TWI495723B - 新穎的噬菌體展示載體 - Google Patents

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Description

新穎的噬菌體展示載體
本發明關於單株抗體的領域。更特別地，其有關於小尺寸的載體以及其等之用於生產噬菌體庫的用途，各個噬菌體表現一結合蛋白於其之表面上，該結合蛋白要被篩選其之結合一結合伙伴的能力。
噬菌體展示方法為使用於研究蛋白的交互作用之一技術。此技術係基於在一噬菌體的表面上表現有興趣的結合蛋白以及憑著其與一結合伙伴形成一複合物的能力來選擇該結合蛋白。此方法的原則係依賴該噬菌體基因組的基因重組：編碼一有興趣的結合蛋白之序列被插入至該噬菌體基因組之內。序列的插入係定位在編碼形成該噬菌體的外套蛋白質複合物之一蛋白之一基因的旁邊。該外套係由不同的蛋白組成，例如舉例而言，最普遍使用的pIII和pVIII蛋白。將一有興趣的序列插入在編碼此等蛋白之基因的旁邊使該有興趣的結合蛋白能夠融合至該噬菌體的外套蛋白。該重組型噬菌體接而感染細菌，以及其之基因組被複製。該重組型噬菌體基因組的表現導致噬菌體的生產，該等噬菌體於其等之表面上表現要被篩選的結合蛋白。在篩選步驟的期間，使不同的蛋白或分子，稱作為結合伙伴，與該有興趣的蛋白接觸。當於該噬菌體的表面上之該結合蛋白和一結合伙伴之間形成一複合物時，該複合物係被純化以及編碼該有興趣的結合蛋白之該核苷酸的(nucleotidic)序列接而可以從該重組型噬菌體基因組來決定。
噬菌體展示的原則開始於1985[Smith,G.P.,1985,Science 228,1315-1317]、且此技術的應用於選擇組合以輔助噬菌體和噬菌體質體載體之抗體片段[McCafferty,J.等人，1990,Nature 348,552-554]，[Barbas,C.F.等人，1991,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 88,7978-7982]，[Breitling,F.等人，1991,Gene 104,147-153]，[Burton,D.R.等人，1991,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 88,10134-10137]，[Clackson,T.等人，1991,Nature 352,624-628]，[Hoogenboom,H.R.等人，1991,Nucleic Acids Res. 19,4133-4137]。該噬菌體展示方法組合了使用噬菌體質體載體，也稱為噬菌體展示載體以及輔助噬菌體用於產生噬菌體庫，該等噬菌體於其等之表面上表現一有興趣的結合蛋白。噬菌體展示載體包含編碼該有興趣的結合蛋白之序列和噬菌體的序列，尤其編碼待與該有興趣的結合蛋白融合的外套蛋白質之序列。噬菌體展示載體亦由不同的功能性序列所組成，用於該噬菌體基因組的複製或是維持該載體於該宿主細胞內。該等噬菌體展示載體不含有全體的噬菌體基因組，此就是此方法要組合使用一輔助噬菌體的原因供用於生產表現結合蛋白於其等之表面上之噬菌體。該輔助噬菌體係藉由從完整的噬菌體基因組來互補該噬菌體展示載體之內所缺少的蛋白而使該噬菌體展示載體上之噬菌體基因組能夠複製和包裝。
於此必須提醒，與包含噬菌體(bacteriophage)M13基因組之全體的經典的噬菌體載體相比，噬菌體展示載體，亦提及為噬菌體質體載體，僅僅包含M13基因組的一小部分，包括基因III和M13基因間的區域之部分。
經由例子來解釋，此等噬菌體載體經典地為大的載體(一般地多於6000個鹼基對)以及可以由以下所構成：於專利申請案WO92/06204中說明的載體M13IX30、M13IX11、M13IX34、M13IX13或M13IX60或是任何衍生的噬菌體載體，例如，使用於一用於產生專利申請案US6,057,098中說明的多價展示庫之方法中的載體668-4。
第一個噬菌體質體載體pCANTAB[Abraham,R.等人，1995,J. Immunol. Methods 183,119-125]，[Tanaka,A.S.等人，1995,Biochem. Biophys. Res. Commun. 214,389-395]，pHEN[Hoogenboom,H.R.等人，1991,Nucleic Acids Res . 19,4133-4137]，[WO 92/01047]，pCOMB[Barbas,C .F .等人，1991,Proc .Natl .Acad .Sci .U .S .A 88,7978-7982]，[Burton,D .R .等人，1991,Proc .Natl .Acad .Sci .U .S .A .88,10134-10137] ，係使用可得到的分子生物工具從在那時可得到的選殖和表現載體予以建構。因為此時已經施加少的最佳化作用至該噬菌體質體載體，一罕見的實例為pKM19[Pavoni,E.等人，2007,Gene 391,120-129]，其之建構考慮到一最佳化的啟動子的優點以及使用噬菌體(bacteriophage)M13的基因III產物的C端領域[Barbas,C.F.等人，1991,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88,7978-7982]。
本發明係有關於一噬菌體展示載體，其包含一選殖卡匣、一噬菌體展示卡匣及一細菌卡匣，以及其之用於產生一噬菌體庫的用途，該庫之各個成員於其之表面上表現一結合蛋白。如同於下列的說明中會顯而易見的，使該等3個卡匣的各個予以最佳化以產生適合於結合蛋白的噬菌體展示之功能性載體。
迄今，即使該技術似乎是穩健的，關於有興趣的蛋白之表現位準仍舊有不充分。到目前為止使用的此技術之另一個缺點為被選擇的結合蛋白之偵測和純化。
本發明打算要解決此等問題以及首次要說明一種新穎且非顯著的最佳化的噬菌體展示載體。
於第一個態樣中，本發明係有關於一種經最小化的噬菌體展示載體，其包含至少一選殖卡匣、一噬菌體展示卡匣及一細菌卡匣，該選殖卡匣包含編碼一多肽的一核酸序列，該多肽至少對應於一抗體的恆定領域之領域內環。
於本說明書中，避免引起懷疑，一“卡匣”應該被視為包含具有特定的生物及/或生化活性之特定的核酸序列的一DNA片段。措辭“卡匣”、“基因卡匣”或“DNA卡匣”可以交換地使用以及具有相同的的意義。
一選殖卡匣應該被視為具有選殖一基因的活性之一卡匣。其因而含有供用於待被選殖的一個或數個有興趣的基因之調控和表現所必須的核酸序列。其包含至少一核酸序列，其編碼對於導入有興趣的基因有用的一啟動子、一終止密碼子，以及一選殖位置，此等組分的各個係互相操作地連結。
術語“操作地連結”或“操作地插入的”意指對於編碼序列的表現所必須的調控序列被放置於一核酸分子內在與該編碼序列有關的適當的位置，以便於能夠表現編碼序列。舉例來說，當該啟動子能夠控制該編碼序列的轉錄或表現時，一啟動子係操作地連結一編碼序列。
一噬菌體展示卡匣應該被視為於該噬菌體展示方法中具有一活性的一卡匣，更明確地用於生產一噬菌體庫，該等噬菌體於其等之表面上表現有興趣的蛋白。其包含至少編碼一噬菌體複製起點的一核酸序列，俾以a)能夠複製該複製載體，其包含由該載體所攜帶之該噬菌體起點為ssDNA，以及b)生產帶有一功能性噬菌體基因組的互補之重組型噬菌體。
一細菌卡匣應該被視為含有用於增殖和維持該載體於該細菌宿主細胞內所必須的序列之一卡匣。一細菌卡匣因而主要地會包含編碼一複製起點和一選擇標識的至少核酸序列。
關於該等卡匣的組成之更多的細節將會在以下提供。
然而，必須了解到對於熟悉此藝者為明顯的任何的修飾應該被視為被本發明包含。
術語“核酸”提及去氧核糖核苷酸(desoxyribonucleotides)或核糖核苷酸和其等之聚合物(“多核苷酸”)，不論單股或雙股形式。除非明確地限制，該術語包含含有天然核苷酸之已知的類似物的核酸，其等具有如參考核酸相似的結合性質以及以相似於天然存在的核苷酸的方式來代謝。除非以其他方式指出，一特定的核酸序列亦暗示地包含其等之守恆地修飾的變體(例如，簡併性密碼子取代)和互補序列以及明白指出的序列。明確地，簡併性密碼子取代可以藉由產生序列來達成，其等之一或更多個經選擇的(或全部的)密碼子之第3個位置係用混合的鹼基及/或去氧肌苷殘基予以取代。
術語“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核苷酸分子”亦可以與基因、由一基因所編碼的cDNA、DNA與RNA可交換地使用。因而，依據本發明之選殖卡匣包含編碼至少一個多肽的一核酸序列，該多肽對應於一抗體的恆定領域之領域內環。於本發明的一個較佳具體例中，該核酸序列係被插入至在該選殖位置旁邊的選殖卡匣之內。此較佳的插入定位允許了，就一(全長)恆定領域的插入而言，獲得由一scFv抗體片段和一恆定領域組成的一單鏈抗體。已經顯示出恆定領域的存在使該有興趣的蛋白，亦即，該單鏈抗體，之改良的功能性的表現成為可能的。該恆定領域亦使得從插入於該噬菌體展示載體之內的核酸序列所生產的結合蛋白之改良的偵測和純化成為可能的。
術語“抗體(antibody)”、“抗體(antibodies)”或“免疫球蛋白”在最廣泛意義而言為可交換地使用的以及包括單株抗體(例如，全長或完整的單株抗體)、多株抗體、多價抗體或多專一性抗體(例如，雙專一性抗體，只要其等顯示出所欲的生物活性)。
更特別地，此分子由一醣蛋白構成，其包含由雙硫鍵互相連接的至少2個重(H)鏈和2個輕(L)鏈。各個重鏈係由一重鏈可變異區(或領域)(本文中縮寫為HCVR或VH)和一重鏈恆定區所組成。該重鏈恆定區係由3個領域，CH1、CH2和CH3所組成。各個輕鏈係由一輕鏈可變異區(本文中縮寫為LCVR或VL)和一輕鏈恆定區所組成。該輕鏈恆定區包含1個領域，CL。VH和VL區可以進一步細分成高度變異性的區域，稱為互補決定區(CDR)，散佈於更恆定的區域，稱為架構區(FR)間。各個VH和VL係由3個CDRs和4個FRs組成，以下列次序從胺端配置至羧端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變異區含有與一抗原交互作用的一結合領域。抗體的恆定區可以媒介免疫球蛋白結合至細菌組織或因子，包括免疫系統之各種各樣的細胞(例如，效應細胞)以及古典的補體系統之第一個組份(Clq)。
