TWI491881B - 胜肽組織化學診斷法 - Google Patents

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Description

胜肽組織化學診斷法
本發明提供一種胜肽組織化學診斷法，特別是一種可應用於甲醛固定，石蠟包埋之外科手術檢體，去做胜肽組織化學診斷。
目前，有些胜肽被研發出後，想去對各種癌症做胜肽標的療法，惟在使用到臨床試驗之前，常無法對經過甲醛固定石蠟包埋後之外科檢體做染色，去查是否其胜肽能與固定之癌細胞結合，以便確認是否癌症患者對此胜肽標的化療會有療效，此係因臨床上雖皆為同一種類癌症，但因為癌症患者的個體差異，胜肽化學治療之標的胜肽是否能與臨床上各患者體內的癌細胞實際結合，仍是未知。因此，若在化學治療之前能先確認每位癌症患者之腫瘤能被標的胜肽結合則對此胜肽化學治療的療效上會有很大的助益。
故在胜肽標的化學治療之前是否可先確認每位患者對化學治療之效果便為治療是否有效的關鍵，因此，所使用之胜肽可否直接與外科切除之腫瘤檢體結合成為一個關鍵性的問題。此外：此胜肽應有如下之特性：a.在不同而未分化的鼻咽癌細胞(NPC)及其他的腫瘤癌細胞也能與此胜肽結合、b.所使用之胜肽療法能使腫瘤縮小、c.同時它不與正常的內臟器官的組織細胞結合。過去曾有文 獻報告將生物素(biotin)直接連結到胜肽，也可用以與腫瘤細胞結合，然而發現其結果非常差。對一些小檢體或許能結合上一點，但比起一般的抗體相差甚遠，尤其是那些外科檢體若超過1公分，則生物素-胜肽幾乎無法結合上。就其原因在於那些腫瘤檢體係為已經過甲醛固定而包埋於石蠟之檢體切片，而生物素-胜肽中的胜肽只有三個胺基酸可與檢體切片中的腫瘤細胞結合，在用甲醛固定而包埋於石蠟之腫瘤檢體切片上此種結合力量非常低，以致於經常看不到其結合現象，而無法預先得知癌症患者經手術後的後續化學治療是否有效。所以，在手術取得的腫瘤切片中，目前尚未有能與經甲醛固定的石蠟包埋之手術檢體結合之胜肽病理診斷方法。
有鑑於此，本發明提供一種胜肽組織化學診斷法(Peptide-histochemical diagnosis)，以解決上述問題。本發明係以類似抗體一樣去定位在腫瘤檢體細胞上之方法。換句話說，當需應用胜肽標的化學療法去治療癌症患者時，考量到臨床上患者腫瘤細胞的個體差異性，皆可使用本發明之方法先去確定是否欲使用之標的胜肽能夠與患者之腫瘤細胞結合。若發現可結合，則可直接用胜肽標的化療法去治療癌症患者。
本發明提供一種胜肽組織化學診斷法，包含下列步驟：(a)提供一腫瘤檢體石蠟切片，係由包埋於一石蠟塊內的一腫瘤檢體經由切片且脫臘而得；(b)提供一標的胜肽-葡聚糖(dextran)包覆之氧化鐵奈米粒子，該氧化鐵 奈米粒子的表面以葡聚糖包覆，且該標的胜肽之N端與葡聚糖連結；以及(c)將該腫瘤檢體切片與該標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子接觸後，經一試劑染色後而顯出一特定顏色，其中該腫瘤檢體切片中的腫瘤細胞會呈現該特定顏色，而該腫瘤檢體切片之正常細胞不會被染色；該試劑為普魯士藍試劑，該普魯士藍試劑係與該標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子中的氧化鐵奈米粒子反應而呈現的，此種特定顏色為藍色；而該腫瘤檢體是先經甲醛固定及脫水後，包埋於該石蠟塊內。另外，該腫瘤檢體於脫蠟後，進一步經過一高壓處理而得該腫瘤檢體切片。
本發明之胜肽組織化學診斷法，其中該標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子係由至少10條以上之標的胜肽與一葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子所組成；且該標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子的標的胜肽能與腫瘤細胞結合。
在本發明之胜肽組織化學診斷法中，該腫瘤包括有鼻咽癌、乳癌、肝癌、胰臟癌、非小細胞肺癌或神經母細胞瘤等。
本發明亦提供一種使用標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子用於製造檢測腫瘤檢體之藥物的用途，其中該腫瘤檢體係為包埋於一石蠟塊內之腫瘤檢體切片，且該腫瘤檢體切片之正常細胞不會被染色；該腫瘤檢體切片的腫瘤細胞呈現一顏色時，表示該腫瘤細胞能與該標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子的標的胜肽結合。
