TWI491394B - 二芐基丁內酯型木脂素或其順式異構物在製備治療關節炎之藥物的用途 - Google Patents

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二芐基丁內酯型木脂素或其順式異構物在製備治療關節炎之藥物的用途
本發明關於一種具有免疫調節功能的醫藥組合物，特別是關於具有免疫調節功能的柴胡萃取物。
近年來對於免疫系統所引起的疾病已有多篇研究其致病的生理機制，有多篇研究指向腫瘤壞死因子(TNF-α )的過量表現與免疫發炎疾病有關，例如類風濕性關節炎、克隆氏症、乾癬性關節炎或僵直性關節炎等。
TNF-α 的作用類似生物激素，例如調節細胞召集、細胞增殖、細胞死亡、或免疫調節。當TNF-α 在組織中為低濃度時，可放大宿主對抗外來感染的防禦機制。當其為高濃度時，TNF-α 會導致過度的發炎反應而造成器官損傷。因此，Brennan等人提出移除在發炎部位多餘的TNF-α 可治療過度發炎反應所造成的免疫疾病(Brennanet al. ,1989,Inhibitory effect of TNF-αantibodies on synovial cell interleukin-1 production in rheumatoid arthritis.Lancet 2,244-247)。
Feldmann等人提出TNF-α 在類風濕性關節炎、克隆氏症、乾癬、及其他疾病中，在致病發展過程的調節扮演特別重要角色，例如快速誘導IL-1 β、IL-6等細胞激素(Feldmannet al. ,2002,Discovery of TNF-α as a therapeutic target in rheumatoid arthritis：preclinical and clinical studies.Joint Bone Spine 69,12-18)。特別是在類風 濕關節炎的小鼠疾病模式中，TNF-α 明顯地過度表現(Kefferet al. ,1991,Transgenic mice expressing human tumor necrosis factor：a predictive genetic model of arthritis.EMBO J 10,4025-4031)。而且在類風濕性關節炎的治療中發現，血清中IL-6的減少可能是TNF-α 中和作用的直接影響(Charleset al. ,1999,Regulation of cytokines,cytokine inhibitors,and acute-phase proteins following anti-TNF-α therapy in rheumatoid arthritis.J Immunol 163,1521-1528)。
因此目前有許多抑制TNF-α 的生物製劑問世，例如阿達里幕麥浦(adalimumab；音譯)、艾坦能塞浦(etanercept；音譯)、因佛里克希麥浦(infliximab；音譯)等，或疾病調節抗風濕藥物(DMARDs)，例如麥松崔克參(methotrexate；音譯)等，或者非類固醇抗發炎藥劑(NSAIDs)。這些生物製劑因為藥效快、效果顯著、且免疫耐受度佳，因此成為主流藥物。然而也因為這些藥劑的價格昂貴、必須以注射方式投與、以及可能引起免疫反應或者增加感染危險的副作用，還有發展其他更安全藥物的空間。
柴胡(Bupleurum )自古即列為「神農本草經」上品藥用植物，為「傷寒論」少陽病之主藥，能解熱、鎮痛、解毒、消炎，主治胸脅苦滿、口苦咽乾、往來寒熱、黃疸、肝炎、胃腸炎、與膽囊炎等。已知柴胡的利用主要在根部，也有相關文獻指出萃取柴胡根部，可分離出含有皂苷(saikosaponin)、龍吉甙元(longispinogenin)、固醇、脂肪油、類黃醇及糖類，其中以皂苷為主要成份，在醫學研究上也證實皂苷a、d具有療效，((台灣)農業試驗所技術服務/第 58期/2004/6月/第10-12頁)。
柴胡目前是肝炎治療生藥中積極開發的對象，然而，尚未有柴胡應用於調節免疫功能之研究或文獻問世。本發明人等研究柴胡的特定萃取方式，並確認其中的活性成分以及該活性成分與TNF-α 、IL-6間的關係，研發出新穎調節免疫功能的醫藥組合物。
本發明提供一種具有免疫調節功能的醫藥組合物，包括一柴胡(Bupleurum )萃取物，該柴胡萃取物係經由一溶劑萃取。
上述柴胡可具體地選自下列所構成的群組：阿爾泰柴胡(Bupleurum krylovianum )、長莖柴胡(Bupleurum longicaule )、大葉柴胡(Bupleurum longiradiatum )、短莖柴胡(Bupleurum pusillum )、柳葉柴胡(Bupleurum salicifolium )、狹葉柴胡(Bupleurum scorzonerifolium )、及黑柴胡(Bupleurum smithii )。
