TWI856109B - 靶向表皮生長因子受體的配體及用於治療腫瘤的組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種靶向表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的配體以及用於治療腫瘤的組合物。特定而言，揭露一種靶向表皮生長因子受體(EGFR)的配體。該配體包含重鏈可變域以及輕鏈可變域。該配體可選自由單鏈可變片段、融合蛋白、單株抗體，及其抗原結合片段所組成之群組。該配體可與脂質體或包封至少一種化學治療劑的奈米顆粒接合，以形成靶向配體的脂質體或奈米顆粒藥物。還揭露用於治療如頭頸部鱗狀細胞癌的腫瘤的共軛體及製劑。還揭露製備靶向配體的脂質體藥物之方法。該藥物可為選自由阿黴素以及長春瑞濱所組成之群組的化學治療劑。

Description

靶向表皮生長因子受體的配體及用於治療腫瘤的組合物
本發明總體上涉及一種癌症療法，更特定而言涉及頭頸部鱗狀細胞癌的治療。
頭頸部鱗狀細胞癌(Squamous cell carcinoma of head and neck, SCCHN)起源於口腔、口咽、下嚥或喉的黏膜。此種惡性腫瘤為全球第五大最普遍的癌症。許多頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)患者被診斷為晚期(第III期至第IVB期)。由於頭部及頸部的複雜解剖結構以及相鄰重要結構的豐富性，很難表示清晰的立體腫瘤邊緣。局部淋巴結牽涉其中亦為頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)的常見的特徵，在三分之二的病例中發現。頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)的五年總生存(overall survival, OS)率為50-60%。儘管多元治療有些進展，但局部復發的風險為60%，遠處轉移的風險為30%。此外，頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)倖存者還有沿呼吸消化道發展第二原發腫瘤的風險。
常規的細胞毒性化療為頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)治療方案不可少的支柱。輔助化療需要手術切除陽性邊緣以及轉移灶的囊外擴散。頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)的主要第一線化療方案為使用氟尿嘧啶或紫杉烷類的鉑基雙聯療法。這些療法產生30%的緩解率，僅適用於具有良好表現評分的患者。長春瑞濱(Vinorelbine)為一種半合成的靶向微管的長春花生物鹼，在患者表現得分處於臨界狀態時，可用於治療轉移性頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)。
因此，需要使治療功效最大化，同時使附帶毒性最小化。
於一方面，本發明涉及一種靶向表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的配體，包含： (a) 重鏈可變域(VH )，包含VH CDR1、VH CDR2，以及VH CDR3，其中該VH CDR1、VH CDR2，以及VH CDR3分別包含如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2，以及SEQ ID NO: 3所示之胺基酸序列；以及 (b) 輕鏈可變域(VL )，包含VL CDR1、VL CDR2，以及VL CDR3，其中該VL CDR1、VL CDR2，以及VL CDR3分別包含如SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:  5，以及SEQ ID NO: 6所示之胺基酸序列。
於一具體實施例中，該VH 包含如SEQ ID NO: 7所示之胺基酸序列，而該VL 包含如SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列。
於另一具體實施例中，該配體包含如SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列。
該配體可進一步包含將該VH 連接至該VL 的胜肽。
於一具體實施例中，該配體係選自由單鏈可變片段(single chain variable fragment，scFv)、融合蛋白，以及單株抗體或其抗原結合片段所組成之群組。
於一具體實施例中，該配體為靶向表皮生長因子受體(EGFR)之抗原結合片段。
於一具體實施例中，該靶向表皮生長因子受體(EGFR)的抗原結合片段包含如SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列。
於另一方面，本發明涉及一種共軛體，包含：(a) 本發明之配體；以及 (b) 與該配體接合之脂質體或奈米顆粒。
於一具體實施例中，該脂質體或奈米顆粒與聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)接合，形成聚乙二醇化脂質體或聚乙二醇化奈米顆粒。
於另一具體實施例中，該共軛體可進一步包含包封在該脂質體或奈米顆粒內的至少一種化學治療劑。該至少一種化學治療化合物可選自由阿黴素(doxorubicin)與長春瑞濱所組成之群組。
於另一方面，本發明涉及以上揭露之共軛體於製備用於在有此需要之個體中治療表現表皮生長因子受體(EGFR)的腫瘤的藥物中之用途。
於另一方面，本發明涉及以上揭露之共軛體於製備用於在有此需要之個體中治療鱗狀細胞癌的藥物中之用途。
於另一方面，本發明涉及一種表現載體、噬菌體，或細胞，包含及/或表現本發明之配體。
於一具體實施例中，該配體為單鏈可變片段(scFv)，其該VH 位於N端或C端。
