TWI439287B - 酸鹼敏感的透明質酸衍生物以及應用 - Google Patents

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酸鹼敏感的透明質酸衍生物以及應用
本發明關於一種透明質酸衍生物及其應用，特別是關於具有酸鹼敏感性的透明質酸衍生物。
透明質酸(hyaluronic acid)為由乙醯基葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)與D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)所形成的重複單元所組成的線性黏多糖(linear mucopolysaccharide)。透明質酸最早在牛眼球的玻璃體中被發現，之後在其他組織，例如細胞間質(ECM)、關節滑液等中發現。生物體中的透明質酸主要功能在於保護及潤滑細胞、調節細胞在此黏彈性基質上的移動、穩定膠原網狀結構及保護該膠原網狀結構免於機械性破壞。
透明質酸的細胞表面受體主要為CD44。透過透明質酸與CD44的接合，可促使細胞聚集、移動、增殖及活化以及細胞與細胞間的黏合等的細胞活動。在腫瘤轉移的機轉上，透明質酸與CD44的接合促進腫瘤細胞的上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition;EMT)，使得腫瘤細胞浸潤血液系統或淋巴系統。最後，使得腫瘤細胞與原始細胞連接及作用而達到腫瘤細胞的轉移。
透明質酸已知在水溶性介質中當濃度高於臨界微胞濃度(critical micelle concentration,CMC)時，遵照熱力學原則自我聚集(self-assembly)而形成奈米尺寸的微胞。目前已有多篇先前文獻記載透明質酸形成微胞及包覆活性藥物的技術，例如美國專利USP 6,350,458B1、美國專利USP 7,780,982B1等。
美國專利USP 6,350,458B1揭示由至少一種微胞形成材料、荷爾蒙或抗體等的大分子藥劑、鹼金屬磺酸烷酯、水楊酸鹼金屬鹽、及醫藥可接受的依地酸(edetate)所形成的醫藥組合物，藉由此醫藥組合物將不易通過腸胃道(GI)的大分子藥劑遞送至組織或細胞中。
美國專利USP 7,780,982B1揭示一種透明質酸衍生物，於透明質酸之羥基(-OH)位置以氨基甲酸酯基(urethane)鍵結碳數2~16的烴基，以提高該透明質酸衍生物及其所形成可包覆藥物的微胞的生物可分解性。
然而，習知包覆活性藥物的微胞在透過胞吞作用(endocytosis)進入腫瘤細胞後，通常在尚未釋放出活性藥物以毒殺腫瘤細胞之前，該微胞已被腫瘤細胞經胞吐作用(exocytosis)排出。因此對於透明質酸及其所形成的微胞仍有改良的需求。
本案提供一種透明質酸衍生物，其包括至少一種下式(I)所示之重複單元，
式中，HA表示包括N-乙醯基-D-葡醣胺和D-葡醣醛酸之單元，q表示2至10000之整數；A表示一生物可斷鍵鍵結，包括腙(hydrazone)、縮醛(acetal)、縮酮(ketal)或亞胺(imine)之至少一種基團；M表示一疏水分子鏈段、親水分子鏈段或親疏水兩性鏈段之至少一種；以及p表示該[A-M]直接鍵結於每一該HA單元之數量，且p為0至4之整數，且每一該HA單元之p不得同時為0；其中，該透明質酸衍生物具有生物可分解性及在酸性環境中裂解的酸鹼敏感性。
本案更提供一種微胞，由上述之透明質酸衍生物於一親水介質中形成。
本案再提供一種藥物遞送系統，包括一載體包覆一生物活性成分，其中該載體為上述之透明質酸衍生物所構成。
再者，本案更提供一種矯味劑，由上述之透明質酸衍生物所構成，用以包覆一生物活性物質以減少該生物活性物質的味道。
本案一實施例為改良應用於藥物釋放控制的酸鹼敏感材料，選用生物相容性優異的透明質酸作為主體，以生物可斷鍵鍵結(biocleavable linkage)鍵結疏水分子鏈段、親水分子鏈段、親疏水兩性鏈段或其組合，形成具有如式(I)所示之重複單元的透明質酸衍生物。
如下式(I)所示之單元中，
HA表示包括N-乙醯基-D-葡醣胺和D-葡醣醛酸之透明質酸單元。q表示上述透明質酸單元的數目，可為2至10000之整數，較佳為10~5000之整數，但不限於此。A表示生物可斷鍵鍵結，與該N-乙醯基-D-葡醣胺及該D-葡醣醛酸之至少一個的羥基(-OH)形成共價鍵結。M表示疏水分子鏈段、親水分子鏈段或親疏水兩性鏈段之至少一種。p為表示上述[A-M]直接鍵結於HA上的數目。由於該生物可斷鍵鍵結係連接於N-乙醯基-D-葡醣胺和D-葡醣醛酸的羥基(-OH)上。已知透明質酸中的N-乙醯基-D-葡醣胺和D-葡醣醛酸具有4個羥基，因此，p為0至4之整數，且每一該HA單元之p不得同時為0。然而，本案不特別限定上述生物可斷鍵鍵結的羥基鍵結位置。但為了使本案技術內容容易了解，以下說明皆以一個生物可斷鍵鍵結(p=1)為例。
此述的「生物可斷鍵鍵結」表示在酸性的環境下可斷鍵的基團，其與該N-乙醯基-D-葡醣胺及該D-葡醣醛酸之至少一個的羥基(-OH)形成共價鍵結。具體地包括腙(hydrazone)、縮醛(acetal)、縮酮(ketal)或亞胺(imine)之至少一種基團。此述的「酸性環境」係指pH值7以下的環境，較佳為pH6.9~pH1.0的範圍，更佳為pH6.5~pH3.0的範圍，例如，生物體細胞之胞器內環境或腫瘤組織部位。
