TWI799366B

TWI799366B - 胱胺酸結骨架平臺

Info

Publication number: TWI799366B
Application number: TW105130077A
Authority: TW
Inventors: 拉米漢那許; 哈里尼卡鄔亞拉啟齊; 亞倫尼爾; 卡麥隆諾蘭; 張映楠; 周麗娟; 高新欣
Original assignee: 美商建南德克公司
Priority date: 2015-09-15
Filing date: 2016-09-14
Publication date: 2023-04-21
Also published as: CN114805528A; IL257399B; JP2018533912A; IL294568A; KR20180052718A; EP3350215A1; PE20181293A1; MA42828A; US11407794B2; JP2022130481A; US20180291069A1; CN108026162A; US11155586B2; AU2016323445B2; AU2021204400B2; CL2020001781A1; WO2017049009A1; PH12018500577A1; CR20180169A; EP3350215B1

Abstract

本發明提供可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)。另外，提供使用可結合VEGF-A之非天然存在之CKP的方法，包括診斷性及治療性組合物及方法。亦提供可結合低密度脂蛋白受體相關蛋白6(LRP6)之非天然CKP。

Description

胱胺酸結骨架平臺

由替代蛋白質骨架設計新穎蛋白質及對其進行工程改造在最近十年中已成為新興領域，具有自結構生物學及成像工具至臨床上目前正在測試之治療試劑的範圍內的諸多應用(HK Binz等人,Nat Biotechnol 23,1257-1268,2005；HK Binz及A Pluckthun,Curr Opin Biotechnol 16,459-469,2005；SS Sidhu及S Koide,Curr Opin Struct Biol 17,481-487,2007；A Skerra,Curr Opin Biotechnol 18,295-304,2007；C Gronwall及S Stahl,J Biotechnol 140,254-269,2009；T Wurch等人,Trends Biotechnol 30,575-582,2012；S Banta等人,Annu Rev Biomed Eng 15,93-113,2013)。

潛在替代骨架分子之理想物理性質包括熱摺疊及展開之高熱穩定性及可逆性。已應用若干種方法來增加蛋白質及酶之表觀熱穩定性，包括基於與高度相似之熱穩定序列進行比較的合理設計、穩定二硫橋之設計、增加α-螺旋傾向性之突變、鹽橋之工程改造、蛋白質表面電荷之改變、定向演化及共有序列之合成(Lehmann及Wyss,Cur Open Biotechnology 12,371-375,2001)。

胱胺酸結肽來自多種來源且展現多樣性藥理學活性。其大致為30至50個胺基酸長且含有六個保守半胱胺酸殘基，由此形成三個二硫鍵。該等二硫鍵之一可滲透由另兩個二硫鍵與其互連主幹所形成之大環，從而產生有多個環暴露於表面上之特徵性有結拓撲結構。該等環定義為側接該六個保守半胱胺酸殘基且本質上高度可變之胺基酸區域。此外，二硫鍵之獨特排列使得胱胺酸結肽對熱、蛋白水解及化學降解高度穩定。

因此，需要開發穩定的人工抗體樣小分子以用於多種治療及診斷應用，諸如眼部疾病及病症。本發明滿足此需要及其他需要。

在某些實施例中，本文中提供一種可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)，其中該CKP包含胱胺酸骨架結構：Z₁C₁L1C₂L2C₃L3C₄L4C₅L5C₆Z₂

其中：Z₁及Z₂為任何胺基酸；L1為環1且具有選自由以下各項組成之群的結構：X₁X₂X₃X₄X₅X₆(SEQ ID NO：2)、X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇(SEQ ID NO：3)、X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈(SEQ ID NO：4)、X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉(SEQ ID NO：5)及X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀(SEQ ID NO：6)，其中X₁至X₁₀各自為任何胺基酸；L2為環2且具有結構：X₁X₂X₃X₄X₅(SEQ ID NO：7)，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸或非天然胺基酸；L3為環3且具有結構：X₁X₂X₃，其中X₁至X₃為任何胺基酸或非天然胺基酸；L4為環4且具有結構：X₁，其中X₁為任何胺基酸或非天然胺基酸；L5為環5且具有結構：X₁X₂X₃X₄X₅(SEQ ID NO：7)，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸或非天然胺基酸；其中該非天然胺基酸選自由以下各項組成之群：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸及L-4-氟苯丙胺酸；且其中該CKP以500pM或更佳之親和力結合VEGF-A。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，參考具有SEQ ID NO：1中所闡述之胺基酸序列的野生型噴瓜胰蛋白酶抑制劑EETI-II蛋白，該可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)具有經改變之二硫鍵連接；其中該經改變之二硫鍵連接為C1-C4、C2-C3及C5-C6。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該非天然胺基酸選自由以下各項組成之群：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、 L-3-氟酪胺酸、-L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，Z₁及/或Z₂為多於一個胺基酸或非天然胺基酸。在某些實施例中，Z₂為兩個胺基酸。在某些實施例中，Z₂為三個胺基酸。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，Z₁及/或Z₂為G。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L1中，X₃不為I；X₅不為M；及/或X₆不為R。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L1中：X₁為選自P、Q、R、T、V、D、N、K、L及X之胺基酸；X₂為選自T、D、L、V、I、R、P、N及X之胺基酸；X₃為選自T、P、M、L、S、F、R及X之胺基酸；X₄為選自R、T、Q、D、W、L、E、S、K及X之胺基酸；X₅為選自F、P、V、E、K、L、I及X之胺基酸；X₆為選自K、N、F、P、L、Y、T、D、M及X之胺基酸；X₇為選自Q、W、H及/X之胺基酸；及/或X₈為選自Y、A、G、D、 E、W、S及X之胺基酸，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸及L-4-氟苯丙胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L1中：X₉為選自L、I、V、D、E及X之胺基酸，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸及L-4-氟苯丙胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L1中：X₁₀為選自Y、T、M、N、F及X之胺基酸，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸及L-4-氟苯丙胺酸。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α- 甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中，X₁至X₅各自為任何胺基酸，但X₂不為脯胺酸(P)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中，X₁至X₅各自為任何胺基酸，但X₄不為甘胺酸(G)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中：X₁為選自G、Q、H、R、L及Q之胺基酸；X₂為選自P、M、W、Y、F、L及H之胺基酸；X₃為選自N、F、H及Y之胺基酸；X₄為選自G、Q、D、N、K、H、E及S之胺基酸；及/或X₅為選自F、S及T之胺基酸。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，L1具有結構X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈(SEQ ID NO：4)，其中：X₁為選自P、Q及R之胺基酸；X₂為選自T、L及D之胺基酸；X₃為選自T、M及L之胺基酸；X₄為選自R、Q及D之胺基酸；X₅為選自F、P及V之胺基酸；X₆為選自K及F之胺基酸；X₇為選自Q及W之胺基酸；且X₈為選自Y、G及D之胺基酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，L1具有結構X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀₍SEQ ID NO：6)，其中：X₁為選自Q、R、T及V之胺基酸；X₂為選自T及D之胺基酸；X₃為P；X₄為選自T及W之胺基酸；X₅為選自F、E、P及K之胺基酸；X₆為選自N及P之胺基酸；X₇為選自W及H之胺基酸；X₈為選自A、D、E及W之胺基酸；X₉為選自L及I之胺基酸；且X₁₀為選自Y、T、M及N之胺基酸。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中：X₁為選自G、H及Q之胺基酸；X₂為選自P、M、W及Y之胺基酸；X₃為選自N及Y之胺基酸；X₄為選自G、Q及S之胺基酸；且X₅為選自F及S之胺基酸。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，L1具有結構X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈(SEQ ID NO：4)，其中：X₁為選自D、Q、N及K之胺基酸；X₂為選自V、I、R、L及P之胺基酸；X₃為選自L、S、M、T及F之胺基酸；X₄為選自Q、L及E之胺基酸；X₅為P；X₆為選自F、 L及Y之胺基酸；X₇為W；且X₈為G。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中：X₃為Y；X₅為S；且X₁、X₂及X₄各自為任何胺基酸，但X₁不為G，X₂不為P，X₄不為G，及/或X₅不為F。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中：X₁為選自H、L、R及Q之胺基酸；X₂為選自W、F及Y之胺基酸；X₃為Y；X₄為選自Q、N、K、H及E之胺基酸；且X₅為S。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，L1具有結構X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀(SEQ ID NO：6)，其中：X₁為選自K、Q、L及R之胺基酸；X₂為選自N及D之胺基酸；X₃為選自P及L之胺基酸；X₄為選自L、T、S及K之胺基酸；X₅為選自F、V、I及L之胺基酸；X₆為選自N及D之胺基酸；X₇為W；X₈為選自A及S之胺基酸；X₉為選自L、V、E及D之胺基酸；且X₁₀為選自Y及F之胺基酸。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中：X1為Q；X₂為選自L、F、M及H之胺基酸；X₃為選自F、Y及H之胺基酸；X₄為選自D、Q、N及K之胺基酸；且X₅為選自S及T之胺基酸。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L2中，X₁為K，X₂為Q，X₃為D，X₄為S，且X₅為D。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，L1具有結構X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈(SEQ ID NO：4)，其中：X₅為P；X₇為W；X₈為G；且其中X₁、X₂、X₃、X₄及X₆各自為任何胺基酸，但X1不為P，X₂不為R，X₃不為I，及/或X₆不為R。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，L1具有結構X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈(SEQ ID NO：4)，其中：X₁為選自N及D之胺基酸；X₂為選自I及V之胺基酸；X₃為選自M及L之胺基酸；X₄為選自L、Q、D及K之胺基酸；X₅為P；X₆為選自F、Y、T、L及M之胺基酸；X₇為W；且X₈為G。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中：X₁為選自Q、H、L及R之胺基酸；X₂為選自Y及W之胺基酸； X₃為Y；X₄為選自Q及N之胺基酸；且X₅為S。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中：X₃為Y；X₅為S；且其中X₁、X₂及X₄各自為任何胺基酸，但：X₁不為G，X₂不為P，及/或X₄不為G。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L2中：X₁為選自G或E之胺基酸；X₂為選自Q、L、P、R、E及M之胺基酸；X₃為選自S、D及N之胺基酸；X₄為選自F、Y、L、M及I之胺基酸；及/或X₅為選自E、D、Q、L及S之胺基酸，在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L3中，X₁為L，X₂為A，且X₃為G。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L4中，X1為V或F。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中，X₁至X₅各自為任何胺基酸，但X₂不為脯胺酸(P)。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中，X₁至X₅各自為任何胺基酸，但X₄不為甘胺酸(G)。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中：X₁為除G以外之任何胺基酸；X₂為除P以外之任何胺基酸；X₃為除N以外之任何胺基酸；X₄為除G以外之任何胺基酸；及/或X₅為除F以外之任何胺基酸。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，L1具有結構X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈(SEQ ID NO：4)，其中X₁為選自N、D及X之胺基酸；X₂為選自I、V及X之胺基酸；X₃為M或X；X₄為選自L、Q及X之胺基酸；X₅為P或X；X₆為F、Y或X；X₇為W或X；且X₈為G或X，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸及L-4-氟苯丙胺酸。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L3中，X₁至X₃各自為任何胺基酸或非天然胺基酸，但X₁不為白胺酸(L)，X₂不為丙胺酸(A)，且X₃不為甘胺酸(G)，其中該非天然胺基酸選自由以下各項組成之群：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸及L-4-氟苯丙胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L3中：X₁為選自M、F、L、V及X之胺基酸；X₂為選自S、N、Q、I、Y、E、V、T及X之胺基酸；X₃為選自D、Q、T、N、E、R及X之胺基酸，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸及L-4-氟苯丙胺酸。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L4中，X₁為除V以外之任何胺基酸或選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸及L-4-氟苯丙胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L4中，X₁為I、L或X，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸及L-4-氟苯丙胺酸。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中：X₃為Y或X；X₅為S或X；且X₁、X₂及X₄各自為任何胺基酸或X，但X₁不為G，X₂不為P，及/或X₄不為G，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸及L-4-氟苯丙胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中，X₁至X₅各自為任何胺基酸，但X₂不為脯胺酸(P)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中，X₁至X₅各自為任何胺基酸，但X₄不為甘胺酸(G)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中：X₁為選自Q、H及X之胺基酸；X₂為選自Y、W及X之胺基酸；X₃為Y或X；X₄為選自Q、N或X之胺基酸；X₅為S或X，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸及L-4-氟苯丙胺酸。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L- 丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L2中：X₁為G或X；X₂為R、P或X；X₃為D或X；X₄為F、I或X；且X₅為E、D或X，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸及L-4-氟苯丙胺酸。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECLQQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：103)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECVERCICQYYQSCG(SEQ ID NO：104)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECMSDCICQYYQSCG(SEQ ID NO：105)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECMNQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：106)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列 GCNIMLPFWGCGRDFECMQTCICQYYQSCG(SEQ ID NO：107)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECVYQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：108)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECFINCICQYYQSCG(SEQ ID NO：109)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECVSQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：110)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECVTECICQYYQSCG(SEQ ID NO：111)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECFYECICQYYQSCG(SEQ ID NO：112)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：113)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECVYRCICQYYQSCG(SEQ ID NO：114)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCDVMQPYWGCGPDIDCFVRCLCHWYNSCG(SEQ ID NO：139)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCDVMQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCG(SEQ ID NO：140)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：142)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCNIXLPFWGCGRDFECMSDCICQYYQSCG(SEQ ID NO：144)，其中X為正白胺酸(Nle)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCNIXLPFWGCGRDFECVSQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：145)，其中X為正白胺酸(Nle)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCNIXLPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：146)，其中X為正白胺酸(Nle)。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含胺基酸序列GCDVXQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCG(SEQ ID NO：224)，其中X為正白胺酸。

在某些實施例中，提供一種非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)，其包含選自由以下各項組成之群的胺基酸：GCNIMLPFWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：113)、GCNIMLPFWGCGRDFECVYRCICQYYQSCG(SEQ ID NO：114)、GCDVMQPYWGCGPDIDCFVRCLCHWYNSCG(SEQ ID NO：139)、GCDVMQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCG(SEQ ID NO：140)、GCNIMLPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：142)、GCNIXLPFWGCGRDFECMSDCICQYYQSCG(SEQ ID NO：144)(其中X為正白胺酸(Nle))、GCNIXLPFWGCGRDFECVSQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：145)(其中X為正白胺酸(Nle))、GCNIXLPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：146)(其中X為正白胺酸(Nle))及GCDVXQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCG(SEQ ID NO：224)(其中X為正白胺酸)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：113)中所闡述之胺基酸序列。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECVYRCICQYYQSCG(SEQ ID NO：114)中所闡述之胺基酸序列。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCDVMQPYWGCGPDIDCFVRCLCHWYNSCG(SEQ ID NO：139)中所闡述之胺基酸序列。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCDVMQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCG(SEQ ID NO：140)中所闡述之胺基酸序列。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCNIMLPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：142)中所闡述之胺基酸序列。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCNIXLPFWGCGRDFECMSDCICQYYQSCG(SEQ ID NO：144)中所闡述之胺基酸序列，其中X為正白胺酸(Nle)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCNIXLPFWGCGRDFECVSQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：145)中所闡述之胺基酸序列，其中X為正白胺酸(NIe)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCNIXLPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：146)中所闡述之胺基酸序列，其中X為正白胺酸(Nle)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCDVXQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCG(SEQ ID NO：224)中所闡述之胺基酸序列，其中X為正白胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP結合VEGF-A。

在某些實施例中，提供一種非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)，其包含選自由以下各項組成之群的胺基酸：GCDVX₁QPYWGCGPDI-D/E-CLS-N/K/X₂-CICHWYNSCG(SEQ ID NO：534)、GCDVX₁QPYWGCGPDI-N/K/X₂-CLS-D/E-CICHWYNSCG(SEQ ID NO：535)、GCNIX₁LPYWGCGRDF-D/E-CME-N/K/X₂-CICQYYQSCG(SEQ ID NO：538)、GCNIX₁LPYWGCGRDF-N/K/X₂-CME-D/E-CICQYYQSCG(SEQ ID NO：539)、GCNIX₁LPFWGCGRDF-D/E-CVS-N/K/X₂-CICQYYQSCG(SEQ ID NO：540) 及GCNIX₁LPFWGCGRDF-N/K/X₂-CVS-D/E-CICQYYQSCG(SEQ ID NO：541)，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCDVX₁QPYWGCGPDI-D/E-CLS-N/K/X₂-CICHWYNSCG(SEQ ID NO：534)中所闡述之胺基酸序列，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCDVXQPYWGCGPDIDCLSKCICHWYNSCG(SEQ ID NO：536)中所闡述之胺基酸序列，其中X為正白胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCDVX₁QPYWGCGPDIDCLSX₂CICHWYNSCG(SEQ ID NO：537)中所闡述之胺基酸序列，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCDVX₁QPYWGCGPDI-N/K/X₂-CLS-D/E-CICHWYNSCG(SEQ ID NO：535)中所闡述之胺基酸序列，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCNIX₁LPYWGCGRDF-D/E-CME-N/K/X₂-CICQYYQSCG(SEQ ID NO：538)中所闡述之胺基酸序列，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCNIXLPYWGCGRDFECMEKCICQYYQSCG(SEQ ID NO：543)中所闡述之胺基酸序列，其中X為正白胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCNIX₁LPYWGCGRDFECMEX₂CICQYYQSCG(SEQ ID NO：544)中所闡述之胺基酸序列，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCNIX₁LPYWGCGRDF-N/K/X₂-CME-D/E-CICQYYQSCG(SEQ ID NO：539)中所闡述之胺基酸序列，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCNIX₁LPFWGCGRDF-D/E-CVS-N/K/X₂-CICQYYQSCG(SEQ ID NO：540)中所闡述之胺基酸序列，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCNIXLPFWGCGRDFECVSKCICQYYQSCG(SEQ ID NO：545)中所闡述之胺基酸序列，其中X為正白胺酸。在根據(或適用於) 以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCNIX₁LPFWGCGRDFECVSX₂CICQYYQSCG(SEQ ID NO：546)中所闡述之胺基酸序列，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP包含GCNIX₁LPFWGCGRDF-N/K/X₂-CVS-D/E-CICQYYQSCG(SEQ ID NO：541)中所闡述之胺基酸序列，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該CKP結合VEGF-A。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，提供一種可結合血管內皮生長因子(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)，其中該CKP包含胱胺酸骨架結構：Z₁C₁L1C₂L2C₃L3C₄L4C₅L5C₆Z₂，其中：Z₁及Z₂為任何胺基酸；L1為環1且具有選自由以下各項組成之群的結構：X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈、X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉及X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀，其中X₁至X₁₀各自為任何胺基酸；L2為環2且具有結構：X₁X₂X₃X₄X₅，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸；L3為環3且具有結構：X₁X₂X₃，其中X₁至X₃各自為任何胺基酸；L4為環4且具有結構：X₁，其中X₁為任何胺基酸；L5為環5且具有結構：X₁X₂X₃X₄X₅，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸；其中參考具有SEQ ID NO：1中所闡述之胺基酸序列的野生型噴瓜胰蛋白酶抑制劑EETI-II蛋白，該CKP具有經改變之二硫鍵連接；其中該經改變之二硫鍵連接為C1-C4、C2-C3及C5-C6；且其中該CKP具有至少20%之α螺旋含量百分比。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，Z₁及Z₂為任何胺基酸、多於一個胺基酸、或非天然胺基酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，L1中之X₁至X₁₀各自為任何胺基酸或非天然胺基酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，L2中之X₁至X₅各自為任何胺基酸或非天然胺基酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，L3中之X₁至X₃各自為任何胺基酸或非天然胺基酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，L4中之X₁為任何胺基酸或非天然胺基酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，L5中之X₁至X₅各自為任何胺基酸或非天然胺基酸。在某些實施例中，該非天然胺基酸選自由以下各項組成之群：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)以500pM或更低之親和力結合VEGF-A。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該結合親和力係經由表面電漿子共振來測定。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，Z₁及/或Z₂為多於一個胺基酸或非天然胺基酸。在某些實施例中，Z₂為兩個胺基酸。在某些實施例中，Z₂為三個胺基酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中，X₁至X₅各自為任何胺基酸，但X₂不為脯胺酸(P)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中，X₁至X₅各自為任何胺基酸，但X₄不為甘胺酸(G)。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)的C末端羧基經修飾(諸如經封端)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)的N末端胺基經修飾(諸如經封端)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)的C末端羧基經封端且該可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)的N末端胺基經修飾(諸如經封端)。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)的C末端羧基經醯胺化。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)的N末端胺基經乙醯化。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)的C末端羧基經醯胺化且該可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)的N末端胺基經乙醯化。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)抑制VEGF-A活性。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，CKP以介於約0.5nM與約1.0nM之間的IC₅₀抑制VEGF-A活性。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該非天然存在之EETI-II骨架蛋白結合人類VEGF-A、小鼠VEGF-A及大鼠VEGF-A。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該非天然存在之CKP與抗體G6.31競爭結合VEGF-A。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，提供一種非天然存在之CKP，其與如以上實施例中任一者之可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)競爭結合VEGF-A。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，可結合VEGF-A上之抗原決定基的非天然存在之CKP，該抗原決定基包含選自由以下各項組成之群的胺基酸殘基中的至少一者：V14、V15、F17、D19、Y21、Q22、Y25、I46、K48、N62、D63、L66、M81、I83、K84、P85、H86、G88、Q89、I91、C104、R105及P106。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該等殘基選自由以下各項組成之群：K48、N62及D63。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該等殘基選自由以下各項組成之群：Y21、Y25及P106。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該等殘基選自由以下各項組成之群：H86及Q89。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該等殘基選自由以下各項組成之群：M81、D19及Q22。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該等殘基選自由以下各項組成之群：F17、M81及I91。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該等殘基選自由以下各項組成之群：V14、F17、D19、Q22、M81及I91。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該等殘基選自由以下各項組成之群：Y25。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之CKP與治療劑結合。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之CKP與標記結合。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該標記選自由以下各項組成之群：放射性同位素、螢光染料及酶。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，提供一種經分離之核酸，其編碼如以上實施例中任一者之可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)。亦提供一種表現載體，其編碼如以上實施例中任一者之核酸分子。亦提供一種細胞，其包含如以上實施例中任一者之表現載體。亦提供一種產生如以上實施例中任一者之可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)的方法，該方法包括培養如以上實施例中任一者之細胞及自細胞培養物中回收可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)。

亦提供一種產生如以上實施例中任一者之可結合VEGF-A 之非天然存在之(CKP)的方法，該方法包括化學合成該可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)。

本文中提供一種組合物，其包含如以上實施例中任一者之可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)及醫藥學上可接受之載劑。

本文中提供一種治療個體之以血管生成及/或血管滲透或滲漏為特徵之眼部疾病的方法，該方法包括向該個體投與有效量之如以上實施例中任一者之可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該眼部疾病為選自由以下各項組成之群的眼內新生血管疾病：增生性視網膜病變、脈絡膜新血管形成(CNV)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病性及其他局部缺血相關性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、馮希伯-林島氏病(von Hippel-Lindau disease)、眼組織胞漿菌病、視網膜靜脈阻塞(RVO，包括視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)及視網膜分枝靜脈阻塞(BRVO))、角膜新血管形成、視網膜新血管形成及早產兒視網膜病變(ROP)。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)或該組合物係經由可植入式裝置投與該個體。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可植入式裝置選自由以下各項組成之群：眼部插入物、緩慢釋放貯庫、眼部插塞/儲器、非生物可降解性眼部植入物或生物可降解性眼部植入物。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，提供一種包含如以上實施例中任一者之可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)的組合物，其用於治療個體之以血管生成及/或血管滲透或滲漏為特徵之眼部疾病。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該眼部疾病為選自由以下各項組成之群的眼內新生血管疾病：增生性視網膜病變、脈絡膜新血管形成(CNV)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病性及其他局部缺血相關性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、視網膜靜脈阻塞(RVO，包括視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)及視網膜分枝靜脈阻塞(BRVO))、角膜新血管形成、視網膜新血管形成及早產兒視網膜病變(ROP)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該組合物係經由可植入式裝置投與該個體。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可植入式裝置選自由以下各項組成之群：眼部插入物、緩慢釋放貯庫、眼部插塞/儲器、非生物可降解性眼部植入物或生物可降解性眼部植入物。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，提供一種包含如以上實施例中任一者之可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)的組合物，其用於治療個體之以血管生成及/或血管滲透或滲漏為特徵之眼部疾病。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該眼部疾病為選自由以下各項組成之群的眼內新生血管疾病：增生性視網膜病變、脈絡膜新血管形成(CNV)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病性及其他局部缺血相關性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、視網膜靜脈阻塞(RVO，包括視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)及視網膜分枝靜脈阻塞(BRVO))、角膜新血管形成、視網膜新血管形成及早產兒視網膜病變(ROP)。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該藥物係經由可植入式裝置投與該個體。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可植入式裝置選自由以下各項組成之群：眼部插入物、緩慢釋放貯庫、眼部插塞/儲器、非生物可降解性眼部植入物或生物可降解性眼部植入物。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)經調配以用於長期作用遞送。

本文中提供一種調配物，其包含如以上實施例中任一者之可結合VEGF-A之非天然存在之(CKP)及PLGA。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該PLGA為PLGA棒。

本文中亦提供一種可結合人類低密度脂蛋白受體相關蛋白6(LRP6)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)，其中該CKP包含胱胺酸骨架結構：Z₁C₁L1C₂L2C₃L3C₄L4C₅L5C₆Z₂；其中：Z₁及Z₂為任何胺基酸； L1為環1且具有選自由以下各項組成之群的結構：X₁X₂X₃X₄X₅X₆、X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇、X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈、X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉及X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀，其中X₁至X₁₀各自為任何胺基酸；L2為環2且具有結構：X₁X₂X₃X₄X₅，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸；L3為環3且具有結構：X₁X₂X₃，其中X₁至X₃各自為任何胺基酸；L4為環4且具有結構：X₁，其中X₁為任何胺基酸；且L5為環5且具有結構：X₁X₂X₃X₄X₅，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L1中：X₁為選自R、V、M、A、G、N、S及E之胺基酸；X₂為選自T、N、S、G、R及A之胺基酸；X₃為選自N、R、H、V、K、S、G、I及Y之胺基酸；X₄為選自R、V、N、I、K、S及T之胺基酸；X₅為選自V、R、K、I、T、S、L及N之胺基酸；且X₆為選自K、G、A、I、R、N、S及V之胺基酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L1中：X₇為選自G、R、K、E、P及T之胺基酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L1中：X₈為選自G、R、K、Q、A及S之胺基酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L1中：X₉為選自R或G之胺基酸。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L1中：X₁₀為選自E、W及G之胺基酸。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L5中：X₁為選自G、S、N、Y、A及R之胺基酸；X₂為選自P、G、S、V、E、R、F及D之胺基酸；X₃為選自N、G、S、E、P、K、H及R之胺基酸；X₄為選自G、R、H、S、Q、V及D之胺基酸；且X₅為選自F、D、N、R、G、Y、S及T之胺基酸。

在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L2中，X₁為K，X₂為Q，X₃為D，X₄為S，且X₅為D。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L3中，X₁為L，X₂為A，且X₃為G。在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，在L4中，X₁為V。

圖1描繪EETI-II胱胺酸結蛋白之結構。

圖2A顯示為了確定EGF_CKP9.54.90是否會破壞VEGF-A(8-109)與KDR之間、VEGF-A(8-109)與Flt-1之間、VEGF-A 165與KDR之間、VEGF-B與Flt-1之間、VEGF-C與Flt-4之間、VEGF-D與Flt-4之間及PIGF-2與FLT-1之間的相互作用而進行之實驗的結果。

圖2B顯示為了確定EGF_CKP9.54.90是否會破壞VEGF-A(8-109)與KDR之間、VEGF-A(8-109)與Flt-1之間、VEGF-A 165與KDR之間、EGF與EGFR之間、PDGF與PDGFR之間、NGF與NGFR之間及IGF與IGFR之間的相互作用而進行之實驗的結果。

圖3顯示為了確定VEGF_CKP9.54.90、VEGF_CKP9.54及VEGF_CKP9.63.12是否抑制胰蛋白酶活性而進行之實驗的結果。

圖4顯示為了確定VEGF_CKP9.54.90及VEGF_CKP9.63.12是否對胰蛋白酶消化具有抗性而進行之實驗的結果。

圖5描繪VEGF_CKP9.54.90之結構、野生型EETI-II之結構，且提供比較結合VEGF之CKP變異體之二硫鍵連接模式與野生型EETI-II之二硫鍵連接模式的示意圖。

