TWI354792B

TWI354792B - The method of stirring solution

Info

Publication number: TWI354792B
Application number: TW094108898A
Authority: TW
Inventors: Takii Yuki; Nagino Kunihisa; Nakamura Fumio; Nobumasa Hitoshi
Original assignee: Toray Industries
Priority date: 2004-03-23
Filing date: 2005-03-23
Publication date: 2011-12-21
Also published as: EP1729136B1; KR101148860B1; ES2382475T3; EP1729136A1; US20070178603A1; JPWO2005090997A1; WO2005090997A1; KR20070006746A; CN1934451A; TW200602639A; US8298832B2; CA2559768A1; ATE546738T1; CA2559768C; EP1729136A4; CN1934451B; JP4420020B2; DK1729136T3

Description

1354792 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】

本發明係關於一種溶液攪拌方法，其係使固定著和被檢物質會選擇性地結合之物質（於本說明書中稱為「選擇結合性物質」）之載體和含有被檢物質的溶液接觸，於固定於載體之選擇結合性物質與被檢物質進行反應之時，對含有被檢物質的溶液進行攪拌之方法。更具體而言，係關於用以促進固定於載體之選擇結合性物質與被檢物質之反應之對含有被檢物質的溶液進行攪拌之方法。【先前技術】各種生物之遺傳資訊解析之研究正展開著。以人類基因為代表之關於多數之基因及其鹼基序列、或基因序列所譯碼之蛋白質及由此等蛋白質二次’作成之糖鏈的資訊正快速地逐一被解開。序列已經解明之基因、蛋白質、糖鏈等之高分子的作用，可用各種方法加以調查。核酸主要係利用北方轉漬法（northern blotting)、或南方轉潰法 (s 〇 u t h e r n b 1 〇 11 i n g )之類的各種核酸/核酸間之互補性，可調查各種基因與其生物體機能表現之關係。蛋白質則可利用以西方轉漬法（western blotting)為代表之蛋白質/ 蛋白質間的反應，針對蛋白質之作用及表現進行調查。近年來，作為進行一次解析多數基因表現之手法，係著眼於被開發之所謂 D N A微陣列法（D N A 晶片法）的新分析法。此等方法係均基於核酸/核酸間之雜交（h y b r i d i z a t i ο η ) 反應之核酸檢測與定量法，原理上係與以往的方法相同。 6 312ΧΡ/發明說明書(補件)/94-0S/94 ] 08898

1354792 此等方法可應用於根據蛋白質/蛋白質間、糖鏈/糖鏈糖鏈/蛋白質間之特異反應所作的蛋白質或糖鏈之檢>: 量。此等技術係以使用於稱為微陣列或D N A晶片之玻面基板片上，高密度地整列固定有多量 DNA片段或質、糖鏈者為其重要特徵。DNA晶片法之具體使用法舉例如：讓經螢光色素等標識之研究對象細胞之表現等的試樣，於平面基板片上進行雜交，使互補的核酸或R N A )彼此結合，對其部位以高解析度檢測裝置（掃才高速地讀取之方法；或檢測依據電化學反應之電流值應答之方法。如此，則可迅速地推斷出試樣中之各基S 又，DNA晶片的應用範疇不只是推斷表現基因之量的表現解析，作為基因之單一核苷酸多型性（S N P)之檢測亦備受期待。作為使核酸固定於基板上之技術，已開發有在載玻平坦基板上塗覆聚-L -離胺酸、胺基矽烷等，使用所謂器（s ρ 〇 11 e r )之點著裝置將各核酸固定化之方法等（曰利特表平1 0 - 5 0 3 8 4 1號公報）。又，最近用於DNA晶片之核酸探針（probe)(固定於上之核酸），由於可降低與檢體雜交時之錯誤，且可藉成機輕易合成，故取代習知之數百〜數千验基長度之及其斷片，使用寡DNA(寡DNA係指鹼基數為10~100 者）。此時，寡DNA與玻璃基板係以共價鍵而結合（曰利特·開2 0 0 1 - 1 0 8 6 8 3號公報）。目前，DNA晶片係於晶片上載置數千至數萬種之多 3 ] 2XP/發明說明書(補件)/94-08/94108S98 間或丨丨J、定璃平蛋白，可基因 (DNA S儀）等之量。基因手段片等打點本專基板由合 cDNA 驗基本專數基 7 1354792

因，多用於一次調查大量基因之表現的研究用途。今後，於診斷用途上，DNA晶片之使用亦受到期待。於將DN A晶片使用於診斷之場合，通常預設可採取之檢體量為非常少。由於現行的DNA晶片之感度不足，故此種檢體的測定被預想為不可能。再者，以目前之DNA晶片，低表現量的基因於雜交後之螢光強度非常微弱，此等基因具有實質上無法解析之問題。從而，以現行之D N A晶片，於檢體量少的情況或表現量少的基因的情況下，如何使雜交後的螢光強度增大，係為其課題所在。為解決此課題，如何使檢體 D N A與探針D N A有效率地反應係為關鍵所在。作為使檢體 DNA與探針DNA有效率地反應的方法，由於藉由檢體之自然擴散並不充分，故考慮將溶液攪拌以促進探針與檢體之間有效率地反應。作為攪拌檢體溶液的例子，於日本專利.特開 2 0 0 3 - 2 4 8 0 0 8號公報 '特開2 0 0 3 - 3 3 9 3 7 5號公報中，曾揭示藉由磁力使磁性珠粒在檢體溶液中移動而攪拌檢體溶液，以提高與檢體之反應效率的方法。又，於特開 2 0 0 3 - 3 3 9 3 7 5號公報中，揭示有使混合有珠粒之檢體溶液與D N A晶片接觸，將溶液以玻璃蓋片（c 〇 v e r g 1 a s s )密封，藉由旋轉晶片，使珠粒朝重力方向落下而攪拌檢體溶液，以使雜交後之訊號增大的方法。然而，於日本專利特開 2 0 0 3 - 2 4 8 0 0 8 號公報與特開 2 0 0 3 - 3 3 9 3 7 5號公報中所揭示之方法，有以下之問題點。亦即，於一般使用平板狀之D N A晶片、以通常之玻璃蓋 8 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898 1354792

片將檢體溶液密封之場合，玻璃蓋片與DNA晶片之間隙約為1 0 // m的程度。因而，當混合較此大的微粒子時，微粒子會夾在DNA晶片與玻璃蓋片之間，微粒子無法移動，以致無法發生效果之問題點。再者，於大小為數# m程度之微粒子，即使欲以重力等使微粒子移動，由於溶液之阻力， . 微粒子於檢體溶液中無法充分移動，而無法充分發揮攪拌的效果之問題點。又，即使以重力使微粒子移動，推斷微粒子與固定有DNA探針之載體的面相接觸亦為無法得到充 ® 分之特性的原因。又，亦有用0環等使玻璃蓋片與DNA晶片之間距加大，令用以攪拌的微粒子加大，藉由重力或磁力使反應液中之微粒子移動而攪拌溶液的方法。然而，由於用以密封的玻璃蓋片與DNA晶片之兩方皆為平坦形狀，故微粒子亦會在固定著DNA探針的部分移動。因此，微粒子會傷及固定著探針D N A的部分，因於該損傷會導致數據解析之障礙，或由於微粒子傷及探針固定面而導致探針剝落，使得訊號強度反而變弱之問題點。【發明内容】本發明為一種溶液攪拌方法，其係使固定於載體表面之選擇結合性物質，和含有與該選擇結合性物質反應之被檢物質的溶液接觸，對該溶液進行攪拌者；其係在含有被檢物質的溶液中混合微粒子或氣泡，使微粒子或氣泡於不與選擇結合性物質的固定面接觸之下移動而攪拌溶液的方法。【實施方式】 9 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898 1354792 以下，就本發明之攪拌方法進行說明。本發明之第1之溶液攪拌方法，係使固定於載體表面之選擇結合性物質，和含有與該選擇結合性物質反應之被檢物質的溶液接觸，對該溶液進行攪拌者；其係在含有被檢物質的溶液中混合微粒子或氣泡，使微粒子或氣泡不與選 . 擇結合性物質的固定面接觸而移動攪拌溶液。於本發明之第1之溶液攪拌方法中，必須藉由在含有被檢物質之溶液中混合微粒子或氣泡並使微粒子或氣泡移動 _而攪拌溶液。再者，於本發明之第1之溶液攪拌方法中，係使微粒子或氣泡於不與選擇結合性物質的固定面接觸之下移動而對溶液進行攪拌。藉由限制微粒子或氣泡之移動區域，可防止因微粒子觸及探針固定面而使此面受到微粒子或氣泡之傷害。

較佳為使用微粒子或氣泡不會與選擇結合性物質之固定面接觸的構造之載體。並以於載體設置凹凸部、且於凸部上面固定選擇結合性物質為佳。又，以使用微粒子或氣泡不會與選擇結合性物質的固定面接觸之構造之保持溶液的容器為佳。再者，於本發明之第2之溶液攪拌方法中，係使固定於載體的凸部上面之選擇結合性物質，和含有與該選擇結合性物質反應之被檢物質的溶液接觸，對該溶液進行攪拌者；其係在含有被檢物質的溶液中混合微粒子或氣泡，使微粒子或氣泡移動而攪拌溶液。 10 3 ] 2XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898 1354792 於本發明之第1之溶液攪拌方法及第2之溶液攪拌方法中，係用氣泡或微粒子。若以氣泡與微粒子進行比較，藉由選擇大小與材料而可容易控制比重的觀點而言，本發明之第1之溶液攪拌方法、及第2之溶液攪拌方法皆以使用微粒子為佳。