此述的M表示疏水分子鏈段、親水分子鏈段或親疏水兩性鏈段之至少一種。M的分子量沒有特別限制，可為100至50,000道爾頓(Dalton;Da)，較佳為300至30,000Da，更佳為500至20,000Da。
此述「疏水分子鏈段」表示由生物可吸收的高分子為重複單元所形成的鏈段。該生物可吸收的高分子之重複單元可包括己內酯(caprolactone)、丁內酯(butyrolactone)、D-乳酸交酯(D-lactide)、L-乳酸交酯(L-lactide)、D-乳酸(D-lactic acid)、L-乳酸(L-lactic acid)、乙交酯(glycolide)、甘醇酸(glycolic acid)、氫氧基已酸(hydroxy hexonoic acid)、氫氧基丁酸(hydroxy butyric acid)、戊內酯(valerolactone)、氫氧戊酸(hydroxy valeric acid)、蘋果酸(malic acid)、上述之共聚物、或上述之組合。該生物可吸收的高分子也可具有一個以上於酸性環境中可斷鍵的鍵結，例如腙、縮醛、縮酮或亞胺之至少一種基團。
此述「親水分子鏈段」表示親水性的分子鏈段，沒有特別限定，可選自聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、聚氧化乙烯(polyethylene oxide,PEO)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)、聚丙烯酸(polyacrylic acid,PAA)、聚甲基丙烯酸(polymethacrylic acid,PMA)或上述之組合。
此述「親疏水兩性鏈段」表示具有親水區域與疏水區域的兩性鏈段。上述親水區域的重複單元可列舉乙二醇(ethylene glycol)、氧化乙烯(ethylene oxide)、乙烯吡咯烷酮(vinylpyrrolidone)、丙烯酸(acrylic acid)、甲基丙烯酸(methacrylic acid)、上述之共聚物、或上述之組合。上述疏水區域的重複單元可列舉己內酯(caprolactone)、丁內酯(butyrolactone)、D-乳酸交酯(D-lactide)、L-乳酸交酯(L-lactide)、D-乳酸(D-lactic acid)、L-乳酸(L-lactic acid)、乙交酯(glycolide)、甘醇酸(glycolic acid)、氫氧基已酸(hydroxy hexonoic acid)、氫氧基丁酸(hydroxy butyric acid)、戊內酯(valerolactone)、氫氧戊酸(hydroxy valeric acid)、蘋果酸(malic acid)、上述之共聚物、或上述之組合。此述「親疏水兩性鏈段」可更具有一個以上於酸性環境中可斷鍵的鍵結，例如腙、縮醛、縮酮或亞胺之至少一種基團。
本案另一實施例中，除上述的A及M的鍵結之外，上述的HA也可更透過一非生物可斷鍵鍵結或一不易快速斷鍵以鍵結一親水分子鏈段。此述的「非生物可斷鍵鍵結」係指在酸性環境中無法酸解斷鍵的鍵結，包括氨基甲酸酯(urethane)鍵。此述之「不易快速斷鍵」是指在酸性環境中無法在24小時內快速斷鍵的鍵結，包括酯(ester)鍵。此述之非生物可斷鍵鍵結或不易快速斷鍵所鍵結的「親水分子鏈段」，可列舉聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、聚氧化乙烯(polyethylene oxide,PEO)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)、聚丙烯酸(polyacrylic acid,PAA)、聚甲基丙烯酸(polymethacrylic acid,PMA)、或上述之組合。此述之非生物可斷鍵鍵結或不易快速斷鍵亦可鍵結於HA的羥基位置，透過此述之非生物可斷鍵鍵結或不易快速斷鍵來鍵結一親水分子鏈段，可提高本案所述的透明質酸衍生物在水溶性介質中的溶解性，以及降低本案所述的透明質酸衍生物所形成之微胞於生物體血液循環系統中被生物體免疫系統辨識之機會，提高該微胞在血液中的循環時間。
在一實施例中，本案所述之透明質衍生物可更以一隔離鏈段鍵結一具有生物辨識功能的蛋白質分子。此述「隔離鏈段」表示與上述A生物可斷鍵鍵結或非生物可斷鍵鍵結在HA的鍵結位置不同之鏈段，其可為碳鏈或碳氧鏈，例如碳數1至1000的碳鏈或碳氧鏈。此述隔離鏈段的分子量可為100至50,000 Da，較佳為300至30,000 Da，更佳為500至20,000 Da。此述「生物辨識功能的蛋白質分子」可為抗體或配體(ligand)，沒有特別限制，但較佳為可辨識特定腫瘤細胞之抗體或配體。
本案所述之透明質酸衍生物，由於於羥基位置施以疏水分子鏈段或親疏水兩性鏈段改質，當在親水介質中的濃度大於臨界微胞濃度後，可自我聚合形成奈米尺度的微胞結構。此述的「親水介質」係指具有親水性的溶劑，可例如水、生理食鹽水、血液、血漿等，但不限於此。此述的「臨界微胞濃度」係指上述透明質衍生物在親水介質中形成微胞結構的濃度，較佳為10至0.0001重量%之範圍。
