TWI754652B - 核酸擴增方法中或相關之改良 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示一種進行非等溫核酸擴增反應之方法，該方法包含以下步驟：(a)將標靶序列與一或多種互補單鏈引子在准許其中引子雜交至標靶之雜交事件之條件下混合，該雜交事件直接或間接引起雙螺旋結構之形成，該雙螺旋結構包含設置於雙螺旋體之相對端處或附近之兩個切口位點；且藉由以下進行擴增方法；(b)在該雙螺旋體之鏈中之該等切口位點的每一者處產生切口；(c)使用聚合酶來延伸切口鏈以形成新合成之核酸，該利用聚合酶之延伸再產生切口位點；(d)視需要重複步驟(b)及步驟(c)以產生新合成之核酸之多個複本；其特徵在於進行該方法之溫度為非等溫，且在步驟(b)-步驟(d)之擴增方法期間溫度降低至少2℃。
Description
本發明係關於一種擴增核酸之方法及用於進行該方法之裝置。
聚合酶鏈反應(PCR)為用於DNA擴增之使用最廣泛之試管內方法。儘管極其有效，但該技術需要使用熱循環裝置以使反應混合物經受週期性溫度變化，從而實現擴增。因此，PCR並非尤其適合於在實驗室環境外部，例如在定點照護(「PoC」)診斷裝置之環境下使用。
為部分地克服此不足之處，設計多種避免需要熱循環之不同等溫擴增技術。此類技術包括例如：信號介導之RNA擴增技術(「SMART」；WO 99/037805)；基於核酸序列之擴增(「NASBA」Compton 1991 Nature 350,91-92)；滾環擴增(「RCA」例如參見Lizardi等人，1998 Nature Genetics 19,225-232)；環介導之擴增(「LAMP」參見Notomi等人，2000 Nucl.Acids Res.28,(12)e63)；重組酶聚合酶擴增(「RPA」參見Piepenberg等人，2006 PLoS Biology 4(7)e204)；鏈置換擴增(「SDA」)；解螺旋酶依賴性擴增(「HDA」Vincent等人，2004 EMBO Rep.5,795-800)；轉錄介導之擴增(「TMA」)；單引子等溫擴增(「SPIA」參見Kurn等人，2005 Clinical Chemistry 51,1973-81)；自動維
持序列擴增(「3SR」)；及切口酶擴增反應(「NEAR」)。
SDA為一種涉及使用一對短「緩衝」引子之技術(由Walker等人，1992 Nucl.Acids Res.20,1691-1696所揭示)，該對引子在包含標靶互補部分之一對引子的上游及標靶互補部分之5'(核酸內切酶之識別及切割位點)。「緩衝」引子藉由產生用於引子擴增之互補單鏈標靶來幫助起始SDA反應。引子雜交至各別的互補單鏈標靶分子。使用包括DNA聚合酶及至少一個經修飾之三磷酸核苷酸之反應混合物，使用引子作為模板來延伸標靶鏈之3'端(且同樣，使用標靶作為模板來延伸引子之3'端。)
標靶鏈之延伸產生核酸內切酶之雙鏈識別位點。然而，因為使用經修飾之三磷酸酯延伸標靶，所以核酸內切酶不使兩個鏈裂解，而是在引子中生成單鏈切口。在切口處之3'端隨後藉由DNA聚合酶(典型地為缺乏外切核酸酶活性之DNA聚合酶I之克列諾(Klenow)片段)延伸。隨著切口引子延伸，其取代最初產生之延伸產物。因為取代產物基本上複製相反引子之標靶序列，所以其隨後自由雜交至相反引子。以此方式，實現標靶序列之兩個鏈之指數擴增。
SDA方法之擴增階段基本上等溫-典型地在37℃下進行，此溫度對於核酸內切酶及聚合酶而言為最佳溫度。然而，在到達擴增階段以前，需要將雙鏈標靶完全解離為其構成單鏈，以允許引子對雜交至其互補標靶鏈。
此解離或「熔融」通常藉由將雙鏈標靶加熱至高溫來實現，通常約90℃，以使得標靶之兩個鏈之間的氫鍵斷裂。隨後使反應混合物冷卻以允許添加擴增反應所需之酶。由於使用高溫產生單鏈標靶，所以SDA
技術並非理想地適合於PoC環境。
US 6,191,267揭示N.BstNBI切口酶之選殖及表現以及其替代限制性核酸內切酶及經修飾之三磷酸酯在SDA中之用途。
另一類似於SDA之擴增技術為切口酶擴增反應(或「NEAR」)。
在『NEAR』(例如，如US 2009/0017453及EP 2,181,196中所揭示)中，正向及反向引子(在US 2009/0017453及EP 2,181,196中稱為「模板」)雜交至雙鏈標靶之各別的鏈且延伸。正向及反向引子(過量存在)之進一步複本雜交至相反引子之延伸產物且自身延伸，從而產生「擴增雙螺旋體」。由此形成之各擴增雙螺旋體包含朝向各鏈之5'端的切口位點，該切口位點由切口酶切刻，從而允許合成進一步延伸產物。先前合成之延伸產物可同時與互補引子之進一步複本雜交，從而使引子延伸且藉此產生「擴增雙螺旋體」之進一步複本。以此方式，可實現指數擴增。
NEAR與SDA之不同之處尤其在於不需要「緩衝」引子及初始熱解離步驟。儘管標靶仍實質上為雙鏈，但仍發生觸發擴增方法所需之初始引子/標靶雜交事件：認為初始引子/標靶雜交利用標靶鏈之局部解離-稱為「呼吸」之現象(參見Alexandrov等人，2012 Nucl.Acids Res.及由Von Hippel等人，2013 Biopolymers 99(12),923-954所回顧)。呼吸為DNA鏈之間的鹼基配對之局部及暫時鬆動。初始引子/標靶異雙螺旋之熔融溫度(Tm)典型地遠低於反應溫度，因此引子傾向於解離，但對於聚合酶而言，短暫雜交持續足夠長時間而使引子延伸，此提高異雙螺旋之Tm且使其穩定。
NEAR中之擴增階段在恆溫下等溫進行。實際上，習知在通
常在54℃至56℃範圍內之相同恆溫下進行初始標靶/引子雜交與後續各輪擴增。
避免對熱循環之需要意謂等溫技術在PoC環境中可能比PCR更有用。此外，即使以極低複本數之標靶分子(例如少至10個雙鏈標靶分子)為起始物質，亦可實現大量擴增產物之合成。
WO 2011/030145(Enigma Diagnostics有限公司)揭示一種在溫度振盪條件下進行之「等溫」核酸擴增反應，其中反應最初在預定溫度下進行，允許該溫度自預定溫度向上或向下偏離，且隨後使該溫度在擴增反應期間至少一次返回至預定溫度。更典型地，允許該溫度自預定溫度上下少量(約5℃)「擺動」。
本發明旨在尤其提供一種改良之核酸擴增技術，該技術相比於現有技術具有一或多個優勢，包括例如反應時間減少，及/或產量增加，及/或非特異性擴增產物減少。
在第一態樣中，本發明提供一種進行非等溫核酸擴增反應之方法，該方法包含以下步驟：(a)將標靶序列與一或多種互補單鏈引子在准許其中引子雜交至標靶之雜交事件之條件下混合，該雜交事件直接或間接引起雙螺旋結構之形成，該雙螺旋結構包含設置於雙螺旋體之相對端處或附近之兩個切口位點；且藉由以下進行擴增方法；(b)在該雙螺旋體之鏈中之該等切口位點的每一者處產生切口；(c)使用聚合酶來延伸切口鏈以形成新合成之核酸，該利用聚合酶
之延伸再產生該等切口位點；(d)視需要重複步驟(b)及步驟(c)以產生新合成之核酸之多個複本；其特徵在於進行該方法之溫度為非等溫，且在步驟(b)-步驟(d)之擴增方法期間溫度降低至少2℃，較佳至少5℃。
在第二態樣中，本發明提供用於進行本發明之第一態樣之方法的設備，該設備包含溫度調節構件及可程式化控制構件，在用於進行第一態樣之方法之反應混合物的擴增方法期間，可程式化控制構件經程式化以操作溫度調節構件使溫度降低至少2℃，較佳至少5℃。
本發明之方法之擴增方法可應用於包括SDA及NEAR之一般已知及習知的擴增技術。
因此，舉例而言，擴增方法可基於鏈置換擴增中所採用之擴增方法，或基於NEAR或實際上依賴於產生單鏈切口及自切口鏈之3'端後續延伸之任何其他核酸擴增方法中所用的擴增方法。因此，與SDA或NEAR之擴增階段相關之先前技術的教示內容大體將同等適用於本發明之方法之擴增方法(與擴增期間維持恆溫相關之先前技術之教示內容除外)。
較佳地，步驟(a)包含將含有雙鏈標靶之樣品與兩個單鏈引子混合，該等引子中之一者與標靶之第一鏈互補，且該等引子中之另一者與標靶之第二鏈互補，使得兩個引子雜交至標靶且該等引子之自由3'端面向彼此。
該兩個引子可便利地描述為『正向』及『反向』引子。
合乎需要地，正向及反向引子二者均將包含切口酶識別位點
