TWI480377B - Methods for detecting Bacillus anthracis - Google Patents
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Description
本發明係有關一種生化檢測方法，尤指一種檢測炭疽桿菌的方法。
炭疽桿菌可做為生化武器使用，亦常被恐怖份子以包裹粉末的形式到處傳送，藉此達到使人們感染的目的，造成人心惶惶，而由於炭疽桿菌必須要經過較長時間的檢驗才能得到檢驗結果，往往在不知情的狀況下便已經將炭疽桿菌散播出來。因此，如何快速、有效且精準的進行炭疽桿菌的檢測，實為研發人員所共同努力之目標。
目前已經有許多運用基因分子檢測微生物的快速檢測技術，其中最為常見的便是聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction,PCR)，其反應過程主要有三個階段，包含：「變性反應(Denaturation)」、「引子黏和反應(Primer Annealing)」以及「延展反應(Extension)」，其中這三個階段所需要的反應溫度皆不相同。現今商業化之PCR設備，所需反應樣本包含欲擴增之模板DNA、與模板DNA各股上特定序列互補之寡核苷酸引子對、熱安定性DNA聚合酶、以及去氧核苷三磷酸(dNTP)。PCR設備藉由反覆加熱與冷卻反應樣本，使反應樣本在三種不同溫度間循環，藉以擴增模板DNA核酸序列之特定部分。
PCR第一個步驟為變性反應，其為將反應樣本加熱至高溫，以讓雙股之模板DNA分離成為單股DNA，典型地變性反應之溫度為介於90℃至95℃之範圍。
PCR第二個步驟為引子結合反應，其為先將分離成為單股DNA的反應樣本冷卻至較低溫度，以讓引子與第一個步驟形成之單股DNA結合，而形成DNA與引子之複合物，典型地引子結合反應之溫度係依據所用引子之解鏈溫度(melting temperature,Tm)而選擇，通常介於35℃至65℃之範圍。
PCR第三個步驟為延展反應，其為將形成DNA與引子的複合物的反應樣本維持於適當溫度，藉由DNA聚合酶的作用，使引子得以延展，形成與模板DNA各股互補的新單股DNA，典型聚合反應之溫度為72℃。
因此由上述三階段組成的每一次循環，可以複製兩倍的模板DNA，將包含變性反應、引子結合反應及延展反應等三個溫度各異之步驟的PCR循環重複約20至40次，可生產出數百萬個標的核酸序列之複製物。
雖然聚合酶連鎖反應可有效的進行基因複製，藉此提高檢測的準確度，但此技術僅可實施於相關的實驗室與專業的技術人員，對於炭疽桿菌的檢測的即時性與有效性仍無法達到要求，難以進行實際應用。
本發明之主要目的，在於解決習知技術無法快速且準確的進行炭疽桿菌的檢測。
為達上述目的，本發明提供一種檢測炭疽桿菌的方法，包含有下列步驟：S1：取得一待測樣品的一脫氧核糖核酸；S2：將該脫氧核糖核酸分別與pXO1、pXO2以及PL3的引子組進行混和，其中，pXO1的前置引子序列為GGACACATACTAGTGAAGTACATGGAA、反置引子序列為
TCCTGCAGATACACTCCCACCAA，pXO2的前置引子序列為TCTTCCCAGATAATGCATCGCT、反置引子序列為CACGGAATGCTGTTTCCTCAT，PL3的前置引子序列為CGATTGATGAAGGCGACAATGTACT、反置引子序列為CTCCTCGTGTGGATCGGTTGIII；S3：分別對該第一反應混和物、該第二反應混和物以及該第三反應混和物進行聚合酶連鎖反應；及S4：檢測該第一反應混和物、該第二反應混和物以及該第三反應混和物，若分別都含有pXO1、pXO2以及PL3的成分，則判斷該待測樣品含有炭疽桿菌。
由上述說明可知，本發明具有下列特點：
一、利用判斷該待測樣品是否同時含有pXO1、pXO2以及PL3的成分，來確認是否為有毒的炭疽桿菌。
二、以pXO1、pXO2以及PL3中的特定引子組進行成分檢驗，提高檢測的靈敏度以及檢測的專一性。
10‧‧‧底座
11‧‧‧光源
20‧‧‧加熱座
21‧‧‧主要加熱件
30‧‧‧輔助加熱件
40‧‧‧反應試管
41‧‧‧底部
42‧‧‧中間段
50‧‧‧固定連接座
60‧‧‧觀測模組
70‧‧‧溫度控制裝置
80‧‧‧高導熱件
S1~S4、S3A、S3B‧‧‧步驟
圖1，為本發明之步驟流程示意圖。
圖2，為本發明之立體結構示意圖。
圖3，為本發明之部分立體分解示意圖。
圖4，為本發明之局部剖面示意圖。
有關本發明之詳細說明及技術內容，現就配合圖示說明如下：請參閱「圖1」所示，本發明係為一種檢測炭疽桿菌的方法，包含有下列步驟：
S1：取得一待測樣品的一脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA)。
