TWI522112B - 疫苗佐劑、疫苗組合物與牛樟芝子實體之多醣體用於製備一疫苗佐劑的用途 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種疫苗佐劑，且特關於包含一牛樟芝(學名為Antrodia camphorata、Antrodia cinnamomea或Taiwanofungus camphoratus)子實體之多醣體的疫苗佐劑。
疫苗可以在生物體中啟動體液性免疫反應而產生抗體，或者透過細胞性免疫反應而活化毒殺性T細胞等淋巴細胞，以抵抗入侵的外來病原菌，並預防疾病發生(Cavallo F et al.,Vaccination for treatment and prevention of cancer in animal models.Adv Immunol.2006.90：175-213.Review)。雖然疫苗具有活化免疫系統的效果，但在臨床使用上常發現其對特定自身免疫系統太弱的族群，例如老人與小孩無法發揮其應有的效能，因此適量疫苗佐劑的添加有其必要性。再者，添加疫苗佐劑也具有提升免疫系統辨識抗原的效果，而藉由提升免疫反應可更有效的使用抗原，以減少疫苗劑量及接種次數。因此添加疫苗佐劑至疫苗除了可降低疫苗使用的成本外，也可增加疫苗的免疫效能。
佐劑的功能，通常可區分為兩大類。第一種為吸附抗原，協助抗原被細胞吞噬，如鋁鹽及M59乳化劑等(O'Hagan DT,Wack A,Podda A.MF59 is a safe and potent vaccine adjuvant for flu vaccines in humans：what did we learn during its development？ Clin Pharmacol Ther.2007 Dec；82(6)：740-4；4.Clapp T,Siebert P,Chen D,Jones Braun L.Vaccines with
aluminum-containing adjuvants：optimizing vaccine efficacy and thermal stability.J Pharm Sci.2011 Feb；100(2)：388-401)；另一種則是免疫調節因子，如弗氏佐劑含結合分枝桿菌(CFA-mycobacteria)等(Hoft DF,Blazevic A,Abate G,Hanekom WA,Kaplan G,Soler JH,Weichold F,Geiter L,Sadoff JC,Horwitz MA.A new recombinant bacille Calmette-Guérin vaccine safely induces significantly enhanced tuberculosis-specific immunity in human volunteers.J Infect Dis.2008 Nov 15；198(10)：1491-501)。疫苗佐劑的主要作用在加強抗原的免疫活性與免疫保護的效果，然而目前常用的鋁鹽佐劑已被證實對疫苗具有選擇性，因此亟需開發新穎的佐劑以提升疫苗的抗原專一性或抗腫瘤抗感染的能力。
本發明提供一種疫苗佐劑，包括：一牛樟芝子實體之多醣體，其中該多醣體的分子量大於100 K Da。
本發明也提供一種疫苗組成物，包括：前述之疫苗佐劑；以及一抗原或編碼出該抗原之DNA。
本發明還提供一種牛樟芝之子實體的多醣體用於製備一疫苗佐劑的用途，其中該多醣體的分子量大於100 K Da。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：
在本發明一實施態樣中，本發明提供一種疫苗佐劑，其包括一牛樟芝子實體之多醣體。
上述牛樟芝子實體之多醣體的分子量可為大於100K Da。例如，上述多醣體的分子量可為在2.0×105 Da至2.0×107 Da之間，但不限於此。又，在一實施例中，上述一牛樟芝子實體之多醣體可包括，但不限於分子量為約2.4×105~2.5×105 Da之部分、分子量為約2.4×106~2.5×106 Da之部分、分子量為約1.0×107~1.1×107 Da之部分與2.0×107~2.1×107 Da之部分。
上述分子量可為大於100K Da之牛樟芝子實體的多醣體，可藉由一萃取製程來獲得。在一實施例中，上述萃取製程可包括下述步驟，但不限於此。
