TWI721966B - 具有背景訊號補償之均相免疫分析 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於允許補償樣品及試劑固有的背景訊號之均相免疫分析。均相免疫分析用於檢測生物樣品中對稱二甲基精胺酸(SDMA)之存在或量之用途。用於實施該等分析之試劑及套組。

Description

具有背景訊號補償之均相免疫分析 相關申請案
本申請案主張於2015年2月15日提出申請之美國臨時專利申請案第62/118,832號之權益，該申請案以全文引用之方式併入本文中。
本發明概言之係關於允許樣品及試劑中固有的背景訊號補償之均相免疫分析。在具體實施例中，本發明係關於均相免疫分析用於檢測生物樣品中對稱二甲基精胺酸(SDMA)之存在或量之用途。
已執行均相免疫分析用於測定各種分析物、最主要地針對藥物濫用這分析物。SDMA已在生物樣品中鑑別為評價(例如)腎功能、心血管功能及SLE之標記。SDMA通常與藥物濫用之分析物相比以相對較低濃度存在於生物樣品中。
因此，本發明者已鑑別出業內對更精確及敏感之均相免疫分析、尤其對在生物樣品中具有較低濃度之分析物(例如SDMA)之需求。
在一個態樣中，本發明係關於對稱二甲基精胺酸(SDMA)之偶聯物，例如SDMA與酶之偶聯物。在本發明之一個實例中，偶聯物係偶聯至葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)之SDMA。在各個實施例中， SDMA及酶係藉助5至15個原子鏈接體偶聯。類似地，SDMA可係藉助長度為約5-15埃之鏈接體偶聯至該酶。本發明之實例偶聯物包括以下：
Figure 105105218-A0305-02-0004-2
Figure 105105218-A0305-02-0004-4
Figure 105105218-A0305-02-0004-5
在另一態樣中，本發明係關於組合物，其包括本發明偶聯物及對游離SDMA特異性之抗體。在各個實施例中，對游離SDMA特異性之抗體對不對稱二甲基精胺酸(ADMA)之反應性可小於其對游離SDMA之反應性的25%。類似地，抗體與一或多種選自由不對稱二甲基精胺酸(ADMA)、L-精胺酸及N-甲基精胺酸組成之群之化合物可不具有或實質上不具有交叉反應性。
在其他態樣中，本發明係關於包括本發明偶聯物及對SDMA特異性之抗體之套組。
在各種態樣中，本發明套組包括用於對含有分析物之樣品實施分析之試劑。套組可包括以下組份(a)用於實施第一分析之第一組試劑，其包括：i.第一試劑，其包括抗分析物抗體及用於酶之訊號產生受質，及ii.第二試劑，其包括該分析物與該酶之偶聯物，及(b)用於實施第二分析之第二組試劑，其包括i.第三試劑，其包括該受質。
在套組中，第二組試劑可進一步包括第四試劑，其包括稀釋劑 及緩衝劑中之至少一者。第四試劑亦可進一步包括偶聯物或酶。另外，套組中該等試劑中之至少一者包括用於除偶聯物之酶以外之酶的抑制劑。在實施例中，第一試劑中偶聯物之濃度為第四試劑中偶聯物濃度之約5倍至約150倍。套組亦可包括標準物，其包括已知量之分析物稀釋於已脫除(stripped)分析物之樣品溶液中。舉例而言，已脫除分析物之樣品溶液可為經脫除之血清、經脫除之血漿或預處理樣品。第一試劑及/或第二試劑可進一步包括電子傳遞介質(electron mediator)及染料，且第三試劑及/或第四試劑可進一步包括傳遞介質及染料，其中該傳遞介質自受質接受電子並將其轉移至該染料。
此外，本發明係關於反應混合物，其包括本發明套組之組份及懷疑包括SDMA之樣品。
在另一實施例中，本發明係關於用於測定樣品中游離SDMA之存在或量之方法。該方法包括使該樣品與對游離SDMA特異性之抗SDMA抗體、技術方案1之偶聯物及包括菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)之受質接觸，量測NAD至NADH之轉化，及基於NAD至NADH之轉化測定該樣品中SDMA之存在或量。
在本發明方法之各個實施例中，量測NAD至NADH之轉化可包括量測NAD至NADH之轉化率。舉例而言，該基於NAD至NADH之轉化測定該樣品中SDMA之存在或量可包括將NAD至NADH之轉化率與標準曲線相比較，或量測NAD至NADH之轉化可包括量測NAD至NADH之轉化量。該基於NAD至NADH之轉化測定該樣品中SDMA之存在或量亦可包括將NAD至NADH之轉化量與標準曲線相比較。
在本發明方法之另一態樣中，方法包括以下步驟：(a)實施樣品第一反應序列，其包括：i.藉由使該樣品與抗分析物抗體、包括分析物及酶之偶聯物及當與該酶接觸時產生訊號之受質接觸形成樣品第一反應混合物，及 ii.量測來自該樣品第一反應混合物之訊號；(b)實施樣品第二反應序列，其包括，i.藉由使該樣品與該受質接觸形成樣品第二反應混合物，ii.量測來自該樣品第二反應混合物之訊號；(c)自來自步驟(a)之訊號之量減去來自步驟(b)之訊號之量以提供淨訊號，(d)使用該淨訊號來測定該樣品中該分析物之量。
本發明之方法可進一步包括以下步驟：(a)實施校準物第一反應序列，其包括：i.藉由使包括已知量之分析物的一組校準物中之每一校準物與抗分析物抗體、包括分析物及酶之偶聯物及當與該酶接觸時產生訊號之受質個別接觸形成校準物第一反應混合物，及ii.量測來自該等校準物第一反應混合物中每一者之訊號；(b)實施校準物第二反應序列，其包括，i.藉由使該組校準物中之每一校準物與該受質接觸形成校準物第二反應混合物，及ii.量測來自該等校準物第二反應混合物之訊號；(c)自來自步驟(b)之訊號之量減去來自步驟(a)之訊號之量以提供每一校準物之淨訊號，(d)使用來自兩個或更多個校準物之淨訊號以生成標準曲線，(e)藉由將來自該樣品之淨訊號與該標準曲線比較測定該樣品中分析物之量。
在本發明方法之其他實施例中，該等方法可包括以下步驟：(a)實施樣品第一反應序列，其包括：i.藉由使該樣品與抗分析物抗體、包括分析物及酶之偶聯物及當與該酶接觸時產生訊號之受質接觸形成樣品第一反應混合物，及 ii.量測來自該樣品第一反應混合物之訊號；iii.藉由計及與該樣品第一反應混合物相關之背景正規化該樣品第一反應混合物之反應速率，(b)實施樣品第二反應序列，其包括，i.藉由使該樣品與該受質接觸形成樣品第二反應混合物，ii.量測來自該樣品第二反應混合物之訊號；iii.藉由計及與該樣品第二反應混合物相關之背景正規化該樣品第二反應混合物之反應速率，(c)自步驟(a)(iii)之正規化速率減去步驟(b)(iii)之正規化速率以提供含有該分析物之樣品之最終反應速率，(d)使用該最終反應速率以測定該樣品中分析物之量。
本發明之方法亦可包括以下步驟：(a)實施校準物第一反應序列，其包括：i.藉由使包括已知量之分析物的一組校準物中之每一校準物與抗分析物抗體、包括分析物及酶之偶聯物及當與該酶接觸時產生訊號之受質個別接觸形成校準物第一反應混合物，及ii.量測來自該等校準物第一反應混合物中每一者之訊號；iii.藉由計及與該等校準物第一反應混合物中之每一者相關之背景正規化該等校準物第一反應混合物中每一者之反應速率，(b)實施校準物第二反應序列，其包括，i.藉由使該組校準物中之每一校準物與該受質接觸形成校準物第二反應混合物，ii.量測來自該等校準物第二反應混合物之訊號；iii.藉由計及與該等校準物第二反應混合物相關之背景正規化該等校準物第二反應混合物中每一校準物之反應速率，(c)自步驟(a)(iii)之正規化速率減去步驟(b)(iii)之正規化速率以 提供該等校準物中每一者之最終反應速率，(d)基於該等校準物中每一者之最終反應速率生成正規化標準曲線，(e)藉由將該樣品之正規化反應速率與正規化標準曲線相比較測定該樣品中分析物之量。
在本發明方法之各個態樣中，樣品及校準物第二反應混合物可包括稀釋劑、緩衝劑及抗分析物抗體中之任一者或多者。同樣，計及與該樣品第一反應混合物相關之背景及/或校準物第一反應混合物可包括自與每一樣品及/或校準物第一反應混合物之反應速率的測定相關之複數個訊號量測值中之每一者減去背景。類似地，計及與樣品及/或校準物第二反應混合物相關之背景包括自與樣品第二反應混合物及/或每一校準物第二反應混合物之反應速率測定相關之複數個訊號之量測值中之每一者減去背景。
在本發明之方法中，樣品可係生物樣品，例如血清、血漿、尿液或腦-脊髓液。
在本發明之方法中，其中該校準物可包括稀釋於血漿或血清(包括例如經脫除之血清或血漿)中之分析物。在另一實施例中，校準物可為預處理樣品。
在本發明方法之其他態樣中，樣品及/或校準物第二反應混合物可進一步包括偶聯物。舉例而言，樣品或校準物第一反應混合物中之偶聯物可以樣品或校準物第二反應混合物中偶聯物濃度之約5倍至約150倍存在。
此外，在本發明方法之其他態樣中，任一反應混合物可包括針對除偶聯物之酶以外之酶的抑制劑。另外，任一反應混合物可進一步包括電子傳遞介質及染料，其中該傳遞介質自受質接受電子並將其轉移至該染料。
在又一態樣中，本發明係關於確定動物中慢性腎病之方法。該方法包括根據本發明方法測定來自動物之生物樣品中SDMA之存在或量，並基於樣品中SDMA之存在量確定該動物之慢性腎病。
圖1顯示來自正常群體及遭受慢性腎病(CKD)之患者之人類血清樣品的本發明分析之結果。
圖2顯示用於使用SIA將SDMA偶聯至G6PDH以活化G6PDH之程序之示意圖示。
圖3顯示用於使用SBAP將SDMA偶聯至G6PDH以活化G6PDH之程序之示意圖示。
圖4顯示用於使用SMCC將SDMA偶聯至G6PDH以活化G6PDH之程序之示意圖示。
圖5係傳遞介質-染料反應機制之示意圖示，其中傳遞介質將電子傳遞至染料以還原染料並使染料之吸光度位移。
圖6顯示摻加至人類血清中並根據本發明方法分析之SDMA的校準曲線。