其等亦可以包括某些抗體片段，如本文中更詳細說明的，其等顯示出所欲的結合專一性以及親和性，不管來源或是免疫球蛋白種類(亦即，IgG、IgE、IgM、IgA，等等)。
一般而言，關於單株抗體或是其等之功能性片段的製備物，尤其鼠科的起源，可能係提及於手冊“Antibodies”(Harlow and Lane,Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY,pp. 726,1988)中特別說明的技術或是由Kohler和Milstein所說明的來自融合瘤的製備技術(Nature,256:495-497,1975)。
該等熟悉此藝者會了解到重鏈分類為γ(gamma)、μ(mu)、α(alpha)、δ(delta)。或是ε(epsilon)，且在其等之中的一些次型(例如，γ.1-.γ.4)。此鏈的本質決定抗體的“型”各別為IgG、IgM、IgA、IgG，或是IgE。免疫球蛋白次型(同型)(例如：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等等)為充分地定特徵的以及為已知的以賦予功能特化。
輕鏈分類為κ或λ。
輕鏈和重鏈二者均被劃分成結構性和功能性同源性的區域。術語“恆定”和“可變異”係功能性地被使用。就這一點而言，會了解到輕(VL)鏈和重(VH)鏈的部分二者之可變異領域決定了抗原辨識以及專一性。相反地，輕鏈(CL)和重鏈(CH1、CH2或CH3，或CH4，就IgM和IgE而言)的恆定領域賦予重要的生物性質，例如：分泌、經胎盤的移動性、Fc受體的結合、補體的結合，及類似物。按常規，隨其等變得離抗體的抗原結合位置或胺端更遠端的，恆定區領域的編號增加。
按措辭一抗體的“恆定領域”了解到該抗體區沒有從一抗體至相同的同型和異型之另一者的任何的變異性，與含有能夠辨識抗原的抗原決定位之全部分歧的序列之抗體的可變異區相比。
進入此等恆定領域的各個，亦即，CL、CH1、CH2、CH3和CH4，一雙硫鍵係形成大約60個胺基酸的一環。於本說明書中，該環會被稱為領域內環。
於人類IgG CH1之較佳的事例中，存在28個不同的可能的γ重鏈，各個擁有由97個胺基酸的一多肽(序列辨識編號：104至131)構成的恆定領域CH1。此等28個領域的各個呈現一殘基半胱胺酸在位置26處以及另一個在位置82處形成一雙硫橋，所以，形成一雙硫鍵於此等2個半胱胺酸之間，因而形成一領域內環。
於本發明的一特定具體例中，該選殖卡匣包含編碼至少一個多肽的一核酸序列，該多肽對應於一抗體的重鏈恆定領域之領域內環。
更特別地，該重鏈之較佳的領域內環為CH1領域內環，其係由包含於在位置26處之半胱胺酸與在位置82處之半胱胺酸之間的多肽所組成。
於一更佳的具體例中，該選殖卡匣包含編碼至少一個多肽的一核酸序列，該多肽對應於一抗體的重鏈恆定領域。
於一更佳的具體例中，抗體的重鏈恆定領域為抗體的CH1重鏈恆定領域。
對於熟悉此藝者，要定義依據本發明之要被使用的另一個重鏈恆定領域之領域內環為明顯的。
於本發明的另一個具體例中，該選殖卡匣包含編碼至少一個多肽的一核酸序列，該多肽對應於一抗體的輕鏈恆定領域之領域內環。
於人類，存在5個不同的κ鏈，其等的各個對應於107個胺基酸的一多肽，其帶有2個半胱胺酸殘基，各別地在位置27與87處，形成一領域內環(序列辨識編號：90至94)。
更特別地，κ輕鏈之較佳的領域內環為由包含在位置27處之半胱胺酸殘基與在位置87處之半胱胺酸殘基之間的多肽所組成之領域內環。
關於人類λ鏈，有9個有區別的(distincts)形式，其等的各個對應於105個胺基酸的一多肽，其帶有2個半胱胺酸殘基，各別地在位置27與86處，形成一領域內環(序列辨識編號：95至103)。
更特別地，λ輕鏈之較佳的領域內環為由包含在位置27處之半胱胺酸殘基與在位置86處之半胱胺酸殘基之間的多肽所組成之領域內環。
於另一個具體例中，該選殖卡匣包含編碼一多肽的一核酸序列，該多肽至少對應於一抗體的輕鏈恆定領域。
於本發明的一個較佳具體例中，該選殖卡匣的恆定領域為輕鏈κ恆定領域。
本發明中使用的κ恆定領域之起源優先地為人類。
於本發明的一最佳具體例之中，該選殖卡匣的該恆定領域為帶有被刪除的C端半胱胺酸之輕鏈κ恆定領域。
該κ恆定領域缺乏C端半胱胺酸俾以避免表現於噬菌體的表面上之單鏈抗體的二聚合作用，此二聚合作用於κ恆定領域之間為可能的。甚至，一抗體之重鏈和輕鏈的恆定領域係藉由輕鏈的C端半胱胺酸和重鏈恆定領域之非成對的半胱胺酸之間的雙硫鍵之形成而組合。本發明提供了結合蛋白於噬菌體的表面上。不移除恆定領域的C端半胱胺酸會導致可能的單鏈抗體之二聚合作用以及經由結合性的作用之非典型的結合。
C端半胱胺酸的移除為必須的以避免該二聚合作用，以及因而被施加俾以避免gIII融合蛋白的失誤摺疊或聚集作用，由於單鏈抗體的二聚合作用。
於本發明的另一個較佳具體例中，該選殖卡匣的恆定領域為輕鏈λ恆定領域。
本發明中使用的λ恆定領域之起源優先地為人類。
於本發明的一最佳具體例之中，該選殖卡匣的該恆定領域為輕鏈λ恆定領域，帶有在位置104處之被刪除的半胱胺酸(序列辨識編號：95至103)。於另一個具體例中，C端殘基104和105處(半胱胺酸-絲胺酸)可以被刪除(序列辨識編號：95至103)。
迄今，表現融合至一單一恆定領域的一單鏈Fv用於由噬菌體展示之呈現和選擇還沒有被說明。
本發明之另一個特定創新的態樣是載體的尺寸。
大腸桿菌之轉形效率為產生高度多樣性庫的限制性步驟以及載體尺寸係與轉形效率成反比的[Siguret,V.等人，1994,Biotechniques 16,422-426]。目前描述的噬菌體展示載體於缺少結合伙伴的可變異領域的情況呈現超過3390個鹼基對的尺寸以及典型地超過4500 bp，隨著增加的載體尺寸，轉形效率會減少因而降低所獲得的庫的尺寸，或是需要重覆的轉形以達到高度多樣性。
目前描述的不含有任何的恆定領域之噬菌體展示載體的尺寸係列舉如下：
pCANTAB 5E　4522 bp
pHEN1　4523 bp
pHEN2　4616 bp
其他使用的M13噬菌體載體之尺寸亦列舉在下文中(參見，舉例而言，WO92/06204)：
M13IX30　7445 bp
M13IX11　7317 bp
M13IX34　7729 bp
M13IX13　7557 bp
20 M13IX60　8118 bp
噬菌體展示載體的尺寸係與轉形效率成反比例。
本發明的另一個目標是要最佳化宿主細胞的轉形效率。此技術問題係藉由降低本發明的載體尺寸同時維持全部必須的生物活性而予以解決。本發明之另一個特定的發明性的態樣係基於移除於該等3個卡匣之內以及介於該等3個卡匣之間的非功能性核苷酸因而使噬菌體展示載體的尺寸最小化以及因而最佳化轉形效率。必須了解到，在此階段，對於熟悉此藝者，噬菌體展示載體的尺寸之此一降低不是顯著的，因不可預料到該經最小化的噬菌體展示載體之活性會是恆定的(見實施例7)。作為此點的闡釋，於此被所提及的噬菌體展示載體自該技術的發生以來，亦即，自八十年代以來便存在，以及沒有任何習知技藝提及該等噬菌體展示載體的尺寸之降低。
載體內的非功能性核苷酸之刪除使能夠產生更小載體的一庫以及產生較少的壓力於宿主細胞上。載體亦更容易地被維持於宿主細胞內。
此等刪除的結果為少於3300個鹼基對之新穎的噬菌體展示載體，其包括編碼至少一個多肽的核酸序列的尺寸，該多肽對應於一抗體的恆定領域之領域內環，其係如以上所說明的本發明之特徵。其係顯著地少於在習知技藝的載體內觀察到的普遍的尺寸，習知技藝的載體不包括編碼一恆定領域或此一恆定領域的一領域內環之此一核酸序列(超過4500個鹼基對)。為了容易比較，吾人可以考慮到不帶有任何的編碼至少一個多肽之核酸序列(對應於一抗體的恆定領域之領域內環)之依據本發明的噬菌體展示載體之尺寸會少於3000個鹼基對。
舉例來說，可以提及載體pPL12和pPL14，3246個鹼基對(相當於不帶有編碼對應於一抗體的領域內環之多肽的核酸序列之2928個鹼基對)，以及pPL22，3109個鹼基對(相當於不帶有編碼對應於一抗體的領域內環之多肽的核酸序列之2751個鹼基對)。亦可以提及載體pPL31，其包含3158個鹼基對。必須了解到此等4種載體，於下述的實例中清楚闡釋的，為依據本發明之載體的非限制性的實例。
此等4種載體，pPL12、pPL14、pPL22以及pPL31，的序列係各別地以序列辨識編號：1、5、7和148中的序列作為代表。
迄今，還沒有描述也未暗示一種經最小化的載體之用途，該載體包含編碼至少一個多肽的一核酸序列，該多肽對應於一抗體的恆定領域之領域內環，且不超過3300個鹼基對。
避免引起懷疑，措辭“經最小化的載體”必須了解到為具有3300個鹼基對的尺寸或更少鹼基對之一載體。
本發明的噬菌體展示載體係使用來產生一噬菌體庫，該等噬菌體表現待篩選的結合蛋白於其等之表面上。
一“結合蛋白”為一肽鏈具有與另一個蛋白或分子之專一的或普遍的親和性。使蛋白接觸以及當結合為可能時形成一複合物。表現於一噬菌體的表面上之本發明的結合蛋白可以宜為一抗體、一抗體的片段或衍生物，一蛋白或一胜肽。
於本發明的一個較佳具體例中，可以因而使用該噬菌體展示方法作為一篩選方法來決定結合新的標的分子(例如抗原)之專一性抗體。此技術呈現出選擇專一性抗體或抗體片段的優點、沒有用於產生該等抗體的任何的動物免疫的步驟作用。表現有興趣的結合蛋白之噬菌體係直接地產生於細菌細胞內。
該等核酸序列係被插入至該噬菌體展示載體的選殖位置之內以及對應於編碼一抗體的可變異鏈之序列，形成一抗體的片段，也稱為scFv，單鏈Fv，其將在下面予以解釋。
按依據本發明的抗體之“功能性片段”，打算要特別指出一抗體片段，例如：片段可變異的(Fv)、scFv(單鏈之sc)、片段抗原結合(Fab)、F(ab’)2 、Fab’、scFv-Fc片段或是雙價抗體(diabodies)，或是藉由化學修飾已經會增加半衰期之任何片段，例如添加聚(亞烷基)二醇，例如聚乙二醇(“聚乙二醇化”)(聚乙二醇化片段稱為Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2 -PEG或Fab’-PEG)(“PEG”用於聚乙二醇)，以及，尤其，因為其能夠以一般的方式發揮該抗體(其係由該抗體傳來的)之甚至部分的活性。