首先，將牛樟芝之子實體的粉末加入水中以形成一混合物。
接著，對上述混合物進行一加熱回流步驟。在一實施例中，加熱回流之時間為約1-3小時。在另一實施例中，加熱回流之時間可為約1小時。
然後，在上述加熱回流步驟之後，從上述混合物將不溶物移除。在一實施例中，係藉由一過濾步驟來從上述混合物將不溶物移除。
在從上述混合物將不溶物移除之後，將乙醇加入上述混合物中以進行沈澱並獲得一沈澱物。在一實施例中，乙醇可包括95%乙醇。又在一實施例中，沈澱時間可為約8-24小時。
最後，將上述沈澱物進行一分離步驟以獲得上述沈澱物之分子量大於100 K Da的分劃(fraction)。在一實施例中，上述分離步驟係藉由一可分離出特定分子量之成分的裝置來進行，例如Amicon® Ultra Centrifugal Filter Device(UFC9 100 08：15 mL,100K NMWL,MILLPORE)，但不限於此。
在一實施例中，上述分子量可為大於100K之牛樟芝子實體的多醣體可分散於一水相溶液中，而上述水相溶液可與一乳化劑及一油脂均質乳化以形成本發明疫苗佐劑。
上述分子量可為大於100K Da之牛樟芝子實體的多醣體可具有活化樹狀細胞之能力。
又，上述分子量可為大於100K Da之牛樟芝子實體的多醣體可具有提升樹狀細胞表現主要組織相容性複合體第二型(major histocompatibility complex(MHC)class II)、CD40及/或CD86之能力。
此外，上述分子量可為大於100K Da之牛樟芝子實體的多醣體可具有促進樹狀細胞誘導抗原專一性T細胞活化之能力。
上述分子量可為大於100K Da之牛樟芝子實體的多醣體還可具有促進因樹狀細胞活化所引起之T細胞增生及/或Th1細胞激素干擾素表現之能力。
在一實施例中，本發明之疫苗佐劑可與一抗原混合以形成一疫苗組合物。適合之抗原的例子，可包括噬菌體、噬菌體成分、病毒、病毒成分、立克次體、立克次體成分、
放線菌、放線菌成分、細菌、細菌成分、真菌、真菌成分、原蟲、原蟲成分、腫瘤組織、腫瘤細胞、腫瘤細胞成分、腫瘤抗原蛋白與腫瘤抗原胜肽等，但不限於此。
在一實施例中，疫苗佐劑於上述疫苗組合物中的含量為約10-50 wt%。
此外，在一實施例中，本發明之佐劑可與一疫苗結合使用。上述疫苗可包括，但不限於一抗癌疫苗、一抗病毒疫苗或一抗菌疫苗。
在一實施例中，上述疫苗可為抗癌疫苗。於此實施例中，能以上述抗癌疫苗來抵抗之癌症可包括，但不限於膀胱癌、肝癌、白血病、結腸直腸癌、乳癌、腎臟癌、肺癌、胰臟癌、攝護腺癌、子宮頸癌或頭頸癌等。
再者，在一實施例中，上述抗癌疫苗可包括一DNA疫苗或樹狀細胞疫苗，但不限於此。
在本發明另一實施態樣中，本發明也提供一種疫苗組合物，其包括上述本發明之疫苗佐劑與一抗原或編碼出此抗原之DNA。在一實施例中，疫苗佐劑於上述疫苗組合物中的含量為約10-50 wt%。又在一實施例中，抗原於上述疫苗組合物中的含量為約50-90 wt%。
在一實施例中，於上述疫苗組合物中，包含於本發明疫苗佐劑中之牛樟芝子實體的多醣體之分子量大於100K Da，更具體地，上述牛樟芝子實體的多醣體的分子量為在2.0×105 Da至2.0×107 Da之間。
又，於上述疫苗組合物中，上述抗原可包括，但不限
於噬菌體、噬菌體成分、病毒、病毒成分、立克次體、立克次體成分、放線菌、放線菌成分、細菌、細菌成分、真菌、真菌成分、原蟲、原蟲成分、腫瘤組織、腫瘤細胞、腫瘤細胞成分、腫瘤抗原蛋白或腫瘤抗原胜肽等。
本發明之疫苗組合物的類型可包括抗癌疫苗組成物、一抗病毒疫苗組成物或一抗菌疫苗組成物，但不限於此。
在一實施例中，本發明之疫苗組合物為一抗癌疫苗組合物。上述抗癌疫苗組成物可用於抵抗膀胱癌、肝癌、白血病、結腸直腸癌、乳癌、腎臟癌、肺癌、胰臟癌、攝護腺癌、子宮頸癌或頭頸癌等，但不限於此。又，上述抗癌疫苗可包括，但不限於一DNA疫苗或樹狀細胞疫苗。
此外，在本發明又另一實施態樣中，本發明還提供一種牛樟芝之子實體的多醣體用於製備一疫苗佐劑的用途。上述牛樟芝之子實體的多醣體的分子量大於100 K Da，例如，上述多醣體的分子量可為在2.0×105 Da至2.0×107 Da之間，但不限於此。在一實施例中，上述牛樟芝之子實體的多醣體可包括，但不限於分子量為約2.4×105~2.5×105 Da之部分、分子量為約2.4×106~2.5×106 Da之部分、分子量為約1.0×107~1.1×107 Da之部分與2.0×107~2.1×107 Da之部分。
