TWI482860B - 利用安定之輔酶使去氫酶安定之方法 - Google Patents

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Description

利用安定之輔酶使去氫酶安定之方法
本發明關於一種藉由於安定之輔酶的存在下儲存酶使該酶安定之方法。本發明進一步關於被安定之輔酶所安定之酶及該酶於供偵測被分析物之測試元件中之用途。
生化測量系統係臨床相關分析方法之重要構成成分。此處之優先係測量被分析物(例如代謝物或受質)，該等被分析物係直接或間接地藉由酶之幫助而被測定。於此情況下，該等被分析物係藉由酶-輔酶複合物之幫助而被轉化且隨後被定量。該轉化需要欲被測定之被分析物與適當之酶和輔酶接觸且通常使用催化用量之該酶。藉由該酶催化反應使該輔酶改變(例如被氧化或被還原)。透過媒質可直接或電化學或光測地偵測此反應過程。校準(calibration)提供該測量與欲被測定之被分析物濃度間的直接關係。
輔酶係與酶共價或非共價鍵結且為被分析物之轉化反應而改變之有機分子。輔酶之顯著實例分別為菸醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和菸醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，且藉由還原反應自該NAD和NADP分別生成NADH和NADPH。
值得注意的是先前技藝所習知之測量系統係於有限期間及環境之特殊要求(諸如冷卻或乾燥儲存)下呈安定以達到所需之安定性。因此，於特殊應用(例如最終使用者本身所進行之測試，諸如例如血糖之自我監測)上，經由不正確、未受注意之錯誤儲存而產生不正確的結果係可能的。特別是主要包裝打開太久所導致之乾燥劑耗盡可能會致使產生錯誤之測量，該錯誤之測量經由某些系統可能幾乎不被使用者確認。
一種用於增加生化測量系統之安定性的習知手段係使用安定之酶，例如使用源自嗜熱性生物體之酶。另一可能性係藉由化學修飾(例如交聯)或發生突變使酶安定。此外，亦可加入酶安定劑(諸如例如海藻糖、聚乙烯吡咯啶酮及血清白蛋白)或藉由例如光聚合反應可將酶包封於聚合物網絡中。
亦業已嘗試使用安定之媒質以改善生化測量系統之安定性。因此，經由使用氧化還原電勢儘可能低之媒質，使測試之專一性增加且反應期間之干擾消失。然而，酶/輔酶複合物之氧化還原電勢形成媒質之氧化還原電勢的較低限制。低於此等電勢下，與媒質之反應速率減緩或甚至停止。
使用不含有媒質之生化測量系統亦是一種可替代之可能，其中例如直接偵測輔酶(例如輔酶NADH)。然而，該測量系統之一個不利處在於輔酶(諸如NAD和NADP)之不安定性。
NAD和NADP係遇鹼不安定之分子且彼等之降解途徑係描述於文獻(N.J.Oppenheimer,The Pyridine Nucleotide Coenzymes,Academic press New York,London 1982,J.Everese,B.Anderson,K.You等編輯，第3章，第56-65頁)中。經由切割核糖單元與吡啶單元間之糖基鍵聯，NAD和NADP之降解本質上分別產生ADP-核糖。另一方面，還原型式NADH和NADPH係遇酸不安定：例如差向異構化係一種習知之降解途徑。對該兩種情況，NAD/NADP和NADH/NADPH之不安定性係出自該核糖單元與吡啶單元間之糖基鍵聯的不穩定性。然而，即使在非嚴峻之條件下(諸如例如於水溶液中)，該等輔酶NAD和NADP經由周遭濕氣係分別被完全水解。此不安定性可能導致被分析物之測量不正確。
許多NAD/NADP衍生物係描述於例如文獻B.M.Anderson,The Pyridine Nucleotide Coenzymes,Academic Press New York,London 1982,J.Everese,B.Anderson,K.You等編輯，第4章中。然而，大多數該等衍生物並未被酶完全接受。因此，迄今已被用於診斷測試之唯一衍生物係3-乙醯基吡啶腺嘌呤二核苷酸(乙醯基NAD)，該化合物最先係於西元1956年被揭露(參閱文獻N.O.Kaplan,J.Biol.Chem.(1956),221,823)。同時，該輔酶顯現不佳之酶接受性及氧化還原電勢之改變。
WO 01/94370描述使用含有經修飾之吡啶基的其他NAD衍生物。然而，修飾菸醯胺基通常對催化反應有直接的影響。對大多數之情況，該影響係負面的。
於另一安定化概念中，該核糖單元已經改變以因此影響該糖基鍵聯之安定性。此方法並未直接干擾該菸醯胺基之催化反應。然而，一旦該酶對該核糖單元顯現強且專一之結合，則可能存有間接影響。對此，Kaufmann et al.分別於文獻WO 98/33936和US 5,801,006以及WO 01/49247中揭示許多硫核糖-NAD衍生物。然而，迄今尚未揭露對該菸醯胺-核糖單元之修飾作用與該等衍生物於酶催化反應中之活性間之關係。
