TWI742015B - 用於醫療應用之化合物 - Google Patents

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意玲 佘
保羅 亞瑟 瓊斯
彼得 詹姆士 詹金斯
亨利 肯尼斯 溫斗
文揚 吳
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Abstract

本發明提供用於治療及/或預防流感之化合物。該化合物包含第一結構域及第二結構域，其中該第一結構域包含結合至流感病毒之表面的至少一個錨定基團，且該第二結構域包含至少一個陰離子基團。該第一結構域與該第二結構域共價連接。本發明亦提供該等化合物之醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、前藥或立體異構體。

Description

用於醫療應用之化合物
本申請案係關於用於醫療用途，特定言之用於治療或預防病毒感染之化合物。本申請案亦係關於用於製備該等化合物之方法。
流感為一種每年5%至25%之美國人口感染之呼吸道感染，其中大約200,000人住院且25,000人死亡。流感感染仍舊不斷威脅人類健康且對健康服務造成負擔。近年來，來自禽類來源之高度致病性H5N1病毒及H7N9病毒之出現及其取得人類傳播性之潛能已增加與流感感染相關聯之風險。儘管疫苗仍然為預防之基石，但研發對抗任何新病毒株之頻繁突變的有效疫苗需要大量時間。諸如病毒神經胺糖酸酶抑制劑(NA抑制劑) (包括紮那米韋(Zanamivir) (瑞樂沙(Relenza))及奧司他韋(Oseltamivir) (克流感(Tamiflu)))及衍生自金剛烷之M2離子通道阻斷劑(包括金剛烷胺(amantidine)及金剛乙胺(rimantidine))之抗流感藥物為可用的且已市售超過20年，但其效力受到作用機制之限制。其效力可由於病毒突變及後續抗藥性之發展而進一步受損。 舉例而言，當前不建議使用M2離子通道阻斷劑，此係因為幾乎所有循環性季節A類病毒(包括H1Nipcim09)在M2基因中攜載S31N點突變，該突變賦予對金剛烷胺及金剛乙胺兩者之耐藥性。此情況已導致嚴重依賴於替代性NA抑制劑，諸如紮那米韋、奧司他韋及帕拉米韋(Peramivir)。 NA抑制劑在病毒生命週期方面影響A型流感病毒之裝配及出芽。對於待自細胞釋放之後代病毒粒子，神經胺糖酸酶(NA)必須自宿主醣蛋白裂解唾液酸基團，該唾液酸基團對於病毒擴散及再感染為至關重要的。因此，藉由特定抑制劑(NA抑制劑)阻斷神經胺糖酸酶之功能為治療流感之一種方式。然而，當此類抑制在病毒生命週期之後期(亦即，在病毒進入、複製、裝配及出芽至細胞表面上之後)發生時，已經對細胞造成許多損害。此外，僅細胞表面上之出芽病毒受到影響。不受抑制之病毒後代可感染新的細胞。此情況導致疾病嚴重程度之進展。為降低疾病之嚴重程度，用NA抑制劑藥物治療之最優治療窗為疾病進展之早期。然而，由於給定活性劑之治療功效通常由作用機制決定，因此NA抑制劑藥物被視為相對溫和的且具有有限之臨床益處。 需要用於治療流感之新方法。 A型流感之生命週期包含若干階段： (a) A型流感病毒具有脂質雙層包膜，該脂質雙層包膜內為八個RNA基因組片段，該等片段中之每一者與三聚病毒RNA聚合酶(PB1、PB2、PA)相關聯且包覆有多個核蛋白(NP)以形成vRNP。脂質包膜之外層帶有HA、NA及少數M2之多個複本，而M1分子保持vRNP附接至內層。 (b)病毒表面醣蛋白HA結合至宿主細胞表面唾液酸受體，且病毒在內吞囊泡中經輸送至細胞中。核內體中之低pH觸發HA蛋白質中之構形改變，該改變引起病毒與核內體膜之融合。低pH亦觸發質子經由M2離子通道流動至病毒中，從而將vRNP自M1基質蛋白質解離。當M1分子經解離時，釋放至細胞質中之vRNP藉由核蛋白上之核定位序列(NLS)之識別而經輸送至細胞核中。 (c)在細胞核中，病毒聚合酶引發的病毒mRNA與5'端加帽之RNA片段之合成自宿主前體mRNA裂解。PB2次單元結合宿主前體mRNA之5'端帽，且PA次單元中之核酸內切酶結構域自該帽向下游裂解前體mRNA 10至13核苷酸。病毒mRNA轉錄隨後自加帽RNA片段之經裂解3'端開始。此「帽攫取(cap snatching)」在新生前體mRNA上發生。 (d)病毒mRNA經輸送至細胞質以供轉譯成病毒蛋白質。表面蛋白質HA、M2及NA在內質網(ER)中經處理，在高基氏體(Golgi apparatus)中經糖基化且經輸送至細胞膜。 (e) A型流感病毒之NS1蛋白質在抑止宿主mRNA之產生中充當關鍵角色，其係藉由抑制宿主前體mRNA之3'端處理，從而阻斷宿主mRNA (包括干擾素β mRNA)之產生。不同於宿主前體mRNA，病毒mRNA不需要藉由宿主細胞機構進行之3'端處理。因此，病毒mRNA經輸送至細胞質，而宿主mRNA合成被顯著阻斷。 (f)病毒聚合酶不僅負責加帽RNA啟動之mRNA合成，且亦負責如下vRNA之無啟動複製： (-) vRNA → (+) cRNA → (-) vRNA. 核蛋白分子為此等兩個複製步驟所需要的且在RNA合成期間沈積於cRNA及vRNA上。所得vRNP隨後經輸送至細胞質，由結合至vRNP之M1-NS2複合物介導；NS2與自細胞核輸出vRNP之人類CRM1蛋白質相互作用。 (g) vRNP到達待併入至出芽之新病毒中的細胞膜。新病毒中之HA及NA蛋白質含有末端唾液酸，該等末端唾液酸將導致病毒叢集在一起且黏附至細胞表面。新形成之病毒之NA裂解此等唾液酸殘留物，從而自宿主細胞釋放病毒。 在流感病毒生命週期之階段(a)及(b)期間，病毒表面醣蛋白血球凝集素(HA)結合至宿主細胞上之唾液酸受體，接著受體介導之內吞作用將病毒內吞至細胞中。核內體中之低pH觸發HA蛋白質之構形改變，該改變引起病毒與核內體膜之融合。同時，低pH亦觸發質子經由M2離子通道流動至病毒中，從而將病毒遺傳物質釋放至細胞核以在細胞中開始病毒感染過程。 已認識到，將病毒曝露於細胞外環境中之低pH使病毒失活。低pH鼻內凝膠噴霧已顯示在活體外抑止流感病毒且保護雪貂免受流感感染。然而，在此類研究中，酸之有效濃度約為0.15M (大致pH 3.5)。此外，需要與病毒接觸以具有殺病毒作用。另外，噴霧僅在病毒感染之早期階段期間展現功效。儘管可藉由投與pH 3.5緩衝之鼻噴霧來達成接近3.5之pH值，但此經鼻遞送存在侷限性，此經鼻遞送由於黏液纖毛清除而在鼻中提供相對較短的產品滯留時間。經鼻投與之溶液在人體中之一般滯留時間約為12至15分鐘。 此外，在治療病毒感染之情況下，將需要將酸性緩衝劑深入遞送至呼吸道中。此類緩衝劑之酸性性質將可能在人體中引起刺激及不耐受性。因此，由於酸性鼻內噴霧基本上為受限的且非特異性的，因此酸性鼻內噴霧將不適合作為用於治療流感病毒感染之治療劑。 聚陰離子化合物作為抗HIV劑提供有吸引力的特徵。聚陰離子之抗病毒活性範圍擴展至多種包膜病毒，包括正黏液病毒及副黏液病毒(流感病毒)。此類聚陰離子已顯示在0.1至1 mg/mL之濃度下抑制細胞培養基中之病毒複製。有利地，此等化合物甚至在多達高10,000倍之濃度下不具有細胞毒性。然而，此等物質具有許多藥物動力學及毒理學缺陷，該等缺陷似乎損害該等物質之臨床效用，例如，該等物質在到達其作用位點之前可被各種血漿蛋白質保留在血流中。另外，一些硫酸化多醣因非所要抗凝血劑作用而臭名昭著。 需要有效對抗流感之新抗病毒劑。特定言之，需要展現以下中之一或多者之新抗病毒劑：i)對抗流感病毒之高效能，ii)快速作用以控制感染，iii)廣泛範圍抗病毒活性(包括A型流感、B型流感、禽流感)，iv)對抗耐藥性病毒株之功效，v)低傾向之耐藥性，vi)延長之功效持續時間，vii)高選擇性，viii)改良之治療窗；ix)低毒性，x)較少副作用及/或xi)適用於治療性及預防性應用。
本發明提供用於治療及/或預防流感感染之化合物及方法。 本發明化合物，亦稱為「表面工程改造化合物」，被認為改變病毒表面，將表面轉換為微酸性/陰離子環境以選擇性地干擾病毒生命週期(包括上文概述之階段(a)及(b))。 此結果被認為係藉由本發明化合物達成，該等化合物將結合至流感病毒之基團與用以干擾血球凝集素至細胞之結合的酸性或陰離子基團合併。當本發明化合物用以防止細胞感染時，此提供優點且在細胞外發揮其作用。此避免對分子侵入細胞之需要，此情形可能引起較低毒性及/或較少副作用。 在一個態樣中，本發明提供一種包含第一結構域及第二結構域之化合物， 第一結構域包含結合至流感病毒之表面的至少一個錨定基團；且 第二結構域包含至少一個陰離子基團； 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、前藥或立體異構體， 其中第一結構域與第二結構域共價連接。 在另一態樣中，提供第一結構域與第二結構域經由至少一個二價連接基團共價連接之化合物。 在另其他態樣中，本發明化合物可進一步包含多價主鏈基團。 在另一態樣中，提供式(I)化合物：
Figure 02_image003
式(I) 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、前藥或立體異構體，其中： A在每次出現時為錨定基團； B為多價主鏈基團； C在每次出現時為陰離子基團； L1 及L2 在每次出現時為二價連接基團； n為1至4之整數；且 p為1至3之整數。 在其他態樣中，提供包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、前藥或立體異構體之醫藥組合物。在其他態樣中，提供本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、前藥或立體異構體之用途，其係用於製造用於治療或預防流感病毒感染之藥劑。 在其他態樣中，提供治療或預防流感病毒感染之方法，該等方法包含向有需要之個人投與治療有效量之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、前藥或立體異構體。 在一些態樣中，流感病毒感染為A型流感、B型流感、禽流感或耐藥性流感病毒株。 除非另外定義，否則本文中所用之所有技術術語及科學術語具有與一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。 在本說明書中對任何先前技術之提及並非且不應視為承認或以任何形式暗示該先前技術形成普通常識之部分。 本文中引用之所有文獻各自以其全文引用之方式併入。
歸檔資料 本申請案與2015年11月20日申請之澳大利亞專利申請案第2015904895號相關聯且主張其優先權，該申請案之全部內容以引用之方式併入本文中。 如上文所論述，本發明化合物被認為改變病毒表面，將表面轉換為微酸性/陰離子環境以選擇性地干擾病毒生命週期中之各階段。 咸信本發明化合物之酸性/陰離子基團將病毒表面轉換為使病毒活性降低或失活之微酸性/陰離子環境。此外，咸信此等化合物在細胞外起作用且因此可能與副作用之發生減少、毒性降低及/或耐藥性傾向減少相關聯。更特定言之，咸信本發明化合物在細胞外、在病毒生命週期之多個目標點起作用，包括(但不限於)： · 酸性/陰離子基團在病毒表面處產生低pH，該低pH觸發血球凝集素(HA)蛋白質之早期構形改變，該改變隨後可減少或阻滯病毒與細胞之融合。此過程特定於上文所提及之病毒生命週期階段(b)。 · 另外，咸信在病毒表面上創造低pH環境激發質子經由M2離子通道流動至病毒中，其可導致遺傳物質釋放在細胞外部。此過程特定於上文所提及之病毒生命週期階段(b)。 · 咸信本發明化合物之錨定基團可交聯NA/HA且聚集病毒粒子以降低病毒之遷移率及感染性。此過程特定於上文所提及之病毒生命週期階段(a)及(b)。 · 咸信錨定基團抑制神經胺糖酸酶(NA)之功能以減少或防止自細胞膜釋放新病毒。此過程特定於上文所提及之病毒生命週期階段(g)。 咸信擾亂病毒生命週期階段(a)及(b)可藉由降低病毒感染性(包括病毒侵入細胞、正常細胞核功能之病毒擾亂及/或病毒複製)來降低感染之潛在嚴重程度。因此，認為相比於當前可用的NA抑制劑藥物，投與本發明化合物可為患者提供對病毒感染之更有效治療及/或更快恢復。此外，咸信本發明化合物可預防性地用於預防流感感染。 因此，在一個態樣中，本發明提供一種包含第一結構域及第二結構域之化合物， 該第一結構域包含結合至流感病毒之表面的至少一個錨定基團；且 第二結構域包含至少一個陰離子基團； 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、前藥或立體異構體， 其中該第一結構域與該第二結構域共價連接。 在一些態樣中，第一結構域及第二結構域可經由至少一個二價連接基團共價連接。在其他態樣中，本發明化合物可進一步包含多價主鏈基團。 在另一態樣中，本發明提供式(I)化合物：
Figure 02_image005
式(I) 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、前藥、酯或立體異構體，其中： A在每次出現時為錨定基團； B為多價主鏈基團； C在每次出現時為陰離子基團； L1 及L2 在每次出現時為二價連接基團； n為1至4之整數；且 p為1至4之整數。 如本文所使用，「本發明化合物」或「式(I)化合物」意謂化合物或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、前藥、酯或立體異構體，或其生理學功能性衍生物。 如本文所用之術語「錨定基團」係指結合至流感病毒之表面的任何適合基團。在一些實施例中，錨定基團為結合至神經胺糖酸酶之基團，諸如神經胺糖酸酶抑制劑或其衍生物。適合的基團之實例包括(但不限於)：唾液酸或其衍生物，包括神經胺糖酸之經N 取代之衍生物或經O 取代之衍生物，諸如紮那米韋或拉蘭那米韋(laninamivir)、奧司他韋、帕拉米韋、2,3-二氟唾液酸(DFSA)及其衍生物。在其他實施例中，錨定基團包含特異性地結合神經胺糖酸酶之抗體結合結構域。包含特異性地結合神經胺糖酸酶之抗體結合結構域的適合錨定基團之實例包括抗體(Ab)或抗體之抗原結合片段、單鏈抗體片段(scFV)或單結構域抗體(dAb)。 如本文所用之術語「主鏈基團」係指一或多個錨定基團及一或多個酸性或陰離子基團連接至之任何適合的多價基團。在一些態樣中，主鏈基團可為三價基團。在其他態樣中，主鏈基團可為四價基團。適合的主鏈基團之實例包括(但不限於)：視情況經取代之丙烷-1,2,3-三羧酸酯、視情況經取代之環己烷-1,3,5-三羧酸酯及視情況經取代之苯-1,2,4,5-四羧酸酯。 術語「酸性或陰離子基團」及「酸性/陰離子基團」係指具有酸性及/或陰離子特性、作用以干擾血球凝集素至細胞之結合的任何適合的官能基。具體言之，術語「陰離子」描述官能基或材料之淨負電荷。應理解，給定的帶負電荷材料可具有與其相關聯之一或多個帶正電荷相對離子，或反之亦然。在溶液中，帶負電荷材料可與同其相關聯之一或多個帶正電荷相對離子解離。如本文所使用，術語「陰離子」用以描述彼材料或官能基之特性，而非具有將通常使得複合物呈中性之一或多個相對離子之整個複合物的特性。應理解，某些官能基在變化的pH值下帶負電荷、中性或帶正電荷。材料是否為陰離子將基於此等電荷之和進行判定。舉例而言，在本發明之範疇內，酸性或陰離子基團可包括以下官能基中之一或多者：羧酸、磺酸、磷酸及次膦酸及其同電子排列體或生物同電子排列體。適合的酸性或陰離子基團之實例包括：羧酸、胺基酸、二肽、三肽或多肽或其具有酸性及/或陰離子特性之衍生物，諸如天冬胺酸、氧化半胱胺酸、麩胺酸或衍生自天冬胺酸、氧化半胱胺酸及/或麩胺酸之肽。 術語「唾液酸」在此項技術中為眾所周知的且係指9-碳單醣，尤其係指衍生自神經胺糖酸之彼等者。適合的基團之實例包括(但不限於)：衍生自N - 乙醯基神經胺糖酸(Neu5Ac)及N - 羥乙醯基神經胺糖酸(Neu5Gc)之N 取代物及/或O 取代物的視情況經取代之單醣。 術語「神經胺糖酸酶抑制劑」在此項技術中為眾所周知的且係指阻斷神經胺糖酸酶之一類化合物。在一些實施例中，錨定基團可為神經胺糖酸酶抑制劑或其衍生物。適合的神經胺糖酸酶抑制劑之實例包括(但不限於)：唾液酸或唾液酸之衍生物，諸如2,3-二氟唾液酸。其他適合的神經胺糖酸酶抑制劑包括：
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紮那米韋                       奧司他韋
Figure 02_image009
蘭那米韋                      帕拉米韋 及其衍生物。 如本文關於抗體與第二化學物質之相互作用所使用之術語「特異性結合」或「特異性地結合」意謂該相互作用取決於化學物質上特定結構(例如，抗原決定子或抗原決定基)之存在；舉例而言，抗體識別且結合至特定蛋白質結構而非一般性地結合至蛋白質。 如本文使用之術語「抗體」廣義地係指由四條多肽鏈(兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈)構成，保留免疫球蛋白(Ig)分子之主要抗原決定基結合特徵的任何Ig分子或其任何功能片段、突變體、變異體或衍生物。該等突變體、變異體或衍生物抗體形式在此項技術中已知。其非限制性實施例於下文加以論述。 在全長抗體中，各重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區構成。重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2及CH3構成。各輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區構成。輕鏈恆定區由一個結構域CL構成。VH區及VL區可進一步再分成高變區，被稱為互補決定區(CDR)，穿插有被稱為構架區(FR)之更保守區。各VH及VL由自胺基端至羧基端依以下順序排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可具有任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類別。 如本文所使用之術語抗體之「抗原結合結構域」或「抗原結合片段」係指保留特異性地結合至抗原(例如，IL-12)之能力的抗體或蛋白質之一或多個片段。經顯示，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來進行。此類抗體實施例亦可為雙特異性、雙重特異性或多特異性形式；特異性地結合至兩個或多於兩個不同抗原。涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內之結合片段之實例包括：(i) Fab片段，由VL結構域、VH結構域、CL結構域及CHl結構域組成之單價片段；(ii) F(ab')2片段，包含藉由鉸鏈區處之二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii) Fd片段，其由VH結構域及CHl結構域組成；(iv) Fv片段，其由抗體之單臂的VL結構域及VH結構域組成，(v) dAb片段(Ward等人，1989 Nature 341 544-6，Winter等人，PCT公開案WO 90/05144 Al，以引用之方式併入本文中)，其包含單個可變結構域；及(vi)分離之互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH藉由單獨基因寫碼，但其可使用重組方法藉由合成性連接基團接合，該合成性連接基團使得其能夠經形成為VL及VH區配對從而形成單價分子之單一蛋白質鏈(被稱為單鏈Fv (scFv))；(例如參見Bird等人,1988 Science 242 423-6；Huston等人,1988 Proc Natl Acad Sci U S A 85 5879-83)。此類單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。亦涵蓋其他形式之單鏈抗體，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH結構域及VL結構域在單一多肽鏈上表現，但使用之連接基團過短以致不允許在同一條鏈上之兩個結構域之間進行配對，從而迫使該等結構域與另一條鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點(例如參見Holliger, P.等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak, R. J.等人，1994，Structure 2:1121-1123)。此類抗體結合部分在此項技術中已知(Kontermann及Dubel編,Antibody Engineering 2001 Springer-Verlag. New York.第790頁，ISBN 3-540-41354-5)。 在一個實施例中，錨定基團在每次出現時為結合至流感病毒之表面的任何適合的錨定基團。在一些實施例中，錨定基團在每次出現時為結合至神經胺糖酸酶之基團，包括神經胺糖酸酶抑制劑或其衍生物。在某些實施例中，錨定基團為神經胺糖酸酶抑制劑或其衍生物，其係選自唾液酸(諸如，紮那米韋或蘭那米韋)、2,3-二氟唾液酸、奧司他韋、帕拉米韋及其衍生物。在其他實施例中，錨定基團在每次出現時包含特異性地結合神經胺糖酸酶之抗體結合結構域。在錨定基團為特異性地結合神經胺糖酸酶之抗體結合結構域的某些實施例中，錨定基團係選自由以下組成之群：抗體(Ab)、抗體之抗原結合片段、單鏈抗體片段(scFV)及單結構域抗體(dAb)。本發明化合物可總共包含1至6個錨定基團，較佳地2至4個錨定基團，更佳地2個錨定基團。 在另一實施例中，錨定基團為衍生自以下各基團之單價基團：式II之基團
