TWI823402B - 多特異性單域抗體嵌合抗原受體及t細胞銜接體、核酸、其表達細胞、其用途以及治療癌症之醫藥組合物 - Google Patents

多特異性單域抗體嵌合抗原受體及t細胞銜接體、核酸、其表達細胞、其用途以及治療癌症之醫藥組合物 Download PDF

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Abstract

本發明是關於一種多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體、核酸、其表達細胞、其用途及治療癌症之醫藥組合物。多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體包含HLA-G單域抗體嵌合抗原受體和雙特異性T細胞銜接體，其中HLA-G單域抗體嵌合抗原受體包含HLA-G單域抗體單元、跨膜域和CD3z訊息傳遞域，雙特異性T細胞銜接體包含PD-L1單域抗體單元和CD3e單域抗體。多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體可誘導腫瘤細胞死亡且具有優異的抑制腫瘤生長的效果，藉此，可用於製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物以及作為治療癌症之醫藥組合物。

Description

多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體、核酸、其表達細胞、其用途以及治療癌症之醫藥組合物
本發明是有關於一種含有抗原或抗體的醫藥製品，特別是一種多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體、核酸、其表達細胞、治療癌症之醫藥組合物以及多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞之用途。
常規的腫瘤治療方法包括手術治療、放射線治療、化學治療及標靶治療等。腫瘤免疫療法為上述治療方法以外的另一種治療腫瘤的方法，係透過激活患者自身免疫系統，利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質誘導機體的特異性細胞免疫和體液免疫反應，增強機體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長、擴散和復發，以達到清除或控制腫瘤的目的。
近年來免疫系統在治療癌症的角色越來越受到重視，目前主要的腫瘤免疫療法包含兩大類，一種為免疫檢查點阻斷療法，藉由阻斷免疫檢查點的活化來恢復自身T細胞對腫瘤細胞的攻擊力；另一種為嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)，藉由對T細胞進行基因修飾以提高其對腫瘤細胞的抗原辨識和殺傷能力 。此外，另一種新的免疫療法-雙特異性T細胞銜接體(bispecific T cell engager, BiTE)也值得關注，BiTE是一種由2種單株抗體的單鏈可變結構域(single-chain fragment variables, scFvs)組成的抗體分子，其具有2個分子鈎，可分別特異性地辨識靶細胞表面的抗原和T細胞表面的CD3分子，因此可同時激活T細胞並辨識癌細胞。
根據腫瘤的存在方式，可以分為實體瘤和非實體瘤 。實體瘤臨床上常有明確的腫塊，主要應用以外科為主的綜合治療；而非實體瘤大多為血液系統惡性腫瘤，通常表現為無明確的腫塊，以化療為主。目前應用於臨床上CAR免疫細胞和BiTE的腫瘤免疫療法在血液系統惡性腫瘤方面治療比較有效，但對實體腫瘤的作用有限，腫瘤相關靶點蛋白的選擇對治療效果非常關鍵，是以如何提高CAR免疫細胞或BiTE在實體瘤中的治療效果是值得研究的問題。
本發明之目的是在提供一種多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體、核酸、多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞、其用途以及治療癌症之醫藥組合物。所述多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體包含與腫瘤細胞具有優異的專一性結合能力的HLA-G單域抗體嵌合抗原受體，以及可以特異性辨識T細胞表面的CD3分子以及腫瘤細胞表面的PD-L1的雙特異性T細胞銜接體。所述核酸編碼所述多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體。所述多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞包含所述核酸，其表現所述多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體 ，可以專一性的靶向腫瘤細胞，避免脫靶效應，並可以同時激活的T細胞並阻斷免疫檢查點活化，進而有效地毒殺腫瘤細胞，是以可用於製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。而所述治療癌症之醫藥組合物包含所述多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞，可有效地毒殺腫瘤細胞進而治療癌症。
本發明之一態樣之一實施方式是提供一種多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，其從N端至C端依序包含HLA-G單域抗體嵌合抗原受體和雙特異性T細胞銜接體。HLA-G單域抗體嵌合抗原受體包含HLA-G單域抗體單元、跨膜域和CD3z訊息傳遞域。HLA-G單域抗體單元與人類白細胞抗原G (human leukocyte antigen G, HLA-G)專一性結合，而HLA-G單域抗體單元包含至少一HLA-G單域抗體，且至少一HLA-G單域抗體之胺基酸序列如SEQ ID NO: 1及/或SEQ ID NO: 2所示。跨膜域之胺基酸序列如SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 29所示，CD3z訊息傳遞域之胺基酸序列如SEQ ID NO: 25所示。雙特異性T細胞銜接體連接於HLA-G單域抗體嵌合抗原受體之C端，且包含PD-L1單域抗體單元和CD3e單域抗體。PD-L1單域抗體單元與程式性死亡-配體1 (programmed death-ligand 1, PD-L1)專一性結合，PD-L1單域抗體單元包含至少一PD-L1單域抗體，且至少一PD-L1單域抗體之胺基酸序列如SEQ ID NO: 5及/或SEQ ID NO: 6所示。CD3e單域抗體與CD3e分子專一性結合，且CD3e單域抗體之胺基酸序列如SEQ ID NO: 9所示。
依據前述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，可更包含第一訊號胜肽，其連接於HLA-G單域抗體嵌合抗原受體之N端，且第一訊號胜肽之胺基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
依據前述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，可更包含CD8鉸鏈區，其串接HLA-G單域抗體單元和跨膜域。
依據前述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，可更包含P2A胜肽，其串接HLA-G單域抗體嵌合抗原受體和雙特異性T細胞銜接體。
依據前述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，可更包含第二訊號胜肽，其連接於雙特異性T細胞銜接體之N端，且第二訊號胜肽之胺基酸序列如SEQ ID NO: 15所示。
依據前述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，其中HLA-G單域抗體單元可阻斷HLA-G與HLA-G受體的相互作用及/或結合。
依據前述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，其中HLA-G受體可為KIR2DL4及/或LILRB1。