較佳地，該等功能性片段將由該抗體的重或輕可變異鏈之一部分的序列所組成或將包含該抗體的重或輕可變異鏈之一部分的序列，該等功能性片段係由該抗體所衍生，該部分的序列係足以保留如同其之起源的該抗體之相同的結合專一性以及足夠的親和性，宜至少等於其之起源的該抗體之親和性的1/100，以更佳的方式至少1/10。此一功能性片段會含有其之起源的該抗體之序列的最小量5個胺基酸，宜為10個、15個、25個、50個以及100個連續的胺基酸。
較佳地，此等功能性片段會是Fv、scFv、scFv-Fc型或是雙價抗體的片段，其等一般具有如同其等之起源的抗體之相同的結合專一性。以另一個方式，本發明所包含的抗體片段可以藉由也為熟悉此藝者所熟知的基因重組的技術來獲得，否則經由藉著，舉例而言，自動化胜肽合成儀(例如由Applied Biosystems公司所供應的該等)，或是基因合成之胜肽合成來獲得。
一“單鏈可變異片段”(scFv)為一抗體的片段，如上所定義的，由抗體的重鏈和輕鏈之可變異區所組成，藉由一結合胜肽所連結在一起。此等片段不存在於天然的狀態，但是已經予以人工建構。於該單鏈可變異片段內可變異區重-輕或輕-重之次序對於辨識結合伙伴或表現該重組型蛋白均無顯著的作用，以及因而可變異區的次序可以視為可交換的。被導入於cis之內介於可變異區之間的結合胜肽供使用來定向可變異區於3維組態、類似一天然抗體的3維組態。結合胜肽的選擇影響所形成的scFv許多的方面；胜肽長度實現了單體或是多聚體scFv化合物之形成。較短的結合胜肽有利於形成多聚體scFvs為二聚體(dimmers)、三聚體或四聚體，超過12個胺基酸之較長的結合胜肽有利於單體的形成。結合胜肽理想地由不會限制經表現的scFv之摺疊或結合的胺基酸殘基所構成，胺基酸組成偏好小的胺基酸，其等為極性的一(an)非可離子化的。
一“單鏈抗體”係定義為由一scFv片段以及一抗體的一恆定領域組成之一結合分子。一單鏈抗體因而呈現一重鏈和一輕鏈的可變異區，含有來自該重鏈或輕鏈的與一抗原交互作用之一結合領域。
按依據本發明的抗體之“衍生物”，其係意指一結合蛋白，其包含一蛋白支架以及選自於原始的抗體之CDRs的至少一者俾以維持結合能力。此等化合物為熟悉此藝者所熟知的以及將於下面的說明書中更詳盡地說明。
更特別地，依據本發明之抗體，或是其之功能性片段或衍生物的一者，特徵在於該衍生物係由包含一支架之一結合蛋白所構成，至少一個CDR已經被接枝於該支架上用於原始的抗體之抗體結合部位(paratope)的保存。
本發明中說明的6個CDR序列之一個或數個序列可以被呈現於一蛋白支架上。於此事例中，該蛋白支架再生產帶有適當的摺疊被接枝的CDR(s)之蛋白骨幹，因而允許其(或其等)維持其等之抗原結合抗體結合部位。
熟悉此藝者知道如何選擇性蛋白支架，可以接枝選自於原始的抗體的至少一個CDR於蛋白支架上。更特別地，已經知道，待選擇的，此等支架應該展現出數個特徵如下(Skerra A.,J. Mol. Recogn.,13,2000,167-187)：
-　系統發生上守恆的，
-　具有熟知的3維分子組織之強健的架構(例如，舉例而言，結晶學或NMR)，
-　小的尺寸，
-　沒有或是僅僅低程度的轉譯後修飾，
-　容易生產、表現以及純化。
此等蛋白支架可以為，但是沒有限制，選自以下組成之群組的結構：纖維網蛋白，及優先地第十纖維網蛋白第III型領域(FNfn10)、脂質載運蛋白、抗載運蛋白(anticalin)(Skerra A.,J. Biotechnol.,2001,74(4): 257-75)、來自葡萄球菌蛋白A的領域B之蛋白Z衍生物、硫氧化還原蛋白A或是任何帶有重複的領域之蛋白，例如：“錨蛋白重複”(Kohl等人，PNAS,2003,vol.100,No.4,1700-1705),“犰狳(armadillo)重複”、“富含白胺酸重覆”或是“三十四肽重複”。
應該也考慮到來自毒素(例如，舉例而言，蠍子、昆蟲、植物或軟體動物毒素)或是神經元一氧化氮合成酶之蛋白抑制劑(PIN)之支架衍生物的一個另外的選擇。
作為此雜交建構物之非限制性的實例，其可以已經展示出插入一抗-CD4抗體(亦即，13B8.2抗體)之CDR-H1(重鏈)，至PIN的暴露的環之一者。所獲得的結合蛋白之結合性質保持相似於原始的抗體(Bes等人，BBRC 343,2006,334-344)。亦可以提及將抗溶菌酶(anti-lyzozyme)VHH抗體的CDR-H3(重鏈)接枝於新抑癌素(neocarzinostatine)的一環上(Nicaise等人，2004)。
如上所提及的，此等蛋白支架可以包含來自原始的抗體之1至6個CDR(s)。於一較佳具體例中，但是沒有限制，熟悉此藝者會從重鏈選擇至少一個CDR，該重鏈為已知特別地牽涉於抗體的專一性。選擇有興趣的CDR(s)對於熟悉此藝者用已知的方法會是明顯的(BES等人，FEBS letters 508,2001,67-74)。
作為證明，此等實例為非限制性的以及任何其他已知的或被描述的支架必須被包括於本說明書中。
依據另一個態樣，依據本發明的載體之選殖卡匣包含編碼一啟動子的至少一核酸序列以及編碼一訊息胜肽的一核酸序列。
一啟動子為能夠起始於一信使RNA內的一基因序列之轉錄之一核酸序列，此轉錄係以結合RNA聚合酶於該啟動子上予以起始。
編碼啟動子的序列可以，作為非限制性的實例，由以下構成的群組來選擇：Lac、Tac、Trp、Tet、T7、SP6。
於一較佳具體例中，本發明的該選殖卡匣之啟動子為Lac啟動子。
一“訊息胜肽”為一肽鏈，其負責一有興趣的結合蛋白在其之表現於該細胞中之後的定位。胜肽訊息序列係處於載體上編碼該有興趣的結合蛋白之序列的旁邊。為了正確的併入有興趣的結合蛋白於一含有噬菌體展示載體之組合的噬菌體殼體於一單股DNA組成物之內必須要使有興趣的結合蛋白藉由一胜肽訊息而瞄準目標至宿主有機體的周質空間。有興趣的結合蛋白之結構需要形成雙硫鍵，就一單鏈抗體而言。周質空間為一氧化的環境，可以執行該單鏈抗體的結構摺疊。
編碼該訊息胜肽的序列可以選擇，作為非限制性的實例，自編碼pelB、基因III、phoA、malE、dsbA的序列所構成的群組。
於一較佳具體例中，該選殖卡匣的訊息胜肽為pelB訊息胜肽。
於另一個態樣中，依據本發明的載體之選殖卡匣進一步包含編碼一選殖位置的一核酸序列。
當使用於本文中，術語“選殖位置”係提及含有一限制性位置的一核酸序列(用於藉由連接含有相容的黏性末端或鈍端之一核酸序列之限制內核酸酶-媒介的選殖)，核酸序列的一區域(供使用作為藉由同源性和延長“重疊PCR拼接”之PCR-媒介之插入DNA的選殖之啟動位置)，或是一重組位置(供用於藉由重組-交換反應之重組酶-媒介的標的核酸序列之插入)，或是鑲嵌末端供用於轉位子媒介的標的核酸序列之插入，以及其他的於本技藝中之普遍的技術。
於一較佳具體例中，依據本發明的選殖位置包含至少2個限制性位置。
作為非限制性的實例，可以提及一選殖卡匣的序列序列辨識編號：2為較佳的選殖卡匣。
由本發明生產的噬菌體，以及定義如下的，於其之表面上呈現一結合蛋白，其包含一抗體的一輕鏈和一重鏈、一結合胜肽以及一恆定領域。2個限制性位置可以為必須的來插入編碼輕鏈和重鏈的序列於載體內。
了解到形成由可變異輕鏈和重鏈組成的一單鏈抗體(具有對應於一恆定領域抗體的領域內環之至少一個多肽)係由於藉由可變異輕鏈和重鏈之間的一結合胜肽所操作之連結。
該結合胜肽的序列可以被插入於該載體內。其亦可以為已經存在於載體內，例如非限制性地例示於本發明中的pPL12、pPL14、pPL22以及pPL31載體，其中額外的限制性位置可以為必須的用於應用的插入。
該噬菌體展示卡匣可以包含編碼M13基因III蛋白之一核酸序列的全部或部分。然而，亦可以使用編碼M13基因VII、VIII或IX蛋白的核酸序列。
M13基因III蛋白為來自M13噬菌體的一蛋白，以及為形成噬菌體的殼體之複合物的部分。基因III蛋白係座落於分泌的噬菌體之遠端的末端，以及殼體內之其之數量不限制於一個蛋白，而是可以計數達到從數個至五個基因III蛋白。編碼一結合蛋白的核酸序列係座落在編碼M13基因III蛋白之核酸序列的旁邊於載體上。在轉譯以後，結合蛋白因而被融合至基因III蛋白。來自該噬菌體展示載體的融合蛋白之表現位準的調控允許了融合蛋白的副本數目之調控，與野生型pIII相比，由噬菌體基因組的互補作用所提供的。理想地，低數目的融合蛋白會被併入於各個噬菌體殼體內以避免呈現的結合分子之結合性。
於一較佳具體例中，該載體特徵在於該噬菌體展示卡匣包含一核酸序列，其含有M13基因III蛋白的至少C端領域，對應於序列辨識編號：132或133。
本發明的另一個態樣為M13基因III蛋白的僅僅C端序列之用途。此核酸序列編碼蛋白的部分，該部分係附著至噬菌體以及形成外套蛋白質複合物。
編碼M13基因III蛋白之C端序列呈現了M13基因III蛋白的野生型之核酸序列(序列辨識編號：133)。然而，此核酸序列可以予以最佳化於本發明中、用一來自野生型序列之單一胺基酸的突變(S110G)、對應至一單一核苷酸的突變(A328G)。該C端M13基因III蛋白的序列已經藉由Geneart予以最佳化用於表現於大腸桿菌內以及對應於序列辨識編號：132。
於一最佳具體例中，該噬菌體展示卡匣包含一最佳化的核酸序列，其包含M13基因III蛋白的至少C端領域，對應於序列辨識編號：132。
於本發明的另一個態樣中，依據本發明之噬菌體展示卡匣包含編碼一終止密碼子的一核酸序列，編碼一噬菌體複製起點的一核酸序列，以及編碼一封入或包裝序列的一核酸序列。
一終止密碼子為一短的序列，其係由3個核苷酸所組成的，以及負責mRNA轉譯的終止。該等3個核苷酸之組合不編碼任何的胺基酸，mRNA的核糖體轉譯成一蛋白會結束。
本發明之終止密碼子的序列應該被定位於編碼一多肽的核酸序列(該多肽對應於一抗體的恆定領域之領域內環)以及編碼M13基因III蛋白的核酸序列之間。終止密碼子的功能將取決於會用本發明的噬菌體展示載體予以轉形之宿主菌株，因其之解析會依據所選擇的細胞菌株而不同。
就一抑制子菌株而言，終止密碼子係由菌株予以辨識為一胺基酸。轉譯因而不被中斷以及轉譯的產物為基因III蛋白與表現於該噬菌體的表面上之結合分子的融合。
就一非抑制子菌株而言，終止密碼子被辨識以及轉譯被停止。轉譯的產物因而為結合分子。非抑制子菌株可以被使用於僅生產結合分子，在篩選和偵測單鏈抗體與一結合伙伴之複合物的形成之後。其亦可以使用於分析沒有被連接至基因III蛋白且呈現於一噬菌體的表面上之單鏈抗體的結構。
已經描述出3個終止密碼子，以及係由3個核苷酸所組成：琥珀終止密碼子(TAG)、赭石終止密碼子(TAA)及蛋白石終止密碼子(TGA)。