在一實施例中，本案所述之透明質酸衍生物可與具生物活性的物質混合、震盪，形成包覆上述生物活性物質之微胞。此述之具有生物活性的物質可為具有療效的藥劑、維生素等的活性成分，特別是癌症治療的化療藥劑，例如若丹明(rhodamine)、艾黴素(doxorubicin)、紫杉醇(paclitaxel)等。在本案所述之包覆生物活性物質的微胞中，該生物活性物質與形成微胞的透明質酸衍生物的重量比較佳可為1：1至1：20。
本案所述之「酸鹼敏感」係指在酸性環境中發生酸解的現象。本案之透明質酸衍生物因具有該生物可斷鍵鍵結，於酸性環境中酸解斷鍵，因此呈現酸鹼敏感的特性。
另一方面，本案所形成的包覆生物活性物質的微胞在進入動物體血液中循環時，該微胞可因促進性滲透與滯留效應(Enhanced Permeation and Retention effect,EPR effect)而滲透並累積在細胞或組織間隙較大之部位，特別是腫瘤組織。由於腫瘤組織周圍多呈現偏酸性，上述透明質酸衍生物所鍵結的生物可斷鍵鍵結因快速酸解而斷鍵，促使所攜帶的生物活性物質快速釋出，達到毒殺腫瘤細胞的效果。再一方面，本案所述之包覆生物活性物質的微胞也可透過胞吞作用(endocytosis)進入動物體細胞中。當細胞內呈現酸性環境時，本案所述之透明質酸衍生物所鍵結的生物可斷鍵鍵結因快速酸解而斷鍵，促使所攜帶的生物活性物質快速釋出。快速的酸解及釋放活性物質，除可達到預期的治療效果外，也可避免習知微胞經胞吐作用(exocytosis)被排出細胞外的問題。再者，當本案所述之透明質酸衍生物鍵結具有生物辨識功能的蛋白質分子的情形時，可透過該蛋白質分子專一性辨識特定細胞，將包覆生物活性物質的微胞專一性的遞送至特定細胞，特別是腫瘤細胞。
本案更提供以上述透明質酸衍生物形成微胞，包覆有強烈氣味或味覺臭味的藥物或生物活性物質以降低氣味的矯味劑用途。作為矯味劑的用途時，包覆的藥物或生物活性物質沒有特別限定。特別是在經口服或腸胃道投藥時，腸胃道的酸性環境可促使本案所述之微胞形成快速酸解斷鍵，進而釋放出所包覆的藥物或生物活性物質。因此，本案所述之矯味劑也可適用於經口或腸胃道投藥的營養品。
以下說明製備本案之透明質酸衍生物之一較佳實施態樣。
首先使用離子吸附方式將水溶性多醣類的透明質酸與四丁基氫氧化銨(tetrabutylammonium hydroxide；TBAOH)結合成有機溶劑可溶解之透明質酸-四丁基氫氧化銨(HA-TBA)(如下示流程圖1)。
之後，將於透明質酸之羥基位置進行酸鹼敏感之基團改質。選用對一級或二級醇類具有選擇性氧化成醛類之氧化試劑-2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl,TEMPO)，並輔以二乙酸碘苯(Iodobenzene diacetate,BAIB)進行HA-TBA之羥基位置氧化反應獲得中間產物HA-TBA-CHO(如下式)。
然後，製備一末端含有醯肼(hydrazide)之疏水鏈段以與HA-TBA-CHO之醛基反應進而形成具有酸鹼敏感性質之腙基(hydrazone)。首先於高溫下利用錫觸媒(stannous octoate)作為催化劑，正十二醇(1-dodecanol)作為起始劑與ε-己內酯(ε-caprolactone)進行開環聚合反應得聚己內酯(poly(ε-caprolactone)；PCL)疏水性聚合物。繼之進行兩步驟的末端官能基改質反應。第一步驟以三乙基胺(triethylamine)將PCL-OH去質子化，接著以4-二甲胺基吡啶(4-dimethylaminopyridine)作為催化劑和丁二酸酐(succinic anhydride)進行加成開環反應，獲得末端改質為羧酸官能基之羧酸聚己內酯(PCL-COOH)。第二步驟以N-甲基嗎琳(N-methylmorpholine；NMM)將PCL-COOH去質子化，再和氯甲酸異丁酯(isobutylchloroformate；IBCF)行加成-脫去(addition-elimination)反應，生成反應性較高的中間產物PCL-酸酐。該中間產物PCL-酸酐再和1M四氫呋喃肼(hydrazine tetrahydrofuran)溶液反應， 得到末端改質為醯肼官能基之疏水性PCL-肼前驅物(如下式)。
本案另一實施例中，在上述末端改質為醯肼官能基之前驅物可於PCL鍵結一親水分子鏈段，例如乙二醇(PEG)，形成親疏水兩性鏈段(如下式)。
最後，將前述PCL-肼或PEG-PCL-肼前驅物與前述HATBA-CHO前驅物混合，並控制目標接枝率之化學計量，使PCL-肼或者PEG-PCL-肼形成腙鍵結(hydrazone linkage)，獲得具有酸鹼敏感生物可分解性透明質酸衍生物HA-g(Hz -PCL)共聚物或HA-g(Hz -PCL-PEG)共聚物，如下所示。
本發明之具體實施詳細說明如下，然而以下的實施例僅用於進一步揭露本發明之技術內容，不應藉以限制本案的發明範疇。
【實施例1】
透明質酸-四級銨鹽(HA-TBA)的製備
首先取500mL體積的氫離子交換樹脂(ROHM HAAS，食品等級)倒入層析管柱中，以二次水清洗氫離子交換樹脂。接下來取透明質酸鈉(HA-COONa)粉末6g(分子量Mw=16,000)加入600mL二次水配製成1%水溶液，倒入已清洗完畢的氫離子交換樹酯的層析管柱中進行鈉離子與氫離子的置換，得到HA-COONa置換成HA-COOH的中間產物。繼之將上述所得之HA-COOH水溶液中間產物加入等莫耳體積量之40%四丁基氫氧化銨9.8mL(Fluka)。於室溫下攪拌反應16小時後，冷凍乾燥後可得白色片狀之HA-TBA固體9.2g(產率99%)。HA-TBA的NMR結構鑑定光譜如第3圖所示。