依據前述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，其中PD-L1單域抗體單元可阻斷PD-L1與PD-L1受體的相互作用及/或結合。
依據前述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，其中PD-L1受體可為細胞程式性死亡蛋白-1 (programmed cell death protein-1, PD-1)。
依據前述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，其中CD3e單域抗體可激活及/或招募T細胞。
本發明之一態樣之另一實施方式是提供一種核酸，其係編碼如前段所述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，所述核酸從5’端至3’端依序包含編碼HLA-G單域抗體嵌合抗原受體片段和編碼雙特異性T細胞銜接體片段。編碼HLA-G單域抗體嵌合抗原受體片段包含編碼HLA-G單域抗體單元片段、編碼跨膜域片段和編碼CD3z訊息傳遞域片段。編碼HLA-G單域抗體單元片段包含至少一編碼HLA-G單域抗體片段，且至少一編碼HLA-G單域抗體片段之核苷酸序列如SEQ ID NO: 3及/或SEQ ID NO: 4所示。編碼跨膜域片段之核苷酸序列如SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 30所示，編碼CD3z訊息傳遞域片段之核苷酸序列如SEQ ID NO: 26所示。編碼雙特異性T細胞銜接體片段連接於編碼HLA-G單域抗體嵌合抗原受體片段之3’端，且包含編碼PD-L1單域抗體單元片段和編碼CD3e單域抗體片段。編碼PD-L1單域抗體單元片段包含至少一編碼PD-L1單域抗體片段，且至少一編碼PD-L1單域抗體片段之核苷酸序列如SEQ ID NO: 7及/或SEQ ID NO: 8所示。編碼CD3e單域抗體片段之核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
本發明之一態樣之又一實施方式是提供一種多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞，其包含一免疫細胞以及如前段所述之核酸，其中多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞為將所述核酸轉染至所述免疫細胞而得。
依據前述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞，其中免疫細胞可為自然殺手細胞或γδT細胞。
本發明之一態樣之又一實施方式是提供一種治療癌症之醫藥組合物，包含如前段所述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞以及醫藥上可接受載劑。
本發明之另一態樣之一實施方式是提供一種如前段所述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞之用途，其係用於製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。
上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本說明書揭露內容提出一種多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體、編碼所述多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體的核酸、包含所述核酸的多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞、其用途以及包含多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞的治療癌症之醫藥組合物。說明書以腫瘤細胞之細胞試驗，證明本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體可以增強免疫細胞對於腫瘤細胞的細胞毒性，因而可使表現本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體的多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞對於腫瘤細胞具有優異的特異性裂解能力。說明書中亦以動物試驗證明本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞具有優異的抑制腫瘤生長效果，是以可用於製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。而所述本發明之治療癌症之醫藥組合物，包含本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞，可有效地毒殺腫瘤細胞進而治療癌症。
本說明書中所述之「單域抗體(single domain antibody, sdAb)」是指缺失抗體輕鏈而只有重鏈可變區的一類抗體。因為完整抗體包含2條免疫球蛋白輕鏈和2條重鏈，完整抗體的分子量大約150-160 kDa。相比之下單域抗體的分子量大約只有12-15 kDa，因單域抗體的分子量小，也被稱為奈米抗體(nanobody)。單域抗體雖然結構簡單，但仍然可以達到與完整抗體相當甚至更高的特異抗原結合親和力。
本說明書中所述之「人類白細胞抗原G (human leukocyte antigen G, HLA-G)」是由 HLA-G基因所編碼，為非典型第一類主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex, MHC)，重鏈大約45 kDa。HLA-G在胎兒來源的胎盤細胞上表達，在免疫應答的負調節中十分活躍，其主要作用在於抑制細胞毒性免疫細胞功能。
本說明書中所述之「程式性死亡-配體1 (programmed death-ligand 1, PD-L1)」是大小為40 kDa的第一型跨膜蛋白，是由CD274基因編碼，PD-L1可與其受體-細胞程式性死亡蛋白-1 (programmed cell death protein-1, PD-1)結合。目前研究發現，腫瘤細胞表面的PD-L1表現增加可與免疫細胞上的PD-1結合，抑制宿主免疫細胞失去功能導致細胞凋亡，藉此可使腫瘤細胞逃過免疫監控。
本說明書中所述之「CD3e分子(又稱為CD3E)」是一種T細胞表面的第一型跨膜蛋白，是由 CD3E基因所編碼，CD3e分子在T細胞發育中起重要作用。CD3e分子與CD3γ、CD3δ和CD3ζ以及T細胞受體α/β和γ/δ異二聚體一起形成T細胞受體-CD3複合物。CD3複合物在將抗原識別與幾種細胞內信號轉導途徑偶聯中起重要作用。
茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。
一、本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體以及核酸
1.1. 多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體
請參照第1圖，繪示本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體的結構及作用機制示意圖。本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體 ，其從N端至C端依序包含HLA-G單域抗體嵌合抗原受體和雙特異性T細胞銜接體。
HLA-G單域抗體嵌合抗原受體包含HLA-G單域抗體單元、跨膜域和CD3z訊息傳遞域。HLA-G單域抗體單元與HLA-G專一性結合，而HLA-G單域抗體單元包含至少一HLA-G單域抗體，且至少一HLA-G單域抗體之胺基酸序列如SEQ ID NO: 1及/或SEQ ID NO: 2所示。跨膜域之胺基酸序列如SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 29所示，CD3z訊息傳遞域之胺基酸序列如SEQ ID NO: 25所示。HLA-G單域抗體嵌合抗原受體可組成的腫瘤靶向受體複合物，使本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體與腫瘤細胞表面上特異性識別的人類白細胞抗原G結合後觸發信號轉導，產生信號級聯導致本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞的活化和增殖，進而引發溶解顆粒的胞吐作用並殺死標靶的腫瘤細胞。