於一具體實施例中，該配體為單鏈可變片段(scFv)，其該VH 位於該VL 的N端並透過連接子胜肽與該VL 連接。
於另一具體實施例中，該配體為單鏈可變片段(scFv)，其該VL 位於該VH 的N端，並透過連接子胜肽與該VH 連接。
於另一方面，本發明涉及醫藥組合物，包含 (a)如上所述之共軛體；以及 (b) 醫藥上可接受之載體。
於另一方面，本發明涉及醫藥組合物，包含： (a) 靶向表皮生長因子受體(EGFR)的共軛體；以及 (b) 醫藥上可接受的載體； 其中： 該靶向表皮生長因子受體(EGFR)的共軛體包含與聚乙二醇化脂質體或聚乙二醇化奈米顆粒接合的單鏈可變片段(scFv)，該單鏈可變片段(scFv)包含重鏈可變區(VH )以及輕鏈可變區(VL )； 此外，其中： (i) 該VH 包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列，且該VL 包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列；以及 (ii) 該聚乙二醇化脂質體或該聚乙二醇化奈米顆粒包封至少一種化學治療劑。
於另一方面，本發明涉及一種製備靶向配體的脂質體或奈米顆粒藥物之方法，包含： (a) 提供聚乙二醇化脂質體或聚乙二醇化奈米顆粒； (b) 將至少一種化學治療劑包封在該聚乙二醇化脂質體或該聚乙二醇化奈米顆粒中，以獲得聚乙二醇化脂質體藥物或聚乙二醇化奈米顆粒藥物； (c) 還原如請求項1至5所述之配體以獲得還原的配體； (d) 將具有一1,2-二硬脂醯基-錫-甘油-3-磷酸基乙醇胺(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylethanolamine，DSPE)磷脂以及馬來醯亞胺的聚乙二醇化試劑插入該聚乙二醇化脂質體藥物或該聚乙二醇化奈米顆粒藥物中，以得到插入有馬來醯亞胺-PEG-DSPE的脂質體藥物或插入馬來醯亞胺-PEG-DSPE的奈米顆粒藥物； (e) 使該還原的配體與該插入有馬來醯亞胺-PEG-DSPE的脂質體藥物或該插入有馬來醯亞胺-PEG-DSPE的奈米顆粒藥物接合，以獲得該靶向配體的脂質體或奈米顆粒藥物。
於另一方面，本發明涉及根據本發明之共軛體於製備用於在有此需要的個體中治療鱗狀細胞癌的藥物中之用途。
「治療」乙詞係指對一有此需要的個體施用有效量的治療劑。可由健康護理專業人員基於任何合適的診斷方法的結果來識別這種對象。
「有效量」係指賦予被治療者治療效果所需的活性化合物的量。如本領域技術人員所認識的，有效劑量將根據給藥途徑、賦形劑的使用，以及與其他治療方法共同使用的可能性而變化。
「靶向配體」以及「靶向配體的」等詞為可互換的。
「 EGFR-s10」乙詞應指從名為EGFR-PC10的噬菌體選殖株產生的可溶性單鏈可變片段(scFv)。
「奈米顆粒藥物」乙詞一般係指「藥物包封的奈米顆粒」。
「化學治療化合物」、「化學治療劑」，以及「化學治療藥物」等詞為可互換的。
美國衛生與公共服務部食品暨藥物管理局發布之「產業及審評人員指南，對成人健康志願者進行治療的臨床試驗中安全起始劑量的估算」揭露，「一人類等效劑量 (human equivalent dose, HED)」可透過以下公式計算得出：HED = 動物劑量 (mg/kg) x [ 動物體重 (kg)/ 人類體重 (kg)]0.33
如本文所用，當列舉一數字或一範圍時，本領域普通技術人員理解其意圖涵蓋與本發明相關的特定領域的適當、合理之範圍。
縮寫 ：單鏈可變片段，scFv (a single-chain variable fragment)；鹽酸二胺基聯苯胺，DAB (diaminobenzidine hydrochloride)；危險相關分子模式，DAMP (danger-associated molecular pattern)；藥物輸送系統，DDS (drug delivery systems)；表皮生長因子受體，EGFR (epidermal growth factor receptor)；表皮生長因子受體的胞外域，EGFR-Ex (extracellular domain of EGFR)；異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷，IPTG (isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)；脂質體阿黴素，LD (liposomal doxorubicine)；靶向配體的脂質體，LTL (ligand-targeting liposomes)；脂質體長春瑞濱，LV (liposomal vinorelbine)；非靶向脂質體，NTL (non-targeting liposomes)；OPD (ortho-phenylenediamine)：鄰苯二胺；總體生存率，OS (overall survival)；含有0.1% TWEEN® 20的PBS，PBST0.1 (PBS containing 0.1 % TWEEN® 20)；聚乙二醇，PEG (polyethelene glycol)；室溫，RT (room temperature)；頭頸部鱗狀細胞癌， SCCHN) (squamous cell carcinoma of head and neck)；單鏈可變片段，scFv (single chain variable fragment)；Terrific培養基，TB (Terrific Broth)；治療有效載荷，TP (therapeutic payloads)；室溫，RT (room temperature)。
本案涉及具有化學治療劑如阿黴素與長春瑞濱的有效載荷的抗表皮生長因子受體(EGFR)人類單鏈可變片段(scFv)接合的新穎靶向配體的脂質體(LTL)。兩種靶向配體的脂質體(LTL)在體外均顯示出比頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)細胞株中非靶向脂質體對應物更高的細胞毒性。在以FaDu細胞皮下或原位異種移植的NOD/SCID小鼠中進行靶向配體的脂質體(LTL)治療後，觀察到腫瘤體積的急劇減少以及延長的生存期，而在體內沒有明顯的副作用。
