TWI335353B - Equol-producing lactic acid bacteria-containing composition - Google Patents

Description

1335353 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 發明領域 本發明係有關具有雌馬酚(equal)產生能之乳酸菌、含 5 有該乳酸菌之組成物，以及利用該乳酸菌以製造雌馬酚的 方法。

I：先前技術;J 發明背景 大豆中所含有的異黃酮（isoflavon)(大豆異黃酮）對乳 10癌、前列腺癌等具有預防效果（抗雌激素(estr〇gen)效果）， 以及對更年期障礙、停經後之骨質疏鬆症.高脂血症.高 血壓等具有改善效果(類雌激素效果）的情形，主要在歐美國 豕已有報告（參見H. Adlercreutz，et al.，（1992) Lancet, 339. 1233; H. Adlercreutz, et al., Lancet, M2, 1209-1210; D. D. 15 Baird, et al., (1995) J. Clin. Endocrinol, Metab., SO, 1685- 1690, A. L. Murkies, et al., (1995) Maturitas., 2J[, 198-195; D. Agnusdei, et al., (1995) Bone and Mineral., 19 (Supple), S43-S48等）。 20 近來’大豆異黃酮的臨床效果被認為是有疑問的，而 有報告指出’大豆異黃酮之活性代謝物，亦即雌馬酚，取 代該大豆異黃鲷掌握了臨床應用上的有效性關鍵。亦即， #各種報告指出，比起大豆異黃酮，其代謝物雌馬酚對乳 癌 '前列腺癌、更年期障礙，以及停經後之骨質疏鬆症等， 為有效（參見D. Ingram, et al., (1997) Lancet, 350, 990- 5 1335353 994; A. M. Duncan, et al” (2000) Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 9, 581-586; C. Atkinson, et al., (2002) J. Nutr., 32 ⑶，595S, H. Akaza, et al., (2002) Jpn. J. Clin. Oncol., 32 ⑻,296-300; S. Uchiyama.，et al”（2001) 5 Ann. Nutr. Metab.，45, 113 (abs)等）。 在2001年舉辦的討論會（第4次International Symposium on the Role of Soy in Preventing and Treating Chronic Disease (San Diego, USA, 2001))中，出現許多關於雌馬酚的 演講專題；到了2002年12月，關於雌馬酚的總說被報告出 10 來；目前，雌馬酚為大豆異黃酮之有效性的真實成分之論 點持續得到學術上的支持(K. D. R. Settchell, et al.，（2002) J. Nutr., 132, 3577-3584)。 和大豆異黃酮比起來，雌馬酚移行到乳房組織、前列 腺組織等組織的移行性非常高，根據這個事實，其生理上 15 的意義也獲得證實(J. Maubach，et al.，（2003) J. Chromatography B.， 784, 137-144; T. E. Hedlund， et al.， （2003) The Prostate, 154, 68-78)。 另外，雌馬酚可由腸内細菌生成，且其生成存在個人 的差異’這點已有報告指出。也有報告指出，日本人當中， 20雌馬酚產生者的比例約為50%(S. Uchiyama.，et al.，（2001) Ann. Nutr. Metab·，公，113 (abs))。無法產生雌馬酌的人，推 測是因為腸内不存在雌馬酚產生菌。這樣的人被認為即使 攝取大ΐ加工食品’依然無法期待有所需的抗雌激素效 果、類雌激素效果。對於這樣的人，為產生所需的效果， 6 1335353 可以考慮或許讓他們攝取雌馬酚產生菌，或者攝取雌馬酚。 本發明人等根據上述構想’經過不斷研究的結果，首 先從人類的糞便新單離.確認出類桿菌屬Bacteroides E-23-15(FERM BP-6435號）、鏈球菌 Streptococcus E-23-17(FERM 5 BP-6436號）及Streptococcus A6G225(FERM BP-6437號）3個 菌株，做為用以使抗雌激素效果、類雌激素效果能夠發揮 的雌馬酚產生菌，並將該等雌馬酚產生菌及其應用之相關 發明提出專利申請（國際公開：WO 99/07392)。 【發明内容3 10 發明概要 本發明人等持續地反覆研究，結果成功地新單離·確 認出本質上和先前所單離.確認出之微生物不同的菌種， 其具有利用黃豆苷元(daidzein)配糖體、黃豆苷元或二氫黃 豆苷元（dihydrodaidzein)為養分而產生雌馬酚的能力之屬 15 於乳酸球菌屬（Lactococcus)的乳酸菌。本發明即是以該乳酸 菌之單離·確認為基礎，完成更進一步反覆研究的結果。 本發明提供以下第1-13項所記載之要旨的發明。 第1項.一種含有產生雌馬酚之乳酸菌的組成物，特徵 在於其含有’具有利用選自黃豆苷元配糖體、黃豆苷元及 20二氯化黃豆苷元所組成之族群的至少一種黃豆苷類為養分 而產生雖馬酚的能力之，屬於乳酸球菌屬的乳酸菌為必要 成分。 第2項·如第1項記載之組成物，其中屬於乳酸球菌屬 的乳酸'菌為格氏乳酸球菌（LizciococcMi garWeae)。 7 1335353 第3項.如第2項記載之組成物’其中屬於乳酸球菌屬 的乳酸菌係已寄存為BCRC910268號（國際寄存編號：FERM BP-10036號）之Lactococcus 20-92 0 第4項·如第1項記載之組成物，其進一步包含從黃豆 5 苷元類及含有黃豆苷元類的物質所形成之族群選出的至少 1種。 第5項·如第4項記載之組成物，其中含有黃豆苷元類 的物質為大豆粉或豆乳。 第6項·如第4項記載之組成物，其為飲料或乳製品形 10 態。 第7項·如第4項記載之組成物，其進一步含有雌馬酚。 第8項.如第7項記載之組成物，其為豆乳發酵物形態。 第9項·一種雌馬酚之製造方法，特徵在於其係使具有 利用選自黃豆苷元配糖體、黃豆苷元及二氫化黃豆苷元所 15 組成之族群的至少一種黃豆苷類為養分而產生雌馬酚的能 力之，屬於乳酸球菌屬的乳酸菌產生作用。 第1〇項.如第9項記載之方法，其中屬於乳酸球菌屬的 乳酸菌為格氏乳酸球菌（LaciococcMj 。 第11項.如第10項記載之方法，其中屬於乳酸球菌屬的 20 乳酸菌係已寄存為BCRC910268號（國際寄存編號FERM BP-10036)之Lactococcus 20-92。 第12項.如第9項記載之方法，其中含有黃豆苷元類的 物質為大豆粉或豆乳。 第13項·一種乳酸菌，其係已寄存為BCRC 910268號 8 ⑴ 5353 (國際寄存編號PERM BP-10036)之屬於乳酸球菌屬的乳酸 菌。 以下將就本發明之含有產生雌馬酚的乳酸菌之組成物 詳加說明。 本發明之含有產生雌馬酚之乳酸菌的組成物，係含有 具有利用選自黃豆苷元配糖體、黃豆苷元及二氫化黃豆苷 %所組成之族群的至少一種黃豆苷類為養分而產生雌馬酚 的能力（代謝活性）之，屬於乳酸球菌屬的乳酸菌為必要成 1〇分。 該乳酸菌之具體例包含本發明人等從人類糞便新單 離.確認出之Lactococcus 20-92(BCRC 910268號，國際寄 存編號：PERM BP-10036號）。 以下將就該乳酸菌之菌學性質詳為敘述。 15 L在培養基上的發育狀態 本菌株用EG(Eggerth-Gagnon)壤脂培養基、BL(Blood Liver)壤月旨培養基或 GAM (Gifu Anaerobic Medium)培養 基，藉加鋼絲棉（Steel Wool)厭氣瓶，進行37。(：、48小時厭 氣培養，或37°C、48小時好氣培養時，會顯示良好或普通 20 的生育。其菌落性狀隆起成正圓、凸圓狀，表面.周緣都 平滑，在EG瓊脂培養基上呈灰白色，在BL瓊脂培養基上則 呈茶褐色。菌形態為革蘭氏陽性的雙球菌。本菌株不形成 芽胞。 II.生化學性質 9 1335353