圖7顯示摻加至人類血清中並根據固定計算方法及本發明之速率計算方法分析之SDMA的校準曲線。
圖8顯示根據本發明方法所實施且未減去背景訊號之已知濃度之SDMA的分析結果。
圖9、10及11顯示根據本發明使用犬(圖9)、貓(圖10)及馬(圖11)經脫除之血清校準物之SDMA分析之結果。
圖12顯示根據本發明使用基於緩衝劑之校準物之SDMA分析之結果。
在詳細闡述本發明之前，將定義許多術語。除非上下文另外明 確指出，否則本文所用單數形式「一(a、an)」及「該」包括複數個指示物。
SDMA係對稱二甲基精胺酸。SDMA之結構係：
Figure 105105218-A0305-02-0010-6
儘管多肽中可存在SDMA之一或多個胺基酸殘基，但「游離SDMA」係指不為多肽鏈之一部分之SDMA，包括SDMA之鹽。
如本文所用，術語「類似物」一般係指可與針對受體之分析物競爭之該分析物的修飾形式，該修飾提供該分析物聯結至另一部分(例如標記或固體載體)之方式。分析物類似物可以類似於分析物之方式結合至抗體。
如本文所用，術語「抗體」一般係指藉由B淋巴球細胞響應於對抗原之暴露並特定結合至該抗原所產生之糖蛋白。術語「抗體」以其最寬廣意義使用且特定涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現期望之生物活性即可。
如本文所用，「抗SDMA抗體」、「抗SDMA抗體部分」或「抗SDMA抗體片段」及/或「抗SDMA抗體變體」及諸如此類包括含有包括免疫球蛋白分子之至少一部分(例如但不限於重鏈或輕鏈恆定區之一互補決定區(CDR)、框架區或其任一部分)之分子之任一蛋白質或肽。
如本文所用，術語「抗體片段」係指全長抗體之一部分、一般而言其抗原結合或可變結構域。特定而言，例如，抗體片段可包括Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv片段；雙鏈抗體；線性抗體；單鏈抗體分 子；及自抗體片段形成之多特異性抗體。
如本文所用，術語「抗原」一般係指在適當條件下能夠與特定針對該抗原之抗體反應之物質。
如本文所用，術語「分析物」一般係指在所檢測及/或量測之樣品中之物質或一組物質。
如本文所用，術語「生物樣品」一般係指來自人類或動物之組織或流體之樣品，包括(但不限於)全血、血漿、血清、脊髓液(例如腦-脊髓液)；淋巴液、腹腔液(腹水)、皮膚之外部部分、呼吸道、腸道及泌尿生殖道、淚液、唾液、尿液、血球、腫瘤、器官、組織及活體外細胞培養成分之樣品。
如本文所用，術語「交叉反應性」一般係指抗體之個別抗原結合位點與多於一個之抗原決定子反應之能力或抗體分子群體與多於一個之抗原反應之能力。一般而言，交叉反應係由於以下而出現：(i)交叉反應抗原與免疫抗原共用共同表位，或(ii)其具有結構上類似於免疫抗原上之表位之表位(多特異性)。
如本文所用，術語「標記」係指可直接或間接偶聯(例如，經由共價或非共價方式，單獨或經囊封)至分析物類似物(例如SDMA類似物)之可檢測化合物或組合物。舉例而言，酶標記可催化可檢測之受質化合物或組合物之化學改變。本發明中所採用之酶可係(但不限於)：鹼性磷酸酶(AP)；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(「G6PDH」)；β半乳糖苷酶(B GAL)；及辣根過氧化酶(HRP)、蘋果酸脫氫酶(MDH)。酶之任何列舉(例如「G6PDH」或「葡萄糖-6-磷酸脫氫酶」在本文中亦包括該酶之變體、同種型及突變體，例如如US 6,455,288(其整體內容以引用的方式併入本文)中所述具有胺基酸取代之G6PDH。標記之中和產生可藉由諸如電磁輻射之檢測或直接可視化之方式檢測且可視情況量測之訊號。
如本文所用，術語「單株抗體」一般係指自實質上均相抗體之群體獲得之抗體，即，包括該群體之個別抗體係相同的。單株抗體具有高度特異性，其針對單一抗原位點。與通常包括針對不同表位之不同抗體之多株抗體製劑相反，每一單株抗體針對抗原上之單一表位。修飾語「單株」僅係指抗體之特徵且不應解釋為需要藉由任何具體方法產生抗體。特定而言，例如，單株抗體可藉由雜交瘤方法製得，且可藉由重組DNA方法製得，或可使用已知技術自噬菌體抗體文庫分離。
如本文所用，術語「多肽」一般係指具有由肽鍵鏈接之胺基酸序列之分子。此術語包括蛋白質、融合蛋白、寡肽、環肽及多肽衍生物。抗體及抗體衍生物在上文係在單獨部分中討論，但出於本發明之目的，抗體及抗體衍生物視為多肽及多肽衍生物之子類。
「受體」係指能夠識別分子之具體空間及極性構成(例如表位或決定子位點)之任何化合物或組合物。說明性受體包括抗體、Fab片段及諸如此類。
「結合特異性」或「特異性結合」係指第一分子對第二分子(例如分析物(例如SDMA)及特定針對該分析物之多株或單株抗體、或抗體片段(例如Fv、單鏈Fv、Fab’或F(ab’)2片段))之實質識別。舉例而言，如本文所用，「特異性」一般係指個別抗體結合位點僅與一個抗原決定子反應之能力或抗體分子群體僅與一個抗原反應之能力。一般而言，在分析物-抗體反應中存在高度特異性。抗體可辨別以下方面之差異：(i)分析物之一級結構，(ii)分析物之異構形式，及(iii)若適當，分析物之二級及三級結構。展現高特異性之抗體-分析物反應展現低交叉反應性。
「實質結合」或「實質上結合」係指在具體分析條件下分析混合物中之分子之間之特異性結合或識別之量。在其最寬態樣中，實質 結合係指第一分子不能結合或識別第二分子與第一分子結合或識別第三分子之能力之間之差異，使得該差異足以允許實施有意義分析以在一組具體分析條件下(包括分子之相對濃度及培育之時間及溫度)區別特異性結合。在另一態樣中，一個分子在交叉反應性意義上實質上不能結合或識別另一分子，其中在一組具體分析條件下，第一分子對第二分子展現之反應性為針對第三分子所展現反應性之小於25%、例如小於20%、小於15%、小於10%、小於5%或小於1%。特異性結合可使用許多廣泛已知之方法測試，例如免疫組織化學分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或西方墨點分析。
如本文所用，術語「鹽」意指酸與化合物之鹼性官能基之間形成之鹽。說明性鹽包含(但不限於)硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異菸鹼酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽、富馬酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽及雙羥萘酸鹽(即，1,1’-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘酸鹽))。術語「鹽」亦係指具有酸性官能基(例如羧酸官能基)之化合物與無機或有機鹼之間形成之鹽。適宜鹼包括(但不限於)鹼金屬(例如鈉、鉀及鋰)之氫氧化物；鹼土金屬(例如鈣及鎂)之氫氧化物；其他金屬(例如鋁及鋅)之氫氧化物；氨及有機胺，例如未經取代或經羥基取代之單-、二-或三烷基胺；二環己基胺；三丁基胺；吡啶；N-甲基，N-乙胺；二乙胺；三乙胺；單-、雙-或參-(2-羥基-低碳烷基胺)，例如單-、雙-或參-(2-羥基乙基)胺、2-羥基-第三丁基胺或參-(羥基甲基)甲胺；N,N-二-低碳烷基-N-(羥基低碳烷基)-胺，例如N,N-二甲基-N-(2-羥基乙基)胺或三-(2-羥基乙基)胺；N-甲基-D-葡萄糖胺；及胺基酸，例如 精胺酸、離胺酸及諸如此類。
現轉向本發明，一般而言，本發明係關於以解決與除分析物以外之樣品及試劑組份相關之背景訊號的方式免疫檢測樣品中之分析物。舉例而言，除分析物以外之樣品組份可彼此或與用於分析之試劑組份反應。該等反應可導致干擾檢測方法之準確度。生物樣品因包括許多可在分析中產生背景雜訊之組份而眾所周知。
樣品可基於EMIT®(酶多聯免疫分析技術，Enzyme Multiplied Immunoassay Technique)均相免疫分析系統使用經修改分析來分析。在傳統EMIT®分析中，使含有分析物之樣品與抗分析物抗體、分析物二酶之偶聯物及當與該酶接觸時產生訊號之受質接觸。抗體至偶聯物之結合抑制或降低酶活性。當分析物存在於樣品中時，樣品分析物與經偶聯分析物競爭結合至抗體，此導致自酶/受質生成更多訊號。當不存在分析物時，更多結合可發生在抗體與偶聯物之間以限制或阻止訊號生成。因此，當存在之分析物越多時，生成之訊號越多。動力學分析可使用訊號生成速率作為樣品中分析物之存在或量之指示。
在本發明之一個態樣中，傳統EMIT®分析格式係在針對分析物及校準物二者之第一反應序列中實施。為方便起見，此第一反應序列在本文中可鑑別為「色彩分析(Color Assay)」。然後，在本發明之經修改分析中，第二及分離分析係在針對樣品及校準物之第二反應序列中實施。為方便起見，第二反應序列在本文中可鑑別為「空白分析(Blank Assay)」。空白分析之試劑不含抗分析物抗體且通常不含偶聯物。因此，空白分析提供樣品依賴性背景訊號。
在各種態樣中，本發明係關於訊號在用於測定分析物之濃度之兩種實例方法中之用途。為方便起見，實例方法在本文中係指「速率」方法及「固定」方法。在兩種方法中，使用色彩及空白分析中之一或多個訊號之量之間之差異。在一個態樣中，將訊號之量測為在特 定針對酶/受質系統之波長下之吸光度，如此項技術中所熟知。舉例而言，G6PDH/NAD酶/受質系統在340nm下吸光度之量測將提供在G6PDH之存在下NAD至NADH之轉化之相對量。該值可用於提供反映受質藉由酶之轉化之淨訊號(用於固定方法)或反應速率(用於速率方法)。作為替代，酶受質反應可與調介受質與各種電子受體(例如，染料)之間之電子轉移之電子載劑聯合使用，此將允許量測在不同於受質之波長下之反應速率。