材料與方法
細胞株
透過西方墨點分析篩選表皮生長因子受體(EGFR)表現後，選擇HPV陰性口咽鱗狀細胞癌細胞株(FaDu)以及另一種牙齦鱗狀細胞癌細胞株(Ca9-22)作為實驗平台。兩種細胞株均在推薦的培養基中培養，並在連續培養的六個月內使用。在BCRC上透過短縱列重複序列(short tandem repeat，STR)譜圖證實所有細胞株的真實性，並透過巢式PCR定期監測黴漿菌污染。
透過噬菌體展示獲得抗表皮生長因子受體 (EGFR) 人類單鏈可變片段 (scFv) 噬菌體選殖株
如前所述，建立噬菌體展示的人類初始單鏈可變片段(scFv)庫。針對人類EGFR-Fc融合蛋白(EGFR-Ex-Fc)的胞外域的生物親和性篩選的方法描述如下。將單鏈可變片段(scFv)庫(噬菌體展示的scFv庫的初始力價，2 x 1011 cfu)與蛋白G DYNABEADS® 作用以消除非特異性結合，然後與重組EGFR-Ex-Fc (R&D系統公司)反應。以含0.1% TWEEN® 20 (PBST0.1 )的PBS洗滌後，透過感染大腸桿菌的TG1菌株回收結合的噬菌體。連續稀釋感染的TG1細菌以確定噬菌體選殖株的力價，其餘噬菌體選殖株透過M13KO7輔助噬菌體拯救。隨後對獲救的噬菌體選殖株進行生物親和性篩選。
透過 ELISA 選擇抗表皮生長因子受體 (EGFR) 人類單鏈可變片段 (scFv) 噬菌體選殖株
我們使用ELISA分析篩選了富集的噬菌體選殖株與表皮生長因子受體(EGFR)的結合能力。將在0.1 M碳酸氫鈉中的EGFR-Ex-Fc融合蛋白(1 μg/ml)於4o C下塗於96孔盤上整夜。隨機選擇從第四輪及第五輪生物親和性篩選中洗脫的噬菌體選殖株(共476個選殖株)，並於室溫(RT)下加入該孔盤作用1小時。孔盤上添加接合辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的小鼠抗M13噬菌體抗體1小時。洗滌後，以鄰苯二胺(OPD)引發比色反應，並以微孔盤讀取儀測量反應產物於波長490 nm下的吸光度。OD值大於1.0的選殖株被選擇並定序。
抗表皮生長因子受體 (EGFR) 人類單鏈可變片段 (scFv) 噬菌體選殖株的體內歸巢測定
將8至10週齡的Nod/SCID雌性小鼠在側腹皮下(s.c.)接種2 x 106 個FaDu細胞。21天後，透過尾靜脈向攜帶大小配對腫瘤(300-500 mm3 )的小鼠注射2 x 109 cfu抗表皮生長因子受體(EGFR)單鏈可變片段(scFv)噬菌體或對照噬菌體。循環8-10分鐘後，以CO2 犧牲小鼠，並以50 ml冷PBS灌注以去除未結合的噬菌體。收集腦、內臟器官(心臟、肝臟、腎臟、脾臟，以及肺臟)與腫瘤並秤重，並以冷PBS洗滌3次。標本一分為二。將每個器官或腫瘤樣品的一半均質化，用於以ER2738 大腸桿菌拯救結合的噬菌體顆粒。在瓊脂平板上評估回收的噬菌體的力價。另一半嵌入OCT化合物中。切下厚度為4 μm的冷凍切片，用於免疫組織化學染色。將冷凍切片於4o C下浸入PBS 10分鐘。應用多聚甲醛(1%)固定組織30分鐘。以PBS徹底沖洗3次後，將內源過氧化物酶活性以3% H2 O2 (於甲醇中)淬滅30分鐘。非特異性結合以1% BSA阻隔30分鐘。將切片與抗M13的單株抗體(1:1000)於室溫下作用1小時。以PBST0.1 洗滌後，將切片以基於聚合物的Super SENSITIVE™ IHC檢測系統處理。將切片與Super Enhancer試劑於室溫下作用20分鐘，並以PBST0.1 徹底沖洗3次，每次5分鐘。隨後於室溫下將切片以Poly-HRP試劑處理30分鐘。以含有0.03% H2 O2 的二胺基聯苯胺鹽酸鹽(0.02%)作為顯色劑，以觀察過氧化物酶的活性。以蘇木精將製劑輕度複染，安裝於PERMOUNT™並透過光學顯微鏡檢查。
可溶性抗表皮生長因子受體 (EGFR) 人類單鏈可變片段 (scFv) 的表現及純化
將EGFR-s10單鏈可變片段(scFv)序列與pFHC載體(包含標記、6 x His，以及半胱胺酸標籤)連接，並轉型至HB2151大腸桿菌中。選擇轉型菌落後，將單顆菌落在Terrific培養基(TB)中於30o C下培養整夜。將整夜培養物在TB培養基中稀釋，並在30o C下生長3小時，直到大腸桿菌達到對數中期(OD600 = 0.6)。異丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG) (0.4 mM)與蔗糖(0.4 M)於30o C下誘導16小時，進而誘導蛋白質的產生。離心後，將細菌沉澱重新懸浮於200 ml PPE緩衝液(50 mM Tris，1 mM EDTA，以及20%蔗糖，pH調整至8.0)中。離心後，收集滲壓衝擊液，並以冰凍的5 mM MgSO4 重新懸浮沉澱物，然後離心收集上清液以獲得周質蛋白萃取物。超音波處理混合物以獲得總蛋白，透過0.45 μm膜過濾並透過Ni+ -NTA SEPHAROSE® 管柱以及ANTI-FLAG® M2管柱(SIGMA®)純化。透過還原SDS-PAGE，隨後以COOMASSIE® 藍色染色並使用ANTA-FLAG® 單株抗體的西方墨點法來分析這些純化的單鏈可變片段(scFv)蛋白。
可溶性 EGFR-s10 單鏈可變片段 (scFv) 的胞吞試驗
將細胞與EGFR-s10於4o C或37o C下作用30分鐘。PBS洗滌後，將細胞以2%多聚甲醛固定並以0.1% TRITON® X-100透化。透過添加3%的BSA以完成阻隔。將小鼠ANTI-FLAG® 抗體添加至細胞中，並以FITC抗小鼠IgG標記。細胞核以DAPI染色，並在共聚焦顯微鏡(TCS-SP5，Leica公司)上觀察細胞。
EGFR-s10 接合的靶向配體的脂質體 (LTL) 以及 lipo-SRB 之製備