CarbaNAD(即一種不含有糖基鍵聯之衍生物)最先係於西元1988年被揭露(參閱文獻J.T.Slama,Biochemistry 1989,27,183和Biochemistry 1989,28,7688)。其中之核糖係被碳環型糖單元替代。雖然carbaNAD被描述為去氫酶之受質，但是該carbaNAD於許多生化偵測方法中之活性迄今尚未於臨床上被證實。
為利用亞甲基雙膦酸酯化合物替代天然之焦磷酸以製備carbaNAD，一種類似之方法稍後係描述於文獻G.M. Blackburn,Chem.Comm.,1996,2765中。該亞甲基雙膦酸酯顯現對磷酸酶增加之安定性並作為ADP-核糖基環化酶之抑制劑。水解反應安定性之增加並不是目標(參閱文獻J.T.Slama,G.M.Blackburn)。
WO 2007/012494和US 11/460,366分別揭示安定之NAD/NADH和NADP/NADPH衍生物、彼等衍生物之酶複合物及彼等酶複合物於生化偵測方法和試劑套組中之用途。
本發明所基於之目標係提供使酶安定之方法，特別係使酶長期安定之方法。
達成此目標係藉由一種使酶安定之方法，其中係於安定之輔酶的存在下儲存該酶。已令人驚訝地發現藉由安定之輔酶的幫助，於高相對濕度或甚至於液相中且於升高之溫度下，數周或數月之長期安定係可能的。此認知係令人驚訝的，因為習知的是雖然多數酶於天然之輔酶的存在下具有增加之短期安定性達數小時(參閱文獻Bertoldi et al.,Biochem.J.389,(2005),885-898；van den Heuvel et al.,J.Biol.Chem.280(2005),32115-32121；及Pan et al.,J.Chin.Biochem.Soc.Vol.3(1974),pp.1-8)，但是該等酶經較長之時間後顯現較低之安定性(參閱文獻Nutrition Reviews 36(1978),251-254)。
與此等與先前技藝有關之認知相比較，令人驚訝的是酶於安定之輔酶的存在下比該酶於天然之輔酶的存在下具有顯著增加之長期安定性，特別係因為該安定之輔酶比該天然之輔酶具有與該酶較低之結合常數。
藉由本發明之方法所安定之酶係一種輔酶依賴性酶。適當之酶的實例係選自葡萄糖去氫醯(E.C.1.1.1.47)、乳酸去氫酶(E.C.1.1.1.27,1.1.1.28)、蘋果酸去氫酶(E.C.1.1.1.37)、甘油去氫酶(E.C.1.1.1.6)、(乙)醇去氫酶(E.C.1.1.1.1)、α-羥基丁酸去氫醯、山梨醇去氫酶或胺基酸去氫酶(例如L-胺基酸去氫酶(E.C.1.4.1.5))之去氫酶。其他適當之酶分別為氧化酶(諸如例如葡萄糖氧化酶(E.C.1.1.3.4)或膽固醇氧化酶(E.C.1.1.3.6))和胺基轉移酶(諸如例如天冬胺酸或丙胺酸胺基轉移酶)、5'-核苷酸酶或肌酸激酶。該酶較佳地係葡萄糖去氫酶。
已證實於本發明之方法中特別較佳的是使用經突變之葡萄糖去氫酶。本發明所使用之“突變體”一詞係指天然酶經基因修飾之變異體，該變異體與野生型酶相比較雖含有相同之胺基酸數目，但是具有經修飾之胺基酸序列，即該變異體與該野生型酶於至少一個胺基酸上係不同的。可藉由位置專一性或非位置專一性之方式導入突變，其中較佳的係藉由使用此技藝所習知之重組方法導入位置專一性突變，然而對特定要求和條件為適當的是於天然酶之胺基酸序列中產生至少一個胺基酸交換。與該野生型酶相比較，該突變體特別較佳地具有增加之熱安定性或水解安定性。
大體上，與對應之野生型葡萄糖去氫酶相比較，該經突變之葡萄糖去氫酶於其胺基酸序列中之任何位置上可包含一或多個經修飾之胺基酸。該經突變之葡萄糖去氫酶較佳地包括於野生型葡萄糖去氫酶之胺基酸序列的位置96、170及252中至少一者上之突變，其中特佳的是於位置96和170上突變之突變體及於位置170和252上突變之突變體。已證實有利的是除了此等突變外，該經突變之葡萄糖去氫酶未包含其他之突變。
原則上，該於位置96、170及252上之突變可包括導致野生型酶安定(例如增加熱安定性或水解安定性)之任何胺基酸交換。位置96上之突變較佳地包括以谷胺酸換甘胺酸之胺基酸交換，然而對位置170較佳的是以谷胺酸換精胺酸或離胺酸之胺基酸交換，特別是以谷胺酸換離胺酸之胺基酸交換。位置252上之突變較佳地包括以離胺酸換亮胺酸之胺基酸交換。
藉由使源自任何生物來源之野生型葡萄糖去氫酶發生突變可得到該經突變之葡萄糖去氫酶，其中於本發明中該“生物來源”包括原核生物(諸如例如細菌)和真核生物(諸如例如哺乳動物和其他動物)。該野生型葡萄糖去氫酶較佳地係源自細菌，特佳地係源自巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)或蘇力菌(Bacillus thuringiensis)之葡萄糖去氫酶，特別是源自枯草芽胞桿菌之葡萄糖去氫酶。
於本發明之一特佳體系中，該經突變之葡萄糖去氫酶係藉由使源自枯草芽胞桿菌之野生型葡萄糖去氫酶發生突變所得之葡萄糖去氫酶，其具有SEQ ID No.1所示之胺基酸序列(GlucDH_E96G_E170K)或SEQ ID No.2所示之胺基酸序列(GlucDH_E170K_K252L)。
