TWI496595B

TWI496595B - 製備魚類核醣核酸試劑之方法

Info

Publication number: TWI496595B
Application number: TW102120353A
Authority: TW
Inventors: ming wei Lu; Jen Leih Wu; Chun Hsi Tso
Original assignee: Univ Nat Taiwan Ocean
Priority date: 2013-06-07
Filing date: 2013-06-07
Publication date: 2015-08-21
Also published as: TW201446285A

Description

製備魚類核醣核酸試劑之方法

本發明係一種製備魚類核醣核酸試劑之方法，尤其係關於一種防治魚類感染性疾病之魚類核醣核酸試劑之製備方法。

近年來，水產養殖已成為國際化的重要產業。由於需求不斷地提升以及經濟效應考量，養殖戶多以密集的方式進行養殖。然而，擁擠的生長環境會直接影響魚隻健康，造成傳染病盛行與氾濫的結果，影響水產養殖業甚鉅。其中，抗生素雖可控制細菌性疾病之疫情，卻無法防制病毒性疾病，使病毒性疾病躍升為水產魚類大規模死亡的主要原因。這其中，又以神經壞死病毒對石斑魚造成的疫情最為嚴重。

目前市面上並未有商品化的魚類病毒試劑，但有學者提出許多不同的疫苗方式進行防治，包括死毒疫苗、活毒疫苗、減毒疫苗、次單位疫苗，係將病毒或病毒表面之分子引入魚體中，誘發魚體免疫系統辨識抗原而產生體液性及細胞性免疫記憶。進而，未來受病毒感染時，免疫系統能有效地辨識抗原並攻擊病毒，避免魚體病情惡化，達到防治的效果。

要將這些疫苗送入魚體內，其方式有三種，即注射法、浸泡法、口服法。其中，注射法是將藥物直接注射至魚隻的腹腔或肌肉中；浸泡法是將魚集中在含有高濃度藥液的小容器中，強迫進行短期藥浴；口服法則是將魚類飼料、藥物及無毒的黏合劑混合拌勻，製成藥餌進行投餵。

口服法有施用方便、成本低廉、對魚隻的傷害及緊迫壓力較小等優點，適用於敏感脆弱的稚魚。然而，魚隻前腸的消化功能會破壞大部分疫苗中的蛋白質抗原。因此，如何保護試劑成分，使抵抗消化道之酸性環境及各種酵素破壞，抵達主司吸收的尾腸，乃口服方式最重要的課題。

在所有學者提出的口服疫苗中，被研究得較清楚的係一種用以對抗魚類神經壞死病毒的疫苗，其方法如下。首先，製作神經壞死病毒抗原的重組蛋白質DNA序列，插入質體DNA中，再轉殖到大腸桿菌內，使大腸桿菌大量表現該重組蛋白質。接著，以大腸桿菌餵食豐年蝦，再以豐年蝦餵食魚類。如此，該大腸桿菌所表現的神經壞死病毒重組蛋白即可藉由食物鏈關係進入魚體，且受豐年蝦外殼及大腸桿菌細胞壁保護，得順利抵達主司吸收的尾腸(請參閱後述參考文獻1)。進而，誘發魚體產生體液性免疫記憶及細胞性免疫記憶，使魚體獲得對抗神經壞死病毒的能力。

然而，魚類免疫系統須至孵化後20-30天才會成熟，始有可能進行主動免疫，且免疫後還需要3-4週才能誘發足夠抗體對抗病毒感染(請參閱後述參考文獻2)。因此，疫苗方法僅適用於體長一吋(平均魚齡40天)以上之魚苗，魚卵孵化後至體長一吋的魚苗都無法使用這樣的方法進行保護。