於HLA-G單域抗體嵌合抗原受體之N端可更包含第一訊號胜肽，其胺基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。而HLA-G單域抗體嵌合抗原受體可更包含CD8鉸鏈區，串接HLA-G單域抗體單元和跨膜域，CD8鉸鏈區之胺基酸序列如SEQ ID NO: 17所示。
雙特異性T細胞銜接體連接於HLA-G單域抗體嵌合抗原受體之C端，且包含PD-L1單域抗體單元和CD3e單域抗體。PD-L1單域抗體單元與PD-L1專一性結合，PD-L1單域抗體單元包含至少一PD-L1單域抗體，且至少一PD-L1單域抗體之胺基酸序列如SEQ ID NO: 5及/或SEQ ID NO: 6所示。CD3e單域抗體與CD3e分子專一性結合，且CD3e單域抗體之胺基酸序列如SEQ ID NO: 9所示。
於雙特異性T細胞銜接體之N端可更包含第二訊號胜肽，其胺基酸序列如SEQ ID NO: 15所示。此外，本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體可更包含P2A胜肽，其串接HLA-G單域抗體嵌合抗原受體和雙特異性T細胞銜接體，P2A胜肽之胺基酸序列如SEQ ID NO: 27所示。P2A胜肽可使經表現後的多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體於HLA-G單域抗體嵌合抗原受體和雙特異性T細胞銜接體進行自切割，進而剪切雙特異性T細胞銜接體，並將其分泌於細胞外。
1.2. 核酸
本發明之核酸，其係編碼如前段所述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，所述核酸從5’端至3’端依序包含編碼HLA-G單域抗體嵌合抗原受體片段和編碼雙特異性T細胞銜接體片段。
編碼HLA-G單域抗體嵌合抗原受體片段包含編碼HLA-G單域抗體單元片段、編碼跨膜域片段和編碼CD3z訊息傳遞域片段。編碼HLA-G單域抗體單元片段包含至少一編碼HLA-G單域抗體片段，且至少一編碼HLA-G單域抗體片段之核苷酸序列如SEQ ID NO: 3及/或SEQ ID NO: 4所示。編碼跨膜域片段之核苷酸序列如SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 30所示，編碼CD3z訊息傳遞域片段之核苷酸序列如SEQ ID NO: 26所示。
於編碼HLA-G單域抗體嵌合抗原受體片段之5’端可更包含編碼第一訊號胜肽片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示。而編碼HLA-G單域抗體嵌合抗原受體片段可更包含編碼CD8鉸鏈區片段，串接編碼HLA-G單域抗體單元片段和編碼跨膜域片段，編碼CD8鉸鏈區片段之核苷酸序列如SEQ ID NO: 18所示。
編碼雙特異性T細胞銜接體片段連接於編碼HLA-G單域抗體嵌合抗原受體片段之3’端，且包含編碼PD-L1單域抗體單元片段和編碼CD3e單域抗體片段。編碼PD-L1單域抗體單元片段包含至少一編碼PD-L1單域抗體片段，且至少一編碼PD-L1單域抗體片段之核苷酸序列如SEQ ID NO: 7及/或SEQ ID NO: 8所示。編碼CD3e單域抗體片段之核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
於編碼雙特異性T細胞銜接體片段之5’端可更包含編碼第二訊號胜肽片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 16所示。本發明之核酸可更包含編碼P2A胜肽片段，其串接編碼HLA-G單域抗體嵌合抗原受體片段和編碼雙特異性T細胞銜接體片段，編碼P2A胜肽片段之核苷酸序列如SEQ ID NO: 28所示。
請參照第2A圖和第2B圖，第2A圖為本發明之實施例1之核酸的構築示意圖，其為利用體外轉錄( in vitrotranscription, IVT) mRNA技術進行構築；第2B圖為本發明之實施例2之核酸的構築示意圖，其為利用慢病毒載體進行構築。其中第2A圖和第2B圖中的標示為其編碼後的蛋白質。
於實施例1之核酸和實施例2之核酸，編碼第一訊號胜肽片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示，編碼HLA-G單域抗體單元片段中包含2個編碼HLA-G單域抗體片段，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 3 (HLA-G Nb #1)和SEQ ID NO: 4 (HLA-G Nb #109)所示，編碼跨膜域片段為SEQ ID NO: 30所示之編碼4-1BB/TYK片段，編碼CD3z訊息傳遞域片段之核苷酸序列如SEQ ID NO: 26所示。編碼第二訊號胜肽片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 16所示，編碼PD-L1單域抗體單元片段包含2個編碼PD-L1單域抗體片段，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 8 (PD-L1 Nb #15)和SEQ ID NO: 7 (PD-L1 Nb #3)所示，編碼CD3e單域抗體片段之核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示。於實施例1和實施例2中的G-S連結分子之核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示。此外，本發明之核酸可依據構築的系統選擇5’端的啟動子。於實施例1之核酸，其啟動子可為T7啟動子，而實施例2之核酸，其啟動子可為EF-1a啟動子。
1.3. HLA-G單域抗體
試驗上先製備HLA-G單域抗體，再以表面電漿共振(surface plasmon resonance, SPR)分析進行動力學分析和其與HLA-G重組蛋白(Origene, CAT#: TP305216)的結合親和力分析。於本試驗例中所製備的HLA-G單域抗體包含如SEQ ID NO: 1 (HLA-G Nb #1)及SEQ ID NO: 2 (HLA-G Nb #109)所示的HLA-G單域抗體。
請參照第3A圖、第3B圖和下表一，第3A圖為HLA-G Nb #1的結合親和力的分析結果圖，第3B圖為HLA-G Nb #109的結合親和力的分析結果圖，表一為HLA-G Nb #1 (表中簡稱#1)和HLA-G Nb #109 (表中簡稱#109)的動力學分析結果。
表一
  K on(1/Ms) K off(1/s) K D(nM) R max(RU) Chi 2
#1 1.66E+5 1.891E-5 0.11 27.40 0.118
#109 3.490E+5 9.191E-4 2.6 408.4 6.37
由第3A圖、第3B圖和表一的結果顯示，本發明之HLA-G單域抗體與HLA-G具有優異的結合親和力，其中HLA-G Nb #1的K D可達0.11 nM，HLA-G Nb #109的K D可達2.6 nM。
試驗上進一步測試本發明之HLA-G單域抗體是否可以阻斷HLA-G與HLA-G受體的相互作用及/或結合 ，試驗上測試的HLA-G受體為KIR2DL4和LILRB1，所使用的HLA-G單域抗體為HLA-G Nb #1，並藉由競爭性ELISA測試HLA-G Nb #1是否能阻斷生物素化的KIR2DL4 (Sino Biological, CAT#: 13052-H02S)和生物素化的LILRB1 (Sino Biological, CAT#: 16014-H08H)與HLA-G重組蛋白(Origene, CAT#: TP305216)的相互作用及/或結合。試驗上另包含市售的HLA-G單株抗體(87G, ThermoFisher)做為對照組。