S2：引子組混和，將該脫氧核糖核酸分別與pXO1、pXO2以及PL3的引子組進行混和，其中，pXO1的前置引子(Forward Primer)序列為GGACACATACTAGTGAAGTACATGGAA、反置引子(Reverse Primer)序列為TCCTGCAGATACACTCCCACCAA，pXO2的前置引子序列為TCTTCCCAGATAATGCATCGCT、反置引子序列為CACGGAATGCTGTTTCCTCAT，PL3的前置引子序列為CGATTGATGAAGGCGACAATGTACT、反置引子序列為CTCCTCGTGTGGATCGGTTGTTT。前置引子以及反置引子係用以作為複製DNA的起點，以順利進行DNA的複製，並且以上所述之前置引子以及反置引子的序列皆位於5’端與3’端之間。而於本發明中，其係利用探針系統(Probe System)的即時-聚合酶連鎖反應(Real Time-PCR,RT-PCR)作為一較佳實施例的說明，其中pXO1的探針(Probe)可為FAM AGTGCATGCGTCGTTCT MGB，pXO2的探針可為VIC TCCCAAGAGCCTCTG MGB，PL3的探針可為FAM AGTGCATGCGTCGTTCT MGB，其中，以pXO1的探針作為說明，在序列前後的「FAM」以及「MGB」分別代表發報染色體(reporter dye)以及抑制染色體(quencher dye)，在一般狀況下，當探針尚未附著於目標物上時，該發報染色體以及抑制染色體的距離較近，因此該抑制染色體可吸收該發報染色體所發出的螢光。而當該探針尋找到目標物時，亦即找到對應的DNA時，該探針便會被水解，而使該發報染色體及該抑制染色體分離，因此該發報染色體的螢光便會顯現出來，而被觀察者所覺知。
S3：進行聚合酶連鎖反應，分別對該第一反應混和物、該第二反應混和物以及該第三反應混和物進行聚合酶連鎖反應，其中，本發明係舉例一較佳的聚合酶連鎖反應方式，可較為有效且快速的進行聚合酶連鎖反應，包含有步驟：
S3A：置放樣品於反應試管40，將該第一反應混和物、該第二反應混和物以及該第三反應混和物分別置放於不同的三反應試管40(示於「圖2」中)內，該些反應試管40皆為長管狀，於本實施例中，係利用不同的反應試管40進行樣品的置放，然亦可將該第一反應混和物、該第二反應混和物以及該第三反應混和物置放於同一個反應試管40內，同樣也可進行反應與檢測。
S3B：對該些反應試管40的底部進行加熱，使該第一反應混和物、該第二反應混和物以及該第三反應混和物分別進行隔絕式恒溫聚合酶連鎖反應(Insulated isothermal PCR,iiPCR)，由於反應試管40為長管狀，請配合參閱「圖2」、「圖3」及「圖4」所示，其係為本發明所利用之機構，其包含有一底座10、一與該底座10連接的加熱座20、一與該加熱座20連接的輔助加熱件30、至少一反應試管40、一固定該反應試管40於該輔助加熱件30上的固定連接座50，以及一觀測模組60。該底座10包含有一光源11(於本實施例中為發光二極體)，其可用以照射容置於該反應試管40中。該加熱座20包含有一主要加熱件21，其可對該反應試管40的底部進行加熱至一變性溫度，該變性溫度介於90℃~98℃之間，藉此使該反應試管40的底部進行變性反應，而藉由熱循環反應，便可藉由溫度較低的反應試管40中段以及較高位置的部分進行引子結合反應以及延展反應，藉此達到循環連鎖反應的目的。其中，為了使該主要加熱件21之熱量能夠更準確的傳遞至該反應
試管40，可將一高導熱件80圈繞於該反應試管40的底部41，而使該反應試管40透過該高導熱件80與該主要加熱件21接觸。除此之外，為了更加穩定該反應試管40的溫度變化，本實施例中之結構更具有該輔助加熱件30以及一與該輔助加熱件30連接的溫度控制裝置70，該輔助加熱件30與該主要加熱件21間隔一距離而對應至該反應試管40的一中間段42，而該輔助加熱件30並未與該反應試管40連接，僅藉由控制該反應試管40週邊環境溫度的方式穩定該反應試管40之中間段42的溫度。該輔助加熱件30位於該反應試管40的中間段42的位置進行輔助溫控，加熱該反應試管40至一輔助加熱溫度，該輔助加熱溫度的溫度小於變性溫度，可介於40℃~50℃之間，藉此穩定聚合酶連鎖反應的進行。
S4：檢測成分含量，若該第一反應混和物、該第二反應混和物以及該第三反應混和物分別都含有pXO1、pXO2以及PL3的成分，則判斷該待測樣品含有炭疽桿菌。以pXO1在本實施例的檢測作為舉例說明：當該脫氧核糖核酸含有pXO1的成分時，pXO1的探針因附著於pXO1的DNA上，便會水解而產生螢光，隨著聚合酶連鎖反應的不斷進行，pXO1便開始被複製增生，因此螢光便越發明顯，觀察者便可藉由螢光的生成來確定待測樣品是否含有pXO1的成分。同理，pXO2以及PL3也是運用一樣的方式進行檢測，以確認該待測樣品的成分是否含有pXO2或PL3。而只有當該待測樣品同時含有pXO1、pXO2以及PL3時，該待測樣品才會是有毒的炭疽桿菌，也才會有可能產生危害。
綜上所述，本發明具有下列特點：
一、利用判斷該待測樣品是否同時含有pXO1、pXO2以及PL3的成分，來確認是否為有毒的炭疽桿菌。
二、以pXO1、pXO2以及PL3中的特定引子組進行成分檢驗，提高檢測的靈敏度以及檢測的專一性。
三、配合利用iiPCR進行檢測，而具有更快的檢測速度以及檢測精準度。
因此本發明極具進步性及符合申請發明專利之要件，爰依法提出申請，祈 鈞局早日賜准專利，實感德便。
以上已將本發明做一詳細說明，惟以上所述者，僅為本發明之一較佳實施例而已，當不能限定本發明實施之範圍。即凡依本發明申請範圍所作之均等變化與修飾等，皆應仍屬本發明之專利涵蓋範圍內。