之序列。典型地，由切口酶產生之切口將僅在外部且典型地在切口酶識別位點之3'。
在一較佳具體實例中，正向引子將在其3'端處或附近包含與標靶序列反義鏈之3'端互補且可與其雜交之部分，而反向引子在其3'端處或附近包含與標靶序列有義鏈之3'端互補且可與其雜交之反向引子之部分。
以此方式，在標靶序列之相反端處引入切口酶識別位點，且標靶序列(連同切口位點下游之引子之介入序列)之擴增藉由以下實現：進行正向及反向引子之聚合酶延伸之多個循環以形成雙鏈切口位點，及用切口酶切刻切口位點，使得藉由聚合酶等進一步延伸切口引子，基本上如例如US 2009/0017453中所揭示，其內容以引用的方式併入本文中。
本發明尤其係關於一種用於所選擇之標靶核酸之擴增的方法。
標靶可為單鏈、雙鏈或包含二者之混合物。標靶可包含RNA、DNA或二者之混合物。詳言之，標靶可併有一或多個經修飾之三磷酸核苷酸(亦即通常在天然產生之核酸中未發現之三磷酸核苷酸)，不過此並非必要且實際上並非較佳。
標靶可選自以下非窮盡性清單：基因組核酸(該術語涵蓋任何動物、植物、真菌、細菌或病毒之基因組核酸)、質體DNA、粒線體DNA、cDNA、mRNA、rRNA、tRNA或合成寡核苷酸或其他核酸分子。
詳言之，方法可另外包含初始逆轉錄步驟。舉例而言，RNA(例如病毒基因組RNA，或細胞mRNA，或來自一些其他來源之RNA)可
用於根據熟習此項技術者熟知之方法使用逆轉錄酶合成DNA或cDNA。DNA隨後可在本發明之方法中用作標靶序列。原始RNA將典型地藉由逆轉錄酶之核糖核酸酶活性降解，但必要時可在完成逆轉錄之後添加其他RNase H。RNA分子常常以大於對應(例如基因組)DNA序列之複本數存在於樣品中，因此，宜自RNA分子製備DNA轉錄本以有效增加DNA序列之複本數。
「標靶序列」為標靶核酸中之鹼基序列，且可指代雙鏈標靶之有義及/或反義鏈，且除非上下文另外指示，否則亦涵蓋與在初始標靶核酸之擴增複本、延伸產物或擴增產物中再生或複製之鹼基序列相同的鹼基序列。
標靶序列可存在於任何種類之樣品中，例如生物或環境樣品(水、空氣等)。生物樣品可為例如食物樣品或臨床樣品。臨床樣品可包括以下：尿、唾液、血液、血清、血漿、黏液、痰、淚液或糞便。
樣品在與引子接觸之前可經受或可不經受處理。此類處理可包括以下各者中之一或多者：過濾、濃縮、部分純化、音波處理、溶解及類似處理。此類方法已為熟習此項技術者所熟知。
本發明之方法涉及使用切口位點及用於在切口位點處產生切口之構件。「切口」為完整或至少部分雙鏈核酸分子之僅一個鏈之磷酸二酯主鏈的裂解。切口位點為其中產生切口之分子中之位置。
在較佳具體實例中，「切口識別位點」將存在於切口位點處、切口位點內或切口位點附近。(在此上下文中「附近」意謂切口識別位點之最近鹼基在切口位點之10個鹼基內，較佳在切口位點之5個鹼基內)。
切口識別位點可包含限制性核酸內切酶之識別位點之至少
一個鏈，且切口位點可包含當作為雙鏈分子存在時經限制性核酸內切酶切割之核酸鹼基序列之至少一個鏈。典型地，限制性核酸內切酶將切割雙鏈核酸分子之兩個鏈。在本發明中，可藉由在切口位點處或附近合併一或多個修飾鹼基來避免雙鏈斷裂，該等修飾鹼基使核酸之鏈不易由限制性核酸內切酶裂解。以此方式，通常切割雙鏈核酸分子之兩個鏈之限制性核酸內切酶可用於將單鏈切口引入雙鏈分子。修飾鹼基及適合於實現此之類似物為熟習此項技術者所熟知且包括例如所有α磷酸修飾之三磷酸核苷及α硼烷修飾之三磷酸核苷；具體而言，2'-去氧腺苷5'-O-(硫代三磷酸酯)、5-甲基去氧胞嘧啶核苷5'-三磷酸酯、2'-去氧尿苷5'三磷酸酯、7-去氮-2'去氧鳥苷5'-三磷酸酯、2'去氧鳥苷-5'-O-(1-硼烷三磷酸酯)等等。包括修飾鹼基之三磷酸酯可存在於用於進行擴增方法之反應混合物內，使得在後續數輪擴增期間在相關位置處併入修飾鹼基以防止形成可由核酸內切酶裂解之位點。
然而，在較佳具體實例中，切口在切口位點處藉助於切口酶製得。此等為在正常環境下僅使雙鏈核酸分子中之單鏈斷裂之酶。切口酶具有切口識別位點且切口位點可在切口識別位點內或可為識別位點之5'或3'。許多切口酶為熟習此項技術者已知且為可購得。切口酶之實例之非窮盡性清單包括：Nb.Bsml、Nb.Bts、Nt.Alwl、Nt.BbvC、Nt.BstNBI及Nt.Bpu101。後一酶可購自ThermoFisher Scientific；其他酶購自例如New England Biolabs。
在較佳具體實例中，切口酶在方法開始時(例如在樣品與引子及DNA聚合酶接觸之1分鐘內)引入反應混合物中。然而，在一些情況下，需要在較長延遲之後(例如使溫度降低至更接近於切口酶之最佳溫度)將切口酶引入反應混合物中。
本發明之方法涉及使用DNA聚合酶。較佳地，本發明之方法包含使用至少一種嗜熱性DNA聚合酶(亦即具有超過60℃之最佳溫度)。較佳地，DNA聚合酶為鏈置換聚合酶。較佳地，DNA聚合酶不具有外切核酸酶活性。較佳地，DNA聚合酶為不具有外切核酸酶活性之鏈置換聚合酶且亦較佳為嗜熱的。
較佳DNA聚合酶之實例包括Bst聚合酶、Vent® DNA聚合酶、9ON聚合酶、Manta 1.0聚合酶(Qiagen)、BstX聚合酶(Qiagen)及Bsm DNA聚合酶之大片段(ThermoFisher Scientific)。
在一些具體實例中，本發明之方法宜包含預擴增或富集步驟。此為其中標靶序列與正向及反向引子及DNA聚合酶接觸但不與切口酶接觸之步驟。此步驟典型地持續約2-5分鐘且產生約1,000倍之標靶序列之初始(線性)擴增，其可尤其適用於標靶序列以低複本數存在於樣品中時。
在一些具體實例中，在低於50℃之溫度下使用諸如Exo-Minus克列諾DNA聚合酶之嗜溫性DNA聚合酶或來自Cenarchaeum symbiosum之Exo-Minus嗜冷DNA聚合酶進行預擴增或富集步驟，且混合物隨後加熱至超過50℃以使不耐熱性DNA聚合酶變性或不活化，且接著添加嗜熱性DNA聚合酶以進行下游擴增。
典型地，本發明之方法包含偵測步驟，其中擴增方法之一或多個直接或間接產物經偵測且視情況定量，此指示樣品中標靶之存在及/或量。存在許多已知之合適偵測及/或定量技術，包括：凝膠電泳、質譜分析、側流捕獲、標記核苷酸之合併、嵌入染料、分子信標及其他探針，尤其具體而言雜交寡核苷酸或其他含有核酸之分子。
在偵測步驟中所偵測之產物(product或products)在本文中可稱作「偵測標靶」。關於偵測步驟之『標靶』不一定與擴增方法中之『標靶』相同且實際上兩個分子通常將至少在一定程度上不同，不過其可具有某些共同序列(典型地10-20個鹼基)，其中偵測標靶包含核酸分子或寡核苷酸。
核酸偵測方法可採用使用允許特定偵測雙股DNA之染料。在結合至DNA或RNA時呈現增強之螢光的嵌入染料為熟知的。染料可為例如DNA或RNA嵌入螢光團且可尤其包括以下：吖啶橙、溴化乙錠、Pico Green、碘化丙錠、SYBR I、SYBR II、SYBR Gold、TOTO-3(噻唑橙二聚體)Oli Green及YOYO(噁唑黃二聚體)。
核酸偵測方法亦可採用使用直接併入偵測標靶序列或含有與相關偵測標靶互補或實質上互補之序列之探針中的標記核苷酸。合適標記可為放射性及/或螢光性的且可以此項技術中習知之任何方式解析。可偵測但另外充當天然核苷酸之標記核苷酸(例如由天然酶識別且可充當其受質)區別於不充當天然核苷酸之經修飾之核苷酸。
可使用分子信標偵測及監測標靶核酸及核酸序列之存在及/或量。分子信標為在一個末端處含有螢光團且在相反末端處含有淬滅染料(淬滅劑)之髮夾形寡核苷酸。髮夾環含有與偵測標靶序列互補或實質上互補之探針序列且莖藉由位於探針序列任一側之自互補或實質上自互補序列之黏接形成。
螢光團及淬滅劑結合在信標之相對端處。在防止分子信標雜交至其標靶之條件下或當分子信標在溶液中游離時，螢光團與淬滅劑彼此
接近，防止發出螢光。當分子信標遭遇偵測標靶分子時，發生雜交；環結構轉換為穩定的更加剛性之構形，從而致使螢光團與淬滅劑分離，允許發出螢光(Tyagi等人.1996,Nature Biotechnology 14：303-308)。因為探針之特異性，所以螢光之產生由於預期擴增產物/偵測標靶之存在而實質上為唯一的。
