TWI667253B - 重組多肽、核酸分子及其組合物以及製造、使用之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種重組多肽、包含該重組多肽之同型二聚體和異型二聚體蛋白、編碼該重組多肽之核酸分子，以及包含該核酸分子的載體及宿主細胞。本發明也提供包含該重組多肽之組合物，以及製備該重組多肽的方法。

Description

重組多肽、核酸分子及其組合物以及製造、使用之方法
本發明係關於一種重組多肽、核酸分子及其組合物以及製造、使用之方法，尤其是指一種具有誘發鹼性磷酸酶活性能力之重組多肽、核酸分子及其組合物以及製造、使用之方法。
骨是一種高度剛性的組織，具有獨特機械性質構成脊椎骨骼的一部分，該獨特機械性質是衍生自其廣泛的基質結構。動物終其一生中，骨組織會不斷地更新。
骨生成及更新的過程由個別特化的細胞進行。成骨作用(osteogenesis，骨生成或骨成長)是由成骨細胞(osteoblasts，骨生成細胞)進行。骨再成型作用(Bone remodeling)是由稱為破骨細胞(osteoclasts)的骨吸收細胞與骨生成的成骨細胞間相互作用所完成。由於這些過程是由特定的活細胞進行，所以化學(例如：藥物和/或激素)、物理及物理化學的變化可影響骨組織的品質、數量及形狀。
各種生長因子(例如：PDGF)及細胞介質會參與骨生成的過程。因此，辨識出可在預定位點誘發骨生成的生理可接受的化學介質(例如：激素、藥物、生長因子及細胞介質)是相當有價值的。然而，為了成功地將化學介質作為治療工具，需克服幾個障礙。障礙之一包括開發具有骨誘發(osteoinductive)活性的重組多肽。例如：重組人類血小板衍生的生長因子-BB中的骨誘發活性尚未得到證實。另一障礙是在化學介質中骨誘發的變異性。例如：去礦物質骨基質(demineralized bone matrix，DBM)是一種化學介質，是一種衍生自加工骨的骨誘發同種異體移植物。市場上以DBM為基礎的產品越來越多，但是在不同產品及同一產品不同批號之間已發現骨誘發的變異性。因此，需要一種化學介質展現一致的骨誘發活性，例如：重組多肽及相關組合物。
本發明揭示一種重組多肽，其包含：一第一域(domain)，其係選自由SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：39所組成之群組；一第二域，其係選自由SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49所組成之群組；及一第三域，其係選自由SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：61所組成之群組；其中該第二域包含一個分子內雙硫鍵(intramolecular disulfide bond)。
本發明也揭示一種重組多肽，其包含：一第一域，其係選自由SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：39所組成之群組；一第二域，其係選自由SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49所組成之群；及一第三域，其係選自由SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：61組成之群；其中該第二域包含在該第二域的第23個胺基酸和該第二域的第27個胺基酸之間之一個分子內雙硫鍵。
於一實施態樣中，該重組多肽係具誘發鹼性磷酸酶活性之能力。
於一實施態樣中，該重組多肽的該第三域包含：一第一胺基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO：356)和一第二胺基酸序列GCGCR(SEQ ID NO：357)，且其中該第三域包含在該第一和該第二胺基酸序列之間之二個分子內雙硫鍵。
於一實施態樣中，該重組多肽包含：在該第一胺基酸序列的該第4個胺基酸和該第二胺基酸序列的該第2個胺基酸之間之一第一分子內雙硫鍵，且在該第一胺基酸序列的該第5個胺基酸和該第二胺基酸序列的該第4個胺基酸之間之一第二分子內雙硫鍵。
於一實施態樣中，該重組多肽包含：在該第一胺基酸序列的該第5個胺基酸和該第二胺基酸序列的該第2個胺基酸之間之一第一分子內雙硫鍵，且在該第一胺基酸序列的該第4個胺基酸和該第二胺基酸序列的該第4個胺基酸之間之一第二分子內雙硫鍵。
本發明也揭示一種同型二聚體蛋白，其包含任一如上所述之重組多肽之二個相同的重組多肽，其中該同型二聚體蛋白包含在該二個重組多肽的該些第一域之間之一個分子間雙硫鍵。
於一實施態樣中，該同型二聚體蛋白的該兩相同重組多肽之單一或全部二個之該第二域包含一個分子內雙硫鍵。
於一實施態樣中，該同型二聚體蛋白的每一該重組多肽的該第三域包含：一第一胺基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO：356)和一第二胺基酸序列GCGCR(SEQ ID NO：357)，且其中該同型二聚體蛋白包含：在該兩個之其一重組多肽的該第三域中之該第一胺基酸序列和該另一重組多肽的該第三域中之該第二胺基酸序列之間之二個分子間雙硫鍵。於一實施 態樣中，該同型二聚體蛋白包含：在該兩個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之該第4個胺基酸和該另一重組多肽的該第二胺基酸序列之該第2個胺基酸之間之一第一分子間雙硫鍵，以及在該兩個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之該第5個胺基酸和該另一重組多肽的該第二胺基酸序列之該第4個胺基酸之間之一第二分子間雙硫鍵。於一實施態樣中，該同型二聚體蛋白包含：在該兩個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之該第5個胺基酸和該另一重組多肽的該第二胺基酸序列之該第2個胺基酸之間之一第一分子間雙硫鍵，以及在該兩個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之該第4個胺基酸和該另一重組多肽的該第二胺基酸序列之該第4個胺基酸之間之一第二分子間雙硫鍵。
於一實施態樣中，該同型二聚體蛋白的每一該重組多肽的該第三域包含：一第一胺基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO：356)和一第二胺基酸序列GCGCR(SEQ ID NO：357)，且其中該同型二聚體蛋白包含：在該兩個之其一重組多肽的該第三域中之該第一胺基酸序列和該其一重組多肽的該第三域中之該第二胺基酸序列之間之二個分子內雙硫鍵。於一實施態樣中，該同型二聚體蛋白包含：在該兩個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之該第4個胺基酸和該其一重組多肽的該第二胺基酸序列之該第2個胺基酸之間之一第一分子內雙硫鍵，以及在該兩個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之該第5個胺基酸和該其一重組多肽的該第二胺基酸序列之該第4個胺基酸之間之一第二分子內雙硫鍵。於一實施態樣中，該同型二聚體蛋白包含：在該兩個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之第5個胺基酸和該其一重組多肽的該第二胺基酸序列之該第2個胺基酸之間之一第一分 子內雙硫鍵，以及在該兩個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之該第4個胺基酸和該其一重組多肽的該第二胺基酸序列之該第4個胺基酸之間之一第二分子內雙硫鍵。
本發明也揭示一種異型二聚體蛋白，其包含任一如上所述之重組多肽之二個相異的重組多肽，其中該異型二聚體蛋白包含：在該二個相異重組多肽的該些第一域之間之一個分子間雙硫鍵。
於一實施態樣中，該異型二聚體蛋白的該一或二個不同的該兩相異重組多肽之單一或全部二個之該第二域包含一分子內雙硫鍵。
本發明也揭示一種重組多肽，其包含一第一域(domain)，其係選自由SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：39所組成之群組；一第二域，其係選自由SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49所組成之群組；及一第三域，其係選自由SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：61所組成之群組；其中該重組多肽包含一胺基酸序列，該胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340及SEQ ID NO：348組成之群組。
本發明也揭示一種重組多肽，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340和SEQ ID NO：348所組成之群組，其中該重組多肽包含在半胱胺酸44和半胱胺酸48之間之一個分子內雙硫鍵。
於一實施態樣中，該重組多肽包含：在半胱胺酸79和半胱胺酸112之間之一個分子內雙硫鍵，及在半胱胺酸80和半胱胺酸114之間之一個分子內雙硫鍵。
於一實施態樣中，該重組多肽包含：在半胱胺酸80和半胱胺酸112之間之一個分子內雙硫鍵，及在半胱胺酸79和半胱胺酸114之間之一個分子內雙硫鍵。
本發明也揭示一種同型二聚體蛋白，其包含任一如上所述之重組多肽之二個相同的重組多肽。
於一實施態樣中，該同型二聚體蛋白包含在該兩個之其一重組多肽的半胱胺酸15和該另一重組多肽的半胱胺酸15之間之一個分子間雙硫鍵。於一實施態樣中，該同型二聚體蛋白包含：(a)在該兩個之其一重組多肽的半胱胺酸79和該另一重組多肽的半胱胺酸112之間之一個分子間雙硫鍵，及在該兩個之其一重組多肽的半胱胺酸80和該另一重組多肽的半胱胺酸114之間之一個分子間雙硫鍵；或(b)在該兩個之其一重組多肽的半胱胺酸80和該另一重組多肽的半胱胺酸112之間之一個分子間雙硫鍵，及在該兩個之其一重組多肽的半胱胺酸79和該另一重組多肽的半胱胺酸114之間之一個分子間雙硫鍵。
本發明也揭示一種經分離之核酸分子，其包含一編碼如上所述之任一重組多肽之多核苷酸序列。
本發明也揭示一種重組核酸分子，其包含一表達控制區，可操作地連結至如上所述之經分離之核酸分子。
本發明也揭示一種經分離之宿主細胞，其包含如上所述之經 分離之核酸分子或如上所述之重組核酸分子。
本發明也揭示一種製備一重組載體之方法，其包含將如上所述之經分離之核酸分子插入一載體內。
本發明也揭示一種製備一重組宿主細胞之方法，其包含將如上所述之經分離之核酸分子或如上所述之重組核酸分子導入至一宿主細胞內。
本發明也提供一種製造一重組多肽之方法，其包含：培養如上所述之經分離之宿主細胞，以及分離該重組多肽。
本發明也提供一種組合物，其包含任一如上所述之重組多肽、任一如上所述之同型二聚體蛋白或任一如上所述之異型二聚體蛋白。
圖1A和1B所示為實驗組A-G之母兔(NZW品系)尺骨的代表性X光影像。每個實驗組中的尺骨包含一外科手術創造的20mm大之圓周缺陷(即缺損部位)。對於A-F組，在該缺損部位中置入移植物。A-E組每個尺骨接受一200mg的β-TCP植入物，A、B、C和D中的該β-TCP係分別作為重組多肽(即SEQ ID NO：260)的2、6、20和60μg載體。E組中該β-TCP不攜帶任何重組多肽。F組接受一髂骨碎片自體移植物。G組在該缺損部位未接受任何移植物。對A-G各組於0週(即手術後立即攝影，以「0W」表示)時，以及在手術後2、4、6及8週(即分別以「2W」、「4W」、「6W」及「8W」表示)時拍攝X光影像。該尺骨上的植入部位(A-F組)或缺損部位(G組)位於每個影像中白色星號的正上方。
圖2A及2B所示為實驗組A-G之代表性電腦斷層掃描(CT)影 像。該植入部位(A-F組)或缺損部位(G組)的中心隨著時間的橫斷面影像變化顯示為0週(即手術後立即攝影，以「0W」表示)，以及手術後4週及8週(即分別以「4W」和「8W」表示)。A-G組如上述圖1所述。
圖3所示為未經手術改造無缺損的尺骨及實驗A-G組(即分別以「A」至「G」表示)的抗扭強度測試結果圖示。最大扭矩為牛頓-公尺(Newton-meters)以「N-m」表示。A-G組如上述圖1部分所述。
本發明提供重組多肽、包含該重組多肽之同型二聚體和異型二聚體蛋白、編碼該重組多肽之核酸分子及載體，及表達該重組多肽的宿主細胞。本發明也提供該重組多肽之組合物及製造該重組多肽的方法。
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[專門用語]
除非另有定義，本文中所有技術和科學用語與本發明所屬領域中具有通常知識者所理解的含義相同。如在本申請中所使用的，以下術語具有如下意涵。
除非上下文中另有指定外，本文及申請專利範圍所述單數格式之「一」、「一個」、「一種」及「該」包含複數指涉。因此，例如：「一域」係包含一個域或複數個域、「該重組多肽」包含一個或多個重組多肽，諸如此類。本文中之用語例如：「一」、「該」、「一或多」、「複數」及「至少為一」可互相代換。
除非另有說明，本文所述之「或」表示「和/或」之意。相似地，本文所述之「包含」、「包括」、「含有」、「囊括」、「具有」也可互相代換而不受限制。
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應當理解，本文用語「包含」無論在描述任何方面的情況下，也提供相似用語「由...組成」和/或「基本上由...組成」所描述之意含。