本發明之胜肽組織化學診斷法，係包括使用氧化鐵奈米顆粒披覆一層葡聚醣，而將標的胜肽一端(N端) 連結到葡聚醣上，每個包覆有葡聚糖之奈米顆粒大約可連上10條以上的標的胜肽；而標的胜肽的另一端(C端)可與腫瘤細胞結合。因此，利用本發明之標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子與腫瘤檢體之石蠟切片作用時，此10條以上標的胜肽便可結合到腫瘤細胞上，而本發明之標的胜肽所包覆之氧化鐵奈米粒子便可利用普魯士藍染劑與氧化鐵反應而呈現藍色，這反應產物會沈澱在有標的胜肽結合的腫瘤細胞中；其不但出現於腫瘤細胞質中，也有微量出現於腫瘤細胞膜上。因此，反應產物出現於腫瘤細胞，而不會出現在正常細胞內，因為正常細胞會表現非常微量的胜肽結合蛋白於其細胞質中(血液中之單核細胞可能表現多一點)，但不會表現於其細胞膜上。
本發明所使用之標的胜肽為短胜肽，只含有12個胺基酸，相較於抗體的分子量是非常小的分子，因此，本案的短胜肽與奈米粒子結合後的體積仍是非常微小，此可使得本案之標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子可以進入細胞外間隙(extracellular space)。再者，因可於單一奈米粒子上結合多條之短胜肽，所以能有效提昇本發明之標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子與腫瘤細胞結合之能力。
因此，凡是要應用胜肽標的療法去治療癌症病患時，都可用本發明之方法先去確定是否標的胜肽能夠與患者的癌細胞檢體石蠟切片結合；若發現可結合，則可直接用胜肽標的療法去治療該癌症病患，以達到有效治療之結果。
第一圖係為異硫氰酸螢光素-標的胜肽(即FITC-標的胜肽)與鼻咽癌細胞及其他癌細胞株之標的胜肽結合之流式細胞儀(flow cytometry)的分析圖，其中該標的胜肽為SEQ ID NO：1。第一圖A係為FITC-標的胜肽結合至鼻咽癌NPC-TW07細胞株，顯示出標的胜肽結合至鼻咽癌細胞的結合活性很強，鼻咽癌細胞與磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline，PBC)共同培養作為對照組，FITC結合控制組胜肽及生物素(biotin)-結合標的胜肽或控制組胜肽都顯示出非常弱的結合活性。第一圖B係為FITC-標的胜肽結合至各種細胞株的流式細胞儀分析結果，從左至右波鋒分別為可長期培養之腎上皮細胞株(239T)、鼻咽癌(NPC-TW01)、肺癌細胞株(A549)、乳癌細胞株(MB157)、神經母細胞瘤細胞株(Be2C)、鼻咽癌NPC-TW07及肺癌細胞株(H1299)，除了可長期培養之腎上皮細胞株239T不會與SEQ ID NO：1標的胜肽結合外，其他癌細胞皆能與此標的胜肽結合。
第二圖係為SEQ ID NO：1標的胜肽與鼻咽癌細胞株(NPC-TW01)之結合結果，控制組胜肽為SEQ ID NO：3：第二圖A、C係為SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子與鼻咽癌細胞株共同培養，以普魯士藍染色結果，在腫瘤細胞顯示普魯士藍反應產物；第二圖C為第二圖A之高倍率影像。第二圖B係為葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子，顯示出一些隨機依附於少數腫瘤細胞沒有特定的反應產物；第二圖D係為第二圖B圖之高倍率影像。
第三圖係為以葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子 (Dex-Fe3 O4 )、標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子(P-Dex-Fe3 O4 )與異硫氰酸螢光素-標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子(FITC-P-Dex-Fe3 O4 )處理之乳癌細胞(MDA-MB-231)的普魯士藍染色結果。其中該標的胜肽為SEQ ID NO：1：第三圖A係為乳癌細胞與Dex-Fe3 O4 奈米粒子一起培養；第三圖B係以P-Dex-Fe3 O4 奈米粒子處理，第三圖C及D係以FITC-P-Dex-Fe3 O4 奈米粒子處理。在第三圖A中沒有顯示出反應產物，在第三圖B及C在乳癌細胞的細胞質顯示出反應產物，且在第三圖D顯示螢光訊號如在第三圖C所示，標記處為100μm。