(1) 最合適的發育溫度： 3TC (2) 最適合發育的pH: 7.0 (3) 明膠的液化： — (4) 從丙酮酸(pyruvicacid)產生3-經基-2-丁顏1 (acetoin) ·· + 5 (5)馬尿酸之加水分解： 一 (6) 七葉苷（aesculin)之加水分解： + (7) 。比11各咬鲷基芳醯胺酶(pyrrolidonyl arylamidase) + (8) α -半乳糖芽酶（a-Galactosidase): — (9) /3-半乳糖苷酶 一 10 (1〇) /5-葡糖苦酸酶（/5-Glucuronidase) — (11) 驗性碟酸酶（Alkaline Phosphatase) — (12) 白胺酸芳酿胺酶(Leucine arylamidase) + (13) 精胺酸二水解酶(Arginine Dihydrolase) + (14) 各碳源之同化性： 15 D-核糖(D-ribose) + L-阿拉伯糖(L-arabinose) — D-甘露糖醇（D-mannitol) + D-山梨糖醇（D-sorbitol) - 乳糖 一 20 D-海藻糖（D-trehalose) + 旋復花粉(inulin) - D-棉子糖(D-raffinose) — 澱粉 + 糖元（glycogen) — 1335353 (15)利用腺(peptone)或葡萄糖為養分後之有機酸組成： 用糖可利用性培養基PYF(Peptone . Yeast論似fteld) 營養液（約含5%的鰊）’及添加葡萄糖於pYF培養液中使其 數終度成為0.5%之營養液，在好氣的條件下，對本菌株進 行37 C、72小時的培養，並對藉此而獲得之培養物中的有 機酸以HPLC法加以測定《結果如表丨所示（單位：爪河）。 表1 有機酸 腺 葡萄糖 馬來酸 nd nd 琥珀酸 0.00 0.01 乳酸 3.33 27.35 曱酸 1.13 0.88 醋酸 3.32 0.57 焦谷胺酸 (pyroglutamic acid、 0.12 0.25 丙酸 nd nd 異丁酸 nd nd η-丁酸 nd nd 異戊酸 nd nd η-戊酸 nd nd nd表示未被檢測出來。 根據以上的發育性狀及生化學性質各點，本菌株雖然 10 被分類成革蘭氏陽性球菌之Lactococcus garvieae，惟與其 模式菌株(type strain)(Schleifer，K. H.，Kraus, J·，Dvorak, C.， Kilpper-Balz, R., Collins, M. D. and Fisher, W. Transfer of Streptococcus lactis and related streptococci to the genus Lactococcus gen. Nov. Syst. Aool. Microbiol., 6, 183-195, 15 1985; ATCC43921 (JCM10343) and ATCC49156 (JCM8735)) 在澱粉之可利用性的點上並不相同。 11 1335353 因此，本發明人等將本菌株命名為Lactococcus 20-92 ’ 於平成15年1月2 3日寄存到獨立行政法人產業技術總合研 究所專利生物寄存中心（曰本國茨城縣筑波市東1丁目1番 3號中央6(郵政區號305-8566)，編號為FERMP-19189號。 5 該菌株目前已經移管為國際寄存，其寄存編號為FERM BP-10036。 另外，本菌株將葡萄糖當做養分利用後會生成乳酸(L 型乳酸）’根據這個現象可以確認其為同質醱酵的乳酸菌。 此外，解析本菌株之16SrRNA序列的結果，可以確認 10 該序列與模式菌株之garv/eae (JCM10343)有 99.189% ’ 與心（JCM8735)有99.375% 的相同性。 再者，上述因 DNA-DNA同質性 的結果近似Laciococcw·? ，故於1996年已經被再分

15 類為[aciococcwj 容flrWeae。因此，在Lflciococcws garv/efle 中’係如上所述，存在著起源互異之2種類的模式菌株(jCM 8735 菌株及 JCM10343 菌株）。E/iieracoccw·? (JCM8735)起源於受到感染的鲖i(y I))之腎臟，原來的 Laciococcwi garv/e似（JCM10343菌株)則是起源於牛的乳房 20 炎。 為了檢討Lactococcus 20-92究竟近似於那一個模式菌 株，乃就其表現形質加以比較。其結果示於下表2。 12 1335353 表2 性狀 本發明菌株 JCM10343 菌株 JCM8735 菌株 脫氨反應 (Arg->NH3) 士 土 土 溫度生育性 10°c 15°C 30°C 37〇C 40°C 45 °C + + + + + + + + + + + + + + PH生育性 pH4.5 pH7.5 PH9.6 土 + + 土 + + 士 + + 鹽濃度(NaCl) 6.5 + + + 胜醣 (peptidoglycan) Lys-Ala-Gly Lys-Ala-Gly Lys-Ala-Gly 醌型 (丰/ >夕彳y) MK-8,9 MK-8,9 無醌 MK表示甲基萘酿（menaquinone)。 由表2可知，本菌株Lactococcus 20-92雖然表現形質與 5 Laciococcws garv/eae模式菌株（JCM10343)—致，但是與 [模式菌株(JCM8735)在40°C 的生育 性和不產生醌的點上是不相同的。因此，本菌株判斷為近 似於LaciococcMi 尽arWeae (JCM10343 菌株）。

本菌株Lactococcus 20-92被分類為GRAS(為美國FDA 10 (食品藥物管理局）認可之食品.食品添加物安全性表示； Generally Recognized As Safe)所收載之乳性乳酸球菌，其 做為食品等被認為有高安全性。 另外’有關[aciococcMS尽arWeae，截至目前為止並無 對人體具有病原性的相關報告’也不會產生toxin等之毒 15 素，被認為是具有高安全性的菌種。 13 1335353 又，gizrWeae過去已經從乇7 7 7 k今起 士、生乳、低溫保存中的肉類加工食品、V — A(泰國的 魚醱酵食品）、卜一^匕。工乇 >亍一七·起士（因起源的名稱而受 到保護之義大利的熟練工起士（PDO)等）被檢測出來。尤 5 其’有報告指出從7。今V—厶檢測出105個/g，從卜一7 (£工 乇 >于一七起士檢測出108個/g之高標準量，就食用經驗.食 用歷史而言，可以擔保具有充分的安全性(P-M. Christine，et al”（2002) Int. J. Food Microbiol·，73, 61-70; M. G. Fortina, et al.，（2003)，Food Microbial.，20, 379-404)。 10 另一方面，關於Enterococcus seriolicida，有報告指出 在魬（/、^千）等的養殖魚類中有病原性。因此，既然Lactoco-ccus 20-92也是一種Laciococctu客arWeiie，在系統上就被認 為和ErtierococcM·? ser/o/i'c/i/a形質相近，而有對養殖魚類具 有病原性的可能性之虞，但是，根據本發明人等的研究， 15 將Lactococcus 20-92的電顯像與病原性菌株(fVlierococirMi ier/o//c/i/ct-KG株)加以比較的結果，核認本菌株與病原性菌 株不同，菌體表面並無莢膜存在。根據此點可以認定本菌 株並不具有病原性，也沒有環境污染的問題。這點也可以 由以下的文獻得到支持。亦即，吉田等人針對養殖魚類的 20 菌體之病原性記載了，如果菌體表面有莢膜存在，則因巨 噬細胞所造成的蠶食鯨呑現象會受到阻礙，其結果導致該 菌無法被殺死，從而在受到該菌所污染的養殖魚類誘發全 身性的敗血症（T. Yoshida, et al·，（1996) Dis. Aquat. Org” 25, 81-86)。 14 此外’本菌株Lactococcus 20-92在直接以牛奶來酿時， 也會維持所需之雌馬酚產生能（活性），且就該雌馬酚產生能 之維持並不需要特殊的培養基，具有例如讓豆乳原封不動 5地醱酵，藉以利用該豆乳中的黃豆苷元為養分即可以產生 雌馬紛的特徵。 一過去，並無具有這種雌馬酚產生能之屬於乳酸球菌屬 、/U夂菌破報導出來的例子。因此，本發明亦提供具有所 34雜馬齡產生能之龍的乳酸菌。 0 道红缝元類的物當 类也本菌株LaCtococcus 2〇_92所利用做為養分之黃豆苷元 ，中包含了黃豆苷元配糖體、黃豆苷元及二氫黃豆苷 鼓次汽一五苦几配糖體之具體例可以<列示如黃豆苦（daidzin)。 厂黃豆苦係具有I歸元做為活性異黃酮(agly⑶n)之異黃 5私配糖體(黃豆衫配糖體）。該黃Μ的情形係被上述微生 ^做養分利用’使黃料元游離，該黃豆苦元又進-步 略均做養分利用而變成二氫黃豆脊元，然後終於產生雌馬 2〇 本發明中係將上述黃豆芽元類當做基質來利用。而， ^基質並不限於黃豆#元類，含有該基質的各種物質都可 Μ用。含有該黃豆苷元類的物質(黃豆苦元類含有物質) ^代表例可關示如大豆異黃酮。大豆異黃啦市面上已 ^售，在本發財可以使用此種市售商品，例如^7 ^司製「7 W >Ρ10」（登錄商標）等。另外，不限 4豆異黃酮，如葛、葛根、紅苜稽㈣Ci〇ver)、紫花首 15 1335353 猜(alfalfa)等植物本身，及以其等為《源之異黃酮衍生物也 包含在含有黃豆苷元類的物質中。 此外，含有黃豆苷元類之物質的其他具體例除了上述 之大豆、葛、葛根、紅苜蓿、紫花苜稽等之食用材料本身 5以外，尚可舉例如其等之加工品，例如大豆粉、煮大豆、 丑腐、油豆腐、豆乳、大豆胚軸萃取物等，以及其等之酸 酵調製物，例如納豆、f油、味嗜、于^…擎）、醋酵 大豆飲料等。這些物質每—種都含有黃料元類。而且， 些物質除肖_3__7〇類外，另含具有類雌激素作用的異黃 ίο賴，例如染料木黃綱（Genistein)和纟配糖體（染料木苦 (Gemstm)等），甘胺黃酮（Glycitein)和其配糖體（Giyd如 :);黃，及染料木黃酮的一部分被甲基化之前驅體花 汽素異κ酮Biochamn A、Formonetin等’都可以合適地應 用在本發明。 (3)本發明組赤铷