「胺基酸」是一種具有一與氫原子連結的中心碳原子(α-碳原子)、一羧酸基(該碳原子在本文中稱為「羧酸碳原子」)、一胺基(該氮原子在本文中稱為「胺基氮原子」)以及一側鏈R基團之結構的分子。當併入肽、多肽或蛋白質時，胺基酸會在脫水反應中失去其胺基酸羧酸基上的一或多個原子將一個胺基酸與另一個胺基酸連結。因此，當併入蛋白質時，將胺基酸稱為「胺基酸殘基」。
「蛋白質」或「多肽」係指藉由肽鍵連結二或多個單個胺基酸的任何聚合物(無論是否為自然發生)，並且發生當與一胺基酸(或胺基酸殘基)上之α-碳原子鍵結的羧酸基上之羧酸碳原子對於與一鄰近胺基酸上非α-碳原子鍵結的胺基之胺基氮原子變為共價鍵。所述之「蛋白質」係包含「多肽」和「肽」之意涵(內文用語會互相代換)。除此之外，蛋白質包含多個多 肽次單元(如：DNA聚合酶III、RNA聚合酶II)或其他組成物(如：RNA分子、也會在端粒酶中發生)在本文中也被理解為「蛋白質」之意。相似地，蛋白質和多肽的碎片也在本文揭示涉及的「蛋白質」範疇。一方面，本文揭示之多肽包含二或多個親代肽段的嵌合體。用語「多肽」也涉及和包含多肽轉譯後修飾(Post-translation modification,PTM)的產物，包含但不限於雙硫鍵生成、醣化、胺甲醯化、脂化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、已知的保護/阻斷基團衍生、分解蛋白切割、被非天然胺基酸修飾、或任何其他調控或修飾，例如與標記組合物接合。多肽可衍生自天然生物源或藉由基因重組科技產生。其不需從特定核酸序列轉譯，亦可經由任何方法包括化學合成之方式生成。「經分離」的多肽或片段、變體或衍生物是指不在其天然環境中的多肽。不需要特定程度的純化。例如：經分離多肽可以是簡單的從其天生或天然環境移除。為了本公開之用，在宿主細胞中表達的重組製造多肽及蛋白質被認為是經過分離的，視同天然或重組多肽已經被經由任何適當技術分離、分級、部分或大體上的純化。
本文所述之「域」可被用語「肽段」代換，其係涉及蛋白質或者是較大的多肽或蛋白質的碎片。域不需具有本身的機能活性，在一些例子中，域可具有其自身的生物活性。
一給定蛋白質的特定胺基酸序列(即當從胺基末端到羧酸基末端寫入時該多肽的「主要結構」)係由mRNA編碼部分的核苷酸序列所確定，其是依次由遺傳訊息來指明，通常是基因體DNA(包括胞器DNA如粒線體或葉綠體DNA)。因此，確定基因的序列有助於預測對應多肽的主要序列，更具體而言是經由該基因或多核苷酸序列的編碼預測多肽或蛋白質之 作用或活性。
本文所述之「N端」是指多肽中相對於多肽上胺基末端的胺基酸、域或肽段的方位或位置。例如：「A域位於B和C域的N端」意指A域是位於相較於B和C域更靠近胺基末端的位置，如此，當B和C域的位置未特別指定時，該多肽從胺基末端的域排列順序則可理解為A-B-C或A-C-B。此外，包含零的任何數量胺基酸可存在於N端之域到另一域之間。相似地，包含零的任何數量胺基酸可存在於多肽之N端及一域其是多肽中其它域N端兩者之間。
本文所述之「C端」是指多肽中相對於多肽上羧酸基末端的胺基酸、域或肽段的方位或位置。例如：「A域位於B和C域的C端」意指A域是位於相較於B和C域更靠近羧酸基末端的位置，如此，當B域和C域的位置未特別指定時，該多肽從胺基末端的域排列順序可理解為B-C-A或C-B-A。此外，包含零的任何數量胺基酸可存在於C端之域到另一域之間。相似地，包含零的任何數量胺基酸可存在於多肽之C端及一域其是多肽中其它域C端兩者之間。
當指二或多個域廣義地涉及重組多肽形成中以任何化學或物理方法將該二或多個域結合(coupling)時，用語「融合」、「操作性連結」及「操作性結合」在本文中可互相代換。於一實施態樣中，本文所揭示之重組多肽係一嵌合體多肽其包含來自二或多個相異多肽的複數個域。
包含本文所揭示之二或多個域的重組多肽可以由包含編碼每個域的多核苷酸序列的單個編碼序列所編碼。除非另有說明，編碼每個域的多核苷酸序列為「in frame(框架內)」，如此包含該多核苷酸序列之單一 mRNA的轉譯會使單一多肽包含每個域。一般而言，本文所述重組多肽中的域會直接彼此融合或被肽連結子(peptide linker)所連結。編碼肽連結子的各種多核苷酸序列是本領域已知的。
本文所述之「多核苷酸」或「核酸」是指聚合形式的核苷酸。在一些情況下，多核苷酸包含一序列，該序列要不是非直接緊鄰編碼序列就是直接緊鄰(在5’終端或3’終端上)，其是從有機體天然存在之基因體中所衍生的編碼序列。因此，該用語包含例如：被併入載體中之重組DNA、被併入自主複製的質體或病毒中之重組DNA或被併入原核或真核的基因體中之重組DNA，或者是獨立於其他序列如同分離分子(如cDNA)般存在的重組DNA。本文所述的核苷酸可以係核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或該核苷酸之一的修飾型。本文所述的多核苷酸尤其是指單股及雙股DNA、單股及雙股區域的混合DNA、單股及雙股RNA、單股及雙股區域的混合RNA或包含DNA和RNA的雜交分子，雜交分子中含有的DNA及RNA可以是單股、更為典型的雙股或單、雙股區域混合。多核苷酸包含基因體DNA或RNA(取決於生物體，即病毒的RNA基因體)及被該基因體DNA編碼的mRNA，以及cDNA。於某些實施態樣中，多核苷酸包含傳統磷酸二酯鍵或非傳統鍵(如：醯胺鍵，在肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)中發現)。「經分離」核酸或多核苷酸是指從其天然環境中移出的核酸分子如：DNA或RNA。例如為了本公開之用，核酸分子包含多核苷酸編碼載體中含有之重組多肽被認為是「經分離」。經分離的多核苷酸之其他示例包括維持在異源宿主細胞中的重組多核苷酸或在溶液中從其他多核苷酸純化(一部分或大部分上)的重組多核苷酸。經分離的RNA分子包含本發明揭示之多核苷酸的體內(in vivo)或體外(in vitro)RNA轉錄物。根據本發明揭示之經分離之多核苷酸或核酸進一步包括合成產生的多核苷酸和核酸(如：核酸分子)。
本文所述之「編碼區」或「編碼序列」是多核苷酸的一部分，其由可轉譯成胺基酸的密碼子組成。儘管「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)一般不會被轉譯成胺基酸，但其可被認為是編碼區的一部分，但任何毗鄰序列如：啟動子、核糖體結合位、轉錄終止子、內含子等並非編碼區的一部分。編碼區的邊界通常由所得多肽的編碼胺基末端即位於5’端的起始密碼子，及所得多肽編碼羧酸基末端即位於3’端的轉譯終止密碼子所決定，但本發明不限於此。
本文所述之「表達控制區」是指轉錄控制單元，其可操作地與編碼區結合，以引導或控制由編碼區編碼的產物表達，包括如：啟動子、強化子、操縱子、抑制子、核糖體結合位、轉譯前導序列、內含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位、效應子結合位、莖環結構及轉錄終止訊號。例如：若啟動子功能的誘導導致包含編碼產物的編碼區之mRNA轉錄，則編碼區和啟動子是「可操作地結合」，且如果啟動子和編碼區間的連接性質並非干擾啟動子引導由編碼區編碼的產物表達的能力，或是干擾DNA模板被轉錄的能力。表達控制區包含位於編碼區上游(5’非編碼序列)內部或下游(3’非編碼序列)的核苷酸序列，其會影響相關聯編碼區的轉錄、RNA加工、穩定性或轉譯。如果編碼區用於真核細胞中的表達，多腺苷酸化訊號及轉錄終止序列通常位於編碼序列3’端。
「核苷酸片段」、「寡核苷酸片段」或「多核苷酸片段」是指一較大多核苷酸分子的一部分。多核苷酸片段不需對應至蛋白質的經編碼 的功能域，然而在某些情況下，該片段將編碼蛋白質的功能域。多核苷酸片段的長度可為大約6個或更多的核苷酸(例如：6-20、20-50、50-100、100-200、200-300、300-400個或更多核苷酸的長度)。
本文所述之「載體」是指將核苷酸分子轉殖和/或轉移到宿主細胞中的任何媒介物。用語「載體」包括包括病毒及非病毒載體，用以導入核酸至一體外、離體或體內細胞中(如質體、噬菌體、黏接質體、病毒)。
本文所述之「宿主細胞」及「細胞」用語可相互代換，其是指任何類型攜帶或能夠攜帶核酸分子(如：重組核酸分子)的細胞或細胞群體，如：初級細胞、培養系統中的細胞或來自細胞株的細胞。宿主細胞可以是原核細胞或是真核細胞，例如：真菌細胞如酵母菌細胞、各種動物細胞如昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
本文所述之「培養(Culture、to culture、culturing)」是指允許細胞生長、分裂或維持細胞處於存活狀態之體外條件下孵育細胞。「經培養細胞」是指經體外繁殖之細胞。
本文所述之「骨誘發性(Osteoinductive)」是指可誘導骨和/或軟骨之形成或生長，包括例如：誘發與骨和/或軟骨生成或生長相關的標記(如：誘發鹼性磷酸酶活性)。
本文所述之「酵母雙雜交試驗」或「酵母雙雜交系統」用語可被相互代換，其是指用以檢測蛋白質對之間的交互作用之試驗或系統。在典型的雙雜交篩選試驗/系統中，轉錄因子分裂為兩個獨立的片段分別為結合域(binding domain，BD)和活化域(activation domain，AD)，該些片段各別提供於獨立的質體上，且該些片段各別與感興趣的蛋白質融合。該酵母 雙雜交試驗系統包含(1)一「誘餌」載體，其包括一誘餌蛋白質及系統中所用該轉錄因子之結合域；(2)一「獵物」載體，其包括一獵物蛋白質(或一裂物蛋白質資料庫被篩選用以與該誘餌蛋白質進行交互作用)及該轉錄因子之活化域；及(3)一合適的報導酵母菌株，其含有結合序列用以於系統中使用該轉錄因子之該結合域。當誘餌-獵物發生交互作用時，該轉錄因子的該活化域驅動一或多種報導蛋白質的表達。將該誘餌和該獵物載體導入該報導酵母菌株，其中經表達的誘餌和獵物蛋白質可能相互作用。或者，可將各自含有誘餌載體或獵物載體的獨立單倍體酵母菌株配對，而所得到的二倍體酵母菌株表達兩種蛋白質。相互作用的誘餌及獵物蛋白質對會導致該轉錄因子的重組和活化，然後結合於該報導酵母菌株中所提供與其相容的活化域，依次觸發該報導基因的表達，接著被偵測。
[重組多肽及組合物]
本文之揭示係關於一種重組多肽，包含任二個或多個選自由SEQ ID NO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77及355所組成之群組之域，包含但不限於如表3所示二個域的任何組合。於一實施態樣中，重組多肽包含任三個域，包含但不限於如表3所示三個域的任何組合。
本文所述之重組多肽的任一域可位於相對該重組多肽的胺基末端或羧酸基末端之任何位置。例如：本文所述之重組多肽的任一域可位於該重組多肽中任一個或多個其他域的N端。相似地，本文所述之重組多肽的任一域可位於該重組多肽中任一個或多個其他域的C端。
本文揭示一種重組多肽包含任二個或多個選自由SEQ ID NO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77及355所組成之群組之域，其具有相較於在該重組多肽中任何個別域更高的活化素受體IIB蛋白質(即ActRIIBecd)細胞外域的親和力。已知ActRIIBecd的核酸序列及多肽序列，以及天然存在的變異，例如：ActRIIBecd可為本文所述之SEQ ID NO：9，其對應本文所述之SEQ ID NO：8的27-117殘基。親和力可藉由如：放射性免疫測定法(RIA)、表面電漿子共振(如：BIAcoreTM)或本領域已知的任何其他結合分析來測量。於一些實施態樣中，此般重組多肽包含二個域的組合，該域的組合選自如下：SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：47，其中該二個域中的任一個是位於另一域的N端或C端。於一些實施態樣中，此般二個域的組合產生一包含選自由如後所述序列之群組所組成的重組多肽：SEQ ID NO：188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248及254。於一些實施態樣中，此般重組多肽包含三個域的組合，該域的組合選自如下：SEQ ID NO：39、49及61；SEQ ID NO：35、47及57；SEQ ID NO：39、47及61；SEQ ID NO：35、49及57；SEQ ID NO：39、57及47；SEQ ID NO：35、61及49，其中任一域是位於另一或另二個域的N端或C端。於一些實施態樣中，此般三個域的組合產生一包含選自如後所述序列之群組所組成的重組多肽：SEQ ID NO：260、268、276、284、292、300、308、316、324、332、340及348。
本文揭示一種重組多肽包含一SEQ ID NO：39的第一域、一 SEQ ID NO：49的第二域及一SEQ ID NO：61的第三域，其中該第一域係位於該第二域之C端，該第三域位於該第二域之N端，或其組合。於某些實施態樣中，該重組多肽包含第一域係選自由SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：39所組成之群組、第二域係選自由SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49所組成之群組、第三域係選自由SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：61所組成之群組，其中該第一域係位於該第二域之C端，該第三域係位於該第二域之N端，或當該第一、第二及第三域分別為SEQ ID NO：39、49及61時其之組合。
於某些實施態樣中，本文所述之重組多肽包含一轉譯後修飾(PTM)，包含但不限於雙硫鍵形成、醣苷化、胺甲醯化、脂化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、已知的保護/阻斷基團衍生、分解蛋白切割、藉由非天然存在胺基酸修飾，或任何其他操作或修飾，例如：與標記成分接合。