但現實情況是，魚苗往往在剛孵化不久即受病毒感染(通常是經由母體垂直感染或環境共養之方式感染)，且在魚卵孵化後十幾天到吋苗期間是死亡率最高之時，約80-90%，養殖業者根本來不及等到魚體免疫系統發育成熟即已損失慘重。由此可知，亟待發展一種新的魚類感染性疾病防治方法，以大幅提高魚類的存活率，特別是極需要解決體長小於或等於一吋之稚魚(抑或是魚齡小於等於40天之稚魚)等魚類發育早期，因感染而大量死亡的問題。

前述參考文獻1：魚用生物包埋型口服疫苗製備與有效性測試，2004，(林青丘、楊惠郎/國立成功大學生物科技研究所)。

前述參考文獻2：石斑魚神經性壞死症病毒重組單源抗體的製備及表現，2009，(張瑞昕、齊肖琪/台灣大學動物學研究所)。

本案發明人鑑於習知魚類感染性疾病口服疫苗的各項缺點，乃亟思加以改良創新，並經多年潛心研究後，終於成功研發完成本件魚類核醣核酸試劑。

有鑑於儘早防治感染性疾病之需求，本發明之目的在於提供一種適用於魚類發育各個時期之感染性疾病試劑之製備方法。亦即，提供一種亦可適用於魚類發育早期之感染性疾病試劑之製備方法。

本發明之次一目的，在於提供一種可順利通過魚類消化道中酸性環境及各種酵素破壞的試劑。

本發明之另一目的，在於提供一種可對抗病毒之試劑。

本發明之再一目的，在於提供一種可對抗魚類神經壞死病毒之試劑。

於一較佳實施例中，本發明提供一種魚類核醣核酸試劑，包括：一核酸分子，用以抑制一魚類病原體之一蛋白質表現；以及一脂質體(liposome)，用以包覆該核酸分子。

於一較佳實施例中，其中該魚類病原體係一魚類致病病毒。

於一較佳實施例中，其中該蛋白質係該致病病毒之一殼蛋白，且該魚類核醣核酸試劑可抑制該魚類致病病毒在一魚體內或一魚類細胞中複製。

於一較佳實施例中，可使體長不大於一吋或魚齡不大於40天之受感染之一稚魚的存活率提升。

於一較佳實施例中，係施用於一石斑魚。

於一較佳實施例中，係直接以口服方式投遞、混合飼料之口服方式投遞、以及浸泡方式投遞等方式中之至少一種。

於一較佳實施例中，其中該魚類病原體係一神經壞死病毒。

於一較佳實施例中，其中該核酸分子係一短鏈核醣核酸分子。

於一較佳實施例中，其中該短鏈核醣核酸分子係SEQ ID NO：1序列、SEQ ID NO：2序列、SEQ ID NO：3序列、以及SEQ ID NO：4序列之至少一者。

於一較佳實施例中，其中該核酸分子係一去氧核醣核酸分子，且該去氧核醣核酸分子可透過一聚合酶(polymerase)而表現一短鏈核醣核酸分子。

於一較佳實施例中，其中該去氧核醣核酸分子包含SEQ ID NO：5序列、SEQ ID NO：6序列、SEQ ID NO：7序列、以及SEQ ID NO：8序列之至少一者。

於一較佳實施例中，其中該脂質體之組成份包括幾丁質。

於另一較佳實施例中，本發明提供一種魚類核醣核酸試劑，包括：一核酸分子，序列包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、以及SEQ ID NO：8之至少一者；其中，該核酸分子可抑制該神經壞死病毒在一魚體內或一魚類細胞中複製。

於再一較佳實施例中，本發明提供一種魚類核醣核酸試劑，包括：一核酸分子，用以抑制一神經壞死病毒之一蛋白質表現；以及一載體，用以包覆或包埋該核酸分子。

於再一較佳實施例中，其中該載體係可為一脂質體(liposome)、一膠囊、一晶球微膠囊、一明膠(Gelatin)膠球、一海藻酸鈉(Sodium Alginate)膠球中之任一種載體。