於一較佳具體例中，本發明的噬菌體展示卡匣之終止密碼子為一琥珀終止密碼子。
於該噬菌體展示卡匣內的“複製起點”為一噬菌體複製起點，其可以起始，用一完整的噬菌體基因組的互補作用，噬菌體起點序列的複製以及該載體所攜帶之編碼有興趣的結合蛋白之序列的複製為單股DNA用於以後的封入於重組型噬菌體內。
噬菌體起點的複製因而促進載體的複製為一單股DNA形式，其接而可以被封入至噬菌體顆粒之內。單股載體DNA係經由完整的噬菌體基因組的互補作用而被封入於噬菌體(bacteriophage)殼體之內。
本發明之噬菌體複製起點之核酸序列可以宜為含有一單一核苷酸的突變之M13噬菌體的非野生型序列，亦即，在位置529處之核苷酸G(序列辨識編號：6)變為核苷酸A(序列辨識編號：3)。該突變導致更多的噬菌體顆粒被生產出。
一“包裝訊息”為一噬菌體的核苷酸的序列，其負責調控編碼有興趣的結合蛋白之序列以及噬菌體起點的序列之包裝成為一保護性且功能性的殼體。為了包裝含有編碼有興趣的結合蛋白之核酸序列的噬菌體的基因組，包裝訊息必須要存在於本發明的噬菌體展示載體之內。用於互補作用之噬菌體基因組係包含於該包裝訊息內導致本發明的載體之偏好的包裝。
本發明的包裝訊息之核酸序列可以為，但是，較佳地，含有一單一核苷酸的突變之M13噬菌體的野生型序列，亦即，在位置784處之核苷酸G(序列辨識編號：6)變為核苷酸A(序列辨識編號：3)。該突變比用M13野生型的包裝訊息賦予了較優的可溶解的重組型噬菌體以及有興趣的蛋白。
作為非限制性的實例，可以提及一種噬菌體展示卡匣，選自於存在於序列序列辨識編號：3、6和149之噬菌體展示卡匣中的群組。
於本發明的另一個態樣中，該噬菌體展示載體的該細菌卡匣包含編碼一啟動子的至少一核酸序列、編碼一正向選擇標識的一核酸序列以及編碼一複製起點的一核酸序列。
依據本發明之細菌卡匣包含一編碼一啟動子之核酸序列。該啟動子係對編碼正向可選擇標識的基因之轉錄負責。
於一較佳具體例中，該細菌卡匣的啟動子可以為一β內醯胺酶啟動子。
一“正向選擇標識”為一核酸，其被導入至一載體之內俾以選擇帶有該載體之經轉形的細菌以及維持帶有該載體之經轉形的細菌於培養物中。此核酸序列可以為一基因或是任何任擇的調控序列，例如一抑制性RNA。
於一較佳具體例中，正向選擇標識可以為一抗胺芐青黴素或抗氯黴素基因。
呈現確實的轉形成功之宿主細胞，亦即，載體已經被導入且保持之細胞將能夠存活及增殖(mutliplicate)於含有一抗生素之一培養基上，因為選擇標識基因賦予該抗生素抗性給宿主。
依據本發明的載體可以進一步包含，設若為必須的，編碼一轉錄終止子的一核酸序列。
一“轉錄終止子”為一核苷酸的序列，其結束一基因之RNA聚合酶的轉錄成為mRNA，本文中編碼該正向選擇標識的基因。編碼抗體的可變異區之核酸序列、一抗體的恆定領域或是一抗體的恆定領域之領域內環以及M13基因III蛋白之轉錄必需要於選殖卡匣之啟動子的控制之下。因而，選擇標識的轉錄必需要被停止，因其係於細菌卡匣的啟動子之控制之下。
該轉錄終止子的核酸序列優先地定位於該噬菌體展示載體之內，在編碼可選擇標識的基因的旁邊。
於另一個態樣中，本發明的細菌卡匣包含含有一複製起點之一核酸序列。此複製起點使該載體能夠在其之轉形之後於該細菌宿主內複製。
作為非限制性的實例，可以提及一種細菌卡匣，選自於存在於序列序列辨識編號：4、8和150之細菌卡匣的群組。
依據另一個較佳具體例，本發明於此說明了一種經最小化的噬菌體展示載體，名為pPL12，其包含序列辨識編號：1的核酸序列。
依據另一個較佳具體例，本發明於此說明了一種經最小化的噬菌體展示載體，名為pPL14，其包含序列辨識編號：5的核酸序列。
依據另一個較佳具體例，本發明於此說明了一種經最小化的噬菌體展示載體，名為pPL22，其包含序列辨識編號：7的核酸序列。
依據另一個較佳具體例，本發明於此說明了一種經最小化的噬菌體展示載體，名為pPL31，其包含序列辨識編號：148的核酸序列。
本發明的另一個態樣為一種設計依據本發明之經最小化的噬菌體展示載體庫之方法，該方法特徵在於其包含以下的步驟：
a)　將編碼該結合蛋白的該等核酸序列插入至本發明之經最小化的噬菌體展示載體之內；
b)　以該經最小化的噬菌體展示載體予以轉形一宿主細胞。
一“噬菌體展示載體庫”為依據本發明之載體的一收集，或是含有該等載體之宿主細胞，該等載體的各個包含了編碼從一載體至另一個之間不同的結合蛋白之序列。
一“宿主細胞”為用來表現有興趣的基因之一有機體，該等基因係被定位於表現的載體上。該等載體能夠複製其等自身但是需要一宿主之生物材料用於不同的生物反應，例如：複製、轉錄以及轉譯。一宿主細胞因而為一細胞，其中本發明的噬菌體展示載體會以噬菌體基因組的互補作用而於其內複製且生產於其等之表面上表現一結合分子之一噬菌體庫。該設計本發明之噬菌體展示載體庫的方法之步驟a)可以用本技藝中已知的技術予以執行，例如：限制性消化、同源重組，或是接合非依賴性選殖。
該方法的步驟b)可以，作為非限制性的實例，藉由化學或熱休克轉形或是，於一較佳具體例中，藉由電穿孔予以執行。
本發明的另一個態樣為一種庫，其係由如上所陳述之設計該噬菌體庫的方法所獲得的經最小化的噬菌體展示載體所組成。
於一較佳具體例中，步驟b)的宿主細胞可以選自於由大腸桿菌菌株TG1、XL1-Blue、XL1-Blue MRF’、K12ER2738細胞所構成的群組。
於本發明之一較佳的實現中，宿主細胞為大腸桿菌TG1。
本發明的另一個態樣為一種生產經最小化的噬菌體庫的方法，該方法包含先前所說明的設計載體庫之方法的2個步驟以及藉由噬菌體(bacteriophage)蛋白I-XI的互補作用之複製、封入與分泌一噬菌體-結合蛋白複合物的額外的步驟c)。
一“噬菌體庫”為噬菌體之一收集，各個表現於其等之表面上從一噬菌體至另一個噬菌體之間不同的結合蛋白。一噬菌體庫因而可以使用來篩選一有興趣的結合蛋白與一結合伙伴。於一噬菌體之間形成一複合物，表現於其之表面上的結合蛋白和該結合伙伴，接而將能夠決定關於哪個噬菌體表現了有興趣的結合蛋白。在已經選擇複合物之後，載體上之序列會予以分析俾以獲得編碼有興趣的結合蛋白之確切的序列。
步驟c)之互補作用可以經由以下方式達到：添加複製以及包裝無效率的輔助噬菌體，例如：M13KO7、R408、VCSM13，或是經由轉形於步驟b)能夠表現必須的噬菌體蛋白質之一宿主細胞以互補該噬菌體質體載體的複製和分泌。
本發明的另一個態樣為一種庫，其係由如上所陳述的生產該噬菌體庫之方法所獲得的噬菌體所組成。
本發明的再另一個態樣為一噬菌體，其係由產生如以上所說明的一噬菌體庫的方法所獲得的，該噬菌體表現有興趣的結合蛋白於其之表面上。
本發明也關於一種篩選對一結合伙伴專一之有興趣的結合蛋白之方法，該方法包含以下步驟：
a)　使結合伙伴與依據本發明之噬菌體庫接觸；
b)　選擇由有興趣的結合蛋白與該結合伙伴所形成之複合物；
c)　從載體萃取編碼該有興趣的結合蛋白之序列，以及
d)　生產該有興趣的結合蛋白。
一結合伙伴為一抗體可以選擇性地結合之一合成的或天然的分子或蛋白。結合伙伴可以為一多肽、多醣、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或是其他天然存在的或合成的化合物。
該方法的篩選一結合蛋白之步驟a)可以藉由使一結合伙伴與表現該結合蛋白於其等之表面上之該噬菌體庫接觸來執行。結合伙伴可以為天然地表現於細胞的表面上，或是被固定的或是於一溶液內。
選擇由該結合蛋白與該結合伙伴所形成之複合物的步驟b)可以，作為非限制性的實例，用選擇的準則來執行，包括：pH、溫度、溶劑、鹽的濃度、有關的結合伙伴的交叉反應性以及藉由結合至低濃度的可得到的結合伙伴所決定之親和性。於所欲的條件下未保留結合蛋白至結合伙伴的之結合複合物被排除。
萃取編碼經選擇的結合蛋白之序列的步驟c)可以藉由以下方式，作為非限制性的實例，執行：藉由用該經選擇的噬菌體-結合蛋白複合物再感染宿主細胞、細胞的擴增以及回收編碼該經選擇的結合蛋白之該載體之DNA。
生產該經選擇的結合蛋白之步驟d)可以，作為非限制性的實例，藉由該載體之轉形至非抑制子細菌宿主細胞來執行。琥珀終止密碼子TAG因而被辨識為一終止密碼子，該結合蛋白係被表現為一可溶解的部分。於另一個具體例中，其可以藉由選擇性選殖該結合蛋白至一任擇的表現系統之內而達到。
本發明亦包含本發明之經最小化的噬菌體展示載體之以產生的載體庫的用途，該用途宜包含以下步驟：
a)　將編碼該結合蛋白的該等核酸序列插入至本發明之經最小化的噬菌體展示載體之內；
b)　以該噬菌體展示載體予以轉形一宿主細胞。
本發明亦包含本發明之經最小化的噬菌體展示載體之以產生一噬菌體庫的用途，該用途宜包含以下步驟：
a)　將編碼該結合蛋白的該等核酸序列插入至本發明之經最小化的噬菌體展示載體之內；
b)　以該噬菌體展示載體予以轉形一宿主細胞；以及
c)　藉由噬菌體(bacteriophage)蛋白I-XI的互補作用之複製、封入與分泌噬菌體-結合蛋白複合物的步驟。
本發明處理該經最小化的噬菌體展示載體之用於篩選對一結合伙伴專一之一結合蛋白之用途，較佳地該用途包含以下的步驟：
a)　使該結合伙伴與依據本發明之噬菌體庫接觸；
b)　選擇由該結合蛋白與該結合伙伴所形成之該複合物；
c)　從該經最小化的噬菌體展示載體萃取編碼該結合蛋白的該等核酸序列；以及
d)　生產該結合蛋白。
本發明亦包含一種套組，其含有至少本發明之經最小化的噬菌體展示載體、專一性引子以及抑制子細胞菌株。
按“抑制子細胞菌株”，打算表明一細菌宿主，其包含一傳遞RNA(transfert RNA)辨識一終止密碼子且插入一胺基酸(aminio-acid)於其之位置上。
作為此抑制子細胞菌株之非限制性的實例和較佳實例，可以提及抑制子細胞菌株TG1、XL1-blue、ER2738、ER2267以及HB101。
於本發明的一最佳具體例中，該套組之專一性引子係選自於存在於序列序列辨識編號：9至85之核引子(nucleic primers)的群組。
圖式簡單說明
本發明之其他的特徵和優點於說明及實例和圖式之中進一步地顯露出，圖式之說明係呈現如下。