該安定之輔酶係與天然之輔酶相比較已經化學修飾之輔酶且係比天然之輔酶具有較高之安定性(例如水解安定性)。該安定之輔酶較佳地係對測試條件下之水解作用呈安定。與天然之輔酶相比較，該安定之輔酶可具有降低之酶結合常數，例如降低因數為2或大於2之結合常數。
安定之輔酶的較佳實例係菸醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)或菸醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)之安定衍生物或截短之NAD衍生物，例如不含有AMP部分或含有非核苷殘基(例如疏水性殘基)者。同樣較佳地於本發明中為安定之輔酶者係式(I)化合物：
NAD/NADH和NADP/NADPH之較佳的安定衍生物係描述於上述之參考文獻中，該等參考文獻所揭示之內容係清楚地併入本文作為參考。特佳之經安定之輔酶係分別描述於WO 2007/012494和US 11/460366中，該等文獻所揭示之內容係清楚地併入本文作為參考。該安定之輔酶係特別較佳地選自通式(II)之化合物：
其中A=腺嘌呤或其類似物，T=各別獨立地O或S，U=各別獨立地OH、SH、BH3 - 或BCNH2 - ，V=各別獨立地OH或磷酸基，或兩個基所形成之環磷酸基，W=COOR、CON(R)2 、COR或CSN(R)2 ，其中R=各別獨立地H或C1 -C2 -烷基，X1 ,X2 =各別獨立地O、CH2 、CHCH3 、C(CH3 )2 、NH或NCH3 ，Y=NH、S、O或CH2 ，Z=直鏈或環狀有機基，唯其Z和該吡啶殘基並非藉由糖苷鍵聯連接，或其鹽或適當之還原型式。
於該式(II)化合物中，Z較佳地係具有4至6個碳原子(較佳地4個碳原子)之直鏈基(其中1或2個碳原子係可選擇地經一或多個選自O、S或N之雜原子替代)、或包括環狀基和CR4 2 基之基，其中該環狀基含有5或6個碳原子且可選擇地包含選自O、S或N之雜原子及可選擇地一或多個取代基，且其中CR4 2 係與該環狀基和X2 基鍵結，其中R4 =各別獨立地H、F、Cl或CH3 。
Z特別較佳地係飽和或未飽和5員碳環或雜環，特別是通式(III)之化合物：
其中R5' 與R5” 之間可存有單鍵或雙鍵，R4 =各別獨立地H、F、Cl或CH3 ，R5 =CR4 2 ，其中若R5' 與R5” 之間存在單鍵，則R5' =O、S、NH、NC1 -C2 -烷基、CR4 2 、CHOH或CHOCH3 ，且R5” =CR4 2 、CHOH或CHOCH3 ，且其中若R5' 與R5” 之間存在雙鍵，則R5' =R5” =CR4 ，且R6 ,R6' =各別獨立地CH或CCH3 。
於一較佳體系中，本發明之化合物包含腺嘌呤或腺嘌呤類似物，諸如例如C8 -和N6 -經取代之腺嘌呤、去氮變異體(諸如7-去氮變異體)、氮變異體(諸如8-氮變異體)或組合變異體(諸如7-去氮或8-氮變異體)、或碳環類似物(諸如間型黴素)，然而該7-去氮變異體於第7位置上可經鹵素、C1 -C6 -炔基、-烯基或-烷基取代。
於另一較佳體系中，該等化合物包含腺苷類似物，其分別包含替代核糖之例如2-甲氧基去氧核糖、2'-氟去氧核糖、己糖醇、阿卓糖醇(altritol)及多環類似物，諸如雙環-、LNA-及三環-糖類。
特別於該式(II)化合物中，(二)磷酸之多個氧亦可等滲地被替代，諸如例如O- 分別被S- 和BH3 - 替代、O分別被NH、NCH3 及CH2 替代及=O被=S替代。
於本發明之式(II)化合物中，W較佳地係CONH2 或COCH3 。
於式(III)化合物中，R5 較佳地係CH2 。進一步較佳的是R5' 選自CH2 、CHOH或NH。於一特定較佳體系中，R5' 和R5” 皆為CHOH。再於另一較佳體系中，R5' 係NH且R5” 係CH2 。較佳的經安定之輔酶的特定實例係示於圖1A和1B。
於最適之體系中，該安定之輔酶係carbaNAD。
本發明之方法係特別適合酶之長期安定。此意謂著被安定之輔酶所安定之酶，當例如以乾燥物儲存達例如至少2週(較佳地至少4週且特佳地至少8週)之期間，顯現相對於起初之酶活性，酶活性衰退較佳地低於50%，特佳地低於30%且最佳地低於20%。
本發明之方法進一步包括於升高之溫度(例如於至少20℃之溫度，較佳地至少25℃之溫度且特佳地至少30℃之溫度)下儲存被安定之輔酶所安定之酶。於此情況下，相對於起初之酶活性，酶活性衰退較佳地係低於50%，特佳地係低於30%且最佳地係低於20%。
藉由本發明之安定化方法，如上所述般甚至於不存有乾燥劑之情況下可長期儲存被安定之輔酶所安定之酶及/或如上所述般可於高溫下儲存被安定之輔酶所安定之酶。進一步，被安定之酶亦可於高相對濕度(例如至少50%之相對濕度)下儲存，對此相對於起初之酶活性，酶活性衰退較佳地係低於50%，特佳地係低於30%且最佳地係低於20%。
