TWI891749B - 抗體-藥物偶聯物及其醫藥用途 - Google Patents

抗體-藥物偶聯物及其醫藥用途

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Abstract

本發明涉及一種抗體-藥物偶聯物及其醫藥用途。具體地，涉及一種抗TROP-2抗體-藥物偶聯物及其醫藥用途。進一步地，本發明涉及一種包含抗TROP-2抗體或其抗原結合片段的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，及其在製備用於治療TROP-2介導的疾病或病症的藥物中的用途和用於腫瘤檢測和診斷中的用途。

Description

抗體-藥物偶聯物及其醫藥用途
本發明涉及一種特異性地對人TROP-2受體具有免疫反應性的抗TROP-2抗體-藥物偶聯物及其醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物用途和檢測或診斷腫瘤的用途。
隨著對腫瘤基因組學、蛋白組學及信號傳導途徑研究的不斷深入，人們對腫瘤細胞的癌基因和抑癌基因的相互作用以及它們對腫瘤微環境的影響已經越來越清楚，這也使得針對腫瘤的特異性分子靶點設計抗腫瘤治療新方案成為可能。
腫瘤的分子靶向治療是一種有異於傳統手術、放療、化療的新治療模式，其優點在於藥物通常僅與相應的靶位結合，藉由直接影響其靶位分子的功能，或所攜帶的物理或化學效應分子來達到殺傷或抑制目標細胞的作用。由於靶位明確，該類藥物通常具有很高的選擇性，既可有效殺傷或抑制靶細胞，又對正常組織細胞不產生或僅產生較小的毒副作用。因此，研製分子靶向藥物成為腫瘤臨床研究的熱點。
人滋養層細胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen 2，TROP-2)是由TACSTD2基因編碼的細胞表面糖蛋白。TROP-2由323個胺基酸構成，其中信號肽26個胺基酸，胞外區248個胺基酸，跨膜區23個胺基酸，胞質區26個胺基酸。TROP-2細胞外結構域中存在4個非均質N結合糖基化位點，添加糖鏈後，表觀分子量增加11至13KD。TACSTD基因家族中，細胞外結構域具有特徵性的甲狀腺球蛋白(TY)序列，通常認為其與癌細胞的增殖、浸潤、轉移有關。
截至目前，尚未鑒定出TROP-2的生理學上的配體，分子功能尚未闡明，但由於其細胞內303號殘基絲胺酸(S303)可藉由Ca2+依賴性蛋白激酶C(PKC)作用而磷酸化，進而促進4,5-二磷酸磷脂醯肌醇(PIP2)水解，形成絲裂原活化蛋白激酶途徑(MAPK)相關的三磷酸肌醇IP3，該信號通路和細胞增殖密切相關，提示Trop2具有介導腫瘤細胞中信號傳遞的功能。
大量臨床研究和文獻報導表明TROP-2在胃癌、肺癌、大腸、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰癌、肝癌、食道癌等多種上皮源癌腫中過度表達。與此相對，TROP-2在成年人正常組織中很少表達或不表達，僅限於上皮區域的細胞有少量表達，表達水平也比癌腫中低，表明TROP-2與腫瘤形成有關。TROP-2在腫瘤組織中的過表達與患者的預後不良和癌細胞的轉移密切相關，同時影響患者的總生存率。因此，TROP-2已成為腫瘤分子靶向治療中引人注目的標靶。
已經報告了幾種抗hTROP-2抗體的抗腫瘤效果的研究：
美國專利第5840854號報告了與細胞毒素結合的抗hTROP-2單株抗體(BR110)對人癌細胞株H3619、H2987、MCF-7、H3396及H2981的細胞毒性。
美國專利第6653104號中公開了一種抗體(RS7)，使用經放射性物質標記的抗體在體內模型中進行了試驗，在裸小鼠異種移植模型中顯示出抗腫瘤活性，但沒有報告僅裸抗時的抗腫瘤效果。
美國專利第7420040號還報導了由人卵巢癌組織免疫小鼠而得的融合瘤細胞株AR47A6.4.2或AR52A301.5產生的分離單株抗體與hTROP-2結合，並且在裸小鼠異種移植模型中顯示抗腫瘤活性。
CN102827282A公開了一種人源抗TROP-2基因工程抗體IgG及其應用，體外試驗結果表明該抗TROP-2抗體IgG對胰腺癌細胞的增殖具有顯著的抑制作用。
CN104114580A公開了一種與hTROP-2特異性反應且在體內具有抗腫瘤活性的抗體(特別是人源化抗體)，以及產生該抗體的融合瘤、該抗體與藥劑的複合物、腫瘤的診斷用或治療用醫藥組成物、腫瘤的檢測方法、腫瘤的檢測用或診斷用試劑盒。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，該抗體-藥物偶聯物如通式(A)所示：
Ab-(L 2 -L 1 -D) y (A)
其中，
D是細胞毒性藥物；
L1選自-O-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-、-O-CR5R6-(CRaRb)m-、-O-CR5R6-、-NH-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-或-S-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-；
Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基、烷氧基、羥基、胺基、氰基、硝基、羥烷基、環烷基或雜環基；
或者，Ra和Rb與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；
R5選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；
R6選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；
或者，R5和R6與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；
或者，Ra和R6與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；
m選自0至4的整數；
y選自1至10的數，y是小數或整數；
L2為橋接單元；
Ab為抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其包含抗體輕鏈可變區和抗體重鏈可變區，該抗體重鏈可變區包含至少1個選自以下序列所示的HCDR：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5；該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自以下序列所述的LCDR：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該抗體重鏈可變區包含：
SEQ ID NO：3所示的HCDR1、
SEQ ID NO：4所示的HCDR2和
SEQ ID NO：5所示的HCDR3。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該抗體輕鏈可變區包含：
SEQ ID NO：6所示的LCDR1、
SEQ ID NO：7所示的LCDR2和
SEQ ID NO：8所示的LCDR3。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該抗體重鏈可變區包含：
SEQ ID NO：3所示的HCDR1、
SEQ ID NO：4所示的HCDR2和
SEQ ID NO：5所示的HCDR3；以及
該抗體輕鏈可變區包含：
SEQ ID NO：6所示的LCDR1、
SEQ ID NO：7所示的LCDR2和
SEQ ID NO：8所示的LCDR3。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段選自鼠源抗體或其抗原結合片段、嵌合抗體或其抗原結合片段、人抗體或其抗原結合片段、人源化抗體或其抗原結合片段。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區或其變體。
在本發明進一步較佳的實施方案中，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人IgG1、IgG2或IgG4的重鏈恆定區或其變體。
在本發明進一步較佳的實施方案中，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：48，或如SEQ ID NO：49所示的重鏈恆定區。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人抗體κ鏈、λ鏈的輕鏈恆定區或其變體。
在本發明進一步佳的實施方案中，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人抗體κ鏈的輕鏈恆定區；
在本發明進一步較佳的實施方案中，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：50所示的輕鏈恆定區。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明的所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段包含選自以下序列所示的重鏈可變區，或與以下序列相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段包含選自以下序列所示的輕鏈可變區，或與以下序列相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段含有選自如下序列所示的重鏈，或與以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段含有選自以下序列所示的輕鏈，或與以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：44。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段包含：