【實施例2】
透明質酸四級銨鹽-醛(HATBA-CHO)製備
準備一250mL雙頸瓶並秤取實施例1的HATBA 4g(6.44mmol)，以真空系統室溫除水2小時。之後，加入71.7mL無水二甲基甲醯胺溶解。再加入5.41g的碳酸氫鈉(64.4mmol)和0.403g的2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(2.58mmol)後，降至0℃。之後加入2.07g的二乙酸碘苯(6.44mmol)，自然回溫反應6小時，得到HATBA-CHO粗產物。真空減壓旋轉濃縮二甲基甲醯胺溶劑至20mL呈橘紅色濃稠態後，緩慢滴入1000mL冰乙酸乙酯進行沈澱並離心。得到HATBA-CHO白色固體粗產物。繼之，將前述HATBA-CHO白色固體粗產物加入20mL的乙醇溶解，再行緩慢滴加至乙醚與四氫呋喃混和溶劑(乙醚：四氫呋喃=2：1)中析出大量白色固體。以離心移除溶劑後減壓濃縮，並在真空室溫乾燥1天後，得到3.05g白色HATBA-CHO固體產物。經化學計量添加調整，HA-TBA轉化為HATBA-CHO的轉化率如下表1所示。
* HA-TBA：透明質酸-四級銨鹽；TEMPO：2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物；BAIB:[雙(乙酸基)碘]苯([bis(acetoxy)iodo]benzene)；S.C.：固含量。
HA-TBA進行氧化反應後，新生成的醛類訊號位於δ 9.46 ppm與δ 9.26 ppm，相較於HA的12號氫的積分比值可計算得轉換率，並可提供調整氧化劑量後的轉換率數值變化資訊，HA-TBA-CHO的NMR結構鑑定光譜如第4圖所標示。
【實施例3】
羧基聚己內酯(PCL-COOH)製備
將十二醇(1-dodecanol)置於柱狀玻璃反應器，加入二價錫觸媒Sn(Oct)2 (stannous octoate)並升溫至130℃，緩慢加入己內酯(epsilon-caprolactone)單體。待聚合反應完成後粗產物冷卻回到室溫，以等體積二氯甲烷(dichloromethane)溶解。於4℃乙醚(diethyl ether)進行沉澱，並於-20℃靜置1小時。將白色沉澱物以抽氣過濾法收集，真空室溫乾燥24小時，得到白色固體聚己內酯單醇(PCL-OH)產物。各化學計量可得到不同分子量PCL-OH產物如下表2所示。
[表2]
a C/D=表示己內酯/十二醇的比值，b mol%表示相對於己內酯的莫耳比，c mol%表示相對於十二醇的莫耳比，PDI表示分子量的分布。
之後，秤取上述獲得的PCL-OH 6g(Mw=4281,1.37 mmol)於100 mL雙頸瓶中。真空乾燥除水，氮氣下加入15.5 mL無水四氫呋喃，加熱至60℃溶解。之後加入1.2 mL三乙基胺(7.44 mmol)。同時將0.121g的4-二甲胺基吡啶(DMAP)(0.992 mmol)及0.844g的丁二酸酐(succinic anhydride)(8.43 mmol)以16 mL的無水四氫呋喃溶解完畢。之後，將PCL-OH溶液緩慢滴加至DMAP與丁二酸酐的混和溶液中，室溫反應48小時。之後減壓濃縮移除四氫呋喃溶劑，獲得PCL-COOH粗產物。
繼之準備600 mL冰乙醚/石油醚(1:1,v/v)混合液，緩慢將前述PCL-COOH粗產物加入冰乙醚/石油醚混合液中。在析出大量白色固體後移至-20℃靜置2小時，以抽氣過濾法收集白色沉澱固體。在室溫真空乾燥，獲得到4.6g PCL-COOH。
【實施例4】
醯肼聚己內酯(PCL-hydrazide)製備
取上述所得的PCL-COOH 12g(Mw=3576,3.36 mmol)於100 mL雙頸瓶中，抽真空移除空氣。於氮氣下加入54 mL無水四氫呋喃，加熱至60℃使之完全溶解後降至室溫。接下來緩慢滴加1.9 mL N-甲基嗎琳(N-methylmorpholine,NMM,16.78 mmol)後降溫至0℃，並加入2.2 mL氯甲酸異丁酯(Isobutyl chloroformamide,IBCF,16.78 mmol)。於室溫攪拌30分鐘，生成PCL-酸酐中間產物並析出大量白色的鹽類固體。
繼之，取前述PCL-酸酐中間產物的澄清溶液緩慢滴加至裝有33.6 mL聯胺四氫呋喃溶液(1 M hydrazine in THF,33.6 mmol)的150 mL雙頸瓶中，升溫至40℃反應16小時。減壓濃縮移除四氫呋喃溶劑，得到醯肼聚己內酯(PCL-hydrazide)粗產物。最後準備1200 mL冰乙醚/石油醚(1:1,v/v)混合液，緩慢滴加醯肼聚己內酯(PCL-hydrazide)粗產物至冰乙醚/石油醚混合液中，析出大量白色固體。移至-20℃靜置2小時，並以抽氣過濾法收集白色沉澱固體，室溫真空乾燥，得到7.44g的醯肼聚己內酯(PCL-hydrazide)產物。醯肼聚己內酯(PCL-hydrazide)之FT-IR光譜如第5圖所示，其中醯肼聚己內酯(PCL-hydrazide)的醯胺基(amide)官能基吸收峰位於1637 cm-1 。