Figure 02_image011
；( 式 II ) 式III之基團
Figure 02_image013
；( 式 III ) 式IV之基團
Figure 02_image015
；( 式 IV ) 及式V之基團
Figure 02_image017
( 式 V ) 其中E1 係選自由以下組成之群：-COOH、COOHR6 、-SO3 H、-PO3 H2 、-PO(OR6 )2 ， G1 係選自-NH2 、-CH2 NH2 、-(CH2 )2 NH2 、
Figure 02_image019
， T1 係選自由以下組成之群：視情況經取代之C1 -C6 烷基、視情況經取代之C2 -C6 烯基或視情況經取代之C2 -C6 炔基， U1 係選自由以下組成之群：-CH2 R7 、-(CH2 )2 R7 、-CH2 CHR7 CH2 R7 ， R7 係選自由以下組成之群：H、-OH、-OCH3 、-OAc、-NH2 或-SH， R8 及R8 ' 各自獨立地選自由以下組成之群：氫、-N3 、-CN、-CH2 NH2 、胍基或-NR10 R11 ； R9 係選自氫、視情況經取代之C1 -C6 烷基、視情況經取代之C2 -C6 烯基或視情況經取代之C2 -C6 炔基； R10 及R11 各自獨立地選自由以下組成之群：氫、視情況經取代之C1 -C6 烷基、視情況經取代之C1 -C6 醯基、-C(NH)NH2 、-CH2 COOH、CH2 CH2 OH或-CH2 CH(R12 )(R13 )， R12 及R13 各自獨立地選自O及R14 N=，且 R14 係選自由以下組成之群：氫、-OH、-OCH3 、-NH2 及-N(CH3 )2 ， R15 及R15 ' 各自獨立地選自氫及CO2 R16 ， R16 為H或視情況經取代之C1 -C6 烷基； R17 係選自NH2 及-NHC(═NH)NH2 ； G2 為
Figure 02_image021
； R18 係選自由以下組成之群：氫、視情況經取代之C1 -C6 烷基、視情況經取代之C2 -C6 烯基及視情況經取代之C2 -C6 炔基。 在另其他實施例中，錨定基團在每次出現時係選自由式VI之基團及式VII之基團組成之群：
Figure 02_image023
( 式 VI )
Figure 02_image025
( 式 VII ) 其中R1 係選自由以下組成之群：-NR2 、胍基、-ONR2 ，其中R為H或視情況經取代之C1 -C6 烷基， R2 係選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C1 -C6 烷基及視情況經取代之芳基，且 R3 係選自由以下組成之群：H、視情況經取代之C1 -C6 烷基、視情況經取代之芳基及視情況經取代之C1 -C6 醯基。 在另一實施例中，錨定基團為式(VIa)之基團：
Figure 02_image027
式 ( VIa ) 。 在又一實施例中，錨定基團為式(VIIa)之基團：
Figure 02_image029
式 ( VIIa ) 。 在一實施例中，連接基團(諸如式I之L1 及/或L2 )在每次出現時為任何適合的二價連接基團。在一個實施例中，連接基團在每次出現時獨立地選自鍵、視情況經取代之C1 -C12 伸烷基、-C(O)-NR-、-O-C(O)O-NR-、-C=N-O-、-C=N-NR-、-SO2 -NR-、二硫鍵、-C(O)-NR-(CH2 )x -NR-、-(CH2 )x -NR-、-(CH2 )x -(O-(CH2 )y -)z -、視情況經取代之-C=N-O-、視情況經取代之-C=N-NR-伸烷基、視情況經取代之伸烷基磺醯胺、視情況經取代之伸烷基二硫鍵，其中R獨立地為H或C1 -C6 烷基，且其中x、y及z各自為獨立地選自0、1、2、3及4之整數。 在錨定基團為式(VI)或式(VIa)之基團的一個實施例中，式(I)之連接基團L1 係選自-C(O)-NR-(CH2)x-NR-、-(CH2 )x -NH-及-(CH2 )x -(O-(CH2 )y )z ，其中x、y及z各自為獨立地選自0、1、2、3及4之整數。在錨定基團為式(VII)或式(VIIa)之基團的另一實施例中，式(I)之連接基團L1 為-(CH2 )x -NH-，其中x為選自0、1、2、3及4之整數。 在一個實施例中，式(I)之連接基團L2 為鍵。 在一實施例中，主鏈基團為任何適合的多價基團。在一個實施例中，主鏈基團為三價主鏈基團。在另一實施例中，主鏈基團為四價主鏈基團。在一個實施例中，主鏈基團係選自視情況經取代之三羧酸酯基團、視情況經取代之四羧酸酯基團或多價肽。在其他實施例中，主鏈基團係選自視情況經取代之丙烷-1,2,3-三羧酸酯、視情況經取代之丙-1-烯-1,2,3-三羧酸酯、視情況經取代之環丙烷-1,2,3-三羧酸酯、視情況經取代之環己烷-1,3,5-三羧酸酯、視情況經取代之苯-1,3,5-三羧酸酯、視情況經取代之甲烷四羧酸酯、視情況經取代之1,2,3,4-丁烷四羧酸酯、視情況經取代之伸乙基-1,1,2,2-四羧酸酯(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))、視情況經取代之環己烷-1,2,4,5-四羧酸酯及視情況經取代之苯-1,2,4,5-四羧酸酯。在另其他實施例中，主鏈基團係選自視情況經取代之丙烷-1,2,3-三羧酸酯、視情況經取代之環己烷-1,3,5-三羧酸酯、視情況經取代之苯-1,2,4,5-四羧酸酯、視情況經取代之苯均四酸及由-C(O)-NH-NH-C(O)-鍵形成之視情況經取代之二苯均四酸(5,5'-(肼-1,2-二羰基)雙(苯-1,2,4-三羧酸))。在另其他實施例中，主鏈基團為多價肽。 在一實施例中，酸性或陰離子基團為具有酸性及/或陰離子特性、作用以干擾血球凝集素至細胞之結合的任何適合的官能基。在一些實施例中，酸性或陰離子基團為包含選自以下之一或多個官能基之任何適合的基團：羧酸、磺酸、磷酸及次膦酸及其同電子排列體或生物同電子排列體。在一些實施例中，酸性或陰離子基團為包含一或多個酸性官能基之任何適合的胺基酸、二肽、三肽、多肽或其衍生物。在一個實施例中，酸性或陰離子基團為天冬胺酸、氧化半胱胺酸、麩胺酸或衍生自天冬胺酸、氧化半胱胺酸及/或麩胺酸之肽。 在一實施例中，本發明化合物總共包含2至26個酸性/陰離子殘基，較佳地4至10個酸性/陰離子殘基。舉例而言，在酸性或陰離子基團包含二羧酸時，應瞭解，此部分包含兩個不同的酸性/陰離子殘基。借助於參考本發明化合物之代表性實例之實例，應注意，MD349總共包含九個酸性或陰離子殘基(五個羧酸殘基及四個磺酸殘基)，MD348總共包含七個酸性或陰離子殘基(四個羧酸殘基及三個磺酸殘基)，MD345總共包含八個酸性或陰離子殘基(一個羧酸殘基及七個磺酸殘基)，MD352總共包含九個酸性或陰離子殘基(兩個羧酸殘基及七個磺酸殘基)，MD356總共包含六個酸性或陰離子殘基(兩個羧酸殘基及四個磺酸殘基)，MD357總共包含六個酸性或陰離子殘基(兩個羧酸殘基及四個磺酸殘基)，MD358總共包含八個酸性或陰離子殘基(八個羧酸殘基)，MD359總共包含八個酸性或陰離子殘基(兩個羧酸殘基及六個磺酸殘基)，MD373總共包含八個酸性或陰離子殘基(八個羧酸殘基)，且MD376總共包含十個酸性或陰離子殘基(十個羧酸殘基)。 在另一實施例中，酸性或陰離子基團為式VIII之基團：
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( 式 VIII ) 其中 R4 在每次出現時獨立地選自由以下組成之群：-COOH、-SO3 H、-NHCH2 SO3 H、-CONH-Cya、-CONH-Asp、-CONH-Asp(-NHCH2 SO3 H)w 及-CONH-Asp(-NHCH2 PO3 H)w ，其中w為整數1或2； R5 係選自由-OH及-NHCH2 SO3 H組成之群； u為0至3之整數； t為0至3之整數； r為0至6之整數； v為1至12之整數。 在一實施例中，n為1至4之整數。在另一實施例中，n為1至3之整數。在某些實施例中，n為1。在其他實施例中，n為2。在另其他實施例中，n為3。在又其他實施例中，n為4。 在一實施例中，p為1至4之整數。在另一實施例中，p為1至2之整數。在某些實施例中，p為1。在其他實施例中，p為2。在另其他實施例中，p為3。在又其他實施例中，p為4。
另外或替代地，在一些實施例中，式(I)化合物可在裝配之前、期間或之後經修改，以增強或修改對於流感病毒表面之生物活性及/或結合親和力。在一實施例中，在酸性或陰離子基團包含一或多個羧酸(包括胺基酸)時，羧酸可藉由硫酸化、磷酸化、官能基相互轉化及/或側鏈之連接進行修改。舉例而言，在酸性或陰離子基團包含羧酸時，羧酸可經修改為包括-C(=O)NH(CH2)nSO3H之醯胺或硫酸化醯胺。替代地或另外，在酸性或陰離子基團包含胺基酸或肽時，C端可經修改成包括替代性官能基，諸如將末端酸轉化為包括-C(=O)NH(CH2)nSO3H之醯胺或硫酸化醯胺。
對於本文揭示之式(I)化合物，涵蓋以下(i)至(vii)中之任一者或更多者之組合：(i)A為式(IIa)；或A為式(IIIa)；(ii)B為丙烷-1,2,3-三羧酸；或B為環己烷-1,3,5-三羧酸酯，或B為苯-1,2,4,5-四羧酸酯；(iii)L1為-C(O)-NH-；或L1為-C(O)-NH-(CH2)2-NH-；或L1為-C(O)-NH-(CH2)3-NH-；或L1為-C(O)-NH-(CH2)4-NH-；或L1為-C(O)-NH-(CH2)5-NH-；或L1為-C(O)-NH-(CH2)6-NH-；或L1為-C(O)-NH-(CH2)7-NH-；或L1為-C(O)-NH-(CH2)8-NH-；或 L1為-C(O)-NH-(CH2)9-NH-；或L1為-C(O)-NH-(CH2)10-NH-；或L1為-C(O)-NH-(CH2)12-NH-；或L1為-(CH2)6-NH-；或L1為-(CH2)8-NH-；或L1為-(CH2)9-NH-；或L1為-(CH2)10-NH-；或L1為-(CH2)12-NH-；(iv)L2為鍵；(v)C為L-天冬胺酸；或C為D-天冬胺酸；或C為L-氧化半胱胺酸；或C為D-氧化半胱胺酸；或C為-(L-Asp)2-OH；或C為-(D-Asp)2-OH；或C為-(L-Cya)2-OH；或C為-(D-Cya)2-OH；或C為-(L-Asp)3-OH；或C為-(D-Asp)3-OH；或C為-(L-Cya)3-OH；或C為-(D-Cya)3-OH；或C為-(L-Cya)7-OH；或C為-(D-Cya)7-OH；或         C為-(L-Asp-L-Cya)4 -OH；或         C為-(L-Asp-L-Cya)4 -OH；或         C為-[L-Asp(L-Cya)]3 -OH；或         C為-[D-Asp(D-Cya)]3 -OH；或         C為-[L-Asp(L-Cya)]4 -OH；或         C為-[(L-Asp)4 -(L-Cya)3 ]-OH；或         C為-[(D-Asp)4 -(D-Cya)3 ]-OH；或         C為-[L-Asp(L-Cya)]3 -OH；或         C為-[D-Asp(D-Cya)]3 -OH；或         C為-[L-Asp(L-Cya)]4 -OH；或         C為-[D-Asp(D-Cya)]4 -OH；或         C為L-Asp(NHCH2 SO3 H)2 ；或         C為D-Asp(NHCH2 SO3 H)2 ；或         C為-[L-Asp(NHCH2 SO3 )]3 -NHCH2 SO3 H；或         C為-[D-Asp(NHCH2 SO3 )]3 -NHCH2 SO3 H； (vi)  n為2；或         n為3 (vii) p為1；或         p為2。 為方便參考，可縮寫本發明化合物之代表性實例。舉例而言，在代表性實例之上下文中，為方便參考，錨定基團(包括式(I)之A)及連接基團(包括式(I)之L1 )在每次出現時可經表示為單個基團，被稱作Zx 或Sy 。具體言之，在本發明化合物包含式Zx 之基團時，此類基團為唾液酸衍生物，其中官能基(胺基或胍基)取代唾液酸環之位置4處的羥基。此修改使得式Zx之基團能夠與流感病毒神經胺糖酸酶相互作用，但不與哺乳動物神經胺糖酸酶相互作用。此情形在將本發明化合物投與給包括人類之哺乳動物時提供安全態樣。式Sy之基團經由唾液酸之2-羥基連接。具體言之，硫基-糖苷連接基團用於與式Sy中之錨定基團(諸如，2-S-(CH2)mNHR)結合，該連接基團與等效醚連接基團(諸如，2-O-(CH2)mNHR)相比阻礙酶水解。為方便參考，Zx或Sy之結構概述如下：
Figure 105137966-A0305-02-0027-1
Figure 105137966-A0305-02-0027-2
Figure 105137966-A0305-02-0027-3
Figure 105137966-A0304-0002
 為方便參考，在代表性實例之上下文中，可自其中衍生出式(I)之主鏈基團B之化合物經縮寫如下
Figure 105137966-A0304-0003
 為方便參考，在代表性實例之上下文中，式(I)之錨定基團A、連接基團L1 及主鏈基團B可經縮寫如下：
Figure 105137966-A0304-0004
 為方便參考，在代表性實例之上下文中，可自其中衍生出式(I)之酸性或陰離子基團之化合物經縮寫如下：
Figure 105137966-A0304-0005
 本發明化合物之代表性實例概述如下。
Figure 105137966-A0304-0006
 本文中單獨或組合使用之術語「烷基」係指直鏈或分支鏈飽和烴基。術語「C1-12烷基」係指含有一至十二個碳原子之此類基團，且「低碳數烷基」係指含有一至六個碳原子之C1-6烷基，諸如甲基(「Me」)、乙基(「Et」)、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基及其類似者。 術語「環烷基」係指非芳族、飽和非芳族碳環。舉例而言，術語「C4-9環烷基」係指具有4至9個碳原子之此類基團。實例包括環丁基、環戊基及環己基。 術語「烯基」係指含有一或多個雙鍵(較佳地含有一個或兩個雙鍵)之直鏈或分支鏈烴。舉例而言，術語「C2-12烯基」係指含有二至十二個碳原子之此類基團。烯基之實例包括烯丙基、1-甲基乙烯基、丁烯基、異丁烯基、1,3-丁二烯基、3-甲基-2-丁烯基、1,3-丁二烯基、1,4-戊二烯基、1-戊烯基、1-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基及1,3,5-己三烯基。 術語「炔基」係指含有一或多個三鍵(較佳地含有一個或兩個三鍵)之直鏈或分支鏈烴。舉例而言，術語「C2-12炔基」係指含有二至十二個碳原子之此類基團。實例包括2-丙炔基及2-丁炔基或3-丁炔基。 單獨或組合使用之術語「烷氧基」係指經由氧鍵(-O-)共價鍵結之直鏈或分支鏈烷基，且術語「C1-6烷氧基」及「低碳數烷氧基」係指含有一至六個碳原子之此類基團，諸如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、第三丁氧基及其類似者。 術語「環烯基」係指具有單一環或多個稠合環及至少一個內部不飽和點的環狀烯基，該等烯基較佳地併有4至11個碳原子。適合的環烯基之實例包括(例如)環丁-2-烯基、環戊-3-烯基、環己-4-烯基、環辛-3-烯基、茚基及其類似者。 術語「醯基」係指基團H-C(O)-、烷基-C(O)-、環烷基-C(O)-、芳基-C(O)-、雜芳基-C(O)-及雜環基-C(O)-，其中烷基、環烷基、芳基、雜芳基及雜環基在本文中加以描述。 術語「芳基」係指碳環(非雜環)芳族環或環系統。芳族環可為單環或雙環系統。芳族環或環系統通常由5至10個碳原子構成。適合的芳基之實例包括(但不限於)苯基、聯二苯、萘基、四氫萘基及其類似者。 術語「伸烷基」係指藉由自母烷烴之同一碳原子或兩個不同碳原子移除兩個氫原子而獲得之具有兩個單價基團中心之飽和的分支鏈或直鏈或環狀烴基。舉例而言，伸烷基可具有1至20個碳原子、1至10個碳原子或1至6個碳原子。典型伸烷基包括(但不限於)亞甲基(-CH2 -)、1,1-乙基(-CH(CH3 )-)、1,2-乙基(-CH2 CH2 -)、1,1-丙基(-CH(CH2 CH3 )-)、1,2-丙基(-CH2 CH(CH3 )-)、1,3-丙基(-CH2 CH2 CH2 -)、1,4-丁基(-CH2 CH2 CH2 CH2 -)及其類似者。 術語「伸烯基」係指藉由自母烯烴之同一碳原子或兩個不同碳原子移除兩個氫原子而獲得之具有兩個單價基團中心之不飽和的分支鏈或直鏈或環狀烴基。舉例而言，伸烯基可具有1至20個碳原子、1至10個碳原子或1至6個碳原子。典型伸烯基包括(但不限於) 1,2-伸乙基(-CH=CH-)。 術語「伸炔基」係指藉由自母炔烴之同一碳原子或兩個不同碳原子移除兩個氫原子而獲得之具有兩個單價基團中心之不飽和的分支鏈或直鏈或環狀烴基。舉例而言，伸炔基可具有1至20個碳原子、1至10個碳原子或1至6個碳原子。典型伸炔基包括(但不限於)乙炔(-C≡C-)、炔丙基(-CH2 C≡C-)及4-戊炔基(-CH2 CH2 CH2 C≡CH-)。 術語「伸芳基」係指藉由自母芳基之同一或兩個不同碳原子或雜原子移除兩個氫原子而獲得之具有兩個單價基團中心之芳基。 術語「鹵基」及「鹵素」係指氟基、氯基、溴基及碘基。 術語「鹵基烷基」之烷基上的氫原子中之一或多者經鹵素取代。 術語「雜芳基」係指在環內較佳地具有2至10個碳原子及選自氧、氮及硫之1至4個雜原子之單價芳族碳環基。較佳地，雜原子為氮。此類雜芳基可具有單個環(例如，吡啶基、吡咯基或呋喃基)或多個稠合環(例如，吲哚嗪基、苯并噻吩基或苯并呋喃基)。 術語「雜環基」係指具有單個環或多個稠合環、在環內較佳地具有1至8個碳原子及選自氮、硫、氧、硒或磷之1至4個雜原子之單價飽和或不飽和基團。 術語「視情況經取代之」意謂基團可包括一或多個取代基。基團上之一或多個氫原子可經獨立地選自以下之取代基取代：鹵素(例如鹵基烷基，諸如-CF3 或-CF2 H)、C1-6 烷基、C2-6 烯基、C2-6 炔基、-(CH2 )v C3 -7 環烷基、-(CH2 )v C4-7 環烯基、-(CH2 )v 芳基、-(CH2 )v 雜環基、-(CH2 )v 雜芳基、-C6 H4 S(O)q C1 -6 烷基、-C(Ph)3 、-CN、-OR、-O-(CH2 )1 - 6 -R、-O-(CH2 )1 - 6 -OR、-OC(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-OC(O)NR'R"、-NR'R"、-NO2 、-NRC(O)R'、-NRC(O)NR'R"、-NRC(S)NR'R"、-NRS(O)2 R'、-NRC(O)OR'、-C(NR)NR'R"、-C(=NOR')R、-C(=NOH)NR'R"、-C(O)NR'R"、-C(=NCN)-NR'R"、-C(=NR)NR'R"、-C(=NR')SR"、-NR'C(=NCN)SR"、-CONRSO2 R'、-C(S)NR'R"、-S(O)q R、-SO2 NR'R"、-SO2 NRC(O)R'、-OS(O)2 R、-PO(OR)2 及-NO2 ；其中v為0至6，q為0至2且各R、R'及R"獨立地選自H、C1-6 烷基、C2-6 烯基、C2-6 炔基、C3-7 環烷基、C4-7 環烯基、芳基、雜環基、雜芳基、C1-6 烷基芳基、C1-6 烷基雜芳基及C1-6 烷基雜環基，其中烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳基、雜環基、雜芳基、C1-6 烷基芳基、C1-6 烷基雜芳基或C1-6 烷基雜環基可視情況經選自鹵素、羥基、低碳數烷基、低碳數烷氧基、-CO2 H、CF3 、CN、苯基、NH2 及-NO2 之一至六個相同或不同基團取代；或當R'及R"連接至同一氮原子時，其可與其所連接至之原子一起形成5至7員含氮雜環。 