(1)SEQ ID NO：9所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：10所示的輕鏈可變區；或，
(2)SEQ ID NO：11所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：12所示的輕鏈可變區；或，
(3)SEQ ID NO：13所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區；或，
(4)SEQ ID NO：15所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：16所示的輕鏈可變區；或，
(5)SEQ ID NO：17所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：18所示的輕鏈可變區；或，
(6)SEQ ID NO：19所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：20所示的輕鏈可變區；或，
(7)SEQ ID NO：21所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：22所示的輕鏈可變區；或，
(8)SEQ ID NO：23所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：24所示的輕鏈可變區；或，
(9)SEQ ID NO：25所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：26所示的輕鏈可變區。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該抗TROP-2抗體包含：
(1)SEQ ID NO：27所示的重鏈和SEQ ID NO：28所示的輕鏈；或，
(2)SEQ ID NO：29所示的重鏈和SEQ ID NO：30所示的輕鏈；或，
(3)SEQ ID NO：31所示的重鏈和SEQ ID NO：32所示的輕鏈；或，
(4)SEQ ID NO：33所示的重鏈和SEQ ID NO：34所示的輕鏈；或，
(5)SEQ ID NO：35所示的重鏈和SEQ ID NO：36所示的輕鏈；或，
(6)SEQ ID NO：37所示的重鏈和SEQ ID NO：38所示的輕鏈；或，
(7)SEQ ID NO：39所示的重鏈和SEQ ID NO：40所示的輕鏈；或，
(8)SEQ ID NO：41所示的重鏈和SEQ ID NO：42所示的輕鏈；或，
(9)SEQ ID NO：43所示的重鏈和SEQ ID NO：44所示的輕鏈；或，
(10)SEQ ID NO：45所示的重鏈和SEQ ID NO：38所示的輕鏈；或，
(11)SEQ ID NO：47所示的重鏈和SEQ ID NO：28所示的輕鏈。
在本發明的一些實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，L1如通式(B)所示：
其中，
M1為-CR1R2-；
R1和R2相同或不同，R1和R2各自獨立的選自氫、烷基、鹵素、羥基或胺基；
n選自0~5的整數，較佳1、2或3。
在本發明的一些實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，L2如通式(C)所示：
其中，
M2為-CR4R5-；
R3選自氫、鹵素、羥基、胺基、烷基、烷氧基和環烷基：
R4和R5相同或不同，各自獨立的選自氫、烷基、鹵素、羥基或胺基；
m選自0~5的整數，較佳1、2或3。
在本發明進一步較佳的實施方案中，該L1的O端與橋接單元L2相連。
在本發明進一步較佳的實施方案中，該L1的O端與橋接單元L2的S端相連。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中，
L1為-O-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-；
Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素或烷基；
R5為鹵烷基或C3-6環烷基；
R6選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；
或者，R5和R6與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；
m選自0或1。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，該L1如通式(E)所示：
其中，R5為鹵烷基或環烷基，
R6選自氫、鹵烷基或環烷基，
或者，R5和R6與其相連接的碳原子一起形成環烷基；
較佳地，
R5選自C1-6鹵烷基或C3-6環烷基，
R6選自氫、C1-6鹵烷基或C3-6環烷基，
或者，R5和R6與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；
m選自0至4的整數。
在本發明進一步較佳的實施方案中，該通式(E)選自以下取代基：
在本發明的一些實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，該L2如以下通式(D)所示：
-K1-K2-K3-K4- (D)
其中，
K1為，s選自2至8的整數；
K2選自-NR1(CH2CH2O)pCH2CH2C(O)-、-NR1(CH2CH2O)pCH2C(O)-、-S(CH2)pC(O)-或單鍵，p選自1至20的整數，較佳1至6的整數；
R1選自氫、氘、羥基、胺基、烷基、鹵素、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；
K3為四肽殘基，較佳地，該四肽殘基選自由兩個或多個苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、賴胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、谷胺酸、天冬胺酸中的胺基酸形成的肽殘基；更佳為GGFG的四肽殘基；
K4為-NR2(CR3R4)t-，R2、R3或R4各自獨立地為氫、氘、羥基、胺基、烷基、鹵素、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基，t選自1或2。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該橋接單元-L2-，其K1端與Ab相連，K4端與L1相連。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該-L2-L1-為以下結構：
其中，K2為鍵；
K3為GGFG的四肽殘基；
R5選自鹵烷基或C3-6環烷基；
R6選自氫、鹵烷基或C3-6環烷基；
或者，R5和R6與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；
R2、R3或R4各自獨立地選自氫或烷基；
s選自2至8的整數；
m選自0至4的整數。
在本發明進一步佳的實施方案中，該-L2-L1-選自以下結構：
在本發明的一些實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該細胞毒性藥物選自毒素、化療藥物、抗生素、放射性同位素和核溶酶。
在本發明較佳的實施方案中，該細胞毒性藥物選自抑制細胞分裂的微管蛋白抑制劑或DNA拓撲異構酶抑制劑；較佳喜樹鹼衍生物、DM1、DM3、DM4、SN-38、MMAF或MMAE；更佳依喜替康或依喜替康衍生物、SN-38、MMAE或MMAF。
在本發明較佳的實施方案中，該細胞毒性藥物選自：
在本發明較佳的實施方案中，該細胞毒性藥物選自依喜替康衍生物，較佳地，該依喜替康衍生物為化合物2-A：
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為通式(I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
其中，L1、L2是橋接單元；
y為選自1~10的數，較佳為2-8的數，更佳2-4的數；Ab選自如上所述的TROP-2抗體或其抗原結合片段。
在本發明較佳的實施方案中，該通式(I)如通式(I-A)所示：
其中L2如前述所定義；較佳地，L2如前述通式(C)所定義。
在本發明較佳的實施方案中，該通式(I)如通式(I-B)所示的：
其中L1如前述所定義；較佳地，L2如前述通式(B)所定義。
在本發明的一些實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為通式(II)所示化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
其中，L1、L2是橋接單元；
y為選自1~10的數，較佳為2-8的數，更佳2-4的數；
Ab選自如前所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段；
在本發明較佳的實施方案中，該通式(II)如通式(II-A)所示：
其中L2如前述所定義；較佳地，L2如前述通式(C)所定義。