由於傳統上藥材基原的鑑定是需要有多年經驗的藥學專家採用植株形態、性味及鏡檢的方式來鑑定，但對外觀形態相似、或經過加工已失去原本性狀的藥材，則往往無法精確地區分，造成藥效不彰或毒害等問題。尤其中藥材品種繁多，市售中藥材因正品不易取得，藥材外觀相近、同名異物、同物異名常見混用情形。因此，可利用植物染色體DNA多型性(polymorphism)的特性，以特定區域的DNA序列來鑑定藥材的基源，其中又以核醣體rRNA的基 因間ITS(Internal Transcribed Spacer)序列的差異常作為生物演化的比較依據，也是被廣泛認同的方法。因此，本發明的柴胡也可包括特定ITS(基因內轉錄間隔區，Interal Transcribed Spacer)序列的序列識別號1(SEQ ID NQ：1)、序列識別號2(SEQ ID NO：2)、序列識別號3(SEQ ID NO：3)、序列識別號4(SEQ ID NQ：4)、序列識別號5(SEQ ID NO：5)、序列識別號6(SEQ ID NO：6)的柴胡、或與上述序列的差異值1%以內的柴胡。
上述柴胡可為整棵植株進行萃取，或者採用其根部進行萃取。
本發明中所謂「萃取」是採用溶劑萃取法(solvent extraction)。此謂「溶劑萃取法」是指將計畫萃取的混合物質，加入適當的溶劑中，利用該混合物質中各成分對該溶劑的不同溶解度，萃取出目標物質。本發明之一實施例中，將上述柴胡(Bupleurum )經過研磨成粉末後，室溫下浸於溶劑中，經過一段時間之後，在室溫下乾燥上述柴胡的萃取物。本發明之另一實施例中，將含有柴胡(Bupleurum )植物粉末的極性溶液進行加熱迴流的方法，萃取上述柴胡。
本發明所使用的溶劑較佳為C1 -C12 醇類、C2 -C5 乙酸酯類、C5 -C6 烷類或其組合，例如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、2-丁醇、第三丁醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、戊醇、異戊醇、2,3-戊二醇、2,4-戊二醇、環戊醇、己醇、環己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸戊酯、正戊烷、環戊烷、正己烷、環己烷、或此等組合，但不限於此。本發明一實施例 中採用乙醇、乙酸乙酯及/或正戊烷作為萃取溶劑。本發明的一實施例中，採用乙醇水溶液作為萃取溶劑，乙醇濃度較佳為20%-95%，更佳為50%-75%。
上述所使用的溶劑的量較佳為柴胡的5倍以上，更佳為柴胡的5~10倍。
上述的萃取時間通常為2小時以上，較佳為2小時~24小時，更佳為4~5小時。
上述的萃取溫度通常為室溫，較佳為室溫至乙醇水溶液沸騰迴流的溫度，更佳為乙醇水溶液沸騰迴流的溫度。
本發明的萃取方法可再包括一濃縮乾燥過程，將上述經過加熱迴流後的萃取液濃縮、乾燥成固體或結晶體。本發明的萃取方法也可反覆操作數次，以獲得純度較高的萃取物。
本發明之柴胡萃取物，在下列的實施例中顯示在生物體內具有抑制TNF-α 或IL-6表現的活性，進而具備免疫調節功能。
再者，本發明之柴胡萃取物，經過進一步的再結晶純化之後，可分離出一活性成分為二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)或其順式異構物。二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)屬於木脂素(lignan)類的化合物，化學式為反式-(3,4-二甲氧基亞芐基)-β-(3,4-亞甲基雙氧基芐基)-γ-丁內酯(trans-(3,4-dimethoxybenzylidene)-β-(3,4-methylenedioxylbenzyl)-γ-butyrolactone))，為透明針狀結晶，融點為131-132℃，化學式C22 H22 O7 ，如式1所示。
從柴胡中萃取及鑑定二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)的其他方法尚揭露於其他文獻，例如竇后松等人(2000)小葉黑柴胡中kaerophyllin含量測定方法的研究，中國中藥雜誌2000年第25卷第8期p.488-490；或尚明遠等人(2000)HLPC法測定寧夏產四種柴胡中kaerophyllin的含量，西北藥學雜誌2000年04期；Estevez-Braun A.et al. ,1994,antibiotic activity and absolute configuration of 8S-Heptadeca-2(Z),9(Z)-diene-4,6-diyne-1,8-diol fromBupleurum salicifolium ,J.Natural Products,57,1178-1182；Estevez-Braun A.et al. ,1995,Busaliol and Busalicifol,two new tetrahydrofuran lignans fromBupleurum salicifolium ,J.Natural Products,58,887-892。