在固定方法中，計算淨訊號。在一個實施例中，淨訊號係基於在預定終點處色彩及空白分析間之訊號(例如，吸光度)的差異，其可因耗盡所有受質而完成或未完成反應。在空白及色彩分析之終點處所量測訊號差異之量可用於提供淨訊號(例如，淨訊號=[色彩訊號之量]-[空白訊號之量])。或者，可測定色彩及空白分析二者之預定起點(T1)(其可為所有試劑之組合完成時或此後另一預定時間)與預定終點(T2)之間之訊號量的差異。來自該等測定之訊號之量的差異然後可用於測定淨訊號(例如，淨訊號=([T2色彩]-[T1色彩])-([T2空白]-[T1空白))。淨訊號可與校準曲線相比較以測定樣品中分析物之量。
當基於色彩及空白分析中每一者之單一量測計算淨訊號時，量測可在試劑已具有足夠時間反應之後進行。舉例而言，每一分析中之單一量測可在所有試劑組合後約30秒至約10分鐘時進行。更具體而言，單一量測可在所有試劑組合後30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360、390、420、450、480、510、540、570及600秒中之一者時進行。當在空白及色彩分析之每一者中量測兩次訊號時，第一量測(T1)係在自分析開始(組合樣品及試劑)約15秒至2分鐘後進行。此時間可基於試劑之濃度及樣品之預計濃度來調整。具體而言，T1可為組合所有試劑之後15、30、45、60、75、90、105或120秒。第二量測(T2)可在T1之後15秒至數分鐘時進行。舉例而言， T2可為(例如)第一量測(T1)後15秒、18秒、30秒、45秒或1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘或5分鐘。
在速率方法中，以界定之間隔自色彩分析之訊號減去空白分析之訊號以提供反應速率。使用校準物之反應速率以提供校準曲線，藉由樣品分析的反應速率曲線與該校準曲線比較可用於測定樣品中分析物之量。
在速率方法中，可藉由測量酶介導之反應期間複數個時間點之訊號(例如吸光度)來測定反應速率。考慮試劑濃度及分析溫度，訊號量測時間及間隔的確定係在熟習此項技術者之範圍內。舉例而言，可藉由樣品(或校準物)及所有試劑在室溫組合後約2-10分鐘開始量測吸光度來測定速率並每5-60秒再量測1-15分鐘。反應速率可以吸光度隨時間之變化表示。舉例而言，吸光度可在樣品(或校準物)及所有試劑組合之後約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分鐘時開始量測。吸光度通常以5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60秒之間隔量測約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分鐘。該等時間中之每一者可延長或縮短，取決於反應條件、分析物及試劑。
在固定或速率方法中，在淨訊號或反應速率中之計算中可對於樣品第一反應混合物之背景計算以提供正規化訊號。在一個實施例中，背景吸光度係自用於代替樣品之校準物基質量測。校準物基質之吸光度初始在所有試劑與基質組合時或在其後之限定時間時量測。校準物基質可係缺少任何分析物之校準物或對照混合物。舉例而言，缺少分析物之校準物基質可係已藉由透析或藉由另一預處理製程脫除分析物之樣品，如本文進一步闡述。在一個實施例中，經脫除或內源性物質特異性或非特異性血清、血漿或其他生物液體可用作校準物基質。在如本文進一步闡述之其他實施例中，校準物基質可為含有蛋白 質及/或其他組合物之水或稀釋劑(例如BSA於PBS中)。在色彩分析及空白分析二者中使用校準物基質代替樣品以提供兩個分析之背景訊號。
若背景已經測定，則在固定方法中自淨訊號(或T1及T2處之量測)或在速率方法中自用於測定樣品反應速率之每一量測減去背景。作為實例，在速率方法中，自用於測定樣品之反應速率(即，吸光度隨時間之改變)之每一吸光度量測減去校準物基質(具有試劑)之吸光度。在另一態樣中，以類似於樣品反應速率之方式測定背景速率。然後自樣品反應速率減去背景速率以提供第一樣品反應混合物之正規化反應速率。
因此，本發明係關於用於針對分析物實施分析之方法。該方法包括藉由形成樣品第一反應混合物對樣品實施色彩分析(樣品第一反應序列)，該樣品第一反應混合物包括樣品、抗分析物抗體、包括分析物及酶之偶聯物及當與該酶接觸時產生訊號之受質。通常，樣品第一反應混合物係藉由首先使樣品與抗體及受質接觸、且然後在第二步驟中添加偶聯物來形成。然而，樣品可首先與抗體及偶聯物組合，且然後在第二步驟中添加受質。在一個態樣中，酶及偶聯物保持分開直至反應序列準備開始為止。如本文所用，「接觸」係以其最寬泛態樣使用，除非本文另外規定，否則係指以任何順序組合試劑。一旦形成樣品第一反應混合物，即可立即或在此後之一或多個預定時間時量測來自混合物之訊號的量用於本發明之固定或速率方法中。
在本發明之經修改固定及速率方法中，以類似於樣品第一反應序列之方式實施單獨分析序列(樣品第二反應序列或「空白分析」)。然而，樣品第二反應序列之試劑不含抗分析物抗體。通常，空白分析之試劑不含偶聯物，但本文所闡述者係其中添加少量偶聯物或酶之實施例。具體而言，樣品第二反應混合物係藉由使樣品與受質接觸且在 一些情況中偶聯物但無抗分析物抗體接觸。量測來自樣品第二反應混合物之訊號。以與樣品第一反應序列相同之方式使用來自校準物基質之背景測定淨訊號或反應速率以提供樣品第二反應序列之正規化淨訊號或正規化反應速率。
在速率方法中，為提供樣品之最終反應速率，自樣品第一反應序列之正規化反應速率減去樣品第二反應序列之正規化速率。最終反應速率可用於測定樣品中分析物之存在或量。通常，此係藉由將樣品之最終反應速率與可根據此項技術中已知之方法製作之標準曲線相比較來實施。
校準物之色彩及空白分析可以類似於用於樣品之色彩及空白分析之方式實施。因此，一系列校準物第一反應序列(色彩分析)係藉由以下實施：藉由使包括已知量之分析物的一組校準物中之每一校準物與抗分析物抗體、包括分析物及酶之偶聯物及當與該酶接觸時產生訊號之受質個別接觸形成校準物第一反應混合物。量測校準物第一反應混合物中每一者之訊號並藉由以上文針對樣品第一反應混合物所述之方式計及與該等校準物第一反應混合物中之每一者相關之背景生成校準物第一反應混合物中每一者之正規化淨訊號(固定方法)或正規化反應速率(速率方法)。校準物中之一者可為用於測定背景之校準物基質(其不含分析物)。
在單獨反應系列(空白分析)中，校準物第二反應序列係藉由在不存在抗分析物抗體且通常偶聯物之情況下使該組校準物中之每一校準物與受質接觸形成校準物第二反應混合物。在一些情況中，偶聯物亦可如本文進一步闡述以通常少量存在。量測校準物第二反應混合物中之每一者的訊號，並藉由以上述方式計及與該等校準物第二反應混合物相關之背景正規化每一混合物之淨訊號或反應速率。
因此，在計及固定方法中之背景訊號中，自來自色彩分析之正 規化淨訊號減去來自空白分析之正規化淨訊號。在速率方法中，藉由自校準物第一反應序列中之校準物的正規化速率減去校準物第二反應序列中之校準物的正規化速率測定該等校準物中每一者之最終反應速率。然後可基於每一校準物之最終反應速率準備正規化標準曲線並藉由將樣品之正規化反應速率與正規化標準曲線相比較用於測定樣品中分析物之量。
在一個實施例中，與色彩分析及空白分析相關聯之試劑顯示於表1中。將試劑與適當稀釋劑及/或緩衝劑組合。如表1中所示，空白分析試劑2(R2)不含偶聯物，但如本文進一步闡述其可存在以確保反應具有適當體積之緩衝劑。在一些態樣中，在不使用空白分析R2之情況下，空白分析R1可具有額外體積。在一個實施例中，用於色彩分析之試劑與用於空白分析之試劑相同，惟存在或不存在抗體及偶聯物。當在空白分析中R2不含任何偶聯物時，其仍含有稀釋劑、緩衝劑及用於色彩分析之R2的其他組份。
Figure 105105218-A0305-02-0019-7
在一些實施例中，空白分析R1亦可含有抗分析物抗體。
色彩分析中之校準物及測試樣品由於添加至反應混合物之分析物-酶偶聯物通常可預計產生吸光度之增加。許多樣品當在空白分析中測試時亦產生正反應，此乃因即使不存在偶聯物，內源性酶與內源性受質或與R1之受質之反應性將產生吸光度之增加。然而，樣品及校準物通常稀釋至通常小的背景訊號進一步減弱之程度，使得反應混 合物當在空白分析中測試時吸光度將產生極少至沒有變化。由於吸光度之變化可低於檢測器之靈敏度範圍，此可導致在分析儀上校準曲線失效。
為避免此問題，可將酶或分析物-酶偶聯物添加至空白分析以確保產生吸光度之小的正變化(無論校準物或樣品行為如何)。因此，表2顯示此實例中存在之試劑。
Figure 105105218-A0305-02-0020-8
酶或偶聯物在R2中之濃度通常保持較低以防止在校準物基質之分析中的不期望雜訊。舉例而言，當酶係G6PDH時，可將約1-15ng/mL酶(經偶聯或未經偶聯)添加至空白分析。具體而言，可添加約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15ng/ml。R2中偶聯物之量取決於分析物之大小，此乃因較大分析物將需要較高數量之偶聯物以提供相同量之酶。在一個實施例中，酶(單獨或經偶聯)在用於色彩分析之R2中之濃度為酶在用於空白分析之R2中之濃度的約10至約150倍。在各個實施例中，在色彩分析中之偶聯物之濃度為酶在用於空白分析之試劑中之濃度的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140及150倍。當偶聯時，酶活性通常小於未經偶聯之酶。舉例而言，經偶聯酶之活性自未經偶聯之酶的活性廣泛變化，例如偶聯物酶之活性為未經偶聯之酶的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。因此，當未經偶聯之酶用於空白分析之R2中時，其可以比肉若其係偶聯物時少的量使用且 仍提供與經偶聯酶相同之活性。