圖6描繪VEGF_CKP9.54.90與VEGF-A之複合物的共晶結構。

圖7描繪顯示VEGF_CKP9.54.90、抗體G6.31、及VEGF-A上之Flt-2之結構域2之結合界面的空間填充模型。

圖8描繪顯示VEGF_CKP9.54.90、抗體G6.31、及VEGF-A上之Flt-2之結構域2之結合界面的帶狀圖解模型。

圖9顯示處於VEGF-A與VEGF_CKP9.54.90之間的相互作用表面的VEGF-A上接觸殘基。

圖10顯示貝伐珠單抗Fab、Z結構域、及VEGF-A上之受體阻斷肽v108的結合界面。

圖11提供為了確定VEGF-A中之胺基酸取代突變對VEGF_CKP9.54.90與VEGF-A之結合及對VEGF_CKP9.63.12與VEGFA之結合的影響而進行之實驗的結果。相對於兩個不同的y軸顯示該等實驗結果。

圖12提供為了確定VEGF_CKP9.54.90對大鼠眼中之CNV的影響而進行之實驗的結果。

圖13提供為了確定結合VEGF之CKP變異體的IC₅₀值而進行之實驗的結果。

圖14描繪VEGF_CKP9.54及VEGF_CKP9.63之結構。圖14中亦顯示VEGF_CKP9.63與VEGF-A之複合物之共晶結構的一部分，其顯示VEGF_CKP9.63之環1內的位置8上的殘基可與VEGF-A之Gln22的側鏈形成氫鍵。

圖15顯示為了評估純系9.54-28、9.54、9.54.1-2、9.54.1-36、9.54.1-42、9.54.1-63、9.54.1-90及9.54.1對hVEGF(8-109)之結合親和力而進行之噬菌體競爭ELISA實驗的結果。

圖16A顯示為了評估純系9.63.44-1至9.63.44-7之結合親和力而進行之噬菌體競爭ELISA實驗的結果。

圖16B顯示為了評估純系9.63.44-8至9.63.44-14之結合親和力而進行之噬菌體競爭ELISA實驗的結果。

提供特異性結合人類VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)。此種非天然存在之CKP顯示一或多個以下特徵：抑制VEGF-A活性且IC₅₀介於小於約0.5nM與小於約1.0nM之間；結合人類VEGF-A、小鼠VEGF-A及大鼠VEGF-A；對胰蛋白酶消化具有抗性；二硫鍵連接C1-C4、C2-C3及C5-C6；至少約15%至至少約50%之α螺旋含量；結合VEGF-A上不同於抗體G6.31所結合之抗原決定基的抗原決定基、結合VEGF-A上不同於貝伐珠單抗所結合之抗原決定基的抗原決定基及/或結合VEGF-A上不同於Flt-1所結合之抗原決定基的抗原決定基。

亦提供包含可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽的嵌合分子及結合物、編碼可結合VEGF-A之非天然存在之CKP的核酸、及組合物(諸如醫藥組合物)。亦提供使用可結合VEGF-A之非天然存在之CKP來治療由異常(諸如過度)血管生成及/或異常血管滲透引起之眼部疾病及/或病症(諸如眼部血管增生性疾病及/或病症)的方法。亦提供可結合VEGF-A之非天然存在之CKP在製造用於治療眼部疾病或病症之藥劑方面的用途。

在一相關態樣中，亦提供可結合人類低密度脂蛋白受體相關蛋白6(LRP6)之非天然存在之CKP。

除非另外指示，否則本發明之實施採用細胞生物學、毒理學、分子生物學、生物化學、細胞培養、免疫學、腫瘤學、重組DNA及相關領域中在熟習此項技術者之能力範圍內的標準方法及習知技術。此種技術描述於文獻中且從而可為熟習此項技術者所用。參見例如Alberts,B.等人,「Molecular Biology of the Cell」,第5版,Garland Science,New York,NY,2008；Voet,D.等人,「Fundamentals of Biochemistry：Life at the Molecular Level」,第3版,John Wiley & Sons,Hoboken,NJ,2008；Sambrook,J.等人,「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001；Ausubel,F.等人,「Current Protocols in Molecular Biology」,John Wiley & Sons,New York,1987及週期性更新；Freshney, R.I.,「Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique」,第4版,John Wiley & Sons,Somerset,NJ,2000；及叢書「Methods in Enzymology」,Academic Press,San Diego,CA。

定義

如本文中所使用，「非天然存在」意謂例如包含並非在自然界中發現之胺基酸序列的多肽，或例如包含並非在自然界中發現之核苷酸序列的核酸。本文中所提供之「非天然存在之胱胺酸結肽」或「非天然存在之CKP」(或編碼其之核酸)不具有野生型EETI-II蛋白之胺基酸序列，亦即，GCPRILMRCKQDSDCLAGCVCGPNGFCG(SEQ ID NO：1)，其中環1(L1)為胺基酸序列PRILMR(SEQ ID NO：92)，環2(L2)為胺基酸序列 KQDSD(SEQ ID NO：93)，環3(L3)為胺基酸序列LAG，環4(L4)為胺基酸V，且環5(L5)為胺基酸序列GPNGF(SEQ ID NO：19)。本文中所提供之非天然存在之CKP可藉由基因工程改造方法或藉由化學合成方法來產生。因而，本文中所描述之非天然存在之CKP可為重組的，亦即，由已藉由引入異源核酸或將天然核酸變成對該細胞而言並非天然之形式而加以修飾之細胞或核酸或載體或來源於經如此修飾之細胞的細胞產生。或者，本文中所描述之非天然存在之CKP可經由化學肽合成而產生。

如本文中所使用，術語「胱胺酸結肽」或「CKP」係指長度介於26至50個胺基酸之間的肽，其含有六個保守半胱胺酸殘基，從而形成三個二硫鍵。該等二硫鍵之一可滲透由另兩個二硫鍵與其互連主幹所形成之大環，從而產生有多個環暴露於表面上之特徵性有結拓撲結構。該等環定義為側接該六個保守半胱胺酸殘基且本質上高度可變之胺基酸區域。

如本文中所使用，「胺基酸變化」係指例如在肽序列中添加、缺失或取代至少一個胺基酸(諸如在WT EETI-II肽序列中，以產生非天然存在之CKP；或在非天然存在之CKP中，以產生另一非天然存在之CKP)。

「經分離」之非天然存在之CKP或組合物為自其天然環境組分中鑑別並分離及/或回收之CKP或組合物。其天然環境之污染組分為將會干擾該非天然存在之CKP之診斷性或治療性用途的物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，該非天然存在之CKP或組合物將純化(1)至非天然存在之CKP之超過95重量%，如藉由Lowry方法所測定，且最佳超過99重量%；(2)至足以藉由使用轉杯式定序儀獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度；或(3)至均質(藉由在還原或非還原條件下使用考馬斯藍進行SDS-PAGE或較佳藉由銀染色)。經分離之非天然存在之CKP包括重組細胞內之原位CKP，此係因為該CKP之天然環境中之至少一種組分將不存在。經分離之非天然存在之CKP將藉由至少一個純化步驟來製備。

就本文中所鑑別之多肽序列而言，「胺基酸序列一致性百分比(%)」或「同源性」定義為在將任何保守取代視為序列一致性之一部分的情況下比對序列之後，候選序列中與正在比較之多肽中的胺基酸殘基一致的胺基酸殘基的百分比。出於確定胺基酸序列同一性百分比之目的而進行的比對可用在熟習此項技術者能力範圍內的多種方式，例如使用公開可獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體來達成。熟習此項技術者可確定適用於量測對準之參數，包括在所比較之序列的全長上達成最大程度之對準所需的任何算法。然而，出於本文中之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列同一性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.編寫，且原始碼已與用戶文件一起提交至美國著作權局(Washington D.C.,20559)，登記在美國著作權登記號TXU510087之下。ALIGN-2程式可經由Genentech,Inc.(South San Francisco,California)公開獲得。應對ALIGN-2程式進行編譯以用於UNIX操作系統，較佳數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定並且不變化。

如本文中所使用，術語「抗原決定基」係指能夠由本文中所提供之非天然存在之CKP特異性結合的蛋白質決定子。抗原決定基可在空間構象中包含介於約3至10個之間的胺基酸，此為抗原決定基所獨有的。此等胺基酸在蛋白質內可為線性的(亦即，在胺基酸序列中連續)或其可位於蛋白質的不同的部分中(亦即，在胺基酸序列中不連續)。確定蛋白質內或兩個蛋白質之界面上之胺基酸的空間構象的方法在本領域中為已知的，且包括例如x射線結晶學及2維核磁共振。

術語「二硫鍵結模式(DBP)」、「二硫鍵連接」及「二硫鍵聯模式」係指相對於WT EETI-II蛋白之半胱胺酸連接模式。WT EETI-II蛋白包含六個保守半胱胺酸殘基(編號1至6)，由此形成具有連接C1-C4、C2-C5及C3-C6之三個二硫鍵。該等二硫鍵結模式在拓撲學上為恆定的，意謂僅可藉由解開一或多個二硫鍵，諸如使用氧化還原條件來改變該等二硫鍵。

「個體」、「患者」或「個人」出於治療之目的係指分類為哺乳動物之任何動物，包括人類、馴養動物及農場動物以及動物園動物、競技動物或寵物，諸如狗、馬、貓、牛等。較佳地，該哺乳動物為人類。

如本文中所揭示之非天然存在之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)的「有效量」為足以實現明確陳述之目的之量。「有效量」可憑經驗及藉由已知方法來確定，與所陳述之目的有關。

術語「治療有效量」係指如本文中所揭示之非天然存在之CKP或組合物有效「治療」哺乳動物(諸如人類患者)之疾病或病症的量。在眼部疾病或眼部病症(諸如眼部血管增生性疾病或以過度血管生成為特徵之眼部病症)的情況下，本文中所描述之可結合VEGF-A之非天然存在之CKP(或包含此種非天然存在之結合VEGF-A之CKP的組合物)的治療有效量係指減輕、終止或預防該眼部疾病之至少一種症狀(諸如本文中在其他部分更詳細描述之眼部疾病之症狀或病症)的量。舉例而言，有效量將被視為足以減輕或預防該眼部疾病或眼部病症(諸如眼部血管增生性疾病或以過度血管生成為特徵之眼部病症)之症狀，例如，完全或部份緩解及/或維持眼部疾病(如藉由光同調斷層掃瞄(OCT)所量測)或增加及/或維持最佳矯正視力(諸如超過5個字母，如藉由EDTRS視力表所評估)或減少新血管形成尺寸或新血管滲透性(如藉由眼底螢光血管造影所評估)的量。如本文中所使用之有效量亦將包括足以預防或延遲例如黃斑水腫、滲透(諸如視網膜血管滲透)增強、CNV病變尺寸及視力損失之發展的量。如本文中所使用之有效量亦將包括足以預防或延遲眼部疾病症狀之發展、改變症狀疾病之過程(例如但不限於減緩眼部疾病症狀之進展)或逆轉疾病症狀的量。

如本文中所使用，「治療」為用於獲得有益或所要結果(包括臨床結果)之方法。出於本發明之目的，有益或所要臨床結果包括但不限於以下各項中之一或多者：減輕由眼部疾病引起之一或多種症狀；削弱眼部疾病之程度；穩定眼部疾病(例如，預防或延遲疾病惡化)；預防或延遲疾病擴散(諸如達至周圍眼組織)；預防或延遲眼部疾病復發；延遲或減緩眼部疾病之進展；改善疾病狀態；提供眼部疾病之緩解或消退(部分或總體)；降低治療眼部疾病所需之一或多種其他藥物的劑量；延遲眼部疾病之進展；增加或改良生活品質；及/或預防或延遲視力損失。「治療」亦涵蓋減輕眼部疾病之病理學後果(諸如例如視力損失)。本文中所提供之方法涵蓋此等治療態樣中之任何一或多者。

「病症」為將受益於用本文中所描述之可結合VEGF-A之非天然存在之CKP進行治療的任何病狀。本文中欲治療之VEGF-A相關病症之非限制性實例包括如本文中在其他部分所描述之眼部疾病及病症(諸如眼部血管增生性疾病或以過度血管生成為特徵之眼部病症)。

如本文中所使用，「醫藥學上可接受」或「醫藥學上相容」意謂不會在生物學或其他方面不合需要之物質，例如，該物質可併入投與患者之醫藥組合物中而不會引起任何顯著不合需要之生物學效應或以不利方式與含有其之組合物的任何其他組分相互作用。醫藥學上可接受之載劑或賦形劑較佳滿足所要求之毒理學及製造測試標準及/或包括在由美國食品藥物管理局製定之非活性成分指南上。

術語「偵測」意欲包括確定物質之存在或不存在或者對物質(諸如靶配位體)之量進行定量。因而，該術語係指使用本文中所提供之物質、組合物及方法進行定性及定量測定。一般而言，用於偵測之特定技術對本發明之實施並不重要。

舉例而言，根據本發明之「偵測」可包括：觀測靶配位體(包括但不限於人類低密度脂蛋白受體相關蛋白6(LRP6)多肽或人類血管內皮生長因子A(VEGF-A)多肽)之存在或不存在；靶配位體水準之變化；及/或靶配位體生物功能/活性之變化。在某些實施例中，「偵測」可包括偵測靶配位體之水準(例如，人類LRP6或人類VEGF-A之多肽水準)。偵測可包括對當與對照相比時介於10%與90%之間的任何值或介於30%與60%之間的任何值或超過100%的變化(增加或減少)進行定量。偵測可包括對介於2倍至10倍(包括端點)之間或更大(例如，100倍)的任何值的變化進行定量。

字組「標記」當在本文中使用時係指直接或間接地與非天然存在之CKP結合的可偵測化合物或組合物。標記本身可為本身可檢測的(例如放射性同位素標記或螢光標記)，或在酶標記之情況下，可催化可檢測之受質化合物或組合物的化學變化。

就非天然存在之CKP與靶配位體的結合而言，術語「特異性結合」特定靶配位體或與特定靶配位體「特異性地結合」或對特定靶配位體具有「特異性」意謂該結合可量測地不同於非特異性相互作用。可例如藉由測定分子之結合且與對照分子之結合相比較來量測特異性結合，該對照分子一般為不具有結合活性之具有類似結構之分子。舉例而言，可藉由與類似於標靶之對照分子(例如，過量未標記標靶)競爭來測定特異性結合。在此情況下，若經標記之標靶與探針之結合因過量未標記標靶而受到競爭性抑制，則指示特異性結合。在某些實施例中，該非天然存在之CKP與「非標靶」配位體的結合程度將小於該非天然存在之CKP與其靶配位體(諸如LRP6或VEGF-A)之結合的約10%，如藉由例如螢光活化細胞分選(FACS)分析或放射免疫沈澱(RIA)所測定。在某些實施例中，本發明之非天然存在之CKP特異性結合靶配位體(諸如人類低密度脂蛋白受體相關蛋白6(LRP6)或人類血管內皮生長因子A(VEGF-A))，其中解離常數(Kd)等於或低於100nM、視情況低於10nM、視情況低於1nM、視情況低於0.5nM、視情況低於0.1nM、視情況低於0.01nM或視情況低於0.005nM；如在約4℃、25℃、37℃或45℃之溫度下所量測。

提及「約」某一值或參數在本文中係指本技術領域中之熟習此項技術者容易獲知之相應值的通常誤差範圍。提及「約」某一值或參數在本文中包括(且描述)針對該值或參數本身之態樣。舉例而言，提及「約X」之描述包括「X」之描述。

應理解，本文中所描述之本發明態樣及實施例包括「包含」、「由......組成」及「基本上由......組成」態樣及實施例。

本文中所引用之所有參考文獻(包括專利申請案及公開案)均以全文引用之方式併入在此。

可結合人類血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)

在某些實施例中，本文中提供一種可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)，其中該CKP包含以下胱胺酸骨架結構(亦即，骨架結構I)：Z₁C₁ L1C₂ L2C₃ L3C₄ L4C₅ L5C₆Z₂ (I)，其中：Z₁及Z₂為任何胺基酸； L1為環1且具有選自由以下各項組成之群的結構：X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈、X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉及X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀，其中X₁至X₁₀各自為任何胺基酸；L2為環2且具有結構：X₁X₂X₃X₄X₅，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸或選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺。

L3為環3且具有結構：X₁X₂X₃，其中X₁至X₃各自為任何胺基酸或選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N- 甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺；L4為環4且具有結構：X₁，其中X₁為任何胺基酸或選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺；L5為環5且具有結構：X₁X₂X₃X₄X₅，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸或選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺；且其中該CKP以500pM或更低之親和力結合VEGF-A。

在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端經修飾(諸如經封端)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的N末端經修飾(諸如經封端)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端及N末端皆經修飾(諸如經封端)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端羧基經醯胺化。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的N末端胺經乙醯化。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端羧基經醯胺化且該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的N末端胺經乙醯化。

在某些實施例中，參考具有SEQ ID NO：1中所闡述之胺基酸序列的野生型噴瓜胰蛋白酶抑制劑EETI-II蛋白，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)具有經改變之二硫鍵連接；其中該經改變之二硫鍵連接為C1-C4、C2-C3及C5-C6。

在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)之Z₁及/或Z₂為G。在某些實施例中，Z₁及/或Z₂包含多於一個胺基酸。在某些實施例中，Z₁及/或Z₂包含4個胺基酸。在某些實施例中，Z₁及/或Z₂包含5個胺基酸。在某些實施例中，Z₁及/或Z₂為非天然胺基酸。在某些實施例中，該非天然胺基酸為N-乙醯基甘胺酸或甘胺醯胺。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L1，其中X₃不為I；其中X₅不為M；及/或其中X₆不為R。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L1，其中X₁為選自P、Q、R、T、V、D、N、K、L及X之胺基酸；其中X₂為選自T、D、L、V、I、R、P、N及X之胺基酸；其中X₃為選自T、P、M、L、S、F、R及X之胺基酸；其中X₄為選自R、T、Q、D、W、L、E、S、K及X之胺基酸；其中X₅為選自F、P、V、E、K、L、I及X之胺基酸；其中X₆為選自K、N、F、P、L、Y、T、D、M及X之胺基酸；其中X₇為選自Q、W、H及/X之胺基酸；及/或其中X₈為選自Y、A、G、D、E、W、S及X之胺基酸，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L- 丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L1，其中X₉為選自L、I、V、D、E及X之胺基酸，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L1，其中X₁₀為選自Y、T、M、N、F及X之胺基酸，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺。

在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L5，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸或選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、 3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺，但X₂不為脯胺酸(P)。

在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L5，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸或選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4，4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺，但X₄不為甘胺酸(G)。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L5，其中X₁為選自G、Q、H、R、L及Q之胺基酸；其中X₂為選自P、M、W、Y、F、L及H之胺基酸；其中X₃為選自N、F、H及Y之胺基酸；其中X₄為選自G、Q、D、N、K、H、E及S之胺基酸；及/或其中X₅為選自F、S及T之胺基酸。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L2，其中X₁為K，X₂為Q，X₃為D，X₄為S，且X₅為D。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L3，其中X₁為L，X₂為A，且X₃為G。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L4，其中X₁為V或F。

在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L1，該L1包含結構X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈，其中：X₁為選自P、Q及R之胺基酸；X₂為選自T、L及D之胺基酸；X₃為選自T、M及L之胺基酸；X₄為選自R、Q及D之胺基酸；X₅為選自F、P及V之胺基酸；X₆為選自K及F之胺基酸；X₇為選自Q及W之胺基酸；且X₈為選自Y、G及D之胺基酸。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L1，該L1包含結構X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀，其中X₁為選自Q、R、T及V之胺基酸；X₂為選自T及D之胺基酸；X₃為P；X₄為選自T及W之胺基酸；X₅為選自F、E、P及K之胺基酸；X₆為選自N及P之胺基酸；X₇為選自W及H之胺基酸；X₈為選自A、D、E及W之胺基酸；X₉為選自L及I之胺基酸；且X₁₀為選自Y、T、M及N之胺基酸。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L5，其中X₁為選自G、H及Q之胺基酸；X₂為選自P、M、W及Y之胺基酸；X₃為選自N及Y之胺基酸；X₄為選自G、Q及S之胺基酸；且X₅為選自F及S之胺基酸。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L2，其中X₁為K，X₂為Q，X₃為D，X₄為S，且X₅為D。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L3，其中X₁為L，X₂為A，且X₃為G。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L4，其中X₁為V或 F。

在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L1，該L1具有結構X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈，其中：X₁為選自D、Q、N及K之胺基酸；X₂為選自V、I、R、L及P之胺基酸；X₃為選自L、S、M、T及F之胺基酸；X₄為選自Q、L及E之胺基酸；X₅為P；X₆為選自F、L及Y之胺基酸；X₇為W；且X₈為G。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L5，其中X₃為Y；X₅為S；且其中X₁、X₂及X₄各自為任何胺基酸，但X₁不為G，X₂不為P，X₄不為G，及/或X₅不為F。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L5，其中X₁為選自H、L、R及Q之胺基酸；X₂為選自W、F及Y之胺基酸；X₃為Y；X₄為選自Q、N、K、H及E之胺基酸；且X₅為S。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L2，其中X₁為K，X₂為Q，X₃為D，X₄為S，且X₅為D。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L3，其中X₁為L，X₂為A，且X₃為G。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L4，其中X₁為V或F。

在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L1，該L1包含結構X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀，其中X₁為選自K、Q、L及R之胺基酸；X₂為選自N及D之胺基酸；X₃為選自P及L之胺基酸；X₄為選自L、T、S及K之胺基酸；X₅為選自F、V、I及L之胺基酸；X₆為選自N及D之胺基酸；X₇為W；X₈為選自A及S之胺基酸；X₉為選自L、V、E及D之胺基酸；且X₁₀為選自Y及F之胺基酸。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L5，其中X₁為Q；X₂為選自L、F、M及H之胺基酸；X₃為選自F、Y及H之胺基酸；X₄為選自D、Q、N及K之胺基酸；且X₅為選自S及T之胺基酸。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L2，其中X₁為K，X₂為Q，X₃為D，X₄為S，且X₅為D。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L3，其中X₁為L，X₂為A，且X₃為G。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L4，其中X₁為V或F。

在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L1，該L1包含結構X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈，其中：X₅為P；X₇為W；X₈為G；且其中X₁、X₂、X₃、X₄及X₆各自為任何胺基酸，但X₁不為P，X₂不為R，X₃不為I，及/或X₆不為R。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L1，該L1包含結構X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈，其中X₁為選自N及D之胺基酸；X₂為選自I及V之胺基酸；X₃為選自M及L之胺基酸；X₄為選自L、Q、D及K之胺基酸；X₅為P；X₆為選自F、Y、T、L及M之胺基酸；X₇為W；且X₈為G。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L5，其中X₁為選自Q、H、L及R之胺基酸；X₂為選自Y及W之胺基酸；X₃為Y；X₄為選自Q及N之胺基酸；且X₅為S。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L5，其中X₃為Y；X₅為S；且其中X₁、X₂及X₄各自為任何胺基酸，但：X₁不為G，X₂不為P，及/或X₄不為G。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L2，其中X₁為選自G或E之胺基酸；X₂為選自Q、L、P、R、E及M之胺基酸；X₃為選自S、D及N之胺基酸；X₄為選自F、Y、L、M及I之胺基酸；及/或X₅為選自E、D、Q、L及S之胺基酸。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L3，其中X₁為L，X₂為A，且X₃為G。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L4，其中X₁為V或F。

在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L5，其中X1至X₅各自為任何胺基酸，但X₂不為脯胺酸(P)。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L5，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸，但X₄不為甘胺酸(G)。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L5，其中X₁為除G以外之任何胺基酸；X₂為除P以外之任何胺基酸；X₃為除N以外之任何胺基酸；X₄為除G以外之任何胺基酸；及/或X₅為除F以外之任何胺基酸。

在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L1，該L1包含結構X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈，其中X₁為選自N、D及X之胺基酸；X₂為選自I、V及X之胺基酸；X₃為M或X；X₄為選自L、Q及X之胺基酸；X₅為P或X；X₆為F、Y或X；X₇為W或X；且X₈為G或X，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L3，其中X₁至X₃各自為任何胺基酸或選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺，但X₁不為白胺酸(L)，X₂不為丙胺酸(A)，且X₃不為甘胺酸(G)，其中該非天然胺基酸選自由以下各項組成之群：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L3，其中X₁為選自M、F、L、V及X之胺基酸；X₂為選自S、N、Q、I、Y、E、V、T及X之胺基酸；且X₃為選自D、Q、T、N、E、R及X之胺基酸，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L4，其中X₁為除V以外之任何胺基酸或選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L- 丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L4，其中X₁為I、L或X，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α- 甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L5，其中X₃為Y或選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺；X₅為S或選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺；且其中X₁、X₂及X₄各自為任何胺基酸或選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺，但X₁不為G，X₂不為P，及/或X₄不為G。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L5，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸，但X₂不為脯胺酸(P)。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L5，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸，但X₄不為甘胺酸(G)。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L5，其中X₁為選自Q、H及X之胺基酸；X₂為選自Y、W及X之胺基酸；X₃為Y或X；X₄為選自Q、N或X之胺基酸；X₅為S或X，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4-氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-吲哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺。在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)包含L2，其中X₁為G或X；X₂為R、P或X；X₃為D或X；X₄為F、I或X；且X₅為E、D或X，其中X為選自由以下各項組成之群的非天然胺基酸：PEG₆-L-炔丙基甘胺酸、L-磺酸基酪胺酸、L-正白胺酸、L-1-萘基丙胺酸、L-2-萘基丙胺酸、L-2-氯色胺酸、L-3-氟酪胺酸、L-4-氟苯丙胺酸、γ-苯甲基-L-脯胺酸、γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸、4-OH-L-脯胺酸、4-氟-L-脯胺酸、4-[4-(三氟甲基)-苯甲基]-L-脯胺酸、3,4-二氟-L-苯丙胺酸、3,4-二氯-L-苯丙胺酸、4- 氯-L-苯丙胺酸、3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸、2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸、吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸、3-(1-N-甲基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-乙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(1-N-異丙基吲哚)-L-丙胺酸、3-(5-氮雜-引哚)-L-丙胺酸、4-甲基-L-苯丙胺酸、2-萘基-L-丙胺酸、L-4,4'-聯苯丙胺酸、3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸、3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸、4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸、4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸、苯并噻唑-L-丙胺酸、苯并噻吩-L-丙胺酸、3-異喹啉基-L-丙胺酸、第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)、3-環丁基-L-丙胺酸、環戊基-L-丙胺酸、5,5,5-三氟-L-白胺酸、第三丁基-L-甘胺酸(亦稱為L-第三白胺酸)、L-環戊基甘胺酸、L-環丁基甘胺酸、3,4-羥基-L-苯丙胺酸、3,4-氟-L-苯丙胺酸、3-氟-4-OH-L-苯丙胺酸、2-氯-L-酪胺酸、2-甲基-L-酪胺酸、2-乙基-L-酪胺酸、4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸、D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲甘胺酸、甘胺醯胺、丙三醇甘胺酸酯、乙二醇甘胺酸酯、氧雜環丁烷-3-基甘胺酸酯及甘胺酸嗎啉醯胺。

本文中亦提供一種可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)，其中該CKP包含以下所提供之胱胺酸骨架結構(亦即，骨架結構I)：Z₁C₁ L1C₂ L2C₃ L3C₄ L4C₅ L5C₆Z₂ (I)，其中：Z₁及Z₂為任何胺基酸； L1為環1且具有選自由以下各項組成之群的結構：X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈、X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉及X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀，其中X₁至X₁₀各自為任何胺基酸；L2為環2且具有結構：X₁X₂X₃X₄X₅，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸；L3為環3且具有結構：X₁X₂X₃，其中X₁至X₃各自為任何胺基酸；L4為環4且具有結構：X₁，其中X₁為任何胺基酸；L5為環5且具有結構：X₁X₂X₃X₄X₅，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸；其中，參考具有SEQ ID NO：1中所闡述之胺基酸序列的野生型噴瓜胰蛋白酶抑制劑EETI-II蛋白，該CKP具有經改變之二硫鍵連接；其中該經改變之二硫鍵連接為C1-C4、C2-C3及C5-C6；且其中該CKP具有至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%或至少約50%之α螺旋含量百分比，包括介於此等值之間的任何範圍。