請參照第4圖和第5圖，第4圖為本發明之HLA-G單域抗體的LILRB1阻斷活性的分析結果圖，第5圖為本發明之HLA-G單域抗體的KIR2DL4阻斷活性的分析結果圖。第4圖的結果顯示，87G對於LILRB1阻斷活性的IC 50為大於1 μM，而HLA-G Nb #1對於LILRB1阻斷活性的IC 50約為70 nM。第5圖的結果顯示，87G對於KIR2DL4阻斷活性的IC 50約為104 nM，而HLA-G Nb #1對於KIR2DL4阻斷活性的IC 50約為22 nM。上述結果顯示本發明之HLA-G單域抗體具有優異的阻斷HLA-G與LILRB1/KIR2DL4相互作用和結合的能力。
試驗上另測試本發明之HLA-G單域抗體增強自然殺手(NK)細胞介導的細胞毒性對腫瘤細胞的影響。於本試驗中進行測試的腫瘤細胞為MDA-MB-231細胞，測試的HLA-G單域抗體為HLA-G Nb #1和HLA-G Nb #109。試驗上將細胞密度為1×10 5個/孔的MDA-MB-231細胞接種於12孔盤中，培養隔夜後，將3×10 5個/孔或5×10 5個/孔的初代NK細胞加到含有MDA-MB-231細胞的孔中，再分別加入1 mg/ml的HLA-G Nb #1及/或HLA-G Nb #109，或是10 mg/ml的87G，48小時後，利用流式細胞術進行LIVE/DEAD細胞介導的細胞毒性測定，來確定初代NK細胞對MDA-MB-231細胞的特異性裂解。
請參照第6A圖和第6B圖，為本發明之HLA-G單域抗體增強自然殺手(NK)細胞介導的細胞毒性對MDA-MB-231細胞影響的分析結果圖，於第6B圖中，*表示 p＜ 0.05，**表示 p＜ 0.01。第6A圖的結果顯示，單獨處理HLA-G Nb #1或HLA-G Nb #109的組別與未處理的組別相比，本發明之HLA-G單域抗體皆可增強初代NK細胞對MDA-MB-231細胞的特異性裂解，而同時處理HLA-G Nb #1和HLA-G Nb #109的組別，更能增強初代NK細胞對MDA-MB-231細胞的特異性裂解 。第6B圖的結果顯示，處理HLA-G Nb #1或HLA-G Nb #109的組別與未處理的組別相比，本發明之HLA-G單域抗體增強初代NK細胞對MDA-MB-231細胞的特異性裂解具有統計上的顯著差異( p＜ 0.01)，而與HLA-G單株抗體-87G相比，在換算成相同抗體濃度下，本發明之HLA-G單域抗體更能增強初代NK細胞對MDA-MB-231細胞的特異性裂解。
1.4. PD-L1單域抗體
試驗上先製備PD-L1單域抗體，再測試本發明之PD-L1單域抗體是否可阻斷PD-L1與PD-L1受體的相互作用及/或結合。於本試驗例中所製備的PD-L1單域抗體包含如SEQ ID NO: 5 (PD-L1 Nb #3)和SEQ ID NO: 6 (PD-L1 Nb #15)所示的PD-L1單域抗體。
阻斷測試為利用PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay 試劑盒(Promega)進行測試，所使用的PD-L1單域抗體為PD-L1 Nb #3和PD-L1 Nb #15，測試的PD-L1受體為PD-1。試驗上將細胞密度為1×10 4個/孔的PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞接種於96孔盤中，培養隔夜後，將1×10 4個/孔的PD-1效應細胞加到含有PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞的孔中，再分別加入不同濃度的PD-L1 Nb #3、PD-L1 Nb #15或阿替利珠單抗(atezolizumab)，6小時後，加入Bio-Glo TM試劑並使用GloMax ®Discover系統測量發光。並利用Sigmaplot軟體將數據繪製4PL曲線。其中阿替利珠單抗為市售的PD-L1單株抗體，用以作為對照組。
請參照第7圖，為本發明之PD-L1單域抗體的PD-L1/PD-1生物阻斷活性的分析結果圖。結果顯示，阿替利珠單抗對於PD-1阻斷活性的IC 50約為41 nM，而PD-L1 Nb #15對於PD-1阻斷活性的IC 50約為0.48 nM，PD-L1 Nb #3對於PD-1阻斷活性的IC 50約為37.7 nM。顯示本發明之PD-L1單域抗體具有優異的阻斷PD-L1與PD-1相互作用和結合的能力。
試驗上再以SPR分析進行本發明之PD-L1單域抗體的動力學分析和其與PD-L1重組蛋白(Sino Biological, CAT#: 10084-H05H)的結合親和力分析 。請參照第8A圖、第8B圖和下表二，為本發明之PD-L1單域抗體的結合親和力的分析結果圖。第8A圖為PD-L1 Nb #15的結合親和力的分析結果圖，第8B圖為PD-L1 Nb #3的結合親和力的分析結果圖，表二為PD-L1 Nb #15 (表中簡稱#15)和PD-L1 Nb #3 (表中簡稱#3)的動力學分析結果。
表二
  K on(1/Ms) K off(1/s) K D(nM) R max(RU) Chi 2
#15 1.03E+6 9.361E-4 0.91 317.3 33.0
#3 6.045E+6 5.21E-3 0.86 331.9 7.65
由第8A圖、第8B圖和表二的結果顯示，本發明之PD-L1單域抗體與PD-L1具有優異的結合親和力，其中PD-L1 Nb #15的K D可達0.91 nM，PD-L1 Nb #3的K D可達0.86 nM。
試驗上另測試本發明之PD-L1單域抗體增強γδT細胞介導的細胞毒性對腫瘤細胞的影響。於本試驗中進行測試的腫瘤細胞為MDA-MB-231細胞，測試的PD-L1單域抗體為PD-L1 Nb #15和PD-L1 Nb #3。試驗上將細胞密度為1×10 5個/孔的MDA-MB-231細胞接種於12孔盤中，培養隔夜後，將3×10 5個/孔的初代γδT細胞加到含有MDA-MB-231細胞的孔中，再分別加入1 mg/ml的PD-L1 Nb #15或PD-L1 Nb #3，或是10 mg/ml的阿替利珠單抗，48小時後，利用流式細胞術進行LIVE/DEAD細胞介導的細胞毒性測定，來確定初代γδT細胞對MDA-MB-231細胞的特異性裂解。
請參照第9圖，為本發明之PD-L1單域抗體增強γδT細胞介導的細胞毒性對MDA-MB-231細胞影響的分析結果圖，其中*表示 p＜ 0.05。結果顯示，處理PD-L1 Nb #15或PD-L1 Nb #3的組別與未處理的組別相比，本發明之PD-L1單域抗體增強初代γδT細胞對MA-MB-231細胞的特異性裂解具有統計上的顯著差異( p＜ 0.05)，而與阿替利珠單抗相比，在換算成相同抗體濃度下，本發明之PD-L1單域抗體更能增強初代γδT細胞對MDA-MB-231細胞的特異性裂解。
1.5. CD3e單域抗體
試驗上先製備CD3e單域抗體，再測試本發明之CD3e單域抗體對於周邊血液單核細胞(PBMC)和γδT細胞中CD3 +T細胞增殖的影響，於本試驗例中所製備的CD3e單域抗體之胺基酸序列如SEQ ID NO: 9 (CD3e Nb)所示。試驗上先預備塗覆1 mg/ml的CD3e Nb、10 mg/ml的OKT3 (Invitrogen, CAT#: MA1-10175)或未處理的12孔盤，其中OKT3為市售的CD3單株抗體。再將1×10 6個/孔的PBMC或γδT細胞分別接種於前述12孔盤中，再於每孔中加入50 IU/ml的IL-2 (Gibco, CAT#: PHC0021)和2 mg/ml的IL-15 (Sino Biological, CAT#: 10360-H07E)，7天後記錄總細胞數，再以偶聯FITC的OKT3 (eBioscience, CAT#: 11-0037-42)進行染色，並以流式細胞術分析，用顯微鏡在40×下拍照並計算CD3陽性T細胞(CD3 +T細胞)的數量，其計算方式為CD3 +T細胞的百分比×總細胞數。
請參照第10圖，為本發明之CD3e單域抗體對PBMC和γδT細胞中CD3 +T細胞增殖影響的分析結果圖，其中*表示 p＜ 0.05，**表示 p＜ 0.01，***表示 p＜ 0.001。結果顯示，在PBMC的部分，處理本發明之CD3e單域抗體和OKT3皆可增強PBMC中CD3 +T細胞的增殖，然本發明之CD3e單域抗體不論是與未處理的組別或是處理OKT3的組別相比，其增強PBMC中CD3 +T細胞增殖的效果皆具有統計上的差異(分別為 p＜ 0.001和 p＜ 0.05)。而在γδT細胞的部分，處理本發明之CD3e單域抗體和OKT3皆可增強γδT細胞中CD3 +T細胞的增殖且差異具有統計上的意義(分別為 p＜ 0.001和 p＜ 0.01)，且本發明之CD3e單域抗體與處理OKT3的組別相比，其增強效果更加顯著。綜上所述，本發明之CD3e單域抗體具有優異地增強PBMC和γδT細胞中CD3 +T細胞增殖的能力。
