TWI509246B - 用於改良偵測澱粉樣β肽類之方法與試劑 - Google Patents

Description

用於改良偵測澱粉樣β肽類之方法與試劑

本發明關於免疫分析之領域，更具體地說，本發明關於增加用於測定生物流體中之澱粉樣β肽類的免疫分析之敏感度的方法。

阿滋海默氏症(AD)是一種中樞神經系統之進行性退化性疾病，其特點為逐步且增加記憶力減退，隨後無法控制四肢和身體機能，最終死亡。迄今為止，這是導致癡呆症最常見之原因，而癡呆症影響1至6%超過65歲之人口及10至20%超過80歲之人口。

AD藉由數種病理特性而與其他類型之癡呆症有所區別，包括患者大腦中神經元之間的胞外空間逐步出現老年性斑塊。該斑塊具有主要由纖維(其具有稱為澱粉樣β肽(Aβ)之具有40-42個胺基酸的肽)形成的澱粉樣沉積之中央核心，其周圍包圍退化之神經炎和神經膠質細胞。此肽係從稱為β澱粉樣先驅蛋白(βAPP)之先驅蛋白的蛋白質水解過程產生。

根據出現年齡，AD可分類為早發型(年齡低於60歲)和遲發型(年齡高於60歲)，根據是否存有體染色體顯性遺傳，可分類為家族型AD或偶發型AD。早發性家族型AD可能與編碼βAPP、早老蛋白1和早老蛋白2之基因(分別位於染色體21、14和1上)中的已知突變有關。這些分 類並不相互排斥。最常見的形式為偶發性遲發型AD。

在臨床實行中，AD之診斷係利用是否出現典型臨床特點之臨床標準及使用神經影像技術和血液分析排除其他類型之癡呆症來進行。使用這些標準，診斷可靠性是可以接受的，雖然，根據採用大腦解剖所進行之研究，被診斷為AD的患者中有10-20%還罹患不同疾病。此外，目前的診斷方法只能在患者患有重度癡呆，神經退化過程進展嚴重時進行，而腦損害是如此廣泛使得治療措施的數量有限。確切診斷需要在死後病理檢查腦組織。

鑑於Aβ聚積在AD患者大腦中且為AD發病機制之核心要素的事實，此種蛋白被認為最合適作為AD生物標記之候選標記。然而，使用Aβ作為AD之血漿生物標記將面臨血清中之Aβ肽類(Aβ(1-40)及Aβ(1-42))濃度極低的問題，因此，沒有足夠敏感之分析能可靠地偵測該肽之物種。

許多不同的分析已被用於測定生物樣本中之澱粉樣β肽類的水準(見，如：Scheuner et al(Nature Med.,1996,2：864-870)；Tamaoka A et al.(J Neurol Sci.,1996,141,65-68)；Suzuki,N.et al.(Science,1994,264：1336-1340)；WO200722015,Vanderstichele H et al.(Amyloid,2000,7,245-258)；Fukomoto y col.(Arch.Neurol.2003,60,958-964)；Mehta et al.(Arch.Neurol.57,2000,100-105)；Mayeux,R.et al.(Ann Neurol.1999,46,412-416)；Lanz,T.A and Schacthter,J.B.(J.Neuroscience Methods,2006,157：71-81),WO200750359,WO0162801,WO0315617, WO0246237,WO0413172所描述之方法)。然而，迄今已知之所有以ELISA為基礎的分析具有之偵測下限幾乎不在個位數之皮克/毫升的範圍內，其足以用於偵測罹患家族型AD之患者們腦脊液中之Aβ40及Aβ42及偵測血漿中之該物種，但並不適合用於偵測罹患偶發型AD之患者們血漿中之Aβ42，其中該Aβ42血漿濃度低得多。

迄今為止，顯示出低於個位數皮克/毫升之偵測下限的僅有之Aβ肽分析對應於WO200646644和WO2009015696中所描述之偵測。

WO200646644中描述致電化學發光(electrochemiluminiscent)(ECL)夾心法，其中該mAb 21F12(其辨識Aβ42之胺基酸33-42)先與磁珠耦合後再用來捕捉含有Aβ42之樣本中的Aβ42肽，再進一步與耦合至釕複合物之3D6 mAb接觸。然後，以施用電能時由釕複合物發射之螢光來偵測經結合之3D6抗體的量。採用此分析，本發明者可偵測到低至0.5皮克/毫升之Aβ42標準。然而，當使用同樣之分析來比較AD患者和健康對照組之血漿樣本中的Aβ42時，兩組患者之間未觀察到顯著差異，此導致本發明者歸結出由於退化之故血清中之完整Aβ42的量非常低而轉向使用21F12 mAb之競爭性ELISA分析法(其提供在奈克/毫升範圍內之較低的敏感度水準)。

WO2009015696中描述一種高敏感度ELISA夾心分析，其中該偵測抗體係接觸顯示出對該抗體具特異性之經生物素標記的試劑。令該試劑接觸與過氧化物酶耦合之抗生蛋 白鏈菌素。然後，使用TMB，藉由比色法或使用QuantaBlue，藉由螢光法來偵測過氧化物酶之活性。

WO2006053251中描述一種用於測定樣本中之澱粉樣β肽之物種的方法，其包含將樣本與變性劑接觸，自該樣本-變性劑混合物中萃取肽累積庫，自該累積庫分離出澱粉樣β肽物種並測定澱粉樣β肽物種之量。此方法需要在測定前先分離出肽類的步驟，這會導致處理時間增加及費用增加。

因此，本技藝需要經改良之用於偵測Aβ衍生之肽類的免疫分析及套組，其可克服本技藝中已知之方法和套組的問題，尤其是，其足夠敏感而能以可靠之方式偵測罹患偶發型AD之患者血漿中之Aβ肽。

於第一種觀點中，本發明關於用於診斷神經退化性疾病、偵測神經退化性疾病前之階段、或區分神經退化性疾病與神經退化性疾病前之階段的方法，其包含下列步驟：(i)測定一或多種選自下列群組之參數：(a)在該個體之生物樣本中的一或多種游離澱粉樣β肽類之水準，(b)在該個體之生物樣本中的一或多種游離澱粉樣肽類的聚集水準及該與存在於該生物樣本中之巨分子成分結合之一或多種澱粉樣β肽類的聚集水準，其中該聚集水準係經由將該樣本與蛋白質助溶劑在足以促進澱粉樣β肽 或肽類從存在於該生物樣本中之成分分解出的條件下接觸後定量在該樣本之不含細胞部分中的該一或多種澱粉樣β肽類之量來測定，(c)與該個體之生物樣本中之細胞結合之一或多種澱粉樣β肽類的水準，其中該水準係經由將該生物樣本之細胞部分分離出後，將該樣本之該細胞部分與蛋白質助溶劑在足以促進澱粉樣β肽或肽類從存在於該樣本中之細胞分解出的條件下接觸來測定，及(ii)將至少一種參數(b)或(c)之數值或從算術組合參數(a)至(c)中至少二者所產生之計算出的參數值與對應於參考樣本中之該參數(b)或(c)或該計算出之參數值的參考值相比較，及(iii)當該參數值或計算出之參數值相對於該參考值有所改變時，診斷神經退化性疾病、偵測神經退化性疾病前之階段或區分神經退化性疾病與該神經退化性疾病前之階段。

於第二種觀點中，本發明關用於測定生物樣本中之澱粉樣β肽類的套組，其包含(i)蛋白質助溶劑，及(ii)至少一種對抗澱粉樣β肽之抗體。

[發明之詳細說明]

令人驚訝地，本發明之作者發現，以樣本緩衝液稀釋血漿可增加Aβ1-40及Aβ1-42之偵測水準。不欲受限於任何 理論，咸信稀釋血漿可改變樣本中之離子強度及分子交互作用，造成與血漿蛋白及其他成分結合之Aβ1-40及Aβ1-42釋出。因此，稀釋血漿後測量值增量可能係由於偵測到Aβ肽類自蛋白質和其他血漿成分中釋出，且可能被解釋為血漿中總Aβ水準之估計值。

在任何情況中，這些結果顯示出血液中之Aβ肽水準遠遠高於從僅分析未稀釋之血漿中的Aβ水準時可估計到者。完整測定總βAPB血液水準應包括定量血漿中之游離肽類、與血漿蛋白結合及與血細胞結合之肽類。此綜合性定量βAPB之不同成分將可更精確的測量Aβ之血液濃度，且可能有助於確定健康人和患者中之Aβ肽的複雜調控。此外，該澱粉樣β肽類累積庫之水準以及經由算術組合不同累積庫之濃度與游離澱粉樣β肽類之濃度所取得之某些計算參數數值可以用來決定患者是否患有神經退化性疾病、患者是否苦於神經退化性疾病前之狀態及區分神經退化性疾病與神經退化性疾病前之階段。

本發明之診斷方法

因此，於第一種觀點中，本發明關於一種用於診斷個體中之神經退化性疾病、偵測神經退化性疾病前之階段、或區分神經退化性疾病與神經退化性疾病前之階段的方法，其包含下列步驟：(i)測定一或多種選自下列群組之參數：(a)在該個體之生物樣本中的一或多種游離澱粉樣β 肽類之水準，(b)在該個體之生物樣本中的一或多種游離澱粉樣肽類的聚集水準及該與存在於該生物樣本中之巨分子成分結合之一或多種澱粉樣β肽類的聚集水準，其中該聚集水準係經由將該樣本與蛋白質助溶劑在足以促進澱粉樣β肽或肽類從存在於該生物樣本中之成分分解出的條件下接觸後定量在該樣本之不含細胞部分中的該一或多種澱粉樣β肽類之量來測定，(c)與該個體之生物樣本中之細胞結合之一或多種澱粉樣β肽類的水準，其中該水準係經由將該生物樣本之細胞部分分離出後，將該樣本之該細胞部分與蛋白質助溶劑在足以促進澱粉樣β肽或肽類從存在於該樣本中之細胞分解出的條件下接觸來測定，及(ii)將至少一種參數(b)或(c)之數值或從算術組合參數(a)至(c)中至少二者所產生之計算出的參數值與對應於參考樣本中之該參數(b)或(c)或該計算出之參數值的參考值相比較，及(iii)當該參數值或計算出之參數值相對於該參考值有所改變時，診斷神經退化性疾病、偵測神經退化性疾病前之階段或區分神經退化性疾病與該神經退化性疾病前之階段。

此處所使用之“診斷”一詞包括評估個體對疾病之感受性，測定個體目前是否罹患該疾病以及受該疾病影響之個體的預後。如熟習本技藝之人士所理解，就被診斷之個體 而言這類評估通常並非100%正確，雖然最好是正確的。然而，此名詞要求統計上有意義之個體數可被鑑定出患有該疾病或有罹患該疾病之傾向。若一部分為統計上有意義的，其可以單純由熟習本技藝之人士採用數種為人熟知之統計評估工具(例如：測定信賴區間、測定p值，學生t試驗、Mann-Whitney試驗，等)測定。詳情見Dowdy and Wearden,Statistics for Research,John Wiley & Sons,New York 1983。較佳之信賴區間為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%。該p值宜為0.2、0.1或0.05。

此處所使用之“個體”一詞係涉及所有被歸類為哺乳動物之動物，包括，但不限於家畜和農場動物、靈長類和人類，例如：人類、非人類之靈長類動物、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或齧齒動物。較佳地，該個體為任何年齡或種族之男人或女人。

此處所使用之“神經退化性疾病”一詞係指其中神經元細胞損失係因為細胞死亡的病況或病症而帶來認知功能惡化或造成特徵為神經、神經退化、生理、心理或行為異常的損壞、功能不全或併發症。可藉由本發明方法診斷之合適的神經退化性疾病包括，但不限於與年齡相關之黃斑變性、庫賈氏症、阿滋海默氏症、由放射治療引起之癡呆、軸突損傷、急性皮層擴散性抑制、α-突觸核蛋白病(synucleinopathies)、腦缺血、杭汀頓氏症、永久性病竈腦缺血、周圍神經再生、後癲癇持續狀態模型、脊髓損傷 、偶發型肌萎縮側索硬化症和傳染性海綿狀腦病變。

於一較佳體系中，該神經退化性疾病為阿滋海默氏症。“阿滋海默氏症”(或“老年癡呆症”)一詞係指與特定之腦部退化疾病有關之智力減退，該腦部退化疾病之特徵為老年性斑塊、神經炎性纏結及進行性神經元損失，其表現在臨床上為進行性記憶障礙、思維混亂、行為問題、無力照顧自己、身體逐漸惡化，最終死亡。罹患阿滋海默氏症之患者係使用NINCDS-ADRDA標準來鑑定(CDR=1，MMSE介於16至24分且在Scheltens量表中內側顳葉萎縮(由MRI確定)>3分)。

此處所使用之“該神經退化性疾病前之階段”一詞係指發生在介於正常個人與罹患神經退化性疾病個體之間的過渡情況，其特點為出現一些神經退化性疾病之徵兆和症狀，或出現在罹患神經退化性疾病之患者中所觀察到的徵兆和症狀之子集合。於一較佳體系中，該神經退化性疾病前之階段為輕度認知障礙(以下稱為MCI)，其係指介於正常老化與早期阿滋海默氏症之間的認知障礙之過渡階段。若患者符合梅奧(Mayo)臨床標準(CDR=0.5，其在Scheltens量表中顯示出高於3分之內側顳葉萎縮(由MRI確定))，在正子發射斷層顯像中顯示出頂葉及顳葉中18-氟脫氧葡萄糖(PET-FDG)代謝減退(暗示為AD)的模式，其通常被鑑定為患有MCI。