於某些實施態樣中，重組多肽可包含一或多個半胱胺酸，其在生理條件下或任何其他標準條件(純化條件或儲存條件)下能夠參與一或多個雙硫鍵的生成。於某些實施態樣中，雙硫鍵是在重組多肽中之兩個半光胺酸殘基間所形成的分子內雙硫鍵。於某些實施態樣中，雙硫鍵是在二聚體中兩個重組多肽之間形成的分子間雙硫鍵。在某些實施態樣中，分子間雙硫鍵是在如本文所述之兩個相同重組多肽之間所形成，其中該兩個相同的重組多肽形成一同型二聚體。於某些實施態樣中，同型二聚體包括至少一個或多於三個分子間雙硫鍵。於某些實施態樣中，分子間雙硫鍵是在如本文所述之兩個相異重組多肽之間所形成，其中該兩個相異重組多肽形成一異型二聚體。在某些實施態樣中，異型二聚體包括至少一個或多於三個分子間雙硫鍵。
本文揭示一種重組多肽包含一第一域，其係選自由SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：39所組成之群組；一第二域，其係選自由SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49所組成之群組；以及一第三域，其係選自由SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：61所組成之群組；其中該重組多肽包含一個分子內雙硫鍵。
於某些實施態樣中，該第一域、該第二域、該第三域或其組合包含一個分子內雙硫鍵。於某些實施態樣中，一個或多個分子內雙硫鍵位於單一域之內、一域和另一域之間、具有多於兩個半胱胺酸的一個域和一個或多個另一域之間或其組合。於某些實施態樣中，該第一域包含一個雙硫鍵。於某些實施態樣中，該第二域包含一個雙硫鍵。於某些實施態樣中，該第三域包含一個雙硫鍵。於某些實施態樣中，每一個域包含一個雙硫鍵。本文所述之「域包含一個雙硫鍵」當涉及分子內雙硫鍵時，如果在一個域中存在多於一個半胱胺酸則是指單一域中兩個半胱胺酸之間的雙硫鍵，或是在兩個之其中一域中的半胱胺酸和另一域中的半胱胺酸之間。
於某些實施態樣中，如本文所述之重組多肽的該第二域包含在該第二域的第23個胺基酸和該第二域的第27個胺基酸之間之一個分子內雙硫鍵。於某些實施態樣中，該重組多肽在該第一域和該第三域之間、該第三域內或兩者皆是，進一步包含一個或多個附加的分子內雙硫鍵。於某些實施態樣中，該重組多肽在該第三域的第9個胺基酸和該第三域的第43胺基酸之間、在該第三域的第8胺基酸和該第三域的第41胺基酸之間、在該第三域的第8胺基酸和該第三域的第43胺基酸之間或在該第三域的第9胺基酸和該第三域的第41個胺基酸之間，進一步包含一個分子內雙硫鍵。於某些實施態樣中，該重組多肽在該第三域的第9胺基酸和該第三域的第43的胺基 酸之間進一步包含一個雙硫鍵，以及在該第三域的第8胺基酸和該第三域的第41胺基酸之間包含一個雙硫鍵。於某些實施態樣中，該重組多肽在該第三域的第8胺基酸和該第三域的第43的胺基酸之間進一步包含一個雙硫鍵，以及在該第三域的第9胺基酸和該第三域的第41胺基酸之間包含一個雙硫鍵。
於某些實施態樣中，如本文所述之重組多肽的該第三域包含一第一胺基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO：356)和一第二胺基酸序列GCGCR(SEQ ID NO：357)，且其中該第三域在該第一和第二胺基酸序列之間包含兩個分子內雙硫鍵或兩個分子間雙硫鍵。於某些實施態樣中，該重組多肽在該第一胺基酸序列的第4個胺基酸和該第二胺基酸序列的第2個胺基酸之間包含一個第一分子內或分子間雙硫鍵，以及在該第一胺基酸序列的第5個胺基酸和該第二胺基酸序列的第4個胺基酸之間包含一個第二分子內或分子間雙硫鍵。於某些實施態樣中，該重組多肽在該第一胺基酸序列的第5個胺基酸和該第二胺基酸序列的第2個胺基酸之間包含一個第一分子內或分子間雙硫鍵，以及在該第一胺基酸序列的第4個胺基酸和該第二胺基酸序列的第4個胺基酸之間包含一個第二分子內或分子間雙硫鍵。於某些實施態樣中，該重組多肽在該第二域的第23個胺基酸和該第二域的第27個胺基酸之間進一步包含一個分子內雙硫鍵。
本文揭示係關於一種重組多肽，其包含一胺基酸序列，該胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340 和SEQ ID NO：348所組成之群組，其中該重組多肽包含一個分子內雙硫鍵。於某些實施態樣中，該分子內雙硫鍵包含從該重組多肽的胺基末端編號的半胱胺酸15、半胱胺酸44、半胱胺酸48、半胱胺酸79、半胱胺酸80、半胱胺酸112、半胱胺酸114及其組合的一個或多個雙硫鍵。於某些實施態樣中，該分子內雙硫鍵包含半胱胺酸44、半胱胺酸48或兩者皆含。
於某些實施態樣中，如本文所述之重組多肽在從該重組多肽之胺基末端編號的半胱胺酸44和半胱胺酸48之間包含一分子內雙硫鍵。於某些實施態樣中，該重組多肽在半胱胺酸79和半胱胺酸112之間、半胱胺酸80和半胱胺酸114之間、半胱胺酸80和半胱胺酸112之間或半胱胺酸79和半胱胺酸114之間進一步包含一分子內或一分子間雙硫鍵。於某些實施態樣中，該重組多肽在半胱胺酸79和半胱胺酸112之間進一步包含一分子內或一分子間雙硫鍵，以及在半胱胺酸80和半胱胺酸114之間進一步包含一分子內或一分子間雙硫鍵。於某些實施態樣中，該重組多肽在半胱胺酸80和半胱胺酸112之間進一步包含一分子內或一分子間雙硫鍵，以及在半胱胺酸79和半胱胺酸114之間進一步包含一分子內或一分子間雙硫鍵。
本文揭示係關於一種同型二聚體蛋白，其包含如本文所述之二個相同的重組多肽。
本文揭示係關於一種異型二聚體蛋白，其包含如本文所述之二個相異的重組多肽。
於某些實施態樣中，如本文所述之同型二聚體蛋白或異型二聚體蛋白，其在該二個重組多肽的該些第一域之間、該二個重組多肽的該些第二域之間、該二個重組多肽的該些第三域之間、該二個重組多肽的該 第一域和該第二域之間、該二個重組多肽的該第一域和該第三域之間、該二個重組多肽的該第二域和該第三域之間或其組合包含一個或多個分子間雙硫鍵。
於某些實施態樣中，如本文所述之同型二聚體或異型二聚體蛋白，其在該二個之其一重組多肽的該第一域之第15個胺基酸和該另一重組多肽的該第一域之第15個胺基酸之間包含一分子間雙硫鍵。於某些實施態樣中，該同型二聚體或異型二聚體蛋白在該二個之其一重組多肽的該第三域之第9個胺基酸和該另一重組多肽的該第三域之第43個胺基酸之間、在該二個之其一重組多肽的該第三域之第8個胺基酸和該另一重組多肽的該第三域之第41個胺基酸之間、在該二個之其一重組多肽的該第三域之第8個胺基酸和該另一重組多肽的該第三域之第43個胺基酸之間或在該二個之其一重組多肽的該第三域之第9個胺基酸和該另一重組多肽的該第三域之第41個胺基酸之間進一步包含一分子間雙硫鍵。於某些實施態樣中，該同型二聚體或異型二聚體蛋白進一步在該二個之其一重組多肽的該第三域之第9個胺基酸和該另一重組多肽的該第三域之第43個胺基酸之間包含一雙硫鍵，以及在該二個之其一重組多肽的該第三域之第8個胺基酸和該另一重組多肽的該第三域之第41個胺基酸之間包含一雙硫鍵。於某些實施態樣中，該同型二聚體或異型二聚體蛋白進一步在該二個之其一重組多肽的該第三域之第8個胺基酸和該另一重組多肽的該第三域之第43個胺基酸之間包含一雙硫鍵，以及在該二個之其一重組多肽的該第三域之第9個胺基酸和該另一重組多肽的該第三域之第41個胺基酸之間包含一雙硫鍵。
於某些實施態樣中，該同型二聚體或異型二聚體蛋白在從該 重組多肽之胺基末端編號的該二個之其一重組多肽的半胱胺酸15和該另一重組多肽的半胱胺酸15之間包含一分子間雙硫鍵。於某些實施態樣中，該同型二聚體或異型二聚體蛋白進一步在該二個之其一重組多肽的半胱胺酸79和該另一重組多肽的半胱胺酸112之間、在該二個之其一重組多肽的半胱胺酸80和該另一重組多肽的半胱胺酸114之間、在該二個之其一重組多肽的半胱胺酸80和該另一重組多肽的半胱胺酸112之間或該二個之其一重組多肽的半胱胺酸79和該另一重組多肽的半胱胺酸114之間包含一分子間雙硫鍵。於某些實施態樣中，該同型二聚體或異型二聚體蛋白進一步在該二個之其一重組多肽的半胱胺酸79和該另一重組多肽的半胱胺酸112之間包含一分子間雙硫鍵，以及在該二個之其一重組多肽的半胱胺酸80和該另一重組多肽的半胱胺酸114之間包含一分子間雙硫鍵。於某些實施態樣中，該同型二聚體或異型二聚體蛋白進一步在該二個之其一重組多肽的半胱胺酸80和該另一重組多肽的半胱胺酸112之間包含一分子間雙硫鍵，以及在該二個之其一重組多肽的半胱胺酸79和該另一重組多肽的半胱胺酸114之間包含一分子間雙硫鍵。
於某些實施態樣中，該同型二聚體或異型二聚體蛋白在該二個之其一重組多肽的該第三域之第9個胺基酸和該另一重組多肽的該第三域之第43個胺基酸之間、在該二個之其一重組多肽的該第三域之第8個胺基酸和該另一重組多肽的該第三域之第41個胺基酸之間、在該二個之其一重組多肽的該第三域之第8個胺基酸和該另一重組多肽的該第三域之第43個胺基酸之間或在該二個之其一重組多肽的該第三域之第9個胺基酸和該另一重組多肽的該第三域之第41個胺基酸之間包含一分子間雙硫鍵。於某些 實施態樣中，該同型二聚體或異型二聚體蛋白在該二個之其一重組多肽的該第三域之第9個胺基酸和該另一重組多肽的該第三域之第43個胺基酸之間包含一雙硫鍵，以及在該二個之其一重組多肽的該第三域之第8個胺基酸和該另一重組多肽的該第三域之第41個胺基酸之間包含一雙硫鍵。於某些實施態樣中，該同型二聚體或異型二聚體蛋白在該二個之其一重組多肽的該第三域之第8個胺基酸和該另一重組多肽的該第三域之第43個胺基酸之間包含一雙硫鍵，以及在該二個之其一重組多肽的該第三域之第9個胺基酸和該另一重組多肽的該第三域之第41個胺基酸之間包含一雙硫鍵。
於某些實施態樣中，該同型二聚體或異型二聚體蛋白在從該重組多肽之胺基末端編號的該二個之其一重組多肽的半胱胺酸79和該另一重組多肽的半胱胺酸112之間、該二個之其一重組多肽的半胱胺酸80和該另一重組多肽的半胱胺酸114之間、該二個之其一重組多肽的半胱胺酸80和該另一重組多肽的半胱胺酸112之間、該二個之其一重組多肽的半胱胺酸79和該另一重組多肽的半胱胺酸114之間包含一分子間雙硫鍵。於某些實施態樣中，該同型二聚體或異型二聚體蛋白該二個之其一重組多肽的半胱胺酸79和該另一重組多肽的半胱胺酸112之間包含一分子間雙硫鍵，以及該二個之其一重組多肽的半胱胺酸80和該另一重組多肽的半胱胺酸114之間包含一分子間雙硫鍵。於某些實施態樣中，該同型二聚體或異型二聚體蛋白在該二個之其一重組多肽的半胱胺酸80和該另一重組多肽的半胱胺酸112之間包含一分子間雙硫鍵，以及在該二個之其一重組多肽的半胱胺酸79和該另一重組多肽的半胱胺酸114之間包含一分子間雙硫鍵。
於某些實施態樣中，如本文所述之同型二聚體或異型二聚體 蛋白的每一該重組多肽之該第三域包含一第一胺基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO：356)及一第二胺基酸序列GCGCR(SEQ ID NO：357)，其中該同型二聚體或異型二聚體蛋白在該二個之其一重組多肽的該第三域中之第一胺基酸序列和該另一重組多肽的該第三域中之第二胺基酸序列之間包含二個分子間雙硫鍵。於某些實施態樣中，該同型二聚體或異型二聚體蛋白在該二個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之第4個胺基酸和該另一重組多肽的該第二胺基酸序列之第2個胺基酸之間包含一第一分子間雙硫鍵，以及在該二個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之第5個胺基酸和該另一重組多肽的該第二胺基酸序列之第4個胺基酸之間包含一第二分子間雙硫鍵。於某些實施態樣中，該同型二聚體或異型二聚體蛋白在該二個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之第5個胺基酸和該另一重組多肽的該第二胺基酸序列之第2個胺基酸之間包含一第一分子間雙硫鍵，以及在該二個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之第4個胺基酸和該另一重組多肽的該第二胺基酸序列之第4個胺基酸之間包含一第二分子間雙硫鍵。
於某些實施態樣中，如本文所述之同型二聚體或異型二聚體蛋白之該單一或全部二個重組多肽包含如本文所述之任一個或多個該分子內雙硫鍵。
於某些實施態樣中，如本文所述之同型二聚體或異型二聚體蛋白的該單一或全部二個重組多肽之該第二域包含一分子內雙硫鍵。於某些實施態樣中，如本文所述之同型二聚體或異型二聚體蛋白之該單一或全部二個重組多肽在該第二域的第23個胺基酸和該第二域的第27個胺基酸包含一分子內雙硫鍵。
於某些實施態樣中，如本文所述之同型二聚體或異型二聚體蛋白的該單一或全部二個重組多肽在從該重組多肽的胺基末端編號的半胱胺酸44和半胱胺酸48之間包含一分子內雙硫鍵。
於某些實施態樣中，如本文所述之同型二聚體蛋白包含二個重組多肽，其中每一個多肽包含相同序列，其中該序列係選自由SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340及SEQ ID NO：348所組成之群組。於一些實施態樣中，該重組多肽包含如本文所述之相同分子內雙硫鍵。於一些實施態樣中，該重組多肽包含如本文所述之相異分子內雙硫鍵。
於某些實施態樣中，如本文所述之相異二聚體蛋白包含二個相異重組多肽，其中每一個多肽包含相異序列，該序列選自由如後所述所組成之群組：SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340及SEQ ID NO：348。於某些實施態樣中，該相異二聚體蛋白中之該二個之其一重組多肽包含序列SEQ ID NO：260，而該另一重組多肽包含一序列其選自由如後所述所組成之群組：SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340及SEQ ID NO：348。於一些實施態樣中，該重組多肽包含如本文所述之相同分子內雙硫 鍵。於一些實施態樣中，該重組多肽包含如本文所述之相異分子內雙硫鍵。