分子信標具有高度特異性且可藉由單鹼基區分核酸序列不同(例如單核苷酸多態性)。分子信標可用不同著色螢光團及不同偵測標靶互補序列合成，使相同反應中之若干不同偵測標靶能夠同時進行偵測及/或定量，從而允許單一PoC分析「多工」偵測複數個不同病原體或生物化學標記物。對於定量擴增方法，分子信標可在擴增後特異性結合於擴增偵測標靶，且因為未雜交之分子信標不發出螢光，所以對於定量測定擴增產物之量而言無需分離探針-標靶雜交體。所產生之信號與擴增產物之量成比例。此可實時進行。如同其他實時格式，必須針對各引子/探針組優化特定反應條件以確保準確度及精確度。
亦可藉由螢光共振能量轉移(FRET)偵測及監測偵測標靶核酸及核酸序列之產生或存在。FRET為供體與受體分子兩個螢光團之間的能量轉移機制。簡言之，在特定激發波長下激發供體螢光團分子。在供體分子返回至其基態時自其之後續發射可將激發能轉移至受體分子(藉由長程偶極子-偶極子相互作用)。FRET為一種如分子信標下所見，可用於定量例如DNA-DNA相互作用中之分子動力學的有用工具。為監測特異性產物之產生，可在一個末端用供體分子標記探針且在另一末端用受體分子標記探針。探針-偵測標靶雜交引起供體及受體之距離或取向之變化且觀察到FRET
特性之變化。(Joseph R.Lakowicz.「Principles of Fluorescent Spectroscopy」,Plenum Publishing Corporation，第2版(1999年7月1日))。
亦可藉由側流裝置偵測及監測偵測標靶核酸之產生或存在。側流裝置為熟知的。此等裝置一般包括流體可穿透之固相流徑，流體藉由毛細管力流過其。實例包括但不限於試紙分析法及具有不同合適塗層之薄層層析板。樣品之各種結合試劑、樣品之結合搭配物或涉及結合搭配物之結合物及信號產生系統固定於流徑中或流徑上。可用包括以下之若干不同方法實現分析物之偵測：酶偵測、奈米粒子偵測、比色偵測及螢光偵測。酶偵測可涉及酶標記探針，該等探針雜交至側流裝置之表面上之互補或實質上互補核酸偵測標靶。所產生之複合物可用合適標記物處理以產生可讀信號。奈米粒子偵測涉及珠粒技術，該技術可使用膠體金、乳膠及順磁奈米粒子。在一個實例中，珠粒可結合至抗生物素抗體。標靶序列可直接經生物素標記，或標靶序列可雜交至序列特異性生物素標記探針。金及乳膠產生裸眼可見之比色信號且順磁粒子在磁場中經激發時產生不可見信號且可藉由專用讀取器解譯。
基於螢光之側流偵測方法亦為已知的，例如雙螢光素及生物素標記之寡核苷酸探針方法或量子點之使用。
亦可在側流裝置上捕獲核酸。捕獲手段可包括抗體依賴性及非抗體依賴性方法。非抗體依賴性捕獲一般使用兩個結合搭配物之間的非共價相互作用，例如生物素標記探針與抗生蛋白鏈菌素捕獲分子之間的高親和力及不可逆鍵。捕獲探針可直接固定於側流膜上。
本發明之整個方法或至少方法之擴增方法部分可在反應容
器(諸如例如來自Eppendorf®之習知實驗室塑膠試劑管)中進行或可在固體支撐物中及/或固體支撐物上進行。固體支撐物可為多孔或無孔的。在一特定具體實例中，固體支撐物可包含多孔膜材料(例如硝化纖維或類似物)。更尤其，固體支撐物可包含或形成多孔側流分析裝置之一部分，如上文所述。可替代地，固體支撐物可包含或形成微流體型分析之一部分，其中一或多個固體窄孔毛細管用於沿分析裝置輸送液體。
在較佳具體實例中，本發明之方法之所有或至少部分可使用定點照護(PoC)分析裝置進行。PoC裝置典型地具有以下特徵：造價便宜，在單次使用後拋棄，一般為整裝，不需要任何其他裝置或設備進行或解譯分析且理想地，使用不需要臨床知識或培訓。
本文揭示適用於本發明之引子之實例。可適用於本發明之方法之其他實例尤其揭示於US 2009/0017453及EP 2,181,196中，該二者之內容以引用的方式併入本文中。熟習此項技術者將容易能夠在無過度試驗下設計適合於其他標靶序列之擴增之其他引子。
如其他地方所解釋，本發明中使用之引子將較佳不僅包含標靶互補部分，且亦包含切口核酸內切酶結合位點及切口位點，以及穩定部分。較佳引子可含有可在引子分子中形成莖環結構之自互補序列。
本發明之方法中使用之引子可包含經修飾之核苷酸(亦即在天然存在之核酸分子中未發現之核苷酸)。此類經修飾之核苷酸宜存在於引子之標靶互補部分，及/或引子中之其他地方。經修飾之核苷酸之較佳實例為2'-修飾核苷酸，尤其2'O-甲基修飾核苷酸，儘管許多其他經修飾之核苷酸為熟習此項技術者所知。
本發明之方法儘管非等溫，但不需要熱循環。因此，本發明之方法不需要使用PCR中所用之相對複雜熱循環裝置，且因此使得其自身更加容易地應用於PoC環境中。
「熱循環」或溫度循環意謂：詳言之，反應混合物之溫度保持在特定溫度(比如t1)下持續特定時長(典型地至少30秒)。隨後在返回至先前維持之溫度之前調節溫度(向上或往下)。
典型地，諸如PCR之非等溫核酸擴增反應需要進行多個熱步驟/循環(亦即至少兩個或超過兩個)及多個熱循環/反應。
本發明之方法中之溫度降低為故意的且在溫度降低之量值高於預定最小水準且低於預定最大水準的意義上進行控制。此外，溫度降低速率較佳在預定範圍內。
本發明之方法中之初始步驟(a)涉及在准許引子至少暫時雜交至標靶之條件下，將標靶序列與具有與標靶序列互補之至少一部分之引子接觸。此可描述為「起始」階段。
此步驟典型地在50℃至65℃範圍內，較佳在52℃至62℃範圍內，更佳在54℃至62℃範圍內，最佳在58℃至62℃範圍內之溫度下實現。包含標靶及引子之反應混合物可保持在此溫度下持續合適之時段。最佳溫度及反應混合物保持在此溫度下所持續之最佳時段可由熟習此項技術者鑒於本發明之益處來判定，且此等條件可受諸如以下參數影響：標靶序列之長度、引子之長度及尤其與標靶互補之引子部分的長度、標靶：引子雜交體之G：C含量、反應混合物之pH及鹽濃度。典型初始溫度保持時間可在5秒
至5分鐘範圍內，較佳在10秒至3分鐘範圍內。准許步驟(a)中之初始雜交事件之典型條件將為熟習此項技術者已知且描述於隨附實例中。
58℃至62℃之溫度範圍對於起始階段為較佳。認為此溫度範圍足夠高以最小化引子二聚體之形成(且因此減少非特異性擴增之量)，且提高在標靶雙螺旋體中產生潛在「起始位點」之機率，同時足夠低以允許至少一些引子分子雜交至標靶。
溫度之後續降低有助於穩定相對較短引子與延伸產物之雜交，而非引子與初始標靶分子之雜交。進一步假設反應混合物之其他冷卻促進偵測探針與偵測標靶之雜交。
在步驟(b)至步驟(d)中所陳述之擴增方法期間，反應混合物之溫度降低。此可以調節方式進行，例如根據預定溫度分佈使用溫度調節構件降低反應混合物之溫度。溫度降低可緊接在起始階段(步驟a)之後開始。反應混合物之體積宜小，使得反應混合物(及其中或上面進行之反應容器或基板)之熱容量降低。
反應混合物之體積宜低於100μl，較佳低於50μl，更佳低於25μl且最佳低於20μl。以此方式，反應混合物之溫度可藉由溫度調節構件更準確及更快速地調節。在合適具體實例中，溫度調節構件可極其簡單(例如風扇)，或可完全省掉，其中藉由被動部件(例如藉由來自反應混合物之熱輻射)基本上或完全實現足夠冷卻。典型地，反應混合物體積可在1μl至50μl，較佳1μl至20μl且更佳地1μl至10μl範圍內。
反應混合物體積可低於10μl。詳言之，本發明之方法可採用「數位PCR」型方法(參見由Morley 2014 Biomolecular Detection and
Quantification 1,1-2所回顧)，其中樣品經稀釋且分成許多(通常數百、數千或甚至百萬)個同時加工之等分試樣：某些等分試樣將含有標靶序列且某些將不含：若不存在標靶序列，則不產生信號。陰性等分試樣之比例可用於推斷原始樣品中之標靶序列之數目及/或濃度。在此類具體實例中，各等分試樣中之反應混合物體積可極小，然而，典型地，最小體積將為2500nl，較佳為至少50μl。
溫度可以任何所需特徵曲線降低。舉例而言，溫度可根據實質上線性特徵曲線(例如具有基本上恆定溫度降低速率)降低，或可以任何非線性方式降低，該等非線性方式包括曲線或逐步方式，或線性與非線性特徵曲線之任何組合(例如一或多個時期恆定速率溫度降低，該速率可為零或相對較低，與相對較高溫度降低速率之時期交替)。