第四圖係標的胜肽(P-Dex-Fe3 O4 )在血液中之單核細胞、肝癌細胞株及胰腺癌細胞株之結合情形，其中該標的胜肽為SEQ ID NO：1；第四圖A及B在單核細胞中未顯示藍色反應產物，A為C之對照組；B為D之對照組，顯然P-Dex-Fe3 O4 不會與正常血液細胞結合；第四圖C及D在肝癌細胞株及胰腺癌細胞株顯示出藍色反應產物。
第五圖係為標的胜肽與肝癌細胞株(Hep G2)之結合，其中該標的胜肽分為SEQ ID NO：1(第五圖A)、SEQ ID NO：2(第五圖C)；第五圖A及C分別顯示出SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子及SEQ ID NO：2標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子與肝癌細胞株結合呈現藍色反應產物；第五圖B顯示出氧化鐵奈米粒子無胜肽連結者無法與肝癌細胞株結合。
第六圖係為鼻咽癌活體組織切取之檢體以胜肽組織化學診斷法處理之結合結果。其中該標的胜肽為SEQ ID NO：1；第六圖A及C係為控制組鼻咽癌切片與 Dex-Fe3 O4 奈米粒子結合，第六圖A、B、D、E係以核速紅(nuclear fast red)反染色之結果，第六圖C及F係為沒有反染之結果。第六圖B、D、E及F係為來自不同患者的鼻咽癌活體組織切取檢體與SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵(P-Dex-Fe3 O4 )奈米粒子結合，第六圖B、D及E係以普魯士藍染色再以核速紅反染色之結果，第六圖F係以普魯士藍染色未以核速紅反染色之結果。在腫瘤細胞團中大部分的鼻咽癌腫瘤細胞顯示普魯士藍反應產物(第六圖B、D、E及F)。在間質區域一些浸潤的腫瘤細胞亦顯示出清晰的染色(第六圖B、D及E)，標記處為25μm。
第七圖係為乳癌外科手術檢體以胜肽組織化學診斷法之結合結果，其中該標的胜肽為SEQ ID NO：1：A至L係為來自不同檢體的乳癌切片以SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵(P-Dex-Fe3 O4 )奈米粒子處理(第七圖B至F及第七圖H至L)或以控制組胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵(CP-Dex-Fe3 O4 )奈米粒子處理(第七圖A及G)。第七圖A至F係為經由普魯士藍染色後再以核速紅反染色之結果；第七圖G至L係為只有以普魯士藍染色之結果。在第七圖A及G中沒有顯示出普魯士藍反應產物，在第七圖B至F中，在每一個切片的乳癌細胞顯示出或多或少的藍色反應產物。在間質組織中，包含內皮細胞及一些纖維細胞亦未顯示出反應產物。第七圖K及L係為來自於乳癌轉移至腋下淋巴結的檢體所得之結果，只有癌細胞有藍色反應結果，而不出現在巨噬細胞，在第七圖L中有許多吞噬碳粉粒之巨噬細胞，這些細胞皆無藍色反應。在第七圖A至J及L標記處為25μm；在第七圖K標記處為100μm。
第八圖係為肝癌外科手術檢體以胜肽組織化學診斷法之結合結果。其使用之該標的胜肽為SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2在肝癌組織石蠟切片與SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵(P-Dex-Fe3 O4 )奈米粒子結合之後染色(見第八圖A及B)，在腫瘤細胞可見藍色反應物。在第八圖A之右半部為正常肝細胞受肝癌擠壓變形，在正常之肝細胞沒有反應產物，但可見單個癌細胞浸潤。第八圖C為肝癌組織切片與SEQ ID NO：2標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子結合之後染色。第八圖D為控制組使用Dex-Fe3 O4 奈米粒子與肝癌切片處理，無反應產物可見。
第九圖係為胰腺癌外科手術檢體以胜肽組織化學診斷法之結合結果。其中該標的胜肽為SEQ ID NO：1(第九圖A及B)、及SEQ ID NO：2(第九圖C)：第九圖A及B顯示胰腺癌組織石蠟切片與SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子結合，及第九圖C為與SEQ ID NO：2標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子之結合。三者皆可見反應產物出現於胰腺癌細胞中。第九圖D為控制組胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子所染者，無反應產物。
 定義
「標的胜肽」一詞係指與癌細胞株結合，而不與正常細胞結合之胜肽。
細胞株、生物及外科手術檢體及標的胜肽之準備工作