“區分神經退化性疾病與神經退化性疾病前之階段“一詞係指區別被發現在神經退化性疾病前或有前驅症狀之階 段中的患者與目前已罹患這種疾病之患者的能力。於該神經退化性疾病為阿滋海默氏症的特定情況下，本發明之方法可區分阿滋海默氏症與稱為輕度認知障礙(MCI)之該疾病的前驅症狀階段：於第一個步驟中，本發明之方法包含測定至少一種選自下列群組之參數：(a)在該個體之生物樣本中的一或多種游離澱粉樣β肽類之水準，(b)在該個體之生物樣本中的一或多種游離澱粉樣肽類的聚集水準及該與存在於該生物樣本中之巨分子成分結合之一或多種澱粉樣β肽類的聚集水準，其中該聚集水準係經由將該樣本與蛋白質助溶劑在足以促進澱粉樣β肽或肽類從存在於該生物樣本中之成分分解出的條件下接觸後定量在該樣本之不含細胞部分中的該一或多種澱粉樣β肽類之量來測定，(c)與該個體之生物樣本中之細胞結合之一或多種澱粉樣β肽類的水準，其中該水準係經由將該生物樣本之細胞部分分離出後，將該樣本之該細胞部分與蛋白質助溶劑在足以促進澱粉樣β肽或肽類從存在於該樣本中之細胞分解出的條件下接觸來測定，且此處之“澱粉樣β肽”一詞與“Aβ”、“Abeta,”、“βAP”或“A beta肽”或“Aβ肽”交換使用且係指在阿滋海默氏症(AD)、唐氏症及具有荷蘭型澱粉樣變性之遺傳性腦出血(HCHWA-D)患者之大腦中發現的老年性斑塊及血管澱粉 樣蛋白沉積(澱粉樣蛋白血管病變)的主要化學組成之一族肽類。澱粉樣β肽類為包含不同數目之胺基酸(通常為38-43個胺基酸)的β-澱粉樣先驅蛋白(APP)之片段。

澱粉樣β肽類通常係以“Aβ(x-y)”表示，其中x代表澱粉樣β肽之胺基端的胺基酸編號，y代表羧基端之胺基酸編號。例如：Aβ(1-40)為其胺基端開始於胺基酸1號，羧基端結束於胺基酸40號之澱粉樣β肽，其序列由SEQ ID NO：1指定。澱粉樣β肽類之實例包括可藉由本發明方法測定者，包括，但不限於：Aβ(1-38)(SEQ ID NO：2)、Aβ(1-39)(SEQ ID NO：3)、Aβ(1-40)(SEQ ID NO：1)、Aβ(1-41)(SEQ ID NO：4)及Aβ(1-42)(SEQ ID NO：5)、Aβ(1-43)(SEQ ID NO：6)、Aβ(11-42)(SEQ ID NO：7)、Aβ(3-40)(SEQ ID NO：8)、Aβ(3-42)(SEQ ID NO：9)、Aβ(4-42)(SEQ ID NO：10)、Aβ(6-42)(SEQ ID NO：11)、Aβ(7-42)(SEQ ID NO：12)、Aβ13(8-42)(SEQ ID NO：13)、Aβ(9-42)(SEQ ID NO：14)、Aβ(x-40)、Aβ(x-42)和Aβ(x-38)，以及總澱粉樣β肽(其係指其中個別物種未區別之多種澱粉樣β肽物種)。於較佳之體系中，該根據本發明方法偵測之澱粉樣β肽類為Aβ(1-40)及Aβ(1-42)。

此處所使用之“Aβ(1-42)”一詞係關於對應於APP之胺基酸672至713(SEQ ID NO：5)的具42個胺基酸之肽，且其係經由以β-及γ-分泌酶將澱粉樣先驅蛋白(SEQ ID NO：15)連續進行蛋白質水解來產生。

此處所使用之“Aβ(1-40)”一詞係關於對應於胺基酸672 至711(SEQ ID NO：1)的具40個胺基酸之肽，且其係經由以β-及γ-分泌酶將澱粉樣先驅蛋白(SEQ ID NO：15)連續進行蛋白質水解來產生。

如本發明中所理解“生物樣本”一詞包括：(1)生物流體，諸如全血、血清、血漿、尿液、淋巴、唾液、精液、唾液、眼淚、黏液、汗水、乳汁、腦萃取物及腦脊髓液；(2)血液成分，諸如血漿、血清、血球和血小板；(3)從固體組織或器官(諸如大腦)中取得之萃取物；以及(4)來自人類或動物之細胞株或原始細胞之培養的萃取物，諸如初級人類神經元，及來自帶有人類APP基因之基因轉殖小鼠的初級神經元，如，來自下列之細胞：基因轉殖PDAPP動物(如老鼠)以及293人腎臟細胞株、人類神經膠質瘤細胞株、人類HeLa細胞株、初級內皮細胞株(如：HUVEC細胞)、初級人類纖維母細胞株或初級淋巴母細胞株(包括源自具有APP突變之患者的內生性細胞)、初級人類混合之腦細胞培養(包括神經元、星形細胞和神經膠質)，或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株。本發明之方法特別適合用於測量人類或非人類動物之血液樣本(如全血、血漿)或包含任何量之任何血液成分的樣本中之Aβ。

“全血”一詞係指來自人類或動物之同時含有細胞成分及液體成分的血液。全血可為凝結狀態或非凝結狀態。“全血”亦包括其中部分或所有細胞成分(諸如白血球或紅血球)已經溶解之血液。

“血漿”一詞係指全血之流體成分。根據所使用之分離 方法，血漿可能完全不含細胞成分，或可能含有不同量之血小板及/或少量之其他細胞成分。

“血清”一詞係指不含凝血蛋白纖維蛋白原及其他凝血因子之血漿。

此處所使用之“游離澱粉樣β肽”係指不與生物樣本中之任何成分聯結且可輕易結合特定抗體之澱粉樣β肽類。此種肽可藉由習知之免疫學技術，經由將生物樣本與特異於該肽之抗體接觸來測定。於一較佳之體系中，該游離澱粉樣肽之水準係在血漿中測定。

此處所使用之“與巨分子成分聯結之澱粉樣β肽”一詞係指該與研究中之生物樣本中發現的分子非共價鍵結合或連接之澱粉樣β肽。這種肽通常不容易進行免疫學偵測，因此，需要將該生物樣本預先處理，以將該肽自成分中分離出。在這些條件下，連接巨分子成分之澱粉樣β肽將自該成分中釋出且將可使用特異性抗體進行免疫偵測。由於生物樣本中已含有一定量之游離澱粉樣β肽，將樣本與蛋白質助溶劑接觸後，該游離澱粉樣蛋白肽的總量將為原始存在之游離澱粉樣β肽的聚集水準以及以蛋白質助溶劑處理時釋出之澱粉樣β肽的水準。在需要測定樣本中與巨分子成分結合之澱粉樣β肽之水準的情況中，此通常可經由在以蛋白質助溶劑處理前先測定游離澱粉樣β肽之水準及在以蛋白質助溶劑處理後測定游離澱粉樣β肽的水準，並從第二個值減去第一個值來測定。為了本發明之目的，測定游離澱粉樣β肽類(其包括原始之游離澱粉樣β肽類及以 蛋白質助溶劑處理後自巨分子成分釋出之澱粉樣β肽類)之聚集水準通常是正確的。因此，該通常在處理樣本以將澱粉樣肽自巨分子肽分解出時測定的參數係對應於存在於樣本中之游離肽以及與巨分子成分聯結之肽的加數。

可能結合澱粉樣β肽類及促成與巨分子成分聯結之澱粉樣β肽之集合庫的樣本之巨分子成分包括蛋白質以及脂質。於特定情況下，該方法係在血液或血漿樣本中進行，該巨分子成分包括，但不限於：血液蛋白及脂質。示範之血液蛋白包括白蛋白、免疫球蛋白G、免疫球蛋白E、免疫球蛋白M、免疫球蛋白A、纖維蛋白原(纖維蛋白及其降解產物)、α-1抗胰蛋白酶、前白蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1酸性糖蛋白、α1胎兒蛋白、結合球蛋白α2、巨球蛋白、銅藍蛋白、轉鐵蛋白、C3/C4 β2微球蛋白、β脂蛋白、α、β及γ球蛋白、C-反應蛋白(CRP)、凝血酶原、甲狀腺素結合蛋白、甲狀腺素，等。示範之血脂包括游離脂肪酸、膽固醇、三酸甘油酯、磷脂、鞘脂，等。與巨分子成分結合之澱粉樣β肽的量可經由將該生物樣本之不含細胞之樣本與蛋白質助溶劑在足以誘導該澱粉樣β肽從巨分子成分釋出的條件下接觸來測定。

此處“接觸”係指在樣本中添加足量之包含蛋白質助溶劑的溶液，以使該混合物中之蛋白質助溶劑之濃度足以有效地幫助該與樣本中之蛋白質和細胞結合的澱粉樣β肽溶解。較佳地，該蛋白質助溶劑係在緩衝溶液之溶液中，從而使加入蛋白質助溶劑不會造成樣本中之pH值大幅修改。

此處所使用之“蛋白質助溶劑”一詞係指能夠改變多肽之二級、三級及/或四級結構，同時使主結構保持完整之組成物的任何化合物。憑藉這些特性，蛋白質助溶劑可增加樣本中之蛋白質的溶解度並可防止分子間和分子內之蛋白質聚集。適合用於本發明之蛋白質助溶劑包括，但不限於：清潔劑、離液劑(chaotropic agent)、還原劑或彼等之混合物。

此處所使用之“清潔劑”一詞一般為表面活性劑之同義詞且係指當加入液體中時，與無清潔劑時之相同液體相比較可降低該液體之表面張力的兩性表面活性劑。清潔劑亦可防止蛋白質聚集並防止非特異性交互作用或污染物結合所欲之蛋白質。適合用於本發明之清潔劑包括，但不限於非離子性(中性)、陰離子性、陽離子性或兩性離子清潔劑。

非離子性或中性清潔劑之實例包括，但不限於吐溫(Tween)系列之清潔劑，如：吐溫® 20、吐溫® 21、吐溫® 40、吐溫® 60、吐溫® 61、吐溫® 65、吐溫® 80、吐溫® 81、吐溫® 85，Span®系列之清潔劑，諸如Span® 20；Tergitol系列之清潔劑，諸如Tergitol型15-S-12；Brij®系列之清潔劑，諸如Brij® 35、Brij® 56、Brij® 72、Brij® 76、Brij® 92V、Brij® 97、Brij® 58P；吐溫系列之清潔劑，諸如：吐溫® 20、吐溫® 21、吐溫® 40、吐溫® 60、吐溫® 61、吐溫® 65、吐溫® 80、吐溫® 81、吐溫® 85；Triton®系列之清潔劑，諸如Triton® X-100、Triton® X- 114、Triton® CF-21、Triton® CF-32、Triton® DF-12、Triton® DF-16、Triton® GR-5M、Triton® X-102、Triton® X-15、Triton® X-151、Triton® X-207、Triton® X-165、Triton® X-305、Triton® X-405、Triton® X-45、Triton® X-705-70，或至少一種該清潔劑之非離子性保守性變體。

陰離子洗滌劑之實例包括，但不限於膽酸及其衍生物、牛磺膽酸、Triton X-200、Triton W-30、Triton-30、Triton-770、磺基琥珀酸二辛酯、N₅N-二甲基十二烷胺N-氧化物、1-烷基磺酸鈉、N-月桂醯肌胺酸或脂肪酸鹽。

陽離子性洗滌劑之實例包括，但不限於單-和二甲基脂胺，烷基三甲基銨鹽、二烷基二甲基銨鹽、醋酸烷基胺、三烷基醋酸銨、烷基二甲苄基銨鹽、二烷基甲苄基銨鹽、烷基吡錠鹵化物和烷基(烷基取代)吡錠鹽、烷基硫代甲基吡錠鹽、烷基醯胺基甲基吡錠鹽、烷基喹啉鎓鹽、烷基異喹啉鎓鹽、N,N-烷基甲基吡咯錠鹽、1,1-二烷基六氫吡錠鹽、4,4-二烷基硫代嗎啉鎓鹽、4,4-二烷基硫代嗚啉鎓-1-氧化物鹽、甲基his(烷基乙基)-2-烷基咪唑鎓甲基硫酸鹽(及其他鹽類)、甲基雙(烷基醯胺基乙基)-2-羥乙基銨甲基硫酸鹽(及其他鹽類)、烷基醯胺基丙基-二甲苄基銨鹽、羧烷基-烷基二甲基銨鹽、烷基胺氧化物、烷基二甲基胺氧化物、聚(乙烯基甲基吡錠)鹽、聚(乙烯基吡啶)鹽、聚乙烯亞胺、三烷基鏻碳酸氫鹽(及其他鹽類)、三烷基甲基鏻鹽、烷基乙基甲基氧鋶鹽及烷基二 甲基氧鋶鹽。

兩性洗滌劑之實例包括，但不限於3-[3-氯醯胺丙基)二甲銨基]-1-丙磺酸酯(CHAPS)，3-[3-氯醯胺丙基)二甲銨基]-2-羥基-1-rhoro丙磺酸酯(CHAPSO)；N-(烷基C10-C16)-N,N-二甲基甘胺酸甜菜鹼(EMPIGEN BB)；辛醯磺基甜菜鹼(SB3-10)；3-[N,N-二甲基(3-肉豆蔻醯胺丙基)銨基]丙磺酸酯(醯胺基磺基甜菜鹼-14；ASB-14)；N-十四烷基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸酯(3-14洗滌劑；ZWITTERGENT)；N-十二烷基-N,N'-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸酯；N-十八烷基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸酯；N-癸基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸酯；Mirataine CB；Mirataine BB；Mirataine CBR；Mirataine ACS；Miracare 2MHT及Miracare 2MCA。

