TWI854953B - 抗ｃｄ３抗體及含有該抗體的分子、及其製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種與人類CD3結合的新穎抗體、或具有包含該抗體的抗原結合性的分子。
與人類CD3結合的新穎抗體、具有包含該抗體的抗原結合性的分子、含有該抗體或該分子作為有效成分且具有細胞毒性活性的醫藥組成物之提供等。

Description

抗CD3抗體及含有該抗體的分子、及其製造方法
本發明係關於與人類CD3結合且與食蟹獼猴(cynomolgus monkey)CD3結合的新穎抗體、及含有該抗體的分子。
1)抗CD3單株抗體係與其他之任意的單株抗體同樣地，藉由對彼等之標的分子的高度辨識而發揮機能。抗CD3抗體係僅辨識為標的之CD3分子上單一抗原決定位(epitope)。CD3複合體中最廣泛使用的特異性單株抗體、又為最佳特徵者為OKT3。
2)OKT3係源自小鼠的抗人類CD3單株抗體(非專利文獻1)。為了防止臟器的同種移植片排斥，投予抗CD3單株抗體，抗體與人類T細胞上的TCR複合體結合，藉由抑制T細胞的活性化與增殖，防止移植臟器排斥的處置法已使用了一段長時間(非專利文獻2-4)。OKT3係用於此種處置的最初使用的抗CD3抗體。OKT3具有強的免疫抑制效果，另一方面，由於與其免疫原性及分裂促進的潛在能力有關的嚴重副作用的原因，其臨床上的使用受阻(非專利文獻5-8)。
3)OKT3於活體外誘導T細胞增殖及細胞介素(cytokine)產生，活體內釋放大量的細胞介素，引起細胞介素症候群(非專利文獻5)。此係因OKT3為2價IgG，產生對T細胞與Fcγ受體表現細胞的交叉連結，結果引起T細胞的增殖(非專利文獻8)。又因OKT3為小鼠抗體，已知經由長期投予，產生如人類抗小鼠抗體(HAMA)的異嗜性抗體(heterophilic antibody)(非專利文獻7)。抗CD3抗體之對治療的應用及副作用的報告係整理如下(專利文獻1)。
4)為了解決此種問題，製作了OKT3之scFv(非專利文獻9)、或人類化OKT3(非專利文獻10)等。又作為OKT3之進一步應用例，已報告利用T細胞活性化能的OKT3的單鏈與對於癌細胞表面表現的標的抗原之抗體的單鏈結合的雙特異性抗體(bispecific antibody)(專利文獻2、非專利文獻11)。
5)使用於目前技術區域所說明的抗CD3抗體的多重特異性抗體被期待對於惡性疾病的治療有很大的治療可能性。例如，已知TROP2於各種上皮細胞癌種類過度表現(非專利文獻12-16)。目前尚未報告人類TROP2特異性抗體之抗原結合性片段與抗CD3抗體之抗原結合性片段於基因上聯繫而使表現的雙特異性抗體。
6)OKT3雖與黑猩猩之CD3反應，但與源自食蟹獼猴等其他之靈長動物的CD3不反應(非專利文獻17)。為抗CD3單株抗體的UCHT-1亦與源自黑猩猩的CD3反應，但與源自食蟹獼猴的CD3不反應(非專利文獻18)。另一方面，亦可見到辨識食蟹獼猴抗原，但未辨識彼等人類對應物的單株抗體的例子。此群的一例係指向源自食蟹獼猴的CD3的單株抗體的FN-18(非專利文獻19)。
7)修飾OKT3及OKT3的一系列抗體的局限性在於它僅與人類CD3特異性結合。此種侷限性於開發作為治療人類疾病的治療劑方面可能成為重大障礙。這是因為為了開發候補藥品獲得市場認可，有必要實施前臨床試驗，於前臨床試驗，期望使用動物，特別是為高等靈長類的食蟹獼猴進行試驗。因此，使用抗CD3抗體的候補藥品的情形，非常期望使用可與人類與食蟹獼猴兩者之CD3結合的抗CD3抗體。
8)與人類及食蟹獼猴兩者結合的抗體已報告於專利文獻3、4、及非專利文獻20。又已報告此種抗CD3抗體之單鏈、與抗於癌細胞表面表現的標的抗原的抗體之單鏈結合的雙特異性抗體(專利文獻5、非專利文獻21)。然而，為了可利用對富含多樣性的癌標的可能適應的多重特異性抗體及多重特異性分子，期望與上述不同的抗原決定位結合，且與人類和食蟹獼猴兩者結合的抗CD3抗體。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1 國際公開第2012/162067號
專利文獻2 國際公開第2007/108152號
專利文獻3 美國專利公開8236308號說明書
專利文獻4 國際公開第2008/119567號
專利文獻5 國際公開第2015/026892號
非專利文獻
非專利文獻1 Salmeron A. et al.，J. Immunol.(1991) 147，3047-3052
非專利文獻2 Cosmi AB. et al.，Transplantation(1981) 32，535-539
非專利文獻3 Gilbert EM. et al.，Am. J. Med.(1987) 82，202-206
非專利文獻4 Thistlethwaite JR. et al.，Transplanation (1987)43，176-184
非專利文獻5 Abramowicz D. et al.，Transplanation (1989)47，606-608
非專利文獻6 Toussaint D. et al.，Transplanation (1989)48，524-526
非專利文獻7 Thistlethwaite，JR. et al.，Am. J. Kidney Dis.(1988)11，112-119
非專利文獻8 Meuer，SC. et al.，Eur. J. Immunol. (1986)136，4106-4112
非專利文獻9 George AJ. et al.，J. Immunol.(1994) 152(4)，1802-11
非專利文獻10 Woodle ES. et al.，J Immunol.(1992) 148(9)，2756-63
非專利文獻11 Yankelevich M.et al.，Pediatr. Blood Cancer(2012)59(7)，1198-1205
非專利文獻12 Qhmachi T. et al.，Clin. Cancer Res. (2006)12(18)，3857-3863
非專利文獻13 Muhlmann G.，et al.，J. Clin. Pathol. (2009)62(2)，152-158
非專利文獻14 Fong D.，et al.，Br. J. Cancer(2000) 99(8)，1290-1295.
非專利文獻15 Fong D. et al.，Mod. Pathol.(2000)21 (2)(2000)，186-191
非專利文獻16 Ning S.，et al.，Neurol. Sci.(2013) 34(10)，1745-1750
非專利文獻17 Sandusky et al.，J. Med. Primatol. (1986)15，441-451
非專利文獻18 http：//www.nhpreagents.org/NHP/clonelist.aspx？ID=77
非專利文獻19 Uda et al.，J.Med.Primatol.(2001)30，141-147
非專利文獻20 Conrad ML.et al.，Cytometry A.(2007) 71(11)，925-33
非專利文獻21 Lum LG. et al.，BioDrugs(2011)25 (6)，365-379.
發明概要
本發明之目的係提供與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合的新穎抗體或該抗體之抗原結合性片段(以下，亦記載為抗體等)、含有該抗體等與另外1個或2個以上之另外的抗體或該抗體之抗原結合性片段的分子、為多重特異性的該分子、含有該抗體等或該分子作為有效成分且具有細胞毒性活性的醫藥組成物等。
本發明人等為了解決標題課題，而進行深入研究，創造出新穎抗CD3抗體、及含有該抗體的分子，而完成本發明。
即，本發明係包含以下之發明。
(1)一種抗體或該抗體之抗原結合性片段，其特徵為：重鏈序列分別包含：包含序列識別號26所示的胺基酸序列的CDRH1、包含序列識別號98所示的胺基酸序列的CDRH2、及包含序列識別號28所示的胺基酸序列的CDRH3；輕鏈序列分別包含：包含序列識別號29所示的胺基酸序列的CDRL1、包含序列識別號99所示的胺基酸序列的CDRL2、及包含序列識別號31所示的胺基酸序列的CDRL3；且與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合。
(2)如前述(1)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其特徵為前述CDRH2之第1個Xaa係選自由(A、E、G、H、I、L、T、V、R、S)所組成的群組，且第2個Xaa為S，或第1個Xaa為N，且第2個Xaa係選自由(E、R、F、Y、L、V、I、K、T)所組成的群組，前述CDRL2之Xaa係選自由(Q、A、G、S、N、D)所組成的群組，且與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合。
(3)如前述(1)或(2)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其特徵為前述CDRH2之第1個Xaa係選自由(R、S)所組成的群組，第2個Xaa為S，且前述CDRL2之Xaa係選自由(Q、A、G、S、N、D)所組成的群組，且與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合。
(4)如前述(1)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其特徵為重鏈序列係包含具有CDRH1、CDRH2、及CDRH3的可變區，前述CDRH1係由序列識別號26所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH2係由序列識別號27所示的胺基酸序列所構成，前述CDRH3係由序列識別號28所示的胺基酸序列所構成；以及 輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、CDRL3的可變區，前述CDRL1係由序列識別號29所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL2係由序列識別號30所示的胺基酸序列所構成，前述CDRL3係由序列識別號31所示的胺基酸序列所構成；以及與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合。
(5)如前述(1)至(4)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其特徵為重鏈可變區序列包含序列識別號100所示的胺基酸序列。
(6)如前述(5)抗體或其抗原結合性片段，其中序列識別號100所示的胺基酸序列之第1個Xaa係選自由(A、E、G、H、I、L、T、V、R、S)所組成的群組，且第2個Xaa為S，或第1個Xaa為N，且第2個Xaa係選自由(E、R、F、Y、L、V、I、K、T)所組成的群組。
(7)如前述(5)之抗體或其抗原結合性片段，其中序列識別號100所示的胺基酸序列之第1個Xaa係選自由(R、S)所組成的群組，且第2個Xaa為S。
(8)如前述(1)至(7)中任一項之抗體或其抗原結合性片段，其特徵為輕鏈可變區包含序列識別號101、102、及103之任一者所示的胺基酸序列。
(9)如前述(8)記載之抗體或其抗原結合性片段，其中序列識別號101、102、及103之任一者所示的胺基酸序列之Xaa係選自由(Q、A、G、S、N、D)所組成的群組。
(10)如前述(5)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其特徵為重鏈可變區序列包含序列識別號16所示的胺基酸序列。
(11)如前述(8)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其特徵為輕鏈可變區序列包含序列識別號17、20、及23之任一者所示的胺基酸序列。
(12)如前述(1)或(2)之抗體或其抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號100所示的胺基酸序列的重鏈可變區、及包含序列識別號101、102、及103之任一者所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，序列識別號100所示的胺基酸序列之第1個Xaa係選自由(A、E、G、H、I、L、T、V、R、S)所組成的群組，且第2個Xaa為S，或第1個Xaa為N，且第2個Xaa係選自由(E、R、F、Y、L、V、I、K、T)所組成的群組，序列識別號101、102、及103之任一者所示的胺基酸序列之Xaa係選自由(Q、A、G、S、N、D)所組成的群組。
(13)如前述(12)之抗體或其抗原結合性片段，其中序列識別號100之第1個Xaa係選自由(R、S)所組成的群組，第2個Xaa為S，且 序列識別號101、102、及103之任一者所示的胺基酸序列之Xaa係選自由(Q、A、G、S、N、D)所組成的群組。
(14)如前述(13)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其係：含有包含序列識別號60之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號60之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段；含有包含序列識別號64之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號64之135至241之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段；含有包含序列識別號66之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號66之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段；含有包含序列識別號68之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號68之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段；含有包含序列識別號70之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號70之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段； 含有包含序列識別號72之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號72之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段；含有包含序列識別號74之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號74之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段；含有包含序列識別號76之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號76之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段；含有包含序列識別號78之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號78之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段；含有包含序列識別號80之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號80之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段；含有包含序列識別號82之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號82之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段；或 含有包含序列識別號84之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號84之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段。
(15)如前述(1)、(4)、(5)、(8)、(10)、或(11)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其含有包含序列識別號16所示的胺基酸序列的重鏈可變區、連結子(linker)、及包含序列識別號17、20、及23之任一者所示的胺基酸序列的輕鏈可變區。
(16)如前述(1)至(15)中任一項之抗體或其抗原結合性片段，其中可變區係自抗體之胺基末端側，以重鏈可變區、輕鏈可變區的順序結合，或以輕鏈可變區、重鏈可變區的順序結合，且任意地：i)於兩可變區之間具有連結子；ii)於胺基末端側的可變區之胺基末端具有甘胺酸殘基；iii)於羧基末端側的可變區之羧基末端，結合有連結子、FLAG標籤、及/或His標籤。
(17)如前述(16)記載之抗原或該抗體之抗原結合性片段，其含有：包含序列識別號60之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號64之第2至241位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號66之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、 包含序列識別號68之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號70之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號72之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號74之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號76之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號78之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號80之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號82之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、或包含序列識別號84之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列。
(18)如前述(16)記載之抗原或該抗體之抗原結合性片段，其含有：包含序列識別號19之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號22之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、 包含序列識別號25之2至267之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號60之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號64之2至267之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號66之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號68之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號70之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號72之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號74之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號76之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號78之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號80之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號82之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、或 包含序列識別號84之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列。
(19)一種抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含一胺基酸序列，且與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合，其中該胺基酸序列係由一核苷酸序列編碼，該核苷酸序列係含於在嚴格條件下與下列多核苷酸之互補鏈雜交的多核苷酸：編碼如前述(14)至(18)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段所含的胺基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。
(20)一種抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含與如前述(14)至(18)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段所含的重鏈之胺基酸序列為90%以上相同的胺基酸序列，及該輕鏈包含與如前述(14)至(18)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段所含的輕鏈之胺基酸序列為70%以上相同的胺基酸序列；且與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合。
(21)一種抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含：在包含有如前述(14)至(18)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段所含的重鏈之胺基酸序列中，1至數個胺基酸經取代、缺失(deletion)或添加而成的胺基酸序列；以及該輕鏈包含：在包含有如前述(14)至(18)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段所含的輕鏈之胺基酸序列中，1至數之胺基酸經取代、缺失或添加而成的胺基酸序列；且與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合。
(22)一種抗體或該抗體之抗原結合性片段，其與前述(14)至(18)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段所結合的人類CD3上之相同部位結合，且與食蟹獼猴CD3結合。
(23)一種抗體或該抗體之抗原結合性片段，其與如前述(14)至(18)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段競爭對人類CD3上的結合，且與食蟹獼猴CD3結合。
(24)如前述(22)記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中前述抗體或該抗體之抗原結合性片段所結合的人類CD3上之部位係由序列識別號1所示的胺基酸序列中之第55位之絲胺酸(Ser)、第56位之麩胺酸(Glu)、第58位之白胺酸(Leu)、第59位之色胺酸(Trp)、第65位之天冬醯胺酸(Asn)、第66位之異白胺酸(Ile)、第77位之絲胺酸(Ser)、第78位之天冬胺酸(Asp)、第101位之精胺酸(Arg)、第101位之甘胺酸(Gly)、第103位之絲胺酸(Ser)、第104位之離胺酸(Lys)、及第105位之脯胺酸(Pro)中之7個胺基酸以上所構成。
(25)如前述(1至17)、(19)至(24)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其為IgG。
(26)如前述(1)至(23)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其選自包含Fab、F(ab)’、Fv、scFv及sdAb的群組。
(27)如前述(1)至(17)、(19)至(25)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其為包含人類免疫球蛋白恆定區的人類化抗體或人類抗體。
(28)一種多核苷酸，其包含編碼前述(1)至(27)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段之胺基酸序列的核苷酸序列。
(29)如前述(27)記載之多核苷酸，其包含編碼下列胺基酸序列的核苷酸序列：包含序列識別號19之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號22之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號25之第2至241位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號60之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號64之第2至241位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號66之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號68之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號70之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號72之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號74之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、 包含序列識別號76之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號78之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號80之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號82之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列、或包含序列識別號84之第2至243位之胺基酸殘基的胺基酸序列。
(30)一種載體，其包含如前述(28)或(29)中任一項記載之多核苷酸。
(31)一種細胞，其包含如前述(28)或(29)中任一項記載之多核苷酸或如前述(30)記載之載體、或產生如前述(1)至(27)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段。
(32)一種與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合的抗體或該抗體之抗原結合性片段之製造方法，其包含：培養如前述(31)記載之細胞的步驟；及自該培養物回收與人類CD3結合的抗體或該抗體之抗原結合性片段的步驟。
(33)一種與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其藉由如前述(32)記載之方法獲得。
(34)一種醫藥組成物，其含有如前述(1)至(27)、(33)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段作為有效成分。
(35)一種具有抗原結合性的分子，其包含如前述(1)至(27)、(33)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段。
(36)如前述(35)記載之分子，其為多重特異性的。
(37)如前述(35)或(36)記載之分子，其包含如前述(1)至(27)、(33)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段、及1個或2個以上之另外的抗體或該抗體之抗原結合性片段。
(38)如前述(37)記載之分子，其中另外的抗體之抗原結合性片段為Fab、F(ab)’、Fv、scFv、或sdAb。
(39)如前述(38)記載之分子，其包含Fc。
(40)如前述(37)至(39)中任一項記載之分子，其中另外的抗體為包含人類免疫球蛋白恆定區的人類化抗體或人類抗體。
(41)如前述(37)至(38)中任一項記載之分子，其中該另外的抗體或該抗體之抗原結合性片段、與如前述(1)至(27)、(33)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段藉由連結子結合而成、或未藉由連結子結合而成。
(42)如前述(41)記載之分子，其中該另外的抗體或該抗體之抗原結合性片段所具有的胺基酸序列之羧基末端與連結子結合，進一步該連結子所具有的胺基酸序列之羧基末端與如前述(1)至(27)、(33)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段結合而成。
(43)如前述(42)記載之分子，其包含：該另外的抗體或該抗體之抗原結合性片段所具有的胺基酸序列之羧基末端與連結子結合，進一步包含該連結子所具有的胺基酸序列之羧基末端與下列抗體或該抗體之抗原結合性片段結合而成的胺基酸序列：包含序列識別號19之第2至243位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號22之第2至243位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段、或包含序列識別號25之第2至241位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段。
(44)如前述(35)至(42)中任一項記載之分子，其於如前述(1)至(27)、(33)中任一項記載之抗體或該抗體之抗原結合性片段中，可變區係自抗體之胺基末端側以重鏈可變區、輕鏈可變區的順序結合，或者，以輕鏈可變區、重鏈可變區的順序結合，任意地：i)於兩可變區之間具有連結子；ii)於胺基末端側之可變區之胺基末端具有甘胺酸殘基；iii)於羧基末端側之可變區之羧基末端，結合有連結子、FLAG標籤、及/或His標籤。於可適用的形態，包含有混雜型(Hybrid型)、雙重型(Dual型)之雙特異性分子。
(45)如前述(44)記載之分子，其包含該另外的抗體或該抗體之抗原結合性片段、與 包含序列識別號19之第2至243位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號25之第2至241位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段。
包含序列識別號60之第2至243位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號64之第2至241位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號66之第2至243位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號68之第2至243位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號70之第2至243位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號72之第2至243位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號74之第2至243位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號76之第2至243位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號78之第2至243位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號80之第2至243位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號82之第2至243位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段、 或包含序列識別號84之第2至243位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段。於可適用的形態，包含混雜型、雙重型之雙特異性分子。
(46)如前述(36)至(45)中任一項記載之分子，其中該另外的抗體為抗癌標的抗體。
(47)如前述(36)至(46)中任一項記載之分子，其為雙特異性的。
(48)如前述(35)至(47)中任一項記載之分子，其為多肽。
(49)一種多核苷酸，其包含編碼如前述(48)記載之分子所具有的胺基酸序列的核苷酸序列。
(50)一種載體，其含有如前述(49)記載之多核苷酸。
(51)一種細胞，其產生如前述(49)記載之多核苷酸或如前述(50記載之載體、或如前述(48記載之分子。