一方面可以乾燥物之型式且另一方面可以液態之型式儲存被安定之輔酶所安定之酶。較佳地係於適用於測定被分析物之測試元件上或其中儲存該被安定之酶。對此，被安定之輔酶所安定之酶較佳地係偵測試劑之成分，該偵測試劑適當地亦可包含其他成分，諸如例如鹽、緩衝劑等。於此情況下，該偵測試劑較佳地不含有媒質。
被安定之輔酶所安定之酶可被用於偵測被分析物，例如分別是體液(諸如例如血液、血清、血漿或尿液)及污穢物樣品或食品之參數。
可被測定之被分析物係可藉由氧化還原反應加以測定之任何生物或化學物質，例如係輔酶依賴性酶之受質的物質或本身係輔酶依賴性酶之物質。被分析物之較佳實例係葡萄糖、乳酸、蘋果酸、甘油、醇、膽固醇、甘油三酸酯、抗壞血酸、半胱胺酸、谷胱甘肽、肽、脲、銨、水楊酸、丙酮酸、5'-核苷酸酶、肌酸激酶(CK)、乳酸去氫酶(LDH)、二氧化碳等。該被分析物較佳地係葡萄糖。
本發明之另一較佳體系關於本發明之化合物或依據本發明的被安定之輔酶所安定之酶於藉由酶催化反應偵測樣品中的被分析物之用途。對此，特佳的是藉由利用葡萄糖去氫酶(GlucDH)以偵測葡萄糖。
原則上可以任何方式偵測安定之輔酶藉由與被分析物反應而產生之變化。於本發明中，對偵測酶催化反應，原則上可使用所有自先前技藝所習知之方法。然而，較佳地係藉由光學方法偵測輔酶之變化。光學偵測方法包括例如測量吸光性、螢光、圓振二向色性(CD)、旋光色散(ORD)、折射性等。
較佳地用於本發明之一種光學偵測方法係光測法。然而，光度測量輔酶因與被分析物反應所產生之變化需要額外存在至少一種媒質，該媒質增加被還原之輔酶的反應性且使電子可被轉移至適當之光學指示劑或光學指示劑系統上。
適合本發明之目的的媒質特別係亞硝基苯胺類(諸如例如[(4-亞硝基苯基)亞胺基]二甲醇氫氯化物)、醌類(諸如例如菲醌類、菲繞啉醌類或苯並[h]喹啉醌類)、吩嗪類(諸如例如1-(3-羧基丙氧基)-5-乙基三氟甲磺酸吩嗪鎓)、或/及心肌黃酶(EC 1.6.99.2)。菲繞啉醌類之較佳實例包括1,10-菲繞啉-5,6-醌類、1,7-菲繞啉-5,6-醌類、4,7-菲繞啉-5,6-醌類及彼等之N-烷基化和N,N'-二烷基化鹽類，且分別對N-烷基化和N,N'-二烷基化鹽類之情況較佳地係作為增加溶解性之鹵化物、三氟甲磺酸鹽或其他陰離子之抗衡離子。
可使用可被還原且於還原過程中光學性質(諸如例如顏色、螢光、反射性、透射率、偏極化或/及折射率)之改變可被偵測之任何物質以作為光學指示劑或光學指示劑系統。可藉由肉眼或/及利用熟習此技藝之人士視為適當之光測方法的偵測裝置測定樣品中被分析物是否存在或/及其量。
較佳地使用雜多酸且特別是2,18-磷鉬酸作為光學指示劑且彼等係被還原為對應之雜多藍(heteropoly blue)。
特佳地係藉由測量螢光以偵測輔酶之變化。螢光測量具高度敏感性且甚至可於小型化系統中偵測低濃度之被分析物。
利用適當之測試元件(諸如例如電化學測試條)以偵測輔酶電化學上的變化亦是一種可替代之可能。對此，先決條件再次係使用適當之媒質，其可藉由電子轉移被還原之輔酶轉化為還原型式。藉由測量使被還原之媒質再氧化所需之電流以測定被分析物且該電流係與樣品中被分析物之濃度有關。可供電化學測量使用之媒質的實例包括特別是上述供光測測量所使用之媒質。
可使用液態測試以偵測被分析物，其中試劑係例如呈水溶性或非水溶性液體之溶液或懸浮液型式或為粉末或冷凍乾燥物。然而，亦可使用乾燥測試，其中試劑係被施於載體(測試條)上。該載體可包括例如測試條，該測試條包括吸收劑或/及可膨脹材料，該可膨脹材料係藉由待分析之樣品液潤濕。
一種特佳之測試型式包括使用葡萄糖去氫酶和適當之NAD衍生物以偵測葡萄糖，其中生成被還原之輔酶NADH之衍生物。藉由光學方法(例如經紫外線(UV)激發後之光度測定或螢光測定)偵測NADH。一種特佳之測試系統係描述於作為本文之特別文獻US 2005/0214891中。
進一步，本發明亦關於被安定之輔酶所安定之酶，其中被安定之酶於較佳地至少20℃(特佳地至少25℃且最佳地至少30℃)之溫度下顯現儲存較佳地達至少2週(特佳地達至少4週且最佳地達至少8週)，其中適當地於高濕度且不存在乾燥劑下，與起初之酶催化活性相比較，酶催化活性之衰退係低於50%，較佳地低於30%且最佳地低於20%。
進一步，本發明亦關於一種用於測定被分析物之偵測試劑，其包含上述被安定之輔酶所安定之酶。另外，本發明關於一種測試元件，其包含分別依據本發明之被安定之酶和依據本發明之偵測試劑。該偵測試劑和測試元件可適於分別實施乾燥試驗或液態試驗。該測試元件較佳地係供被分析物之螢光測定偵測或光度測定偵測之測試條。該測試條包含被安定之輔酶所安定且被固定於吸收劑或/及可膨脹材料(諸如例如纖維素、塑料等)上之酶。
本發明將藉由下述之圖式和實施例加以更為詳細地說明。
 實施例1
將Carba-NAD(圖1A)或NAD加入至對葡萄糖專一之GlucDH中。將此等調製物各別施加至Pokalon膜(Lonza)上並經乾燥後儲存於溫熱且潮濕之條件(32℃,85%相對濕度)下。隨後於定期之時間間隔下測定反應動力學和函數圖形。於每個測量時間點同時進行cNAD/NAD分析及測定酶之殘餘活性。