細胞株 ：細胞株包含鼻咽癌細胞株 (Nasopharyngeal carcinoma)NPC-TW01、NPC-TW06及NPC-TW07；乳癌細胞株MDA-MB231、MB157；非小細胞肺癌細胞株H1299、A549；神經母細胞瘤細胞株Be2C；肝癌細胞株(Hep G2)；胰腺癌細胞株(Pan 1)；胚胎腎上皮細胞株(為可長期培養而非癌化(non-tumorigenic)之細胞株)TEKID、(239T)，於DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養基加上L-麩醯胺酸(L-glutamine)及10%小牛血清在10% CO2 一般細胞培養箱環境下培養。
生物及外科手術檢體 ：從台大醫院病理科取得鼻咽癌、乳癌、肝癌及胰腺癌外科手術檢體石蠟切片。
胜肽 ：胜肽包含有：(1)SEQ ID NO：1標的胜肽及SEQ ID NO：2標的胜肽、(2)控制組胜肽(SEQ ID NO：3)、(3)異硫氰酸螢光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)-SEQ ID NO：1標的胜肽、(4)FITC-控制組胜肽、(5)生物素(biotin)-SEQ ID NO：1標的胜肽(B-P)、(6)生物素-控制組胜肽(B-C-P)、(7)生物素-5胺基酸間隔(spacer)-SEQ ID NO：1標的胜肽，亦即為生物素-修飾-標的胜肽(B-m-P)，其中該5個胺基酸間隔(spacer)的序列為SEQ ID NO：4、(8)SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖(dextran)包覆氧化鐵(P-Dex-Fe3 O4 )奈米粒子、(9)控制組胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵(CP-Dex-Fe3 O4 )奈米粒子；大多數胜肽是由GeneDiveX公司(拉斯維加斯，美國)合成；Dex-Fe3 O4 奈米粒子是購買自台灣磁量生技有限公司(台北，台灣)。
實施例1. 磁性奈米粒子的組合及特性
由台灣磁量生技有限公司將SEQ ID NO：1標的 胜肽或異硫氰酸螢光素(FITC)-SEQ ID NO：1標的胜肽-連接至葡聚糖(dextran)包覆氧化鐵(Dex-Fe3 O4 )奈米粒子。葡聚糖可做為親水性的表面活性劑層。所需的氧化鐵液體濃度係以pH7.4磷酸鹽(PBS)稀釋高濃度氧化鐵液體。鼻咽癌細胞株(NPC-TW01)在培養24小時後，以每毫升10μg的Fe3 O4 奈米粒子的濃度包括含有及沒有胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子加入並在4℃培養1小時，然後在37℃的10% CO2 培養箱培養2小時；之後細胞以含有2%胎牛血清的磷酸鹽清洗。細胞在固定後與普魯士藍反應劑作用，而觀察SEQ ID NO：1標的胜肽與癌細胞結合能力；每個氧化鐵奈米粒子平均大約連接有10條以上之標的胜肽。
實施例2. 藉由流式細胞儀(flow cytometry)分析不同細胞與SEQ ID NO：1標的胜肽之結合
經培養的細胞株(鼻咽癌細胞株NPC-TW01、NPC-TW07；肺癌細胞株H1299、A549；神經母細胞瘤細胞株Be2C；乳癌細胞株MB157；胚胎腎上皮細胞株TEKID、239T以FITC-SEQ ID NO：1標的胜肽(2μg/mL)處理後以流式細胞儀(FACscan，BD公司，美國)分析，同時亦以FITC-控制組胜肽、生物素(biotin)-SEQ ID NO：1標的胜肽(B-P)及生物素-控制組胜肽(B-C-P)進行流式細胞儀進行分析作比較。
當NPC-TW07細胞株與FITC-SEQ ID NO：1標的胜肽一起培養，可以清楚地在第一A圖中看到清楚的波峰，然而，當SEQ ID NO：1標的胜肽與生物素連接時，與鼻咽癌細胞結合較微弱甚至沒有結合力。鼻咽癌 NPC-TW01細胞株及其他細胞株包含：肺癌細胞株(H1299、A549)、神經母細胞瘤細胞株(Be2C)及乳癌細胞株(MB157)與FITC-SEQ ID NO：1標的胜肽一起培養，如第一B圖所示，不同於腎上皮細胞株(239T)，其他癌症細胞株皆可看到清楚結合波峰，惟獨239T沒有結合的現象。
實施例3. SEQ ID NO：1標的胜肽與鼻咽癌細胞之結合