在本文所定義之可能的官能基之清單中，當給定基團含有兩個或多於兩個子基團(例如，子基團可如在烷基芳基中以[子基團A][子基團B]之格式列出或如在芳基氧基烷基中以[子基團A][子基團B][子基團C]之格式列出)時，如以上所列之子基團之次序不意欲限制其出現之次序。因此，具有經定義為[子基團A][子基團B]之兩個子基團的基團(諸如，烷基芳基)亦意欲指具有經定義為[子基團B][子基團A]之兩個子基團的基團(諸如，芳基烷基)。 術語「對掌性」係指具有鏡像搭配物之非重疊性特性的分子，而術語「非對掌性」係指在其鏡像搭配物上可重疊之分子。 術語「立體異構體」係指具有相同化學構成但在原子或基團之空間排列上不同的化合物。 術語「非對映異構體」係指具有兩個或多於兩個對掌性中心且其分子並不互為鏡像之立體異構體。非對映異構體具有不同物理特性，例如熔點、沸點、光譜特性及反應性。可在諸如電泳及層析之高解析度分析程序下分離非對映異構體之混合物。 術語「對映異構體」係指化合物之互為不可重疊鏡像的兩種立體異構體。 本文所用之立體化學定義及定則一般遵循S. P. Parker編, McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York；以及Eliel, E.及Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994), John Wiley & Sons, Inc., New York。許多有機化合物以光活性形式存在，亦即其能夠使平面偏振光之平面旋轉。在描述光活性化合物時，使用前綴D及L或R及S來表示分子圍繞其對掌性中心之絕對組態。前綴d及l或(+)及(-)用於表示平面偏振光由化合物引起旋轉之跡象，其中(-)或l意謂化合物為左旋的。具有前綴(+)或d之化合物為右旋的。對於既定化學結構，此等立體異構體相同，例外為其互為鏡像。特定立體異構體亦可被稱為對映異構體，且此類異構體之混合物通常被稱為對映異構混合物。對映異構體之50:50混合物被稱為外消旋混合物或外消旋體，其可在化學反應或製程中尚未具有立體選擇或立體特異性時出現。術語「外消旋混合物」及「外消旋體」係指兩種對映異構物質之等莫耳混合物，其缺乏光學活性。 如本文所使用，胺基酸及其衍生物可視需要經縮寫為其各別三字碼或單字碼。舉例而言，氧化半胱胺酸在本文中可被稱為Cya、Cyst或Cyst-SO3 H，天冬胺酸可被稱為Asp。 本發明化合物之鹽較佳地為醫藥學上可接受的，但應瞭解，非醫藥學上可接受之鹽亦屬於本發明之範疇，因為此等非醫藥學上可接受之鹽適用於作為製備醫藥學上可接受之鹽的中間產物。 應瞭解，本發明化合物及其鹽可以醫藥學上可接受之衍生物之形式存在。術語「醫藥學上可接受之衍生物」包括式(I)化合物之醫藥學上可接受之酯、前藥、溶劑合物及水合物或其鹽。醫藥學上可接受之衍生物可包括當投與給個體時能夠(直接或間接)提供本發明化合物或其活性代謝物或殘餘物的任何醫藥學上可接受之水合物或任何其他化合物或前藥。 醫藥學上可接受之鹽包括酸加成鹽、鹼加成鹽及四級胺及吡啶鎓之鹽。酸加成鹽由本發明化合物及醫藥學上可接受之無機或有機酸形成，該等酸包括(但不限於)鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、乙酸、丙酸、抗壞血酸、檸檬酸、丙二酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、柳酸、胺磺酸、酒石酸或胺基酸。四級胺及吡啶鎓之相對離子包括氯離子、溴離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、甲烷磺酸根、檸檬酸根、乙酸根、丙二酸根、富馬酸根、胺磺酸根及酒石酸根。鹼加成鹽包括(但不限於)諸如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋰鹽、鎂鹽、銨鹽及烷基銨鹽。此外，可藉由試劑將鹼性含氮基團四級銨化，該等試劑諸如：低碳數烷基鹵化物，諸如甲基、乙基、丙基及丁基氯化物、溴化物及碘化物；二烷基硫酸鹽，諸如二甲基硫酸鹽及二乙基硫酸鹽；及其他。鹽可以已知方式製造，例如藉由在適合的溶劑存在下用適當的酸或鹼處理化合物。 本發明化合物可呈結晶形式及/或作為溶劑合物(例如水合物)，意欲將兩種形式包括於本發明之範疇內。術語「溶劑合物」為由溶質(在本發明中為本發明化合物)及溶劑形成之不同化學計量之複合物。此類溶劑不應干擾溶質之生物活性。借助於實例，溶劑可為水、乙醇或乙酸。溶合之方法在此項技術中通常已知。 術語「前藥」以其最廣泛的含義使用且涵蓋活體內轉化為本發明化合物之彼等衍生物。此類衍生物對於熟習此項技術者將容易想到，且包括(例如)其中游離羥基轉化成酯衍生物或環氮原子轉換為N-氧化物之化合物。酯衍生物之實例包括烷基酯、磷酸酯及由胺基酸(較佳地為纈胺酸)形成之彼等。任何為本發明化合物之前藥之化合物包括在本發明之範疇及精神內。 術語「醫藥學上可接受之酯」包括本發明化合物之生物學上可接受之酯，諸如磺酸、磷酸及羧酸衍生物。 因此，在本發明之另一態樣中提供本發明化合物或其鹽之前藥或醫藥學上可接受之酯。 應瞭解，本發明化合物具有至少一個非對稱中心，且因此能夠以超過一種立體異構形式存在。本發明單獨地擴展至此等形式中之每一者且擴展至其混合物(包括外消旋體)。通常可藉由層析方法或使用解析劑將異構體分離。替代地，可使用對掌性中間產物藉由不對稱合成製備單獨異構體。在化合物具有至少一個碳-碳雙鍵時，其可以具有包括於本發明中之化合物的所有異構體形式之Z形式及E形式出現。 本發明亦包括上述本發明之實施例之可能的鹽或諸如醫藥學上可接受之酯、溶劑合物及/或前藥之醫藥學上可接受之衍生物。 在本發明之另一態樣中提供醫藥組合物，該醫藥組合物包含治療有效量之前述化合物或其醫藥學上可接受之鹽中之一或多者，包括其醫藥學上可接受之衍生物，且視情況包括醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。 在另一態樣中，本發明提供用於治療或預防流感病毒感染之醫藥組合物，該組合物包含有效量之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，包括其醫藥學上可接受之衍生物，且視情況包括醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。 術語「組合物」意欲包括活性成份與作為載劑之囊封材料之調配物，以得到其中由載劑包圍之活性成份(具有或不具有其他載劑)之膠囊。 醫藥組合物或調配物包括適用於經口、經直腸、經鼻、體表(包括頰內及舌下)、經陰道或非經腸(包括肌肉內、皮下及靜脈內)投與或呈適用於藉由吸入或吹入投與之形式之彼等者。在一個實施例中，本發明化合物經調配用於吸入、經口投與、鼻內投與、腹膜內投與、靜脈內投與或肌肉內投與。 醫藥組合物藥劑之調配及/或製造中之一般考慮因素可見於(例如)Remington ' s Pharmaceutical Sciences ,第十六版, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)及Remington : The Science and Practice of Pharmacy ,第21版(Lippincott Williams & Wilkins, 2005)。 在一個實施例中，根據本發明之組合物及調配物可藉由任何適合的吸入、吹入或鼻內遞送方法向有需要之個人投與。用於吸入、吹入或鼻內投與之適合的方法將為熟習此項技術者所熟知。 在一個實施例中，本發明化合物之組合物或調配物可呈適用於藉由吸入或吹入投與之形式。舉例而言，本發明化合物之組合物或調配物可經製備為用於經由口或鼻吸入或吹入之乾燥粉末、溶液、懸浮液或氣溶膠。適用於以氣溶膠或乾燥粉末形式投與之調配物可根據習知方法製備且可與其他治療劑一起傳遞，該等治療劑諸如迄今為止用於治療或預防如本文所描述之感染的化合物。 在一個實施例中，本發明化合物之組合物或調配物可藉助於乾燥粉末吸入劑投與。可使用此項技術中容易揭示之類型之乾燥粉末吸入劑，以及可使用具有或不具有諸如乳糖之惰性黏合劑之藥物的等靜壓縮錠劑或片劑之微粉化屑。此投與之方法提供尤其快速至肺之遞送。當本發明化合物以乾燥粉末之形式提供時，其可單獨存在或以與適合的醫藥學上可接受之稀釋劑之摻合物存在，該稀釋劑諸如澱粉、澱粉衍生物(諸如，羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯啶酮(PVP))、糖衍生物(諸如，甘露醇或乳糖)。粉末組合物可以單位劑型存在，例如以膠囊或(例如)明膠之藥筒或形成的塑料或可藉助於吸入裝置自其中投與粉末之泡殼包裝；或可以多次劑型存在，例如粉末儲集器。 對於吸入液滴、噴霧及氣溶膠，諸如噴霧器或經加壓之氣溶膠產生器之各種裝置為易於獲得的。另外，此類裝置可經計量以提供給藥均一性。 所有吸入劑可經設計及塑造以將液體或固體粒子遞送至鼻黏膜以及上呼吸道及/或下呼吸道。 在另一實施例中，本發明化合物之組合物或調配物可藉助於濕氣溶膠吸入劑藉由吸入或吹入投與。舉例而言，本發明化合物之組合物或調配物可經製備以預計量吸入劑藉由濕氣溶膠吸入投與。 在又一實施例中，本發明化合物之組合物或調配物呈適用於經鼻內投與之形式。本文揭示之鼻內組合物可作為噴霧或液滴投與。因此，含有鼻內調配物之適合的商用封裝可在此項技術中已知的任何噴霧容器中。在一或多個實施例中，本發明之調配物可經由噴霧裝置或容器投與。本發明之噴霧裝置可為單個單位劑量系統或多次劑量系統，例如包含瓶、泵及/或致動器。此類噴霧裝置為可商購的。適合的商用噴霧裝置包括可購自Nemera、Aptar、Bespak及Becton-Dickinson之彼等裝置。用於經鼻內投與本發明之組合物或調配物之其他適合的構件包括經由滴管、注射器、擠壓瓶及此項技術中已知用於以精確及可重複形式將液體塗覆至鼻黏膜之任何其他構件。 本文提供之化合物亦可以廣泛多種經口及非經腸劑型投與。熟習此項技術者將顯而易見，以下劑型可包含本發明化合物抑或本發明化合物之醫藥學上可接受之鹽作為活性組分。 本發明化合物之組合物或調配物可呈無菌可注射製劑之形式，諸如無菌可注射水性或油性懸浮液。此懸浮液可根據已知技術使用本文已提及之彼等適合的分散劑或濕潤劑及懸浮劑調配。無菌可注射製劑亦可為於無毒非經腸可接受稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液(諸如於1,3-丁二醇中之溶液)，或經製備成凍乾粉末。在可採用之可接受媒劑及溶劑中有水、林格氏溶液(Ringer's solution)及等張氯化鈉溶液。另外，無菌不揮發性油可常用作溶劑或懸浮介質。出於此目的，可採用任何溫和不揮發性油，包括合成的單甘油酯或二甘油酯。此外，諸如油酸之脂肪酸亦可用於製備可注射劑。此外，適於非經腸投與之調配物包括可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預期接受者血液等張之溶質的水性及非水性無菌注射溶液；及可包括懸浮劑及增稠劑之水性及非水性無菌懸浮液。 本發明化合物之組合物或調配物亦可經口投與，可製備(例如)錠劑、糖衣錠、口含錠、水性或油性懸浮液、分散性粉末或顆粒、乳液、硬膠囊或軟膠囊、糖漿或酏劑。可根據製造醫藥組合物之技術中已知的任何方法製備欲用於口服使用的組合物，且該等組合物可含有一或多種試劑，包括甜味劑、調味劑、著色劑及防腐劑，以便提供可口製劑。 本發明化合物連同習知佐劑、載劑或稀釋劑可製成醫藥組合物及其單位劑型之形式且以此形式可用作均口服使用之諸如錠劑或填充膠囊之固體，或諸如溶液、懸浮液、乳液、酏劑、凝膠或經其填充之膠囊的液體；用於直腸投藥之栓劑形式；或用以非經腸(包括皮下)使用之無菌注射溶液形式。 此類醫藥組合物及其單位劑型可包含以習知比例之習知成分，有或無額外活性化合物或成分，且此類單位劑型可含有與所預定採用之日劑量範圍相當之任何適合有效量之活性成分。因此每錠劑含有十(10)毫克活性成份或更廣泛地含有0.1至一百(100)毫克之調配物為適合的代表性單位劑形。 為由本發明化合物製備醫藥組合物，醫藥學上可接受之載劑可為固體或液體。固體形式製劑包括粉末、錠劑、丸劑、膠囊、扁囊劑、栓劑及可分配顆粒。固體載劑可為一或多種物質，其亦可充當稀釋劑、調味劑、增溶劑、潤滑劑、懸浮劑、黏合劑、防腐劑、錠劑崩解劑或囊封材料。 在粉末中，載劑為與細粉狀活性組分混合的細粉狀固體。 在錠劑中，活性組分以適合比例與具有所需結合能力之載劑混合且以所要形狀與大小壓實。 粉末及錠劑較佳含有百分之五或百分之十至約百分之七十之活性化合物。適合載劑為碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、果膠、糊精、澱粉、明膠、黃蓍、甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈉、低熔點蠟、可可脂及其類似物。術語「製備」意欲包括用囊封材料作為載劑調配活性化合物，從而得到膠囊，其中含或不含載劑之活性組分由載劑包圍，因此與載劑結合。類似地，包括扁囊劑及口含錠。錠劑、粉末、膠囊、丸劑、扁囊劑及口含錠可以適合於經口投與之固體形式使用。 對於製備栓劑，首先熔化低熔點蠟(諸如脂肪酸甘油酯或可可脂之摻合物)並將活性組分均勻分散於其中(如藉由攪拌)。接著將熔融均勻混合物傾倒於適宜大小之模具中，使其冷卻，從而凝固。 適用於經陰道投與之調配物可以子宮托、棉塞、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧形式呈現，除含有活性成分以外，其亦含有諸如此項技術中已知為適當之載劑。 液體形式製劑包括溶液、懸浮液及乳液，例如水或水-丙二醇溶液。舉例而言，非經腸注射液體製劑可以於聚乙二醇水溶液中之溶液形式調配。 無菌液體形式組合物包括無菌溶液、懸浮液、乳液、糖漿及酏劑。活性成份可溶解或懸浮於醫藥學上可接受之載劑(諸如無菌水、無菌有機溶劑或之混合物)中。 因此根據本發明之化合物可經調配用於非經腸投與(例如，藉由注射，例如快速注射或連續輸注)，且可在安瓿、預填充注射器、較小體積輸注或在具有附加防腐劑之多劑量容器中以單位劑型呈現。組合物可採用諸如於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液之形式，且可含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑之調配劑。替代地，活性成份可藉由無菌隔離無菌固體或藉由自溶液凍乾獲得之呈粉末形式，用於在使用之前以適合的媒劑(例如無菌、無熱原質水)復原。 適用於經口使用之水溶液可藉由將活性組分溶解於水中且視需要添加適合的著色劑、調味劑、穩定劑及增稠劑來製備。 適用於經口使用之水性懸浮液可藉由將細粉狀活性組分與黏性材料(諸如天然或合成樹膠、樹脂、甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈉或其他熟知懸浮劑)一起分散於水中來製備。 亦包括固體形式製劑，意欲在使用前不久將其轉化成液體形式製劑用於經口投與。此類液體形式包括溶液、懸浮液及乳液。除活性組分外，此等製劑可含有著色劑、調味劑、穩定劑、緩衝劑、人工及天然甜味劑、分散劑、增稠劑、增溶劑及其類似物。 為局部投與至表皮，本發明化合物可經調配為軟膏、乳膏或洗劑，或經皮貼片。軟膏及乳膏可(例如)用添加適合的增稠劑及/或膠凝劑之水性或油性鹼調配。洗劑可用水性或油性鹼調配且通常將亦含有一或多種乳化劑、穩定劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑或著色劑。 適用於在口腔中局部投與之調配物包括在調味基質(通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃蓍)中包含活性成分的口含錠；在惰性基質(諸如明膠及甘油或蔗糖及阿拉伯膠)中包含活性成分之片劑；及在適合液體載劑中包含活性成分的漱口劑。 藉由習知方式，例如用滴管、移液管或噴霧器將溶液或懸浮液直接塗覆至鼻腔。可以單次或多次劑型提供調配物。在滴管或移液管之後一情況中，此可藉由向患者投與適當之預定體積之溶液或懸浮液實現。在噴霧器之狀況下，此可藉助於(例如)計量霧化噴射泵來實現。為改良經鼻遞送及保持性，可用環糊精囊封根據本發明之化合物，或與預期增強鼻黏膜中之遞送及保持力之其他製劑調配。 投與至呼吸道亦可藉助於氣溶膠調配物實現，在該氣溶膠調配物中以具有諸如氫氟烷烴(HFA)或氯氟碳化物(CFC) (例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷)、二氧化碳或其他適合的氣體之適合推進劑之加壓封裝提供活性成份。氣溶膠亦宜含有諸如卵磷脂之表面活性劑。可藉由提供計量閥控制藥物之劑量。 替代地，活性成分可以乾燥粉末之形式提供，例如化合物於適合粉末基質中之粉末混合物，該基質諸如乳糖、澱粉、澱粉衍生物(諸如，羥丙基甲基纖維素)及聚乙烯吡咯啶酮(PVP)。適宜地，粉劑載劑應在鼻腔中形成凝膠。粉末組合物可以例如膠囊或藥筒(例如，明膠或泡殼包裝)之單位劑型呈現，散劑可藉助於吸入器自其投與。 在意欲用於投與至呼吸道之調配物(包括鼻內調配物)中，化合物通常將具有較小粒徑，例如約為5微米至10微米或更小。此類粒徑可藉由此項技術中已知之方式，例如藉由微粉化獲得。 在需要時，可採用適於提供活性成分之持續釋放的調配物。 藥物製劑較佳地呈單位劑型。在此類形式中，製劑再分為含有適量活性組分之單位劑量。單位劑型可為封裝製劑，該包裝含有離散量之製劑，諸如包裝錠劑、膠囊及小瓶或安瓿裝粉末。此外，單位劑型可為膠囊、錠劑、扁囊劑或口含錠本身，或其可為適當數目之呈封裝形式之此等單位劑型中之任一者。 本發明亦包括無載劑存在下之化合物，其中化合物呈單位劑型。 取決於化合物之活性及待治療之疾病，待投與之本發明化合物之量可在每天0.01 mg至2000 mg之範圍內。 用於治療所需之化合物之量將隨投與途徑、所治療之病況的性質以及動物(包括人類患者)之年齡及狀況而變化，且將最終由主治獸醫或醫師酌情處理。 舉例而言，適合的劑量將在每天每kg體重約0.1 mg至100 mg之範圍內，較佳地在0.1 mg/kg/天至50 mg/kg/天之範圍內。 在一些實施例中，用於經口投與之劑量將在1 mg/kg/天至100 mg/kg/天之範圍內。用於注射之劑量將在1 mg/kg/天至100 mg/kg/天之範圍內。用於吸入之劑量將在0.01 mg/kg/天至1 mg/kg/天之範圍內。在一些較佳實施例中，用於經口或注射之劑量將在5 mg/kg至50 mg/kg之範圍內，一日兩次至三次，持續1至15天，較佳地持續3至12天，更佳地持續5至10天。在其他較佳實施例中，用於吸入之劑量將在0.1 mg/kg至0.5 mg/kg之範圍內，一日一至五次，持續1至15天，較佳地持續3至12天，更佳地持續5至10天。替代地，在其他較佳實施例中，用於吸入之劑量將在0.2 mg/kg至0.4 mg/kg之範圍內，在治療期間作為單次每日投與。應理解，所期望的劑量可以單次劑量投與或作為分次劑量在合適的間隔下投與，例如每天兩個、三個、四個或多於四個子劑量。 本發明化合物宜以單位劑型投與，例如每單位劑型含有0.1 mg至10 mg之活性成份。 儘管化合物在用於療法中可能作為化學原料投與，但較佳地將活性成份呈現為醫藥調配物。因此本發明進一步提供醫藥調配物，其包括化合物以及一或多種其醫藥學上可接受之載劑且視情況包括其他治療性及/或預防性成分。載劑必須在與調配物之其他成分相容且不對其受體有害之意義上為『可接受的』。 醫藥調配物包括適用於經口、經直腸、經鼻、或非經腸(包括肌肉內、皮內、皮下及靜脈內)投與之彼等或呈適用於投與胃腸道之形式，或呈適用於投與呼吸道(包括鼻腔通道)之形式(例如藉由吸入或吹入)，或用於皮內或皮下植入或用於經皮貼片。適當時，調配物宜以離散劑量單位形式呈現，且可藉由此項技術中熟知之方法中的任一者製備。所有方法包括將活性化合物與載劑(諸如，液體載劑或細粉狀固體載劑或其組合)結合之步驟，且接著在必要時將產物塑形成所期望的調配物。 用於鼻內投與之液體或粉末、用於經口投與之錠劑或膠囊及用於靜脈內投與之液體為較佳的組合物。 根據本發明之化合物之藥物製劑可在組合療法中與一或多種其他活性劑共同投與。舉例而言，活性化合物之藥物製劑可與一或多種其他抗病毒劑、抗生素及抗炎藥共同投與(例如分別、同時或連續) 術語「治療有效量」係指當投與需要此類治療之個體(諸如哺乳動物，包括人類)時足以有效治療之量(如上所定義)。