(52)一種與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合的分子之製造方法，其包含培養如前述(51)記載之細胞的步驟、及自該培養物回收與人類CD3結合的分子的步驟。
(53)一種與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合的分子，其係藉由如前述(52)記載之方法而獲得。
(54)一種醫藥組成物，其含有如前述(35)至(48)、(53)中任一項記載之分子作為有效成分。
(55)如前述(54)記載之醫藥組成物，其特徵為藉由T細胞對標的細胞重定向(redirection)，誘導對該標的細胞的細胞毒性。
依據本發明，可獲得與人類CD3結合且與食蟹獼猴CD3結合的新穎抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段、及含有該抗體等且具有抗原結合性的新穎分子。又，可獲得含有此種抗體等或分子作為有效成分的新穎醫藥組成物。該抗體等或該分子係具有T細胞依賴的細胞毒性活性，有用於各種疾病，例如癌等之治療劑或預防劑。
圖1係呈示人類CD3ε之胺基酸序列的圖。
圖2係呈示人類CD3δ之胺基酸序列的圖。
圖3係呈示編碼人類CD3εγ單鏈抗原的核苷酸序列的圖。
圖4係呈示人類CD3εγ單鏈抗原之胺基酸序列的圖。
圖5係呈示重鏈基因增幅用有義引子(sense primer)Nhe-polyC-S之核苷酸序列的圖。
圖6係呈示重鏈基因增幅用第1次反義引子(anti-sense primer)rIgγ-AS1之核苷酸序列的圖。
圖7係呈示重鏈基因增幅用第2次反義引子rIgγ-AS2之核苷酸序列的圖。
圖8係呈示輕鏈基因增幅用有義引子Nhe-polyC-S2之核苷酸序列的圖。
圖9係呈示輕鏈基因增幅用第1次反義引子rIgL-AS1之核苷酸序列的圖。
圖10係呈示輕鏈基因增幅用第2次反義引子rIgL-AS2之核苷酸序列的圖。
圖11係呈示重鏈定序用有義引子rIgγ-seq之核苷酸序列的圖。
圖12係呈示輕鏈定序用反義引子1rIgL-seq1之核苷酸序列的圖。
圖13係呈示輕鏈定序用反義引子2rIgL-seq2之核苷酸序列的圖。
圖14係呈示編碼C3-147之重鏈可變區的核苷酸序列的圖。
圖15係呈示C3-147之重鏈可變區之胺基酸序列的圖。
圖16係呈示編碼C3-147之輕鏈可變區的核苷酸序列的圖。
圖17係呈示C3-147之輕鏈可變區的胺基酸序列的圖。
圖18係呈示G4S連結子有義鏈之寡核苷酸序列的圖。
圖19係呈示G4S連結子反義鏈之寡核苷酸序列的圖。
圖20係呈示編碼C3E-7000的核苷酸序列的圖。
圖21係呈示C3E-7000之胺基酸序列的圖。
圖22係呈示C3E-7034之重鏈可變區之胺基酸序列的圖。
圖23係呈示C3E-7034之輕鏈可變區之胺基酸序列的圖。
圖24係呈示C3E-7000之CDR-H1之胺基酸序列的圖。
圖25係呈示C3E-7000之CDR-H2之胺基酸序列的圖。
圖26係呈示C3E-7000之CDR-H3之胺基酸序列的圖。
圖27係呈示C3E-7000之CDR-L1之胺基酸序列的圖。
圖28係呈示C3E-7000之CDR-L2之胺基酸序列的圖。
圖29係呈示C3E-7000之CDR-L3之胺基酸序列的圖。
圖30係呈示C3E-7035之輕鏈可變區之胺基酸序列的圖。
圖31係呈示C3E-7035之胺基酸序列的圖。
圖32係呈示C3E-7036之輕鏈可變區之胺基酸序列的圖。
圖33係呈示C3E-7036之胺基酸序列的圖。
圖34係呈示編碼C3E-7034的核苷酸序列的圖。
圖35係呈示編碼C3E-7035的核苷酸序列的圖。
圖36係呈示編碼C3E-7036的核苷酸序列的圖。
圖37係呈示人類CD3γ之胺基酸序列的圖。
圖38係呈示C3E-7034之胺基酸序列的圖。
圖39係呈示CD3εγ與C3E-7034之複合體結構的圖。
圖40係呈示CD3εγ與C3E-7034之重鏈及輕鏈的相互作用的圖。
A係於粗棒模型中顯示C3E-7034之輕鏈可變區和CD3ε彼此位於4Å以內的CD3ε之胺基酸殘基，於細棒模型顯示其他胺基酸的圖。
B係於粗棒模型中顯示C3E-7034之重鏈可變區和CD3ε彼此位於4Å以內的CD3ε之胺基酸殘基，於細棒模型顯示其他胺基酸的圖。
圖41係呈示人類CD3ε與C3E-7034之重鏈可變區及輕鏈可變區之序列上的相互作用部位的圖。
圖42係呈示OKT3之重鏈可變區之胺基酸序列的圖。
圖43係呈示C3E-3007之重鏈可變區之胺基酸序列的圖。
圖44係呈示OKT3之輕鏈可變區之胺基酸序列的圖。
圖45係呈示C3E-3007之輕鏈可變區之胺基酸序列的圖。
圖46係呈示編碼C3E-3007 scFv的核苷酸序列的圖。
圖47係呈示C3E-3007 scFv之胺基酸序列的圖。
圖48係呈示為人類化抗CD3scFv的C3E-3007、C3E-7034、C3E-7035、C3E-7036之對人類CD3(PBMC)的結合性的圖。
圖49係呈示為人類化抗CD3 scFv的C3E-3007、C3E-7034、C3E-7035、C3E-7036之對食蟹獼猴CD3(PBMC)的結合性的圖。
圖50中A係呈示為人類化抗CD3 scFv的C3E-7034、C3E-3007之對人類CD8陽性細胞的活性化作用的圖。B係呈示為人類化抗CD3 scFv的C3E-7034、C3E-3007之食蟹獼猴的CD8陽性細胞活性化作用的圖。
圖51係呈示HT1-11 scFv之胺基酸序列的圖。
圖52係呈示編碼HT1-11 scFv的核苷酸序列的圖。
圖53係呈示HT1-11 scFv與人類TROP2陽性細胞株結合的圖。A係呈示對咽頭扁平上皮癌細胞株FaDu的結合的圖。B係呈示對胰臟癌細胞株HPAF-II的結合的圖。
圖54係呈示編碼T2C-0001之ORF核苷酸序列的圖。
圖55係呈示編碼T2C-0003之ORF核苷酸序列的圖。
圖56係呈示編碼T2C-0005之ORF核苷酸序列的圖。
圖57係呈示編碼T2C-0006之ORF核苷酸序列的圖。
圖58係呈示T2C-0001之胺基酸序列的圖。
圖59係呈示T2C-0003之胺基酸序列的圖。
圖60係呈示T2C-0005之胺基酸序列的圖。
圖61係呈示T2C-0006之胺基酸序列的圖。
圖62係呈示抗TROP2-CD3雙特異性分子、T2C-0001、T2C-0003、T2C-0005、T2C-0006之與TROP2陽性細胞株結合的圖。A係呈示對咽頭扁平上皮癌細胞株FaDu的結合的圖。B係呈示對胰臟癌細胞株HPAF-II的結合的圖。
圖63係呈示抗TROP2-CD3雙特異性分子、T2C-0001、T2C-0003、T2C-0005、T2C-0006之對人類CD3(PBMC)的結合性的圖。
圖64係呈示抗TROP2-CD3雙特異性分子、T2C-0001、T2C-0003、T2C-0005、T2C-0006之對食蟹獼猴CD3(PBMC)的結合性的圖。
圖65
A係呈示於咽頭扁平上皮癌細胞株FaDu，有TROP2表現的圖。
B係呈示於胰臟癌細胞株HPAF-II，有TROP2表現的圖。
C係於肺癌細胞株Calu-6，沒有TROP2表現的圖。
圖66
A係呈示抗TROP2-CD3雙特異性分子、T2C-0001、T2C-0003、T2C-0005、T2C-0006對咽頭扁平上皮癌細胞株FaDu，於人類PBMC共存下，具有細胞毒性活性的圖。
B係呈示抗TROP2-CD3雙特異性分子、T2C-0001、T2C-0003、T2C-0005、T2C-0006對胰臟癌細胞株HPAF-II，於人類PBMC共存下，具有細胞毒性活性的圖。
C係呈示抗TROP2-CD3雙特異性分子、T2C-0001、T2C-0003、T2C-0005、T2C-0006對人類肺癌細胞株Calu-6，於人類PBMC共存下，未顯示細胞毒性活性的圖。
圖67係呈示編碼C3E-7078的核苷酸序列的圖。
圖68係呈示C3E-7078之胺基酸序列的圖。
圖69係呈示編碼C3E-7079的核苷酸序列的圖。
圖70係呈示C3E-7079之胺基酸序列的圖。
圖71係呈示編碼C3E-7085的核苷酸序列的圖。
圖72係呈示C3E-7085之胺基酸序列的圖。
圖73係呈示編碼C3E-7086的核苷酸序列的圖。
圖74係呈示C3E-7086之胺基酸序列的圖。
圖75係呈示編碼C3E-7087的核苷酸序列的圖。
圖76係呈示C3E-7087之胺基酸序列的圖。
圖77係呈示編碼C3E-7088的核苷酸序列的圖。
圖78係呈示C3E-7088之胺基酸序列的圖。
圖79係呈示編碼C3E-7089的核苷酸序列的圖。
圖80係呈示C3E-7089之胺基酸序列的圖。
圖81係呈示編碼C3E-7090的核苷酸序列的圖。
圖82係呈示C3E-7090之胺基酸序列的圖。
圖83係呈示編碼C3E-7091的核苷酸序列的圖。
圖84係呈示C3E-7091之胺基酸序列的圖。
圖85係呈示編碼C3E-7092的核苷酸序列的圖。
圖86係呈示C3E-7092之胺基酸序列的圖。
圖87係呈示編碼C3E-7093的核苷酸序列的圖。
圖88係呈示C3E-7093之胺基酸序列的圖。
圖89係呈示編碼C3E-7094的核苷酸序列的圖。
圖90係呈示C3E-7094之胺基酸序列的圖。
圖91係呈示編碼C3E-7095的核苷酸序列的圖。
圖92係呈示C3E-7095之胺基酸序列的圖。
圖93係呈示編碼引子HN53R Fw的核苷酸序列的圖。
圖94係呈示編碼引子HN53R Rv的核苷酸序列的圖。
圖95係呈示編碼引子HN53S Fw的核苷酸序列的圖。
圖96係呈示編碼引子HN53S Rv的核苷酸序列的圖。
圖97係呈示編碼AXC-0001的ORF核苷酸序列的圖。
圖98係呈示AXC-0001之胺基酸序列的圖。
圖99係呈示編碼AXC-0002的ORF核苷酸序列的圖。
圖100係呈示AXC-0002之胺基酸序列的圖。
圖101係呈示編碼MGC-0001的ORF核苷酸序列的圖。
圖102係呈示MGC-0001之胺基酸序列的圖。
圖103係呈示編碼MGC-0002的ORF核苷酸序列的圖。
圖104係呈示MGC-0002之胺基酸序列的圖。
圖105係用於抗CD3抗體CDR變異體之製作的引子列表。
圖106-1係呈示各種抗CD3抗體CDR變異體之對人類及食蟹獼猴CD3(PBMC)的結合性的圖。
圖106-2係呈示各種抗CD3抗體CDR變異體之對人類及食蟹獼猴CD3(PBMC)的結合性的圖。
圖107係呈示人類肺癌細胞株A549(A)、人類胰臟癌細胞株PANC-1(B)、人類胰臟癌細胞株MIA PaCa-2(C)、人類骨髓瘤細胞株U266B1(D)、套膜細胞(mantle cell)淋巴瘤細胞株Jeko-1(E)中的Axl之表現的圖。
圖108中A、B、C係呈示抗Axl-CD3雙特異性分子、AXC-0001、AXC-0002對Axl表現細胞株，於人類PBMC共存下，具有細胞毒性活性的圖。D、E係呈示抗Axl-CD3雙特異性分子、AXC-0001、AXC-0002對Axl非表現細胞株，於人類PBMC共存下，未呈現細胞毒性活性的情事的圖。
圖109係呈示MAGEC1淋巴瘤(A)、或添加DMSO的(B)人類淋巴母細胞融合細胞株T2細胞中的MAG-032scFv之結合性的圖。
圖110中A係呈示抗HLA-A2/MAGEC1-CD3雙特異性分子、MGC-0001、MGC-0002對添加MAGEC1肽的T2細胞，於人類PBMC共存下，具有細胞毒性活性的圖。B係呈示抗HLA-A2/MAGEC1-CD3雙特異性分子、MGC-0001、MGC-0002對添加DMSO的T2，於人類PBMC共存下，未顯示細胞毒性活性的情形的圖。
圖111係呈示MAGEC1肽之胺基酸序列的圖。
圖112係呈示CDR變異體之CDRH2區域的胺基酸序列的圖。第1個Xaa與第2個Xaa係各自為任意之天然胺基酸殘基。
圖113係呈示CDR變異體之CDRL2區域的胺基酸序列的圖。Xaa係任意之天然胺基酸殘基。
圖114係呈示C3E-7034之CDR變異體之重鏈胺基酸序列的圖。第1個Xaa與第2個Xaa係各自為任意之天然胺基酸殘基。
圖115係呈示C3E-7034之CDR變異體之輕鏈胺基酸序列的圖。CDRL2之Xaa係任意之天然胺基酸殘基。
圖116係呈示C3E-7035之CDR變異體之輕鏈胺基酸序列的圖。CDRL2之Xaa係任意之天然胺基酸殘基。
圖117係呈示C3E-7036之CDR變異體之輕鏈胺基酸序列的圖。CDRL2之Xaa係任意之天然胺基酸殘基。
用以實施發明之形態 1.定義
於本發明，「基因」係意指編碼蛋白質之胺基酸的鹼基序列所包含的核苷酸或其互補鏈，例如，為編碼蛋白質之胺基酸的鹼基序列所包含的核苷酸或其互補鏈的多核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA、cRNA等包含於「基因」的意義。該基因為單鏈、雙股鏈或三股鏈以上之核苷酸，DNA鏈與RNA鏈之會合體、在單 股核苷酸鏈上有核糖核苷酸(RNA)與去氧核糖核苷酸(DNA)混在者及含有此種核苷酸鏈的雙股鏈或三股鏈以上之核苷酸亦包含於「基因」的意義。於本發明，鹼基序列與核苷酸序列係相同意義。
於本發明，「多核苷酸」、「核酸」及「核酸分子」係同意義，例如，DNA、RNA、探針、寡核苷酸、引子等亦包含於「多核苷酸」的意義。該多核苷酸包含單鏈、雙股鏈或三股以上之鏈的多核苷酸，DNA鏈與RNA鏈的會合體、在單股多核苷酸鏈上有核糖核苷酸(RNA)與去氧核糖核苷酸(DNA)混合者及含有該多核苷酸鏈的雙股鏈或三股以上之鏈的會合體亦包含於「多核苷酸」的意義。
於本發明，「多肽」、「肽」及「蛋白質」係同意義。
於本發明，有時將「抗原」用於「免疫原」的意義。
於本發明，於「細胞」亦包含源自動物個體的各種細胞、繼代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、重組細胞及微生物等。
於本發明，「抗體」係與免疫球蛋白同意義。惟，本發明之稱為抗CD3抗體的情形之「抗體」係以具有恆定區與可變區的免疫球蛋白之意義使用。抗體為天然者，或藉由部分或完全合成所製造的免疫球蛋白，但未特別限定。本發明之抗CD3抗體係包含於後述之「分子」。
基本的4鏈抗體之結構係由2條相同輕(L)鏈、及2條相同重(H)鏈構成。輕鏈係藉由1個共價雙硫鍵與重鏈結合。2條重鏈因應重鏈的同型藉由1個或複數個雙硫鍵而彼此結合。各自之輕鏈、重鏈係具有規則的間隔且具有鏈內雙硫鍵。於重鏈與輕鏈，存有胺基酸序列顯示非常高類似性的恆定區及胺基酸序列之類似性低的可變區。輕鏈係接於恆定區(CL)後於胺基末端具有可變區(VL)。重鏈係接於3個恆定區(CH1/CH2/CH3)後於胺基末端具有可變區(VH)。VL與VH成對，CL與重鏈之第一恆定區(CH1)對齊。VL與VH成對，形成單一之抗原結合部位。
就本發明之抗體之恆定區而言，雖未特別限定，但就用以治療或預防人類疾病之本發明抗體而言，較佳為使用人類抗體。就人類抗體之重鏈恆定區而言，可列舉例如，Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε等。就人類抗體之輕鏈恆定區而言，可列舉例如，Cκ、Cλ等。
Fab係由重鏈之CH1與接續其之VH、及輕鏈之CL與接續其之VL構成。VH與VL係包含互補性決定區(CDR)。
Fc為重鏈之恆定區的羧基末端區域，包含CH2與CH3，為二聚物。本發明之Fc可為天然之序列之Fc，亦可為於天然之序列加入變異的變異型之Fc。
可變區係由具有稱為超可變區(HVR：hypervariable region)的極度可變性的區域、及經該區域 分離的稱為框架區(FR：Framework region)的比較不變的區域構成。天然的重鏈與輕鏈之可變區係包含經3個超可變區接續的4個FR，各鏈的超可變區係利用FR與另一鏈的超可變區一起保持極接近，有助於抗體之抗原結合部位之形成。
於抗體分子之重鏈及輕鏈，已知各自有3處的互補性決定區(CDR：Complemetarity determining region)。互補性決定區亦稱為超可變區，於抗體之重鏈及輕鏈的可變區內，為一級結構的變異性特高的部位，於重鏈及輕鏈之多肽鏈的一級結構上，通常，各自分離於3處。於本發明，關於抗體之互補性決定區，將重鏈之互補性決定區自重鏈胺基酸序列之胺基末端側標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3，將輕鏈之互補性決定區自輕鏈胺基酸序列之胺基末端側標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等之部位係於立體結構上相互的接近，決定了對結合的抗原的特異性。
於本發明，CDR的位置及長度係由IMGT之定義(Developmental and Comparative Immunology 27(2003)55-77)決定。
框架區(FR)係CDR殘基以外的可變區。可變區一般而言具有FR1、FR2、FR3、FR4之4個FR。
CDR與FR的位置為本項技術區域中周知之各種定義，例如，IMGT以外，亦可依Kabat、Chothia、AbM、contact等之定義來決定。
於本發明，「抗體之抗原結合性片段」係意指由重鏈可變區及輕鏈可變區構成之具有與抗原的結合活性的抗體之部分片段。就「抗體之抗原結合性片段」而言，可列舉例如，Fab、F(ab’)2、scFv、Fab’、Fv、單域抗體(single-domain antibody(sdAb))等之抗原結合片段，但並未限定於彼等。該抗體之抗原結合性片段係除了藉由將抗體蛋白質之全長分子以木瓜酵素、胃蛋白酶等酵素處理而獲得者之外，亦可為使用重組基因於適當宿主細胞所產生的重組蛋白質。
於本發明，抗體所結合的「部位」，即抗體所辨識的「部位」係意指抗體所結合或辨識的抗原上之部分肽或部分高次結構。
於本發明，該部位亦稱為抗原決定位、抗體之結合部位。於本發明，「抗體變異體」係意指於原本抗體具有的胺基酸序列有胺基酸取代、缺失、添加(於添加包含插入)(以下，總稱為「變異」)而成的胺基酸序列，且與本發明之CD3結合的多肽。該抗體變異體中的變異胺基酸之數為1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40或50個。該抗體變異體亦包含於本發明之「抗體」。
於本發明，「1至數個」中的「數個」係指2至10個。
於本說明書中，「分子」係包含上述之抗體、抗體之抗原結合性片段的分子，進一步包含由抗體或源自其之複數種抗原結合性片段所形成的多重特異性的分子。
於本說明書中，「多重特異性的分子」「多重特異性(的)分子」及「多重特異性分子」係同意義，只要可與1個分子上之複數個彼此相異的抗原決定位、及/或可與2個以上之分子上之彼此相異的抗原決定位結合的分子即可，並未特別限定。就多重特異性的分子而言，亦包含含有重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)的抗體。於此種多重特異性的分子，包含具有相異2種類以上之重鏈及輕鏈的完全長抗體分子，即IgG型多重特異性分子、及具有2種類以上之VL及VH的抗原結合性片段而成的分子，即組合Fab、Fab’、Fv、scFv、sdAb等而衍生的分子，即包含串聯scFv、雙鏈抗體(diabody)、單鏈雙鏈抗體、三鏈抗體(triabody)等，但未限定於此等。藉由基因或化學連結具有抗原結合性而沒有免疫球蛋白骨架的蛋白質與其它抗原結合片段產生的分子亦包括於多重特異性分子。
就本發明之抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段、或本發明之多重特異性的分子具有的活性‧性質而言，可列舉例如，生物學的活性、物理化學的性質等，具體而言，可列舉各種生物活性、對抗原或抗原決定位的結合活性、製造或保存時中的安定性、熱安定性等。
於本發明，「於嚴格條件下雜交」係於包含5×SSC的溶液中於65℃進行雜交，接著於包含2×SSC-0.1%SDS的水溶液中於65℃進行20分鐘，於包含0.5×SSC-0.1%SDS的水溶液中於65℃進行20分鐘， 以及於含0.2×SSC-0.1%SDS的水溶液中於65℃進行20分鐘，於各自洗淨的條件或與其同等的條件進行雜交。SSC係意指150mMNaCl-15mM檸檬酸鈉之水溶液，n×SSC係意指n倍濃度之SSC。
於本發明，「細胞毒性(cytotoxic)」係指任何方式，對細胞造成病理的變化，不僅包括直接的外傷，亦包括DNA的切斷或鹼基的二聚物形成、染色體的切斷、細胞分裂裝置的損傷、各種酵素活性的降低等所有的細胞結構或機能上的損傷。
於本發明，「細胞毒性活性(cytotoxic activity)」係意指引起上述細胞毒性者。
於本發明，「抗體依賴性細胞毒性活性」係指「antibody dependent cellular cytotoxicity(ADCC)活性」，亦指NK細胞藉由抗體而傷害腫瘤細胞等之標的細胞的作用活性。
於本發明，「T細胞重定向所致的細胞毒性活性」係意指藉由包含抗腫瘤抗原抗體與抗CD3抗體的多重特異性的分子而引起上述細胞毒性。即，抗腫瘤抗原抗體與標的腫瘤細胞結合，藉由抗CD3抗體與T細胞結合，拉近標的腫瘤細胞與T細胞的距離，藉由T細胞活性化而誘導細胞毒性。該分子係可包含於醫藥組成物中。
2.抗原蛋白質CD3(CD3複合體)
於本發明，「CD3」係以與CD3蛋白質相同的意義使用。
CD3係呈多分子T細胞受體複合體之一部分而於T細胞上表現，為γ鏈、δ鏈、ε鏈、ζ鏈、η鏈之5種類多肽(分子量依序為25000-28000、21000、20000、16000、22000)之複合體。
於本發明使用的CD3係可自動物組織(包含體液)、源自該組織的細胞或該細胞培養物之純化及利用單離、基因重組、活體外轉譯、化學合成等進行調製。
編碼人類CD3ε的cDNA之核苷酸序列係以登錄號：NM_000733.3登錄於GenBank。編碼食蟹獼猴CD3的cDNA之核苷酸序列係以登錄號：NM_001283615.1登錄於GenBank。人類CD3ε之胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號1。
CD3ε之cDNA係可藉由例如，將表現CD3ε之mRNA的臟器之cDNA庫作為模板，使用特異性增幅CD3ε之cDNA的引子而進行聚合酶連鎖反應(以下稱為「PCR」)(Saiki，R.K.，et al.，Science(1988)239，487-49)之所謂的PCR法來取得。
又，編碼於CD3之胺基酸序列包含有1至數個之胺基酸經取代、缺失或添加的胺基酸序列，且具有與CD3同等生物活性的蛋白質的核苷酸序列，亦包含於CD3基因之核苷酸序列。又，於CD3之胺基酸序列包含有1或數個之胺基酸經取代、缺失或添加的胺基酸序列，且具有與CD3同等之生物活性的蛋白質，亦包含於CD3。
又，與由編碼人類或食蟹獼猴之CD3ε的核苷酸序列互補的核苷酸序列而成的多核苷酸於嚴格條件下雜交，且編碼具有與CD3ε同等之生物活性的蛋白質的多核苷酸亦包含於CD3ε之cDNA。再者，自人類或食蟹獼猴CD3ε基因座轉錄的剪接變異體(splicing variant)或於嚴格條件與其雜交的多核苷酸，且編碼具有與CD3ε同等之生物活性的蛋白質的多核苷酸亦包含於CD3ε之cDNA。
3.抗CD3抗體 (3-1)抗體之分類
本發明之抗CD3抗體及該抗體之抗原結合性片段(以下，亦記載為本發明之抗體等)可為單株抗體及多株抗體之任一者。就本發明之單株抗體而言，可列舉源自非人類動物之抗體(非人類動物抗體)、人類抗體、嵌合化抗體(亦稱為「嵌合抗體」)、人類化抗體等。
就非人類動物抗體而言，可列舉源自哺乳類、鳥類等之脊椎動物的抗體等。就源自哺乳類的抗體而言，可列舉小鼠抗體、大鼠抗體等之源自囓齒類的抗體等。就源自鳥類的抗體而言，可列舉雞抗體等。就抗人類CD3大鼠單株抗體而言，可列舉本發明之C3-147(實施例1)-7)等。
就嵌合化抗體而言，可列舉將源自非人類動物抗體之可變區與人類抗體(人類免疫球蛋白)恆定區結合而成的抗體等，但未限定於此等。
就人類化抗體而言，可列舉將非人類動物抗體之可變區中之CDR移植至人類抗體(人類免疫球蛋白之可變區)者、除了CDR亦將非人類動物抗體之框架區序列部分移植至人類抗體者、該等任一者之源自非人類動物抗體的1個或2個以上的胺基酸以人類型之胺基酸取代者等，但並未限定彼等。就非人類動物抗體之可變區中之CDR而言，可例示於本發明之源自大鼠抗CD3抗體C3E-7000的重鏈可變區中之CDRH1至CDRH3及輕鏈可變區中之CDRL1至CDRL3、彼等之CDR之胺基酸序列，有1或2個之胺基酸取代為其他胺基酸者等。
就人類抗體而言，只要較佳為與人類CD3結合，更佳為與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合的抗體即可，並未特別限定。亦可例示與本發明之人類化抗體相同的部位結合的人類抗體等。例如，可例示結合於與C3E-7034相同的部位的人類抗體。
本發明之較佳抗體等係與人類CD3結合。再者，本發明之更佳抗體等係兼具與食蟹獼猴之CD3的結合活性。
本發明之抗體等若為與人類CD3結合，亦與食蟹獼猴之CD3結合，可為由源自複數之相異抗體的部分所構成的抗體，可列舉例如，於複數之相異抗體間將重鏈及/或輕鏈進行交換者、將重鏈及/或輕鏈之全長進行交換者、僅交換可變區或僅交換恆定區者、交換CDR之全部或僅交換一部分者等。嵌合化抗體之重鏈可變區與輕鏈可變區可為源自不同的本發明之抗體。人類化抗 體之重鏈及輕鏈之可變區中之CDRH1至CDRH3以及CDRL1至CDRL3係可為源自2種或其以上之本發明之抗體。人類抗體之重鏈及輕鏈之可變區中之CDRH1至CDRH3以及CDRL1至CDRL3係可為2種或其以上之本發明之抗體具有的CDR之組合。
本發明之單株抗體的同型並未特別限定，可列舉例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等之IgG；IgM、IgA1、IgA2等之IgA；IgD；IgE等。
單株抗體之同型及亞型係可以例如，奧特隆(Ouchterlony)法、酶聯免疫吸附分析(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA))法、放射免疫分析(Radio Immuoassay(RIA))法等決定，亦可利用市售之鑑定用套組(Rat Immunoglobulin Isotyping ELISA Kit(BD Pharmingen公司)等)。
(3-2)抗CD3抗體之結合特異性
本發明之抗體等係辨識CD3。即，本發明之抗體等係與CD3結合。本發明之抗體等較佳與人類CD3、猴CD3等結合，更佳與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合。
更詳細言之，本發明之抗體、其抗原結合性片段及其可變區係與存在於人類CD3複合體之ε鏈(圖1、序列識別號1)之細胞外區域的類Ig域(Ig-like domain)結合。再者亦與存在於食蟹獼猴CD3複合體之ε鏈的細胞外區域的類Ig域結合。
本發明之抗體等所結合的存在於人類CD3複合體的ε鏈(圖1、序列識別號1)之細胞外區域的抗原決定位係包含下列胺基酸；Ser55、Glu56、Leu58、Trp59、Asn65、Ile66、Ser77、Asp78、Arg101、Gly102、Ser103、Lys104、及Pro105。
本發明之抗體等係較佳可藉由與包含選自此等13個胺基酸的至少7個之胺基酸的抗原決定位區域結合，而維持與人類CD3結合。
抗體與上述之胺基酸以4Å以內距離鄰接的情形，此種抗體可判斷為具有與本發明之抗體等相同抗原決定位特異性。另一方面，上述之抗原決定位的胺基酸中，Arg101、Gly102、Ser103、Lys104、及Pro105亦有與公知之抗CD3抗體OKT3或UCHT1相互作用的抗原決定位殘基(Lars Kjer-Nielsen et al.，PNAS(2004)(Kelly L Arnett et al.，PNAS(2004))。然而，OKT3與UCHT1雖與人類CD3結合，但不與食蟹獼猴CD3結合。
於本發明，「辨識」，即「結合」，係意指不是非特異性地吸附結合。就是否辨識，即是否結合的判定基準而言，可列舉例如，解離常數(Dissociation Constant：以下，稱為「KD」)。本發明之較佳抗體等之對CD3的KD值係1×10-5M以下、5×10-6M以下、2×10-6M以下或1×10-6M以下。
本發明中的抗原與抗體之結合係可利用SPR法、BLI法等之活體分子間相互作用解析系統、或ELISA 法、RIA法等進行測定或判定。細胞表面上的表現的抗原與抗體之結合係可利用流式細胞儀法等進行測定。
SPR法(表面電漿子共振(Surface Plasmon Resonance)解析法)係被使用作為藉由測量利用化學動力學(動力學)解析的結合速度常數(Ka值)與解離速度常數(Kd值)而求得成為親和力的指標的解離常數(KD值)等的分析手法。就用於SPR解析的機器而言，可例示Biacore(商標)(GE HEALTHCARE公司製)、ProteOn(商標)(BioRad公司製)、SPR-Navi(商標)(BioNavis公司製)、Spreeta(商標)(Texas Instruments公司製)、SPRi-PlexII(商標)(HORIBA公司製)、Autolab SPR(商標)(Metrohm公司製)等。
BLI法(生物膜層干涉技術，BioLayer Interferometry)係測量使用生物膜層干涉的活體分子間相互作用的方法。就用於使用BLI法的相互作用解析的機器而言，可例示Octet系統(Pall ForteBio公司製)等。
ELISA法係將試料溶液中所含的目的之抗原或抗體，以特異抗體或抗原進行捕捉的同時，利用酵素反應進行檢測‧定量的方法。將酵素標識的抗原或抗體併入反應系統中，檢測酵素活性。於酵素活性的檢測，使用依反應而有吸光光譜變化的基質，以吸光度測定進行數值化。
Cell-ELISA係以每個細胞補充於細胞表面的測定對象的同時，利用酵素反應而進行檢測‧定量的方法。
RIA法(放射免疫分析，Radio Immunoassay)係使用放射性物質將抗體標識，藉由測量來自抗體的放射能，可將抗體定量。
流式細胞儀法係使微細的細胞於流體中分散，將該流體細流，而將各個細胞進行光學分析的手法。經螢光色素標識的抗體，藉由抗原抗體反應而與細胞表面抗原結合，藉由將抗體所結合的細胞數使用螢光強度進行測定，而測定抗體之抗原結合性。
如上述，與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合的抗體等可較佳供給於醫藥品之非臨床開發(前臨床開發)必須使用的靈長類，特別是食蟹獼猴的與有效性或安全性有關的各種試驗。又，與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合的抗體等，具有細胞毒性活性，單獨或作為本發明之分子，有用於人類及食蟹獼猴中的癌症等之疾病的治療或預防。下文描述醫藥組成物。
又，本發明之與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合的抗體等因不與小鼠CD3結合，於導入人類CD3基因的小鼠之細胞、組織、個體(包含轉基因動物、基因剔除動物、基因敲入(knock in)動物)及使用該抗體等的各種分析、免疫組織化學等，可無由於為宿主的小鼠之CD3所致的影響下來實施，包含該抗體等的醫藥、動物藥或診斷藥等之使用小鼠的研究及非臨床開發上為較佳。
(3-3)單株抗體
本發明提供單株抗體。於單株抗體，包含大鼠抗體、小鼠抗體、兔抗體、雞抗體、魚類抗體等之源自非人類動物的單株抗體、嵌合化抗體、人類化抗體、人類抗體、彼等之抗原結合性片段、彼等之抗體變異體、彼等之修飾體等。
例如，利用實施例1記載之方法所獲得的C3-147為抗CD3大鼠單株抗體。
編碼C3-147之重鏈可變區的DNA之核苷酸序列記載於序列表之序列識別號6(圖14)，胺基酸序列記載於序列識別號7(圖15)。編碼C3-147之輕鏈可變區的DNA之核苷酸序列記載於序列表之序列識別號8(圖16)，胺基酸序列記載於序列識別號9(圖17)。
較佳地，本發明之抗體變異體可以作成對蛋白質的分解或氧化的感受性降低、生物活性及機能的維持、改善或降低及變化的抑制、抗原結合能的改善或調節、或物理化學的性質或機能的性質的賦予等。已知蛋白質係於其表面的特定胺基酸側鏈有變化而該蛋白質之機能或活性會變化，此種例包含天冬醯胺酸側鏈的脫醯胺化、天冬胺酸側鏈的異構物化等。為了防止此種胺基酸側鏈的變化，取代為其他胺基酸者包含於本發明之抗體變異體的範圍。
就本發明之抗體變異體之例而言，可列舉於抗體所具有的胺基酸序列具有經保存的胺基酸取代而成的胺基酸序列的抗體。保存的胺基酸取代係與胺基酸側鏈有關連的胺基酸群內發生的取代。
適當的胺基酸群係如以下：酸性群=天冬胺酸、麩胺酸；鹼基性群=離胺酸、精胺酸、組胺酸；非極性群=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及非帶電極性家族=甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。其他適合的胺基酸群如下：脂肪族羥基群=絲胺酸及蘇胺酸；含有醯胺基群=天冬醯胺酸及麩醯胺酸；脂肪族群=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；以及芳香族群=苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸。該抗體變異體中的胺基酸置換係於不使原本抗體具有的抗原結合活性降低的範圍內進行為較佳。
於本發明之含C3-147的上述(1)抗體或其抗原結合性片段具有的胺基酸序列具有保存的胺基酸取代及/或其他變異而成的胺基酸序列的抗體變異體、以及含C3-147的上述(1)抗體或其抗原結合性片段含有的CDRH1至CRDH3及CDRL1至CDRL3之任一胺基酸序列具有保存的胺基酸取代及/或其他變異而成的胺基酸序列的包含該CDR的小鼠抗體、大鼠抗體、嵌合化抗體、人類化抗體、人類抗體、彼等之抗原結合性片段、包含彼等的等亦包含於本發明。
(3-4)抗CD3抗體之抗原結合性片段
提供本發明之抗CD3抗體之抗原結合性片段作為本發明之一個態樣。抗體之抗原結合性片段係意指該抗體所具有的機能中至少保持抗原結合性的片段或其修飾物。作為該抗體之機能，一般而言，可列舉抗原 結合活性、調節抗原活性的活性、抗體依賴性細胞毒性活性及補體依賴性細胞毒性活性等。就作為本發明之抗體等及包含本發明之抗體等的多重特異的分子的情形的機能而言，可列舉例如T細胞的重定向、T細胞的活性化、利用將T細胞活性化的癌細胞之細胞毒性活性。
就抗體之抗原結合性片段而言，只要該抗體所具有的活性中至少保持抗原結合性的該抗體之片段即可，並未特別限定，可列舉例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、以適當連結子使重鏈及輕鏈之Fv連結的單鏈Fv(scFv)、單一域(domain)抗體(sdAb)等，但未被限定於該等。如保有連結子部分的scFv，包含本發明之抗體之抗原結合性片段以外的部分的分子亦包含於本發明之抗體之抗原結合性片段的意義中。