於本發明之溶液攪拌方法中，微粒子之大小（微粒子之最大徑）以1 0 /z m以上為佳。微粒子之大小若小於1 0 // m，則有幾乎無法得到藉由微粒子攪拌之效果的情況。其理由在於，微粒子之大小若小於 1 0 # m，由於溶液之P且力，即使施加外力（磁場、重力或振動）微粒子亦幾乎不會移動。微粒子尤以2 0 /z m以上為特佳。於本發明之溶液攪拌方法中，可使用任何形狀之微粒子。特佳為微粒子的形狀為球狀，亦即珠粒。微粒子若為珠粒，藉由其本身進行旋轉，可在反應液中不停滞地順暢地移動，其結果係可良好地進行檢體溶液之攪拌故為較佳。作為微粒子的形態，最佳為可用直徑為2 0 // m - 3 0 0仁m 的球狀微粒子（珠粒）。珠粒的直徑若於此範圍内，由於珠粒本身的重力，即使有反應液之阻力，亦可容易地藉由重力或加速度等使珠粒在液中移動，可充分地進行液體的攪拌，故可得到良好的結果。本發明之溶液攪拌方法中，作為微粒子之材質並無特別限定。微粒子之材質可用金屬、玻璃、陶瓷、聚合物（聚苯乙烯、聚丙烯、尼龍等）。此等之中，若為比重較水大的材質（玻璃、石英、二氧化鍅陶瓷）之珠粒，由於藉由重力或 11 3] 2XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898 1354792 振動所產生之加速度等而可容易地在液中移動，故為較佳。又，亦可使用磁性珠粒。尤其是由二氧化锆陶瓷所構成的磁性珠粒，由於比重大，故藉由重力或振動所產生之加速度可容易地使珠粒移動，故為最佳使用者。另外，由於玻璃、石英、二氧化锆陶瓷在檢體溶液中珠粒成分之溶出少，故為較佳。

由二氧化鍅陶瓷（氧化釔安定化二氧化鍅）所構成的珠粒，密度為6g/cm3，與石英玻璃之2.2 g/cm3相較之下為大，故更可發揮攪拌效果，對於以容器密封時之溶液的移動，珠粒亦較少上揚舞動，故較容易進行設定，而為特佳。於本發明之溶液攪拌方法中，較佳為使微粒子移動以攪拌溶液。於本發明之溶液攪拌方法中，更佳為藉由重力、磁力、載體之振動之任一者、或此等之組合使微粒子移動。其中，使載體沿著垂直面旋轉，藉由重力使珠粒移動的方法，由於可簡便地實施，且可得到充分的效果，故為較佳。此時之旋轉速度以 0.1rpm~30rpm為佳。旋轉速度若超過 3 0 r p m，貝，1微粒子於朝一方向上未完全移動時，將有對微粒子施加相反側之重力的情況。亦即，會使微粒子在檢體溶液中之來回運動的距離減小，致使攪拌的效果無法充分發揮。又，若旋轉速度較0 . 1 r p m慢，則液中之微粒子之移動的總時間會變短，結果由於檢體溶液之攪拌的時間變短，故無法得到充分的效果。有鑑於上述諸點，旋轉速度之更佳範圍為 0.5rpm~5rpni。藉由使載體左右振動並施加加速度，使溶液中的微粒子移動，亦為較佳之可行方法。 12 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94丨08898 1354792 於本發明之溶液攪拌方法中，以使用保持溶液之容器為佳。再者，於本發明之溶液攪拌方法中，更佳為藉由使微粒子移動以攪拌溶液，且微粒子之最小寬度較選擇結合性物質的固定面與保持溶液的容器之間的最短距離更大。於本發明之溶液攪拌方法中，較佳為微粒子之最大寬度 . 為lOem以上、凸部上面與凹部的高度差以下之間。於本發明之溶液攪拌方法中，較佳為藉由使微粒子移動以攪拌溶液，並於載體上設置凹凸部，且於凸部上面固定 ® 選擇結合性物質，使微粒子於凹部移動。於本發明之溶液攪拌方法中，較佳為於載體設置平坦部與凹凸部，於複數的凸部上面固定著選擇結合性物質，該凸部上面的高度為大致相同，且平坦部分與凸部上面的高度差為50//m以下。再針對固定有選擇結合性物質的載體之較佳形狀進行敘述。

本發明之攪拌方法中所用之固定有選擇結合性物質的載體，以設有凹凸部、並使選擇結合性物質固定於凸部上面為佳。藉由作成為如此之構造，於檢測時，由於不會檢測出非專一性地吸附之檢體，故雜訊少，結果可得到更良好的 S/N 之結果。雜訊之所以會減小之具體理由係如下述。亦即，對選擇結合性物質固定於凸部上面之載體，以所謂掃描器的裝置進行掃描，則雷射光的焦點會聚集在凹凸部之凸部上面，故雷射光不聚焦於凹部，而有不易檢測到非專一性地吸附於凹部之檢體的未達所需量之螢光（雜 13 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898 1354792 訊）的效果。有關凹凸部之凸部的高度，以各凸部上面的高度為大致相同為佳。此處，所謂「高度為大致相同j，係指在高度有若干差異的凸部表面固定選擇結合性物質，使其與有螢光標示之被檢體進行反應，再以掃描器掃描時，其訊號水準之強度差不致於有問題的高度。具體而言，所謂之「高度為大致相同」，係指高度差小於 5 Ο μ m。以高度差小於 30 /zm 以下為更佳，尤以高度為相同更佳。又，於本申請案 # 中所謂之相同的高度，係包含生產等所會發生的誤差。最高的凸部上面的高度與最低的凸部上面之高度差若大於 5 0. # m，於高度偏離之凸部上面之雷射光將不易聚焦，則與固定於此凸部上面之選擇結合性物質進行反應之檢體所發出的訊號強度會變弱。尚且，凸出部分的上面，以實質上為平坦者為佳。此處，所謂之「凸部上面實質上為平坦者」，係指凹凸未超過 20 /z m以上。

再者，於本發明之攪拌方法中所用之載體，以設置有平坦部為佳。凹凸部的凸部的上面之高度以大致相同為佳。亦即，平坦部的高度與凸部上面的高度差以5 0 /z m以下為佳。凸部上面的高度與平坦部的高度差若為5 0 μ m以上，則可檢測之螢光強度會較弱。更佳為3 0 // πι以下，最佳為平坦部的高度與凸部的高度為相同。本發明之攪拌方法中所用之載體的具體例，係例示於圖 3、圖4。於凹凸部的周圍有以1 1表示之平坦部，且於以 14

312XP/發明說明書(補件)/94-08/94 ] 0889S 1354792 12 表示之凹凸部的凸部上面固定著選擇結合性物質（例如核酸）。使用此平坦部，可容易對焦於凸部的上面。亦即，於發光之焦點對焦時，如圖5所使雷射光的焦點預先調整於此使本發明之攪拌方法中所用的面，可容易地使雷射光的焦點於本發明之溶液攪拌方法中 #物質的載體之選擇結合性物質作為數據所必要的選擇結合性分，須排除僅為假性的選擇結於本發明之溶液攪拌方法中物質之載體係凸部的上面之面上面之面積為大致相同，多種部分之面積可成為相同，故有謂「凸部的上部之面積為大致

的上面面積除以最小的上面面於本發明之溶液攪拌方法中載體，其凸部的上面之面積並物質的量可較少與容易處理之 μ m2以上為佳。於本發明之溶液攪拌方法中凸部的高度以1 0 # m以上、5 0 理由，以5 0 # in以上、3 0 0 m 地使掃描器之激發光的焦點掃描器在載體的表面進行激示般，大多使載.體抵住夾具，夾具之抵接面的高度。藉由載體之平坦部抵接住夾具的對焦於載體的凸部上面。，所謂「固定著選擇結合性所固定之複數的凸部」，係指物質（例如核酸）所固定的部合性物質之固定部分。，較佳為固定有選擇結合性積為大致相同。藉由凸部的之選擇結合性物質之固定的利於後續的解析。此處，所相同」，係指於凸部中之最大積所得之值為1 . 2以下。，固定有選擇結合性物質之無特別限定，就選擇結合性觀點而言，以1 m m2以下' 1 0 ，較適用之載體的凹凸部之 0 # m以下為佳。基於後述之以下為特佳。凸部的高度若 15 312XP/發明說明書(補件)/94-0S/94 ] 0S898