在本發明的植物萃取物中發現，二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)容易與其順式異構物形成混晶的形式存在，該順式異構物為異二芐基丁內酯型木脂素(isokaerophyllin)，化學式為順式-(3,4-二甲氧基亞芐基)-β-(3,4-亞甲基雙氧基芐基)-γ-丁內酯 (cis-(3,4-dimethoxybenzylidene)-β-(3,4-methylenedioxylbenzyl)-γ-butyrolactone)，為透明方形結晶，融點為146.5-148℃，化學式C22 H22 O7 ，如式2所示。
目前尚未有任何文獻證實或確認二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)或其順式異構物具有生理上的功能。但是本發明的下列實施例中顯示，二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)及其順式異構物在生物體內皆具有抑制TNF-α 或IL-6表現的活性，進而具備免疫調節功能。
因此，本發明之具有免疫調節功能的醫藥組合物，可用於治療、緩減或預防與TNF-α 或IL-6生理作用相關的疾病或症狀，例如敗血性休克、敗血症、缺血後再灌注損傷、分枝桿菌(mycobacterial)感染、腦膜炎、乾癬、充血性心臟衰竭、惡病質(cachexia)、移植排斥現象、皮膚T細胞淋巴瘤、血管新生疾病、自體免疫疾病、皮膚發炎疾病、克隆氏病(Crohn's disease)、結腸炎、退化性關節炎及類風濕性關節炎、僵直性脊椎炎、乾癬性關節炎、成人史 提爾氏病(adult Still's disease)、葡萄膜炎、韋格納肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)、伯克氏病(Behcehe disease)、修格倫氏症候群(Sjogren's syndrome)、類肉瘤病、多肌炎、皮肌炎、多發性硬化症、坐骨神經痛、牙周疾病、後天免疫不全症候群、非胰島素依賴性糖尿病、全身性紅斑性狼瘡、青光眼、原發性肺纖維化、支氣管肺發育不良、視網膜疾病、硬皮病、骨質疏鬆症、腎缺血、心肌梗塞、腦中風、腦缺血、腎炎、肝炎、絲球體性腎炎、異位性皮膚炎、血管炎(vasculitis)、過敏、季節過敏性鼻炎、可送性氣道阻塞、成人呼吸窘迫症候群、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管炎、或此等疾病的組合，但不限於此等疾病。
本發明之醫藥組合物更包括此技術領域中熟知的藥學上可接受載劑及/或添加劑，以適當比例添加。
本發明之醫藥組合物的投與可為，例如靜脈內的、肌肉內的、口服的或皮下的投予，較佳為口服。也可在適當期間內對患者進行多重劑量投藥，該投藥療程依據藥學上例行方法加以測定。
本發明之具體實施詳細說明如下，然而以下的實施例僅用於進一步揭露本發明之技術內容，不應藉以限制本案的發明範疇。
實施例1 篩選植物材料
選取多種柴胡(Bupleurum )的植物根部，研磨成植物粉末。
取上述植物粉末0.5g，以25ml的95%乙醇在室溫下振盪過夜後，經過乾燥濃縮後以95%酒精回溶成2ml，進行高效液相層析法(HPLC)分析，HPLC分析條件如下：層析柱(Column)：SymmetryShieldTM (Waters)，RP 18，5μ m，250x4.6mmlD
移動相(Mobile phase)：A：H2 O，B：乙腈，C：甲醇
偵測：UV/λ=237nm。
在這些柴胡萃取物當中，選取與標準品二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)(第1圖中(a)線)具有相同高峰(第1圖中框出的高峰)的柴胡，第1圖中(b)線代表(b)柴胡(即序列識別號1)；(c)線代表阿爾泰柴胡(即序列識別號2的柴胡)；(d)線代表大葉柴胡(即序列識別號3的柴胡)；(e)線代表(e)柴胡(即序列識別號4)；(f)線代表(f)柴胡(即序列識別號5)；(g)線代表(g)柴胡(即序列識別號6)。
實施例2 萃取活性成分
將實施例1選取的阿爾泰柴胡(Bupleurum krylovianum )植物磨碎，取2kg粉末加入16L的95%乙醇水溶液中，室溫下經過5小時後，乾燥濃縮，獲得萃取率6.7±0.1%的萃取物，進行高效液相層析法(HPLC)分析，如第2圖所示，在30-40分鐘間具有高峰。
HPLC分析條件：層析柱(Column)：SymmetryShieldTM (Waters)，RP 18，5μ m，250x4.6mmlD
移動相(Mobile phase)：A：H2 O，B：乙腈，C：甲醇
偵測：UV/λ=237nm。
實施例3 鑑定活性成分