抗體蛋白質之胺基末端及/或羧基末端的胺基酸有1至數個或其以上刪除，且保持該抗體所具有的機能之至少一部分的分子，亦包含於抗體之抗原結合性片段的意義。此種抗體之抗原結合性片段之修飾體亦包含於本發明之抗體或其抗原結合性片段、或其修飾體(後述)。
本發明之抗體之抗原結合性片段之一個態樣為scFv。scFv係藉由以多肽連結子連結抗體之重鏈可變區與輕鏈可變區而獲得(Pluckthun A.The Pharmacology of Monoclonal Antibodies113，Rosenburg及Moore編，Springer Verlag，New York，269-315(1994)，Nature Biotechnology(2005)，23，1126-1136)。又，以多肽連結 子使2個scFv結合而製作的串聯scFv亦可使用作為雙特異性分子。進一步由3個以上scFv而成的三鏈抗體等亦可使用作為多特異性分子。
本發明之抗體可為具有單一重鏈可變區，且不具有輕鏈序列的抗體。此種抗體稱為單域抗體(single domain antibody：sdAb)或奈米抗體(nanobody)，且已報告抗原結合能力被保持(Muyldemans S.et.al.，Protein Eng.，(1994)7(9)，1129-35，Hamers-Casterman C.et.al.，Nature(1993)363(6428)，446-448)。此等抗體亦包含於本發明中的抗體之抗原結合性片段的意義。
又，於本發明，包含使用適當連結子將抗體之重鏈及輕鏈的全長序列連結的單鏈免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)(Lee，H-S，et.al.，Molecular Immunology(1999)36，61-71；Shirrmann，T.et.al.，mAbs(2010)，2(1)，1-4)。此種單鏈免疫球蛋白藉由二聚物化，可能保持與原本為四聚物的抗體類似的結構及活性。
(3-5)具有抗原結合性的分子
本發明之分子係包含本發明之抗CD3抗體或其抗原結合性片段。
本發明之分子進一步可包含後述者：訊息序列；純化等用的標籤；胺基末端之Gly；ADC之藥物連結子部分；白蛋白結合多肽；PEG等之聚合物；抗CD3抗體以外之抗體、其抗原結合性片段；不具有免疫球蛋 白骨架而具有抗原結合性的蛋白質；具有抗癌作用、細胞毒性活性、其他藥理活性的化合物(之部分)等。
本發明之分子係與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合。
本發明之分子包含後述的多重特異性分子。
本發明之分子可為CAR-T等之被導入細胞的形態、被呈現於細胞表面上的形態。
(3-6)多重特異性分子、雙特異性分子
本發明之多重特異性分子係持有2個以上抗原結合部位的分子。即，可結合於1個分子上之2個以上彼此相異的抗原決定位或可結合於2個以上之分子上的彼此相異的抗原決定位的分子，包含複數之彼此相異的抗原結合性片段。於此種多重特異性分子，包含IgG型多重特異性分子、具有2種類以上之可變區的多重特異性分子，例如串聯scFv、單鏈雙鏈抗體、雙鏈抗體、及三鏈抗體之類的抗體片段、共價鍵結或非共價鍵結而連結的抗體片段，但並未限定於此等。多重特異性分子可包含Fc。
本發明之多重特異性分子係包含本發明之抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段。本發明之多重特異性分子係包含本發明之抗體等、及1個或2個以上另外的抗體或該抗體之抗原結合性片段。就另外的抗體之抗原結合性片段而言，可列舉例如，Fab、F(ab)’、Fv、scFv、sdAb。
本發明之多重特異性分子係可與CD3特異性結合，或者進一步可與如效應子(effector)細胞上的Fc受體的標的結合。
就本發明之多重特異性分子之較佳例而言，可列舉雙特異性分子。「雙特異性」係意指可與同一分子之2個彼此相異的抗原決定位或2個分子上之彼此相異的抗原決定位結合，包含具有此種雙特異性的抗體或抗原結合性片段。本發明之雙特異性分子係與CD3結合，且與位於不具有CD3的其他抗原的抗原決定位結合。更具體而言，該雙特異性分子係(i)與CD3上之某抗原決定位(抗原決定位1)結合，且(ii)與於CD3上的某抗原決定位1不同的抗原決定位(抗原決定位2)結合、或與於CD3以外之抗原的抗原決定位(抗原決定位3)結合。
例如於BiTE所代表的串聯scFv型之雙特異性分子，第一抗體之重鏈可變區之抗原結合部位、與第一抗體之輕鏈可變區之抗原結合部位以連結子連結或不以連結子而直接結合，而形成第一多肽，又，第二抗體之重鏈可變區之抗原結合部位、與第二抗體之輕鏈可變區之抗原結合部位以連結子連結或不以連結子而直接結合，而形成第二多肽，第一多肽與第二多肽係以連結子連結或不以連結子而直接結合。又，第一多肽與第二多肽亦可介隔另外的分子而結合。
於雙鏈抗體型之雙特異性分子，第一抗體之重鏈可變區之抗原結合部位與第二抗體之輕鏈可變區之抗原結合部位以連結子連結或不以連結子而直接結合， 又，第一抗體之輕鏈可變區之抗原結合部位與第二抗體之重鏈可變區之抗原結合部位以連結子連結或不以連結子而直接結合。又亦可製作使雙鏈抗體型雙特異性分子進一步二聚物化的雙特異性分子。亦可使其他雙鏈抗體型雙特異性分子與Fc之一者之單鏈或者兩鏈以連結子連結(雙鏈抗體-Fc型雙特異性分子)。
於雙重scFv(dual scFv)型之雙特異性分子，與不同抗原決定位結合的2種之scFv係與二聚物之Fc一者各自以連結子連結或不以連結子而直接結合。或者，與不同抗原決定位結合的2種類之scFv係各自以連結子與CH、CL連結，進而二聚物之Fc的一者各自與連結子連結。以下亦將雙重scFv型之雙特異性分子記載為雙重型雙特異性分子，或簡單記載為雙重型。
於IgG型之雙特異性分子，與不同抗原決定位結合的2種之Fab係與二聚物之Fc的一者各自以連結子連結或不以連結子而直接結合。以下，將IgG型之雙特異性分子亦記載為全長抗體(Full-Size Antibody(FSA))型雙特異性分子，或簡單記載為FSA型。
或者，作為本發明之雙特異性分子，與不同抗原決定位結合的Fab與scFv可為與二聚物之Fc的一者各自以連結子連結或不以連結子而直接結合的雙特異性抗體。或者可為於二聚物之Fc的一者，第一抗體之Fab，已一者藉由連結子結合第二抗體之scFv的雙特異性分子。以下亦將此種雙特異性分子記載為混雜型雙特異性分子、或混雜型。
本發明之雙特異性分子中所含的scFv及Fab係較佳為人類化抗體或人類抗體之scFv及Fab，Fc係較佳為人類抗體之Fc。
於本發明之雙特異性分子所含的可變區，自抗體之胺基末端側可以重鏈可變區、輕鏈可變區的順序結合，或者，可以輕鏈可變區、重鏈可變區的順序結合。於兩可變區之間，任意地具有連結子。又，於胺基末端側之可變區的胺基末端可具有甘胺酸殘基(任意地)。於串聯scFv型之雙特異性分子，於羧基末端側之可變區的羧基末端，可與連結子、FLAG標籤、及/或His標籤結合(任意地)。就適合的態樣之一者而言，自胺基末端，可例示以重鏈可變區、第一連結子、輕鏈可變區、第二連結子、FLAG標籤、及His標籤的順序結合者。
連結子亦包含單鏈多肽或單鏈寡肽、或者PEG、核苷酸、糖鏈、化合物等之合成品。其他，只要結合二個多肽者即可，並未特別限定，使用公知的連結子為可能的。
就連結子的長度而言，例如肽連結子的情形為5~30個胺基酸。於雙特異性分子包含複數個連結子的情形，可使用全部為相同長度的肽連結子，亦可使用不同長度的肽連結子。
就肽連結子而言，例如可例示(Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser)的重複，亦可於此等添加1至數個之與Gly、Ser不同的胺基酸殘基。
(3-7)人類化抗CD3抗體
本發明係於其一態樣，提供人類化抗CD3抗體或其抗原結合性片段。
就本發明之人類化抗體而言，可列舉僅將互補性決定區(CDR；complementarity determining region)併入源自人類的抗體的抗體(Nature(1986)321，522-525)；藉由CDR移植法，除了CDR的序列之外，亦將一部分框架的胺基酸殘基移植至人類抗體的抗體(國際專利公開WO1990/007861號)。
本發明之適合的人類化抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段所含的重鏈可變區係保有：由序列識別號26(圖24)所示的胺基酸序列而成的CDRH1(GVTFNYYG)、由序列識別號98(圖112)所示的胺基酸序列而成的CDRH2(ITXaaXaaGGRI)(其中，第1個Xaa與第2個Xaa係各自為任意之天然胺基酸殘基。以下，亦各自將CDRH2之第1個Xaa記載為X1，將第2個Xaa記載為X1、X2。)、及由序列識別號28(圖26)所示的胺基酸序列而成的CDRH3(TLDGRDGWVAY)。
又，本發明之適合的人類化抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段中所含的輕鏈可變區係保有：由序列識別號29(圖27)所示的胺基酸序列而成的CDRL1(TGNIGSNY)、 由序列識別號99(圖113)所示的胺基酸序列而成的CDRL2(RXaaD)(其中，Xaa為任意之天然胺基酸殘基。以下，亦將CDRL2之Xaa記載為X3。)、及由序列識別號31(圖29)所示的胺基酸序列而成的CDRL3(QSYSSGFI)。
於上述之CDRH2(ITX1X2GGRI)，較佳為X1係選自由(A、E、G、H、I、L、T、V、R、S)所組成的群組，且X2為S；或X1為N，且X2係選自由(E、R、F、Y、L、V、I、K、T)所組成的群組，且於上述之CDRL2(RX3D)，較佳為X3係選自由(Q、A、G、S、N、D)所組成的群組。
於上述之CDRH2(ITX1X2GGRI)，更佳為X1係選自由(R、S)所組成的群組，且X2為S，於上述之CDRL2(RX3D)，更佳為X3係選自由(Q、A、G、S、N、D)所組成的群組。
就此種本發明之適合的人類化抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段中所含的重鏈可變區之事例而言，可列舉包含於序列識別號100(圖114)所示的胺基酸殘基的重鏈可變區。
又，就於本發明之適合的人類化抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段中包含的輕鏈可變區之事例而言，可列舉包含於序列識別號101(圖115)、序列識別號102(圖116)、序列識別號103(圖117)所示的胺基酸殘基的輕鏈可變區。
就於本發明之適合的人類化抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段中包含的重鏈可變區之具體例而言，可列舉保有由序列識別號26(圖24)所示的胺基酸序列而成的CDRH1(GVTFNYYG)、由序列識別號27(圖25)所示的胺基酸序列而成的CDRH2(ITNSGGRI)、及由序列識別號28(圖26)所示的胺基酸序列而成的CDRH3(TLDGRDGWVAY)的重鏈可變區。
又，就本發明之適合的人類化抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段中包含的輕鏈可變區之具體例而言，可列舉保有由序列識別號29(圖27)所示的胺基酸序列而成的CDRL1(TGNIGSNY)、由序列識別號30(圖28)所示的胺基酸序列而成的CDRL2(RDD)、及由序列識別號31(圖29)所示的胺基酸序列而成的CDRL3(QSYSSGFI)的輕鏈可變區。
於本發明，CDR之位置與長度係由IMGT的定義(Developmental and Comparative Immunology 27(2003)55-77)來決定。
就本發明之重鏈可變區之具體例而言，可列舉包含於序列識別號16所示的胺基酸殘基的胺基酸序列。
就本發明之輕鏈可變區之具體例而言，可列舉包含於序列識別號17、20、及23所示的胺基酸殘基的胺基酸序列。
就本發明之人類化抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段中包含的適合具定例而言，可列舉下列之抗體或該抗體之抗原結合性片段：含有包含序列識別號60之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、與包含序列識別號60之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段、含有包含序列識別號64之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、與包含序列識別號64之135至241之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段、含有包含序列識別號66之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、與包含序列識別號66之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段、含有包含序列識別號68之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、與包含序列識別號68之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段、含有包含序列識別號70之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、與包含序列識別號70之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段、 含有包含序列識別號72之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、與包含序列識別號72之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段、含有包含序列識別號74之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、與包含序列識別號74之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段、含有包含序列識別號76之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、與包含序列識別號76之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段、含有包含序列識別號78之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、與包含序列識別號78之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段、含有包含序列識別號80之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、與包含序列識別號80之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段、含有包含序列識別號82之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、與包含序列識別號82之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段、或 含有包含序列識別號84之2至119之胺基酸殘基的重鏈可變區、與包含序列識別號84之135至243之胺基酸殘基的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段。
又，就本發明之人類化抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段所含的具定例而言，亦可列舉含有包含序列識別號16所示的胺基酸序列的重鏈可變區、連結子、包含序列識別號17、20、及23之任一者所示的胺基酸序列的輕鏈可變區的抗體或該抗體之抗原結合性片段。
本發明之抗體或該抗體之抗原結合性片段所含的可變區係可自抗體之胺基末端側以重鏈可變區、輕鏈可變區的順序結合，或可以輕鏈可變區、重鏈可變區的順序結合。又，於可變區的胺基末端可具有甘胺酸殘基，於可變區的羧基末端可結合有連結子、FLAG、及His標籤。
就本發明之人類化抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段所含的適合的具體例而言，可列舉：包含序列識別號19之第2至243位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號22之第2至243位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號25之第2至241位之胺基酸殘基的抗體或該抗體之抗原結合性片段。
就本發明之人類化抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段所含的更適合的具體例而言，可例舉：包含序列識別號60(圖68)之第1至243位之胺基酸殘基的抗體(選殖株ID：C3E-7078)或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號64(圖72)之第1至241位之胺基酸殘基的抗體(選殖株ID：C3E-7085)或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號66(圖74)之第1至243位之胺基酸殘基的抗體(選殖株ID：C3E-7086)或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號68(圖76)之第1至243位之胺基酸殘基的抗體(選殖株ID：C3E-7087)或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號70(圖78)之第1至243位之胺基酸殘基的抗體(選殖株ID：C3E-7088)或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號72(圖80)之第1至243位之胺基酸殘基的抗體(選殖株ID：C3E-7089)或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號74(圖82)之第1至243位之胺基酸殘基的抗體(選殖株ID：C3E-7090)或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號76(圖84)之第1至243位之胺基酸殘基的抗體(選殖株ID：C3E-7091)或該抗體之抗原結合性片段、 包含序列識別號78(圖86)之第1至243位之胺基酸殘基的抗體(選殖株ID：C3E-7092)或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號80(圖88)之第1至243位之胺基酸殘基的抗體(選殖株ID：C3E-7093)或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號82(圖90)之第1至243位之胺基酸殘基的抗體(選殖株ID：C3E-7094)或該抗體之抗原結合性片段、包含序列識別號84(圖92)之第1至243位之胺基酸殘基的抗體(選殖株ID：C3E-7095)或該抗體之抗原結合性片段。
本發明之人類化抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段中所含之自胺基酸末端側以重鏈可變區、第一連結子、及輕鏈可變區的順序結合，就又於輕鏈可變區之羧基末端結合有第二連結子、FLAG標籤、及His標籤的適合具體例而言，可列舉前述(16)記載之抗原或該抗體之抗原結合性片段，其包含：包含序列識別號22之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號25之2至267之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號60之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、 包含序列識別號64之2至267之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號66之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號68之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號70之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號72之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號74之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號76之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號78之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號80之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、包含序列識別號82之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列、或包含序列識別號84之2至269之胺基酸殘基的胺基酸序列。
就本發明之抗體等而言，重鏈可變區之胺基酸序列、及/或輕鏈可變區之胺基酸序列可為與上述之本發明之抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段所含的重 鏈可變區之胺基酸序列、及/或輕鏈可變區之胺基酸序列有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%以上同一性，且可為包含與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合的抗體等的分子。
就本發明之抗體等而言，可為於上述之人類化抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段中導入變異，而使對CD3的結合能力最適化。就導入變異的具體的方法而言，可列舉使用易錯PCR(error-prone PCR)法的隨機突變誘發法、使用NNK庫的部位特異性的胺基酸變異導入、利用結構情報的部位特異的變異導入、及彼等之組合。
就本發明之抗體等而言，為了降低抗體之效應子活性，可為取代恆定區而使ADCC、CDC活性降低者。
為了避免對正常的人類CD3表現細胞的細胞毒性，寄望抗體之效應子活性為低的。已知效應子活性係依抗體之亞型而異。可見IgG4係ADCC、CDC活性低，IgG2雖具有CDC活性，但ADCC活性低等之特徵。由此特徵，藉由將IgG1之恆定區置換為IgG2、4之恆定區，製作使ADCC、CDC活性降低的抗體為可能的。又，藉由參考IgG2、4而將IgG1之恆定區的一部分序列置換，可製作使ADCC、CDC活性降低的IgG1抗體。作為一例，若依據Marjan Hezareh et.al.Journal of Virology，75(24)：12161-12168(2001)，將IgG1之第234位、第235位之白胺酸殘基(數字係依Kabat等人的EU index)各自置換為丙胺酸殘基時，顯示ADCC、CDC活性降低。
(3-8)與同一部位結合，亦與食蟹獼猴CD3結合的抗體
與本發明之提供的抗體等「同一部位結合，且亦與食蟹獼猴CD3結合的抗體」亦包含於本發明之抗體等。與某抗體「同一部位結合的抗體」係意指與該抗體辨識的抗原分子上之部位結合的另一抗體。若第一抗體結合的抗原分子上之部分肽或部分立體結構有第二抗體結合，可判定第一抗體與第二抗體結合於同一部位。
又，藉由確認第二抗體與第一抗體競爭對抗原的結合，即，第二抗體妨礙第一抗體與抗原的結合，即使未決定具體的結合部位之肽序列或立體結構，亦可判定第一抗體與第二抗體結合於同一部位。
再者，第一抗體與第二抗體結合於同一部位，且第一抗體具有如細胞毒性活性之本發明之抗體的一態樣之特徵的效果的情形，第二抗體亦具有同樣活性的可能性係極高的。
因此，若於第一抗CD3抗體之結合的部位有第二抗CD3抗體結合且第二抗CD3抗體與食蟹獼猴CD3結合，可判定第一抗體與第二抗體結合於CD3蛋白質上之同一部位。與本發明之抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段所結合的人類CD3上之同一部位結合且與食蟹獼猴CD3結合的抗體或該抗體之抗原結合性片段，亦包含於本發明之抗體等。
又，若可確認第二抗CD3抗體與第一抗CD3抗體競爭對CD3蛋白質的結合，且第二抗CD3抗體與食蟹獼猴CD3結合，可判定為第一抗體與第二抗體結合於與CD3蛋白質上之同一部位的抗體。與本發明之抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段對人類CD3上的結合為競爭且與食蟹獼猴CD3結合的抗體或該抗體之抗原結合性片段亦包含於本發明之抗體等。
抗體之結合部位係可藉由免疫試驗等本項技術領域中具通常知識者周知的方法來決定。例如，將抗原之胺基酸序列，製作自羧基末端或胺基末端適當削減而成的一系列肽，研討抗體與該等之反應性，大致決定辨識部位後，進一步合成短的肽而研討抗體對該等肽的反應性，藉此可決定結合部位。抗原片段肽係可使用基因重組、肽合成等之技術而調製。
本發明之抗體等係辨識、結合形成CD3中的立體結構的區域，即類Ig域(Ig-like domain)。該抗體之結合部位(抗原決定位)係使用X射線結構解析，藉由特定與該抗體鄰接的抗原上之胺基酸殘基而加以決定。
(3-9)抗CD3抗體或其抗原結合性片段之修飾體
本發明係提供抗體或其抗原結合性片段之修飾體。本發明之抗體或其抗原結合性片段之修飾體係意指於本發明之抗體或其抗原結合性片段施加化學或生物學的修飾而成者。化學的修飾體包含對胺基酸骨架的化學部分的鍵結、N-鍵或O-鍵碳水化物鏈的化學修飾體等。生物學的修飾體包含轉譯後修飾(例如，對N-鍵或 O-鍵的糖鏈加成、胺基末端區域或羧基末端區域的加工(processing)、脫醯胺化、天冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化)者之藉由使用原核生物宿主細胞而表現，於胺基末端添加甲硫胺酸殘基者等。又，為了使本發明之抗體或抗原的檢出或單離成為可之經標識者，例如，酵素標識體、螢光標識體、親和力標識體亦包含於該種修飾物的意義中。此種本發明之抗體或其抗原結合性片段之修飾物係有用於原本之本發明之抗體或其抗原結合性片段之安定性及血中滯留性的改善、抗原性的減少、該抗體或抗原之檢出或單離等。
就化學的修飾體所包含的化學部分而言，可例示聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧基甲基纖維素、聚葡糖、聚乙烯醇等之水溶性聚合物。
就生物學的修飾物而言，可列舉藉由酵素處理、細胞處理等施予修飾者、藉由基因重組附加標籤等其他肽的融合體、以及將表現內因性或外來性的糖鏈修飾酵素的細胞作為宿主而調製者等。
該修飾係可施予於抗體或其抗原結合性片段中的任意位置上、或於冀望的位置上，可於1個或2個以上的位置施予相同或2種以上不同的修飾。
於本發明，「抗體之抗原結合性片段之修飾體」其意義亦包含「抗體之修飾體之片段」。
又，例如，於哺乳類培養細胞所生產的抗體已知重鏈的羧基末端的離胺酸殘基有缺失(Journal of Chromatography A，705：129-134(1995))，又，已知相 同重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸的2胺基酸殘基有缺失，位於新的羧基末端的脯胺酸殘基經醯胺化(Analytical Biochemistry，360：75-83(2007))。再者，已知於抗體之製作時，抗體之重鏈或輕鏈之胺基末端的麩醯胺酸或麩胺酸殘基經焦麩胺醯基化修飾，本發明之抗體係可具有此種修飾(國際專利公開WO2013/147153號)。
然而，此等重鏈序列的缺失及修飾對於抗體之抗原結合能及效應子抗原結合性(補體的活性化、抗體依賴性細胞毒性作用等)不太影響。因此，本發明亦包含受到該修飾的抗體及該抗體之抗原結合性片段，於重鏈羧基末端有1或2個胺基酸缺失的缺失體、及經醯胺化的該缺失體(例如，羧基末端部位之脯胺酸殘基經醯胺化的重鏈)、重鏈或輕鏈之胺基末端殘基經焦麩胺醯基化的抗體等(將彼等統稱為「缺失體」)。惟，只要保有抗原結合能之全部或一部分，本發明之抗體之重鏈及輕鏈的羧基末端的缺失體並未限定於上述種類限定。本發明之抗體包含2股以上的鏈(例如重鏈)的情形，該2股以上的鏈(例如重鏈)可為選自包含完全長度及上述缺失體的群組的重鏈之任一種，亦可為組合任2種以上者。各缺失體的量比或分子數比係可受到產生本發明的抗體的哺乳類培養細胞之種類及培養條件等之影響，但就本發明之抗體之缺失體而言，可列舉例如，於2股的重鏈雙方，羧基末端的1個胺基酸殘基有缺失的情形。此等亦全部包含於本發明之抗體變異體、抗體之抗原結合性片段或彼等之修飾體的意義。
又，藉由調節與本發明之抗體結合的糖鏈修飾(醣苷化(glycosylation)、脫岩藻醣化(deglucosylation)等)，可增強抗體依賴性細胞毒性活性。就抗體之糖鏈修飾之調節技術而言，雖已知國際專利公開WO99/54342號、WO00/61739號、WO02/31140號等，但並未限定於此等。本發明之抗體及該抗體之抗原結合性片段亦包含該糖鏈修飾經調節的抗體及該抗體之抗原結合性片段。
於本發明，「抗體或其抗原結合性片段」之範圍亦包含「抗體或其抗原結合性片段」之「缺失體」、「修飾體」、及與此等之混合物。又，(3-5)及(3-6)記載得本發明之具有抗原結合性的分子、多重特異性分子、雙特異性分子等所包含的「抗體或其抗原結合性片段」之範圍中亦包含「抗體或其抗原結合性片段」之「缺失體」「修飾體」、及與彼等之混合物。
4.抗體之製造 (4-1)使用融合瘤的方法
作為本發明之一個態樣的抗CD3抗體，可按照例如，柯勒(Kohler)與麥爾斯坦(Milstein)的方法(Kohler and Milstein，Nature(1975)256，p.495-497、Kennet，R.ed.，Monoclonal Antibodies，p.365-367，Plenum Press，N.Y.(1980))，自以CD3蛋白質免疫的動物之脾臟將抗CD3抗體之產生細胞單離，藉由使該細胞與骨髓瘤細胞融合，而建立融合瘤，自該融合瘤的培養物取得單株抗體。
(4-1-1)抗原之調製
用以製作抗CD3抗體的抗原可按照天然型或重組型之CD3蛋白質(人類CD3εγ單鏈抗原)之調製法等而取得。就可如此調製的抗原而言，可列舉CD3蛋白質或CD3蛋白質片段、或彼等任意之胺基酸序列、附加担體的衍生物等(以下，統稱為「CD3」)。
天然型CD3，例如，可自源自人類組織的細胞、或該細胞的培養物進行純化、單離。重組型人類CD3εγ單鏈抗原係藉由將含有編碼人類CD3εγ單鏈抗原所具有的胺基酸序列的鹼基序列的基因導入宿主細胞，自該細胞之培養物回收該抗原，而進行調製。又，藉由活體外轉譯系統將編碼CD3抗原之胺基酸序列的鹼基序列所包含的基因以無細胞蛋白質合成而獲得的CD3亦包含於本發明之「CD3抗原」。
(4-1-2)抗CD3單株抗體之製造
單株抗體之製造係通常經由如下述的步驟。
(a)調製抗原的步驟、(b)調製抗體產生細胞的步驟、(c)調製骨髓瘤細胞(以下，稱為「骨髓瘤」)的步驟、(d)使抗體產生細胞與骨髓瘤融合的步驟、(e)篩選產生目的抗體的融合瘤群的步驟、及(f)獲得單一細胞株的步驟(選殖)。
因應必要，進一步施加(g)融合瘤之培養步驟、移植融合瘤的動物之飼育步驟等、(h)單株抗體之生物活性之測定步驟‧判定步驟等。
以下，按照上述步驟詳述單株抗體之製作法，但該抗體之製作法並未被限制於此，亦可使用例如脾臟細胞以外的抗體產生細胞及骨髓瘤。
(a)調製抗原的步驟
本發明之CD3蛋白質藉由可動物組織(包含體液)、源自該組織的細胞或自該細胞培養物的純化及單離、基因重組、無細胞蛋白質合成、化學合成等加以調製。
(b)調製抗體產生細胞的步驟
將步驟(a)所獲得的抗原、與弗氏(Freund)完全或不完全佐劑、或鉀礬(potash alum)之類的佐劑混合，作為免疫原而對實驗動物進行免疫。實驗動物可無問題地使用於周知融合瘤製作法所使用的動物。具體而言，例如可使用小鼠、大鼠、羊、綿羊、牛、馬等。惟，由使與摘出的抗體產生細胞融合的骨髓瘤細胞的取得容易性等之觀點，較佳以小鼠或大鼠作為被免疫動物。
又，實際使用的小鼠及大鼠之品系並未特別限制，於小鼠的情形，可使用例如，A、AKR、BALB/c、BALB/cAnNCrj、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB、129等，於大鼠的情形，可使 用例如，Wistar、Low、Lewis、Sprague-Dawley、ACI、BN、Fischer等。
此等小鼠及大鼠係可例如由日本Claire、日本Charles River等之實驗動物飼育販賣業者取得。
其中，若考量後述之與骨髓瘤細胞的融合適合性，特佳為於小鼠以BALB/c品系作為被免疫動物，於大鼠以Wistar及Low品系作為被免疫動物。
又，考慮抗原之人類與小鼠的相同性，使去除自體抗體的活體機構降低的小鼠，即較佳使用自體免疫疾病小鼠。
又，此等小鼠或大鼠之免疫時的週齡係較佳為5至12週齡，更佳為6至8週齡。
於以CD3蛋白質免疫動物，可使用例如，Weir，D.M.，Handbook of Experimental Immunology Vol.I.II.III.，Blackwell Scientific Publications，Oxford(1987)、Kabat，E.A.and Mayer，M.M.，Experimental Immunochemistry，Charles C Thomas Publisher Spigfield，Illinois(1964)等之方法。
就抗體價的測定法而言，可列舉例如，RIA法、ELISA法等之免疫分析，但未被限定於該等方法。