二、本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞、其用途以及治療癌症之醫藥組合物
請參照第11圖，係繪示本發明之實施例之核酸及比較例之核酸的構築示意，其中的標示為其編碼後的蛋白質。其中實施例1之核酸(以下簡稱實施例1)為利用IVT mRNA技術進行構築，實施例2之核酸(以下簡稱實施例2)為利用慢病毒載體進行構築，而構築細節如前所述，在此不在贅述。而比較例1之核酸為利用IVT mRNA技術進行構築的HLA-G單域抗體嵌合抗原受體，其不包含靶向PD-L1和CD3e的雙特異性T細胞銜接體。比較例1之核酸中編碼第一訊號胜肽片段為SEQ ID NO: 12所示之編碼CD8a訊號胜肽片段，編碼HLA-G單域抗體單元片段中包含2個編碼HLA-G單域抗體片段，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 3 (HLA-G Nb #1)和SEQ ID NO: 4 (HLA-G Nb #109)所示，編碼跨膜域片段為SEQ ID NO: 30所示之編碼4-1BB/TYK片段，編碼CD3z訊息傳遞域片段之核苷酸序列如SEQ ID NO: 26所示。
試驗上分別將2 μg的實施例1之核酸或比較例1之核酸電穿孔至1×10 6個γδT細胞中，以得到實施例3之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞(以下簡稱實施例3)和比較例2之HLA-G單域抗體嵌合抗原受體表達細胞(以下簡稱比較例2)。此外，利用慢病毒將實施例2之核酸轉導至γδT細胞中，以得到實施例4之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞(以下簡稱實施例4)。再將1×10 6個比較例2、實施例3、實施例4和親代γδT細胞(以下簡稱為親代細胞)以iFluor 647偶聯的抗VHH抗體(GenScript)進行染色。再用含有1% BSA的PBS洗滌兩次後，以流式細胞術並使用親代細胞作為背景對照，測定比較例2、實施例3和實施例4在第1天至第7天每天的HLA-G單域抗體嵌合抗原受體的表達狀況，以確定實施例1和實施例2在γδT細胞中的轉導率。
本發明之治療癌症之醫藥組合物包含本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞。較佳地，所述治療癌症之醫藥組合物可更包含另一治療癌症的製劑，例如化療藥物、靶向治療藥物、抗體藥物、免疫調節劑或其組合。
請參照第12A圖和第12B圖，為比較例2、實施例3和實施例4表現HLA-G單域抗體嵌合抗原受體的分析結果圖，其中第12A圖為第1天至第4天的分析結果圖，第12B圖為第5天至第7天的分析結果圖。第12A圖和第12B圖的結果顯示，比較例2在第1天的HLA-G單域抗體嵌合抗原受體的表現量最高，可達59.8%，但表現量逐日遞減，在第7天的表達量僅剩13.5%。實施例3的HLA-G單域抗體嵌合抗原受體的表現量也是在第1天最高，可達56.1%，表現量也是逐日遞減，但在第7天的表達量仍有26.1%。而實施例4在第1天的HLA-G單域抗體嵌合抗原受體僅有10.3%，但逐日遞增至第6天的表現量最高，可達74%，至第7天降至54.8%的表現量。上述結果顯示本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞可以穩定表達轉導於其中的HLA-G單域抗體嵌合抗原受體。
試驗上進一步測試本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞對腫瘤細胞的細胞毒性。於此試驗中所使用的多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞為實施例4，所測試的細胞包含三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer, TNBC)細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞和胰腺癌細胞，其中TNBC細胞包含MDA-MB-231細胞和MDA-MB-231 HLA-Gov細胞，多形性膠質母細胞瘤細胞包含GBM-8901細胞和DBTRG-05MG細胞，肺癌細胞包含A549細胞和H1975細胞，卵巢癌細胞包含SKOV3細胞和SKOV3 HLA-Gov細胞，胰腺癌細胞為AsPC1細胞。其中MDA-MB-231 HLA-Gov細胞為穩定過表現HLA-G的MDA-MB-231細胞株，SKOV3 HLA-Gov細胞為穩定過表現HLA-G的SKOV3細胞株，其係利用Lipofectamine 3000 (Invitrogen)分別將可編碼HLA-G的pCMV1質體轉染至MDA-MB-231細胞株和SKOV3細胞株中而得到的細胞株。
試驗上將實施例4或親代細胞作為效應細胞，在37 oC下以效應細胞/腫瘤細胞(E:T)比例為1:1、2:1、3:1 、6:1和10:1的條件下，將效應細胞和腫瘤細胞共培養。所有腫瘤細胞在共培養前，以帶有綠色螢光的鈣黃綠素-AM染色，在共培養48小時後以帶有紅色螢光的碘化丙啶染色，並利用流式細胞術進行LIVE/DEAD細胞介導的細胞毒性測定，來確定實施例4對腫瘤細胞的特異性裂解。
請參照第13A圖至第17圖，為本發明之實施例4對腫瘤細胞特異性裂解的分析結果圖，其中第13A圖和第13B圖分析的腫瘤細胞為MDA-MB-231細胞和MDA-MB-231 HLA-Gov細胞，第14A圖和第14B圖分析的腫瘤細胞為GBM-8901細胞和DBTRG-05MG細胞，第15A圖和第15B圖分析的腫瘤細胞為A549細胞和H1975細胞，第16A圖和第16B圖分析的腫瘤細胞為SKOV3細胞和SKOV3 HLA-Gov細胞，第17圖分析的腫瘤細胞為AsPC1細胞。第13A圖至第17圖中，*表示 p＜ 0.05，**表示 p＜ 0.01，***表示 p＜ 0.001。
由第13A圖和第13B圖的結果顯示，與親代細胞相比，實施例4在E:T比例為1:1、2:1、3:1、6:1和10:1的條件下皆可增強其對於MDA-MB-231細胞和MDA-MB-231 HLA-Gov細胞的特異性裂解，且差異具有統計上的意義。第14A圖和第14B圖的結果顯示，與親代細胞相比，實施例4在E:T比例為1:1、2:1、3:1、6:1和10:1的條件下皆可增強其對於GBM-8901細胞和DBTRG-05MG細胞的特異性裂解，且差異具有統計上的意義。第15A圖和第15B圖的結果顯示，與親代細胞相比，實施例4在E:T比例為1:1、2:1、3:1、6:1和10:1的條件下皆可增強其對於A549細胞和H1975細胞的特異性裂解，且差異具有統計上的意義。第16A圖和第16B圖的結果顯示，與親代細胞相比，實施例4在E:T比例為1:1、2:1、3:1、6:1和10:1的條件下皆可增強其對於SKOV3細胞和SKOV3 HLA-Gov細胞的特異性裂解，且差異具有統計上的意義。第17圖的結果顯示，與親代細胞相比，實施例4在E:T比例為1:1、2:1、3:1、6:1和10:1的條件下皆可增強其對於AsPC1細胞的特異性裂解，且差異具有統計上的意義。上述結果顯示，本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞對於不論是TNBC細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞或胰腺癌細胞皆具有優異的細胞毒殺作用。
請參照第18圖及第1圖，第18圖係繪示本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞分泌多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體的作用機制示意圖。因本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體於HLA-G單域抗體嵌合抗原受體和雙特異性T細胞銜接體之間具有P2A胜肽可進行自切割，是以當多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞表現多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體後，可剪切雙特異性T細胞銜接體，並將其分泌於細胞外。