將實施例1篩選的阿爾泰柴胡(Bupleurum krylovianum )18.5kg加入25L甲醇，在室溫下經過4小時後，經濃縮乾燥，獲得18.5kg的殘餘物。取此殘餘物500mg，進行管柱層析法，以SiO2 為固定相，以已烷、乙酸乙酯、甲醇(6/4/1-3/2/1-0/0/1調整不同比例)為移動相，以極性梯度流洗管柱後，分別收集，進行薄層層析法(TLC)分析獲得12個部分。將此12個部分進行下列的HLPC分析，12個部分分別溶於甲醇，濃調整為1mg/ml，選取與標準品二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)具有相同高峰的部分，將此部分再進行一次上述的管柱層析法，分離出純度較高的萃取物，再進一步結晶精製，獲得一白色透明結晶物。
將此結晶物進行1 H、13 C-NMR、MS光譜分析，如第3(a)圖所示，由光譜圖上在6-8ppm及2.5-4ppm處的化學移動(chemical shift)，得知此兩化合物為C3及C6的木脂素類化合物。再根據先行文獻(Wen-Liang C.et al. ,2003,Immunosuppressive flavones and lignans fromBupleurum scorzonerifolium ,Phytochemistry 64,1375-1379)，比對確認此結晶物為二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin))，如表1、表2及第3(a)圖所示。
表1 實施例3之白色結晶物的1 H NMR與二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)的比對
再由正己烷分層中進行再結晶，分離出透明方形結晶物，將此結晶物進行1 H、13 C-NMR、MS光譜分析，如第3(b)圖所示，再根據先行文獻(Wen-Liang C.et al. ,Immunosuppressive flavones and lignans fromBupleurum scorzonerifolium ,Phytochemistry 64,2003,1375-1379)，比對確認此結晶物為異二芐基丁內酯型木脂素(isokaerophyllin)，如表3、表4及第3(b)圖所示。
表3 實施例3之透明方形結晶物的1 H NMR與異二芐基丁內酯型木脂素(isokaerophyllin)的比對
將此二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)及其順式異構物的純化物同樣進行下列的HPLC分析，二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)純化物的高峰出現在約37分鐘，如第4(a)圖所示。而異二芐基丁內酯型木脂素(isokaerophyllin)的高峰出現在約40分鐘，如第4(b)圖所示。
HPLC分析條件：層析柱(Column)：ODS 3V
移動相(Mobile phase)：CH3 OH/H2 O(0.1%H3 PO4 )進行梯度流洗
流洗速度：1.0ml/min
偵測：UV/λ=310nm。
實施例4 不同乙醇濃度萃取物的抑制效果
將實施例1篩選的阿爾泰柴胡(Bupleurum krylovianum )植物粉末200g，分成四份各50g分別放入四個1L圓底瓶中，各自加入20%、50%、75%、95%比例的乙醇水溶液，加熱迴流2小時後，取出濾液，濃縮乾燥之後，分別獲得萃取物。
取上述萃取物各自以500mg/kg灌食BALB/c小鼠，兩小時後給予BALB/c小鼠1mg/Kg的脂多醣體(1ipopolysaccharide；LPS)(溶於Phosphate Buffered Saline,PBS)腹腔注射，經過1.5小時後採血。以酵素免疫分析法(ELISA)(R&D Systems®)分別定量小鼠血漿中TNF-α 及IL-6的濃度。以未灌食上述萃取物的小鼠體內TNF-α 及IL-6血漿濃度為基準，計算血漿中TNF-α 及IL-6的抑制率(%)，結果如表5所示。
實施例5 不同溶劑萃取的抑制效果
a)以50%乙醇萃取：將實施例1篩選的阿爾泰柴胡 (Bupleurum krylonianum )植物粉末50g加入1L圓底瓶中，加入500mL的50%乙醇，加熱迴流2小時後，取出濾液，濃縮乾燥之後，獲得一萃取物(a)，此萃取物(a)將進行以下的生理實驗。
b)以正己烷萃取：將實施例1篩選的阿爾泰柴胡(Bupleurum krylovianum )植物粉末50g加入1L圓底瓶中，加入500mL的50%乙醇，加熱迴流2小時，取出濾液之後，再加入與此濾液等量的100%正己烷，以上述相同萃取步驟反覆萃取三次，濃縮乾燥之後，獲得一萃取物(b)，此萃取物(b)將進行以下的生理實驗。
c)以乙酸乙酯萃取：將實施例1篩選的阿爾泰柴胡(Bupleurum krylovianum )植物粉末50g加入1L圓底瓶中，加入500mL的50%乙醇，加熱迴流2小時，取出濾液之後，再加入與此濾液等量的乙酸乙酯，以上述相同萃取步驟反覆萃取三次，濃縮乾燥之後，獲得一萃取物(c)，此萃取物(c)將進行以下的生理實驗。