根據本發明之反應之溫度特徵曲線使得反應溫度不能夠返回至進行「起始」階段之溫度。因此，在本發明之方法中，預定溫度不存在振盪且不「返回」至預定溫度，與例如WO 2011/030145之揭示內容相反。
在擴增方法開始時反應混合物之溫度將典型地與步驟(a)中之溫度相同，例如較佳在54℃至62℃且最佳在58℃至62℃範圍內。在擴增方法期間，溫度降低至少2℃，較佳至少3℃、4℃或5℃，更佳至少8℃、9℃或10℃，且最佳至少13℃、14℃或15℃，不過應瞭解，在絕對意義上而言，溫度下降之較佳量值可至少部分地視在擴增方法開始時所選擇之初始溫度而定，其中較低初始溫度(例如在45℃至55℃範圍內)可預測較低溫度下降及/或較低溫度降低速率。典型地，在擴增方法期間溫度降低之最大量值為約20℃，不過應瞭解，最大溫度降低可低於此溫度(例如16℃、
17℃、18℃或19℃)或更高(例如25℃或30℃)。
在較佳具體實例中，在擴增方法期間反應混合物之溫度降低之量值可在5℃至40℃範圍內，較佳在8℃至35℃範圍內，更佳在8℃至30℃或甚至8℃至25℃範圍內，且最佳在8℃至20℃範圍內。在擴增方法開始時反應混合物之典型初始溫度在50℃至62℃，較佳54℃至62℃範圍內，更佳在56℃至60℃範圍內，且最佳在58℃至60℃範圍內。
在較佳具體實例中，在擴增方法期間(本發明之方法之步驟(b)至步驟(d))溫度降低包括涵蓋54℃至50℃、56℃至50℃或58℃至50℃，更佳58℃至45℃、58℃至40℃或甚至60℃至40℃範圍之降低。將瞭解，在擴增方法期間溫度降低可超過如上文所定義之陳述範圍。亦即，最大溫度可超出陳述範圍之上限溫度及/或最低溫度可低於陳述範圍之下限溫度。
擴增反應之終點溫度較佳經選擇以與所選擇之偵測方法相容。舉例而言，若偵測方法涉及使用酶標記，則需要安排擴增反應之終點溫度與酶相容且例如在酶之最佳溫度之±5℃內。可替代地，在偵測方法涉及使用雜交偵測探針，諸如分子信標或類似物之情況下，宜安排擴增反應之終點溫度經選擇以與偵測探針/偵測標靶雙螺旋體之Tm相容。
舉例而言，終點溫度宜低於偵測探針/偵測標靶雙螺旋體之Tm，較佳低至少2℃以促進探針雜交至偵測標靶。
在擴增方法期間溫度降低之典型平均速率在-0.10℃ min-1至-6.0℃ min-1範圍內，較佳在-0.20℃ min-1至-3.5℃ min-1範圍內，更佳在-0.30℃ min-1至-3.5℃ min-1範圍內，且最佳在-0.40℃ min-1至-3.5℃ min-1範圍內。
如自前文顯而易見，在擴增方法期間之任何一個時刻，溫度降低之實際速率均可偏離較佳平均速率，視溫度降低梯度之性質而定。
在一些具體實例中，溫度降低梯度歷時至少3分鐘，更佳至少4分鐘且最佳歷經擴增方法之大部分持續時間為實質上線性的。典型地，溫度降低梯度歷經在3分鐘至12分鐘範圍內，較佳在4分鐘至10分鐘範圍內，更佳在4分鐘至8分鐘範圍內之時段為實質上線性的。出於本發明目的，「實質上線性」意謂對於描述溫度梯度之任何二階多項式，X之係數量值比Y之係數值小5%。
可設想大量不同技術用於實現擴增方法期間之所需溫度降低。此等技術可包括以下中之一者或二者：(a)停止將熱量施加至反應混合物及/或將反應混合物自加熱及/或絕熱環境移出且藉由被動熱損失使反應混合物基本冷卻至周圍環境；(b)將主動冷卻施加至反應混合物。主動冷卻可涉及使反應混合物曝露於冷卻環境，例如將反應混合物置放於與冷卻介質，尤其流體之熱傳遞(傳導、輻射或對流)接觸中。此可包含例如：使反應混合物與冷凍水浴接觸；使用風扇吹冷空氣或其他氣體流經或穿過反應混合物；使反應混合物與反應混合物相容冷卻劑接觸，該冷卻劑可為氣體、液體或固體；或使用Peltier型冷卻裝置。舉例而言，反應混合物相容冷卻劑可為呈冷凍或冷藏液體形式之反應混合物相容緩衝液。添加冷緩衝液將易於稀釋反應混合物，因此若採納此方法，則較佳使用處於遠低於反應混合物之溫度(亦即低於反應混合物之溫度超過20℃)下的較小體積(例如低於1μl至2μl)之冷卻劑。
任何主動冷卻步驟均可在擴增方法期間不連續地應用以實
現所需溫度降低水準及/或所需溫度降低特徵曲線。詳言之，主動冷卻可在擴增方法期間以兩個或超過兩個穿插時間間隔進行，且可視情況與被動冷卻同時或交替組合。
一般而言，較佳地，實質上完全藉由被動部件可實現溫度降低之所需量及速率，此係因為此簡化方法及進行方法所需要之任何裝置或套組。為藉由實質上完全被動部件實現所需冷卻量及速率，需要反應混合物之體積較小以降低其熱容量，如先前所提及。
本發明之方法之一較佳特徵為擴增方法可利用具有最佳溫度之第一聚合酶及具有最佳溫度之第二聚合酶，其中第二聚合酶之最佳溫度低於第一聚合酶之最佳溫度。因此，因為反應混合物之溫度可等於或接近第一聚合酶之最佳溫度，所以第一聚合酶在接近擴增方法開始時可尤其活躍。
因此，舉例而言，第一聚合酶可有利地為「嗜熱性」酶(亦即具有超過60℃之最佳溫度)。
相反地，第二聚合酶具有低於第一聚合酶之最佳溫度。隨著擴增方法繼續，反應混合物之溫度降低且更加接近於第二聚合酶之最佳溫度。因此，第二聚合酶變得日益活躍，其至少部分地補償下降之反應速率，該下降係因為(i)反應由於溫度較低而一般在熱力學上減緩及(ii)反應混合物之溫度可能降至低於第一聚合酶之最佳溫度，從而導致催化減少。
有利地，第二聚合酶之最佳溫度在30℃至55℃範圍內，更佳在30℃至45℃範圍內。
在一特定具體實例中，第二聚合酶可為DNA聚合酶I或Bsu
聚合酶之克列諾片段。
可設想可甚至使用較佳具有另一較低第三最佳溫度之第三或其他聚合酶。
第二聚合酶較佳自擴增方法開始時在反應混合物中，但視需要，第二聚合酶可在延遲之後加入，使得反應混合物之溫度自較高初始溫度降低。此在例如第二聚合酶尤其不耐熱且若在擴增方法開始時通常採用之相對高溫下存在時即可能實質上變性時可為有利的。
以完全類似於前文之方式，擴增方法可利用分別具有較高及較低最佳溫度之第一切口酶及第二切口酶。第一切口酶及第二切口酶可視具體情況與單個聚合酶或多個聚合酶結合使用。
如上，使用具有較低最佳溫度之第二切口酶可至少部分地抵消在擴增方法期間伴隨溫度降低之預期降低反應速率。
因此，在一些具體實例中，反應混合物之溫度可開始於低於第一聚合酶及/或第一切口酶之最佳溫度之溫度或可在擴增方法之過程期間降低至低於第一聚合酶及/或第一切口酶之最佳溫度之溫度，且將傾向於接近且可甚至達到第二聚合酶及/或第二切口酶之最佳溫度。
在一些具體實例中，本發明之方法宜包含使反應混合物與降解核酸之降解酶接觸之步驟。合乎需要地，此步驟在使用者獲得擴增反應之所需結果(例如病原體之偵測)之後進行。典型地，因此降解酶在擴增方法已達到所需終點之後添加至反應混合物中。較佳地，降解酶為不耐熱的，使得若在擴增方法達到所需終點之前無意將其引入至反應混合物中或與反應混合物接觸，則溫度足以使該酶實質上變性或以其他方式使其不活
化。合適實例包括可購自ArcticZymes®之鱈魚尿嘧啶-DNA醣苷酶(「UDG」)及南極不耐熱性UDG(可購自New England BioLabs)。此等酶在分別曝露於55℃或50℃之溫度時快速及不可逆地不活化，且因此應解釋與降解酶有關之術語「不耐熱性」。可替代地，可使用熱敏降解酶(亦即在低於50℃時至少部分活躍，但在高於55℃時可逆地，實質上不活躍之降解酶)。
現將藉助於說明性實例且參考隨附圖式進一步描述本發明，其中：
圖1A至圖1C為可用於進行本發明之方法之引子的典型具體實例之示意圖。
圖2A及圖2B為適合於進行本發明之方法之核酸擴增反應的分別起始階段及指數擴增階段之示意圖；圖3至圖11為(減去背景之)螢光(任意單位)及溫度(℃)對時間(分鐘)之曲線；圖12A至圖12C為擴增反應之個別複製反應的(減去背景之)螢光(任意單位)對時間之曲線；圖13為比較在本發明之「STAR」條件下或在等溫條件下實現自模板序列之10個複本擴增所花費之時間的散佈圖；圖14A及圖14B為使用等溫擴增條件(分別為63℃或49℃)之(減去背景之)螢光(任意單位)及溫度(℃)對時間之曲線。
圖15A、圖15B及圖15C為在各種溫度特徵曲線下本發明之擴增反應之個體複製反應(10個複本或100個複本；分別為虛線及實線)