而上述分子量可為大於100K Da之牛樟芝子實體的多醣體，可藉由一萃取製程來獲得。在一實施例中，上述萃取製程可包括下述步驟，但不限於此。
首先，將牛樟芝之子實體的粉末加入水中以形成一混
合物。
接著，對上述混合物進行一加熱回流步驟。在一實施例中，加熱回流之時間為約1-3小時。在另一實施例中，加熱回流之時間可為約1小時。
在上述加熱回流步驟之後，從上述混合物將不溶物移除。在一實施例中，細藉由一過濾步驟來從上述混合物將不溶物移除。
在從上述混合物將不溶物移除之後，將乙醇加入上述混合物中以進行沈澱並獲得一沈澱物。在一實施例中，乙醇可包括95%乙醇。又在一實施例中，沈澱時間可為約8-24小時。
最後，將上述沈澱物進行一分離步驟以獲得上述沈澱物之分子量大於100 K Da的分劃。在一實施例中，上述分離步驟係藉由一可分離出特定分子量之成分的裝置來進行，例如Amicon® Ultra Centrifugal Filter Device(UFC9 100 08：15 mL,100K NMWL,MILLPORE)，但不限於此。
在一實施例中，上述疫苗佐劑可與一疫苗結合使用，而於此所述之疫苗可包括，但不限於一抗癌疫苗、一抗病毒疫苗或一抗菌疫苗。
在一實施例中，上述疫苗可為抗癌疫苗。於此實施例中，能以上述抗癌疫苗來抵抗之癌症可包括，但不限於膀胱癌、肝癌、白血病、結腸直腸癌、乳癌、腎臟癌、肺癌、胰臟癌、攝護腺癌、子宮頸癌或頭頸癌等。
再者，在一實施例中，上述抗癌疫苗可包括一DNA疫
苗或樹狀細胞疫苗，但不限於此。
1.本發明牛樟芝子實體多醣體的製備
A.牛樟芝子實體粗多醣體(ACFB01)樣品製備
首先從牛樟芝萃取出粗多醣體，萃取製程如第1A圖所示，其詳細製程如下所述。
(1)將600 g牛樟芝子實體粉碎後，加入2400 mL純水鐘並加熱迴流1小時(步驟S1)。
(2)趁熱利用濾紙減壓過濾以濾除不溶物(步驟S2)。
(3)對不溶物重複執行步驟(1)-(2)兩次，並將根據上述步驟所得三次濾液合併，共得6.254 kg濾液。
(4)將濾液緩慢(50 ml/分鐘)加入4倍量95%乙醇共25 Kg，以槳葉均勻攪拌(25 rpm/分鐘)混合(步驟S3)。
(5)於乙醇全數加完後將所得溶液靜置24小時。
(6)吸除上清液，底部含有沈澱部分利用離心(3000×g，15分鐘)將剩餘溶液去除。
(7)沈澱物置於減壓抽氣容器1小時，待乙醇揮發殆盡時利用冷凍乾燥將剩餘水分去除。
(8)收集冷凍乾燥產物共11.73 g，此產物為粗多醣。代號ACFB01。
B.牛樟芝多醣體(ACFB01>100 K)樣品製備
將上述之粗多醣ACFB01進行進一步分離製程，分離
製程如第1B圖所示，其詳細製程如下所述。
(1)將上述所得之粗多醣2.0 g加入10倍量的純水(20 g)中，加熱至90℃，1小時。
(2)離心(3000×g)15分鐘，以去除沈澱物。
(3)將上清液置於Amicon® Ultra Centrifugal Filter Device(UFC9 100 08：15 mL,100K NMWL,MILLPORE)的內管中，並離心(5000×g)15分鐘，之後分別收集內管及外管液體(步驟S4)。
(4)將內管液體再加入10 ml純水，均勻混合(vortex)後再重覆步驟(3)。
(5)重覆步驟(3)-(4)共3次，收集內管液體利用液態氮冷凍後進行冷凍乾燥，產物即為分子量大於100 K的多醣體分劃，並將此產物命名為ACFB01>100 K。
(6)收集步驟(5)的外管液體，利用不同型號(不同分子量劃分)之Amicon® Ultra Centrifugal Filter Device可進一步得到依不同分子量區分的多醣體。不同分子量之多醣體與其重量及其於粗多醣中之重量比如表1所示。
2. ACFB01>100K樣品所含多醣體之凝膠過濾層析圖譜(gel filtration chromatography profile)及其組成
利用高效液相層析儀(HPLC)結合多角度雷射光散射儀(multi angle laser light scatter)、UV及RI檢測器，來檢測ACFB01>100K樣品之分子量的分佈及不同分子量的重量比。檢測結果顯示出分別代表平均分子量為約2.4×105~2.5×105 Da、約2.4×106~2.5×106 Da、約1.0×107~1.1×107 Da與2.0×107~2.1×107 Da之4個區域(第2圖)，由此可知ACFB01>100K之分子量的分佈約為2.0×105~2.0×107 Da。四個區域於ACFB01>100K樣品中所占的重量比如表2所示。