於再一較佳實施例中，其中該魚類核醣核酸試劑可使體長不大於一吋或魚齡不大於40天之受感染之一稚魚的存活率提升。

於再一較佳實施例中，其中該核酸分子係一短鏈核醣核酸分子。

於再一較佳實施例中，其中該短鏈核醣核酸分子係SEQ ID NO：1序列、SEQ ID NO：2序列、SEQ ID NO：3序列、以及SEQ ID NO：4序列之至少一者。

於再一較佳實施例中，其中該核酸分子係一去氧核醣核酸分子，且該去氧核醣核酸分子可透過一聚合酶(polymerase)而表現一短鏈核醣核酸分子。

於再一較佳實施例中，其中該去氧核醣核酸分子包含SEQ ID NO：5序列、SEQ ID NO：6序列、SEQ ID NO：7序列、以及SEQ ID NO：8序列之至少一者。

圖1：神經壞死病毒殼蛋白之訊息核醣核酸示意圖暨核醣核酸干擾序列。

圖2A：核醣核酸干擾序列質體對病毒殼蛋白表現量影響的cDNA電泳圖。

圖2B：圖2A之定量分析圖。

圖3：pSi730核醣核酸干擾序列質體對受病毒感染之魚類細胞響之顯微照片。

圖4：pSi730核醣核酸干擾序列質體對受病毒感染之魚類細胞內病毒數量影響之長條圖。

圖5：被餵食魚類核醣核酸試劑之斑馬魚的螢光顯微照片。

圖6：被餵食魚類核醣核酸試劑之斑馬魚的即時聚合酶鏈鎖反應結果。

圖7：魚類核醣核酸試劑對受病毒感染之石斑魚存活影響之分析圖。

鑑於習知技術的限制及缺陷，亟待發展一種適用於魚類發育早期之感染性疾病試劑。本案發明人基於斑馬魚的核醣核酸干擾作用(RNAi)系統幾乎在魚苗孵化後就建立完全之事實，積極探究養殖魚類是否有類似的情形，並設法開發適用於魚類發育早期之口服感染性疾病試劑，終於研發完成本案一種防治魚類感染性疾病之魚類核醣核酸試劑。

以下係提供本發明實施例之詳細說明書、本發明之技術及特點，係以防治石斑魚受神經壞死病毒感染為例。然本實施例並非用以限定本發明，任何熟悉此技術者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可應用於其他養殖魚類及其他病原性疾病，或作各種更動與潤飾。

核醣核酸干擾作用簡介

核醣核酸干擾作用(RNA interference，簡稱RNAi)始於長度為21~23個核甘酸的一短鏈核醣核酸分子(RNA)，被稱為小干擾核醣核酸分子(small interfering RNA，siRNA)。當該短鏈核醣核酸分子與細胞轉錄(Transcription)出的訊息核醣核酸分子(Messenger RNA,mRNA)互補性結合時，將活化沉默結合體(RNA-induced silencing complex)，導致該訊息核醣核酸分子降解，而無法進一步轉譯(Translation)出蛋白質。

因此，設計特定序列的短鏈核醣核酸分子，使與一目標基因之訊息核醣核酸分子序列互補，即可能藉由核醣核酸干擾作用而專一性地抑制該基因表現。

目前人們在設計短鏈核醣核酸分子序列上仍有些許進步空間，有時會發生預測出的序列無法抑制基因表現，或即便能抑制基因表現，其抑制效果也不一定好之情形(例如僅讓蛋白質表現量由1降低到0.9)。因此，除了借重序列的互補性進行預測外，還需倚賴實驗進行篩選驗證，才能在巨大的基因分子上挑出適合設計短鏈核醣核酸分子的位置。