於某些實施態樣中，如本文所述之重組多肽、同型二聚體蛋白或異型二聚體蛋白在如表4或5中所列之半胱胺酸對之間包含該一個或多個雙硫鍵。
於某些實施態樣中，如本文所述之重組多肽、同型二聚體蛋白或異型二聚體蛋白包含骨誘發活性。可以常規用於測量此類活性的任何條件狀況下量測骨誘發活性(即「骨誘發條件」)。
例如：C2C12細胞是來自營養不良小鼠肌肉的鼠類的肌纖維母細胞品系。將C2C12細胞暴露於具有骨誘發活性的多肽可將C2C12細胞從肌肉轉移到骨之分化，例如：藉由誘發骨相關蛋白如鹼性磷酸酶的表達為特徵的成骨細胞形成。鹼性磷酸酶是一種廣泛接受的骨標記，且檢測鹼性磷酸酶活性的測定被認為可用以表現骨誘發活性。參見如：Peel等人(2003年公開於J.Craniofacial Surg.14：284-291)、Hu等人(2004年公開於Growth Factors 22：29033)及Kim等人(2004年公開於J.Biol.Chem.279：50773-50780)之研究。
於某些實施態樣中，如本文所述之重組多肽、同型二聚體或異型二聚體蛋白係具有誘發鹼性磷酸酶活性之能力。
於某些實施態樣中，骨誘發活性可利用醫學影像技術或骨樣本的組織學檢驗來進行檢測，或是任何其他用以檢測骨生成或成長的常規檢驗方法。於某些實施態樣中，上述檢測包括放射攝影影像，例如：X光影像。於某些實施態樣中，上述檢測包括電腦斷層攝影(CT)掃描。於一些實施態樣中，上述檢測包括分子影像或核影像(即，正電子發射斷層攝影術 (PET))。於某些實施態樣中，上述檢測包括組織學檢驗。於某些實施態樣中，上述檢測包括蘇木素-伊紅(HE)染色法。
於某些實施態樣中，如本文所述之重組多肽、同型二聚體蛋白或異型二聚體蛋白可包含但不限於片段、變體或其衍生物分子。當涉及多肽時，用語「片段」、「變體」、「衍生物」和「類似物」包含保留參考多肽的至少一些性質或生物活性的任何多肽。多肽片段可包含分解蛋白片段、缺失片段及當植入動物中時更容易到達作用位點的片段。多肽片段可包含變體區域，包括如上所述之片段，以及由於胺基酸取代、缺失或插入而具有經改變胺基酸序列之多肽。可以使用本領域已知的誘變技術產生非天然存在的變體。本文揭示之多肽片段可包含保守或非保守的胺基酸取代、缺失或添加。變體多肽在本文中也可稱為「多肽類似物」。本文揭示之多肽片段也可包括衍生分子。本文所用多肽或多肽片段的「衍生物」是指一主體多肽，其具有一個或多個由官能側基團的反應以化學性衍生之殘基。「衍生物」也包括該些多肽其含有一個或多個20個標準胺基酸之天然存在的胺基酸衍生物。例如：4-羥脯胺酸可被取代以作為脯胺酸；5-羥離胺酸可被取代以作為離胺酸；3-甲基組胺酸可被取代以作為組胺酸；高絲胺酸可被取代以作為絲胺酸；及鳥胺酸可被取代以作為離胺酸。
於某些實施態樣中，如本文所述之重組多肽、同型二聚體蛋白或異型二聚體蛋白包含一標記。於某些實施態樣中，該標記是一種可催化基質化合物或組成物之化學改變酵素標記、放射性標記、螢光團、發色團、成像劑或金屬包括金屬離子。
於某些實施態樣中，本文所述之重組多肽包括一個或多個保 守的胺基酸取代。「保守的胺基酸取代」是一種具有相似側鏈之相異胺基酸殘基的胺基酸取代。本領域已定義具有相似胺基酸側鏈之胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈(如：離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-支鏈側鏈(蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳香族側鏈(酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，若多肽中的胺基酸被來自同一側鏈家族的另一胺基酸替換，則認為該取代是保守的。於另一實施態樣中，一胺基酸鏈可被以差異在於順序和/或側鏈家族成員組成之結構上相似胺基酸鏈保守的替換。
於某些實施態樣中，本文揭示之重組多肽藉由如本文所述之核酸分子或載體所編碼，或是藉由如本文所述之宿主細胞所表達。
[核酸分子、載體及宿主細胞]
本文揭示是針對一種經分離之核酸分子，其包含一編碼如本文所述之任一重組多肽之多核苷酸序列。
於某些實施態樣中，該經分離之核酸分子包含任二個或多個編碼如本文所述之域之多核苷酸序列。於某些實施態樣中，該經分離之核酸分子包含任二個或多個多核苷酸序列，該多核苷酸序列係選自由SEQ ID NO：32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76及78所組成之群組，其編碼如本文所述之域分別對應SEQ ID NO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77及355。於某些實施態 樣中，該經分離核酸分子包含二個或三個多核苷酸序列的任何組合，該些多核苷酸序列編碼本文表3中所示之二個或三個域的對應組合。
於某些實施態樣中，該經分離之核苷酸分子包含多核苷酸序列係選自由SEQ ID NO：115、157、187、193、199、205、211、217、223、229、235、241、247、253、259、267、275、283、291、299、307、315、323、331、339及347所組成之群組，其編碼如本文所述之重組多肽分別對應SEQ ID NO：116、158、188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248、254、260、268、276、284、292、300、308、316、324、332、340及348。
於某些實施態樣中，多核苷酸序列經密碼子最佳化(codon-optimized)。
本文揭示是針對一種重組核酸分子，該重組核酸分子包含一表達控制區可操作的連結至如本文所述之經分離之核酸分子。於某些實施態樣中，該表達控制區是啟動子、增強子、操縱子、抑制子、核糖體結合位、轉譯前導序列、內含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位、效應子結合位、莖環結構、轉錄終止訊號或其組合。於某些實施態樣中，該表達控制區是一啟動子。表達控制區可以是轉錄控制區和/或轉譯控制區。
本發明所屬技術領域已知各種轉錄控制區。該些轉錄控制區包括但不限於在脊椎動物細胞中起作用之轉錄控制區，例如但不限於：來自巨細胞病毒的啟動子及增強子片段(迅早期啟動子，與內含子-A連接)、猴病毒40(早期啟動子)、反轉錄病毒(如勞斯肉瘤病毒)。其他轉錄控制區包括那些衍生自脊椎動物基因如：肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β- 球蛋白，以及在真核細胞中能控制基因表達的其他序列。另外，適合的轉錄控制區包括組織特異性啟動子和增強子，以及淋巴介質誘導型啟動子(如：干擾素或介白素可誘導之啟動子)。
類似地，本發明所屬技術領域已知各種轉譯控制控制單元。該些轉譯控制控制單元包括但不限於：核糖體結合位、轉譯起始與終止密碼子，以及衍生自微小核醣核酸病毒之單元(特別是內部核糖體進入位(internal ribosome entry site，IRES)，也稱為CITE序列)。
於某些實施態樣中，該重組核酸分子是一種重組載體。
載體可以是將核酸轉殖和/或轉移至宿主細胞內的任何媒介。本領域已知和已使用大量載體，包括例如：質體、噬菌體、黏接質體、染色體、病毒、經修飾之真核病毒、經修飾之細菌病毒。將多核苷酸插入至合適之載體可以藉由將適當的多核苷酸片段連接至具有互補的黏合端之所選載體中來完成。
可以將載體設計成編碼選擇性標記或報導者，該選擇性標記或報導者提供用來選擇或辨識已併入該載體的細胞。選擇性標記或報導者之表達允許宿主細胞辨識和/或選擇，該宿主細胞是併入且表達該載體上所含的其他編碼區。本領域已知及已使用之選擇性標記基因包括例如：對於胺芐青黴素、鏈黴素、健他黴素、康黴素、潮黴素、新黴素、嘌黴素、雙丙胺磷除草劑(bialaphos herbicide)、磺醯胺及其類似物提供抗性的基因，以及使用作為表型標記的基因，即花青素調節基因、異戊烯基轉移酶基因及其類似物。本領域已知及已使用之報導者包括例如：螢光素酶(Luc)、綠螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯基移轉酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡萄 醣醛酸酶(Gus)及其類似物。選擇性標記也可當作報導者。
用語「質體」是指通常帶有基因的染色體外單元，該基因並非細胞中心代謝的一部分，且通常是環狀雙股DNA分子形式。此般單元可以是衍生自任何來源自主複製序列(ARS)、基因體整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線性、環狀或超旋扭的單股或雙股DNA或RNA，其中已有許多核苷酸序列被連接或重組成獨特構造，該構造能夠為了所選基因產物將啟動子片段和DNA序列連同適當3’端未轉譯序列一起導入細胞中。
可以使用的真核病毒載體包括但不限於：腺病毒載體、反轉錄病毒載體、腺相關病毒載體及痘病毒，如牛痘病毒載體、桿狀病毒載體或疱疹病毒載體。非病毒載體包括質體、脂質體、帶電性脂質(細胞增生素)、DNA-蛋白質複合物及生物聚合物。哺乳動物表達載體可包含非轉錄單元如：複製起點、與待表達基因連結的合適啟動子和增強子，以及其他5’端或3’端毗鄰非轉錄序列及5’端或3’端非轉譯序列，如必需的核糖體結合位、多腺苷酸化位、剪接供給者與接受者位及轉錄終止序列。
該重組載體可以是一種「重組表達載體」，其是指任何核酸構造，該核酸構造含有用以轉錄和轉譯已插入之編碼序列的必須單元，或是在RNA病毒載體的情況下，當導入至適當宿主細胞時用以複製和轉譯的必須單元。
本文揭示針對一種製備一重組載體的方法，其包含將如本文所述之經分離之核酸分子插入至一載體內。
本文揭示針對一種經分離之宿主細胞，其包含如本文所述之經分離之核酸分子或重組核酸分子。於某些實施態樣中，該經分離之宿 主細胞包含如本文所述之重組載體。
核酸分子可以藉由本領域已知的方法導入至宿主細胞中，例如：轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉澱、脂轉染(溶酶體融合)，基因槍的使用或DNA載體轉運蛋白。
本文揭示針對一種製備重組宿主細胞的方法，其包含將如本文所述之經分離之核酸分子或重組核酸分子導入至一宿主細胞內。於某些實施態樣中，該方法包含將如本文所述之重組載體導入至一宿主細胞內。
如本文所述之宿主細胞可表達如本文所述之任何經分離之核酸分子或重組核酸分子。關於在宿主細胞中核酸分子的表達所使用的術語「表達/表現」是指藉由基因引起生物化學的過程，例如：RNA或多肽。該過程包括細胞內所具有該基因之功能出現的任何具體呈現，包括但不限於：瞬態表達或穩定表達。其包括但不限於將該基因轉錄成傳訊RNA(mRNA)以及將該mRNA轉譯成多肽。
宿主細胞包括但不限於原核生物或真核生物。適當宿主細胞的代表性實例包括：細菌細胞、真菌細胞如酵母菌、昆蟲細胞及經分離之動物細胞。細菌細胞可包括但不限於革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌，例如：大腸桿菌(Escherichia coli)。或者，也可使用乳酸桿菌(Lactobacillus)屬物種或芽孢桿菌(Bacillus)屬物種作為宿主細胞。真核細胞可以包括但不限於已建立的哺乳動物來源細胞品系。合適的哺乳動物細胞品系包括例如：COS-7、L、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、HeLa及BHK細胞品系。
該宿主細胞可以在適合如本文所述之用以活化啟動子、選擇轉化體或擴增核酸分子的經適當修飾之常規營養培養基中進行培養。該 培養之條件如溫度、pH等，可以是當使用選擇用以表達的宿主細胞時已知使用或經常規修飾的任何條件，並且對於本發明所屬技術領域中具有普通知識者是顯而易見地。
本文揭示一種製造一重組多肽的方法，其包含：培養如本文所述之經分離之宿主細胞，以及從該宿主細胞分離該重組多肽。從經培養的宿主細胞分離多肽的技術，可以選擇用以表達的宿主細胞分離多肽時已知使用或經常規修飾的任何技術，並且對於本發明所屬技術領域中具有普通知識者是顯而易見地。
[組合物]
本文揭示一種組合物，其包含如本文所述之重組多肽、同型二聚體蛋白或異型二聚體蛋白。
於某些實施態樣中，該組合物進一步包含生理可接受載體、賦形劑或穩定劑。參見如1990年美國賓州伊士頓的麥克出版社(Mack Publishing Co.,Easton,PA)出版之雷明頓藥物科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)。可接受載體、賦形劑或穩定劑可包含對受試者無毒的物質。於某些實施態樣中，該組合物或該組合物中一個或多個成分是無菌的。無菌成分可使用如過濾(如通過無菌過濾膜)或放射線照射(如通過γ-射線照射)來製備。
於某些實施態樣中，如本文所述之組合物進一步包含骨或骨碎片的同種異體移植物或自體移植物。
於某些實施態樣中，如本文所述之組合物進一步包含骨移植替代物。