為測試本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞中雙特異性T細胞銜接體的分泌狀況，試驗上將親代細胞、實施例3或實施例4與MDA-MB-231細胞以E:T比例為3:1接種於塗覆PD-L1的12孔盤中，在共培養48小時後，以抗CD3的抗體檢測雙特異性T細胞銜接體的分泌量。
請參照第19圖，為本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞分泌雙特異性T細胞銜接體的分析結果圖。結果顯示，與共培養前的數據相比不論是實施例3或是實施例4，在與MDA-MB-231細胞共培養後，皆能使雙特異性T細胞銜接體的分泌量增加，顯示本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞所分泌雙特異性T細胞銜接體是可檢測的。
本試驗進一步利用細胞不可穿透的transwell膜(孔徑為0.4 μm)評估本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞所釋放的多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體對於腫瘤細胞的細胞毒殺作用。試驗上將效應細胞(PBMC)和/或腫瘤細胞(GBM-8901細胞或DBTRG-05MG)以E:T比例為5:1接種於12孔盤的底部，然後在含有或不含細胞不可穿透的transwell膜的上部空間加入5×10 5的實施例3、親代細胞或比較例2。並在指定的時間點，並對底部細胞進行LIVE/DEAD細胞介導的細胞毒性測定，再藉由流式細胞術進行分析。
請參照第20A圖、第20B圖和第20C圖，為實施例3、親代細胞或比較例2的條件培養基增強PBMC誘導的細胞毒性對多形性膠質母細胞瘤細胞影響的分析結果圖，其中第20A圖為顯微照片圖，第20B圖和第20C圖為第20A圖的統計結果圖，且*表示 p＜ 0.05，**表示 p＜ 0.01，***表示 p＜ 0.001。第20A圖和第20B圖的結果顯示，與未處理的空白對照組相比，親代細胞、比較例2和實施例3的條件培養基皆能增強PBMC誘導的細胞毒性，進而引發對於GBM-8901細胞的特異性裂解，但實施例3的條件培養基所增強的PBMC誘導的細胞毒性顯著地優於其他組別，不論是和親代細胞或比較例2相比，差異皆具有統計上的意義(分別為 p＜ 0.001和 p＜ 0.05) 。而第20A圖和第20C圖的結果顯示，與未處理的空白對照組相比，親代細胞、比較例2和實施例3的條件培養基皆能增強PBMC誘導的細胞毒性，進而引發對於DBTRG-05MG細胞的特異性裂解，但實施例3的條件培養基所增強的PBMC誘導的細胞毒性顯著地優於其他組別 ，不論是和親代細胞或比較例2相比，差異皆具有統計上的意義(分別為 p＜ 0.05和 p＜ 0.05)。上述結果顯示，本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞確實可分泌雙特異性T細胞銜接體至細胞培養基中，進而增強效應細胞對於腫瘤細胞的細胞毒性而引發特異性裂解。
進一步地，為測試本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞是否具有治療癌症的功效，請參照第21A圖，係繪示本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞於動物治療試驗策略的示意圖。在試驗前10天(第-10天)先建立原位異種移植乳腺腫瘤PBMC-huNGS小鼠模型，係於雌性NGS小鼠的左側第4乳腺皮下注射1×10 6個MDA-MB-231-luc細胞，植入7天後(第-3天)，以尾靜脈注射注射5×10 6個huPBMC細胞至NGS小鼠中，以建立完成原位異種移植乳腺腫瘤PBMC-huNGS小鼠模型(以下簡稱為腫瘤小鼠)。再3天後(第0天)開始進行治療，治療方式為以尾靜脈注射1×10 7個親代細胞或實施例4至腫瘤小鼠中，並於每週追加注射1次1×10 7個親代細胞或實施例4至腫瘤小鼠中，追加次數為3次(第7天、第14天和第21天)。腫瘤小鼠在治療過程中，每週使用活體影像系統(IVIS Spectrum, PerkinElmer)進行監測腫瘤的生長情況，監測時間點為第0天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天、第49天、第56天、第63天、第70天、第77天和第84天。此外，腫瘤小鼠的存活率係以Kaplan-Meier存活曲線進行分析。
請參照第21B圖、第21C圖和第21D圖，為本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞對於腫瘤小鼠的腫瘤生長抑制影響的分析結果圖。其中第21B圖為IVIS的影像圖，照片下的號碼為腫瘤小鼠在試驗組別中的編號。第21C圖為各組腫瘤小鼠於各監測時間點的生物發光量，生物發光量與腫瘤的大小成正比。第21D圖為各組腫瘤小鼠的Kaplan-Meier存活曲線圖。
結果顯示，未經治療的腫瘤小鼠(以下簡稱載體組)的腫瘤於第0天開始逐漸生長，並在第63天全數的載體組腫瘤小鼠 (n = 6)皆已死亡。以親代細胞治療的腫瘤小鼠(以下簡稱親代細胞組)與載體組相比，其腫瘤的生長速度雖然較慢，但從第0天開始腫瘤的大小也隨著時間增加，並在第81天全數的親代細胞組腫瘤小鼠 (n = 6)皆已死亡。而以實施例4治療的腫瘤小鼠(以下簡稱實施例4組)，其腫瘤大小被控制，甚至6隻實施例4組中的2隻腫瘤小鼠在第84天未增測到腫瘤殘留的訊號，而其中1隻的存活天數可以延長至第128天。上述結果顯示，本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞能增加腫瘤抑制的效果，並有效延長原位異種移植乳腺腫瘤PBMC-huNGS小鼠的生存時間。
綜上所述，本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，特別是與腫瘤細胞之細胞膜上所表現的HLA-G專一性結合，因而可使表現本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞專一性的靶向腫瘤細胞，避免脫靶效應。此外，本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體可以特異性辨識T細胞表面的CD3分子以及腫瘤細胞表面的PD-L1的雙特異性T細胞銜接體，並可以同時激活的T細胞並阻斷免疫檢查點活化，進而有效地毒殺腫瘤細胞，是以可用於製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。本發明之治療癌症之醫藥組合物，包含本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞，可有效地毒殺腫瘤細胞進而治療癌症。並經由實驗數據證實，本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞在動物模型上具有優異抑制腫瘤進展的效果，具有運用於生醫保健市場之潛能。