治療有效量將取決於經治療個體及疾病病況、病痛之嚴重程度及投與之方式而變化，且可由一般技術者常規地測定。 術如本文所用之語「治療」覆蓋動物(較佳地為哺乳動物，更佳地為人類)中之疾病或病症之任何治療，且包括：(i)在個體中預防疾病或病況發生；(ii)抑制疾病或病況；(iii)緩解疾病或病況；或(iv)緩解由疾病引起之病況/症狀。 如本文所用之術語「預防(preventing)」及「預防(prophylaxis)」係指預先投與藥劑以避免或防止疾病或病症之一或多種症狀之出現。醫學領域中之一般技術者認為術語「預防」不為絕對術語。應理解在醫學領域中係指預防性投與藥物以大體上減小病況或病況之症狀之可能性或嚴重性，且此為本發明中意欲之含義。如在此領域中之標準教科書(Physician's Desk Reference)中所用，關於病症或疾病之術語「預防(prevent/preventing及prevention)」，係指在疾病或病症自身完全顯現之前避免疾病或病症之產生、作用、症狀或進展。 關於本發明之化合物、組合物或調配物之術語「投與(administer/administering或administration)」意謂將化合物導入至需要治療之動物之系統中。當以與一或多種其他活性劑之組合提供本發明化合物時，「投與」及其變化形式各自理解為包括同時及/或依序引入化合物及其他活性劑。實例 本文所揭示之態樣藉由以下非限制性實例進一步加以描述。通用方法及說明 除非另外指出，否則在Bruker Avance 300 (DPX 300A上之Xwin-NMR版本3.5)上記錄NMR光譜。 除非另外指出，否則使用ESI (電噴霧電離探頭)、使用Water Mass Lynx NT軟體在Mass Spectrometer Waters Micromass ZMD上記錄質譜。 除非另外指出，否則在矽膠60 F245上進行急驟管柱層析(E. Merck)。 在預塗矽膠之培養盤上進行薄層層析(TLC) (E. Merck)。 除非另外指出，否則使用Waters雙波長2487 UV偵測器及Waters Millennium 32軟體在Waters Alliance 2690分離模組上進行高效液相層析(HPLC)。實驗室動物管制之一般程序 利用實驗室動物之相關實驗之倫理學管制係根據對應機構/大學之機構動物護理及使用委員會之批准進行。空斑減少分析之一般程序 將MDCK細胞接種至六孔組織培養盤中且藉由標準方法使其生長至匯合。在補充有0.2% BSA之最小體積之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中稀釋流感病毒，得到每孔50至100 PFU之估計滴定度。在37℃下在5% CO2 氛圍中將病毒接種體吸收至MDCK細胞上持續1 h之後，抽吸出病毒接種體且用含有足以在室溫下使培養基膠化之量(通常為1%至2%)的瓊脂或瓊脂糖之病毒生長培養基(補充有BSA、胰蛋白酶及胰島素-運鐵蛋白-硒之基本伊格爾培養基(Eagle's medium))替換。在37℃下在CO2 氛圍中培育培養盤直至空斑出現(通常2至4天)。藉由適合的染色劑(例如，含0.4%結晶紫之縮甲醛鹽水)使空斑顯現，隨後對空斑進行計數。抗病毒效能(EC50 )經測定為將空斑數目減少至未處理對照物之值的50%之培養基中之化合物之濃度。CPE 分析 之材料及一般程序 將測試化合物溶解於無菌水中且在-20℃下進行儲存。隨後在分析培養基(MEM +胰蛋白酶)中將化合物稀釋至所要濃度。 分析培養基包含補充有1 mM MEM非必需胺基酸、50U-青黴素50 μg/mL鏈黴素、1 mM丙酮酸鈉之Gibco 1 MEM (500 mL)。在進行分析之前，將胰蛋白酶(經TPCK處理)添加至培養基中直至1 μg/ml之最終濃度。 在補充有1 mM MEM非必需胺基酸、50U-青黴素-50 μg/mL鏈黴素、1 mM丙酮酸鈉及10% FBS之生長培養基Gibco l x MEM (500 mL)中使MDCK細胞(ATCC)生長。 在PBS中稀釋病毒儲備液。 使用CellTitre 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)進行分析。 除非另外指出，否則利用以下一般方法進行CPE分析： i)     在96孔托盤中在生長培養基中使MDCK細胞生長至匯合； ii)    移除培養基； iii)   每孔添加46 μL經稀釋之病毒，包括模擬感染孔； iv)    在37℃下培育培養盤1.5 h。在此時間期間，製備測試化合物。 v)     在1.5 h之後移除病毒接種體。 vi)    藉由在上述培養盤上執行化合物之1:3連續稀釋來製備待測試之化合物： a)  將100 μL分析培養基添加至第3至11列中； b) 將150 μL化合物添加至第2列； c)  自第2至10列滴定50 μL，接著自第10列丟棄50 μL。 d) 第11列充當陽性及陰性對照。 vii)   在37℃下培育細胞48 h至96 h。 viii)  在感染48 h至96 h後，移除培養基。 ix)    用不含胰蛋白酶之100 μL分析培養基替換培養基。 x)     每孔添加20 μL偵測溶液。 xi)    在37℃下培育培養盤另外1 h。 xii)   培養盤之吸收率為490 nm之量測。實例 1 ：在 感染 MDCK 細胞之前用測試化合物預處理病毒 在感染MDCK細胞之前利用式(I)之代表性化合物評定抗病毒活性。MD345 [(PK2 TCA(Z0 )2 -[D-Cya-SO3 H)7 -OH]、MD345 [(PK2 TCA(Z0 )2 -[Cya)7 -OH]、MD348 [(CHTCA(Z0 )2 -D-Asp-(D-Cya)-D-Asp- (D-Cya)-D-Asp-(D-Cya)-OH]及MD348 [(CHTCA(Z0 )2 -D-Asp- (D-Cya-SO3 H)-D-Asp-(D-Cya-SO3 H)-D-Asp-(D-Cya-SO3 H)-OH]作為式(I)之代表性化合物進行測試。測試抵抗兩種病毒株(A/Sydney/250/99 (H1N1)及A/Sydney/5/97 (H3N2))之活性。紮那米韋用作對照。 條件詳述於表1中且概述提供於圖1中。表 1 ：在 感染 MDCK 細胞之前預處理病毒之 條件 的概述
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 A/Sydney/250/99之結果概括於表2以及圖2A、圖2B及圖2C中。A/Sydney/5/97之結果概括於表3以及圖3A、圖3B及圖3C中。 結果表明式(I)化合物、MD345及MD348在細胞外使病毒A/Sydney/25/99 (H1N1)及A/Sydney/5/97 (H3N2)中和。用紮那米韋預處理病毒不影響病毒之感染性。 MD345-2及紮那米韋對A/Sydney/250/99之後續時程比較表明MD345-2在少於1分鐘內使兩種病毒中和。A/Sydney/250/99之結果概括於表2以及圖2A、圖2B及圖2C中。A/Sydney/5/97之結果概括於表4及圖4中。表 2 ：在 感染 MDCK 細胞之前預處理病毒 測試化合物：MD348-2、MD345-2及紮那米韋(對照) 病毒滴定度：A/Sydney/25/99
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 說明 ： 將化合物溶解於H2 O中至50 μg/mL。在1×PBS中進一步稀釋至5 μg/mL。將細胞維持在含有1 μg/mL胰蛋白酶之培養基中。在感染72 h後進行分析。(1000 140711) 0.5×10-4 病毒經預吸附持續1 h，移除病毒，洗滌一次細胞且添加新鮮培養基，培育72 h。表 3 ：在 感染 MDCK 細胞之前預處理病毒 測試化合物：MD348-2、MD345-2及紮那米韋(對照) 病毒滴定度：A/Sydney/5/97
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 說明 ： 將化合物溶解於H2 O中至50 μg/mL。在1×PBS中進一步稀釋至5 μg/mL。將細胞維持在含有1 μg/mL胰蛋白酶之培養基中。在感染72 h後進行分析。(2000 271011) 1×10- 4 病毒經預吸附持續1 h，移除病毒，洗滌一次細胞且添加新鮮培養基，培育72 h。表 4 ：在 感染 MDCK 細胞之前預處理病毒之時程比較 測試化合物：MD345-2及紮那米韋(對照) 病毒滴定度：A/Sydney/250/99
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 說明 ： 將化合物溶解於H2 O中至50 μg/mL。在1×PBS中進一步稀釋至0.5 μg/mL。將細胞維持在含有1 μg/ml胰蛋白酶之培養基中。在感染72 h後進行分析。(1000 140711) 1×10- 4 病毒經預吸附持續1 h，移除病毒，洗滌一次細胞且添加新鮮培養基，培育72 h。實例 2 ： 不同酸性 / 陰離子基團關於測試化合物之抗病毒活性之比較 利用式(I)之代表性化合物來比較酸性/陰離子基團對抗病毒活性之影響。以下化合物作為式(I)之代表性化合物進行測試： · MD314-1：(CHTCA(Z0 )2 -L-Asp-(L-Cyst-SO3 H)-Asp-(L-Cyst-SO3 H) -L-Asp-(L-Cyst-SO3 H)-OH，包含三個磺酸及四個羧酸； · MD021-7：CHTGA(Z)2 -L-Asp，包含2個羧酸；及 · MD051-3：PK2 TCA(Z)2 -L-Asp-L-Asp，包含3個羧酸。 測試抵抗三種病毒株之活性：A/Sydney/250/99 (H1N1)、A/Mississippi/03/01 (H1N1)野生型及A/Mississippi/03/01 (H1N1) H274Y (耐奧司他韋)。 A/Sydney/5/97 (H3N2)之結果概括於表5及圖5中。A/Mississippi/03/01 (H1N1)野生型之結果概括於表5以及圖6及圖7中。A/Mississippi/03/01 (H1N1) H274Y (耐奧司他韋)之結果概括於表5以及圖8及圖9中。表 5 ： 酸性 / 陰離子基團關於抗病毒活性之比較
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 結果表明化合物之抗病毒活性與酸性/陰離子基團之數目成正比。實例 3 ： 肺及鼻甲中之病毒清除率之改變 評定式(I)之代表性化合物對小鼠之肺及鼻甲中之病毒清除率之影響。MD021 (CHTCA(Z)2 -L-Asp)作為式(I)之代表性化合物進行測試。紮那米韋及PBS用作對照。 在麻醉下用2 μg MD021、2 μg紮那米韋或PBS在第-1天、第+1天、第+2天、第+3天、第+4天及第+5天經鼻內治療每組20隻小鼠，且在第0天用低於致死劑量之50 pfu之PR8流感病毒感染該等小鼠。每天對小鼠進行稱重。在感染後第1天、第3天、第5天及第7天每治療組殺死五隻小鼠且收集其肺及鼻甲。針對病毒負荷分析肺。在-80℃下儲存鼻甲直至用於分析。 小鼠之所有治療、感染及殺死發生在前一天干預之24小時之後的兩小時窗內。小鼠在其被殺死的當天不接受治療。治療感染及器官收集之時序概括於圖10中。 結果詳述於表6及圖11至圖14中。在所有時間點處，經MD021治療之小鼠中之肺病毒負荷(經表示為log10 )顯著低於經PBS治療之小鼠之肺病毒負荷。在感染後第3天及第7天，經MD021治療之小鼠之肺病毒負荷亦顯著低於經紮那米韋治療之小鼠之肺病毒負荷。使用單因子ANOVA藉由對第1天、第3天及第5天資料之Tukey事後測試及對第7天資料之Mann Witney t-測試來評定結果。分析之臨限為101 . 07 。陰性樣本經賦值為101 。儘管給予低劑量之病毒，但未經治療之小鼠(PBS對照治療)未存活至第7天。 針對直至感染後第7天未殺死之各組小鼠評定體重減輕。結果表明藉由MD021治療後之最小體重減輕大體上小於藉由投與紮那米韋在較晚時間點觀察到之體重減輕。表 6 ： 肺及鼻甲中之病毒清除率之改變
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 藉由雙因子重複量測ANOVA對體重減輕曲線之統計分析展示治療曲線中之高度顯著差異(p ＜ 0.0001)。注意，由於歸因於過早死亡，PBS組未具有第6天及第7天完整資料，僅針對直至感染後第5天獲得之資料完成雙因子重複量測ANOVA。Bonferroni後測試揭露紮那米韋及MD021兩者在第3天、第4天及第5天顯著不同於PBS(p ＜ 0.001)。針對MD021及紮那米韋之完全體重減輕曲線進行之相同分析僅揭露兩個體重減輕曲線整體中之統計顯著差異(p = 0.0443)，而Bonferroni後測試展示出現於第6天(p ＜ 0.01)及第7天(p ＜ 0.001)之顯著差異。 結果表明每天藉由2 μg之化合物MD021之多個治療與類似地藉由PBS在感染後第1天、第3天及第5天及亦藉由2 μg之紮那米韋在感染後第3天及第7天治療之小鼠相比能夠顯著降低肺病毒負荷。病毒負荷中之顯著降低伴隨小鼠中之較少體重減輕，且認為等同疾病嚴重程度中之實質性降低。藉由MD021貫穿整個疾病過程之最小體重減輕為驚人的且顯著好於藉由紮那米韋在較晚時間點之體重減輕。 儘管給予小鼠之PR8病毒之劑量在正常情況下為低於致死的，但接受PBS對照治療之所有小鼠體重減輕且在感染後第7天之前經殺滅。未預期的過早死亡可與每天的麻醉及鼻內投與50 μL之液體之有害作用相關聯。然而，MD021組及紮那米韋組之治療超過任何有害作用。實例 4 ： CPE 分析篩檢 根據以上概述之CPE分析之一般程序針對式(I)之代表性化合物進行CPE分析篩檢。結果詳述於表7及表8中。亦針對一系列病毒株進行特定活體外抗病毒篩檢，該等病毒株包括A型流感H7N9 A/Anhui/1/2003 (表9)、A型流感H5N1 Hong Kong/213/2003 (表10)、A型流感H3N2 Perth/16/2009 (表11)、A型流感H7N9 A/Anhui/1 2003 (表12)、A型流感H1N1 California 07/2009 (表13)、A型流感H5N1 Duck/MN/1525/81 (表14)、A型流感H5N1 Thailand/16/2004 (表15)、A型流感病毒H1N1、A/Mississippi/3/2001 H275Y，耐奧司他韋(表16)、A型流感病毒H5N1 Duck/MN/1525/81 (表17)、B型流感病毒，B/Brisbane/60/2008 (表18)、B型流感病毒、B/Florida/4/2006 (表19)及A/Sydney/250/99 (H1N1) (表20)。 抗流感活性資料表明式(I)化合物中之酸基愈多，抗病毒活性愈高。 在後續CPE分析(表38)中及不同病毒滴定度下(表39)進一步評定式(I)之代表性化合物之抗流感活性。實例 5 ：抵抗 耐奧司他韋病毒株之抗流感病毒活性 針對式(I)之代表性化合物評定抵抗耐奧司他韋病毒株之抗流感病毒活性。記錄對空斑大小及空斑數目之抑制。奧司他韋用作對照。結果詳述於表21中。實例 6 ： 病毒空斑減少 分析 在抵抗CA/07/2009病毒H1N1及A/PR/8病毒H1N1中之每一者之病毒空斑減少中評定式(I)之代表性化合物。利用紮那米韋作為對照。結果分別詳述於表22及表23中。實例 7 ： 式 ( I ) 之代表性化合物之活體內小鼠功效資料 在小鼠中抵抗一系列病毒感染來評定式(I)之代表性化合物之活體內小鼠功效資料。 表24詳述在藉由A/California/04/2009 (H1N1)A/Victoria/3/75 (H3N2)、A/Mississippi/3/01 H275Y，耐奧司他韋病毒(H1N1)、A/Duck/MN/1525/81 (H5N1)、或B/Sichuan/379/99 (B型流感)中之一者病毒感染且用式(I)之代表性化合物在不同劑量下單次化合物治療之後之小鼠存活率。 表25詳述在藉由A/PR/8病毒(每小鼠500 pfu)鼻內病毒感染且用式(I)之代表性化合物在不同劑量及時間下單次化合物治療之後之小鼠存活率。 表26詳述當在感染後投與不同劑量時，用式(I)之代表性化合物單次經鼻內治療對小鼠之流感A/California/04/2009 (H1N1pdm)病毒感染存活率之影響。將紮那米韋用作對照且將生理鹽水用作安慰劑。 表27詳述當在感染後48小時投與不同劑量時，用式(I)之代表性化合物單次經鼻內治療對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒感染存活率之影響。將紮那米韋用作對照且將生理鹽水用作安慰劑。 表28詳述當在感染後48小時投與時，用式(I)之代表性化合物單次經鼻內治療對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒感染存活率之影響。將紮那米韋用作對照且將生理鹽水用作安慰劑。 表29詳述當在感染後48小時投與不同劑量時，用式(I)之代表性化合物單次經鼻內治療對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒(每小鼠500 pfu)感染存活率之影響。將紮那米韋用作對照且將生理鹽水用作安慰劑。 表30詳述當在感染後60小時投與不同劑量時，用式(I)之代表性化合物單次經鼻內治療對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒(每小鼠500 pfu)感染存活率之影響。將紮那米韋用作對照且將生理鹽水用作安慰劑。將紮那米韋用作對照且將生理鹽水用作安慰劑。 表31詳述當在感染後60 hr投與時，用式(I)之代表性化合物單次鼻內治療在自小鼠中之A型流感/PR/8 (H1N1)病毒(500 pfu/小鼠)感染存活率上之作用。將紮那米韋用作對照且將生理鹽水用作安慰劑。 表32詳述當在感染後72小時投與時，用式(I)之代表性化合物單次經鼻內治療對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒(每小鼠500 pfu)感染存活率之影響。 表33詳述當在感染後72小時投與時，用式(I)之代表性化合物單次經鼻內治療對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒(每小鼠500 pfu)感染存活率之影響。 表34詳述當在流感A/PR/8 (H1N1)病毒(每小鼠500 pfu)之致死性攻擊前1小時經腹膜內投與時，用式(I)之代表性化合物單次治療對小鼠之影響。 表35詳述當在感染後4小時經腹膜內投與(20 μg/小鼠/天×5天)時，用式(I)之代表性化合物治療對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒(每小鼠500 pfu)感染存活率之影響。 呈現於表34及表35中之結果表明式(I)化合物可用於系統性治療感染。 表36詳述當在感染後60小時經鼻內投與時，用式(I)之代表性化合物治療對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒(每小鼠500 pfu)感染存活率之影響。 表37詳述當在感染後60小時經鼻內投與時，用式(I)之代表性化合物治療對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒(每小鼠500 pfu)感染存活率之影響。 表38詳述當在A型流感/PR/8 (H1N1)病毒(500 pfu/小鼠)致死性攻擊小鼠前1小時經腹膜內投與時，用式(I)之代表性化合物治療之作用。 活體外及活體內測試之結果展示式(I)化合物有效抵抗多種流感病毒株，包括A型流感、B型流感、禽流感及耐藥性病毒株。此外，結果展示式(I)化合物未呈現細胞毒性。 關於小鼠研究，發現當用式(I)化合物治療時，當與生理鹽水安慰劑及/抑或對照(亦即，紮那米韋)比較時，經感染小鼠通常減輕較少體重且/或較快恢復。此外，發現式(I)化合物在投與至小鼠中之鼻腔持續一週期或超過11天之後有效。 活體內功效資料表明式(I)化合物活性比紮那米韋對照高至少75倍(以劑量重量)或＞400倍(以莫耳劑量)。 關於感染病毒A型流感PR8 (每小鼠500 pfu)之小鼠之活體內功效資料，基於比較時間在感染之後48小時、60小時或72小時鼻內投與本發明之代表性化合物使得大部分小鼠存活，且最大體重減輕＜15% (僅三個小鼠體重減輕在20%至25%之間)。 關於感染病毒流感A/PR/8 (每小鼠500 pfu)之小鼠之活體內功效資料，腹膜內投與本發明之代表性化合物使得所有小鼠存活，且表明本發明化合物可用於系統性治療感染。 在hERG IC50 (hERG-CHO，自動膜片鉗)分析中測試式(I)之兩種代表性化合物MD185及MD317。兩者結果表明兩種化合物在心臟毒性方面為安全的。此外，以激酶組掃描測試MD185及MD317，在100 nM下在化合物與激酶之間不存在顯著相互作用。表 7 ： CPE 分析篩檢