第1圖：有明顯的領域內環之免疫球蛋白結構；第2圖：人類κ輕鏈的恆定領域之胺基酸序列，各別地帶有在位置27與87之明顯的2個半胱胺酸殘基；第3圖：人類λ輕鏈的恆定領域之胺基酸序列，各別地帶有在位置27與86之明顯的2個半胱胺酸殘基；第4圖：γ重鏈的人類恆定領域CH1之胺基酸序列，各別地帶有在位置26與82之明顯的2個半胱胺酸殘基；第5圖：pPL12載體；第6圖：pPL14載體；第7圖：pPL22載體；第8圖：大腸桿菌菌株TOP10之轉形效率(cfu/ml)；第9圖：大腸桿菌菌株TOP10之轉形效率(cfu/mg DNA)；第10圖：於pPL12和pCANTAB之間的在單鏈抗體噬菌體生產後之IPTG誘導的效應；第11圖：生產的噬菌體/ml和載體尺寸之間的關係；第12圖：由用載體pPL12和pPL14予以轉形且用輔助噬菌體M13KO7感染的大腸桿菌菌株TG1所生產的噬菌體之比較；第13圖：pPL20載體；第14圖：pPL31載體。
 較佳實施例之詳細說明 實施例1：載體建構
載體pPL12(第5圖)的建構係在經合成的DNA和PCR產物之此等核酸用相關的限制性酵素之限制性消化以及消化產物的連接之後、經由組合該等經合成的DNA和PCR產物來執行。
包含Lac啟動子、pelB訊息胜肽、選殖位置、連結胜肽、人類κ2個恆定領域、6個組胺酸標記以及琥珀終止密碼子之選殖卡匣係藉由Geneart AG(Regensburg,Germany)予以合成。於5’末端包括一Hind III限制性位置以促進載體建構。該選殖卡匣係予以合成與噬菌體(bacteriophage)M13基因III蛋白的C端領域融合，密碼子序列係藉由Geneart AG予以最佳化用於表現於一大腸桿菌宿主中。在合成的期間將一EcoR I限制性位置導入噬菌體(bacteriophage)M13基因III蛋白的C端領域在終止密碼子之後的3’末端。經合成的DNA片段係由具有Hind III和EcoR I限制性位置於末端之1032 bp片段所構成。具有Hind III和EcoR I之此片段的限制性消化產出1026 bp的一產物。
噬菌體展示卡匣之剩餘的部分係使用寡核苷酸引子M13oriPSApaI和M13oriPSEcoRI藉由PCR從噬菌體展示載體pCANTAB5E(Amersham lifesciences)予以擴增：
M13oriPSApaI：
5’-GGGCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAG-3’(序列辨識編號：86)
25 M13oriPSEcoRI：
5’-GAATTCCCGAAATCGGCAAAATCCCT-3’　(序列辨識編號：87)
所形成的PCR產物為具有EcoR I與Apa I限制性位置於末端之393 bp片段。具有EcoR I與Apa I之此片段的限制性消化產出391 bp的一產物。
細菌卡匣係使用寡核苷酸引子BlaProApaI與pUCOriHindIII藉由PCR從選殖載體pUC19予以擴增：
BlaProApaI：5’-GGGCCCACTTTTCGGGGAAATGTGC-3’(序列辨識編號：88)
pUCOriHindIII：5’-AAGCTTATCAGGGGATAACGCAGG-3’(序列辨識編號：89)
所形成的PCR產物為具有Apa I和Hind III限制性位置於末端之1835 bp片段。具有Apa I和Hind III之此片段的限制性消化產出1829 bp的一產物。
3個DNA片段1026 bp、391 bp和1829 bp係被連接在一起、定向係藉由相容的黏性末端予以確定，以產生包含一選殖卡匣(序列辨識編號：2)、一噬菌體展示卡匣(序列辨識編號：3)及一細菌卡匣(序列辨識編號：4)之3246 bp的載體pPL12。
連接產物係藉由熱休克轉形予以轉形至大腸桿菌細胞之內。所形成的陽性轉形體(對胺芐青黴素的存在有抵抗的)係被選擇以及質體序列係藉由標準DNA定序法予以確認。
載體pPL14係使用寡核苷酸引子M13ori1QcS和M13ori1QcAS以及M13ori2QcS和M13ori2QcAS藉由載體pPL12的定點突變誘發予以產生。引子對M13ori1QcS和M13ori1QcAS導入A>G突變以再生M13野生型序列於M13包裝訊息中在位置784 bp處於該噬菌體展示卡匣內(序列辨識編號：6)。引子對M13ori2QcS和M13ori2QcAS導入A>G突變以再生M13野生型序列於M13複製起點在位置529 bp處於該噬菌體展示卡匣內(序列辨識編號：6)。
M13ori1QcS　CTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCC(序列辨識編號：139)
M13ori1QcAS　CTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGC(序列辨識編號：140)
M13ori2QcS　CAACACTCAACCCTATCTCG(序列辨識編號：141)
M13ori2QcAS　AGGGTTGAGTGTTGTTCC(序列辨識編號：142)
定點突變誘發係執行如下：藉由孵育50 ng的載體pPL12、首先用M13ori1QcS和M13ori1QcAS(各個以10 μM的濃度)、2 μl的dNTP混合物(各個以10 mM)、5 μl的10x濃縮的反應緩衝液用於Pfu ultra(Stratagene)，以及用H2 O完成該反應至50 μl。在反應混合物於94℃歷時30s之變性之後，執行94℃歷時30秒接著55℃歷時30秒以及98℃歷時3分鐘之12個週期的擴增。在反應之後，親代質體係藉由用限制內核酸酶Dpn I之處理予以移除。消化的產物係藉由熱休克轉形予以轉形至大腸桿菌細胞之內。所形成的陽性轉形體(對胺芐青黴素的存在有抵抗的)係被選擇以及質體序列係藉由標準DNA定序法予以確認。相同的程序係用引子對M13ori2QcS和M13ori2QcAS於陽性純株上執行以導入第二個突變。所形成的陽性轉形體(對胺芐青黴素的存在有抵抗的)係被選擇以及質體序列係藉由標準DNA定序法予以確認，導致載體pPL14。
載體pPL22係藉由pPL14之PCR擴增予以產生，其係用會產生排除細菌卡匣內之冗餘的核苷酸序列之一產物的引子。用引子pPL12SenseApaI和pPL12ApaIAS的PCR擴增導致一PCR產物，其當用限制內核酸酶Apa I予以處理時可以再連接以產生於噬菌體展示卡匣和細菌卡匣之間缺少53 bp之一產物。連接產物係藉由熱休克轉形予以轉形至大腸桿菌細胞之內。所形成的陽性轉形體係被選擇以及質體序列係藉由標準DNA定序法予以確認。此材料係使用作為用引子Seqls和pPL12HindIIIAS之PCR擴增的模板，所形成的PCR產物係用限制內核酸酶Hind III予以處理以及再連接(relegated)。所形成的再連接產物於細菌卡匣和選殖卡匣之間缺少84 bp。連接產物係藉由熱休克轉形予以轉形至大腸桿菌細胞之內。所形成的陽性轉形體係被選擇以及質體序列係藉由標準DNA定序法予以確認，導致3109 bp的載體pPL22(序列辨識編號：7)，其包含新穎的細菌卡匣(序列辨識編號：8)，該細菌卡匣含有比pPL12或14之中的細菌卡匣(序列辨識編號：4)少134 bp。
pPL12SenseApaI
GCATGGGCCCTTCAAATATGTATCCGCTCA(序列辨識編號：143)
pPL12ApaIAS
GCGCACATTTCCCCGAAAAG(序列辨識編號：144)
Seq1s
5TTTGCTGGCCTTTTGCTCAC(序列辨識編號：145)
pPL12HindIIIAS
GCATAAGCTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGAC(序列辨識編號：146)
實施例2：庫的產生
結合分子庫的產生可以以下述的方式予以執行。
RNA係由一適合的宿主萃取，理想地人類淋巴細胞。編碼所欲的結合伙伴之mRNA係使用互補於所欲的結合分子之清晰的恆定區之反訊息寡核苷酸而依次地反轉錄成cDNA。
所欲的結合分子的可變異區係依次藉由使用互補於該等可變異區的5’和3’末端之一組訊息與反訊息寡核苷酸的PCR予以擴增。訊息與反訊息寡核苷酸併入特定的限制性位置供用於經擴增的可變異領域之隨後的選殖。接續用適當的限制性酵素之限制性消化經擴增的可變異領域之後，所形成的DNA片段可以連接至已經依次用相容的限制性酵素予以經限制性消化之本發明的載體。所產生的相容的限制性位置黏性末端促進了定向選殖結合分子至本發明的載體之內。為本發明的載體以及至少一個結合分子之所形成的連接產物係依次轉形至一適當的細菌宿主之內。
RNA萃取宜於經單離的B淋巴細胞上執行，但是同樣地可以於由人類血液所獲得的經單離的單核細胞或總非紅血球的細胞族群上執行。使用1000000個經單離的單核細胞接著用RNeasy miniprep(QIAGEN GmbH)萃取總RNA，產生足夠的RNA用於產生一庫。
在總RNA單離之後，cDNA合成係用Superscript III反轉錄酶予以執行，儘管可以使用其他的反轉錄酶。2 μg的經單離的總RNA係與2 pmol的一第一股cDNA合成引子(序列辨識編號：9、10和11)和1 μl的dNTPs(以各個10 mM的濃度)混合，以及該反應體積完成至13 μl。
HuCg　5’-TTGACCAGGCAGCCCAGG-3’　(序列辨識編號：9)
HuCk　5’-GGAAGATGAAGACAGATGG-3’　(序列辨識編號：10)
HuCl　5’-ACGGTGCTCCCTTCATGG3’　(序列辨識編號：11)