於某些實施態樣中，該骨移植替代物是一種生物陶瓷(bioceramic)材料。用語「生物陶瓷材料」及「生物陶瓷」於本文中可相互代換。於某些實施態樣中，該生物陶瓷在體內是可生物相容的且可再吸收的。於某些實施態樣中，該生物陶瓷是任何基於以磷酸鈣鹽類為基礎的生物陶瓷。於某些實施態樣中，該生物陶瓷係選自由磷酸三鈣(TCP)、α-磷酸三鈣(α-TCP)、β-磷酸三鈣(β-TCP)、雙相磷酸鈣(BCT)、氫氧磷灰石、硫酸鈣及碳酸鈣所組成之群組。於某些實施態樣中，該生物陶瓷是β-磷酸三鈣(β-TCP)。
於某些實施態樣中，該骨移植替代物是一種生物活性玻璃(bioactive glass)。於某些實施態樣中，該生物活性玻璃包含二氧化矽(SiO2)、氧化鈉(Na2O)、氧化鈣(CaO)或氧化鉑(Pt2O5)。
以下實施例是用以說明而非限制本發明。
[實施例]
[實施例1]-質體建構
為了建構質體pQE-80L-Kana，利用BspHI(BioLab公司)從pET-24a(+)(Novagen公司)切割康黴素抗性基因，以產生875-bp康黴素抗性基因(+3886到+4760)片段(SEQ ID NO：1)。用BspHI切割pQE-80L(凱杰公司)載體以去除胺芐青黴素抗性基因(+3587到+4699)片段(SEQ ID NO：2)，然後將該康黴素抗性基因片段連接到該pQE-80L載體中以生成4513-bp質體(pQE-80L-Kana)。(SEQ ID NO：3)。
[實施例2]-酵母雙雜合(two-hybrid)篩選
A.誘餌質體建構
使用市售系統(媒合雙雜合系統2；美國加州帕洛阿爾托的CLONTECH公司)進行酵母雙雜合篩選。為了建構誘餌質體，用具有pCRII/ActRIIB的聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)(1994年Hilden等人公開於Blood 83(8)：2163-70之研究)生產IIB型活化素受體(ActRIIB)蛋白之細胞外域(+103到+375bp)(SEQ ID NO：4)的編碼區以作為模板。設計用於擴增ActRIIB該細胞外域(ActRIIBecd)的引子(XmaI：5'-CCCGGGACGGGAGTGCATCTACAACG-3'(SEQ ID NO：5)；SalI：5'-GTCGACTTATGGCAAATGAGTGAAGCGTTC-3'(SEQ ID NO：6))使其在5’末端分別包含一個XmaI和SalI限制位。使用模板DNA 10ng、每個引子0.2μM、每個dNTP 0.2mM、1X PCR緩衝液(10mM三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、pH 8.3、50mM氯化鉀(KCl)及1.5mM氯化鎂(MgCl2))以及pfu DNA聚合酶(勁因科技有限公司)1.25U，在總體積50μl下進行PCR。進行PCR 30次循環：在95℃下變性30秒，接著在45℃下黏合1分鐘，在68℃下延伸5分鐘。以XmaI-SalI切割該PCR產物，然後在框架內經次轉殖(subcloned)到在pAS2-1載體(CLONTECH公司GenBank登入號：U30497)中GAL4的DNA-結合域中相同的限制位，以產生質體pAS-ActRIIBecd。
已知ActRIIB的核酸序列和多肽序列以及天然存在的變體。例如野生型ActRIIB核酸序列為SEQ ID NO：7。對應的多肽序列為SEQ ID NO：8。ActRIIB的細胞外域(ActRIIBecd)為SEQ ID NO：9，其對應SEQ ID NO：8的殘基21-117，且由核酸序列SEQ ID NO：4編碼。
B.pACT2/MC3T3 cDNA資料庫建構
為了建構pACT2/MC3T3 cDNA資料庫，由Tu Q.等人(2003 年公開於J Bone Miner Res.18(10)：1825-33)所揭示大約7×106轉殖的小鼠MC3T3-E1成骨細胞cDNA資料庫，並進行一些修飾以容許cDNA資料庫插入小於1.5kb，該資料庫建構到pACT2載體(CLONTECH公司GenBank登入號：U29899)中，其中在S1核酸酶處理後(英杰生命科技公司cDNA合成系統CAT.編號18267-013)，在pACT2載體中轉殖該雙股cDNA，其經SmaI切割以表達具有GAL4活化域的融合蛋白。接著根據製造商(美國加州帕洛阿爾托的CLONTECH公司)的方案，以「HIS3 Jump-Start」程序篩選pACT2/MC3T3 cDNA資料庫。於另一實施態樣中，該pACT2 cDNA資料庫是由市售產品獲得。
C.酵母菌株選擇
首先以誘餌質體轉化釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y190細胞(美國加州帕洛阿爾托的CLONTECH公司，MATa、ura3-52、his3-D200、lys2-801、ade2-101、trp1-901、leu2-3、112、gal4D、gal80D、URA3：：GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ、cyhr2、LYS2：：GALUAS-HIS3TATA-HIS3)，並在不含色胺酸的合成葡萄糖培養基(SD-Trp)上進行篩選。隨後以pACT2/MC3T3 cDNA資料庫轉化在該SD-Trp培養基上生長的轉化體，並在不含色胺酸和白胺酸的培養基(SD-Trp-Leu)上進行篩選。於不含色胺酸、白胺酸及組胺酸(SD-Trp-Leu-His)並具有30mM的3-胺基-1,2,4-三唑(3-amino-1,2,4-triazole)之培養基上(美國密蘇里州聖路易，西格瑪奧瑞奇公司)收集並再培養該誘餌與資料庫共轉化後的轉殖體，以抑制Y190細胞的滲漏生長。進一步測定在此步驟中所選的轉殖體其β-半乳糖苷酶活性。經過30℃培養3天後，將培養皿拍照攝影。至少進行了三次獨立實驗，並有相似 結果。從個別陽性轉殖體純化該pACT2資料庫質體，並在大腸桿菌中進行擴增。用珀金埃爾默ABI自動DNA定序儀定序插入陽性轉殖體中的該cDNA，如表1所示(引子5'-AATACCACTACAATGGAT-3'(SEQ ID NO：10))。
[實施例3]-易誤(Error-prone)隨機誘變PCR
A.從質體設計引子之誘變
將來自實施例2的陽性轉殖體的DNA序列誘發突變。
於一實施態樣中，經定序的陽性轉殖體被次轉殖到pQE-80L-Kana中，接著進行隨機誘變PCR。用於擴增陽性轉殖體DNA序列如表1所示之引子，經設計在其5’末端包含一個MseI或BamHI限制位。該PCR條件如實施例2所述。該PCR產物以MseI-BamHI進行切割，接著在框架內經次轉殖到該pQE-80L-Kana載體中的相同限制位。在Leung等人(1989年公開於Technique,1,11-15)揭示的易誤PCR基礎下，經些微修飾，將隨機誘變導入至該經次轉殖之pQE-80L-Kana質體內。使用線性化pQE-80L-Kana(經XhoI切割)作為模板DNA。用於使誘變PCR擴增的引子(MseI：5'- GAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAA(SEQ ID NO：29)；BamHI：5'-CCGGGGTACCGAGCTCGCATGCGGATCCTTA(SEQ ID NO：30))，經設計在其5’末端分別包含一個MseI或BamHI限制位。使用模板DNA 10ng、每個引子40pM、每個dNTP 0.2mM、1X PCR緩衝液(10mM Tris-HCl、pH 8.3、50mM KCl及1.5mM MgCl2)、氯化錳(MnCl2)0.2-0.3mM、二甲亞碸1%及Taq DNA聚合酶1.25U(美國加州卡爾斯巴德的英杰公司)，在總體積50μl下進行誘變PCR。誘變PCR進行30次循環：在94℃下變性30秒，接著在55℃下黏合2分鐘，在72℃下延伸3分鐘。用MseI和BamHI切割該PCR產物。這個片段與經MseI和BamHI切割之pQE-80L-Kana的4.5-kb片段連接。以所得之pQE-80L-Kana衍生物轉化大腸桿菌BL 21(Novagen公司)。菌落在LTB-瓊脂培養基(LB補充有1% v/v甘油三丁酸酯、0.1% v/v土溫乳化劑-80、100mg/L的康黴素、0.01μM的異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷及1.5%瓊脂)的培養皿中於37℃環境下生長。
B.表1引子之誘變
於另一實施態樣中，基於先前Lenug所揭示的易誤PCR並經一些修改，將隨機誘變導入至來自該陽性轉殖體的該pACT2資料庫質體中。使用該線性化pACT2(經XbaI切割)作為模板DNA。使用具有如表1所示MseI和BamHI限制位的合成寡核苷酸作為誘變PCR擴增反應之引子。使用模板DNA 10ng、每個引子40pM、每個dNTP 0.2mM、1X PCR緩衝液(10mM Tris-HCl、pH 8.3、50mM KCl及1.5mM MgCl2)、MnCl2 0.2-0.3mM、二甲亞碸1%及Taq DNA聚合酶1.25U(美國加州卡爾斯巴德，英杰公司)，在總體積50μl下進行誘變PCR。誘變PCR進行30次循環：在94℃下變性30秒，接著 在55℃下黏合1.5分鐘，在72℃下延伸4分鐘。用MseI和BamHI切割該PCR產物。將此片段與經MseI和BamHI切割之pQE-80L-Kana的4.5-kb片段連接。以所得之pQE-80L-Kana衍生物轉化大腸桿菌BL 21(Novagen公司)。菌落在LTB-瓊脂培養基(LB補充有1% v/v甘油三丁酸酯、0.1% v/v土溫乳化劑-80、100mg/L的康黴素、0.01μM的異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷及1.5%瓊脂)的培養皿中於37℃環境下生長。
[實施例4]-ActRIIBecd相關多肽的表達
使用如實施例3所述經穩定轉化之大腸桿菌細胞，以表達來自實施例2之該誘變DNA的與ActRIIBecd交互作用之多肽(即「域」)。
A.轉化體發酵
於一實施態樣中，將具有pQE-80L-Kana衍生物的大腸桿菌BL21轉化體在含有康黴素25-32μg/mL的65mL培養基(10g/L BBL植物蛋白腖、5g/L Bacto酵母萃取物、10g/L NaCl)於500mL錐形瓶中，在30℃至37℃下，以180±20rpm攪拌，進行隔夜培養(約10小時)。將前述隔夜培養物37-420mL加至3.7-42L的TB培養基(BBL植物蛋白腖18g、Bacto酵母萃取物36g、磷酸二氫鉀(KH2PO4)18.81g、甘油6mL，於1L水中)中，該培養基於5-50L發酵槽中含有23.8-38.5μg/mL的康黴素及1-3mmol/L的異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，並且將溫度控制在37℃至42℃範圍內，以260-450rpm攪拌該培養基10-24小時。在GSA旋轉器(索福公司)中，經8,000rpm離心10分鐘後，在冰水浴中收集該細胞。
於另一實施態樣中，將1L的LB液狀培養基(具有100mg/L康黴素)與新鮮長成之菌落(具有pQE-80L-Kana衍生物的大腸桿菌BL21轉化 體)或10mL的新鮮長成之培養物接菌，並在37℃下孵育直到OD600達0.4-0.8。藉由加入40或400μM的IPTG在37℃下經3至5小時，以誘發該多肽表達。經離心後(約8,000rpm)，於4℃下收集細胞。
B.回收與純化來自大腸桿菌的多肽
如先前實施例4A所述，發酵大腸桿菌BL21/pQE-80L-Kana衍生物細胞。於一實施態樣中，在4℃下將來自那些衍生物的多肽進行細胞破碎和回收。將約18g的濕細胞懸浮於60mL之0.1M的TRIS/HCl、10mM EDTA(乙二胺四醋酸)、1mM PMSF(苯基甲烷磺醯氟)、pH 8.3(破碎緩衝液)之中。根據製造商的說明書，該些細胞通過法式細胞破碎器(Frenchpress，SLM儀器公司)2次，並用破碎緩衝液將體積調整至200mL。將懸浮液在15,000g下離心20分鐘。將所獲得的沉澱物懸浮於含有1M氯化鈉(NaCl)的100mL破碎緩衝液中，並如上所述離心10分鐘。將沉澱物懸浮於含有1% Triton X-100(Pierce公司)的100mL破碎緩衝液中，並再次如上所述離心10分鐘。然後將沖洗下來之沉澱物懸浮於50mL的Tris/HCl、1mM EDTA、1mM PMSF、1% DTT(二硫蘇糖醇)中，並在鐵氟龍(Teflon)組織研磨機中均質化。所得之懸浮液中含有不可溶型態之粗多肽(crude polypeptide)。
將根據前述實施態樣所獲得之10mL多肽懸浮液以10%醋酸酸化至pH 2.5，並使用Eppendorf離心機在室溫下離心10分鐘。上清液在10%醋酸流速1.4mL/min下，使用Sephacryl S-100型管柱(法瑪西亞公司，2.6×78cm)進行層析。合併在適當時間區間沖提出的含多肽之層析餾分。使用此材料用於再折疊以得到生物活性多肽或是用於進一步純化。
將來自前述實施態樣的5mg多肽溶解於140mL之50mM之 Tris/HCl、pH 8.0、1M之NaCl、5mM之EDTA、2mM之還原型麩胱甘肽、1mM之氧化型麩胱甘肽和33mM之Chaps生化試劑(Calbiochem公司)中。在4℃下經72小時後，將上述溶液之酸鹼值以鹽酸(HCl)調整至pH 2.5，並將前述混合物在Amicon超濾杯(stirred cell)中以YM 10薄膜(美國麻州丹佛斯，Amicon公司)進行超濾10倍濃縮。將前述經濃縮的溶液以10mM之HCl稀釋至原始體積，並再經同樣方法濃縮至最終體積為10mL。所形成的沉澱物以5000g離心30分鐘移除。在非還原狀態下，利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)判斷含有雙硫連結之多肽的前述上清液。使用表面電漿共振式生物分子感測器(BIAcoreTM)量測前述製劑之生物活性(實施例5)。