的(減去背景之)螢光(任意單位)及溫度(℃)對時間(分鐘)之曲線；圖16A及圖16B為在各種溫度特徵曲線下根據本發明之擴增反應的(減去背景之)螢光(任意單位)及溫度對時間(分鐘)之曲線；圖17A及圖17B為根據本發明，使用含有6個(圖17A)或7個(圖17B)O-甲基化鹼基之引子進行之擴增反應的(減去背景之)螢光(任意單位)及溫度(℃)對時間(分鐘)之曲線；以及圖18為根據本發明，使用由單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)23S RNA之逆轉錄產生之DNA標靶進行的擴增反應之(減去背景之)螢光(任意單位)對時間(分鐘)之曲線。
藉由比較使用隨著時間推移溫度降低與標準等溫條件之擴增測試溫度降低對擴增反應之影響。降低溫度之擴增在本文中稱作「STAR」(選擇性溫度擴增反應)。除非指出，否則此等比較使用如下所述之方案進行。
沙眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)(Ct)用作用於研發STAR機制之初始標靶。沙眼披衣菌血清變型J(ATCC VR-886)基因組DNA自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection,Manassas,VA)獲得。隱蔽性質體之開放閱讀框架6區用引子STARctF61a(SEQ ID NO：1，5'-CGACTCCATATGGAGTCGATTTCCCCGAATTA-3')及STARctR61c(SEQ ID
NO：2，5'-GGACTCCACACGGAGTCTTTTTCCTTGTTTAC-3')擴增。所產生之DNA模板使用分子信標STARctMB1(SEQ ID NO：3，5'-FAM/ccattCCTTGTTTACTCGTATTTTTAGGaatgg/BHQ1-3')偵測，如EP第0728218號中所描述。Manta 1.0 DNA聚合酶購自Enzymatics(Beverly,MA)。Nt.BstNBI切口核酸內切酶購自New England BioLabs(Ipswich,MA)，如美國專利第6,191,267中所描述。
寡核苷酸及分子信標藉由Integrated DNA Technologies(Coralville,IA)及Bio-Synthesis(Lewisville,TX)合成。用於STAR反應之引子之一般特徵如下：
引子組用切口位點之穩定區5'及切口位點之標靶特異性結合區3'構築(圖1A)。引子以如下方式構築，以使得莖及環結構可藉由產生形成莖之至少部分之自互補結構在寡核苷酸之5'端形成。此結構之Tm經選擇以視既定時間之反應溫度而引導線性或指數擴增。莖進一步涵蓋切口酶識別序列之至少一部分。引子中之切口酶識別序列為雙鏈莖結構之一部分，但至少一個核苷酸為單鏈以避免切刻。視需要，與標靶序列互補之序列可包含二級結構或可不含二級結構。此外，此序列可含有經修飾之核苷酸，諸如2'修飾或硫代磷酸酯鍵。
參考圖1A，「引子區」為與標靶序列互補且黏接至標靶序列之序列。「NEB區」為切口核酸內切酶結合區，亦即在此情況下在NEB區之末端下游四個核苷酸之位點處切刻引子之切口酶識別區。「擴增環」為擴增方法提供引子穩定及雜交且在起始階段期間藉助於自互補而環繞自身以減少背景非特異性擴增。圖1B及1C展示可用於本發明之方法之引子的稍
微不同具體實例。引子結構基本上與圖1A所示之具體實例相同，但變化之引子包括「引子區」中之修飾鹼基。具體而言，在引子區之3'端處，存在連續2'O-甲基化鹼基鏈。在圖1B中，此鏈有7個鹼基長且在圖1C中，鏈有6個鹼基長。圖1B及圖1C中所示之類別之引子用於以下實施例8中。
在反應中發現之寡核苷酸及擴增機制之概述包含：(1)標靶核酸分子；(2)包含與標靶核酸分子互補之一些數目寡核苷酸之兩個或超過兩個引子寡核苷酸分子；及(3)引子內可由切口酶切刻之位點。方法涉及使標靶核酸分子與聚合酶、兩個或超過兩個引子寡核苷酸及切口酶接觸，各引子寡核苷酸特異性結合於標靶核苷酸分子上之互補序列；及在非等溫條件下產生包含結合標靶序列之引子寡核苷酸之至少一部分的可偵測擴增子。整個STAR反應可理解為經歷兩個相異階段：起始及指數擴增。起始階段為其中可發生指數擴增之指數-模板雙螺旋體的初始形成。此兩個階段示意性說明於圖2A及圖2B中。在彼等圖中，三角形符號表示切口酶且六邊形符號表示DNA聚合酶。初始引子與標靶核酸先接觸，接著正向起始模板延伸及產生。隨後相反鏈引子結合至新產生之正向起始模板，沿朝向起始模板之切口位點之方向延伸且穿過起始模板之切口位點。此初始過程可理解為涉及用於延伸之聚合酶且高度傾向於形成引子二聚體及截短或背景產物之錯誤擴增。一旦切刻在任一鏈上開始，則聚合酶將滲入切口位點且朝向相反引子延伸且穿過切口位點。
一旦在正向起始鏈及反向起始鏈二者上發生此切刻且接著聚合酶延伸之循環，則形成稱為指數雙螺旋體之雙螺旋體。開始反應之第二階段；因為自切口及延伸產生之各新模板現成為另一引子之標靶，所以
此指數擴增過程自我供給。
現瞭解，第二階段需要活性切口核酸內切酶用於快速產生模板。先前已知此切口鏈置換複製阻隔對溫度循環之需要，因此反應可且始終在恆溫下進行。本新穎發現實現獨特及相異擴增方法，其效能顯著高於現有方法，包括在短時段內高產率產生具有高特異性之產物。
基本選擇性溫度擴增反應(STAR)混合物含有兩個引子、聚合酶及切口酶(參考以上)。反應在20μl之最終體積中進行，包括0.41μM正向引子、0.2μM反向引子、0.18μM分子信標、10μl STAR主混合物及5μl DNA樣品。STAR主混合物含有以下試劑；15mM MgSO4、90mM Tris-HCl(pH 8.5)、300μM各dNTP、15mM(NH4)2SO4、15mM Na2SO4、1mM DTT、0.01% Triton X-100、7U切口核酸內切酶、48U聚合酶。反應溫度為等溫或基於溫度降低量而變化。若在各反應中擴增期間溫度在60℃開始且每15秒或1分鐘降低指定量，則例如負0.5℃速率(亦即每15秒0.5℃之溫度降低)歷時10分鐘將導致溫度歷經反應之過程自60℃降低至40℃。擴增及STAR產物偵測用Agilent Mx3005 P QPCR設備(Agilent)進行。除非另外指出，否則下表列舉所測試之溫度特徵曲線：
預反應培育將允許試劑達到溫度以測試降低溫度對擴增動力學、酶效能及信號螢光之影響。以此方式進行反應移除遞增溫度變數且允許現有等溫擴增技術與新穎STAR方法之間的直接比較。
進行擴增反應之確切步驟如下：1)製備主混合物；2)製備具有標靶或不具有標靶之引子；3)視每個盤將進行之反應數目而定，將引子混合物添加至96孔盤之列A至列G；4)將主混合物添加至同一96孔盤之列H；5)密封板且進行預反應培育，持續2分鐘；6)將主混合物自列H轉移至各引子混合物列，在轉移之間等待15秒；7)密封且起始預先選擇之溫度特徵曲線及收集資料。
在反應過程期間，藉由使用如上文所述之分子信標每15秒量測擴增產物。監測反應混合物中分子信標之螢光以量測在反應期間所產生之特異性產物之量。在反應期間產生之特異性產物結合至分子信標，使螢光團與淬滅劑分離，從而產生螢光。將螢光量測結果減去背景，螢光背
景係基於擴增開始前各反應孔之前3次讀數之平均值。基於自基線臨限位準(TL)之上升進行進一步特性化。選擇接近於減去背景之螢光之基線但大於隨機波動之範圍之TL。溫度之降低導致分子信標基線螢光由於莖強度增加而降低，致使恆定線性基線隨著淬滅劑及螢光團具有較強相互作用而降低。為所有反應選擇2000之TL。為進行比較，基於擴增達至TL之時間來確定確切數，稱為AT值。使用AT值允許盤彼此之間的比較。
為證明STAR相比於當前等溫技術提供之改良，使用對應標靶之18個複製物及對應無標靶之6個複製物進行擴增。STAR反應展示與等溫條件相比，速度、靈敏度及總螢光顯著改良。詳言之，-0.8℃分鐘至-3.2℃分鐘之範圍明顯優於所有等溫條件(圖3至圖11)。令人驚訝及意外地，此類溫度之顯著下降仍產生極佳結果。不將申請人限制於任何特定理論，咸信擴增改良可歸因於至少三個特徵，以下進一步討論。
使用未經修飾之引子之實驗的結果展示於圖3至圖11中。在彼等圖中，溫度特徵曲線藉由背景陰影指示。「無標靶」陰性對照之信號(螢光)之量藉由暗曲線指示。在標靶(沙眼披衣菌之基因組DNA)之10個複本或100個複本存在下產生之信號量藉由較亮曲線指示。