所形成的混合物係被加熱至65℃歷時5分鐘在於冰上冷卻之前以允許寡核苷酸黏著至RNA模板。一旦冷卻，4 μl 5x First-Strand Buffer(250 mM Tris-HCl(pH 8.3於室溫下)、375 mM KCl、15 mM MgCl2 )、1 μl 0.1 M DTT、1 μl RNaseOUTTM 、1 μl SuperScriptTM III RT(200單位/μl)被添加以及該反應係於55℃予以孵育歷時1小時。在藉由於70℃孵育反應混合物歷時15分鐘而加熱失活SuperScriptTM 酵素之後，所形成的cDNA可以直接地使用作為一模板，用於藉由使用庫產生引子組之結合分子的PCR擴增。訊息與反訊息寡核苷酸係使用作為單純的對或池、代表所欲的結合分子之訊息與反訊息定向的一者或二者。為了擴增免疫球蛋白γ鏈的可變異領域，一或多重的訊息寡核苷酸(序列辨識編號：12至38)係組合以一或更多個反訊息寡核苷酸(序列辨識編號：39至45)來使用。PCR擴增係使用PhireHot Start DNA聚合酶(Finnzymes)來執行，儘管其他的DNA聚合酶可以使用於其之位置上。擴增係藉製備1μl dNTS(各個10 mM)、以各個0.5 μM之最終濃度的訊息寡核苷酸(oligonucleotide)或寡核苷酸(oligonucleotides)、以各個0.5 μM之最終濃度的反訊息寡核苷酸(oligonucleotide)或寡核苷酸(oligonucleotides)、10 μl 5x PhireTM 反應緩衝液、0.5-1μl cDNA合成產物以及1 μl PhireTM Hot Start DNA聚合酶的一混合物來執行。擴增係於一Applied Biosystems 9700熱循環儀用下述的循環條件予以執行：起始的變性98℃×30s，接著30個週期的98℃×5s、60℃×5s以及72℃×20s，72℃歷時1 min之最終伸長的步驟，該反應接而被維持於4℃，在儲存於-20℃之前或是利用之前。免疫球蛋白κ或λ鏈可變異領域之擴增係以相同的方式予以執行，各別地用選擇序列辨識編號：46至58或是63至80之一或更多者取代訊息寡核苷酸以及各別地反訊息寡核苷酸序列辨識59至62或81至85。
為了改良隨後的限制性消化，可以添加1 μl的蛋白酶K(20 mg/ml)至PCR反應以及於37℃孵育歷時30分鐘接著於70℃加熱失活歷時15分鐘。此步驟有效地移除仍然附著於擴增的DNA之末端的聚合酶以及可以避免限制性消化。
在擴增之後，可變異領域係用限制性酵素的組合予以處理以促進的定向選殖至本發明的載體之內。κ與λ可變異領域以及本發明的載體之製備物係用限制內核酸酶Sal I和Mlu I予以消化。經限制性消化的DNA係藉由凝膠電泳以及用Nucleospin Extract II(Machery Nagel)之所欲的DNA片段的單離而從不想要的DNA片段來純化。所形成的經純化的DNA接而予以連接以產生κ或λ可變異領域之庫於本發明的載體之內。所形成的連接產物接而係藉由熱休克轉形予以轉形至勝任的大腸桿菌TOP10細胞(Invitrogen)之內。在熱休克以後，細胞係被平盤培養於含有100 μg/ml胺芐青黴素之選擇性瓊脂平盤之上，因而僅僅含有重組型載體的細胞會存活。經轉形的細胞代表一免疫球蛋白κ或λ可變異領域庫，處在經選殖的可變異領域之前之終止密碼子的存在於本發明的載體之內會避免蛋白的表現以及有利於載體的維持。
經轉形的細胞係從選擇性瓊脂平盤予以回收以及κ或λ可變異領域庫之DNA藉由標準的質體純化技術予以回收。
存在於本發明的載體之內的免疫球蛋白γ鏈可變異領域以及κ或λ輕鏈可變異領域庫係用限制內核酸酶Nco I和Mfe I予以限制性消化，除了用HuVL9產生的λ(Lamda)可變異領域庫(序列辨識編號：71)(其係用Sfi I和Mfe I予以限制性消化)之外，由於Nco I限制性位置確定的存在於編碼用此寡核苷酸擴增的λ可變異領域之生殖系列內。限制性消化的DNA係藉由凝膠電泳以及用Nucleospin Extract II(Machery Nagel)之所欲的DNA片段的單離而從不想要的DNA片段來純化。所形成的經純化的DNA接而予以連接以產生γ與κ或λ可變異領域之庫於本發明的載體之內。所形成的連接產物接而藉由電穿孔予以轉形至勝任的大腸桿菌細胞XL1-Blue、XL1-Blue MFR’或是TG1超級勝任細胞(Stratagene)之內以確保最大數目的轉形體，其等依次指定呈現於該產生的庫之內的結合分子之多樣性。可以執行多重的連接和轉形以擴充所形成的結合分子庫之多樣性。
所形成的轉形體可以藉由添加輔助噬菌體(例如M13KO7(New England Biolabs))來產生出呈現結合分子庫的噬菌體顆粒而予以立即利用，或是可以添加20%甘油(v/v)和葡萄糖至最終濃度5%(v/v)而儲存於-80℃。
實施例3：最佳化的噬菌體展示載體之經改良的轉形效率
為了研究降低的載體尺寸對於細菌宿主的轉形之效率的效應，測試的轉形係執行大腸桿菌TOP10熱休克勝任細胞。相等數目的細胞係用由0.5-10 fmoles之一系列的載體DNA的副本予以轉形。經轉形的特定數目的載體分子被視為轉形效率之更準確的表示，因轉形相同的DNA濃度導致顯著更多副本的被轉形之更小的載體。吾人考慮到此會不正當地使本發明中說明的載體處於優勢。
細胞係用0.5、1、2或是10 fmoles的pPL12或pCANTAB於冰上孵育歷時30分鐘。施加42℃的熱休克歷時準確地45秒。細胞接而於冰上冷卻歷時另外的2分鐘。隨後，細胞係予以孵育於回收培養基中，在平盤培養於選擇性瓊脂平盤上之前。在37℃隔夜孵育以後，菌落的數目係予以評估。
透過熱休克之大腸桿菌TOP10細胞之轉形效率顯示出轉形10 fmoles的pPL12比起pCANTAB每毫升轉形的細胞產出4.5 x更多的轉形體，第8圖。
每μg轉形的DNA之轉形效率為普遍的表示以及就其本身而論亦為了比較的目的而決定。載體pPL12或是pCANTAB之每μg的DNA之轉形效率隨著DNA濃度增加0.5-10 fmoles而減少。每μg的DNA之最高效率的轉形係以最低的DNA濃度(0.5 fmoles)來達到，於此條件pPL12產出比pCANTAB 4.5 x更多的菌落形成單位(cfu)(第9圖)。
實施例4：調控結合領域融合至噬菌體顆粒
為了決定融合至噬菌體顆粒的結合領域之背景表現的程度，對致癌基因cMET之一抗體的重鏈和輕鏈可變異領域係以cis選殖於pPL12和pCANTAB的選殖卡匣中。為scFv-Fc之所形成的融合蛋白融合至pPL12內之M13蛋白3的C端領域以及scFv融合至噬菌體(bacteriophage)M13之完整的蛋白3，就pCANTAB而言。
帶有相關的載體之大腸桿菌TG1細胞係予以孵育於選擇性生長培養基之內至對數中期(OD600 nm 0.6)，於該時將輔助噬菌體M13KO7以20：1之感染的多重性添加至該培養物。1ac啟動子係經由以0、10或是100 nM的濃度來添加別乳糖模擬異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)來誘導。在30℃隔夜孵育以後，所生產的噬菌體係藉由沉澱予以純化以及於磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)內回收。將獲得的噬菌體隨後滴定至一固定於一飽和的聚苯乙烯96井平盤上之固定的cMET分子，以0.7 μg/ml的濃度。在大量的清洗以後，經由融合至蛋白3的全部(pCANTAB)或是蛋白3的部分(pPL12)之功能性結合領域而被保留的噬菌體係藉由對噬菌體外套蛋白質之蛋白8專一的一抗體予以偵測，該抗體係用辣根過氧化酶予以標示以促進比色偵測。
缺少IPTG pPL12展現出比pCANTAB表現的純株3.5 x較少的結合訊息(第10圖)，指示出由pCANTAB之較高位準之無限制的表現。用10或是100 nM IPTG誘導的結合領域-蛋白3融合產出了來自2個表現載體之可比較的結合訊息，顯示出由pPL12載體之更牢固地控制但是高度可誘導的蛋白表現。較低的基礎表現有利於維持更毒的純株於一庫族群中以及因而為較佳的。
實施例5：關於載體尺寸之噬菌體的生產
載體尺寸對於由經感染的大腸桿菌宿主細胞之噬菌體生產的效應係藉由比較載體pPL12和pPL14兩者皆3246 bp，4522 bp的pCANTAB以及4728 bp的pPL2予以評估。載體pPL12和pPL14不同在於噬菌體展示卡匣內的僅僅2個核苷酸的位置；pPL2含有全長M13蛋白3以及野生型M13起點或是複製和包裝訊息，但是缺少一抗體恆定領域。
用各個載體轉形的大腸桿菌TG1細胞係生長至對數中期(OD600 nm 0.6)於選擇性生長培養基之內以及以輔助噬菌體M13KO7以20：1之感染的多重性予以感染。在隔夜生長以後，所生產的噬菌體係藉由沉澱從生長培養基予以回收以及在感染對數中期大腸桿菌TG1細胞之前依次滴定。經感染的細胞係被平盤培養於選擇性生長培養基之上以及計算菌落形成單位(被噬菌體感染且表現選擇性生長標識的細胞)。觀察到當載體尺寸增加獲得的菌落形成單位之數目顯示出較低位準的噬菌體生產(第11圖)。個
最小的載體測試的pPL12和pPL14(兩者皆包含3246 bp)生產了9x1012 個菌落形成單位，與具有4522 bp的尺寸之pCANTAB相比(其生產5.75×1012 個)。所生產的菌落形成單位之差異比載體尺寸的差異顯著，pCANTAB比pPL12(產生1.5x更少的噬菌體)為1.4x更大的。
實施例6：於噬菌體展示卡匣內的野生型或突變殘基之評估
於pPL12的噬菌體展示卡匣內之M13複製起點和包裝訊息內的突變或野生型殘基之效應係予以評估與pPL12同一的載體pPL14相比，除了pPL12含有野生型殘基於噬菌體展示卡匣內之外。
用載體pPL12和pPL14予以轉形之大腸桿菌TG1細胞係生長至對數中期(OD600 nm 0.6)於選擇性生長培養基之內以及以輔助噬菌體M13KO7以20：1之感染的多重性予以感染。在隔夜生長以後，所生產的噬菌體係藉由沉澱從生長培養基予以回收以及在感染對數中期大腸桿菌TG1細胞之前依次滴定。經感染的細胞係被平盤培養於選擇性生長培養基之上，其含有抗生素胺芐青黴素(100 μg/ml)以選擇含有該載體之細胞或是康黴素(25 μg/ml)以選擇被包裝的輔助噬菌體M13KO7予以感染的細胞。計算藉由以帶有抵抗胺芐青黴素的噬菌體之感染所生產的菌落形成單位的數目(實心條)以及產生的污染輔助噬菌體的百分比係表達為此數值之百分比(三角形)(第12圖)。
載體pPL12生產比pPL14 2x更多的噬菌體顆粒以及含有一半數目的污染輔助噬菌體(0.7%，與pPL14之1.4%相比)。於pPL12噬菌體展示卡匣的M13起點和包裝訊息內之非野生型核苷酸為與pPL14間僅有的差異以及負責增加的噬菌體生產以及降低的輔助噬菌體基因組的封入。
實施例7：降低尺寸的載體之限制
為了進一步降低載體pPL12的尺寸，細菌卡匣的要素係藉由PCR予以擴增以移除於選擇標識基因blaR以及細菌複製起點側翼的非編碼的核苷酸區域。選擇標識基因blaR和其之構成性啟動子區域係用引子blaRHindIII(序列辨識編號：134)和blarRBamHI(序列辨識編號：135)從pPL12予以擴增，導致一933 bp片段，在用限制內核酸酶Hind III和Bam HI的限制性消化之後。細菌複製起點pMB1係用引子pMB1Bam HI(序列辨識編號：136)和pMBApa I(序列辨識編號：137)從pPL12予以擴增，導致一595 bp片段，在用限制內核酸酶Bam HI和Apa I的限制性消化之後。用限制內核酸酶Hind III和Apa I之pPL12的限制性消化產出1417 bp的一片段，含有選殖和噬菌體展示卡匣。933 bp、595 bp的2個DNA片段之連接產生了1528 bp之一新穎的細菌卡匣(序列辨識編號：138)。