將來自前述實施態樣中的該濃縮溶液以1mL/min流速施加到Mono S HR 5/5型管柱(法瑪西亞公司)，該管柱經85%緩衝液A(20mM醋酸鈉、30%異丙醇，pH 4.0)及15%緩衝液B(含有1M氯化鈉的緩衝液A)之混合物平衡。然後以相同流速沖洗該管柱，保持上述緩衝液混合物之組成恆定直到280nm吸光度讀值達基線水平，接著在平衡狀態下開始注射線性梯度超過20分鐘，最後以50%緩衝液A/50%緩衝液B的混合物結束。生物活性多肽在梯度開始後約9分鐘被沖提，並將其收集。利用生物活性測定及非還原條件下的SDS-PAGE判斷。
於另一實施態樣中，該多肽經由實施例4所收集細胞的包涵體製備。在室溫下隔夜萃取(50mM之醋酸鈉、pH 5、8M之尿素、14mM之2-巰基乙醇)，並對水徹底透析後，該多肽再折疊、濃縮，並通過Sephacryl S-100 HR型管柱(法瑪西亞公司)以1%之醋酸或5mM之HCL在流速1.8 mL/min下濃化。最後以蛋白質層析儀(FPLC，Fractogel EMD SO3 - 650、50mM之醋酸鈉、pH 5、30%之2-丙醇)純化並以從0至1.5M之NaCl梯度沖提。合併在適當時間區間沖提出的含多肽餾分。對水徹底透析後，該多肽經冷凍/乾燥後儲存於-20℃。以SDS-PAGE分析該多肽的純度，接著以考馬斯亮藍R染色。
於另一實施態樣中，將衍生自例如上述實施例4A的每1克的細胞顆粒再懸浮於10-20mL的10mM之TRIS/HCl、150mM之NaCl、1mM之EDTA、5mM之DTT、pH 8.0(破碎緩衝液)中，並以音波處理使細胞爆破，該音波處理是使用具有1號增幅器(Enhance Booster #1)探針的Misonix S4000儀器在30A(儀器刻度)上使用5分鐘。可選擇性地藉由離心(18,000×g經20分鐘或15,000×g經30分鐘)澄清前述細胞裂解混合物，並將沉澱物以含有1v/v% Triton X-100的10-20mL破碎緩衝液沖洗數次，並如上述離心10分鐘。將細胞裂解物以含有6M尿素的100-200mL破碎緩衝液溶解，並如上述離心10分鐘，保留含有該多肽的上清液以進一步純化。
將前述上清液溶解於再折疊緩衝液(100mL之Tris/HCl pH 8.0、500mM之精胺酸-HCl、5mM之EDTA、25mM之Chaps、2mM之氧化型麩胱甘肽和1mM之還原型麩胱甘肽)中。在室溫經4-7天後，該多肽以FPLC(Fractogel EMD SO3 - 650、20mM醋酸鈉、pH 4-5、30% 2-丙醇和25mM Chaps)純化並以從0至3M之NaCl梯度沖提。合併在適當時間區間沖提出的含多肽餾分。以SDS-PAGE分析該多肽的純度，接著以考馬斯亮藍R染色。
於某些實施態樣中，本文揭示之異型二聚體可以藉由如先前在實施例3所述在瞬態表達系統中共表達(co-expression)來製備，且可以從 該培養基分離出該異型二聚體以實施例5之測定進行篩選。
[實施例5]-體外BIAcore TM 測定
生物感應器實驗。於一實施態樣中，在BIAcoreTM T100/T200型儀器(Pharmacia Biosensor AB公司)之多通道模式(串流路徑涉及細胞流動室1+2+3+4)下進行實驗。流速為10μl/min，溫度為25℃，並以2.5點/秒記錄數據。利用胺基偶聯法將所有四個片段的感應器晶片CM5塗覆鏈親和素(streptavidin，西格瑪公司)至密度2000pg/mm2(2000共振單位)。將ActRIIBecd(10mg)和胺-PEG3-生物素(amine-PEG3-Biotin，10mg，美國伊利諾州羅克福德，Pierce公司)溶於200μl之水中，並加入10mg之氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)以製備生物素化之ActRIIBecd。將反應混合物於70℃下加熱24小時，之後再進一步加入10mg之NaCNBH3，接著將該反應物於70℃下再加熱24小時。冷卻至室溫後，該混合物以旋轉管柱(3,000截留分子量(MWCO))脫鹽。收集生物素化之ActRIIBecd，經冷凍乾燥後用於鏈親和素(SA)晶片製備。然後將胺基生物素化之ActRIIBecd在流速為5μL/min下獨立地固定在細胞流動室2-4上10分鐘，並在10mM醋酸鈉中濃度為20μM，pH 4.0，密度為50-250共振單位(RU)。將儲存之該多肽溶解於甘胺酸緩衝液(2.5g之甘胺酸、0.5g之蔗糖、370mg之L-麩胺酸鹽、10mg之氯化鈉和10mg之土溫乳化劑-80，於100mL水中，pH 4.5)中以製備10mg/mL溶液，接著用先前的甘胺酸緩衝液稀釋以製備成各種濃度的分析物。在分析物(如先前所述之ActRIIBecd相關多肽(即，域))流動期間記錄感應圖譜，首先通過細胞流動室1(對照)，接著通過細胞流動室2(生物素化之ActRIIBecd)。將細胞流動室2獲得的感應圖譜減去細胞流動室1獲得的感應圖譜。藉由儀器提供的程式 (Pharmacia Biosensor AB公司，1995年軟體手冊，BIA評估2.1)，評估在1、11、3.33、10、30和90nM分析物上獲得的感應圖譜之平衡結合、結合速率和解離速率。分析物和牛血清白蛋白(BSA，陰性對照)列於表2中。使用如前所述之珀金埃爾默ABI自動DNA定序儀進行與分析物相關轉殖體中該pQE-80L-Kana衍生物的定序(引子5'-CTCGAGAAAT CATAAAAAAT TTATTTG-3'(SEQ ID NO：31))，該pQE-80L-Kana衍生物具有相較於白蛋白更高的親和力常數。
[實施例6]-重組多肽的製造
為了確定是否可以增強親和力常數，使用Atanassov等人(2009年公開於Plant Methods 5：14)所揭示之PCR融合(PCR-Fusion)方法經一些修改，將表2中的各別域彼此融合以製造重組多肽。使用Phusion DNA聚合酶(芬蘭，Finnzymes公司)和標準熱循環儀進行PCR融合。以BP Clonase II和LR Clonase II酵素混合物(英杰公司)進行通路重組反應(Gateway recombination reactions)。勝任大腸桿菌DH5α細胞是根據Nojima等人揭示內容(1990年公開於Gene 96(1)：23-28)製備。使用QIAprep®公司的Spin Miniprep試劑盒和QIAquick®公司的膠體萃取和PCR純化試劑盒(德國，凱杰公司)純化質體DNA和PCR片段。
所得重組多肽的DNA模板、PCR引子和DNA/多肽序列如表3所示。PCR融合涉及來自質體模板的二個或三個平行PCR擴增。在來自該些平行反應的膠體經純化PCR片段上，進行通過單個重疊延伸擴增片段的PCR融合。根據Phusion DNA聚合酶指引(NewEnglandBiolabs公司：PhusionTM 高保真度(HF)DNA聚合酶手冊)在本稿中對於所有PCR擴增用於反應混合及條件的循環參數皆相同。質體模板的黏合溫度為55℃。
對於融合二個PCR片段，使用30μl重疊延伸反應，其包含：16μl的該二個PCR片段混合物(通常每個8μl，約200-800ng，DNA)、6μl的5×Phusion HF緩衝液、3μl的2mM dNTP混合物、0.3μl的PhusionTM DNA聚合酶(2U/μl)。在重疊延伸混合物中不加入引子。當融合三個DNA片段時，使用18μl該PCR混合物(通常每個6μl)。一般而言，使用等體積的經純化PCR片段不會檢查精確的DNA濃度。若該經擴增PCR片段的莫耳比看起來明顯不同(例如：在瓊脂糖電泳後估計DNA帶強度超過5-7倍)，來自純化過的PCR片段體積則應對應調整。上述反應混合物在98℃培養30秒、60℃培養1分鐘、72℃培養7分鐘。使用PCR純化試劑盒純化該重疊延伸反應後所獲得的DNA。如前所述，PCR產物經切割並結合於pQE-80L-Kana載體中用以蛋白質/多肽表達。利用先前討論過之BIAcoreTM T100/T200型(GE Healthcare公司)監測經純化之蛋白質/多肽對於ActRIIBecd的親和力，並使用實施例5中BIA評估軟體版本4.1(GE Healthcare公司)進行資料分析。
數據顯示，與來自每一單個轉殖體的個別多肽相比，來自如後述之二個轉殖體組合所形成的重組多肽，其親和力常數(KD)較低：轉殖體編號10可操作地連接轉殖體編號15(SEQ ID NO：188)、轉殖體編號15可操作地連接轉殖體編號10(SEQ ID NO：194)、轉殖體編號15可操作地連接轉殖體編號21(SEQ ID NO：200)、轉殖體編號21可操作地連接轉殖體編號15(SEQ ID NO：206)、轉殖體編號21可操作地連接轉殖體編號10(SEQ ID NO：212)、轉殖體編號10可操作地連接轉殖體編號21(SEQ ID NO：218)、轉殖體編號8可操作地連接轉殖體編號14(SEQ ID NO：224)、轉殖體編號14可操作性地連接轉殖體編號8(SEQ ID NO：230)、轉殖體編號19可操作地連接轉殖體編號8(SEQ ID NO：236)、轉殖體編號8可操作地連接轉殖體編號19(SEQ ID NO：242)、轉殖體編號19可操作性地連接轉殖體編號14連接(SEQ ID NO：248)及轉殖體編號14可操作地連接轉殖體編號19(SEQ ID NO：254)。換言之，來自所述組合所形成的該重組多肽相對於來自轉殖體編號8(SEQ ID NO：35)、轉殖體編號10(SEQ ID NO：39)、轉殖體編號14(SEQ ID NO：47)、轉殖體編號15(SEQ ID NO：49)、轉殖體編號19(SEQ ID NO： 57)及轉殖體編號21(SEQ ID NO：61)之每個轉殖體的各別多肽，具有對ActRIIBecd更高的親和力。
除此之外，來自三個轉殖體之組合而製成重組多肽，該轉殖體是使用：轉殖體編號8(SEQ ID NO：35)、轉殖體編號10(SEQ ID NO：39)、轉殖體編號14(SEQ ID NO：47)、轉殖體編號15(SEQ ID NO：49)、轉殖體編號19(SEQ ID NO：57)及轉殖體編號21(SEQ ID NO：61)。令人意外的，與來自各別轉殖體的多肽或來自二個轉殖體組合之多肽相比，來自如後述之三個轉殖體組合所形成的重組多肽之KD較低，該轉殖體為：轉殖體編號10可操作地連接轉殖體編號15及21(SEQ ID NO：260)、轉殖體編號15可操作地連接轉殖體編號10及21(SEQ ID NO：268)、轉殖體編號21可操作地連接轉殖體編號15及10(SEQ ID NO：276)、轉殖體編號21可操作地連接轉殖體編號10及15(SEQ ID NO：284)、轉殖體編號8可操作地連接轉殖體編號14及19(SEQ ID NO：292)、轉殖體編號14可操作地連接轉殖體編號8及19(SEQ ID NO：300)、轉殖體編號19可操作地連接轉殖體編號8及14(SEQ ID NO：308)、轉殖體編號19可操作地連接轉殖體編號14及8(SEQ ID NO：316)、轉殖體編號10可操作地連接轉殖體編號14及21(SEQ ID NO：324)、轉殖體編號8可操作地連接轉殖體編號15及19(SEQ ID NO：332)、轉殖體編號10可操作地連接轉殖體編號19及14(SEQ ID NO：340)及轉殖體編號8可操作地連接轉殖體編號21及15(SEQ ID NO：348)。
[實施例7]-轉譯後修飾
研究關於轉譯後修飾(PTM)對於該重組多肽KD值的影響。PTM的一實施例是雙硫鍵連接。表4所示為雙硫鍵位置和結合親和力之間關 係的數據，結果顯示PTM會影響該重組多肽對ActRIIBecd的結合親和力。該PTM測定是根據以下實驗進行。
A.酵素切割和二甲基標記
如實施例4和6製備多肽。標準蛋白購自西格瑪公司(美國密蘇里州聖路易士)。可選擇性地使用pH 6含有5mM之N-乙基順丁烯二醯亞胺(NEM，西格瑪公司)的100mM醋酸鈉(美國紐澤西州非力普堡，J.T.Baker公司)在室溫下阻斷游離半胱胺酸30分鐘。酵素切割直接於醋酸鈉中在37℃下以1：50胰蛋白酶(美國威斯康辛州麥迪遜，勁因公司)進行。在二甲基標記之前，將蛋白質切割物使用100mM之醋酸鈉(pH 5)進行三倍稀釋。
於某些實施態樣中，如實施例4和6製備之重組多肽以50mM三乙基碳酸氫銨(Triethylammonium bicarbonate，TEABC，T7408，西格瑪奧瑞奇公司)緩衝液(pH 7)稀釋，並分裝於二個試管用以不同酵素切割。首先，加入NEM(N-乙基順丁烯二醯亞胺，E3876，西格瑪奧瑞奇公司)至最終濃度5mM以阻斷游離半胱胺酸。烷基化反應在室溫下進行30分鐘。經NEM烷基化後，該兩個試管之其一於37℃下加入胰蛋白酶(V5111，勁因公司)(1：65)18小時，隨後在37℃下以Glu-C(P8100S，New England BioLabs公司)(1：50)進行隔夜切割。另一試管則於37℃下加入Glu-C(1：50)18小時，隨後在37℃下以胰凝乳蛋白酶(1：50)進行隔夜切割。
為進行二甲基標記，於50μL的蛋白質切割物中加入2.5μL的4%(w/v)甲醛-H2(J.T.Baker公司)或2.5μL的4%(w/v)甲醛-D2(奧瑞奇公司)，接著加入2.5μL的600mM氰基硼氫化鈉(西格瑪公司)，上述反應在pH 5-6進行30分鐘。
B.質譜分析
使用配有CapLC系統(美國麻州密爾福，沃特斯公司)的電灑式四極棒-飛行時間(ESI Q-TOF)利用毛細管柱(台灣，志聖工業股份有限公司，內徑75μm、長度10cm)進行測量掃描(MS，m/z 400-1600；MS/MS，m/z 50-2000)。將該經烷基化及二甲基化標記之蛋白質切割物進行液相層析串聯式質譜(LC-MS/MS)分析，其在含有0.1%甲酸的乙腈線性梯度5%至50%中45分鐘。