圖3、圖4及圖5展示分別在50℃、56℃及60℃下之等溫擴增(亦即未根據本發明之方法)之結果。如在圖3中可看出，在50℃下基本不存在特異性擴增，在56℃下至少對於100個標靶複本數，存在較強擴增(圖4)，且在60℃處存在較低擴增(圖5)。
圖6至圖10展示對於本發明之非等溫(STAR)擴增反應所
獲得之結果，其中溫度在擴增期間降低。溫度降低速率為線性的，介於圖6中之-0.1℃/15秒(亦即-0.4℃/分鐘)至圖10中之-1.0℃/15秒(亦即-4.0℃/分鐘)範圍內。可看出，在所有情況下，利用標靶之100個複本之反應比利用標靶之10個複本之反應產生的螢光信號多，如所預期。更顯著地，反應產生之信號遠多於等效等溫擴增，尤其對於10個標靶複本數反應。此外，可偵測信號之產生比等效等溫反應中快。
當使用非線性、逐步溫度降低(如圖11中所示)進行本發明之方法時獲得相似結果。
本發明人亦發現(為簡潔起見，省略資料)在STAR反應中不同複製物之間的信號量變化遠低於等溫反應中複製物之間的信號量變化，證明本發明之方法產生更一致之結果。以下評論提供本發明之方法賦予上述優勢之可能機制。
在大多數核酸擴增反應中，最終可形成引子二聚體，競爭有限試劑且在低標靶濃度時，引子二聚體可變為反應之主要擴增途徑。限制或延遲引子二聚體之形成，即使較少量，亦為反應提供顯著益處。由於擴增反應之快速性，所以延遲引子二聚體形成允許較佳擴增途徑成為有利的(亦即模板產生)，改良擴增之所有態樣。藉由在高溫下起始反應，此等模板途徑變為有利的且甚至較佳。此體現在STAR方法中提高之靈敏度、提高之螢光信號、更緊密之複製物分群(亦即更高之再現性)及提高之速度。
在反應之起始階段之後，指數階段開始。因為模板途徑比錯誤途徑有利，所以需要儘可能迅速地產生儘可能多產物，且STAR促進此。對於此產生而言最可能限制步驟之一為切口核酸內切酶對位點之切刻。隨
著反應混合物之溫度降低，其接近切口核酸內切酶之最有利溫度，且反應效率增加，產生儘可能多之用於偵測之模板。
隨著溫度降低，進一步分子信標有利於模板偵測及減少螢光背景。模板對分子信標之熔融溫度變得顯著地高於偵測溫度，隨著更少模板自分子信標熔融，產生改良之信號。此外，因為溫度降低，所以莖熔融溫度變得高於反應溫度。因此當不存在模板時分子信標有利於閉合階段，產生更少之背景信號。
本發明之新穎非等溫反應方法比現有等溫及熱循環條件顯著改良。藉由促進酶活性及最佳反應動力學，該方法改良AT之變化，增加所產生之螢光總量，改良擴增一致性且提高偵測靈敏度。
因為分子信標僅量測特異性單股DNA產物之總量之增加，所以未量測與預期擴增產物無關之非特異性擴增產物。為量測非特異性擴增產物之產生(例如由引子二聚體形成產生)，在SYBR Green II存在下進行分開反應。SYBR Green II為已知用於偵測單鏈DNA、RNA及雙鏈DNA之最靈敏染料之一。因為SYBR Green II具有低內源螢光，所以若在無標靶存在下進行擴增，則其為用於偵測反應或非特異性擴增中之全部擴增之自然選擇。直接在兩種條件-等溫及非等溫(STAR)下進行反應，如下表2所顯示。
此外，反應比較基因組DNA之50個複本對無標靶。獲得10,000x濃度之SYBR Green II，每次反應使用0.5x(Life Technologies,Carlsbad)。較高TL 9000用於計算因嵌入染料之固有本質所致之AT。SYBR Green II之螢光與溫度具有相反關係。溫度愈低，螢光信號愈高，如「Comparison of multiple DNA dyes for real-time PCR：effects of dye concentration and sequence composition on DNA amplification and melting temperature」(Gudnason等人，2007 Nucl.Acids Res.35(19)e 127)中所描述。結果展示於下表3中。
STAR方法呈現多個改良：首先，該方法減少背景產生，此可由以下明顯看出：相對於標靶信號，「無標靶」展示SYBR Green II擴增所耗費之時間更長。其次，該方法改良產物擴增，體現在標靶存在時擴增時間更快。總之，此等改良使相對於等溫方法AT之間的差值超過四倍。
應注意，來自等溫反應之AT值具有比來自STAR之AT值更多之變化。此展示新方法在控制擴增方法方面所具有之益處且反映使用傳統方法之非特異性擴增途徑之不可預測性。
如美國專利6,794,142及6,130,038中所描述，已知使用2' O-甲基修飾之引子可減少擴增期間之引子二聚體形成。US 2005-0059003描述位於SDA引子之3'處之2' O-甲基修飾的使用，因此Bst DNA聚合酶I及衍生物可將2'修飾核糖核苷酸有效用作用於DNA合成之引子。包含一或多個2'修飾核苷酸(例如2'-O-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟基、2'-烯丙基、2'-O-[2(甲胺基)-2-側氧基乙基]、2'-羥基(RNA)、4'-硫基、4'-CH3-O-2'-橋、4'-(CH3)3-O-2'-橋、2'-LN A及2'-O-(N-胺基甲酸甲酯2'-Suc-OH))之標靶特異性引子區應提高等溫反應。若2'修飾之核苷酸完全消除引子二聚體形成，則STAR方法可進一步提高擴增將為出人意料的。直接在兩種條件-等溫及非等溫(STAR)之間進行反應，如下所顯示。
在引子之3'端上使用2'修飾核苷酸擴增之結果展示於下表5中。在無標靶反應中用最少6個複製物進行反應且標靶反應用最少12複製物。
資料表明使用合併2' O-甲基核苷酸之至少一個引子延遲引子二聚體之形成，儘管使反應減緩，但改良反應。此外，使用STAR方法不僅改良2' O-甲基擴增之使用，恢復一些損失速度，且亦將改良標靶擴增與無標靶擴增之間的差值達三倍。此表明儘管2' O-甲基修飾確實減少非特異性之錯誤擴增之產生，但該等修飾並未將其消除。資料進一步表明STAR方法比先前揭示之現有技術更好地利用由2' O-甲基修飾所產生之改良。
本發明不受限於任何特定理論，假設藉由在引子區中使用一或多個2'修飾核苷酸所獲得之潛在改良主要是因為擴增之起始階段之增強。
在標靶上之引子區之初始延伸期間，STAR之引子區中之一或多個2'修飾核苷酸的合併導致此等核苷酸不適合充當由引子之相互作用形成之非特異性複合物中聚合酶延伸之模板，從而減少背景信號。聚合酶極有可能在核苷酸進入結合袋時停止。在非產生性反應(亦即，脫靶或引子二聚體形成)中，因為模板結合接近其熔融溫度，所以停止效應足以使異常延伸最小化。因此，因為反應已陷入困境，所以2'修飾能夠限制不合需要之擴增途徑。然而，在有利擴增期間，2'修飾降低熔融溫度，因此不利地影響擴增，從而減緩擴增時間。STAR能夠在最小化陰性標靶擴增缺點的同
時利用2'修飾。
此聚合酶停止進一步解釋STAR結合2' O-甲基修飾改良彼此之原因。除天然減少引子二聚體以外，在STAR方法中發現之溫度之初始提高在錯誤擴增可能發生之前加劇2'修飾停止及引子之熔融，因此兩種方法彼此互補。此外，因為STAR涉及降低溫度，所以由引子中之2'修飾所導致之熔融溫度之降低可隨反應進行降至最低。
現有擴增技術熱循環或在恆溫下進行。本發明之方法皆非二者，而是在不存在循環下藉由降低溫度進行。本發明之特定新穎特徵為能夠使用相似功能但具有不同溫度最佳值之酶。舉例而言，此技術將允許使用針對在不同溫度最佳值下起作用之切口核酸內切酶進行設計之多個引子，以及具有不同最佳值之不同鏈置換聚合酶。本發明不受限於任何特定理論，此方法開拓快速擴增方法，從而允許現有技術中未發現之酶與引子之新組合。以下反應(表6)直接在三種條件-等溫、非等溫(STAR)及具有BSU聚合酶(除初始Manta 1.0聚合酶外)之非等溫(STAR)之間進行，如以下所顯示。BSU聚合酶購自New England BioLabs(Ipswich,MA)且以0.5U/反應進行。所有條件均使用18個標靶複製物及6個無標靶複製物進行。
擴增反應使用含有10個複本之沙眼披衣菌基因組DNA之樣品進行，結果展示於圖12A至圖12C中。