自經免疫的動物分離的脾臟細胞或源自淋巴球的抗體產生細胞，可按照例如，Kohler et al.，Nature(1975)256，495，；Kohler et al.，Eur.J.Immnol.(1977)6，511，；Milstein et al.，Nature(1977)，266，550，；Walsh，Nature(1977)266，495，)等之公知方法進行調製。
於脾臟細胞的情形，可採用將脾臟細切，而將細胞以不鏽鋼網過濾後，使浮游於伊戈最低必需培養基(Eagle minimum essential medium，MEM)等而將抗體產生細胞分離的一般方法。
(c)調製骨髓瘤的步驟
用於細胞融合的骨髓瘤細胞並未特別限定，可自公知之細胞株加以適當選擇來使用，考慮自融合細胞選擇融合瘤之際的利便性，較佳使用其選擇手續已確立的(次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶HGPRT(Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase))缺損株，即源自小鼠的X63-Ag8(X63)、NS1-ANS/1(NS1)、P3X63-Ag8.U1(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、BU.1等、源自大鼠的210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等、源自人類的U266AR(SKO-007)、GM1500‧GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等。此等之HGPRT缺損株係可自例如，美國菌種保存中心(erican Type Culture Collection(ATCC))等取得。
此等之細胞株以適當培養基，例如8-氮鳥嘌呤培養基〔於RPMI-1640培養基中添加麩醯胺酸、2-巰基乙醇、正大黴素(gentamicin)、及胎牛血清(以下稱為「FCS」)的培養基中加入8-氮鳥嘌呤的培養基〕、Iscove改良的DEME(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium； 以下稱為「IMDM」)、或杜氏改良伊戈培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；以下稱為「DMEM」)進行繼代培養，但於細胞融合的3至4日前以正常培養基〔例如，含10% FCS的ASF104培養基(味之素(股)公司製)〕進行繼代培養，於融合當日確保有2×107以上之細胞數。
(d)使抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合的步驟
抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合係按照公知之方法(Weir，D.M.，Handbookof Experimental Immunology Vol.I.II.III.，Blackwell Scientific Publications，Oxford(1987)、Kabat，E.A.and Mayer，M.M.，Experimental Immunochemistry，Charles C Thomas Publisher Spigfield，Illinois(1964)等)，可於使細胞的生存率未極度降低的程度的條件下加以實施。可使用例如，於聚乙二醇等之高濃度聚合物溶液中使抗體產生細胞與骨髓瘤細胞混合的化學方法、利用電氣刺激的物理方法等。
(e)篩選產生為目的之抗體的融合瘤群的步驟
藉由細胞融合獲得的融合瘤之選擇方法並未特別限制，但通常使用HAT(次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸苷(hypoxanthine aminopterin thymidine))選擇法(Kohler et al.，Nature(1975)256，495；Milstein et al.，Nature(1977)266，550)。此方法係使用於胺基蝶呤無法生存的HGPRT缺損株之骨髓瘤細胞而獲得融合瘤的情形為有效。即，藉由以HAT培養基培養未融合細胞及融合瘤，使選擇性殘存僅對胺基蝶呤具有耐性的融合瘤，且可使增殖。
(f)獲得單一細胞株的步驟(選殖)
就融合瘤的選殖法而言，可使用例如，甲基纖維素法、軟瓊脂糖法、界限稀釋法等之公知方法(例如，Barbara，B.M.and Stanley，M.S.：Selected Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman and Company，San Francisco(1980))，較佳為界限稀釋法。
(g)融合瘤之培養步驟、移植融合瘤的動物之飼育步驟
藉由培養選擇的融合瘤，可產生單株抗體，較佳為選殖冀望的融合瘤後供給於抗體的產生。
產生該融合瘤的單株抗體係可自該融合瘤的培養物回收。又，亦可自有該單株抗體基因導入的細胞之培養物呈重組抗體而回收。再者，將融合瘤注射至同品系的小鼠(例如，上述之BALB/cAnNCrj)、或Nu/Nu小鼠之腹腔內，藉由使該融合瘤增殖，亦可自其腹水進行回收。
(h)單株抗體之生物活性之測定步驟‧判定步驟
因應目的可選擇、應用各種生物試驗。
(4-2)細胞免疫法
藉由使用表現天然型之CD3的細胞、表現重組型CD3或其片段的細胞等作為免疫原來使用，可利用前述融合瘤法調製抗CD3抗體。
就表現天然型之CD3的細胞而言，可列舉人類胸腺細胞、T淋巴球等。彼等之CD3表現細胞係一次免疫使用1×105至1×109個，較佳為1×106至1×108個，更佳為0.5至2×107個，進一步較佳為1×107個，但因應CD3的表現量，可改變供應於免疫的細胞數目。該免疫源，一般而言投予至腹腔內，亦可投予至皮內等。就融合瘤之製作手法而言，可適用(4-1-2)記載之方法。
(4-3)DNA免疫法
本發明之抗CD3抗體亦可使用DNA免疫法。將抗原表現質體基因導入至小鼠、大鼠等之動物個體，藉由使抗原於個體內表現，誘導對抗原的免疫。於基因導入之手法，存有直接將質體注射至肌肉的方法、將脂質體或聚乙亞胺等之導入試藥作靜脈注射的方法、使用病毒載體的手法、利用基因槍將使附著質體的金粒子射入的手法、急速地將大量質體溶液作靜脈注射的流體動力法等。
就如此樹立的大鼠抗人類CD3抗體之實例而言，可列舉C3-147。C3-147之輕鏈可變區之胺基酸序列係示於序列表之序列識別號9(圖17)。又C3-147之重鏈可變區之胺基酸序列係示於序列表之序列識別號7(圖15)。
(4-4)基因重組
本發明之抗體，將編碼其重鏈胺基酸序列的核苷酸序列所含的核苷酸(重鏈核苷酸)及編碼其輕鏈胺基酸序列的核苷酸序列所含的核苷酸(輕鏈核苷酸)、或有該重鏈核苷酸插入的載體及輕鏈核苷酸插入的載體導入宿主細胞，培養該細胞後，藉由自其培養物回收該抗體，可加以調製。於一個載體可插入重鏈核苷酸及輕鏈核苷酸。
就宿主細胞而言，可使用原核細胞或真核細胞。使用真核細胞作為宿主的情形，可使用動物細胞、植物細胞、真核微生物。
就動物細胞而言，可列舉例如，源自哺乳類的細胞，即，源自人類胎兒的腎臟細胞HEK293F細胞(Subedi GP et al.、J Vis Exp.(2015)106)源自猴腎.的COS細胞(Gluzman，Y.Cell(1981)23，175-182、ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)、其二氫葉酸還原酵素缺損株(CHOdhfr-：Urlaub，G.and Chasin，L.A.PNAS(1980)77，4126-4220)、源自雞等鳥類的細胞、源自昆蟲的細胞等。
又，亦可使用藉由糖鏈結構的改變，改變以提高抗體之生物活性的細胞作為宿主。例如，與抗體之Fc區域結合的N-醣苷結合複合型糖鏈之中，藉由使用於糖鏈還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺未結合岩藻醣的糖鏈的比率改變成為20%以上的CHO細胞，可調製ADCC活性、CDC活性提高的抗體(國際專利公開WO02/31140號)。
就真核微生物而言，可列舉例如，酵母等。就原核細胞而言，可列舉例如，大腸菌、枯草菌等。
就用以使本發明之抗體(源自各種動物的單株抗體、大鼠抗體、小鼠抗體、嵌合化抗體、人類化抗體、人類抗體等)分泌的訊息肽而言，未限定於與該抗體同種、同型及同亞型的抗體之分泌訊息、以及該抗體自體的分泌訊息，若為其他型或亞型的抗體之分泌訊息、或源自其他真核生物種或原核生物的蛋白質之分泌訊息，可選擇任意者而利用。
包含訊息肽而被分泌的抗體等亦包含於本發明之抗體等或本發明之分子。
(4-5)人類化抗體之設計法及調製法
就人類化抗體而言，可列舉僅非人類動物抗體之CDR併入源自人類的抗體的抗體(參照Nature(1986)321，p.522-525)、利用CDR移植法添加於CDR之序列的一部分框架的胺基酸殘基亦移植至人類抗體的抗體(參照WO90/07861號、US6972323號公報)、彼等任一者中的非人類動物抗體之1個或2個以上之胺基酸經人類型之胺基酸取代而成的抗體等，但並未限定於彼等。
(4-6)人類抗體之調製法
就本發明之抗體而言，進一步可列舉人類抗體。人類抗CD3抗體係意指由源自人類的抗體之胺基酸序列而 成的抗CD3抗體。人類抗CD3抗體係藉由使用包含具有人類抗體之重鏈與輕鏈的基因的人類基因體DNA片段的人類抗體產生小鼠的方法(參照Tomizuka，K.et al.，Nature Genetics(1997)16，133-143，；Kuroiwa，Y.et.al.，Nuc.Acids Res.(1998)26，3447-3448；Yoshida，H.et.al.，Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol.10，69-73(Kitagawa，Y.，Matuda，T.and Iijima，S.eds.)，Kluwer Academic Publishers，1999.；Tomizuka，K.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97，722-727等)而取得。
具體而言，此種人類抗體產生動物係可藉由破壞非人類哺乳動物之內在性免疫球蛋白重鏈及輕鏈的基因座，而藉由酵母人工染色體(Yeast artificial chromosome，YAC)載體等導入人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座，而製作。又，藉由基因重組技術，藉由編碼此種人類抗體之重鏈及輕鏈各自的cDNA，較佳為含有該cDNA的載體，將真核細胞轉形，藉由培養產生基因重組人類單株抗體的轉形細胞，亦可自培養上清液中獲得此抗體。
其中，就宿主而言，例如可使用真核細胞，較佳可使用HEK293F細胞、CHO細胞等之哺乳動物細胞。
又，獲得源自由人類抗體庫篩選的噬菌體展示的人類抗體的方法亦為已知。例如，可使用使人類抗體之可變區作為scFv於噬菌體表面表現，選擇與抗原結 合的噬菌體的噬菌體展示法。藉由解析經與抗原結合而選擇的噬菌體的基因，可決定編碼與抗原結合的人類抗體之可變區的DNA序列。若清楚與抗原結合的scFv之DNA序列，可製作具有該序列的表現載體，使導入適當宿主而表現，而取得人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12，433-455)。
(4-7)抗體之抗原結合性片段之調製法
作成scFv的方法為本技術領域所周知(例如，參照美國專利第4,946,778號、美國專利第5,260,203號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,455,030號等)。於此scFv，重鏈可變區與輕鏈可變區係以未作成結合物的方式而藉由連結子，較佳藉由多肽連結子而連結(Huston，J.S.et al.，PNAS(1988)，85，5879-5883)。scFv中的重鏈可變區及輕鏈可變區係可源自同一抗體，亦可源自各別的抗體。
就連結可變區的多肽連結子而言，例如可使用由5至30個殘基而成的任意單鏈肽。
編碼scFv的DNA係以編碼前述抗體之重鏈或重鏈可變區的DNA、及編碼輕鏈或輕鏈可變區的DNA中、彼等序列中之編碼全部或所冀望的胺基酸序列的DNA部分作為模板，使用指定引子對於其兩端，藉由PCR法來增幅，接著，再藉由組合編碼多肽連結子部分的 DNA、及針對其兩端各自與重鏈、輕鏈連結的引子而獲得。或者，亦可以全合成編碼scFv全區域的DNA而獲得。
使用編碼scFv的DNA，按照通常方法可調製含有該DNA的表現載體、及利用該表現載體轉形的宿主細胞，又，藉由培養該宿主細胞，按照通常方法，可自該培養物回收該scFv。
其他抗體之抗原結合性片段亦可藉由將依據前述方法取得編碼該抗原結合性片段的基因導入細胞，自該細胞的培養物回收該抗原結合性片段而獲得。
本發明之抗體等可為多量化而提高對抗原的親和性者。就多量化的抗體而言，可為1種類的抗體，亦可為辨識同一抗原之複數個抗原決定位的複數之抗體。就將抗體多量化的方法而言，可列舉IgG CH3域與2個scFv之結合、與鏈親和素(streptavidin)的結合、螺旋-轉角-螺旋基序(helix-turn-helix motif)之導入等。
本發明之抗體等可為胺基酸序列不同的複數種類之抗CD3抗體之混合物，即可為多株抗體。就多株抗體而言，可列舉例如，CDR組的一部份或全部為不同的複數種類之抗體之混合物。此種多株抗體可將不同的抗體之產生細胞混合培養，並自該培養物加以回收(WO2004/061104號)。又，亦可混合個別調製的抗體。再者，多株抗體之一個態樣的抗血清係可以所冀望的抗原將動物進行免疫，按照通常方法，可自該動物回收血清而調製。
就抗體之修飾物而言，亦可使用與聚乙二醇(PEG)等之各種分子結合的抗體。
本發明之抗體等可為此等抗體與其他分子以連結子連結的複合體(Immunoconjugate，免疫結合物)。就該抗體與放射性物質或具有藥理作用的化合物(藥物)結合的抗體-藥物複合體之例而言，可列舉ADC(抗體-藥物結合物(Antibody-Drug Conjugate))(Methods MolBiol.(2013)1045：1-27)。
本發明之抗體等可進一步將此等抗體與其他機能性多肽連繫。就此種抗體-肽複合體之例而言，可列舉該抗體與白蛋白結合多肽的複合體(Protein Eng Des Sel.(2012)(2)：81-8)。
(4-8)抗體及抗體之抗原結合性片段之純化
獲得的抗體及抗體之抗原結合性片段係可以不含該抗體等以外的方式均一地純化。抗體及抗體之抗原結合性片段的分離、純化只要使用於通常蛋白質所使用的分離、純化方法即可。
例如，若適當選擇、組合層析管柱、過濾、超過濾、鹽析、透析、調製用聚丙烯醯胺膠體電泳、等電點電泳等，即可將抗體分離、純化，但並未限定於此等。
就較佳的分離‧純化法而言，例如，藉由將編碼His標籤或FLAG標籤的DNA序列附加於抗體可變區的羧基末端而製作表現載體，藉由此載體使細胞轉 形，進一步培養細胞而使該抗體及抗體之抗原結合性片段表現，培養結束後，提取培養上清液，以Ni、Co等的金屬親和力層析、抗FLAG標籤抗體管柱、膠體過濾、離子交換層析等，可加以純化。
含有編碼His標籤或FLAG標籤等之標籤的胺基酸序列而表現的抗體及抗體之抗原結合性片段，亦包含於本發明之抗體等或本發明之分子。
(4-9)多重特異性分子、雙特異性分子
本發明之雙特異性分子及多重特異的分子係可列舉於宿主細胞導入表現質體，使暫時性表現的方法；於宿主細胞導入質體後，藉由藥劑選擇選擇安定表現細胞株，並使恒常性表現的方法；無細胞地合成方法；各自的抗體或抗原結合性片段以上述方法製作後，使用合成肽連結子而化學性地結合的方法。
於使用抗體可變區的雙特異性分子，有以肽連結子使2個之1股鏈抗體(scFv)結合(串聯scFv)、特異性相異的2個抗體中交換彼此的結構域而非共價鍵結地形成二聚物(雙鏈抗體)、特異性相異的2個抗體中交換彼此的結構域並單鏈化(單鏈雙鏈抗體)、將雙鏈抗體1股鏈化而非共價鍵結地形成二聚物(TandAb、美國專利US7129330)等之方法。
本發明亦提供本發明之抗體或該抗體之抗原結合性片段、或編碼抗原等之修飾物的基因、有該基因插入的重組載體、有該基因或載體導入的細胞、其他產生本發明之抗體的細胞。
5.醫藥組成物
本發明提供抗CD3抗體、其抗原結合性片段或其修飾體、及/或含有彼等的本發明之分子，例如，含有多重特異性分子的醫藥組成物。
於本發明，疾病之治療及/或預防包含該疾病發病的預防、惡化或進行的抑制或阻礙、罹患該疾病的個體所呈現的一個或二個以上之症狀的減輕、惡化或進行的抑制或緩解、繼發性疾病之治療或預防等，但未限定於彼等。就疾病而言，例如，前述分子的情形，可列舉癌症。
於本發明之醫藥組成物，可含有治療或預防上有效量之抗CD3抗體或該抗體之抗原結合性片段與藥學上可許的稀釋劑、載體、助溶劑、乳化劑、保存劑及/或輔助劑。
「治療或預防上有效量」係意指對特定疾病、投予形態及投予路徑發揮治療或預防效果的量。
於本發明之醫藥組成物，可含有用以使pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、無菌性、該組成物或其所包含的抗體之安定性、溶解性、徐放性、吸收性、浸透性、劑型、強度、性狀、形狀等變化、維持、保持的物質(以下，稱為「製劑用之物質」)。就製劑用之物質而言，只要為藥理學上可容許的物質即可，並未特別限定。例如，非毒性或低毒性係製劑用之物質較佳具備的性質。
就製劑用之物質而言，例如，可列舉以下者，但未限定於此等；甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸等之胺基酸類、抗菌劑、抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等之抗氧化劑、磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝劑、碳酸氫鈉、Tris-鹽酸(Tris-Hcl)溶液等之緩衝劑、甘露醇或甘胺酸等之填充劑、乙二胺四乙酸(EDTA)等之螯合劑、咖啡因、聚乙烯吡咯啶、β-環糊精或羥基丙基-β-環糊精等之錯化劑、葡萄糖、甘露糖或糊精等之增量劑、單糖類、二糖類或葡萄糖、甘露糖或糊精等之其他碳水化合物、著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑或聚乙烯吡咯啶等之親水聚合物、低分子量多肽、鹽形成對離子、氯化苄烷銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、洛赫西定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫等之防腐劑、甘油、丙二醇或聚乙二醇等之溶媒、甘露醇或山梨糖醇等之糖醇、懸浮劑、PEG、山梨糖醇酐酯、聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80等聚山梨醇酯、曲拉通(triton)、三羥基氨基甲烷(tromethamine)、卵磷脂或膽固醇等之界面活性劑、蔗糖或山梨糖醇等之安定化增強劑、氯化鈉、氯化鉀、甘露醇或山梨糖醇等之彈性增強劑、輸送劑、稀釋劑、賦形劑、及/或藥學上的輔助劑。
此等之製劑用物質的添加量，相對於抗CD3抗體、其抗原結合性片段或其修飾體、或本發明之分子，例如，多重特異性分子之重量，為0.001至1000倍，較佳為0.01至100倍，更佳為0.1至10倍。
含有使本發明之抗CD3抗體、其抗原結合性片段或其修飾體、或本發明之分子，例如，多重特異性分子含於脂質體中的免疫脂質體、抗體與脂質體結合而成的抗體修飾體(美國專利第6214388號等)的醫藥組成物亦包含於本發明之醫藥組成物。
賦形劑或載體通常為液體或固體，只要注射用的水、生理食鹽水、人工腦脊髓液、其他之經口投予或非經口投予用之製劑使用的物質即可，並未特別限定。就生理食鹽水而言，可列舉中性者、包含血清白蛋白者等。
就緩衝劑而言，可例示調製醫藥組成物之最終pH成為7.0至8.5的Tris緩衝液、調製pH成為4.0至5.5的乙酸緩衝液、調製pH成為5.0至8.0的檸檬酸緩衝液、調製pH成為5.0至8.0的組胺酸緩衝液等。
本發明之醫藥組成物為固體、液體、懸浮液等。可列舉冷凍乾燥製劑。可使用蔗糖等之賦形劑來將冷凍乾燥製劑加以成型。
就本發明之醫藥組成物之投予路徑而言，可為經腸投予、局部投予及非經口投予之任一者，依成為對象的疾病來選擇適合的投予路徑即可。具體而言，可列舉靜脈內投予、動脈內投予、肌肉內投予、皮內投予、皮下投予、腹腔內投予、經皮投予、骨內投予、關節內投予等。
該醫藥組成物之組成可因應投予方法、抗體之CD3蛋白質結合親和性等來決定。
本發明為抗CD3抗體、其抗原結合性片段或其修飾體、或本發明之分子，例如，多重特異性分子之投予量，可因應個體的種類、疾病的種類、症狀、性別、年齡、老毛病、該抗體之CD3蛋白質結合親和性或其生物活性、其他要素而適當決定，但通常為0.01至1000mg/kg，較佳為0.1至100mg/kg，於1至180日1次、或1日2次或3次以上投予。
就醫藥組成物之形態而言，可例示注射劑(包含冷凍乾燥製劑、點滴劑)、栓劑、經鼻型吸收製劑、經皮型吸收製劑、舌下劑、膠囊、錠劑、軟膏劑、顆粒劑、氣溶膠劑、丸劑、散劑、懸浮劑、乳劑、點眼劑、可活體埋入型製劑等。
本發明為抗CD3抗體、其抗原結合性片段或其修飾體、及/或含有彼等的本發明之分子，例如多重特異性分子(以下，記載為抗CD3抗體等)可與其他劑組合來使用。抗CD3抗體等、或將其作為有效成分而含有的醫藥組成物，可與含有其他劑，即抗CD3抗體等以外的藥劑作為有效成分的醫藥組成物同時或各別投予。例如，可投予其他劑後，投予含有抗CD3抗體等作為有效成分的醫藥組成物，或投予含有抗CD3抗體等作為有效成分的醫藥組成物後，投予其他劑，或將含有抗CD3抗體等作為有效成分的醫藥組成物與其他劑同時投予。於單一醫藥組成物中含有抗CD3抗體等及其他劑之兩者的有效成分的情形、及將兩有效成分分別含於複數個醫藥組成物的情形之任一者，皆於本發明稱為「含抗CD3抗 體等及其他劑的醫藥組成物」。於本發明，該「醫藥組成物」係與「使抗CD3抗體等與其他劑組合投予的醫藥組成物」同意義。
於本發明，將抗CD3抗體等與其他劑「組合投予」係意指於某一定期間，於被投予對象的體內，併入抗CD3抗體等與其他劑。抗CD3抗體等與其他劑可為含於單一製劑中的製劑被投予，又可各自被各別製劑化，而各別被投予。被各別製劑化的情形，其投予時期並未特別限定，可同時投予，亦可間隔時間而於相異時間或相異日被投予。抗CD3抗體等與其他劑被各自於相異時間或日被投予的情形，其投予順序並未特別限定。通常，各自之製劑因按照各自的投予方法被投予，彼等之投予有成為同一次數的情形，亦有成為不同次數的情形。又，各自各別被製劑化的情形，各製劑之投予方法(投予路徑)可為相同，亦可以相異投予方法(投予路徑)投予。又，不需要抗CD3抗體等與其他劑同時存於體內，只要某一定期間(例如一個月，較佳為1週，更佳為數日，進一步較佳為1日)之間攝入體內即可，亦可於任一者投予時另一者有效成分已自體內消失。
就「將抗CD3抗體等與其他劑組合投予的醫藥組成物」之投予形態而言，可列舉例如，1)含有抗CD3抗體等與其他劑的單一製劑之投予、2)將抗CD3抗體等與其他劑各別製劑化而獲得的2種製劑之以同一投予路徑的同時投予、3)將抗CD3抗體等與其他劑各別製劑化而獲得的2種製劑之於同一投予路經間隔時間差的 投予、4)將抗CD3抗體等與其他劑各別製劑化而獲得的2種製劑以不同投予路徑之同時投予、5)將抗CD3抗體等與其他劑各別製劑化而獲得的2種製劑之以不同投予路徑間隔時間差的投予等。「將抗CD3抗體等與其他劑組合投予的醫藥組成物」之投予量、投予間隔、投予形態、製劑等係類似於含有抗CD3抗體的醫藥組成物之彼等投予量、投予間隔、投予形態、製劑等，但並未限定於彼等。
該醫藥組成物於其成為2種相異製劑的情形，可為包含彼等的套組。
於本發明，抗CD3抗體等及其他劑之「組合」係意指將抗CD3抗體等及其他劑「組合而投予」者。
本發明之組合或醫藥組成物可進一步使用其他醫藥。
本發明亦提供與CD3有關的疾病之治療方法或預防方法、用以調製該疾病之治療用或預防用醫藥組成物之本發明抗體之用途、用以治療或預防該疾病之本發明抗體之用途。包含本發明之抗體的治療用或預防用套組亦包含於本發明。
[實施例]
以下，更具體地說明本發明，但本發明並未限定於彼等。又，於下述實施例，關於基因操作的各操作只要未特別明示，藉由「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.及Maniatis，T.著，Cold Spring Harbor Laboratory Press於1989年發刊)記載之方法進 行，或於使用市售試藥或套組的情形，按照市售品的說明書來使用。
(實施例1)大鼠抗人類CD3抗體之製作 1)-1人類CD3εδ表現載體之構築
利用Gateway Vector Conversion System(Thermo Fisher Scientific公司)，製作改變為目的載體(Destination Vector)的控制載體pcDNA3.1-DEST。編碼圖1(序列識別號1)所示的人類CD3ε蛋白質(NCBI Reference Sequence：NP_000724.1)的cDNA係購自Sino Biological，使用Gateway LR Clonase Enzyme mix(Thermo Fisher Scientific公司)，選殖於pcDNA3.1-DEST載體而構築hCD3ε-pcDNA3.1。編碼圖2(序列識別號2)所示的人類CD3δ蛋白質(NP_000723.1)的cDNA係按照本項技術領域中具通常知識者公知的方法，利用以源自人類T細胞的cDNA作為模板的PCR法進行增幅，藉由選殖於pcDNA3.1(+)(Thermo Fisher Scientific公司)而構築表現載體hCD3δ-pcDNA3.1。於各表現載體之大量調製，使用Endofree Plasmid Giga Kit(QIAGEN公司)。
1)-2免疫
免疫係使用雌WKY/Izm大鼠(Japan SLC公司)。首先將大鼠兩腳小腿部以玻尿酸酶 (Hyaluronidase)(SIGMA-ALDRICH公司)作前處理後，於相同部位肌肉注射實施例1)-1製作的hCD3ε-pcDNA3.1及hCD3δ-pcDNA3.1表現載體。接著，使用ECM830(BTX公司)，使用2個針電極，於相同部位實施活體內電穿孔。於重複約每兩週一次的活體內電穿孔之後，收集大鼠的淋巴結或脾臟並使用於融合瘤製作
1)-3融合瘤製作
將淋巴節細胞或脾臟細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14細胞(ATCC,No.CRL-1 581)，使用LF301 Cell Fusion Unit(BEX公司)進行電細胞融合，以ClonaCell-HY Selection Medium D(StemCell Technologies公司)稀釋並培養。藉由回收出現的融合瘤群落，製作單株融合瘤。將經回收的各融合瘤株，使用ClonaCell-HY Selection Medium E(StemCell Technologies公司)來培養，使用獲得的融合瘤培養上清液，進行抗人類CD3抗體產生融合瘤的篩選。
1)-4利用Cell-ELISA法的抗體篩選 1)-4-1 Cell-ELISA用抗原基因表現細胞之調製
使HEK293α細胞(源自表現整合素(integrin)αv及整合素β3的HEK293之安定表現細胞株)於含有10% FBS的DMEM培養基中調製為7.5×105細胞/mL。對此，按照使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific公司) 的轉形步驟，導入hCD3ε-pcDNA3.1及hCD3δ-pcDNA3.1、或作為對照之pcDNA3.1-DEST，各分注100μL於96孔盤(Corning公司)，於含有10%FBS之DMEM培養基中於37℃、5%CO2的條件下培養一晚。將獲得的導入細胞直接以接著狀態，使用於Cell-ELISA。
1)-4-2 Cell-ELISA
將於實施例1)-4-1調製的表現載體導入HEK293α細胞的培養上清液去除後，各自對hCD3ε-pcDNA3.1及hCD3δ-pcDNA3.1、或pcDNA3.1-DEST導入HEK293α細胞添加融合瘤培養上清液，於4℃靜置1小時。將孔中之細胞以含有5% FBS的PBS洗淨1次後，添加以含有5% FBS的PBS稀釋500倍的抗大鼠IgG、HRP-連結的全Ab山羊(HRP-Linked Whole Ab Goat)(GE Healthcare Bioscience公司)，於4℃靜置1小時。將孔中之細胞以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，以100μL/孔添加OPD顯色液(OPD溶解液(0.05M檸檬酸3鈉、0.1M磷酸氫2鈉‧12水pH4.5)中各自添加鄰苯二胺二鹽酸鹽(和光純藥公司)、H2O2溶解成為0.4mg/mL、0.6%(v/v))。一邊偶而攪拌一邊進行顯色反應，100μL/孔添加1M HCl而使顯色反應停止後，以平盤讀數機(ENVISION：PerkinElmer公司)測定490nm之吸光度。為了選擇產生與於細胞膜表面上表現的人類CD3結合的抗體的融合瘤，與對照之pcDNA3.1-DEST導入HEK293α細胞比較，選擇於hCD3ε-pcDNA3.1及hCD3δ-pcDNA3.1表現載體導入 HEK293α細胞產生顯示更高吸光度的培養上清液的融合瘤作為抗人類CD3抗體產生陽性。
1)-5利用人類T細胞活性化的抗體篩選
將獲得的融合瘤所產生的抗CD3抗體所致的T細胞活性化，以CD69活性化標記的檢出作為指標而評價。將為人類T細胞株的Jurkat細胞(ATCC,No.TIB-152)，於含有FBS的RPMI1640培養基中調製成為5×106細胞/mL之濃度，於96孔盤各接種100μL。於離心而去除上清液的Jurkat細胞中，以終濃度5μg/mL添加以實施例1)-4之Cell-ELISA選擇作為抗人類CD3抗體產生陽性的融合瘤的培養上清液、或大鼠IgG同型對照抗體(R&D Systams公司)，於37℃靜置30分鐘。之後，以終濃度10μg/孔添加交聯山羊抗大鼠IgG FcγFragment specific(JACKSON IMMUNORESEARCH公司)，37℃、5%CO2之條件下培養一晚。次日，去除上清液，將孔中細胞以含有5% FBS的PBS洗淨1次後，以20μL/孔添加PE小鼠抗-人類CD69抗體(BD Bioscience公司)，於4℃靜置30分鐘。將孔中細胞以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，再懸浮於含有5% FBS的PBS，以流式細胞儀(FC500：BeckmanCoulter公司)進行檢測。資料解析係以Flowjo(Treestar公司)進行。作成PE螢光強度的直方圖，將產生PE的螢光強度的直方圖相對於大鼠IgG同型對照抗體的螢光強度直方圖向強螢光強度側偏移的樣品的融合瘤選擇作為人類T細胞活性化能陽性抗人類CD3抗體產生融合瘤。
1)-6利用流式細胞儀法的對人類或猴CD3的選擇結合性篩選 1)-6-1人類抗原基因表現細胞之調製
將Lenti-X293T細胞(TAKARA公司，Cat#632180)接種於225cm2燒瓶成為5.3×104細胞/cm2，於含有10% FBS的DMEM培養基中，於37℃、5%CO2之條件下培養一晚。次日，將hCD3ε-pcDNA3.1及hCD3δ-pcDNA3.1，或作為對照之pcDNA3.1-DEST各自使用Lipofectamine 2000導入至Lenti-X293T細胞，於37℃、5%CO2之條件下進一步培養一晚。次日，將表現載體導入Lenti-X293T細胞以TrypLE Express(Thermo Fisher Scientific公司)處理，以含有10%FBS的DMEM將細胞洗淨後，以含有5% FBS的PBS調製為5×106細胞/mL之濃度。將獲得的細胞懸浮液使用於流式細胞儀法解析。
1)-6-2對人類CD3的結合性流式細胞儀法解析
進一步利用流式細胞儀法確認於實施例1)-5判定為人類T細胞活性化能陽性的融合瘤產生的抗體之對人類CD3的結合特異性。將實施例1)-6-1所調製的Lenti-X293T細胞懸浮液以100μL/孔接種於96孔U底微孔盤，離心後去除上清液。各自對hCD3ε-pcDNA3.1及hCD3δ-pcDNA3.1導入Lenti-X293T細胞及 pcDNA3.1-DEST導入Lenti-X293T細胞添加融合瘤培養上清液而懸浮，於於4℃靜置1小時。以含有5% FBS的PBS洗淨1次後，添加以含有5% FBS的PBS稀釋500倍的抗大鼠IgG FITC結合物(conjugate)(SIGMA公司)而懸浮，於4℃靜置30分鐘。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，再懸浮於含有2μg/ml 7-胺基放射菌素D(7-aminoactinomycin D)(Molecular Probes公司)的含有5% FBS的PBS，以流式細胞儀進行檢測。資料解析係以Flowjo進行。7-胺基放射菌素D陽性的死細胞以閘門排除後，作成活細胞的FITC螢光強度的直方圖。選擇產生相對於為對照的pcDNA3.1-DEST導入Lenti-X293T細胞之螢光強度直方圖，hCD3ε-pcDNA3.1及hCD3δ-pcDNA3.1導入Lenti-X293T細胞之直方圖偏移至強螢光強度側的樣品的融合瘤，作為與人類CD3結合的抗體產生融合瘤。
1)-6-3猴CD3εδ表現載體之構築
編碼猴CD3ε蛋白質(NCBI參考序列：NP_001270544.1)及猴CD3δ蛋白質(NCBI參考序列：NP_001274617.1)的cDNA係本項技術領域中具通常知識者按照公知方法，藉由以源自猴T細胞的cDNA作為模板的PCR法進行增幅，藉由選殖於pcDNA3.1(+)(Thermo Fisher Scientific公司)，構築表現載體cynoCD3ε-pcDNA3.1及cynoCD3δ-pcDNA3.1。
1)-6-4猴抗原基因表現細胞之調製