透過薄膜方法製備聚乙二醇化脂質體。將二硬脂醯磷脂醯膽鹼、膽固醇，以及mPEG2000-DSPE溶解，並依照治療有效載荷(TPs)以最佳比例混合於氯仿中。然後透過蒸發除去氯仿。將脂質膜於60o C的硫酸銨或5-磺基水楊酸溶液的銨鹽(取決於TPs)中水合，並於55o C下使用高壓擠出設備(LIPEX® Biomembranes)透過孔徑為​​0.1 μm的聚碳酸酯膜過濾器擠出)。透過遠程裝載方法將藥物包封在濃度為每10 μmol磷脂1 mg阿黴素以及每10 μmol磷脂3.5 mg長春瑞濱中，分別得到脂質體阿黴素(LD)以及脂質體長春瑞濱(LV)。脂質體的最終濃度透過磷酸鹽分析(巴特利特法)估算。為了獲得接合單鏈可變片段(scFv)的脂質體藥物，將表皮生長因子受體(EGFR)單鏈可變片段(scFv)以2 mM參(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP)處理，以在N2 氣氛中於室溫下還原分子間二硫鍵2小時。以NAP™-10去鹽管柱對還原的表皮生長因子受體(EGFR)單鏈可變片段(scFv)進行去鹽以去除TCEP，然後以HEPES緩衝液(5 mM HEPES，145 mM NaCl，3.4 mM EDTA，pH 7.0)洗脫。將馬來醯亞胺-羧基聚乙二醇(Mr 2000)衍生的二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(馬來醯亞胺-PEG-DSPE)摻入聚乙二醇化脂質體藥物中。簡言之，將馬來醯亞胺-PEG-DSPE溶解在HEPES緩衝液中，並以0.5莫耳脂質體磷脂添加至脂質體阿黴素(LD)或脂質體長春瑞濱(LV)。將混合物於60o C下溫和攪拌作用1小時。隨後，將還原的表皮生長因子受體(EGFR)單鏈可變片段(scFv)與插入有馬來醯亞胺-PEG-DSPE的脂質體一起作用，於4o C下接合整夜，每個脂質體平均產生60個單鏈可變片段(scFv)分子。以2-巰基乙醇(終濃度2 mM)終止接合反應，以不活化所有未反應的馬來醯亞胺基團。SEPHAROSE® 4B凝膠過濾色譜法用於去除釋放的游離藥物、未結合的單鏈可變片段(scFv)，以及未結合的共軛體。透過使用分光螢光計(SPECTRAMAX® M5)在λEx/ Em = 485/590 nm處測量螢光以確定洗脫液級分中的阿黴素濃度。長春瑞濱的濃度則透過HPLC測定。透過還原SDS-PAGE分離插入表皮生長因子受體(EGFR)單鏈可變片段(scFv)的脂質體藥物，然後以硝酸銀染色以評估結合效率。為了產生脂質SRB，含Rh-DPPE的脂質體係以SPC：膽固醇：mPEG-DSPE 於莫耳比為97∶2∶0.8∶0.2的SPC：膽固醇：mPEG-DSPE：Rh-DPPE製備之。然後透過聚乙二醇化以及隨後將EGFR-s10與脂質-SRB接合來產生EGFR-s10-脂質-SRB，如先前所述。
EGFR-s10 接合的靶向配體的脂質體 (LTL) 的特徵描述
使用Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments公司)於633 nm激光以及90o 的檢測角度下，透過動態光散射(Dynamic light scattering, DLS)於25o C下測定脂質體的平均粒徑。在Malvern Zetasizer Nano ZS上使用激光多普勒電泳儀測量脂質體的ζ電位。
EGFR-s10 接合的靶向配體的脂質體 (LTL) 的內在化分析
將FaDu以及Ca9-22細胞與抗表皮生長因子受體(EGFR)完全人類單鏈可變片段(scFv)接合的靶向配體的脂質體(LTL)以及lipo-SRB於4o C及37o C下作用30分鐘。以PBS洗滌後，將細胞以多聚甲醛(4%)固定，以TRITON® X-100 (0.1%)透化，並以3% BSA阻隔。將小鼠抗M13抗體添加至細胞中，並以FITC抗小鼠IgG標記。以DAPI對細胞核染色，並在共聚焦顯微鏡(TCS-SP5，Leica公司)上觀察細胞。
EGFR-s10 接合的靶向配體的脂質體 (LTL) 的體外細胞毒性測定
FaDu與Ca9-22細胞與各種濃度的非靶向脂質體藥物或EGFR-s10接合的靶向配體的脂質體(LTL)作用4、8、16以及24小時。以完全培養基替換培養基培養48小時，然後添加0.5 mg/ml 4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑]-1,3-苯二磺酸鹽(WST-1)。將細胞於37o C下培養3小時後，測量反應產物於波長440 nm處的吸光度，並計算最大抑制濃度的一半(IC50 )。
體內鼠皮下異種移植治療測定
將FaDu以及Ca9-22細胞以皮下接種於8至10週齡的Nod/SCID小鼠的側面(1 x 106 個細胞/小鼠)。每週兩次測量產生的腫瘤之直徑，並按以下方式計算腫瘤體積：大直徑 x (小直徑)2 x 0.52。當腫瘤的平均體積達到350 mm3 時，將腫瘤大小相似的小鼠隨機分為治療組(n = 8隻小鼠/組)。治療方案以PBS、非靶向脂質體藥物，或EGFR-s10接合的靶向配體的脂質體(LTL)靜脈內(i.v.)注射，劑量為1 mg/kg，每週兩次，共4週，每組的累積劑量為8 mg/kg。每週兩次監測腫瘤體積。過早死亡的終點包括體重減輕超過5 g、無法進食，或腫瘤體積超過2000 mm3 。
體內鼠原位異種移植治療測定
將表現螢光素酶的FaDu-Luc細胞(每隻小鼠2 x 105 個細胞與基質膠在50 μl PBS中混合)原位注射到Nod/SCID小鼠(8至10週大)的口腔底部。腹膜內給予150 mg/kg螢光素後，每週兩次以IVIS體內成像系統(Caliper Life Sciences公司，霍普金頓鎮，麻州，美國)監測腫瘤生長，並使用LIVING IMAGE® 4.1軟體(Caliper Life Sciences公司)分析影像 。當腫瘤的平均體積達到75 mm3 時，將具有相似大小腫瘤的小鼠隨機分為治療組(n = 6隻小鼠/組)。各組分別接受PBS、FD (1 mg/kg) + FV (2 mg/kg)、LD (1 mg/kg) + LV (2 mg/kg)，或EGFR-s10-LD (1 mg/kg) + EGFR-s10-LV (2 mg/kg)每週兩次，共8劑。對小鼠進行如上所述之相同分析。