第1天所測定之NAD動力學圖(圖2A)和cNAD動力學圖(圖2B)係可相比較的且亦顯示對葡萄糖依賴性之類似上升。然而，經5週後動力學圖上之清楚差異係明顯的。雖然NAD之動力學(圖2C)於動態上大為降低，但是被cNAD安定之酶的動力學實質上仍保持未變(圖2D)。
由圖3明顯可知，於空白值(於施加血液樣品前之乾燥空白值)上亦存有明顯差異。NAD之乾燥空白值上升可歸因於螢光粒子之生成(Oppenheimer(1982)，如上述)。令人驚訝地，此現象並未發生於cNAD上。
比較圖4和5亦明顯可知，葡萄糖去氫酶分別於NAD和cNAD之存在下係呈不同之安定性。經5週後，被cNAD安定之酶的函數圖仍呈一串先前之測量值(圖5A)，然而經NAD處理之酶的圖(圖4)呈現於較高濃度下掉落，該掉落係酶/輔酶量太低之一種典型訊號。圖5B顯示被cNAD安定之葡萄糖去氫酶於24週期間之各種不同函數圖。對此，清楚可知於整個期間該酶之功能僅於高葡萄糖濃度下呈現些微之變化且於24週後約略對應於經5週後所得到之值。
輔酶之結構與其經預定期間後之安定性間的關係係清楚地示於圖6。依據圖6，經儲存(於32℃和85%相對濕度下)24週後，葡萄糖偵測試劑中cNAD之殘餘量仍達起初量之約80%，然而僅經5週後，經NAD安定之葡萄糖偵測試劑中NAD之量衰減至起初量之約35%且藉由外插法得知經約17週後將衰減至0。
於32℃和85%相對濕度下，活性GlucDH經5週後之殘餘活性的測定結果(圖7A)係十分令人驚訝的。被NAD安定之酶現今僅顯現極低之酶活性(0.5%)，然而被cNAD安定之酶仍顯現70%之殘餘活性(每個情況係藉由與儲存於冰箱中且於乾燥劑下之樣品相比較)。於32℃和85%相對濕度下經24週後(圖7B)，被cNAD安定之酶的殘餘活性仍呈約25%。
若使用突變體以替代源自枯草芽胞桿菌之野生型酶，更進一步增加GlucDH之殘餘活性係可能的。於32℃和85%相對濕度下且於cNAD之存在下經儲存24週後，突變體GlucDH_E96G_E170K(GlucDH-Mut1；野生型酶第96位置上之谷胺酸→甘胺酸的胺基酸替代及第170位置上之谷胺酸→離胺酸的胺基酸替代)之殘餘活性係約70%，然而突變體GlucDH_E170K_K252L(GlucDH-Mut2；野生型酶第170位置上之谷胺酸→離胺酸的胺基酸替代及第252位置上之離胺酸→亮胺酸的胺基酸替代)之殘餘活性係約50%(圖8)。
葡萄糖去氫酶於SDS凝膠上之凝膠電泳分析(圖9和10)亦清楚顯示分別於NAD之存在下與於cNAD之存在下的儲存差異性。雖然於32℃和85%相對濕度下且於cNAD之存在下經儲存5週後，該酶仍然可被鑑別(呈現具有所預期之移動性的帶)，但是於NAD之存在下所儲存之酶完全消失(圖9)。由圖10，於相同時間下，清楚可知被NAD安定且儲存於50℃下之酶的帶隨著儲存時間增加而變得較弱且於476小時後實質上消失，然而於cNAD之存在下經儲存之酶的對應帶與實驗開始時所偵測之帶相比較僅顯現些微之改變。
此結果亦可由液相儲存加以證貫(圖11A和11B)。於50℃下經95小時後，葡萄糖去氫酶於天然之輔酶NAD的存在下之殘餘活性係5%，然而GlucDH於人造輔酶cNAD之存在下的殘餘活性係75%(圖11A)。於50℃下經儲存336小時後，被NAD安定之酶的殘餘活性現今僅約1%；於cNAD之存在下經儲存之酶的殘餘活性仍然係約70%。對應之SDS凝膠同樣地顯示於天然之輔酶NAD的存在下GlucDH帶之改變：新帶出現於較大分子量區且30kDa帶發生位移。
整體而言，輔因子之安定化作用同時致使酶之安定化且不僅是經由該酶之較佳黏合的協同功效係十分令人驚訝之結果。輔因子NAD之分解對酶GlucDH之安定性具有負面作用且事實上加速該酶失去活性。藉由人造類似物替代天然之NAD允許GlucDH儲存於應激條件(例如升高溫度)下且甚至於輔因子之存在下。
利用此系統可製造具有顯著改良之安定性的血糖測試條，且該血糖測試條可於不含有乾燥劑下存在。
實施例2
將cNAD或NAD加入至醇偵測溶液中。令該等混合物儲存於35℃下。於定期之時間間隔下檢驗酶之安定性並測定該酶之殘餘活性。
再次，於SDS凝膠上之凝膠電泳分析(圖12和13)顯示分別於NAD和cNAD之存在下儲存之差異性。因此，分別於6℃和35℃下經儲存65小時後，被cNAD安定之(乙)醇去氫酶的帶僅些微不同，該結果說明該酶被人造輔酶安定化。相比較下，於NAD之存在下儲存於35℃下之酶的帶已完全消失(圖12)。
進一步由圖13清楚可知，被NAD安定且儲存於35℃下之酶的帶係隨著儲存時間之增加而變得較弱且經5天後已幾乎完全消失。被cNAD安定之酶於35℃下經儲存6天後所偵測之帶顯示明顯較少之酶分解及因此增加之安定性。
此結果亦可由液相儲存加以證實(圖14)。於天然之輔酶NAD的存在下且於35℃下經65小時後，(乙)醇去氫酶之殘餘活性係約6%，然而於人造輔酶cNAD之存在下該酶之殘餘活性係仍然約60%。
實施例3
為測定葡萄糖，對各種不同之測試系統進行光度測定或電化學測定，該等測試系統各別包括葡萄糖去氫酶、NAD、媒質及適當之光學指示劑。