一種受質或多種受質(當酶具有多於一個受質時)可過量存在於試劑中。
在一些態樣中，分析試劑可包括分析試劑之穩定劑。舉例而言，當訊號產生酶係葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)時，可將葡萄糖-6-磷酸(G6P)或NAD添加至含偶聯物之試劑以穩定酶-分析物偶聯物。
血清含有若干種可貢獻背景之酶。因此，將特異性酶抑制劑添加至試劑稀釋劑可進一步改良分析準確度。抑制劑幫助消除色彩及空白分析中之一部分干擾雜訊。因此，在各種態樣中，反應組份可包括內源性樣品酶之抑制劑。舉例而言，草醯胺酸鈉係乳酸脫氫酶(LDH)(其係NAD及/或NADP之酶)之已知抑制劑。草醯胺酸鈉藉由防止LDH轉化樣品中或可為與分析相關聯之酶-受質系統(例如，G6PDH/NAD)之一部分之NAD來防止與內源性樣品LDH相關聯之背景訊號。已知超過三十種血清酶及酶抑制劑組合且抑制劑可用於其中之許多。
在一個態樣中，校準物包括於去離子水或鹽水中之已知數量之分析物(或沒有校準物基質)以提供代替樣品使用之校準基質。在其他態樣中，使用經脫除之血清而非水或鹽水。經透析血清係中性、物種特異性或非特異性血清或血漿，其已在(例如)透析製程中脫除分析物。已知眾多其他樣品預處理製程用以移除分析物或使其失活。在該等實施例之每一者中，溶液摻加有已知數量之分析物以提供超過樣品中分析物之預計濃度範圍之一系列校準物。在另一實施例中，校準溶液係基於蛋白質之溶液，例如1-7% BSA於PBS中。在此實施例中，可需要將BSA校準物校準至經脫除及摻加之血清校準物。
通常，由於空白分析意欲補償貢獻背景訊號之內源性蛋白質、酶或其他大分子組份，故水或鹽水更適於非生物樣品，儘管在許多情 形中利用水或鹽水作為生物樣品之校準物溶液可獲得足夠特異性。同樣，在自動化分析儀中使用水或鹽水緩衝劑用於校準物基質可具有產生校準物基質之錯誤訊息的趨勢，此乃因與緩衝劑之使用相關聯之反應速率與血清相比可導致顯著增加之反應速率。在此情形中，減去校準基質之吸光度值將導致負速率。儘管該等速率可針對基於血清之校準物基質正規化，但在此情形中自動化分析儀通常將產生錯誤訊息。
根據本發明之一個實施例，分析物係SDMA且酶-偶聯物系統係G6PDH/NAD。在此實施例中，SDMA之類似物偶聯至G6PDH且在色彩及空白分析中用作偶聯物，以測定在來自諸如人類、貓及狗等動物之血清或血漿樣品中SDMA之存在或量。在此實施例之一個態樣中，校準物係藉由將已知量之SDMA與校準物基質(經脫除之血清或血漿)組合來製備。色彩及空白分析係如上文所述使用以下試劑以如表3中所述之實例性量來實施：
Figure 105105218-A0305-02-0022-9
具體而言，抗SDMA抗體在色彩分析之R1中可具有約4μg/mL至約10μg/mL、例如約4、5、6、7、8、9或10μg/mL之濃度。在色彩分析或空白分析之R1中，G6P及NAD之濃度可為約8-75mM、更具體而言約10-65mM或約20-55mM、且更具體而言約8、10、15、20、25、30、35、40、45 50、55、60、65、70mM。在色彩分析之R2中，SDMA-G6PHD偶聯物之濃度可為約0.25至約0.75μg/mL、更具體而言 約0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.65、0.70或0.75μg/mL。在空白分析之R2中，偶聯物之濃度可為約5-30ng/mL、更具體而言約5、10、15、20、25或30ng/mL。
G6P存在於R2試劑中以穩定酶。或者，可使用NAD。穩定受質係可選的。
試劑可與樣品及校準物以以下體積組合用於色彩及空白分析，但體積可經調整以適應不同分析物及反應條件：
樣品：5-20μL
R1：20-60μl
R2：20-150μL
在一個具體實施例中，反應混合物含有10μl樣品、40μl R1及125μL R2。
在色彩及空白分析中使用以上試劑，可製備校準曲線並用於測定血清或血漿樣品中SDMA之存在或量。圖1顯示利用Beckman AU680®臨床化學分析儀在正常及慢性腎病人類血清樣品使用速率方法測定SDMA之結果。結果顯示當與金標準LC-MS相比時，精確測定SDMA濃度。使用人類血清(未經脫除)作為校準物基質。因此，本發明係關於測定動物(包括人類且例如家畜、農場動物及動物園動物)中之慢性腎病之方法。方法包括根據本發明方法測定來自動物個體之生物樣品中之SDMA濃度，並將濃度與健康個體及患有慢性腎病之個體中來自與該個體相同物種之樣品中之SDMA量之標準曲線或其他模型相比較。
在一個實施例中，本發明係關於含有測定樣品中分析物之存在或量之試劑的套組。舉例而言，套組可包括用於實施色彩分析之第一組試劑，例如包括抗分析物抗體及用於酶之訊號產生受質之第一試劑及包括分析物與酶之偶聯物之第二試劑。套組亦可包括第二組試劑， 其包括含有受質之第三試劑。第二組試劑亦可包括含有緩衝劑/稀釋劑及視情況偶聯物之第四試劑。僅含有緩衝劑/稀釋劑之第四試劑之目的係確保與第二組試劑相關聯之反應以適當體積實施。當第二組試劑不包括第四試劑時，應相應地調整第三試劑之體積。另外，第三或第四試劑均不可含有抗分析物抗體。
每一試劑中組份之濃度及量可如上文針對色彩及空白分析中每一者之R1及R2所述。舉例而言，第一試劑中偶聯物之濃度為第四試劑中偶聯物之濃度的約5倍至約150倍。在一個態樣中，套組中之至少一種試劑包括除偶聯物之酶以外之酶的抑制劑。套組亦可包括標準物或一系列標準物(校準物)，其包括已知量之稀釋於適當稀釋劑(例如水、鹽水)或經脫除或處理之血清或血漿(例如，預處理樣品)中之分析物。
當分析物係SDMA時，實例性套組包括於第一試劑中之抗SDMA抗體(多株或單株)及受質(例如NAD及G6P)。第二試劑包括SDMA類似物及G6PDH之偶聯物作為酶之穩定劑。第三試劑包括SDMA-G6PDH偶聯物及視情況第四試劑。第四試劑可僅含有稀釋劑或緩衝劑，或其可含有偶聯物。
除套組以外，本發明係關於反應混合物，其包括來自套組之試劑及懷疑含有SDMA之樣品。舉例而言，反應混合物可包括樣品或校準物、抗SDMA抗體、SDMA-G6PDH偶聯物、NAD及G6P。
在本發明之套組、方法及反應混合物中之每一者中，許多酶/受質系統可用於代替G6PDH/NAD。作為另一實例，蘋果酸脫氫酶係酶，其類似於G6PDH使用NAD+至NADH之還原催化蘋果酸至草醯乙酸根之氧化。另外，已知許多增強酶之訊號或穩定性之酶突變體。參見例如美國專利第6,455,288號。
分析物-酶偶聯物可藉由各種已知方法製備。所採用方法及試劑 之選擇可在分析物與酶之間提供各種長度之鏈接體。鏈接體長度可對抗體抑制酶活性之能力有影響且因此影響分析靈敏度。通常，可使用約5-15個原子或2-20埃之鏈接體。對於許多可根據本發明檢測之分析物而言，酶至分析物之偶聯在熟習此項技術者之範圍內。
舉例而言，圖2顯示式1之SDMA類似物(下文)至葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)之偶聯。G6PDH在偶聯之前利用碘乙酸琥珀醯亞胺酯(SIA)活化。利用SIA之活化在SDMA及酶(-C-C-S-C-C(O)-)之間產生五原子鏈接體，其在SDMA上不包括在SDMA之衍生期間利用氮代替氧產生之非原生氮。
圖3顯示式1之SDMA類似物使用3-(溴乙醯胺基)丙酸琥珀醯亞胺酯(SBAP)偶聯至G6PDH，此導致九原子鏈接體(不計及非原生氮)(-C-C-S-C-C(O)-C-N-C-C(O)-)。
圖4顯示式1之SDMA類似物使用4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基琥珀醯亞胺酯(SMCC)偶聯至G6PDH，此導致十二原子鏈接體。
鏈接體長度可在偶聯反應中藉由利用其他試劑或使用其他SDMA類似物修飾G6PDH來調整以提供(例如)約5個至約15個原子、具體而言約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個原子之鏈接體長度。因此，本發明係關於藉助5-15個原子之鏈接體之SDMA與酶之偶聯物，其僅包括藉助最短途徑直接位於鏈接體之鏈中之彼等原子，其排除鏈接體分子中不為SDMA與酶之間之最短途徑之一部分之側鏈、取代基或環之任何原子。
鏈接體長度可在約2埃至約20埃之範圍內、具體而言約5埃至約15埃、更具體而言約6-10埃。
在一個實施例中，SDMA係在G6PDH受質葡萄糖-6-磷酸(G6P)及/或菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)之存在下偶聯至G6PDH。最佳偶 聯物-酶活性及藉由抗體之活性抑制可藉由調整酶、受體及SDMA之比率來獲得。
適用於偶聯至G6PDH之SDMA的若干類似物闡述於美國專利第8,481,690號中，其整體以引用的方式併入本文中。端視SDMA與G6PDH之間之鏈接體的期望長度而定，可使用以下類似物中之一者：
Figure 105105218-A0305-02-0026-10
Figure 105105218-A0305-02-0026-11
Figure 105105218-A0305-02-0026-12
Figure 105105218-A0305-02-0026-13
其中x及y係1至5範圍內之整數。