因為SEQ ID NO：1標的胜肽在共軛結合於生物素之後與腫瘤細胞之結合很弱；故將該生物素修飾-標的胜肽(B-m-P)此修飾是用5個胺基酸間隔(spacer)加到N端再加上生物素，其中該5個胺基酸間隔的序列為SEQ ID NO：4，此種生物素加修飾之標的胜肽，雖然可與較小塊的鼻咽癌檢體作用，但效果不佳，所見反應產物常不清晰。若對超過一公分的外科手術大檢體中去與該生物素修飾的標的胜肽作用時，對經甲醛固定石蠟包埋的外科手術檢體做結合時，常無法看到有結合現象。因而要使用本發明提供之SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵(P-Dex-Fe3 O4 )奈米粒子加普魯士藍反應以結合腫瘤細胞，其結果非常優異，本發明稱此方法為胜肽組織化學診斷法(peptide histochemical diagnosis)。
本發明方法先準備SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子，該奈米粒子係由葡聚糖包覆氧化鐵所組成(分子量介於60,000至70,000之間)，本發明每一個葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子可達到與多於10條標的胜肽分子連結。
第二圖係為SEQ ID NO：1標的胜肽與鼻咽癌細 胞株(NPC-TW01)之結合結果：當鼻咽癌細胞株(NPC-TW01)與SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子在4℃共培養1.5小時再轉到37℃培養四小時後，固定再用普魯士藍去反應時，在許多腫瘤細胞的細胞質(第二圖A及C)可見普魯士藍反應產物出現；然而，以C-P-Dex-Fe3 O4 奈米粒子處理則沒有顯示出特別的反應產物(第二圖B及D)。
實施例4. SEQ ID NO：1標的胜肽與乳癌細胞之結合
乳癌細胞株與SEQ ID NO：1標的胜肽的結合結果：在乳癌細胞(MDA-MB-231)與本發明之SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵(P-Dex-Fe3 O4 )奈米粒子或與異硫氰酸螢光素-SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子(FITC-P-Dex-Fe3 O4 )處理時，在大部分的腫瘤細胞的細胞質中顯示出反應產物(第三圖B)，而在與Dex-Fe3 O4 處理之癌細胞則沒有顯示出反應產物(第三圖A)。以FITC-P-Dex-Fe3 O4 奈米粒子處理的細胞，在腫瘤細胞的細胞質也顯示出反應產物(第三圖C)，在相同細胞中亦可見螢光訊號(第三圖D)。
實施例5. SEQ ID NO：1標的胜肽對血液單核細胞、肝癌細胞及胰腺癌細胞之結合情形
使用本發明提供之SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵(P-Dex-Fe3 O4 )奈米粒子與血液單核細胞、肝癌細胞株(Hep G2)及胰腺癌細胞株(Pan 1)一起培養，90分鐘後再放到37℃培養四小時。固定後再以普魯士藍染 色。其結果在肝癌細胞株(第四圖C)及胰腺癌細胞株(第四圖D)的細胞顯示出藍色反應產物。但在單核細胞中不見顯示藍色反應產物(第四圖A及B)，表示SEQ ID NO：1標的胜肽-標記之結合蛋白質只表現在癌細胞，而不表現在血液中之單核細胞。
實施例6. SEQ ID NO：2標的胜肽與肝癌細胞之結合
除SEQ ID NO：1標的胜肽外，本發明還用另一SEQ ID NO：2標的胜肽，去合成SEQ ID NO：2標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵(SEQ ID NO：2-Dex-Fe3 O4 )奈米粒子。若分別將SEQ ID NO：1標的胜肽葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子、SEQ ID NO：2標的胜肽葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子及Fe3 O4 奈米粒子與肝癌細胞株(Hep G2)一起培養，再以普魯士藍染色後，其結果顯示出SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子(第五圖A)、SEQ ID NO：2標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子(第五圖C)皆有呈現藍色反應產物，而控制組Fe3 O4 奈米粒子則無呈現藍色反應產物(第五圖B)。
此試驗證實，只要某種標的胜肽能與某種癌細胞株結合，只需用本發明之方法都可以觀察其與外科石蠟切片之相對的癌細胞結合。
實施例7. SEQ ID NO：1標的胜肽與外科手術取得的鼻咽癌細胞檢體之結合