然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1圖係繪示本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體的結構及作用機制示意圖； 第2A圖和第2B圖係繪示本發明之核酸的構築示意圖； 第3A圖和第3B圖為本發明之HLA-G單域抗體的結合親和力的分析結果圖； 第4圖為本發明之HLA-G單域抗體的LILRB1阻斷活性的分析結果圖； 第5圖為本發明之HLA-G單域抗體的KIR2DL4阻斷活性的分析結果圖； 第6A圖和第6B圖為本發明之HLA-G單域抗體增強自然殺手(NK)細胞介導的細胞毒性對MDA-MB-231細胞影響的分析結果圖； 第7圖為本發明之PD-L1單域抗體的PD-L1/PD-1生物阻斷活性的分析結果圖； 第8A圖和第8B圖為本發明之PD-L1單域抗體的結合親和力的分析結果圖； 第9圖為本發明之PD-L1單域抗體增強γδT細胞介導的細胞毒性對MDA-MB-231細胞影響的分析結果圖； 第10圖為本發明之CD3e單域抗體對周邊血液單核細胞(PBMC)和γδT細胞中CD3 +T細胞增殖影響的分析結果圖； 第11圖係繪示本發明之核酸及比較例之核酸的構築示意圖； 第12A圖和第12B圖為本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞表現HLA-G單域抗體嵌合抗原受體的分析結果圖； 第13A圖、第13B圖、第14A圖、第14B圖、第15A圖、第15B圖、第16A圖、第16B圖和第17圖為本發明之實施例4之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞對腫瘤細胞特異性裂解的分析結果圖； 第18圖係繪示本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞分泌多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體的作用機制示意圖； 第19圖為本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞分泌雙特異性T細胞銜接體的分析結果圖； 第20A圖、第20B圖和第20C圖為本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞的條件培養基增強PBMC誘導的細胞毒性對多形性膠質母細胞瘤細胞影響的分析結果圖； 第21A圖係繪示本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞於動物治療試驗策略的示意圖；以及 第21B圖、第21C圖和第21D圖為本發明之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞對於腫瘤小鼠的腫瘤生長抑制影響的分析結果圖。
<110> 長聖國際生技股份有限公司
<120> 多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體、核酸、 其表達細胞、其用途以及治療癌症之醫藥組合物
<130> CP-5346-TW
<140> TW111119186
<141> 2022-05-23
<150> US 63/223,985
<151> 2021-07-21
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-G Nb #1
<400> 1
Figure 111119186-A0305-02-0035-1
<210> 2
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-G Nb #109
<400> 2
Figure 111119186-A0305-02-0036-2
<210> 3
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼HLA-G Nb #1片段
<400> 3
Figure 111119186-A0305-02-0036-3
Figure 111119186-A0305-02-0037-4
<210> 4
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼HLA-G Nb #109片段
<400> 4
Figure 111119186-A0305-02-0037-5
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 Nb #3
<400> 5
Figure 111119186-A0305-02-0037-6
Figure 111119186-A0305-02-0038-7
<210> 6
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-L1 Nb #15
<400> 6
Figure 111119186-A0305-02-0038-8
<210> 7
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼PD-L1 Nb #3片段
<400> 7
Figure 111119186-A0305-02-0038-9
<210> 8
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼PD-L1 Nb #15片段
<400> 8
Figure 111119186-A0305-02-0039-10
<210> 9
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3e Nb
<400> 9
Figure 111119186-A0305-02-0039-11
<210> 10
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼CD3e Nb片段
<400> 10
Figure 111119186-A0305-02-0040-12
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一訊號胜肽
<400> 11
Figure 111119186-A0305-02-0040-13
<210> 12
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼第一訊號胜肽片段
<400> 12
Figure 111119186-A0305-02-0040-14
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G-S連結分子
<400> 13
Figure 111119186-A0305-02-0041-15
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼G-S連結分子片段
<400> 14
Figure 111119186-A0305-02-0041-16
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第二訊號胜肽
<400> 15
Figure 111119186-A0305-02-0041-17
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼第二訊號胜肽
<400> 16
Figure 111119186-A0305-02-0041-18
<210> 17
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8鉸鏈區
<400> 17
Figure 111119186-A0305-02-0041-19
Figure 111119186-A0305-02-0042-20
<210> 18
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼CD8鉸鏈區片段
<400> 18
Figure 111119186-A0305-02-0042-21
<210> 19
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IFNAR1/4-1BB
<400> 19
Figure 111119186-A0305-02-0042-22
Figure 111119186-A0305-02-0043-23
<210> 20
<211> 377
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼IFNAR1/4-1BB片段
<400> 20
Figure 111119186-A0305-02-0043-24
<210> 21
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myd88/CD40
<400> 21
Figure 111119186-A0305-02-0043-25
Figure 111119186-A0305-02-0044-26
<210> 22
<211> 510
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼Myd88/CD40片段
<400> 22
Figure 111119186-A0305-02-0044-27
<210> 23
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myd88/IFNAR1