d)取上述萃取物(a)、(b)、(c)各自以500mg/kg灌食BALB/c小鼠，兩小時後給予BALB/c小鼠1mg/Kg的LPS(溶於PBS)腹腔注射，經過1.5小時後採血。以酵素免疫分析法(ELISA)(R&D Systems®)分別定量小鼠血漿中TNF-α 及IL-6的濃度。以未灌食上述萃取物的小鼠體內TNF-α 及IL-6血漿濃度為基準，計算血漿中TNF-α 及IL-6的抑制率(%)，結果如表6所示。
表6
實施例6 不同溶劑的萃取結果
取實施例1篩選的阿爾泰柴胡(Bupleurum krylovianum )植物粉末5g，以1g/份分別放入5個不同的錐形瓶中，分別加入10ml的甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、及癸醇五種不同極性醇類，分別放置在超音波震盪器中震盪10分鐘後取出液體，將這些萃取液定量至10ml，並以二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)分別配製成濃度為0.3，0.27，0.21，0.15，0.09，0.06及0.03mg/ml之標準品溶液，檢驗這些萃取液中活性成分二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)的含量比例，結果如表7。
實施例7 不同萃取時間的抑制效果
取實施例1篩選的阿爾泰柴胡(Bupleurum krylovianum )植物粉末2.0Kg加入20L圓底瓶中，加入16.3L的50%乙 醇加熱迴流，分別在迴流2、3、4、5小時後取樣，取出的濾液各自濃縮乾燥，分別獲得萃取物，並以二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)作為標準品分別配製成濃度為0.3，0.27，0.21，0.15，0.09，0.06及0.03mg/ml之標準品溶液，檢驗這些萃取液中活性成分二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)的含量比例，結果如表8。
另外，再取上述各萃取物分別以500mg/kg灌食BALB/c小鼠，兩小時後給予BALB/c小鼠1mg/Kg的LPS(溶於PBS)腹腔注射，經過1.5小時後採血。以酵素免疫分析法(ELISA)(R&D Systems®)分別定量小鼠血漿中TNF-α 及IL-6的濃度。以未灌食上述萃取物的小鼠體內TNF-α 及IL-6血漿濃度為基準，計算血漿中TNF-α 及IL-6的抑制率(%)，結果如表8所示。
實施例8 在LPS(脂多醣體)誘導發炎反應的小鼠模式中乙醇萃取物投予量的效應
取實施例5a)的萃取物(a)250mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg、及2000mg/kg，分別灌食BALB/c小鼠。兩小 時後給予BALB/c小鼠1mg/Kg的LPS(溶於PBS)腹腔注射，經過1.5小時後採血。以酵素免疫分析法(ELISA)(R&D Systems®)分別定量小鼠血漿中TNF-α 及IL-6的濃度，如第5、6圖所示。控制組為10ml/kg的2% Tween 80載劑。
實施例10 在LPS(脂多醣體)誘導發炎反應的小鼠模式中乙醇萃取物投予時間的效應
取實施例5a)的萃取物(a)500mg/kg灌食BALB/c小鼠，在灌食後1小時、2小時、4小時、及6小時後分別給予BALB/c小鼠1mg/Kg的LPS(溶於PBS)腹腔注射，經過1.5小時後採血。以酵素免疫分析法(ELISA)(R&D Systems®)分別定量小鼠血漿中TNF-α 及IL-6的濃度，如第7、8圖所示。控制組為10ml/kg的2% Tween 80載劑。
實施例11 在鹿角膠(carrageenan)誘導腳腫脹的大鼠模式中乙醇萃取物的抑制腳腫脹效應
取實施例5a)的萃取物(a)250、500、1000mg/kg、以及3mg/kg非類固醇止痛消炎藥(indomethacin)作為正控制組，10ml/kg,2% Tween 80載劑作為負控制組，分別灌食大鼠(Long-Evans)。1小時後，在大鼠的左腳注入0.1ml的1%鹿角膠(carrageenan)，在注射後的第0、1.5、3小時分別以足體積測量儀(plethysmometer)(Stoelting)測量大鼠左腳體積，如第9圖所示。
另外，根據公式計算抑制率：抑制率(%)=(Nt-Nv)/Nv×100
(Nt為餵食二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)萃取物的大鼠左後腳浮腫淨值；Nv為餵食載劑組的大鼠左後腳浮腫淨值)。