將外科手術檢體在經甲醛(formaldehyde)固定(fixation)，脫水(dehydration)後包埋(embedding)於石蠟塊 後切取5mm之切片，經過脫蠟(deparaffinization)後以Trilogy液體(Cell Marque公司，奧斯丁，德克薩斯州)浸泡對切片進行恢復(retrieval)結合蛋白之結合能力，放入132-140℃高壓鍋5-10分鐘，冷卻至室溫後，在4℃加入P-Dex-Fe3 O4 奈米粒子至隔夜，過夜後以磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline，PBC)沖洗，以普魯士藍染液(含有2%亞鐵氰化鉀及0.5N HCL在水中比例為1：1)中浸泡15-30分鐘，以蒸餾水沖洗，最後再以核速紅(nuclear fast red)染細胞核5分鐘，以水沖洗，風乾後以甘油(glycerol)封片或以酒精脫水以芳香樹脂封片。
本發明之胜肽組織化學診斷法主要便是應用於以甲醛-固定之腫瘤檢體加上石蠟包埋之切片，故不只可應用腫瘤細胞株而己；本發明之胜肽組織化學診斷法皆能成功的應用於各種腫瘤檢體切片。
鼻咽癌外科手術檢體以本發明之胜肽組織化學診斷法之結合結果。由於生物素修飾之標的胜肽(B-m-P)不容易與經甲醛(formaldehyde)固定的石蠟包埋組織切片結合，而本發明提供之胜肽組織化學診斷法，其係使用SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子能與鼻咽癌細胞結合，結果顯示出普魯士藍反應產物可輕易在染色的切片中定義出腫瘤細胞(第六圖B、D、E及F)，一些腫瘤細胞浸潤於間質區域亦顯示出反應產物(第六圖B、D及E)。在鼻咽癌外科手術檢體的腫瘤團中的腫瘤細胞顯示出陽性反應產物，但對控制組之胜肽皆無作用(第六圖A、C)，第六圖A使用核速紅染劑，而第六圖C、F皆無使用核速紅染劑。
實施例8. SEQ ID NO：1標的胜肽與乳癌外科手術檢體之結合 。
本發明之胜肽組織化學診斷法以SEQ ID NO：1標的胜肽同樣可成功應用於以甲醛-固定之乳癌外科手術檢體之石蠟包埋切片。
乳癌外科手術檢體以胜肽組織診斷化學法之結合之結果。其中該標的胜肽為SEQ ID NO：1：以生物素修飾-標的胜肽(B-m-P)與乳癌外科石蠟包埋檢體結合之後染色，顯示出非常弱的訊號，或沒有發現與SEQ ID NO：1標的胜肽結合的訊號，染色後之結果沒有呈現反應產物(無圖片呈現)。顯示SEQ ID NO：1標的胜肽不易與甲醛(formaldehyde)固定的石蠟包埋外科手術組織結合。
因此，本發明提供之胜肽組織化學診斷法，可用於外科手術大檢體經甲醛固定石蠟包埋的切片之標的胜肽結合蛋白之定位。當乳癌檢體固定之石蠟切片與SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵(P-Dex-Fe3 O4 )奈米粒子結合之後染色，在很多腫瘤細胞中可見顆粒狀的藍色反應產物(第七圖B至F及第七圖H至J)。此外，在腫瘤細胞團中的間質細胞沒有顯示反應產物。第七圖K及L所示，取自於由乳癌細胞轉移至腋下淋巴結的腫瘤細胞，顯示出藍色的反應產物。以控制組胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子處理的控制組切片未顯示出反應產物(第七圖A及G)。總之，在乳癌外科手術檢體中，若用本方法處理之腫瘤細胞可顯示出陽性染色反應。
實施例9. SEQ ID NO：1標的胜肽與肝癌外科手術檢體之結 合 。
本發明之胜肽組織化學診斷法以SEQ ID NO：1標的胜肽也可應用於肝癌外科手術檢體。因此，利用本發明提供之胜肽組織化學診斷法可應用於此處，肝癌檢體之組織石蠟切片若與SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵(P-Dex-Fe3 O4 )奈米粒子結合(見第八圖A及B)，第八圖C為肝癌組織切片與SEQ ID NO：2標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子結合之後染色，同樣在腫瘤細胞中可發現反應產物，第八圖D為控制組胜肽所染者未顯示出反應產物。
實施例10. SEQ ID NO：1標的胜肽與及SEQ ID NO：2標的胜肽皆與胰腺癌外科手術檢體之結合 。