在某些實施例中，該非天然存在之CKP以約500pM或更低之親和力結合VEGF-A。

在某些實施例中，該非天然存在之CKP與VEGF-A之結合親和力係經由例如表面電漿子共振或以下實例中所詳述之其他分析法加以測定。

在某些實施例中，可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)之Z₁及/或Z₂為G。在某些實施例中，Z₁及/或Z₂包含多於一個胺基酸。在某些實施例中，Z₁及/或Z₂包含4個胺基酸。在某些實施例中，Z₁及/或Z₂包含5個胺基酸。在某些實施例中，Z₁及/或Z₂為非天然胺基酸。在某些實施例中，該非天然胺基酸為N-乙醯基甘胺酸或甘胺醯胺。

在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端經修飾(諸如經封端)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的N末端經修飾(諸如經封端)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端及N末端皆經修飾(諸如經封端)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A 之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端羧基經醯胺化。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的N末端胺經乙醯化。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端羧基經醯胺化且該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的N末端胺經乙醯化。

在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之CKP包含L5，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸，但X₂不為脯胺酸(P)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之CKP包含L5，X₁至X₅各自為任何胺基酸，但X₄不為甘胺酸(G)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之CKP抑制VEGF-A活性，且IC₅₀為約0.5nM至約1.0nM。在某些實施例中，抑制程度係經由如以下實例中更詳細描述之細胞IC₅₀分析法加以測定。

在某些實施例中，參考以上骨架結構I，該可結合VEGF-A之非天然存在之CKP包含L1，該L1包含胺基酸序列HMMYDY(SEQ ID NO：231)或K/P/Q/R-K/T/L/D-W/T/M/L-Q/R/D-W/F/P/V-W/K/F-Y/Q/W-M/Y/G/D(SEQ ID NO：15)或E/G/P/Q/R/T/V-T/E/A/D-D/T/I/P-W/V/Q/T/W-Y/F/N/E/P/K-P/E/W/N/P-H/Q/K/W/H-Q/F/E/A/D/W-I/L/H-D/W/P/Y/T/M/N(SEQ ID NO：232)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之CKP包含L4，該L4包含V或F。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之CKP包含L5，該L5包含胺基酸序列G/E/Y/Q/H-P/M/W/Y-N/Y/W-G/D/T/Q/R/S-F/A/E/S(SEQ ID NO：20)或SWWPSL(SEQ ID NO：237)。

在某些實施例中，參考以上骨架結構I，該可結合VEGF-A之非天然存在之CKP包含L1，該L1包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：8-14及225-230。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之CKP包含L4，該L4包含V或F。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之CKP進一步包含L5，該L5包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO 15-18及233-238。SEQ ID NO8-18、225-230及233-238之胺基酸序列提供於以下表1中。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含SEQ ID NO：21-17及239-244中任一者之胺基酸序列。SEQ ID NO：21-17及239-244之胺基酸序列提供於以下表2中。

在某些實施例中，參考以上骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含胺基酸序列Q/H/E/N/D-L/V/R/P/I-M/F/L-Q/E/R/L-P-F/A/L/S-W-G(SEQ ID NO：358)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含胺基酸序列HWYQS(SEQ ID NO：17)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO33、36及245-253。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含胺基酸序列HWYQS(SEQ ID NO：17)。SEQ ID NO 33、36及245-253之胺基酸序列提供於以下表3中：

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含SEQ ID NO：265-275中任一者之胺基酸序列。SEQ ID NO：265-275之胺基酸序列提供於以下表4中。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L1，該L1包含胺基酸序列QLMQPFWG(SEQ ID NO：10)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L5，該L5包含胺基酸序列R/H-W-Y-N/Q/H-S(SEQ ID NO：359)。

在某些實施例中，參考以上骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L1，該L1包含胺基酸序列QLMQPFWG(SEQ ID NO：10)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L5，該L5包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：HWYQS(SEQ ID NO：17)、RWYHS(SEQ ID NO：43)及RWYNS(SEQ ID NO：133)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：23、276及278。SEQ ID NO 23、276及278提供於以下表5中。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含胺基酸序列Q/D/K/N/A/R/H-L/V/I/R/P/V/-M/L/S/T/F-Q/E/L/H-P-F/L/M/Y/S-W-G(SEQ ID NO：40)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含胺基酸序列H/L/R/Q/-W/F/Y-Y-Q/N/K/H/D/E-S(SEQ ID NO：360)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：28-39及254-261。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：17、41-46、133及262-264。SEQ ID NO：17、28-39、41-46、133及254-264之胺基酸序列提供於以下表6中：

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：47-59及279-286。SEQ ID NO：47-59及279-286之胺基酸序列提供於以下表7中。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含胺基酸序列Q/D/K/W/E/L/R-D/N-P/R/L/T-T/S/L/K-F/V/L/I-N/D-W-A/S/G-L/V/E/T/Q/D-F/Y(SEQ ID NO：70)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含胺基酸序列Q/R-M/L/F/H-Y/F/H-D/Q/N/K-S/T(SEQ ID NO：80)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：60-69及287-291。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：16、71-79、274及292。SEQ ID NO：16、60-69、71-79、274及287-292之胺基酸序列提供於以下表8中。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：81-91及293-297。SEQ ID NO：81-91及293-297之胺基酸序列提供於以下表9中。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含胺基酸序列NIMLPFWG(SEQ ID NO：33)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列K/G/Q/S/N-Q/L/P/A/V/T/R/W/K/G/Y-D/S/E/N-S/F/Y/L/F/Q/M-D/E/N/A/L/F/H/Q(SEQ ID NO：98)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含胺基酸序列QYYQS(SEQ ID NO：45)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含胺基酸序列NIMLPFWG(SEQ ID NO：33)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：94-97及298-309。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含胺基酸序列QYYQS(SEQ ID NO：45)。SEQ ID NO：94-97及298-309之胺基酸序列提供於以下表10中。

表10

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：99-102及310-321。SEQ ID NO：99-102及310-321之胺基酸序列提供於以下表11中。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含胺基酸序列N-I-M/L-L/S/T/Q/N/E/D-P-F/Y/S-WG(SEQ ID NO：454)。在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含胺基酸序列NIMLPFWG(SEQ ID NO：33)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列GRDFE(SEQ ID NO：97)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列L/V/M/F-A/Q/E/S/N/Y/I/T-G/Q/R/D/T/N/E。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V或I。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含胺基酸序列QYYQS(SEQ ID NO：45)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：NIMLPFWG(SEQ ID NO：33)、NILLPFWG(SEQ ID NO：396)、NILLPYWG(SEQ ID NO：397)、NIMSPFWG(SEQ ID NO：398)、NIMTPFWG(SEQ ID NO：399)、NIMQPFWG(SEQ ID NO：400)、NIMNPFWG(SEQ ID NO：401)、NIMEPFWG(SEQ ID NO：402)、NIMDPFWG(SEQ ID NO：403)、NIMLPSWG(SEQ ID NO：414)及NIMLPYWG(SEQ ID NO：141)。在某些實施例中，參考骨架結構V或I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含胺基酸序列NIMLPFWG(SEQ ID NO：33)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列GRDFE(SEQ ID NO：97)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：LQQ、VER、MSD、MNQ、MQT、VYQ、FIN、VSQ、VTE、FYE、MEQ及VYR。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸I。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含胺基酸序列QYYQS(SEQ ID NO：45)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：103-114。SEQ ID NO：103-114之胺基酸序列提供於以下表12中。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含胺基酸序列DVMQPYWG(SEQ ID NO：35)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列K/G/D/A/E-Q/E/R/V/P/D/M/G/N/L/A/F-D/N/Y/S-S/F/L/I/M/Y/V/N/E-D/L/Q/S/E/T/L/A/N(SEQ ID NO：121)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含胺基酸序列HWYNS(SEQ ID NO：46)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含胺基酸序列DVMQPYWG(SEQ ID NO：35)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：117-120、211及322-339。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含胺基酸序列HWYNS(SEQ ID NO：46)。SEQ ID NO：117-120、211及322-339之胺基酸序列提供於以下表13中。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：122-126及340-357。SEQ ID NO：122-126及340-357之胺基酸序列提供於以下表14中。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含胺基酸序列D-V-M/L-Q/K/D-P-Y/M/T/L-W-G(SEQ ID NO：130)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含胺基酸序列H/L/Q/R-W-Y-N-S(SEQ ID NO：134)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含選自SEQ ID NO：127-129之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含 L4，該L4包含胺基酸V。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：131-133。SEQ ID NO：127-129及131-133之胺基酸序列提供於以下表15中：

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：135-137。SEQ ID NO：135-127之胺基酸序列提供於以下表16中：

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含胺基酸序列DVMQPYWG(SEQ ID NO：35)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列GPDID(SEQ ID NO：118)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列L/F-A/V/S-G/R/N。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含選自V、I及L之胺基酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含胺基酸序列HWYNS(SEQ ID NO：46)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含胺基酸序列DVMQPYWG(SEQ ID NO：35)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列GPDID(SEQ ID NO：118)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含I3，該L3包含胺基酸序列 FVR及LSN。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含選自V、I及L之胺基酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含胺基酸序列HWYNS(SEQ ID NO：46)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVMQPYWGCGPDIDCFVRCLCHWYNSCG(SEQ ID NO：139)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVMQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCG(SEQ ID NO：140)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含本文中所揭示之非天然存在之結合VEGF-A之CKP中任一者的L1、L2、L3、L4及/或L5。因而，在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含L1，該L1包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：8-14、28-39、60-69、127-129、141、225-230、245-261、287-291、396-403及414。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L2，該L2包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：93-97、117-120、211、298-309及322-339。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L3，該L3包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：LAG、LQQ、VER、MSD、MNQ、MQT、VYQ、FIN、VSQ、VTE、FYE、MEQ及VYR、FVR及LSN。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V、F、I或L。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP進一步包含L5，該L5包含選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：15-18、41-46、71-79、131-133、233-238、262-264及292。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端經修飾(諸如經封端)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的N末端經修飾(諸如經封端)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端及N末端皆經修飾(諸如經封端)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端羧基經醯胺化。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的N末端胺經乙醯化。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端羧基經醯胺化且該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的N末端胺經乙醯化。

在某些實施例中，至少一個胺基酸自本文中所提供之結合VEGF-A之CKP中缺失。在某些實施例中，至少一個胺基酸自N末端缺失。在某些實施例中，至少一個胺基酸自C末端缺失。在某些實施例中，至少一個胺基酸自N末端及C末端缺失。在某些實施例中，至少一個內部胺基酸缺失。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列CNIMLPYWGCGRDFECLAGCVCQYYQSC(SEQ ID NO：217)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端經修飾(諸如經封端)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的N末端經修飾(諸如經封端)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端及N末端皆經修飾(諸如經封端)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端羧基經醯胺化。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端羧基經醯胺化且該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的N末端胺經乙醯化。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端羧基經醯胺化且該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的N末端胺經乙醯化。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含至少一個胺基酸添加。在某些實施例中，至少一個胺基酸添加至N末端。在某些實施例中，至少一個胺基酸添加至C末端。在某些實施例中，至少一個胺基酸添加至N末端及C末端。

在某些實施例中，兩個胺基酸添加至本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的N末端。在某些實施例中，兩個胺基酸添加至GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：102)中所闡述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的N末端。在某些實施例中，添加至SEQ ID NO：102之N末端的兩個胺基酸為F/I/G/T/V/L-H/A/S/R。在某些實施例中，添加至SEQ ID NO：102之N末端的兩個胺基酸選自由以下各項組成之群：FH、IA、GS、TR、VH及LS。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCGFH(SEQ ID NO：379)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCGIA(SEQ ID NO：380)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCGGS(SEQ ID NO：381)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCGTR(SEQ ID NO：382)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCGVH(SEQ ID NO：383)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCGLS(SEQ ID NO：384)中所闡述之胺基酸序列。

在某些實施例中，兩個胺基酸添加至GCDVLQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCG(SEQ ID NO：386)中所闡述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的N末端。在某些實施例中，添加至SEQ ID NO：102之N末端的兩個胺基酸為R/W/P/D/Q/E/S-T/K/E/F/Q/L/S。在某些實施例中，添加至SEQ ID NO：102之N末端的兩個胺基酸選自由以下各項組成之群：RT、WK、PL、DE、QF、EQ、PT、RL及SL。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCDVLQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCGRT(SEQ ID NO：387)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCDVLQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCGWK(SEQ ID NO：388)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCDVLQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCGPL(SEQ ID NO：389)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCDV LQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCGDE(SEQ ID NO：390)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCDVLQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCGQF(SEQ ID NO：391)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCDVLQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCGEQ(SEQ ID NO：392)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCDVLQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCGPT(SEQ ID NO：393)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCDVLQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCGRL(SEQ ID NO：394)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCDVLQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCGSL(SEQ ID NO：395)中所闡述之胺基酸序列。

在某些實施例中，三個胺基酸添加至本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的N末端。在某些實施例中，兩個胺基酸添加至GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：102)中所闡述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的N末端。在某些實施例中，添加至SEQ ID NO：102之N末端的三個胺基酸為P/N/T/D/E/Y/W-L/Y/F/H/D/P-I/Q/V/K/S/Y/H。在某些實施例中，添加至SEQ ID NO：102之N末端的三個胺基酸選自由以下各項組成之群：PLI、NYQ、PLQ、TFQ、DLV、EHK、YLS、WDY、WPH及PHQ。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCGPLI(SEQ ID NO：369)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCGNYQ(SEQ ID NO：370)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCGPLQ(SEQ ID NO：371)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCGTFQ(SEQ ID NO：372)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCNIMLPFWG CGRDFECLAGCVCQYYQSCGDLV(SEQ ID NO：373)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCGEHK(SEQ ID NO：374)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCGYLS(SEQ ID NO：375)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCGWDY(SEQ ID NO：376)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCGWPH(SEQ ID NO：377)中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCGPHQ(SEQ ID NO：378)中所闡述之胺基酸序列。

在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端經修飾(諸如經封端)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的N末端經修飾(諸如經封端)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端及N末端皆經修飾(諸如經封端)。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端羧基經醯胺化。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端羧基經醯胺化且該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的N末端胺經乙醯化。在某些實施例中，該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的C末端羧基經醯胺化且該可結合VEGF-A之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)的N末端胺經乙醯化。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP為本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的變異體。在某些實施例中，此種變異體在SEQ ID NO：8-14、28-39、60-69、127-129、141、225-230、245-261、287-291、396-403及414、SEQ ID NO：93-97、117-120、211、298-309及322-339中所闡述之序列、胺基酸序列LAG、LQQ、VER、MSD、MNQ、MQT、VYQ、FIN、VSQ、VTE、FYE、MEQ及VYR、FVR及LSN及/或 15-18、41-46、71-79、131-133、233-238、262-264及292中之一或多者中包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個胺基酸取代。在某些實施例中，胺基酸取代為保守胺基酸取代。在某些實施例中，胺基酸取代實質上不降低該非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合人類VEGF-A的能力。舉例而言，可進行實質上不降低VEGF-A結合親和力的保守變化(例如，如本文中所提供之保守取代)。可使用以下實例中所描述之方法來評估非天然存在之結合VEGF-A之CKP之變異體的結合親和力。

保守取代示於以下表17中「保守取代」之表頭下。更實質性變化提供於表17中「例示性取代」之表頭下，且如以下參考胺基酸側鏈類別進一步描述。可將胺基酸取代引入非天然存在之結合VEGF-A之CKP的變異體中且針對所要活性(例如，保持/改良之VEGF-A結合)篩選產物。

非保守取代將使得有必要將此等類別之一的成員與另一類別交換。

例示性取代變異體為親和力成熟型非天然存在之結合VEGF-A之CKP，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文中所描述之彼等親和力成熟技術)便利地產生。簡而言之，改變(亦即，添加、缺失或取代)L1、L2、L3、L4及/或L5中之一或多個殘基，且將變異之結合VEGF-A之CKP呈現於噬菌體上並且針對VEGF-A結合親和力進行篩選。在親和力成熟之某些實施例中，藉由多種方法(例如，易出錯PCR、環改組或寡核苷酸定向突變誘發)中之任一種將多樣性引入針對成熟所選擇之可變基因中。隨後建立第二文庫。隨後篩選該文庫以鑑別對VEGF-A具有所要親和力的任何非天然存在之CKP變異體。在某些實施例中，引入多樣性包括環定向方法，其中對L1、L2、L3、L4及/或L5中之若干殘基(例如，每次約5個、約4-6個或約6-10個殘基)進行隨機化。可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來鑑別參與結合靶配位體之L1、L2、L3、L4及/或L5殘基。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGQSFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：215)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：216)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAKCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：542)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECMSDCICQYYQSCG(SEQ ID NO：363)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECMSDCICQYYQSCG(SEQ ID NO：364)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECMNQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：222)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECFYECICQYYQSCG(SEQ ID NO：223)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：142)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNILLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：405)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNILLPYWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：406)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMSPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：407)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMTPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：408)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMQPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：409)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMNPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：410)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMEPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：411)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMDPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：412)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPSWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：415)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECLSGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：421)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECLTGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：422)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECLEGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：423)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCLCQYYQSCG(SEQ ID NO：424)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCICQYYQSCG(SEQ ID NO：425)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCS(SEQ ID NO：431)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNILLPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO： 435)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVLQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCG(SEQ ID NO：386)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNILLPFWGCGRDFECVSQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：547)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNILQPFWGCGRDFECVSQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：548)。

在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的序列中的一或多個胺基酸經非天然胺基酸取代。在某些實施例中，該一或多個胺基酸經相同的非天然胺基酸取代。在某些實施例中，該一或多個胺基酸各自經不同的非天然胺基酸取代。在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP在L1、L2、L3、L4及/或L5中之任何胺基酸位置上包含非天然胺基酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：216)，其中N末端甘胺酸以C(=O)-氧雜環丁烷-3-基封端。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAXCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：216，其中X為鳥胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列XCNIMLPYWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：361)，其中X為N-乙醯基甘胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPXWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：362)，其中X為磺酸基酪胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPXWGCGRDFECLAGCVCQYY QSCG(SEQ ID NO：362)，其中X為3,4-二氟-L-苯丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPXWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：362)，其中X為3,4-二氯-L-苯丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPXWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：362)，其中X為4-氯-L-苯丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPXWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：362)，其中X為3-F,4-Cl-L-苯丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPXWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：362)，其中X為2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPXWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：362)，其中X為吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIXLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：218)，其中X為正白胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPFXGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：219)，其中X為1-萘基丙胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPFXGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：219)，其中X為2-萘基丙胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列XCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：221)，其中X為PEG6-炔丙基甘胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIXLPYWGCGRDFECMSDCICQYYQSCG(SEQ ID NO：365)，其中X為正白胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIXLPFWGCGRDFECMSDCICQYYQSCG(SEQ ID NO：144)，其中X為正白胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIXLPFWGCGRDFECVSQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：145)，其中X為正白胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIX₁LPFWGCGRDF-D/E-CVS-N/K/X_2-CICQYYQSCG(SEQ ID NO：540)，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIXLPFWVGCGRDFECVSKCICQYYQSCG(SEQ ID NO：545)，其中X為正白胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIX₁LPFWGCGRDFECVSX₂CICQYYQSCG(SEQ ID NO：546)，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIX₁LPFWGCGRDF-N/K/X₂-CVS-D/E-CICQYYQSCG(SEQ ID NO：541)，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIXLPFWGCGRDFKCVS-D/E-CICQYYQSCG(SEQ ID NO：561，在本文中X為正白胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列CNIXLPFWGCGRDFKCVSDCICQYYQSCG(SEQ ID NO：562，在本文中X為正白胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列CNIXLPFWGCGRDFKCVSECICQYYQSCG(SEQ ID NO：563，在本文中X為正白胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIX₁LPFWGCGRDFX₂CVS-D/E-CICQYYQSCG(SEQ ID NO：564，在本文中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIX₁LPFWGCGRDFX₂CVSDCICQYYQSCG(SEQ ID NO：565，在本文中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIX₁ LPFWGCGRDFX₂CVSECICQYYQSCG(SEQ ID NO：566，在本文中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIXLPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：146)，其中X為正白胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIX₁LPYWGCGRDF-D/E-CME-N/K/X_2-CICQYYQSCG(SEQ ID NO：538)，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIXLPYWGCGRDFECMEKCICQYYQSCG(SEQ ID NO：543)，其中X為正白胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIX₁LPYWGCGRDFECMEX₂CICQYYQSCG(SEQ ID NO：544)，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIX₁LPYWGCGRDF-N/K/X₂-CME-D/E_-CICQYYQSCG(SEQ ID NO：539)，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIXLPYWGCGRDFKCME-D/E-CICQYYQSCG(SEQ ID NO：555)，其中X為正白胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIXLPYWGCGRDFKCMEDCICQYYQSCG(SEQ ID NO：556)，其中X為正白胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIXLPYWGCGRDFKCMEECICQYYQSCG(SEQ ID NO：557)，其中X為正白胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIX₁LPYWGCGRDFX₂CME-D/E-CICQYYQSCG(SEQ ID NO：558)，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIX₁LPYWGCGRDFX₂CMEDCICQYYQSCG(SEQ ID NO：559)，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIX₁LPYWGCGRDFX₂CMEECICQYYQSCG(SEQ I D NO：560)，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVX₁QPYWGCGPDI-D/E-CLS-N/K/X₂-CICHWYNSCG(SEQ ID NO：534)，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVXQPYWGCGPDIDCLSKCICHWYNSCG(SEQ ID NO：536)，其中X為正白胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVX₁QPYWGCGPDIDCLSX₂CICHWYNSCG(SEQ ID NO：537)，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVX₁QPYWGCGPDI-N/K/X₂-CLS-D/E-CICHWYNSCG(SEQ ID NO：535)，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVXQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCG(SEQ ID NO：224)，其中X為正白胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVXQPYWGCGPDIKCLS-D/E-CICHWYNSCG(SEQ ID NO：549)，其中X為正白胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVXQPYWGCGPDIKCLSDCICHWYNSCG(SEQ ID NO：550)，其中X為正白胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVXQPYWGCGPDIKCLSECICHWYNSCG(SEQ ID NO：551)，其中X為正白胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVX₁QPYWGCGPDIX₂CLS-D/E-CICHWYNSCG(SEQ ID NO：552)，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVX₁QPYWGCGPDIX₂CLSDCICHWYNSCG(SEQ ID NO：553)，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVX₁QPYWGCGPDIX₂CLSECICHWYNSCG(SEQ ID NO：554)，其中X₁為正白胺酸且X₂為鳥胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLXFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：413)，其中X為γ-苯甲基-L-脯胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLXFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：413)，其中X為γ-(4-氟-苯甲基)-L-脯胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLXFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：413)，其中X為4-OH-L-脯胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLXFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：413)，其中X為4-氟-L-脯胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLXFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：413)，其中X為4-[4-(三氟甲基)苯甲基]-L-脯胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYXGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：417)，其中X為N-甲基吲哚。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYXGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：417)，其中X為N-乙基吲哚。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYXGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：417)，其中X為N-異丙基吲哚。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYXGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：417)，其中X為5-氮雜-吲哚。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDXECLAGCVCQYYQSCG(SED ID NO：419)，其中X為4-甲基-L-苯丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDXECLAGCVCQYYQSCG(SED ID NO：419)，其中X為2-萘基-L-丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDXECLAGCVCQYYQSCG(SED ID NO：419)，其中X為2-喹啉基-丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDXECLAGCVCQYYQSCG(SED ID NO：419)，其中X為4,4'-聯苯-L-丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDXECLAGCVCQYYQSCG(SED ID NO：419)，其中X為3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDXECLAGCVCQYYQSCG(SED ID NO：419)，其中X為3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDXECLAGCVCQYYQSCG(SED ID NO：419)，其中X為3-(2-喹喏啉基)-L-丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDXECLAGCVCQYYQSCG(SED ID NO：419)，其中X為4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDXECLAGCVCQYYQSCG(SED ID NO：419)，其中X為4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDXECLAGCVCQYYQSCG(SED ID NO：419)，其中X為苯并噻唑-L-丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDXECLAGCVCQYYQSCG(SED ID NO：419)，其中X為苯并噻吩-L-丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDXECLAGCVCQYYQSCG(SED ID NO：419)，其中X為3-(3-異喹啉基)-L-丙胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECXAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：420)，其中X為第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECXAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：420)，其中X為3-環丁基-L-丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECXAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：420)，其中X為3-環戊基-L-丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECXAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：420)，其中X為5,5,5-三氟-L-白胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCXCQYYQSCG(SEQ ID NO：426)，其中X為L-第三白胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCXCQYYQSCG(SEQ ID NO：426)，其中X為第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCXCQYYQSCG(SEQ ID NO：426)，其中X為L-環戊基甘胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCXCQYYQSCG(SEQ ID NO：426)，其中X為3-環戊基-L-丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCXCQYYQSCG(SEQ ID NO：426)，其中X為L-環丁基-L-甘胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCXCQYYQSCG(SEQ ID NO：426)，其中X為3-環丁基-L-丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCXCQYYQSCG(SEQ ID NO：426)，其中X為5,5,5-三氟-L-白胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCVCQXYQSCG(SEQ ID NO：428)，其中X為2-吡啶酮。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCVCQXYQSCG(SEQ ID NO：428)，其中X為3,4-羥基-L-苯丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCVCQXYQSCG(SEQ ID NO：428)，其中X為3,4-氟苯丙胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCVCQXYQSCG(SEQ ID NO：428)，其中X為3-氟,4-OH-L-苯丙胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCVCQYXQSCG(SEQ ID NO：430)，其中X為2-氯-L-酪胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCVCQYXQSCG(SEQ ID NO：430)，其中X為2-甲基-L-酪胺酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCVCQYXQSCG(SEQ ID NO：430)，其中X為2-乙基-L-酪胺酸或4-(萘-1-酚)-L-丙胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPYWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCX(SEQ ID NO：432)，其中X為D-絲胺酸、L-β-高絲胺酸、L-β-丙胺酸、N-α-甲基甘胺酸、羧基末端轉化成三醇酯之甘胺酸、羧基末端轉化成二醇酯之甘胺酸、羧基末端轉化成氧雜環丁醇酯之甘胺酸或甘胺酸嗎啉醯胺。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIXQPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：436)，其中X為正白胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIX₁LPYWGCGRDFECX₂EQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：437)。在某些實施例中，X₁及X₂為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁及X₂為不同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁及X₂為正白胺酸。在某些實施例中，X₁為正白胺酸且X₂為3-環丁基-L-丙胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIXLPYWGCGRDFECLEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：438)，其中X為正白胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIX₁LPYWGCGRDFECX₂EQCX₃CQYYQSCG(SEQ ID NO：439)。在某些實施例中，X₁、X₂及/或X₃為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁、X₂及/或X₃不為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中， X₁為正白胺酸，X₂為3-環丁基-L-丙胺酸，且X₃為環丁基-L-甘胺酸。在某些實施例中，X₁為正白胺酸，X₂為3-環丁基-L-丙胺酸，且X₃為3-環丁基-L-丙胺酸。在某些實施例中，X₁為正白胺酸，X₂為3-環丁基-L-丙胺酸，且X₃為正白胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列CNIX₁QPYWGCGRDFECX₂EQCX₃CQYYQSCG(SEQ ID NO：440)。在某些實施例中，X₁、X₂及/或X₃為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁、X₂及/或X₃不為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁為正白胺酸，X₂為3-環丁基-L-丙胺酸，且X₃為環丁基-L-甘胺酸。在某些實施例中，X₁為正白胺酸，X₂為3-環丁基-L-丙胺酸，且X₃為3-環丁基-L-丙胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNILLPYWGCGRDFECXEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：441)，其中X為3-環丁基-L-丙胺酸或第三丁基-L-丙胺酸(亦稱為L-新戊基甘胺酸)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNILLPYWGCGRDFECMEQCXCQYYQSCG(SEQ ID NO：442)，其中X為環丁基-L-甘胺酸或3-環丁基-L-丙胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列X₁CNIX₂LPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCX₃(SEQ ID NO：443)。在某些實施例中，X₁、X₂及/或X₃為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁、X₂及/或X₃不為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁為N-乙醯基甘胺酸，X₂為正白胺酸，且X₃為甘胺醯胺。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列X₁CNILLPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCX₂(SEQ ID NO：444)。在某些實施例中，X₁及X₂為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁及X₂為不同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁為N-乙醯基甘胺酸且X₂為甘胺醯胺。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列X₁CNILQPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCX₂(SEQ ID NO：445)。在某些實施例中，X₁及X₂為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁及X₂為不同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁為N-乙醯基甘胺酸且X₂為甘胺醯胺。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列X₁CNILQPYWGCGRDFECLEQCICQYYQSCX₂(SEQ ID NO：446)。在某些實施例中，X₁及X₂為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁及X₂為不同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁為N-乙醯基甘胺酸且X₂為甘胺醯胺。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVLQPYWGCGPDIDCXSNCICHWYNSCG(SEQ ID NO：447)，其中X為3-環丁基-L-丙胺酸或第三丁基-L-丙胺酸(L-新戊基甘胺酸)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVLQPYWGCGPDIDCLSNCXCHWYNSCG(SEQ ID NO：448)，其中X為環丁基-L-甘胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVX₁QPYWGCGPDIDCX₂SNC2X₃CHWYNSCG(SEQ ID NO：449)。在某些實施例中，X₁、X₂及/或X₃為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁、X₂及/或X₃不為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁為正白胺酸，X₂為3-環丁基-L-丙胺酸，且X₃為環丁基-L-甘胺酸。在某些實施例中，X₁為正白胺酸，X₂為3-環丁基-L-丙胺酸，且X₃為3-環丁基-L-丙胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVLQPYWGCGPDIDCX₁SNC2X₂CHWYNSCG(SEQ ID NO：450)。在某些實施例中，X₁及X₂為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁及X₂為不同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁為3-環丁基-L-丙胺酸，且X₂為環丁基-L-甘胺酸。在某些實施例中，X₁為3-環丁基-L-丙胺酸，且X₂為3-環丁基-L-丙胺酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列X₁CDVLQPYWGCGPDIDCX₂SNC2X₃CHWYNSCX₄(SEQ ID NO：451)。在某些實施例中，X₁、X₂、X₃及/或X₄為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁、X₂、X₃及/或X₄不為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁為N-乙醯基甘胺酸，X₂為3-環丁基-L-丙胺酸，X₃為環丁基-L-甘胺酸，且X₄為甘胺醯胺。在某些實施例中，X₁為乙醯基甘胺酸，X₂為環丁基-L-丙胺酸，X₃為環丁基-L-丙胺酸，且X₄為甘胺醯胺。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列X₁CDVX₂QPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCX₃(SEQ ID NO：452)。在某些實施例中，X₁、X₂及/或X₃為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁、X₂及/或X₃不為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁為N-乙醯基甘胺酸，X₂為正白胺酸，且X₃為甘胺醯胺。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列X₁CDVLQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCX₂(SEQ ID NO：453)。在某些實施例中，X₁及X₂為相同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁及X₂為不同的非天然胺基酸。在某些實施例中，X₁為N-乙醯基甘胺酸且X₂為甘胺醯胺。