15 20 本發明之含有產生雌馬紛的乳酸菌之組成物含有，具 有以上述LaCt0C0CCUS 2〇竭主，作用於做為基質之黃豆* 疋類或含有黃豆苦元類的物質以產生雌馬_能力之屬於 乳酸球®屬的乳酸菌’做為必要成分。做為該必要成分之 乳酸菌雖錢料生菌，惟並不特縣定於此，例如其培 養液’含有㈣培錢所單離出來之菌體㈣養物之粗精 製乃至於精製OD、其等之冷來乾燥品等也都可以使用。 述微生物之培她代表㈣可域由例如用適合 16 於培養該微生物之培養基，例如MRS培養基等 ，在37°c培 =微生物48小時左右來取得。料，㈣可以在上述培 < ’例如’將培養液以3_次旋轉/分、4。(：離心分離 ^分鐘再收集_的方式獲得。這些可以依照—般方法精 Λ述㈣也可以冷♦乾燥。所獲得之冷;東乾燥茵 色可以利㈣為本發籠成物之有效成分。 10 本發明組成物只要含有做為上述有效成分之微生物 (菌體等）即可，並無其他特殊的需要，不過也可以依需要而 3有適β於維持（或增殖)做為上述有效成分之微生物的營 養成刀。玄呂養成分之具體例係如前所述，可舉用以培養 各微生物之營養培養基為例，例如ΒΗΙ、EG、BL、GAM培 養基等。 其它的營養成分可例示如乳果寡糖、大豆寡糖、萬苣 二糖(i_i〇se)、乳糖醇(lactit〇1)、果寡糖、乳募糖等各種 15寡糖。這些寡糖的調配量並無特殊限制，惟通常以從本發 明組成物中占1-3重量％左右的量的範圍來做選擇為佳。 上述本發明組成物透過其攝取，會在攝取者的體内發 揮產生所需要的雌馬酚產生能。通常，日本人有習慣食用 3只豆苷類食品，代表性者係如前述之大豆等的食用材 2〇料、其等之加工品、其等之醱酵調製物等，因此只要攝取 本發明組成物，就會在生體内產生雌馬酚。 再者，本發明組成物中亦可以依需要而適當地添加各 種維生素類、微量金屬元素等。該維他命類可例示如維生 素B、維生素D、維生素〇維生素E、維生素K(尤其是來自 17 1335353 納豆菌的MK-7 (menaquinone-7))等。微量金屬元素可例示 如鋅、硒、鐵、錳等。 本發明組成物中所調配的微生物之量可依所使用的乳 酸讀之種類等來做適當的決定。例如以Lactococcus 20-92 5調製成菌數（生菌數）為1〇8〜1〇9個/100g左右的組成物量為 佳。該菌數之測定係將稀釋到菌培養用的瓊脂培養基而成 之試料加以塗布，再於37。(：下進行好氣培養，然後計測所 生育之菌落數’從而算出菌數。上述微生物之調配量係以 上述量為基準，並可依所調製成之本發明組成物的形態等 10 而做適當的變更。 IU)含有黃豆苷元類之太發明組成物 本發明組成物可依需要而進一步含有自前述之黃豆苷 元類及含有黃豆苷元類的物質所構成之族群選出的至少j 種成份。在該黃豆苷元類及含有黃豆苷元類的物質之内， 15尤其以大豆胚軸及採用大豆胚軸為原料調製而成的食品材 料為佳，其中又以水溶性或者經過乳化的食品原料更佳。 其他合適的含有黃豆苷元類的物質之例有大豆粉或豆乳。 此組成物由於在組成物中含有基質，故即使是沒有習 慣食用大豆等食品材料的Λ，只要攝取這個組成物 ，依然 2〇可以透過微生物在生體内將組成物中之基質當做養分利用 的機制而產生所需要的雌馬齡。 黃豆苷元類及/或含有黃豆苷元的物質調配到組成物 中的調配量雖無特殊限制，惟以一般曰本人每曰所攝取的 量為10-25mg左右者為合適。 18 1335353 本發明組成物亦可進-步含有雌馬紛。 ' &叩的S好性可以透過例如使乳酸潑酵而獲得 D而纟發明組成物中所例用的微生物之代表例為

Lactococcus 20-92，且右後 Λ 優良的雖馬紛產生能（活性）。在本 發^中亦提供，使上述微生物作用於例如豆乳等之含有黃 旦苦7L類的物質，彻豆乳巾之黃豆#元類為養分使雜馬 產生而形成之丑礼醱酵物等之含有雌馬賴組成物。 ίο 15 此處’可以利用前述之各種黃豆苦類及含有黃豆發類 的物質做為基質。在這些物ft巾又以從魏、大豆粉等 調製成之溶液乃至於乳化液為佳。 含有雌馬紛之本發明組成物的一個合適的具體例4举 例如將大豆異Θ酮或含有大豆異黃酮之食用材料添加别 合適的培養基，使本發職生物，合適者為Laetoeoecus 20-92在該培養基中醱酵而獲得之醱酵產物。在此，更詳細地 說’醋酵可以透過例如’將基質做成溶液狀態並加以滅菌 後，把預定量之本發明微生物添加到本發明微生物可以生 月的營養培養基’例如BHI、EG、BL、GAM培養基等，戍 可以利用做為食品之牛乳、豆乳、蔬菜汁等之中，於37。〇 20下’在厭氣狀態或好氣的靜置狀態使其醱酵48-96小時左 右（可依需要添加pH調節劑、還原物質（例如酵母提取物、 維生素心等))的方式來實施。上述實施方式中，基質量可以 調整在0.〇l-〇.5mg/mL左右，微生物之接種量可以從15%的 範圍選出。 19 1335353 藉此，可以製造含有雌馬酚之本發明組成物。該組成 物可依據上述醱酵產物的形態，當做食品、醫藥品做成合 適的製品。另外，也可以從所獲得之培養物，依照常法將 雌馬酚加以單離精製，再依需要於其中適當地調配其他合 5適的食用材料，調製成適當的食品形態乃至於醫藥品形態。 上述單離精製可以透過例如，使醱酵培養物吸附於離 子交換樹脂(DIAION HP20，三菱化成公司製）後，用甲醇使 之溶出再令其乾固的方法來實施。 本發明組成物中之雌馬酚量係依所調製成之食品形態 10及醫藥品形態來決定，並無特殊限制，惟通常以組成物總 量100g中含有雌馬酚2-5g左右的量之範圍為佳。 所獲得之本發明組成物含有雌馬驗的情形可以用，例 如後述之試驗例1所示的方法來確認。 含有雌馬紛之本發明組成物由於其有效成分雌馬盼為 15天然物，所以安全性優良；而且因為是用乳酸菌調製而成， 所以沒有混入來自其製造步驟的化學藥品等之疑慮；此外 更有高收率、低生產成本，同時做為食品時在風味香味上 也都很優質的優點。 £1-4)含品形態 20 本發明含有產生雌馬酚之乳酸菌的組成物，通常係以 前述特定的乳酸菌為必要成分調製成同時含有適當的可食 性載體之食品形態。 本發明組成物之食品形態的具體例可舉例如飲料形 態、飲料形態以外之乳製品形態（包含醱酵乳）、固形食品形 20 1335353 態、含茵之微膝囊形態等。飲料形態之本發明組成物中包 含乳酸菌飲料及添加乳酸菌的飲料。 此處有關「醋酵乳」及「乳酸菌飲料」的用語係依從 舊厚生省所頒「礼及乳製品成分等之相關省令」第二條37 5 「醋酵乳」及38「乳酸菌飲料」的定義。亦即，「撥酵乳」 是指用乳酸菌或酵母使乳或乳製品發酵形成糊狀或液狀而 成者。因此，該醱酵乳中包含了飲料形態及優路乳形態。 而「乳酸菌飲料」是指用乳酸菌或酵母使乳或乳製品發酵 形成糊狀或液狀，再以之為主原料並兒水弄淡而成的飲料。 1〇 添加乳酸菌的飲料可以例示如酸酵蔬菜飲料、醱酵水 果飲料及醱酵豆乳飲料等。飲料形態以外的乳製品形態包 含凝乳狀形態，例如優路乳等。固形食品形態包含顆粒、 粉末（包含酸酵乳冷;束乾燥粉末等）、錠冑、發泡製劑、膠、 橡皮糖、布丁等形態。 15 彳以根據常法調製成各該等形態。且任-種可食性載 體都可以在調製成各該等形態時用做為載體。尤其，以入 口感覺良好之具有味纽善效果的紐為宜。該入口感覺 良好之具有味覺改善效果的載體之具體例可以例示如人工 甘味料、山梨糖醇、木糖醇等。其他合適的载體可例示如 20遮蔽劑，例如海藻糖(trehal〇se)(林原公司製）、環狀糊精 (Cycl〇dextrin)、Benecoat BMI(花王公司製）等。 關於食品形態之合適具體例，即添加乳酸菌的飲料， 詳細地說’於調製成該等飲料形態時，可以透過在含有微 生物的營養源之適當的潑酵用原料物質，例如蔬菜類、水 21 1335353 果類、豆乳（大豆乳化液）等的液體中，培養微生物以使該原 料酸酵的方式來進行。做為醱酵用原料物質的蔬菜類及水 果類中，包含各種蔬菜及水果的切斷物、破碎物、磨碎物、 搾汁、酵素處理物、其等之稀釋物及濃縮物。蔬菜類中包 5含南瓜、紅蘿蔔、蕃茄、青椒、芹菜、菠菜、有色蕃薯、 玉米、甜菜、芥藍 '荷蘭芹、高麗菜、花椰菜等。水果類 中包蘋果、水蜜桃、香蕉、草莓、葡萄、西瓜、橙、蜜柑 等。 蔬菜及水果的切斷物、破碎物及磨碎類可以在將例如 10上述蔬菜類或水果類洗淨後，依需要而放到熱水中等做分 枝(branching)處理後，再用壓碎機、混合器、食物調理機、 碎漿機、Mycolloider等予以切斷、破碎、磨碎而獲得。搾 汁可以用例如壓渡式脫水機(filter press)、果汁機等調製。 酵素處理係使纖維素酶（cellulase)、果膠解聚酶（pectin_ 15 nase)、原果膠(pr〇t〇pectin)分解酵素等作用於上述切斷物、 破碎物、磨碎物、搾汁等來調製。稀釋物中包含以水稀釋 成1-50倍的產物。濃縮物中包含以例如冷凍濃縮、減壓濃 縮等手段濃縮成1-100倍的產物。 釀酵用原料物質之其他具體例為豆乳，可以依啤常 2〇 法，從大豆原料調製而成。該豆乳中包含例如，將脫皮大 豆浸在水中後，用膠體磨（colloid mill)等適當的粉碎機進行 濕式粉碎處理後，依照常法進行均質處理而得之均質化 液，或將水溶性大豆蛋白質溶解於水中而成之溶解液等。 利用微生物的醱酵可以透過將本發明微生物接種到醱 22 5 進行靜置培養的方式來實施。培養基當中 質，例如葡萄糖^本發明微生物良好發？_酵促進物 、澱粉 '蔗糖、乳糖、環糊精、山、 果㈣之碳源’酵母提取物，鰊等之氮源，唯生二 物質類等。 '准生素類、礦