將Lenti-X293T細胞以成為5.3×104細胞/cm2的方式接種於225cm2燒瓶，於含有10%FBS的DMEM培養基中，於37℃、5%CO2之條件下培養一晚。次日，將cynoCD3ε-pcDNA3.1及cynoCD3δ-pcDNA3.1，或作為對照之pcDNA3.1-DEST各自使用Lipofectamine 2000導入Lenti-X293T細胞，於37℃、5% CO2之條件下進一步培養一晚。次日，將表現載體導入Lenti-X293T細胞以TrypLE Express處理，以含有10%FBS的DMEM將洗淨細胞後，以含有5% FBS的PBS調製為5×106細胞/mL之濃度。將獲得的細胞懸浮液使用於流式細胞儀法解析。
1)-6-5向猴CD3的結合性流式細胞儀法解析
利用流式細胞儀法，進一步確認實施例1)-6-2被判定為與人類CD3結合的抗體產生融合瘤的融合瘤所產生的抗體之對猴CD3的結合特異性。將實施例1)-6-4調製的Lenti-X293T細胞懸浮液以100μL/孔接種於96孔U底微孔盤，離心後去除上清液。對cynoCD3ε-pcDNA3.1及cynoCD3δ-pcDNA3.1導入Lenti-X293T細胞及pcDNA3.1-DEST導入Lenti-X293T細胞各自添加融合瘤培養上清液而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5% FBS的PBS洗淨1次後，添加以含有5% FBS的PBS稀釋500倍的抗大鼠IgG FITC結合物而懸浮，於4℃靜置30分鐘。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，再懸浮於含有 2μg/ml 7-胺基放射菌素D的含有5% FBS的PBS，以流式細胞儀進行檢測。資料解析係以Flowjo進行。7-胺基放射菌素D陽性的死細胞以閘門排除後，作成活細胞的FITC螢光強度的直方圖。選擇產生相對於為對照組的pcDNA3.1-DEST導入Lenti-X293T細胞之螢光強度直方圖，cynoCD3ε-pcDNA3.1及cynoCD3δ-pcDNA3.1導入Lenti-X293T細胞之直方圖向強螢光強度側位移的樣品的融合瘤，作為與猴CD3結合的抗體產生融合瘤。
1)-6-6人類CD3δ基因表現細胞之調製
將Lenti-X293T細胞接種於225cm2燒瓶使成為5.3×104細胞/cm2，於含有10%FBS的DMEM培養基中於37℃、5% CO2之條件下培養一晚。次日，各自將hCD3δ-pcDNA3.1或作為對照的pcDNA3.1-DEST，使用Lipofectamine 2000導入於Lenti-X293T細胞，於37℃、5%CO2之條件下進一步培養一晚。次日，將表現載體導入Lenti-X293T細胞，以TrypLE Express處理，以含有10%FBS的DMEM將細胞洗淨後，以含有5% FBS的PBS調製成5×106細胞/mL之濃度。將獲得的細胞懸浮液使用於流式細胞儀法解析。
1)-6-7對人類CD3δ的結合性流式細胞儀法解析
進一步利用流式細胞儀法確認於實施例1)-6-5判定為與猴CD3結合的抗體產生融合瘤的融合瘤產生的抗體之對人類CD3δ的結合特異性。將實施例1)-6-6所調製 的Lenti-X293T細胞懸浮液以100μL/孔接種於96孔U底微孔盤，離心後去除上清液。各自對hCD3δ-pcDNA3.1導入Lenti-X293T細胞及pcDNA3.1-DEST導入Lenti-X293T細胞添加融合瘤培養上清液而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5% FBS的PBS洗淨1次後，添加以含有5% FBS的PBS稀釋500倍的抗大鼠IgG FITC conjugate而懸浮，於4℃靜置30分鐘。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，再懸浮於含有2μg/ml 7-胺基放射菌素D的含有5% FBS的PBS，以流式細胞儀進行檢測。資料解析係以Flowjo進行。7-胺基放射菌素D陽性的死細胞以閘門排除後，作成活細胞的FITC螢光強度的直方圖。對為對照的pcDNA3.1-DEST導入Lenti-X293T細胞之螢光強度直方圖，產生與hCD3δ-pcDNA3.1導入Lenti-X293T細胞之直方圖向強螢光強度側位移的樣品的融合瘤排除作為與人類CD3δ結合的抗體產生融合瘤。
1)-6-8對猴T細胞株之結合性流式細胞儀法解析
將於實施例1)-6-7未被排除的抗體產生融合瘤所產生的抗體之對猴T細胞株的結合特異性利用流式細胞儀法進一步確認。將為食蟹獼猴T細胞株的HSC-F(JCRB細胞庫，No.JCRB1164)，調製為含有FBS的RPMI1640培養基中5×106細胞/mL之濃度，於96孔盤各接種100μL。於離心而去除上清液的HSC-F細胞中，添加於實施例1)-5-7未被排除的抗體產生融合瘤之培養上清液、或大鼠IgG同型對照抗體，於4℃靜置1小時。之後， 去除上清液，將孔中之細胞以含有5%FBS的PBS洗淨1次後，添加以含有5% FBS的PBS稀釋500倍的抗大鼠IgG FITC結合物而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5% FBS的PBS洗淨3次後，再懸浮於含有2μg/ml 7-胺基放射菌素D的含有5% FBS的PBS，以流式細胞儀進行檢測。資料解析係以Flowjo進行。7-胺基放射菌素D陽性的死細胞以閘門排除後，作成活細胞的FITC螢光強度的直方圖，選擇產生相對於大鼠IgG同型對照抗體之螢光強度直方圖，FITC之螢光強度的直方圖向強螢光強度側位移的樣品的融合瘤，作為亦與猴T細胞株結合的抗體產生融合瘤。
1)-7抗體之同型決定
自實施例1)-6所取得的大鼠抗CD3抗體產生融合瘤之中，挑選與人類及猴CD3ε結合，亦與猴T細胞株結合、以及暗示具有高人類T細胞活性化能力的C3-147，鑑定抗體同型。同型係利用Rat Immunoglobulin Isotyping ELISA Kit(BD Pharmingen公司)而決定。其結果，可確認大鼠抗CD3單株抗體C3-147之同型為IgG2b、λ鏈。
(實施例2)大鼠抗CD3單株抗體(C3-147)之對人類CD3的結合性研討 2)-1單株抗體自融合瘤上清液的調製 2)-1-1產生C3-147的融合瘤之培養
大鼠抗CD3單株抗體係自融合瘤培養上清液純化。首先，將C3-147產生融合瘤以ClonaCell-HY Selection Medium E(StemCell Technologies公司)使增殖至充分量後，添加20%之Ultra Low IgG FBS(Thermo Fisher Scientific公司)，與含有5μg/mL之正大黴素(Thermo Fisher Scientific公司)的Hybridoma SFM(Thermo Fisher Scientific公司)交換培養基，培養7日。回收本培養上清液，通過0.22μm的過濾器(Corning公司)進行滅菌。
2)-1-2純化
自實施例2)-1-1所調製的融合瘤之培養上清液，以Protein G親和力層析純化抗體。使抗體吸附於Protein G管柱(GE Healthcare Bioscience公司)，以PBS將管柱洗淨後，以0.1M甘胺酸/鹽酸水溶液(pH2.7)溶出。於溶出液中添加1M Tris-HCl(pH9.0)，調整為pH7.0~7.5後，以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分級分子量UF30K、Sartorius公司)進行對PBS的緩衝液置換的同時，進行抗體之濃縮，將抗體濃度調至為2mg/mL。最後，以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾，作為純化樣品。
2)-2取得大鼠抗CD3抗體(C3-147)之對人類單鏈抗原的結合 2)-2-1人類CD3εγ單鏈抗原之調製
編碼CD3ε或CD3γ的胺基酸序列係於蛋白質數據庫中發布的OTK3-人類CD3εγ單鏈抗原複合體的結晶結構(PDBID：1SY6)中使用的序列。CD3ε之羧基末端與CD3γ之胺基末端連接的連結子係使用與於參考文獻(Kim，K.S.et al.，(2000)J.Mol.Biol.302，899-916)報告者相同的26個胺基酸而成的肽連結子。編碼圖3(序列識別號4)所示的人類CD3εγ單鏈抗原的基因係5‘末端、3’末端各自附加限制酶位點BamHI、Hind III而合成(GENEART公司)。將質體pQE80L(Qiagen公司)以限制酶BamHI、Hind III消化而獲得的約4.8kb之片段、及將人類CD3εγ單鏈抗原基因以BamHI、Hind III消化而獲得的約0.6kb之片段，使用Ligation high(東洋紡)使結合，而製作大腸菌表現用質體pQE80L-scCD3εγ。生成的scCD3εγ之胺基酸序列係記載於圖4(序列識別號5)。將表現用大腸菌BL21(DE3)以表現用質體pQE80L-scCD3εγ轉形，將獲得的選殖株植菌於1L MagicMedia(Invitrogen公司)/Ultrayield燒瓶(Thomson公司)，於30℃、250rpm振盪培養21小時。回收培養後之菌體，於含1%Triton溶液的Tris緩衝液存在下，重複利用超音波均質機的菌體破碎及冷凍融解，最終地，於4℃、15000rpm，離心15分鐘，回收包涵體(inclusion body)。自包涵體的再摺疊(refolding)至純化為止係按照參考文獻(Kjer-Nielsen et al.(2004)PNAS vol.101，no.20，7675-7680)的手法來進行。惟，用於抗體管柱的抗CD3抗體係並非文獻所 使用的2C11，使用小鼠抗CD單株抗體OKT3(Sgro、Toxicology 105(1995)、23~29、Orthoclone、Janssen-Cilag公司)。
2)-2-2利用SPR與人類CD3εγ單鏈抗原的結合性
抗體與抗原之結合係使用Biacore 3000(GE Healthcare Bioscience公司)，以將抗體作為配位體而捕捉(capture)固定化的抗小鼠IgG抗體，將抗原作為分析物而測定的捕獲法來測定。抗原使用2)-2-1所調製的人類CD3εγ。通過胺偶合法將抗小鼠IgG抗體(小鼠抗體捕捉套組(Mouse Antibody Capture Kit)、GE Healthcare Bioscience公司)以約11000RU與感應器晶片CM5(GE Healthcare Bioscience)共價結合。亦同樣地固定於參考單元(reference cell)。使用HBS-EP+(10mM HEPES pH 7.4,0.15M NaCl，3mM EDTA，0.05%界面活性劑P 20)作為運行緩衝液。於將抗小鼠IgG抗體固定化的晶片上，約1分鐘添加抗體作為配位體而捕捉後，以流速30μl/分添加100nM之抗原120秒，監測抗原的結合。作為再生溶液，以流速10μl/分添加10mM glycine-HCl pH1.7 3分鐘。其結果，於C3-147，120秒後的結合訊息為34RU。
2)-3利用SPR取得大鼠抗CD3抗體(C3-147)之抗原結合部位的確認
抗原結合部位之確認方法係按照2)-2-2。其結果，於C3-147，獲得34RU之結合訊息。另一方面，作為比較例，對於為公知的抗CD3抗體的SP34(BD Pharmingen 公司)，亦同樣地進行抗原結合部位的確認。於SP34，未見到34RU之結合訊息。因此，C3-147所辨識的CD3εγ表面之結合部位顯示與SP34不同。
(實施例3)編碼大鼠抗CD3抗體(C3-147)之可變區的cDNA之鹼基序列的決定
編碼大鼠抗CD3抗體(C3-147)之可變區的cDNA之核苷酸序列係利用以下之方法決定。
3)-1 cDNA合成
將大鼠抗CD3抗體(C3-147)產生融合瘤之細胞溶解液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、250mM LiCl、5mM EDTA(pH8)、0.5%十二烷基硫酸Li(LiDS)、2.5mM二硫蘇糖醇(DTT))，與寡dT25結合的Dynabeads mRNA DIRECT Kit(Thermo Fisher Scientific公司)之磁氣珠混合，使mRNA與磁氣珠結合。其次，將磁氣珠以mRNA洗淨溶液A(10mM Tris-HCl(pH7.5)、0.15M LiCl、1mM EDTA、0.1% LiDS、0.1% TritonX-100)及cDNA合成用溶液(50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、5mM DTT、0.5mM dNTP、0.2% TritonX-100、1.2單位RNase抑制劑(Thermo Fisher Scientific公司)洗淨1次後，以添加12單位SuperScriptIII反轉錄酶(Thermo Fisher Scientific公司)的cDNA合成用溶液進行cDNA合成。接著，以3’加尾反應溶液(50mM磷酸鉀、4mM MgCl2、0.5mM dGTP、0.2% TritonX-100、1.2unit RNase inhibitor)洗淨後，添加48單位末端轉移酶，以添加重組物(Roche公司)的反應溶液進行3’加尾反應。
3)-2大鼠免疫球蛋白重、輕鏈可變區基因片段之增幅及序列決定
將磁氣珠以TE溶液(10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.1% TritonX-100)洗淨後，使用5’-RACE PCR法，進行大鼠免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因的增幅。即，將磁氣珠移至PCR反應溶液(0.2μM引子、0.2mM dNTP、0.25unit PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TAKARA公司))，將94℃ 30秒-68℃ 90秒之反應進行35次循環。使用的引子組係如下述。
重鏈基因增幅用PCR引子組
有義引子Nhe-polyC-S
5’-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3’圖5(序列識別號50)
第1次反義引子rIgγ-AS1
5’-TCACTGAGCTGGTGAGAGTGTAGAGCCC-3’圖6(序列識別號51)
第2次反義引子rIgγ-AS2
5’-TCACCGAGCTGCTGAGGGTGTAGAGCCC-3’圖7(序列識別號52)
輕鏈基因增幅用PCR引子組
有義引子Nhe-polyC-S2
5’-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3’圖8(序列識別號53)
第1次反義引子rIgL-AS1
5’-TTCCACATCACTCGGGTAGAAATCAG-3’圖9(序列識別號54)
第2次反義引子rIgγ-AS2
5’-TAACACCAGGGTAGAAATCTGTCACCAT-3’圖10(序列識別號55)
針對利用上述PCR反應增幅的片段，實施鹼基序列的序列解析。使用的引子係如下述。
重鏈定序用有義引子rIgγ-seq
5’-2TGGCTCAGGGAAATAGCC-3’圖11(序列識別號56)、
輕鏈用定序用反義引子rIgL-seq1
5’-TCCCTGGAGCTCCTCAGT-3’圖12(序列識別號57)
輕鏈用定序用反義引子rIgL-seq2
5’-GCCTTGTCAGTCTTGAGC-3’圖13(序列識別號58)
序列解析係使用基因序列解析裝置(「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems」或「Applied Biosystems 3730xl Analyzer；Applied Biosystems」)來實施，定序反應係使用Dye Terminator Cycle Sequencing System with AmpliTaq DNA polymerase(Life Technologies公司)及GeneAmp 9700(Applied Biosystems公司)。
各自將利用序列解析所決定的C3-147重鏈可變區之鹼基序列記載於圖14(序列識別號6)、胺基酸序列記 載於圖15(序列識別號7)、C3-147輕鏈可變區之鹼基序列記載於圖16(序列識別號8)、胺基酸序列記載於圖17(序列識別號9)。
(實施例4)大鼠抗CD3 scFv(C3E-7000)、及其人類化體(C3E-7034)之製作 4)-1大鼠抗CD3抗體(C3-147)scFv之製作 4)-1-1大鼠抗體CD3 scFv表現載體(pC3E-7000)之構築
於編碼插入於C3-147重鏈可變區(VH)與輕鏈可變區(VL)之間的連結子的DNA序列之前後具有15個鹼基的附加序列的DNA片段之有義寡核苷酸圖18(序列識別號10)，及合成該反義鏈寡核苷酸圖19(序列識別號11)(Sigma Aldrich公司，客製寡核苷酸受託合成服務)，調整為100pmol/μL後，各自各20μL混合，藉由於96℃10分鐘、70℃2分鐘、60℃2分鐘、40℃2分鐘、30℃2分鐘靜置，使兩者退火，而製作插入於VH與VL之間的連結子片段。其次，於源自動物細胞表現載體pcDNA-3.3TOPO(Thermo Scientific公司)的載體骨架中附加人類IgG重鏈訊息序列的方式，使用In-Fusion HD選殖套組，使以PCR增幅的DNA片段、將圖14(序列識別號6)所示的大鼠抗CD3抗體C3-147之VH以PCR增幅的DNA片段、於VH與VL之間插入的連結子片段、將圖16(序列識別號8)所示的C3-147之包含VL的區域 中使編碼FLAG-His標籤的DNA序列附加於羧基末端的PCR增幅的DNA片段結合，而製作將圖20(序列識別號14)之核苷酸序列含於ORF的scFv表現載體pC3E-7000。
4)-1-2大鼠抗CD3 scFv(C3E-7000)之表現‧純化
Expi293F細胞(Thermo Scientific公司)係按照手冊，進行繼代、培養。於對數增殖期之Expi293F細胞導入上述之scFv表現載體，使暫時性表現，過濾器過濾後，用於純化。純化係以使用His Trap excel(GE Healthcare公司)的Ni親和力層析、及使用Superdex 200increase(GE Healthcare公司)的膠體過濾的2階段步驟進行，回收相當於scFv單體分子量的峰，作為純化蛋白質樣品。於純化，使用AKTA層析系統，將全部的步驟於4℃下進行。純化蛋白質之緩衝液係使用HBSor(25mM組胺酸/5%山梨糖醇、pH5.0)。純化蛋白質樣品係供給於分析用SEC，決定純度及濃度後，使用於各種分析。C3E-7000之胺基酸序列係記載於圖21(序列識別號15)。
4)-2大鼠抗CD3 scFv(C3E-7000)之人類化 4)-2-1抗CD3抗體之人類化設計
大鼠抗體之可變區的分子模擬係按照作為同源模擬(homology modeling)之公知方法(Methods in Enzymology，203，121-153，(1991))，使用市售的蛋白質立體結構解析程式Discovery Studio3.5(Dassault系統公司)進行。
人類化係依據作為CDR接枝(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))之一般公知方法進行。受體抗體係基於由KABAT et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))中已確定的人類之亞群‧一致(consensus)序列或Germline序列的框架區內之胺基酸同一性或被期待的免疫原性預測分數及物性等而選擇。又，利用以上述手法構築的3次元結構模型，參考由Queen et al.(PNAS(1989)86，10029-10033)提出的基準等，選擇返回變異。
4)-2-2 C3E-7000之人類化胺基酸序列之設計
基於實施例4)-2-1記載的手法，將人類之亞群‧一致序列之γ3及λ6作為受體，設計成為C3E-7000之人類化體的C3E-7034之胺基酸序列。圖15(序列識別號7)所示的C3-147VH之胺基酸序列中，伴隨將胺基酸編號第16位之精胺酸取代為甘胺酸、胺基酸編號第17位之丙胺酸取代為絲胺酸、胺基酸編號第19位之離胺酸取代為精胺酸、胺基酸編號第23位之纈胺酸取代為丙胺酸、胺基酸編號第24位之纈胺酸取代為丙胺酸、將胺基酸編號第88位之絲胺酸取代為丙胺酸、將胺基酸編號第93位之蘇胺酸取代為纈胺酸的設計的C3E-7034VH之胺基酸序列，記載於圖22(序列識別號16)。
圖17(序列識別號9)所示的C3-147VL之胺基酸序列中，伴隨將胺基酸編號第1位的麩醯胺酸取代為天冬醯胺酸、胺基酸編號第3位之纈胺酸取代為甲硫胺酸、胺基酸編號第8位之天冬醯胺酸取代為組胺酸、將胺基酸編號第12位的蘇胺酸取代為麩胺酸、將胺基酸編號第13位之天冬醯胺酸取代為絲胺酸、胺基酸編號第14位之白胺酸取代為脯胺酸、胺基酸編號第16位之蘇胺酸取代為離胺酸、胺基酸編號第19位之麩胺酸取代為蘇胺酸、將胺基酸編號第20位之白胺酸取代為異白胺酸、將胺基酸編號第43位之精胺酸取代為絲胺酸、將胺基酸編號第75位之白胺酸取代為絲胺酸、將胺基酸編號第79位之天冬醯胺酸取代為絲胺酸、將胺基酸編號第81位的纈胺酸取代為白胺酸、將胺基酸編號第82位的麩醯胺酸取代為離胺酸設計的C3E-7034VL之胺基酸序列，記載於圖23(序列識別號17)。IMGT之CDR定義中的C3E-7000及C3E-7034之CDR序列係各自將CDR-H1記載於圖24(序列識別號26)、CDR-H2記載於圖25(序列識別號27)、CDR-H3記載於圖26(序列識別號28)、CDR-L1記載於圖27(序列識別號29)、CDR-L2記載於圖28(序列識別號30)、CDR-L3記載於圖29(序列識別號31)。
4)-2-3人類化抗CD3 scFvC3E-7034之改變
為了製作維持對猴CD3ε的交叉性，同時於結合活性、細胞毒性性活性具有差異的變異體，對C3E-7034之VL，與實施例4)-2-1記載之手法同樣地將VL之框架 區的胺基酸，設計scFv之VL(於IGLV1-40＊01置入A2S、S8P、V13A、F80L之4個變異的序列)被取代的變異體。
4)-2-3-1 C3E-7035之胺基酸序列設計
設計成為C3E-7034之變異體的C3E-7035之胺基酸序列。圖23(序列識別號17)所示的C3E-7034之輕鏈中，伴隨將可變區之胺基酸編號第1位的天冬醯胺酸取代為麩醯胺酸、胺基酸編號第2位的苯丙胺酸取代為丙胺酸、胺基酸編號第3位之甲硫胺酸取代為纈胺酸、胺基酸編號第8位之組胺酸取代為絲胺酸、胺基酸編號第12位的麩胺酸取代為甘胺酸、胺基酸編號第13位之絲胺酸取代為纈胺酸、胺基酸編號第16位之離胺酸取代為麩醯胺酸、胺基酸編號第17位之蘇胺酸取代為精胺酸、胺基酸編號第40位之組胺酸取代為白胺酸、胺基酸編號第41位的麩胺酸取代為脯胺酸、胺基酸編號第43位之絲胺酸取代為蘇胺酸、胺基酸編號第44位之絲胺酸取代為丙胺酸、胺基酸編號第46位之蘇胺酸取代為離胺酸、胺基酸編號第47位之蘇胺酸取代為白胺酸、胺基酸編號第48位之異白胺酸取代為白胺酸、胺基酸編號第57位之天冬胺酸取代為絲胺酸、胺基酸編號第60位之絲胺酸取代為脯胺酸、胺基酸編號第67位之異白胺酸取代為離胺酸、刪除胺基酸編號第68位之天冬胺酸、刪除胺基酸編號第69位之精胺酸、胺基酸編號第71位的絲胺酸取代為甘胺酸、胺基酸編號第72位的離胺酸取代為蘇胺酸、 胺基酸編號第77位之蘇胺酸取代為丙胺酸、胺基酸編號第79位之絲胺酸取代為蘇胺酸、胺基酸編號第80位之天冬醯胺酸取代為甘胺酸、胺基酸編號第81位的白胺酸取代為苯丙胺酸、胺基酸編號第82位的離胺酸取代為麩醯胺酸、胺基酸編號第83位之蘇胺酸取代為丙胺酸、胺基酸編號第90位之苯丙胺酸取代為酪胺酸的設計的C3E-7035輕鏈之胺基酸序列，記載於圖30(序列識別號20)，輕鏈之可變區的正前方插入甲硫胺酸及丙胺酸的C3E-7035之全長序列，記載於圖31(序列識別號22)。
4)-2-3-2 C3E-7036之胺基酸序列設計
設計成為C3E-7034之變異體的C3E-7036之胺基酸序列。伴隨圖23(序列識別號17)所示的C3E-7034之輕鏈中可變區之胺基酸編號第8位之組胺酸取代為絲胺酸、胺基酸編號第12位的麩胺酸取代為甘胺酸、胺基酸編號第13位之絲胺酸取代為纈胺酸、胺基酸編號第16位之離胺酸取代為麩醯胺酸、胺基酸編號第17位之蘇胺酸取代為精胺酸、胺基酸編號第23位之離胺酸取代為蘇胺酸、胺基酸編號第24位之精胺酸取代為甘胺酸、胺基酸編號第40位之組胺酸取代為白胺酸、胺基酸編號第41位的麩胺酸取代為脯胺酸、胺基酸編號第43位之絲胺酸取代為蘇胺酸、胺基酸編號第44位之絲胺酸取代為丙胺酸、胺基酸編號第46位之蘇胺酸取代為離胺酸、胺基酸編號第47位之蘇胺酸取代為白胺酸、胺基酸編號第48位之異白胺酸取代為白胺酸、胺基酸編號第57位之 天冬胺酸取代為絲胺酸、胺基酸編號第60位之絲胺酸取代為脯胺酸、胺基酸編號第67位之異白胺酸取代為離胺酸、刪除胺基酸編號第68位之天冬胺酸、刪除胺基酸編號第69位之精胺酸、胺基酸編號第71位的絲胺酸取代為甘胺酸、胺基酸編號第72位的離胺酸取代為蘇胺酸、胺基酸編號第77位之蘇胺酸取代為丙胺酸、胺基酸編號第79位之絲胺酸取代為蘇胺酸、胺基酸編號第80位之天冬醯胺酸取代為甘胺酸、胺基酸編號第81位的白胺酸取代為苯丙胺酸、胺基酸編號第82位的離胺酸取代為麩醯胺酸、胺基酸編號第83位之蘇胺酸取代為丙胺酸、胺基酸編號第90位之苯丙胺酸取代為酪胺酸的設計的C3E-7036輕鏈之胺基酸序列，係記載於圖32(序列識別號23)，C3E-7036之全長胺基酸序列記載於圖33(序列識別號25)。
4)-2-3-3 CDR變異體之胺基酸序列設計
於去除C3E-7034之CDRH2(圖25、序列識別號27)存在的脫胺基化部位的目的，設計圖22(序列識別號16)所示的C3E-7034之重鏈可變區之胺基酸編號第53位之天冬醯胺酸取代為精胺酸的C3E-7078、及絲胺酸被取代的C3E-7079。又，設計C3E-7036之重鏈可變區之胺基酸編號第53位之天冬醯胺酸取代為精胺酸的C3E-7085。C3E-7078之全長胺基酸序列記載於圖_68(序列識別號60)，C3E-7079之全長胺基酸序列記載於圖70(序列識別號62)，C3E-7085之全長胺基酸序列記載於圖72(序列識別號64)。
再者，於使C3E-7078之人類CD3親和性降低的目的，設計C3E-7078之輕鏈可變區之胺基酸編號第52位的天冬胺酸取代為甘胺酸的C3E-7086、麩醯胺酸被取代的C3E-7087、天冬醯胺酸被取代的C3E-7088、絲胺酸被取代的C3E-7089、丙胺酸被取代的C3E-7090。同樣地，於使C3E-7079之人類CD3親和性降低的目的，設計將C3E-7079之輕鏈可變區之胺基酸編號第52位的天冬胺酸取代為甘胺酸的C3E-7091、麩醯胺酸被取代的C3E-7092、天冬醯胺酸被取代的C3E-7093、絲胺酸被取代的C3E-7094、丙胺酸被取代的C3E-7095。C3E-7086之全長胺基酸序列係記載於圖74(序列識別號66)，C3E-7087之全長胺基酸序列記載於圖76(序列識別號68)，C3E-7088之全長胺基酸序列記載於圖78(序列識別號70)，C3E-7089之全長胺基酸序列記載於圖80(序列識別號72)，C3E-7090之全長胺基酸序列記載於圖82(序列識別號74)，C3E-7091之全長胺基酸序列記載於圖84(序列識別號76)，C3E-7092之全長胺基酸序列記載於圖86(序列識別號78)，C3E-7093之全長胺基酸序列記載於圖88(序列識別號80)，C3E-7094之全長胺基酸序列記載於圖90(序列識別號82)，C3E-7095之全長胺基酸序列記載於圖92(序列識別號84)。
4)-3人類化抗CD3 scFv(C3E-7034、C3E-7035，C3E-7036)之製作 4)-3-1人類化抗CD3 scFv(C3E-7034)表現載體pC3E-7034之構築
合成於圖22(序列識別號16)所示的C3E-7034重鏈之羧基末端介隔15個胺基酸可撓性的連結子而將圖23(序列識別號17)所示的包含C3E-7034輕鏈的區域連接的scFvDNA序列、及包含前後15個鹼基的附加序列的DNA片段(GENEART公司)。將此作為模板而將C3E-7034及包含前後附加序列的區域使用PCR法增幅，獲得插入DNA片段。又以實施例4)-1-1所製作的表現載體pC3E-7000為模板，將除去scFv區域的載體區域使用PCR法增幅，獲得載體片段。各自之DNA片段使用In-Fusion HD選殖套組(CLONTECH公司)而使結合，製作包含圖34(序列識別號18)之核苷酸序列於ORF的人類化抗CD3 scFv表現載體pC3E-7034。
4)-3-2人類化抗CD3 scFv(C3E-7035)表現載體pC3E-7035之構築
合成圖22(序列識別號16)所示的C3E-7034重鏈之羧基末端介隔17個胺基酸所構成的可撓性連結子而將圖30(序列識別號20)所示的C3E-7035輕鏈連結的scFvDNA序列及包含前後15個鹼基的附加序列的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例4)-3-1相同的方法，構築包含圖35(序列識別號21)之核苷酸序列於ORF的C3E-7035表現載體。將獲得的表現載體命名為「pC3E-7035」。
4)-3-2人類化抗CD3 scFv(C3E-7036)表現載體pC3E-7036之構築
合成圖22(序列識別號16)所示的C3E-7034重鏈之羧基末端介隔15個所構成的可撓性連結子而將圖32(序列識別號23)所示的C3E-7036輕鏈連結的scFvDNA序列及包含前後15個鹼基之附加序列的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例4)-3-1同樣之方法，構築包含圖36(序列識別號24)之核苷酸序列於ORF的C3E-7036表現載體。將獲得的表現載體命名為「pC3E-7036」。
4)-3-4CDR改變人類化抗體CD3 scFv之表現載體的構築
將包含圖34(序列識別號18)所示的C3E-7034之核苷酸序列於ORF的pC3E-7034作為模板，使用具有圖93、94(序列識別號85、86)所示的鹼基序列的引子，進行使用PCR的部位特異的變異導入，製作包含將C3E-7034之重鏈可變區之胺基酸編號第53位之天冬醯胺酸取代為精胺酸的C3E-7078之核苷酸序列於ORF的C3E-7078表現載體。將獲得的表現載體命名為「pC3E-7078」。同樣地，將pC3E-7034作為模板，將圖95、96(序列識別號87、88)作為引子，進行使用PCR的部位特異的變異導入，製作包含將C3E-7034之重鏈可變區之胺基酸編號第53位之天冬醯胺酸取代為絲胺酸的C3E-7079之核苷酸序列於ORF的C3E-7079表現載體。 將獲得的表現載體命名為「pC3E-7079」。同樣地，將pC3E-7036作為模板，將圖93、94(序列識別號85、86)作為引子，進行使用PCR的部位特異的變異導入，製作包含將C3E-7036之重鏈可變區之胺基酸編號第53位之天冬醯胺酸取代為精胺酸的C3E-7085之核苷酸序列於ORF的C3E-7085表現載體。將獲得的表現載體命名為「pC3E-7085」。
將包含C3E-7078之輕鏈可變區之胺基酸編號第52位的天冬胺酸取代為甘胺酸的C3E-7086、麩醯胺酸被取代的C3E-7087、天冬醯胺酸被取代的C3E-7088、絲胺酸被取代的C3E-7089、丙胺酸被取代的C3E-7090之各核苷酸序列於ORF的表現載體、及包含C3E-7079之輕鏈可變區之胺基酸編號第52位的天冬胺酸取代為甘胺酸的C3E-7091、麩醯胺酸被取代的C3E-7092、天冬醯胺酸被取代的C3E-7093、絲胺酸被取代的C3E-7094、丙胺酸被取代的C3E-7095之各核苷酸序列於ORF的表現載體亦以同樣手法製作。將製作的載體名、模板、引子之一覽各自一起記載於表1，引子列表一起記載於圖105。
Figure 106145218-A0202-12-0115-301
4)-3-5人類化抗CD3 scFv之表現‧純化
C3E-7034、C3E-7035、C3E-7036之表現‧純化係以與實施例4)-1-2同樣之方法進行。
4)-3-6 CDR改變人類化抗CD3 scFv之表現‧純化
C3E-7078、C3E-7079、C3E-7085、C3E-7086、C3E-7087、C3E-7088、C3E-7089、C3E-7090、C3E-7091、C3E-7092、C3E-7093、C3E-7094、C3E-7095之各CDR變異體的表現‧純化係以與實施例4)-1-2同樣之方法進行。
(實施例5)人類化抗CD3 scFv(C3E-7034)之結晶結構解析 5)-1人類化抗CD3 scFv(C3E-7034)-人類CD3εγ單鏈抗原複合體之調製
將實施例2)-2-1所製作的CD3εγ與實施例4)-3-1所製作的C3E-7034以莫耳比1：2混合，於AmiconUltra15 MWCO 10kilo(Millipore公司)，將緩衝液置換為10mM Tris HCl(pH7.5)、50mM NaCl，濃縮成3.5mg/mL。使用Superdex200 10/300GL(GE Healthcare)將此以膠體過濾層析純化，使用AmiconUltra15MWCO 10kilo(Millipore公司)將複合體的級分濃縮成約4.0mg/mL。
5)-2結晶化
將獲得的CD3εγ與C3E-7034之複合體利用蒸氣擴散法加以結晶化。將於蛋白質溶液0.5μL中等量添加沉澱劑溶液(0.1M MES單水合物(pH 6.5)、1.6M硫酸銨、10% v/v 1,4-二
Figure 106145218-A0202-12-0116-2
烷)的溶液，收取於置入0.05mL之沉澱劑溶液的密閉容器使兩溶液未接觸，於25℃靜置。1個月後，獲得0.1mm×0.05mm×0.05mm的棒狀晶。
5)-3 X射線結晶結構解析與抗原決定位的鑑定
將獲得的結晶浸入全氟聚醚(Perfluoropolyether)PFO-X175/08(Hampton Research)，接著以液態氮冷凍。 以光束線BL41XU(SPring-8，Hyogo)收集X射線繞射資料。自獲得的繞射像，使用軟體imosflm(CCP4：Collaborative Computational Project No.4)將繞射強度數值化，求得結晶結構因子。結晶為六方晶系，空間群為P62，結晶之單位格子係a=193.54Å、b=193.54Å、c=43.88Å。
使用獲得的結構因子與同源模擬之三次元結構座標，進行分子置換法，而決定位相。於計算使用軟體phaser(CCP4：Collaborative Computational Project No.4)。結晶係於非對稱單位含有1個複合體。