為進行光度測定，起初於各種不同之葡萄糖濃度下測試4個測試元件，該等測試元件已各別於室溫下儲存達11週且包含2,18-磷鉬酸、葡萄糖去氫酶、NAD及媒質。
由圖15清楚可知，對所使用之所有4種媒質(即[(4-亞硝基苯基)亞胺基]二甲醇氫氯化物(媒質A)、1-甲基-5,6-二側氧基-5,6-二氫-1,10-三氟甲磺酸菲繞啉鎓(媒質B)、7-甲基-5,6-二側氧基-5,6-二氫-1,7-三氟甲磺酸菲繞啉鎓(媒質F)及1-(3-羧基丙氧基)-5-乙基三氟甲磺酸吩嗪鎓(媒質G))，隨著葡萄糖濃度之增加，觀察到反射率降低，因此上述該等媒質原則上係適合光度測定葡萄糖。
於800mg/dl區域之高葡萄糖濃度下，分別使用[(4-亞硝基苯基)亞胺基]二甲醇氫氯化物和1-(3-羧基丙氧基)-5-乙基三氟甲磺酸吩嗪鎓之被測樣品之反射率仍然係約20%，此結果建議該兩種媒質係特別適合於使用葡萄糖去氫酶/NAD系統之光度測量且因此亦特別適合於使用葡萄糖去氫酶/cNAD系統之光度測量。於範圍0至800mg/dl之葡萄糖濃度下，使用葡萄糖去氫酶、NAD、1-(3-羧基丙氧基)-5-乙基三氟甲磺酸吩嗪鎓及2,18-磷鉬酸系統所進行之葡萄糖轉化的動力學結果係示於圖16。
由圖17之圖示說明清楚可知，(額外)使用心肌黃酶作為中間媒質亦可進行葡萄糖之光度測量。圖18顯示對葡萄糖去氫酶、NAD、心肌黃酶、[(4-亞硝基苯基)亞胺基]二甲醇氫氯化物及2,18-磷鉬酸系統(系統1)，反射率之濃度依賴性降低。作為比較之系統係葡萄糖染料氧化還原酶、吡咯並喹啉醌、[(4-亞硝基苯基)亞胺基]二甲醇氫氯化物及2,18-磷鉬酸(系統2)，該系統2同樣地造成反射率之濃度依賴性降低，但是因為葡萄糖染料氧化還原酶之低專一性而有些缺點。於範圍0至800mg/dl之葡萄糖濃度下，使用系統1所進行之葡萄糖轉化的動力學結果係示於圖19。
為測定被分析物，亦可使用電化學測量以作為光度測量之替代方法。因此，利用包含葡萄糖去氫酶、作為輔酶之NAD及作為媒質之1-(3-羧基丙氧基)-5-乙基三氟甲磺酸吩嗪鎓之測試元件及包括安定之輔酶cNAD以替代NAD之對應系統，發現使被還原之媒質再氧化所需之電流係線性取決於葡萄糖濃度(圖20)。
因此，已顯示藉由電化學偵測及利用不受輔酶影響之其他波長進行評估，亦可利用去氫酶/安定之輔酶系統測定被分析物。經使用安定之酶/輔酶對，應亦使整體調製物更為安定。
圖1A：描繪安定之輔酶carba-NAD(cNAD)。
圖1B：描繪安定之輔酶吡咯啶基-NAD。
圖2：說明於儲存前後，分別於NAD和cNAD之存在下葡萄糖去氫酶之酶動力學。
2A：於NAD之存在下經1天後GlucDH之酶動力學。
2B：於cNAD之存在下經1天後GlucDH之酶動力學。
2C：於NAD之存在下經於32℃和85%相對濕度下儲存達5週後GlucDH之酶動力學。
2D：於cNAD之存在下經於32℃和85%相對濕度下儲存達5週後GlucDH之酶動力學。
圖3：於32℃和85%相對濕度下經達5週之期間，分別於NAD之存在下和cNAD之存在下比較葡萄糖去氫酶之空白值。
圖4：描繪葡萄糖去氫酶於NAD之存在下經於32℃和85%相對濕度下儲存後之各種不同函數圖。儲存時間係介於1天至5週。
圖5：描繪葡萄糖去氫酶於cNAD之存在下經於32℃和85%相對濕度下儲存後之各種不同函數圖。儲存時間係分別介於1天至5週(圖5A)和介於1天至24週(圖5B)。
圖6：描繪葡萄糖去氫酶分別於NAD和cNAD之存在下經於32℃和85%相對濕度下儲存24週後，NAD和cNAD之殘餘量。
圖7：描繪葡萄糖去氫酶分別於NAD和cNAD之存在下經於32℃和85%相對濕度下儲存分別達5週(圖7A)和24週(圖7B)後，葡萄糖去氫酶之活性。
圖8：描繪野生型葡萄糖去氫酶(GlucDH-wt)、葡萄糖去氫酶雙重突變體GlucDH_E96G_E170K(GlucDH-Mut1)及葡萄糖去氫酶雙重突變體GlucDH_E170K_K252L(GlucDH-Mut2)分別於NAD和cNAD之存在下經於32℃和83%相對濕度下儲存25週後，葡萄糖去氫酶之活性。
圖9：說明葡萄糖去氫酶分別於NAD和cNAD之存在下經儲存後，藉由凝膠電泳分析葡萄糖去氫酶。測試條件：MW,10-220kDa標記物；1:GlucDH/NAD,5週於6℃下；2:GlucDH/NAD，5週於32℃/85%相對濕度下；3:GlucDH/cNAD,5週於6℃下；4:GlucDH/cNAD,5週於32℃/85%相對濕度下。
圖10：說明葡萄糖去氫酶分別於NAD和cNAD之存在下經於50℃下儲存後，藉由凝膠電泳分析葡萄糖去氫酶。測試條件：MW,10-220kDa標記物；1:GlucDH 8.5mg/ml,NAD,0小時；2:GlucDH 8.5mg/ml,NAD,22小時；3:GlucDH 8.5mg/ml,NAD,96小時；4:GlucDH 8.5mg/ml,NAD,118小時；5:GlucDH 8.5mg/ml,NAD,140小時；6:GlucDH 8.5mg/ml,NAD,188小時；7:GlucDH 8.5mg/ml,NAD,476小時；8:GlucDH 8.5mg/ml,cNAD,0小時；9:GlucDH 8.5mg/ml,cNAD,188小時；10:GlucDH 8.5mg/ml,cNAD,476小時。