Figure 105137966-A0304-0026
 *CC50 ＞ 10,000 ng/mL MDCK細胞株
Figure 105137966-A0304-0027
 表 8 ：由 CPE 分析 * ( EC50 nM ) 導出之抗流感病毒活性
Figure 105137966-A0304-0028
 *CC50 ＞ 600 ng/ml MDCK細胞株 **值為至少三次測定之平均值表 9： 活體外抗病毒篩檢 ( A 型流感病毒 H7N9 ，A /Anhui/ 1 / 2003 )
Figure 105137966-A0304-0029
 * SI50 = CC50 /EC50 **SI90 = CC50 /EC90 表 10 ： 活體外抗病毒篩檢 ( A 型流感病毒 H5N1 ， Hong Kong / 213 / 2003 )
Figure 105137966-A0304-0030
 * SI50 = CC50 /EC50 **SI90 = CC50 /EC90 表 11 ：活體外抗病毒篩檢 ( A 型流感病毒 H3N2 ， Perth/ 16 / 2009 )
Figure 105137966-A0304-0031
 * SI50 = CC50 /EC50 **SI90 = CC50 /EC90 表 12 ： 活體外抗病毒篩檢 ( A 型流感病毒 H7N9 ， A /Anhui/ 1 / 2003 )
Figure 105137966-A0304-0032
 * SI50 = CC50 /EC50 **SI90 = CC50 /EC90 表 13 ：活體外抗病毒篩檢 ( A 型流感病毒 H1N1 ， California / 07 / 2009 )
Figure 105137966-A0304-0033
 *SI50 = CC50 /EC50 **SI90 = CC50 /EC90 表 14 ： 活體外抗病毒篩檢 ( A 型流感病毒 H5N1 ， Duck/ MN / 1525 / 81 )
Figure 105137966-A0304-0034
 * SI50 = CC50 /EC50 **SI90 = CC50 /EC90 表 15 ：活體外抗病毒篩檢 ( A 型流感病毒 H5N1 ， Thailand / 16 / 2004 )
Figure 105137966-A0304-0035
 * SI50 = CC50 /EC50 **SI90 = CC50 /EC90 表 16 ： 活體外抗病毒篩檢 ( A 型流感病毒 H1N1 ， A /Mississippi/ 3 / 2001 H275Y ， 耐奧司他韋 )
Figure 105137966-A0304-0036
 *SI50 = CC50 /EC50 **SI90 = CC50 /EC90 表 17 ： 活體外抗病毒篩檢 ( A 型流感病毒 H5N1 ， Duck/ MN / 1525 / 81 )
Figure 105137966-A0304-0037
 *SI50 = CC50 /EC50 **SI90 = CC50 /EC90 表 18 ：活體外抗病毒篩檢 ( B 型流感 病毒， B / Brisbane / 60 / 2008 )
Figure 105137966-A0304-0038
 *SI50 = CC50 /EC50 **SI90 = CC50 /EC90 表 19 ：活體外抗病毒篩檢 ( B 型流感 病毒， B / Florida / 4 / 2006 )
Figure 105137966-A0304-0039
 *SI50 = CC50 /EC50 **SI90 = CC50 /EC90 表 20 ：活體外抗病毒篩檢 ( A / Sydney / 250 / 99 )
Figure 105137966-A0304-0040
 表 21 ：抵抗 耐奧司他韋病毒株之抗流感病毒活性 藉由式(I)之代表性化合物對空斑大小及空斑數目之抑制
Figure 105137966-A0304-0041
 a 當IC50 下降至兩種藥物濃度之間時給定範圍。b 藉由兩次重複觀測之範圍可跨越超過一次log10 稀釋。表 22 ： 病毒空斑減少 分析 ( CA / 07 / 2009 病毒 H1N1 )
Figure 105137966-A0304-0042
 表 23 ： 病毒空斑減少 分析 ( A / PR / 8 病毒 H1N1 )
Figure 105137966-A0304-0043
 表 24 ：式 ( I ) 之代表性化合物之活體內小鼠功效資料 病毒感染及不同劑量之一次化合物治療後之小鼠存活數/總數。
Figure 105137966-A0304-0044
 說明： 在感染前24小時經鼻內投與一次化合物；經鼻內感染小鼠且觀察期為21天。表 25 ： 式 ( I ) 之代表性化合物之活體內小鼠功效資料 病毒感染及不同劑量及次數之化合物治療後之小鼠存活數/總數。藉由A/PR/8病毒(每小鼠500 pfu)經鼻內感染小鼠且用式(I)之代表性化合物經鼻內治療小鼠。
Figure 105137966-A0304-0045
 表 26 ：式 ( I ) 之代表性化合物之活體內小鼠功效資料 當感染後投與時，用MD 185及紮那米韋經鼻內治療一次對小鼠之流感A/California/04/2009 (H1N1pdm)病毒感染存活率之影響。
Figure 105137966-A0304-0046
 a 相對於病毒曝露。b 在21天觀察期期間死亡之小鼠之平均死亡天數。c 初始組大小為10隻經藥物治療之小鼠及15隻經安慰劑治療之小鼠。排除四個動物，因為其未展示感染跡象(無體重減輕)。    * P＜0.05，** P＜0.01，*** P＜0.001，與安慰劑相比。表 27 ： 式 ( I ) 之代表性化合物之活體內小鼠功效資料 當感染後48小時投與時，用MD185、MD317、紮那米韋或鹽水經鼻內治療一次對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒感染存活率之影響。
Figure 105137966-A0304-0047
 a相對於病毒曝露。 b在21天觀察期期間。表 28 ： 式 ( I ) 之代表性化合物之活體內小鼠功效資料 當感染後48小時投與時，用MD185、MD345、MD348、紮那米韋或鹽水經鼻內治療一次對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒感染存活率之影響。
Figure 105137966-A0304-0048
 a相對於病毒曝露；b在21天觀察期期間；c平均死亡天數：6.9天；d平均死亡天數：6.6天表 29 ： 式 ( I ) 之代表性化合物之活體內小鼠功效資料 當感染後48小時投與時，用MD185、MD348、紮那米韋或鹽水經鼻內治療一次對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒(每小鼠500 pfu)感染存活率之影響。
Figure 105137966-A0304-0049
 a相對於病毒曝露；b在21天觀察期期間。表 30 ：式 ( I ) 之代表性化合物之活體內小鼠功效資料 當感染後60小時投與時，用MD185、紮那米韋或鹽水經鼻內治療一次對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒(每小鼠500 pfu)感染存活率之影響。
Figure 105137966-A0304-0050
 a相對於病毒曝露；b在21天觀察期期間；c平均死亡天數：8天；d平均死亡天數：6.6天表 31 ： 式 ( I ) 之代表性化合物之活體內小鼠功效資料 當感染後60小時投與時，用MD185、MD317、MD345、紮那米韋或鹽水經鼻內治療一次對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒(每小鼠500 pfu)感染存活率之影響。
Figure 105137966-A0304-0051
 a相對於病毒曝露；b在21天觀察期期間。表 32 ：式 ( I ) 之代表性化合物之活體內小鼠功效資料 當感染後72小時投與時，用MD185、紮那米韋或鹽水經鼻內治療一次對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒(每小鼠500 pfu)感染存活率之影響。
Figure 105137966-A0304-0052
 a相對於病毒曝露；b在21天觀察期期間。表 33 ： 式 ( I ) 之代表性化合物之活體內小鼠功效資料 當感染後72小時投與時，用MD185、MD345、紮那米韋或鹽水經鼻內治療一次對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒(每小鼠500 pfu)感染存活率之影響。
Figure 105137966-A0304-0053
 a相對於病毒曝露；b在21天觀察期期間。表 34 ： 式 ( I ) 之代表性化合物之活體內小鼠功效資料 在流感A/PR/8 (H1N1)病毒(每小鼠500 pfu)之致死性攻擊前1小時經腹膜內投與一次MD185、MD317、紮那米韋或鹽水對小鼠之影響。
Figure 105137966-A0304-0054
 a 相對於病毒曝露；b 在21天觀察期期間；c 平均死亡天數：7天；d 平均死亡天數：7天表 35 ： 式 ( I ) 之代表性化合物之活體內小鼠功效資料 在感染後4小時用MD185、MD317、紮那米韋或鹽水經腹膜內投與20 μg/小鼠/天×5天對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒(每小鼠500 pfu)感染存活率之影響。
Figure 105137966-A0304-0055
 a 相對於病毒曝露；b 在21天觀察期期間；c 平均死亡天數：7.5天；d 平均死亡天數：7.5天。表 36 ： 式 ( I ) 之代表性化合物之活體內小鼠功效資料 當感染後60小時投與時，用MD185、MD317、紮那米韋或鹽水經鼻內治療一次對小鼠之流感A/PR/8 (H1N1)病毒(每小鼠500 pfu)感染存活率之影響。
Figure 105137966-A0304-0056
 a 相對於病毒曝露，b 在21天觀察期期間表 37 ： 式 ( I ) 之代表性化合物之活體內小鼠功效資料
Figure 105137966-A0305-02-0099-31
Figure 105137966-A0305-02-0099-32
表39：針對式(I)之代表性化合物之CPE分析中之抗流感病毒活性(EC50ng/ml/nM)
Figure 105137966-A0304-0059
 表 40 ： 在不同病毒滴定度下針對式 ( I ) 之代表性化合物之 CPE 分析中之抗流感病毒活性 ( EC50 ng / ml / nM )
Figure 105137966-A0304-0060
 實例 8 ： 式 ( I ) 之代表性化合物之 ADME 毒理學 在hERG IC50 (hERG-CHO，自動化膜片鉗)分析中測試式(I)之兩種化合物MD185及MD317。MD 185之IC50 值不可計算。MD317之效量曲線展示在最高驗證測試濃度(亦即IC50 ＞ 100 nM)下低於25%效力。 結果表明MD185及MD317在心臟毒性方面為安全的。實例 9 ： 式 ( I ) 之代表性化合物之激酶組掃描分析 根據激酶分析之以下協定測試式(I)之兩種化合物MD185及MD317。 對於大多數分析，激酶標記之T7噬菌體病毒株同時生長於自BL21病毒株衍生之大腸桿菌宿主中之24孔方塊中。大腸桿菌生長至對數期並自冷凍儲備液用T7相感染(感染倍率 = 0.4)並藉由在32℃下振盪培育直至裂解(90至150分鐘)。將裂解物離心(6,000×g)並過濾(0.2 μm)以移除細胞殘渣。在HEK-293細胞中產生剩餘激酶且隨後標記有DNA以供qPCR檢測。在室溫下用生物素化小分子配位體處理經抗生蛋白鏈菌素塗佈之磁性珠粒持續30分鐘，產生用於激酶分析之親和樹脂。用過量生物素阻斷經配位之珠粒，且用阻斷緩衝液(SeaBlock (pierce)，1% BSA、0.05% Tween20、1 mM DTT)洗滌以移除未結合之配位體及減少非特異性鍵結。結合反應藉由在1×結合緩衝液(20% SeaBlock、0.17×PBS、0.05% Tween20、6 mM DTT)中組合激酶、經配位之親和珠粒及測試化合物來組裝。將測試化合物製備為含40×原料之100%DMSO並直接稀釋至分析中。所有反應均在聚丙烯384孔培養盤中以0.04 ml之最終體積進行。將分析培養盤在室溫下在震盪下培育1小時，且用緩衝液(1×PBS、0.05% Tween 20)洗滌親和珠粒。接著將珠粒再懸浮於溶離緩衝液(1×PBS，0.05% Tween 20，0.5 μM未經生物素標記之親和配位體)中並藉由振盪在室溫下培育30分鐘。溶離液中之激酶濃度藉由qPCR來測量。 在100 nM下在化合物與激酶之間不存在顯著相互作用。結果概括於表41中。表 41 ：選擇性評分表
Figure 105137966-A0304-0061
 本發明之代表性化合物之製備 為方便起見，許多化學部分使用熟知縮寫來表示，該等縮寫包括(但不限於)：甲基(Me)、乙基(Et)、正丙基(nPr)、異丙基(iPr)、正丁基(nBu)、第三丁基(tBu)、正己基(nHex)、環己基(cHex)、苯基(Ph)、甲氧基(MeO)、乙氧基(EtO)、三甲基矽烷基(TMS)、第三丁氧基羰基(Boc)及乙醯基(Ac)。 為方便起見，許多化合物使用熟知縮寫來表示，該等縮寫包括(但不限於)：甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、乙醚(Et2O)、乙酸乙酯(EtOAc)、三乙胺(TEA)、二氯甲烷(dichloromethane) (二氯甲烷(methylene chloride)、DCM、CH2 Cl2 )、三氟乙酸(TFA)、三氟乙醇(TFE)、二甲基甲醯胺(DMF)、硫酸鈉(Na2 SO4 )、四氫呋喃(THF)、間氯過氧苯甲酸(m CPBA)、六甲基二矽氮烷鈉鹽(NaHMDS)、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲
Figure 105137966-A0304-12-0011-1
六氟磷酸酯(HATU)、O - (苯并三唑-1-基)-N , N , N ', N '- 雙(四亞甲基)
Figure 105137966-A0304-12-0011-1
六氟磷酸酯(HBTU)、二甲亞碸(DMSO)、硫酸鎂(MgSO4 )、碳酸氫鈉(NaHCO3 )、第三丁醇(t -BuOH)、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDCl.HCl)、氟化四正丁基銨(TBAF)、N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)、第三丁基二甲基矽烷基(TBDMS)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、反二氯雙(三苯膦)鈀(II) (PdCl2 (PPh3 )2 )、肆(三苯膦)鈀(0) (Pd(PPh3 )4 )、參(二苯苄基丙酮)二鈀(0) (Pd2 (dba)3 )、鏻四氟硼酸三-第三丁酯(t -Bu3 PH.BF4 )、4,5-雙(二苯膦基)-9,9-二甲基二苯并哌喃(Xantphos)、三苯膦(PPh3 )、偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD)、氯鉻酸吡啶(PCC)、甲硼烷二甲基硫醚(BMS)、異丙醇鈦(TiOiPr4 )、三乙醯氧基硼氫化鈉(NaBH(OAc)3 )、氰基硼氫化鈉(NaBH3 (CN))、硼氫化鈉(NaBH4 )、氯化銨(NH4 Cl)、氯仿(CHCl3 )、二氧化錳(MnO2 )、碳酸鉀(K2 CO3 )、1,2-二氯乙烷(DCE)、疊氮化鈉(NaN3 )、亞硝酸鈉(NaNO2 )、二碳酸二-第三丁酯(Boc2 O)及S-乙醯胺基甲基(Acm)。 式(I)化合物之一般合成概括於下方流程 1 中：流程 1 ： 式 ( I ) 化合物之一般合成
Figure 105137966-A0305-12-0101-001
實例 10 ： N - Boc - 1 , 9 - 二胺基壬烷之製備 將1,9-二胺基壬烷(1 g，6.329毫莫耳)溶解於50 ml乙醇與50 ml水之混合物中，接著在R.T.下添加二碳酸二-第三丁酯(1.38 g，6.329毫莫耳)。在R.T.下攪拌全部混合物16小時，得到白色懸浮液。過濾出此懸浮液。在風乾之後固體為二-Boc-1,9-二胺基壬烷488 mg (1.36毫莫耳，21.53%產率)。用二氯甲烷(150 ml，100 ml)萃取濾過物。可將含有未反應之1,9-二胺基壬烷(289 mg，1.83毫莫耳)之水層再利用於下一批次之製備中。有機萃取物經合併且用50 ml水洗滌，接著與10 g無水Na2 SO4 一起在R.T.下攪拌隔夜。過濾有機懸浮液。將濾過物真空蒸發至乾燥，得到呈無色固體狀之N-Boc-1,9-二胺基壬烷809 mg (49.5%產率)。MS 295(M+1)。實例 11 ： 錨定化合物 Zn ' 之製備 合成詳述於下方流程 2 中。以下化合物參考編號及合成步驟參照係關於流程 2 。 步驟A)在60℃至62℃下將唾液酸(1) (5 g，16.18毫莫耳)及Dowex 50×8 (H+ )樹脂(10 g)在無水甲醇(400 mL)中攪拌48小時。過濾出混合物。將濾過物真空蒸發至乾燥，得到呈白色固體狀之化合物(2) 4.5 g (13.25毫莫耳，82.5%產率)。MS 338(M+1)。 步驟B)將化合物(2) (4 g，11.87毫莫耳)與乙酸酐(40 mL，d 1.08，MW 102.29，423毫莫耳)及硫酸(2 mL)一起攪拌。接著在32℃至35℃下將混合物在油浴中攪拌72小時。在冰浴下將反應混合物逐滴添加至Na2 CO3 (51 g)於水(280 mL)及乙酸乙酯(14 mL)中之攪拌混合物中。然後，在冰浴中將混合物攪拌額外1.5小時，隨後用乙酸乙酯(400 mL，270 mL)萃取。乙酸乙酯萃取物經合併且用10% NaHCO3 溶液(270 mL×2)、飽和NaCl溶液(270 mL×2)洗滌，經無水Na2 SO4 乾燥隔夜。過濾，將濾過物真空蒸發至乾燥，得到化合物(3) 4.78 g (11.57毫莫耳，97.5%產率)。MS 414(M+1)。油狀殘餘物在儲存於裝有P2 O5 之乾燥器中3天之後變成灰白色固體。 步驟C)將化合物(3) (3.47 g，8.4毫莫耳)溶解於第三BuOH (25 mL)中。向此溶液中添加疊氮基三甲基矽烷(1.81 mL，13.63毫莫耳)。在80℃至82℃下在氬氣下將全部混合物攪拌24小時。反應混合物用乙酸乙酯(100 mL)稀釋，接著與含0.9 g NaNO2 之25 mL水一起攪拌，且在室溫下用5N HCl經1小時之時段調整至pH 2。將二相混合物分離，用乙酸乙酯(50 mL)萃取水層。有機萃取物經合併且用水(25 mL×2)、6% NaHCO3 溶液(25 mL)、水(25 mL×3)連續洗滌，接著經Na2 SO4 乾燥。將濾過物真空蒸發至乾燥，得到呈油狀物質之化合物(4) 3.17 g (6.95毫莫耳，82.7%產率)。MS 457(M+1)，479(M+Na)，925(2M+Na)。 步驟D)將化合物(4) (3.15 g，6.91毫莫耳)溶解於甲醇(100 mL)及甲苯(70 mL)中。將溶液放置於真空下以移除空氣(氧氣)，接著用氬氣回填。向此混合物中添加Pd/C (10%) (616 mg)，接著放置於真空下以排出氬氣，氬氣隨後經氫氣(H2 )替換。在室溫下進行氫化持續2小時且隨後過濾出觸媒。將濾過物真空蒸發至乾燥，得到呈灰白色固體狀之化合物(5) 2.82 g (6.55毫莫耳，94.7%產率)。MS 431 (M+1)。 步驟E)將化合物(5) (2.80 g，6.51毫莫耳)溶解於無水乙腈(15 mL)中。向此溶液中添加N,N'-二-Boc-1H-吡唑-1-甲脒[雙(Boc)PCH] (3.03 g，9.76毫莫耳)。在室溫下在氬氣下攪拌全部混合物40小時。將反應混合物真空蒸發至乾燥。