使用軟體Refmac5(CCP4：Collaborative Computational Project No.4)進行結構的精密化，使用軟體coot進行模型的修正。重複進行此操作，於3.3Å分解能，獲得最終之R值22.1%、free R值27.0%。最終的模型係包含C3E-7034之輕鏈區域(圖23、序列識別號17)之胺基酸殘基1-108、C3E-7034之重鏈區域(圖22、序列識別號16)之胺基酸殘基1-118、CD3ε區域(圖1、序列識別號1)之胺基酸殘基33-67及71-118、及CD3γ區域(圖37、序列識別號3)之胺基酸殘基23-103。CD3ε區域(圖1、序列識別號1)之胺基酸殘基68-70、及C3E-7034(圖38、序列識別號19)之胺基末端區域(胺基酸殘基1)、連結子部分(胺基酸殘基120-134)、及羧基末端區域(胺基酸殘基243-269)因各自電子密度不明瞭而未構築模型。複合體全體之絲帶模型(ribbon model)及表面示於圖39。
於圖40呈示CD3ε與C3E-7034之輕鏈及重鏈的相互作用。A組係C3E-7034之離輕鏈可變區4Å以內的距離的CD3ε之胺基酸殘基以粗棒模型表示，除此以外的胺基酸殘基以細棒模型表示的圖。於圖中四方形內標示殘基名及殘基編號的Ser55、Glu56、Arg101、Gly102、Ser103、Lys104、及Pro105係C3E-7034之離輕鏈可變區4Å以內的距離的CD3ε之胺基酸殘基，各胺基酸編號對應序列表之序列識別號1。B組係C3E-7034之離重鏈可變區4Å以內的距離的CD3ε之胺基酸殘基以粗棒模型表示，除此以外之胺基酸以細棒模型表示的圖。於圖中，四方形內標示的殘基名及殘基編號的Ser55、Glu56、Leu58、Trp59、Asn65、Ile66、Ser77、Asp78、及Arg101為CD3ε之胺基酸，各胺基酸編號對應序列表之序列識別號1。離C3E-70344Å以內之距離，解釋為對C3E-7034的CD3ε之抗原決定位的胺基酸殘基係如下：Ser55、Glu56、Leu58、Trp59、Asn65、Ile66、Ser77、Asp78、Arg101、Gly102、Ser103、Lys104、及Pro105。
對C3E-7034的CD3ε之抗原決定位中，Arg101、Gly102、Ser103、Lys104、及Pro105亦為共通對OKT3及UCHT1的CD3ε的抗原決定位殘基(Kjer-Nielsen et al.，PNAS 101(2004)，p.7675-80；Arnett et al.，PNAS 101(2004)，p.16268-73)。又，C3E-7034係證明與相當於包含WO2008/119565A2記載的I2C、H2C等的抗CD3抗體之抗原決定位的序列識別號1中的胺基酸編號22至48未相互作用。於圖41，CD3ε之序列上呈現相互作用 殘基。CD3ε之訊息序列以斜體表示，離C3E-7034之4Å以內距離的胺基酸畫下線表示。
(實施例6)人類化OKT3 scFv之製作 6)-1 OKT3 scFv表現載體pC3E-3000之構築
以與實施例4)-1-1同樣之手法，製作小鼠抗CD3單株抗體OKT3(Sgro、Toxicology 105(1995)、23~29、Orthoclone、Janssen-Cilag公司)之scFv，導入源自pcDNA3.3的動物細胞表現載體。將獲得的表現載體命名為「pC3E-3000」。
6)-2 OKT3 scFv(C3E-3000)之人類化胺基酸序列之設計
基於實施例4)-2-1記載之手法，將人類的亞群‧一致序列的gamma1及kappa4作為受體，設計成為OKT3的人類化體的C3E-3007之胺基酸序列。又，考量對免疫原性評分及物性的影響，於一部分處所導入kappa1的胺基酸。圖42(序列識別號36)所示的OKT3之重鏈中，將伴隨可變區之胺基酸編號第5位之麩醯胺酸取代為纈胺酸、胺基酸編號第11位的白胺酸取代為絲胺酸、胺基酸編號第12位的丙胺酸取代為離胺酸、胺基酸編號第13位之精胺酸取代為離胺酸、胺基酸編號第20位之甲硫胺酸取代為纈胺酸、胺基酸編號第38位之離胺酸取代為精胺酸、胺基酸編號第40位之精胺酸取代為丙胺酸、胺基酸編號第48位之異白胺酸取代為甲硫胺酸、胺基酸編號 第67位之離胺酸取代為精胺酸、胺基酸編號第68位之丙胺酸取代為纈胺酸、胺基酸編號第70位之白胺酸取代為異白胺酸、胺基酸編號第72位的蘇胺酸取代為丙胺酸、胺基酸編號第76位之絲胺酸取代為蘇胺酸、胺基酸編號第82位的麩醯胺酸取代為麩胺酸、胺基酸編號第87位之蘇胺酸取代為精胺酸、胺基酸編號第91位的絲胺酸取代為蘇胺酸、胺基酸編號第114位之蘇胺酸取代為白胺酸、胺基酸編號第115位之白胺酸取代為纈胺酸的設計的C3E-3007重鏈之胺基酸序列係記載於圖43(序列識別號38)。
圖44(序列識別號37)所示的OKT3之輕鏈可變區之中，伴隨將胺基酸編號第3位之纈胺酸取代為麩醯胺酸、胺基酸編號第4位之白胺酸取代為甲硫胺酸、胺基酸編號第9位之丙胺酸取代為絲胺酸、胺基酸編號第10位之異白胺酸取代為絲胺酸、胺基酸編號第11位的甲硫胺酸取代為白胺酸、胺基酸編號第12位的絲胺酸取代為丙胺酸、胺基酸編號第13位之丙胺酸取代為纈胺酸、胺基酸編號第15位之脯胺酸取代為白胺酸、胺基酸編號第18位之離胺酸取代為精胺酸、胺基酸編號第19位之纈胺酸取代為丙胺酸、胺基酸編號第21位的甲硫胺酸取代為異白胺酸、胺基酸編號39位之絲胺酸取代為脯胺酸、胺基酸編號第41位的蘇胺酸取代為離胺酸、胺基酸編號第42位的絲胺酸取代為丙胺酸、胺基酸編號第59位之丙胺酸取代為天冬胺酸、胺基酸編號第60位之組胺酸取代為精胺酸、胺基酸編號第62位的精胺酸取代為絲胺 酸、胺基酸編號第69位之絲胺酸取代為天冬胺酸、胺基酸編號第70位之酪胺酸取代為苯丙胺酸、胺基酸編號第71位的絲胺酸取代為蘇胺酸、胺基酸編號第76位之甘胺酸取代為絲胺酸、胺基酸編號第77位之甲硫胺酸取代為白胺酸、胺基酸編號第78位之麩胺酸取代為麩醯胺酸、胺基酸編號第82位的丙胺酸取代為纈胺酸、胺基酸編號第99位之絲胺酸取代為麩醯胺酸、胺基酸編號第103位之白胺酸取代為纈胺酸的設計的C3E-3007輕鏈之胺基酸序列，記載於圖45(序列識別號39)。
6)-3人類化OKT3 scFv(C3E-3007)表現載體pC3E-3007之構築
合成於圖43(序列識別號38)所示的C3E-3007重鏈之羧基末端介隔15個胺基酸可撓性連結子而包含圖45(序列識別號39)所示的C3E-3007輕鏈區域連結的scFvDNA序列及包含前後15個鹼基之附加序列的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例4)-3-1同樣之方法，構築包含圖46(序列識別號34)之核苷酸序列於ORF的C3E-3007表現載體。將獲得的表現載體命名為「pC3E-3007」。
6)-4人類化OKT3 scFv(C3E-3007)之表現‧純化
C3E-3007之表現‧純化係以與實施例4)-1-2同樣之方法進行。C3E-3007之胺基酸序列係記載於圖47(序列識別號35)。
(實施例7)人類化抗CD3 scFv之活體外活性 7)-1人類化抗CD3 scFv(C3E-3007、C3E-7034、C3E-7035、C3E-7036)之與人類CD3的結合性研討 7)-1-1人類化抗CD3 scFv(C3E-3007、C3E-7034、C3E-7035、C3E-7036)之利用流式細胞儀法的對人類CD3的結合性研討
以含有市售人類PBMC(CTL公司)的5% FBS的PBS調製為適當濃度，添加LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher Scientific公司)與抗CD19抗體(Beckman Coulter公司)，於4℃靜置30分鐘。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，以含有5% FBS的PBS調製成1×106細胞/mL之濃度，以100μL/孔接種於96孔U底微孔盤，離心後去除上清液。添加含有5% FBS的PBS稀釋的人類化抗CD3 scFv(C3E-3007、C3E-7034、C3E-7035、C3E-7036)100μL/孔，於4℃靜置60分鐘。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，添加以含有5% FBS的PBS稀釋的Penta-His Alexa Fluor 488(QIAGEN公司)30μL/孔，於4℃靜置30分鐘。含有5% FBS的PBS洗淨2次後，以含有5% FBS的PBS再懸浮，以流式細胞儀(FACSCanto(商標)II：BD公司)進行檢出。資料解析以Flowjo(Treestar公司)進行，算出去除死細胞與CD19陽性細胞的級份的Alexa Fluor 488之平均螢光強度 (MFI)，自scFv添加樣品的MFI值減去抗體未添加樣品的MFI值，計算MFI值之相對值(rMFI)。如圖48所示，人類化抗CD3 scFv顯示與人類CD3結合。
7)-1-2人類化抗CD3 scFv(C3E-3007、C3E-7034、C3E-7035、C3E-7036)之利用SPR對人類CD3的結合性研討
人類化抗CD3 scFv(C3E-3007、C3E-7034、C3E-7035、C3E-7036)之對CD3的親和力係利用使用BIAcore T-200(GE Healthcare公司)的表面電漿共振法來決定。使5個不同濃度的scFv流入固定在感應器晶片上的CD3，自獲得的反應推定Rmax，取1/2的抗體濃度作為scFv對CD3的解離常數。其結果，該scFv之對CD3的解離常數係各自為400、4.5、22、25nM。
7)-2人類化抗CD3 scFv(C3E-3007、C3E-7034、C3E-7036)之與食蟹獼猴CD3的結合性研討 7)-2-1食蟹獼猴PBMC之調製
使用SepMate(STEMCELL公司)與Lymphocyte Separation Solution(Nacalai Tesque公司)，自食蟹獼猴之血液，按照通常方法採取PBMC。
7)-2-2人類化抗CD3 scFv(C3E-3007、C3E-7034、C3E-7035、C3E-7036)之利用流式細胞儀法的對食蟹獼猴CD3之結合性研討
將實施例7)-2-1所取得的食蟹獼猴PBMC以含有5% FBS的PBS調製為適當濃度，以與實施例7)-1-1同樣的方法，實施染色、解析。如圖49所示，呈現人類化抗CD3 scFv(C3E-7034、C3E-7035、C3E-7036)與食蟹獼猴CD3結合。
7)-3人類化抗CD3 scFv(C3E-3007、C3E-7034)之T細胞活性化
將人類末梢血單核細胞(PBMC)，藉由使用Lympholyte-H(Cedarlane公司)的濃度梯度密度分離法，自隨機捐贈者的新鮮血沉棕黃層(buffy coat)單離。以LR10(含有10% ultra low IgG之FBS RPMI1640(Thermo Fisher Scientific公司))，將稀釋為100nM的人類化抗CD3 scFv(C3E-3007、C3E-7034)、與相同濃度之抗His抗體(Qiagen公司)同量混和。將人類或猴PBMC以LR10調製為2×105細胞，於96孔U底微孔盤，與混合抗His抗體混和的人類化抗CD3 scFv同量混和，於37℃24小時、5%CO2條件下培養。反應結束後，離心，添加分選緩衝液(sorter buffer)(HBSS(-)(Thermo Fisher Scientific公司)、0.1% BSA(Sigma-Aldrich公司)、0.1%疊氮化鈉(Sigma-Aldrich公司))，離心後，於細胞中添加LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher Scientific公司)，於4℃靜置20分鐘。以篩選緩衝液洗淨後，添加經分選緩衝液稀釋的PE標示的抗CD69抗體(Becton、Dickinson公司)、FITC標示的抗CD8 抗體(Becton、Dickinson公司)，於4℃靜置20分鐘。以分選緩衝液洗淨後，以含有1%聚甲醛(paraformaldehyde)的PBS(和光純藥工業公司)再懸浮，以流式細胞儀(FACSCanto II：Becton、Dickinson公司)進行檢出。資料解析係以Flowjo(Treestar公司)進行，自去除死細胞的級分，算出CD8高表現且PE高表現級分的比率作為來自母集團的百分率(母體的%，% of parents)。如圖50所示，人類化抗CD3 scFv係呈現將人類及猴CD8高表現細胞加以活性化。
7)-4 CDR改變人類化抗CD3 scFv之利用流式細胞儀法的對人類及食蟹獼猴CD3之結合性比較
將實施例7)-1-1取得的人類PBMC、及7)-2-1取得的食蟹獼猴PBMC以含有5% FBS的PBS調製成適當濃度，以與實施例7)-1-1同樣之方法染色，實施解析。如圖106所示，確認CDR改變人類化抗CD3 scFv之對人類及猴CD3的結合性。
(實施例8)人類化抗TROP2 scFv之製作 8)-1 HT1-11 scFv表現載體pHT1-11scFv之構築
合成包含編碼圖51(序列識別號41)所示的HT1-11 scFv之胺基酸的DNA序列的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，藉由插入源自pcDNA-3.3TOPO(Thermo Scientific公司) 的載體合成的DNA片段，構築包含圖52(序列識別號40)所示的核苷酸序列於ORF的人類化抗TROP2 scFv表現載體pHT1-11scFv。
8)-2 HT1-11 scFv之表現‧純化
HT1-11scFv之表現‧純化係以與實施例4)-1-2同樣之方法進行。
(實施例9)人類化抗TROP2 scFv(HT1-11scFv)之利用流式細胞儀法的對人類TROP2之結合性評價
將咽頭扁平上皮癌細胞株FaDu(ATCC)與胰臟癌細胞株HPAF-II(ATCC)以含有5% FBS的PBS調製為適當濃度，添加LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit，於4℃靜置30分鐘。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，以含有5% FBS的PBS調製為1×106細胞/mL之濃度，以100μL/孔接種於96孔U底微孔盤，離心後去除上清液。以100μL/孔添加含有5% FBS的PBS稀釋的人類化抗TROP2 scFv(HT1-11scFv)，於4℃靜置60分鐘。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，以含有5% FBS的PBS稀釋的Penta-His Alexa Fluor 488添加30μL/孔，於4℃靜置30分鐘。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，以含有5% FBS的PBS再懸浮，以流式細胞儀(FACSCanto(商標)II)進行檢出。資料解析以Flowjo進行，算出去除死細胞的級分之Alexa Fluor 488之平均螢光強度(MFI)，自scFv添加樣品的MFI值減去抗體未添 加樣品的MFI值，計算MFI值之相對值(rMFI)。如圖53所示，呈現人類化抗TROP2 scFv與人類TROP2結合。
(實施例10)抗TROP2-CD3雙特異性分子之製作 10)-1抗TROP2-CD3雙特異性分子表現載體之構築 10)-1-1 HT1-11scFv/C3E-7034雙特異性分子(T2C-0001)表現載體的構築
將實施例8)-1製作的pHT1-11scFv作為模板，使用設計用於於5’側連繫HT1-11scFv與人類抗體重鏈訊息序列之一部分、於3’側連繫scFv間的連結子的引子，進行PCR，獲得插入DNA片段。又將4)-3-1所製作的表現載體pC3E-7034作為模板，使用訊息序列、及編碼抗CD3 scFv之胺基末端序列的引子，進行PCR，獲得包含含有抗CD3 scFv的載體全區域的載體DNA片段。將各自之DNA片段使用In-Fusion HD選殖套組(CLONTECH公司)而使結合，製作包含圖54(序列識別號42)之核苷酸序列於ORF的抗TROP2-CD3雙特異性分子表現載體pT2C-0001。
10)-1-2 HT1-11scFv/C3E-3007雙特異性分子(T2C-0003)表現載體之構築
以實施例10)-1-1同樣之方法，構築包含圖55(序列識別號44)之核苷酸序列於ORF的抗TROP2-CD3雙特異 性分子表現載體。惟，作為製作載體片段之際的模板，使用pC3E-3007。將獲得的表現載體命名為「pT2C-0003」。
10)-1-3 HT1-11scFv/C3E-7035雙特異性分子(T2C-0005)表現載體之構築
以與實施例10)-1-1同樣之方法，構築包含圖56(序列識別號46)之核苷酸序列於ORF的抗TROP2-CD3雙特異性分子表現載體。惟，作為製作載體片段之際的模板，使用pC3E-7035。將獲得的表現載體命名為「pT2C-0005」。
10)-1-4 HT1-11scFv/C3E-7036雙特異性分子(T2C-0006)表現載體之構築
以與實施例10)-1-1同樣之方法，構築包含圖57(序列識別號48)之核苷酸序列於ORF的抗TROP2-CD3雙特異性分子表現載體。惟，作為製作載體片段之際的模板，使用pC3E-7036。將獲得的表現載體命名為「pT2C-0006」。
10)-2抗TROP2-CD3雙特異性分子之表現‧純化
T2C-0001、T2C-0003、T2C-0005、T2C-0006之表現‧純化係以與實施例4)-1-2同樣之方法進行。T2C-0001之胺基酸序列記載於圖58(序列識別號43)。T2C-0003之胺基酸序列記載於圖59(序列識別號45)。T2C-0005 之胺基酸序列記載於圖60(序列識別號47)。T2C-0006之胺基酸序列記載於圖61(序列識別號49)。
(實施例11)抗TROP2-CD3雙特異性分子之活體外活性評價 11)-1利用SPR的結合活性評價 11)-1-1抗TROP2-CD3雙特異性分子之對TROP2的結合
雙特異性分子與TROP2之結合係使用BIAcore 3000(GE Healthcare Bioscience公司)，對以抗人類IgG抗體捕捉(capture)的抗原，以將雙特異性分子作為分析物而測定的捕捉法來測定。抗原係使用重組人類TROP-2/人類IgG F融合體(R&D系統)。通過胺偶合法將抗人類IgG(Fc)抗體(人類抗體捕捉套組(Human Antibody Capture Kit)、GE Healthcare Bioscience公司)以約2000RU與感應器晶片CM5(GE Healthcare Bioscience公司)共價結合。亦同樣地固定於參考單元。使用HBS-P(10mM HEPES pH7.4、0.15M NaCl，0.005%界面活性劑P20)作為運行緩衝液。雙特異性分子係自200nM以2倍稀釋調製至1nM。將抗人類IgG(Fc)抗體固定化的晶片上，以約30秒添加1μg/ml之抗原後，以流速30μl/分300秒添加各濃度之雙特異性分子，接著監測600秒鐘的解離相。作為再生溶液，30秒鐘添加3M氯化鎂溶液。於資料的解析，使用分析軟體(BIAevaluation軟體， 版本4.1.1)之1：1結合模型，算出結合速度常數ka、解離速度常數kd及解離常數(KD；KD=kd/ka)。
11)-1-2抗TROP2-CD3雙特異性分子之對人類CD3εγ單鏈抗原的結合
雙特異性分子與CD3εγ抗原之結合係使用BIAcore3000(GE Healthcare Bioscience公司)，對固定化的抗原，以將抗體作為分析物而測定的方法，進行測定。抗原使用2)-2-1所調製的人類CD3εγ單鏈抗原，以胺偶合法使約100RU與感應器晶片CM5(GE Healthcare Bioscience公司)共價結合。於參考單元未添加抗原蛋白而僅進行固定化處理。使用HBS-P(10mM HEPES pH7.4、0.15M NaCl，0.005%界面活性劑P20)作為運行緩衝液。雙特異性分子係自最高濃度1μM以2倍稀釋至4nM，或自200nM以2倍稀釋至1nM調製。於將抗原固定化的晶片上，以流速10μl/分添加各濃度之雙特異性分子25分鐘，偵測結合量。作為再生溶液，添加10mM甘胺酸鹽酸溶液pH1.5 30秒。於資料解析，使用分析軟體(BIAevaluation軟體，版本4.1.1)，自各濃度中的結合量算出解離常數KD。將結果示於表2、表3。
Figure 106145218-A0202-12-0130-2
Figure 106145218-A0202-12-0131-3
11)-2利用流式細胞儀法的結合活性評價 11)-2-1抗TROP2-CD3雙特異性分子之對TROP2的結合
使用與實施例9同樣之癌細胞株，以同樣的方法實施染色、解析。如圖62所示，呈現抗TROP2-CD3雙特異性分子與TROP2結合。
11)-2-2抗TROP2-CD3雙特異性分子之對人類CD3εγ單鏈抗原的結合
以與實施例7)-1-1同樣之方法實施染色、解析。如圖63所示，呈示抗TROP2-CD3雙特異性分子與人類CD3εγ單鏈抗原結合。
11)-2-3抗TROP2-CD3雙特異性分子之對食蟹獼猴CD3抗原的結合
將實施例7)-2-1取得的食蟹獼猴PBMC以含有5% FBS的PBS調製成適當濃度，以與實施例7)-1-1同樣之方法實施染色、解析。如圖64所示，呈現抗TROP2-CD3雙特異性分子(T2C-0001、T2C-0005、T2C-0006)與食蟹獼猴CD3抗原結合。
11)-3抗TROP2-CD3雙特異性分子之細胞毒性活性評價 11)-3-1標的細胞中的TROP2的表現解析
咽頭扁平上皮癌細胞株FaDu(ATCC)、胰臟癌細胞株HPAF-II(ATCC)、及人類肺癌細胞株Calu-6以含有5% FBS的PBS調製成適當濃度，添加LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit(活/死可固定死细胞染料套組)(Thermo Fisher Scientific公司)，於4℃靜置30分鐘。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，以含有5% FBS的PBS調製成2×106細胞/mL之濃度，以100μL/孔接種於96孔U底微孔盤，離心後去除上清液。25μL/孔添加以含有5% FBS的PBS稀釋的抗TROP2 Alexa Fluor 488抗體(eBioscience公司)及同型對照(Isotype Control)抗體(eBioscience公司)，於4℃靜置30分鐘。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，以含有5% FBS的PBS再懸浮，以流式細胞儀(Cytomics FC500、BeckmanCoulter公司)進行檢出。資料解析以Flowjo(Treestar公司)進行，算出死細胞去除級分之Alexa Fluor 488的幾何學的平均螢光強度(geometric MFI)。如圖65(A、B、C)所示，於FaDu、及HPAF-II，觀察到TROP2的表現；於Calu-6未觀察到表現。
11)-3-2標的細胞之調製
將FaDu、HPAF-II、及Calu-6以含有10%的RPMI1640培養基(Thermo Fisher Scientific公司)調製成2×106細胞/mL之濃度，細胞懸浮液每1mL添加100μL之Chromium-51 Radionuclide(PerkinElmer公司)，於37℃、5% CO2的條件下，培養2小時。以含有10% FBS的RPMI1640培養基洗淨2次後，以含有10% FBS的RPMI1640培養基再懸浮成2×105細胞/mL者使用作為標的細胞。
11)-3-3效應細胞之調製
將市售的冷凍PBMC(Cellular Technology Limited公司)於37℃解凍，移至於含有10% FBS的RPMI1640培養基中添加Anti-aggregate Wash試藥(Cellular Technology Limited公司)的溶液，洗淨2次後，以含有10% FBS的RPMI1640培養基調製成1×106細胞/mL，作為效應細胞(effector cell)。
11)-3-4細胞毒性試驗
將實施例11)-3-2取得的FaDu、HPAF-II、及Calu-6以50μL/孔添加於96孔U底微孔盤。於其中以50μL/孔添加調製為各濃度的各種抗TROP2-CD3雙特異性分子，以100μL/孔添加於11)-3-1-3調製的效應細胞，於室溫1000rpm×1分鐘離心後，於37℃、5% CO2之條件，培養20-24小時。將上清液50μL回收於固態閃爍定量盤(LumaPlate)(PerkinElmer公司)，於50℃使乾燥約2小時 後，以平盤讀數機(TopCount：PerkinElmer公司)測定。細胞溶解率係亦下式算出。
細胞溶解率(%)=(A-B)/(C-B)×100
A：樣品孔的計數
B：背景(抗體非添加孔)計數的平均值(n=3)。於抗體添加時，添加50μL試驗用培養基。除此以外，與樣品孔進行同樣的操作。
C：最大放出(以界面活性劑使標的細胞溶解的孔)計數的平均值(n=3)。於抗體添加時添加試驗培養基50μL。界面活性劑係添加100μL，與樣品孔同樣地，將50μL分移至固態閃爍定量盤而實施測定。
如圖66(A、B、C)所示，顯示FaDu、及對HPAF-II的各種TROP2-CD3雙特異性分子之細胞毒性活性)。另一方面，未觀察對Calu-6的細胞毒性活性。
(實施例12)抗Axl-CD3雙特異性分子之製作 12)-1抗Axl-CD3雙特異性分子表現載體之構築 12)-1-1 11D5-T3scFv/C3E-7034雙特異性分子(AXC-0001)表現載體之構築
將於h#11D5-T3H(記載於歐州專利申請公開第2270053號說明書之圖12)之N末端添加甘胺酸的序列、及h#11D5-T3L(記載於歐州專利申請公開第2270053號說明書之圖6)之序列，介隔由(GGGGS)三次重複序列所 構成的多肽連結子而連結的抗Axl單鏈抗體，設計11D5-T3scFv之胺基酸序列，合成編碼此之核苷酸序列(GENEART,Thermo Fisher Science公司)。將其作為模板，使用設計的引子使於5‘側附加人類抗體重鏈訊息序列之一部分，於3’側附加連繫scFv間的連結子，而進行PCR，獲得插入DNA片段。又將於4)-3-1製作的表現載體pC3E-7034作為模板，藉由PCR法，使用人類抗體重鏈訊息序列、及編碼抗CD3 scFv的核苷酸序列而成的引子，將包含抗CD3 scFv的載體全區域增幅，獲得載體DNA片段。將各自之DNA片段，使用In-Fusion HD選殖套組(CLONTECH公司)而結合，製作包含圖97(序列識別號89)所示的核苷酸序列於ORF的抗Axl-CD3雙特異性分子表現載體pAXC-0001。
12)-1-2 11D5-T3scFv/C3E-7036雙特異性分子(AXC-0002)表現載體之構築
以與實施例10)-1-1同樣之方法，構築於圖99(序列識別號91)所示的核苷酸序列含於ORF的抗Axl-CD3雙特異性分子表現載體。惟，製作載體片段之際，使用pC3E-7036作為模板。將獲得的表現載體命名為「pAXC-0002」。
12)-2抗Axl-CD3雙特異性分子之表現‧純化
AXC-0001、AXC-0002之表現‧純化係以與實施例4)-1-2同樣之方法進行。AXC-0001之胺基酸序列記載於 圖98(序列識別號90)。AXC-0002之胺基酸序列記載於圖100(序列識別號92)。
(實施例13)抗Axl-CD3雙特異性分子之活體外活性評價 13)-1標的細胞中的Axl之表現解析
將人類肺癌細胞株A549(ATCC)、人類胰臟癌細胞株PANC-1(ATCC)、MIA PaCa-2(ATCC)、人類骨髓瘤細胞株U266B1(ATCC)、套膜細胞淋巴瘤細胞株Jeko-1(ATCC)以含有5% FBS的PBS調製成適當濃度，添加LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher Scientific公司)，於4℃靜置30分鐘。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，以含有5% FBS的PBS調製成2×106細胞/mL之濃度，以100μL/孔接種於96孔U底微孔盤，離心後去除上清液。以25μL/孔添加以含有5% FBS的PBS稀釋的抗Axl抗體(RD-系統公司)及Isotype Control抗體(RD-系統公司)，於4℃靜置30分鐘。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，25μL/孔添加以含有5% FBS的PBS稀釋的Alexa Fluor488抗小鼠IgG抗體(Thermo Fisher Scientific公司)，於4℃靜置30分鐘。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，以含有5% FBS的PBS再懸浮，以流式細胞儀(Cytomics FC500、BeckmanCoulter公司)進行檢測。資料解析係以Flowjo(Treestar公司)進行，算出死細胞去除級分的Alexa Fluor 488之幾何學的平均螢光強度(geometric MFI)。如圖107(A、B、C、D、E)所示，於 A549、PANC-1、及MIA PaCa-2觀察到Axl的表現，於U266B1、Jeko-1未觀察到表現。
13)-2標的細胞之調製
將A549、PANC-1、MIA PaCa-2、U266B1、及Jeko-1以含有10% FBS的RPMI1640培養基(Thermo Fisher Scientific公司)調製成2×106細胞/mL之濃度，細胞懸浮液每1mL添加100μL之Chromium-51 Radionuclide(PerkinElmer公司)，於37℃、5% CO2之條件下培養2小時。以含有10%的FBS的RPMI1640培養基洗淨2次後，使用以含有10% FBS的RPMI1640培養基再懸浮成2×105細胞/mL者作為標的細胞。
13)-3效應細胞之調製
將市售的冷凍PBMC(Cellular Technology Limited公司)於37℃解凍，移至於含有10% FBS的RPMI1640培養基中添加Anti-aggregate Wash試藥(Cellular Technology Limited公司)的溶液洗淨2次後，以含有10% FBS的RPMI1640培養基調製成1×106細胞/mL，作為效應細胞。
13)-4細胞毒性試驗
將實施例13)-2取得的A549、PANC-1、MIA PaCa-2、U266B1、及Jeko-1以50μL/孔添加於96孔U底微孔盤。於其中以50μL/孔添加調製成各濃度的各種抗Axl-CD3雙特異性分子，以100μL/孔添加13)-3調製的效應細胞， 於室溫下離心1000rpm×1分鐘離心後，於37℃、5% CO2之條件下培養20-24小時。將上清液50μL回收於固態閃爍定量盤(PerkinElmer公司)，於50℃使乾燥約2小時後，以平盤讀數機(TopCount：PerkinElmer公司)測定。細胞溶解率係以下式算出。
細胞溶解率(%)=(A-B)/(C-B)×100
A：樣品孔的計數。
B：背景(抗體非添加孔)計數的平均值(n=3)。抗體添加時，添加50μL試驗用培養基。除此以外與樣品孔進行同樣的操作。
C：最大放出(以界面活性劑使標的細胞溶解的孔)計數的平均值(n=3)。抗體添加時添加50μL試驗培養基。界面活性劑係添加100μL，與樣品孔同樣地，將50μL分移至固態閃爍定量盤而實施測定。
如圖108(A、B、C、D、E)所示，呈現各種抗Axl-CD3雙特異性分子對A549、PANC-1、及MIA PaCa-2的細胞毒性活性。另一方面，未觀察到對U266B1、及Jeko-1的細胞毒性活性。
(實施例14)抗HLA-A2/MAGEC1-CD3雙特異性分子表現載體之製作 14)-1抗HLA-A2/MAGEC1-CD3雙特異性分子表現載體之構築 14)-1-1 MAG-032scFv/C3E-7034雙特異性分子(MGC-0001)表現載體之構築
HLA-A2/MAGEC1特異性結合的MAG-032 scFv係由人類抗體噬菌體庫取得。將編碼MAG-032 scFv之胺基酸序列的核苷酸序列作為模板，使用設計的引子的PCR法，於5‘側附加人類抗體重鏈訊息序列之一部分，於3’側附加連繫scFv間的連結子、及編碼C3E-7034之一部分的核苷酸序列，獲得包含編碼MAG-032 scFv之胺基酸序列的核苷酸序列的插入DNA片段。又將於4)-3-1製作的表現載體pC3E-7034作為模板，使用由人類抗體重鏈訊息序列、及編碼抗CD3 scFv之胺基末端序列的核苷酸序列構成的引子，利用PCR法將包含抗CD3 scFv的載體全區域增幅，獲得載體DNA片段。將各自的DNA片段使用In-Fusion HD選殖套組(CLONTECH公司)而使結合，製作包含圖101(序列識別號93)所示的核苷酸序列於ORF的抗HLA-A2/MAGEC1-CD3雙特異性分子表現載體pMGC-0001。
14)-1-2 MAG-032scFv/C3E-7036雙特異性分子(MGC-0002)表現載體之構築
以與實施例14)-1-1同樣之方法，構築包含圖103(序列識別號95)所示的核苷酸序列於ORF的抗HLA-A2/MAGEC1-CD3雙特異性分子表現載體。惟，使用製作載體片段之作為模板之pC3E-7036。將獲得的表現載體命名為「pMGC-0002」。
14)-2抗HLA-A2/MAGEC1-CD3雙特異性分子之表現‧純化
MGC-0001、MGC-0002之表現‧純化係以與實施例4)-1-2同樣之方法進行。MGC-0001之胺基酸序列係記載於圖102(序列識別號94)。MGC-0002之胺基酸序列係記載於圖104(序列識別號96)。
(實施例15)抗HLA-A2/MAGEC1-CD3雙特異性分子之活體外活性評價 15)-1標的細胞中的HLA-A2/MAGEC1之表現解析