在本發明較佳的實施方案中，該通式(II)如通式(II-B)所示：
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為通式(III)所示化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
其中，L1、L2是橋接單元；
y為選自1~10的數，較佳為選自2-8的數，更佳4-8的數；
Ab選自如前所述的TROP-2抗體或其抗原結合片段。
在本發明進一步較佳的實施方案中，該通式(III)所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中L1如通式(E)所定義，L2如通式(D)所定義。
在本發明進一步較佳的實施方案中，該通式(III)所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中橋接單元-L2-，其K1端與Ab相連，K4端與L1相連。
在本發明進一步較佳的實施方案中，該通式(III)所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，該-L2-L1-選自以下結構：
K2為鍵；
K3為GGFG的四肽殘基；
R5選自鹵烷基或C3-6環烷基；
R6選自氫、鹵烷基或C3-6環烷基；
或者，R5和R6與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；
R2、R3或R4各自獨立地為氫或烷基；
s選自2至8的整數；
m選自0至4的整數；
較佳地，-L2-L1-選自以下結構：
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為通式(IV)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
其中，
W選自C1-8烷基、C1-8烷基-環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該雜烷基包含1至3個選自N、O或S的雜原子，其中該C1-8烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；
K2選自-NR1(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR1(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-或鍵，R1選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基，p1為1至20的整數；
K3選自由2至7個胺基酸構成的肽殘基，胺基酸可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基為一個或多個獨立地選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基；
R2獨立地選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；
R3和R4各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；
R5選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；
R6選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；
或者，R5和R6與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；
m選自0至4的整數；
y選自1至10的數，y是小數或整數；
Ab選自本發明所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段。
在本發明進一步較佳的實施方案中，根據本發明所述的的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為通式(IV-A)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
在本發明進一步較佳的實施方案中，該通式(IV-A)選自以下結構：
在本發明的一些實施方案中，根據本發明的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物選自以下化合物：
其中Ab選自本發明所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段；較佳地，Ab選自本發明的HU1-HU10，HU6DL。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其選自如下化合物：
和
其中，y選自2-10，較佳4-8，更佳6-8，進一步佳7-8，最佳8，y是小數或整數。
另一方面，本發明提供了一種製備如通式(IV)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的方法，其包括以下步驟：
Ab還原後，與通式(F)偶聯反應，得到通式(IV)所示的化合物；
其中，Ab選自如前所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段；
W、K2、K3、R2~R6、m和y如通式(IV)中所定義。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明通式(IV)所述的製備方法，其中該通式(F)為通式(F-1)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽：
其中，K2、K3、R2~R6、s和m如通式(IV)中所定義。
在本發明的一些實施方案中，根據本發明通式(F)或通式(F-1)所示的化合物，其選自：
另一方面，本發明提供了一種醫藥組成物，其包含本發明所述的抗體-藥物偶聯物或該抗體-藥物偶聯物藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，和一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
另一方面，本發明還提供了通式(A)所述的抗體-藥物偶聯物或該抗體-藥物偶聯物藥學上可接受的鹽或溶劑化合物或其醫藥組成物在製備用於治療與人TROP-2相關疾病的藥物中的應用。
在本發明更佳的實施方案中，該與人TROP-2相關的疾病為製備用於治療TROP-2高表達的癌症的藥物中的應用，該癌症選自三陰性乳腺癌、小細胞肺癌、尿路上皮癌、人腦星形膠質母細胞瘤、人咽頭癌、腎上腺腫瘤、AIDS-相關癌症、腺泡狀軟組織肉瘤、星形細胞瘤、膀肮癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、促結締組織增生性小圓細胞腫瘤、室管膜細胞瘤、尤文腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維發育不全、骨纖維性發育不良、膽 囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養細胞疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞瘤、卡波因肉瘤、腎癌、白血病、脂肪肉瘤、惡性脂肪瘤性腫瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤病、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合症、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺瘤、小兒癌症、外周神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、後葡萄膜黑色素瘤、腎轉移性癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌和子宮癌。
本發明的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物能夠特異性結合靶抗原，內吞效率高，體內半衰期時間長，在保證安全性的同時，顯著殺傷腫瘤。
圖1顯示抗體的ELISA體外結合實驗，顯示11個人源化抗TROP-2抗體與人TROP-2抗原的結合活性。
[發明詳述]
一、術語
為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本文件中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
本發明所述的術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列 的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2，和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本發明所述的抗體或抗原結合片段的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則和Kabat或ABM定義規則(http：//bioinf.org.uk/abs/)。
術語“抗原呈遞細胞”或“APC”是在其表面上展示與MHC複合的外來抗原的細胞。T細胞利用T細胞受體(TCR)識別這種複合物。APC的實例包括但不限於樹突細胞(DC)、外用血單個核細胞(PBMC)、單核細胞、B淋巴母細胞和單核細胞衍生的樹突細胞。