1354792 較此為低，則焦點之外的部分之非專一性吸附之檢體亦會被檢測，結果會使S / N變差。又，凸部的高度若肩 # m以上，則易發生凸部折斷破損等之問題。於本發明之第1之溶液攪拌方法中，對微粒子或氣移動區域有所限制。針對用於確實地實現此點之具體持載體及溶液的容器的形狀，以圖1為例加以說明。圖1中，1表示探針D N A (選擇結合性物質）。又，2 粒子（此場合為珠粒），3為固定著探針D N A之載體。此 2、3係接觸含有標的D N A (被檢物質）之溶液。又，4 如載玻片、玻璃蓋片、或由金屬、塑膠等材質所構成持液體之容器，含有標的DNA之溶液係保持在此容器體之間。於圖1之例中，探針DNA係固定於載體之ώ 載體之凸部上面（固定著選擇結合性物質的面）與保持液的容器之最短距離為未滿微粒子之直徑，形成不會粒子與固定著探針DNA的面接觸之狀態，防止微粒子此面。於微粒子為例如橢圓形的情況，若凸部上面與之最短距離未滿微粒子之最小寬孝，則可防止探針固與微粒子或氣泡之接觸。作為具體地實現圖1之狀況的方法，係在呈現凹凸的載體上，滴下含有檢體D Ν Α之溶液（檢體溶液），以微粒子附著於凸部上面之方式將微粒子置入該液中後，覆蓋上與容器相當之玻璃蓋片，將其周圍以黏著賴或接著劑等予以密封，以不使檢體溶液外溢或蒸發。如於玻璃蓋片的面與凸部上面之間可以有數// m〜數十// 312XP/發明說明書(補件)/94-0S/94108S98 試料 ,500 泡之之保為微等卜為例之保與載部° 著溶使微傷及容器定面形狀不使 » 狄 l帶、 I il 匕， m 程 16 1354792 度之填充檢體溶液的空間。微粒子之大小若較玻璃蓋片的面與凸部上面之間為大，則微粒子不會傷及凸部上面。藉由使用此等形狀的載體，使載體在垂直的面内旋轉等，微粒子只會在凹凸部的凹部移動，可使微粒子在不觸及凸部上面之狀態下對檢體溶液進行攪拌。為了使凸部上面與容器之間可確實地有注入檢體溶液的空間，較佳為例如：準備板面的角落較其他的面高出5/zm~100//m的板；或中央部凹入5 # m〜1 0 0 # m的板；使此板的中央部、與固定著選 Φ 擇結合性物質的載體之凹凸部相抗衡的方式嵌合。此板之例子係表示於圖1之4。欲製作如此之容器，例如可於使玻璃以氟酸處理之平板之2〜4邊貼上薄膜或黏著膠帶；或以射出成形等製作圖1之4之形狀的板；或以網版印刷在板的角落印刷上隆起狀等。於本發明之溶液攪拌方法中，較佳為使用保持微粒子或氣泡不會與選擇結合性物質的固定面接觸之構造之溶液的容器。

圖1中之載體具有凹凸形狀。藉由在保持溶液之容器設置凹凸形狀，亦可得到相同的效果。其具體例表示於圖2。此場合，係於容器的凸部之下配置探針 DNA。此場合，固定著探針DNA的面與容器凸部之距離若亦未滿微粒子之最小寬度即可。作為其他之具體例，可舉出載體與容器之兩方的構造皆作成為凹凸構造者。使用如上述之設置有凹凸部之載體或設置有凹凸部之容器，若藉由微粒子對含有標的 DNA的檢體溶液進行攪 17 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94〗OS898

1354792 拌，可發揮下述之效果，結果，於雜交後之螢光強度知技術之強度更強。亦即，以一般的平板狀的DNA晶片覆蓋上玻璃蓋片雜交的場合，玻璃蓋片與DNA晶片之間隙，最高也約 "m 的程度。即使混合較此大的微粒子，微粒子會被 .DNA晶片與玻璃蓋片之間，使得微粒子無法移動，導失混合微粒子之效果的問題。另一方面，為避免此問混合不會被夾在玻璃蓋片與 DNA晶片之間的直徑為j ® 程度之微粒子，即使欲藉由重力或振動之加速度使微移動，由於微粒子較小，故會承受到較大的溶液阻力使微粒子無法在檢體溶液中充分地移動。因而，發生子之攪拌效果無法充分發揮之問題。又，若用0環等璃蓋片與載體之間距加大，並將用以攪拌的微粒子加欲進行充分之攪拌，則會因微粒子而傷及晶片表面，斷因微粒子衝擊到探針之固定面而使探針脫落，故有交後之螢光強度不夠強之問題點。如本發明之較佳實施形態，若使用設置有凹凸部體、或設置有凹凸部之容器，如圖1或圖2所示般，子的大小至少可加大至由凹凸部的凹部至凸部的高度而，使用設置有凹凸部的載體、或設置有凹凸部之容利用微粒子對含有標的DNA的檢體溶液進行攪拌，則較大的微粒子可對檢體溶液充分進行攪拌，並且不會探針DNA的固定面，可得到較佳效果。於本發明之溶液攪拌方法中，較適用的容器之材質 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94108S98 較習進行為10 夾在致喪題， t β m 粒子，致微粒使玻大而或推於雜的載微粒。因器，藉由傷及並無 18

1354792 特別限定。本發明中，作為較適用的容器之材質，可如玻璃或塑膠等。於容器之形狀為平板的場合，較佳用玻璃蓋片或載玻片等之玻璃製的板，另一方面，於的形狀為凹凸形狀的場合，就可進行射出成形之生產面而言，較佳為聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯等之塑 . 料。本發明中使用之載體的材質並無特別限定。於本中，較適用之載體的材質為玻璃或各種聚合物（聚苯乙 Φ 聚曱基丙烯酸曱酯、聚碳酸酯）。為使選擇結合性物質固定，於載體的材質為玻璃合，可藉由矽烷耦合處理在表面生成官能基，能以此使D N A等之選擇結合性物質固定於載體上之據點。例使用胺基烷基矽烷等在玻璃表面生成胺基，於 DNA 合，藉由此胺基之正電荷與DNA之負電荷則可藉由靜而固定。於本發明中，尤其是用以使選擇結合性物質固定之表面，若為具有含由下述通式（1)表示之構造單位的聚之固體時，雜交後之訊號會變得較大，故為較佳。 R1 CH,-C- C=0

I

X t R2 (通式（1)之R1、R2、R3表示烷基、芳基或氫原子。）作為含有以通式Π )表示之構造單位的聚合物，可 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94 ] 08898 舉例可使容器性方膠材發明稀、之場作為如，的場電力載體合物 ⑴ X=0, NR3, CH2 使用 19 1354792 單一聚合物或共聚合物。前述聚合物係使用至少1種類的單體作為原料，該單體係以下述形態存在：可參與聚合之雙鍵、及可參與聚缩合之官能基、以及酮或羧酸或其等之衍生物的形態。又，前述聚合物以具有通式（1 )之構造為更佳。 . 於含有以通式（1)表示之構造單位之聚合物為共聚合物的場合，較佳為含有以通式（1 )表示之構造單位佔全部單體單位的1 0 %以上為佳。以通式（1 )表示之構造單位的含有量 Φ 若為1 0 %以上，由於藉由後述說明般的步驟可在表面生成多量之羧基，而可將多量的探針核酸固定，結果s / N可更為提尚。於本發明中，所謂「聚合物」，係指數量平均聚合度為 50 以上者。此數量平均聚合度之較佳的範圍為 1 0 0〜1 0 0 0 0。尤以2 0 0以上、5 0 0 0以下為特佳。又，數量平均聚合度可用 G P C (凝膠滲透層析）以既定方法測定聚合物之分子量，容易地測定。

於通式（1)中，R1及R2表示烷基、芳基或氫原子，可分別為相同或不同。前述烷基可為直鏈狀或分枝狀，以具有卜2 0個碳為佳。前述芳基以具有6 ~ 1 8個碳為佳，而以6〜1 2 個碳為更佳。官能基X可任意選自0、NR3、或CH2之中。 R3為與前述R1及R2之相同定義的官能基。於本發明中，用以使選擇結合性物質固定之載體表面的聚合物，以含有官能基之聚合物為佳。含有官能基之聚合物中，較佳者為例如：聚甲基丙烯酸曱SI ( Ρ Μ Μ A )、聚曱基 20 312XP/發明說明書(補件)/94-0S/94108898

1354792 丙烯酸乙酯（PE Μ A)或聚甲基丙烯酸丙酯之聚甲基丙烯酯（P A Μ A )等。此等之中，尤以聚甲基丙烯酸甲酯為特再者，亦可用聚醋酸乙烯、聚甲基丙烯酸環己酯或聚丙烯酸苯基酯等。又，亦可使用由前述聚合物之構成所組合之構造的共聚合物，或於前述聚合物之構成要加上其他之一種或多種之聚合物之構成要素的構造之合物。作為前述其他的聚合物係為聚苯乙烯。於聚合物為共聚合物的場合，各構成要素之比的範 Φ 較佳為含有羧基的單體（例如，曱基丙烯酸烷酯）之比 10 莫耳％以上。藉由如此規定，由於可在表面生成多羧基而可使多量的探針核酸固定，故其結果可更提高比。聚合物的構造單位之中，該單體之更佳比例為50 %以上。為了在包含具有至少有 1個以通式（1)表示之構造之聚合物的載體上使選擇結合性物質固定，以對其施處理，在載體表面形成羧基為佳。作為在載體表面形基之手段，可舉饷：以酸、鹼等處理之外，在溫水中音波處理、使載體暴露於氧氣電r、氬氣電漿、放射方法等，從對載體之損傷較少且容易施行的觀點而言將載體浸潰於鹼、或酸中使其在表面生成羧基為佳。具體例，可使載體浸潰於氫氧化鈉或硫酸之水溶液（較濃度為1 N〜2 0 N )中，較佳為設定在3 0 °C ~ 8 0 °C的溫度、 1小時~ 1 0 0小時。作為聚合物，亦可使用具有酸酐單位之熱塑性共 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898 酸烧佳。甲基要素素再共聚圍，例為量的 S/N 莫耳單位以前成羧之超線的 , 以作為佳之· 保持聚合 21 1354792 物。此熱塑性共聚合物，以具有（i )酸酐單位為佳。此謂「（ i )酸酐單位」，係存在於（A )熱塑性共聚合物之主側鏈的骨架中或末端的單位。作為（i )酸酐單位的構这無特別限fil ，可舉例如：（甲基）丙烯酸酐單位、戊二單位、順丁烯二酸酐單位、衣康酸酐單位、焦檸檬酸位、烏頭酸酐單位等，以順丁烯二酸酐單位、戊二酸位為佳，其中，更佳者為以下述通式（2)表示之戊二酸處所鏈或，並酸酐酐單酐單酐單位。