實驗一：報導質體及核醣核酸干擾(RNAi)序列質體的選殖

病毒進入魚體後，會利用宿主細胞內的酵素及原料大量複製病毒核酸及殼蛋白，經組裝後再由宿主細胞釋出大量的新病毒，使魚體內的病毒數量越來越多，病況也越來越嚴重。其中，病毒表面的殼蛋白是病毒複製並從宿主細胞釋出時不可或缺的元件。因此，可針對病毒的殼蛋白(或其他必要蛋白)設計短鏈核醣核酸分子序列，並將該短鏈核醣核酸分子送入魚體細胞內，以阻斷病毒之殼蛋白(或其他必要蛋白)基因表現，進而抑制病毒在宿主細胞內複製，以防止魚類病毒疾病之惡化或發生。

首先，於美國國家生技資訊中心(NCBI)資料庫中搜尋魚類神經壞死病毒(Nervous Necrosis Virus,NNV)殼蛋白基因的互補去氧核醣核酸(complementary DNA，cDNA)序列，查得一NCBI序列編號為NC_008041之序列。其中，該魚類神經壞死病毒為Nodaviridae科，betanodavirus屬，RGNNV基因型。將該魚類神經壞死病毒的殼蛋白基因序列輸入軟體，經該軟體分析取得所有有潛力進行核醣核酸干擾作用的位置，再挑選出其中四個可能最有潛力進行核醣核酸干擾作用的位置，其序列分別為：

(1)5’-CAATCGTCGGCGTAGCAAT-3’

(2)5’-CACTGATGTGGTCAACGTG-3’

(3)5’-TCCATCCTCCTAGGATCCA-3’

(4)5’-AACTAACCGGGTCATCCGG-3’

請參閱圖一，係神經壞死病毒殼蛋白之訊息核醣核酸示意圖暨核醣核酸干擾序列。將該四個可能最有潛力進行核醣核酸干擾作用的位置序列轉換為短鏈核醣核酸分子序列(即SEQ ID NO：1、SEQ ID NO： 2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4)。抑或是將該些短鏈核醣核酸分子序列再進一步轉換為雙股之去氧核醣核酸分子序列(即SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8，依序命名為siRNA 93、siRNA 585、siRNA 730、siRNA 1024)。

將siRNA 93、siRNA 585、siRNA 730、siRNA 1024分別選殖到pIASIR這個核醣核酸干擾表現質體(產品名稱為pAAV-IRES-Neo Expression Vector，購自美國Cell Biolabs，產品編號為VPK-416，亦可選用其他核醣核酸干擾表現質體)的魚類啟動子序列下游，分別將這些新的「核醣核酸干擾序列質體」命名為pSi93、pSi585、pSi730、pSi1024。則魚類聚合酶(Polymerase，例如位於魚體內之魚類聚合酶、位於游離之魚類細胞中的魚類聚合酶、或於試管中外加之魚類聚合酶)在辨識到該魚類啟動子序列後，即能進一步依據下游的siRNA 93、siRNA 585、siRNA 730、或siRNA 1024序列轉錄出短鏈核醣核酸分子。

其中，pIASIR中也含有遠紅螢光蛋白(hc-red)基因及抗新黴素(neomycin)基因，可作為後續篩選之用。選殖後，再經酵素切割及DNA定序以確認該些序列是否已正確插入質體中。

實驗二：核醣核酸干擾序列對病毒殼蛋白表現之影響

為了評估各個序列是否能抑制病毒殼蛋白之表現，再進一步以健康的魚類細胞株SSN-1(購自英國European Collection of Animal Cell Cultures，簡稱ECACC，產品編號為96082808)進行測試。首先，將魚類神經壞死病毒殼蛋白基因選殖到質體(可購自德國QIAGEN，產品名稱為pQE-30 Xa Vector)中，經定序確認後命名為pIRNNV質體。利用轉染套組(購自美國Roche，產品名稱為FuGENE)，將pIRNNV質體轉染(transfect)到健康的SSN-1細胞株中，使SSN-1細胞表現魚類神經壞死病毒之殼蛋白。