【實施例5】
醯肼聚乙二醇-聚己內酯(PEG-PCL-hydrazide)製備
首先使用250ml之柱狀玻璃器做為反應裝置，聚合前先升溫至100℃，並通氮氣30分鐘。120 g聚乙二醇單甲醚(Methoxypolyethylene Glycol,mPEG,分子量5000 g/mole)、48 g己內酯(ε-caprolactone)依序加入反應器中緩慢升高溫度直至完全溶解。溫度繼續升高至100℃時加入觸媒辛酸亞錫(Stannous Octoate,SnOct)0.67 ml，130℃反應24小時。產物先以二氯甲烷溶解，再以乙醚進行再沉澱後，於25℃之溫度下真空乾燥24小時，得到PEG-PCL-OH為白色粉末狀產物。不同PEG鏈長與不同化學劑量比例產出之PEG-PCL-OH如下表3所示。
[表3]
*PDI表示分子量的分布。
取前述PEG-PCL-OH產物樣品1712 g(Mw=4928,2.435 mmol)於100 mL雙頸瓶中真空乾燥除水。於氮氣下加入14.1 mL無水四氫呋喃並加熱至60℃，待PEG-PCL-OH均勻溶解後加入1.1 mL三乙基胺(7.305 mmol)。同時將0.119 g的4-二甲胺基吡啶(DMAP)(0.974 mmol)及0.828 g的丁二酸酐(succinic anhydride)(8.28 mmol)以25 mL的無水四氫呋喃溶解完畢後。將前述PEG-PCL-OH溶液緩慢滴加至DMAP與丁二酸酐混和溶液中，室溫反應48小時後減壓濃縮移除四氫呋喃溶劑。獲得PEG-PCL-COOH(PEG1900 -PCL3000 -COOH)粗產物。繼之，準備800 mL冰乙醚/石油醚(1:1,v/v)混合液，緩慢滴加PEG1900 -PCL3000 -COOH粗產物至冰乙醚/石油醚混合液中，析出大量白色固體。移至-20℃靜置2小時，以抽氣過濾法收集白色沉澱固體，室溫真空乾燥得到11.06 g的PEG-PCL-COOH(PEG1900 -PCL3000 -COOH)。不同PEG-PCL-OH鏈長與不同化學劑量比例產出之PEG-PCL-COOH結果如下表4所示。
[表4]
SA：丁二酸酐；DMAP: 4-二甲胺基吡啶；Et3N：三乙胺(triethylamine)；THF：四氫呋喃。
最後秤取上述樣品2310 g產物PEG1900 -PCL3000 -COOH(Mw=4928,2.03 mmol)於100 mL雙頸瓶中，抽真空移除空氣。氮氣下加入45 mL無水四氫呋喃加熱至60℃，使之完全溶解後降溫至室溫。接下來緩慢滴加1.1 mL N-甲基嗎琳(N-methylmorpholine,NMM,10.15 mmol)後，降溫至0℃，加入2.2 mL氯甲酸異丁酯(isobutyl chloroformamide,IBCF,10.15 mmol)。於室溫下攪拌30分鐘生成PEG1900 -PCL3000 -酸酐中間產物，並析出大量白色的鹽類固體。取澄清之PEG1900 -PCL3000 -酸酐中間產物溶液，緩慢滴加至裝有20.3 mL聯胺四氫呋喃溶液(1 M hydrazine in THF,20.03 mmol)的150 mL的雙頸瓶中，升溫至40℃中反應16小時。經過減壓濃縮移除四氫呋喃溶劑，得PEG1900 -PCL3000 -醯肼(PEG1900 -PCL3000 -hydrazide)粗產物。繼之，準備1200 mL冰乙醚/石油醚(1:1,v/v)混合液，緩慢滴加PEG1900 -PCL3000 -醯肼粗產物至冰乙醚/石油醚混合液中，析出大量白色固體。之後移至-20℃靜置2小時，以抽氣過濾法收集白色沉澱固體。室溫真空乾燥24小時後，得到8.76gPEG1900 -PCL3000 -醯肼白色粉末狀產物。不同PEG-PCL-COOH鏈長與不同化學劑量比例產出之PEG-PCL-醯肼結果如下表5所示。
[表5]
IBCF：氯甲酸異丁酯；NMM：N-甲基嗎琳；NH2 NH2 in THF：聯胺四氫呋喃溶液；THF：四氫呋喃。
【實施例6】
透明質酸-g-(腙-聚己內酯)[HA-g-( Hz PCL)]製備
秤取實施例2所得的HATBA-CHO(0.805 mmol)0.5g於25 mL雙頸瓶中，加入5.6 mL絕對乙醇溶解。另取實施例4所得的PCL-醯肼(0.0805 mmol)0.344g，加入4 mL絕對乙醇溶解後，再緩慢滴加至HATBA-CHO乙醇溶液中。65℃反應8小時後回室溫冷卻，得到HATBA16k -g-(Hz PCL)粗產物(PCL接枝率為10%)。
接下來將上述HATBA16k -g-(Hz PCL)粗產物裝入透析膜(molecular weight cut out(MWCO) 12,000~14,000)於16℃環境下進行透析純化。透析程序為500 mL DMSO透析一天，接下來以pH=8之飽和食鹽水透析二天，再對pH=8的二次水透析兩天後。以鈉離子交換樹脂置換TBA後得到以得純化後的HA-g-(Hz PCL)產物水溶液。再將HA-g-(Hz PCL)水溶液冷凍乾燥後，獲得最終產物HA16k -g-(Hz PCL)/(Hz PCL接枝率為10%)。