將殘餘物溶解於乙酸乙酯(4 mL)中，接著用己烷(4 mL)稀釋，塗覆於急驟管柱層析上，用己烷(150 mL)洗滌，接著用溶劑(乙酸乙酯:己烷1:1) (150 mL)洗滌，最後用溶劑(乙酸乙酯:己烷1:1)溶離。真空蒸發所收集之部分，得到呈白色固體狀之產物化合物(6)，3.23 g (4.8毫莫耳，73.7%產率)。MS 673(M+1)。 步驟F)將化合物(6) (2.8715 g，4.273毫莫耳)溶解於無水甲醇(22 mL)中。在氬氣下向此溶液中添加NaOCH3 (4.9134 mg，0.2136毫莫耳)。在R.T.下在氬氣下將全部混合物攪拌2.5小時，接著用Dowex50×8 (H+ )樹脂調整至pH 6.5，隨後將該樹脂過濾出。將濾過物真空蒸發至乾燥，得到呈白色固體狀之化合物(7) 2.2024 g (4.0337毫莫耳，94.4%產率)。MS 547(M+1)。 步驟G)將化合物(7) (2 g，3.66毫莫耳)溶解於無水乙腈中。向此溶液中添加1,1'-羰基二咪唑(714 mg，4.403毫莫耳)。在20℃至30℃下在氬氣下攪拌全部混合物18小時。將其真空蒸發至乾燥，接著對殘餘物進行急驟管柱層析，首先用己烷(150 mL)洗滌，接著用溶劑(乙酸乙酯:己烷2:1)展開。Rf 值為0.5之部分(乙酸乙酯:己烷2:1)經合併且真空蒸發至乾燥，得到呈白色固體狀之化合物(8) 1.35 g (2.36毫莫耳，64.5%產率)。MS 573(M+1)。 步驟H)將化合物(8) (1.3 g，2.27毫莫耳)溶解於無水吡啶(12.5 mL)中。向此溶液中添加氯甲酸對硝苯酯(503.3 mg，2.497毫莫耳)、4-二甲胺基-吡啶(808.5 mg，6.62毫莫耳)。在30℃下在氬氣下攪拌全部混合物7小時。向此反應混合物中添加N - Boc-1,9-二胺基壬烷(690 mg，2.67毫莫耳)及4-二甲胺基吡啶(166 mg，1.36毫莫耳)於無水吡啶(4 mL)中之溶液。在30℃下在氬氣下攪拌反應混合物16小時，接著真空蒸發以移除吡啶。將殘餘物分配於乙酸乙酯(300 mL)與含有2.45 mL之5N HCl之水(50 mL)之間，用水(50 mL×2)、2% NaHCO3 溶液(50 mL×6)、水(50 mL×2)連續洗滌，經無水Na2 SO4 乾燥且過濾。將濾過物真空蒸發至乾燥，得到2.25 g油狀物質。對其進行急驟管柱層析(乙酸乙酯:己烷1.5:1作為溶離劑)。部分(Rf值為0.27 TLC，乙酸乙酯:己烷1.5:1作為展開溶劑)經合併且真空蒸發至乾燥，得到呈白色固體狀之化合物(9) 1.057 g (1.234毫莫耳，54.4%產率)。MS 857(M+1)，879(M+Na)。1 H-NMR (DMSO-d6 ) δ(ppm) 11.42 (1H, s, 胍NHBoc), 8.25 (1H, d, NH-4), 7.95 (1H, d, AcNH), 7.16 (1H, t, OCONH), 6.75 (1H, t, 壬基NHBoc), 5.80 (1H, s, H-3), 4.92 (2H, m,H-7, H-8), 4.75 (1H, m, H-4), 4.31-4.62 (4H, m, H-5, H-6, H-9, H-9'), 3.74 (3H, s, COOCH3 ), 2.90 (4H, m, NHCH2 (CH2 )7 CH2 NH), 1.86 (3H, s, NHCOCH3 ), 1.49 (9H, s, Boc), 1.38 (18H, s, Boc), 1.2-1.6 (14H, m, NHCH2 (CH2 )7 CH2 NH)。 步驟I)將化合物(9) (1 g，1.168毫莫耳)溶解於三氟乙酸(TFA) (36 ml)及甲基苯基醚(苯甲醚) (3.9 ml)於二氯甲烷(CH2 Cl2 ) (36 ml)中之混合物中。在25℃下將全部混合物攪拌2小時及40分鐘，接著在35℃下將其真空蒸發持續2小時。在R.T.下在己烷(100 ml)中將殘餘物攪拌隔夜，傾析己烷且添加新鮮己烷(60 ml)，且在R.T.下持續攪拌4小時。接著移除己烷。將殘餘物溶解於CH2 Cl2 (10 ml)中且在35℃至40℃下蒸發至乾燥。將殘餘物溶解於水(25 ml)中。將水溶液凍結乾燥，得到呈白色泡沫狀之TFA3 Zn , 鹽之化合物(10) 1.026 g (1.143毫莫耳，97.8%產率)。MS 557 (M+1) [Zn , 之MW = 556，TFA3 Zn , 之MW = 898]。流程 2 ： 錨定化合物 Zn ' 之製備
Figure 02_image159
實例 12 ： 錨定主鏈化合物 PYR ( Zn , ) 2 之製備 合成詳述於下方流程 3 中。以下化合物參考編號係關於流程 3 。 在室溫下向苯均四酸二酐(11) (27.25 mg，0.125毫莫耳)於無水DMF (2 ml)中之溶液中添加Zn , (10) (224.5 mg，0.25毫莫耳)及二異丙基乙胺(DIPEA) (130.64 μl，0.75毫莫耳)。使全部反應混合物在氬氣下在25℃下攪拌36小時，接著用醚:石油醚1:1 (100 ml)處理。將沈澱過濾，用醚洗滌且風乾，得到灰白色固體(197 mg)，接著對該固體進行HPLC分離及純化。HPLC 分析 ： pepl 梯度 管柱：Gemini C18管柱100A 5 μm 150×3.00 mm。波長：220/280 nm。流動速率：0.7 ml/min。溶劑A = 0.1%三氟乙酸。溶劑B = 100%乙腈。溫度：30℃。梯度：0-50% B，15分鐘。滯留時間：在14.35分鐘處PK1PYR(Zn , )2 (12)，在14.53分鐘處PK2PYR(Zn , )2 (13)。HPLC 製備型 ： 管柱：Water Xterra C18製備型MS管柱19×50 mm，5 μm。波長：220/280 nm。流動速率：8 ml/min。溶劑A = 0.1%三氟乙酸。溶劑B = 100%乙腈。溫度：30℃。梯度：10-100% B，80分鐘。PK1PYR(Zn , )2 及PK2PYR(Zn , )2 (13)之純部分經收集且分開凍結乾燥，分別得到PK1PYR(Zn , )2 (12) 49 mg及PK2PYR(Zn , )2 (13) 42 mg。 PK1PYR(Zn , )2 (12) MS指示ESI +ve 10V 1331.5離子。1 H-NMR (D2 O) δ (ppm)：8.00 (2H, s, 芳族對位H x 2), 6.00 (2H, d, H-3 x 2), 5.20-5.50 (4H, m, H-7 x 2, H-8 x 2), 4.35-4.90 (8H, m, H-4 x 2, H-5 x 2, H-6 x 2, H-9 x 2), 4.15 (2H, dd, H-9' x 2), 3.80 (6H, s, COOCH3 x 2), 3.25-3.45 (4H, m, OCONHCH2 x 2), 2.90-3.20 (4H, m, NHCH2 x 2), 1.95 (6H, s, CH3 C0 x 2), 1.20-1.70 (28H, m, (CH2 )7 x 2)。 PK2PYR(Zn , )2 (13) MS指示ESI +ve 10V 1331.5離子。1 H-NMR (D2 O) δ (ppm) 8.35 (1H, s, 芳族H x 1), 7.50 (1H, s, 芳族H x 1), 6.00 (2H, d, H-3 x 2), 5.20-5.50 (4H, m, H-7 x 2, H-8 x 2), 4.35-4.90 (8H, m, H-4 x 2, H-5 x 2, H-6 x 2, H-9 x 2), 4.15 (2H, dd, H-9' x 2), 3.80 (6H, s, COOCH3 x 2),3.25-3.45 (4H, m, OCONHCH2 x 2), 2.90-3.20 (4H, m, NHCH2 x 2), 1.95 (6H, CH3 CO x 2), 1.20-1.70 (28H, m, (CH2 )7 x 2)。流程 3 ：錨定主鏈化合物 PYR ( Zn , ) 2 之製備
Figure 02_image161
實例 13 ： 酸性 / 陰離子基團 D - Asp ( NHCH2 SO3 H ) 2 之製備 合成詳述於下方流程 4 中。以下化合物參考編號係關於流程 4 。 將Boc-D-天冬胺酸(14) (233 mg，1毫莫耳)及HBTU [O-(苯并三唑-1-基)-N , N , N ', N '- 雙(四亞甲基)
Figure 105137966-A0304-12-0011-1
六氟磷酸酯] (758 mg，2毫莫耳)溶解於DMF (10 ml)中。向此溶液中添加DIPEA (二異丙基乙胺) (349 μl，2毫莫耳)。在室溫下將溶液攪拌10分鐘，接著與胺基甲烷磺酸鈉(332 mg，2.5毫莫耳)於DMF (3 ml)中之溶液組合。在室溫下攪拌所得溶液隔夜。將反應混合物真空蒸發，得到淺橙色固體。將其溶解於水(20 ml)中，用乙酸乙酯(20 ml×3)洗滌，將水相真空蒸發以移除有機溶劑，接著凍結乾燥，得到呈白色固體狀之粗產物(15) 310 mg，對該固體進行HPLC分離及純化。HPLC 分析： pep1 梯度 管柱：Gemini C18管柱100A 5 μm 150×30 min。波長：220 nm。流動速率：0.7 ml/min。溶劑A = 0.1%三氟乙酸。溶劑B = 100%乙腈。溫度：30℃。梯度：0-50% B，15分鐘。滯留時間：化合物(15)在4.669分鐘處呈游離酸，MS ESI -ve 418(M-1)，在1.658分鐘處溶劑峰，在2.722分鐘處胺基甲烷磺酸，在5.520分鐘處HBTU物質，在5.802分鐘處單Boc-D-Asp-NHCH2 SO3 H。HPLC 製備型 管柱：Germini AXIA C18管柱，5 μm 50×21.2 mm。波長：220 min。流動速率：8 ml/min；溶劑A = 0.1%三氟乙酸；溶劑B = 100%乙腈；溫度：30℃。梯度：0-100% B，100分鐘。 含有(15)之部分經收集且合併在一起，接著經凍結乾燥，得到呈游離酸之純產物(15)。MS ESI -ve 418(M-1)。將呈游離酸之化合物(15) (200 mg，0.477毫莫耳)溶解於含有苯甲醚(1 ml)之三氟乙酸(10 ml)中。在室溫下攪拌溶液一小時，接著真空蒸發至乾燥。在醚(20 ml×2)中濕磨殘餘物，過濾。將固體風乾，接著再溶解於水中，經凍結乾燥，得到呈白色固體狀之產物(16) 106 mg。MS ESI -ve 318(M-1)。將產物溶解於水(10 ml)中，接著用兩當量之氫氧化鈉中和，凍結乾燥，得到呈白色固體狀之二鈉鹽(16)。流程 4 ： 酸性 / 陰離子基團 D - Asp ( NHCH2 SO3 H ) 2 之製備
Figure 02_image163
實例 14 ： 化合物 MD185 PK2PYR ( Zn ) 2 [( D - Asp )( NHCH2 SO3 ) 2 ] 2 之製備 合成詳述於下方流程 5 中。以下化合物參考編號係關於流程 5 。 向PK2PYR(Zn , )2 (13) (30 mg，22.56微莫耳)於無水DMF (5 ml)中之溶液中添加HATU [O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N , N , N ', N '- 雙(四亞甲基)
Figure 105137966-A0304-12-0011-1
六氟磷酸酯] (17.14 mg，45.11微莫耳)及DIPEA (7.9 μl，45.31微莫耳)。將所得溶液在室溫下攪拌10分鐘，接著添加[D-Asp(NHCH2 SO3 Na)2 ] (33 mg，91.16微莫耳)於DMF (5ml)中之二鈉鹽(16)。在室溫下攪拌反應混合物18小時，接著對其進行HPLC分離及純化。HPLC 分析： pep 1 梯度 管柱：Gemini C18管柱 100A 5 μm 150×3.00 mm；波長：220/280 nm；流動速率：0.7 ml/min；溶劑A = 0.1%三氟乙酸；溶劑B = 100%乙腈；溫度：30℃；梯度：0-50% B，15分鐘；滯留時間：在14.270分鐘處產物(17)呈游離酸。MS ESI +ve +30V 967.5，MS ESI --ve，-25v 965.4。其他峰如下：在11.7分鐘處起始物質PK2PYR(Zn , ) (13)，在13.6分鐘處PK2PYR(Zn , )2 -D-Asp(NHCH2 SO3 H)2 。HPLC 製備型 管柱：Water Xterra製備型MS C18管柱19×50 mm 5 μm；波長：220/280 nm；流動速率：8 ml/min；溶劑A = 0.1%三氟乙酸；溶劑B = 100%乙腈；溫度：30℃；梯度：0-100% B 100分鐘 產物以相對Gemini分析之逆向分佈溶離。溶離分佈在25-35%乙腈之間。將取樣之部分與具有大於90%純度之試管合併，且在Gemini AXIA管柱上分離其他物質。 將產物(17)凍結乾燥，得到白色蓬鬆粉末。MS ESI -ve -25v 965.4表明MW為1932。將化合物(17) PK2 PYR(Zn , )2 [D-Asp(NHCH2 SO3 H)2 ]2 (8 mg，4.14微莫耳)溶解於50%甲醇水溶液(2 ml)中，接著添加三乙胺(40 μl，287.5微莫耳)。在室溫下攪拌所得溶液。藉由分析HPLC針對10.848分鐘處之峰監測反應。2小時之後，用乙酸(60 μl，1049微莫耳)酸化反應混合物且用水稀釋至10 ml。在Kinetex管柱上純化溶液。純部分經合併且凍結乾燥，得到呈白色粉末狀之產物(18) PK2 PYR(Zn )2 [D-Asp(NHCH2 SO3 H)2 ]2 6 mg。 HPLC滯留時間10.695 min。MS ESI -ve -30V 925.6。 為移除化合物中之TFA殘餘物，將純材料溶解於60 ml 4mM HCl中且凍結乾燥，接著溶解於60 ml 1mM HCl中且凍結乾燥，最後自60 ml水凍結乾燥。產率5.6 mg (18) MD185 MW1852。流程 5 ： 化合物 MD185 PK2PYR ( Zn ) 2 [( D - Asp )( NHCH2 SO3 ) 2 ] 2 之製備
Figure 105137966-A0305-12-0112-001
實例 15 ： 錨定化合物 Z0 ' 之製備 合成詳述於下方流程 6 中。以下化合物參考編號及合成步驟參照係關於流程 6 。 根據實例11處描述之程序(H)及程序(I)，使化合物(8)與氯甲酸對硝苯酯反應，接著與N-Boc-1,8-二胺基辛烷反應，在層析之後，得到呈白色固體狀之化合物(19)。MS 843(M+1)。用三氟乙酸(TFA)處理化合物(19)，在處理後得到呈白色泡沫狀之TFA3 Z0 , 鹽之化合物(20) Z0 , ，MS 543 (M+1) [Z0 , 之MW = 542，TFA3 Z0 , 之MW = 884]。流程 6 ： 錨定化合物 Z0 ' 之製備
Figure 02_image167
實例 16 ： 錨定主鏈化合物 PK1 TCA ( Z0 ' ) 2 及 PK2 TCA ( Z0 ' ) 2 之製備 合成詳述於下方流程 7 中。以下化合物參考編號係關於流程 7 。 向TCA (21) (3.085 mg，17.52微莫耳)於DMF (309 μl)中之溶液中添加HATU (13.32 mg，35.03微莫耳)及DIPEA (6.5 μl，37.32微莫耳)。在室溫下攪拌全部混合物10分鐘，接著逐滴添加Z0 ' (20) (30.97 mg，35.03微莫耳)及DIPEA (18.44 μl，105.9微莫耳)於DMF (600 μl)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌隔夜。對所得混合物進行HPLC分離及純化。HPLC 分析 ： pepl 梯度 管柱：Phenomenex C18 5 μl 110A 150×3 mm；波長：220/280 nm；流動速率：0.7 ml/min；溶劑A = 0.1%三氟乙酸；溶劑B = 100%乙腈；溫度：30℃；梯度：100-50% B 15分鐘；滯留時間：PK1 TCA(Z0 ' )2 (22) 11.100 min及PK2 TCA(Z0 ' )2 (23) 11.156 min。 在2.5 ppm下PK1 TCA(Z0 ' )2 (22)1 H-NMR (D2 O) δ ppm (AB對稱dd，4H，Ca H2 =Cb H2 )表明其對稱結構。MS 1225.4 (MW 1224)。 在2.35-2.75 ppm下PK2 TCA(Z0 ' )2 (23)1 H-NMR (D2 O) δ ppm (非對稱，dd，4H，(Ca H2 ≠ Cb H2 ))表明其非對稱結構。MS 1225.4 (MW 1224)。製備型 HPLC 用少量1M乙酸酸化溶液且在水中稀釋至25 ml。經由0.45 μm針筒過濾器過濾此溶液且在20%至80%緩衝劑A下泵取至Water Xterra製備型MS C18管柱19×50 mm上。流動速率8 ml/min，梯度0-100% B 100分鐘，波長210/280 nm。溶離曲線空隙DMF/DIPEA/HATU 在Phenomenex Gemini 5 μm C18 110A Axia 50×21.2 mm管柱上在0.1% TFA緩衝劑中進一步純化且分離PK1 TCA(Z0 ' )2 及PK2 TCA(Z0 ' )2 。 PK1/PK2比率為約1:2，兩者MS ESI +30V 1225.4。流程 7 ： 錨定主鏈化合物 PK1 TCA ( Z0 ' ) 2 及 PK2 TCA ( Z0 ' ) 2 之製備 實例 17 ： 酸性 / 陰離子基團 [ D - Cya - SO3 H ] 7 OH 之 製備 合成詳述於下方流程 8 中。以下化合物參考編號係關於流程 8 。 如流程8中所詳述，應用固相合成來製備[D-Cys-SH]7 -OH (33)，接著氧化聚半胱胺酸(33)得到[D-CyaSO3 H]7 -OH (34)。 在50 ml Falcon試管中將Fmoc-D-Cys(Trt)-OH(24) (2.93 g，5毫莫耳)溶解於無水二氯甲烷(DCM) (35 ml)中，接著添加2-氯三苯甲基氯樹脂(25) (5 g)，劇烈振盪，添加二異丙基乙胺(DIPEA) (3.5 ml，20毫莫耳)。在5 min之後，添加另一部分之DIPEA (1.3 ml，7.5毫莫耳)。將全部混合物振盪另外4小時。為封端任何剩餘的反應性2-氯三苯甲基氯，添加甲醇(4 ml)。將混合物振盪另外30分鐘。用DMF (20 ml ×3)、DCM (20 ml×3)、甲醇(20 ml×3)連續洗滌樹脂，接著真空乾燥隔夜。產率指示0.57 mM/g之負載量(26)。 為自樹脂移除Fmoc基團，在DCM (35 ml)中將樹脂(26)預膨脹，接著添加含50%哌啶之DMF (30 ml)。將全部混合物放置在旋轉器上30 min。用50%哌啶於DMF (30 ml)中之新鮮溶液重複過程持續60 min。接著用DMF (20 ml×2)、DCM (20 ml×2)、DMF (20 ml×3)連續洗滌樹脂。進行陽性寧海准(ninhydrin)測試。樹脂(27)準備好用於偶合。 向Fmoc-D-Cys(Trt)-OH (24) (1758 mg，3毫莫耳)於DMF (6 ml)中之溶液中添加HBTU [O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-雙(四亞甲基)