結構特徵

在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的結構具有不同於WT EETI-II蛋白，亦即，不同於WT EETI-II所特有之C1-C4、C2-C5及C3-C6二硫鍵模式的二硫鍵連接。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP具有C1-C4、C2-C3及C5-C6之二硫鍵連接。確定例如非天然存在之結合VEGF-A之CKP的二硫鍵連接的方法包括例如藉由解出並分析非天然存在之結合VEGF-A之CKP與VEGF-A之複合物的共晶結構、在部分還原烷基化後經由質譜或在蛋白水解消化後經由質譜、如Sampoli等人,(2000)Proteins Struct Funct Gen.40,168-174中所描述進行結構計算等。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP具有至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%或至少約50%之α螺旋含量，包括介於此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP的至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個或至少18個胺基酸形成該α螺旋。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP具有C1-C4、C2-C3及C5-C6之二硫鍵連接及至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%或至少約50%之α螺旋含量，包括介於此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，藉由例如圓二色性(CD)、旋光色散(ORD)、核磁共振(NMR)、藉由解出並分析非天然存在之結合VEGF-A之CKP與VEGF-A之複合物的共晶結構、在部分還原烷基化後經由質譜或在蛋白水解消化後經由質譜來測定該非天然存在之結合VEGF-A之CKP的α螺旋含量。

在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP與第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP競爭結合VEGF-A，其中參考骨架結構I，該第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列NIMLPFWG(SEQ ID NO：33)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列QYYQS(SEQ ID NO：45)。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP與第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP競爭結合VEGF-A，其中該第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCKQDSDCLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：52)。

在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A上由第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP所結合之同一抗原決定基，其中參考骨架結構I，該第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列NIMLPFWG(SEQ ID NO：33)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列QYYQS(SEQ ID NO：45)。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A上由第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP所結合之同一抗原決定基，其中該第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCKQDSDCLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：52)。

在某些實施例中，本文中所提供之非天然之結合VEGF-A之CKP與第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP競爭結合VEGF-A，其中參考骨架結構I，該第二結合VEGF-A之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列NIMLPFWG(SEQ ID NO：33)；L2，其包含胺基酸序列GRDFE(SEQ ID NO：97)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列QYYQS(SEQ ID NO：45)。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP與第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP競爭結合VEGF-A，其中該第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：102)。

在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A上由第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP所結合之同一抗原決定基，其中參考骨架結構I，該第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列NIMLPFWG(SEQ ID NO：33)；L2，其包含胺基酸序列GRDFE(SEQ ID NO：97)；L3，其包含胺基酸序列 LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列QYYQS(SEQ ID NO：45)。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A上由第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP所結合之同一抗原決定基，其中該第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：102)。

在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP與第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP競爭結合VEGF-A，其中參考骨架結構I，該第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列DVMQPYWG(SEQ ID NO：35)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列HWYNS(SEQ ID NO：46)。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP與第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP競爭結合VEGF-A，其中該第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVMQPYWGCKQDSDCLAGCVCHWYNSCG(SEQ ID NO：55)。

在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A上由第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP所結合之同一抗原決定基，其中參考骨架結構I，該第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列DVMQPYWG(SEQ ID NO：35)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列HWYNS(SEQ ID NO：46)。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A上由第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP所結合之同一抗原決定基，其中該第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVMQPYWGCKQDSDCLAGCVCHWYNSCG(SEQ ID NO：55)。

在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP蛋白與第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP競爭結合VEGF-A，其中參考骨架結構I，該第二結合VEGF-A之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列DVMQPYWG(SEQ ID NO：35)；L2，其包含胺基酸序列GPDID(SEQ ID NO：118)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列HWYNS(SEQ ID NO：46)。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP與第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP競爭結合VEGF-A，其中該第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVMQPYWGCGPDIDCLAGCVCHWYNSCG(SEQ ID NO：123)。

在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A上由第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP所結合之同一抗原決定基，其中參考骨架結構I，該第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列DVMQPYWG(SEQ ID NO：35)；L2，其包含胺基酸序列GPDID(SEQ ID NO：118)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列HWYNS(SEQ ID NO：46)。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A上由第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP所結合之同一抗原決定基，其中該第二非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVMQPYWGCGPDIDCLAGCVCHWYNSCG(SEQ ID NO：123)。

在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A中包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個或多於十個選自由以下各項組成之群的胺基酸的抗原決定基：V14、V15、F17、D19、Y21、Q22、Y25、I46、K48、N62、D63、L66、M81、I83、K84、P85、H86、Q87、G88、Q89、I91、C104、R105及P106。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A中包含K48、N62及D63之抗原決定基。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A中包含H86之抗原決定基。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A中包含Y21、Y25及P106之抗原決定基。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A中包含M81、D19及Q22之抗原決定基。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A中包含F17、M81及I91之抗原決定基。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A中包含V14、F17、D19、Q22、M81及I91之抗原決定基。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A中包含Q22及Y25之抗原決定基。

在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A上與抗VEGF-A抗體G6.31所結合之VEGF-A抗原決定基重疊的抗原決定基(Fuh等,(2006)J.Biol.Chem.281,6625-6631)。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A上與Flt-1所結合之VEGF-A抗原決定基重疊的抗原決定基。在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合VEGF-A上與貝伐珠單抗所結合之VEGF-A抗原決定基重疊的抗原決定基。

功能特徵

在某些實施例中，可「特異性結合」VEGF-A(諸如人類VEGF-A、小鼠VEGF-A及/或大鼠VEGF-A)之非天然存在之CKP具有不超過約1×10^-7M、較佳不超過約1×10^-8M且最佳不超過約1×10^-9M)之結合親和力(Kd)值，但對VEGF-A同系物或其他生長因子所具有的結合親和力比其對VEGF-A之結合親和力弱至少約50倍或至少約500倍或至少約1000倍。

在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP與例如非靶蛋白(例如，VEGFA同系物，諸如VEGF-B、VEGF-C及VEGF-D)或其他生長因子(諸如P1GF、EGF、NGF、IGF及PDGF)的結合程度小於該非天然存在之結合VEGF-A之CKP與VEGF-A之結合的約10%，如藉由本領域中已知的方法，諸如ELISA、螢光活化細胞分選(FACS)分析或放射免疫沈澱(RIA)所測定。可例如藉由測定分子之結合且與對照分子之結合相比較來量測特異性結合，該對照分子一般為不具有結合活性之具有類似結構之分子。舉例而言，可藉由與類似於標靶之對照分子(例如，過量未標記標靶)競爭來測定特異性結合。在此情況下，若經標記之標靶與探針之結合因過量未標記標靶而受到競爭性抑制，則指示特異性結合。評估可「特異性結合」VEGF-A之非天然存在之CKP之結合的其他方法描述於實例中。

如本文中所使用之術語特定多肽或特定多肽靶上之抗原決定基的「特異性結合」或與特定多肽或特定多肽靶上之抗原決定基「特異性結合」或對特定多肽或特定多肽靶上之抗原決定基「具有特異性」可例如藉由對該標靶具有至少約10^-4M、或者至少約10^-5M、或者至少約10^-6M、或者至少約10^-7M、或者至少約10^-8M、或者至少約10^-9M、或者至少約10^-10M、或者至少約10^-11M、或者至少約10^-12M或更大之Kd的分子來展現。在一個實施例中，術語「特異性結合」係指分子與特定多肽或特定多肽上之抗原決定基結合而實質上不存在與任何其他多肽或多肽抗原決定基之結合的結合。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP以介於約1pM至約500nM之間的Kd結合VEGF-A。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP以介於約1pM至約50pM之間、介於約50pM至約250pM之間、介於約250pM至約500pM之間、介於約500pM至750pM之間、介於約750pM至約1nM之間、介於約1nM至約25nM之間、介於約25nM至約50nM之間、介於50nM至約100nM之間、介於約100nM至約250nM之間或介於約250nM至約500nM之間的Kd結合VEGF-A。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP結合人類VEGF-A、小鼠VEGF-A及/或大鼠VEGF-A。在某些實施例中，參考骨架結構I，可結合人類VEGF-A、小鼠VEGF-A及大鼠VEGF-A之非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列NIMLPFWG(SEQ ID NO：33)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列QYYQS(SEQ ID NO：45)。在某些實施例中，可結合人類VEGF-A、小鼠 VEGF-A及大鼠VEGF-A之非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCKQDSDCLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：52)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，可結合人類VEGF-A、小鼠VEGF-A及大鼠VEGF-A之非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列NIMLPFWG(SEQ ID NO：33)；L2，其包含胺基酸序列GRDFE(SEQ ID NO：97)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列QYYQS(SEQ ID NO：45)。在某些實施例中，可結合人類VEGF-A、小鼠VEGF-A及大鼠VEGF-A之非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCNIMLPFWGCGRDFECLAGCVCQYYQSCG(SEQ ID NO：102)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，可結合人類VEGF-A、小鼠VEGF-A及大鼠VEGF-A之非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列DVMQPYWG(SEQ ID NO：35)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列HWYNS(SEQ ID NO：46)。在某些實施例中，可結合人類VEGF-A、小鼠VEGF-A及大鼠VEGF-A之非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVMQPYWGCKQDSDCLAGCVCHWYNSCG(SEQ ID NO：55)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，可結合人類VEGF-A、小鼠VEGF-A及大鼠VEGF-A之非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列DVMQPYWG(SEQ ID NO：35)；L2，其包含胺基酸序列GPDID(SEQ ID NO：118)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列HWYNS(SEQ ID NO：46)。在某些實施例中，可結合人類VEGF-A、小鼠VEGF-A及大鼠VEGF-A之非天然存在之結合VEGF-A之CKP包含胺基酸序列GCDVMQPYWGCGPDIDCLAGCVCHWYNSCG(SEQ ID NO：123)。

在某些實施例中，本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP具有小於約0.5nM、小於約0.6nM、小於約0.7nM、小於約0.8nM、小於約0.9nM或小於約1.0nM之IC₅₀值，包括介於此等值之間的任何範圍。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP不抑制胰蛋白酶活性，如在肽受質裂解分析(例如，實例中所描述之肽受質裂解分析)中所量測。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP對胰蛋白酶消化具有抗性。在某些實施例中，與胰蛋白酶一起在37℃下進行24h培育之後，約30%或更少、約25%或更少或者約20%或更少的非天然存在之結合VEGF-A之CKP在環2內之Arg13上裂解。

亦涵蓋編碼本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的核酸分子、包含編碼該非天然存在之結合VEGF-A之CKP的核酸分子的表現載體及包含該等核酸分子之細胞。本文中亦提供產生本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的方法，該等方法係藉由培養此種細胞、表現該非天然存在之結合VEGF-A之CKP及自細胞培養物中回收該非天然存在之結合VEGF-A之CKP。

在某些實施例中，如本文中其他部分所描述，經由活體外轉譯來產生非天然存在之結合VEGF-A之CKP。

在某些實施例中，經由化學肽合成，例如藉由將化學合成之L1、L2、L3、L4及/或L5肽接枝至骨架構架(諸如骨架結構I)上或藉由化學合成整個非天然存在之結合VEGF-A之CKP來產生非天然存在之結合VEGF-A之CKP。

可結合人類低密度度脂蛋白受體(LDL)相關蛋白6(LRP6)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)

LDL受體為參與脂蛋白及蛋白質配位體之受體介導之細胞吞噬的跨膜細胞表面蛋白。人類LDL受體相關蛋白6(LRP6)(登錄號：NM_002336(mRNA)及NP_002327(蛋白質)；UniProtKB：O75581)充當Wnt之受體或與Frizzled一起充當共受體，且從而傳輸典型Wnt/β-連環蛋白信號傳導級聯(Katoh等人,(2007)Clin Cancer Res 13：4042-4045)。藉由其與Wnt/β-連環蛋白信號傳導級聯之相互作用，LRP6在調控細胞分化、增殖及移行中且在許多癌症類型之發展中起作用(Li等人,(2004)Oncogene 23：9129-9135；Tung等人,(2012)PLoS ONE7(5)：e36565.doi：10.1371/journal.pone.0036565；Liu等人,(2010)Proc Natl Acad Sci USA 107：5136-5141)。

Wnt信號傳導涉及許多生物途徑。關於疾病，其涉及癌症及轉移性疾病、骨質疏鬆症及其他骨代謝及疾病、神經元及神經變性疾病、變形性關節炎及其他炎性疾病。此由阻斷LRP6所致之對Wnt信號傳導之抑制可具有多種治療效用。骨損失為嚴重醫學問題，不僅在停經後骨質疏鬆症期間，而且在變形性關節炎中。在多發性骨髓瘤中及骨轉移中發生骨質降解。因此對旨在強化骨質、骨折預防或恢復受損骨骼之治療策略非常感興趣(Kawai等人,(2011)Nat.Rev.Drug Discov.10,141-156；Mason及Williams(2010)J.Osteoporosis,第2010卷,文章ID 460120,9頁；doi：10.4061/2010/460120)。Wnt途徑抑制劑DKK1及SOST由於其在抑制新骨形成中之作用而被視為非常有前景之治療標靶；中和SOST之功能的抗體顯示顯著臨床前活性(Ominsky等人,(2010)J.Bone Miner.Res.25,948-959)且現下正在人類臨床試驗中(Padhi等人,(2011)J.Bone Miner.Res.26,19-26)。

失調之Wnt信號傳導牽涉自骨質疏鬆症至癌症範圍內之疾病(Clevers(2006)Cell 127：469-80；MacDonald等人,2009.Dev Cell 17：9-26；Nusse(2008)Cell Res 18：523-7；Polakis(2007)Curr Opin Genet Dev 17：45-51)。此清單已擴大至包括代謝病症(Mani等人,(2007)Science 315：1278-82)及神經退化(Caricasole等人,(2004)J Neurosci 24：6021-7；De Ferrari等人,(2007)Proc Natl Acad Sci USA 104：9434-9)。腺瘤性結腸息肉病蛋白(APC)中可防止有效調控β-連環蛋白水準之突變與結腸直腸癌之間存在尤其明確之關聯(Polakis(2007)Curr Opin Genet Dev 17：45-51)。亦應尤其注意LRP5與骨恆定之間的強基因關係。LRP5中之功能損失型突變導致以低骨質、眼部缺陷及骨折之傾向為特徵之常染色體隱性病症骨質疏鬆症-假神經膠質瘤症候群(OPPG)(Gong等人,(2001)Cell 107：513-23)。

本文中提供一種可結合人類低密度脂蛋白受體相關蛋白6(LRP6)之非天然存在之CKP，其中該非天然CKP包含以下胱胺酸骨架結構 (亦即，骨架結構I)：Z₁C₁ L1C₂ L2C₃ L3C₄ L4C₅ L5C₆Z₂ (I)，其中：Z₁及Z₂為任何胺基酸；L1為環1且具有選自由以下各項組成之群的結構：X₁X₂X₃X₄X₅X₆、X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇、X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈、X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉及X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀，其中X₁至X₁₁各自為任何胺基酸；L2為環2且具有結構：X₁X₂X₃X₄X₅，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸；L3為環3且具有結構：X₁X₂X₃，其中X₁至X₃各自為任何胺基酸；L4為環4且具有結構：X₁，其中X₁為任何胺基酸；且L5為環5且具有結構：X₁X₂X₃X₄X₅，其中X₁至X₅各自為任何胺基酸。

在某些實施例中，可結合LRP6之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)之Z₁及/或Z₂為G。在某些實施例中，Z₁及/或Z₂包含多於一個胺基酸。在某些實施例中，Z₁及/或Z₂包含4個胺基酸。在某些實施例中，Z₁及/或Z₂包含5個胺基酸。

在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含L1，其中X₁為選自R、V、M、A、G、N、S及E之胺基酸；其中X₂為選自T、N、S、G、R及A之胺基酸；其中X₃為選自N、R、H、V、K、S、G、I及Y之胺基酸；其中X₄為選自R、V、N、I、K、S及T之胺基酸；其中X₅為選自V、R、K、I、T、S、L及N之胺基酸；且其中X₆為選自K、G、A、I、R、N、S及V之胺基酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含L1，其中X₇為選自G、R、K、E、P及T之胺基酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含L1，其中X₈為選自G、R、K、Q、A及S之胺基酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含L1，其中X₉為選自R或G之胺基酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含L1，其中X₁₀為選自E、W及G之胺基酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含L5，其中X₁為選自G、S、N、Y、A及R之胺基酸；其中X₂為選自P、G、S、V、E、R、F及D之胺基酸；其中X₃為選自N、G、S、E、P、K、H 及R之胺基酸；其中X₄為選自G、R、H、S、Q、V及D之胺基酸；且其中X₅為選自F、D、N、R、G、Y、S及T之胺基酸。在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含L2，其中X₁為K，X₂為Q，X₃為D，X₄為S，且X₅為D。在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含L3，其中X₁為L，X₂為A，且X₃為G。在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含L4，其中X₁為V。

在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP競爭性抑制競爭分子與人類LRP6之結合。在某些實施例中，該競爭分子為抗LRP6抗體。在某些實施例中，該競爭分子為第二非天然存在之結合LRP6之CKP。

可結合標靶上重疊或類似區域之非天然存在之結合LRP6之CKP可藉由競爭性抑制/結合分析加以鑑別。此種分析在本領域中為熟知的且描述於例如以下文獻中：S.J.Mather(編)1996.Current Directions in Radiopharmaceutical Research and Development,169-179,Kluwer Academic Publishers；Zettner(1973)Clin.Chem.19,699-705；Gao(2012)Analytical Methods 4,3718-3723。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP結合人類LRP6中由第二非天然存在之結合LRP6之CKP所結合之同一抗原決定基且包含：L1，其包含胺基酸序列V/R/N/S/E/G-N/S/G/R-R/V/K/S/N/I/Y-V/N/I/R/S/T-R/K/I/N-G/I/R/K/S/A(SEQ ID NO：185)或A/R/M/V/G/S-N/T/S/A-R/N/H-V/R/K-K/V/I-R/K/A/N/S/V-T/G/R/K/P-S/G/R/A(SEQ ID NO：186)或R/A/Q-S/A-G/S/N/I-N/K-T/S/L/R-I/R/V-R/E/K-K/Q/A/R-R/G/Q-E/W/G/R(SEQ ID NO：187)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列G/S/N/Y/A/R-P/G/S/V/E/R/F/D-N/G/S/E/P/K/H/R-G/R/H/S/Q/V/D-F/D/N/R/G/Y/S/T(SEQ ID NO：188)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含L1，該L1包含胺基酸序列V/R/N/S/E/G-N/S/G/R-R/V/K/S/N/I/Y-V/N/I/R/S/T-R/K/I/N-G/I/R/K/S/A(SEQ ID NO：185)或A/R/M/V/G/ S-N/T/S/A-R/N/H-V/R/K-K/V/I-R/K/A/N/S/V-T/G/R/K/P-S/G/R/A(SEQ ID NO：186)或R/A-S-G/S/N-N/K-T/S/L-I/R-R/E-K/Q/A-R/G-E/W/G(SEQ ID NO：187)。在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP進一步包含L2，該L2包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)。在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V。在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP進一步包含L5，該L5包含胺基酸序列G/S/N/Y/A/R-P/G/S/V/E/R/F/D-N/G/S/E/P/K/H/R-G/R/H/S/Q/V/D-F/D/N/R/G/Y/S/T(SEQ ID NO：188)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含本文中所揭示之非天然存在之結合LRP6之CKP中任一者的L1及/或L5。在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含L1，該L1包含SEQ ID NO：147-168及367中之任一者中所闡述的胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP進一步包含L2，該L2包含SEQ ID NO：93中所闡述之胺基酸序列。在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP進一步包含L3，該L3包含胺基酸序列LAG。在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP進一步包含L4，該L4包含胺基酸V。在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP進一步包含L5，該L5包含SEQ ID NO：19及169-184中之任一者中所闡述的胺基酸序列。

以上所描述之L1及L5胺基酸序列提供於以下表18中：

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列RTNRVKGG(SEQ ID NO：147)； L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列GPNGF(SEQ ID NO：19)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列VNRVRG(SEQ ID NO：148)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列SGGRD(SEQ ID NO：169)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列MNHVKARR(SEQ ID NO：149)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列GPNGF(SEQ ID NO：19)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列RSVNKI(SEQ ID NO：150)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列GSSRN(SEQ ID NO：170)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列VNKIKG(SEQ ID NO：151)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列GVEGR(SEQ ID NO：29)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列RNSIKR(SEQ ID NO：152)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列SVGHG(SEQ ID NO：172)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合 LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列VSNRVNKG(SEQ ID NO：153)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列GPNGF(SEQ ID NO：19)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列RGNIIK(SEQ ID NO：154)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列NESRG(SEQ ID NO：173)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列RSGNTIRKRE(SEQ ID NO：155)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列GGPGG(SEQ ID NO：174)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列ASSNSIRQGW(SEQ ID NO：156)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列GPKSN(SEQ ID NO：175)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列RSNRIR(SEQ ID NO：157)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列YGHGD(SEQ ID NO：176)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列RSNKLREARG(SEQ ID NO：158)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列GSRQD(SEQ ID NO：177)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合 LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列VNSVKR(SEQ ID NO：159)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列SRGVN(SEQ ID NO：178)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列GSNKIRPR(SEQ ID NO：160)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列GPNDF(SEQ ID NO：179)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列NRIRNS(SEQ ID NO：161)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列GRGDY(SEQ ID NO：180)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列SRNSIK(SEQ ID NO：162)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列ASGSS(SEQ ID NO：181)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列SNYVKR(SEQ ID NO：163)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列SPGGR(SEQ ID NO：182)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列RANRVSGR(SEQ ID NO：164)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列GPNGF(SEQ ID NO：19)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合 LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列SNRVKVRA(SEQ ID NO：165)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列GPNGF(SEQ ID NO：19)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列ENRTKG(SEQ ID NO：166)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列GFRGT(SEQ ID NO：183)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列GNKIRA(SEQ ID NO：167)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列RDRVG(SEQ ID NO：184)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列ANRVKRTS(SEQ ID NO：168)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列GPNGF(SEQ ID NO：19)。

在某些實施例中，參考骨架結構I，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含：L1，其包含胺基酸序列QAINRVKRQR(SEQ ID NO：367)；L2，其包含胺基酸序列KQDSD(SEQ ID NO：93)；L3，其包含胺基酸序列LAG；L4，其包含胺基酸V；及L5，其包含胺基酸序列GPNGF(SEQ ID NO：19)。

在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP包含SEQ ID NO：189-210及366中之任一者中所闡述的胺基酸序列。SEQ ID NO：189-210及366提供於下文。

GCRTNRVKGGCKQDSDCLAGCVCGPNGFCG(SEQ ID NO：189)

GCVNRVRGCKQDSDCLAGCVCSGGRDCG(SEQ ID NO：190)

GCMNHVKARRCKQDSDCLAGCVCGPNGFCG(SEQ ID NO：191)

GCRSVNKICKQDSDCLAGCVCGSSRNCG(SEQ ID NO：192)

GCVNKIKGCKQDSDCLAGCVCGVEGRCG(SEQ ID NO：193)

GCRNSIKRCKQNSDCLAGCVCSVGHGCG(SEQ ID NO：194)

GCVSNRVNKGCKQDSDCLAGCVCGPNGFCG(SEQ ID NO：195)

GCRGNIIKCKQDSDCLAGCVCNESRGCG(SEQ ID NO：196)

GCRSGNTIRKRECKQDSDCLAGCVCGGPGGCG(SEQ ID NO：197)

GCASSNSIRQGWCKQDSDCLAGCVCGPKSNCG(SEQ ID NO：198)

GCRSNRIRCKQDSDCLAGCVCYGHGDCG(SEQ ID NO：199)

GCRSNKLREARGCKQDSDCLAGCVCGSRQDCG(SEQ ID NO：200)

GCVNSVKRCKQDSDCLAGCVCSRGVNCG(SEQ ID NO：201)

GCGSNKIRPRCKQDSDCLAGCVCGPNDFCG(SEQ ID NO：202)

GCNRIRNSCKQDSDCLAGCVCGRGDYCG(SEQ ID NO：203)

GCSRNSIKCKQDSDCLAGCVCASGSSCG(SEQ ID NO：204)

GCSNYVKRCKQDSDCLAGCVCSPGGRCG(SEQ ID NO：205)

GCRANRVSGRCKQDSDCLAGCVCGPNGFCG(SEQ ID NO：206)

GCSNRVKVRACKQDSDCLAGCVCGPNGFCG(SEQ ID NO：207)

GCENRTKGCKQDSDCLAGCVCGFRGTCG(SEQ ID NO：208)

GCGNKIRACKQDSDCLAGCVCRDRVGCG(SEQ ID NO：209)

GCANRVKRTSCKQDSDCLAGCVCGPNGFCG(SEQ ID NO：210)

GCQAINRVKRQRCKQDSDCLAGCVCGPNGFCG(SEQ ID NO：366)

在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP為本文中所描述之非天然存在之結合LRP6之CKP的變異體。在某些實施例中，此種變異體在SEQ ID NO：19、93、147-168、169-184及189-210中所闡述之序列中之一或多者中及/或在胺基酸序列LAG中包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個胺基酸取代。在某些實施例中，胺基酸取代為保守胺基酸取代。在某些實施例中，胺基酸取代實質上不降低該非天然存在之結合LRP6之CKP結合人類LRP6的能力。舉例而言，可進行實質上不降低LRP6結合親和力的保守變化(例如，如本文中所提供之保守取代)。可使用以下實例中所描述之方法來評估非天然存在之結合LRP6之CKP之變異體的結合親和力。