於一較佳之體系中，該蛋白質助溶劑為一種洗滌劑。於一更佳之體系中，該洗滌劑為吐溫20。再於一更佳之體系中，吐溫20之使用濃度為0.5%。

此處所使用之“離液劑”係關於破壞蛋白質之間和蛋白質內部之氫鍵和疏水性交互作用的化合物或化合物之混合物。當使用高濃度時，離液劑破壞二級蛋白質結構，使無法以其他方式溶解之蛋白質溶解於溶液中。合適之離液劑包括，但不限於尿素、異硫氰酸胍、硫氰酸鈉(NaSCN)、鹽酸胍、氯化鈲、硫氰酸鈲、四氯醋酸鋰、過氯酸鈉、四氯醋酸銣、碘化鉀或三氯醋酸銫。

此處所使用之“還原劑”一詞係指將巰基保持在還原狀 態並還原分子內或分子間二硫鍵的任何化合物或物質。例如：適合本發明方法之還原劑包括巰基或膦還原劑。巰基還原劑之實例包括二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)及β-巰基乙醇。膦還原劑之實例包括三丁基膦(TBP)及三-羧乙基膦(TCEP)。

通常，該生物樣本係先經過處理以去除細胞部分。然後，將不含細胞之樣本與蛋白質助溶劑接觸。於一較佳體系中係使用包含蛋白質助溶劑之緩衝劑稀釋樣本。通常，該樣本係在包含吐溫20之緩衝溶液中稀釋5倍。

此處所使用之“緩衝液”為任何可中和酸及鹼二者而不會明顯改變溶液原來之酸度或鹼度的在溶液中之物質或化合物之混合物。用於本發明方法中的合適之緩衝液包括，但不限於Tris緩衝溶液、磷酸鹽緩衝溶液、硼酸鹽緩衝溶液、碳酸鹽緩衝溶液、甘胺酸-氫氧化鈉緩衝溶液，等。較佳地，該緩衝溶液為磷酸鹽緩衝溶液，諸如磷酸鹽緩衝之生理食鹽水或PBS。

該加入生物樣本中之包含蛋白質助溶劑的溶液量並不重要，只要澱粉樣β肽能充分分解。例如，該生物流體可在該包含蛋白質助溶劑之溶液中稀釋成下列倍數：至少1/2(體積/體積)、1/3(體積/體積)、1/4(體積/體積)、1/5(體積/體積)、1/6(體積/體積)、1/7(體積/體積)、1/8(體積/體積)、1/9(體積/體積)、1/10(體積/體積)、1/20(體積/體積)、1/50(體積/體積)、1/60(體積/體積)、1/80(體積/體積)、1/90(體積/體積)、 1/100(體積/體積)，或更多。熟習本技藝之人士將可察知該稀釋比率之任何組合及該蛋白質助溶劑濃度之任何組合均可使用，只要該蛋白質助溶劑之最終濃度足以取得所需之效果。例如，包含蛋白質助溶劑之溶液可包含含有濃度在0.001%至0.5%(重量/體積)範圍內之選定的蛋白質助溶劑之溶液。在該含有蛋白質助溶劑之溶液中稀釋後，該生物流體通常包含少於0.1%(重量/體積)之該表面活性劑，宜少於0.6%(重量/體積)，更宜為不超過0.5%(重量/體積)，最宜為不超過0.45%重量/體積，甚至最宜為0.5%。

用於本發明之合適的緩衝系統包括Tris-HCl緩衝液(包括，諸如氯化鈉或氯化鉀之鹽及可選擇的，BSA)。特殊緩衝系統包括，但不限於：50mM Tris-HCl pH 8,0.5M NaCl,0.05%；BSA,0.05%吐溫-20；50mM Tris-HCl pH 8,0.5M NaCl,0.05%；BSA,0.05%吐溫-20,1M GuHCl；50mM Tris-HCl pH 8,0.5M KCl,0.05%；BSA,0.05%吐溫-20；50mM Tris-HCl pH 8,0.5M KCl,0.05%；BSA,0.05%吐溫-20,1M GuHCl；50mM Tris-HCl pH 8,0.5M NaCl,0.05%；BSA,0.05%吐溫-80；50mM Tris-HCl pH 8,0.5M KCl,0.05%；BSA,0.05%吐溫-80；50mM Tris-HCl pH 8,0.5M NaCl；0.05%；BSA,0.05%Triton X-100 50mM Tris-HCl pH 8,0.5M KCl,0.05%；BSA,0.05%Triton X-100；50mM Tris-HCl pH 8；0.05%；BSA,0.05%吐溫-20；50mM Tris-HCl pH 8,0.5M NaCl,0.1%；BSA,0.05%吐溫-20；50mM Tris-HCl pH 8,0.5M NaCl,0.05%；BSA,0.1%吐溫-20； 50mM Tris-HCl pH 8,0.5M NaCl,0.1%；BSA,0.1%吐溫-20；50mM Tris-HCl pH 8,1M NaCl,0.05%；BSA,0.05%吐溫-20；50mM Tris-HCl pH 8,1.5M NaCl,0.05%；BSA,0.05%吐溫-20；50mM Tris-HCl pH 8,2M NaCl,0.05%；BSA,0.05%吐溫-20；50mM Tris-HCl pH 8,2,5M NaCl,0.05%；BSA,0.05%吐溫-20；50mM Tris-HCl pH 8,3M NaCl,0.05%；BSA,0.05%吐溫-20；50mM Tris-HCl pH 8,0.5M NaCl,0.05%；BSA,0.05%吐溫-20,10%DMSO；50mM Tris-HCl pH 8,0.5M NaCl,0.05%；BSA,0.05%吐溫-20,0.5M GuHCl；50mM Tris-HCl pH 6,0.5M NaCl,0.05%；BSA,0.05%吐溫-20；50mM Tris-HCl pH 7,0.5M NaCl,0.05%；BSA,0.05%吐溫-20；50mM Tris-HCl pH 9,0.5M NaCl,0.05%；BSA,0.05%吐溫-20；50mM Tris-HCl pH 8,0.5M NaCl,0.05%；BSA

例如：當使用吐溫20作為蛋白質助溶劑時，該較佳濃度為0.004-0.02%，更宜為0.005-0.01%(重量/體積)。

該接觸步驟宜在低溫下進行，以抑制存在於樣本中之蛋白水解活性。合適之溫度約為0-10℃，宜為約攝氏3-5度，例如：約攝氏4度。

一旦該生物流體已與包含蛋白質助溶劑之溶液接觸後，可將兩種流體混合。混合可藉由攪拌進行，較佳地，藉由搖動進行，更佳地，藉由高速搖動進行，最佳地，震盪混合至少5秒、宜為至少10秒，更宜為至少15秒(例如：15-50秒)。該混合、攪拌、搖動、高速搖動或震盪混合之有利速度包含至少為250rpm(宜為至少500rpm，更宜 為至少1000rpm，最宜為約2,000-2,500rpm)之速度。

該接觸步驟係在足以使來自存在生物樣本中之蛋白質和脂肪的澱粉樣β肽部分，或較佳地，完全分解之條件下進行。該條件可由本技藝中之一般技術人士藉由監控在接觸步驟前可偵測到之澱粉樣β肽之量及在接觸發生後之不同時間點逐步監控來正確測定。時間進程實驗可依實驗部分之實例中的描述測定。

熟習本技藝之人士將可察知當該澱粉樣β肽之水準係經由以含有蛋白質助溶劑之緩衝液稀釋生物樣本來測定時，經由免疫測定法取得之游離澱粉樣β肽的水準必須予以校正，以將先前施用於生物樣本之稀釋倍數納入考慮。

因此，於一較佳之體系中，本發明方法之步驟(i)中所測定之參數為一或多種選自下列群組的參數：該個體之生物樣本中的游離Aβ40肽之水準(以下稱為1ab40或UP Aβ(1-40))、在生物樣本中之游離Aβ40肽之聚集水準及依上述取得之與該生物樣本的成分結合之Aβ40肽(以下稱為2ab40或DP Aβ(1-40))的聚集水準、在生物樣本中之游離Aβ42肽的水準(以下稱為1ab42或UP Aβ(1-42))和在生物樣本中之游離Aβ42肽的聚集水準以及依上述取得之與該生物樣本的成分結合之Aβ42肽(以下稱為2ab42或DP Aβ(1-42))的聚集水準。

此處所使用之“與細胞結合之澱粉樣β肽”一詞係指與存在於生物樣本中之細胞表面非共價結合的澱粉樣β肽且其無法與添加到樣本中之抗體結合，因此，無法以免疫方 法偵測到。通常，若該生物樣本為血液，該澱粉樣β肽係與紅血球、白血球(包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞)以及血小板結合。

本發明之方法可測定在給定之樣本中與細胞結合之澱粉樣β肽的量，且此值可單獨使用或與其他與澱粉樣β肽類相關之參數組合用於本發明之方法中。為此，首先需要從生物樣本中分離細胞部分。此可利用熟習本技藝之人士已知之任何技術(諸如離心、沉澱、過濾，等)進行。一旦將生物樣本之細胞部分分離出，將細胞與蛋白質助溶劑接觸。

合適之蛋白質助溶劑包括如上述定義之洗滌劑、離液劑和還原劑，其通常係以適當之濃度提供在緩衝溶液中。

合適之作用劑、緩衝液及在緩衝液中之作用劑濃度已描述於上文中。該接觸步驟大致上係依上述用於釋出連接生物樣本之成分(蛋白質和脂肪)的澱粉樣肽之方法進行。於較佳之體系中，該蛋白質助溶劑為洗滌劑。再於一更佳之體系中，該洗滌劑為吐溫20。作為蛋白質助溶劑之吐溫20的合適濃度係如上述定義，即，介於0.004-0.02%，更宜為0.005-0.01%(重量/體積)。

該接觸步驟宜在低溫下進行，以抑制存在於樣本中之蛋白質水解活性。合適之溫度為約0-10℃，宜為約3-5℃，例如：約4℃。

通常，該接觸步驟係經由將生物樣本中之細胞部分再懸浮於包含蛋白質助溶劑之溶液中來進行。該再懸浮可經 由輕輕上下抽吸、攪拌，較佳為搖動，更佳為藉由高速搖動，最佳為震盪混合至少5秒鐘，較佳為至少10秒，更佳為至少15秒(例如：15-50秒)來進行。用於該混合、攪拌、搖動、高速搖動或震盪混合之有利速度包含至少250rpm，較佳為至少500rpm，更佳為至少1000rpm，最佳為約2,000-2,500rpm之速度。

該接觸步驟係在足以使澱粉樣β肽從存在於生物樣本中之細胞部分(或較佳地，完全分離)的條件下進行。該條件可由本技藝中之一般技術人士藉由監控在接觸步驟前可偵測到之澱粉樣β肽之量及在接觸步驟後在不同的時間點逐步監控而正確決定。該時間進程實驗可依實驗部分中之實例的描述測定。

因此，於一較佳體系中，在本發明方法之步驟(i)中測定之參數為一或多種選自下列群組之參數：與存在於生物樣本中之細胞結合之ABETA40的水準(以下稱為3ab40或CB Aβ(1-40))及與存在於生物樣本中之細胞結合之ABETA42的水準(以下稱為3ab42或CB Aβ(1-42))。

本發明方法之接下來的步驟包括將至少一種參數(b)或(c)之數值或從算術組合參數(a)至(c)中之一或多種參數產生之計算出的參數值與對應於參考樣本中之該參數(b)或(c)或該計算出之參數值的參考值相比較，其中(a)、(b)及(c)已在上文中詳細定義且分別對應於該個體(a)之生物樣本中的游離澱粉樣β肽的水準、該個體之生物樣本中的游離澱粉樣肽的聚集水準和與存 在於該生物樣本(b)中之巨分子成分結合之該澱粉樣β肽的聚集水準，以及在該個體(c)之生物樣本中與細胞結合之澱粉樣β肽的水準。

用於本發明方法之步驟(ii)中的參數為直接參數，即，如上述定義之可直接測定的參數，其對應於先前定義為2ab40、3ab40、2ab42和3ab42之參數。或者，亦可能將一或多個直接參數算術組合，以取得計算之參數。實際上，任何二或多個參數之算術組合(包括相加、相減、相乘、相除及彼等之組合)均可產生具診斷價值之計算得到的參數。用於本發明方法中之特殊的計算標記包括，但不限於2ab40/2ab42、3ab40/3ab42、2ab40/3ab40、2ab42/3ab42、1ab40+2ab40、1ab40+3ab40、2ab40+3ab40、1ab40+2ab40+3ab40、1ab42+2ab42、1ab42+3ab42、2ab42+3ab42、1ab42+2ab42+3ab42、1ab40+2ab40+1ab42+2ab42、1ab40+3ab40+1ab42+3ab42、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42、1ab40+2ab40+3ab40+1ab42+2ab42+3ab42、(1ab40+2ab40)/(1ab42+2ab42)、(1ab40+3ab40)/(1ab42+3ab42)、(2ab40+3ab40)/(2ab42+3ab42)、(1ab40+2ab40+3ab40)/(1ab42+2ab42+3ab42)、(1ab42+2ab42)/(1ab40+2ab40)、(1ab42+3ab42)/(1ab40+3ab40)、(2ab42+3ab42)/(2ab40+3ab40)、(1ab42+2ab42+3ab42)/(1ab40+2ab40+3ab40)、2ab40-1ab40 、2ab42-1ab42及(2ab40-1ab40)/(2ab42-1ab42)。於一較佳體系中，該計算之參數係從2ab40與3ab40參數相加(以下稱為T40)產生。於另一較佳體系中，該計算之參數係從2ab42與3ab42參數相加(以下稱為T42)產生。再於另一較佳體系中，該計算之參數係從2ab40、3ab40、2ab42和3ab42參數相加(以下稱為T-βAPB)產生。