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六氟磷酸酯] (1140 mg，3毫莫耳)及DIPEA (523 μl，3毫莫耳)。在室溫下攪拌混合物10分鐘，接著添加樹脂(27) (2.5 g，0.57 mM/g，1.5毫莫耳)。將反應混合物攪動24小時。寧海准測試陰性，用DMF (20 ml×3)洗滌樹脂，接著用含5%乙酸酐、1% DIPEA之DMF (20 ml)處理30分鐘。接著用DMF (20 ml×3)、DCM (20 ml×3)、甲醇(20 ml×3)洗滌樹脂(28)。在DCM中將樹脂(28)預膨脹，且添加含30%哌啶/N-甲基吡咯酮之DMF (20 ml)。將全部混合物放置在旋轉器上30 min，接著與30%哌啶及N-甲基吡咯酮之新鮮溶液一起放置另外60分鐘，在用DMF (20 ml×2)、DCM (20 ml×2)、DMF (20 ml×2)洗滌之後得到樹脂(29)。 使樹脂(29)與(24) (1758 mg，3毫莫耳)在DMF (6ml)中進一步偶合24小時，用HBTU (1140 mg，3毫莫耳)及DIPEA (523 μl，3毫莫耳)預活化10分鐘，在處理之後得到樹脂(30)。其中一半隨後遵循以下程序：由哌啶/甲基吡咯酮去保護，與(24)再偶合，用HBTU/DIPEA預活化，重複此程序4次，產生樹脂(31)。 用DCM (20 ml×5)洗滌樹脂(31)，接著放入50 ml Falcon試管中，添加含40%乙酸之DCM (35 ml)，在室溫下在旋轉器上振盪6小時。過濾樹脂懸浮液，將濾過物真空蒸發至淡黃色泡沫。用水(100 ml×3)洗滌殘餘物，在乾燥之後得到白色固體(32) [D-Cys(Trt)]7 -OH。 在TFA (20 ml)、三異丙基矽烷(1 ml)及水(0.5 ml)之溶液中攪拌(32)持續3小時。過濾所得懸浮液。將濾過物蒸發至油狀物質，用醚(20 ml×4)濕磨該物質，得到白色固體。將其在50%乙腈水溶液(100 ml)中攪拌。材料經超聲處理以形成白色懸浮液，將懸浮液凍結乾燥，得到(33) [D-Cys-SH]7 -OH (380 mg)之粗產物。HPLC 分析 管柱：Phenomenex Gemini 5 μm C18 110A 150×3.00 mm，溶劑A = 0.1%三氟乙酸，溶劑B = 100%乙腈，流動速率：0.7 ml/min，波長：210/280 nm，溫度：30℃，梯度：0-50% B 15分鐘，滯留時間：9.356分鐘。 MS Cone +25V主峰740 Cone -25V主峰738指示(33)之MW為739 [D-Cys-SH]7 -OH 將化合物(33) (10 mg，13.53微莫耳)添加至在冰鹽浴中預冷之過甲酸溶液(1 ml)中。將全部混合物在冰浴中攪拌1小時，接著用100 ml冷水稀釋，凍結乾燥，得到淡黃色形式(34)。在Phenomenex Kinetex 5 μm XB-C18 100A管柱上使用等度0.1% TFA作為溶離劑純化材料，得到呈無色粉末狀之化合物(34) [D-Cyst-SO3 H]7 -OH MW 1075，MS Cone +50V 1076(M+1)。 藉由將甲酸(8.74 ml)、水(0.96 ml)及30%過氧化氫(1 ml)混合來製備過甲酸，且使混合物在室溫下在靜止的燒瓶中靜置30分鐘。此過氧化物應在使用之前新製。流程 8 ： 酸性 / 陰離子基團 [ D - 包囊 - SO3 H ] 7 OH 之製備
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實例 18 ： 化合物 MD345 PK2 TCA ( Z0 ) 2 -[ D - Cyst - SO3 H ] 7 - OH 之製備 合成詳述於下方流程 9 中。以下化合物參考編號係關於流程 9 。 向PK2 TCA(Z0 ' )2 (23) (4 mg，3.268微莫耳)於無水DMF (2 ml)中之溶液中添加含HATU (1.242 mg，3.268微莫耳)及2% DIPEA之DMF (30 μl，3.44微莫耳)。在室溫下攪拌混合物10分鐘，接著與(34) [D-Cyst-SO3 H]7 -OH (7.03 mg，6.54微莫耳)及DIPEA (9.11 μl，52.32微莫耳)於DMF (3 ml)中之溶液組合。在室溫下將全部反應混合物攪拌隔夜。用水/甲醇1/1將混合物稀釋至15 ml，接著對其進行HPLC分離及純化。HPLC 製備型 ： 管柱：Phenomenex Kinetex 5 μm XB-C18 50×21.2 mm；波長：220/280 nm；流動速率：8 ml/min；溶劑A = 0.1%三氟乙酸(TFA)；溶劑B = 100%乙腈；溫度：30℃；梯度：0-100% B，80分鐘。將含有(35)游離酸(B=H)之部分合併且凍結乾燥，得到呈白色粉末狀之化合物(35)游離酸(B=H) 4 mg。MS ESI +ve Cone 35V 1142.1 2 + 離子。 將化合物(35)游離酸(B=H) PK2 TCA(Z0 ' )2 -[D-Cyst-SO3 H]7 -OH (4 mg，1.754微莫耳)溶解於含有三乙胺(TEA) (20 μl，146微莫耳)之50%甲醇水溶液(800 μl)中。在室溫下攪拌混合物，藉由HPLC監測。在3小時之後將其處理。在Kinetex管柱上純化溶液。將11.254 min之滯留時間處之純部分合併且凍結乾燥，得到呈白色粉末狀之化合物(36) 2 mg。MS ESI +ve Cone 40V 1102.2 2 + 離子。 為移除化合物中之TFA殘餘物，將化合物(36)溶解於4 mM HCl (30 ml)中且凍結乾燥。接著將其溶解於1 mM HCl (30 ml)中且凍結乾燥。最後將其自水(30 ml)凍結乾燥，得到產物(36) 1.1 mg，MD345 PK2 TCA(Z0 )2 [D-Cyst-SO3 H]7 -OH MW2201 [MS 2202 (M+1)]。流程 9 ： 化合物 MD345 、 PK2 TCA ( Z0 ) 2 -[ D - Cyst - SO3 H ] 7 - OH MW2201 之製備 實例 19 ： 錨定化合物 Z ' 之製備 合成詳述於以下流程 10 中。以下化合物參考編號及合成步驟參照係關於流程 10 。 根據實例11中描述之程序(H)及程序(I)，使化合物(8)與氯甲酸對-硝苯酯反應，接著與N-Boc-1,6-二胺基己烷反應，在層析之後，得到呈白色固體之化合物(37)，MS 815(M+1)。用三氟乙酸(TFA)及苯甲醚處理化合物(37)，在處理之後得到呈白色形式之TFA鹽之化合物(38)Z'。MS 515 (M+l)。 [ Z'之MW = 514，TFA3 Z' = 856]。流程 10 ：錨定化合物 Z ' 之製備
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實例 20 ： 錨定主鏈化合物 CHTCA ( Z ' ) 2 之製備 合成詳述於下方流程 11 中。以下化合物參考編號係關於流程 11 。 向CHTCA (39) (4.4 mg，20微莫耳)於DMF (300 μl)中之溶液中添加HATU (15.2 mg，40微莫耳)及DIPEA (7.4 μl，42.4微莫耳)。在室溫下攪拌全部混合物10分鐘，接著逐滴添加Z' (38) (34.24 mg，40微莫耳)及DIPEA (21.06 μl，120.9微莫耳)於DMF (700 μl)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌隔夜。用1M HAc (50 μl)及水(25 ml)稀釋所得混合物。經由0.45 μm針筒過濾器過濾此混合物。對濾過物進行HPLC分離及純化。 管柱：Water Xterra製備型MS C18管柱19×50 mm；波長：210/280 nm；流動速率：8 ml/min；溶劑A = 0.1% TFA；溶劑B = 100%乙腈；溫度：30℃；梯度：0-100% B 100分鐘；溶離曲線空隙DMF/DIPEA/HATU。 在Phenomenex Gemini 5 μm C18 110A AXIA 50×21.2 mm管柱上在0.1% TFA緩衝劑中進一步純化含有化合物(40)之部分。將該部分凍結乾燥，得到呈白色泡沫狀之化合物(40) CHTCA(Z')2 ，15 mg。MS ESI +ve, +30v, 1209指示MW為1208。流程 11 ： 錨定主鏈化合物 CHTCA ( Z ' ) 2 之製備 實例 20 ： 錨定化合物 S6 之製備 合成詳述於下方流程 12 中。以下化合物參考編號及合成步驟參照係關於流程 12 。 步驟A)在室溫下在無水甲醇(100 ml)中攪拌化合物(1) 48小時，過濾出混合物。將濾過物真空蒸發至乾燥，得到呈白色固體狀之化合物(41)，1.25 g (6.037毫莫耳，93%產率)。MS 324 (M+1)。 步驟B)在室溫下在乙醯氯(20 ml，281毫莫耳)中攪拌化合物(41) (1.95 g，6.037毫莫耳)持續3天，接著真空蒸發至乾燥，得到化合物(42) 3.06 g (6.01毫莫耳，99%產率)。MS 510.5 (M+1)。 步驟C)在二氯甲烷(DCM) (35ml)中攪拌殘餘物(42) (3.06 g，6.01毫莫耳)，接著添加KSAc (3.57 g，31.26毫莫耳)。在氬氣下在室溫下攪拌反應混合物40小時，用二氯甲烷(50 ml)稀釋，接著分配於二氯甲烷與水(50 ml)之間。用5% NaCl溶液(22 ml×2)洗滌有機層，且經無水Na2 SO4 乾燥隔夜，過濾出。將濾過物蒸發至乾燥，得到呈灰白色泡沫狀之(43) 2.93 g (5.34毫莫耳，88.8%產率)。MS 550 (M+l)。 步驟D)在DMF (2 ml)中攪拌化合物(43) (200 mg，0.364毫莫耳)及Boc-胺基己烷溴化物(107.4 mg，0.385毫莫耳)，向其中添加二乙胺(0.81 ml，7.83毫莫耳)。在氬氣下在25℃下將全部混合物攪拌2.5小時。將反應混合物分配於乙酸乙酯(EA) (80 ml)與飽和NaCl溶液之間。用飽和NaCl溶液(15 ml×3)、水(10 ml×3)洗滌有機層。將有機層經Na2 SO4 乾燥，過濾，將濾過物真空蒸發至乾燥。對殘餘物進行矽膠管柱層析(甲苯:丙酮= 2:1)。將含有化合物(44)之部分合併且真空蒸發至乾燥，得到呈白色泡沫狀之化合物(44) 98 mg (0.139毫莫耳，38%產率)。MS 706 (M+1)。 步驟E)將化合物(44) (95 mg，0.135毫莫耳)溶解於無水甲醇(1 ml)中。在氬氣下向此溶液中添加甲醇鈉(0.16 mg，6.94微莫耳)，在室溫下攪拌反應混合物2.5小時，接著用Dowex50×8 (H+ )樹脂調整至pH 6.0至6.5，過濾出。在真空下將濾過物蒸發至乾燥，得到呈白色泡沫狀之化合物(45) 71 mg (0.132毫莫耳，97.9%產率)。MS 538(M+1)。 步驟F)在氬氣下在室溫下在0.2N NaOH (2 ml，0.4毫莫耳)中攪拌化合物(45) (60 mg，0.109毫莫耳) 2.5小時。用Dowex50×8 (H+ )樹脂將溶液調整至pH 3至4且過濾出。將濾過物凍結乾燥，得到呈白色泡沫狀之化合物(46) 56 mg (0.107毫莫耳，98%產率)。MS 524(M+1)。 步驟G)將化合物(46) (50 mg，0.0956毫莫耳)溶解於三氟乙酸(TFA) (2 ml，25.96毫莫耳)及甲基苯基醚(苯甲醚) (0.2 ml，1.84毫莫耳)於二氯甲烷(2 ml)中之混合物中。在25℃下將全部混合物攪拌2.5小時，接著在35℃下將其真空蒸發持續2小時。在室溫下在己烷(10 ml×2)中洗滌殘餘物隔夜，傾析己烷。在室溫下在醚(10 ml×2)中攪拌殘餘物，接著移除醚。將殘餘物溶解於水(1 ml)中，且凍結乾燥，得到呈白色泡沫狀之S6 •TFA鹽之化合物(47)，51 mg (0.0949毫莫耳，99%產率)。MS 424(M+I) [S6 之MW = 423，S6 •TFA鹽之MW = 537]。流程 12 ： 錨定化合物 S6 之製備
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實例 21 ： 化合物 MD012 CHTCA ( Z ) 2 ( S6 ) 之製備 合成詳述於下方流程 13 中。 以下化合物參考編號及合成步驟參照係關於流程 13 。 向CHTCA(Z')2 (40) (4 mg，3.3微莫耳)於DMF (100 μl)中之溶液添加HATU (1.254 mg，3.3微莫耳)及DIPEA (0.6 μl，3.44微莫耳)。在室溫下攪拌混合物10分鐘，接著添加S6 •TFA鹽(47) (1.8 mg，3.35微莫耳)及DIPEA (1.20 μl，6.89微莫耳)於DMF (100 μl)中之溶液。在室溫下將反應混合物攪拌隔夜。用1 M HAc (5 μl)及水(2 ml)稀釋所得混合物，接著經由0.45 μm針筒過濾器將其過濾。對濾過物進行HPLC分離及純化。 管柱：Phenomenex Gemini AXIA 5 μm，C18 110A 50×21.2 mm；波長：210/280 nm；流動速率：8 ml/min；溶劑A = 含0.1%三氟乙酸之超純水；溶劑B = 100%乙腈；梯度：0至100%B，100分鐘，線性；溫度：30℃。 採集含有化合物(48)之部分並凍結乾燥以得到呈白色泡沫狀之化合物(48)CHTCA (Z')2 (S6 )2.4 mg。MS ESI +30v 1615指示MW為1614。 在室溫下在含有三乙胺(6.6 μl)之50%甲醇水性溶液(90 μl)中攪拌化合物(48) (2.4 mg，1.486微莫耳)5小時，接著真空蒸發至乾燥。將殘餘物再溶解於水(100 μl)中，凍結乾燥以得到呈白色泡沫狀之產物(49)CHTCA (Z)2 (S6 )，2 mg (1.303毫莫耳 87.7%產率)。MS ESI +30v 1535.7指示MW為1534.7。流程 13 ： 化合物 MD012 、 CHTCA ( Z ) 2 ( S6 ) 之製備
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實例22 ：錨定主鏈化合物CHTCA ( Z0 ' ) 2 之製備 合成詳述於以下流程 14 中。以下化合物參考編號係關於流程 14 。 錨定化合物(20)Z0 ' 之製備詳述於實例15處。根據詳述於實例20中之程序製備錨定主鏈化合物(50)CHTCA(Z0 ' )2 。獲得呈白色固體狀之錨定主鏈化合物(50)CHTCA(Z0 ' )2 。MS ESI +30v 1265指示MW為1264。流程 14 ： 錨定主鏈化合物 CHTCA ( Z0 ' ) 2 之製備
Figure 02_image185
實例 23 ： 酸性 / 陰離子基團 D - Asp ( D - Cya )- D - Asp ( D - Cya )- D - Asp ( D - Cya )- OH 之製備 合成詳述於下方流程 15 中。以下化合物參考編號(A)至(I)及合成步驟參照係關於流程 15 。 將Boc-D-半胱胺酸(Acm)甲酯[Boc-D-Cys(Acm)-OMe] (1.532 g，5毫莫耳)溶解於含有苯甲醚(1 ml)之三氟乙酸(TFA) (10 ml)中，且在室溫下攪拌30分鐘。接著在真空下蒸發反應混合物以移除TFA以得到油狀物質，在醚(100 ml×2)中濕磨該物質，接著再溶解於20%乙腈水性溶液(100 ml)中，且凍結乾燥72小時，得到化合物TFA•D-Cys(Acm)-OMe，1.60 g。HPLC/MS指示MW為206.35 (呈游離鹼)。 在室溫下用含HBTU (MW 379.25) (1.517 g，4毫莫耳)及DIPEA (MW 129.25) (0.517 g，4毫莫耳)之DMF (20 ml)活化Fmoc-D-天冬胺酸-α-酸-β-O-第三丁酯[Fmoc-D-Asp-Obut] (1.646 g，4毫莫耳)持續10分鐘，接著與TFA•D-Cys(Acm)-OMe (1.47 g，4.2毫莫耳)及DIPEA (0.542 g，4.2毫莫耳)於DMF (10 ml)中之溶液合併。在室溫下將全部反應混合物攪拌16小時。藉由HPLC監測反應。在真空下蒸發混合物以移除DMF。接著向殘餘物中添加水(5×70 ml)以洗去殘餘DMF及D-Cys(Acm)OMe以得到灰白色固體，接著將該固體真空乾燥，得到呈白色固體狀之化合物(A) Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-O-But。HPLC/MS指示MW為599.7。 在室溫下用含20%哌啶之乙腈(20 ml)處理化合物(A) (1.2 g，2毫莫耳)30分鐘，接著過濾。在真空下蒸發濾過物，得到化合物(B) D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut。HPLC/MS指示MW為377.4。 在室溫下用TFA (6 ml)處理化合物(A) (599.7 mg，1毫莫耳) 1小時。接著將其真空蒸發至乾燥。在醚(50 ml×3)中濕磨殘餘物，接著溶解於30%乙腈水溶液(100 ml)中，且凍結乾燥，得到呈白色固體狀之化合物(C) Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OH。HPLC/MS指示MW為542.7。 在室溫下用含HBTU (303.4 mg，0.8毫莫耳)及DIPEA (103.4 mg，0.8毫莫耳)之DMF (8 ml)活化化合物(C) Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm) -OMe]-OH (434 mg，0.8毫莫耳)10分鐘，接著向其中添加化合物(B) D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut (9332 mg，0.88毫莫耳)。在室溫下攪拌反應混合物16小時。在真空下蒸發DMF且藉由用水謹慎地洗滌白色固體物質來移除殘餘DMF。接著在真空下乾燥白色固體24小時，得到呈白色固體狀之化合物(D) Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm) -OMe]-OBut。HPLC/MS指示MW為902.19。在室溫下用TFA (16 ml)處理化合物(D) 1小時以移除第三丁酯。將TFA真空蒸發至乾燥。用水洗滌殘餘物以移除殘餘TFA，且將固體真空乾燥72小時，得到Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OH。HPLC/MS指示MW為846。 在室溫下用含HBTU (189.5 mg，0.5毫莫耳)及DIPEA (64.63 mg，0.5毫莫耳)之DMF (5 ml)活化Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OH-D- Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OH (423 mg，0.5毫莫耳) 10分鐘，接著向其中添加化合物(B) D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut (317 mg，0.84毫莫耳)。在室溫下攪拌全部混合物16小時。藉由HPLC檢查反應完成，且在真空下移除DMF。謹慎地用冷水洗滌所獲得之白色固體，接著在真空下乾燥48小時，得到化合物(E) Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut，MW 1206，藉由HPLC進一步純化該化合物。 此材料之分析HPLC指示純度為70%。將材料溶解於50%甲醇/水中且經由用於製備型HPLC之0.2 μm過濾器過濾。製備型 HPLC 管柱：Waters Xterra C18管柱 5 μm 19×50 mm，以40 mg之批次；波長：220/280 nm；流動速率：8 ml/min；溶劑A = 0.1%三氟乙酸；溶劑B = 100%乙腈；梯度：10-100% B，100分鐘；溫度：30℃。 接著在室溫下用TFA (10 ml)處理化合物(E) Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut 1小時且真空蒸發至乾燥。將殘餘物溶解於40%乙腈水溶液(100 ml)中，且凍結乾燥，得到呈白色固體狀之化合物(F) Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OH。HPLC/MS指示MW為1150.27。 在室溫下在攪拌下用含20%哌啶之乙腈(10 ml)處理化合物(F) Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D- Cys(Acm)-OMe]-OH (200 mg，0.1738毫莫耳) 30分鐘，且隨後過濾。將濾過物真空蒸發。在室溫下在含有三乙胺(500 μl)之50%水/甲醇(20 ml)中攪拌殘餘物6小時，藉由HPLC監測以指示反應完成。將此混合物真空蒸發至乾燥，得到化合物(G) D-Asp[D-Cys(Acm)-OH]-D-Asp[D-Cys(Acm) -OH]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OH]-OH。HPLC/MS指示MW為885.9。 分析HPLC指示50%純度。 藉由製備型HPLC進一步純化化合物(G)。 管柱：Phenomenex Gemini Axia 110A 5 μm 50×21.2 mm C18 HPLC管柱；波長：210/280 nm；流動速率：8 ml/min；溶劑A = 0.1% TFA；溶劑B = 100%乙腈；梯度：0-100% B，100分鐘；溫度：30℃。 將樣本(100 mg)溶解於10%甲醇水溶液中，經超聲處理，且經由0.2 μm過濾器過濾。以梯度游程將20 mg/批次泵取至管柱中。使用Phenomenex Gemini C18 5 μm管柱藉由分析RF-HPLC監測部分。流動速率0.7 ml/min；波長210/280 nm；梯度0-50% B 15分鐘；溶劑A = 0.1% TFA；溶劑B = 100%乙腈。 將具有大於90%純度之校正MS之部分合併且凍結乾燥，得到經純化化合物(G)。 將化合物(G) D-Asp[D-Cys(Acm)-OH]-D-Asp-[D-Cys(Acm) -OH]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OH]-OH (21.8 mg，0.0246毫莫耳)溶解於含有苯甲醚(200 μl)之TFA (10 ml)中，接著添加三氟甲烷磺酸銀(504 mg，1.96毫莫耳)。接著在室溫下攪拌反應混合物1小時。接著將其真空蒸發至乾燥。在醚(40 ml×2)中濕磨殘餘物，傾析出醚洗液。在25℃下在含有二硫蘇糖醇(403 mg，2.62毫莫耳)之1M乙酸(20 ml)中攪拌殘餘物3小時。在50 ml falcon試管中以4000 rpm將懸浮液離心10分鐘。謹慎地收集上清液，接著藉由HPLC純化且凍結乾燥，得到化合物(H) D-Asp(D-Cys-SH，-OH)-D-Asp(D-Cys-SH,-OH)-D-Asp(D-Cys-SH,-OH)-OH，HPLC/MS指示MW為672.3。 在室溫下將95%甲酸(7.36 ml)、30% H2 O2 (0.8 ml)及H2 O (0.368 ml)之混合物保持30分鐘，接著在-5℃冰浴下攪拌，向其中添加化合物(H) (8 mg，0.0119毫莫耳)且攪拌1小時，接著在真空下攪拌10分鐘。接著用水將剩餘的溶液稀釋至200 ml且凍結乾燥，得到呈白色固體狀之化合物(I) 9.5 mg，D-Asp[D-Cya-SO3 H,-OH]-D-Asp[D-Cya-SO3 H,-OH]-D-Asp[D-Cya-SO3 H, -OH]-OH，HPLC/MS指示MW為816.78。 藉由在以下條件下脫鹽來純化此化合物。 管柱：Phenomenex Gemini Axia 110A 5 μm 50×21.2 mm C18 HPLC管柱；波長：210/280 nm；流動速率：8 ml/min；溶劑A = 0.1% TFA；溶劑B = 100%乙腈；梯度：0-100% B，100分鐘；溫度：30℃。化合物(I)接近空隙溶離。 接著將此材料凍結乾燥，產生作為純化合物(I)之白色粉末。如下用三乙胺(TEA)中和化合物(I)以形成TEA鹽(51)：