HA16k -g-(Hz PCL)結構以1 H-NMR進行鑑定如第6圖所示。以12號之proton訊號(δ 1.97 ppm,s)作為計算PCL接枝比，其積分值相對於腙鍵結(hydrazone linkage)之proton訊號(δ 8.33 ppm,s)。求得HA16k -g-(Hz PCL)結構中PCL接枝率。
【實施例7】
透明質酸-g-(腙-聚己內酯-聚乙二醇) [HA-g-( Hz PCL-PEG)]製備
秤取實施例2所得的HATBA-CHO 2g(3.22 mmol)於100 mL雙頸瓶中，加入20 mL絕對乙醇溶解。另取實施例5所得的樣品131.06g(PEG550 -PCL3000 -醯肼)(0.39 mmol)，加入15 mL絕對乙醇溶解後，再緩慢滴加至HATBA-CHO乙醇溶液中。65℃反應8小時後，回降溫至室溫，得到HATBA16k -g-(Hz PCL3000 -PEG550 )粗產物(PCL3000 -PEG550 接枝率12%)。
將HATBA16k -g-(Hz PCL3000 -PEG550 )粗產物裝入透析膜(MWCO 12,000~14,000)中，於16℃環境下進行透析純化。透析程序為500 mL DMSO透析一天，接下來以pH=8之飽和食鹽水透析二天，再對pH=8的二次水透析兩天。之後以鈉離子交換樹脂置換TBA後，得到純化後之HA16k -g-(Hz PCL3000 -PEG550 )水溶液。再將該水溶液冷凍乾燥後，可得為黃色固體之HA16k -g-(Hz PCL3000 -PEG550 )最終產物(PCL3000 -PEG550 接枝率12%)。不同的PEG550 -PCL3000 -醯肼鏈長組成與不同化學劑量比例產出之HA16k -g-(Hz PCL3000 -PEG550 )結果如下表6所示。
另一方面，HA16k -g-(Hz PCL3000 -PEG550 )結構以1 H-NMR進行鑑定如第7圖所示。以12號之proton訊號(δ 1.91 ppm,s)作為計算PCL接枝比，其積分值相對於腙鍵結(hydrazone linkage)之proton訊號h1(δ 9.10 ppm,s)與h2(δ 6.51 ppm,s)，求得HA16k -g-(Hz PCL-PEG)結構中PCL接枝率。
[表6]
【實施例8】
透明質酸-g-(聚己內酯-聚乙二醇)[HA-g-(PCL-PEG)]製備
秤取實施例5所得的PEG-PCL-OH樣品13 1.87 g(0.54 mmol)於雙頸瓶中，利用甲苯溶劑於65~70℃共沸除水。接續加入二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide,DMSO)4.8mL溶解上述PEG-PCL-OH。再加入6000ppm的三乙二胺(triethylene diamine)(DABCO)以及3000ppm的辛酸亞錫(stannous octoate(SnⅡ))做為觸媒。繼之，再加入氫化苯基甲烷二異氰酸酯(dicyclohexylmthane diisocyanate,H12 MDI,0.23 mL,0.48 mmol)至反應瓶中，60℃反應6小時，得到PEG-PCL-NCO預聚合物溶液。
接下來於50 mL雙頸瓶中加入實施例2所得的HA16k -TBA 3 g(4.84 mmol)。加入13 mL DMSO後將反應瓶加熱至60℃溶解，待完全溶解再加入6000ppm三乙二胺以及3000ppm辛酸亞錫做為觸媒。將前述PEG-PCL-NCO預聚合物溶液打入HA-TBA之反應瓶中，於60℃下反應16小時，獲得HA-g-(PCL-PEG)粗產物(PCL-PEG接枝率為10%)。
最後將前述HA-g-(PCL-PEG)粗產物裝入透析膜(MWCO 12,000~14,000)中，於16℃環境下進行透析純化。透析程序為500 mL DMSO透析一天，接下來以pH=8之飽和食鹽水透析二天，再對pH=8的二次水透析兩天。之後以鈉離子交換樹脂置換TBA後，得到純化後之HA-g-(PCL-PEG)粗產物水溶液。再將該水溶液冷凍乾燥後，可得為黃色固體HA-g-(PCL-PEG)最終產物(PCL-PEG接枝率10%)。不同PCL-PEG鏈長組成與不同化學劑量比例產出之HA-g-(PCL-PEG)結果如下表7所示。
[表7]
【實施例9】
臨界微胞濃度(CMC)分析
秤取上列樣品配製成1 mg/ml水溶液，以50%稀釋方式將前述樣品依序稀釋至6×10-5 mg/ml等15種濃度。分別加入15μl的1.8×10-4 M芘(pyrene)丙酮溶液，混合均勻後，避光靜置16小時，真空抽除丙酮。接下來使用螢光光譜儀，以波長設定390 nm，激發波長掃瞄設定270-360nm進行上述15種濃度掃瞄。記錄於330-340nm間吸收最強之波長值。以濃度的Log值與螢光光譜吸收強度值做圖，找出螢光光譜吸收強度變異起始點為臨界微胞濃度值。下表8顯示不同微胞材料的臨界微胞濃度(CMC)。
[表8]
【實施例10】
粒徑分析
粒徑分析步驟為，秤取測試樣品20 mg，加入2 mL DMSO溶劑，於室溫震盪溶解20分鐘。再加入1 mL二次去離子水，於室溫震盪20分鐘至完全溶解。接下來於室溫環境下將上述溶液以MWCO 6000~8000透析袋對二次去離子水1000 mL透析24小時，去除DMSO溶劑。待透析結束，收集透析袋內樣品溶液，調配製成測試樣品的臨界微胞濃度(CMC)100倍的溶液，進行粒徑測試。使用粒徑分析儀為COULTER，N4 Plus粒徑儀。測試前先行以0.45 μm濾膜過濾測試樣品。將樣品水溶液置於石英樣品槽，測試溫度設定為25℃，光散射角度為90°，記錄平均粒徑與粒徑分佈，結果如下表9所示。