若二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)萃取物具有抗發炎效果，則計算出的抑制率為負值。結果如表9。
實施例12 在輔劑(adjuvant)誘導的大鼠模式中乙醇萃取物的抑制關節炎效應
取每組5隻大鼠在尾巴基部注射20mg/ml懸浮於鮫鯊烯(squalene)中牛型結核死菌(Mycobacterium butyricum )50μ l，共注射三各點(150μl/rat)。在大鼠一開始誘發疾病時，各組分別立即灌食實施例5a)的萃取物(a)500mg/kg、1000mg/kg、以及非類固醇消炎止痛藥(indomethacin)3mg/kg、皮質類固醇(dexamethasone)0.1mg/kg、及2% Tween 80載劑10ml/kg，並進行關節炎症狀評估。
關節炎的症狀評估以分數(score)評分：0：大鼠腳部沒有紅腫現象； 1：大鼠腳部有輕微紅腫或是有一個趾關節有紅腫現象；2：大鼠腳部有輕微明顯紅腫或是有兩個以上趾關節有紅腫現象；3：大鼠後腳不能踏地行走；4：大鼠踝關節固定不能扳動。
評估結果如第10圖所示。相較於僅投予載劑的關節腫脹現象，以乙醇萃取物呈現具有抑制關節炎的功效。非類固醇消炎止痛藥(indomethacin)及皮質類固醇(dexamethasone)作為正控制組。P<0.05。
實施例13 在膠原蛋白(collagen)引起的關節炎的鼠模式中乙醇萃取物的抑制關節炎效應
將等量的胎牛II型膠原蛋白(2mg/ml)與完全輔劑(complete Freund’s adjuvant；CFA)或不完全輔劑(incomplete Freund’s adjuvant；IFA)以均質機Homogenizer)(IKA,RW20 DZM.n.)乳化。取8隻一組、共四組的老鼠，在第一天以皮內注射方式施打每隻老鼠50μ g的膠原蛋白與CFA乳化液，並在第8天注射每隻老鼠100μ g的膠原蛋白與IFA乳化液。在各組老鼠開始誘發疾病時，各組立即分別灌食如實施例5a)的萃取物(a)50mg/kg、非類固醇止痛消炎藥(celebrex)30mg/kg、1%羧甲基纖維素(Carboxymethyl Cellulose；CMC)10ml/kg為載劑、或不灌食任何東西，並進行關節炎症狀評估。如第11圖所示。
關節炎的症狀評估以分數(score)評分：0：大鼠腳部沒有紅腫現象；1：大鼠腳部有輕微紅腫或是有一個趾關節有紅腫現象；2：大鼠腳部有輕微明顯紅腫或是有兩個以上趾關節有紅腫現象；3：大鼠後腳不能踏地行走；4：大鼠踝關節固定不能扳動。
結果顯示僅需要50mg/kg的乙醇萃取物，在兩個星期後就有顯著的關節炎抑制效果。非類固醇止痛消炎藥(celebrex)30mg/kg作為正控制組；1% CMC載劑10ml/kg為負控制組；不灌食任何東西為空白試驗。
實施例14 二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)及其順式異構物對人類單核球細胞株U937的TNF-α 抑制效果
將人類單核球細胞株U937培養在含有50ng/mlPMA(巴豆醇12-硬脂酸酯13-乙酯；phorbol 12-myristate 13-acetate；PMA)(Sigma)的RPMI細胞培養液(含有10%胎牛血清)(RPMI培養基；如Mooreet.al. at Roswell Park Memorial Institute所揭示)中24小時後，再將U937移到不含PMA的上述細胞培養液中繼續培養48小時。將活化的U937細胞株植入96孔盤中，植入細胞數為1.6X105 個/孔，另外再加入分別含有12.5、25、50、100μ g/ml二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)、及1、3、10、30μ g/ml異二芐基丁內酯型木脂素(isokaerophyllin)或緩衝液10μ l，最 終使每孔體積為190μ l。在37℃下反應30分鐘。反應完成後，加入10μ l的2μ g/ml的LPS刺激細胞，在37℃下反應4小時，然後離心收集上清液。
利用ELISA(R&D Systems®)分別測量上清液中TNF-α 的含量，並以控制組(DMSO)為基準，分別計算TNF-α 的含量比。另外以MTT(3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)2,5-diphenyltrazolium)(Sigma)分別檢測細胞存活率。
結果為：第12圖顯示二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)對細胞分泌TNF-α 與及MTT分析(assay)的影響，其IC50 為44±5μg/ml。第13圖顯示芐基丁內酯型木脂素(isokaerophyllin)對細胞分泌TNF-α 與及MTT分析(assay)的影響，其IC50 為18±4μg/ml。可見二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)及其順式異構物皆具有抑制TNF-α 分泌的效果。