式A、B及C提供可與包括適當「硫醇-反應性位點」(即，將與硫醇基團反應之位點)之偶聯靶標反應之可用硫醇。舉例而言，馬來醯亞胺、烷基及芳基鹵基及α-鹵基醯基係可與硫醇反應以形成硫醚之說明性硫醇-反應性位點。類似地，吡啶基二硫化物可與硫醇反應以形成混合二硫化物。利用SIA、SBAP或SMCC活化之G6PDH提供適當硫醇反應性位點。當X=1時，式A與SIA活化之G6PDH之偶聯在SDMA與G6PDH之間提供五原子鏈接體。式A(X=1)與SMCC之偶聯導致十二原子鏈接體。藉由改變X可獲得其他鏈接體長度。
在一個具體實施例中，當X=1時，SDMA類似物具有下式(式1)：
Figure 105105218-A0305-02-0027-43
式1可自SDMA(自Gibbstown,NJ之EMD Chemicals公司市售購得)藉由以下說明性合成方案(1)來製備：
Figure 105105218-A0305-02-0027-15
藉由使SDMA與二碳酸二-第三丁基酯(Boc2O)反應保護SDMA之一級及二級胺基。然後將所得經第三丁氧基羰基(BOC)保護之SDMA((Boc3)-SDMA,1)鏈接至樹脂。舉例而言，(Boc3)-SDMA(1)可藉由使(Boc3)-SDMA(1)與樹脂在2-(1H-7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸甲銨(HATU)及N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)之存在下在二甲基甲醯胺(DMF)中接觸鏈接至半胱胺-4-甲氧基三苯甲基樹脂(EMD Chemicals公司，Gibbstown,NJ)，以提供結合(Boc3)-SDMA胱胺之樹脂(2)。移除結合(Boc3)-SDMA胱胺之樹脂(2)上之BOC保護基團並使用(例如)二氯甲烷中之三氟乙酸將所得結合SDMA胱胺之樹脂自樹脂裂解以提供SDMA半胱胺(3)，其藉由與鹽酸反應轉化成鹽酸鹽(4)。
傳統EMIT®分析藉由監測340nm下之吸光度量測NADH(或NADPH)之累積。在本發明之另一實施例中，將色彩改變染料及電子傳遞介質添加至試劑中可允許量測在340nm以外之波長下之吸光度。在一個具體實例中，染料係3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)且傳遞介質係1-甲氧基吩嗪甲基硫酸鹽(PMS)。如圖5中所繪示，PMS自NADP拾取電子並將其轉移至MTT，此使得MTT還原以提供在大約650nm下之吸光度。
抗SDMA抗體可為多株或單株抗體，如美國專利第8,481,690號中所述。產生多株及單株抗體之方法係在熟習此項技術者之範圍內。在一個實施例中，抗體係針對SDMA-KLH偶聯物產生之單株抗體，其具有以下結構：
Figure 105105218-A0305-02-0028-16
在各種態樣中，用於本發明經修改分析中之抗SDMA抗體對SDMA可具有高特異性且與一或多種選自由以下組成之群之化合物沒 有或實質上沒有交叉反應性：不對稱二甲基精胺酸(ADMA)、L-精胺酸及N-甲基精胺酸。舉例而言，在一組具體分析條件下，抗SDMA抗體對ADMA、L-精胺酸及N-甲基精胺酸展現之反應性為針對SDMA所展現反應性之小於25%、小於20%、小於15%、小於10%、小於5%或小於1%。
所有上述組份均可用於測定樣品中游離SDMA之存在或量之方法中。舉例而言，該方法包括使樣品與抗SDMA抗體、包括SDMA及G6PDH之偶聯物及包括NAD及G6P之受質接觸。如本文所述，量測NAD至NADH之轉化率並與標準曲線相比較以測定樣品中SDMA之存在或量。SDMA係利用如本文所述之5-15原子鏈接體(2-10埃)偶聯至G6PDH。抗SDMA抗體可為對ADMA、L-精胺酸及N-甲基精胺酸沒有反應性或實質上沒有反應性之單株抗體。
在另一實施例中，本發明係關於測定樣品中之SDMA的方法，其包括使游離SDMA衍生並使用針對該衍生物之抗體。舉例而言，美國專利公開案2004/0214252(其整體以引用的方式併入本文中)闡述修飾SDMA之胍基氮之方法及針對經修飾SDMA之抗體。因此，在一個實施例中，樣品中之SDMA在根據本發明之方法測定之前經修飾。在此實施例中，抗SDMA抗體應以足夠親和力結合至經修飾SDMA及偶聯物之SDMA(其亦可經修飾)二者以提供適宜分析。
實例 實例1：經脫除之血清之製備
將未經處理之市售犬血清(500mL)加載於雙足SNAKESKINTM透析管(3.5K MWCO,35mm Dry I.D.)(Thermo Scientific)上並針對PBS緩衝劑(20L)利用20g碳粉末在4℃下透析至少6小時。藉由更換緩衝劑及碳將製程重複三次。
在透析之前及之後藉由LC/MS量測血清中之SDMA濃度。在透析 之前之血清中，SDMA為9.89μg/dL。在透析之後，SDMA為0.02μg/dL。
將經木炭脫除之犬血清儲存於-80℃以供使用：
實例2：SDMA標準物製備：
將SDMA.HCl(ChemBio)溶於去離子水中至1000μg/ml之SDMA最終濃度。將200μl SDMA水溶液添加於10ml經脫除之血清中用於SDMA濃度為20μg/ml之最終原液。將溶液儲存於-80℃下。將280μl SDMA原液轉移至10ml經脫除之血清中以製備56μg/dL之標準SDMA。藉由將原液連續稀釋於經脫除之血清中來製備其他SDMA標準物以提供28.0、14.0、7.0及3.75μl/dL之溶液。標準物可藉由LC/MS驗證。
實例3：稀釋劑之製備
稀釋劑調配物R1及R2含有表4中所鑑別之組份。草醯胺酸鈉係可選組份，如本文中別處所述。
Figure 105105218-A0305-02-0030-17
稀釋劑製備方案
R1稀釋劑(1L規模)。將以下組份添加至500ml去離子水中：10g BSA
50ml 1M TRIS,pH 8.0
0.372g EDTA鈉
4ml Brij-35(30%)
4ml Proclin 150
0.96g PEG 6000
17.6g NaCl
10ml小鼠血清
1.665g草醯胺酸鈉(可選)
使用攪拌棒將溶液以緩慢速度充分混合。一旦粉末完全溶解，即視需要利用10N NaOH或3N HCl將pH調整至7.0。將溶液添加至量筒並使用去離子水使其至1L之最終體積。充分混合之後，將溶液輕柔地充分混合，並藉助0.2μm硝酸纖維素過濾器單元過濾並在使用之前儲存於4℃下。
R2稀釋劑(1L規模)：將以下組份添加至500ml去離子水中：10g BSA
100ml 1M TRIS,pH 8.0
2ml 0.5M EDTA(pH 8.0)
4ml Brij-35(30%)
4ml Proclin 150
0.96g PEG 6000
17.6g NaCl
10ml小鼠血清
G6P 0.56g
1.665g草醯胺酸鈉(可選)
使用攪拌棒將溶液以緩慢速度充分混合。一旦粉末完全溶解，即視需要利用10N NaOH或3N HCl將pH調整至8.0。將溶液添加至量筒並使用去離子水使其至1L之最終體積。充分混合之後，將溶液輕柔地充分混合，並藉助0.2μm硝酸纖維素過濾器單元過濾並在使用之前儲存於4℃下。
實例4：分析試劑之製備 R1試劑及R1空白之製備
R1試劑及R1空白含有存於R1稀釋劑中之NAD(35mM)、G6P(56mM)。R1試劑亦包括抗體(10.5μg/ml)。G6P係偶聯物之穩定劑且係可選的。
在製備試劑之前，使稀釋劑及其他材料處於室溫。藉由將4.644g NAD及3.160g葡萄糖-6-磷酸(G6P)鈉添加至R1稀釋劑中來製備2X受質工作溶液(100ml)。藉由輕柔地混合使粉末完全溶解並用10M NaOH或3M HCl將pH調整至7.0。將溶液添加至量筒中並添加額外R1稀釋劑以獲得100mL之最終體積。藉由在滾筒上輕柔地旋轉將溶液充分混合並經0.2μm硝酸纖維素過濾器單元過濾。
藉由抗體原料(6.6mg/ml)以1：10倍預稀釋於R1稀釋劑中以獲得660μg/ml之抗體溶液來製備4X抗體工作溶液(25ml)。將1.59ml預稀釋之抗體溶液(660μg/ml)添加至23.41ml R1稀釋劑中以製備濃度42μg/ml之抗體工作溶液(4X)。
藉由混合40ml受質工作溶液(2X)、20ml抗體工作溶液(4X)及20ml R1稀釋劑製備R1試劑。將溶液輕柔地混合，用鋁箔覆蓋，並在使用之前儲存於4℃。
藉由40ml受質工作溶液(2X)及40ml R1稀釋劑混合製備R1空白。將溶液輕柔地混合，用鋁箔覆蓋，並在使用之前儲存於4℃。
R2試劑及R2空白之製備
R2試劑含有於R2稀釋劑中之SDMA-G6PDH偶聯物(0.42μg/ml)。R2空白含有於R2稀釋劑中之SDMA-G6PDH偶聯物(0.014μg/mL)。
將0.3ml偶聯物原料(批號5616-80-2,770μg/ml)添加至29.7ml R2稀釋劑中以1：100倍預稀釋偶聯物，獲得7.7μg/ml之最終濃度。
將21.8ml經預稀釋之偶聯物溶液添加至378.2ml R2稀釋劑中以製備R2試劑。
將0.73ml經預稀釋之偶聯物溶液添加至399.27ml R2稀釋劑中以製備R2空白。
將溶液充分混合並在使用之前儲存於4℃。
實例5：SDMA類似物N,N’-二甲基精胺酸硫醇(SDMA-SH)之製備 材料：
- 半胱胺4-甲氧基三苯甲基樹脂：載量0.7mmol/g樹脂及200-400網目共聚物基質(Novabiochem)。
- Fmoc-SDMA(Boc)2ONa：MW 624.7，純度
Figure 105105218-A0305-02-0033-41
95%,(Novabiochem)
- HATU：MW 380.3(Novabiochem)。
- N,N-二異丙基乙胺：藉由重結晶純化，99.5%，來自Sigma.