微生物之接種量通常以從酿酵用原料物 中約含菌體lxl〇6個 各有液1CC 為人、南Μ 個以上，較佳為ΐχίο7個左右的量選出者 10 件通常是從_溫度20鲁C左右，較佳為 中來㈣擇1佳為37t，㈣時間8_24小時左右的條件 為^進行安定的醱酵，建議採用預先準備引酵物 8咖，將之接種咖酵用原料物質再使之醱酵的方法。 此處之⑽物可舉例如，代祕 預先於90-12rC進杆、體接種到 15 過G分鐘之—般_處理的醱酵用 ’、’貝、小加酵母提取物之1〇%脫脂粉乳等，再以相间 ^条件進行培養叫之物。如此處理喊得之引酵物通^ 含有本發明微生物約ι〇7-ιο9個/g培養物。 20 另外’如上所述而獲得之乳酸醋酵物有具有凝乳 態(類似優絡乳乃至布丁用形態)的情形，這樣的醋酵物可二 就這樣當做食品來食用。職乳狀形態的乳酸可以藉由將 之進-步均質化而做成所需要的飲料形態（例如‘豆二 飲料等該均質化可以用一般的乳化機(均化器)來實施。 具體而言’該均f化可以採關如高林(GAULIN)公司製古 壓均化器α卿），以大約.誦kgfW，較佳為^ 23 1335353 300-800kgf/cm2的條件，或者採用三和機械工業公司製均化 器（商品號碼：HAX4571，H20-A2等），以15〇kg/cm2或以上 的條件來實施。由於該均質化，可以獲得具有優良的口感， 尤其是具有滑順感的飲料製品，特別是醱酵豆乳飲料製 5品。另外，在該均質化時可一方面依需要適當地予以稀釋， 一方面添加用以調整pH的有機酸類；又，可以在飲料的製 造上適當地添加通常所使用的糖類、果汁、增粘劑、界面 活性劑、香料等各種添加劑。合適的添加劑和其添加量(相 對於凝乳狀潑酵物重量的重量％)之一具體例可舉例如，葡 10萄糖8%(重量％ ’以下同）、砂糖8%、環糊精8%、檸檬酸 0.1%、甘油脂肪酸酯0.2%及香料0.1%。 藉此所獲得之醱酵豆乳飲料等的本發明乳酸菌飲料可 以依照常法無菌地填充到適當的容器中做成製品。該製品 具有滑順的吞嚥口感及風味。 15 其投與(攝取）量係依攝取該物的生物體之年齡、性別、 體重、疾病的程度等來決定，並無特殊限制。通常，每天 服用調製成微生物含量108-109個/mL的飲料食品100_ 300mL左右即可。 本發明組成物之食品形態的其他具體例可舉例如發泡 20 製劑形態。此製劑可以用碳酸鈉及（或）碳酸氫鈉10-35%， 與中和劑20-70%為發泡成分，調配到本發明微生物（菌體冷 凍乾燥物）0.01-50%(重量％，以下同）中而製成。此處所使 用之中和劑係使上述碳酸鈉及碳酸氫鈉中和並產生二氧化 碳而得到之酸性化合物。該化合物中包含例如，代表性的 24 1335353 L /酉石酸、摔樣酸、昌馬酸、抗壞血酸(ascorbic acid)等有 機酸。 上述發泡成分調配到本發明發泡製劑中的比例係以所 獲得之本發明製劑溶解於水中時，溶液呈現酸性，特別是 5 PH約3.5-4.6左右的酸性之比例為佳。更具體而言，上述比 例以選自碳酸鈉及（或）碳酸氫鈉1〇_35%及中和劑2〇 7〇%的 範圍者為佳。尤以從碳酸鈉11-31%，較佳為22-26%，碳酸 氫鈉10-35%，較佳為20-35%的範圍選出者為佳。其中又以 單獨使用20-25%範圍的碳酸氫鈉者最佳。而中和劑係選自 10 2〇-7〇% ’較佳為30-40%的範圍，尤以使用L_酒石酸20-25 % 及抗壞血酸8-15%的範圍者最佳。 本發泡製劑係以本發明微生物及發泡成分為必要成分 ’另外亦可依需要而適當地添加配合以周知的各種添加劑 成分，例如賦形劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、增粘劑、 15表面活性劑、滲透壓調節劑、電解質、甘味劑、香料、色 素、pH調卽劑等。上述添加劑可例示如小麥澱粉、馬鈴薯 澱粉、玉米澱粉、環糊精等之澱粉類；蔗糖、葡萄糖、果 糖、麥芽糖、木糖、乳糖等之糖類；山梨糖醇、甘露糖醇 、麥芽糖醇(Maltitol)、木糖醇(xyiitol)等之糖醇類；偶聯糖 20 (couPling sugar)、paratinose等之糖轉位配糖體；磷酸鈣、 硫酸鈣等之賦形劑；澱粉、糖類、明膠、阿拉伯膠、環糊 精、甲基纖維素、聚乙一歸°比洛烧嗣(polyvinyl pyrrolidone) 、t 乙稀醇(polyvinyl alcohol)、經丙基纖維素(hydroxypropyl cellulose)、黃原膠(xanthan gum)、果膠、西黃蓍膠(trogacanth 25 gUm)、路蛋白、褐藻酸(alginicacid)等之結合劑乃至增枯劑 白氣酸異白氨酸、L-绳氛酸、糖醋（SUgar ester)、硬化 硬月曰&硬脂酸鎂 '滑石、聚乙二醇(macrogol)等之潤 滑劑；結晶纖維素(旭化成公司製「T匕七/1/」）、羧曱基纖 5維素(CMC)、叛甲基纖維素納(CMC Na)、缓曱基纖維素妈 (CMC-Ca)等之崩解劑；聚環氧乙烷山梨醇酐脂肪酸酯（聚山 4醇針知肪酸酷’ p〇lys〇rbate)、卵磷脂等之表面活性劑、 阿斯巴甜(Asparatame)、阿力甜(Alitame)等之二肽(dipeptide) ，其他像Sutevia、糖精(saccharin)等之甘味料等◎這些成分 ~T以在考慮其與必要成分之關係和製劑的性質、製造方法 等之下’適當地選擇其合適量而使用。 此外，本發明發泡製劑中，可以添加配合適當量的維 生素類，特別是維生素&2和抗壞血酸（維生素〇等。其調配 比例雖無特殊限制，惟通常以選自維生素C至30%為止的量 15 ’較佳約為5-25%的範圍者為宜。 本發明發泡製劑的製造方法基本上可以用同於一般所 使用的這種發泡錠劑的製造方法來進行。亦即，本發明製 劑之發泡錠劑形態可以秤取預定量之各成分，經過混合， 依照直接粉末壓縮法'乾式或濕式顆粒壓法等來調製。 20 如此所製得之本發明製劑只需投入水中就可以變成適 合於經口投與的飲料形態，然後被經口投與。 其投與(攝取）量係依應適用此製劑之生體的年齡、性別 、體重、疾病程度等來做適當決定，雖無特殊限制，惟一 般以每次將調製成1錠約1.5_6.〇g之本發明發泡錠劑卜2鍵溶 26 於l〇〇-30〇mL的水中來服用為佳。 *做為本發明組成物中之基質的黃豆皆元類或含有黃豆 苷元類的物質、乳酸菌，及依需要而添加配合之其他成分 ，其等之特別合適的混合比例以，相對於本發明組成物丨〇〇g 5 ，頁丑苷疋類或含有黃豆苷元類的物質換算成黃豆苷元約 為l〇-50mg的範圍，乳酸菌為1〇9〜1〇10個（生菌數)及寡糖等 約l-5g的範圍者為合適。 另，如上所述，本發明含有產生雌馬酚之乳酸菌的組 成物為使其中能含有微生物（主要為生菌），在該組成物之製 1〇品化過程中並不適合採用加熱、加壓等條件。因此，在將 本發明組成物調製成例如棒狀、顆粒、粉末、錠劑等之製 品形態時，或將微生物直接處方成冷凍乾燥菌體，或以適 當的被復劑加小冷凍乾燥菌體為宜。 但是，本發明含有產生雌馬酚之乳酸菌的組成物並不 15 一定要在其中含有生菌。當調配有生菌和生菌利用養分而 獲得之黃豆苷元類等之本發明組成物，已經產生所需要的 雌馬酚時，則該組成物亦可依據常法對其施以加熱滅菌處 理以殺死存在該組成物中之菌類。若採用這種加熱滅菌處 理’則在調配有生菌和生菌利用養分而獲得之黃豆苦元類 20等之本發明組成物的情形中，有時候也可以避免存在於該 組成物中之生菌在該組成物的保存中或流通過程中發生剩 餘醱酵而使味道、風味劣化的疑慮。 (Ml醫藥品形態 本發明含有產生雌馬紛之乳酸菌的組成物通常係以前 27 1335353 述特疋之乳酸菌為必要成分，並且被調製成同時含有該組 成物和適當的藥學上可容許製劑載體之醫藥製劑形態。 裝劑載體可以例示如’一般在這個領域被使用之周知 、充劑增昼劑、結合劑、付濕劑、崩解劑、表面活性 齊丨潤β劑等之稀釋劑或賦形劑。這些載體可依所製得之 1劑，技與單位形態而做適當的選擇使用。 醫藥製_投與單位形態可以選擇各種形態。其代表 可舉例如錠劑、丸劑、散劑、液劑、懸浮劑、乳劑 、顆粒劑、膠囊劑、坐劑等。 ιυ 15 。在成形為錠劑形態時，上述製劑載體可以使用例如， L糖白糖、氯化納、葡萄糖、尿素、殿粉、碳酸約、高 嶺土 H纖維素、錢、磷祕等之賦形劑；水、乙醇 、丙醇、單糖漿、葡萄糖液、殿粉液、明膠溶液、羧甲基 纖維素、㈣基纖維素、甲基齡素、聚乙稀料㈣等 之結合劑4甲基纖維素鈉、叛甲基纖維相、低取代度 ㈣基纖維素、乾燥澱粉、海級鋼、遭脂紛末、海帶多 糖(Laminaran)粉末、碳酸氫納、碳酸鱗之崩解劑；聚产 氧乙烧山梨醇肝脂肪酸酿類、十二燒基硫酸納心 20