術語“抗原呈遞”是指APC捕獲抗原和使它們能夠被T細胞識別的過程，例如作為MHC-I/MHC-II偶聯物的組分。
術語“TROP-2”包括由細胞天然表達的TROP-2的任何變體或同種型。本發明的抗體可與得自非人物種的TROP-2交叉反應。作為另一種選擇，該抗體也可以是人TROP-2特異性的，可不表現出與其他物種的交叉反應性。TROP-2或其任何變體或同種型可從天然表達它們的細胞或組織中分離而得，或使用本領域通用以及本文所述的那些技術藉由重組技術產生。較佳地，抗TROP-2抗體靶向具有正常糖基化模式的人源TROP-2。
術語“重組人抗體”包括藉由重組方法製備、表達、創建或分離的人抗體，所涉及的技術和方法在本領域中是熟知的，諸如：
1.從人免疫球蛋白基因的轉基因、轉染色體動物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤中分離的抗體；
2.從經轉化以表達抗體的宿主細胞如轉染瘤中分離的抗體；
3.從重組組合人抗體文庫中分離的抗體；以及
4.藉由將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法製備、表達、創建或分離的抗體。
此類重組人抗體包含可變區和恆定區，這些區域利用特定的由種系基因編碼的人種系免疫球蛋白序列，但也包括隨後諸如在抗體成熟過程中發生的重排和突變。
術語“鼠源抗體”在本發明中為根據本領域知識和技能製備的對人TROP-2的單株抗體。製備時用TROP-2抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本發明一個較佳的實施方案中，該鼠源TROP-2抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。
術語“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本發明的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。然而，術語“人抗體”不包括這樣的抗體，即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗體”)。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。人源化抗體可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的免疫應答反應的缺點。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對該人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要選建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再據需要選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。人抗體的恆定區可選自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後增強ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG1重鏈恆定區。
術語“抗原結合片段”是指抗體的抗原結合片段及抗體類似物，其通常包括至少部分母體抗體(parental antibody)的抗原結合區或可變區(例如一個或多個CDR)。抗體片段保留母體抗體的至少某些結合特異性。通常，當基於摩爾來表示活性時，抗體片段保留至少10%的母體結合活性。較佳地，抗體片段保留至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多的母體抗體對標靶的結合親和力。抗原結合片段實例包括但不限於：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、線性抗體(linear antibody)、單鏈抗體、奈米抗體、結構域抗體和多特異性抗體。工程改造的抗體變體綜述於Holliger和Hudson，2005，Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
“Fab片段”由一條輕鏈和一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。
“Fc”區含有包含抗體的CH2和CH3結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個或多個二硫鍵並藉由CH3結構域的疏水作用保持在一起。
“Fab’片段”含有一條輕鏈和包含VH結構域和CH1結構域以及CH1和CH2結構域之間區域的一條重鏈的部分，由此可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”含有兩條輕鏈和兩條包含CH1和CH2結構域之間的恆定區的部分的重鏈，由此在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab’)2片段由藉由兩條重鏈間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段組成。
“Fv區”包含來自重鏈和輕鏈二者的可變區，但缺少恆定區。
術語“多特異性抗體”按其最廣義使用，涵蓋具有多表位特異性的抗體。這些多特異性抗體包括但不限於：包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗體，其中該VH-VL單元具有多表位特異性；具有兩個或多個VL和VH區的抗體，每個VH-VL單元與不同的靶點或同一個靶點的不同表位結合；具有兩個或更多個單可變區的抗體，每個單可變區與不同的靶點或同一個靶點的不同的表位結合；全長抗體、抗體片段、雙抗體(diabodies)、雙特異性雙抗體和三抗體(triabodies)、己共價或非共價連接在一起的抗體片段等。
術語“單鏈抗體”是由抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL藉由一段連接肽連接而成的單鏈重組蛋白，它是具有完全抗原結合位點的最小抗體片段。
術語“結構域抗體片段”是僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區鏈的具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。在某些情況下，兩個或多個VH區與肽接頭共價連接以形成二價結構域抗體片段。二價結構域抗體片段的兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
本發明的術語“與TROP-2結合”，指能與人TROP-2相互作用。
本發明的術語“抗原結合位點”指本發明抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
術語“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
本發明所用的術語“特異性結合”、“選擇性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用人TROP-2作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中藉由表面電漿共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10-7M或甚至更小的平衡解離常數(KD)與預定的抗原結合，並且其與預定抗原結合的親和力是其與預定抗原或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。術語“識別抗原的抗體”在本文中可以與術語“特異性結合的抗體”互換使用。
術語“交叉反應”是指本發明的抗體與來自不同物種的TROP-2結合的能力。例如，結合人TROP-2的本發明的抗體也可以結合另一物種的TROP-2。交叉反應性是藉由在結合測定(例如SPR和ELISA)中檢測與純化抗原的特異性反應性，或與生理表達TROP-2的細胞的結合或功能性相互作用來測量。確定交叉反應性的方法包括如本文所述的標準結合測定，例如表面電漿共振(SPR)分析，或流式細胞術。
術語“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。配體的抑制/阻斷較佳地降低或改變無抑制或阻斷的情況下發生配體結合時出現活性的正常水平或類型。抑制和阻斷也旨在包括與抗TROP-2抗體接觸時，與未與抗TROP-2抗體接觸的配體相比，任何可測量的配體結合親和力降低。
術語“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。
術語“誘導免疫應答”和“增強免疫應答”可互換使用，並指免疫應答對特定抗原的剌激(即，被動或適應性的)。針對誘導CDC或ADCC的術語“誘導”是指剌激特定的直接細胞殺傷機制。
本發明中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，是指表達Fc受體的細胞藉由識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾，增強或降低降低或消除抗體的ADCC效應功能。該修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變。