分別將pSi93、pSi585、pSi730、pSi1024轉染到上述可表現魚類神經壞死病毒殼蛋白之健康SSN-1細胞中，觀察各組別的干擾結果。請參閱圖2A，係核醣核酸干擾序列質體對病毒殼蛋白表現量影響的cDNA電泳圖。圖2B之橫軸方向由左至右依序為對照組、負控制組、pSi93組、pSi585組、pSi730組、pSi1024組；由上而下依序為神經壞死病毒殼蛋白之表現量、β肌動蛋白(β-actin)之表現量。

其中，對照組細胞僅轉染pIRNNV質體，並未轉染核醣核酸干擾序列質體，因此，可觀察到其大量表現pIRNNV質體中帶有的病毒殼蛋白基因。負控制組為完全未經處理的細胞，可觀察到完全沒有表現病毒殼蛋白基因，顯示所使用的SSN-1細胞株並未受神經壞死病毒感染，也不曾被轉殖外來的病毒殼蛋白基因。pSi93組、pSi585組、pSi730組及pSi1024組為同時轉染pIRNNV質體及核醣核酸干擾序列質體的細胞(但各組的核醣核酸干擾序列不同)，可觀察到病毒殼蛋白基因的表現量確實受到核醣核酸干擾序列抑制。請參閱圖2B，其為圖2A之定量分析圖。圖2B中，pSi93組、pSi585組、pSi730組及pSi1024組之病毒殼蛋白表現量分別為65.1%、69.3%、56.2%、60.4%，顯示pSi730組抑制病毒殼蛋白表現的效果最好。

實驗三：核醣核酸序列保護魚類神經細胞之情形

將pSi730轉染入受病毒感染的魚類細胞株SSN-1中，以觀察抑制病毒殼蛋白之表現是否確實能抑制魚類神經細胞中的病毒數量，並保護魚類神經細胞不受病毒所害。

首先，利用轉染套組(購自美國Roche，產品名稱為FuGENE)將pSi730轉染到健康的魚類細胞株SSN-1中，再以抗新黴素篩選出含有pSi730質體之細胞。接著，在L-15培養基(購自美國Gibco，產品名稱Leibovitz L-15 medium)中加入與細胞數量相等的魚類神經病毒(MOI=1)，使帶有pSi730質體的SSN-1細胞與魚類神經病毒共同培養5天，觀察細胞中的病毒數量及細胞之存活情形(5天內不更換培養基，以避免細胞流失)。

請參閱圖3，其為pSi730核醣核酸干擾序列質體對受病毒感染之魚類細胞響之顯微照片。圖3之橫軸方向由左至右依序為負控制組、對照組、實驗組；縱軸方向由上而下依序為培養36小時、3天、5天。其中，負控制組為完全未處理的健康SSN-1細胞，其細胞數量隨著時間而增加，且細胞貼附情形良好，幾乎未出現細胞剝落、變圓等現象；對照組為經病毒共培養及轉染溶劑處理之細胞，可觀察到細胞逐漸出現剝落、變圓等細胞病變效應(cytopathic effect，CPE，即細胞感染病毒後產生剝落、變圓、萎縮等現象)；實驗組為經病毒共培養及pSi730質體處理之細胞，相較於對照組，可觀察到pSi730明顯改善細胞剝落、變圓之情形。本實驗顯示，阻斷病毒殼蛋白表現確實能降低魚類神經細胞受病毒感染所發生的病變。

請參閱圖4，其為pSi730核醣核酸干擾序列質體對受病毒感染之魚類細胞內病毒數量影響之長條圖。橫軸為感染後的天數，由左而右依序為對照組1、對照組2、實驗組，縱軸則為病毒數量。其中，對照組1僅經病毒共培養5天，完全未經其他處理，數據顯示第5天之總病毒數量達10¹⁰ ；對照組2經轉染溶劑處理後，再經病毒共培養5天，數據顯示第5天之總病毒數量達10⁹ ，與對照組1之間無顯著差異；實驗組經pSi730質體轉染後，再經病毒共培養5天，數據顯示第5天之總病毒數量達10³ ，與對照組1及對照組2之間均有顯著差異，病毒數量為原來的10^-7 倍。