實施例15 二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)或其順式異構物對人類單核球細胞株U937的IL-6抑制效果
將人類單核球細胞株U937培養在含有50ng/mlPMA(Sigma)的RPMI1細胞培養液(含有10%胎牛血清)中24小時，再將U937移到不含PMA的上述細胞培養液中繼續培養48小時。將活化的U937細胞株植入96孔盤中，植入細胞數為1.6x105 個/孔，另外再加入分別含有6.3、12.5、25、50μ g/ml二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)純化物，及3.8、7.5、15、30μ g/ml異二芐基丁內酯型木 脂素(isokaerophyllin)純化物或緩衝液10μ l，最終使每孔體積為190μ l。在37℃下反應30分鐘。反應完成後，加入10μ l的20μ g/ml的LPS刺激細胞，在37℃下反應16-18小時，然後離心收集上清液。
利用ELISA(R&D Systems®)分別測量上清液中IL-6的含量，並以控制組(DMSO載劑)為基準，分別計算IL-6的含量比。另外以MTT(Sigma)分別檢測細胞存活率。
第14圖顯示二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)對細胞分泌IL-6與MTT分析(assay)的影響，其IC50 為13±2μg/ml。第15圖顯示異二芐基丁內酯型木脂素(isokaerophyllin)對細胞分泌IL-6與MTT分析(assay)的影響，其IC50 為24±6μg/ml。可見二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)及其順式異構物具有抑制IL-6分泌的效果。
實施例16 對腸炎模式的乙醇萃取物的發炎抑制效果
自每隻BABL/c小鼠肛門深入大腸內4公分注射1.75mg三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma)，經過TNBS刺激48小時後，取自肛門起6公分大腸，浸泡於PBS2小時，以酵素免疫分析法(ELISA)(R&D Systems®)分別定量分析腸浸出液中發炎因子TNF-α、IL-6及G-CSF含量變化。取6隻小鼠一組、共四組小鼠，50%酒精為TNBS溶劑對照組，1.75mg TNBS處理組，100mg/kg DLS01給藥TNBS處理組以及0.6mg/kg皮質類固醇(dexamethasone；DEX)給藥TNBS處理組，以1.75mg TNBS刺激但未灌食上述萃取物的小鼠腸浸出液中TNF-α、IL-6及G-CSF含量為基準，計 算TNF-α、IL-6及G-CSF含量中TNF-α 及IL-6的抑制率(%)，結果如表10所示，負值表示促進分泌：
實施例17 在LPS(脂多醣體)誘導發炎反應的小鼠模式中不同種柴胡萃取物的效應
分別取實施例1篩選的六種柴胡屬植物各60g磨碎，粉末過5網目(mesh)篩網。
a)以50%乙醇萃取：將本實施例的粉末各50g加入2L圓底瓶中，加入400mL的50%乙醇/水混合溶液，加熱迴流2小時後，取出濾液，濃縮乾燥之後，獲得一組對應實施例1中(b)~(g)柴胡的萃取物(1)~(6)，這組萃取物(1)~(6)將進行以下的生理實驗。
b)取上述萃取物(1)以1000mg/kg及上述萃取物(2)、(3)、(4)、(5)、(6)各自以500mg/kg灌食BALB/c小鼠，兩小時後給予BALB/c小鼠1mg/Kg的LPS(溶於PBS)腹腔注射，經過1.5小時後採血。以酵素免疫分析法(ELISA)(R&D Systems®)分別定量小鼠血漿中TNF-α 及IL-6的濃度。以未灌食上述萃取物的小鼠體內TNF-α 及IL-6血漿濃度為基準，計算血漿中TNF-α 及IL-6的抑制率(%)，結果如表 11所示。
實施例18 ITS序列確認柴胡品種
取實施例1篩選的六種柴胡屬植物(b)~(g)各取0.5-1克樣本於研缽中，加入液態氮研磨成粉末，倒入含7-10ml CTAB萃取緩衝液的離心管中，混合均勻後，於70℃搖盪30-60分鐘。取出後加入5ml氯仿混合均勻，以8,000rpm在4℃下離心5分鐘。取出上清液至新的離心管中，再加入2-2.5倍體積的沉澱液，以12,000rpm在4℃下離心20分鐘，盡量倒掉上清液，加入3ml含RNase之1.2M NaCl溶液，於37C中搖晃溶解30-60分鐘，取出後再加入3ml之氯仿，混合均勻後，以8,000rpm在4℃下離心5分鐘，取出上清液分置於新的1.5ml微量離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇於-20℃冰箱中沉澱過夜。再經過離心，以75%酒精洗過一次、晾乾、並以50μ L TE緩衝液回溶。最後以適當的DNA濃度及特定的引子對進行PCR(polymerase chain reaction)複製出各個 柴胡的ITS片段。經由序列分析，獲得序列識別號1(對應實施例1的(b)柴胡)、序列識別號2(對應實施例1的阿爾泰柴胡)、序列識別號3(對應實施例1的大葉柴胡)、序列識別號4(對應實施例1的(e)柴胡)、序列識別號5(對應實施例1的(f)柴胡)、及序列識別號6(對應實施例1的(g)柴胡)。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1圖顯示多種柴胡(Bupleurum )以95%乙醇水溶液萃取的萃取物HPLC圖。