生產和純化抗體和抗原結合片段的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。如，小鼠可以用人TROP-2或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人FR區。人FR種系序列可以從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。相應抗體的cDNA序列可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在FC區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
本發明的抗體指單株抗體。本發明所述的單株抗體(mAb)，指由單一的純株細胞株得到的抗體，該細胞株不限於真核的、原核的或噬菌體的純株細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、合成技術(如CDR-grafting)、或其它現有技術進行重組得到。
“施用”、“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸、以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，諸如包含本發明的任一種抗體，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療 作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。盡本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個患都有的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
整個說明書和申請專利範圍中使用的術語“基本上由......組成”或其變形表示包括所有所述元件或元件組，並且任選包括與所述元件類似或不同性質的其它元件，該其它元件非顯著改變指定給藥方案、方法或組成物的基本性質或新性質。
本發明所述的應用於某個對象的術語“天然存在的”是指這樣的事實，即該對象可在自然界中發現。例如存在於可從自然界來源分離得到的生物體(包括病毒)、且未經人工在實驗室中有意修飾的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
“有效量”包含足以改善或預防醫字病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑 和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指根據背景在生物、細胞或人體外產生的物質。
“內源性”指根據背景在細胞、生物或人體內產生的物質。
“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
“任選”或“任選地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“任選包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述抗體或其抗原結合片段，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
以下結合實施例用於進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1抗原準備
編碼帶His標簽的人TROP-2(TROP-2-His)蛋白由SinoBiologics公司合成(10428-H08H)。
TROP-2-His序列：
SEQ ID NO：46
實施例2鼠融合瘤及抗體序列的獲得
用人抗原TROP-2-His進行動物免疫，共5隻Balb/c和5隻A/J小鼠，雌性，10週齡，使用Sigma完全弗氏佐劑(CFA)和Sigma不完全弗氏佐劑(IFA)， 免疫原和免疫佐劑以1：1的比例充分混合乳化，製成穩定“油包水”液體；注射劑量25μg/200μL/小鼠。
對免疫小鼠血清使用如實施例3所述的間接ELISA法評估血清效價及結合細胞表面抗原的能力，對照效價檢測情況(大於10萬倍稀釋度)決定啟動細胞融合。選擇血清效價、親和力和FACS結合強的免疫小鼠進行一次終免疫後犧牲小鼠，取脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合後鋪板獲得融合瘤，藉由間接ELISA篩選到目標融合瘤，並藉由有限稀釋法建株為單株細胞株。得到的陽性抗體株進一步使用間接ELISA進行篩選，從而選定結合重組蛋白的融合瘤。收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,15596-018)提取RNA並反轉錄(PrimeScriptTM Reverse Transcriptase，Takara #2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用小鼠Ig引子組(Novagen，TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後測序，最終得到鼠源抗體的序列。
鼠單抗M1的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
M1 HCVR
SEQ ID NO：1
M1 LCVR
SEQ ID NO：2
實施例3 抗體的體外結合活性檢測方法
(1)體外間接ELISA結合實驗：
用pH7.4的PBS將TROP-2His蛋白(Sino Biological Inc.，cat# 10428-H08H)稀釋至1μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔高親和力酶標板中，於4℃冰 箱孵育過夜(16-20小時)。用PBST(pH7.4 PBS含0.05%Tween-20)洗板4次後，加入用PBST稀釋的3%牛血清白蛋白(BSA)封閉液150μl/孔，室溫孵育1小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板4次。
用含3%BSA的PBST稀釋待測抗體，1μM起始，10倍梯度，10個劑量，以100μl/孔加到酶標板中，放於室溫孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板4次，加入100μl/孔用含3%BSA的PBST稀釋的HRP標記羊抗人二抗(Abcam，cat#ab97225)，室溫孵育1小時。用PBST洗板4次後，加入100μl/孔TMB顯色受質(Cell Signaling Technology，cat#7004S)，於室溫避光孵育1分鐘，加入100μl/孔終止溶液(Cell Signaling Technology，cat#7002S)終止反應，用酶標儀(BioTek，型號Synergy H1)在450nm處讀取吸收值，分析數據。做濃度信號值曲線分析結果，如下表所示：
(2)體外細胞結合實驗：
收集培養好的TROP-2高表達細胞(過表達TROP-2的CHO或293細胞和表達TROP-2的腫瘤細胞，如HCC-827、MDA-MB-468等)，調節細胞密度後分鋪於96孔U底板，每孔1×105至2×105個細胞。1200g，5min離心，去上清液，添加100ul已梯度稀釋的抗體溶液或小鼠免疫血清，4℃度孵育60min；1200g，5min離心，去上清液，PBS洗細胞2次後，添加螢光標記二抗(PE-GAM或PE-GAH)100ul每 孔，4℃度孵育60min。1200g，5min離心去上清液。PBS洗細胞2次後，再重新懸浮於PBS，使用流式細胞計數儀檢測信號，並作濃度曲線分析結果。
實施例4 小鼠抗體人源化實驗
鼠源抗人TROP-2單株抗體人源化如本領域許多文獻公示的方法進行。簡言之，使用人恆定結構域替代親本(鼠源抗體)恆定結構域，根據鼠源抗體和人抗體的同源性選擇人種抗體序列，本發明將鼠源抗體M1進行人源化。
在所獲得的鼠源抗體VH/VL CDR典型結構的基礎上，將重、輕鏈可變區序列與人源抗體種系數據庫比較，獲得同源性高的人種系模板。
將鼠源抗體M1的CDR區移植到選擇好的相應人源化模板上。然後，以鼠源抗體的三維結構為基礎，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基、以及對VL和VH的構象有重要影響的殘基進行回復突變，經表達測試和回復突變數量對比，選擇出設計了人源化重鏈可變區HCVR和輕鏈可變區LCVR序列組合而成的抗體，序列如下：
HU1 HCVR
SEQ ID NO：9
HU1 LCVR
AIRMTQSPFSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYLQKPGQSPQLLIYSASYRYTRIPPRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCQQHYSTPLTFGQGTRLEIK SEQ ID NO：10
HU2 HCVR
SEQ ID NO：11
HU2 LCVR
ETTLTQSPAFMSATPGDKVNISCKASQDVSTAVAWYLQKPGQSPQLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPLTFGQGTRLEIK SEQ ID NO：12
HU3 HCVR
SEQ ID NO：13
HU3 LCVR
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKASQDVSTAVAWYLQKPGQSPQLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQHYSTPLTFGQGTRLEIK SEQ ID NO：14