將人類淋巴母細胞融合細胞株T2(ATCC)細胞以含有20%FBS的AIM-V培養基(Thermo Fisher Scientific公司)調整為適當濃度，添加圖106(序列識別號97)MAGEC1肽(Sigma Genosys公司)、或DMSO，於37℃培育4小時。以含有20%FBS的AIM-V培養基洗淨2次後，以含有5% FBS的PBS調製為適當濃度，添加LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher Scientific公司)，於4℃靜置30分鐘。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，以含有5% FBS的PBS調製為2×106細胞/mL之濃度，以100μL/孔接種於96孔U底微孔盤，離心後去除上清液。以25μL/孔添加以含有5% FBS的PBS稀釋的抗HLA-A2/MAGEC1抗體(MAG032 scFv)，於4℃靜置30分鐘。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後， 以含有5% FBS的PBS稀釋。以25μL/孔添加Penta-His Alexa Fluor 488(QIAGEN公司)，於4℃靜置30分鐘。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，以含有5% FBS的PBS再懸浮，以流式細胞儀(Cytomics FC500、BeckmanCoulter公司)進行檢測。資料解析係以Flowjo(Treestar公司)進行，算出死細胞去除級分的Alexa Fluor 488之幾何學的平均螢光強度(geometric MFI)。如圖109(A、B)所示，於添加MAGEC1肽的T2細胞觀察到HLA-A2/MAGEC1的表現，於添加DMSO的T2細胞未觀察到表現。
15)-2標的細胞之調製
將T2細胞以含有20%FBS的AIM-V培養基(Thermo Fisher Scientific公司)調整為適當濃度，添加MAGEC1肽、或DMSO，於37℃培育4小時。以含有10% FBS的RPMI1640培養基(Thermo Fisher Scientific公司)調製成2×106細胞/mL之濃度，細胞懸浮液每1mL添加100μL之Chromium-51 Radionuclide(PerkinElmer公司)，於37℃、5% CO2之條件下培養2小時。以含有10% FBS的RPMI1640培養基洗淨2次後，使用以含有10% FBS的RPMI1640培養基再懸浮成2×105細胞/mL者作為標的細胞。
15)-3效應細胞之調製
將市售的冷凍PBMC(Cellular Technology Limited公司)於37℃解凍，移至於含有10% FBS的RPMI1640培養 基添加Anti-aggregate Wash試藥(Cellular Technology Limited公司)的溶液，洗淨2次後，以含有10% FBS的RPMI1640培養基調製成1×106細胞/mL，作為效應細胞。
15)-4細胞毒性試驗
將實施例15)-2取得的T2細胞以50μL/孔添加於96孔U底微孔盤。以50μL/孔於其中添加調製為各濃度的各種抗HLA-A2/MAGEC1-CD3雙特異性分子，以100μL/孔添加15)-3所調製的效應細胞，於室溫1000rpm×1分鐘離心後，於37℃、5% CO2之條件下培養20-24小時。將上清液50μL回收於固態閃爍定量盤(PerkinElmer公司)，於50℃使乾燥約2小時後，以平盤讀數機(TopCount：PerkinElmer公司)測定。細胞溶解率係以下式算出。
細胞溶解率(%)=(A-B)/(C-B)×100
A：樣品孔的計數。
B：背景(抗體非添加孔)計數的平均值(n=3)。於抗體添加時，添加50μL試驗用培養基。除此以外與樣品孔進行同樣的操作。
C：最大放出(以界面活性劑使標的細胞溶解的孔)計數的平均值(n=3)。抗體添加時添加50μL的試驗培養基。界面活性劑係添加100μL，與樣品孔同樣地，將50μL分移至固態閃爍定量盤而實施測定。
如圖110(A、B)所示，呈現各種抗HLA-A2/MAGEC1-CD3雙特異性分子對添加MAGEC1肽 的T2細胞的細胞毒性活性。另一方面，未觀察到對添加DMSO的T2細胞的細胞毒性活性。
產業上之可利用性
本發明之人類化抗CD3抗體因與人類CD3結合，同時亦與食蟹獼猴CD3結合，適合使用於醫藥之開發用的非臨床試驗。
[序列表之非關鍵詞文字]
序列識別號1：人類CD3ε之胺基酸序列
序列識別號2：人類CD3δ之胺基酸序列
序列識別號3：人類CD3γ之胺基酸序列
序列識別號4：編碼人類CD3εγ單鏈抗原的核苷酸序列
序列識別號5：His-scCD3抗原之胺基酸序列
序列識別號6：編碼C3-147之重鏈可變區的核苷酸序列
序列識別號7：(C3-147_VH AA)：C3-147之重鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號8：(C3-147_VL DNA)：編碼C3-147之輕鏈可變區的核苷酸序列
序列識別號9：(C3-147_VL AA)：C3-147之輕鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號10：(G4S連結子有義(sence))：
序列識別號11：(G4S連結子反義(antisence))：
序列識別號12：(C3E-7000_VH AA)：C3E-7000之重鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號13：(C3E-7000_VL AA)：C3E-7000之輕鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號14：(C3E-7000 ORF)：編碼C3E-7000的核苷酸序列
序列識別號15：(C3E-7000 AA)：C3E-7000之胺基酸序列
序列識別號16：(C3E-7034_VH AA)：C3E-7034之重鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號17：C3E-7034之輕鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號18：(C3E-7034 ORF)：編碼C3E-7034的核苷酸序列
序列識別號19：(C3E_7034 AA)：C3E-7034之胺基酸序列
序列識別號20：(C3E-7035_VL AA)：C3E-7035之輕鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號21：(C3E-7035 ORF)：編碼C3E-7035的核苷酸序列
序列識別號22：(C3E_7035 AA)：C3E-7035之胺基酸序列
序列識別號23：(C3E-7036_VL_AA)：C3E-7036之輕鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號24：(C3E-7036 ORF)：編碼C3E-7036的核苷酸序列
序列識別號25：(C3E_7036 AA)：C3E-7036之胺基酸序列
序列識別號26：(7000_CDR-H1)：C3E-7000系之CDR-H1之胺基酸序列
序列識別號27：(7000_CDR-H2)：C3E-7000系之CDR-H2之胺基酸序列
序列識別號28：(7000_CDR-H3)：C3E-7000系之CDR-H3之胺基酸序列
序列識別號29：(7000_CDR-L1)：C3E-7000系之CDR-L1之胺基酸序列
序列識別號30：(7000_CDR-L2)：C3E-7000系之CDR-L2之胺基酸序列
序列識別號31：(7000_CDR-L3)：C3E-7000系之CDR-L3之胺基酸序列
序列識別號32：(C3E-3000 ORF)：編碼OKT3 scFv的核苷酸序列
序列識別號33：(C3E-3000 AA)：OKT3 scFv之胺基酸序列
序列識別號34：(C3E-3007 ORF)：編碼C3E-3007 scFv的核苷酸序列
序列識別號35：(C3E-3007 AA)：C3E-3007 scFv之胺基酸序列
序列識別號36：(C3E-3000_VH AA)：OKT3之重鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號37：(C3E-3000_VL AA)：OKT3之輕鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號38：(C3E-3007_VH AA)：C3E-3007之重鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號39：(C3E-3007_VL AA)：C3E-3007之輕鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號40：(HT1-11 ORF)：編碼HT1-11 scFv的核苷酸序列
序列識別號41：(HT1-11 AA)：HT1-11 scFv之胺基酸序列
序列識別號42：(T2C-0001 ORF)：編碼T2C-0001的ORF核苷酸序列
序列識別號43：(T2C-0001 AA)：T2C-0001之胺基酸序列
序列識別號44：(T2C-0003 ORF)：編碼T2C-0003的ORF核苷酸序列
序列識別號45：(T2C-0003 AA)：T2C-0003之胺基酸序列
序列識別號46：(T2C-0005 ORF)：編碼T2C-0005的ORF核苷酸序列
序列識別號47：(T2C-0005 AA)：T2C-0005之胺基酸序列
序列識別號48：(T2C-0006 ORF)：編碼T2C-0006的ORF核苷酸序列
序列識別號49：(T2C-0006 AA)：T2C-0006之胺基酸序列
序列識別號50：重鏈基因增幅用有義引子之胺基酸序列
序列識別號51：重鏈基因增幅用第1次反義引子之核苷酸序列
序列識別號52：重鏈基因增幅用第2次反義引子之核苷酸序列
序列識別號53：輕鏈基因增幅用有義引子之核苷酸序列
序列識別號54：輕鏈基因增幅用第1次反義引子之核苷酸序列
序列識別號55：輕鏈基因增幅用第2次反義引子之核苷酸序列
序列識別號56：重鏈定序用有義引子之核苷酸序列
序列識別號57：輕鏈定序用反義引子1之核苷酸序列
序列識別號58：輕鏈定序用反義引子2之核苷酸序列
序列識別號59：編碼C3E-7078的ORF核苷酸序列
序列識別號60：C3E-7078之胺基酸序列
序列識別號61：編碼C3E-7079的ORF核苷酸序列
序列識別號62：C3E-7079之胺基酸序列
序列識別號63：編碼C3E-7085的ORF核苷酸序列
序列識別號64：C3E-7085之胺基酸序列
序列識別號65：編碼C3E-7086的ORF核苷酸序列
序列識別號66：C3E-7086之胺基酸序列
序列識別號67：編碼C3E-7087的ORF核苷酸序列
序列識別號68：C3E-7087之胺基酸序列
序列識別號69：編碼C3E-7088的ORF核苷酸序列
序列識別號70：C3E-7088之胺基酸序列
序列識別號71：編碼C3E-7089的ORF核苷酸序列
序列識別號72：C3E-7089之胺基酸序列
序列識別號73：編碼C3E-7090的ORF核苷酸序列
序列識別號74：C3E-7090之胺基酸序列
序列識別號75：編碼C3E-7091的ORF核苷酸序列
序列識別號76：C3E-7091之胺基酸序列
序列識別號77：編碼C3E-7092的ORF核苷酸序列
序列識別號78：C3E-7092之胺基酸序列
序列識別號79：編碼C3E-7093的ORF核苷酸序列
序列識別號80：C3E-7093之胺基酸序列
序列識別號81：編碼C3E-7094的ORF核苷酸序列
序列識別號82：C3E-7094之胺基酸序列
序列識別號83：編碼C3E-7095的ORF核苷酸序列
序列識別號84：C3E-7095之胺基酸序列
序列識別號85：HN53R Fw之核苷酸序列
序列識別號86：HN53R Rv之核苷酸序列
序列識別號87：HN53S Fw之核苷酸序列
序列識別號88：HN53S Rv之核苷酸序列
序列識別號89：(AXC-0001 ORF)：編碼AXC-0001的ORF核苷酸序列
序列識別號90：(AXC-0001 AA)：AXC-0001之胺基酸序列
序列識別號91：(AXC-0002 ORF)：編碼AXC-0002的ORF核苷酸序列
序列識別號92：(AXC-0002 AA)：AXC-0002之胺基酸序列
序列識別號93：(MGC-0001 ORF)：編碼MGC-0001的ORF核苷酸序列
序列識別號94：(MGC-0001 AA)：MGC-0001之胺基酸序列
序列識別號95：(MGC-0002 ORF)：編碼MGC-0002的ORF核苷酸序列
序列識別號96：(MGC-0002 AA)：MGC-0002之胺基酸序列
序列識別號97：(MAGEC1肽)：MAGEC1肽之胺基酸序列
序列識別號98：(變異體之CDRH2)：CDR變異體CDRH2之胺基酸序列
序列識別號99：(變異體之CDRL2)：CDR變異體CDRL2之胺基酸序列
序列識別號100：(C3E-7034變異體之VH)：C3E-7034之CDR變異體之重鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號101：(C3E-7034變異體之VL)：C3E-7034之CDR變異體之輕鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號102：(C3E-7035變異體之VL)：C3E-7035之CDR變異體之輕鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號103：(C3E-7036變異體之VL)：C3E-7036之CDR變異體之輕鏈可變區之胺基酸序列
<110> 第一三共股份有限公司(DAIICHI SANKYO COMPANY,LIMITED)
<120> 抗CD3抗體及含有該抗體的分子、及其製造方法
<130> FP1729
<140> TW106145218
<141> 2017-12-22
<150> JP2016-249148
<151> 2016-12-22
<160> 103
<170> PatentIn版本3.5
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<211> 207
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Figure 106145218-A0305-02-0153-1
Figure 106145218-A0305-02-0154-3
<210> 2
<211> 171
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Figure 106145218-A0305-02-0154-4
Figure 106145218-A0202-12-0153-7
<210> 3
<211> 182
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Figure 106145218-A0202-12-0153-8
Figure 106145218-A0202-12-0154-9
<210> 4
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ε γ DNA
<400> 4
Figure 106145218-A0202-12-0154-10
<210> 5
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-scCD3 AA
<400> 5
Figure 106145218-A0202-12-0154-11
Figure 106145218-A0202-12-0155-12
<210> 6
<211> 354
<212> DNA
<213> 擬鯉(Rutilus rutilus)
<400> 6
Figure 106145218-A0202-12-0155-13
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 擬鯉(Rutilus rutilus)
<400> 7
Figure 106145218-A0202-12-0156-14
<210> 8
<211> 327
<212> DNA
<213> 擬鯉(Rutilus rutilus)
<400> 8
Figure 106145218-A0202-12-0156-15
<210> 9
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3-147_VL AA
<400> 9
Figure 106145218-A0202-12-0157-16
<210> 10
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G4S連結子有義
<400> 10
Figure 106145218-A0202-12-0157-17
<210> 11
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G4sS連結子反義
<400> 11
Figure 106145218-A0202-12-0158-18
<210> 12
<211> 118
<212> PRT
<213> 擬鯉(Rutilus rutilus)
<400> 12
Figure 106145218-A0202-12-0158-19
<210> 13
<211> 109
<212> PRT
<213> 擬鯉(Rutilus rutilus)
<400> 13
Figure 106145218-A0202-12-0158-20
Figure 106145218-A0202-12-0159-21
<210> 14
<211> 867
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7000 ORF
<400> 14
Figure 106145218-A0202-12-0159-300
Figure 106145218-A0202-12-0160-23
<210> 15
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7000 AA
<400> 15
Figure 106145218-A0202-12-0160-24
Figure 106145218-A0202-12-0161-25
<210> 16
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7034_VH AA
<400> 16
Figure 106145218-A0202-12-0161-26
Figure 106145218-A0202-12-0162-27
<210> 17
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7034_VL AA
<400> 17
Figure 106145218-A0202-12-0162-28
<210> 18
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7034 ORF
<400> 18
Figure 106145218-A0202-12-0162-30
Figure 106145218-A0202-12-0163-31
<210> 19
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7034 AA
<400> 19
Figure 106145218-A0202-12-0163-32
Figure 106145218-A0202-12-0164-33
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7035_VL AA
<400> 20
Figure 106145218-A0202-12-0164-34
Figure 106145218-A0202-12-0165-35
<210> 21
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7035 ORF
<400> 21
Figure 106145218-A0202-12-0165-36
Figure 106145218-A0202-12-0166-37
<210> 22
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7035 AA
<400> 22
Figure 106145218-A0202-12-0166-38
Figure 106145218-A0202-12-0167-39
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7036_VL AA
<400> 23
Figure 106145218-A0202-12-0167-40
<210> 24
<211> 858
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7036 ORF
<400> 24
Figure 106145218-A0202-12-0168-41
<210> 25
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7036 AA
<400> 25
Figure 106145218-A0202-12-0168-42
Figure 106145218-A0202-12-0169-43
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7000_CDR-H1
<400> 26
Figure 106145218-A0202-12-0170-44
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7000_CDR-H2
<400> 27
Figure 106145218-A0202-12-0170-45
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7000_CDR-H3
<400> 28
Figure 106145218-A0202-12-0170-46
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7000_CDR-L1
<400> 29
Figure 106145218-A0202-12-0170-47
<210> 30
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7000_CDR-L2
<400> 30
Figure 106145218-A0202-12-0171-48
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7000_CDR-L3
<400> 31
Figure 106145218-A0202-12-0171-49
<210> 32
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-3000 ORF
<400> 32
Figure 106145218-A0202-12-0171-50
Figure 106145218-A0202-12-0172-51
<210> 33
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-3000 AA
<400> 33
Figure 106145218-A0202-12-0172-52
Figure 106145218-A0202-12-0173-53
<210> 34
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-3007 ORF
<400> 34
Figure 106145218-A0202-12-0173-54
Figure 106145218-A0202-12-0174-55
<210> 35
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-3007 AA
<400> 35
Figure 106145218-A0202-12-0174-56
Figure 106145218-A0202-12-0175-57
<210> 36
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-3000_VH AA
<400> 36
Figure 106145218-A0202-12-0175-58
Figure 106145218-A0202-12-0176-59
<210> 37
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-3000_VL AA
<400> 37
Figure 106145218-A0202-12-0176-60
<210> 38
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-3007_VH AA
<400> 38
Figure 106145218-A0202-12-0176-61
Figure 106145218-A0202-12-0177-62
<210> 39
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-3007_VL AA
<400> 39
Figure 106145218-A0202-12-0177-63
Figure 106145218-A0202-12-0178-64
<210> 40
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HT1-11 scFv ORF
<400> 40
Figure 106145218-A0202-12-0178-67
<210> 41
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HT1-11 scFv AA
<400> 41
Figure 106145218-A0202-12-0178-66
Figure 106145218-A0202-12-0179-68
Figure 106145218-A0202-12-0180-69
<210> 42
<211> 1614
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2C-0001 ORF
<400> 42
Figure 106145218-A0202-12-0180-70
Figure 106145218-A0202-12-0181-71
<210> 43
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2C-0001 AA
<400> 43
Figure 106145218-A0202-12-0181-72
Figure 106145218-A0202-12-0182-73
Figure 106145218-A0202-12-0183-74
<210> 44
<211> 1647
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2C-0003 ORF
<400> 44
Figure 106145218-A0202-12-0183-76
Figure 106145218-A0202-12-0184-77
<210> 45
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2C-0003 AA
<400> 45
Figure 106145218-A0202-12-0184-78
Figure 106145218-A0202-12-0185-79
Figure 106145218-A0202-12-0186-80
Figure 106145218-A0202-12-0187-81
<210> 46
<211> 1614
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2C-0005 ORF
<400> 46
Figure 106145218-A0202-12-0187-82
Figure 106145218-A0202-12-0188-83
<210> 47
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2C-0005 AA
<400> 47
Figure 106145218-A0202-12-0188-84
Figure 106145218-A0202-12-0189-85
Figure 106145218-A0202-12-0190-86
<210> 48
<211> 1608
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2C-0006 ORF
<400> 48
Figure 106145218-A0202-12-0190-87
Figure 106145218-A0202-12-0191-88
<210> 49
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2C-0006 AA
<400> 49
Figure 106145218-A0202-12-0191-89
Figure 106145218-A0202-12-0192-90
Figure 106145218-A0202-12-0193-91
Figure 106145218-A0202-12-0194-92
<210> 50
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nhe-polyC-S
<220>
<221> 各種不能歸類的特徵
<222> (37)..(37)
<223> n為a、c、g或t
<400> 50
Figure 106145218-A0202-12-0194-93
<210> 51
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rIg γ-AS1
<400> 51
Figure 106145218-A0202-12-0194-94
<210> 52
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rIg γ-AS2
<400> 52
Figure 106145218-A0202-12-0194-95
<210> 53
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nhe-polyC-S2
<220>
<221> 各種不能歸類的特徵
<222> (37)..(37)
<223> n為a、c、g或t
<400> 53
Figure 106145218-A0202-12-0195-96
<210> 54
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rIgL-AS1
<400> 54
Figure 106145218-A0202-12-0195-97
<210> 55
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rIgL-AS2
<400> 55
Figure 106145218-A0202-12-0195-98
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rIg γ-seq
<400> 56
Figure 106145218-A0202-12-0195-99
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rIgL-seq1
<400> 57
Figure 106145218-A0202-12-0195-100
<210> 58
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rIgL-seq2
<400> 58
Figure 106145218-A0202-12-0196-101
<210> 59
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7078 ORF
<400> 59
Figure 106145218-A0202-12-0196-102
<210> 60
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7078 AA
<400> 60
Figure 106145218-A0202-12-0197-103
Figure 106145218-A0202-12-0198-104
<210> 61
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7079 ORF
<400> 61
Figure 106145218-A0202-12-0198-105
<210> 62
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7079 AA
<400> 62
Figure 106145218-A0202-12-0199-106
Figure 106145218-A0202-12-0200-107
<210> 63
<211> 858
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7085 ORF
<400> 63
Figure 106145218-A0202-12-0200-108
<210> 64
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7085 AA
<400> 64
Figure 106145218-A0202-12-0201-109
Figure 106145218-A0202-12-0202-110
<210> 65
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7086 ORF
<400> 65
Figure 106145218-A0202-12-0202-111
<210> 66
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7086 AA
<400> 66
Figure 106145218-A0202-12-0203-112