保守取代示於以上表17中「保守取代」之表頭下。更實質性變化提供於表17中「例示性取代」之表頭下，且如以下參考胺基酸側鏈類別進一步描述。可將胺基酸取代引入非天然存在之結合LRP6之CKP的變異體中且針對所要活性(例如，保持/改良之LRP6結合)篩選產物。

非保守取代將使得有必要將此等類別之一的成員與另一類別交換。例示性取代變異體為親和力成熟型非天然存在之結合LRP6之CKP，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文中所描述之彼等親和力成熟技術)便利地產生。簡而言之，改變(亦即，添加、缺失或取代)L1、L2、L3、L4及/或L5中之一或多個殘基，且將變異之結合LRP6之CKP呈現於噬菌體上並且針對LRP6結合親和力進行篩選。在親和力成熟之某些實施例中，藉由多種方法(例如，易出錯PCR、環改組或寡核苷酸定向突變誘發)中之任一種將多樣性引入針對成熟所選擇之可變基因中。隨後建立第二文庫。隨後篩選該文庫以鑑別對LRP6具有所要親和力的任何非天然存在之CKP變異體。在某些實施例中，引入多樣性包括環定向方法，其中對L1、L2、L3、L4及/或L5中之若干殘基(例如，每次約5個、約4-6個或約6-10個殘基)進行隨機化。可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來鑑別參與結合靶配位體之L1、L2、L3、L4及/或L5殘基。

在某些實施例中，可「特異性結合」人類LRP6之非天然存在之CKP(亦即，具有不超過約1×10^-7M、較佳不超過約1×10^-8M且最佳不超過約1×10^-9M)之結合親和力(Kd)值)但對另一LRP蛋白所具有的結合親和力比其對LRP6之結合親和力弱至少約50倍或至少約500倍或至少約 1000倍。

在某些實施例中，非天然存在之結合LRP6之CKP與非靶蛋白(例如，LRP6同系物，諸如LRP1、LRP1B、LRP2、LRP3、LRP4、LRP5、LRP8、LRP10、LRP11及LRP12)的結合程度小於該非天然存在之結合LRP6之CKP與人類LRP6之結合的約10%，如藉由本領域中已知的方法，諸如ELISA、螢光活化細胞分選(FACS)分析或放射免疫沈澱(RIA)所測定。可例如藉由測定分子之結合且與對照分子之結合相比較來量測特異性結合，該對照分子一般為不具有結合活性之具有類似結構之分子。舉例而言，可藉由與類似於標靶之對照分子(例如，過量未標記標靶)競爭來測定特異性結合。在此情況下，若經標記之標靶與探針之結合因過量未標記標靶而受到競爭性抑制，則指示特異性結合。如本文中所使用之術語特定多肽或特定多肽靶上之抗原決定基的「特異性結合」或與特定多肽或特定多肽靶上之抗原決定基「特異性結合」或對特定多肽或特定多肽靶上之抗原決定基「具有特異性」可例如藉由對該標靶具有至少約10^-4M、或者至少約10^-5M、或者至少約10^-6M、或者至少約10^-7M、或者至少約10^-8M、或者至少約10^-9M、或者至少約10^-10M、或者至少約10^-11M、或者至少約10^-12M或更大之Kd的分子來展現。在一個實施例中，術語「特異性結合」係指分子與特定多肽或特定多肽上之抗原決定基結合而實質上不存在與任何其他多肽或多肽抗原決定基之結合的結合。

在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP以介於約1pM至約500nM之間的Kd結合人類LRP6。在某些實施例中，該可特異性結合LRP6之非天然存在之結合LRP6之CKP蛋白以介於約1pM至約50pM之間、介於約50pM至約250pM之間、介於約250pM至約500pM之間、介於約500pM至750pM之間、介於約750pM至約1nM之間、介於約1nM至約25nM之間、介於約25nM至約50nM之間、介於50nM至約100nM之間、介於約100nM至約250nM之間或介於約250nM至約500nM之間的Kd結合人類LRP6，包括介於此等值之間的任何範圍。

在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP抑制Wnt1信號傳導，例如，如使用以下實例中所描述之方法所測定。

亦涵蓋編碼所描述之非天然存在之結合LRP6之CKP的核酸分子、包含編碼該非天然存在之結合LRP6之CKP的核酸分子的表現載體及包含該等核酸分子之細胞。本文中亦提供產生非天然存在之結合LRP6之CKP的方法，該等方法係藉由培養此種細胞、表現該非天然存在之結合LRP6之CKP及自細胞培養物中回收該非天然存在之結合LRP6之CKP。

在某些實施例中，如本文中其他部分所描述，經由活體外轉譯來產生非天然存在之結合LRP6之CKP。

如本文中其他部分所描述，經由化學肽合成，例如藉由將化學合成之L1、L2、L3、L4及/或L5肽接枝至EETI-II構架上或藉由化學合成整個非天然存在之結合LRP6之CKP來產生非天然存在之結合LRP6之CKP。

在某些實施例中，該非天然存在之結合LRP6之CKP在涉及過度LRP6活性之疾病或病狀之治療中作為治療劑。

產生方法

在某些實施例中，經由基因工程改造來產生非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP。先前已描述用於突變誘發之多種方法(以及適用於篩選或選擇之方法)。此種突變誘發方法包括但不限於例如易出錯PCR、環改組或寡核苷酸定向突變誘發、隨機核苷酸插入或其他重組前方法。關於此等方法之其他細節描述於例如以下文獻中：Abou-Nadler等人,(2010)Bioengineered Bugs 1,337-340；Firth等人,(2005)Bioinformatics 21,3314-3315；Cirino等人,(2003)Methods Mol Biol 231,3-9；Pirakitikulr(2010)Protein Sci 19,2336-2346；Steffens等人,(2007)J.Biomol Tech 18,147-149；及其他。因此，在某些實施例中，提供經由基因工程改造技術產生之非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP。

在某些實施例中，經由活體外轉譯來產生非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP。簡而言之，活體外轉譯需要將蛋白質編碼序列選殖至含有啟動子之載體中，藉由用RNA聚合酶轉錄所選殖之序列來產生mRNA，及藉由在活體外(例如，使用無細胞提取物)轉譯此mRNA來合成蛋白質。可藉由改變所選殖之蛋白質編碼序列簡單地產生所要變異蛋白質。可在小麥胚芽提取物中或在兔網狀紅血球溶解物中有效地轉譯許多mRNA。關於活體外轉譯之其他細節描述於例如以下文獻中：Hope等人,(1985)Cell 43,177-188；Hope等人,(1986)Cell 46,885-894；Hope等人,(1987)EMBO J.6,2781-2784；Hope等人,(1988)Nature 333,635-640；及Melton等人,(1984)Nucl.Acids Res.12,7057-7070。

因此，提供編碼本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP的核酸分子。亦提供與編碼非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP的核酸分子可操作地連接的表現載體。亦提供包含編碼非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP的核酸的宿主細胞(包括例如原核宿主細胞，諸如大腸桿菌；真核宿主細胞，諸如酵母細胞、哺乳動物細胞、CHO細胞等)。

在某些實施例中，經由活體外轉譯來產生非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP。簡而言之，活體外轉譯需要將蛋白質編碼序列選殖至含有啟動子之載體中，藉由用RNA聚合酶轉錄所選殖之序列來產生mRNA，及藉由在活體外(例如，使用無細胞提取物)轉譯此mRNA來合成蛋白質。可藉由改變所選殖之蛋白質編碼序列簡單地產生所要突變蛋白質。可在小麥胚芽提取物中或在兔網狀紅血球溶解物中有效地轉譯許多mRNA。關於活體外轉譯之其他細節描述於例如以下文獻中：Hope等人,(1985)Cell 43,177-188；Hope等人,(1986)Cell 46,885-894；Hope等人,(1987)EMBO J.6,2781-2784；Hope等人,(1988)Nature 333,635-640；及Melton等人,(1984)Nucl.Acids Res.12,7057-7070。

在某些實施例中，經由化學合成來產生非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP。在某些實施例中，將化學合成之L1、L2、L3、L4及/或L5肽接枝至基於EETI-II之構架(諸如骨架結構I)上，以產生非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP。在某些實施例中，化學合成整個非天然存在之結合VEGF-A之CKP或整個非天然存在之結合LRP6之CKP。固相及液相肽合成方法在本領域中為熟知的且詳細描述於例如以下文獻中：Methods of Molecular Biology,35,Peptide Synthesis Protocols,(M.W. Pennington及B.M.Dunn編),Springer,1994；Welsch等人,(2010)Curr Opin Chem Biol 14,1-15；Methods of Enzymology,289,Solid Phase Peptide Synthesis,(G.B.Fields編),Academic Press,1997；Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins,(P.Lloyd-Williams,F.Albericio及E.Giralt編),CRC Press,1997；Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,A Practical Approach,(W.C.Chan,P.D.White編),Oxford University Press,2000；Solid Phase Synthesis,A Practical Guide,(S.F.Kates,F Albericio編),Marcel Dekker,2000；P.Seneci,Solid-Phase Synthesis and Combinatorial Technologies,John Wiley & Sons,2000；Synthesis of Peptides and Peptidomimetics(M.Goodman,Editor-in-chief,A.Felix,L.Moroder,C.Tmiolo編),Thieme,2002；N.L.Benoiton,Chemistry of Peptide Synthesis,CRC Press,2005；Methods in Molecular Biology,298,Peptide Synthesis and Applications,(J.Howl編)Humana Press,2005；及Amino Acids,Peptides and Proteins in Organic Chemistry,第3卷,Building Blocks,Catalysts and Coupling Chemistry,(A.B.Hughs編)Wiley-VCH,2011。

包含非天然存在之EETI-II蛋白之嵌合分子

若有利則亦可用某一方式對本文中所描述之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)加以修飾，以形成包含該非天然存在之CKP與另一異源多肽或胺基酸序列之融合物(例如，重組融合物)的嵌合分子。在某些實施例中，此種嵌合分子包含本文中所描述之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)與用於形成例如二價分子或雙特異性分子之抗體的融合物。

在某些實施例中，嵌合分子包含本文中所描述之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)與使用例如人類免疫缺陷病毒TAT蛋白之蛋白質轉導結構域來靶向該嵌合分子以遞送至不同的組織或例如越過腦血屏障的第二部分(諸如蛋白質轉導結構域)的融合物(Schwarze等人,1999,Science 285：1569-72)。

在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之CKP可用作雙特異性或多特異性(針對不同的靶配位體或同一靶配位體上之不同的抗原決定基)，呈多聚體形式。舉例而言，二聚雙特異性非天然存在之CKP具有對第一靶蛋白或抗原決定基具有特異性之一個亞單元及對第二靶蛋白或抗原決定基具有特異性之第二亞單元。非天然存在之CKP蛋白亞單元可能以可增加原子價且因而增加與靶配位體之結合親合力的多種構形連接。

在某些實施例中，本文中所提供之嵌合分子包含兩個或更多個(諸如三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或多於十個)非天然存在之CKP蛋白。在某些實施例中，核酸可經工程改造以編碼單一非天然存在之CKP的兩個或更多個複本，該等複本經串聯轉錄與轉譯以產生一致亞單元之共價連接型多聚體。在某些實施例中，該核酸可經工程改造以編碼兩種或更多種不同的非天然存在之CKP，該等複本經串聯轉錄與轉譯以產生結合例如單一靶配位體之不同抗原決定基或例如不同靶配位體的不同亞單元之共價連接型多聚體。

在另一實施例中，此種嵌合分子包含本文中所描述之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)與提供抗標籤抗體可選擇性地結合之抗原決定基的標籤多肽的融合物。該抗原決定基標籤一般位於該非天然存在之CKP的胺基或羧基末端。可使用針對該標籤多肽之抗體來偵測該非天然存在之CKP蛋白之此種抗原決定基標籤化形式的存在。此外，提供抗原決定基標籤使得能夠藉由使用抗標籤抗體或可結合該抗原決定基標籤之另一類型親和力基質的親和力純化來容易地純化該非天然存在之CKP。各種標籤多肽及其個別抗體在本領域中為已知的。實例包括聚組胺酸(聚His)或聚組胺酸-甘胺酸(聚His-Gly)標籤；flu HA標籤多肽及其抗體12CA5(Field等人,(1988)Mol.Cell.Biol.8,2159-2165)；c-myc標籤以及其8F9、3C7、6E10、G4、B7及9E10抗體(Evan等人,(1985)Mol.Cell.Biol.5,3610-3616]；以及單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標籤及其抗體(Paborsky等人,(1990)Protein Eng.,3,547-553)。其他標籤多肽包括Flag肽(Hopp等人,(1988)BioTechnology,6,1204-1210)；KT3抗原決定基肽(Martin等人,(1992)Science,255,192-194]；α-微管蛋白抗原決定基肽(Skinner等人,(1991)J.Biol.Chem.266,15163-15166)；及T7基因10蛋白肽標籤(Lutz-Freyermuth等人,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,6393-6397]。

在某些實施例中，該嵌合分子可包含本文中所描述之非天然存在之CKP蛋白(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)與免疫球蛋白或免疫球蛋白之特定區域的融合物。對於該嵌合分子(例如「免疫黏附素」)之二價形式，此種融合物可為與IgG分子之Fc區的融合物。本文中所提供之Ig融合物包括大致或僅包含人類殘基94-243、殘基33-53或殘基33-52替代Ig分子內之至少一個可變區的多肽。在一尤佳實施例中，該免疫球蛋白融合物包括IgG1分子之鉸鏈區、CH2區及CH3區，或鉸鏈區、CH1區、CH2區及CH3區。關於免疫球蛋白融合物之產生，亦參見1995年6月27日頒發之美國專利第5,428,130號。在某些實施例中，本文中所描述之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)例如在N或C末端與IgG之恆定區(Fc)融合。在某些實施例中，非天然存在之CKP/Fc融合分子可活化免疫反應之補體組分。在某些實施例中，非天然存在之CKP/Fc融合蛋白可增加該非天然存在之CKP的治療價值。在某些實施例中，本文中所描述之非天然存在之CKP蛋白(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)例如在N或C末端與補體蛋白(諸如C1q)融合(諸如重組融合)。各種出版物描述用於獲得非天然存在之蛋白質的方法，該等蛋白質之半衰期係藉由將FcRn結合多肽引入分子中(WO 1997/43316、US 5869046、US 5747035、WO 1996/32478、WO 1991/14438)或藉由使蛋白質與FcRn結合親和力得以保留但對其他Fc受體之親和力已大大降低的抗體融合(WO 1999/43713)或與抗體之FcRn結合結構域融合(WO 2000/09560、US 4703039)來調節。增加生理學活性分子(例如，非天然存在之CKP)之半衰期的特定技術及方法亦可見於US 7083784中。在某些實施例中，本文中所描述之非天然存在之CKP蛋白(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)可與來自IgG之包含以下胺基酸殘基突變(如藉由Kabat中之EU指數進行編號)的Fc區融合：M252Y/S254T/T256E 或H433K/N434F/Y436H。

在某些實施例中，本文中所描述之非天然存在之CKP蛋白(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)可與可增加或延長活體內或血清半衰期之分子融合。在某些實施例中，本文中所描述之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)可與諸如人血清白蛋白(HSA)之白蛋白、聚乙二醇(PEG)、聚糖、免疫球蛋白分子(IgG)、補體、血紅蛋白、結合肽、脂蛋白或用於增加其在血流中之半衰期及/或其組織滲透的其他因子融合。

包含非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP的額外嵌合分子可藉由基因改組、基元改組、外顯子改組及/或密碼子改組(總稱為「DNA改組」)技術來產生。DNA改組可用於改變非天然存在之CKP(例如，具有較高親和力及較低解離速率之非天然存在之CKP)的活性。一般參見US 5605793、US5811238、US 5830721、US 5834252、US 5837458；Patten等人,(1997)Curr.Opinion Biotechnol.8,724-33；Harayama(1998)Trends Biotechnol.16,76-82；Hansson等人,(1999)J.Mol.Biol.287,265-76；以及Lorenzo及Blasco,(1998)Biotechniques 24,308-313。

在某些實施例中，藉由以易出錯PCR、隨機核苷酸插入或其他重組前方法進行隨機突變誘發來改變本文中所提供之非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP。可將編碼可結合特定標靶之骨架的多核苷酸的一或多個部分與一或多個異源分子之一或多個組件、基元、節段、部分、結構域、片段等重組。

此等融合物中之任一者均可藉由標準技術來產生，例如藉由使用公開可獲得之基因序列由重組融合基因構建體表現融合蛋白質或藉由化學肽合成。

包含非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP的結合物

本文中提供包含本文中所描述之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)與諸如化學治療劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即，放射性結合物)之細胞毒性劑結合的免疫結合物。

可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌)、篦麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚麴菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒素、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、分裂黴素、局限麴菌素、酚黴素、依諾黴素及單端孢黴烯族毒素。其他毒素包括美登素及類美登素、卡奇黴素及其他細胞毒性劑。多種放射性核素可用於產生放射性結合之非天然存在之CKP。實例包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y及¹⁸⁶Re。

本文中所描述之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)與例如細胞毒性劑之結合物係使用多種雙官能蛋白質偶合劑來製造，諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對雙重氮苯甲醯基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6-二異氰酸伸甲苯酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，可如Vitetta等人,Science,238：1098(1987)中所描述來製備篦麻毒素免疫毒素。經碳14標記之1-異硫氰酸酯基苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於結合放射性核素與本文中所提供之非天然存在之CKP的例示性螯合劑。參見WO94/11026。

在另一實施例中，本文中所描述之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)可與「受體」(諸如鏈黴親和素)結合以用於眼部「預靶向」，其中將該非天然存在之EETI-II骨架蛋白-受體結合物投與眼病患者，隨後使用清除劑自循環中移除未結合之結合物，且隨後投與已與細胞毒性劑(例如放射性核素)或治療劑結合之「配位體」(例如親和素)。

在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)可用作雙特異性或多特異性(針對不同靶配位體或同一靶配位體上之不同抗原決定基)多聚體形式。連接可為共價或非共價的。舉例而言，二聚雙特異性非天然存在之CKP具有對第一靶蛋白或抗原決定基具有特異性之一個亞單元及對第二靶蛋白或抗原決定基具有特異性之第二亞單元。非天然存在之CKP亞單元可能以可增加原子價且因而增加與一個靶配位體結合或與多個靶配位體結合之親合力的多種構形，例如經由結合而連接。

在某些實施例中，本文中所提供之非天然存在之CKP經工程改造以提供反應性基團供結合。在某些實施例中，N末端及/或C末端亦可用於提供反應性基團供結合。在某些實施例中，N末端與一個部分(諸如但不限於PEG)結合，而C末端與另一部分(諸如但不限於生物素)結合，或相反。

提供本文中所描述之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)與一或多個部分(包括但不限於肽、多肽、蛋白質、融合蛋白質、核酸分子、小分子、模擬劑、合成藥物、無機分子及有機分子)之結合物。亦提供本文中所描述之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)與異源蛋白質或多肽(或其片段至具有至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個胺基酸之多肽)的化學結合物(包括共價及非共價結合)的用途。融合未必需要為直接融合，而可能經由本文中所描述之連接子序列來發生。

在某些實施例中，本文中所描述之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)或其類似物或衍生物可與診斷劑或偵測劑結合。此種非天然存在之CKP結合物可作為臨床測試程序之一部分用於監測或預測疾病之發展或進展，諸如確定特定療法之效力。此種診斷及偵測可藉由使該非天然存在之CKP與可偵測物質偶合來實現，所述可偵測物質包括但不限於各種酶，諸如但不限於辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔成基，諸如但不限於鏈黴親和素及親合素/生物素；螢光材料，諸如但不限於傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料，諸如但不限於魯米諾(luminol)；生物發光材料，諸如但不限於螢光素酶、螢光素及水母素；放射性材料，諸如但不限於碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、銦(¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In、¹¹¹In)及鍀(⁹⁹Tc)、鉈(²⁰¹Ti)、鎵(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、鈀(¹⁰³Pd)、鉬(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、¹¹³Sn及¹¹⁷Tn；用於各種正電子發射斷層攝影術之正電子發射金屬、非放射性順磁性金屬離子及經放射性標記或與特定放射性同位素結合之分子。

亦提供非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)與治療部分的結合物。在某些實施例中，非天然存在之CKP可與諸如細胞毒素(例如細胞抑制劑或殺細胞劑)、治療劑或放射性金屬離子(例如α發射體)之治療部分結合。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞不利之任何藥劑。

在某些實施例中，本文中所描述之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)與諸如放射性金屬離子(諸如α發射體，諸如²¹³Bi)或適用於使放射性金屬離子(包括但不限於¹³¹In、¹³¹Lu、¹³¹Y、¹³¹Ho、¹³¹Sm)與多肽結合之大環螯合劑之治療部分結合。在某些實施例中，該大環螯合劑為1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N'''-四乙酸(DOTA)，其可經由連接子分子而連接於該非天然存在之CKP。此種連接子分子在本領域中通常為已知的且描述於例如以下文獻中：Denardo等人,(1998)Clin Cancer Res.4,2483-90；Peterson等人,(1999)Bioconjug.Chem.10,553-557；及Zimmerman等人,(1999)Nucl.Med.Biol.26,943-50。

用於使治療部分與抗體結合之技術為熟知的且可應用於本文中所揭示之非天然CKP，參見例如Amon等人,「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(編),第243-56頁.(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人,「Antibodies For Drug Delivery」,Controlled Drug Delivery(第2版),Robinson等人(編),第623-53頁(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」,Monoclonal Antibodies 84：Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(編),第475-506頁(1985)；「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radio labeled Antibody In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(編),第303-16頁(Academic Press 1985)；及Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.62：119-58。可改適類似之方法以用於本文中所提供之非天然存在之CKP。

應選擇與本文中所描述之非天然CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)結合的治療部分或藥物以便在個體中達成對特定病症之所要預防或治療效應。當決定何種治療部分或藥物與骨架結合時，臨床醫師或其他醫學人士應考慮以下各項：疾病之性質、疾病之嚴重程度及個體之病狀。

在某些實施例中，本文中所描述之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)亦可連接於尤其適用於免疫分析或靶抗原純化之固體載體。此種固體載體包括但不限於玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、耐綸、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

共價修飾

亦涵蓋對本文中所描述之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)的共價修飾。一種類型之共價修飾包括使非天然存在之CKP的靶向胺基酸殘基與能夠跟該非天然存在之CKP的所選側鏈或者N或C末端殘基反應的有機衍生化劑反應。利用雙官能試劑之衍生化適用於例如使非天然存在之CKP與水不溶性載體基質或表面交聯以用於純化靶配位體之方法中，且反之亦然。常用交聯劑包括例如1,1-雙(二疊氮乙醯基)-2-苯乙烷；戊二醛；N-羥基琥珀醯亞胺酯，例如與4-疊氮基水楊酸之酯；同雙官能醯亞胺基酯，包括二琥珀醯亞胺基酯，諸如3,3'-二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)；雙官能馬來醯亞胺，諸如雙-N-馬來醯亞胺基-1,8-辛烷；及諸如甲基-3-[(對疊氮基苯基)-二硫]丙醯亞胺酯之試劑。

其他修飾包括穀醯胺基及天冬醯胺基殘基之脫醯胺化，分別形成相應的麩胺醯及天冬胺醯殘基；脯胺酸及離胺酸之羥基化；絲胺醯或蘇胺醯殘基之羥基磷酸化；離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化(T.E.Creighton,Proteins：Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,第79-86頁(1983))；N末端胺之乙醯化；及任何C末端羧基之醯胺化。

非天然存在之CKP的另一類型之共價修飾包括以US 4640835、US 4496689、US 4301144、US 4670417、US 4791192或US 4179337中所闡述之方式將該非天然存在之CKP連接至多種非蛋白質聚合物之一，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。

術語「聚乙二醇」或「PEG」意謂聚乙二醇化合物或其在存在或不存在偶合劑、偶合或活化部分(例如存在硫醇、三氟甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯、環氮乙烷、環氧乙烷、N-羥基琥珀醯亞胺或馬來醯亞胺部分)之情況下的衍生物。術語「PEG」意欲指示分子量介於500與150,000Da之間的聚乙二醇，包括其類似物，其中舉例而言，末端OR基團已置換為甲氧基(稱為mPEG)。

在某些實施例中，用聚乙二醇(PEG)對本文中所描述之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)進行衍生化。PEG為具有兩個末端羥基之氧化乙烯重複單元之線性水溶性聚合物。PEG係藉由其分子量加以分類，其分子量典型地介於約500道爾頓至約40,000道爾頓之範圍內。在一目前較佳之實施例中，所採用之PEG具有介於5,000道爾頓至約20,000道爾頓之範圍內的分子量。與本文中所描述之非天然存在之CKP偶合的PEG可為分枝或無分枝的(例如，Monfardini,C.等人,1995 Bioconjugate Chem 6：62-69)。PEG可購自Nektar Inc.、Sigma Chemical Co.及其他公司。此種PEG包括但不限於單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(MePEG-S)、單甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧基聚乙二醇胺(MePEG-NH2)、單甲氧基聚乙二醇三氟乙磺酸酯(MePEG-TRES)及咪唑基羰基單甲氧基聚乙二醇(MePEG-IM)。

在某些實施例中，在一端以諸如甲氧基或乙氧基之無反應性基團對所採用之親水性聚合物(例如PEG)進行封端。此後，在另一端藉由與諸如氰尿醯鹵(例如氰尿醯氯、氰尿醯溴或氰尿醯氟)、二咪唑、酸酐試劑(例如二鹵琥珀酸酐，諸如二溴琥珀酸酐)、醯基疊氮、對二重氮苯甲醚、3-(對二重氮苯氧基)-2-羥基丙醚)及其類似物之適合活化劑反應來活化該聚合物。隨後使已活化之聚合物與本文中之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)反應，以產生經聚合物衍生化之非天然存在之CKP。或者，可將本文中所提供之非天然存在之CKP中的官能基活化以便與聚合物反應，或可在協同偶合反應中使用已知偶合方法來連接該兩個基團。應容易瞭解，本文中所提供之非天然存在之CKP可使用熟習此項技術者已知及使用之多種其他反應流程以PEG衍生化。

脂質體

本文中所揭示之非天然存在之CKP(諸如非天然存在之結合VEGF-A之CKP或非天然存在之結合LRP6之CKP)亦可調配為脂質體。含有本文中所描述之非天然存在之EETI-II骨架蛋白的脂質體可藉由本領域中已知的方法來製備，諸如以下文獻中所描述：Epstein等人,Proc Natl Acad Sci USA,82：3688(1985)；Hwang等人,Proc Natl Acad Sci USA,77：4030(1980)；及美國專利第4,485,045號及第4,544,545號。具有增加之循環時間的脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。

尤其適用之脂質體可藉由逆相蒸發法利用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生化磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物來產生。使脂質體經由具有限定孔徑之過濾器擠出以產生具有所要直徑之脂質體。該脂質體內亦視情況含有第二治療劑。參見Gabizon等人,J.National Cancer Inst.,81(19)：1484(1989)。

包含可結合人類血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然胱胺酸結肽(CKP)的醫藥組合物及調配物

在某些實施例中，本文中提供包含非天然存在之結合VEGF-A之CKP及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物。在某些實施例中，該組合物亦可含有緩衝劑、載劑、穩定劑、防腐劑及/或增積劑，以使該組合物適用於經眼投與患者以達成所要效應或結果。在某些實施例中，該醫藥組合物包含一或多種允許非天然存在之結合VEGF-A之CKP滲透角膜之滲透增強劑。此種滲透增強劑之實例包括例如界面活性劑、膽汁酸、螯合劑、防腐劑、環糊精(亦即，具有親水性外表面及親脂性內表面且與親脂性藥物形成複合物的圓柱形寡核苷酸)等。此種滲透增強劑增加化學穩定性及生物可用性且減少局部刺激。在某些實施例中，本文中所提供之醫藥組合物另外包含可增加非天然存在之結合VEGF-A之CKP在各種眼部隔室中之吸收及分佈的藥劑。在某些實施例中，本文中所提供之醫藥組合物包含交聯聚丙烯酸，由此可借助於其黏膜黏附性來提高經眼生物可用性。在某些實施例中，本文中所提供之醫藥組合物包含生物黏附性聚合物。