圖11：說明於液相中、於50℃下且分別於NAD和cNAD之存在下分別達4天(圖10A)和14天(圖10B)後，葡萄糖去氫酶之安定性。測試條件：GlucDH 10mg/ml：NAD和cNAD分別為12mg/ml；緩衝液：0.1M Tris,1.2M NaCl,pH 8.5；溫度50℃。
圖12：說明分別於NAD和cNAD之存在下經儲存後，藉由凝膠電泳分析酵母菌之(乙)醇去氫酶。測試條件：MW,10-220kDa標記物；1:ADH,65小時於6℃下；2:ADH/cNAD,65小時於6℃下；3:ADH/NAD,65小時於6℃下；4:ADH,65小時於35℃下；5:ADH/cNAD,65小時於35℃下；6:ADH/NAD,65小時於35℃下。
圖13：說明分別於NAD和cNAD之存在下經於35℃下儲存後，藉由凝膠電泳分析酵母菌之(乙)醇去氫酶。測試條件：MW,10-220kDa標記物；1:ADH/NAD,0天；2:ADH/NAD,1天；3:ADH/NAD,2天；4:ADH/NAD,3天；5:ADH/NAD,5天；6:ADH/cNAD,0天；7:ADH/cNAD,1天；8:ADH/cNAD,2天；9:ADH/cNAD,3天；10:ADH/cNAD,6天。
圖14：說明於液相中、於35℃下且分別於NAD和cNAD之存在下達65小時後，酵母菌之(乙)醇去氫酶之安定性。測試條件：ADH 5mg/ml；NAD和cNAD分別為50mg/ml；緩衝液：75mM Na4 P2 O7 ，甘胺酸,pH 9.0；溫度35℃。
圖15：描繪於室溫下且於NAD和各種不同之媒質的存在下經儲存達11週後，葡萄糖去氫酶之各種不同函數圖。
圖16：描繪於NAD和1-(3-羧基丙氧基)-5-乙基三氟甲磺酸吩嗪鎓之存在下且在各種不同之葡萄糖濃度下，葡萄糖去氫酶之酶動力學。
圖17：圖示說明利用GlucDH作為酶及心肌黃酶作為媒質進行葡萄糖偵測。
圖18：分別描繪於吡咯並喹啉醌(PQQ)和[(4-亞硝基苯基)亞胺基]二甲醇氫氯化物作為媒質之存在下葡萄糖染料氧化還原酶(GlucDOR)之函數圖及於NAD和心肌黃酶/[(4-亞硝基苯基)亞胺基]二甲醇氫氯化物作為媒質之存在下葡萄糖去氫酶之函數圖。
圖19：描繪於NAD和心肌黃酶之存在下且在各種不同之葡萄糖濃度下，葡萄糖去氫酶之酶動力學。
圖20：描繪分別於NAD和cNAD之存在下，利用葡萄糖去氫酶進行葡萄糖之電化學測定，所測定之電流係葡萄糖濃度之函數。測試條件：分別為25mM NAD和cNAD；2.5秒遲延；5秒測量時間。
圖21：說明葡萄糖去氫酶雙重突變體GlucDH_E96G_E170K和GlucDH_E170K_K252L之胺基酸序列。

Claims (32)

  1. 一種安定酶之方法，其特徵在於該酶係於安定之輔酶的存在下儲存，其中該安定之輔酶係選自安定之菸醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)化合物、菸醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)化合物或式(I)化合物
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該酶係選自去氫酶。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該酶係選自葡萄糖去氫酶(E.C.1.1.1.47)、乳酸去氫酶(E.C.1.1.1.27,1.1.1.28)、蘋果酸去氫酶(E.C.1.1.1.37)、甘油去氫酶(E.C.1.1.1.6)、(乙)醇去氫酶(E.C.1.1.1.1)、α-羥基丁酸去氫酶、山梨醇去氫酶或胺基酸去氫酶。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該胺基酸去氫酶為L-胺基酸去氫酶(E.C.1.4.1.5)。
  5. 如申請專利範圍第3項之方法，其中使用葡萄糖去氫酶作為酶。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該安定之輔酶係選自通式(II)之化合物 其中A=腺嘌呤、7-去氮變異體、8-氮變異體或7-去氮-8-氮變異體，其中該7-去氮變異體於第7位置上可較佳經鹵素、C1 -C6 -快基、C1 -C6 -烯基或C1 -C6 -烷基取代，T=各別獨立地O或S，U=各別獨立地OH、SH、BH3 - 或BCNH2 - ，V=各別獨立地OH或磷酸基，或兩個基所形成之環磷酸基，W=COOR、CON(R)2 、COR或CSN(R)2 ，其中R=各別獨立地H或C1 -C2 -烷基，X1 ,X2 =各別獨立地O、CH2 、CHCH3 、C(CH3 )2 、NH或NCH3 ，Y=NH、S、O或CH2 ，Z=具有4至6個碳原子之直鏈基(其中1或2個碳原 子可經一或多個選自O、S或N之雜原子替代)或包括環狀基和CR4 2 基之環狀有機基(其中該環狀基含有5或6個碳原子且可包含選自O、S或N之雜原子及可包含一或多個取代基，且其中CR4 2 係與該環狀基和X2 基鍵結，其中R4 =各別獨立地H、F、Cl或CH3 )，唯其Z和該吡啶殘基並非藉由糖苷鍵聯連接，或其鹽或還原型式。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該直鏈基具有4個碳原子。