此處所使用之“參考值”一詞係指用於比較且係在未罹患神經退化性疾病或沒有任何神經退化性疾病病史之個體中測定的參數。較佳地，用於取得不同參數及計算之參數的參考值之個體為顯示出無記憶抱怨、在神經心理測試中表現正常且MRI中無結構性改變的患者。

特別是，選擇之參考值為允許敏感度高於85%且特異性高於75%。於另一較佳體系中，選擇參考值以取得高於70%之敏感性及高於70%之特異性。較佳地，該參考值容許取得至少有80%正確度或精準度之預測。

在本發明方法之步驟(iii)中，診斷神經退化性疾病、偵測神經退化性疾病前之階段、或區分神經退化性疾病與神經退化性疾病前之階段係採用可特別提供足夠之特異性和敏感度水準之特殊標記或計算標記組來進行。因此，於一特殊實例中，診斷神經退化性疾病係經由比較選自3ab40和2ab42之參數值或選自下列群組之計算出的參數值來進行：2ab40+3ab40及2ab40+3ab40+2ab42+3ab42。

於另一特殊體系中，偵測神經退化性疾病前之階段係經由比較選自2ab40、3ab40及2ab42之參數值或比較選自 下列群組之計算的參數值來進行：2ab40+3ab40、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42、1ab40+2ab40+3ab40+1ab42+2ab42+3ab42、1ab40+2ab40+3ab40、1ab42+2ab42+3ab42、1ab40+1ab42+2ab42+3ab42、1ab40+2ab40+1ab42+2ab42和1ab40+3ab40+1ab42+3ab42。

於另一較佳體系中，區分神經退化性疾病與該神經退化性疾病前之階段係經由比較選自3ab40和2ab42之參數值或比較選自下列群組之計算出的參數值來進行：2ab40+3ab40、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42和1ab40+2ab40+1ab42+2ab42。

用於本發明之不同診斷方法的適當參考值摘要於表1中。

一旦測定出參數或計算之參數值，當參數值或計算之參數值相對於參考值有所改變時，根據本發明來診斷神經退化性疾病、偵測神經退化性疾病前之階段、或區分神經退化性疾病與該神經退化性疾病前之階段。

“改變”一詞係指正在審議之參數值相對於參考值為統計上顯著地增加或減少。

此處所使用之“統計上顯著”係關於在二或多個結果、終點或後果之間具有非隨機相關之概率的統計分析，亦即，相對於參考值，該參數值與特定之患者群體有一定程度之數學上的可靠度。

統計上顯著之數值改變可使用p-值測定。例如：當使用p-時，當p值小於0.1(宜小於0.05，較宜為小於0.01，更宜為小於0.005，最宜為小於0.001)，則參數被確定為顯示出顯著改變。

通常，與參考值相比較，當數值高於參考值至少1.1倍、1.5倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或甚至更高時，所審議之參數值可被派定為“增加”。另一方面，與參考值相比較，當數值低於參考值至少0.9倍、0.75倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍、0.025倍、0.02倍、0.01倍、0.005倍，甚至更低時，所審議之參數值可被派定為“減少”。於一特殊之體系中，參數值或計算之參數值相對於參考值的改變為增加。

適合用於測定肽類之任何方法均可用於本發明中。例如：澱粉樣β肽之濃度可使用一或多種選自下列群組之技術測定：西方印漬、免疫沈澱法、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、表面電漿子共振、沉澱素反應、凝膠免疫擴散分析、放射免疫分析(RIA)、螢光流式細胞分選(FACS)、二維凝膠電泳法、毛細管電泳法、質譜分析(MS)、基質輔助雷射脫附/游離飛行時間(MALDI-TOF)MS、表面增強雷射脫附游離飛行時間(SELDI-TOF)、高效液 態色層分析法(HPLC)、快速蛋白質液態色層分析法(FPLC)、接著進行串聯質譜分析(MS/MS)之多維液態色層分析法(LC)、薄層色層分析法、蛋白質晶片表現分析及雷射密度測定法。

於一較佳體系中，測定至少一或多個1ab40、1ab42、2ab40、2ab42、3ab40和3ab42係藉由免疫學方法進行。此處所使用之“免疫學方法”，當用於測定時係關於任何涉及使用一或多種特異於標靶物質之抗體以測定樣本中不包括其他物質之該標靶物質的量/濃度之方法。合適之免疫學方法包括，但不限於西方印漬、免疫沉澱法、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、表面電漿子共振、放射免疫分析(RIA)。

熟習本技藝之人士可察知任何類型之抗體均足以用於執行根據本發明之免疫學偵測法，惟其該抗體具足夠之特異性以有效地區分樣本中之澱粉樣β肽物種與其他物質。適合用於本發明之免疫學方法的抗體分子包括，但不限於：

(i)“完整”抗體，其包含抗原結合可變區，以及輕鏈恆定區(CL)和重鏈恆定區、CH1、CH2和CH3，

(ii)由木瓜蛋白酶分解完整抗體所產生之“Fab”片段且其含有單一抗原結合位點及一CL區和一CH1區，

(iii)由胃蛋白酶分解完整抗體所產生之“F(ab')₂”片段且其含有二個抗原結合位點，

(iv)“Fab”片段包含輕鏈之恆定區及重鏈之第一恆定 區(CH1)，且僅具有一個抗原結合位點。Fab'片段在重鏈CH1結構區之羧基端加入數個殘基(包括一或多個來自抗體鉸鏈區的半胱胺酸)而與Fab片段不同。

(v)“Fv”為包含完整之抗原辨識及抗原結合位點的最小抗體片段。此區域係由具有一個重鏈與一個輕鏈可變區之二聚體所組成，該重鏈及輕鏈可變區以緊密，非共價方式結合。此種構形中，各個可變區之三個高變區(CDRs)相互作用以在VH-VL二聚體之表面上界定一抗原結合位點。總括而言，該六個高可變區賦予該抗體抗原結合特異性。然而，即使是單一之可變區(或僅包含三個特異於一個抗原之高可變區的一半Fv)亦具有識別並結合抗原之能力，雖然其親和力較整個結合位點低。

(vi)單鏈Fv或“scFv”抗體片段包含VL及VH抗體結構區，其中這些結構區係存於單一多肽鏈中。較佳地，該VL和VH區係藉由多肽連接子連接，其可使scFv形成結合抗原所需之結構。

(vii)“雙功能抗體(Diabodies)”包含藉由肽連接子連接在同一多肽鏈(VH-VL)上之輕鏈可變區(VL)的重鏈可變區(VH)，該肽連接子太短而無法使同一鏈上之兩個結構區之間形成配對。這迫使與另一鏈之互補結構區形成配對並促使二聚體分子與兩個功能性抗原結合位點組裝。

(viii)“雙特異性抗體”(BAbs)為具有兩個不同特異性抗原結合位點之一價、二價抗體(或其免疫治療上有 效之片段)。這兩個抗原位點可以化學方式或藉由本技藝已知之基因工程方法結合在一起。

所有這些抗體片段可使用本技藝已知之習知技術進一步修改，例如，經由單獨或組合使用本技藝已知之胺基酸缺失、插入、替代、加入及/或重組(及/或任何其他修改)(例如：轉譯後及化學修飾，諸如糖基化和磷酸化)技術。用於引入這類免疫球蛋白鏈之胺基酸序列下的DNA序列中之修改的方法為熟習本技藝之人士所熟知；見，例如Sambrook et al.；Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,2^nd edition 1989 and 3rd edition 2001。

抗體包含多株抗體和單株抗體。為了製造多株抗體，可為包括山羊、兔子、大鼠、小鼠、駱駝、單峰駱駝、美洲駝、人類、鳥類，等各種宿主注射對應於Aβ40或Aβ42之片段的具有免疫特性之肽來將其免疫化。根據宿主種類，可使用各種不同之佐劑來增加免疫反應。這類佐劑包括，但不限於：弗氏(Freund's)、礦物凝膠(諸如氫氧化鋁)及表面活性物質(諸如溶血卵磷脂)、聚陰離子、肽類、油乳劑、KLH及二硝基酚。在用於人類之佐劑中，BCG((Calmette-Guerin)卡介苗桿菌)及短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)為特佳者。若該抗原為一種肽，將其與一種在該欲免疫化之物種中具致免疫性的蛋白質耦合可能有所助益。例如：該抗原可利用雙官能或衍生劑，如：馬來醯亞胺基苯甲醯磺基琥珀醯亞胺酯(透過半胱 胺酸殘基共軛結合)、N-羥基琥珀醯亞胺(透過離胺酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐或SOCl₂而與鎖孔帽貝血藍蛋白(KLH)、藍載體(Blue Carrier)(自似鮑羅螺(Concholepas concholepas)分離出之血藍蛋白)、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑耦合。

為了製造單株抗體，可使用習知技術。例如：可使用由Kohler et al.,Nature,256：495(1975)首先描述之雜交瘤方法，利用Ausubel,F.M.，等(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons Inc；ring-bound edition,2003)之單元11.4至11.11中詳細說明之程序來製造單株抗體。或者，可藉由重組DNA程序自採用McCafferty et al.,Nature,348：552-554(1990)中所描述之技術產生的抗體噬菌體庫分離出單株抗體。Clacksoii et al.,Nature,352：624-628(1991)及Marks et al.,J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)描述利用噬菌體庫分別分離出小鼠和人類抗體。隨後之刊物描述藉由鏈改組(chain shuffling)(Marks et al.,Bio/Technology,10：779-783(1992))和組合感染以及體內重組作為建構非常大之噬菌體庫(Waterhouse et al.,Nucl.Acids.Res.,21：2265-2266(1993))之策略來製造高親和力(nM範圍)之人類抗體。因此，這些技術為可行之用於分離單株抗體之習知單株抗體雜交瘤技術之替代法。

出血及去除纖維蛋白凝塊後，多株抗體可直接作為來自免疫化之宿主的抗血清。在合適宿主之腹腔中植入雜交瘤後，單株抗體可直接以雜交瘤培養之上清液型式或腹水 型式使用。或者，該免疫球蛋白分子，無論是多株或單株，可在使用前藉由習知方法純化，諸如使用自澱粉樣β肽類衍生之肽類進行親和性純化法、非變性凝膠純化法、HPLC或RP-HPLC純化法、體積排阻法、在蛋白A管柱上純化或這些技術之任意組合。

用於進行本發明之免疫學方法的合適抗體包括，但不限於：(i)辨識來自澱粉樣β肽類之N端區的抗體，諸如特異於位在Aβ40或Aβ42之胺基酸1至16、1至17、13至28、15至24、1至5及1至11之抗原決定部位的抗體。針對對應於Aβ42肽之C端區的肽而製備的抗體，該抗體特異結合Aβ42，而與Aβ40或Aβ43無任何實質之交叉反應，(ii)針對對應於Aβ40肽之C端區的肽而製備的抗體，該抗體特異結合Aβ40，而與Aβ42、Aβ39、Aβ38、Aβ41或Aβ43無任何實質之交叉反應，(iii)同時辨識Aβ40和Aβ42之C端區的抗體，及(iv)特異於澱粉樣β肽類之連接區的抗體，其適合區分澱粉樣β肽類與其他APP片段以及位於胺基酸16與17之間(通常跨越胺基酸殘基13至28)者，(v)(i)至(iv)中所提及之二或多種抗體的組合。

於一較佳體系中，該澱粉樣β肽之量係經由ELISA測定。

此處所使用之“ELISA”一詞係代表酶聯免疫吸附分析 且涉及一種分析，經由該分析使未知量之靶的物質(該澱粉樣β肽)固定在表面上，然後將特異抗體沖刷過表面，以使其可結合抗原。此抗體連接酶並在最後之步驟中添加一種物質以使酶可轉化成一些偵測信號。已知一些不同類型之ELISA分析且可應用於本發明之方法中，包括直接ELISA法、夾心ELISA法、競爭性ELISA及ELISA逆向法和裝置(ELISA-Rm&d)。

直接ELISA法係經由將包含澱粉樣β肽之測試樣本與先前已塗覆非交互作用蛋白質或試劑(牛血清白蛋白、酪蛋白)之濃縮液的固態支撐接觸來進行。一旦存在於該測試樣本中之澱粉樣β肽被吸附至支撐上，將特異於澱粉樣β肽之抗體在足以使其與澱粉樣β肽結合之條件下加入其中。然後，以與可偵測之標籤或受質修飾酶耦合的二級抗體偵測經結合之抗體。從偵測標籤或從該受質產生之信號係與結合在支撐上之抗體的量成比例，換言之，與樣本中之澱粉樣β肽的量直接相關。

競爭性ELISA分析包括其中將包含未知量之澱粉樣β肽的試驗樣本與如上述定義之第一抗體接觸的第一個步驟。將抗體抗原複合物添加入塗覆抗原之槽中。一旦清洗該支撐以去除任何非特異結合之複合物後，以與一偵測部分耦合之第二抗體偵測該第一抗體的量。於此類型之分析中，原始抗原的濃度越高，最終之信號越弱。另一種競爭性ELISA分析為其中包含酶聯抗原，而非酶聯抗體之分析。經標記之抗原與樣本抗原(未經標記)競爭主要抗體結合 位點。使用此類型之分析，樣本中之抗原濃度與保留在槽中之經標記的抗原量呈負相關的良好，因此，產生較弱的信號。