在某些實施例中，本文中所提供之醫藥組合物調配為原位膠凝系統，例如當該組合物接觸淚液時由於特定物理化學參數(離子強度、溫度、pH值或溶劑交換)之變化而在眼表面上展現溶膠至凝膠相過渡的基於黏性聚合物之液體。在某些實施例中，本文中所提供之醫藥組合物調配為眼部噴霧。在某些實施例中，所提供之醫藥組合物調配為脂質體。在某些實施例中，本文中所提供之醫藥組合物調配為非離子體(亦即，含有例如膽固醇作為賦形劑之基於非離子界面活性劑之囊泡)。在某些實施例中，本文中所提供之醫藥組合物調配為藥質體(亦即，由兩性藥物形成之囊泡)。在某些實施例中，本文中所提供之醫藥組合物調配為微乳液。關於各種眼用醫藥調配物之其他細節提供於例如以下文獻中：Gaikwad等人,(2013)Indo Amer J Pharm Res.3,3216-3232；Achouri等人,(2012)Drug Dev Indust Pharm.39,1599-1617；Lu(2010)Recent Pat Drug Deliv Formul.4,49-57；Baranowski等人,(2014)Sci World J.doi.org/10.1155/2014/861904；Lang(1995)Adv Drug Deliv Rev.16,39-43；Short(2008)Toxicologic Path.36,49-62；及其他。

在某些實施例中，包含本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的醫藥組合物在室溫下(諸如在約20℃至25℃下)可穩定約0.5週、約1.0週、約1.5週、約2.0週、約2.5週、3.5週、約4.0週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月或超過6個月，包括介於此等值之間的任何範圍。在某些實施例中，包含本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的醫藥組合物在加速條件(諸如在約37℃下儲存)下可穩定約0.5週、約1.0週、約1.5週、約2.0週、約2.5週、3.5週、約4.0週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月或超過6個月，包括介於此等值之間的任何範圍。

使用可結合人類血管內皮生長因子A(VEGF-A)之非天然存在之胱胺酸結肽(CKP)進行治療的方法

約40kDa之二聚糖蛋白血管內皮生長因子(VEGF-A)為可刺激增殖、移行及管形成從而引起新血管之血管生成生長及血管滲透增加的有效內皮細胞促分裂原。視網膜或角膜中之低氧條件誘導血管內皮生長因子(VEGF-A)之表現，且漏血管之異常(諸如過度或在其他方面不當)生長促成若干衰弱性眼病之病理，包括例如糖尿病性失明、視網膜病變、原發性糖尿病性視網膜病變、年齡相關性黃斑變性(AMD)、增生性糖尿病性視網膜病變(PDR)、早產兒視網膜病變(ROP)、脈絡膜新血管形成(CNV)、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、視網膜靜脈阻塞(視網膜分枝靜脈阻塞(BRVO)及視網膜中央靜脈阻塞(CRVO))、角膜新血管形成、視網膜新血管形成及虹膜發紅。VEGF-A誘導之新血管形成為不利的，且視網膜、小梁間或角膜新血管形成最終可導致視力喪失。

在某些實施例中，本文中提供治療個體之眼部疾病或病症之方法，其包括向該個體投與有效量之本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP或包含本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的組合物(諸如醫藥組合物)。在某些實施例中，提供包含本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的組合物(諸如醫藥組合物)以用於治療個體之眼部疾病或病症。在某些實施例中，提供本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)用於製造用以治療個體之眼部疾病或病症之藥物的用途。

在某些實施例中，欲治療之個體為哺乳動物(例如，人類、非人類靈長類、大鼠、小鼠、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓等)。在某些實施例中，該個體為人類。在某些實施例中，該個體為臨床患者、臨床試驗志願者、實驗動物等。在某些實施例中，該個體疑似患有或有風險患上以異常血管生成及/或異常血管滲透為特徵之眼部疾病或病症(諸如本文中所描述之彼等)。在某些實施例中，已診斷該個體患有以異常血管生成及/或異常血管滲透為特徵之眼部疾病或病症(諸如本文中所描述之彼等)。

在某些實施例中，該眼部疾病或病症為眼部血管增生性疾病，諸如選自由以下各項組成之群的眼部血管增生性疾病：糖尿病性失明、視網膜病變、原發性糖尿病性視網膜病變、年齡相關性黃斑變性(AMD)、增生性糖尿病性視網膜病變(PDR)、早產兒視網膜病變(ROP)、脈絡膜新血管形成(CNV)、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、視網膜靜脈阻塞(視網膜分枝靜脈阻塞(BRVO)及視網膜中央靜脈阻塞(CRVO))、角膜新血管形成、視網膜新血管形成及虹膜發紅。在某些實施例中，該角膜新血管形成引起眼睛感染、眼睛炎症、眼睛創傷(包括化學灼傷)或角膜緣幹細胞屏障喪失。在某些實施例中，該角膜新血管形成由皰疹性角膜炎、沙眼或盤尾絲蟲病引起。

在某些實施例中，如本文中在其他部分更詳細描述，將有效量之本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的組合物)直接投與個體之眼睛(諸如經玻璃體內或局部)。

在某些實施例中，該本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)與第二藥劑組合投與。對於眼部疾病或病症由炎性反應觸發之患者，可考慮利用消炎劑之組合療法。舉例而言，組合使用類固醇與本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然CKP之組合物)來分別減輕炎症並防止新血管形成在存在例如角膜新血管形成之患者中可能尤其有利。受細菌、病毒、真菌或棘狀變形蟲感染繼發性眼部疾病或病症困擾之患者可受益於投與本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)與抗微生物劑及視情況選用之消炎劑的組合。由於眼部疾病或病症而存在角膜基質血管之患者在角膜移植之後處於免疫排斥之重大風險下。因此，在角膜移植之前(且視情況在之後亦)投與本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)可能尤其有益於存在角膜基質血管之患者，因為成功減少角膜血管化將降低移植排斥之風險。在某些實施例中，該本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)與第二抗血管生成劑組合投與。在某些實施例中，該本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)與基質金屬蛋白酶(MMP)抑制劑組合投與。

在某些實施例中，該本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)與第二療法組合投與。在某些實施例中，該第二療法為雷射光凝療法(LPT)。LPT使用雷射光造成視網膜之受控損傷，以產生有益治療效應。短促雷射光可密封漏血管，破壞異常血管，密封視網膜裂孔，或破壞眼後部之異常組織。其快速、不具侵襲性，且通常無需除麻醉用點眼劑以外之麻醉。LPT技術及裝置對於眼科醫師而言為容易利用的(參見Lock等人,(2010)Med J Malaysia 65：88-94)。關於LPT之額外細節可見於例如WO 2014/033184中。

在某些實施例中，該第二療法為光動力療法(PDT)。PDT使用光活化分子對新生血管內皮造成局部損傷，從而導致血管阻塞。使用適合之眼科放大鏡經由纖維光纜及狹縫燈將光作為單一圓斑遞送至視網膜(雷射處理)。在雷射處理之前將光活化型化合物注入循環中，且在受新血管形成困擾之區域中藉由化合物之光活化施以損傷。一種常用光活化型化合物為維替泊芬(verteporfin)(Visudyne®)。維替泊芬主要藉由脂蛋白在血漿中輸送。一旦維替泊芬在氧之存在下由光活化，便產生高反應性短壽命單態氧及反應性氧自由基，由此損傷血管周圍之內皮。已知受損之內皮會經由脂加氧酶(白細胞三烯)及環加氧酶(類花生酸，諸如凝血脂素)途徑釋放促凝血因子及血管活性因子，從而導致血小板凝聚、纖維蛋白結形成及血管收縮。維替泊芬看似在某種程度上優先積聚在新血管結構中。用於光活化型化合物之光活化的雷射的波長可視所使用之特定光活化型化合物而變化。關於PDT之額外細節可見於例如WO 2014/033184中。

在某些實施例中，該第二療法為電療法及燒灼術，其中藉由單極電療單元施加凝結電流或藉由使用插入角膜緣處之滋養血管中的電解針進行熱燒灼來阻塞血管。

投藥

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)係例如經由注射投與，例如結膜下注射、角膜內注射或玻璃體內注射。通常以20-150μl，例如40-60μl或50μl之典型體積呈水溶液形式投與。注射可經由30號×1/2吋(12.7mm)針來進行。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)提供於即刻投與型預填充無菌注射器中。在某些實施例中，該注射器具有低矽酮含量或不含矽酮。該注射器可由玻璃製造。使用預填充注射器進行遞送所具有之優勢在於可避免投與前對無菌拮抗劑溶液之任何污染。預填充注射器亦為投藥眼科醫師提供更容易之處理。關於玻璃體內投藥之進一步細節，參見例如WO 2014/033184；Fagan等人,(2013)Clin Exp Ophthalmol.41,500-507；Avery等人,(2014)Retina.34增刊12,S1-S18；及Doshi等人,(2015)Seminar Ophthalmol.26,104-113。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)經局部，例如呈點眼劑形式投與。關於對眼睛進行局部藥物遞送之額外細節見於例如以下文獻中：Loftsson等人,(2012)Acta Ophthalmologica.90,603-608；Patel等人,(2013)World J.Pharmacol.2,47-64；Freeman等人,(2009)Exp Rev Ophthalmol.4,59-64；及Boddu等人,(2014)Recent Patents on Drug Delivery and Formulation.8,27-36。

在某些實施例中，使用玻璃體內裝置將該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)連續遞送至眼睛中。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)係經由眼部插入物(包括但不限於例如Ocusert、Lactiser、可溶性眼部藥物插入物(SODI)、Minidisc、接觸式透鏡、膜、濾紙條、人工淚插入物及膠原蛋白眼罩)投與。參見例如Gaikwad等人,(2013)Indo Amer J Pharm Res.3,3216-3232)。在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)作為緩慢釋放貯庫、眼部插塞/儲器、眼部植入物(諸如鞏膜或玻璃體植入物)投與。各種鞏膜及玻璃體內遞送系統在本領域中為已知的。此等遞送系統典型地為非生物可降解的，且可為主動或被動的。舉例而言，WO 2010/088548描述一種使用被動擴散來遞送治療劑之具有剛性體之遞送系統。WO 2002/100318揭示一種允許經由壓力差主動投藥之具有可撓性體之遞送系統。或者，可藉由可植入式微型泵來達成主動遞送。使用微型泵遞送治療劑之玻璃體內遞送系統的一個實例為由Replenish,Inc.出售之Ophthalmic MicroPump System^TM，該系統可經程式化以遞送設定量之治療劑，持續預定次數。在某些實施例中，將該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)囊封於小膠囊樣容器(例如，矽酮彈性體杯)中。通常將該容器植入眼中之虹膜上方。該容器包括釋放開口。可藉由位於該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)與該開口之間的膜或借助於與該容器連接之微型泵來控制該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)的釋放。或者，可將該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)沈積在緩慢釋放基質中，由此防止拮抗劑自容器中快速擴散。較佳地，該玻璃體內裝置經設計以便在前一個月中以較高初始速率釋放該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)。釋放速率例如在植入之後前一個月的過程中緩慢降至比初始速率低約50%的速率。該容器可具有足以容納持續約四至六個月之該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)之供應量的大小。因為當連續投藥時減少劑量之該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)可能足以實現有效治療，故該容器中之供應量可持續一年或更久，較佳約兩年，更佳約三年。因為僅需要小手術來植入遞送系統且避免玻璃體內注射，故可避免患者順應性問題與重複玻璃體內注射。該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)的玻璃體內濃度得以降低，且因此，由該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)進入循環所致之潛在副作用風險得以降低。

在某些實施例中，該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)係經由離子電滲法投與。離子電滲法為非侵襲性技術，其中施加小電流以增強電離之藥物向組織中滲透(參見例如Myles等人,(2005)Adv Drug Deliv Rev 57,2063-79；及Eljarrat-Binstock等人,(2006)J Controlled Release 110,479-89)。用攜帶與藥物相同之電荷的電極來施加藥物，並且將具有相反電荷的接地電極置放在身體上之其他處以完成電路。藥物充當通過組織之電流的導體。

關於向眼睛投與藥物之額外細節提供於例如以下文獻中：Kuno等人,(2011)Polymers 3,193-221；Short(2008)Toxicologic Path.36,49-62；Ghate等人,(2006)Expert Opin Drug Deliv 3,275-87；Davis等人,(2004)Curr Opin Mol Therap 6,195-205；Gaudana等人,(2010)AAPS J.12,348-360；及其他。

緩慢釋放/長期作用遞送調配物

在某些實施例中，提供呈緩慢釋放調配物形式之非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)。典型地藉由將治療劑與生物可降解聚合物混合或將其囊封至微粒中來獲得緩慢釋放調配物。

根據本發明之緩慢釋放調配物典型地包含該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)、聚合物載劑及用於調節該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)自該聚合物載劑之釋放速率的釋放調節劑。藉由改變基於聚合物之遞送組合物的製造條件，可調節所得組合物之釋放動力學性質。該聚合物載劑通常包含一或多種生物可降解聚合物或其共聚物或組合。舉例而言，該聚合物載劑可選自聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、聚酯、聚(原酸酯)、聚(膦嗪)、聚(磷酸酯)、聚己內酯或其組合。

在某些實施例中，該聚合物載劑為PLGA。該釋放調節劑典型地為較佳包含10至40個碳原子之長鏈脂肪醇。常用釋放調節劑包括辛醇、壬醇、癸醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鯨蠟醇、棕櫚油醇、硬脂醇、異硬脂醇、反油醇、油醇、亞麻油醇、多不飽和反亞麻油醇、多不飽和亞麻醇、反亞麻醇、多不飽和蓖麻油醇、花生醇、二十二醇、瓢兒菜醇、木蠟醇、蠟醇、褐煤醇、二十八醇、蜂花醇、蜂蠟醇及三十四醇。

在某些實施例中，將該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)併入基於微球體之持續釋放組合物中。在某些實施例中，該等微球體由PLGA製備。可藉由改變用於製備該等微球體之條件來控制併入微球體中之非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)的量及非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)的釋放速率。用於製造此種緩慢釋放調配物之方法描述於US 2005/0281861及US 2008/0107694中。

在某些實施例中，將該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)併入生物可降解之植入物(諸如微針)中。基質植入物(諸如微針)典型地用於治療眼部疾病，其需要一個負載劑量隨後在1天至6個月時間段期間逐漸減少藥物劑量(Davis等人,(2004)Curr Opin Mol Therap 6,195-205)。其最通常由將降解成水及二氧化碳之共聚物聚乳酸(PLA)及/或聚乳酸-乙醇酸(PLGA)製成。可藉由改變乳交酯(緩慢)及乙交酯(快速)之相對濃度、改變聚合物重量比、添加額外聚合物塗層或使用疏水性不溶性藥物來降低藥物自植入物中釋放之速率及程度。藥物釋放一般遵循一級動力學，其中藥物水準在初始爆發後快速降低。不需要移除生物可降解植入物，因為其隨時間而溶解(Hsu(2007)Curr Opin Ophthalmol 18,235-9)。生物可降解植入物亦允許劑量及治療自短持續時間(數週)至較長持續時間(數月至一年)變動，視聚合物PLA/PLGA比率而定，此為針對疾病進展定製藥物遞送之另一益處，因為劑量及治療要求可能隨時間而變化。關於製造及植入生物可降解植入物(諸如PLGA或PLA植入物)以用於經眼投與之額外細節提供於例如WO 2006/093758、US 2006/0182783、WO 2009/026461、US 2008/0181929、US 2009/0263460、US 2010/0015158、US 2011/0207653及US 2014/0154321中。關於用於眼部藥物遞送之微針的額外細節提供於例如以下文獻中：Donnelly等人,(2010)Drug Deliv 14,187-207；USP7918814，Yavux等人,(2013)Sci World J.doi.org/10.1155/2013/732340；及其他文獻。

製品及套組

在某些實施例中，提供含有本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP及適用於治療眼部疾病或病症(諸如眼部血管增生性疾病或以過度血管生成為特徵之眼部病症)之物質的製品。該製品可包括容器及處於該容器上或與該容器相關聯之標籤或包裝插頁。適合之容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。該等容器可由多種材料形成，諸如玻璃或塑膠。在某些實施例中，該容器容納對治療眼部疾病或病症(諸如眼部血管增生性疾病或以過度血管生成為特徵之眼部病症)有效之組合物且可具有植入緩慢釋放眼部或眼內藥物遞送系統所需之一整套物品，包括但不限於注射裝置、局部及可注射藥物、手術儀器、縫合線及縫合針以及眼罩。在某些實施例中，該容器容納無菌單位劑量包裝。該組合物中之至少一種活性劑為本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP。該標記或包裝插頁指示該組合物用於治療眼部疾病或病症(諸如眼部血管增生性疾病或以過度血管生成為特徵之眼部病症)。該標記或包裝插頁將進一步包括關於向患者投與該非天然存在之結合VEGF-A之CKP(或包含此種非天然存在之CKP的組合物)的說明。亦涵蓋包含本文中所描述之組合療法的製品及套組。

包裝插頁係指照例包括在治療產品之商業包裝中之說明書，其含有關於與使用此種治療產品相關之適應症、用法、劑量、投與、禁忌及/或警告的資訊。在某些實施例中，該包裝插頁指示包含該非天然存在之結合VEGF-A之CKP的組合物用於治療眼部疾病或病症(諸如本文中所描述之眼部血管增生性疾病或以過度血管生成為特徵之眼部病症)。

亦提供適用於多種目的，例如用於分離或偵測VEGF-A之視情況與該等製品組合之套組。對於VEGF-A之分離及純化，該套組可含有與珠粒(例如，瓊脂糖凝膠珠粒)偶聯之本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP。可提供含有本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的套組，以用於在活體外，例如在ELISA或墨點法中對VEGF-A進行偵測及定量。如同該製品，該套組包括容器及處於該容器上或與該容器相關聯之標籤或包裝插頁。舉例而言，該容器容納包含至少一種本文中所描述之非天然存在之結合VEGF-A之CKP的組合物。可包括含有例如稀釋劑及緩衝劑、對照抗體等之額外容器。該標籤或包裝插頁可提供組合物之描述以及關於預定活體外或診斷用途之說明。

實例

實例1：用於實例2至實例3之材料及方法

在M13噬菌體上呈現EETI-II。

藉由修飾先前描述之噬菌體質體pS2202b將EETI-II呈現於M13噬菌體之表面上(Skelton,N.J.,Koehler,M.F.,Zobel,K.,Wong,W.L.,Yeh,S.,Pisabarro,M.T.,Yin,J.P.,Lasky,L.A.及Sidhu,S.S.(2003)Origins of PDZ domain ligand specificity.Structure determination and mutagenesis of the Erbin PDZ domain.J Biol Chem 278,7645-7654)。使用標準分子生物學技術以編碼EETI-II之DNA片段置換編碼Erbin PDZ結構域之pS2202d片段。所得噬菌體質體(p8EETI-II)含有編碼麥芽糖結合蛋白分泌信號之開放閱讀框，隨後為gD標籤及EETI-II，且以M13主要外鞘蛋白p8封端。用M13-KO7輔助噬菌體對帶有p8EETI-II之大腸桿菌進行共感染，且使培養物在30℃下在補充有50μg/ml羧苄青黴素及25μg/ml卡那黴素之30ml 2YT培養基中生長隔夜。根據標準方案來純化所繁殖之噬菌體(Tonikian,R.,Zhang,Y.,Boone,C.及Sidhu,S.S.(2007)Identifying specificity profiles for peptide recognition modules from phage-displayed peptide libraries.Nat Protoc 2,1368-1386)，且再懸浮於1ml PBT緩衝液(PBS、0.5% BSA及0.1% TWEEN®20)中，從而產生囊封p8EETI-II DNA及所呈現之EETI-II的噬菌體粒子。使用噬菌體ELISA來分析呈現水準。

文庫構建及分選。

遵循Kunkel突變誘發方法來構建EETI-II文庫(Kunkel,T.A.,Roberts,J.D.及Zakour,R.A.(1987)Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Methods Enzymol 154,367-382)。構建三個文庫：文庫1，其中用編碼除Cys以外之所有天然胺基酸的簡併密碼子以6、8或10個胺基酸之長度使環1(3-8)隨機化；或文庫2，其中用同一組簡併密碼子以5個胺基酸之固定長度使環5(22-26)隨機化；或文庫3，其中以6、8及10個胺基酸使環1隨機化且同時用編碼19個胺基酸之簡併密碼子以5個胺基酸使環5隨機化。使用編碼19個胺基酸之三聚亞磷醯胺在等莫耳濃度下之定製混合物(Glen Research，Sterling，VA)來合成用於突變誘發之寡核苷酸。終止模板為p8EETI-II之在3-26區域中含有三個終止密碼子的單股DNA，且用於構建所有三個文庫。三個文庫之庫含有約3×10¹⁰個獨特成員，且循環通過遵循標準方案針對俘獲在培養板上之hVEGF(8-109)的數輪結合選擇(四輪)(Tonikian,R.,Zhang,Y.,Boone,C.及Sidhu,S.S.(2007)Identifying specificity profiles for peptide recognition modules from phage-displayed peptide libraries.Nat Protoc 2,1368-1386)，其中變化之處在於使用25ug/ml hVEGF(8-109)來塗佈培養板且藉由使隔夜培養物在30℃下生長使所溶離之噬菌體繁殖。

斑點噬菌體ELISA。

在四輪結合選擇之後，揀選個別噬菌體純系且接種至96孔板中含有50μg/ml羧苄青黴素及M13-KO7輔助噬菌體之450μl 2YT培養基中，使其在37℃下生長隔夜。利用斑點噬菌體ELISA分析上清液，如下：將hVEGF(8-109)或BSA塗佈於384孔MAXISORP^TM免疫培養板上並且將經PBT緩衝液稀釋(1：3)之噬菌體上清液添加至各孔。洗滌培養板且依序用抗M13-HRP及TMB受質來偵測已結合之噬菌體。在此等分析中，並行測試與單獨BSA之噬菌體結合以評估背景結合。對hVEGF-A(8-109)之結合信號比BSA(背景)高出超過3倍的純系被視為陽性。對陽性純系進行DNA序列分析。

結晶學。

為了形成穩定複合物，將VEGF-A濃縮至7mg/ml且與6倍莫耳過量之VEGF_CKP9.54.90變異體一起培育。藉由懸滴氣相擴散法，使用2：1蛋白質：儲備溶液之懸滴比來使原始單斜空間群P12₁1之VEGFA/VEGF_CKP9.54.90晶體在19℃下生長。儲備溶液含有100mM HEPES pH 7.4及26% PEG 3350。在資料收集之前，在補充有25% PEG 200之儲備溶液中對晶體進行低溫保護且在液氮中快速冷凍。

資料收集及結構確定。

在先進光子源上以光束線21IDF針對1.64Å收集X射線繞射資料。使用iMosflm處理資料。藉由使用Phenix中之Phaser，以先前公開之apo VEGF-A結構(PDB：1VPF)(作為檢索模型)及不對稱單元中之一個VEGF-A二聚體進行分子置換來解出結構。VEGF_CKP9.54.90變異體存在明顯F_o-F_c密度，因此，使用Coot將此變異體之結構手動地包括在密度中，且隨後使用Phenix及Coot進行數輪疊代精化及重建。

用於測定細胞IC ₅₀ 之KDR-CHO VEGF分析

使KDR-CHO細胞(經gD標籤化KDR穩定轉染之CHO細胞)在細胞生長培養基(DMEM/Ham氏F-12、10%經透析過濾之FBS(GIBCO目錄號26400)、25mM HEPES、2mM L-GLUTAMAX^TM)中生長。對於VEGF刺激分析，將5×10⁴個細胞/孔接種於96孔組織培養板中之100μl細胞接種培養基(DMEM/Ham氏F-12、0.2% BSA、0.25%經透析過濾之FBS、25mM HEPES、2mM L-GLUTAMAX^TM)中且在37℃下培育隔夜。將該培養基替換為100μ1無血清細胞刺激培養基(DMEM/Ham氏F-12、0.5% BSA、25mM HEPES)且在37℃下將細胞培育2小時。在刺激之前一小時，將該培養基替換為50μl無血清細胞刺激培養基。同時，在37℃下在50μl無血清細胞刺激培養基中將VEGF(對於hVEGF，50ng/ml；對於mVEGF及rVEGF，100ng/ml)與滴定量之CKP或抗VEGF一起預培育1小時且添加至細胞。在37℃下將細胞刺激15min且移除培養基。用130μl冰冷細胞溶解緩衝液(150mM NaCl、50mM HEPES、0.5% Triton-X 100、HALT蛋白酶與磷酸酶抑制劑混合液(ThermoFisher Scientific,Inc.，目錄號78444)、5mM EDTA)來溶解細胞。藉由基於ELISA之分析法來測定KDR之VEGF介導之Tyr磷酸化。簡而言之，在4℃下以100μl稀釋於PBS中之抗gD抗體(1μg/ml)塗佈MAXISORP^TM 96孔培養板(ThermoFisher Scientific,Inc.，目錄號439454)隔夜且用洗滌緩衝液(PBS、0.05% TWEEN®20，pH7.4)洗滌三次。在室溫下用300μ1阻斷緩衝液(PBS、0.5% BSA)阻斷培養板1小時，隨後用洗滌緩衝液洗滌三次。將以上KDR-CHO細胞溶解物(100μl)添加至各孔且在室溫下培育2小時。用洗滌緩衝液將培養板洗滌四次，隨後在室溫下在阻斷緩衝液中與100μl之0.5μg/ml生物素結合抗磷酸酪胺酸(純系4G10，Millipore目錄號16-103)一起培育2小時。在洗滌四次之後，在室溫下在阻斷緩衝液中將培養板與100μl HRP結合鏈黴親和素一起培育30min。在洗滌四次之後，在室溫下用100μl TMB受質(BD Biosciences)使培養板顯色20至30min，且藉由添加50μl H₂SO₄溶液來終止。使用設定至450nm之微板讀數器來測定各孔之光學密度。

競爭ELISA

藉由競爭ELISA來確定各肽之結合特異性。首先，藉由在4℃下將含2或5μg/mL VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGf-2、NGF、EGF、PDGF-ββ或IGF-1之PBS塗佈在MAXISORP^TM培養板中隔夜來證實各生長因子與其相應受體以培養板-ELISA格式結合。在室溫下用阻斷緩衝液(含0.5% BSA及0.05% TWEEN®20之PBS)阻斷2小時之後，使用分析緩衝液(含0.5% BSA及0.05% TWEEN®20之PBS)連續稀釋受體-Fc融合物或生物素化受體且在室溫下培育1小時。藉由分別與抗人類Fc-HRP(Life Technologies)或高親和力鏈黴親和素-HRP(ThermoFisher Scientific,Inc.)一起培育30min來偵測已結合之受體-Fc或生物素化受體的量。用與以上所描述相同之方式進行競爭ELISA，但在阻斷之後，添加含有恆定濃度之受體-Fc融合物或生物素化受體之連續稀釋肽混合物(受體濃度設定至EC₆₀)且培育1小時。所有重組人類蛋白質及抗體均購自R & D Systems(Minneapolis，MN)。

SPR結合分析。

在BIACORE^TM 3000儀器(GE Healthcare)上，在37℃下使用含有0.1% DMSO(v/v)之HBS-EP緩衝液(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA及0.005% v/v界面活性劑P20)使用表面電漿子共振技術來評估VEGF-A抑制劑之結合動力學及親和力。視分析格式而定，如以下所描述利用鏈黴親和素感測器(SA)或葡聚糖塗佈(CM5)感測器。

在與SA感測器一起使用時，首先藉由在冰上將蛋白質與EZ-連接NHS-PEG4-生物素(Pierce)分別以1：1.5莫耳比在PBS中培育2小時將VEGF-A生物素化(不超過2個生物素/VEGF-A)。隨後藉由添加10倍莫耳過量之甘胺酸pH 8.0來淬滅反應物且使用Amicon 0.5mL 3000 MWCO超離心過濾器(EMD Millipore)將樣品緩衝液交換至PBS中。藉由LC-MS分析來驗證蛋白質之生物素化狀態。隨後將生物素化VEGF-A俘獲在表面上直至約~400之共振單位(RU)信號。為了將VEGF-A固定在CM5感測器上，首先根據供應商說明用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽及N-羥基琥珀醯亞胺之混合物(EDC/NHS)活化表面。隨後將VEGF-A稀釋至偶合緩衝液(0.1M乙酸鹽緩衝液，pH 5.0)中並且注入，直至信號達到約~400RU，隨後用1M乙醇胺pH 8.0洗滌以淬滅其餘已活化之位點。