- DMF(無水)：純度
Figure 105105218-A0305-02-0033-42
99.8%，來自Sigma.
- 六氫吡啶：20%存於無水DMF中。
程序：
向20mL小瓶中添加半胱胺4-甲氧基三苯甲基樹脂(1.2g,0.46mmol)、Fmoc-SDMA(Boc)2ONa(0.9g,1.4mmol,3.0當量)、HATU(0.54g,1.4mmol,3.0當量)、二異丙基乙胺(0.4mL,2.3mmol,5.0當量)及無水DMF(18mL)。將混合物蓋上蓋子並於室溫下顛倒16小時。使用玻璃移液管將液體自小瓶移除。然後將樹脂利用DMF(18mL,4次)、然後甲醇(18mL,4次)洗滌。將樹脂在室溫下於存於DMF中之20% 六氫吡啶中顛倒15分鐘(18mL,3次)。然後將樹脂利用DMF(18mL,4次)、然後甲醇(18mL,4次)洗滌，並在凍乾器上乾燥1小時。然後可將黃色/淺粉色樹脂儲存於4℃下或裂解以獲得SDMA-SH。
為進行裂解，將來自樹脂之SDMA-SH(50mg)在三氟乙酸(3mL)中在室溫下顛倒1小時。然後過濾深紅色漿液並利用乙腈(1mL)沖洗以獲得澄清黃色溶液。然後將溶液凍乾以獲得濃稠黃色油狀物之SDMA-SH(7mg)。由於硫醇之氧化，化合物應立即使用或儲存於-80℃下(在-80℃下儲存2個月後導致<10%氧化)。藉由LC/MS及NMR證實SDMA-SH(式1)。
Figure 105105218-A0305-02-0034-18
實例6：SDMA與G6PDH之偶聯
SDMA與G6PDH之偶聯物係藉由在NAD及G6P之存在下將SDMA類似物SDMA-SH與利用SIA、SBAP或SMCC活化之G6PDH偶聯來製備。SDMA與G6PDH之間之鏈接體的長度可藉由選擇如圖2、3及4中所示用於活化之試劑來改變。
酶利用SIA預活化：將一小瓶之葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)(12mg)溶於3ml MES緩衝劑(50mM,pH 8.0)中並旋轉1小時以確保酶完全溶解。將酶溶液保持於冰上直至需要時為止。將額外4.5ml MES緩衝劑(50mM,pH 8.0)添加至酶溶液，藉助渦旋(5秒)充分混合並於冰上保持10分鐘。將100mg G6P溶於1ml去離子水中並於冰上保持10min。將200mg NADH溶於1ml去離子水中並於冰上保持10min。將0.68ml G6P溶液及0.34ml NADH溶液添加至酶溶液，藉助渦旋(5秒) 充分混合並於冰上保持10min。將一小瓶之SIA(50mg)溶於0.5ml DMSO(100mg/ml)中。將0.14ml SIA溶液添加至酶溶液，藉助渦旋(5秒)充分混合，用鋁箔覆蓋，並於室溫下旋轉2小時。將溶液轉移至G2 Slide-A-Lyzer透析盒並在黑暗中在4℃下針對PBS緩衝劑(4L)透析5小時。將緩衝劑更換為新鮮PBS(4L)並將溶液在黑暗中在4℃下透析過夜。將透析緩衝劑更換為MES(4L,25mM,pH 8.0)並將溶液在4℃下透析3小時。自透析盒移除12.5ml酶溶液並添加0.32ml MES緩衝劑(1M,pH 8.0)及0.32ml EDTA(0.2M,pH 8.0)以使溶液之最終濃度為50mM MES及5mM EDTA。若需要，若酶溶液少於12.5ml，可相應地調整MES及EDTA之體積。用氬使溶液脫氣5分鐘。
酶利用SBAP預活化：向存於1ml MES緩衝劑(50mM,pH 8.0)之2mg G6PDH中添加11.3mg G6P及16.8mg NADH，充分混合並於冰上保持10min。將SBAP(50mg)溶於0.5ml DMSO(100mg/ml)中。將0.025ml SBAP添加至酶溶液，藉助渦旋(5秒)充分混合，覆蓋鋁箔，並於室溫下旋轉2小時。將溶液轉移至G2 Slide-A-Lyzer透析盒並在黑暗中在4℃下針對PBS緩衝劑(2L)透析5小時。將緩衝劑更換為新鮮PBS(2L)，並將溶液在黑暗中在4℃下透析過夜。將透析緩衝劑更換為MES(2L,25mM,pH 8.0)並將溶液在4℃下透析3小時。自透析盒移除2.5ml酶溶液並添加0.060ml MES緩衝劑(1M,pH 8.0)及0.025ml EDTA(0.5M,pH 8.0)以使溶液之最終濃度為50mM MES及5mM EDTA。
酶利用SMCC預活化：向存於1ml MES緩衝劑(50mM,pH 8.0)中之2mg G6PDH中添加11.3mg G6P及16.8mg NADH，充分混合並於冰上保持10min。將50mg-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基琥珀醯亞胺酯(SMCC)溶於0.5ml DMSO(100mg/ml)中。將0.035ml SMCC溶液添加至酶溶液，藉助渦旋(5秒)充分混合，覆蓋鋁箔並於室 溫下旋轉2小時。溶液將轉移至G2 Slide-A-Lyzer透析盒並在黑暗中在4℃下針對PBS緩衝劑(2L)透析5小時。將緩衝劑更換為新鮮PBS(2L)，並將溶液在黑暗中在4℃下透析過夜。在4℃下將透析緩衝劑更換為MES(2L,25mM,pH 8.0)達3小時。自透析盒移除2.5ml酶溶液並添加0.060ml MES緩衝劑(1M,pH 8.0)及0.025ml EDTA(0.5M,pH 8.0)以使溶液之最終濃度為50mM MES及5mM EDTA。
SDMA與經預活化G6PDH之偶聯：將新製備之SDMA-SH(式1)以以下量添加至預活化之酶溶液：0.35ml(100mg/ml)用於SIA-活化之G6PDH及0.065ml(100mg/ml)用於SBAP或SMCC活化之G6PDH。將溶液充分混合，並將混合物在4℃下旋轉36小時。將反應混合物在4℃下針對PBS(2或4L)使用G2 Slide-A-Lyzer透析盒(Thermo Scientific)透析(3或4個循環)。藉由在4℃下針對Tris HCl緩衝劑(25mM,pH 8.0)透析4小時使SDMA-酶偶聯物溶液平衡。將溶液使用0.45μm離心過濾器過濾(1500*g達10分鐘)。
表5顯示鏈接體長度及每一偶聯物之活性及抗體抑制偶聯物之G6PDH的能力。鏈接體長度不包括式1之SDMA衍生物中之非原生氮。G6PDH在SIA之存在下的預活化產生之酶活性較利用SBAP或SMCC製備之偶聯物為佳。
Figure 105105218-A0305-02-0036-19
實例7：抗SDMA單株抗體之製備
產生單株抗體之方法在熟習此項技術者之範圍內。在一個實施 例中，抗體係針對SDMA-KLH偶聯物產生之單株抗體，其具有以下結構：
Figure 105105218-A0305-02-0037-20
抗SDMA抗體之純化係如下實施：
材料：
˙2 x 2L抗SDMA
˙反相(rPA)管柱(5ml)(GE Healthcare)專門用於抗SDMA IgG純化
˙Pierce IgG純化緩衝劑
˙IgG結合緩衝劑
˙IgG低pH溶析緩衝劑
˙PBS,pH 7.4，用於透析
˙2 x 4L @ 4C
方案：
˙將rPA管柱(5ml)在結合緩衝劑中以3ml/min平衡
1.藉由OD 280nm監測流量
˙將1000ml抗SDMA稀釋於等體積Pierce IgG結合緩衝劑中
1.重複程序用於額外1000ml
˙以6ml/min將經稀釋抗SDMA加載於rPA管柱上
1.藉由OD 280nM監測流量
˙將rPA管柱用PBS/IgG結合緩衝劑1：1以3ml/min洗滌直至
1.OD 280nM達到基線為止
˙使用IgG低pH溶析緩衝劑以3min/ml溶析抗SDMA IgG
1.手動收集峰
˙將抗SDMA IgG立即針對4L PBS(更換2次)進行透析
1.30ml 10k MWCO盒
2.將體積彙集且OD 280nm用於測定IgG濃度
如美國專利第8,481,690號中所述藉由SDS Page、SEC及基於板之免疫分析分析抗體。
實例8：分析程序
實施本發明之經修改分析用於犬、貓及人類樣品中之SDMA。
試劑組份顯示於表6中。
Figure 105105218-A0305-02-0038-21
如上所述製備之試劑之移液體積對於色彩分析及空白分析係相同的：
Figure 105105218-A0305-02-0038-22
在Beckman AU680®自動化分析儀上實施樣品及校準物之色彩及空白分析及相關計算。使用含有56.0、28.0、14.0、7.0、及3.75及0μg/dL存於校準物基質(經脫除犬血清)中之SDMA之校準標準物用於貓及狗二者。將分析儀程式化以如下實施色彩及空白分析：將樣品及校準物添加至試劑R1並在添加R2之前培育3-4分鐘。在添加R2後大約36 秒開始量測340nm下之OD。每18秒量測吸光度達4個額外18秒循環。自用於計算色彩及空白分析之反應速率(吸光度之變化/min)之每一量測值減去校準物基質(0μg/dL SDMA)之吸光度值以提供正規化色彩及空白反應速率。
為測定標準曲線之速率，自色彩分析中每一校準物之正規化速率減去來自空白分析之每一校準物的正規化速率。樣品SDMA濃度係藉由以下測定：自色彩分析中樣品之正規化速率減去空白分析中樣品之正規化速率以提供最終樣品反應速率，將其與最終標準曲線相比較。