ELISA逆向法和裝置(ELISA-R m&d)係採用由具有4-12個突出卵形物之免疫吸附性聚苯乙烯棒構成之新穎固相；整個裝置適合被引入含有收集之樣本的試管中，將該卵形物浸入預先填充試劑之標準微孔板的微孔中，密封並保存至使用時以使下列步驟(清洗、在共軛物中培育及在呈色物中培育)容易進行。

於較佳之體系中，該ELISA分析法為ELISA夾心分析法。該ELISA夾心分析涉及以特異於澱粉樣β肽之第一抗體塗覆支撐，施放含有澱粉樣β肽之樣本，此將導致澱粉樣β肽與第一抗體結合，並施放亦對澱粉樣β肽類具特異性之第二抗體，其中該第二抗體通常與可偵測之標籤或修飾酶耦合。由標籤或轉化之受質所產生之信號係與樣本中的抗原量呈比例。

在本發明之背景下，第一抗體將被稱為“捕捉抗體“，意指此抗體係用於從樣本中收回所有與抗體特異結合之分子物種。可作為捕捉抗體之抗體類型實際上沒有任何限制只要其包含至少一個特異於Aβ40和/或Aβ42之抗原結合位點。因此，上述提及之任何抗體均可作為捕捉抗體。

在本發明之背景下，第二抗體將被稱為“偵測抗體“，因為此抗體將可用於偵測由捕捉抗體保留之抗原量。如同捕捉抗體，作為偵測抗體之抗體類型實際上沒有任何限制 。然而，熟習本技藝之人士亦可理解該偵測抗體(i)必須結合未被捕捉抗體覆蓋之抗原區及(ii)必須不僅包含抗原結合位點，亦須含有可偵測之標籤、受質修飾酶或可被顯示出對該抗體具高結合親和性之試劑特異偵測的其他區，從而可偵測結合該由捕捉抗體捕捉之抗原的抗體。較佳地，該可被該試劑特異結合之其它區係對應於免疫球蛋白分子之恆定區。

於一較佳體系中，該捕捉抗體為特異對抗澱粉樣β肽類之N端區的抗體。再於一較佳體系中，該捕捉抗體為特異於位在Aβ40或Aβ42之胺基酸1至16內的抗原決定部位之抗體。特佳之捕捉抗體為如Kim,K.S.(Neuroscience Res.Comm.1988,2：121-130)所描述之6E10單株抗體。

於另一較佳體系中，該偵測抗體為特異於位在澱粉樣β肽之C端區內之抗原決定部位的抗體。如上文所解釋者，偵測抗體之性質可由本技藝之一般技術人士根據欲偵測之澱粉樣β物種的數目適當選擇。

為了特異偵測或測定Aβ40，該捕捉抗體可為辨識Aβ40之N端區(以及Aβ42之N端區，因為兩種肽類具有同一N端區)的抗體且該偵測抗體可為特異辨識Aβ40之C端區，不與Aβ42有任何交叉反應的抗體。或者，可使用辨識Aβ40之C端區，不與Aβ42有任何交叉反應的捕捉抗體，及辨識Aβ40與Aβ42所共通之Aβ40區(宜為Aβ42/Aβ40之N端區)的偵測抗體來特異偵測Aβ40。

為了特異偵測或測定Aβ42，該捕捉抗體可為辨識 Aβ42之N端區(以及Aβ40之N端區，因為兩種肽類具有同一N端區)的抗體且偵測抗體可為特異辨識Aβ42之C端區，不與Aβ40有任何交叉反應的抗體。或者，可使用辨識Aβ42之C端區的捕捉抗體，及辨識Aβ42與Aβ40所共通之Aβ42區的偵測抗體來特異偵測Aβ42。

為了同時偵測或測定Aβ42及Aβ40，該捕捉抗體可為辨識Aβ42與Aβ40共通之N端區的抗體且該偵測抗體可為至少兩種抗體之組合，其中該第一抗體特異辨識Aβ42之C端區，不與Aβ40有任何交叉反應，第二抗體特異辨識Aβ40之C端區，不與Aβ42有任何交叉反應。或者，捕捉抗體可為辨識Aβ42與Aβ40所共通之N端區的抗體，且該偵測抗體可為辨識Aβ40與Aβ42二者之C端區的抗體。或者，可使用為至少二種抗體之混合物的捕捉抗體(該二種抗體包含特異辨識Aβ42之C端區，不與Aβ40有任何交叉反應的第一抗體和特異辨識Aβ40之C端區，不與Aβ42交叉反應的第二抗體)，以及辨識Aβ42與Aβ40所共通之N端區的偵測抗體同時偵測Aβ42及Aβ40。或者，可以使用辨識Aβ40與Aβ42二者之C端區的抗體作為捕捉抗體，及辨識Aβ42與Aβ40所共通之N端區的偵測抗體同時偵測Aβ42及Aβ40。

特異於Aβ40及Aβ42之抗體及彼等之製備方法已詳細描述於WO2004024770及WO2004098631中，其內容納入本文作為參考。

該偵測和/或捕捉抗體可先利用包含用於製備彼等之多肽序列的多肽進行親和純化。

如上所述，該偵測抗體可直接與可偵測之標籤或受質修飾酶耦合。較佳地，可使用顯示出對偵測抗體具親和力之試劑，在此情況下，以可偵測之標籤或受質修飾酶標記的為該試劑而非該偵測抗體。此外，該抗體結合劑可與結合對之第一個成員耦合，在此情況下，可與偵測標籤或受質修飾酶耦合者為結合對的第二個成員。

抗體結合劑可非共價結合特定類型、特定類別和/或特定子類之抗體或抗體片段。或者，抗體結合劑可與特異於特定抗原之抗體非共價結合。於某些體系中，該抗體結合劑與偵測抗體之Fc區或F(ab)區非共價結合。較佳之抗體結合劑包括蛋白A、蛋白G、蛋白V、蛋白L、抗Fc抗體或其抗體結合片段以及Fc受體(FcR)或其抗體結合片段。可與偵測抗體非共價結合之抗體的非限制性實例包括單株抗體、多株抗體、多特異性抗體、人抗體、人化抗體、嵌合抗體、單結構區抗體、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段、經二硫鍵連接之Fvs(sdFv)、內抗體(intrabodies)及抗遺傳型(抗-Id)抗體，以及任何上述抗體之抗原結合片段。Fc受體之非限制性實例包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIAα、FcγRIIIB、FcεRIα、FcεRIξ和FcγRIIIAξ。

合適之用於偵測的結合對包括：‧半抗原或抗原/抗體，例如：長葉毛地黃苷(Digoxin)及抗長葉毛地黃苷抗體‧生物素或生物素類似物(例如：胺基生物素、亞胺 基生物素或脫硫生物素)/卵白素(avidin)或鏈黴卵白素(streptavidin)，‧糖/凝集素，‧酶和輔酶，‧葉酸/葉酸化物，‧選擇性結合蛋白質之雙股寡核苷酸/轉錄因子‧核酸或核酸類似物/互補核酸，‧受體/配體，例如：類固醇激素受體/類固醇激素。

可理解的，結合對之“第一”和“第二”成員等詞為相對的，而上述之各成員可被視為結合對之第一或第二個成員。於一較佳體系中，該結合對之第一個成員為生物素或其功能上相等之變異體，而結合對之第二個成員為卵白素、鏈黴卵白素或其功能上相等之變異體。

於一較佳體系中，該結合對之第二個成員為鏈黴卵白素。

合適之偵測標籤包括，但不限於：螢光部分(如：螢光素、羅丹明、藻紅素、香豆素、噁嗪、試鹵靈(resorufin)、青色素及其衍生物)、發光部分(如：由美國加州Palo Alto Quantum Dot公司提供的Qdot^TM)。

合適之受質修飾酶為那些，例如：在加入活化劑、受質、放大劑，等時能夠產生偵測信號者。適合作為本發明之偵測標籤的酶及其對應之受質包括：

‧鹼性磷酸酶：

○顯色受質：以對-硝苯基磷酸化物(p-NPP)、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸化物/硝基藍四氮唑(BCIP/NPT)、Fast-Red/萘酚-AS-TS磷酸化物為底質之受質。

○螢光受質：4-甲基傘形苯基磷酸化物(4-MUP)、2-(5'-氯-2'-磷醯氧基苯基)-6-氯-4-(3H)-喹唑酮(CPPCQ)、3,6-螢光素二磷酸化物(3,6-FDP)、Fast Blue BB、Fast Red TR或Fast Red Violet LB重氮鹽類。

‧過氧化物酶：

○以下列物質為底質之顯色受質：2,2-聯氮雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、鄰-苯二胺(OPT)、3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)、鄰-聯二茴香胺、5-胺基水楊酸、3-二甲胺基苯甲酸(DMAB)及3-甲基-2-苯並噻唑啉腙(MBTH)、3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)-及3,3'-二胺基聯苯胺四氫氯酸鹽(DAB)。

○螢光受質：4-羥基-3-甲氧苯基醋酸、還原之吩嗪和還原之苯並噻嗪，包括Amplex^® Red試劑、Amplex UltraRed及還原之二氫呫噸。

‧糖苷酶：

○顯色受質：用於β-D-半乳糖苷酶之鄰-硝苯基-β-D-半乳糖苷(o-NPG)，對-硝苯基-β-D-半乳糖苷和4-甲基傘形苯基-β-D-半乳糖苷(MUG)。

○螢光受質：試鹵靈β-D-半乳糖苷、螢光素二半乳糖 苷(FDG)、螢光素二葡萄糖醛酸苷、4-甲基傘形苯基β-D-吡喃半乳糖苷、羧基傘形苯基β-D-半乳糖苷及氟化香豆素β-D-吡喃半乳糖苷。

‧氧化還原酶(螢光酶)：

○發光受質：蟲螢光素。

本發明之套組

本發明亦提供適合實行本發明方法的套組。因此，於另一觀點中，本發明提供用於測定在生物樣本中之澱粉樣β肽類的套組，其包含(i)蛋白質助溶劑，及(ii)至少一種對抗澱粉樣β肽之抗體。

套組之成分(i)及(ii)大致上如關於本發明方法之描述。於一較佳體系中，該蛋白質助溶劑為洗滌劑。再於更佳之體系中，該洗滌劑為吐溫20。

於另一較佳體系中，該至少一種對抗澱粉樣β肽之抗體係選自下列群組：(i)對抗該澱粉樣β肽之N端區的抗體，(ii)對抗該澱粉樣β肽之C端區的抗體，及(iii)對抗該澱粉樣β肽之N端區的抗體與對抗該澱粉樣β肽之C端區的抗體之組合。

再於一更佳體系中，本發明之套組包含一對抗該澱粉樣β肽之N端區的抗體，該抗體係針對位於Aβ40和Aβ42之 胺基酸1至16內的抗原決定部位。於另一較佳體系中，本發明之套組包含一對抗該澱粉樣β肽之C端區的抗體，該抗體係針對選自下列群組之肽：(i)針對對應於Aβ42肽之C端區的肽而製備之多株抗體，其特異結合Aβ42肽，而與Aβ40無任何實質性交叉反應(ii)針對對應於Aβ40肽之C端區的肽而製備之多株抗體，其特異結合Aβ40肽，而與Aβ42無任何實質性交叉反應(iii)同時辨識Aβ40及Aβ42之C端區的抗體以及(iv)(i)及(ii)之抗體的組合。

於一較佳體系中，本發明之套組進一步包括固態支撐。此處所使用之“支撐”或“表面”一詞係指一種固相，其為多孔或非多孔型之不溶於水的物質且可具有多種形狀中之任一種，諸如條、棒、顆粒，包括膠乳粒、磁粒、微球、珠、膜、微量滴定槽和塑膠管。原則上，任何材料均適合作為固態支撐，只要其可結合足夠量之捕捉抗體。因此，固相材料之選擇係根據所需之分析格式性能特徵來測定。適合用於固態支撐之材料包括聚合材料，尤其是纖維素材料及自纖維素衍生之材料，諸如含紙之纖維，例如：濾紙、色譜紙、玻璃纖維紙，等；合成或經改質之天然聚合物，諸如硝基纖維素、醋酸纖維素、聚(氯乙烯)、聚丙烯醯胺、交聯葡聚醣、瓊脂糖、聚丙烯酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚( 對苯二甲酸乙二醇酯)、尼龍、聚乙烯丁酸酯，等；其可本身單獨使用或與其他材料一起使用；玻璃，諸如，例如：可以生物玻璃形式取得之玻璃、陶瓷、金屬，等。苯乙烯與羧基化苯乙烯或以其他活性基團(諸如胺基、羥基、鹵素，等為較佳者)官能化之苯乙烯的非交聯聚合物為較佳者。於一些情況下，將使用經取代之苯乙烯與二烯類(諸如丁二烯)之共聚物。

該固態支撐及抗體可分別提供於套組中，或者，該支撐遞送時可預先塗覆捕捉抗體。在此情況下，該支撐可能在結合捕捉抗體後已以阻斷溶液處理過。

套組之其他成分可包括：

‧用於自患者移除欲分析之樣本的工具。

‧製備澱粉樣β肽類之標準曲線所需的緩衝液和溶液。

‧分析期間用於清洗及阻斷固態支撐的緩衝液和溶液

‧以塗層抗體塗覆該固態支撐所用的緩衝液和溶液

‧用於自偵測標籤發展出有色或螢光信號的試劑

‧用於終止自偵測標籤形成有色或螢光產物的試劑(例如：1N硫酸)