[表9]
【實施例11】
酸解性能測試
秤取實施例7所得的樣品40之HA-g-(HZ PCL-PEG)材料，配製成5組相同濃度之HA-g-(HZ PCL-PEG)微胞水溶液(濃度為CMC的100倍濃度，pH值5.0)。將上述微胞水溶液移入MWCO 12000~14000透析袋中，於37℃/pH=5.0水中透析24小時。其間分別於不同時間取樣，並迅速將水溶液調整為中性後，以DMSO透析2天，將酸催化斷鍵之PEG-PCL-醯肼移除。繼之以NMR氫譜計算透明質酸上(δ 1.97 ppm,s)proton訊號相對於NMR氫譜(δ 1.2-2.5 ppm)間變化，計算出HA-g-(HZ PCL-PEG)材料所形成的微胞於pH=5.0環境中酸解比例，結果如下表10所示。
[表10]
【實施例12】
微胞材料藥物包覆及酸解釋放試驗
秤取實施例7所得的樣品34 50 mg與2.0 mg若丹明-123(rhodamine-123)於DMSO(10 mL)中。使用超音波震盪5分鐘使之溶解，於室溫環境中靜置一天後，將溶液轉移至透析袋中(Spectrum,MWCO 3,500)。對pH 8.0的二次水透析2天(將未包覆的若丹明-123確實去除)，以冷凍乾燥法使上述所得包覆若丹明-123的微胞溶液乾燥。
取上述凍乾後的微胞10 mg回溶於水中，倒入透析袋(spectrum,MWCO 3,500)，於pH 5.0的二次水進行酸解試驗。結果顯示，裝有包覆若丹明-123之微胞水溶液，外觀於0小時為橘色(若丹明-123的原來顏色)，6小時轉為淺黃綠色，20小時接近無色透明。此結果顯示包覆於微胞內的若丹明-123因微胞酸解而釋出。之後，分別於第0小時與第6小時取透析袋內溶液乾燥後之產物，以1 H-NMR分析比對。結果顯示，開始前之第0小時與酸解開始之第6小時的微胞材料，發現6小時於δ 9.10、6.51 ppm的腙(hydrazone)氫訊號與δ 1.10-1.32 ppm的PCL氫訊號均已消失。此結果代表腙被酸解後，PEG-PCL片段藉由透析被移除。
【實施例13】
透明質酸衍生物包覆艾黴素(Doxorubicin)藥物配方
秤取2 mg艾黴素加入1 ml的DMSO攪拌。然後加入艾黴素3倍當量莫耳濃度的三乙胺(TEA)，室溫攪拌過夜。之後，再秤取實施例6至實施例8所得的不同微胞材料各10 mg，加入2 ml的DMSO與去離子水的共同溶液(v/v=2/1)，攪拌1小時至完全溶解。將上述2溶液互相混合，攪拌0.5小時至完全均勻後，置入透析膜為MWCO=3500的透析袋中，以去離子水或pH 7.4的PBS進行透析一天。所得到的樣品進行後續包覆率與粒徑量測。
不同配方組成及其粒徑與包覆率結果如下表11及表12所示。結果顯示，在疏水鏈段PCL末端導入親水的PEG鏈段(親疏水分子鏈段)，除了可增加材料的親水性質外，此配方在酸性環境中之具有酸解能力之鍵結(腙鍵結)斷鍵後，可以使得包覆在微胞內部的PEG鏈段鑽出微胞外，同時釋放出藥物，增加藥物在酸性環境的釋放量。
[表11]
D/P比：艾黴素對微胞材料的比值；P.S.：粒徑；E.E.：包覆率。
[表12]
D/P比：艾黴素對微胞材料的比值；P.S.：粒徑；PI：分子量分散；[DXR]：艾黴素濃度；E.E.：包覆率。
【實施例14】
透明質酸衍生物包覆艾黴素(Doxorubicin)之藥物釋放行為
依照前實施例13所述之配方及方法，將艾黴素藥物包覆於不同材料結構組成之微胞中進行釋放行為測試。取樣時間為第0小時至24小時，結果如第8圖與第9圖所示。第8圖顯示實施例13之HA-g-(Hz PCL-PEG)在不同pH值下的釋放曲線。結果得知，酸性環境下的藥物釋放明顯高於中性環境的藥物釋放，其比值約2倍。此結果表示藉由具有酸解能力之鍵結(腙鍵結)的作用，可以加速藥物在酸性環境下的釋放。第9圖顯示實施例13之HA-g-(Hz PCL-PEG)材料中不同PEG鏈長的藥物釋放效果。結果可觀察到，不同親水鏈(PEG)的長度，藉由具有酸解能力之鍵結(腙鍵結)的效果，可以看出酸鹼敏感的特性。而且，親水鏈(PEG)長度愈長，顯示藥物釋放率的增加。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1圖顯示本案一實施例之HA-g-HZ PCL的化學結構式，HA表示透明質酸之單元，g表示接枝狀態，HZ表示腙鍵結，PCL表示聚己內酯鏈段。
第2圖顯示本案一實施例之HA-g-(HZ PCL-PEG)的化學結構式，HA表示透明質酸之單元，g表示接枝狀態，HZ表示腙鍵結，PCL表示聚己內酯鏈段；PEG表示乙二醇鏈段。
第3圖顯示HA-COONa及HA-TBA之1 H-NMR光譜圖。
第4圖顯示HATBA-CHO之1 H-NMR光譜圖。
第5圖顯示PCL-醯肼的FT-IR光譜圖。
第6圖顯示本案一實施例之HA-g-(HZ -PCL)的化學結構式及其1 H-NMR光譜圖，HA表示透明質酸之單元，g表示接枝狀態，HZ表示腙鍵結，PCL表示聚己內酯鏈段。