HU4 HCVR
SEQ ID NO：15
HU4 LCVR
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQHYSTPLTFGQGTRLEIK SEQ ID NO：16
HU5 HCVR
SEQ ID NO：17
HU5 LCVR
SEQ ID NO：18
HU6 HCVR
SEQ ID NO：19
HU6 LCVR
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLFIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPLTFGQGTRLEIK SEQ ID NO：20
HU7 HCVR
SEQ ID NO：21
HU7 LCVR
AIRMTQSPFSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYLQKPGQSPQLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQHYSTPLTFGQGTRLEIK SEQ ID NO：22
HU8 HCVR
SEQ ID NO：23
HU8 LCVR
AIRMTQSPFSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYLQKPGQSPQLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQHYSTPLTFGQGTRLEIK SEQ ID NO：24
HU9 HCVR
SEQ ID NO：25
HU9 LCVR
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKASQDVSTAVAWYLQKPGQSPQLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPLTFGQGTRLEIK SEQ ID NO：26
將設計的重鏈和輕鏈可變區序列分別與IgG重鏈恆定區和人抗體輕鏈恆定區序列連接，示例性的重鏈恆定區和輕鏈恆定區序列如下：
IgG1 C1
SEQ ID NO：48
IgG1 C2
SEQ ID NO：49
Ig kappa C
SEQ ID NO：50
得到重鏈和輕鏈序列如下(其中，HU1-HU9重鏈來自於將序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25分別連接於序列SEQ ID NO：49；HU6DL和HU10重鏈來自於將序列SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：9分別連接於序列SEQ ID NO：48)：
HU1 HC
SEQ ID NO：27
HU1 LC
SEQ ID NO：28
HU2 HC
SEQ ID NO：29
HU2 LC
SEQ ID NO：30
HU3 HC
SEQ ID NO：31
HU3 LC
SEQ ID NO：32
HU4 HC
SEQ ID NO：33
HU4 LC
SEQ ID NO：34
HU5 HC
SEQ ID NO：35
HU5 LC
SEQ ID NO：36
HU6 HC
SEQ ID NO：37
HU6 LC
SEQ ID NO：38
HU7 HC
SEQ ID NO：39
HU7 LC
SEQ ID NO：40
HU8 HC
SEQ ID NO：41
HU8 LC
SEQ ID NO：42
HU9 HC
SEQ ID NO：43
HU9 LC
SEQ ID NO：44
HU6DL HC
SEQ ID NO：45
HU6DL LC
SEQ ID NO：38
HU10 HC
SEQ ID NO：47
HU10 LC
SEQ ID NO：28
根據以上各人源化抗體輕鏈和重鏈的胺基酸序列合成cDNA片段，插入到pcDNA3.1表達載體(Life Technologies Cat.No.V790-20)中。將表達載體和轉染試劑PEI(Polysciences，Inc.Cat.No.23966)以1：2的比例轉染HEK293細胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，並置於CO2孵育箱中孵育4-5天。收取細胞培養液，離心過濾後上樣到抗體純化親和管柱，經磷酸緩衝液洗管柱、甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.7 0.1M Gly-HCl)沖提、1M Tris鹽酸pH 9.0中和、以及磷酸緩衝液透析，得到本發明的人源化抗體蛋白，其濃度和純度如下表所示：
實施例5 體外結合親和力和動力學實驗
使用實施例3(1)體外間接ELISA結合實驗測定的各人源化抗體對人TROP-2抗原的親和力(EC50)如下表所示：
為檢測各人源化抗體與腫瘤細胞上的標靶蛋白TROP-2的結合能力，使用實施例3(2)體外細胞結合實驗測定的各人源化抗體對HCC827腫瘤細胞(非小細胞肺癌)、MAB-MB-468腫瘤細胞(乳腺癌，浸潤型導管癌)的親和力(EC50)如下表所示：
實施例6 人源化抗體介導的腫瘤細胞殺傷作用
人源化抗體可以從多個方面發揮對腫瘤細胞的殺傷作用，其中之一是介導免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。為檢測本發明人源化抗體介導的免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，採用人外周血單個核細胞(PBMC)與HCC827腫瘤細胞(非小細胞肺癌)共培養的系統進行評估。收集HCC827細胞，離心計數後用完全培養基調整細胞密度為0.44×106/mL，鋪於白色96孔板中間60個孔，每孔90μL，細胞數為4000。收集商業化的人PBMC細胞，離心計數後用完全培養基 調整細胞密度為2.2×106個/mL，鋪於已有HCC827細胞的白色96孔板中間60個孔，每孔90μL，細胞數為20000。其餘邊孔加入200μL PBS，細胞板放入37℃，5%CO2培養箱培養過夜。實驗第二天，用PBS在96孔V型底板中配製人源化抗體溶液，濃度為1000nM起始，3倍稀釋，9個濃度，配製完成後加入到白色96孔板中，每孔20μL，兩複孔，將細胞板放入37℃，5%CO2培養箱中繼續培養72小時。實驗第五天，檢測讀數：取出細胞培養板，平衡至室溫後，每孔加入50μL CTG溶液(Promega G7573)，振盪混勻後放於暗處靜置10分鐘後，使用酶標儀的發光程序進行檢測。實驗結果如下表8所示：
採用同樣方法測定HU6抗體對HCC827腫瘤細胞的殺傷作用，結果顯示最高劑量殺傷效果為52.3%。
實施例7 人源化抗體介導的TROP-2內吞
為研究人源化抗體介導的TROP-2蛋白在腫瘤細胞中的內吞，將SW780細胞使用胰酶消化，收集細胞並用預冷的PBS重新懸浮，調整細胞濃度為1×106個/mL。取EP管，加入1mL細胞懸液，1500rpm離心5分鐘後去上清液，加入1mL已經配製好的待測抗體重新懸浮細胞，抗體的終濃度均為20μg/ml，4度搖床孵育1h，離心 棄上清液(4℃、1500rpm×5min)，PBS洗滌兩次，去上清液。每管加入100μL螢光二抗工作液重新懸浮細胞，4℃搖床孵育30min，離心棄上清液(4℃、1500rpm×5min)，PBS洗滌兩次，去上清液。每管加入1.0mL預熱的SW780細胞完全培養基重新懸浮細胞並混勻後，分裝為4管，每管200μL，分別為0min組，blank組，30min組和2h組，取出0min及blank置於冰上，其餘放置於37℃培養箱，分別內吞30min、2h，在不同相應時間點取出1管，置於冰上預冷5min，所有處理組離心棄上清液(4℃、1500rpm×5min)，用PBS洗滌一次，去上清液。除0min組外所有處理組的管中加入250μL strip buffer，室溫孵育8min，離心棄上清液(4℃、1500rpm×5min)，PBS洗滌兩次，去上清液。所有處理組加入100μL免疫染色固定液，4℃放置30min以上，上機用流式細胞儀DxFlex進行檢測。從0min組的管中，取200μl，直接加免疫染色固定液。從blank組取200μl，直接加strip buffer和加免疫染色固定液。上機用流式細胞儀DxFlex進行檢測。數據統計和分析：30min平均內吞百分比(%)=(30min組MIF-blank組MFI)/(0min組MFI-blank組MFI)，2h平均內吞百分比(%)=(2h組MIF-blank組MFI)/(0min組MFI-blank組MFI)。採用上述方法檢測人源化抗體的內吞百分比如下表9：
實施例8 人源化抗體與抗原的競爭性結合
研究不同抗體與抗原的結合方式和結合位點，通常採用競爭性結合實驗。用pH7.4的PBS將hRS7抗體蛋白稀釋至1μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔高親和力酶標板中，於4℃冰箱孵育過夜(16-20小時)。用PBST(pH7.4 PBS含0.05%Tween-20)洗板4次後，加入用PBST稀釋的2%牛血清白蛋白(BSA)封閉液150μl/孔，室溫孵育1小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板4次。