統計分析
治療組與未治療組之間的所有比較均透過學生氏t檢驗進行。所有測試的p值均小於0.05，具有統計學意義。
結果
抗表皮生長因子受體 (EGFR) 人類單鏈可變片段 (scFv) 噬菌體選殖株的獲取及特徵描述
為了生成作為靶向配體的脂質體(LTL)靶向部分體的抗表皮生長因子受體(EGFR)人類單鏈可變片段(scFv)選殖株，我們以2 x 1011 個選殖株的噬菌體展示人類單鏈可變片段(scFv)庫對重組人類EGFR-Ex-Fc進行五輪生物親和性篩選。透過該過程，在第五輪結束時，結合表皮生長因子受體(EGFR)的噬菌體的力價不斷提高並富集到原始力價的1714倍(圖1A)。我們隨機選擇了476個噬菌體選殖株，並透過ELISA調查它們與EGFR-Ex-Fc的結合親和力。79個選殖株表現出與人類表皮生長因子受體(EGFR)的高結合力，但與陰性對照(BSA)沒有高結合力。在進行DNA定序後，我們在79個免疫陽性噬菌體選殖株中鑑定出16個不同的序列，其中有6個顯示出與EGFR-Ex-Fc的劑量依賴性結合(圖1B)，並且與陰性對照正常人類IgG (NHIgG)未檢測到發生反應。該結果還排除了在我們的候選噬菌體內存在Fc結合選殖株的可能性。接下來，我們在透過西方墨點分析驗證表皮生長因子受體(EGFR)表現狀態後，使用ELISA分析法檢查這些噬菌體選殖株是否可與各種人類癌細胞株中的內源性表皮生長因子受體(EGFR)結合。相較於輔助噬菌體，噬菌體選殖株EGFR-PC10與所有6個人類癌細胞株均表現出明顯更高的結合訊號(圖1C)。因此，選擇該選殖株作為進一步開發靶向配體的脂質體(LTL)的候選靶向部分。
EGFR-PC10 噬菌體選殖株優先在體內腫瘤中蓄積
我們檢測體內噬菌體選殖株EGFR-PC10的腫瘤歸巢能力。靜脈內注射輔助噬菌體或EGFR-PC10噬菌體至透過尾靜脈導入FaDu皮下異種移植的小鼠。相較於重要器官，EGFR-PC10噬菌體優先在腫瘤異種移植物中積累(相較於腦為250倍，相較於肺為33倍，圖2A，右圖)。輔助噬菌體在腫瘤及內臟器官之間未顯示差異分佈(圖2A，左圖)。透過針對噬菌體M13的免疫組織化學染色進行噬菌體沉積的原位檢測。在EGFR-PC10噬菌體組的腫瘤組織而非正常器官中觀察到EFGR-PC10噬菌體的富集。在對照噬菌體組中在腫瘤組織或正常器官中沒有明顯的噬菌體陽性訊號(圖2B)。
EGFR-s10 內在化檢查與 EGFR-s10 接合靶向配體的脂質體 (LTL) 的特徵描述
我們從EGFR-PC10生產了可溶性單鏈可變片段(scFv)，並將其命名為EGFR-s10。靶標結合以及內化為靶向配體的脂質體(LTL)的靶向部分體的基本要求。我們調查了頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)細胞株中EGFR-s10的這些特徵。將FaDu細胞以及Ca9-22細胞分別與EGFR-s10於4o C或37o C下作用30分鐘，並與同型IgG對照進行比較。EGFR-s10於4o C與FaDu以及Ca9-22細胞的細胞膜結合。於37o C下在兩種細胞株中均觀察到EGFR-s10 (scFvs)的內在化作為細胞質聚集體(圖3A-B)。
為了評估在EGFR-s10與脂質體連接後是否保留內在化以及靶向作用，我們於37o C下在頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)細胞株FaDu以及Ca9-22細胞中測試EGFR-s10-接合的脂質體SRB 30分鐘(圖3C-D)。相較於先前的可溶性EGFR-s10，在任一細胞株中均未發現內在化能力受到損害。相較於非靶向脂質-SRB組，EGFR-s10-脂質SRB組的細胞攝取增強。
EGFR-s10識別人類及鼠EGFR-Ex-Fc。此功能消除對用於評估鼠類平台毒性的替代分子的任何要求。在驗證EGFR-s10在靶細胞中的內在化後，我們使用薄膜方法以及EGFR-s10的聚乙二醇化製備了裝載有阿黴素或長春瑞濱的靶向配體的脂質體(LTL) (分別為EGFR-s10-LD以及EGFR-s10-LV)。表1列出了靶向配體的脂質體(LTL)的物理參數。所有靶向配體的脂質體(LTL)直徑均小於150 μm，因此不易被單核吞噬細胞系統清除。ζ電位均高於防止聚集體形成所需的電位。當處理表皮生長因子受體(EGFR)敲低細胞時，我們的靶向配體的脂質體(LTL)沒有顯示出增強的攝取。總之，透過化學處理可保留EGFR-s10的表皮生長因子受體(EGFR)特異性結合，並且所產生的靶向配體的脂質體(LTL)滿足抗腫瘤脂質體藥物的要求，表示適合進一步開發。
表1
Z-平均(d.nm) ζ-電位 (mV)
LD 102.1 -32.6
LV 103.6 -24.5
EGFR-s10-LD 125 -28.1
EGFR-s10-LV 115.2 -29.2
相較於非靶向脂質體，與 EGFR-s10 接合的靶向配體的脂質體 (LTLs) 增強了細胞毒性
將EGFR-s10接合的靶向配體的脂質體(LTL)的細胞毒性與人類頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)細胞株中的非靶向對應物的細胞毒性進行比較。透過WST-1測定法分析細胞生存力，並計算為活細胞百分比。在所有檢查的時間點(8小時時間點，圖4B-D)都與非靶向脂質體(NTL)相比，具有包封的阿黴素以及長春瑞濱的靶向表皮生長因子受體(EGFR)的靶向配體的脂質體(LTL)降低了FaDu與Ca9-22細胞的IC50 ，除了在4小時及8小時FaDu細胞中的脂質體阿黴素除外(圖4A)。FaDu細胞中EGFR-s10-LD與EGFR-s10-LV的IC50 值分別為0.33倍(p = 0.2056)以及0.21倍(p = 0.0027)(圖4A及C)。Ca9-22細胞中IC50 的降低甚至更為明顯。Ca9-22細胞中EGFR-s10-LD以及EGFR-s10-LV的IC50 分別為0.0028倍(p = 0.0001)以及0.14倍(p = 0.0057)(圖4B及D)。為了闡明EGFR-s10是否有助於這些靶向配體的脂質體(LTL)的抗腫瘤能力，我們分析了沒有阿黴素或長春瑞濱有效載荷的空靶向脂質體的細胞毒性。在用不同濃度的空的EGFR-s10接合的脂質體處理的FaDu細胞中未觀察到明顯的細胞毒性(數據未顯示)。