(2) (上述式中，R4、R5表示相同或不同之氫原子或碳數1· 烧基）。熱塑性共聚合物之構造，只要含有（i )酸酐單位即並無特別限制，較佳為具有以下述通式（3 )表示之（i i ) 和羧酸單位者。 -5之可，不飽

平6 \ CH2—C-coo^/ ⑶ (其中，R6表示氫或碳數1〜5的烷基）。此處所謂「（ i 飽和羧酸單位」，係指使不飽和羧酸單體藉由共聚合所單位，作為此時所用之不飽和羧酸單體並無特別限制 i )不得之，可 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898 22 1354792 與其他的乙烯化合物進行共聚合之任何不飽和羧酸單體皆可使用。作為較佳之不飽和羧酸單體可舉出以下述通式（4) ch2 二 c (4)

COOH .(其中，R6表示氫或碳數1~5的烷基）表示之化合物、順丁烯二酸、以及順丁烯二酸酐之水解物等，.就熱安定性優異的方面而言，以丙烯酸、曱基丙烯酸 Φ 為佳，而以甲基丙烯酸為更佳。此等可使用1種或至少2 種。 (A )熱塑性共聚合物只要是含有（i )酸酐單位即可，並無特別限制，較佳者為具有以下述通式（5 )

(其中，R7表示氫或碳數1〜5的烷基，R8表示碳數1~6之脂肪族或脂環型烴基或1個以上6個以下之羥基或以鹵素取代之碳數1 ~ 6的脂肪族或脂環型烴基）表示之（i i i )不飽和羧酸烷基酯單位者。此處所謂之「（ i i i )不飽和羧酸烷基酯單位」，係使不飽和羧酸烷基酯單體藉由共聚合所得到之單位，此處，作為不飽和羧酸烷基酯單體並無特別限制，較佳的例子可舉例如以下述通式（6)表示者。 23 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94 ] 08898 1354792 R7 cn2—c (6) COOR8 於載體的表面，只要有羧基或酸酐，則可使具有胺基或羥基之選擇結合性物質在載體表面以共價鍵固定。於載體表面有羧基的場合，為了助長此等之鍵合反應，係使用二環己基碳化二醯亞胺、N -乙基-5 -苯基異。号唑啉-3 ’ -硫酸鹽等之各種縮合劑。此等之中，尤其是1 -乙基-3 - ( 3 -二曱 Φ 基胺基丙基）碳化二醯亞胺（E D C )，由於毒性小，且比較容易自反應系除去，故對於選擇結合性物質與載體表面的羧基之縮合反應為最有效的縮合劑之一。此等EDC等之縮合劑，可與選擇結合性物質之溶液混合使用，亦可使表面生成有羧基的載體先浸潰於EDC的溶液中，再使表面的羧基活性化。縮合劑係以與選擇結合性物質的溶液混合使用之方式，可提高反應產率，並可使多量的選擇結合性物質固定於載體上，為較適用者。

使用此種縮合劑，使載體表面之羧基與選擇結合性物質之胺基進行反應的場合，藉由醯胺鍵使選擇結合性物質固定於載體表面；於載體表面之羧基與選擇結合性物質之羥基反應的場合，藉由酯鍵合使選擇結合性物質固定於載體表面。含有選擇結合性物質之試料與載體作用時的溫度，以0 °C ~ 9 5 °C為佳，而以1 5 °C〜6 5 °C為更佳。處理時間通常 » 為5分鐘〜2 4小時，以1小時以上為佳。另一方面，於表面有酸酐存在的聚合物之場合，可加入 24 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898 1354792

上述之縮合劑，不加入亦可的胺基之間可進行共價鍵合如此般，藉由使選擇結合抑制非專一性之檢體吸附，地使選擇結合性物質固定，定的選擇結合性物質之空間之雜交效率高的載體。於含有由通式（η或通式 Φ 製作載體之場合，與玻璃、用射出成形方法或熱壓花（h 大量生產設置有微細的凹凸法，由於容易大量生產，故於本發明中，使用之較佳在聚合物表面使選擇結合性檢體吸附，並以共價鍵可強物質固定。再者，由於與玻合性物質之空間自由度較高高的載體。藉由上述方法得到之選擇擇結合性物質固定後施行適鹼處理、界面活性劑處理等改質。選擇結合性物質固定載體固定於載體之選擇結合性物，例如，於與選擇結合性物質〇性物質固定於聚合物表面，可且以共價鍵可強固地且高密度再者，推斷與玻璃相比，經固自由度較高，故可得到與檢體 (2 )表示之構造單位的聚合物陶究 '金屬等相比較，藉由使 ot emboss)法等，可更簡單地形狀之載體。尤其是射出成形為較佳。的載體，利用前述方法，藉由物質固定，可抑制非專一性之固地且高密度地使選擇結合性璃相比，推斷經固定的選擇結，故可得到與檢體之雜交效率結合性物質固定載體，可於選當的處理。例如，藉由熱處理、亦可使固定之選擇結合性物質，通常為使螢光標識之檢體與質進行雜交反應，以稱為掃描 25 312XP/發明說明書(補件)/94-08/9410S8卯

1354792 器之裝置讀取螢光。掃描器係以屬於激發光之雷射光鏡聚焦而使雷射光聚光。然而，於自載體表面產生本螢光之場合，其發光會成為雜訊致使檢測精度降低。止此情況，欲減低自載體本身發出之螢光，較佳為使通式（1 )或通式（2 )的構造單位之聚合物顯現黑色，或 . 含有以雷射照射不會產生發光的物質而使表面成為黑藉由使用此種載體，於檢測之時可減低自載體本身所的螢光。黑色的載體係雜訊小，結果可成為S/N比良 # 固定著選擇結合性物質之載體。此處，所謂「載體為黑色」者，係指於可見光（波 400nm〜800nm)範圍中，載體之黑色部分的分光反射率有特定之光譜圖形（特定的波峰等），為同樣的低值，體的黑色部分之分光透過率亦無特定的光譜圖形，為的低值。於本發明中，載體之較佳者為，可見光（波 400nm〜800nm)的範圍之分光反射率為7%以下，同波長之分光透過率為2%以下。此處，所謂之分光反射率係適合於J I S Z 8 7 2 2條件C之照明、受光光學系之下，體得到正反射光的場合之分光反射率。於本發明中，作為使載體成為黑色之方法，可藉由體含有黑色物質而達成，黑色物質之較佳者，可舉例碳黑 '石墨、欽黑、苯胺黑' R u、Μ π、N i、C r、F e、 C u之氧化物、S i、T i、T a、Z r及C r之碳化物等之黑質。此等黑色物質中，以含有碳黑、石墨、鈦黑為佳 3】2XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898 以物身的為防具有使其色。發出好之長為不具且載同樣長為範圍指在自載使載如： :〇及色物 ’尤 26 1354792 其特佳者可使用碳黑。此等黑色物質可單獨含有，亦可混合至少2種而含有。

於本發明中，作為載體之形狀，若在由玻璃、金屬等之不易熱變形的材料所構成的支持體上，設置由具有至少1 個以通式（1 )表示之構造單位之聚合物所構成之選擇結合 . 性物質固定層，則可防止受熱或外力所致之載體的形狀變化，故為較佳。此概念之一例係表示於圖 6。作為支持體層，以聚丙烯、玻璃、鐵、鉻、鎳、鈦、不銹鋼等之金屬 Φ 為佳。又，為使此支持體層與選擇結合性物質固定層之密合性良好，以對支持體層的表面施行以氬氣、氧氣、氮氣之電漿處理或施行以矽烷耦合劑之處理為佳。作為此種矽烷耦合劑，可舉例如：3 -胺基丙基三乙氧基矽烷、3 -胺基丙基三甲氧基石夕坑、3_胺基丙基二乙氧基曱基石夕烧、3_(2_ 胺基乙基胺基丙基）三曱氧基矽烷、3-(2 -胺基乙基胺基丙基）二甲氧基甲基矽烷、3 -硫醇基丙基三甲氧基矽烷、二甲氧基-3-硫醇基丙基曱基石夕坑等。作為在支持體層上設置選擇結合性物質固定層之手段，可使用使聚合物溶解於有機溶劑中，進行旋塗或浸潰等之公知手段。更簡單者，可用接著劑黏合於支持體層上。於本發明中，所謂「選擇結合性物質」，係指可和被檢物質直接或間接.地進行選擇性結合的物質，作為代表例，可舉例如：核酸、蛋白質、糖類及其他之抗原性化合物。作為「選擇結合性物質」，特佳者為核酸。核酸，可為 DNA或RNA，亦可為PNA。具有特定之鹼基序列之一條鏈核 27 312XP/發明說明書(補件)/94-08/9410S898 1354792 酸，可和具有與該鹼基序列或其一部份為互補的鹼基序列之一條鏈核酸進行選擇性的雜交而結合，故相當於本發明中所謂的「選擇結合性物質」。又，作為蛋白質，可舉例如：抗體及F a b片段或F ( a b ’ ）2