<110> 瑞基海洋生物科技股份有限公司
<120> 檢測炭疽桿菌的方法
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<141> 2013/04/02
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S1~S4、S3A、S3B‧‧‧步驟
Claims (7)
- 一種檢測炭疽桿菌的方法，包含有下列步驟：S1：取得一待測樣品的一脫氧核糖核酸；S2：將該脫氧核糖核酸分別與pXO1、pXO2以及PL3的引子組進行混和而分別為一第一反應混和物、一第二反應混和物以及一第三反應混和物，其中，pXO1的前置引子包含有如SEQ ID NO：1所示之序列、pXO1的反置引子包含有如SEQ ID NO：2所示之序列，pXO2的前置引子包含有如SEQ ID NO：3所示之序列、pXO2的反置引子包含有如SEQ ID NO：4所示之序列，PL3的前置引子包含有如SEQ ID NO：5所示之序列、PL3的反置引子包含有如SEQ ID NO：6所示之序列；S3：分別對該第一反應混和物、該第二反應混和物以及該第三反應混和物進行聚合酶連鎖反應；及S4：檢測該第一反應混和物、該第二反應混和物以及該第三反應混和物，若分別都含有pXO1、pXO2以及PL3的成分，則判斷該待測樣品含有炭疽桿菌。
- 如申請專利範圍第1項所述之檢測炭疽桿菌的方法，其中於步驟S2中，pXO1的探針包含有如SEQ ID NO：7所示之序列，pXO2的探針包含有如SEQ ID NO：8所示之序列，PL3的探針包含有如SEQ ID NO：9所示之序列，而於步驟S3中進行探針系統的即時聚合酶連鎖反應。
- 如申請專利範圍第2項所述之檢測炭疽桿菌的方法，其中於步驟S3中，更包含有以下步驟：S3A：將該第一反應混和物、該第二反應混和物以及該第三反應混和物分別置放於不同的三反應試管內，該三反應試管皆為長管狀；及S3B：對該些反應試管的底部進行加熱，使該第一反應混和物、該第二反應混和物以及該第三反應混和物分別進行聚合酶連鎖反應。
- 如申請專利範圍第3項所述之檢測炭疽桿菌的方法，其中於步驟S3B中，其係利用一主要加熱件對該反應試管的底部進行加熱至一變性溫度，並維持於該變性溫度。
- 如申請專利範圍第4項所述之檢測炭疽桿菌的方法，其中該變性溫度介於90℃~98℃之間。
- 如申請專利範圍第4項所述之檢測炭疽桿菌的方法，其中於步驟S3B中，其係更利用一輔助加熱件對該反應試管的一中間段進行加熱至一輔助加熱溫度，該輔助加熱溫度小於該變性溫度。
- 如申請專利範圍第6項所述之檢測炭疽桿菌的方法，其中該輔助加熱溫度介於40℃~50℃之間。
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|---|---|---|---|---|
| CN201311886Y (zh) * | 2008-01-07 | 2009-09-16 | Abb法国公司 | 电磁接触器 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Kumar, S. and Tuteja, U.," Detection of Virulence-Associated Genes in Clinical Isolates of Bacillus anthracis by Multiplex PCR and DNA Probes", J. Microbiol. Biotechnol., 2009, Vol.19, No. 11, P.1475-1481. * |
| Makino, S. , et al.," Molecular Characterization and Protein Analysis of the cap Region, which is Essential for Encapsulation in Bacillus anthracis", J. Bacteriol., 1989, Vol.171, No. 2, P.722-730. * |
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| Wielinga, P.R., et al.," A Multiplex Real-Time PCR for Identifying and Differentiating B. anthracis Virulent Types", Int. J. Food Microbiol., Vol.145, Suppl. 1, P.S137-S144, 2010-07-31 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW201439327A (zh) | 2014-10-16 |
| US20140295435A1 (en) | 2014-10-02 |
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