3.牛樟芝子實體多醣體ACFB01活性評估
(1)ACFB01對樹狀細胞成熟的影響
目前已知TNF-α是樹狀細胞成熟的一個重要指標(Huang RY,Yu YL,Cheng WC,OuYang CN,Fu E,Chu CL.Immunosuppressive effect of quercetin on dendritic cell activation and function.J Immunol.2010 Jun 15；184(12)：6815-21.)。所以，於此以2.5-20μg/ml濃度的牛樟芝子實體粗多醣體ACFB01樣品來處理小鼠骨髓細胞以確認其是否具有樹狀細胞成熟的功效。
利用不同劑量之牛樟芝子實體粗多醣體ACFB01樣品處理小鼠骨髓分化的樹狀細胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)4小時後，收集各處理組別之細胞培養液進行ELISA實驗測試以測定各處理組別所分泌的TNF-α含量，並測定各處理組別之細胞的細胞存活率。結果顯示於第3圖中。於第3圖中之數值為各組每次試驗3個不同孔洞的平均值，在直方圖上標示有標準差。*與**代表相較於不處理之控制組具有顯著差異(*p<0.05；**p<0.01，學生氏t檢定(student t-test))。
結果發現，ACFB01具有刺激TNF-α分泌的效果，且有劑量相關性(第3圖)，而此結果代表ACFB01具有促使樹狀細胞成熟化之能力。此外，此結果也顯示此有效之劑量範圍，並不會造成樹狀細胞的存活率減少，反而有些許增加細胞數目(第3圖)。
(2)ACFB01樣品中之不同分子量的劃分對樹狀細胞成
熟的影響
進一步進行ACFB01的純化分離，運用分子量差異將多醣體區分成不同分劃部位，並進行小鼠骨髓樹狀細胞的測試。
以不同分子量之ACFB01樣品的劃分(20ug/ml)分別處理小鼠骨髓分化的樹狀細胞4小時後，收集各處理組別之細胞培養液進行ELISA實驗測試以測定各處理組別所分泌的TNF-α含量。結果顯示於第4圖中。第4圖中之數值為各組每次試驗3個不同孔洞的平均值，在直方圖上標示有標準差。*表示相較於牛樟芝子實體多醣體(ACFB01)處理組具有顯著差異(*p<0.05，學生氏t檢定)。結果顯示ACFB01具有活化樹狀細胞成熟的部分是大於100K的多醣部分。
4.牛樟芝子實體多醣體ACFB01>100K活性評估
(1)ACFB01>100K刺激小鼠骨髓細胞分泌細胞激素之能力
更進一步利用ELISA方式分析ACFB01>100K樣品刺激小鼠骨髓細胞分泌細胞激分泌細胞激素之能力。
利用不同劑量之ACFB01>100K樣品(0-20μg/ml)處理小鼠骨髓分化的樹狀細胞24小時後，收集各處理組別之細胞培養液進行ELISA實驗測試以測定各處理組別分泌IL-6及IL-12的程度。結果顯示於第5A與5B圖中。其數值為各組每次試驗3個不同孔洞的平均值，在直方圖上有
標示標準差。*表示比較於不處理之控制組(*p<0.05；**p<0.01，學生氏t檢定)。
結果顯示，牛樟芝子實體多醣體(ACFB01>100K)能增加IL-6及IL-12分泌表現，且具有劑量關係(分別參見第5A與5B圖)。而由於IL-12是活化Th1細胞之重要細胞激素，且Th1細胞已知是活化毒殺性CD8+ T細胞的主要細胞(Trinchieri G.Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity.Nat Rev Immunol.2003 Feb；3(2)：133-46.Review)，因此牛樟芝子實體多醣體(ACFB01>100K)應該同樣具有作為抗癌或抗感染疫苗佐劑之潛力。
(2)ACFB01>100K刺激小鼠骨髓細胞分泌趨化激素之能力
利用ELISA方式分析ACFB01>100K樣品刺激分泌趨化激素之能力。