表7顯示僅使用色彩分析(「無減除」)及當自色彩分析速率減去空白分析速率(「有減除」)時貓及犬血清之SDMA分析之結果。樣品偏差反映LC/MS結果與使用上述程序之結果之間之差異。
Figure 105105218-A0305-02-0040-23
表8顯示在經脫除犬血清中使用已知量之SDMA在有或沒有減除之情況下製得之校準曲線。製備其他物種之類似曲線。
Figure 105105218-A0305-02-0040-24
表9顯示圖6中所示使用上述速率分析程序(即，有減除之色彩及空白分析)使用摻加有SDMA之未經脫除之人類血清之校準曲線之值。
Figure 105105218-A0305-02-0041-25
該曲線用於測定如圖1中所示之正常及慢性腎病人類血清樣品中之濃度。
實例9：酶抑制劑之使用
將乳酸脫氫酶抑制劑草醯胺酸鈉添加至空白試劑如上文實例3中所述之稀釋劑及試劑。抑制劑之使用可改良分析之精確度，如表10中所示。
Figure 105105218-A0305-02-0041-26
在此實例中，製備具有及不具有草醯胺酸鈉之犬血清之標準曲線，如表11中所示。可製備類似曲線用於其他物種。
Figure 105105218-A0305-02-0042-27
實例10：利用經脫除及未經脫除之人類血清校準物測試人類血清樣品
使用內源性及木炭脫除之人類血清作為校準物基質測定人類血清樣品中SDMA之發現。此試驗中所收集之數據可用於利用速率及固定校準方法製備校準曲線。
製備如表12中所示之分析試劑。
Figure 105105218-A0305-02-0042-28
如實例7中製備抗SDMA mAb並以1.5μg/mL分析濃度使用。
如實例6中製備SDMA-G6PDH並以0.3μg/mL分析濃度使用。
校準物係利用具有以下SDMA濃度(μg/dL)：0.0、4.7、15.0、29.0、59.0及111.0(藉由LC/MS測定)之木炭脫除之人類血清製備。
根據實例8實施速率方法。
在固定方法中，設置Beckman儀器以量測在反應開始後1分鐘與3分鐘之間在340nm下之吸光度的變化。
用於測定SDMA濃度之固定及速率計算方法之結果顯示於圖7中。
實例11：具有緩衝劑校準物之未脫除人類校準物劑量
使用基於緩衝劑之校準物(0、6、11、24、46及95ug/dL SDMA於具有1% BSA之PBS緩衝劑中)校準SDMA分析並用於測試未經脫除之人類血清標準物以確定發現。此試驗使用固定方法來計算在儀器循環12及16時340nm下之吸光度變化，其中每一循環為18秒(T1=216秒，T2=288秒)。未自淨吸光度減去來自試劑空白(diH2O)之吸光度。
如實例9中所示運行分析。結果如圖8中所示。
實例12：手動及自動化背景減除之比較
測試Beckman AU680®分析儀之機載自動化背景減除方法以確定機載解決方案之有效性。根據機載指令分析SDMA分析並單獨運行分析且使用離線方法計算之結果作為對照。
如實例1中製備木炭脫除之犬血清校準物。試劑組份顯示於表13中。
Figure 105105218-A0305-02-0044-29
反應體積係如下：
樣品體積：17μL
試劑1體積：25μL
試劑2體積：125μL
色彩及空白分析未鏈接機載分析儀。針對每一分析單獨生成資料並離開儀器進行處理。對於校準物及樣品，自色彩分析反應OD減去空白分析反應OD。將曲線擬合至校準資料且使用最佳擬合曲線之方程式根據經減除反應OD測定樣品濃度。
表14顯示在固定反應方法中校準物之吸光度的經變化：
Figure 105105218-A0305-02-0044-30
表15顯示樣品中之SDMA使用如表14中所示自校準物生成之標準曲線之量測。
Figure 105105218-A0305-02-0045-31
實例12：來自不同物種之校準物基質之分析
分析自各種動物物種之彙集血清製得之校準物組以測定當使用具有來自不同物種之血清之校準物時SDMA分析之穩健性。
人類SDMA之分析係如實例10中使用固定方法針對利用來自狗、貓及馬之經脫除及內源性(未經脫除)血清製得之校準物實施。分析結果顯示於圖9、10及11中。
實例13：基於緩衝劑之校準
校準曲線係針對表14中之校準濃度使用於PBS中之1% BSA作為校準基質。結果顯示於圖12中。
實例14：在沒有添加至空白試劑之偶聯物之情況下的SDMA分析.
SDMA分析係使用實例8之速率程序利用表6之試劑濃度來運行，惟未將偶聯物添加至R2。在Beckman分析儀上運行分析。結果展示於表16中。
Figure 105105218-A0305-02-0045-32
儘管本文已闡述本發明之各種特定實施例，但應瞭解，本發明並不侷限於彼等精確實施例，且熟習此項技術者可在其中作出各種改變或修改而不背離本發明之範圍及精神。
上文給出之實例僅係說明性的且並不欲作為本發明之所有可能實施例、應用或修改之詳盡列表。因此，本發明之所述方法及系統之各種修改及變化對熟習此項技術者將顯而易見，此並不背離本發明之範圍及精神。儘管已結合特定實施例對本發明進行闡述，但應瞭解所主張之本發明不應過度地限於此等特定實施例。實際上，對彼等熟習分子生物學、免疫學、化學、生物化學或相關領域之技術者顯而易見之用於實施本發明之所述方式的多種修改意欲涵蓋於隨附申請專利範圍之範圍內。
本文所引用之任何數值均包括自下限值至上限值以一個單位增加之全部數值，前提條件係任一下限值與任一上限值之間間隔至少2個單位。作為實例，若闡述組份之濃度或製程變量(例如，大小、角度大小、壓力、時間及諸如此類)之值為(例如)1至90、特定地20至80、更特定地30至70，則諸如15至85、22至68、43至51、30至32等值意欲清楚地枚舉於本說明書中。對於小於1之值，一個單位適當視為0.0001、0.001、0.01或0.1。該等僅為明確期望者之實例，且介於所列舉最低值與最高值之間之數值的所有可能組合皆視為以類似方式明確闡述於本申請案中。

Claims (59)

  1. 一種經分離偶聯物(conjugate)，其包含對稱二甲基精胺酸(SDMA)，該SDMA係經由5至9原子鏈接體(linker)偶聯至葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)。
  2. 如請求項1之經分離偶聯物，其中該SDMA係經由5原子鏈接體偶聯至該G6PDH。
  3. 如請求項1之經分離偶聯物，其中該SDMA係經由9原子鏈接體偶聯至該G6PDH。
  4. 如請求項1之經分離偶聯物，其中該鏈接體具有下式：
    Figure 105105218-A0305-02-0047-33
  5. 如請求項1之經分離偶聯物，其中該SDMA及該鏈接體形成下式基團：
    Figure 105105218-A0305-02-0047-34
  6. 如請求項1之經分離偶聯物，其中該SDMA及該鏈接體形成下式基團：
    Figure 105105218-A0305-02-0047-35
  7. 如請求項5或6之經分離偶聯物，其係選自由以下組成之群：
    Figure 105105218-A0305-02-0047-36
    Figure 105105218-A0305-02-0048-37
  8. 一種組合物，其包含如請求項1至7中任一項之偶聯物及對游離SDMA特異性之抗體。
  9. 如請求項8之組合物，其中該對游離SDMA特異性之抗體針對不對稱二甲基精胺酸(ADMA)之反應性小於其針對游離SDMA之反應性的25%。
  10. 如請求項9之組合物，其中該抗體與一或多種選自由以下組成之群之化合物沒有或實質上沒有交叉反應性：不對稱二甲基精胺酸(ADMA)、L-精胺酸及N-甲基精胺酸。
  11. 一種套組，其包含以下組份：如請求項1至7中任一項之偶聯物及對SDMA特異性之抗體。
  12. 如請求項11之套組，其進一步包含以下組份：菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。
  13. 一種反應混合物，其包含如請求項11之套組的組份及懷疑包含SDMA之樣品。
  14. 一種套組，其包含用於對含有分析物之樣品實施分析之試劑，其包含：(a)用於實施第一分析之第一組試劑，其包含i.第一試劑，其包含抗分析物抗體及G6PDH之訊號產生受質，及ii.第二試劑，其包含該分析物與如請求項1至7中任一項之該偶聯物，及(b)用於實施第二分析之第二組試劑，其包含i.第三試劑，其包含該受質。
  15. 如請求項14之套組，其中該第二組試劑進一步包含第四試劑，其包含稀釋劑及緩衝劑中之至少一者。
  16. 如請求項15之套組，其中該第四試劑進一步包含該偶聯物或該酶。
  17. 如請求項15之套組，其中該等試劑中之至少一者包含該偶聯物之該G6PDH以外之酶之抑制劑。
  18. 如請求項15之套組，其中該偶聯物在該第一試劑中之濃度係該偶聯物在該第四試劑中之濃度的5倍至150倍。
  19. 如請求項14之套組，其進一步包含標準物，該標準物包含已知量之分析物稀釋於已經脫除(stripped)該分析物之樣品溶液中。