Figure 105137966-A0305-12-0135-001
* HBTU：O-1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基-鈾六氟磷酸酯MW 379.24 TFA：三氟乙酸MW 114.02 DIPEA：二異丙基乙胺MW 129.25 TEA：三乙胺MW 101.19 Acm：作為硫基保護基之S-乙醯胺基甲基 OBut：第三丁酯流程 15 ： 酸性 / 陰離子基團 D - Asp ( D - Cyst )- D - Asp ( D - Cyst )- D - Asp ( D - Cyst )- OH 之製備
Figure 105137966-A0305-12-0136-001
Figure 02_image191
實例 24 ： 化合物 MD348 CHTCA ( Z0 ) 2 -[ D - Asp ( D - Cyst )- D - Asp ( D - Cyst )- D - Asp ( D - Cyst )]- OH 之製備 合成詳述於下方流程 16 中。以下化合物參考編號係關於流程 16 。 在室溫下在DMF (5 ml)中將來自實例22 (10.744 mg，8.5微莫耳)之化合物(50) CHTCA(Z0 ' )2 與HATU (3.23 mg，8.5微莫耳)及DIPEA (1.496 μl，8.56微莫耳)一起攪拌10分鐘，接著在DMF (5ml )中將其與來自含實例23 (13.2 mg，8.67微莫耳)之化合物(51) D-Asp(D-Cya-SO3 B,-OB)-D-Asp- (D-Cya-SO3 B,-OB)-D-Asp(D-Cya-SO3 B,-OB)-OB合併。在室溫下攪拌全部混合物16小時。藉由分析HPLC/MS在滯留時間峰1，12.903 min處監測所得混合物。44% MS ESI +ve，+20v 1032.3 2+離子，ESI-ve， ‑40v 1030.7 2+ion指示MW為2062，不含鹼之化合物(52)，亦即CHTCA(Z0 )2 [D-Asp(D-Cya-SO3 H,-OH)-D-Asp(D-Cya-SO3 H,-OH)-D-Asp-(D-Cyst-SO3 H,-OH)]-OH。分析 HPLC ： 管柱：Phenomenex Kinetex EVO 5 μm C18 100A 150×4.6 mm；波長：210/280 nm；流動速率：0.7 ml/min；溶劑A = 0.1% TFA；溶劑B = 100%乙腈；梯度：0-50% B，15分鐘，線性；溫度：30℃。 用檸檬酸酸化所得混合物，用水稀釋至20 ml，經由0.2 μm過濾器過濾，接著對其進行製備型HPLC來分離及純化。製備型 HPLC 管柱：Phenomenex Gemini AXIA 5 μm C18 110A 50×21.2 mm；波長：210/280 nm；流動速率：8 ml/min；溶劑A = 0.1 TFA；溶劑B = 100%乙腈；梯度：0-100% B，100分鐘，線性；溫度：30℃。 滯留時間為31.087 min之主峰為產物(52)。收集含有產物之部分且如下藉由進一步HPLC再純化。 管柱：Phenomenex Kinetex x B 5 μm C18 100A 50×21.2 mm；波長：210/280 nm；流動速率：8 ml/min；溶劑A = 0.1% TFA；溶劑B = 100%乙腈；梯度：5%至100% B，80 min，線性；溫度30℃。 將19.597 min之滯留時間處之經純化化合物(52)與21.714 min之滯留時間處之起始物質完全分離。 將化合物(52) (3.5 mg，1.697微莫耳)溶解於50%甲醇/含有三乙胺(TEA) (18 μl，129微莫耳)之水(5 ml)中。將其在室溫下攪拌3小時。HPLC指示反應未完成，因此，添加額外11 μl之TEA。將混合物攪拌另外60分鐘，接著HPLC指示反應完成。接著用1M乙酸將反應溶液中和至pH 6。接著用水將溶液稀釋至20 ml。對混合物進行HPLC。分析 HPLC 管柱：Phenomenex Kinetex Evo 5 μm C18 100A 150×3 mm；波長：210/280 nm 流動速率：0.7 ml/min；溶劑A = 20 mM NaHPO4 pH 7.0緩衝劑；溶劑B = 10 mM NaHPO4 pH 7.0緩衝劑+ 50%乙腈；梯度：0至100% B，30分鐘，線性；溫度：30℃。製備型 HPLC 管柱：Phenomenex Kinetex XB 5 μm C18 100A 50×21.2 mm；波長：210/280 nm；流動速率：8 ml/min；溶劑A = 0.1% TFA；溶劑B = 100%乙腈；梯度：0-100% B，80 min，線性；溫度：30℃。 在16.431 min之滯留時間處溶離產物(53)。 將純部分合併且凍結乾燥，接著使用HCl交換以移除殘餘TFA。冷凍乾燥得到呈白色固體狀之產物(53) CHTCA(Z0 )2 [D-Asp(D-Cya)-D- Asp(D-Cya)-D-Asp(D-Cya]-OH，純度＞99%。MS ESI cone -20v, 990.5 2+離子指示MW為1982。流程 16 ： 化合物 MD348 CHTCA ( Z0 ) 2 -[ D - Asp ( D - Cyst )- D - Asp ( D - Cyst ) - D - Asp ( D - Cyst )]- OH 之製備
Figure 02_image193
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圖 1 ： 在感染MDCK細胞之前用測試化合物預處理病毒(A/Sydney/250/99或A/Sydney/5/97)之不同條件之概述。圖 2 ： 在感染MDCK細胞之前用測試化合物對病毒(A/Sydney/250/99)進行之預處理：A) MD348，B) MD345，及C)紮那米韋(對照)。圖 3 ： 在感染MDCK細胞之前用測試化合物對病毒(A/Sydney/5/97)進行之預處理：A) MD348，B) MD345，及C)紮那米韋(對照)。圖 4 ： 在感染MDCK細胞之前用MD345 (測試化合物)及紮那米韋(對照)在變化的時間段內及變化的條件下對病毒(A/Sydney/250/99)進行之預處理。圖 5 ： MD314-1與MD021-7對A/Sydney/5/97 (H3N2)之抗病毒活性之比較。圖 6 ：MD314-1與MD021-7對A/Mississippi/03/01 (H1N1)野生型之抗病毒活性之比較。圖 7 ： MD021-7與MD051-3對A/Mississippi/03/01 (H1N1)野生型之抗病毒活性之比較。圖 8 ：MD021-7與MD051-3對A/Mississippi/03/01 (H1N1) H274Y (耐奧司他韋)之抗病毒活性之比較。圖 9 ： MD314-1與MD021-7對A/Mississippi/03/01 (H1N1) H274Y (耐奧司他韋)之抗病毒活性之比較。圖 10 ： 用於評定小鼠中之肺及鼻甲中之病毒清除率的治療、感染及器官採集之時序之概述。圖 11 ： 用於評定關於MD021、紮那米韋及PBS之病毒清除率之小鼠中之比較性肺病毒滴定度。圖 12 ：用於評定關於MD021、紮那米韋及PBS在感染後第1天、第3天、第5天及第7天之病毒清除率的小鼠中之比較性肺病毒滴定度。圖 13 ：經表示為PBS對照組之平均值之百分比的比較性病毒滴定度。圖 14 ： 用於評定關於MD021、紮那米韋及PBS之病毒清除率之小鼠中之比較性體重減輕。圖 15 ： A/California/7/09 (pan H1N1)在活體外之中和。
Figure 105137966-A0304-11-0002-1

Claims (26)

  1. 一種具有式(I)之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體，
    Figure 105137966-A0305-02-0150-5
     其中：A在每次出現時為錨定基團，選自由以下所組成之群：紮那米韋(zanamivir)、蘭那米韋(laninamivir)、奧司他韋(oseltamivir)、帕拉米韋(peramivir)、2,3-二氟唾液酸及特異性地結合神經胺糖酸酶之抗體結合結構域；B為多價主鏈基團，選自由以下所組成之群：視情況經取代之丙烷-1,2,3-三羧酸酯、視情況經取代之丙-1-烯-1,2,3-三羧酸酯、視情況經取代之環丙烷-1,2,3-三羧酸酯、視情況經取代之環己烷-1,3,5-三羧酸酯、視情況經取代之苯-1,3,5-三羧酸酯、視情況經取代之甲烷四羧酸酯、視情況經取代之1,2,3,4-丁烷四羧酸酯、視情況經取代之伸乙基-1,1,2,2-四羧酸酯、視情況經取代之環己烷-1,2,4,5-四羧酸酯及視情況經取代之苯-1,2,4,5-四羧酸酯；C在每次出現時為式VIII之陰離子基團：
    Figure 105137966-A0305-02-0151-6
     其中R4在每次出現時獨立地選自由以下組成之群：-COOH、-SO3H、-NHCH2SO3H、-CONH-Cya、-CONH-Asp、-CONH-Asp(-NHCH2SO3H)w及-CONH-Asp(-NHCH2PO3H)w，其中w為整數1或2；R5係選自由-OH及-NHCH2SO3H組成之群；u為0至3之整數；t為0至3之整數；r為0至6之整數；及v為1至12之整數；L1及L2在每次出現時為二價連接基團；n為2或3；及p為1或2。
  2. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體，其中該錨定基團係選自由以下組成之群：抗體(Ab)或抗體之抗原結合片段、單鏈抗體片段(scFV)及單結構域抗體(dAb)。
  3. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體，其中L1及L2在每次出現時獨立地選自由以下組成之群：鍵、視情況經取代之C1-C12伸烷基、-C(O)-NR-、-O-C(O)O-NR-、-C=N-O-、-C=N-NR-、-SO2-NR-、二硫鍵、-C(O)-NR-(CH2)X-NR-、-(CH2)X-NR-、-(CH2)X-(O-(CH2)y-)z-、視情況經取代之-C=N-O-、視情況經取代之-C=N-NR-伸烷基、視情況經取代之伸烷基磺醯胺、視情況經取代之伸烷基二硫鍵，其中R獨立地為H或C1-C6烷基，且其中x、y及z各自為獨立地選自0、1、2、3及4之整數。
  4. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體，其中B係選自由以下組成之群：視情況經取代之丙烷-1,2,3-三羧酸酯、視情況經取代之環己烷-1,3,5-三羧酸酯及視情況經取代之苯-1,2,4,5-四羧酸酯。
  5. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體，其係選自：
    Figure 105137966-A0305-02-0152-7
    Figure 105137966-A0305-02-0153-8
    Figure 105137966-A0305-02-0154-9
    Figure 105137966-A0305-02-0155-10
    Figure 105137966-A0305-02-0156-11
    Figure 105137966-A0305-02-0157-12
    Figure 105137966-A0305-02-0158-13
    Figure 105137966-A0305-02-0159-14
    Figure 105137966-A0305-02-0160-15
    Figure 105137966-A0305-02-0161-16
    Figure 105137966-A0305-02-0162-17
    Figure 105137966-A0305-02-0163-18
    Figure 105137966-A0305-02-0164-19
     其中 Z0為
    Figure 105137966-A0305-02-0164-20
     Z為
    Figure 105137966-A0305-02-0165-21
    ，及Zn為
    Figure 105137966-A0305-02-0165-22
     或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體。
  6. 如請求項1、3及4中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體，其中A為紮那米韋。
  7. 如請求項1至4中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體，其中B為苯-1,2,4,5-四羧酸酯。
  8. 如請求項1至4中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體，其中R4在每次出現時為-COOH，且R5為-OH。
  9. 如請求項1至4中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體，其中L2在每次出現時為鍵。
  10. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體，其中[A-L1]在每次出現時獨立地由具有下式之式Zx之基團表示：
    Figure 105137966-A0305-02-0166-23
     其中x為0-12之整數。
  11. 如請求項10之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體，其中Zx為式Zn之基團：
    Figure 105137966-A0305-02-0166-24
  12. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體，其具有結構：
    Figure 105137966-A0305-02-0167-25
     其中Zn為
    Figure 105137966-A0305-02-0167-26
     或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體。
  13. 如請求項12之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體，其中該化合物為烷基酯。
  14. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至13中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體。
  15. 如請求項14之醫藥組合物，其中該化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體為如請求項5之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體。
  16. 如請求項14之醫藥組合物，其中該組合物用於吸入、經口投與、鼻內投與、腹膜內投與、靜脈內投與或肌肉內投與。
  17. 如請求項之14之醫藥組合物，其進一步包含額外活性劑。
  18. 一種如請求項1至13中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體之用途，其係用於製造用於治療或預防流感病毒感染之藥劑。
  19. 如請求項18之用途，其中該流感病毒感染為A型流感、B型流感、禽流感，或耐藥性流感病毒株。
  20. 如請求項18或19之用途，其中該感染為呼吸道感染或全身性感染。
  21. 如請求項18之用途，其中該藥劑經調配以用於吸入、經口投與、鼻內投與、腹膜內投與、靜脈內投與或肌肉內投與。
  22. 如請求項18之用途，其中該化合物係選自：
    Figure 105137966-A0305-02-0169-27
     其中Zn為
    Figure 105137966-A0305-02-0169-28
     或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體。
  23. 如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立 體異構體，其係用於治療或預防流感病毒感染。
  24. 如請求項23之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體，其中該流感病毒感染為A型流感、B型流感、禽流感，或耐藥性流感病毒株。
  25. 如請求項23之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體，其中該感染為呼吸道感染或全身性感染。
  26. 如請求項23之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體，其中該化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯或立體異構體係用於藉由吸入、經口投與、鼻內投與、腹膜內投與、靜脈內投與或肌肉內投與來進行投與。
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