本發明之胜肽組織化學診斷法以SEQ ID NO：1標的胜肽及SEQ ID NO：2標的胜肽也可應用於胰腺癌外科手術檢體。因此，本發明提供之胜肽組織化學診斷法，胰腺癌組織石蠟切片與SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子(第九圖A及C)及SEQ ID NO：2標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子(第九圖B)結合之後染色，在腫瘤細胞中發現反應產物(第九圖A、B及C)，但胰腺癌組織石蠟切片與控制組胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子之間無結合反應(第九圖D)。
另外，本發明所使用的不同的癌症細胞，包含：鼻咽癌、乳癌、非小細胞肺癌、神經母細胞瘤、肝癌及胰腺癌，顯示出與異硫氰酸螢光素(FITC)-SEQ ID NO：1標的胜肽有特殊的結合能力；然而，本發明之異硫氰酸螢光素-標的胜肽與控制組的可長期生長(immortalized)之胚 胎腎上皮細胞則顯示出非常弱或未顯示結合能力(第一圖B)；異硫氰酸螢光素-SEQ ID NO：2標的胜肽則能與肝癌及胰腺癌結合。這個結果顯示出標的胜肽可特別與鼻咽癌細胞及其他癌症細胞結合，但不與未癌化(untransformed)的細胞結合。
另外，本發明加入大劑量的SEQ ID NO：1標的胜肽(如1mg/mL)至鼻咽癌培養液中，即使是培養10天，腫瘤細胞型態及特性沒有發現有特定的改變，此表示所用標的胜肽之結合蛋白並非屬於受體之類的蛋白。
本發明可用於標的胜肽與腫瘤細胞檢體結合，此可進一步應用於臨床的化療。在鼻咽癌及其他癌之組織石蠟切片也能觀察到SEQ ID NO：1標的胜肽與癌細胞之結合，此因有較多的SEQ ID NO：1標的胜肽插入至葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子(Dex-Fe3 O4 )，這可以合理的預期會有很好的結合效果。因此，將組織石蠟切片與SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子一起培養，再以普魯士藍反應觀察與腫瘤細胞之結合，所顯示出的普魯士藍反應產物，可輕易的定義出在組織石蠟切片中的腫瘤細胞，不管是腫瘤細胞成團或單一浸潤的腫瘤細胞，皆可經由普魯士藍染色反應定義出。
本發明之標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子，該標的胜肽顯示出與各種類型的癌細胞結合，因此，本發明之標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子也能與乳癌或其他癌細胞有效結合，然而，若用生物素修飾之標的胜肽(B-m-P)在乳癌組織石蠟切片之表現，雖然該標的胜肽同為SEQ ID NO：1，但發現其結合訊號微弱或沒有結合 訊號。因此，若用本發明之胜肽組織化學診斷法去與乳癌外科手術檢體之細胞結合，在染色後可獲得良好的結果，並且不但在外科手術檢體中，在其轉移的腋下淋巴結中也可觀察到大量染色的乳癌細胞。
同時，在本發明之又一實施例提供另一種SEQ ID NO：2-標的胜肽，其所形成的SEQ ID NO：2標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子，發明人也發現其無論是在肝癌及胰腺癌細胞株或組織石蠟切片，也皆顯示出與SEQ ID NO：1標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子一樣，有良好的結合能力。
此外，本發明之標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子已證實在活體外(in vitro )及活體內(in vivo )的鼻咽癌、乳癌、肝癌及胰腺癌細胞皆可應用，甚至引導化學治療於未分化的鼻咽癌及乳癌中亦顯示出良好的治療效果及最低的副作用，這些結果都顯示出本發明之標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子在臨床應用上具有多重功能，對鼻咽癌、乳癌、肝癌及胰腺癌細胞之外科手術檢體有效結合，可應用於外科手術檢體中標記引導化學治療，進一步判斷每位患者對應用胜肽標的化學治療之效果。
因此，本發明提供一種胜肽組織化學診斷法，其可在不同的癌症外科手術檢體中以標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子與腫瘤細胞結合，其中該標的胜肽可為只有12個胺基酸的短胜肽，相較於抗體的分子量是非常小的分子，因此，該短胜肽與奈米粒子結合後的體積仍是非常微小，此可使得本案之標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子可以進入細胞外間隙。再者，本發明能於單一奈 米粒子上結合更多條之短胜肽，可有效提昇標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子與腫瘤細胞結合之能力。