第7圖為本案一實施例之HA-g-(HZ PCL-PEG)的化學結構式及其1 H-NMR結構鑑定光譜圖，HA表示透明質酸之單元，g表示接枝狀態，HZ表示腙鍵結，PCL表示聚己內酯鏈段；PEG表示乙二醇鏈段。
第8圖顯示本案實施例之微胞配方的藥物釋放行為。
第9圖顯示本案實施例之微胞配方的藥物釋放行為。

Claims (17)

  1. 一種透明質酸衍生物，其具有如式(I)所示之結構： 其中，HA表示N-乙醯基-D-葡醣胺和D-葡醣醛酸之單元，q表示2至10000之整數；A表示腙(hydrazone)基團；M表示疏水分子鏈段或親疏水兩性鏈段；以及p表示該[A-M]直接鍵結於每一該HA單元之數量，且p為0至4之整數，且每一該HA單元之p不得同時為0；其中，該透明質酸衍生物具有生物可分解性及在酸性環境中斷鍵的酸鹼敏感性。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之透明質酸衍生物，其中，該生物可斷鍵鍵結係於酸性環境進行酸解斷鍵。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之透明質酸衍生物，其中，該生物可斷鍵鍵結係與該N-乙醯基-D-葡醣胺及該D-葡醣醛酸之至少一羥基形成共價鍵結相互連接。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之透明質酸衍生物，其中，該疏水分子鏈段由生物可吸收高分子的重複單元所構成。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之透明質酸衍生物，其中，該生物可吸收性高分子的重複單元包括：己內酯 (caprolactone)、丁內酯(butyrolactone)、D-乳酸交酯(D-lactide)、L-乳酸交酯(L-lactide)、D-乳酸(D-lactic acid)、L-乳酸(L-lactic acid)、乙交酯(glycolide)、甘醇酸(glycolic acid)、氫氧基已酸(hydroxy hexonoic acid)、氫氧基丁酸(hydroxy butyric acid)、戊內酯(valerolactone)、氫氧戊酸(hydroxy valeric acid)、蘋果酸(malic acid)、上述之共聚物、或上述之組合。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之透明質酸衍生物，其中，該親疏水兩性鏈段由一疏水區域的重複單元及一親水區域的重複單元所構成。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之透明質酸衍生物，其中，該疏水區域的重複單元包括：己內酯(caprolactone)、丁內酯(butyrolactone)、D-乳酸交酯(D-lactide)、L-乳酸交酯(L-lactide)、D-乳酸(D-lactic acid)、L-乳酸(L-lactic acid)、乙交酯(glycolide)、甘醇酸(glycolic acid)、氫氧基已酸(hydroxy hexonoic acid)、氫氧基丁酸(hydroxy butyric acid)、戊內酯(valerolactone)、氫氧戊酸(hydroxy valeric acid)、蘋果酸(malic acid)、上述之共聚物、或上述之組合。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之透明質酸衍生物，其中，該親水區域的重複單元包括：乙二醇(ethylene glycol)、氧化乙烯(ethylene oxide)、乙烯吡咯烷酮(vinylpyrrolidone)、丙烯酸(acrylic acid)、甲基丙烯酸(methacrylic acid)、上述之共聚物、或上述之組合。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之透明質酸衍生物，其中，該M的分子量為100至50,000Da的範圍。
  10. 一種微胞，由申請專利範圍第1-9項任一項所述之透明質酸衍生物於一親水介質中形成。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之微胞，其中該透明質酸衍生物的濃度相對於該親水介質為10重量%至0.0001重量%之範圍。
  12. 一種藥物遞送系統，包括一載體包覆一生物活性成分，其中該載體為由申請專利範圍第1-11項任一項所述之透明質酸衍生物所構成。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之藥物遞送系統，其中，該載體形成微胞構造。
  14. 如申請專利範圍第12項所述之藥物遞送系統，其中該生物活性成分包括藥物或營養物質。
  15. 如申請專利範圍第12項所述之藥物遞送系統，其中該活性成分包括抗癌藥物。
  16. 如申請專利範圍第12項所述之藥物遞送系統，其中該生物活性成分與該透明質酸衍生物的重量比為1：1至1：20。
  17. 一種矯味劑，由申請專利範圍第1-11項任一項所述之透明質酸衍生物所構成，用以包覆一生物活性物質以減少該生物活性物質的味道。
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