‧含有為Aβ40或Aβ42肽類或彼等之組合的貯存溶液之樣本。

於一較佳體系中，本發明之套組包含可用於ELISA夾心分析的兩種抗體。在此情況下，抗體之一，該捕捉抗體，係固定在固態支撐上。固定可在結合欲偵測之靶的多肽 前進行或在該肽/蛋白質一旦結合捕捉抗體時進行。於任何情況下，若係使用固態支撐則在加入包含欲測定之靶的多肽的樣本前阻斷在載體上之過量的蛋白質結合位點較方便。較佳地，將在支撐上之肽結合位點阻斷或淬滅係使用在各結合反應後清洗複合物之相同緩衝液進行(例如：50mM Tris-HCl，pH8、選擇性的PBS或TBS，包含吐溫20)，該緩衝液中係補充濃度約0.05%至10%(較佳為1至5%，更佳為約3%)之巨分子化合物(如：牛血清白蛋白、脫脂乾燥奶、西方阻斷劑、酪蛋白、乳清蛋白、卵白蛋白)。

本發明藉由下列實例描述，這些實例僅用於說明，而非限制本發明的範圍。

實例1

研究族群

該研究包括40名參加者，16名健康對照組(HC)，8名癡呆輕度認知障礙患者(MCI)及16名阿滋海默病患者(AD)。所有患者均為65歲以上且各組中之男女各50%。參加者之人口特徵摘要於表2中。

在社區寓所、社會活動自願者中精心挑選無記憶抱怨，神經心理測試中表現正常且在定量磁共振造影(MRI)中無結構改變的健康對照組。

MCI參與者符合梅奧(Mayo)臨床標準。選擇MCI參與者另外需要CDR 0.5分，在用於評估內側顳葉萎縮之Scheltens(J.Neurol.Neurosurg Psychiatry.1992；55：967-972)量尺中超過3分以及在以18-氟去氧葡萄糖進行之正子發射斷層掃描(PET-FDG)中具頂葉及/或顳葉代謝減退樣式(暗示轉變成AD)。除了可能之神經退化性疾病外，患有可能導致MCI之任何精神或全身性病變的患者被排除在外。

AD組之具體納入標準為診斷出可能為AD(NINCDS-ADRDA標準)、CDR 1分、介於16至24分之MMSE及在用於評估內側顳葉萎縮之Scheltens量尺中超過3分。

用於MCI和AD診斷之認知測試係根據他處描述之ACE記憶臨床例行檢查進行。

自每個參與者取得知情同意書(或者，在數個AD患者之案例中係由其近親同意)。這項研究的議訂計劃係由Hospital Clinic i Provincial(西班牙巴塞隆納)之倫理委員會修訂及核准。

實例2

樣本之製備方法

自個體收集血液並在每10毫升中加入羅氏(Roche)CompleteMini小丸(蛋白酶抑制劑)。將血液直接旋轉或保存在4℃中，並在分析當天離心。

將血漿與細胞部分分開，收集血漿並以每份0.5毫升分裝在Eppendorf管中。將該等分液保持在-80℃下。

在依下述取得之未稀釋的澄清血漿中直接測定血漿中之游離的澱粉樣蛋白(1ab40和1ab42)。下文中，這些參數在Aβ(1-40)方面稱為1ab40或UP(未稀釋之血漿)Aβ(1-40)，在Aβ(1-42)方面稱為1ab42或UP Aβ(1-42)。

將150微升血漿在300微升稀釋緩衝液(包含0.5%吐溫20之PBS)中稀釋，在由此取得之樣本中測定總血漿澱粉樣蛋白(對應於血漿中之游離澱粉樣蛋白加與血漿結合之澱粉樣蛋白)。下文中，這些參數在Aβ(1-40)方面稱為2ab40或DP(稀釋之血漿)Aβ(1-40)，在Aβ(1-42)方面稱為2ab42或DP Aβ(1-42)。

將血漿細胞部分在稀釋樣本(包含0.5%吐溫20之PBS)中稀釋5倍(體積/體積)以測定與細胞結合之β澱粉樣 蛋白。下文中，這些參數在Aβ(1-40)方面稱為3ab40或CB(與細胞結合)Aβ(1-40)，在Aβ(1-42)方面稱為3ab42或CB Aβ(1-42)。

實例3

用於處理樣本之條件

稀釋樣本

為了鑑定在ELISA分析中產生最高吸光度的樣本稀釋倍數，測試不同的稀釋液和緩衝液。

將樣本稀釋1/2、1/3、1/4、1/5及1/10。觀察指出當稀釋1/4以上時吸收度下降。最佳稀釋倍數為1/2和1/3。

樣本離心

將樣本在13.000rpm離心1分鐘使樣本澄清，以移除可能干擾免疫偵測之微粒成分。收集上清液並依上述直接測試或稀釋。

樣本超聲波處理

將樣本超聲波處理5至10分鐘。該經超聲波處理之樣本可以直接用於ELISA分析中或可在13000rpm下旋轉1分鐘，該上清液可直接用於ELISA分析中。該經超聲波處理之樣本亦可以使用如前述實例中定義之適當緩衝液稀釋。

樣本之預檢

大致上依Fukumoto et al,(Arch.Neurol.,2003,60：958-964)之描述將樣本通過Sepharosa 4B-IgGK柱以去除可能之污染物。利用以下程序將經CNBr活化之瓊脂糖與IgGlk反應以準備Sepharosa 4B-IgGK柱：

-使用500微升IgGlk(0.6毫克)及1.5毫升耦合緩衝液將IgGlk(MW=150,000)溶解於耦合緩衝液(0.1M碳酸氫鈉，pH 8.3和0.5M NaCl)(300毫克瓊脂糖使用1.5毫升)中。

-以1mM HCl(每300毫克樹脂使用60毫升)清洗樹脂。

-將配體與經酸清洗之樹脂混合並在4℃培育一整夜且持續搖動(或者，可在室溫下培育2小時)。

-然後，使用5倍體積之耦合緩衝液清洗過量配體。

-然後，以0.1M Tris-HCl，pH8在室溫下搖動2小時來阻斷樹脂中未反應之活性基團。

-或者，使用0.1M Tris-HCl，pH8+0.5M氯化鈉/0.1M醋酸鈉，pH4+0.5M NaCl清洗樹脂三個週期。

一旦取得Sepharosa 4B-IgGK柱，對樣本之處理包括下列步驟：

-將300微升血漿與525微升樣本緩衝液和75微升瓊脂糖IgGlk接觸並在4℃下培育2小時且持續攪拌。

-經由離心移出瓊脂糖(1000rpm，5分鐘)

-將100微升經處理之樣本加入微量滴定盤之槽中並在4℃培育一整夜，該微量滴定盤之槽中已吸附特異於澱粉 樣β肽之N端的捕捉抗體。

-存在於澄清樣本中之澱粉樣β肽的量係經由下列步驟進行測定：在室溫下，將抗Aβ40或抗Aβ42特異性抗血清(1/4000)加入槽中1小時並持續搖動，再藉由ELISA分析測定。

-然後，在室溫下將樣本與生物素化之抗兔子的1/5000稀釋液一起培育1小時，並持續搖動。

-然後，在室溫下將樣本與1/4000之與過氧化酶耦合之抗生蛋白鏈菌素一起培育1小時，並搖動之。

-然後，將反應在黑暗中以TMB發展30分鐘。

-以終止溶液終止發展中之反應並在450nm處讀取吸光度。

移除白蛋白及IgG

將樣本通過結合白蛋白及結合IgG之管柱。分析通過之水流以鑑定發現澱粉樣肽類之分液。根據製造商的指示，利用“ProteoExtract Albumin Removal，套組”(CALBIOCHEM公司)去除白蛋白。

依照製造商的指示使用蛋白A柱(Protein A Sepharose 4 Fast Flow，Amersham，生物科技公司)去除IgG。

樣本濃縮

以截止值10000之微量濃縮離心管將樣本濃縮。在通過之水流中回收澱粉樣肽，而高分子量蛋白質係回收在保 留液中。

不同處理方案之效果可摘要如下：

-洗滌劑：吐溫20為使吸光度值增加較多的洗滌劑。當吐溫20之濃度從0.05%上升至0.1%時未觀察到效果。

-pH：提供較佳結果之pH值為7和8。當測定Aβ40時，pH=9處亦可觀察到適當之吸光度數值。當測定Aβ42時，適當之吸光度數值係在pH=9及5處取得。

-變性條件：加入0.5M或1MGuHCl或10%DMSO並未改良吸光度數值。

-鹽類：與KCl相比較，當使用NaCl時可取得較高之吸光度數值。

-BSA：當BSA的濃度從0.05%增加至0.5%時未觀察到任何差異。

-超聲波處理：在測定吸光度前將樣本進行超聲波處理並未觀察到吸光度水準有任何差異。

-預檢：以Sepharosa 4B-IgGK柱預先處理樣本時未觀察到任何影響。

-移除白蛋白和IgG：澱粉樣肽類顯示出與IgG結合，而非白蛋白。

-濃縮：澱粉樣肽類主要係出現在持留液中。

實例4

以生物素-抗生蛋白鏈菌素放大之比色性ELISA夾心法

為了提高敏感度，可使用生物素-抗生蛋白鏈菌素放 大該信號。使用辨識澱粉樣Aβ40肽及澱粉樣Aβ42肽二者中之胺基酸1-17的6E10 mAb捕捉抗體塗覆該盤。在4℃下，以在100mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液，pH=9.6中之5微克/毫升的濃度塗層一整夜。然後，在室溫下，以300微升之阻斷溶液(50mM Tris-HCl，pH 8、0.2%吐溫-20、0.5%BSA)阻斷該盤3小時，並一邊搖動，或在37℃下阻斷該盤2小時。需要時，阻斷後，可以100微升之含有20毫克/毫升海藻糖的50mM Tris-HCl，pH 8處理該盤。令該盤蒸發直到出現海藻糖之白色光暈特徵。經如此處理之盤可保持在4℃，以鋁箔覆蓋之可保持穩定兩年。

在塗覆6E10 mAb並經海藻糖處理之盤上，從200皮克/毫升之Aβ40及Aβ42肽的貯存溶液製備樣本之標準曲線。從這些溶液開始製備在SDB中之1：2系列稀釋液，以產生200、100、50、25、12.5、6.25和3.125皮克/毫升之濃度。將100微升各經稀釋或未經稀釋之樣本經稀釋或未經稀釋地加入SDB中(1/1,000,000)並在4℃培育一整夜(或在37℃下2小時)。依實例1中之描述製備用於測定測試樣本中之游離血漿澱粉樣蛋白、總血漿澱粉樣蛋白及與細胞結合之澱粉樣蛋白的樣本，並使用用於標準樣本之相同條件將其加入ELISA盤之槽中。加入在SDB中稀釋之偵測抗體(根據欲偵測者為Aβ42或Aβ40，其為針對對應於Aβ42肽之C端區而製備之多株抗體或針對對應於Aβ40肽之C端區而製備之多株抗體)。在各槽中加入100微升，並在室溫下培育1小時。接著，加入100微升在SDB中稀釋5000倍之 經生物素標記之抗兔子IgG抗體(SIGMA)，並在室溫下一邊搖動一邊培育1小時。然後，在各槽中加入100微升在SDB中稀釋4000倍之與HRP耦合之抗生蛋白鏈菌素(來自SIGMA)，並在室溫下培育1小時。

該盤係使用100微升之產色受質TMB(ZEU Inmunotec)發展顏色。加入TMB並在黑暗中培育15-30分鐘。在每一槽中加入50微升之1N硫酸以作為終止溶液。在平盤讀取器Synergy HT上讀取450nm處之吸光度(BioTek儀器)。

校正從用於測定總血漿澱粉樣蛋白(游離血漿澱粉樣蛋白加上與血漿成分結合之澱粉樣蛋白)之樣本取得之濃度值(皮克/毫升)以補償在製備步驟期間進行之稀釋。由於稀釋通常為1：3稀釋(見實例1)，自吸光度讀值取得之皮克/毫升必須乘以3以測定血漿中游離澱粉樣蛋白及與血漿成分結合之澱粉樣蛋白之真正的聚集濃度。同樣地，亦校正從用於測定與細胞結合之澱粉樣蛋白之樣本取得之吸光度的皮克/毫升以補償在製備步驟期間進行之稀釋。由於稀釋通常為1：5稀釋(見實例1)，自吸光度讀值取得之皮克/毫升必須乘以5以測定與細胞結合之澱粉樣蛋白之真正濃度。

各步驟之間使用自動洗盤機(E1x50 BioTek儀器)清洗該盤，其安排為每次清洗5次。該清洗溶液中包含50mM Tris-HCl，pH 8、0.05%吐溫-20和150mM NaCl(過濾後使用)。

實例5

螢光ELISA夾心分析

在4℃下以在碳酸氫鹽緩衝液(5微克/毫升)中之6E10塗覆分析盤一整夜。然後，在室溫下將分析盤阻斷3小時並一邊搖動(300微升/槽)。然後，將測試和標準曲線樣本加入分析盤中並在4℃下培育一整夜。將稀釋成1/4000之偵測抗體(抗-Aβ40及抗-Aβ42血清)添加到每一槽中並在室溫下培育1小時且一邊搖動。將與FITC耦合之抗-抗體的系列稀釋液(稀釋1/1000、1/5000、1/10000)加入其中並在室溫下，黑暗中培育1小時。使用激發波長為485nm且發射波長為528nm之螢光。