圖12A展示等溫反應(非根據本發明)之結果。圖12B展示在單獨Manta聚合酶存在下之STAR反應之結果，且圖12C展示在其他BSU聚合酶存在下之STAR反應之結果。
第一明顯差異為藉由等溫方法未偵測到基因組DNA之10個複本，18個複製物中僅9個超出螢光臨限位準且可稱為已擴增。兩種STAR方法均偵測到18複製物中之17個。(應注意，各STAR方法中之遺漏複製物係由於有故障之多注式吸液管)。
儘管STAR方法之間的差異並不明顯，但添加具有較低最佳溫度37℃之第二聚合酶在10分鐘後提高總螢光。此外，第二聚合酶亦緊固複製物，從而減少AT變化。若自市場購得最佳溫度為45℃至50℃之商業鏈置換聚合酶，則將進一步表明此差異。結果表明STAR方法優於等溫條件且進一步表明此技術允許新穎的新機制、酶組合及引子擴增方案。
為驗證STAR技術之一致性，進行大型複製物研究，比較
STAR與如美國專利第9,562,263號中所描述之公佈之等溫條件。對於含有標靶之反應使用100+複製物且對於不含標靶之對照反應混合物使用16個複製物來進行STAR與等溫擴增。二者條件均使用相同緩衝液、聚合酶、切口酶及標靶。如圖13中之散佈圖所示，STAR技術展示：實現擴增至螢光之臨限位準(TL)之平均時間(AT)明顯提高、靈敏度提高及複製物之間的標準差減小。根據本發明進行之反應之AT時間為3.35分鐘，而根據習知等溫方案進行之反應之AT值為4.88分鐘，該差值如藉由雙尾t-檢驗所判定為統計學上顯著的。不將申請人限制於任何特定理論，認為擴增時間之顯著降低係由於反應之起始得到改善，從而允許更有效之低複本擴增，最小化引子二聚體事件，且增加之特異性產物延伸產生模板比先前所揭示之方法更快。
STAR技術之進一步益處為能夠在最常見等溫擴增溫度範圍之外進行擴增。如美國專利5,712,124、9,562,263及5,399,391中所描述，大多數等溫擴增技術具有其中可發生擴增之精確溫度範圍。在此等典型溫度範圍之外，習知等溫技術擴增困難。為表明STAR之通用性，進行擴增，如下表7中所描述。
如美國專利第9,562,263號中所描述，進行等溫反應。圖14A及圖14B為展示對於在63℃(圖14A)或49℃(圖14B)下進行之等溫擴增反應，螢光信號(減去背景；任意單位)之量對時間(分鐘)之圖。在兩個圖中，點曲線表示在無模板情況下自陰性對照反應獲得之結果；實線曲線為來自含有模板之測試反應之結果。
自圖14A顯而易見，當反應溫度保持在63℃時實質上未發生模板特異性擴增。在圖14B中，結果似乎表明在49℃下擴增自約9分鐘開始發生，但實際上此可能為由分子信標與引子之相互作用產生之錯誤信號(資料未示出)。
相比於等溫反應，根據本發明進行之「STAR」反應可在高溫下起始且仍實現良好擴增。來自此等反應之結果展示於圖15A、圖15B及圖15C中。此等為螢光(減去背景，任意單位)對時間(分鐘)之曲線。
實陰影表明反應期間之溫度(℃)。點曲線表示使用10個標靶複本所獲得之結果，實曲線表示使用100個標靶複本所獲得之結果。在圖15A中，初始溫度為62℃，且溫度降低速率為-0.8℃/15秒(亦即-3.2℃/分鐘)。在圖15B中，初始溫度為63℃，且溫度降低速率為-0.8℃/15秒。在圖15C中，初始溫度為64℃，且溫度降低速率為-0.9℃/15秒(亦即-3.6℃/分鐘)。自圖示中顯而易見，62℃或甚至63℃之初始溫度為STAR反應提供良好結果，且甚至使用64℃之初始溫度亦存在一些擴增，儘管此明顯為次佳的。
此外，使用大幅溫度下降進行實驗。結果展示於圖16A及圖16B中。該等圖展示無標靶陰性對照(無螢光信號超過臨限位準)及在標靶沙眼披衣菌基因組DNA之10個或100個複本存在下進行之STAR反應之結果。
圖16A展示使用63℃之初始溫度，隨後-0.8℃/15秒之溫度降低速率持續1分鐘，隨後急劇降低至49℃，且隨後-0.2℃/15秒(亦即-0.8℃/分鐘)之逐漸溫度降低持續反應之持續時間所獲得之結果。該等圖展示對於10個複本數及100個複本數反應而言均實現擴增，不過與10個複本標靶反應相比100個複本標靶反應存在多約兩倍之螢光信號，且組內變化性顯著。
圖16B展示使用相同63℃初始溫度持續1分鐘，隨後急劇降低至49℃所獲得之結果。此後，反應溫度保持在49℃，持續實驗之持續時間。自圖中可見，存在良好特異性擴增及少得多之組內變化性(用100個複本數標靶或僅無標靶進行之反應)
STAR在整個40℃溫度範圍內擴增之能力明確表明STAR與
習知擴增反應顯著不同。具有較大範圍之非典型反應溫度並不常見且將預期其不起作用。不將申請人限制於任何特定理論，出人意料地，相比於習知擴增方法，此等較大溫度範圍對STAR之擴增的限制似乎更少。STAR在較大溫度範圍內實現優良擴增之能力可能係由於提高引子特異性及結合以及戰略上利用酶溫度最佳值。藉由利用起始階段之較高溫度，促進正確產物擴增且因此提高所有後續階段、指數擴增及偵測之效率。此選擇及後續溫度下降開拓擴增工具箱，因為可實現酶、引子及溫度之新模式。
如先前所描述，已知2'-O-甲基修飾之引子在擴增期間減少引子二聚體形成。進一步說明此等修飾與STAR技術之合作性質的是能夠合併較大2'-O-甲基修飾鏈且仍實現擴增。典型地，2'-O-甲基修飾使聚合酶停止，永久地延遲擴增；認為六個或超過六個導致聚合酶自複合物「脫落」而非僅僅停止。圖17A及圖17B證明STAR能夠容許此等修飾且用比先前所鑑別之2'-O-甲基鏈更長之2'-O-甲基鏈實現顯著擴增。含有2'-O-甲基化鹼基之引子之結構展示於圖1B及圖1C中。
圖17A及圖17B為(減去背景之)螢光(任意單位)對時間(分鐘)之圖。陰影表明在擴增反應之過程期間，隨著時間推移之溫度特徵曲線(℃)。圖17A展示使用含有6個2'-O-甲基修飾鹼基進行之反應的結果，且圖17B展示使用含有7個2'-O-甲基修飾鹼基進行之反應的結果。在兩種情況下，無標靶陰性對照反應未產生任何螢光信號，而使用經修飾之引子中之任一者均良好擴增，不過6個修飾鹼基引子之平均螢光信號略高，且組內變化性與來自7個修飾鹼基引子之結果相比少得多。
如圖中所見，含有6個及7個2' O-甲基之鏈的引子用STAR擴增良好。此可能係由於STAR能夠在鏈置換聚合酶之高度有利溫度區，65℃附近開始擴增。此有利區可允許聚合酶延伸較長2'修飾鏈，從而允許其他技術所缺乏之起始。為簡潔起見，未展示資料，但亦可描述全長引子區已用2'-O-甲基修飾且展示擴增，不過擴增較慢且螢光信號較低。
STAR可使用DNA(cDNA及gDNA)、RNA(mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、微RNA)、RNA/DNA類似物、糖類似物、雜交體、聚醯胺核酸及其他已知類似物之任何組成，自任何核酸擴增。如下所述進行核糖體核糖核酸之擴增。
單核球增多性李氏菌用作用於發展STAR RNA分析之標靶。單核球增多性李氏菌(ATCC VR-886)基因組DNA自美國菌種保存中心(Manassas,VA)獲得。對gDNA進行初步篩選，且發現核糖體核糖核酸之23S區以用引子LMONF72(SEQ ID NO：4，5'-GGACTCGATATCGAGTCCAGTTACGATTTGTTG-3')及LMONR86(SEQ ID NO：5，5'-gGACTCCATATGGAGTCCTACGGCTCCGCTTTT-3')擴增。所產生之DNA模板使用分子信標LMONMB1(SEQ ID NO：6，5'-FAM/gctgcGTTCCAATTCGCCTTTTTCGCagc/BHQ1-3')偵測，如EP第0728218號中所描述。總RNA使用RNeasy Plus微型套組Qiagen(Hilden,Germany)組合Mini Bead Mill 4(VWR)上之快速機械溶解來分離。單核球增多性李氏菌(ATCC BAA-2660)自美國菌種保存中心(Manassas,VA)獲