  8. 如申請專利範圍第6或7項之方法，其中Z係飽和或未飽和5員碳環或雜環。
  9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中Z為通式(III)之化合物 其中R5' 與R5” 之間可存有單鍵或雙鍵，R4 =各別獨立地H、F、Cl或CH3 ，R5 =CR4 2 ，其中若R5' 與R5” 之間存在單鍵，則R5' =O、S、NH、NC1 -C2 -烷基、CR4 2 、CHOH或CHOCH3 ，且R5” =CR4 2 、 CHOH或CHOCH3 ，且其中若R5' 與R5” 之間存在雙鍵，則R5' =R5” =CR4 ，且R6 ,R6' =各別獨立地CH或CCH3 。
  10. 如申請專利範圍第6項之方法，其中W=CONH2 或COCH3 。
  11. 如申請專利範圍第9項之方法，其中R5 係CH2 。
  12. 如申請專利範圍第9項之方法，其中R5” 係選自CH2 、CHOH或NH。
  13. 如申請專利範圍第9項之方法，其中R5' 和R5” 皆為CHOH。
  14. 如申請專利範圍第9項之方法，其中R5' 係NH且R5” 係CH2 。
  15. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中該安定之輔酶係carbaNAD。
  16. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中被安定之輔酶所安定之酶係儲存達至少2週之期間。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中被安定之輔酶所安定之酶係儲存達至少4週之期間。
  18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中被安定之輔酶所安定之酶係儲存達至少8週之期間。
  19. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中係於至少20℃之溫度下儲存被安定之輔酶所安定之酶。
  20. 如申請專利範圍第19項之方法，其中係於至少25℃之溫度下儲存被安定之輔酶所安定之酶。
  21. 如申請專利範圍第20項之方法，其中係於至少30℃之溫度下儲存被安定之輔酶所安定之酶。
  22. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中係於不存在乾燥劑下儲存被安定之輔酶所安定之酶。
  23. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中係於至少50%相對濕度下儲存被安定之輔酶所安定之酶。
  24. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中係以乾燥物之方式儲存被安定之輔酶所安定之酶。
  25. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中係於液相儲存被安定之輔酶所安定之酶。
  26. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中係於測試元件上儲存被安定之輔酶所安定之酶。
  27. 一種被安定之輔酶所安定之酶，其特徵在於該酶於至少25℃之溫度下儲存達至少4週，其中該酶儲存於高濕度且不存在乾燥劑下，其中與起初之酶催化活性相比較，顯出酶催化活性之衰退係低於20%，其中該酶為經突變之葡萄糖去氫酶，以及與野生型葡萄糖去氫酶相比較，該經突變之葡萄糖去氫酶具有增加之熱安定性或水解安定性。
  28. 如申請專利範圍第27項之被安定之輔酶所安定之酶，其中該酶儲存達至少8週。
  29. 如申請專利範圍第27項之被安定之輔酶所安定之酶，其中該酶於至少30℃之溫度下儲存。
  30. 如申請專利範圍第27項之被安定之輔酶所安定之酶，其中與起初之酶催化活性相比較，顯出酶催化活性之衰退係低於30%。
  31. 一種用於測定被分析物之偵測試劑，其包含如申請專利範圍第27項之被安定之酶。
  32. 一種測試元件，其特徵在於包含如申請專利範圍第27項之被安定之酶或如申請專利範圍第31項之偵測試劑。
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