  20. 如請求項14之套組，其中該第一試劑及該第二試劑中之至少一者進一步包含電子傳遞介質(mediator)及染料，且該第三試劑進一步包含該傳遞介質及該染料，其中該傳遞介質自該受質接受電子並將其轉移至該染料。
  21. 如請求項20之套組，其中該第一試劑及該第二試劑中之至少一者包含電子傳遞介質及染料，且該第三試劑及該第四試劑中之至少一者包含該傳遞介質及該染料，其中該傳遞介質自該受質接受電子並將其轉移至該染料。
  22. 如請求項14之套組，其中該分析物係游離對稱二甲基精胺酸(SDMA)。
  23. 如請求項22之套組，其中該抗分析物抗體係對游離SDMA特異性之抗體。
  24. 如請求項23之套組，其中該抗體對不對稱二甲基精胺酸(ADMA)之反應性小於其對游離SDMA之反應性的25%。
  25. 如請求項24之套組，其中該抗分析物抗體對ADMA、L-精胺酸及N-甲基精胺酸無反應性或實質上無反應性。
  26. 如請求項14之套組，其中該受質包含NAD。
  27. 如請求項14之套組，其中該第二試劑進一步包含葡萄糖-6磷酸(G6P)。
  28. 一種測定樣品中游離SDMA之存在或量之方法，其包含(a)使該樣品與對游離SDMA特異性之抗SDMA抗體、如請求項1至7中任一項之偶聯物及包含NAD之受質接觸，(b)量測NAD至NADH之轉化，及(c)基於NAD至NADH之轉化測定該樣品中SDMA之存在或量。
  29. 如請求項28之方法，其中該量測NAD至NADH之轉化包含量測NAD至NADH之轉化率。
  30. 如請求項29之方法，其中基於NAD至NADH之轉化測定該樣品中SDMA之存在或量包含比較NAD至NADH之轉化率與標準曲線。
  31. 如請求項28之方法，其中該量測NAD至NADH之轉化包含量測NAD至NADH之轉化量。
  32. 如請求項31之方法，其中基於NAD至NADH之轉化測定該樣品中SDMA之存在或量包含比較NAD至NADH之轉化量與標準曲線。
  33. 如請求項28之方法，其中該偶聯物係選自由以下組成之群：
    Figure 105105218-A0305-02-0050-38
    Figure 105105218-A0305-02-0050-39
  34. 如請求項28之方法，其中對游離SDMA特異性之抗SDMA抗體對不對稱二甲基精胺酸(ADMA)之反應性小於其對游離SDMA之反 應性的25%。
  35. 如請求項34之方法，其中該抗SDMA抗體對ADMA、L-精胺酸及N-甲基精胺酸無反應性或實質上無反應性。
  36. 一種對分析物實施分析之方法，其包含：(a)實施樣品第一反應序列，其包含：i.藉由使該樣品與抗分析物抗體、如請求項1至7中任一項之該偶聯物及當與該G6PDH接觸時產生訊號之受質接觸形成樣品第一反應混合物，及ii.量測來自該樣品第一反應混合物之訊號；(b)實施樣品第二反應序列，其包含i.藉由使該樣品與該受質接觸形成樣品第二反應混合物，ii.量測來自該樣品第二反應混合物之訊號；(c)自步驟(a)之訊號之量減去步驟(b)之訊號之量以提供淨訊號，(d)使用該淨訊號來測定該樣品中該分析物之量。
  37. 如請求項36之方法，其中該樣品第二反應混合物包含稀釋劑、緩衝劑及抗分析物抗體中之至少一者。
  38. 如請求項37之方法，其進一步包含：(a)實施校準物第一反應序列，其包含：i.藉由使包含已知量之該分析物的一組校準物中之每一校準物與抗分析物抗體、該偶聯物及當與該酶接觸時產生訊號之受質個別接觸形成校準物第一反應混合物，及ii.量測來自該等校準物第一反應混合物中每一者之訊號；(b)實施校準物第二反應序列，其包含i.藉由使該組校準物中之每一校準物與該受質接觸形成校準物第二反應混合物，及 ii.量測來自該等校準物第二反應混合物之訊號；(c)自步驟(b)之訊號量減去步驟(a)之訊號量以提供各校準物之淨訊號，(d)使用來自該等校準物中之兩者或更多者之淨訊號以生成標準曲線，(e)藉由該樣品之淨訊號與該標準曲線比較來測定該樣品中該分析物之量。
  39. 如請求項38之方法，其中該校準物第二反應混合物包含稀釋劑、緩衝劑及抗分析物抗體中之至少一者。
  40. 一種對分析物實施分析之方法，其包含：(a)實施樣品第一反應序列，其包含：i.藉由使該樣品與抗分析物抗體、如請求項1之該偶聯物及當與該G6PDH接觸時產生訊號之受質接觸形成樣品第一反應混合物，及ii.量測來自該樣品第一反應混合物之訊號；iii.藉由對於與該樣品第一反應混合物相關之背景之計算正規化該樣品第一反應混合物之反應速率，(b)實施樣品第二反應序列，其包含i.藉由使該樣品與該受質接觸形成樣品第二反應混合物，ii.量測來自該樣品第二反應混合物之訊號；iii.藉由對於與該樣品第二反應混合物相關之背景之計算正規化該樣品第二反應混合物之反應速率，(c)自步驟(a)(iii)之正規化速率減去步驟(b)(iii)之正規化速率以提供含有該分析物之樣品之最終反應速率，(d)使用該最終反應速率以測定該樣品中該分析物之量。
  41. 如請求項40之方法，其中該校準物第二反應混合物包含稀釋 劑、緩衝劑及抗分析物抗體中之至少一者。
  42. 如請求項40之方法，其中對於與該樣品第一反應混合物相關之背景之計算包含自與該樣品第一反應混合物之反應速率測定相關之複數個訊號量測值中之每一者減去該背景。
  43. 如請求項40之方法，其中對於與該樣品第二反應混合物相關之背景之計算包含自與該樣品第二反應混合物之反應速率測定相關之複數個訊號量測值中之每一者減去該背景。
  44. 如請求項40之方法，其進一步包含：(a)實施校準物第一反應序列，其包含：i.藉由使包含已知量之該分析物的一組校準物中之每一校準物與抗分析物抗體、該偶聯物及當與該酶接觸時產生訊號之受質個別接觸形成校準物第一反應混合物，及ii.量測來自該等校準物第一反應混合物中每一者之訊號；iii.藉由對於與該等校準物第一反應混合物中之每一者相關之背景之計算正規化該等校準物第一反應混合物中每一者之反應速率，(b)實施校準物第二反應序列，其包含i.藉由使該組校準物中之每一校準物與該受質接觸形成校準物第二反應混合物，ii.量測來自該等校準物第二反應混合物之訊號；iii.藉由對於與該等校準物第二反應混合物相關之背景之計算正規化該等校準物第二反應混合物中每一校準物之反應速率，(c)自步驟(a)(iii)之正規化速率減去步驟(b)(iii)之正規化速率以提供該等校準物中每一者之最終反應速率，(d)基於該等校準物中每一者之最終反應速率生成正規化標準 曲線，(e)藉由比較該樣品之正規化反應速率與該正規化標準曲線測定該樣品中該分析物之量。
  45. 如請求項44之方法，其中該校準物第二反應混合物包含稀釋劑、緩衝劑及抗分析物抗體中之至少一者。
  46. 如請求項44之方法，其中對於與該校準物第一反應混合物相關之背景之計算包含自與每一校準物第一反應混合物之反應速率測定相關之複數個訊號量測值中之每一者減去該背景。
  47. 如請求項44之方法，其中對於與該等校準物第二反應混合物相關之背景之計算包含自與每一校準物第二反應混合物之反應速率測定相關之複數個訊號量測值中之每一者減去該背景。
  48. 如請求項36至47中任一項之方法，其中該樣品第二反應混合物進一步包含該偶聯物。
  49. 如請求項48之方法，其中該偶聯物在該樣品第一反應混合物中之濃度係該偶聯物在該樣品第二反應混合物中之濃度的5倍至150倍。
  50. 如請求項49之方法，其中該校準物第二反應混合物進一步包含該偶聯物。
  51. 如請求項50之方法，其中該偶聯物在該校準物第一反應混合物中之濃度係該偶聯物在該校準物第二反應混合物中之濃度的5倍至150倍。
  52. 如請求項36至47中任一項之方法，其中該分析物係游離對稱二甲基精胺酸(SDMA)。
  53. 如請求項52之方法，其中該抗分析物抗體係對游離SDMA特異性。
  54. 如請求項53之方法，其中該抗體對不對稱二甲基精胺酸(ADMA) 之反應性小於其對游離SDMA之反應性的25%。
  55. 如請求項53之方法，其中該抗體與一或多種選自由以下組成之群之化合物沒有或實質上沒有交叉反應性：不對稱二甲基精胺酸(ADMA)、L-精胺酸及N-甲基精胺酸。
  56. 如請求項36至47中任一項之方法，其中該等反應混合物中之任一者包含針對該偶聯物之酶以外之酶之抑制劑。
  57. 如請求項36至47中任一項之方法，其中該樣品第一反應混合物及該樣品第二反應混合物進一步包含電子傳遞介質及染料，其中該傳遞介質自該受質接受電子並將其轉移至該染料。
  58. 如請求項53之方法，其中該校準物第一反應混合物及該校準物第二反應混合物進一步包含電子傳遞介質及染料，其中該傳遞介質自該受質接受電子並將其轉移至該染料。
  59. 一種用於確定動物中慢性腎病之活體外方法，其包含根據如請求項36至58之方法測定來自動物之生物樣品中SDMA之存在或其量，及基於該樣品中SDMA之存在或其量確定該動物之慢性腎病。
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