片段之類的抗體之抗原結合性斷片、及各種抗原。抗體及其抗原結合性斷片，會與對應的抗原選擇性地結合，由於抗原會與對應的抗體選擇性地結合，故係相當於「選擇結合性物質」。作為糖類，以多糖類為佳，可舉例出各種抗原.。又，亦可使蛋白質或糖類以外之具有抗原性的物質固定。本發明中所用之選擇結合性物質，可為市售者，亦可為由生物細胞等所得到者。本發明中所用之選擇結合性物質，以核酸為佳，核酸之中，特別是稱為寡核酸之長度為10鹼基至10 0鹼基的核酸，由於其可使用合成機容易地進行人工合成，且核酸末端之胺基修飾容易，故容易固定於載體表面，而為較佳。再者，若由未滿2 0鹼基則雜交之安定性低的觀點考量，以 2 0 ~ 1 0 0 鹼基為更佳。為保持雜交的安定性，尤以 4 0 ~ 1 0 0 鹼基的範圍為特佳。於本發明之溶液攪拌方法中，作為被檢物質之欲測定的核酸，可舉例如：病原菌或病毒等之基因、遺傳疾病之原因基因等及其一部份、具有抗原性之各種生物體成分、對病原菌或病毒等之抗體等，惟並非限定於此等。於本發明之溶液攪拌方法中，作為含有此等被檢物質之 28 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898 1354792 溶液釋萃 .(t 核合 Φ物存物藉體體對

質互與原通疫數液，可舉例如：血液、血清、血漿 '尿液 '糞便 '脊髓、唾液、各種組織液等之體液 '各種飲食物及其等之稀物等，惟並非限定於此等。作為被檢物質之核酸，可對由血液或細胞以通常的方法取之核酸進行標識，亦能以該核酸作為模板 emplate)，藉由PCR等之核酸放大法所放大者。於以該酸作為模板，藉由 PCR等之核酸放大法所放大者的場，可大幅地提高測定感度。於以核酸放大產物作為被檢質的場合，藉由在以螢光物質等標識之核苷酸三磷酸之在下進行放大，則可對放大核酸進行標示。又，於被檢質為抗原或抗體的場合，亦可對被檢物質之抗原或抗體由通常的方法直接標識。亦可於使被檢物質之抗原或抗與選擇結合性物質結合後，將載體洗淨，使該抗原或抗與標識為要進行抗原抗體反應之抗體或抗原進行反應，結合於載體之標識進行測定。於本發明之溶液攪拌方法中，較佳者為使選擇結合性物與被檢物質進行反應。於本發明之溶液攪拌方法中，使固定物質與被檢物質相作用之步驟，可使用與習知相同的方法進行。反應溫度時間可依要進行雜交之核酸的鏈長、參與免疫反應之抗及/或抗體的種類而適當地選擇，於核酸之雜交的場合，常係於3 5 °C ~ 7 0 °C的程度下進行1分鐘〜十多小時，於免反應的場合，通常係於室溫〜4 0 °C的程度下進行1分鐘-小時的程度。 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94 】08S98 29

1354792 於本發明之溶液攪拌方法中，可知不只可訊號，並有後述般的優點。亦即，用以往的交方法，於雜交後之螢光強度較弱，固定著焦點（spot)内之螢光強度的分布成為甜甜圈後的數據解析時之妨礙的問題。然而，於本拌方法中，具有不只螢光強度大幅地提高，焦點内之甜甜圈狀的螢光強度分布亦可減低 (實施例）茲以以下之實施例針對本發明更詳細地加本發明並非限定於下述實施例。 (實施例1 ) (DNA固定載體之製作）用公知的方法之 LIGA(LithographieG£ Abformung ：微光刻電鎮模造）製程製作射具，藉由射出成形法得到具有後述的形狀之體。又，此實施例中所用的PMMA之平均分子 Ρ Μ Μ A中含有1重量％之比例的碳黑（三菱化# 載體為黑色。測定此黑色載體之分光反射率，結果，分光反射率於可見光域（波長為之任何波長下皆為5 %以下，又，於同範圍的為0.5%以下。分光反射率、分光透過率，於無特定的光譜圖形（波峰等），光譜為一樣的分光反射率係用搭載著適合於J I S Z 8 7 2 2伯受光光學系的裝置（美樂達相機公司製，C Μ - 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898 提高雜交後的 DNA晶片之雜探針DNA的投狀，會導致其發明之溶液攪且上述般之投之優點。以說明。惟， ilvanoformung 出成形用之模 PMM A 製的載 •量為5萬，於 ^ 製，# 3 0 5 0 B )，率與分光透過 400nm~800nm) 波長下透過率可見光域中皆平坦狀。又， i件C之照明、 2 0 0 2 )，對自載 30

1354792 體得到正反射光的場合之分光反射率進行測定者。載體的形狀，大小為長76mm、寬26mm、厚1mm，體的中央部分之外的表面為平坦的。於載體的中央有直徑10mm、深0.2mm的凹入的部分，於此凹部中有64(8x8)處直徑0.2mm、高度0.2mm之凸部。對凹之凸部上面的高度（64 處之凸部的高度之平均值）部分之高度差進行測定，結果為3 // m以下。又，专凸部上面的高度之參差（最高的凸部上面與最低的 Φ 面之高度差）、乃至於凸部上面的高度之平均值與平面的高度之差進行測定，結果分別為3 // m以下。再凸部之凸部的間距（自凸部的中央至鄰接的凸部中距離）為0 · 6 m m。將上述之PMMA載體於65 °C下之10N的氫氧化鈉中浸潰1 2小時。將其依序以純水、0 . 1 N之H C 1水純水進行洗淨，於載體表面生成羧基。 (探針D Ν Α之固定）合成序列編號1 ( 6 0鹼基、5 ’ 末端為胺基化者）白此序列編號1的DNA之5’ 末端係被胺基化。將此D N A，以0 . 3 π m ο 1 / a L的濃度溶解於水中，備原液（stocksolution)。於點著在載體上時，以 8g 之 NaCl ' 2.9g 之 Na2HP〇4 · 1 2Hz〇 ' 0. 2g 之 KC 1 之K Η 2 P 0 4溶解於純水中，增量為1 L，對其力σ入p Η 之鹽酸所成，ρ Η 為 5 . 5 )將探針 D Ν Α之最終濃度 0 . 0 3nmo 1 / L >且，為了使載體表面之羧酸與探針 312XP/發明說明書(補件)/94_08/94丨08S98 除了載，設置，設置凸部份與平坦子6 4個凸部上坦部上者，凹央部之水溶液溶液、 "NA ° 作為儲 P B S (使、〇· 2g 調整用調成為 DNA的 31 1354792 末端之胺基進行缩合，而加入1-乙基- 3- (3 -二甲基胺基丙基）碳化二醯亞胺（EDC)，使最终濃度作成為50mg/mL。然後’將此等混合溶液以玻璃毛細管點著於載體凸部上面。接著’將載體置入密閉的塑勝容器中，於37。匚、濕度100% 的條件下進行靜置2 0小時左右’再以純水進行洗淨。此反應流程係表示於圖7。 (檢體DNA之調整）作為檢體DNA，係使用具有與固定於上述DNA固定載體鲁之探針 DNA可進行雜交的鹼基序列之序列编號4之 DNA(968驗基）。調整方法如下述。合成序列編號2與序列编號3的DNA。將其溶解於純水中使濃度成為1〇〇；/Μ。然後，備妥PKF3質體DNACTAKARA B I 0 (股），製品編號：3 1 0 0 )(序列編號5 : 2 2 6 4鹼基），以其作為模板（t e m p 1 a t e )，以序列編號2及序列編號3的D N A 作為引子（primer)，藉由 PCR 反應（Polymerase Chain Reaction)進行放大〇

P C R 之條件係如下述。亦即，加入 E X T a q 2 // L、1 0 X ExBuf f er40 μ. L > dNTP Mix 32/z L(以上為 TAKARA BIO (股）製，附屬於製品編號R R 0 0 1 A )、序列編號2的溶液2 # L、序列編號3的溶液2 L、模板（序列編號5 ) 0 · 2 // L，以純水增量至總量為4 0 0 # L。將此等之混合液，分至4個微量管，用熱擔環機（thermal cycler)進行PCR反應。將其藉由乙醇沈澱而純化，溶解於40yL的純水中。取PCR反應後的溶液之一部份，以電泳進行確認，結果確認經放大的 32 312XP/發明說明書(補件)/94_08/94108898 1354792 D N A之鹼基長為約9 6 0鹼基’故係序列編號4 ( 9 6 8鹼基）的放大。然後，將 9鹼基之隨機引子（random primer)( TAKARA BIO (股）製，製品編號：3802)溶解成6mg/mL的濃度，加入2 // L至上述之P C R反應後經純化之D N A溶液中。將此溶 . 液加熱至1 0 0 °C後，於冰上急速冷卻。對此等加入K 1 e η 〇 w FragmentCTAKARA BIO (股）製’製品編號 2140ΑΚ)附屬之緩衝液5 " L、d N T P混合物（d A T P、d T T P、d G T P的濃度分別 Φ 為 2.51^、（3(：丁卩的濃度為 400/^1〇2.5；^1^。再加入