La—謹_、硬脂酸單甘油醋等之界面活性劑.白糖 硬脂⑽a…可油、氣添加油等之崩解抑制劑⑽ 鹽基、十一院基硫酸鈉等之吸收促進劍. ，甘油、澱粉等之 :呆關：澱粉、礼糖、高嶺土、膨潤土、膠體狀矽酸等之 吸附劑，精製滑石、硬脂酸鹽、硼酸粉 _ 潤滑劑等。 X乙一醇等之 28 例 卜，鍵劑可依需要而做成被覆一般的劑皮之鍵劑， 如糖衣錠劑、明膠被包錠、腸溶被錠、薄獏被覆錠或雙 層錠、多層錠。 在成形成丸劑的形態時，可以使用例如葡 、乳糖 .。々、可可油、硬化植物油、高嶺土、滑石等之賊形劑 。把伯膠粉末、西黃蓍膠粉末、明膠、乙之結合劍 '海薄玄Μ "糖、瓊脂等之崩解劑等做為製劑載體。 10 高級成形為坐劑形態時可以使用例如聚乙二醇、巧*可油、 戟體醇、向級醇之酯類、明膠、半合成甘油酯等使為製劑 的各^囊_依照常法’將本發明微生物和上述所例示 而調^劑載體混合後，再填充到硬質膠囊、軟質膠囊等 15 劑、H，本發明製劑中亦可依需要而含有著色劍、保存 科、風味劑、甘味劑等或其他醫藥品。 制，^發明製劑中應含有之本發明微生物的量並無特殊限 ^廣範圍中做適當選擇。通常，醫藥謝 10個/g左右為佳。 20 达醫藥製劑之投與方法並盈特跌 劑形態、串…'特殊限制’係依各種製 〜者年齡、性別，其他 。例如鉸淑X ^ ’、、疾病程度等來決定 劑可經口投與，坐劑則是直腸内投與礼劑、顆粒劑及穆囊 ^述««的投與量可根據其料 别和其他條件、疾病程度等做適當選擇，惟ρ年齡社 分，即本_生狀爾日魏戯 29 1335353 為佳’且該製劑可以分成1日1-4回來投與。 又，本發明組成物因其攝取(投與），該組成物中之微生 物可以活生生地到達下部消化管，或定著成常在菌，進而 發揮所預期的效果。特別合適的製劑是腸溶性鍵劑形離， 如果利用這種錠劑形態，則可以在 ^ 生物送到腸部位。 料襲下把微 =所獲得之本發明含有產生雌馬_乳酸菌之組成 ^中高齡女性之無法確定病因的身體不順，乃至於伴 10 發生之例如骨質疏鬆、更年期障礙等症狀的預 :^置上都是有㈣。相_預防及處理係，藉由對有 =中高齡女性，或投與或使其攝取有效量之上述本 组^ 方式來實施。該有效量只要是可以藉本發明 順tr與，而射高齡女性之無法確定病因的身體不 15 :等^於伴隨著停經而發生之例如骨質疏鬆、更年期障 礙專症狀加以肋歧置者都^，料特殊 通常可以用攝取本發明组忐札 j f隹， 以】 本U、·且成物的人，其尿中雌馬_泄量 从e(約仏以曰以上的量做為標準。 【方包:¾'式】 實施發明之最佳態樣 20 盼之細說明本發明將舉出本發明含有產生雖馬 之极ϋ的組成物之調製例做為實施例，惟本發明並不 限於該等實施例所示之範圍。 實施立jj_ 麼酵豆料之調盥 30 1335353 調製成醱酵豆乳飲料

lOOmL 適量 適量 適量 150mL 量秤並混合下列處方之各成分 形態之本發明組成物。 水溶性大豆蛋白之醱酵培養物 維生素.礦物質 香料 水 總量 上述水溶性大豆蛋白的醱酵培養物係將水溶性大豆蛋