或者，該分析係使用Quanta-Blu(皮爾斯(PIERCE))螢光受質進行，其可增加ELISA分析之敏感度。最大激發波長為325nm且最大發射波長為420nm。可偵測之範圍為激發波長在315-340nm及發射波長在370-470nm。QuantaBlu操作溶液係經由將9份QuantaBlu受質溶液與1份QuantaBlu穩定之過氧化酶溶液(溶液在室溫下可穩定24小時)混合來製備。在室溫下，培育時間可為1.5分鐘至90分鐘，且可在停止反應或不停止反應下讀取(產生藍色)。

在4℃下以在碳酸氫鹽緩衝液(5微克/毫升)中之6E10 mAb塗覆分析盤一整夜，然後，在室溫下將分析盤阻斷3小時並一邊搖動(300微升/槽)。以下列濃度之Aβ42及Aβ40肽製備不同標準曲線：

‧1000,500,250,125,62.5,31,25及15.65皮克/毫升

‧200,100,50,25,12.5,6.25及3.125皮克/毫升

‧25,12.5,6.25,3.125,1.56,0.78及0.39皮克/毫升

‧10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125及0.156皮克/毫升

‧5,2.5,1.25,0.625,0.3125,0.156及0.078皮克/毫升

‧1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.03125及0.0156皮克/毫升

在室溫下，加入偵測抗體(抗-Aβ40及抗-Aβ42血清)(稀釋成1/4000)1小時並一邊搖動。將與HRP耦合之抗-兔子IgG 1/1000加入其中並在室溫下培育1小時且一邊搖動。為了發展反應，加入100微升QuantaBlu操作溶液並將其在室溫下、黑暗中培育30、60及90分鐘。然後，在30、60和90分鐘時於沒有停止反應或以終止溶液停止反應的情況下讀取螢光值(激發：360/40nm；發射：460/40nm)。

實例6

Aβ40及Aβ42標準曲線之的製備方法

為了製備Aβ40標準曲線，將人類Aβ40之凍乾樣本重構成10微克/毫升。從貯存溶液製備含有以下濃度(以皮克/毫升表示)之樣本：25,000皮克/毫升、2,500皮克/毫升、25皮克/毫升、12.5pg/ml、6.25皮克/毫升、3.125皮克/毫升、1.56皮克/毫升、0.78皮克/毫升。在1mM蛋白酶抑製劑AFBSF之存在下製備樣本。然後，根據前述實例中定義之方法處理樣本。

為了製備Aβ42標準曲線，將人類Aβ42之凍乾樣本重構成10微克/毫升。從貯存溶液製備含有以下濃度(以皮克/毫升表示)之樣本：25,000皮克/毫升、2,500皮克/毫升、25皮克/毫升、12.5pg/ml、6.25皮克/毫升、3.125皮克/毫升、1.56皮克/毫升、0.78皮克/毫升。在1mM蛋白酶抑製劑AEBSF之存在下製備樣本。然後，根據前述實例中定義之方法處理樣本。

實例7

統計分析

藉由一致性相關係數(CCC)來評估來自16個隨機選擇之樣本的實驗室間測量重複性，該CCC係經由測量從原點到45度線(一致性線)的變化來評估三個讀值(我們自己及由兩個外部實驗室報告之來自同一樣本的讀值)之間的一致性。相同個人在不同的日子取得之樣本彼此相似的程度(個體內之重複性)係藉由類別內相關係數(ICC)進行評估。藉由這些相關係數估計之一致性程度可被描述為差(0.21至0.40)、中等(0.41至0.60)，大致(0.61至0.80)和幾乎完美(0.81至1.00)。使用Mann-Whitney U測試比較不同診斷組中之Aβ水準。使用斯皮爾曼(Spearman)分析來評估連續變量之間的相關性。在否決虛無假設方面必須p<0.05。所有統計分析，包括診斷準確性之測量係使用SAS 9.1版軟體。第1-3圖係以PASW統計軟體製作。

估計下列作為AD、MCI和HC患者間之篩選試驗的澱粉樣p肽標記的有效性和可靠性之指標。

對於每一種指示及測定之標記，進行下列具體指明之分析，將參與者在健康對照組-AD、健康對照組-MCI及MCI-AD之間分類：

效力性質：

敏感度：此為正確分類生病個體之概率，即，生病個體在測試中取得陽性結果之概率。因此，敏感度為該測試 偵測該疾病之能力。

特異性：此為正確分類健康個體的概率，即，健康個體取得陰性結果之概率。換言之，特異性可設計成偵測健康人的能力。

可靠性性質：

陽性預測值：此為若在測試中得到陽性結果時罹患疾病之概率。因此，陽性預測值可從測試中具陽性結果之患者最後罹患疾病之比例估計：

陰性預測值：此為測試中個體得到陰性結果時實際上是健康的概率。其係經由將真正陰性之數目除以測試中具陰性結果之患者的總數來估計：

除了敏感性、特異性和預測值之概念外，似然比、概 率比或機率比的概念亦列入考量。愈晚測量則特異(正或負)結果愈可能根據疾病之存在或不存在。

陽性似然比或陽性機率比：此係經由將生病患者之陽性結果的概率除以健康個體之陽性結果的概率來計算。簡單地說，其為真陽性(敏感性)部分和偽陽性部分(1-特異性)之間的比例：

陰性似然比或陰性機率比：此係經由將出現疾病的族群中得到陰性結果的概率除以無疾病存在的族群中得到陰性結果的概率計算出。因此，其係經由計算偽陰性(1-敏感性)部分和真陰性部分(特異性)之間的比例取得：

ROC曲線係藉由圖形和ROC曲線下面積(95%CI)呈現，而根據(生病/健康)患者之參數的真正分類以及敏感性、特異性之數值、陽性預測值和陰性預測值(具95%CI)係藉由表格呈現。

所有統計測試係以0.05之顯著性水準執行。

實例8

實驗室間之Aβ測量的再現性。

將16個隨機選擇之任何參與者的樣本及萃取物送往兩個外部實驗室以評估該測量在實驗室之間的再現性。所有標記均以類似方式表現，其CCC在0.84至0.99之範圍內(整體95%IC為從0.73至0.99)，在所有情況中此對應於大致至幾乎完美的一致性程度(第1圖)。

各實驗室中，6個標記之平均分析內再現性(以一式三份之槽的變異係數表示)為4.31、5.83和8.34(表6)。在三個實驗室中，Aβ1-40之分析的偵測極限分別為5.31、3.63和1.91皮克/毫升，而Aβ1-42之分析的偵測極限分別為2.37、2.04和2.45皮克/毫升。

CV：各標記之一式三份之槽的變異係數。

實例9

Aβ測量之個體內再現性。

在三組中之所有直接標記方面，每週採血，共4週(BS1-BS4)後藉ICC測量之Aβ測量值的再現性係在大致至幾乎完美之間變化(表7)。平均來說，該三組診斷組中 ，較高之ICC係對應於DP組中之Aβ1-40及Aβ1-42的測量值(分別為0.93,95%CI=0.98-0.80及0.93,95%CI=0.98-0.78)。

平均ICC值：四個萃取物彼此比較後之數值。所有相關為性統計上有意義。Max和Min係指95%信賴區間。

實例10

診斷組間之比較。

與測量值之高個體內再現性一致，在不同天(BS1至BS4)收集之4個血液樣本中，各組參與者間之比較遵循相同模式，雖然BS彼此間有些p值略有不同。下列描述是基於BS4之測量。

第一個引人注目的結果為對任何診斷組而言在UP中測量之Aβ1-40和Aβ1-42的濃度僅分別約為DP中之水準的1/3和1/4(表8)。

其次，直接從血液樣本之細胞部分測量之CB肽水準類似於在DP中測量之水準。此外，在UP、DP或CB組中測量之Aβ1-40和Aβ1-42強烈相關(r分別=0.58、0.71和0.71；p<0.001)。在樣本中直接分析之六個標記的任一對間(在UP、PD、CB中之Aβ1-40和Aβ1-42，表9)亦發現顯著之相關性。

此外，吾人發現，相對於健康對照組，MCI和AD患者中之每一個標記的水準增加(第2圖，表8)。MCI和HC組間，3個Aβ1-40標記(UP、PD和CB，其分別增加2.9、2.2和18倍)及2個Aβ1-42血漿標記(UP和DP分別增加3.1和1.8倍)的增量達到統計上有意義。AD組中之每一個標記的平均水準與MCI組中之平均水準很相似，且在此二組患者之間並沒有顯著差異。類似地，AD和HC組之間亦無統計差異，除了Aβ1-42之CB水準以外(第2圖)。缺乏顯著性最可能是由於AD組內之大範圍的個別測量(n=16)，其顯示出每一標記之CV高於MCI(n=8)組1.5至27倍，且高於HC組(n=16)2.5至5.7倍(表8)。

Aβ1-40和Aβ1-42二種血漿標記(UP和DP)，但不包括CB，與MMSE顯著相關(表9)，但其可能被部分高估，因為HC群朝向較高之截止點。事實上，排除MMSE≧26之參與者，受嚴重影響之患者(MMSE≦21，n=5)體內的 Aβ1-40和Aβ1-42水準較受中等影響者(MMSE 22-25，n=12)為低，但差異未達到統計學上有意義(數據未顯示)。此外，三個Aβ1-42標記(但Aβ1-40則不)被發現與在左、右兩個腦半球中之內側顳葉萎縮程度顯著相關(表9)。

吾人亦考慮數個從樣本中直接分析取得者計算得到之標記。除了平常之Aβ1-42/Aβ1-40比外，最有趣的為DP加CB Aβ1-40之總和及DP加CB Aβ1-42之總和(其分別稱為總Aβ1-40(T40)及總Aβ1-42(T42))，以及這兩項之總和(稱為總βAPB(T-βAPB))。在UP、DP或CB中測量之Aβ1-42/Aβ1-40比在各組之間未表現出顯著差異。然而，MCI組中之T40、T42和T-βAPB相對於健康對照組分別增加2.0、15和1.8倍(p≦0.03)(表4)。HC與AD患者之間可發現類似之平均增量，但在此情況中，僅T42達到統計上有意義(第2圖)。

實例11

直接和計算標記之診斷特性

表10中提及之直接和計算參數係使用前述實例中定義之方法測定。

將上述參數之預測值進行下列測試：(i)診斷阿滋海默氏症(經由比較來自健康患者的樣本與來自阿滋海默氏症患者的樣本AD/HC)，(ii)診斷輕度認知功能損害及阿滋海默氏症前之階段(經由比較來自健康患者的樣本與來自罹患輕度認知功能損害之患者的樣本，MCI/HC)和(iii)區分輕度認知功能損害與阿滋海默氏症(經由比較來自罹患輕度認知功能損害之患者的樣本與來自阿滋海默氏症患者的樣本，MCI/AD)。

藉由邏輯分析Aβ測量值及被視為黃金標準的臨床診斷 來評估分析之診斷特性。關於敏感性、特異性、陽性預測值(PPV)、陰性預測值(NPV)、準確性及受試者操作特性(ROC)曲線下面積之結果摘要於表11中。

以灰色強調者為符合被認為適合作為標題中之數字之標準的結果。PPV：陽性預測值。NPV：陰性預測值。ROC：受試者操作特性曲線下面積。

最直接之標記及兩個計算之標記(T40及T-βAPB)符合被認為適合區分MCI患者和HC之標準，此標準最重要，因為從任何實際觀點來看，此為診斷應改良之處。因此，所有直接標記，除了CB Aβ1-42外，呈現ROC≧0.8且其中四個(DP Aβ1-40、CB Aβ1-40，UP Aβ1-42及DP Aβ1-42)之準確度>80%，此意指當與臨床金標準相比較時，80%之測試是正確的(第3圖)。計算之T40和T-βAPB在區分MCI和HC上與直接標記同樣準確，然而T42顯示出較不可靠(第3圖)。由於Aβ測量值在AD組內之個體間的變異很大，找不到任何切割點可使這些標記以可接受之敏感性和特異性來區別AD患者與其他兩組參與者(第3圖)。

實例12

其他顯示出最高敏感性和感受性及適合用於本發明之參數包括那些顯示於表12中者。

此處提供之方法特別適合用於採用1ab40標記(第4圖)、2ab40標記(第5圖)、3ab40標記(第6圖)、1ab42標記(第7圖)、2ab42標記(第8圖)、3ab42標記(第9和10圖)、2ab40+3ab40標記(第11圖)、2ab42+3ab42標記(第12圖)、2ab42+3ab42(第13圖)和2ab40+3ab40+2ab42+3ab42(第14圖)來從健康患者中偵測輕度認知障礙。

第1圖：A-F。在兩個外部實驗室(實驗室1和實驗室2)中取得之(A)UP Aβ1-40、(B)DP Aβ1-40、(C)CBA Aβ1-40、(D)UP Aβ1-42、(E)DP Aβ1-42及(F)CB Aβ1-42之測量值之點狀圖。大部分之點接近一致性線，顯示出測量之一致性為大致至一幾乎完美的程度。各繪圖之下右方插圖表示一致性相關係數(CCC)及95%之信賴區間。