Cy3-dCTP(Amersham phamac i a Biotech 製；製品編號 PA53021)2/iL。對此溶液加入 10U 之 Klenow Fragment，於37°C下靜置20小時，得到以Cy3標識之檢體DNA。又，由於在標識時係使用隨機引子，故檢體DNA的長度有參差之情形。最長的檢體D N A為序列編號4 ( 9 6 8鹼基）。再將檢體D N A之溶液取出，以電泳進行確認，結果於相當於9 6 0 I 鹼基附近出現最強的帶（band)，對應於較其短之鹼基長的區域為帶有薄的彌散（s m e a r )的狀態。然後，將其藉由乙醇沈殿而純化，並乾燥之。將此經標識化的檢體D N A，溶解至由1重量％ B S A (牛血清白蛋白）、5xSSC(5xSSC係指將20xSSC(Sigma製）以純水稀釋4倍者。又’將20xSSC以純水稀釋成2倍者係表示為 lOxSSC，20xSSC之2倍稀釋液表示為i〇xsSC、100倍豨釋液則表示為0.2xSSO)、0.1重量％SDS(十二烷基硫酸鈉）、 0 · 0 1重量％鮭魚精子D N A之溶液（各濃度皆為最終濃度）所 33 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898 1354792 成之4 Ο 0 /i L中，作為雜交用儲備原液。於下述之實施例、比較例中，於雜交時之檢體溶液，只要無特別限制，上述所調整的儲備原液係使用 1重量 %BSA ' 5xSSC ' 0.0 1重量％鮭魚精子DNA、0.1重量％SDS之溶液（各濃度皆為最终濃度）稀釋成2 0 0倍者。又，對此溶液之檢體D N A的濃度進行測定，結果為1 . 5 n g / /z L。 (玻璃珠之修飾）將直徑為1 5 0 // m的玻璃珠1 0 g，浸潰至1 0 N N a Ο Η溶液 # 中後，以純水洗淨。接著，將A PS ( 3 -胺基丙基三乙氧基矽烷；信越化學工業（股）製）以2重量％的比例溶解至純水中之後，將上述玻璃珠浸潰1小時，自此溶液取出後於1 1 0 °C下乾燥1 0分鐘。如此，將胺基導入到玻璃珠的表面。然後，將 5 . 5 g 的琥珀酸酐溶解到 1 -曱基-2 -吡咯烷酮 3 3 5 m L中。將上述之琥ίέ酸溶液加入1M的50mL之棚酸納 (加入硼酸3. 0 9 g與p Η調整用之氫氧化鈉，以純水增量成 5 0 m L者；ρ Η為8. 0 )。將上述之玻璃珠浸潰於此混合液中 2 0分鐘。浸潰後，以純水洗淨並乾燥。如此，使玻璃珠的表面之胺基與琥珀酸酐反應，使羧基導入到玻璃珠表面。 (雜交）在上述所得到之固定著探針DNA的載體上，使上述檢體 DNA進行雜交。具體而言，係對事先所準備之探針核酸固定於凸部之載體，滴下50//L的雜交用溶液，於載體凹部混合上述之經修飾的玻璃珠 2 m g，在其上覆蓋玻璃蓋片。並將玻璃蓋片的周圍以紙帶密封，以使雜交的溶液不會乾 34 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94 ] 08898 1354792 燥。於此玻璃蓋片面，其4邊之中，相向的2邊係使用藉由光微影術形成的厚8//m、寬1mm之光阻所形成者。如此，於雜交時，可使載體凸部與玻璃蓋片的距離（間距）作成為 8/z m。將其固定於設置在微量管旋轉機（microtube rotator)(阿茲旺公司製，商品編號：1-4096-01)的旋轉面之塑膠容器内，於6 5 °C '濕度1 0 0 %的條件下靜置1 0小時。此時，係使旋轉機之旋轉數設定為3 r p m，旋轉機之旋轉面係作成為與水平面成直角。並且，載體之探針DNA固定面 φ 係作成為對旋轉機之旋轉面成直角。於靜置後，自載體將玻璃蓋片剝離後將載體洗淨並乾燥。 (測定）將上述處理後之載體安置於 DNA晶月用之掃描器（Axon Instruments 公司之 GenePix 4000B)，以雷射輸出 33%' 光電倍增器之電壓設定設為5 0 0之狀態下進行測定。其結果示如表 1。此處，所謂「螢光強度」係指投焦點（s ρ 〇 t) 内之螢光強度的平均值。

又，於本實施例中，係使用玻璃珠，但即使是用陶瓷珠、鐵氟隆（註冊商標）珠，亦可得到與表1大致相同的結果。 (比較例1 ) 於未置入玻璃珠的場合進行實驗。實驗程序為除了在雜交時未混合入玻璃珠之外，其餘係與實施例 1同樣地進行。結果示如表1。經確認得知，與實施例1相比，螢光強度較低。再者，相對於比較例 1 之載體凸部的螢光強度分布為不均一（甜 35 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898 1354792 甜圈狀分布），實施例1的結果，載體凸部之螢光強度分布則為大致均一。 (比較例2 ) 於未設置凹凸部之平坦的 PMMA載體的場合進行實驗。實驗程序，除了（ 1 )用平坦的載體；（2 )探針D N A之點著係使用專用機器（日本雷射電子（股）製，GeneStamp II)進行；（3)並且，於玻璃蓋片的 4邊黏貼厚 20〇Aim、寬1mm 之聚酯膜，以可進行珠粒攪拌的方式，於載體與玻璃蓋片 φ 之間設置間隙，在此間隙中使珠粒與檢體溶液混合進行雜交；之外，係以與實施例1之相同方法進行。結果示如表 1。可知：與實施例1比較，其螢光強度較低。再者，可確認出在實施例1中所未看到的點（s ρ 〇 t)之損傷。推判其係於雜交時，珠粒傷到探針固定化面之故。又，使珠粒的直徑設定為1 " m，與本比較例進行實驗之下，螢光強度更低，成為1 5 0 0的程度。推判此乃因雜交溶液的阻力，得以確認珠粒難以移動的現象之故。

(實施例2 ) 進行利用氣泡之攪拌效果之實驗。實驗程序，除了於雜交步驟之覆蓋玻璃蓋>ί時係以微型注射器送入氣泡 0.9// L，並且未加入玻璃珠之外，係與實施例1相同。又，係以使傾斜向鉛直方向之旋轉機的旋轉面與載體之探針固定面成為平行的方式將載體固定而使其旋轉，使氣泡只在密封之檢體溶液的周圍移動。 (實施例3 ) 36 312ΧΡ/發明說明書(補件)/94-08/94108898

1354792 使用圖2所示之截面構造之用以保持溶液之容器4代玻璃蓋片，進行與比較例2同樣的實驗。亦即，凹凸部非設置於載體，而係設置於玻璃蓋片。此容器與平坦 PMMA載體之位置關係，係如圖2所示般審慎地加以配J 又，若邊使珠粒移動邊進行雜交，則由於探針DNA的固化面與保持溶液的容器4之距離較珠粒2的直徑小，故璃珠不會與探針DNA固定面1接觸，可使玻璃珠移動。果示如表1。有關螢光強度，可得到與實施例1同等的 # 果。若合併比較例2的結果考量，認為珠粒不接觸探針定面是重要的。於本實施例之方法中，正確地進行使玻蓋片之凸部與固定著探針 DNA之部分的位置對準係為要。 (比較例3 ) 進行於未設置凹凸部之平坦的 PMMA載體、且未以珠攪拌之場合的實驗。除了於雜交溶液中未混合入珠粒、未施行旋轉之外，係進行與比較例2同樣的操作與測定結果示如表1。 [表1] 實施例1 實施例2 實施例3 比較例1 比較例2 比較例3 標的濃度 (ng/ μ. L) 1. 5 1.5 1. 5 1.5 1. 5 1. 5 基板形狀凹凸凹凸平板凹凸平板平板間隙（// m) 8 8 8 8 200 8 攪拌方法珠粒氣泡珠粒無珠粒無旋轉有有有有有無螢光強度 1 2000 8800 11800 2900 3900 700 雜訊 45 50 300 50 300 300 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898 替並的〇定玻結結固璃重粒且 37 1354792 (實施例4 ) 於實施例]中之玻璃珠，選擇5種進行實驗。實驗程序係與實施例1同樣，玻璃珠之直徑為1 0、2 0、5 0、1 0 0、 2 Ο Ο μ m。結果示如表2。 (比較例4 ) 除了將玻璃珠的直徑定為 300/im、400"m之外，係與實施例1同樣地進行實驗。其結果示如表2。 [表2 ] 實施例4 比較例4 尺寸（V m ) 10 20 50 1 00 2 0 0 300 400 螢光強度 8 2 0 0 1 0 5 0 0 1 2 7 0 0 1 2 0 0 0 1 2 5 0 0 3100 3 0 0 0

由上述者，使用1 0 ~ 2 0 0 // m的珠粒，明顯地有攪拌效果，而比較例4之3 0 0、4 0 0 # m的珠粒則未能得到顯著的效果。其理由在於，由於載體凹部與玻璃蓋>i的距離為208"m，勉強 '致置 3 0 0、4 0 0 # m的珠粒則會被玻璃蓋片與載體夾住，致無法移動之故。由實施例、比較例，可知：於珠粒無法移動的場合，螢光強度較弱。又，由實施例4可知：珠粒之較佳的尺寸為1 0 // m以上，而以2 Ο μ m以上為更佳。 (實施例5 ) 進行利用具有後述的特徵之載體且與實施例1同樣的實驗。於載體的中央，設置直徑1 0 m m、深0 · 3 m m的凹入部分，在此凹部之中，設置 64(8x8)處之直徑 0.2mm、高 0.3mm 的ώ部。其他之載體的特徵與實驗之程序係與實施例1相同。又，玻璃珠的直徑係設定為1 0、2 0、5 0、1 0 0 ' 2 0 0、 38 312ΧΡ/發明說明書(補件)/94-08/94108898 1354792 3 Ο Ο // m。結果示如表3。 (比較例5 ) 除了將玻璃珠的直徑設為 4 0 0 // m之外，係與實施例 5 同樣地進行實驗。其結果示如表3。 [表3 ] 實施例5 比較例5 尺寸（/i m ) 10 20 50 10 0 200 300 400 螢光強度 88 0 0 11000 1 3 0 0 0 1 2 0 0 0 1 2 7 0 0 1 2 0 0 0 2 7 0 0