由圖3及圖4的結果可知，核醣核酸干擾試劑阻斷病毒殼蛋白表現(請參見圖2)，使得病毒複製所需的殼蛋白原料不足，確實會進一步反應在受感染細胞的病毒數量上，即會抑制病毒在魚類細胞中複製，使病毒數量顯著減少(請參見圖4)，且會進一步改善受感染細胞之細胞病變及死亡情形(請參見圖3)。這些結果顯示，核醣核酸干擾試劑有機會成為疫苗以外的另一項利器，用以防制魚類病毒性疾病。

應能理解的是，病毒在魚隻體內的細胞中也會採行一樣的複製方式，因此，使用同樣的核醣核酸干擾方式應會有類似的結果，而能抑制病毒在魚體內複製。因此，以下將進一步確認這樣的方法及系統是否確實能保護魚隻不受病毒所害。

實驗四：製備魚類核醣核酸試劑

本發明魚類核醣核酸試劑之主要成分為核酸分子(例如序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、以及SEQ ID NO：4之至少一者，抑或是序列包括SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、以及SEQ ID NO：8之至少一者)，可利用口服方式投遞、混合飼料之口服方式投遞、以及浸泡方式投遞之至少任一種。較佳者，利用一載體包覆或包埋核酸分子，例如利用一膠囊、一晶球微膠囊、一明膠(Gelatin)膠球、一海藻酸鈉(Sodium Alginate)膠球或其他載體包覆或包埋核酸分子，以保護核酸分子不被外界環境中的物質破壞。

較佳者，利用一脂質體(liposome，係一空心微球)包覆核酸分子，以保護該核酸分子通過魚類消化道，進而被尾腸吸收。例如脂質體包覆之該核酸分子為pSi730質體，則此種魚類核醣核酸試劑可透過脂質體之保護而順利抵達魚隻的尾腸，且其內的pSi730質體可抑制魚類神經壞死病毒的殼蛋白表現，進而抑制該魚類神經壞死病毒在魚體內或魚類細胞中複製，達到較佳的防治魚類神經壞死疾病之效果。

該脂質體之組成份包括例如卵磷脂、膽固醇，亦可替換為其他脂質類。較佳者，該脂質體之組成份更包括幾丁質，使該脂質體更能保護該核酸分子通過魚類消化道。本實施例之魚類核醣核酸試劑之製備方法如下，但應能理解的是，並不以此為限：

將1.5μg卵磷脂、1.5μg膽固醇、及1mL氯仿(chloroform)加入圓底瓶中，混合均勻。於70℃水浴槽中均勻搖晃，使氯仿揮發。再加入1mL含有20μg pSi730質體之二次水溶液，搖晃均勻使脂質溶解。最後，再加入1ug幾丁質粉末，混合均勻，即製備出核醣核酸干擾試劑。應能理解的是，所包覆之核酸分子可以如上述般為去氧核醣核酸(DNA)分子，抑或是核醣核酸(RNA)分子，只要送入魚體或是魚類細胞後，能透過核醣核酸干擾作用抑制病毒之蛋白質(例如殼蛋白)表現即可。

實驗五：以魚類核醣核酸試劑餵食魚類後之吸收情形

利用斑馬魚評估魚類核醣核酸試劑是否可以順利通過魚隻的腸胃，進而被魚隻吸收。

斑馬魚可向國家衛生研究院台灣斑馬魚核心設施(衛清分支)購買。將魚類核醣核酸試劑(脂質體中包覆的是pSi730質體)溶液與飼料混合(魚類核醣核酸試劑溶液與飼料的體積比為5：2)，直接餵食魚齡為4天的斑馬魚。16小時後利用螢光顯微鏡以及即時聚合酶鏈鎖反應(Real time PCR)觀察魚隻是否表現遠紅螢光蛋白(hc-red)，以確認魚類核醣核酸試劑是否已進入魚體、魚隻細胞內的聚合酶是否能辨識pSi730上的啟動子而表現下游基因。