在小鼠皮下以及原位異種移植模型中，結合 EGFR-s10 的靶向配體的脂質體 (LTL) 誘導更快的腫瘤消退並延長總體生存期
鑑於我們的靶向配體的脂質體(LTL)製劑在癌細胞株中抗腫瘤藥物的IC50 顯著降低，我們測試在FaDu異種移植Nod/SCID小鼠體內的治療效果。當腫瘤體積達到350 mm3 時開始治療，開始每週兩次，持續4週，每組8 mg/kg的累積劑量，給藥劑量為1 mg/kg。以EGFR-s10-LD以及EGFR-s10-LV (靶向配體的脂質體(LTL))的組合治療的組別在治療後表現出腫瘤體積的顯著減少(圖5A-B)，而沒有明顯的副作用(圖5C)。靶向配體的脂質體(LTL)治療組的平均腫瘤體積於第7天顯著小於非靶向脂質體(NTL)治療組，並於第21天達到最低，而非靶向脂質體(NTL)組的腫瘤體積於處理後第28天達到最低點(圖5A-B)。相較於非靶向脂質體，靶向配體的脂質體(LTL)治療具有統計學上顯著的生存優勢(p = 0.00153)，靶向配體的脂質體(LTL)組的生存時間中位數比非靶向脂質體(NTL)組的生存時間中位數長1.5倍(分別為94天以及60天；圖5D，上圖以及下圖)。我們還在皮下注射Ca9-22的異種移植的NOD/SCID小鼠中，以1.5 mg/kg的劑量每週兩次持續4週，以游離藥物、非靶向脂質體(NTL)或靶向配體的脂質體(LTL)的形式測試單線長春瑞濱的治療。EGFR-s10-LV治療組的平均腫瘤體積也小於非靶向脂質體(NTL)-長春瑞濱的腫瘤體積，並且未觀察到體重減輕。
考慮到皮下微環境不能代表頭頸癌，我們透過使用FaDu-異種移植的NOD/SCID小鼠驗證了原位異種移植模型中靶向配體的脂質體(LTL)的功效。在靶向配體的脂質體(LTL)治療組中腫瘤內的近紅外(near-infrared, NIR)螢光訊號強度比在非靶向脂質體(NTL)治療組中更弱(圖6A)。靶向配體的脂質體(LTL)組的生存時間中位數為非靶向脂質體(NTL)組的生存時間中位數的1.28倍(72天對56天；p = 0.0032；圖6B，左圖及右圖)。因此，結合EGFR-s10的脂質體製劑在體內皮下及原位鼠模型中都增強了阿黴素以及長春瑞濱的治療功效，進而在不增加附帶毒性的情況下提供了優異的存活率。
本發明揭露名為EGFR-s10的靶向表皮生長因子受體(EGFR)的單鏈可變片段(scFv)，包含重鏈可變域(VH ，SEQ ID NO: 7；圖7)以及輕鏈可變域(VL ，SEQ ID NO: 8；圖 8)。該VH 包括VH CDR1 (SEQ ID NO: 1)、VH CDR2 (SEQ ID NO: 2)，以及VH CDR3 (SEQ ID NO: 3)。該VL 包括VL CDR1 (SEQ ID NO: 4)、VL CDR2 (SEQ ID NO: 5)，以及VL CDR3 (SEQ ID NO: 6)。完整的靶向表皮生長因子受體(EGFR)的單鏈可變片段(scFv)的胺基酸序列以及連接該VH 與VL 的一連接子在SEQ ID NOs：9及11中公開，且DNA序列在SEQ ID NO: 10中公開(圖9)。
討論
可透過配體調節的主動靶向來延長腫瘤保留時間並透過受體調節的內吞作用增強攝取，進而將脂質體藥物優先遞送至腫瘤細胞。該方法涉及將靶向部分，例如單株抗體、抗體片段(例如，單鏈可變片段(scFv))、蛋白質或碳水化合物接合至奈米顆粒。單株抗體以及單鏈可變片段(scFv)由於其高親和力以及特異性而成為最常用的靶向配體。公認的是，單鏈可變片段(scFv)提供了降低的免疫原性，改善的藥物動力學特性以及更好的腫瘤滲透性。本發明揭露單鏈可變片段(scFv)作為靶向配體的脂質體(LTL)的靶向部分體。為了使免疫原性最小化，從展示完全人源單鏈可變片段(scFv)的噬菌體庫中產生單鏈可變片段(scFv)。數據清楚地證明了靶向部分在異種移植腫瘤中的優先保留(圖2)，並且以其游離形式以及脂質體接合形式(圖3)被癌細胞攝取增加。在原位異種移植模型中(圖6)，即使與非靶向脂質體(NTL)治療組相比，靶向配體的脂質體(LTL)減輕了腫瘤負擔並顯著延長了荷瘤小鼠的存活期，表示這些新穎的製劑同時具有更高的治療效果以及更低的毒性。
總之，相較於非靶向脂質體(NTL)對應物，本發明所公開之靶向配體的脂質體(LTL)製劑在體外FaDu以及Ca9-22細胞中皆大幅降低化學療法的IC50 。此外，在皮下異種移植模型以及原位模型中，靶向配體的脂質體(LTL)極大地抑制了腫瘤的生長。靶向配體的脂質體(LTLs)治療組的生存時間中位數長於非靶向脂質體(NTL)治療組，表示療效提高，有效載荷毒性降低。參見Wang等人「新穎抗表皮生長因子受體(EGFR)單鏈可變片段(scFv)人類抗體接合的免疫脂質體可增強頭頸部鱗狀細胞癌的化學治療功效。 Oral Oncol」 2020年4月21日；106:104689，其透過引用整體併入本文。
在本說明書中引用及討論的所有參考文獻皆透過引用以其整體併入本文，其程度與每個參考文獻透過引用單獨併入的程度相同。