利用不同劑量之ACFB01>100K樣品(0-20μg/ml)處理小鼠骨髓分化的樹狀細胞24小時後，收集各處理組別之細胞培養液進行ELISA實驗測試以測定各處理組別分泌MCP-1、MIP-1 α、RANTES的程度。結果顯示於第6A、6B與6C圖中。於第6A、6B與6C圖中之數值為各組每次試驗3個不同孔洞的平均值，在直方圖上有標示標準差。*與**代表相較於不處理之控制組具有顯著差異(*p<0.05；**p<0.01，學生氏t檢定)。
結果顯示，ACFB01>100K樣品同樣能刺激MCP-1、MIP-1α、RANTES等趨化激素的分泌，並具有劑量關係(第6A、6B與6C圖)。由此結果可以得知，ACFB01>100K樣品除了能促使樹狀細胞成熟外，還與樹狀細胞引發之發炎反應啟動、及引發後繼之免疫反應(adaptive immunity)皆有很大的關聯性。
(3)ACFB01>100K刺激小鼠骨髓樹狀細胞表現細胞表面輔助刺激因子之能力
利用流氏細胞儀來分析ACFB01>100K刺激小鼠骨髓樹狀細胞表現細胞表面輔助刺激因子之能力。
以ACFB01>100K樣品(20μg/ml)處理小鼠骨髓分化的樹狀細胞24小時後，收集細胞。之後利用專一性抗體將細胞染色並進行流氏細胞儀分析。結果顯示於第7A、7B與7C圖中。
於第7A、7B與7C圖中，灰色線代表利用同型對照(isotype control)抗體染色之背景值結果。黑色區塊線代表以ACFB01>100K樣品處理之實驗組別。平均值代表當次實驗所有細胞之平均螢光強度。%代表圈選(gate)範圍內之細胞數目佔總分析細胞數目中之比例。
結果顯示，ACFB01>100K多醣體(20ug/ml)同樣也能刺激表現CD40(第7A圖)、CD86(第7B圖)、MHC class II(第7C圖)等表面活化輔助因子。由此結果可明確得知ACFB01>100K多醣體確實能促使樹狀細胞活化T細胞。
(4)牛樟芝多醣體(ACFB01>100K)於in vitro對小鼠骨髓樹狀細胞誘導抗原專一性T細胞活化的影響
於in vitro測試經ACFB01>100K樣品處理之小鼠骨髓樹狀細胞促進抗原專一性T細胞活化的能力。
將樹狀細胞(1x106細胞/ml)以ACFB01>100K處理或不以ACFB01>100K處理1小時後，再給予OVA257-264胜肽(2ug/mL)刺激。於16個小時後，移除細胞培養基，並將上述樹狀細胞與從OT-I基因轉殖鼠取下的T細胞共同培養(樹狀細胞比T細胞比例為1：5；對照組為不給予T細胞)3天。於收取細胞培養基前18個小時，在細胞培養基中加入[3H]胸腺嘧啶(thymidine)。之後收取細胞並偵測[3H]的表現量以計算T細胞增生的情況(38.Lin CC,Yu YL,Shih CC,Liu KJ,Ou KL,Hong LZ,Chen JD,Chu CL.A novel adjuvant Ling Zhi-8 enhances the efficacy of DNA cancer vaccine by activating dendritic cells.Cancer Immunol Immunother.2011 Jul；60(7)：1019-27)，結果顯示於第8A圖中。同時也收集各組別之細胞培養液進行ELISA實驗測試以測定各組別之細胞培養基中干擾素-γ(Interferon-γ/IFN-γ)及IL-4的表現量。結果顯示於第8B圖中。於第8A與8B圖中之數值為各組每次試驗3個不同孔洞的平均值，在直方圖上標示有標準差。**表示相較於於不處理之控制組具有顯著差異(p<0.01)。上述實驗總共進行3次獨立的實驗，3次結果皆類似具有重複性。第8A與8B圖為其中一次的
代表數據。
由第8A圖可知，牛樟芝多醣體(ACFB01>100K)具有促使樹狀細胞活化OVA專一性T細胞增生之能力。又由第8B圖可知，牛樟芝多醣體(ACFB01>100K)主要是透過IFN-α(Th1 response)的路徑來使樹狀細胞活化抗原專一性T細胞。
(5)牛樟芝多醣體(ACFB01>100K)於in vivo對誘導抗原專一性T細胞活化的影響
於in vivo測試經ACFB01>100K樣品促進抗原專一性T細胞活化的能力。