白13旦溶解於水10〇mL，其中加入Lactococcus 20-92 (BCRC 10 910268號（國際寄存編號：FERM Bp_1〇〇36))1〇8_1〇9個在 37 C使之醱酵24-48小時而得者。而，所利用之水溶性大豆

蛋白於ig中含有黃豆苷元類的量換算成黃豆苷元為12mg 左右。 (2)醋酵乳之調寧J 量秤並/昆合下列處方之各成分，調製成酸酵乳形態之 本發明組成物。

Lactococcus 20-92醱酵乳 100mL 維生素.礦物質 適量 香料 適量 水 適量 總量 150mL 上述Lactococcus 20-92醋酵乳係於牛乳il(無脂乳固形 刀8.5%以上，乳月日肪3.8%以上）中加入[3(；|；〇(；〇〇(：118 20-92 20 (BCRC 910268號（國際寄存編號：fermBP-10036))108-109 31 1335353 個，在37°C使之醱酵24-48小時而得者。 〇)醱酵豆乳冷凍乾燥輪束之調事 使用約 109個Lactococcus 20-92(BCRC 910268號（國際 寄存編號· FERM BP-10036))，在37°C讓豆乳(大豆固形分 5含莖10%，黃豆苷元含量：黃豆苷元換算量10-15mg)100g 進行乳酸醋酵72-96小時，使其生成雌馬紛。將其冷凍乾燥 後再做成粉末。粉末中之雌馬酚含量以HpLC測定的結果為 0.1-0.3重量％。 用上述粉末，並量秤混合下列處方之各成分，調製成 10粉末形態之本發明組成物(食品形態及醫藥品形態）。 醱酵豆乳冷凍乾燥粉末 2.2g (雌馬酚 含有 0.005g) 賦形劑（玉米澱粉） 17g 維生素·礦物質 適量 香料 適量 總量 20g (4)粉太之調 量秤並混合下列處方之各成分， 調製成粉末形態（食品 形態及醫藥品形態）之本發明組成物（ Lact〇coccus 20-92冷凍乾燥粉末 4.1g 賦形劑（乳糖） l.Og 維生素.礦物質 適量 香料 適量 總量 20g 32 1335353

Lactococcus 20-92冷凍乾燥粉末係以可增殖之適當的 液體培養基(MTS)培養(37°C ’ 24-48小時)Lactococcus 20-92 (BCRC91〇268號（國際寄存編號：FERMBP-10036))後，經 過集菌處理，使之懸浮於10%的Skim Milk後，再藉冷凍乾 5燥處理而獲得者’其菌體含量為1〇9-1〇10個/g。 另外，上述粉末亦可進一步配合以粗精製大豆異黃酮 粉末4.1g而製成含有黃豆苷元的粉末。 若攝取所獲得之含有黃豆苷元的粉末，則可以觀察到 每天約有5μιη〇1ε(約l.2mg)的尿中雌馬酚排泄量；因此，在 1〇體内可以產生和該排泄量相稱的雌馬酚之事實獲得確認。 ί!)顆趣之調劁 量秤並混合下列處方之各成分，調製成顆粒形態（食品 形態及醫藥品形態）之本發明組成物。 4.1g l.〇g l.〇g 適量 適量 20g 粗精製大豆異黃酮粉末 15 Lactococcus 20-92冷;東乾燥粉末 蔗糖酸酯 維生素·礦物質 香料 總量 20 乂 又用和刖述（1)相同的材料做為Lactococcus 20-92冷 凍乾燥粉末。 〜如果攝取此產物，則可以讓黃豆苷元與雌馬酚產生菌 起到達大腸内，從而可以在大腸内產生雌馬紛。 以下將例舉就本發明產生雌馬紛之乳酸菌所進行的試 33 1335353 驗例。 試驗Ϊ歹*π

(1)試驗方法 將Lactococcus 20-92株（1 〇7-1 〇9/g)在腦心浸出培養液 BHI Broth(增殖用液體培養基(基礎培養基))5址中，於厭氣 的條件下，在37。(：培養24小時後，用基礎培養基稀釋成1〇2 及104以調製稀釋液。 將培養結束後之培養液及其各稀釋分別各取〇2mL，和

1〇含有黃豆苷元基礎培養基（在BHI Broth中以成為10|Ltg/mL 的量添加黃豆苷元而成者）、牛乳及豆乳各5mL相混合，厭

氣的條件下，在37。(：進行培養。培養時間在含有1〇|[lg/mL 黃丑苷元的基礎培養基及豆乳的情形中為8小時、24小時、 48小時、72小時及96小時；在牛乳的情形中為8小時、24小 15 時及48小時。 在培養開始前和各培養結束的時點，進行〇lmL及 0 · 2 m L培養液的取樣’分別供用於菌數測定及雌馬酚產生能 (活性）測定。此外，針對含有1〇貼就黃豆苦元的基礎培養 基及丑乳’在培養開始前和各培養結束的時點，進行ai5mL· 20培養液的取樣，並測定該液令之雌馬酚產生量。 囷數測定係如下所述般地進行。亦即，將各試樣〇imL 以PBS㈠溶液（二、以1公司製）稀釋，作成1〇4、1〇5、106及 ίο稀釋液，將各該稀釋液〇 lmL塗布於GMA瓊脂培養基， 於好氣的條件下，在3rc培養24小時，計測在料塌生 34 1335353 育出來的菌落數以做為菌數。 雌馬酚產生能（活性）之測定係如下所述般地進行。亦 即’將各試樣0.2mL和含有黃旦4元的基礎培養基5mL(各3 支)混合，厭氣的條件下，在37 C培養96小時；培養终了後 5 對各培養液進行〇.5mL的取樣’用乙酸乙賴5mL萃取2次 後’以HPLC測定萃取液中之黃豆苷元、二氫黃豆苦元（中 間體)及雌馬酚；另外，由其等之總量算出雌馬酚所占的比 例。所獲得之結果以下述5階段予以積分化，以3檢體的平 均積分做為雌馬酚產生能（活性）的指標。 10 4 :9〇%以上的雌馬酚； 3 :雌馬酚生成，黃豆苷元減少到不滿50%(有中間體）； 2 .雌馬紛生成，黃豆苷元殘餘5〇%以上（有中間體）； 1 ·有中間體生成，未生成雌馬酚； 〇:中間體及雌馬酚都未生成，黃豆苷元沒有減少。 15 雌馬盼產生量測定如下所述地進行。亦即，將各試樣 〇-5mL用乙酸乙酿5mL萃取2次，以HpLC測定萃取液中之黃 且發元、二氫黃豆苷元（中間體)及雌馬酚。算出各濃度以做 為雌馬酚產生量。 (2)試驗結果 20 (2-1)菌數(增殖性）的調查結果示於第1圖。 圖中’（1)為利用含有黃豆苷元基礎培養基的結果；（2) 為利用丑乳的結果；（3)為利用牛乳的結果。在各圖中，橫 轴表不培養時間(hr)，縱轴表示生菌數(Logcfu/ml)。 根據各圖所示的結果，本菌株之增殖性良好，無論是 35 1335353 含有黃豆苷元的基礎培養基、豆乳及牛乳中的任一者，無 論接種量如何，在培養8小時後都達到定常狀態。菌數在含 有黃豆苷元的基礎培養基中維持109·1-9·4個/mL，在豆乳中維 持108·5-8·7個/mL，在牛乳中維持1080—8·4個/mL。 5 (2-2)雌馬酚產生能（活性）算出來的結果示於第2圖。 在第2圖中，（1)為利用含有黃豆苷元之基礎培養基的結 果；（2)為利用豆乳的結果；（3)為利用牛乳的結果。在各圖 中.，橫軸表示培養時間（hr)，縱軸表示積分。 根據該圖所示之結果可以確認在含有黃豆苷元之基礎 10 培養基、豆乳及牛乳的任一者中，雌馬酚產生能（活性)都有 經時地增加之傾向。而且，在利用牛及豆乳的情形中，也 可以確認本菌株之雌馬酚產生能（活性）可以被維持。 (2-3)雌馬酚產生量測定結果 測定在含有黃豆苷元的基礎培養基及豆乳（黃豆苷元 15 換算量約為80pg/mL)中所產生之雌馬酚量，結果如第3圖所 示。 在第3圖中，（1)為利用含有黃豆苷元之基礎培養基的結 果；（2)為利用豆乳的結果。在各圖中，橫軸表示培養時間 (hr)，縱軸表示雌馬盼濃度(pg/ mL)。 20 兩種培養基都是從培養開始後第48小時起確認到雌馬 酚的產生。在利用豆乳的情形中，觀察到因接種量的變化 所造成之雌馬酚生成量的差異，尤其是以4.00%接種培養96 小時，可看到有57.Opg/mL之顯著量的雌馬盼生成。 雖然豆乳中構成雌馬酚之基質的黃豆苷元90%以上以 36 1335353 配糖體（葡萄糖形成結合的狀態)存在，但是在所測定的色層 分析譜上，該配糖體的波峰卻消失了，因此可以認定是本 菌株將配糖體分解（β-葡萄糖甘酶（β-glucosidase)活性）而生 成黃豆苷元後，將該黃豆苷元代謝成雌馬酚。 5 試驗例2 由Lactococcus 20-92株所造成之雌‘辱胁d杰玫砰 (1)試驗方法