該細菌卡匣以及來自pPL12之1417 bp片段之連接產出了2945 bp的載體pPL20(序列辨識編號：147；第13圖)。將限制性位置添加至細菌複製起點以及選擇選擇標識基因blaR，藉此選擇標識blaR之構成性的表現不會導致插入的結合伙伴之多作用子的通讀過(polycistronic read through)。連接產物係藉由熱休克轉形予以轉形至大腸桿菌細胞之內。所形成的建構物之於多重的時機執行之許多的轉形作用沒有產出轉形體，相對於載體pPL12、pPL14和pPL22，其等在連接以及重覆的轉形後產出了數以百計的陽性純株。
無法獲得變體pPL20之轉形體指示出限制存在於可能被除去的該載體的非編碼區。介於pPL20和pPL22之間的不同為於pPL22內的細菌複製起點和選擇標識基因blaR之間的170 bp區域，其係由pPL20內的限制內核酸酶Bam HI之6 bp辨識位置所取代。
實施例8：任擇的正向選擇標識
基因氯黴素乙醯轉移酶(catR)的開放讀取架構為201 bp，比β內醯胺酶基因更短。因而，載體pPL12的尺寸可以藉由以編碼氯黴素乙醯轉移酶的基因取代編碼β內醯胺酶的基因而降低。
catR基因係藉由用引子fwCATpPL30FspI和revCATpPL30AhdI由載體pBeloBAC11(New EnglandBiolabs)之PCR予以擴增。將一個Fsp I限制性位置導入於引子fwCATpPL30FspI(序列辨識編號：151)內以及將一個Ahd I位置導入引子revCATpPL30AhdI(序列辨識編號：152)內。載體pPL12係用Ssp I和Ahd I限制性酵素予以消化。因Fsp I和Ssp I為鈍端切割，PCR產物可以予以定向地選殖。序列係藉由定序catR ORF予以確認。存在於catR基因內的一個Nco I位置係藉由導入無聲突變來移除，其係透過用引子FwpPL30NcoICATdel(序列辨識編號：153)與RevpPL30NcoICATdel(序列辨識編號：154)之定點突變誘發。
測試所形成的載體pPL31(序列辨識編號：148)之一抗體片段的表現。由pPL31之表現位準比得上由pPL12所偵測的該等。
實施例9：一人工限制性位置的產生
一人工限制性位置係在建構載體pPL31的期間予以導入。限制性位置係藉由導入用於切口酶Nt .Bbv CI的2個辨識位置於載體的訊息與反訊息股二者而產生。Nt .Bbv CI位置係藉由用引子FwNbBbvCI17Nkan(序列辨識編號：155)和RevNbBbvCI17Nkan(序列辨識編號：156)之不相關的DNA片段之PCR擴增而導入載體至之內。將PCR產物選殖至噬菌體展示卡匣中的Eco RI位置之內。分裂Nt .Bbv CI以及再連接所形成的載體產生了含有Nt .Bbv CI位置的DNA序列CCTCAGCGTTCAGAGTTATGGCTGAG(序列辨識編號：157)。用酵素Nt .Bbv CI孵育該載體產出2個切口於相對的DNA股、有17 bp之單股DNA突出。人工限制性位置係藉由定序予以確認。
新穎的人工限制性位置促進高度專一的分裂以及載體之復閉用於經單離的純株之隨後的操作。
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<220>
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<400>　114
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<400>　115
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<400>　117
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<212>　PRT
<213>　智人
<400>　118
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<212>　PRT
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<400>　119
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<212>　PRT
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<400>　120
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<211>　97
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<400>　124
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<400>　125
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<400>　126
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<400>　127
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<400>　128
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<400>　129
<210>　130
<211>　97
<212>　PRT
<213>　智人
<400>　130
<210>　131
<211>　97
<212>　PRT
<213>　智人
<400>　131
<210>　132
<211>　468
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　來自M13基因III之最佳化的序列
<400>　132
<210>　133
<211>　468
<212>　DNA
<213>　噬菌體M13
<400>　133
<210>　134
<211>　45
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子
<400>　134
<210>　135
<211>　39
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子
<400>　135
<210>　136
<211>　43
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子
<400>　136
<210>　137
<211>　38
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子
<400>　137
<210>　138
<211>　1528
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列
<400>　138
<210>　139
<211>　26
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子
<400>　139
<210>　140
<211>　22
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子
<400>　140
<210>　141
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子
<400>　141
<210>　142
<211>　18
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子
<400>　142
<210>　143
<211>　30
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子
<400>　143
<210>　144
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子
<400>　144
<210>　145
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子
<400>　145
<210>　146
<211>　35
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子
<400>　146
<210>　147
<211>　2945
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列
<400>　147
<210>　148
<211>　3158
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　載體pPL31
<400>　148
<210>　149
<211>　895
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　pPL31載體的噬菌體展示卡匣
<400>　149
<210>　150
<211>　1711
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　pPL31載體的細菌卡匣
<400>　150
<210>　151
<211>　53
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子fwCATpPL30Fspl
<400>　151
<210>　152
<211>　54
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子revCATpPL30Ahdl