若用1 0 ~ 3 0 0 # m的珠粒，則可明顯地看到攪拌效果，而用4 0 0 /z m的珠粒，則無法得到顯著的效果。其理由在於，由於載體凹部與玻璃蓋片的距離為308/zm，勉強設置400 仁m的珠粒，會被玻璃蓋片與載體夾住，致無法移動之故。由實施例、比較例，可知於珠粒無法移動的場合，螢光強度較弱。又，由實施例5可知：珠粒之較佳的尺寸為1 0 // m以上，而以2 0 // m以上為更佳。 (實施例6 ) 就凸部的高度參差不一的場合進行實驗。對實施例1中所用之PMMA的射出成形品之凸部以砂紙（rubbing paper) 研磨·，使凸部上面的高度有差別。亦即，分別製作成有較其他的凸部上面（作為基準之凸部）低30//m的凸部（4處）之載體（載體A);有較其他的凸部上面低50"m的凸部（4 處）之載體（載體B )。又，此等載體之低的部分以外的凸部 (作為基準之凸部）上面之高度、和平坦部分之高度的差為 3 # m以下。與實施例1同樣地進行對點著的探針D N A之調整。然後，於作為基準之凸部上面之4處、與低的凸部上 39 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898 1354792 面之4處，與實施例1同樣地進行探針DNA之點著，並且，與實施例1同樣地進行雜交用的檢體DNA之調整。亦與實施例1同樣地進行雜交與測定。作為基準之凸部上面的螢光強度之平均值、與高度低的凸部上面的螢光強度之平均值示如表 4。

[表4] 實施例6 載體A 載體B 作為基準之凸部低3 0 // m之凸部作為基準之凸部低5 0〆m 之凸部 II 1 3 0 0 0 1 2 0 0 0 1 2 6 0 0 8 9 0 0 如此般可知，即使凸部的高度有參差（5 0 # m以下）的情形，亦可得到與實施例1、2同等的螢光強度。 (實施例7 ) 就凸部上面與平坦部有相差的場合進行檢討。對實施例 1中所用之Ρ Μ Μ A的射出成形品之平坦部以砂紙研磨，製作成平坦部上面與凸部上面的高度差為 30// m之載體（載體 C)、與高度差為50//m之載體（載體D)之2種類。亦即，載體C為凸部的高度較平坦部的高度高30#m。實驗程序係與實施例1同樣地進行對點著的探針D N A之調整、對凸部上面之探針DNA溶液之點著、檢體DNA之調整、玻璃珠之修飾。雜交，係用黏合著矽片（厚6 0 m)者代替實施例1 中之在玻璃蓋片上形成聚合物者。又，分別於各載體之凸部上面之4處點著（s ρ 〇 t) D N A溶液。然後，求出點著D N A 之點（spot)(4處）之螢光強度的平均值。其結果示如表5。 40

312XP/發明說明書(補件)/94-08/941OS89S 1354792 [表5 ] 實施例7 載體C 載體D 螢光強度 11500 8 7 0 0 如此般可知，即使平坦部上面與凸部上面的高度有相差 (5 0 # m以下）的情形，亦可得到與實施例1同等的螢光強度。 (實施例8 )

進行將實施例1中之與玻璃蓋片以紙帶密封的基板安置於旋渦搜拌器（Vortex)(Scientific Industries， Inc. 製），以振動使玻璃珠移動進行雜交攪拌《實驗程序除了固定於旋渦攪拌器之外，係與實施例1同樣地進行。結果示如表6。顯示出強的螢光強度。 (實施例9 )

於雜交時混合磁性珠粒，藉由改變周遭的磁場使磁性珠粒移動，進行攪拌雜交溶液之實驗。首先，自行製作如圖 8之磁石可來回運動的機器。實驗程序為（DNA固定化載體之製作）（探針D N A之固定）（檢體D N A之調整）（測定）係與實施例1同樣地進行。雜交係將1 m g的直徑為5 0 # m之代替玻璃珠之磁性珠粒（特萊伊阿爾（股）製）混合於載體凹部，並安置於代替旋轉機（rotator)之前述自製機器，除此之外，係與實施例1同樣地進行。結果示如表6。顯示出強的螢光強度。 (比較例6 ) 41 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94 ] 08898 1354792 用未設置有凹凸部之平坦的 PMMA載體進行與實施例 9 同樣的實驗。實驗程序，除了（1)用平坦的載體；（2)以專用機（日本雷射電子（股）製，GeneStamp II)進行探針 DNA 之點著；（3)並且，於玻璃蓋片的4邊黏貼厚200//m、寬 1 m m之聚酯膜，以可進行磁性珠粒攪拌的方式，於載體與 . 玻璃蓋片之間設置間隙，在此間隙中使磁性珠粒與檢體溶液混合進行雜交；（4 )安置於圖8所示之自製機係使玻璃蓋片面朝下；之外，係與實施例1同樣地進行。藉由使玻璃 Φ 蓋片面朝下，可使磁性珠粒吸引至玻璃蓋片面上，而可期待在不與在對面之探針固定面接觸之下對溶液進行攪拌。結果示如表6。僅得到較實施例9差的螢光強度。並且，可確認到實施例9中未見到的點（s ρ 〇 t)之損傷。於比較例 6 中，受磁石吸引而移靠之磁性珠粒，於以聚酯膜設置之 2 0 0 // m的寬度滿滿地凝集，由於其係以成塊之狀態移動，故此塊狀物會與探針固定面接觸。 [表6 ] 實施例8 實施例9 比較例6 珠粒種類玻璃磁性體磁性體外力振動磁力磁力螢光強度 9 9 0 0 7 8 0 0 2 8 0 0 10) (實施例除了珠粒使用紀安定化之二氧化結（Yttria-stabilizedZirconia) (對二氧化锆以 2 . 5莫耳％之比例混合三氧化二釔者）製之直徑為1 2 5 // m者之外，係與實施例1同樣地進行實驗。其 42 3 ] 2XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898 1354792 結果，於雜交後之螢光強度為大致相同。然而，混合珠粒 2 m g，即使對於在其上覆蓋玻璃蓋片時之溶液的擾動，珠粒亦難於移動，故容易安置。其理由在於，二氧化錯珠粒的比重為6.05g/cm3，相對於玻璃為接近3倍的比重之故。 (實施例1 1 ) . 使用檢體 DNA的濃度調整為 0.73、0.29、0.15ng//zL 者進行與實施例1同樣的實驗。結果示如圖9。圖9中一併記載著實施例1與比較例1的結果。癱（比較例7 ) 使用檢體 DNA的濃度調整為 0.73、0.29、0.15ng//zL 者進行與比較例1同樣的實驗。結果示如圖9。圖9中一併記載著實施例1與比較例1的結果。如此般，於4條件之檢體濃度，確認得到用珠粒攪拌之效果。 (實施例1 2 ) 進行藉由 DNA 晶片之 SNP(single nucleotide polymorphism : 單一核苷酸多態性）之檢測實驗。實驗程序為（D N A固定化載體之製作）（檢體D N A之調製）（玻璃珠之修飾）（雜交）（測定），係與實施例1同樣地進行。檢體D N A之濃度為1 · 5 n g / "L。其中，雜交係於4 2 °C進行。探針D N A係合成5 ’末端經胺基化之序列編號6、序列編號7的DNA而使用。序列編號6與7只有1個鹼基不同。兩個探針之自5’側起之 1 0個鹼基之T之序列，與檢體D N A無互補性，序列編號6 之此部分除外的部分（2 0鹼基）係與檢體D N A完全地互補。 43 312XP/發明說明書(補件)/94-08/94108S98 1354792 將此2種類的DNA以與實施例1同樣的程序固定於載體凸部。結果示如表7。藉由本發明之方法，可檢測出此2種類的探針DNA之1鹼基的差異。 [表Π 實施例1 2 序列編號 6 7 螢光強度 1 0 5 0 0 3 2 0 0 (產業上之可利用性）

藉由本發明，可提供一種攪拌方法，其可促進固定於載體之選擇結合性物質與被檢物質之反應，即使是微量的檢體亦可得到良好的訊號強度與S / N比。亦即，藉由使用本發明之攪拌方法，可提高以D N A晶片為代表之選擇結备性固定化載體之訊號強度與S / N比（亦即，提高感度），即使是微量的臨床檢體亦可測定。藉由本發明，於使用以 D N A 晶片為代表之選擇結合性物質固定載體之臨床現場，可進行診斷與診察。【圖式簡單說明】圖1為本發明之實施形態之剖面示意圖。圖2為本發明之實施形態之剖面示意圖。圖3為載體之示意圖。圖4為載體之剖面示意圖。圖5為DNA晶片抵住用夾具之例。圖 6為以載體作為支持體層/選擇結合性物質固定化層之場合的示意圖。 44 312XP/發明說明書(補件)/94-08/9410S898 1354792 圖7為在Ρ Μ Μ A表面固定選擇結合性物質時之反應流程圖。圖8為實施例9中所用之夾具之示意圖。圖9為改變標的（t a r g e t)濃度之場合的螢光強度。【主要元.件符號說明】 1 固定於載體之選擇結合性物質（D N A ) 2 微粒子（b e a d s ) 3 載體 φ 4 保持反應溶液之容器 11 平坦部 1 2 凹凸部 13 D Ν Α晶片 14 物鏡 15 雷射激發光 16 用以將微陣列抵住夾具之彈簧 3 1 選擇結合性物質固定化層 ^ 32 支持體層

41 PMMA

42 DNA 51 磁石 5 2 磁石之來回運動之方向 53 基板 45 312XP/發明說明書(補件)/94-08/9410SS98 1354792 序列表 <110〉東レ株式会社 <120〉溶液爸攪拌Τ·δ方法 <130> Case No. 04080 060) 7 <170> Patent In Ver. 2. 1 <210> 1 <2Π> 60 <212〉 DNA <213> Plasmid pKF3 <400〉 1 acattttgag gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcatctgga 60 <210> 2 <zn> 2〇 <212> DNA ^