將OT-I小鼠分成不經處理、單獨以OVA257-264胜肽施打小鼠腳掌、以OVA257-264胜肽混合ACFB01>100K樣品施打小鼠腳掌以及單獨以ACFB01>100K樣品施打小鼠腳掌四組，而每組有三隻小鼠。於處理10天後，將各組小鼠之大腿淋巴節細胞與從正常之C57BL/6小鼠骨髓分離之免疫樹狀細胞混合後，再以OVA胜肽刺激72小時。於收取細胞培養基前18個小時在細胞培養基中加入[3H]胸腺嘧啶。之後收取細胞偵測[3H]的表現量計算T細胞增生的情況。結果顯示於第9A圖中。同時也收集各組別之細胞培養液進行ELISA實驗測試以測定各組別之細胞培養基中干擾素-γ(Interferon-γ/IFN-γ)及IL-4的表現量。結果顯示於第9B圖中。第9A與9B之數值為各組每次試驗3個不同孔洞的平均值，在直方圖上標示有標準差。*表示相較於
於不處理之控制組具有顯著差異(*p<0.05，學生氏t檢定)。上述實驗總共進行3次獨立的實驗，3次結果皆類似具有重複性。第9A與9B圖為其中一次的代表數據。
結果顯示，牛樟芝多醣體(ACFB01>100K)確實具有in vivo促使樹狀細胞活化OVA專一性T細胞增生之能力，且其主要是透過Th1的路徑活化抗原專一性T細胞。
(6)牛樟芝多醣體(ACFB01>100K)合併HER-2/neu DNA疫苗對於腫瘤抑制的效果
已知HER-2/neu為原致癌基因，其可轉譯出185kDa的穿膜醣蛋白，且在臨床上證實許多的腫瘤內都有大量表現之現象且與藥物抗藥性有關，而為了評估合併牛樟芝多醣體(ACFB01>100K)與DNA疫苗之抗癌效能，以HER-2/neu DNA疫苗(以胞外區域之HER-2/neu(胺基酸1-650)當作攜帶抗原)做為本實驗中之DNA疫苗(Lin CC,Chou CW,Shiau AL,Tu CF,Ko TM,Chen YL,Yang BC,Tao MH,Lai MD.Therapeutic HER2/Neu DNA vaccine inhibits mouse tumor naturally overexpressing endogenous neu.Mol Ther.2004 Aug；10(2)：290-301)。
將經皮下注射MBT-2腫瘤細胞(HER-2/neu大量表現之膀胱癌細胞)的C3/HeN小鼠分成不經處理、單獨注射10μg之ACFB01>100K樣品、單獨注射HER-2/neu DNA疫苗、注射HER-2/neu DNA疫苗混合5μg之ACFB01>100K樣品以及注射HER-2/neu DNA疫苗混合10μg之
ACFB01>100K樣品五組。根據腫瘤生長大小及老鼠存活率評估各組老鼠的腫瘤抑制情況與壽命長短。由Kaplan-Meier分析存活率數據。結果顯示於第10A與10B圖中。*表示比較於控制組老鼠。**表示相較於施打Her-2/neu DNA疫苗組有顯著差異。此實驗總共進行2次獨立的實驗，每次實驗有4隻小鼠，2次結果皆類似具有重複性。
結果顯示，HER-2/neu DNA疫苗合併使用10μg牛樟芝多醣體(ACFB01>100K)施打比起單一HER-2/neu DNA疫苗之組別有明顯抑制MBT-2細胞生長及延長腫瘤小鼠存活率之效果。
(7)牛樟芝多醣體(ACFB01>100K)合併HER-2/neu DNA疫苗對於專一性T細胞的活化效果
將前述不經處理、單獨注射HER-2/neu DNA疫苗、注射HER-2/neu DNA疫苗混合5μg之ACFB01>100K樣品以及注射HER-2/neu DNA疫苗混合10μg之ACFB01>100K樣品之組別的經皮下注射MBT-2腫瘤細胞(HER-2/neu大量表現之膀胱癌細胞)的C3/HeN小鼠以流式細胞儀測定HER-2/neu專一性分泌IFN-γ之CD8陽性細胞於總CD8陽性細胞中之比例。結果顯示於第11A與11B圖中。(i)不經處理；(ii)單獨注射HER-2/neu DNA疫苗；(iii)注射HER-2/neu DNA疫苗混合5μg之ACFB01>100K樣品；與(iv)注射HER-2/neu DNA疫苗混合10μg之ACFB01>100K
樣品。此實驗總共進行2次獨立的實驗，2次結果皆類似具有重複性。