於某些實施態樣中，上述經切割及標記的蛋白質切割物以高分辨質譜(Q-Exactive Plus MS)連接快速液相層析(Ultimate 3000 RSLC)系統進行分析。使用C18管柱(Acclaim PepMap RSLC,75μm x 150mm,2μm,100Å)進行液相層析(LC)分離，其使用之梯度如下：
以m/z 300-2000範圍進行全MS掃描，並將MS掃描中10個最強的離子用於串聯式質譜(MS/MS)光譜碎片分析。
C.資料分析
使用MassLynx 4.0從原始數據產生峰值列表(減去30%，3/2 Savitzky Golay平滑法，中央三通道80%質心)。可以用相對高地減法以消除背景雜訊。真正的a1離子通常顯示為主波峰，以使其可保留於峰值列表中。
D.逆相層析
在具有二元幫浦的安捷倫1100型高效液相層析系統(Agilent 1100 HPLC)裝備有UV偵測器和自動進樣器。將蛋白質注入75℃操作下的Zorbax 300SB C8管柱(150±2.1mm，5μm，300Å)。流速為0.5ml/min。移動相A為含有0.1%三氟乙酸的水。移動相B為70%異丙醇、20%乙腈，以及0.1%三氟乙酸水溶液。樣品在10% B的負載條件下注入，並在2分鐘內增加至19% B。在兩分鐘時開始1.1% B/min的線性沖提梯度，並在24分鐘時結束。然後使用95% B沖洗該管柱5分鐘。將該管柱於負載條件下5分鐘以重新平衡。此方法能夠部份分離區別雙硫鍵異構物。
如表4所示，不同半胱胺酸位置間的雙硫鍵會影響親和力常數(KD)的值。除此之外，數據也顯示，二聚體中兩個重組多肽間的雙硫鍵會顯著降低KD值。換言之，二聚合作用可能有助於重組多肽的二聚體和該ActRIIBecd間體外之分子交互作用。
觀察到一些重組多肽自發性形成如表4所示之二聚體蛋白。所有該二聚體蛋白可經由如實施例4B所述之凝膠過濾將其從重組多肽中分離純化。於此實施態樣中，該二聚體蛋白係同型二聚體蛋白，因為其單體相同。於其它實施態樣中，若如實施例4中所述之經穩定轉化之大腸桿菌細胞由選自SEQ ID No：260、268、276、284、292、300、308、316、324、332、340和348所組成之群組之兩個相異重組多肽共表達，則該二聚體蛋白可以係異型二聚體蛋白。
[實施例8]-鹼性磷酸酶生物活性測定
使用已公開之C2C12細胞中鹼性磷酸酶誘發檢驗法，研究該重組多肽與細胞受體結合以及誘發訊號傳導途徑的能力。參見如：Peel等人(2003年公開於J Craniofacial Surg.14：284-291)及Hu等人(2004年公開於 Growth Factors 22：29033)之研究。
在合流之前將C2C12細胞(美國維吉尼亞州馬納薩斯，ATCC登錄號CRL-1772)繼代，並再懸浮於補充有10%經熱滅活之胎生牛血清的DMEM中1×105cells/mL。將96孔組織培養板(康寧公司，Cat #3595)的每孔植入100μL細胞懸浮液。加入連續稀釋標準品及測試樣本的等分試樣，並將培養物保持於37℃和5%之CO2環境中。測試樣本包括經限制之培養基、經純化之重組多肽以及作為陽性對照的市售經純化之重組人類BMP-2「rhBMP-2」(美國明尼亞波利斯，R&D Systems公司)。rhBMP-2已顯示在骨及軟骨發展上扮演重要角色，例如：Mundy GR等人(2004年公開於Growth Factors. 22(4)：233-41)之研究。陰性對照培養物(培養基不加入樣本或rhBMP-2)經培養2至7天。培養基每兩日更換一次。
收獲培養物時以生理食鹽水潤洗(0.90%之NaCl，pH 7.4)，並將潤洗後的食鹽水丟棄。在該些培養物中加入50μL萃取溶液(Takara Bio公司，catalogue #MK301)，然後在室溫下超音波處理10分鐘。溶菌液的鹼性磷酸酶(ALP)的檢測，是藉由如Peel等人(2003年公開於J Craniofacial Surg.14：284-291)所揭示監測鹼性緩衝液(美國密蘇里州聖路易，西格瑪奧瑞奇公司，catalog P5899)中硝基酚磷酸酯的水解作用，或是根據製造商的說明書使用TRACP & ALP檢測試劑盒(Takara Bio公司，catalogue #MK301)。藉由記錄405nm吸光度測定ALP活性。經重複樣本的平均ALP活性計算活性評分。使用4參數曲線擬合法(4-parameter curve fit)對連續稀釋樣本及其相對活性評分作圖以計算各個重組多肽之EC50濃度。數據顯示如表5。於一些實施態樣中，使用考馬斯亮藍(布拉德福)蛋白質檢測法(oomasie(Bradford) Protein Assay，Pierce生物科技股份有限公司，catalogue #23200)將每個孔中細胞蛋白質含量的該ALP活性進行標準化。藉由將每個孔的該ALP活性除以每個孔的蛋白質含量以計算每個樣本該經標準化的ALP活性。
於另一實施態樣中。進行由Katagiri,T.等人(1990年公開於Biochem.Biophys.Res.Cornrnun.172,295-299)所揭示的鹼性磷酸酶檢測。將來自C3H10T1/2品系的小鼠纖維母細胞培養於加上10%胎生小牛血清的BME-Earle培養基，將1mL的1 x 105cells/mL等分試樣置於24孔培養板中，維持37℃和10% CO2環境下24小時。移除上清液後，加入帶有各種濃度樣本的1mL新鮮培養基。在進一步培養4天後，將細胞溶解於0.2mL緩衝液(0.1M之甘油、pH 9.6、1%之NP-40、1mM之MgCl2、1mM之ZnCl2)中，鹼性磷酸酶活性在50μL等分試樣溶胞液中測定，該溶胞液是經過使用pH 9.6緩衝液作為基質，以0.3mM對硝基酚磷酸酯150μL處理。在37℃下培養20分鐘後記錄405nm之吸光度。該活性是與每個樣本中的蛋白質含量(BCA蛋白質檢測法，Pierce化學公司)有關。
如表5所示，具有某些雙硫連結的大多數重組多肽，其EC50值較rhBMP-2的EC50值為低。換言之，具有某些雙硫連結的大多數重組多肽能夠誘發骨或軟骨生成或成骨作用相關的訊號傳導路徑。
[實施例9]-體內骨誘發活性
在兔子的尺骨軸缺損中，針對根據實施例6(即SEQ ID NO：260，包括分子內雙硫鍵C44-C48)之兩個重組多肽之同型二聚體蛋白的骨誘發活性以及多孔β-磷酸三鈣(β-TCP)作為載體材料進行評估。
在40隻雌兔(NZW品系，日本SLC股份有限公司)上，以外科手術暴露左和右的尺骨軸製造圓周20mm大的缺損。簡言之，使用氯胺酮鹽酸鹽(商品名Ketalar，第一三共股份有限公司)及甲苯噻嗪(xylazine，商品名 Selactar 2%注射液，拜耳醫藥有限公司)以3：1的組合進行複合麻醉。在長時間的手術中使用相同溶液作為額外麻醉。手術前，將氟黴寧(Flumarin學名flomoxef sodium，塩野義製藥股份有限公司)作為抗生素皮下給藥。前臂一般區域的毛使用電動剃刀將其刮除，並使用希必定酒精(Hibitane，葡萄糖酸氯己定-乙醇溶液，大日本住友製藥股份有限公司)進行消毒。在尺骨的每個肢的後內側部位製造一縱向切口。將肌肉組織抬起以暴露該尺骨。使用手術刀從該暴露尺骨的手部關節25mm處製造一標記。使用15mm直徑的鑽頭在該標記處縱向及垂直鑽孔，密切注意不造成該骨斷裂。使用骨剪將該骨分割。在距離近端方向20mm處也製造一標記，並以相似方式分割。當分割時，該尺骨覆蓋骨膜，接著將該骨膜移除，並用鹽水徹底清潔該骨碎片。
如下表6所示，根據A-G組之其一，對每個尺骨植入或不植入植入物。A-D組之尺骨植入由β-TCP攜帶特定劑量同型二聚體蛋白的單一植入物。E組之尺骨植入僅β-TCP的單一植入物，沒有任何同型二聚體蛋白。F組之尺骨植入骨自體移植之單一植入物。G組之尺骨則沒有植入物。之後，迅速縫合肌肉及真皮組織。
A-E組中所使用的β-TCP為1-3mm的顆粒型式，其孔隙率為 75%，孔徑為50-350μm(日本，SuperporeTM公司，pentax陶瓷人工骨系列，「HOYA」人工骨替代物)。
於某些實施態樣中，A-E組中所使用的β-TCP為1-3mm的顆粒型式，其孔隙率為70%或以上，孔徑為300-600μm(台灣微創醫療器材公司，「台微醫」康骨益人工骨替代物)。
A-D組中包含重組多肽(即SEQ ID NO：260)的同型二聚體蛋白是在每隻動物植入前立即使用0.5mM鹽酸(以注射劑(大塚製藥公司)進行標準溶液稀釋)從冷凍批次準備。對於單側植入設定流體體積為180μl，並在已滅菌培養皿中200mg的β-TCP顆粒上均勻滴加。當流體完全滴落，以刮勺輕輕攪拌該β-TCP顆粒，在室溫下靜置超過15分鐘，接著進行植入。
關於F組，自體移植骨是利用骨剪從左翼或右翼的胯骨獲得。將骨加工成碎片，且植入的骨量與A-E組的量相同。
X光評估
拍攝側面及前面的X光影像(即，放射線照片)，分別為植入後立即拍攝以及每兩週拍攝一次直至植入後8週。使用該放射線照片評估植入部位的狀況及骨生成的程度。每一組代表性實施例的X光影像如圖1A(A-D組)及圖1B(E-G組)所示。
在2週時，在所有組別中可以清楚地看到受植床其移植材料的顆粒和邊界的對比。在4週時，在該同型二聚體蛋白組(即A-D組)中的TCP顆粒變的不明顯，顯示出該顆粒的吸收及骨生成的進度。在具有高劑量同型二聚體蛋白的C組和D組的部分樣本中，該植入部位和該受植床之間的邊界變的不明顯。在6週時，B組中該植入部位和該受植床之間的邊界變的不 明顯。在C組和D組的某些樣本中觀察到該受植床的連續性及骨皮質生成的改善。在8週時，A組和B組中該受植床的邊界變得更加不明顯。C組中該受植床的連續性及骨皮質生成改善。D組中觀察到該尺骨缺損區的重建，如6週的影像所示。
在單獨使用TCP的E組中，隨著時間可觀察到該受植床有骨生成。然而，即使在8週時剩餘的TCP顆粒仍清晰可見，顯示該植入部位上骨生成不足並且該受植床中的連續性差。因此，E組中缺損的修復在8週時仍然不完整。
在具有自體移植的F組中，隨著時間可觀察到骨生成的進度，且在8週時跟該受植床已達融合。然而，生成並不均勻。
在僅具有缺損而沒有移植物的G組中，在8週時於橈骨上可觀察到些微骨生成，而沒有任何其他該缺損的修復。
電腦斷層(Computerized Tomography，CT)掃描
在移植後當下、移植後4週及8週時使用CT掃描，以1mm間隔進行軸定向(GE橫河醫療系統有限公司)。主要掃描該植入部位的影像。在圖2A(A-D組)和圖2B(E-G組)中的代表性實施例顯示該植入部位中心隨著時間推移的橫截面影像變化。
在具有同型二聚體蛋白的A至D組中，在移植後立刻觀察到的顆粒在4週的橫截面影像中部分降解，顯示骨生成發生。在60μg劑量的D組中，進一步觀察到骨生成的進度，並且在一些樣本中觀察到骨髓腔生成。8週時，在6μg以上劑量組別的影像中觀察到骨髓腔和骨皮質生成的進度。在僅有TCP的E組中，即使在8週時仍有顆粒團聚體。在有自體移植的F組 中，8週時觀察到骨髓腔生成，如再成型過程中。在僅有缺損的G組中，僅觀察到些微的骨生成。
抗扭強度測試
該移植材料從植入後8週安樂死的兔子中取出，從每一組的尺骨樣本分離出的橈骨上進行抗扭強度測試。使用858 Mini Bionix II工具(MTS系統公司)進行測試。該測試在50mm長的區域進行，即在該尺骨軸中心的20mm長的重建區域及在該重建區域之近側和遠側15mm長的區域。每側的邊緣用牙科樹脂固定。將樹脂部分夾在量測設備中。以30°/min的旋轉速度將左側尺骨以逆時鐘方向旋轉，右側尺骨以順時鐘方向旋轉，以確定失敗時的最大扭矩。並檢查和比較分別獲得的健康兔子尺骨。該些健康兔子尺骨是從日本白兔獲得，與A至E組中使用的類型不同。然而，該些日本白兔在安樂死時的年齡和性別與A至E組相同，即26週齡的母兔。
圖3所示為該抗扭強度測試下每一組所獲得的最大扭矩。在具有同型二聚體蛋白的A至D組中，最大扭矩和劑量的相依性高。
與單獨使用TCP的E組相比，在具有同型二聚體蛋白劑量2μg及超過2μg的之A至D組中觀察到顯著高的值。
與僅有缺損的G組相比，在具有同型二聚體蛋白劑量6μg及超過6μg之B至D組中觀察到顯著高的值。
在完整無缺損尺骨、自體移植或同型二聚體蛋白的組別間未觀察到顯著差異。
由於在E組和G組中骨生成不足，當分離橈骨時，難以確保在一些樣本中的支承。故，在測試中僅使用E組的2個樣本和G組的4個樣本， 而A至D組和F組則各使用6個樣本。
下表7所示為使用相同動物模型的本發明與Kokubo等人(2003年公開於Biomaterials 24：1643-1651，2003)對於CHO衍生BMP-2的評估研究間測試條件和結果的比較。與Kokubo等人的報告相比，本發明在更為困難的條件下進行，例如：較大的骨缺損、較小劑量之活性劑，以及在抗扭強度測試之前較短的植入期間。然而，本發明顯示尺骨成功修復，且本發明中的最大扭矩非常相似。
組織學評估
在8週和4週之組別中對所有動物製備標本。將屍體剖檢時獲得的組織保存於4%多聚甲醛溶液中並以10%之EDTA脫鈣。接著將該組織以石蠟包埋。在平行於橈骨長軸的平面上製作薄片樣本，以蘇木素和伊紅(HE)染色，並進行組織學評估。以確定骨生成和對該受植床的融合條件。
在具有同型二聚體蛋白的A至D組中，在4週時骨生成進展 成橫紋型。在高劑量同型二聚體蛋白的樣本中觀察到主動性地骨生成。在60μg劑量的D組中觀察到顯著大量的新生骨和血管新生。在低劑量之A組和B組的一些樣本中觀察到殘餘材料，在C組和D組中則幾乎沒有觀察到殘餘材料。在A和B組中，一些樣本的該受植床邊界附近觀察到軟骨生成。在所有樣本中，該受植床直接與該橫紋型的新生骨連接。在8週時，2μg劑量的A組仍可觀察到橫紋及殘餘材料。在受植床邊界附近也可觀察到軟骨。即使再成型不足，仍可觀察到骨生成的進展。在一些樣本中觀察到橈骨中骨皮質的生成。劑量超過6μg的B組至D組，通過再成型形成骨皮質及骨髓。在更高劑量的組別中進步更為顯著。在植入部位上的連續性也增加。