<110> 國立台灣大學 林欽塘
<120> 胜肽組織化學診斷法
<130>
<140>
<160> 4
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與癌細胞結合而不與正常細胞結合之標的胜肽
<400> 1
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與肝癌細胞結合而不與正常細胞結合之標的胜肽
<400> 2
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 控制組胜肽
<400> 3
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5個胺基酸間隔
<400> 4

Claims (12)

  1. 一種胜肽組織化學診斷法(Peptide histochemical diagnosis)，包含下列步驟：(a)提供一腫瘤檢體石蠟切片，係由包埋於一石蠟塊內的一腫瘤檢體經由切片且脫臘而得；(b)提供一標的胜肽-葡聚糖(dextran)包覆之氧化鐵奈米粒子，該氧化鐵奈米粒子的表面以葡聚糖包覆，且該標的胜肽之N端與葡聚糖連結；以及(c)將該腫瘤檢體石蠟切片與該標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子接觸後，經一試劑染色後而顯出一特定顏色，其中該腫瘤檢體石蠟切片中的腫瘤細胞會呈現該特定顏色。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽組織化學診斷法，其中該標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子係由至少10條以上之標的胜肽與一葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子所組成。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽組織化學診斷法，其中該標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子之標的胜肽C端係與該腫瘤細胞結合。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽組織化學診斷法，其中該腫瘤檢體先經甲醛固定及脫水後，才包埋於該石蠟塊內。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽組織化學診斷法，其中該腫瘤檢體於脫蠟後，進一步經過一高壓處理而得該腫瘤檢體石蠟切片。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽組織化學診斷法，其中該試劑為普魯士藍試劑。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之胜肽組織化學診斷法，其中該普魯士藍試劑係與該標的胜肽-葡聚糖包覆氧化鐵奈米粒子中的氧化鐵奈米粒子反應之該特定顏色為藍色。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽組織化學診斷法，其中該腫瘤檢體石蠟切片之正常細胞不會被染色。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽組織化學診斷法，其中該腫瘤係為鼻咽癌、乳癌、肝癌、胰臟癌、非小細胞肺癌或神經母細胞瘤。
  10. 一種使用標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子用於製造檢測腫瘤檢體之藥物的用途，其中該腫瘤檢體係為包埋於一石蠟塊內之腫瘤檢體石蠟切片。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之用途，其中該腫瘤檢體石蠟切片之正常細胞不會被染色。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之用途，其中該腫瘤檢體石蠟切片的腫瘤細胞呈現一顏色時，表示該腫瘤細胞能與該標的胜肽-葡聚糖包覆之氧化鐵奈米粒子的標的胜肽結合。
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