Figure 106145218-A0202-12-0204-113
<210> 67
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7087 ORF
<400> 67
Figure 106145218-A0202-12-0204-114
<210> 68
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7087 AA
<400> 68
Figure 106145218-A0202-12-0205-115
Figure 106145218-A0202-12-0206-116
<210> 69
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7088 ORF
<400> 69
Figure 106145218-A0202-12-0206-117
<210> 70
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7088 AA
<400> 70
Figure 106145218-A0202-12-0207-118
Figure 106145218-A0202-12-0208-119
<210> 71
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7089 ORF
<400> 71
Figure 106145218-A0202-12-0208-120
<210> 72
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7089 AA
<400> 72
Figure 106145218-A0202-12-0209-121
Figure 106145218-A0202-12-0210-122
<210> 73
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7090 ORF
<400> 73
Figure 106145218-A0202-12-0210-123
<210> 74
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7090 AA
<400> 74
Figure 106145218-A0202-12-0211-124
Figure 106145218-A0202-12-0212-125
<210> 75
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7091 ORF
<400> 75
Figure 106145218-A0202-12-0212-126
<210> 76
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7091 AA
<400> 76
Figure 106145218-A0202-12-0213-127
Figure 106145218-A0202-12-0214-128
<210> 77
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7092 ORF
<400> 77
Figure 106145218-A0202-12-0214-129
<210> 78
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7092 AA
<400> 78
Figure 106145218-A0202-12-0215-130
Figure 106145218-A0202-12-0216-131
<210> 79
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7093 ORF
<400> 79
Figure 106145218-A0202-12-0216-132
<210> 80
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7093 AA
<400> 80
Figure 106145218-A0202-12-0217-133
Figure 106145218-A0202-12-0218-134
<210> 81
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7094 ORF
<400> 81
Figure 106145218-A0202-12-0218-135
<210> 82
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7094 AA
<400> 82
Figure 106145218-A0202-12-0219-136
Figure 106145218-A0202-12-0220-137
<210> 83
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7095 ORF
<400> 83
Figure 106145218-A0202-12-0220-139
<210> 84
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7095 AA
<400> 84
Figure 106145218-A0202-12-0221-140
Figure 106145218-A0202-12-0222-141
<210> 85
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HN53R Fw
<400> 85
Figure 106145218-A0202-12-0222-142
<210> 86
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HN53R Rv
<400> 86
Figure 106145218-A0202-12-0222-143
<210> 87
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HN53S Fw
<400> 87
Figure 106145218-A0202-12-0222-144
<210> 88
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HN53S Rv
<400> 88
Figure 106145218-A0202-12-0222-145
<210> 89
<211> 1590
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AXC-0001 ORF
<400> 89
Figure 106145218-A0202-12-0223-146
Figure 106145218-A0202-12-0224-147
<210> 90
<211> 511
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AXC-0001 AA
<400> 90
Figure 106145218-A0202-12-0224-148
Figure 106145218-A0202-12-0225-149
Figure 106145218-A0202-12-0226-150
<210> 91
<211> 1584
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AXC-0002 ORF
<400> 91
Figure 106145218-A0202-12-0226-151
Figure 106145218-A0202-12-0227-152
<210> 92
<211> 509
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AXC-0002 AA
<400> 92
Figure 106145218-A0202-12-0227-153
Figure 106145218-A0202-12-0228-154
Figure 106145218-A0202-12-0229-155
<210> 93
<211> 1620
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MGC-0001 ORF
<400> 93
Figure 106145218-A0202-12-0229-156
Figure 106145218-A0202-12-0230-157
<210> 94
<211> 521
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MGC-0001 AA
<400> 94
Figure 106145218-A0202-12-0231-158
Figure 106145218-A0202-12-0232-159
Figure 106145218-A0202-12-0233-160
<210> 95
<211> 1614
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MGC-0002 ORF
<400> 95
Figure 106145218-A0202-12-0233-161
Figure 106145218-A0202-12-0234-162
<210> 96
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MGC-0002 AA
<400> 96
Figure 106145218-A0202-12-0234-163
Figure 106145218-A0202-12-0235-164
Figure 106145218-A0202-12-0236-165
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 97
Figure 106145218-A0202-12-0236-167
<210> 98
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變異體之CDRH2
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
<223> 第一個Xaa為任何自然發生的胺基酸
<220>
<221> Xaa
<222> (4)..(4)
<223> 第二個Xaa為任何自然發生的胺基酸
<400> 98
Figure 106145218-A0202-12-0237-168
<210> 99
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變異體之CDRL2
<220>
<221> X
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為任何自然發生的胺基酸
<400> 99
Figure 106145218-A0202-12-0237-169
<210> 100
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7034變異體之VH
<220>
<221> 各種不能歸類的特徵
<222> (53)..(53)
<223> 第一個Xaa為任何自然發生的胺基酸
<220>
<221> 各種不能歸類的特徵
<222> (54)..(54)
<223> 第二個Xaa為任何自然發生的胺基酸
<400> 100
Figure 106145218-A0202-12-0238-170
<210> 101
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7034變異體之VL
<220>
<221> 各種不能歸類的特徵
<222> (52)..(52)
<223> Xaa為任何自然發生的胺基酸
<400> 101
Figure 106145218-A0202-12-0238-171
Figure 106145218-A0202-12-0239-172
<210> 102
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7035變異體之VL
<220>
<221> 各種不能歸類的特徵
<222> (52)..(52)
<223> Xaa為任何自然發生的胺基酸
<400> 102
Figure 106145218-A0202-12-0239-173
Figure 106145218-A0202-12-0240-174
<210> 103
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C3E-7036變異體之VL
<220>
<221> 各種不能歸類的特徵
<222> (52)..(52)
<223> Xaa為任何自然發生的胺基酸
<400> 103
Figure 106145218-A0202-12-0240-175

Claims (41)

  1. 一種抗體或該抗體之抗原結合性片段，其特徵為重鏈序列包含：包含序列識別號26所示的胺基酸序列的CDRH1、包含序列識別號98所示的胺基酸序列ITX1X2GGRI的CDRH2，其中X1為選自由A、E、G、H、I、L、T、V、R、及S所組成的群組且X2為S；或X1為N且X2為選自由E、R、F、Y、L、V、I、K、及T所組成的群組，及包含序列識別號28所示的胺基酸序列的CDRH3；及輕鏈序列包含：包含序列識別號29的CDRL1、包含序列識別號99所示的胺基酸序列RX3D的CDRL2，其中X3為選自由Q、A、G、S、N、及D所組成的群組，及包含序列識別號31的CDRL3；且其中該抗體或該抗體之抗原結合性片段與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合。
  2. 如請求項1之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中在CDRH2中，X1係選自由R及S所組成的群組，且X2為S，及在CDRL2中，X3係選自由Q、A、G、S、N、及D所組成的群組。
  3. 如請求項1之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中重鏈序列包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含序列識別號100，其中在序列識別號100中，第1個Xaa係選自由A、E、G、H、I、L、T、V、R、及S所組成的群組，且第2個Xaa為S；或第1個Xaa為N，且第2個Xaa係選自由E、R、F、Y、L、V、I、K、及T所組成的群組。
  4. 如請求項3之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中在序列識別號100中，第1個Xaa係選自由R及S所組成的群組，且第2個Xaa為S。
  5. 如請求項1之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中輕鏈序列包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含序列識別號101、102、及103之任一者，其中在序列識別號101、102、及103之任一者中，Xaa係選自由Q、A、G、S、N、及D所組成的群組。
  6. 如請求項1之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中該抗體或該抗體之抗原結合性片段包含：包含序列識別號100的重鏈可變區、及包含序列識別號101、102、及103之任一者的輕鏈可變區； 其中在序列識別號100中，第1個Xaa係選自由A、E、G、H、I、L、T、V、R、及S所組成的群組，且第2個Xaa為S；或第1個Xaa為N，且第2個Xaa係選自由E、R、F、Y、L、V、I、K、及T所組成的群組；以及在序列識別號101、102、及103之任一者中，Xaa係選自由Q、A、G、S、N、及D所組成的群組。
  7. 如請求項6之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中在序列識別號100中，第1個Xaa係選自由R及S所組成的群組，及第2個Xaa為S；且在序列識別號101、102、及103之任一者中，Xaa係選自由Q、A、G、S、N、及D所組成的群組。
  8. 如請求項1至3及5中任一項之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中該抗體或該抗體之抗原結合性片段包含：包含序列識別號60之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號60之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號64之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號64之第135至241位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號66之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號66之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區； 包含序列識別號68之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號68之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號70之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號70之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號72之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號第72之135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號74之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號74之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號76之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號76之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號78之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號78之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號80之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號80之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號82之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號82之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；或 包含序列識別號84之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號84之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區。
  9. 如請求項1至3及5中任一項之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中該抗體或該抗體之抗原結合性片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，且可選擇進一步包含：i)於可變區之間的連結子；ii)於胺基末端側的可變區之胺基末端的甘胺酸殘基；及iii)於羧基末端側的可變區之羧基末端的連結子、FLAG標籤、及/或His標籤。
  10. 如請求項1至3及5中任一項之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中該抗體或該抗體之抗原結合性片段包含：序列識別號60之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號64之第2至241位之胺基酸殘基、序列識別號66之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號68之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號70之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號72之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號74之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號76之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號78之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號80之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號82之第2至243位之胺基酸殘基、或 序列識別號84之第2至243位之胺基酸殘基。
  11. 如請求項1至3及5中任一項之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中該抗體或該抗體之抗原結合性片段包含：序列識別號60之第2至269位之胺基酸殘基、序列識別號64之第2至267位之胺基酸殘基、序列識別號66之第2至269位之胺基酸殘基、序列識別號68之第2至269位之胺基酸殘基、序列識別號70之第2至269位之胺基酸殘基、序列識別號72之第2至269位之胺基酸殘基、序列識別號74之第2至269位之胺基酸殘基、序列識別號76之第2至269位之胺基酸殘基、序列識別號78之第2至269位之胺基酸殘基、序列識別號80之第2至269位之胺基酸殘基、序列識別號82之第2至269位之胺基酸殘基、或序列識別號84之第2至269位之胺基酸殘基。
  12. 如請求項1至3及5中任一項之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中該抗體為IgG。
  13. 如請求項1至3及5中任一項之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中該抗體之抗原結合性片段係選自由Fab、F(ab)’、Fv、scFv及sdAb所組成的群組。
  14. 如請求項1至3及5中任一項之抗體或該抗體之抗原結合性片段，其中該抗體為包含人類免疫球蛋白恆定區的人類化抗體或人類抗體。
  15. 一種多核苷酸，其包含編碼如請求項1至14中任一項之抗體或該抗體之抗原結合性片段的核苷酸序列。
  16. 如請求項15之多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼下列的核苷酸序列：序列識別號60之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號64之第2至241位之胺基酸殘基、序列識別號66之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號68之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號70之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號72之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號74之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號76之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號78之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號80之第2至243位之胺基酸殘基、序列識別號82之第2至243位之胺基酸殘基、或序列識別號84之第2至243位之胺基酸殘基。
  17. 一種載體，其包含如請求項15或16之多核苷酸。
  18. 一種細胞，其包含如請求項15或16之多核苷酸或如請求項17之載體。
  19. 一種與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合的抗體或該抗體之抗原結合性片段之製造方法，其包含：培養如請求項18之細胞的步驟；及自培養物回收與人類CD3結合的抗體或該抗體之抗原結合性片段的步驟。
  20. 一種醫藥組成物，其含有如請求項1至14中任一項之抗體或該抗體之抗原結合性片段作為有效成分。
  21. 一種具有抗原結合活性的分子，其包含如請求項1至14中任一項之抗體或該抗體之抗原結合性片段。
  22. 如請求項21之分子，其中該分子為多重特異的。
  23. 如請求項21或22之分子，其除了該抗體或該抗體之抗原結合性片段之外，進一步包含1個或2個之另外的抗體或該另外的抗體之抗原結合性片段。
  24. 如請求項23之分子，其中該另外的抗體之抗原結合性片段為Fab、F(ab)’、Fv、scFv、或sdAb。
  25. 如請求項22之分子，其中該分子包含Fc。
  26. 如請求項23之分子，其中該另外的抗體為包含人類免疫球蛋白恆定區的人類化抗體或人類抗體。
  27. 如請求項23之分子，其中該抗體或該抗體之抗原結合性片段與該1個或2個之另外的抗體或該另外的抗體之抗原結合性片段經由連結子結合、或未經由連結子結合。
  28. 如請求項27之分子，其中該另外的抗體或該另外的抗體之抗原結合性片段的胺基酸序列之羧基末端與連結子結合，且該連結子的胺基酸序列之羧基末端進一步與該抗體或該抗體之抗原結合性片段結合。
  29. 一種包含抗體或該抗體之抗原結合性片段的分子，其中該抗體或該抗體之抗原結合性片段係特徵在於：重鏈序列包含： 包含序列識別號26所示的胺基酸序列的CDRH1、包含序列識別號98所示的胺基酸序列ITX1X2GGRI的CDRH2，其中X1為選自由A、E、G、H、I、L、T、V、R、及S所組成的群組且X2為S；或X1為N且X2為選自由E、R、F、Y、L、V、I、K、及T所組成的群組，及包含序列識別號28所示的胺基酸序列的CDRH3；及輕鏈序列包含：包含序列識別號29的CDRL1、包含序列識別號99所示的胺基酸序列RX3D的CDRL2，其中X3為選自由Q、A、G、S、N、及D所組成的群組，及包含序列識別號31的CDRL3；且其中該抗體或該抗體之抗原結合性片段與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合，其中該抗體或該抗體之抗原結合性片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含序列識別號100且該輕鏈可變區包含序列識別號101、102、及103中任一者。
  30. 如請求項29之分子，其中該抗體或該抗體之抗原結合性片段包含：包含序列識別號60之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號60之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號64之第2至119位之胺基酸殘基的重 鏈可變區、及包含序列識別號64之135至241之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號66之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號66之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號68之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號68之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號70之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號70之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號72之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號72之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號74之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號74之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號76之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號76之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號78之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號78之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號80之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號80之第135至243位之 胺基酸殘基的輕鏈可變區；包含序列識別號82之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號82之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區；或包含序列識別號84之第2至119位之胺基酸殘基的重鏈可變區、及包含序列識別號84之第135至243位之胺基酸殘基的輕鏈可變區。
  31. 如請求項21之分子，其中該抗體或該抗體之抗原結合性片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，且進一步包含：i)於可變區之間的連結子；ii)於胺基末端側之可變區之胺基末端的甘胺酸殘基；iii)於羧基末端側之可變區之羧基末端的連結子、FLAG標籤、及/或His標籤。
  32. 如請求項23之分子，其中1個或2個之另外的抗體或該另外的抗體之抗原結合性片段在有連結子或標籤或沒有連結子或標籤下結合至：該抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含序列識別號60之第2至243位之胺基酸殘基；該抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含序列識別號64之第2至241位之胺基酸殘基；該抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含序列識別號66之第2至243位之胺基酸殘基；該抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含序列識別號68之第2至243位之胺基酸殘基； 該抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含序列識別號70之第2至243位之胺基酸殘基；該抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含序列識別號72之第2至243位之胺基酸殘基；該抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含序列識別號74之第2至243位之胺基酸殘基；該抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含序列識別號76之第2至243位之胺基酸殘基；該抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含序列識別號78之第2至243位之胺基酸殘基；該抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含序列識別號80之第2至243位之胺基酸殘基；該抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含序列識別號82之第2至243位之胺基酸殘基；或該抗體或該抗體之抗原結合性片段，其包含序列識別號84之第2至243位之胺基酸殘基。
  33. 如請求項23之分子，其中該另外的抗體為抗癌標的抗體。
  34. 如請求項22之分子，其中該分子為雙特異性的。
  35. 如請求項21之分子，其中該分子為多肽。
  36. 一種多核苷酸，其包含編碼如請求項35之分子的胺基酸序列的核苷酸序列。
  37. 一種載體，其含有如請求項36之多核苷酸。
  38. 一種細胞，其含有如請求項36之多核苷酸或如請求項37之載體，或產生如請求項35之分子。
  39. 一種與人類CD3及食蟹獼猴CD3結合的分子之製造方法，該方法包含：培養如請求項38之細胞的步驟；及自培養物回收與人類CD3結合的分子的步驟。
  40. 一種醫藥組成物，其含有如請求項21至35中任一項之分子作為有效成分。
  41. 如請求項40之醫藥組成物，其中該醫藥組成物藉由T細胞對標的細胞重定向(redirection)，誘導對該標的細胞的細胞毒性。
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