Lactococcus 20-92株（107個/g)以BHI Broth(增殖用液體 培養基，基礎培養基)5mL’厭氣條件下，在37°C進行培養。 10培養時間為8小時、24小時、30小時、36小時、48小時、51 小時、54小時、6〇小時、84小時及96小時。 在培養開始前和各培養終了的時點進行〇 5mL的取 樣，測定試樣中之黃豆苷元、二氫黃豆苷元（中間體)及雌馬 紛濃度。 15 (2)結果 所獲得之結果示於第4圖。 第4圖顯示黃豆苷元(左圖）、二氫黃豆苷元（中央圖）及 雌馬酚(右圖）之各別的經時濃度變化。圖中，橫軸表示培養 時間(hr)，縱軸表示各物質的濃度(pg/mL)。 20 根據第4圖所示的結果，培養後，在第48小時黃豆苷元 濃度開始減少，中間體二氫黃豆苷元在第48-60小時出現， 從第48小時起可以確認到雌馬盼之生成。另外，在第6〇小 時從黃豆苷元變成雌馬酚的代謝幾乎已經結束。 從汽豆苷元變成雌馬酚的代謝雖然可以確認是經由中 37 1335353 間體二氫黃豆苷元的形態，但是推估二氫黃豆苷元之生成 和，由二氳黃豆苷元變成雌馬酚的代謝是同時並進的。 試驗例3 含有Lactococcus 20-92株之醱醏乳的彼！龙它枓 5 (1)試驗方法 將Lactococcus 20-92株以增殖用液體培養基(基礎培養 基)5mL，厭氣的條件下，在37〇c培養24小時後，對牛乳匕、 2L以及市售的SkimMilk(10%固形分）iL進行4%接種，好氣 條件下’在37 C靜置培養48小時。培養後，保存於4。〇。 10 對牛乳，在培養終了時，以及4t低溫保存後4週的期 間為止，每週都測定雌馬酚產生能（活性）。進一步從其中僅 取2支保存到第42日和第51日為止，並測定活性。 對Skim Milk，在培養終了時及4〇c低溫保存後第丨週與 第34曰，測定其活性。 15 培養開始前和在各保存時點的活性係準據前述方法， 將含有1 〇pg/ mL黃豆苦元的培養基5mL分別接種4% (〇 2mL) 到3支試樣中，於厭氣條件下在37它培養％小時後根據培 養基中之賀豆苷元、二氫黃豆苷元（中間體)及雌馬酚濃度進 行判定(積分化）。 20 (2)結果 結果示於第5圖。第5圖中橫軸所示為保存期間⑻，縱 軸表示積分。 根據圖中所示結果可知，有關牛乳無論^及几之任一 者於培養終了後’在低溫保存下到第4週為止雌馬盼產生能 38 1335353 (活性)都可以獲得維持。另外，在2L的牛乳中確認了檢討4 。(：保存安定性到第51天為止，活性都獲得維持。關於市隹 的Skim Milk 1L也於培養終了後，在4〇c低溫保存下加以檢 測，發現到第34天為止雌馬酚產生能（活性)都獲得維持。 5 根據以上結果，因為用Lactococcus 20-92株所調製之酿 酵乳即使在低溫保存下依然可以維持活性，所以從流通面 看也可以考慮對應做為食品。 根據上述試驗例1-4所獲得的結果，將Lact〇coccus 2〇_ 92株之增殖與雌馬酚產生能（活性）及雌馬酚產生量的關係 10 做一彙整，結果如第6圖所示。 亦即，依所使用的培養基而改變培養條件，雌馬紛產 生能（活性）無論在增殖期及恆定期都可以維持。另一方面， 有關雌馬酚的產生可以考慮是在恆定狀態以後經過某種程 度的時間’酵素出現或活性化而生成雌馬酚。 15 試驗例4 用Lactococcns on-cn,株調製之醱酵乳的胃液耐受性詖給 (1)试驗方法

將Lactococcus 20-92株在厭氣性菌增殖用液體培養基 (BHI Broth，基礎培養基)5 mL中，於厭氣條件下，在37°C 20 培養24小時後，把培養物（109個/g)4%接種混合到牛乳1L， 好氣條件下，在37。(：靜置培養48小時。培養後，用保存於4 °C的培養物做為醱酵乳，供進行以下試驗。

人工胃液係以含有0.045%胃蛋白（pepsin)之50mM甘胺 酸·鹽酸緩衝溶液(PH2.5及pH3.0)調製成。對照組則用50mM 39 1335353 甘胺酸·鹽酸緩衝溶液(pH6.0)調製成。 在所調製成之人工胃液9mL中添加保存在低溫的醱酵 乳lmL ’將混合物在37乞的恆溫槽，好氣條件下，以靜置 狀態進行培養。 5 培養時間定為1小時、2小時及3小時，在培養開始前與 各培養終了時分別做培養物O.lmL及0.2mL的取樣，測定各 試樣的菌數(O.lmL的情形）並供測定雌馬酚產生能（活性）之 用（0.2mL的情形）。 菌數測定係，依照前述試驗例1-(1)所記載的方法，對 10 培養後的培養物分別取O.lmL，用二v只彳公司製的pbs (-) 溶液稀釋成104、105、106及1〇7倍之後，把各稀釋液塗布在 GAM瓊脂培養基’好氣條件下在37。(：培養24小時，藉計測 在該GAM瓊脂培養基上所生育的菌落數來求得。 雌馬酚產生能（活性）的測定係，依照前述試驗例丨_(1) 15所記載的方法，將試樣0.2mL(4%)接種到含有黃豆苷元的基 礎培養基5mL(3支），厭氣條件下在37°c培養96小時之後， 由培養基中之黃立苷元、二氫黃豆苷元（中間體）及雌馬酴濃 度來進行判斷(積分化）。 (2)結果 20 所獲得的結果示於第7圖之A(生菌數測定結果）及b(雌 馬酚濃度）。 第7-A圖中，橫轴為培養時間（hr)，縱軸為生菌數(L〇g cfu/ml in milk)。 第7-B圖中，橫軸為培養時間（hr)，縱轴為雌馬紛活性 40 1335353 (積分）。 根據第7-A圖及第7-B圖所示的結果，判知以下情形 亦即，在pH6.〇的緩衝溶液中，生菌數到3小時為止都 在108個/mL，這個情形下，雌馬酚產生能（活性）也維持著、 5在ΡΗ3·〇的人工胃液中，生茵數直到培養3小時為止都可 維持，這個情形下，活性也獲得維持。另一方 在 ΡΗ2.5 的人工胃液中觀察到，從培養的第2小時開始，生菌數明顯 降低，活性也消失。 10 一般出現在市場上的益生菌（Probiotics)(活著到達腸内 且具有生理作用之微生物），已有報告指出，當以相同的試 驗系統進行檢討時，生菌數在pH3.0沒有變化，但是在pH 2 $ 則會顯著下降。因此，可以認定如果有pH3 〇的胃液耐為 性’就可以活著通過’所以用Lactococcus 20-92株調製成的 醱酵乳被認為可以活著到達腸内，並且在小腸下部或大腸 15 内維持活性。 試驗例5

Lactococcus 20-92棟之膽汁耐受性試驗 膽汁耐受性試驗係採用八彳干7夕G PI凝乳（日本匕、才y V二一股份公司），以在10%及40%膽汁中之本菌株生育性做 20 指標來進行判定。 (1)試驗方法 將Lactococcus 20-92株塗抹於加了 5 %羊血液之Tryp_ case soy壤脂培養基（108— 109個），在37°C進行好氣培養24 小時。對培養後之生育在培養基上的菌落進行釣菌，用〇 5% 41 1335353 滅菌食鹽水調製均質的懸浮液。將之加入八4于7々GPI凝 乳，在35t培養15小時後，用色素(pH指示劑）來判定本菌 株在膽汁存在下的生育性。另外，膽汁係將預定量之膽汁 粉末溶解於滅菌蒸餾水後，注入凝乳中備用。 5 (2)結果 上述試驗之結果顯示Lactococcus 20-92株在10%及 40%膽汁中有生育性。由這個結果確認了對40%的膽汁都有 财受性。 試驗例6 10 Lactococcus 20-92株之溶jk性試驗 (1) 試驗方法 將Lactococcus 20-92株塗抹於加了 5%羊血液之Tryp-case soy瓊脂培養基（108- 109個），在37°C厭氣的條件下 (N2 : C02 : H2=8 : 1 : 1)培養24〜48小時。觀察培養後之生 15 育在培養基上的菌落周圍，從血液成分的分解(脫色或變色） 判定溶血性。 (2) 結果 上述試驗的結果，因為在所生育的菌落周圍沒有觀察 到血液成分的脫色（透明且無色的區域之出現），所以可以判 20 定Lactococcus 20-92株沒有β溶血性，在這點上是安全的。 試驗例7