第2圖顯示阿爾泰柴胡(Bupleurum krylovianum )以95%乙醇水溶液萃取的萃取物HPLC圖。
第3(a)圖顯示二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)的光譜圖，第3(b)圖顯示異二芐基丁內酯型木脂素(isokaerophyllin)的光譜圖。
第4(a)圖顯示二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)純化物的HPLC圖，第4(b)圖顯示異二芐基丁內酯型木脂素(isokaerophyllin)純化物的HPLC圖。
第5圖顯示在LPS誘導發炎反應的小鼠模式中，不同劑量的柴胡的乙醇萃取物對TNF-α 的抑制效果。
第6圖顯示在LPS誘導發炎反應的小鼠模式中，不同劑量的柴胡的乙醇萃取物對IL-6的抑制效果。
第7圖顯示LPS誘導發炎反應的小鼠模式中，柴胡的乙醇萃取物在生物體內的作用時間對TNF-α 的抑制效果。
第8圖顯示LPS誘導發炎反應的小鼠模式中，柴胡的乙醇萃取物在生物體內的作用時間對IL-6的抑制效果。
第9圖顯示在鹿角膠(carrageenan)誘導腳腫脹的大鼠模式中柴胡的乙醇萃取物的抑制腳腫脹效應。
第10圖顯示在輔劑(adjuvant)誘導腳腫脹的大鼠模式中柴胡的乙醇萃取物的抑制關節炎效應。
第11圖顯示在膠原蛋白(collagen)引起的關節炎的鼠模式中柴胡的乙醇萃取物的抑制關節炎效應。
第12圖顯示二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)純化物對人類單核球細胞株U937的TNF-α 抑制效果。
第13圖顯示異二芐基丁內酯型木脂素(isokaerophyllin)純化物對人類單核球細胞株U937的TNF-α 抑制效果。
第14圖顯示二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)純化物對人類單核球細胞株U937的IL-6抑制效果。
第15圖顯示異二芐基丁內酯型木脂素(isokaerophyllin)純化物對人類單核球細胞株U937的IL-6抑制效果。
<110> 財團法人工業技術研究院
<120> 柴胡萃取物在製備治療關節炎之藥物的用途
<160> 6
<170> 專利版本2.0
<210> 1
<211> 629
<212> rRNA
<213> 柴胡屬(Bupleurum )
<400> 1
<210> 2
<211> 629
<212> rRNA
<213> 柴胡屬(Bupleurum )
<400> 2
<210> 3
<211> 629
<212> rRNA
<213> 柴胡屬(Bupleurum )
<400> 3
<210> 4
<211> 629
<212> rRNA
<213> 柴胡屬(Bupleurum )
<400> 4
<210> 5
<211> 629
<212> rRNA
<213> 柴胡屬(Bupleurum )
<400> 5
<210> 6
<211> 629
<212> rRNA
<213> 柴胡屬(Bupleurum )
<400> 6

Claims (5)

  1. 一種二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)或其順式異構物在製備治療關節炎之藥物的用途。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該二芐基丁內酯型木脂素(kaerophyllin)或其順式異構物係萃取自柴胡(Bupleurum )。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該柴胡(Bupleurum )為阿爾泰柴胡(Bupleurum krylovianum )。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該藥物更包括一藥學上可接受載劑或添加劑。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該藥物係經口投予。
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