<400>　152
<210>　153
<211>　36
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子FwpPL30NcolCATdel
<400>　153
<210>　154
<211>　36
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子RevpPL30NcolCATdel
<400>　154
<210>　155
<211>　59
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子FwNbBbvCl17Nkan
<400>　155
<210>　156
<211>　59
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　引子RevNbBbvCl17Nkan
<400>　156
<210>　157
<211>　26
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　Nt.BbvCl
<400>　157
第1圖：有明顯的領域內環之免疫球蛋白結構；
第2圖：人類κ輕鏈的恆定領域之胺基酸序列，各別地帶有在位置27與87之明顯的2個半胱胺酸殘基；
第3圖：人類λ輕鏈的恆定領域之胺基酸序列，各別地帶有在位置27與86之明顯的2個半胱胺酸殘基；
第4圖：γ重鏈的人類恆定領域CH1之胺基酸序列，各別地帶有在位置26與82之明顯的2個半胱胺酸殘基；
第5圖：pPL12載體；
第6圖：pPL14載體；
第7圖：pPL22載體；
第8圖：大腸桿菌菌株TOP10之轉形效率(cfu/ml)；
第9圖：大腸桿菌菌株TOP10之轉形效率(cfu/mg DNA)；
第10圖：於pPL12和pCANTAB之間的在單鏈抗體噬菌體生產後之IPTG誘導的效應；
第11圖：生產的噬菌體/ml和載體尺寸之間的關係；
第12圖：由用載體pPL12和pPL14予以轉形且用輔助噬菌體M13KO7感染的大腸桿菌菌株TG1所生產的噬菌體之比較；
第13圖：pPL20載體；
第14圖：pPL31載體。

Claims (33)

  1. 一種經最小化的噬菌體展示載體，其包含至少一選殖卡匣，其包含至少編碼一啟動子的一核酸序列以及編碼一訊息胜肽的一核酸序列；一噬菌體展示卡匣，其包含一核酸序列，其含有M13基因III蛋白的至少C端領域，對應於序列辨識編號(SEQ ID NO)132或133；及一細菌卡匣，其包含至少編碼一啟動子的一核酸序列、編碼一正向選擇標識的一核酸序列以及編碼一複製起點的一核酸序列；其特徵在於該選殖卡匣包含編碼一多肽的一核酸序列，該多肽至少對應於一抗體的恆定領域之領域內環，該經最小化的噬菌體展示載體具有3300個鹼基對或更少鹼基對之尺寸。
  2. 如申請專利範圍第1項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於該多肽係對應於抗體的一重鏈恆定領域之領域內環。
  3. 如申請專利範圍第1項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於該多肽係對應於抗體的一重鏈恆定領域。
  4. 如申請專利範圍第3項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於抗體的該重鏈恆定領域為抗體的CH1重鏈恆定領域。
  5. 如申請專利範圍第1項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於該多肽係對應於抗體的一輕鏈恆定領域之領域內環。
  6. 如申請專利範圍第1項之經最小化的噬菌體展示載體， 其特徵在於該多肽對應於抗體的一輕鏈恆定領域。
  7. 如申請專利範圍第6項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於抗體的該輕鏈恆定領域為輕鏈κ(Kappa)恆定領域。
  8. 如申請專利範圍第7項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於該輕鏈κ恆定領域的C端半胱胺酸係被刪除。
  9. 如申請專利範圍第6項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於抗體的該輕鏈恆定領域為輕鏈λ(Lambda)恆定領域。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於該啟動子係選自於以下所構成的群組：Lac、Tac、Trp、Tet、T7、SP6。
  11. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於該訊息胜肽係選自於以下所構成的群組：pelB、geneIII、phoA、malE、dsbA。
  12. 如申請專利範圍第1項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於該選殖卡匣進一步包含編碼一選殖位置的一核酸序列。
  13. 如申請專利範圍第12項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於該選殖位置包含至少2個限制性位置。
  14. 如申請專利範圍第1至9、12及13項中任一項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於該噬菌體展示卡匣進一步包含編碼一終止密碼子的一核酸序列、編碼一噬菌體 複製起點的一核酸序列，以及編碼一封入或包裝序列的一核酸序列。
  15. 如申請專利範圍第14項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於該終止密碼子為一琥珀終止密碼子。
  16. 如申請專利範圍第1至9、12及13項中任一項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於該啟動子為一β內醯胺酶啟動子。
  17. 如申請專利範圍第16項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於該正向選擇標識為一抗胺芐青黴素或抗氯黴素基因。
  18. 如申請專利範圍第1至9、12及13項中任一項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於其係存在於含有序列辨識編號：1之核酸序列的pPL12中。
  19. 如申請專利範圍第1至9、12及13項中任一項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於其係存在於含有序列辨識編號：5之核酸序列的pPL14中。
  20. 如申請專利範圍第1項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於其係存在於含有序列辨識編號：7之核酸序列的pPL22中。
  21. 如申請專利範圍第1項之經最小化的噬菌體展示載體，其特徵在於其係存在於含有序列辨識編號：148之核酸序列的pPL31中。
  22. 一種設計經最小化的噬菌體展示載體庫的方法，其特徵在於其包含以下的步驟： a)將編碼結合蛋白的核酸序列插入至如申請專利範圍第1項之經最小化的噬菌體展示載體中，以及b)利用於步驟a)中所獲得之該經最小化的噬菌體展示載體使宿主細胞轉形。
  23. 如申請專利範圍第22項之方法，其特徵在於其中該宿主細胞係選自於由以下所構成的群組：TG1、XL1-Blue、XL1-Blue MRF’、大腸桿菌K12 ER2738細胞。
  24. 一種庫，其係由如申請專利範圍第1項之經最小化的噬菌體展示載體所組成及/或由如申請專利範圍第22項或第23項之方法所獲得的經最小化的噬菌體展示載體所組成。
  25. 一種生產一噬菌體庫的方法，其特徵在於其包含以下步驟：a)依據申請專利範圍第22項或第23項之方法來設計經最小化的噬菌體展示載體庫，以及b)藉由噬菌體(bacteriophage)蛋白I-XI的互補作用來複製、封入與分泌噬菌體-結合蛋白複合物。
  26. 一種庫，其係由如申請專利範圍第25項之方法所獲得之噬菌體所組成。
  27. 一種經最小化的噬菌體，其係由如申請專利範圍第22項或第23項之方法所獲得，該噬菌體表現有興趣的結合蛋白於其表面上。
  28. 一種篩選對一結合伙伴專一之有興趣的結合蛋白之方法，該方法包含以下步驟： a)使該結合伙伴與如申請專利範圍第24項之噬菌體庫接觸；以及b)選擇由該有興趣的結合蛋白與該結合伙伴所形成之複合物。
  29. 一種利用如申請專利範圍第1至21項之經最小化的噬菌體展示載體以產生噬菌體展示載體庫的用途，該用途宜包含以下步驟：a)將編碼結合蛋白的核酸序列插入至如申請專利範圍第1至21項之經最小化的噬菌體展示載體之內；b)如申請專利範圍第22項或第23項之一項，利用該噬菌體展示載體來使宿主細胞轉形。
  30. 一種利用如申請專利範圍第1至21項之經最小化的噬菌體展示載體以產生一噬菌體庫的用途，該用途宜包含以下步驟：a)將編碼結合蛋白的核酸序列插入至如申請專利範圍第1至21項之經最小化的噬菌體展示載體之內；b)如申請專利範圍第22項或第23項之一項，利用該噬菌體展示載體來使宿主細胞轉形；以及c)藉由噬菌體(bacteriophage)蛋白I-XI的互補作用來複製、封入與分泌噬菌體-結合蛋白複合物的步驟。
  31. 一種如申請專利範圍第1至21項之經最小化的噬菌體展示載體之用途，係用於篩選對一結合伙伴專一之結合蛋白者，該用途宜包含以下步驟：a)使該結合伙伴與本發明之噬菌體庫接觸；以及 b)選擇由該結合蛋白與該結合伙伴所形成之複合物。
  32. 一種套組，其包含至少如申請專利範圍第1至21項之經最小化的噬菌體展示載體、專一性引子以及抑制子細胞菌株。
  33. 一種如申請專利範圍第32項之套組，其特徵在於該等專一性引子係選自於由序列辨識編號：9至85的核引子(nucleic primers)所構成的群組。
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