又將前述不經處理、單獨注射10μg之ACFB01>100K樣品、單獨注射HER-2/neu DNA疫苗、注射HER-2/neu DNA疫苗混合5μg之ACFB01>100K樣品以及注射HER-2/neu DNA疫苗混合10μg之ACFB01>100K樣品之組別的經皮下注射MBT-2腫瘤細胞(HER-2/neu大量表現之膀胱癌細胞)的C3/HeN小鼠之CD8陽性T細胞純化出來，之後將純化出之CD8陽性T細胞進行即時定量RNA分析以測定IFN-γ和IL-4的表現。結果顯示於第11C圖中。(i)不經處理；(ii)單獨注射10μg之ACFB01>100K樣品；(iii)單獨注射HER-2/neu DNA疫苗；(iv)注射HER-2/neu DNA疫苗混合5μg之ACFB01>100K樣品；以及(v)注射HER-2/neu DNA疫苗混合10μg之ACFB01>100K樣品。於第11B圖中之數值代表，在1 x 105個CD8陽性T細胞中，IFN-γ和IL-4介白素相對於控制組表現量的平均值，且直方圖中標示標準誤差值。*表示相較於空載體控制組具有顯著之差異(p<0.05，學生氏t檢定)。**表示相較於單獨施打HER-2/neu DNA疫苗組具有顯著差異(p<0.05)。
結果顯示，以牛樟芝多醣體合併HER-2/neu DNA疫苗，在MBT-2腫瘤小鼠比起單獨使用HER-2/neu DNA疫苗治療可增加較多具有抗癌能力的IFN-γ陽性CD8陽性T細胞(第11A與11B圖)，而骨髓樹狀細胞誘導抗原專一性T-細胞活化是經由IFN-γ所達成(第11C圖)。因此這
些研究結果證實ACFB01>100K多醣體的確具有潛力可開發成抗癌DNA疫苗之佐劑。
(8)牛樟芝多醣體(ACFB01>100K)合併肝癌細胞萃取物-pulsed DC疫苗對於原位性肝癌的腫瘤抑制效果
為評估牛樟芝子實體多醣體(ACFB01>100K)對於原位癌的抑制效果，將小鼠肝腫瘤細胞(ML-1腫瘤2x106)植入Balb/c小鼠肝臟，作為原位性肝腫瘤的動物模式(
Huang TT,Yen MC,Lin CC,Weng TY,Chen YL,Lin CM,Lai MD.Skin delivery of short hairpin RNA of indoleamine 2,3 dioxygenase induces antitumor immunity against orthotopic and metastatic liver cancer.Cancer Sci.2011 Dec；102(12)：2214-20)。
於肝腫瘤細胞植入小鼠5天後，將與腫瘤萃取物或腫瘤萃取物+ACFB01>100K樣品共培養72小時之BALB/C小鼠骨髓樹狀細胞再由皮下植入患有肝腫瘤之小鼠，並且分別在植入腫瘤細胞後之第28天及35天將小鼠犧牲取其肝臟觀察癌細胞生長之情形，每次實驗有2隻小鼠。結果顯示於第12圖中。箭號標示處為癌細胞。
結果顯示，多醣體(ACFB01>100K)合併ML-1腫瘤裂解物刺激的樹狀細胞疫苗比較起只有ML-1腫瘤裂解物刺激的樹狀細胞疫苗有明顯對抗腫瘤之能力(第12圖)。此結果再次驗證牛樟芝多醣體(ACFB>100K)可以提升樹狀細胞疫苗對抗原位性肝癌的功效，對於癌症樹狀細胞疫苗具有
佐劑的效果。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
101‧‧‧牛樟芝子實體
103‧‧‧水萃物
105‧‧‧沈澱物(ACFB01)
107‧‧‧溶液，非多醣
109‧‧‧分子量為5K Da之劃分
111‧‧‧分子量為5-10K Da之劃分
113‧‧‧分子量為10-30K Da之劃分
115‧‧‧分子量為30-50K Da之劃分
117‧‧‧分子量為50-100K Da之劃分
119‧‧‧分子量為大於100K Da之劃分
121‧‧‧水不溶物
S1‧‧‧加入水並進行回流
S2‧‧‧加入乙醇以進行沈澱
S3‧‧‧過濾離心，F 5000g，15分鐘
第1A圖顯示牛樟芝子實體粗多醣體(ACFB01)樣品的製備製程。
第1B圖顯示牛樟芝子實體多醣體(ACFB01>100K)樣品的製備製程。
第2圖顯示ACFB01>100K樣品之凝膠過濾層析圖譜。
第3圖顯示經不同劑量之牛樟芝子實體粗多醣體ACFB01處理小鼠骨髓分化的樹狀細胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)之分泌TNF-α的程度及細胞存活率。
第4圖顯示以不同分子量之ACFB01樣品的劃分(20ug/ml)分別處理小鼠骨髓分化的樹狀細胞之分泌TNF-α的程度。
第5A與5B圖分別顯示經不同劑量之ACFB01>100K樣品(0-20μg/ml)處理小鼠骨髓分化的樹狀細之分泌IL-6及IL-12的程度。
第6A、6B與6C圖分別顯不同劑量之ACFB01>100K樣品(0-20μg/ml)處理小鼠骨髓分化的樹狀細胞之分泌MCP-1、MIP-1 α、RANTES的程度。