Lactococcus 20-92株之細胞浸潤性酵素活性試驗 所攝取的乳酸菌侵入生體内的情形中，腸管膜防禦機 能下降或膜本身的損傷被認為是在宿主側的要因。細菌侧 42 1335353 的要因則為具有結合脂質、蛋白，將構成腸管膜的蛋白多 糖(Proteoglycan)分解之酵素活性(細胞浸潤性酵素）。 此試驗係用來檢讨Lactococcus 20-92株是否具有做為 細胞改潤性酵素之膠原蛋白酶（C〇uagenase)(動物膠酶 5 (gelatinase))、玻尿酸酶（Hyaluronidase)及唾液酸酶（Siali-dase)(神經胺基酸酶(neuraminidase))活性，實施方法如下所 述。 (1) 試驗方法 將Lactococcus 20-92株塗抹於加了血液之瓊脂培養基 10 (塗抹量：1〇8·9個）’在37°C厭氣的條件下（n2 : C02 : H2=8 : 1 : 1)培養24〜48小時。 對培養後之生育在培養基上的菌落進行釣菌，使之懸 浮於滅菌蒸餾水以調製成均質的懸浮液。就所獲得之懸浮 液’以τ y >牛（日本匕才〆"2 一股份公司）同定套組，把 15動物膠之分解當做指標’判定有無膠原蛋白酶（動物膠酶） 活性。 另，Lactococcus 20-92株是否有玻尿酸酶及唾液酸酶 (神經胺基酸酶）活性的試驗係透過在分別以玻尿酸及唾液 酸(Sialic Acid)做為基質之Tris-HCl緩衝溶液(pH7.0)中培養 2〇 Lactococcus 20-92株(37°C，在好氣條件下就唾液酸酶活性 為15分鐘，就玻尿酸酶活性為24小時），並測定是否使各基 質濃度下降的方式來實施。 (2) 結果

Lactococcus 20-92株未顯示膠原蛋白酶(動物膠酶）、玻 43 1335353 尿酸酶及唾液酸酶(神經胺基酸酶）中之任一禮活性β 因此’本菌株由於缺乏成為感染性之1要因的細胞浸潤 性酵素，所以從感染性的面來看可以確認是安全性高的菌 種。 5 試驗例8 萬古黴素（vancomycin)射,Μ： g輪· 近年來細菌對於抗生物質會獲得耐受性（變異）已成為 問題。這種獲得對抗生物質之耐受性的細菌所感染的患 者，被認為就是因為無法得到抗生物質所造成之抗菌效 10果，故每每發生死亡的情形。尤其，針對抗生物質萬古黴 素的对性菌之出現，目前更是在醫療現場形成深刻的問 題。而，當被攝取到體内的微生物具有萬古黴素耐性遺傳 基因時’該微生物如果到達腸内並定著，一旦和毒性或感 染性菌種(病原菌）接觸，就會把萬古黴素耐性遺傳基因移轉 15給該病原菌’結果，造成病原菌獲得萬古黴素耐性的疑慮。 為此之故，可以被利用做為益生菌的生菌，至少該菌本身 必需不是萬古黴素耐性菌。 此試驗係用以檢討Lactococcus 20-92株之對於萬古黴 素的感受性，實施方式如下所述。 20 (1)試驗方法 對萬古黴素之感受性（敏感）試驗係使用Sensi-Disc(日 本Becton，Dickinson股份公司製）來實施。亦即，將Lactococ-cus 20-92株塗抹於GAM瓊脂培養基（塗抹量1〇8·9個），將含 有萬古黴素30pg之紙疑(disc)置於培養基上，在37°C進行好 44 1335353 氣培養24小時。培養後，測定形成於紙錠周邊的抑制圈直 徑，依判定表做判定。 (2)結果

Lactococcus 20-92株之抑制圈直徑為11.9±0.2mm，依判 5 定表被判定為有敏感性（10mm以上就判定為有敏感性）。根 據這個結果可以確認，本菌株並非萬古黴素耐性菌，因此， 在這一點上安全性是高的。 以下將舉實施例2說明利用本發明乳酸菌從黃豆苷元 製造雌馬酚的製造例。 10 實施例2 雌馬酚之製造 使Lactococcus 20-92株(BCRC 910268號（國際寄存編 號：FERM BP-10036))107~109個懸浮於厭氣性菌培養用的 GAM培養基，調製成液體lmL，將該液體加入豆乳100g(固 15 形分濃度約2.2%)，厭氣條件下在37°C培養72~96小時，以 HPLC法測定培養液中產生之雌馬酚量。另，上述豆乳中之 黃豆苷元類含量換算成黃豆苷元量為95gg/mL。 其結果，可以確認所獲得之豆乳培養物中，雌馬酚之 生成量為10.7±6.3pg/mL(3次的平均值土標準偏差）。 20 由以上說明可知，若利用本發明微生物，可以從食品 素材中之黃豆苷元類更有效率且價廉地製造雌馬酚。 L圖式簡單說明3 第1圖係依照試驗例1所示之方法求得的培養時間與生 菌數之關連性示意圖。 45 1335353 第2圖係依照試驗例1所示之方法求得的培養時間與雌 馬酚產生能（積分)之關連性示意圖。 第3圖係依照試驗例1所示之方法求得的培養時間與雌 馬齡產生能之關連性示意圖。 5 第4圖係依照試驗例2所示之方法求得的培養物中之黃 豆苷元類及雌馬酚的經時變化示意圖。 第5圖係依照試驗例3所示之方法求得的保存期間與雌 馬酚產生能（積分）之關連性示意圖。 第6圖係從試驗例1 - 3所示試驗求得之伴隨培養時間變 10 化的雌馬酚產生菌之狀態（增殖性、雌馬酚產生能及馬酚產 生量變化）的示意圖。 第7圖係依照試驗例4所示之方法求得的培養時間與生 菌數之關連性示意圖。 【圖式之主要元件代表符號表】 (無） 46

Claims (1)

1. 4 4 1335353 中”月ί日修(〆)正本 第93119028號專利申請案申請專利範圍替換本I-----明uM〇月一.~ 拾、申請專利範圍： 1. 一種含有產生雌馬酚之乳酸菌的組成物，其特徵在於： 含有已寄存為BCRC 910268號（國際寄存編號：FERM ΒΡ-10036)之乳酸球菌 20-92 菌株(Lactococcus 20-92)為 5 必要成分，該乳酸球菌20-92菌株具有以黃豆苷元類為 養分來產生雌馬酚的能力，且該黃豆苷元類係選自於由 黃豆苷元配糖體、黃豆苷元及二氳黃豆苷元所構成群組 中之至少1種物質。 2. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中乳酸球菌20—92菌 10 株係源自人類糞便。 3. 如申請專利範圍第1項之組成物，其更含有選自於由黃 豆苷元類及含有黃豆苷元類的物質所構成群組中之至 少1種物質。 4. 如申請專利範圍第3項之組成物，其中含有黃豆芽元類 15 的物質為大豆粉或豆乳。 5. 如申請專利範圍第3項之組成物，其形態為飲料或乳製 品。 6. 如申請專利範圍第3項之組成物，其更含有雌馬紛。 7. 如申請專利範圍第6項之組成物’其形態為豆乳醱酵物。 20 8. 一種雌馬酚之製造方法，其特徵在於：使具有以黃豆苷 元類為養分來產生雌馬紛之能力且已寄存為Bcrc 910268號（國際寄存編號：FERM BP-i〇〇36)之乳酸球菌 [S] 20-92菌株(Lactococcus 20-92)發揮作用，且該黃豆苦元 類係選自於由黃豆普元類及含有黃豆苷元類的物質所 47 1335353 構成群組中之至少1種物質。 9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中乳酸球菌20-92係源 自人類糞便。 10. 如申請專利範圍第8項之方法，其中含有黃豆苷元類的 5 物質為大豆粉或豆乳。 11. 一種已寄存為BCRC 910268號（國際寄存編號：FERM BP-10036)之乳酸球菌 20-92菌株(Lactococcus 20-92)，其 特徵在於：具有以黃豆苷元類為養分來產生雌馬酚的能 力，且該黃豆苷元類係選自於由黃豆苷元配糖體、黃豆 10 苷元及二氫黃豆苷元所構成群組中之至少1種物質。 12. 如申請專利範圍第11項之乳酸球菌20-92菌株，其係源 自人類糞便。 48