<213> Plasmid pKF3 <400> Z gggcgaagaa gttgtccata 20 <Z10> 3 <210 20 <212> DNA <213> Plasmid pKF3 <400> 3 gcagagcgag gtatgtaggc 20

<Z10> 4 <2Π> 968 <212〉 DNA <213> Plasmid pKF3 <400> 4 gggcgaagaa gttgtccata ttagccacgt ttaaatcaaa actggtgaaa ctcacccagg 60 gattggctga gacgaaaaac atattctcaa taaacccttt agggaaatag gccaggtttt 120

caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata tgtgtagaaa ctgccggaaa tcgtcgtggt 180 attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag tttgctcatg gaaaacggtg taacaagggt 240 gaacactatc ccatatcacc agctcaccgt ctttcattgc catacgaaat tccgtatgag 300 cattcatcag gcgggcaaga atgtgaataa aggccggata aaacttgtgc ttatttttct 360 ttacggtclt 丨aaaaaggcc gtaatatcca gatgaacggt ctggttatag gtacattgag 420 caactgactg aaatgcctca aaatgttctt 丨acgatgcca ttgggatata tcaatggtgg 480 tatatccagt gatttttttc tccattttag cttccttagc tcctgaaaat ctcgataact 540 caaaaaatac gcccggtagt eatcttattt cattatggtg aaagttggaa cctcttacgt 600 gccgatcaac gtctcatttt cgccaaaagt tggcccaggg cttcccggta tcaacaggga 660 caccaggatt tatttattct gcgaagtgat cttccgttcg acggagttcc actgagcgtc 720 agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 780 312XP/發明說明書(補件)/94-〇S/94108898 46 1354792 ctgcttgcaa aca2saaaac caccgctacc agcggtggtt 丨gtttgccgg atcaagagct 840 accaactctt tltccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa at2ctgtcct 900 tctagtgtag ccgtagtUg gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 960 cgctctgc 968 <210> 5 <211> 2246 <212> DNA <213> Plasmid pKF3 <400> 5 atggcaacag tcaatcagct ggttcgaaag ccgcgagctc gtaa.agtggc caaatclasc 60 gttccggctc tcgaggcatg cccgtagaag cgtggcata丨 gcacacgtgt atacactact 120 actccgaags aaccgaattc agcectgcgc aagctttgcc gCEtacgcct gaccaacggt 180 ttcgaggtca cctcatatat aggtggtgaa ggacacaacc tgcaggaaca ctcigttatc 240 ctgatcagag gcggccgcgt laaagatctg cccgggatcc ggtaccacac cgtccgcggc 300 gctctagsct gctccggagt aaaggaccgt cgacaggatc eatcgaaata cgetgtaaaa 360 cgtccgaagg cctaatagaa gctagcttgg cactgggcca agctgaattt ctgccattca 420

tccgcttatt atcacttstt caggcgtagc accaggcett taagggcacc aataacigcc 480 ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac tgttgtaatt cattaagcat 540 tctgccgaca tggaagccat cacagacggc atgatgaacc tgaatcgcca gcggcatcag .600 caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catagtgaaa acgggggcga agaagttgtc 660 catattagcc acgtttaaat caaaactggt gaaactcacc cagggattgg cteagacgaa 720 aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa ataggccagg ttttcaccgt aacacgccac 780 atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg gaaatcgtcg tggtattcac tccagagcga 840 tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa gggteaacac tatcccatat 900 caccagctca ccgtctttca ttgccatacg aaattccgta tgagcattca tcaggcgggc 960 aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa Ί020 ggccgtaata tccagatgaa cggtdggtt ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc 1080 ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt 1140 tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg 1200 tagtgatctt alttcattat ggtgaaagtt ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca 1260 ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc ggtatcaaca gggacaccag gatttattta 1320 ttctgcgaag tgatcttccg ttcgacggag ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 1380 atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 1440 aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 1500 aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 1560

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312XP/發明說明書(補件)似-08/941OS89S 47 1354792

<210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Plasmid pKF3 <400〉 6 tttttttttt acattttgag gcatttcagt

<210> 7 <211〉 30 <212> DNA <2Ί3> Plasmid pKF3 <400> 7 tttttttttt acattttgag acatttcagt 3 ] 2XP/發明說明書(補件)/94-08/94108898

Claims

AUG 1 〇 2011 替換本 1354792 十、申請專利範圍： 1. 一種溶液攪拌方法，係使固定於載體表面之選擇結合性物質，與含有可與該選擇結合性物質反應之被檢物質的溶液接觸，以攪拌該溶液者；其特徵為，使用微粒子或氣泡不與選擇結合性物質固定面接觸的構造之載體，在含有被檢物質的溶液中混合微粒子或氣泡，使微粒子或氣泡移動，而不與選擇結合性物質的固定面接觸。

2. 如申請專利範圍第1項之溶液攪拌方法，其中，微粒子或氣泡不與選擇結合性物質固定面接觸的構造之載體係設有凹凸部且使選擇結合性物質固定在該凸部上面之載體。 3. 如申請專利範圍第1或2項之溶液攪拌方法，其中，藉由使微粒子移動而攪拌溶液。 4. 如申請專利範圍第1或2項之溶液攪拌方法，其中，使用保持溶液之容器。 5. 如申請專利範圍第1或2項之溶液攪拌方法，其中，藉由使微粒子移動而攪拌溶液，且於載體設置有凹凸部；選擇結合性物質係固定於凸部上面，微粒子係於凹部移動。 6. 如申請專利範圍第1或2項之溶液攪拌方法，其中，於載體設置有平坦部與凹凸部，選擇結合性物質係固定於複數的凸部上面，該凸部上面的高度為大致相同，且平坦部分與凸部上面的高度差為5 0 " m以下。 7. 如申請專利範圍第1或2項之溶液攪拌方法，其中，藉由重力、磁力、載體之振動之任一者或此等之組合，使 49 94108898 1354792 微粒子移動。 8. 如申請專利範圍第1或2項之溶液攪拌方法，其中，選擇結合性物質為核酸。 9. 如申請專利範圍第1或2項之溶液攪拌方法，其中，使選擇結合性物質與被檢物質反應。 1 0.如申請專利範圍第 5項之溶液攪拌方法，其中，微粒子之最大寬度為10/zm以上、載體凸部上面與凹部的高度差以下。

11. 一種溶液攪拌方法，係使固定於載體表面之選擇結合性物質，與含有可與該選擇結合性物質反應之被檢物質的溶液接觸，以攪拌該溶液者；其特徵為，使用微粒子或氣泡不與選擇結合性物質固定面接觸之構造的保持溶液之容器，在含有被檢物質的溶液中混合微粒子或氣泡，使微粒子或氣泡移動，而不與選擇結合性物質的固定面接觸。 1 2.如申請專利範圍第1 1項之溶液攪拌方法，其中，微 φ 粒子或氣泡不與選擇結合性物質固定面接觸之構造的保持溶液之容器，係設有凹凸部的保持溶液之容器，且選擇結合性物質固定在該凸部之下的載體表面。 1 3.如申請專利範圍第1 1或1 2項之溶液攪拌方法，其中，藉由使微粒子移動而擾拌溶液。 1 4.如申請專利範圍第1 1或1 2項之溶液攪拌方法，其中，藉由使微粒子移動而攪拌溶液，且微粒子之最小寬度較選擇結合性物質的固定面與保持溶液的容器之間的最短距離更大。 50 94108898

1354792 15.如申請專利範圍第11或12項之溶液攪拌方法，中，藉由重力、磁力、載體之振動之任一者或此等之組1 使微粒子移動。 1 6.如申請專利範圍第1 1或1 2項之溶液攪拌方法，中，選擇結合性物質為核酸。 17. 如申請專利範圍第11或12項之溶液攪拌方法，中，使選擇結合性物質與被檢物質反應。 18. —種溶液攪拌方法，係使固定於載體的凸部上面選擇結合性物質，與含有可與該選擇結合性物質反應之檢物質的溶液接觸，對該含有被檢物質之溶液混合微粒並使微粒子移動，以攪拌該溶液者；其特徵為，使用保溶液之容器，而微粒子之最小寬度較選擇結合性物質的定面與保持溶液的容器之間的最短距離更大。 1 9.如申請專利範圍第1 8項之溶液攪拌方法，其中，由使微粒子移動而攪拌溶液，且微粒子之最小寬度較選結合性物質的固定面與保持溶液的容器之間的最短距離大0 2 0.如申請專利範圍第1 8項之溶液攪拌方法，其中，由使微粒子移動而攪拌溶液，且於載體設置有凹凸部；選結合性物質係固定於凸部上面，微粒子係於凹部移動。 2 1 .如申請專利範圍第1 8項之溶液攪拌方法，其中，載體設置有平坦部與凹凸部，選擇結合性物質係固定於數的凸部上面，該凸部上面的高度為大致相同，且平坦分與凸部上面的高度差為50ym以下。 94108898 其 ) 其其之被子持固藉擇更藉擇於複部 51 rI354792 22.如申請專利範圍第18項之溶液攪拌方法，其中，藉由重力、磁力、載體之振動之任一者或此等之組合，使微粒子移動。 23. 如申請專利範圍第18項之溶液攪拌方法，其中，選擇結合性物質為核酸。 24. 如申請專利範圍第18項之溶液攪拌方法，其中，使選擇結合性物質與被檢物質反應。

2 5 .如申請專利範圍第2 0項之溶液攪拌方法，其中，微粒子之最大寬度為ΙΟμιη以上、載體凸部上面與凹部的高度差以下。 52 94108898 1354792 如6 1 Ο _替換頁 Η—、圖式： 94108898 53