在俘獲步驟之後，在具有相匹配之DMSO濃度的HBS-EP緩衝液中製備一系列肽濃度(直至0.1%)，且以80μL/min之流速注入。隨後使用Scrubber 2.0(BioLogic Software)，使用1：1結合模型來分析所得感測圖以獲得動力學資料及親和力。

CKP合成及摺疊。

將線性前驅物LRP6肽溶解於DMSO(0.5mg/mL)、0.1M碳酸氫銨(pH 9)、含1mM還原谷胱甘肽之50% DMSO中且在室溫下在振盪的同時培育24h。在C18管柱上藉由RP-HPLC來純化摺疊之CKP，且隨後藉由質譜分析所收集之溶離份，彙集並凍乾，然後使用。

細胞培養及轉染。

用螢火蟲螢光素酶Wnt報告子穩定轉染HEK293細胞(Gong等人,(2010)PLoS ONE 5,9：e12682)。且使pRL-SV40海腎螢光素酶(Promega)在補充有10% FBS、2mM GLUTAMAX^TM及40μg/ml潮黴素之DMEM：F12(50：50)中生長至90%匯合。在5% CO₂濕潤培育箱中在37℃下將細胞培育24h。在培育之後，將細胞胰蛋白酶化(含0.05% Gibco 15400-54之PBS)，隨後在補充有10% FBS、2mM GLUTAMAX^TM之DMEM：F12(50：50)中稀釋至4×10⁵個細胞/ml。將20,000個細胞裝載至白色microtest 96孔optilux培養板(目錄號353947)之個別孔中並且培育~24h。使用FUGENE® HD，以Wnt1-pCDNA3.2(5ng/孔)或Wnt3a-pCDNA3.2(25ng/孔)轉染各孔，隨後生長24h。將所有結合LRP6之變異體稀釋於DMSO中且以0、0.1、0.1、1.0、10及100μM之肽濃度添加至細胞，最終DMSO濃度為1%，持續6小時。對於刺激，在PBS中將重組Wnt3a(5036-WN-010/CF，R & D Systems)稀釋至50ng/mL且添加至含所指示之CKP的培養基中。

隨後，用Promega之DUAL-GLO®套組，根據製造商之說明但使用各試劑之體積的一半來量測所有分析中之螢光素酶反應。在Perkin Elmer ENVISION^TM多標記讀數器上量測螢火蟲發光及海腎發光。計算螢火蟲發光：海腎發光之比且針對表現所指示之Wnt蛋白或經所指示之Wnt蛋白處理的對照細胞中的比率進行標準化。在Prism Graphpad中使用對數(抑制劑)相對於標準化反應使用標準化資料來計算抑制常數：可變斜率Y=100/(1+10^((LogIC₅₀-X)*希爾斜率))。使用Holm-Sidak方法以α=5.000%來確定統計顯著性。計算假定所有列均為來自具有相同散射(SD)之群體的樣品且使用額外平方和F檢驗(其中當顯著時P<0.05)將IC₅₀鑑別為顯著不同。

實例2A：可結合VEGF-A之非天然存在之EETI-II變異體的產生

選擇EETI-II(圖1)作為骨架用於呈現在M13噬菌體之表面上。將EETI-II融合至M13主要外鞘蛋白p8之N末端。此外，gD標籤為EETI-II序列之經工程改造之N末端，以便驗證呈現水準。基於EETI-II構架產生三個肽噬菌體文庫，如下：文庫I，其中使環1胺基酸殘基隨機化且環長度為可變的(6、8、10個殘基)；文庫II，其中使環5胺基酸殘基隨機化且天然環長度為固定的；及文庫III，其中同時使環1及環5在胺基酸內含物方面隨機化，且環1長度自6至10個胺基酸殘基變化，而環5長度為固定的。總而言之，三個文庫含有3×10¹⁰個獨特成員且循環通過針對VEGF-A之數輪選擇。

針對VEGF-A之淘選產生與hVEGF_8-109結合之十三個獨特變異體(參見表19)。此等變異體在環1中或在環1及環5兩者中同時含有胺基酸組成變化。此外，許多變異體具有與EETI-II中所存在之天然環相比更長之環。保守YXS基元亦可見於環5中。吾等產生對應於此等獨特變異體中之七者的可溶性摺疊胱胺酸結肽，且其在噬菌體競爭ELISA中均顯示與hVEGF-A結合(表19)。此外，吾等在細胞分析中評估一些變異體且其顯示對人類、小鼠及大鼠VEGF-A活性之跨物種抑制，具有低μM之IC₅₀。

表20：針對hVEGF-A之可溶性基於EETI-II之結合劑的噬菌體競爭ELISA及細胞抑制活性

為了進一步改良此等變異體之效力，吾等對VEGF_CKP7及VEGF_CKP9進行跟進。在VEGF-CKP7構架內對環1及環5進行軟隨機化，產生與人類VEGF-A結合的16個獨特變異體(參見以下表21)。

在VEGF-CKP9構架內對環1及環5進行軟隨機化，產生與人類VEGF-A結合的16個獨特變異體(參見以下表22至表24)。

*S/N=與BSA對照相比之信號雜訊比

選擇此等純系以用於在噬菌體滴定分析中進一步驗證，並且產生對應於此等序列中之十者的可溶性摺疊形式以用於進一步活體外評估(參見以下表25)。在此組變異體中，與親本VEGF-CKP9相比，VEGF_CKP9.2、VEGF_CKP9.54及VEGF_CKP9.63在活體外及細胞分析中對VEGF-A展現改良之效力，IC₅₀在100至200nM範圍內(參見表25)。

為了提高效力，吾等選擇前導9.54及9.63分子且基於此等構架產生新噬菌體庫，其中使環2隨機化。針對hVEGF-A淘選新文庫且產生許多環2變異體，與親本9.54及9.63分子相比，該等變異體對VEGF-A顯示顯著提高之效力(分別參見以下表26及表27)，其中最有效之分子展現介於0.5至2nM範圍內之IC₅₀(參見以下表28)。

表26：基於9.54構架的親和力成熟型結合VEGF-A之環2變異體

表27：基於VEGF_CKP9.63構架的親和力成熟型結合VEGF-A之環2變異體*S/N=與BSA對照相比之信號雜訊比

VEGF_CKP9.63.1、VEGF_CKP9.63.27、VEGF_CKP9.63.44、VEGF_CKP9.63.69及VEGF_CKP9.63.12對hVEGF-A(8-109)之親和力/效力示於以下表29中。

如藉由表面電漿子共振所測定，變異體VEGF_CKP9.54.90(參見表26之第2列)及VEGF_CKP9.63.12(參見表27之第6列)以及親本變異體VEGF_CKP9.54(參見表24之第12列)及VEGF_CKP9.63(參見表24之第15列)以類似之親和力結合人類、小鼠、大鼠及兔VEGF-A。參見以下表30。

VEGF_CKP9.54.90亦對VEGF-A具有高選擇性且不結合或抑制其他VEGF同功異型物(諸如VEGF-B、VEGF-C及VEGF-D)或其他生長因子(諸如P1GF、EGF、NGF、IGF及PDGF)之活性。如圖2A及圖2B中所示，變異體VEGF_CKP9.54.90破壞VEGF-A與KDR之間的相互作用以及VEGF-A與Flt-1之間的相互作用，但不破壞VEGF-B與Flt-1之間、VEGF-C與Flt-4之間的相互作用、VEGF-D與Flt-4之間、PIGF-2與Flt-1之間、EGF與EGFR之間、PDGF與PDGFR之間、NGF與NGFR之間或IGF與IGFR之間的相互作用。

如在肽受質裂解分析中所測定，不同於EETI-II，VEGF_CKP9.54.90、VEGF_CKP9.54及VEGF_CKP9.63.12不抑制胰蛋白酶活性(Stanger等人,(2014)FEBS Lett.588(23),4487-96)。參見圖3。然而，VEGF_CKP9.54.90及VEGF_CKP9.63.12維持一定程度之抗胰蛋白酶消化性(參見圖4)。在37℃下與胰蛋白酶一起進行24h培育之後，約20%之VEGF_CKP9.54.90在環2內之Arg13處裂解。

VEGF_CKP9.54、VEGF_CKP9.63及VEGF_CKP9.54.90各自大致含有具有3個轉角之α-螺旋，且各自採用與野生型EETI-II不同的二硫鍵特徵(VEGF_CKP9.54.90之C1-C4、C2-C3、C5-C6相對於野生型EETI-II之C1-C4、C2-C5、C3-C6)。參見圖5。在該螺旋之一側上，VEGF_CKP9.54.90形成由兩個二硫鍵(C1-C4及C2-C3)橋接之稠合二環結構，從而涵蓋環1、環2及環3，以及該α-螺旋之~1.5個轉角。環5形成在該螺旋之相對側上且受C5-C6二硫鍵約束。

獲得VEGF_CKP9.54、VEGF_CKP9.63及VEGF_CKP9.54.90與VEGF-A之複合物的共晶結構。VEGF_CKP9.54、VEGF_CKP9.63及VEGF_CKP9.54.90與VEGF-A之複合物的共晶結構非常相似。關於VEGF_CKP9.54與VEGF-A之複合物的共晶結構，參見圖5及圖6。鑒於VEGF_CKP9.54、VEGF_CKP9.63及VEGF_CKP9.54.90之結構非常相似(參見圖5及圖6)，用VEGF_CKP9.54.90進行進一步研究。由VEGF_CKP9.54.90之殘基Phe15至Tyr26限定之螺旋與VEGF-A表面形成廣泛疏水性及極性相互作用(參見以下表31)。另外，主幹H鍵之網狀結構形成在具有~3個轉角之α螺旋內且使其穩定。一般而言，VEGF_CKP9.54.90展現藉由分子內極性及疏水性接觸(包括主幹-主幹、側鏈-主幹及側鏈-側鏈相互作用)加以穩定之緊湊剛性結構(表32)。VEGF_CKP9.54.90之接觸VEGF-A之表面本質上主要為疏水性的且具有極少極性側鏈(表31)，而該肽之不與VEGF-A相互作用之相對表面係暴露於溶劑的且本質上主要為極性的。

VEGF_CKP9.54.90在VEGF-A上之結合界面與天然受體及G6.31抗體重疊(圖7及圖8)。VEGF-A上處於肽界面中之接觸殘基彙總於表33中且示於圖9中。VEGF-A上之VEGF_CKP9.54.90結合抗原決定基與雷尼珠單抗及貝伐珠單抗不同(圖10)，該二者不結合小鼠或大鼠VEGF-A，因為其與人類VEGF-A之相互作用依賴於齧齒動物中經Ser取代之關鍵Gly88殘基。VEGF_CKP9.54.90之結合模式表明，其實質上不依賴於Gly88，且此觀點由該肽有效地結合人類及齧齒動物VEGF-A兩者之觀測結果驗證。利用定點突變誘發來驗證自晶體結構觀測到之蛋白質-肽界面中之許多接觸。不出所料，VEGF-A上之Y21A、Q89A及F17A/M81A突變導致VEGF_CKP9.54.90在VEGF-A上之結合減少。參見圖11。然而，K48A突變使VEGF_CKP9.54.90之結合增強~2至3倍，此特性類似於利用G6.31抗體下所觀測者(Fuh等人,(2006)J.Biol.Chem.281,6625-6631)。參見以下表34及圖11。

接下來，評估VEGF-A結合變異體VEGF_CKP9.54.90、VEGF_CKP9.63.12及VEGF_CKP9.63.44在脈絡膜新血管形成之VEGF-A驅動模型中的活體內效力。在大鼠眼睛中產生雷射灼傷斑且在14天週期之後在存在及不存在以不同的間隔經玻璃體內投與之肽的情況下監測新血管形成。肽VEGF_CKP9.54.90顯示有效抑制大鼠眼睛中之雷射誘導之脈絡膜新血管形成，如藉由與對照眼睛相比在經肽治療之眼睛中在新血管面積方面所觀測之顯著減少所量度。參見圖12。

VEGF_CKP9.54.90與VEGF-A之複合物的共晶結構顯示，環3及環4中之天然胺基酸殘基就與VEGF-A結合而言未必呈最佳取向(參見圖9)且可經修飾以增強其與VEGF-A表面之相互作用或在該肽內引發可改良肽摺疊及穩定性之分子內相互作用。因此，在進一步改良前導分子之效力及特性的目標下，基於9.54、54.1及9.63、63.12之序列構建新噬菌體庫，其中僅使環3及環4隨機化。儘管稍弱於前導分子，但仍選擇此等特定構架以便在分析中允許充分動態範圍以偵測親和力之改良。經鑒定，僅在環3及環4中含有變化之許多新純系顯示與VEGF-A之結合有所改良。選擇十四個所獲得之序列且接枝至前導VEGF_CKP9.54.90或VEGF_CKP9.63.12分子內之環3及環4上，且隨後產生呈摺疊形式之相應可溶性分子。該十四個親和力成熟型變異體之胺基酸序列提供於以下表35中。

含有L3/L4變化之所有可溶性分子均顯示在細胞分析中之效力相對於54.90或63.12.12有所改良。三個前導分子VEGF_CKP9.54.90.67、VEGF_CKP9.54.90.53及VEGF_CKP9.63.12.12具有在約0.5至約1nM之範圍內的細胞IC₅₀值。參見圖13及以下表36。

VEGF_CKP9.63與VEGF-A之複合物的共晶結構顯示，環1內之位置8上的Tyr殘基可與VEGF-A上之Gln22的側鏈形成氫鍵。參見 圖14。在來源於VEGF_CKP9.54之變異體(諸如表35中之變異體)中，位置8上之胺基酸為Phe。因此，吾等設法使表35中之一些變異體中的Phe8突變至Tyr I，目的在於改良所得F8Y變異體之親和力及/或溶解度。F8Y突變顯示對一些分子(例如VEGF_CKP9.54.1.F8Y、VEGF_CKP9.54.90.F8Y及VEGF_CKP9.54.90.67.F8Y)之親和力/效力的適度改良，而在極少其他情況下，其顯示極小或稍微消極之效應(例如VEGF_CKP9.54.90.13.F8Y及VEGF_CKP9.54.90.62.F8Y)。參見表37，其中比較某些變異體之結合親和力(如藉由表面電漿子共振所測定)，及表38，其中比較某些變異體之效力(如藉由細胞IC₅₀所測定)。F8Y取代有助於使VEGF_CKP9.54.90.67.F8Y之溶解度提高約2mg/ml。選擇VEGF_CKP9.54.90.67.F8Y用於進一步跟進研究。

如下分析各種CKP變異體之氧化穩定性：將5μL含11mM AAPH(Calbiochem目錄號100110)之水添加至50uL變異肽樣品(製備為含1mg/mL肽之20mM組胺酸乙酸鹽pH 5.5)並且在40℃下將混合物培育16小時。在培育結束時，藉由添加27.5uL 40mM甲硫胺酸來淬滅樣品，隨後添加160ul 20mM組胺酸乙酸鹽、100mM蔗糖(pH 5.5)以稀釋樣品。藉由LC-MS分析反應物。

據觀測，VEGF_CKP9.54.90在環1內之Met5處經歷~30%氧化。用非天然胺基酸正白胺酸置換Met 5致使VEGF_CKP9.54.90完全抗氧化。用正白胺酸置換Met5亦對結合效率具有良好效應(~2倍提高)。產生變異體VEGF_CKP9.54.90.67 F8Y M5Nle、VEGF_CKP9.54.90.53 M5Nle及VEGF_CKP9.63.12.12 M5Nle。Met5Nle變異體之所有三個Met5Nle均顯示與其親本分子相比細胞效力適度改良~1.5至2倍。

接下來評估VEGF_CKP9.54.90之環1中之Trp9處的基於萘之胺基酸取代對VEGF-A結合親和力之效應。VEGF_CKP9.54.90與VEGF之複合物的晶體結構指示VEGF_CKP9.54.90(及由其衍生之變異體)的Trp9殘基與VEGF-A表面相互作用，而其餘空間可能允許大環系統融入。為了驗證此假設，吾等產生VEGF_CKP9.54.90之可溶性變異體，其中以1-萘基異構體或2-萘基異構體置換Trp9之吲哚環。此等分子顯示細胞效力相對於親本VEGF_CKP9.54.90有所降低。關於包含F8Y取代及/或非天然胺基酸取代之VEGF_CKP9.54.90衍生變異體之效力的其他資料提供於表38中：

藉由剪除N末端及C末端之兩個甘胺酸殘基使前導VEGF_CKP9.54.90.F8Y縮短以產生變異體VEGF_CKP9.54.90 F7YΔ2G)導致細胞效力相對於VEGF_CKP9.54.90稍微降低。參見以上表38。

實例2B：包含C末端胺基酸延伸之結合VEGF-A之非天然存在之EETI-II變異體的產生

為了鑑別對VEGF-A具有增強之親和力的額外肽變異體，吾等選擇9.54(SEQ ID NO：52)、9.54.1(SEQ ID NO：99)分子且基於此等構架產生新噬菌體庫，其中向其C末端添加兩個額外胺基酸。

自9.54文庫中，鑑別出對hVEGF-A(8-109)之結合信號比與BSA(背景)之結合信號高出超過3倍的二十二個純系(表39)。此等中選者在環2內、在環2及環4內或在環2、環4及環5內含有胺基酸組成變化。

自9.54.1文庫中，鑑別出對hVEGF-A(8-109)之結合信號比與BSA(背景)之結合信號高出超過3倍的純系(表40)。

如藉由噬菌體競爭ELISA(如以上所描述)所測定，純系9.54-28(表39中)顯示對hVEGF-A(8-109)之結合親和力與9.54相比提高約10倍。(參見圖15)。如藉由噬菌體競爭ELISA所測定，純系9.54.1-2、9.54.1-36、9.54.1-42、9.54.1-63及9.54.1-90(表40中)亦顯示對hVEGF-A(8-109)之結合親和力與9.54.1相比提高約10倍。(参见图15)。

選擇肽9.63(SEQ ID NO：55)及9.63.44(SEQ ID NO：125)以便如以上所描述進行進一步修飾。產生基於此等構架之新噬菌體庫，其中向其C末端添加兩個額外胺基酸。

自9.63文庫中，鑑別出對hVEGF-A(8-109)之結合信號比與BSA(背景)之結合信號高出超過3倍的28個純系(表41)。此等中選者在環2及環4內含有胺基酸組成變化。

自9.63.44文庫中，鑑別出對hVEGF-A(8-109)之結合信號比與BSA(背景)之結合信號高出超過3倍的17個純系(表42)。此等中選者在環4內含有胺基酸組成變化。純系9.63.44-55在環2內含有胺基酸組成變化，且純系9.63.44-10在環3內含有胺基酸組成變化。令人感興趣的是，表42中之純系9.63.44-12與表41中之純系9.63-70具有相同的胺基酸序列。

如藉由噬菌體競爭ELISA所測定，純系9.63.44-1至9.63.44-14(表42中)與9.63.44相比對hVEGF-A(8-109)顯示改良之結合親和力。(參見圖16A及圖16B)。

總而言之，以上結果指示藉由向其C末端添加兩個胺基酸來延伸前導肽9.54(SEQ ID NO：52)、9.54.1(SEQ ID NO：99)、9.63(SEQ ID NO：55)及9.63.44產生對hVEGF-A(8-109)具有高出~10倍之結合親和力的變異體。

接下來選擇肽9.54.90(SEQ ID NO：102)及63.12.12.M5L(SEQ ID NO：386)以便如以上所描述進行進一步修飾。簡而言之，產生基於9.54.90之新噬菌體庫，其中在C末端添加兩個額外胺基酸、三個額外胺基酸或四個額外胺基酸。產生基於63.12.12.M5L之第二組文庫，其中在C末端添加兩個額外胺基酸。

自包含2個胺基酸之C末端延伸的9.54.90文庫中，鑑別出對hVEGF-A(8-109)之結合信號與對BSA(背景)相比高出超過3倍的6個純系(表43)。

自包含3個胺基酸之C末端延伸的9.54.90文庫中，鑑別出對hVEGF-A(8-109)之結合信號與對BSA(背景)相比高出超過3倍的10個純系(表44)。

包含4個胺基酸之C末端延伸的來自9.54.90文庫之所有肽均含有3個胺基酸之C末端延伸。

自包含2個胺基酸之C末端延伸的63.12.12.M5L文庫中，鑑別出對hVEGF-A(8-109)之結合信號與對BSA(背景)相比高出超過3倍的9個純系(表45)。

實例2C：包含C末端胺基酸延伸之結合VEGF-A之非天然存在之EETI-II變異體的表徵

經由如以上所描述之噬菌體競爭ELISA分析以上表43至表45中所提供之變異體，以鑑別出對hVEGF-A(8-109)具有較大結合親和力的變異體。

隨後選擇對hVEGF(8-109)顯示較高親和力之純系(例如，諸如表39至表45中所提供之彼等)，包括例如9.54.1-2、9.54.1-36、9.54.1-42、9.54.1-63及9.54.1-90以及9.63.44-1至9.63.44-14，以如以上所描述來進行進一步活體外評估，諸如在噬菌體競爭ELISA及VEGF-KDR相互作用ELISA中之抑制活性。

隨後經由表面電漿子共振分析純系以測定其對各種VEGF同功異型物(包括hVEGF-A(8-109)、hVEGF-A165、小鼠VEGF-A164、大鼠VEGF-A及兔VEGF-A)之親和力。

進行進一步分析以評估對VEGF-A之純系特異性。舉例而言，如以上所描述用VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGf-2、NGF、EGF、PDGF-β或IGF-1進行競爭ELISA。

如在肽受質裂解分析中所量測，亦分析該等純系抑制胰蛋白酶活性之能力(Stanger等人,(2014)FEBS Lett.588(23),4487-96)。

如以上所描述來測定該等純系對各種hVEGF突變體(包括例如Y21A、K48A、Q89A及F17A/M81A)之結合動力學及親和力。

接下來，如以上所描述在脈絡膜新血管形成之VEGF-A驅動模型中評估該等純系之活體內效力。

如以上所描述來分析該等變異體之氧化穩定性。

實例3：可結合LRP6之非天然存在之EETI-II變異體的產生

實例2A中所描述之天然EETI-II庫循環通過數輪針對LRP6E1E2蛋白之選擇。鑑別出結合LRP6 E1E2之二十二個獨特純系(表46)。此等初步中選者在環1及環5內含有胺基酸內含物變化。在若干變異體中，與天然EETI-II構架相比，環1展現更長之長度。值得注意的是，與LRP6結合之新演化序列在環1中含有與作為內源性LRP6配位體之天然Dkk1分子內所存在之基元(NAI)類似的共同基元(NXI)。該等新演化變異體概括了天然配位體中所存在之基元。

LRP6之細胞外域由與捲曲受體及Wnt蛋白相互作用以傳播Wnt信號傳導之四個螺旋槳結構域(E1-E4)組成。利用模組化方法，LRP6分別經由其E1-E2或E3-E4結構域與特定Wnt同功異型物之選擇性結合來區分Wnt1或Wnt3a信號傳導(Hannoush等人,(2010)J.Biol.Chem.285,9172-9179)。為了在藥理學上描繪Wnt1及Wnt3a信號傳導臂，吾等設法鑑別出選擇性地結合LRP6 E1-E2之配位體。

在所鑑別之序列中，產生呈可溶性摺疊形式之R1、LRP6_CKP6及LRP6_CKP19以測試其針對Wnt1或Wnt3a信號傳導之藥理學活性。如以下表47及表48中所示，在基於細胞之信號傳導報告子分析中，藉由R77未觀測到對Wnt1或Wnt3a之顯著選擇性。另一方面，如在螢光素酶報告子分析中所量測，相對於Wnt3a，R1及R19對Wnt1信號傳導顯示選擇性抑制(Wnt1相對於Wnt3a，分別為160倍及11倍)，從而支持此等變異體不靶向LRP6 E3-E4結構域(IC₅₀>44μM)。總而言之，該資料突出顯示新演化變異體之特異性及其在模擬天然配位體中所存在之基元方面的效應。更重要的是，所鑑別之變異體提供一種用於查詢Wnt1及Wnt3信號傳導之藥理學手段。

表47及表48中之F1、F2及F3分別係指在R1、LRP6_CKP6及LRP6_CKP19之純化期間所獲得之峰溶離份1、2及3。

前述實例僅出於說明性目的而提供，而不意欲以任何方式限制本發明之範疇。根據以上描述，除本文中所顯示及描述之彼等修改以外的對本發明的各種修改對於本領域技術人員將顯而易見且屬於所附申請專利範圍之範疇內。

<110> 美商建南德克公司(GENENTECH,INC.)