在單獨使用TCP的E組中，在橈骨中觀察到移植材料上有骨生成，但即使在8週時殘餘材料仍清晰可見，顯示在軸上骨生成不足且連續性差。
在具有自體移植物的F組中，4週時可見移植骨碎片上良好的骨生成，且新生骨與受植床接觸。在受植床邊界附近觀察到軟骨生成。8週時可觀察到新生骨再成型及骨皮質生成的進展，但是仍可觀察到殘餘的移植骨碎片。
在僅有缺損的G組中，僅在橈骨中觀察到骨生成，且該缺損尚未完成修復。
本發明不限於本文所述之具體實施例之範圍。實際上，除了所描述的內容之外，對於本發明所屬技術領域之技術人員根據先前描述及附圖中顯而易見的各種修飾。此般修飾意同落入所附之申請專利範圍之中。
其它實施態樣在所附之申請專利範圍內。
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<220>
<223> 引子
<400> 329
<210> 330
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 330
<210> 331
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合產物
<400> 331
<210> 332
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合產物
<400> 332
<210> 333
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 333
<210> 334
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 334
<210> 335
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 335
<210> 336
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 336
<210> 337
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 337
<210> 338
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 338
<210> 339
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合產物
<400> 339
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合產物
<400> 340
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 341
<210> 342
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 343
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<212> DNA
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<223> 引子
<400> 344
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 345
<210> 346
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 346
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<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合產物
<400> 347
<210> 348
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合產物
<400> 348
<210> 349
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 349
<210> 350
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 350
<210> 351
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 351
<210> 352
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 352
<210> 353
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 353
<210> 354
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 354
<210> 355
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 355
<210> 356
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組多肽之第三域片段
<400> 356
<210> 357
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組多肽之第三域片段
<400> 357

Claims (25)

  1. 一種重組多肽，其包含：一第一域(domain)，其係選自由SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：39所組成之群組；一第二域，其係選自由SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49所組成之群組；及一第三域，其係選自由SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：61所組成之群組；其中該第二域包含一個分子內雙硫鍵(intramolecular disulfide bond)，該重組多肽係具誘發鹼性磷酸酶活性之能力。
  2. 如請求項1之重組多肽，其中該第三域包含：一第一胺基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO：356)和一第二胺基酸序列GCGCR(SEQ ID NO：357)，且其中該第三域包含在該第一和該第二胺基酸序列之間之二個分子內雙硫鍵。
  3. 如請求項2之重組多肽，其中該重組多肽包含：在該第一胺基酸序列的第4個胺基酸和該第二胺基酸序列的第2個胺基酸之間之一第一分子內雙硫鍵，且在該第一胺基酸序列的第5個胺基酸和該第二胺基酸序列的第4個胺基酸之間之一第二分子內雙硫鍵。
  4. 如請求項2之重組多肽，其中該重組多肽包含：在該第一胺基酸序列的第5個胺基酸和該第二胺基酸序列的第2個胺基酸之間之一第一分子內雙硫鍵，且在該第一胺基酸序列的第4個胺基酸和該第二胺基酸序列的第4個胺基酸之間之一第二分子內雙硫鍵。
  5. 一種同型二聚體蛋白，其包含如請求項1至4任一項之二個相同的重組多肽，其中該同型二聚體蛋白包含在該二個重組多肽的該些第一域之間之一個分子間雙硫鍵。
  6. 如請求項5之同型二聚體蛋白，其中每一該重組多肽的該第三域包含：一第一胺基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO：356)和一第二胺基酸序列GCGCR(SEQ ID NO：357)，且其中該同型二聚體蛋白包含：在該兩個之其一重組多肽的該第三域中之該第一胺基酸序列和該另一重組多肽的該第三域中之該第二胺基酸序列之間之二個分子間雙硫鍵。
  7. 如請求項6之同型二聚體蛋白，其中該同型二聚體蛋白包含：在該兩個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之第4個胺基酸和該另一重組多肽的該第二胺基酸序列之第2個胺基酸之間之一第一分子間雙硫鍵，以及在該兩個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之第5個胺基酸和該另一重組多肽的該第二胺基酸序列之第4個胺基酸之間之一第二分子間雙硫鍵。
  8. 如請求項6之同型二聚體蛋白，其中該同型二聚體蛋白包含：在該兩個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之第5個胺基酸和該另一重組多肽的該第二胺基酸序列之第2個胺基酸之間之一第一分子間雙硫鍵，以及在該兩個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之第4個胺基酸和該另一重組多肽的該第二胺基酸序列之第4個胺基酸之間之一第二分子間雙硫鍵。
  9. 如請求項5之同型二聚體蛋白，其中每一該重組多肽的該第三域包含：一第一胺基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO：356)和一第二胺基酸序列GCGCR(SEQ ID NO：357)，且其中該同型二聚體蛋白包含：在該兩個之其一重組多肽的該第三域中之該第一胺基酸序列和該其一重組多肽的該第三域中之該第二胺基酸序列之間之二個分子內雙硫鍵。
  10. 如請求項9之同型二聚體蛋白，其中該同型二聚體蛋白包含：在該兩個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之第4個胺基酸和該其一重組多肽的該第二胺基酸序列之第2個胺基酸之間之一第一分子內雙硫鍵，以及在該兩個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之第5個胺基酸和該其一重組多肽的該第二胺基酸序列之第4個胺基酸之間之一第二分子內雙硫鍵。
  11. 如請求項9之同型二聚體蛋白，其中該同型二聚體蛋白包含：在該兩個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之第5個胺基酸和該其一重組多肽的該第二胺基酸序列之第2個胺基酸之間之一第一分子內雙硫鍵，以及在該兩個之其一重組多肽的該第一胺基酸序列之第4個胺基酸和該其一重組多肽的該第二胺基酸序列之第4個胺基酸之間之一第二分子內雙硫鍵。
  12. 一種重組多肽，其包含：一第一域(domain)，其係選自由SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：39所組成之群組；一第二域，其係選自由SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49所組成之群組；及一第三域，其係選自由SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：61所組成之群組；其中該重組多肽包含一胺基酸序列，該胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340及SEQ ID NO：348組成之群組；其中該第二域包含一個分子內雙硫鍵(intramolecular disulfide bond)。
  13. 如請求項12之重組多肽，該胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：324和SEQ ID NO：332所組成之群組，其中該重組多肽包含在半胱胺酸44和半胱胺酸48之間之一個分子內雙硫鍵。
  14. 如請求項13之重組多肽，其中該重組多肽包含：在半胱胺酸79和半胱胺酸112之間之一個分子內雙硫鍵，及在半胱胺酸80和半胱胺酸114之間之一個分子內雙硫鍵。
  15. 如請求項13之重組多肽，其中該重組多肽包含：在半胱胺酸80和半胱胺酸112之間之一個分子內雙硫鍵，及在半胱胺酸79和半胱胺酸114之間之一個分子內雙硫鍵。
  16. 一種同型二聚體蛋白，其包含如請求項13至15任一項之二個相同的重組多肽。
  17. 如請求項16之同型二聚體蛋白，其包含在該兩個之其一重組多肽的半胱胺酸15和該另一重組多肽的半胱胺酸15之間之一個分子間雙硫鍵。
  18. 如請求項17之同型二聚體蛋白，其包含：(a)在該兩個之其一重組多肽的半胱胺酸79和該另一重組多肽的半胱胺酸112之間之一個分子間雙硫鍵，及在該兩個之其一重組多肽的半胱胺酸80和該另一重組多肽的半胱胺酸114之間之一個分子間雙硫鍵；或(b)在該兩個之其一重組多肽的半胱胺酸80和該另一重組多肽的半胱胺酸112之間之一個分子間雙硫鍵，及在該兩個之其一重組多肽的半胱胺酸79和該另一重組多肽的半胱胺酸114之間之一個分子間雙硫鍵。
  19. 一種經分離之核酸分子，其包含一編碼如請求項1至4或12至15任一項之重組多肽之多核苷酸序列。
  20. 如請求項19之經分離之核酸分子，其進一步包含一表達控制區，連結至該重組多肽之多核苷酸序列。
  21. 一種經分離之宿主細胞，其包含如請求項19或20之經分離之核酸分子。
  22. 一種製備一重組載體之方法，其包含將如請求項19或20之經分離之核酸分子插入一載體內。
  23. 一種製備一重組宿主細胞之方法，其包含將如請求項19或20之經分離之核酸分子導入至一宿主細胞內。
  24. 一種製造一重組多肽之方法，其包含：培養如請求項21之經分離之宿主細胞，以及分離該重組多肽。
  25. 一種組合物，其包含如請求項1至4或12至15任一項之重組多肽或如請求項5至11或16至18任一項之同型二聚體蛋白。
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