得，且藉由塗鋪在腦心浸液瓊脂板(BHI)上來再生。單菌落用於接種25mL BHI培養基，其在37℃下生長18小時以達至生長停滯期。培養物隨後經反向稀釋且在收穫之前生長另外四個小時。細菌丸粒再懸浮於RLT溶解緩衝液中，且在Mini Bead Mill(VWR)上均質化。根據製造商之說明(Qiagen)純化總RNA。藉由使溶解產物通過設置於RNeasy Plus純化套組中之DNA結合管柱來移除基因組DNA。藉由在RNeasy RNA結合管柱上樣品進行管柱上去氧核糖核酸酶I消化使基因組DNA污染進一步最小化。Bst X DNA聚合酶購自Beverly Qiagen(Beverly,MA)。逆轉錄酶Omniscript購自Qiagen(Hilden,Germany)。Nt.BstNBI切口核酸內切酶購自New England BioLabs(Ipswich,MA)，如美國專利案第6,191,267中所描述。寡核苷酸及分子信標藉由Integrated DNA Technologies(Coralville,IA)合成。
基本STAR混合物含有如以上實施例1中所描述之所有事物，另外包括以下：4U逆轉錄酶(參考以上)及用於Bst.X之替代物Manta 1.0。
結果展示於圖18中，其為螢光(任意單位)對時間(分鐘)之圖。陰影指示在反應過程期間之溫度特徵曲線。陰性對照反應未產生任何螢光信號，而10個複本數、100個複本數或1000個複本數標靶反應在降低時間量(分別為約3.5分鐘、3.0分鐘及2.75分鐘)時產生超過臨限值之螢光信號。結果展示STAR可自逆轉錄RNA標靶有效擴增。
<110> 盧米瑞德克斯英國有限公司(LumiraDx UK Ltd)
<120> 核酸擴增方法中或相關之改良
<140> TW 106123056
<141> 2017-07-10
<160> 6
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 1
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 2
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
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<223> 引子序列
<400> 3
<210> 4
<211> 33
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<223> 引子序列
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<220>
<223> 引子序列
<400> 5
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 6
Claims (28)
- 一種進行非等溫核酸擴增反應之方法，該方法包含以下步驟：(a)將標靶序列與一或多種互補單鏈引子在准許其中該等引子雜交至該標靶之雜交事件之條件下混合，該雜交事件直接或間接引起雙螺旋(duplex)結構之形成，該雙螺旋結構包含設置於該雙螺旋體之相對端處或附近之兩個切口(nicking)位點；且藉由以下進行擴增程序；(b)在該雙螺旋體之鏈中之該等切口位點的每一者處產生切口；(c)使用聚合酶來延伸該等切口鏈以形成新合成之核酸，該利用聚合酶之延伸再產生切口位點；(d)視需要重複步驟(b)及步驟(c)以產生該新合成之核酸之多個複本；其特徵在於進行該方法之溫度為非等溫，且在步驟(b)-步驟(d)之擴增程序期間該溫度經受至少2℃之降低，且其中該反應之溫度未返回至一預定溫度。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中在步驟(a)中，該標靶包含兩個核酸互補鏈，且該引子包含正向及反向引子，該等正向及反向引子各自與該標靶之各別的鏈互補，使得該等正向及反向引子之3'端的方向朝向彼此。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中在該擴增反應期間該溫度經受至少5℃之受控降低。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中在該擴增反應期間溫度降低之平均速率在-0.10℃ min-1至-6.0℃ min-1的範圍內。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中步驟(b)-步驟(d)實質上緊接在步驟(a)之後進行，且其中步驟(a)-步驟(d)在相同反應容器中或相同固體支撐物上進行。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中步驟(a)在55℃至62℃範圍內之溫度下進行。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其進一步包含直接或間接偵測該新合成之核酸之步驟。
- 如申請專利範圍第7項之方法，其中該偵測步驟包含使用分子信標或螢光染料、側流標記探針或催化電化學反應之酶。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中步驟(b)包含使用切口酶。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其包含使用具有一最佳溫度之第一聚合酶及/或第一切口酶，及具有一最佳溫度之第二聚合酶及/或第二切口酶，其中該第二聚合酶及/或第二切口酶之最佳溫度低於該各別的第一聚合酶及/或第一切口酶之該最佳溫度。
- 如申請專利範圍第10項之方法，其中該第二聚合酶是Bsu聚合酶或DNA聚合酶之克列諾(Klenow)片段。
- 如申請專利範圍第10項之方法，其中該擴增反應之初始溫度為或高於該第一切口酶之最佳溫度，且在該擴增反應之過程期間該溫度降低至低於該第一切口酶之最佳溫度之溫度。
- 如申請專利範圍第10項之方法，其中該擴增反應之溫度降低至該第二聚合酶及/或第二切口酶之最佳溫度或低於該最佳溫度。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其進一步包含以下步驟：使藉由進行該方法所獲得之混合物與降解核酸之不耐熱性酶接觸，該混合物與該不耐熱性酶在該不耐熱性酶實質上具活性之溫度下接觸。
- 如申請專利範圍第14項之方法，其中該酶為鱈魚尿嘧啶-DNA醣苷酶(UDG)，或南極不耐熱性UDG。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中在步驟(a)之前進行逆轉錄步驟，該逆轉錄步驟包含使目標RNA分析物與逆轉錄酶接觸以形成該目標RNA分析物之DNA轉錄物。
- 如申請專利範圍第16項之方法，其進一步包含自該DNA轉錄物製備雙鏈DNA之步驟。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其進一步包含預擴增或富集步驟。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該等引子中之一或多者包含經修飾之核苷酸。
- 如申請專利範圍第19項之方法，其中該經修飾之核苷酸是在該引子之標靶互補部分中。
- 如申請專利範圍第19項之方法，其中該一或多種引子包含2'修飾核苷酸。
- 如申請專利範圍第21項之方法，其中該一或多種引子包含2' O-甲基修飾核苷酸。
- 如申請專利範圍第22項之方法，其中該一或多種引子包含複數個2' O-甲基修飾核苷酸。
- 如申請專利範圍第23項之方法，其中該一或多種引子包含最多達至7個2' O-甲基修飾核苷酸。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中在步驟(b)-步驟(d)期間該反應之溫度未返回至進行步驟(a)之溫度。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該等引子中之一或多者包含自互補部分。
- 如申請專利範圍第26項之方法，其中該自互補部分形成髮夾結構。
- 如申請專利範圍第27項之方法，其中該髮夾結構包含5個至10個鹼基對。
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