第7A、7B與7C圖分別顯示經ACFB01>100K樣品(20μg/ml)處理之小鼠骨髓分化的樹狀細胞之CD40、CD86與MHC class II的表現情況。
第8A圖顯示in vitro ACFB01>100K樣品對T細胞增生的影響。
第8B圖顯示in vitro經ACFB01>100K樣品對干擾素-α(Interferon-α/IFN-α)及IL-4的表現量的影響。
第9A圖顯示in vivo ACFB01>100K樣品對T細胞增生的影響。
第9B圖顯示in vivo經ACFB01>100K樣品對干擾素-α(Interferon-α/IFN-α)及IL-4的表現量的影響。
第10A圖顯示HER-2/neu DNA疫苗結合ACFB01>100K樣品對經MBT-2腫瘤細胞(HER-2/neu大量表現之膀胱癌細胞)注射之C3/HeN小鼠的腫瘤的影響。
第10B圖顯示HER-2/neu DNA疫苗結合ACFB01>100K樣品對經MBT-2腫瘤細胞(HER-2/neu大量表現之膀胱癌細胞)注射之C3/HeN小鼠的壽命的影響。
第11A與11B圖顯示HER-2/neu DNA疫苗結合ACFB01>100K樣品對經MBT-2腫瘤細胞(HER-2/neu大量表現之膀胱癌細胞)注射之C3/HeN小鼠的T細胞活化的影響。
第11C圖顯示HER-2/neu DNA疫苗結合ACFB01>100K樣品對經MBT-2腫瘤細胞(HER-2/neu大量表現之膀胱癌細胞)注射之C3/HeN小鼠之IFN-γ和IL-4表現。
第12圖於ACFB01>100K樣品合併樹狀細胞疫苗的治療下，對於原位性肝腫瘤動物模式的腫瘤的影響。
Claims (15)
- 一種疫苗佐劑，包括：一牛樟芝子實體之多醣體，其中該多醣體的分子量大於100 K Da。
- 如申請專利範圍第1項所述之疫苗佐劑，其中該多醣體的分子量為在2.0×105 Da至2.0×107 Da之間。
- 如申請專利範圍第1項所述之疫苗佐劑，其中多醣體係經由一萃取製程所獲得，該萃取製程包括：(a)將牛樟芝之子實體的粉末加入水中以形成一混合物；(b)將該混合物加熱回流；(c)於步驟(b)之後，自該混合物移除不溶物；(d)於步驟(c)之後，將乙醇加入該混合物中以進行沈澱並獲得一沈澱物；以及(e)將該沈澱物進行一分離步驟以獲得該沈澱物之分子量大於100 K Da的分劃。
- 如申請專利範圍第1項所述之疫苗佐劑，其中該多醣體具有活化樹狀細胞之能力。
- 如申請專利範圍第1項所述之疫苗佐劑，其中該多醣體具有提升樹狀細胞表現主要組織相容性複合體第二型(major histocompatibility complex(MHC)class II)、CD40及/或CD86之能力。
- 如申請專利範圍第1項所述之疫苗佐劑，其中該多醣體具有促進樹狀細胞誘導抗原專一性T細胞活化之能力。
- 如申請專利範圍第1項所述之疫苗佐劑，其中該多醣體具有促進因樹狀細胞活化所引起之T細胞增生及/或Th1細胞激素干擾素表現之能力。
- 一種疫苗組成物，包括：如申請專利範圍第1項所述之疫苗佐劑；以及一抗原或編碼出該抗原之DNA。
- 如申請專利範圍第8項所述之疫苗組成物，其中該多醣體的分子量為在2.0×105 Da至2.0×107 Da之間。
- 如申請專利範圍第8項所述之疫苗組成物，其中該抗原包括噬菌體、噬菌體成分、病毒、病毒成分、立克次體、立克次體成分、放線菌、放線菌成分、細菌、細菌成分、真菌、真菌成分、原蟲、原蟲成分、腫瘤組織、腫瘤細胞、腫瘤細胞成分、腫瘤抗原蛋白或腫瘤抗原胜肽。
- 如申請專利範圍第8項所述之疫苗組成物，其中該疫苗組成物包括一抗癌疫苗組成物、一抗病毒疫苗組成物或一抗菌疫苗組成物。
- 如申請專利範圍第11項所述之疫苗組成物，其中該抗癌疫苗係用於抵抗膀胱癌、肝癌、白血病、結腸直腸癌、乳癌、腎臟癌、肺癌、胰臟癌、攝護腺癌、子宮頸癌或頭頸癌。
- 如申請專利範圍第11項所述之疫苗組成物，其中該抗癌疫苗包括一DNA疫苗或樹狀細胞疫苗。
- 一種牛樟芝子實體之多醣體用於製備一疫苗佐劑的用途，其中該多醣體的分子量大於100 K Da。
- 如申請專利範圍第14項所述之牛樟芝之子實體的多醣體用於製備一疫苗佐劑的用途，其中該其中該多醣體的分子量為在2.0×105 Da至2.0×107 Da之間。
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