用含2%BSA的PBST稀釋待測抗體至100μg/ml，以50μl/孔加到酶標板中。用含2%BSA的PBST稀釋TROP-2 His蛋白(Sino Biological Inc.，cat# 10428-H08H)，以50μl/孔加到酶標板中。將酶標板放於室溫孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板4次，加入100μl/孔用含2%BSA的PBST稀釋的anti-His HRP標記二抗(Abcam，cat#ab197049)，室溫孵育1小時。用PBST洗板4次後，加入100μl/孔TMB顯色受質(Cell Signaling Technology，cat#7004S)，於室溫避光孵育1分鐘，加入100μl/孔Stop Solution(Cell Signaling Technology，cat#7002S)終止反應，用酶標儀(BioTek，型號Synergy H1)在450nm處讀取吸收值，分析數據，如下表所示。本發明的人源化抗體對hRS7抗體與TROP2蛋白的結合抑制率很低，提示本發明的人源化抗體與hRS7抗體不競爭結合相同的表位。
實施例9 化合物1的製備
第一步，將2a(2g，17.2mmol溶於75mL乙腈中，依次加入碳酸鉀(9.27g，67.2mmol)、溴化苄(20mL，167.2mmol)和四丁基碘化銨(620mg，1.68mmol)。將反應液室溫攪拌48小時，藉由矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯(20 ml)淋洗，合併濾液減壓濃縮，用矽膠管柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到產物5a(3.2g，產率：90.1%)。
第二步，將5a(181.3mg,0.879mmol)和4b(270mg，0.733mmol)加入反應瓶，加入6mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入叔丁醇鉀(164mg，1.46mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌40分鐘，加入15mL冰水，用乙酸乙酯(40mL×2)和氯仿(20mL×5)萃取，合併有機相並濃縮。所得殘餘物溶於6mL二噁烷中，加入3mL水，加入碳酸氫鈉(73.8mg，0.879mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(190mg，0.734mmol)，室溫攪拌2小時。加入30mL水，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(30mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠管柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到產物5b 10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸苄酯(73mg，產率：19.4%)。
MS m/z(ESI)：515.0[M+1]。
第三步，將5b(30mg，0.058mmol)溶於6.75mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(18mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯淋洗，濾液濃縮，得到粗品產物5c 10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸(20mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：424.9[M+1]。
第四步，將1b(15mg，28.2μmol)加入反應瓶，加入1.5mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入粗品5c(20mg，47.1μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎 啉鹽(25.4mg，86.2μmol)，冰浴攪拌反應40分鐘。加入15mL水，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL×2)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物5d(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-環丙基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-側氧乙氧基)甲基)胺基)-2-側氧乙基)胺基甲酸酯(23.7mg，產率：78.9%)。
MS m/z(ESI)：842.1[M+1]。
第五步，將5d(30mg，35.7μmol)溶於3mL二氯甲烷中，加入1.5mL二乙胺，室溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，加入1.5mL甲苯並減壓濃縮，重複兩次。向殘餘物中加入4.5mL正己烷打漿，靜置後傾倒出上層清液，保留固體。將固體殘餘物減壓濃縮，油泵拉乾得到粗品產物5e 2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-2-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)乙醯胺(23mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：638.0[M+18]。
第六步，將粗品5e(20mg，32.3μmol)溶於1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入4g(31.8mg，67.3μmol)的0.5mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(27.8mg，94.3μmol)，冰浴攪拌反應10分鐘，撤去冰浴，升至室溫攪拌1小時，反應生成化合物5。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜管柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙 腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到產物5-A和5-B(3.6mg，2.6mg)。
MS m/z(ESI)：1074.4[M+1]。
單一構型化合物5-A(較短保留時間)：
UPLC分析：保留時間1.14分鐘，純度：85%(色譜管柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.60(t,1H),8.51-8.49(d,1H),8.32-8.24(m,1H),8.13-8.02(m,2H),8.02-7.96(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.31(s,1H),7.26-7.15(m,4H),6.99(s,1H),6.55-6.48(m,1H),5.65-5.54(m,1H),5.41(s,2H),5.35-5.15(m,3H),4.74-4.62(m,2H),4.54-4.40(m,2H),3.76-3.64(m，4H),3.62-3.48(m,2H),3.20-3.07(m,2H),3.04-2.94(m,2H),2.80-2.62(m,2H),2.45-2.30(m,3H),2.25-2.15(m,2H),2.15-2.04(m,2H),1.93-1.78(m,2H),1.52-1.39(m,3H),1.34-1.12(m,5H),0.87(t,3H),0.64-0.38(m,4H)。
單一構型化合物5-B(較長保留時間)：
UPLC分析：保留時間1.16分鐘，純度：89%(色譜管柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.68-8.60(m,1H),8.58-8.50(m,1H),8.32-8.24(m,1H),8.13-8.02(m,2H),8.02-7.94(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.31(s,1H),7.26-7.13(m,4H),6.99(s,1H),6.55-6.48(m,1H),5.60-5.50(m,1H),5.41(s,2H),5.35-5.15(m,3H),4.78-4.68(m,1H),4.60-4.40(m,2H),3.76-3.58(m,4H),3.58-3.48(m,1H),3.20-3.10(m,2H),3.08-2.97(m,2H),2.80-2.72(m,2H),2.45-2.30(m,3H),2.25-2.13(m,2H),2.13-2.04(m,2H),2.03-1.94(m,2H),1.91-1.78(m,2H),1.52-1.39(m,3H),1.34-1.12(m,5H),0.91-0.79(m,3H),0.53-0.34(m,4H)。
其他中間體的製備方法參考中間體5。
在37℃條件下，向抗體HU1的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；7.3ml，13.8mg/ml，0.681μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.347mL，3.47μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至14.0ml，並取出3.3ml溶液往下反應。