<400> 23
Figure 111119186-A0305-02-0044-28
Figure 111119186-A0305-02-0045-29
<210> 24
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼Myd88/IFNAR1片段
<400> 24
Figure 111119186-A0305-02-0045-30
Figure 111119186-A0305-02-0046-31
<210> 25
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3z訊息傳遞域
<400> 25
Figure 111119186-A0305-02-0046-32
<210> 26
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼CD3z訊息傳遞域片段
<400> 26
Figure 111119186-A0305-02-0047-33
<210> 27
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A胜肽
<400> 27
Figure 111119186-A0305-02-0047-34
<210> 28
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼P2A胜肽片段
<400> 28
Figure 111119186-A0305-02-0047-35
<210> 29
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB/TYK
<400> 29
Figure 111119186-A0305-02-0047-36
Figure 111119186-A0305-02-0048-37
<210> 30
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼4-1BB/TYK片段
<400> 30
Figure 111119186-A0305-02-0048-38

Claims (11)

  1. 一種多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，從N端至C端依序包含：一第一訊號胜肽，其胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示；一HLA-G單域抗體嵌合抗原受體，包含：一HLA-G單域抗體單元，其與人類白細胞抗原G(human leukocyte antigen G,HLA-G)專一性結合，該HLA-G單域抗體單元包含二HLA-G單域抗體，且該二HLA-G單域抗體之胺基酸序列分別如SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所示；一跨膜域，該跨膜域以一CD8鉸鏈區串接該HLA-G單域抗體單元，該跨膜域之胺基酸序列如SEQ ID NO：29所示；及一CD3z訊息傳遞域，該CD3z訊息傳遞域之胺基酸序列如SEQ ID NO：25所示；一第二訊號胜肽，其胺基酸序列如SEQ ID NO：15所示；以及一雙特異性T細胞銜接體，連接於該HLA-G單域抗體嵌合抗原受體之C端，該雙特異性T細胞銜接體包含：一PD-L1單域抗體單元，其與程式性死亡-配體1(programmed death-ligand 1,PD-L1)專一性結合，該PD-L1單域抗體單元包含二PD-L1單域抗體，且該二PD-L1單域抗體之胺基酸序列分別如SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6所示；及一CD3e單域抗體，其與CD3e分子專一性結合，該CD3e單域抗體之胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示；其中該HLA-G單域抗體嵌合抗原受體以一P2A胜肽串接該雙特異性T細胞銜接體。
  2. 如請求項1所述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，其中該HLA-G單域抗體單元阻斷HLA-G與一HLA-G受體的相互作用及/或結合。
  3. 如請求項2所述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，其中該HLA-G受體為KIR2DL4及/或LILRB1。
  4. 如請求項1所述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，其中該PD-L1單域抗體單元阻斷PD-L1與一PD-L1受體的相互作用及/或結合。
  5. 如請求項4所述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，其中該PD-L1受體為細胞程式性死亡蛋白-1(programmed cell death protein-1,PD-1)。
  6. 如請求項1所述之多特異性單域抗體嵌合抗 原受體及T細胞銜接體，其中該CD3e單域抗體激活及/或招募T細胞。
  7. 一種核酸，其係編碼如請求項1所述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體，該核酸從5’端至3’端依序包含：一編碼第一訊號胜肽片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；一編碼HLA-G單域抗體嵌合抗原受體片段，包含：一編碼HLA-G單域抗體單元片段，該編碼HLA-G單域抗體單元片段包含二編碼HLA-G單域抗體片段，且該二編碼HLA-G單域抗體片段之核苷酸序列分別如SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所示；一編碼跨膜域片段，該編碼跨膜域片段以一編碼CD8鉸鏈區片段串接該編碼HLA-G單域抗體單元片段，該編碼跨膜域片段之核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示；及一編碼CD3z訊息傳遞域片段，該編碼CD3z訊息傳遞域片段之核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示；一編碼第二訊號胜肽片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；以及一編碼雙特異性T細胞銜接體片段，連接於該編碼HLA-G單域抗體嵌合抗原受體片段之3’端，該編碼雙特異性T細胞銜接體片段包含： 一編碼PD-L1單域抗體單元片段，該編碼PD-L1單域抗體單元片段包含二編碼PD-L1單域抗體片段，且該二編碼PD-L1單域抗體片段之核苷酸序列分別如SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8所示；及一編碼CD3e單域抗體片段，該編碼CD3e單域抗體片段之核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；其中該編碼HLA-G單域抗體嵌合抗原受體片段以一編碼P2A胜肽片段串接該編碼雙特異性T細胞銜接體片段。
  8. 一種多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞，包含：一免疫細胞；以及如請求項11所述之核酸；其中該多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞為將該核酸轉染至該免疫細胞而得。
  9. 如請求項8所述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞，其中該免疫細胞為自然殺手細胞或γδT細胞。
  10. 一種治療癌症之醫藥組合物，包含：如請求項8所述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞；以及一醫藥上可接受載劑。
  11. 一種如請求項8所述之多特異性單域抗體嵌合抗原受體及T細胞銜接體表達細胞之用途，其係用於製備誘導哺乳類動物之一腫瘤細胞死亡之藥物。
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