圖1所示為結合表皮生長因子受體(EGFR)蛋白的人類單鏈可變片段(scFv)噬菌體選殖株的選擇與鑑定。(A) 柱狀圖，顯示透過生物親和性篩選(biopanning)回合連續升高並富集的表皮生長因子受體(EGFR)結合噬菌體的效價。(B) 柱狀圖，顯示透過ELISA分析的以劑量依賴性方式(上圖)而非正常人類IgG (normal human IgG, NHIgG，下圖)結合至EGFR-Ex-Fc蛋白的所有免疫陽性單鏈可變片段(scFv)噬菌體選殖株。(C) 柱狀圖，比較透過ELISA評估的各種癌細胞株中噬菌體選殖株與內源性細胞表皮生長因子受體(EGFR)結合的親和力。 圖2所示為在FaDu異種移植物中抗表皮生長因子受體(EGFR) 單鏈可變片段(scFv)噬菌體選殖株的腫瘤歸巢能力的鑑定。(A) 柱狀圖，顯示在腹腔內注射指示相應的噬菌體後，人類口咽癌FaDu異種移植小鼠的重要器官與腫瘤組織中的對照噬菌體(左圖)以及EGFR-PC10噬菌體(右圖)的分佈。灌注後回收結合的噬菌體，並比較重要器官與腫瘤組織中的噬菌體力價。(B) 顯微照片，顯示透過免疫組織化學染色原位偵測EGFR-PC10噬菌體的結果。比例尺：100 μm。 圖3所示為透過共聚焦顯微鏡評估的可溶性EGFR-s10 scFv以及EGFR-s10接合的脂質-SRB的內在化。(A-D) 顯微照片顯示於4o C或37o C下在FaDu (A) 以及 Ca9-22 (B) 細胞中EGFR-s10 scFv的結合與內在化，以及於4o C或37o C下在FaDu (C) 與Ca9-22 (D)細胞中與EGFR-s10結合的lipo-SRB內在化。比例尺：25 μm。 圖4所示為靶向EGFR-s10的脂質體在人類頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)細胞株中增強阿黴素與長春瑞濱的細胞毒性作用。(A-D) 相較於未接合的脂質體阿黴素(LD，A與B)，EGFR-s10 scFv接合的脂質體阿黴素(EGFR-s10-LD，A與B)的劑量反應曲線(A-D，左圖)以及IC50柱狀圖(A-D，右圖)，或相較於未接合的脂質體長春瑞濱(LV)，在FaDu (A)以及Ca9-22 (B)細胞中EGFR-s10 scFv接合的脂質體長春瑞濱(EGFR-s10-LV)。虛線表示平均50%生存力。每個點代表三個獨立實驗的平均值。 圖5所示為EGFR-s10接合的靶向配體的脂質體(LTLs)在皮下人類頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)異種移植物中的治療功效。(A) 所有四組的腫瘤體積(n = 8)。點，平均腫瘤體積。(B) 靶向配體的脂質體(LTL)與非靶向脂質體(NTL)組之間的腫瘤體積反應曲線的比較。 點，平均腫瘤體積。(C) 每組的體重。(D) Kaplan-Meier生存曲線(上圖)以及所有四組的生存時間中位數(下圖)。誤差條，標準誤差(standard error, SE)。 圖6所示為EGFR-s10接合的靶向配體的脂質體(LTLs)在原位人類頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)異種移植物中的治療功效。(A) 攜帶FaDu-Luc細胞的SCID小鼠的體內圖像。(B) Kaplan-Meier生存曲線(左圖)與所有四組的生存時間中位數(右圖)。誤差條，標準誤差(SE)。 圖7所示為重鏈可變域(VH ，SEQ ID NO: 7)以及VH CDR1 (SEQ ID NO: 1)、VH CDR2 (SEQ ID NO: 2)以及VH CDR3 (SEQ ID NO: 3)的胺基酸序列。 圖8所示為輕鏈可變域(VL ，SEQ ID NO: 8)以及VL CDR1 (SEQ ID NO: 4)、VL CDR2 (SEQ ID NO: 5)以及VL CDR3 (SEQ ID NO: 6)的胺基酸序列。 圖9所示為完整單鏈可變片段(scFv)的胺基酸(SEQ ID NO: 9)與DNA序列(SEQ ID NO: 10)以及連接重鏈可變域以及輕鏈可變域的連接子(底線標示， SEQ ID NO: 11)。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006

Claims (17)

  1. 一種靶向表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的配體，包含：(a)重鏈可變域(VH)，包含VH CDR1、VH CDR2，以及VH CDR3，其中該VH CDR1、VH CDR2，以及VH CDR3分別包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，以及SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列；以及(b)輕鏈可變域(VL)，包含VL CDR1、VL CDR2，以及VL CDR3，其中該VL CDR1、VL CDR2，以及VL CDR3分別包含如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5，以及SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之配體，其中該VH包含如SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列，而該VL包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列。
  3. 如請求項1之配體，其包含如SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列。
  4. 如請求項1之配體，其進一步包含將該VH連接至該VL的胜肽。
  5. 如請求項1之配體，其中該配體係選自由單鏈可變片段(single chain variable fragment，scFv)、融合蛋白，以及單株抗體或其抗原結合片段所組成之群組。
  6. 一種共軛體，包含：(a)如請求項1至5中任一項所述之配體；以及(b)與該配體接合之脂質體或奈米顆粒。