請參閱圖5，係被餵食魚類核醣核酸試劑之斑馬魚的螢光顯微照片。圖5由左至右依序為明視野及暗視野下的結果，明視野係用以觀察魚隻整體形態，暗視野則用以觀察螢光量及螢光表現位置；由上而下依序為控制組及實驗組。控制組之斑馬魚被餵食一般飼料，可觀察到並未表現遠紅螢光蛋白；實驗組之斑馬魚則被餵食混合魚類核醣核酸試劑(包覆 pSi730質體)的飼料，可觀察到確實有表現遠紅螢光蛋白，顯示本發明之魚類核醣核酸試劑能順利通過魚隻的腸胃，進而被魚隻吸收，且魚隻細胞內的聚合酶確實能辨識pSi730上的啟動子而表現下游基因。

請參閱圖6，係被餵食魚類核醣核酸試劑之斑馬魚的即時聚合酶鏈鎖反應結果，橫軸為餵食後經歷的時間長度，由左而右依序為控制組及實驗組，縱軸則為遠紅螢光蛋白mRNA之相對定量結果。圖6同樣顯示本發明之魚類核醣核酸試劑能順利通過魚隻的腸胃，且魚隻細胞內的聚合酶能辨識pSi730上的啟動子而表現下游基因。

實驗六：魚類核醣核酸試劑保護石斑魚之情形

石斑魚，泛指鱸形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)石斑魚屬(Epinephelus )裡的各種魚類。石斑魚為暖水性魚類，廣佈全世界熱帶及亞熱帶海域，由於其肉質鮮美，目前已成為全世界重要的高經濟海水養殖魚種。然而，目前人工養殖之石斑魚普遍受神經壞死病毒所苦，影響養殖業甚鉅。因此，下列將以防治點帶石斑魚(Epinephelus coioides )受神經壞死病毒感染為例，測試本發明魚類核醣核酸試劑之效果及系統之可行性。

以下係評估核醣核酸試劑是否可以保護受神經壞死病毒感染之石斑幼魚，以減少幼魚之死亡率。石斑魚可向海洋大學水生動物實驗中心購買。將3mL神經壞死病毒液(TCID₅₀ 為10⁶ )加入700mL水體中，再放入魚齡20天之石斑幼魚，浸泡2小時。接下來，將石斑魚移到乾淨的水體中養殖，並將魚類核醣核酸試劑(包覆pSi730質體)溶液與飼料混合，直接餵食該些石斑幼魚，觀察魚隻存活情形。

請參閱圖7，係魚類核醣核酸試劑對受病毒感染之石斑魚存活影響之分析圖。其中，負控制組的石斑幼魚未浸泡病毒液，飼料中也未做任何處理，可觀察到數量由剛開始的15隻經正常死亡率而剩9隻；對照組的石斑幼魚經浸泡神經壞死病毒液，飼料中混合二次水，可觀察到數量由剛開始的15隻經大量死亡而剩1隻；實驗組1的石斑幼魚經浸泡神經壞死病毒液，飼料中混合0.5倍劑量之魚類核醣核酸試劑(含有pSi730質體。魚類核醣核酸試劑溶液經對倍稀釋後與飼料混合，該魚類核醣核酸試劑溶液之稀釋液與飼料的體積比為5：2)，可觀察到數量由剛開始的15隻到最後剩9隻，與未感染病毒之負控制組間無顯著差異；實驗組2的石斑幼魚經浸泡神經壞死病毒液，飼料中混合1倍劑量之魚類核醣核酸試劑(含有pSi730質體。魚類核醣核酸試劑溶液與飼料的體積比為5：2)，可觀察到數量由剛開始的15隻到最後剩11隻，與未感染病毒之負控制組間無顯著差異。圖7之結果顯示本發明魚類核醣核酸試劑確實有保護石斑魚的效果，且證實本發明魚類核醣核酸試劑利用脂質體包覆核苷酸而防治魚類感染性疾病之系統確實可行，可施用於體長不大於一吋或魚齡不大於40天之稚魚。