第2圖：Aβ1-40(A)、Aβ1-42(B)之直接標記及Aβ1-40和Aβ1-42(C)之計算標記。A.以皮克/毫升表示之健康對照組(HC)、罹患輕度認知功能障礙之患者(MCI)和罹患阿滋海默氏症之患者(AD)之血清中的游離Aβ1-40(FP)、血漿中之總Aβ1-40水準(包括游離Aβ1-40及結合血漿成分之Aβ1-40)(TP)及結合細胞之Aβ1-40(CB)的濃度。B.以皮克/毫升表示之健康對照組(HC)、罹患輕度認知功能障礙之患者(MCI)和罹患阿滋海默氏症之患者 (AD)之血清中的游離Aβ1-42(FP)、血漿中之總Aβ1-42水準(包括游離Aβ1-42及結合血漿成分之Aβ1-42)(TP)及結合細胞之Aβ1-42(CB)的濃度。C.以皮克/毫升表示之總血漿Aβ1-40(經由將血漿樣本與蛋白質助溶劑接觸取得)加與細胞結合之Aβ1-40(TP+CB Aβ1-40)、總血漿Aβ1-42(經由將血漿樣本與蛋白質助溶劑接觸取得)加與細胞結合之Aβ1-42(TP+CB Aβ1-42)的聚集值、或TP+CB Aβ1-40及Aβ1-42(TP+CB Aβ1-42)的聚集值。H、M及A分別指HC、MCI和AD具顯著性(P<0.05)。*意指p<0.01。

第3圖：A-F。HC、MCI和AD參與者中(A)DP Aβ1-40，(B)CB Aβ1-40，(C)UP Aβ1-42，(D)DP Aβ1-42，(E)T40及(F)T-βAPB值之點狀圖。*旁之號碼表示MCI和AD組中離群者之數值，此數值(為了澄清表示)並不以與縱軸之同等比例表示。水平線代表MCI與HC間之截止值。

第4圖：MCI/HC患者中之1ab40標記的ROC曲線。ROC曲線下面積=0.510。

第5圖：MCI/HC患者中之2ab40標記的ROC曲線。ROC曲線下面積=0.778。

第6圖：MCI/HC患者中之3ab40標記的ROC曲線。ROC曲線下面積=0.458。

第7圖：MCI/HC患者中之1ab42標記的ROC曲線。ROC曲線下面積=0.576。

第8圖：MCI/HC患者中之2ab42標記的ROC曲線。ROC曲線下面積=0.667。

第9圖：AD/HC患者中之3ab42標記的ROC曲線。ROC曲線下面積=0.744。

第10圖：MCI/HC患者中之3ab42標記的ROC曲線。

ROC曲線下面積=0.508。

第11圖：MCI/HC患者中之2ab40+3ab40標記的ROC曲線。曲線下面積為0.830。

第12圖：AD/HC患者中之2ab42+3ab42標記的ROC曲線。曲線下面積為0.713。

第13圖：MCI/HC患者中之2ab42+3ab42標記的ROC曲線。曲線下面積為0.777。

第14圖：MCI/HC患者中之2ab40+3ab40+2ab42+3ab42標記的ROC曲線。曲線下面積為0.848。

<110> 亞拉克隆生物科技有限公司

<120> 用於改良偵測澱粉樣β肽類之方法與試劑

<130> P4599PC00

<150> EP09382279

<151> 2009-12-11

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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Claims (15)

1. 一種用於體外診斷個體中之神經退化性疾病、偵測神經退化性疾病前之階段、或區分神經退化性疾病與該神經退化性疾病前之階段的方法，其包含：(i)測定一或多種選自下列所組成的群組之參數：(a)在該個體之生物樣本中的一或多種游離澱粉樣β肽類之水準，(b)在該個體之生物樣本中的一或多種游離澱粉樣肽類的聚集水準及該與存在於該生物樣本中之巨分子成分結合之一或多種澱粉樣β肽類的聚集水準，其中該聚集水準係經由將該樣本與蛋白質助溶劑在足以促進澱粉樣β肽或肽類從存在於該生物樣本中之成分分解出的條件下接觸後定量在該樣本之不含細胞部分中的該一或多種澱粉樣β肽類之量來測定，(c)與該個體之生物樣本中之細胞結合之一或多種澱粉樣β肽類的水準，其中該水準係經由將該生物樣本之細胞部分分離出，將該樣本之該細胞部分與蛋白質助溶劑在足以促進澱粉樣β肽或肽類從存在於該樣本中之細胞分解出的條件下接觸來測定，及(ii)將至少一種參數(b)或(c)之數值或從算術組合參數(a)至(c)中至少二者所產生之計算出的參數值與對應於參考樣本中之該參數(b)或(c)或該計算出之參數值的參考值相比較，及(iii)當該參數值或計算出之參數值相對於該參考值 有所改變時，診斷神經退化性疾病、偵測神經退化性疾病前之階段或區分神經退化性疾病與該神經退化性疾病前之階段；其中該生物樣本係血漿或血液，且其中該在步驟(i)中測定之參數為選自以下群組之一或多種參數：(a)1ab40，其對應於在該個體之生物樣本中之游離ABETA40肽的水準，(b)1ab42，其對應於在該個體之生物樣本中之游離ABETA42肽的水準，(c)2ab40，其對應於在該個體之生物樣本中之游離ABETA40肽及與該生物樣本之成分結合之ABETA40肽的聚集水準，其中2ab40係經由將該樣本與蛋白質助溶劑在足以促進ABETA40肽從存在於該生物樣本中之成分分解出的條件下接觸後，定量在該樣本中之ABETA40肽的量來測定，(d)2ab42，其對應於在該個體之生物樣本中之游離ABETA42肽及與該生物樣本之成分結合之ABETA42肽的聚集水準，其中2ab42係經由將該樣本與蛋白質助溶劑在足以促進ABETA42肽從存在於該生物樣本中之成分分解出的條件下接觸後，定量在該樣本中之ABETA42肽的量來測定，(e)3ab40，其對應於與該個體之生物樣本中之細胞結合之ABETA40肽的水準，其中3ab40係經由將該生物樣 本之細胞部分與蛋白質助溶劑在足以促進澱粉樣β肽類從存在於該樣本中之細胞分解出的條件下接觸後，定量ABETA40肽之量來測定，及(f)3ab42，其對應於與該個體之生物樣本中之細胞結合之ABETA42肽的水準，其中3ab42係經由將該生物樣本之細胞部分與蛋白質助溶劑在足以促進澱粉樣β肽類從存在於該樣本中之細胞分解出的條件下接觸後，定量ABETA42肽之量來測定，以及其中在步驟(ii)中取得之計算出的參數係選自以下群組：2ab40/2ab42、3ab40/3ab42、2ab40/3ab40、2ab42/3ab42、1ab40+2ab40、1ab40+3ab40、2ab40+3ab40、1ab40+2ab40+3ab40、1ab42+2ab42、1ab42+3ab42、2ab42+3ab42、1ab42+2ab42+3ab42、1ab40+2ab40+1ab42+2ab42、1ab40+3ab40+1ab42+3ab42、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42、1ab40+2ab40+3ab40+1ab42+2ab42+3ab42、(1ab40+2ab40)/(1ab42+2ab42)、(1ab40+3ab40)/(1ab42+3ab42)、(2ab40+3ab40)/(2ab42+3ab42)、(1ab40+2ab40+3ab40)/(1ab42+2ab42+3ab42)、(1ab42+2ab42)/(1ab40+2ab40)、(1ab42+3ab42)/(1ab40+3ab40)、(2ab42+3ab42)/(2ab40+3ab40)、(1ab42+2ab42+3ab42)/(1ab40+2ab40+3ab40)、 2ab40-1ab40、2ab42-1ab42及(2ab40-1ab40)/(2ab42-1ab42)。
2. 如申請專利範圍第1項中定義之方法，其中(i)診斷神經退化性疾病係經由比較選自3ab40、2ab42、和3ab42之群組之參數值或選自2ab40+3ab40、2ab42+3ab42、1ab40+2ab40+1ab42+2ab42及2ab40+3ab40+2ab42+3ab42之群組之計算出的參數值來進行，(ii)偵測神經退化性疾病前之階段係經由比較選自2ab40、3ab40、2ab42和3ab42之群組的參數值或比較選自2ab40+3ab40、2ab42+3ab42、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42、1ab40+2ab40+3ab40+1ab42+2ab42+3ab42、1ab40+2ab40+3ab40、1ab42+2ab42+3ab42、1ab40+2ab40+1ab42+2ab42和1ab40+3ab40+1ab42+3ab42之群組之計算出的參數值來進行，或(iii)區分神經退化性疾病與該神經退化性疾病前之階段係經由比較選自3ab40和2ab42之群組的參數值或比較選自2ab40+3ab40、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42和1ab40+2ab40+1ab42+2ab42之群組之計算出的參數值來進行。
3. 如申請專利範圍第2項中定義之方法，其中在步驟(ii)中用於比較參數值或計算出之參數值的參考值係選自以下群組：(i)當使用參數2ab40來偵測神經退化性疾病前之階 段時係使用63.8皮克/毫升，(ii)當使用參數3ab40來診斷神經退化性疾病時係使用71.9皮克/毫升，(iii)當使用參數3ab40來偵測神經退化性疾病前之階段時係使用71.1皮克/毫升，(iv)當使用參數3ab40來區分神經退化性疾病與該神經退化性疾病前之階段時係使用211.3皮克/毫升，(v)當使用參數2ab42來診斷神經退化性疾病時係使用47.4皮克/毫升，(vi)當使用參數2ab42來偵測神經退化性疾病前之階段時係使用50.3皮克/毫升，(vii)當使用參數2ab42來區分神經退化性疾病與神經退化性疾病前之階段時係使用151.7皮克/毫升，(viii)當該參數為3ab42且係用於診斷神經退化性疾病時係使用76.9皮克/毫升，(ix)當該參數為3ab42且係用於偵測神經退化性疾病前之階段時係使用58.8皮克/毫升，(x)當使用參數2ab40+3ab40來診斷神經退化性疾病時係使用132.7皮克/毫升，(xi)當使用參數2ab40+3ab40來偵測神經退化性疾病前之階段時係使用132.7皮克/毫升，(xii)當使用參數2ab40+3ab40來區分神經退化性疾病與該神經退化性疾病前之階段時係使用550.8皮克/毫升， (xiii)當該參數為2ab42+3ab42且係用於診斷神經退化性疾病時係使用115.8皮克/毫升，(xiv)當該參數為2ab42+3ab42且係用於偵測神經退化性疾病前之階段時係使用103.3皮克/毫升，(xv)當使用參數2ab40+3ab40+2ab42+3ab42來診斷神經退化性疾病時係使用235.5皮克/毫升，(xvi)當使用參數2ab40+3ab40+2ab42+3ab42來偵測神經退化性疾病前之階段時係使用235.5皮克/毫升，(xvii)當使用參數2ab40+3ab40+2ab42+3ab42來區分神經退化性疾病與該神經退化性疾病前之階段時係使用778.1皮克/毫升，(xviii)當使用參數1ab40+2ab40+3ab40+1ab42+2ab42+3ab42來偵測神經退化性疾病前之階段時係使用272.1皮克/毫升，(xix)當使用參數1ab40+2ab40+3ab40來偵測神經退化性疾病前之階段時係使用155.8皮克/毫升，(xx)當使用參數1ab42+2ab42+3ab42來偵測神經退化性疾病前之階段時係使用124.3皮克/毫升，(xxi)當使用參數1ab40+2ab40+1ab42+2ab42來診斷神經退化性疾病時係使用158.3皮克/毫升，(xxii)當使用參數1ab40+2ab40+1ab42+2ab42來偵測神經退化性疾病前之階段時係使用142.4皮克/毫升，(xxiii)當使用參數1ab40+2ab40+1ab42+2ab42來區分神經退化性疾病與該神經退化性疾病前之階段時係使用 161.2皮克/毫升，(xxiv)當使用參數1ab40+3ab40+1ab42+3ab42來偵測神經退化性疾病前之階段時係使用154.7皮克/毫升。
4. 如申請專利範圍第1項中定義之方法，其中該參數值或計算出之參數值相對於參考值之變化為增加。
5. 如申請專利範圍第1項中定義之方法，其中該蛋白質助溶劑為一種洗滌劑(detergent)。
6. 如申請專利範圍第1項中定義之方法，其中該1ab40、1ab42、2ab40、2ab42、3ab40及3ab42之至少一或多者之測定步驟係經由免疫學方法進行。
7. 如申請專利範圍第6項中定義之方法，其中該免疫學方法為ELISA分析法。
8. 如申請專利範圍第7項中定義之方法，其中該ELISA分析法為ELISA夾心分析法。
9. 如申請專利範圍第8項中定義之方法，其中在ELISA夾心分析法中之捕捉抗體為對抗該澱粉樣β肽之N端區的抗體。
10. 如申請專利範圍第9項中定義之方法，其中該對抗該澱粉樣β肽之N端區的抗體係針對位於ABETA40及ABETA42之胺基酸1至7內的抗原決定部位。
11. 如申請專利範圍第7項中定義之方法，其中該ELISA夾心分析法中之偵測抗體為針對位於該澱粉樣β肽之C端區內之抗原決定部位具特異性的抗體。
12. 如申請專利範圍第11項中定義之方法，其中該針 對該澱粉樣β肽之C端區具特異性之抗體係選自以下群組：(i)針對對應於ABETA42肽之C端區的肽而製備之多株抗體，其特異結合ABETA42而不會與ABETA40有任何實質之交叉反應，(ii)針對對應於ABETA40肽之C端區的肽而製備之多株抗體，其特異結合ABETA40而不會與ABETA42有任何實質之交叉反應，及(iii)同時辨識ABETA40和ABETA42二者之C端區的抗體，及(iv)在(i)及(ii)下之抗體的組合。
13. 如申請專利範圍第8項中定義之方法，其中該偵測抗體係使用一種對該與結合對之第一員耦合之抗體具親和力的試劑進一步偵測出。
14. 如申請專利範圍第12項中定義之方法，其中該偵測係使用與可偵測之標記耦合的結合對之第二員進行。
15. 如申請專利範圍第1項中定義之方法，其中該神經退化性疾病為阿滋海默氏症及/或該神經退化性疾病前之階段為輕度之認知功能障礙。