  7. 如請求項6之共軛體，其中該脂質體或奈米顆粒係與聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)接合，形成聚乙二醇化脂質體或聚乙二醇化奈米顆粒。
  8. 如請求項7之共軛體，其進一步包含包封在該脂質體或奈米顆粒內的至少一種化學治療劑。
  9. 如請求項8之共軛體，其中該至少一種化學治療化合物係選自由阿黴素(doxorubicin)與長春瑞濱(vinorelbine)所組成之群組。
  10. 一種如請求項8或9之共軛體於製備用於在有此需要之個體中治療表現表皮生長因子受體(EGFR)的腫瘤的藥物之用途。
  11. 一種如請求項8或9之共軛體於製備用於在有此需要之個體中治療鱗狀細胞癌的藥物中之用途。
  12. 一種表現載體，包含編碼如請求項1-5中任一項所述之配體之核酸。
  13. 一種噬菌體，包含請求項12所述之表現載體。
  14. 一種細胞，包含如請求項12所述之表現載體。
  15. 如請求項1至5中任一項之配體，其中該配體為單鏈可變片段(scFv)，其VH位於該VL的N端，且透過連接胜肽連接至該VL。
  16. 一種醫藥組合物，包含：(a)如請求項8之共軛體；以及(b)醫藥上可接受之載體。
  17. 一種製備靶向配體的脂質體藥物或靶向配體的奈米顆粒藥物之方法，包含：(a)提供聚乙二醇化脂質體或聚乙二醇化奈米顆粒； (b)將至少一種化學治療劑包封在該聚乙二醇化脂質體或該聚乙二醇化奈米顆粒中，以獲得聚乙二醇化脂質體藥物或聚乙二醇化奈米顆粒藥物；(c)還原如請求項1至5所述之配體，以獲得還原的配體；(d)將具有1,2-二硬脂醯基-錫-甘油-3-磷酸基乙醇胺(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylethanolamine，DSPE)磷脂以及馬來醯亞胺的聚乙二醇化試劑插入該聚乙二醇化脂質體藥物或該聚乙二醇化奈米顆粒藥物中，以得到插入馬來醯亞胺-PEG-DSPE的脂質體藥物或插入馬來醯亞胺-PEG-DSPE的奈米顆粒藥物；(e)使該還原的配體與該插入有馬來醯亞胺-PEG-DSPE的脂質體藥物或該插入有馬來醯亞胺-PEG-DSPE的奈米顆粒藥物接合，以獲得該靶向配體的脂質體或該靶向配體的奈米顆粒藥物。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009040426A1 (en) * 2007-09-28 2009-04-02 Universitätsspital Basel Immunoliposomes for treatment of cancer
US20100009390A1 (en) * 2008-05-09 2010-01-14 The Regents Of The University Of California Mutant antibodies with high affinity for egfr
CN102379848A (zh) * 2011-09-02 2012-03-21 天津冠勤生物科技有限公司 一种紫杉醇免疫纳米脂质体及其制备方法和用途

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102320178B1 (ko) 2011-01-06 2021-11-02 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 혈장 칼리크레인 결합 단백질
RU2014121043A (ru) 2011-10-24 2015-12-10 Эббви Инк. Биспецифические иммуносвязывающие средства, направленные против tnf и il-17
EP3590538A1 (en) * 2011-12-05 2020-01-08 Novartis AG Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3)
CA2872018A1 (en) * 2012-05-17 2013-11-21 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind egfr
KR101971770B1 (ko) 2014-03-03 2019-04-24 아카데미아 시니카 이중특이성 항체 및 이의 용도
CA2961950A1 (en) * 2014-09-28 2016-03-31 The Regents Of The University Of California Modulation of stimulatory and non-stimulatory myeloid cells
KR20180016972A (ko) * 2015-02-22 2018-02-20 소렌토 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 Cd137에 결합하는 항체 치료제

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009040426A1 (en) * 2007-09-28 2009-04-02 Universitätsspital Basel Immunoliposomes for treatment of cancer
US20100009390A1 (en) * 2008-05-09 2010-01-14 The Regents Of The University Of California Mutant antibodies with high affinity for egfr
CN102379848A (zh) * 2011-09-02 2012-03-21 天津冠勤生物科技有限公司 一种紫杉醇免疫纳米脂质体及其制备方法和用途

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