把發明利用核醣核酸干擾作用及脂質體包覆運輸系統，成功建立一種適用於稚魚的魚類核醣核酸試劑。在考量不傷害稚魚或對稚魚造成緊迫壓力時，可直接經由口服方式投遞，而不用擔心被消化系統中的酸性環境或酵素破壞。本發明魚類核醣核酸試劑有別於習知技術一魚類疫苗無法防治稚魚受病原體感染之藥物系統缺陷，為一種可成功施用於稚魚的藥物系統，且確實可使受感染稚魚之存活率大幅度提升。

應能理解的是，本發明魚類核醣核酸試劑應用的範圍並不以口服方式投遞於稚魚為限。投遞方式可以其它方式實現，例如注射法或浸泡法；被投遞之魚隻亦可以為體長大於一吋或魚齡大於40天之魚隻；被投遞之魚種不限於石斑魚，其他種類的魚隻例如黃臘鯵(yellow-waxpompano)、海鱺(cobia)、歐洲鰻(European eel)、赤鰭笛鯛(fire-spot snapper)、中國鯰魚(Chinese catfish)等亦可。應能理解的是，上述之投遞方式、魚隻大小及魚種等均為本發明魚類核醣核酸試劑應用範圍之示例，但並不以此為限。

以上所述僅為本發明之較佳實施例，並非用以限定本發明之申請專利範圍，因此凡其它未脫離本發明所揭示之精神下所完成之等效改變或修飾，均應包含於本案之申請專利範圍內。

<110> 國立臺灣海洋大學

<120> 製備魚類核醣核酸試劑之方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 神經壞死病毒(Nervous necrosis virus)

<400> 1

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 神經壞死病毒(Nervous necrosis virus)

<400> 2

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 神經壞死病毒(Nervous necrosis virus)

<400> 3

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 神經壞死病毒(Nervous necrosis virus)

<400> 4

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 神經壞死病毒(Nervous necrosis virus)

<400> 5

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 神經壞死病毒(Nervous necrosis virus)

<400> 6

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 神經壞死病毒(Nervous necrosis virus)

<400> 7

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 神經壞死病毒(Nervous necrosis virus)

<400> 8

Claims

一種製備魚類核醣核酸試劑之方法，且該魚類核醣核酸試劑為一倍劑量，其中步驟包括：(a)加入一卵磷脂、一膽固醇與一氯仿(chloroform)至一容器之中以進行混合，其中該氯仿為1毫升，且該卵磷脂與該膽固醇分別為1.5微克；(b)放置該容器於一水浴槽中，並以70℃之溫度加熱且持續搖晃，使該氯仿揮發；(c)加入1毫升之一水溶液至該容器之中以進行混合，其中該水溶液包括20微克之一質體，該質體包括一核酸分子，且該核酸分子之序列包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7以及SEQ ID NO：8之至少一者；以及(d)加入一幾丁質至該容器之中以進行混合，其中該幾丁質為1微克。
如申請專利範圍第1項所述之製備魚類核醣核酸試劑之方法，其中該核酸分子用以抑制一神經壞死病毒之一殼蛋白表現。
如申請專利範圍第1項所述之製備魚類核醣核酸試劑之方法，其中該核酸分子用以抑制受到一神經壞死病毒感染之一魚體內的該神經壞死病毒之複製。
如申請專利範圍第1項所述之製備魚類核醣核酸試劑之方法，其中該核酸分子用以抑制一石斑幼魚之一神經壞死病毒。
如申請專利範圍第1項所述之製備魚類核醣核酸試劑之方法，其中該容器為一圓底瓶。
如申請專利範圍第1項所述之製備魚類核醣核酸試劑之方法，其中該魚類核醣核酸試劑與一飼料互相混合，且該魚類核醣核酸試劑與該飼料之體積比為5：2。