<120> 胱胺酸結骨架平臺

<130> 146392026840

<140> TW 105130077

<141> 2016-09-14

<150> US 62/219,063

<151> 2015-09-15

<160> 568

<170> FastSEQ f或Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 28

<212> PRT

<213> 噴瓜(Ecballium elaterium)

<400> 1

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1,2,3,4,5,6

<223> Xaa=任何胺基酸

<400> 2

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1,2,3,4,5,6,7

<223> Xaa=任何胺基酸

<400> 3

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1,2,3,4,5,6,7,8

<223> Xaa=任何胺基酸

<400> 4

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1,2,3,4,5,6,7,8,9

<223> Xaa=任何胺基酸

<400> 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10

<223> Xaa=任何胺基酸

<400> 6

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1,2,3,4,5

<223> Xaa=任何胺基酸或非天然胺基酸

<400> 7

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 8

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 9

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 10

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 11

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 12

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 13

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 14

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 15

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 16

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 17

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 18

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 19

<210> 20

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=G或E或Y或Q或H

<220>

<221> 變異體

<222> 2

<223> Xaa=P或M或W或Y

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=N或Y或W

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=G或D或T或Q或R或S

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=F或A或E或S

<400> 20

<210> 21

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 21

<210> 22

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 22

<210> 23

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 23

<210> 24

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 24

<210> 25

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 25

<210> 26

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 26

<210> 27

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 27

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 28

<210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 29

<210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 30

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 31

<210> 32

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 32

<210> 33

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 33

<210> 34

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 34

<210> 35

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 35

<210> 36

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 36

<210> 37

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 37

<210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 38

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 39

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=Q或D或K或N或A或R或H

<220>

<221> 變異體

<222> 2

<223> Xaa=L或V或I或R或P或V

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=M或L或S或T或F

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=Q或E或L或H

<220>

<221> 變異體

<222> 6

<223> Xaa=F或L或M或Y或S

<400> 40

<210> 41

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 41

<210> 42

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 42

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 43

<210> 44

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 44

<210> 45

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 45

<210> 46

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 46

<210> 47

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 47

<210> 48

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 48

<210> 49

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 49

<210> 50

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 50

<210> 51

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 51

<210> 52

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 52

<210> 53

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 53

<210> 54

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 54

<210> 55

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 55

<210> 56

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 56

<210> 57

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 57

<210> 58

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 58

<210> 59

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 59

<210> 60

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 60

<210> 61

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 61

<210> 62

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 62

<210> 63

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 63

<210> 64

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 64

<210> 65

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 65

<210> 66

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 66

<210> 67

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 67

<210> 68

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 68

<210> 69

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 69

<210> 70

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=Q或D或K或W或E或L或R

<220>

<221> 變異體

<222> 2

<223> Xaa=D或N

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=P或R或L或T

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=T或S或L或K

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=F或V或L或I

<220>

<221> 變異體

<222> 6

<223> Xaa=N或D

<220>

<221> 變異體

<222> 8

<223> Xaa=A或S或G

<220>

<221> 變異體

<222> 9

<223> Xaa=L或V或E或T或Q或D

<220>

<221> 變異體

<222> 10

<223> Xaa=F或Y

<400> 70

<210> 71

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 71

<210> 72

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 72

<210> 73

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 73

<210> 74

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 74

<210> 75

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 75

<210> 76

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 76

<210> 77

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 77

<210> 78

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 78

<210> 79

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 79

<210> 80

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=Q或R

<220>

<221> 變異體

<222> 2

<223> Xaa=M或L或F或H

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=Y或F或H

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=D或Q或N或K

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=S或T

<400> 80

<210> 81

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 81

<210> 82

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 82

<210> 83

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 83

<210> 84

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 84

<210> 85

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 85

<210> 86

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 86

<210> 87

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 87

<210> 88

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 88

<210> 89

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 89

<210> 90

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 90

<210> 91

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 91

<210> 92

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 92

<210> 93

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 93

<210> 94

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 94

<210> 95

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 95

<210> 96

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 96

<210> 97

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 97

<210> 98

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=K或G或Q或S或N

<220>

<221> 變異體

<222> 2

<223> Xaa=Q或L或P或A或V或T或R或W或K或G或Y

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=D或S或E或N

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=S或F或Y或L或F或Q或M

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=D或E或N或A或L或F或H或Q

<400> 98

<210> 99

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 99

<210> 100

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 100

<210> 101

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 101

<210> 102

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 102

<210> 103

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 103

<210> 104

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 104

<210> 105

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 105

<210> 106

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 106

<210> 107

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 107

<210> 108

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 108

<210> 109

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 109

<210> 110

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 110

<210> 111

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 111

<210> 112

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 112

<210> 113

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 113

<210> 114

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 114

<210> 115

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=K或P或Q或R

<220>

<221> 變異體

<222> 2

<223> Xaa=K或T或L或D

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=W或T或M或L

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=Q或R或D

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=W或F或P或V

<220>

<221> 變異體

<222> 6

<223> Xaa=W或K或F

<220>

<221> 變異體

<222> 7

<223> Xaa=Y或Q或W

<220>

<221> 變異體

<222> 8

<223> Xaa=M或Y或G或D

<400> 115

<210> 116

<400> 116 000

<210> 117

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 117

<210> 118

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 118

<210> 119

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 119

<210> 120

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 120

<210> 121

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=K或G或D或A或E

<220>

<221> 變異體

<222> 2

<223> Xaa=Q或E或R或V或P或D或M或G或N或

L或A或F

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=D或N或Y或S

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=S或F或L或I或M或Y或V或N或E

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=D或L或Q或S或E或T或L或A或N

<400> 121

<210> 122

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 122

<210> 123

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 123

<210> 124

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 124

<210> 125

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 125

<210> 126

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 126

<210> 127

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 127

<210> 128

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 128

<210> 129

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 129

<210> 130

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=M或L

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=Q或K或D

<220>

<221> 變異體

<222> 6

<223> Xaa=Y或M或T或L

<400> 130

<210> 131

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 131

<210> 132

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 132

<210> 133

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 133

<210> 134

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=H或L或Q或R

<400> 134

<210> 135

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 135

<210> 136

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 136

<210> 137

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 137

<210> 138

<400> 138 000

<210> 139

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 139

<210> 140

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 140

<210> 141

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 141

<210> 142

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 142

<210> 143

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 143

<210> 144

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 144

<210> 145

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 145

<210> 146

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 146

<210> 147

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 147

<210> 148

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 148

<210> 149

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 149

<210> 150

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 150

<210> 151

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 151

<210> 152

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 152

<210> 153

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 153

<210> 154

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 154

<210> 155

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 155

<210> 156

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 156

<210> 157

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 157

<210> 158

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 158

<210> 159

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 159

<210> 160

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 160

<210> 161

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 161

<210> 162

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 162

<210> 163

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 163

<210> 164

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 164

<210> 165

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 165

<210> 166

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 166

<210> 167

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 167

<210> 168

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 168

<210> 169

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 169

<210> 170

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 170

<210> 171

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 171

<210> 172

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 172

<210> 173

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 173

<210> 174

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 174

<210> 175

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 175

<210> 176

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 176

<210> 177

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 177

<210> 178

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 178

<210> 179

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 179

<210> 180

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 180

<210> 181

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 181

<210> 182

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 182

<210> 183

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 183

<210> 184

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 184

<210> 185

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=V或R或N或S或E或G

<220>

<221> 變異體

<222> 2

<223> Xaa=N或S或G或R

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=R或V或K或S或N或I或Y

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=V或N或I或R或S或T

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=R或K或I或N

<220>

<221> 變異體

<222> 6

<223> Xaa=G或I或R或K或S或A

<400> 185

<210> 186

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=A或R或M或V或G或S

<220>

<221> 變異體

<222> 2

<223> Xaa=N或T或S或A

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=R或N或H

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=V或R或K

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=K或V或I

<220>

<221> 變異體

<222> 6

<223> Xaa=R或K或A或N或S或V

<220>

<221> 變異體

<222> 7

<223> Xaa=T或G或R或K或P

<220>

<221> 變異體

<222> 8

<223> Xaa=S或G或R或A

<400> 186

<210> 187

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=R或A或Q

<220>

<221> 變異體

<222> 2

<223> Xaa=S或A

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=G或S或N或I

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=N或K

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=T或S或L或R

<220>

<221> 變異體

<222> 6

<223> Xaa=I或R或V

<220>

<221> 變異體

<222> 7

<223> Xaa=R或E或K

<220>

<221> 變異體

<222> 8

<223> Xaa=K或Q或A或R

<220>

<221> 變異體

<222> 9

<223> Xaa=R或G或Q

<220>

<221> 變異體

<222> 10

<223> Xaa=E或W或G或R

<400> 187

<210> 188

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=G或S或N或Y或A或R

<220>

<221> 變異體

<222> 2

<223> Xaa=P或G或S或V或E或R或F或D

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=N或G或S或E或P或K或H或R

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=G或R或H或S或Q或V或D

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=F或D或N或R或G或Y或S或T

<400> 188

<210> 189

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 189

<210> 190

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 190

<210> 191

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 191

<210> 192

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 192

<210> 193

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 193

<210> 194

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 194

<210> 195

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 195

<210> 196

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 196

<210> 197

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 197

<210> 198

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 198

<210> 199

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 199

<210> 200

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 200

<210> 201

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 201

<210> 202

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 202

<210> 203

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 203

<210> 204

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 204

<210> 205

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 205

<210> 206

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 206

<210> 207

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 207

<210> 208

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 208

<210> 209

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 209

<210> 210

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 210

<210> 211

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 211

<210> 212

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 6

<223> Xaa=3,4-二氟-L-苯基丙胺酸,3,4-二氯-L-苯基丙胺酸,4-氯-L-苯基丙胺酸, 3-F,4-Cl-L-苯基丙胺酸,2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸,吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸,或硫酪胺酸

<400> 212

<210> 213

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 7

<223> Xaa=1-萘基丙胺酸,2-萘基丙胺酸,或2-氯吲哚

<400> 213

<210> 214

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 214

<210> 215

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 215

<210> 216

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 30

<223> 甘胺酸可附加C(=O)-環氧丙烷-3基

<400> 216

<210> 217

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 217

<210> 218

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 218

<210> 219

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 9

<223> Xaa=1-萘基丙胺酸,或2-萘基丙胺酸

<400> 219

<210> 220

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=3-氟酪胺酸,或4-氟苯基丙胺酸

<400> 220

<210> 221

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=PEG6-炔丙基甘胺酸

<400> 221

<210> 222

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 222

<210> 223

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 223

<210> 224

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 224

<210> 225

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 225

<210> 226

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 226

<210> 227

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 227

<210> 228

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 228

<210> 229

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 229

<210> 230

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 230

<210> 231

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 231

<210> 232

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=E或G或P或Q或R或T或V

<220>

<221> 變異體

<222> 2

<223> Xaa=T或E或A或D

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=D或T或I或P

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=W或V或Q或T或W

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=Y或F或N或E或P或K

<220>

<221> 變異體

<222> 6

<223> Xaa=P或E或W或N或P

<220>

<221> 變異體

<222> 7

<223> Xaa=H或Q或K或W或H

<220>

<221> 變異體

<222> 8

<223> Xaa=Q或F或E或A或D或W

<220>

<221> 變異體

<222> 9

<223> Xaa=I或L或H

<220>

<221> 變異體

<222> 10

<223> Xaa=D或W或P或Y或T或M或N

<400> 232

<210> 233

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 233

<210> 234

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 234

<210> 235

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 235

<210> 236

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 236

<210> 237

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 237

<210> 238

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 238

<210> 239

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 239

<210> 240

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 240

<210> 241

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 241

<210> 242

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 242

<210> 243

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 243

<210> 244

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 244

<210> 245

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 245

<210> 246

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 246

<210> 247

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 247

<210> 248

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 248

<210> 249

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 249

<210> 250

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 250

<210> 251

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 251

<210> 252

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 252

<210> 253

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 253

<210> 254

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 254

<210> 255

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 255

<210> 256

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 256

<210> 257

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 257

<210> 258

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 258

<210> 259

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 259

<210> 260

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 260

<210> 261

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 261

<210> 262

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 262

<210> 263

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 263

<210> 264

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 264

<210> 265

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 265

<210> 266

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 266

<210> 267

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 267

<210> 268

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 268

<210> 269

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 269

<210> 270

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 270

<210> 271

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 271

<210> 272

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 272

<210> 273

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 273

<210> 274

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 274

<210> 275

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 275

<210> 276

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 276

<210> 277

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 277

<210> 278

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 278

<210> 279

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 279

<210> 280

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 280

<210> 281

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 281

<210> 282

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 282

<210> 283

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 283

<210> 284

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 284

<210> 285

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 285

<210> 286

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 286

<210> 287

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 287

<210> 288

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 288

<210> 289

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 289

<210> 290

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 290

<210> 291

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 291

<210> 292

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 292

<210> 293

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 293

<210> 294

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 294

<210> 295

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 295

<210> 296

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 296

<210> 297

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 297

<210> 298

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 298

<210> 299

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 299

<210> 300

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 300

<210> 301

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 301

<210> 302

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 302

<210> 303

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 303

<210> 304

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 304

<210> 305

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 305

<210> 306

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 306

<210> 307

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 307

<210> 308

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 308

<210> 309

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 309

<210> 310

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 310

<210> 311

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 311

<210> 312

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 312

<210> 313

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 313

<210> 314

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 314

<210> 315

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 315

<210> 316

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 316

<210> 317

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 317

<210> 318

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 318

<210> 319

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 319

<210> 320

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 320

<210> 321

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 321

<210> 322

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 322

<210> 323

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 323

<210> 324

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 324

<210> 325

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 325

<210> 326

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 326

<210> 327

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 327

<210> 328

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 328

<210> 329

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 329

<210> 330

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 330

<210> 331

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 331

<210> 332

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 332

<210> 333

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 333

<210> 334

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 334

<210> 335

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 335

<210> 336

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 336

<210> 337

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 337

<210> 338

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 338

<210> 339

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 339

<210> 340

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 340

<210> 341

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 341

<210> 342

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 342

<210> 343

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 343

<210> 344

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 344

<210> 345

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 345

<210> 346

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 346

<210> 347

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 347

<210> 348

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 348

<210> 349

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 349

<210> 350

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 350

<210> 351

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 351

<210> 352

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 352

<210> 353

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 353

<210> 354

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 354

<210> 355

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 355

<210> 356

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 356

<210> 357

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 357

<210> 358

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=Q或H或E或N或D

<220>

<221> 變異體

<222> 2

<223> Xaa=L或V或R或P或I

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=M或F或L

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=Q或E或R或L

<220>

<221> 變異體

<222> 6

<223> Xaa=F或A或L或S

<400> 358

<210> 359

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=R或H

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=N或Q或H

<400> 359

<210> 360

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=H或L或R或Q

<220>

<221> 變異體

<222> 2

<223> Xaa=W或F或Y

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=Q或N或K或H或D或E

<400> 360

<210> 361

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=乙醯甘胺酸

<400> 361

<210> 362

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 8

<223> Xaa=硫化酪胺酸,3,4-二氟-L-苯基丙胺酸,3,4-二氯-L-苯基丙胺酸,4-氯-L-苯基丙胺酸,3-F,4-Cl-L-苯基丙胺酸,2-吡啶酮(NH對)-L-丙胺酸,或吡啶酮(NH間)-L-丙胺酸

<400> 362

<210> 363

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 363

<210> 364

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 364

<210> 365

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 365

<210> 366

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 366

<210> 367

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 367

<210> 368

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 368

<210> 369

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 369

<210> 370

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 370

<210> 371

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 371

<210> 372

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 372

<210> 373

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 373

<210> 374

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 374

<210> 375

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 375

<210> 376

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 376

<210> 377

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 377

<210> 378

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 378

<210> 379

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 379

<210> 380

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 380

<210> 381

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 381

<210> 382

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 382

<210> 383

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 383

<210> 384

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 384

<210> 385

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 385

<210> 386

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 386

<210> 387

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 387

<210> 388

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 388

<210> 389

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 389

<210> 390

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 390

<210> 391

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 391

<210> 392

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 392

<210> 393

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 393

<210> 394

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 394

<210> 395

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 395

<210> 396

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 396

<210> 397

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 397

<210> 398

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 398

<210> 399

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 399

<210> 400

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 400

<210> 401

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 401

<210> 402

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 402

<210> 403

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 403

<210> 404

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=苄基-L-脯胺酸,4-氟-苄基-L-脯胺酸,3-OH-L-脯胺酸,3-氟-L-脯胺酸,或三氟甲基-苄基-L-脯胺酸

<400> 404

<210> 405

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 405

<210> 406

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 406

<210> 407

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 407

<210> 408

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 408

<210> 409

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 409

<210> 410

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 410

<210> 411

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 411

<210> 412

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 412

<210> 413

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 7

<400> 413

<210> 414

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 414

<210> 415

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 415

<210> 416

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 7

<223> Xaa=N-甲基吲哚,N-乙基吲哚,N-異丙基吲哚,或5-氮雜-吲哚

<400> 416

<210> 417

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 9

<223> Xaa=N-甲基吲哚,N-乙基吲哚,N-異丙基吲哚,或5-氮雜-吲哚

<400> 417

<210> 418

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=4-甲基1-L-苯基丙胺酸,2-萘基-L-丙胺酸,2-喹啉基-丙胺酸,4-二苯基-L-丙胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸,3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸,3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸,4-甲基1-2-吡啶基-丙胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸,苯并噻唑-L-丙胺酸,或苯并噻吩-L-丙胺酸,3-異喹啉基-L-丙胺酸

<400> 418

<210> 419

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 15

<220>

<221> 變異體

<222> 15

<223> Xaa=3-(3-喹啉基)-L-丙胺酸,3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸,3-(2-喹啉基)-L-丙胺酸,4-甲基-2-吡啶基-丙胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 15

<223> Xaa=4-乙基-2-吡啶基-L-丙胺酸,苯并噻唑-L-丙胺酸,苯并噻吩-L-丙胺酸,或3-異喹啉基-L-丙胺酸

<400> 419

<210> 420

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 18

<223> Xaa=t-丁基-L-丙胺酸,環丁基-L-丙胺酸,環戊基-L-丙胺酸,或5,5,5-三氟-L-白胺酸

<400> 420

<210> 421

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 421

<210> 422

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 422

<210> 423

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 423

<210> 424

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 424

<210> 425

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 425

<210> 426

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 22

<223> Xaa=t-丁基-L-甘胺酸(亦名L-第三-白胺酸),t-丁基-L-丙胺酸,L-環戊基甘胺酸,環戊基-L-丙胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 22

<223> Xaa=L-環丁基1-L-甘胺酸,環丁基1-L-丙胺酸,或5,5,5-三氟-L-白胺酸

<400> 426

<210> 427

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 2

<223> Xaa=2-吡啶酮,3,4-羥基苯基丙胺酸,3,4-氟苯基丙胺酸,或3-氟,4-OH苯基丙胺酸

<400> 427

<210> 428

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 25

<400> 428

<210> 429

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=2-氯酪胺酸,2-甲基酪胺酸,2-乙基酪胺酸,或1-萘酚丙胺酸

<400> 429

<210> 430

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 26

<400> 430

<210> 431

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 431

<210> 432

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 30

<223> Xaa=D-絲胺酸,L-beta-高絲胺酸,L-beta-丙胺酸,N-alpha-甲基甘胺酸,甘胺醯胺,丙三醇甘胺酸酯

<220>

<221> 變異體

<222> 30

<223> Xaa=丙三醇甘胺酸酯,環氧丙烷-3-基醇甘胺酸酯,甘胺酸嗎啉醯胺

<400> 432

<210> 433

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 433

<210> 434

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 434

<210> 435

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 435

<210> 436

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 436

<210> 437

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 18

<223> Xaa=正白胺酸或環丁基-L-丙胺酸

<400> 437

<210> 438

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 438

<210> 439

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 18

<223> Xaa=環丁基-L-丙胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 22

<223> Xaa=環丁基-L-甘胺酸,環丁基-L-丙胺酸或正白胺酸

<400> 439

<210> 440

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 18

<223> Xaa=環丁基-L-丙胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 22

<223> Xaa=環丁基-L-甘胺酸或環丁基-L-丙胺酸

<400> 440

<210> 441

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 18

<223> Xaa=環丁基-L-丙胺酸或t-丁基-L-丙胺酸

<400> 441

<210> 442

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 22

<223> Xaa=環丁基-L-甘胺酸或環丁基-L-丙胺酸

<400> 442

<210> 443

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=乙醯甘胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 30

<223> Xaa=甘胺醯胺

<400> 443

<210> 444

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=乙醯甘胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 30

<223> Xaa=甘胺醯胺

<400> 444

<210> 445

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=乙醯甘胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 30

<223> Xaa=甘胺醯胺

<400> 445

<210> 446

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=乙醯甘胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 30

<223> Xaa=甘胺醯胺

<400> 446

<210> 447

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 18

<223> Xaa=環丁基-L-丙胺酸或t-丁基-L-丙胺酸

<400> 447

<210> 448

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 22

<223> Xaa=環丁基-L-甘胺酸

<400> 448

<210> 449

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 18

<223> Xaa=環丁基-L-丙胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 22

<223> Xaa=環丁基-L-甘胺酸或環丁基-L-丙胺酸

<400> 449

<210> 450

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 18

<223> Xaa=環丁基-L-丙胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 22

<223> Xaa=環丁基-L-甘胺酸或環丁基-L-丙胺酸

<400> 450

<210> 451

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=乙醯甘胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 18

<223> Xaa=環丁基-L-丙胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 22

<223> Xaa=環丁基-L-甘胺酸或環丁基-L-丙胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 30

<223> Xaa=甘胺醯胺

<400> 451

<210> 452

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=乙醯甘胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 30

<223> Xaa=甘胺醯胺

<400> 452

<210> 453

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 1

<223> Xaa=乙醯甘胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 30

<223> Xaa=甘胺醯胺

<400> 453

<210> 454

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 3

<223> Xaa=M或L

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=L或S或T或Q或N或E或D

<220>

<221> 變異體

<222> 6

<223> Xaa=F或Y或S

<400> 454

<210> 455

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 455

<210> 456

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 456

<210> 457

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 457

<210> 458

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 458

<210> 459

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 459

<210> 460

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 460

<210> 461

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 461

<210> 462

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 462

<210> 463

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 463

<210> 464

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 464

<210> 465

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 465

<210> 466

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 466

<210> 467

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 467

<210> 468

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 468

<210> 469

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 469

<210> 470

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 470

<210> 471

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 471

<210> 472

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 472

<210> 473

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 473

<210> 474

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 474

<210> 475

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 475

<210> 476

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 476

<210> 477

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 477

<210> 478

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 478

<210> 479

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 479

<210> 480

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 480

<210> 481

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 481

<210> 482

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 482

<210> 483

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 483

<210> 484

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 484

<210> 485

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 485

<210> 486

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 486

<210> 487

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 487

<210> 488

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 488

<210> 489

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 489

<210> 490

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 490

<210> 491

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 491

<210> 492

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 492

<210> 493

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 493

<210> 494

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 494

<210> 495

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 495

<210> 496

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 496

<210> 497

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 497

<210> 498

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 498

<210> 499

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 499

<210> 500

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 500

<210> 501

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 501

<210> 502

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 502

<210> 503

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 503

<210> 504

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 504

<210> 505

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 505

<210> 506

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 506

<210> 507

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 507

<210> 508

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 508

<210> 509

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 509

<210> 510

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 510

<210> 511

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 511

<210> 512

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 512

<210> 513

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 513

<210> 514

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 514

<210> 515

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 515

<210> 516

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 516

<210> 517

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 517

<210> 518

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 518

<210> 519

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 519

<210> 520

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 520

<210> 521

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 521

<210> 522

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 522

<210> 523

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 523

<210> 524

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 524

<210> 525

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 525

<210> 526

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 526

<210> 527

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 527

<210> 528

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 528

<210> 529

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 529

<210> 530

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 530

<210> 531

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 531

<210> 532

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 532

<210> 533

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 533

<210> 534

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 16

<223> Xaa=D或E

<220>

<221> 變異體

<222> 20

<223> Xaa=N,K,或鳥胺酸

<400> 534

<210> 535

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 16

<223> Xaa=N,K,或鳥胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 20

<223> Xaa=D或E

<400> 535

<210> 536

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 536

<210> 537

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 20

<223> Xaa=鳥胺酸

<400> 537

<210> 538

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 16

<223> Xaa=D或E

<220>

<221> 變異體

<222> 20

<223> Xaa=N,K,或鳥胺酸

<400> 538

<210> 539

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 16

<223> Xaa=N或K或鳥胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 20

<223> Xaa=D或E

<400> 539

<210> 540

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 16

<223> Xaa=D或E

<220>

<221> 變異體

<222> 20

<223> Xaa=N或K或鳥胺酸

<400> 540

<210> 541

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 16

<223> Xaa=N或K或鳥胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 20

<223> Xaa=D或E

<400> 541

<210> 542

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 542

<210> 543

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 543

<210> 544

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 20

<223> Xaa=鳥胺酸

<400> 544

<210> 545

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 545

<210> 546

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 20

<223> Xaa=鳥胺酸

<400> 546

<210> 547

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 547

<210> 548

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 548

<210> 549

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 20

<223> Xaa=D或E

<400> 549

<210> 550

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 550

<210> 551

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 551

<210> 552

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 16

<223> Xaa=鳥胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 20

<223> Xaa=D或E

<400> 552

<210> 553

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 16

<223> Xaa=鳥胺酸

<400> 553

<210> 554

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 16

<223> Xaa=鳥胺酸

<400> 554

<210> 555

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 20

<223> Xaa=D或E

<400> 555

<210> 556

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 556

<210> 557

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 557

<210> 558

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 16

<223> Xaa=鳥胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 20

<223> Xaa=D或E

<400> 558

<210> 559

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 16

<223> Xaa=鳥胺酸

<400> 559

<210> 560

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5,16

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 16

<223> Xaa=鳥胺酸

<400> 560

<210> 561

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 20

<223> Xaa=D或E

<400> 561

<210> 562

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 562

<210> 563

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 4

<223> Xaa=正白胺酸

<400> 563

<210> 564

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 16

<223> Xaa=鳥胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 20

<223> Xaa=D或E

<400> 564

<210> 565

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 16

<223> Xaa=鳥胺酸

<400> 565

<210> 566

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 5

<223> Xaa=正白胺酸

<220>

<221> 變異體

<222> 516

<223> Xaa=鳥胺酸

<400> 566

<210> 567

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 567

<210> 568

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> 變異體

<222> 20

<223> Xaa=鳥胺酸

<400> 568

Claims

一種可結合血管內皮生長因子A(VEGF-A)之肽，其係由下列骨架結構所組成：Z₁C₁L1C₂L2C₃L3C₄L4C₅L5C₆Z₂，其中：Z₁對應該肽之N端且係G；Z₂對應該肽之C端且係G；C₁-C₆係半胱胺酸殘基；以及L1為環1，L2為環2，L3為環3，L4為環4，以及L5為環5；其中：L1係NIMLPFWG(SEQ ID NO：33)；DVMQPYWG(SEQ ID NO：35)；NIMLPYWG(SEQ ID NO：141)；NIXLPYWG(SEQ ID NO：143)，其中X係正白胺酸；DVXQPYWG(SEQ ID NO：214)，其中X係正白胺酸；NIXLPFWG(SEQ ID NO：277)，其中X係正白胺酸；或NIXQPYWG(SEQ ID NO：433)，其中X係正白胺酸；L2係GRDFE(SEQ ID NO：97)或GPDID(SEQ ID NO：118)；L3係LEQ、LQQ、VER、MSD、MNQ、MQT、VYQ、FIN、VSQ、VTE、FYE、MEQ、VYR、FVR、LSN或XEQ，其中X係正白胺酸；L4係I；以及L5係QYYQS(SEQ ID NO：45)或HWYNS(SEQ ID NO：46)。
如申請專利範圍第1項之肽，其中：Z₁及Z₂為G；L1係SEQ ID NO：33或433；L2係SEQ ID NO：97；L3係LEQ、MEQ或XEQ，其中X係正白胺酸；L4係I；以及L5係SEQ ID NO：45。
如申請專利範圍第1項之肽，其係由選自由下列所組成之胺基酸序列所組成：GCNIMLPFWGCGRDFECLQQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：103)；GCNIMLPFWGCGRDFECVERCICQYYQSCG(SEQ ID NO：104)；GCNIMLPFWGCGRDFECMSDCICQYYQSCG(SEQ ID NO：105)；GCNIMLPFWGCGRDFECMNQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：106)；GCNIMLPFWGCGRDFECMQTCICQYYQSCG(SEQ ID NO：107)；GCNIMLPFWGCGRDFECVYQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：108)；GCNIMLPFWGCGRDFECFINCICQYYQSCG(SEQ ID NO：109)；GCNIMLPFWGCGRDFECVSQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：110)；GCNIMLPFWGCGRDFECVTECICQYYQSCG(SEQ ID NO：111)；GCNIMLPFWGCGRDFECFYECICQYYQSCG(SEQ ID NO：112)；GCNIMLPFWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：113)；GCNIMLPFWGCGRDFECVYRCICQYYQSCG(SEQ ID NO：114)；GCDVMQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCG(SEQ ID NO：140)；GCNIMLPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：142)；GCNIXLPFWGCGRDFECVSQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：145)，其中X為正白胺酸(Nle)；GCNIXLPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：146)，其中X為正白胺酸(Nle)；GCDVXQPYWGCGPDIDCLSNCICHWYNSCG(SEQ ID NO：224)，其中X為正白胺酸；GCNIXQPYWGCGRDFECMEQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：436)，其中X為正白胺酸；以及GCNIX₁LPYWGCGRDFECX₂EQCICQYYQSCG(SEQ ID NO：437)，其中X₁及X₂為正白胺酸。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之肽，其中：(a)該肽之C末端羧基經封端；(b)該肽之N末端胺經封端；或(c)該肽之C末端羧基及N末端胺經封端。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之肽，其中該肽抑制VEGF-A活性。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之肽，其與治療劑結合。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之肽，其與標記結合。
如申請專利範圍第7項之肽，其中該標記係放射性同位素、螢光染料或酶。
一種經分離之核酸，其編碼如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之肽。
一種表現載體，其包含如申請專利範圍第9項之核酸。
一種細胞，其包含如申請專利範圍第10項之表現載體。
一種產生肽之方法，其包括培養如申請專利範圍第11項之細胞及自細胞培養物回收由該細胞所表現之肽。
一種產生如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之肽的方法，其包括化學合成該肽。
一種組合物，其包含如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之肽及醫藥學上可接受之載劑。
一種調配物，其包含如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之肽及聚(乳酸-共-乙醇酸)(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)。
如申請專利範圍第15項之調配物，其中該PLGA為PLGA棒。
一種如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之肽用於製備醫藥品之用途，其中該醫藥品係用於治療個體之以血管生成及/或血管滲透或滲漏為特徵之眼部疾病。
一種如如申請專利範圍第14項之組合物用於製備醫藥品之用途，其中該醫藥品係用於治療個體之以血管生成及/或血管滲透或滲漏為特徵之眼部疾病。
一種如申請專利範圍第15或16項之調配物用於製備醫藥品之用途，其中該醫藥品係用於治療個體之以血管生成及/或血管滲透或滲漏為特徵之眼部疾病。
如申請專利範圍第17項至第19項中任一項之用途，其中該眼部疾病為選自由以下各項組成之群的眼內新生血管疾病：增生性視網膜病變、脈絡膜新血管形成(CNV)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病性及其他局部缺血相關性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、馮希伯-林島氏病(von Hippel-Lindau disease)、眼組織胞漿菌病、視網膜靜脈阻塞(RVO，包括視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)及視網膜分枝靜脈阻塞(BRVO))、角膜新血管形成、視網膜新血管形成及早產兒視網膜病變(ROP)。
如申請專利範圍第17項至第19項中任一項之用途，其中該醫藥品係經調配為可植入式裝置。
如申請專利範圍第21項之用途，其中該可植入式裝置係眼部插入物、緩慢釋放貯庫、眼部插塞/儲器、非生物可降解性眼部植入物或生物可降解性眼部植入物。
如申請專利範圍第17項至第19項中任一項之用途，其中該醫藥品係經調配以用於長期作用遞送。