將化合物5-A(5.0mg，2.75μmol)溶解於0.15mL DMSO中，加入到上述3.3ml溶液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到Ab-依喜替康衍生物的示例性產物HU1-依喜替康衍生物的PBS緩衝液(1.45mg/mL，17mL)，於4℃冷凍儲存。
採用紫外法測定平均值y。將裝有琥珀酸鈉緩衝液的比色皿分別置於參比吸收池和樣品測定吸收池中後，扣除溶劑空白後，再將裝有供試品溶液的比色皿置於樣品測定吸收池中，測定280nm和370nm處吸光度。
數據處理：
藉由建立標準曲線，測定280nm波長下的吸收，確定抗體含量Cmab，測定370nm波長下的吸收，確定小分子含量CDrug。
藥物載量平均值y=CDrug/Cmab。
藉由以上方法測定示例性產物的藥物載量，並藉由UV-HPLC純化獲得化合物1(y=8)的樣品。
化合物2-化合物11的製備方法參考化合物1。類似的，採用化合物1相同的製備方法，使用現有技術中的hRS7抗體製備化合物12(y=8)：
實施例11 抗體偶聯MC-MMAF
第一步將硫代乙酸S-(3-醛丙基)酯(0.7mg，5.3mol)溶解於0.9mL乙腈溶液備用。向抗體pH=4.3的乙酸/乙酸鈉緩衝液(10.35mg/mL,9.0mL，0.97mol)加入上述預製的硫代乙酸S-(3-羥基丙基)酯的乙腈溶液，然後滴加1.0mL的氰基硼氫化鈉(14.1mg，224mol)的水溶液，於25℃下振盪反應2小時。反應結束後，用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH6.5的0.05M的PBS溶液)後，得產物1a溶液，濃縮到10mg/mL後直接進行下一步反應。
第二步，向1a溶液(11.0mL)中加入0.35mL的2.0M鹽酸羧胺溶液，於25℃下振盪反應30分鐘後，將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH6.5的0.05M的PBS溶液)後，得到產物2a溶液(濃度6.17mg/mL，14.7mL)。
第三步，將化合物MC-MMAF(1.1mg，1.2mol，採用PCT專利W02005081711公開的方法製備得到)溶解於0.3mL乙腈中，加入2a溶液(濃度6.17mg/mL，3.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後，將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH6.5的0.05M的PBS溶液)後，在無菌條件下用濾器過濾後得到產物Ab-MC-MMAF抗體-藥物偶聯物的PBS緩衝液(3.7mg/mL，4.7mL)，於4℃冷藏。
實施例12 抗體偶聯SN-38
第一步將硫代乙酸S-(3-醛丙基)酯(0.7mg，5.3mol)溶解於0.9mL乙腈溶液備用。向抗體pH=4.3的乙酸/乙酸鈉緩衝液(10.35mg/mL,9.0mL，0.97mol)加入上述預製的硫代乙酸S-(3-羥基丙基)酯的乙腈溶液，然後滴加1.0mL的氰基硼氫化鈉(14.1mg，224mol)的水溶液，於25℃下振盪反應2小時。反應結束後，用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH6.5的0.05M的PBS溶液)後，得產物1h溶液，濃縮到10mg/mL後直接進行下一步反應。
第二步，向1h溶液(11.0mL)中加入0.35mL的2.0M鹽酸羧胺溶液，於25℃下振盪反應30分鐘後，將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽 純化(沖提相：pH6.5的0.05M的PBS溶液)後，得到產物2h溶液(濃度6.2mg/mL，15.0mL)，濃縮到約10mg/ml後用於下一步反應。
第三步，將化合物MC-VC-PAB-SN-38(1.3mg，1.2mol)溶解於0.3ml的乙腈中，加入2h溶液(濃度6.2mg/mL，3.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後，將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH6.5的0.05M的PBS溶液)後，在無菌條件下用濾器過濾後得到產物Ab-SN-38抗體-藥物偶聯物的PBS緩衝液(3.7mg/mL，4.7mL)，於4℃冷藏。
實施例13抗體偶聯藥物對腫瘤細胞的殺傷作用
為檢測本發明的抗體-藥物偶聯物對腫瘤細胞的殺傷作用，用膀胱癌細胞SW780進行評估。收集SW780細胞，離心計數後用完全培養基調整細胞密度為0.44×106個/mL，鋪於白色96孔板中間60個孔，每孔90μL，細胞數為4000，其餘邊孔加入100μL PBS，細胞板放入37℃，5%CO2培養箱培養過夜。實驗第二天，用PBS在96孔V型底板中配製抗體-藥物偶聯物溶液，濃度為1000nM起始，3倍稀釋，9個濃度，配製完成後加入到白色96孔板中，每孔10μL，兩複孔，將細胞板放入37℃，5%CO2培養箱中繼續培養72小時。實驗第五天，檢測讀數：取出細胞培養板，平衡至室溫後，每孔加入50μL CTG溶液(Promega G7573)，振盪混勻後放於暗處靜置10分鐘後，使用酶標儀的發光程序進行檢測。藉由四參數擬合的方法計算EC50值，同時參照以上方法，評估了本發明抗體-藥物偶聯物對膀胱癌細胞RT4、表皮癌細胞A431的殺傷作用。實驗結果如表11所示：
實施例14 抗體偶聯藥物的藥物代謝動力學
為進一步研究抗體-藥物偶聯物在體內的藥物代謝動力學，藉由靜脈將抗體-藥物偶聯物注射入C57BL/6小鼠體內(劑量為10mg/kg)。在1h、2h、4h、8h、24h、48h、96h、144h和240h的時間點抽取20微升的血液，藉由實施例3(1)的ELISA的方法測定血液中抗體-藥物偶聯物的濃度之後，利用WinNonlin軟件對藥物代謝動力學數據進行分析，得到藥物代謝動力學參數，如下表12。
實施例15 抗體偶聯藥物的體內抗腫瘤作用
為進一步研究抗體-藥物偶聯物對體內形成的腫瘤的殺傷作用，在小鼠體內用N87形成移植瘤後，評估本發明抗體-藥物偶聯物的抗腫瘤效果。將5x106個N87細胞注射到免疫缺陷的裸鼠皮下，2週後開始藉由靜脈注射抗體-藥物偶聯物化合物10(y=8)和化合物12(y=8)，每2週注射一次，劑量為2mg/kg。對照採用人IgG1蛋白，劑量為2mg/kg。對照組或給藥組每組5隻小鼠。藉由測量腫瘤體積計算抑瘤率。抑瘤率=100%-(第28天給藥組腫瘤體積-第0天給藥組腫瘤體積)/(第28天對照組腫瘤體積-第0天對照組腫瘤體積)，實驗結果如表13所示：
化合物10(y=8)顯示了超過100%的抑瘤率，意味著化合物10(y=8)不僅能抑制腫瘤的生長，而且對已形成的腫瘤有殺傷的作用。
實施例16：依喜替康衍生物的製備
向2e(4mg，7.53μmol)中加入2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基嗎啉，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入2-環丙基-2-羥基乙酸1e(2.3mg，19.8μmol，採用專利申請“WO2013106717”公開的方法製備而得)、1-羥基苯并三唑(3mg，22.4μmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(4.3mg，22.4μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應1小時。撤去冰水浴，加熱至30℃攪拌2小時。反應液減壓濃縮，所得到的粗品化合物2-C用高效液相色譜法純化(分離條件：色譜管柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)，B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(2-A：1.5mg，2-B：1.5mg)。
MS m/z(ESI)：534.0[M+1]。
單一構型化合物2-B(較短保留時間)
UPLC分析：保留時間1.06分鐘，純度：88%(色譜管柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.37(d,1H),7.76(d,1H),7.30(s,1H),6.51(s,1H),5.58-5.56(m,1H),5.48(d,1H),5.41(s,2H),5.32-5.29(m,2H),3.60(t,1H),3.19-3.13(m,1H),2.38(s,3H),2.20-2.14(m,1H),1.98(q,2H),1.87-1.83(m,1H),1.50-1.40(m,1H),1.34-1.28(m,1H),0.86(t,3H),0.50-0.39(m,4H)。
單一構型化合物2-A(較長保留時間)
UPLC分析：保留時間1.10分鐘，純度：86%(色譜管柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.35(d,1H),7.78(d,1H),7.31(s,1H),6.52(s,1H),5.58-5.53(m,1H),5.42(s,2H),5.37(d,1H),5.32(t,1H),3.62(t,1H),3.20-3.15(m,2H),2.40(s,3H),2.25-2.16(m,1H),1.98(q,2H),1.87-1.82(m,1H),1.50-1.40(m,1H),1.21-1.14(m,1H),0.87(t,3H),0.47-0.35(m,4H)。
實施例17：依喜替康衍生物對腫瘤細胞體外增殖抑制測試
檢測化合物2-A和2-B，對U87MG細胞(中科院細胞庫，Catalog#TCHu138)和SK-BR-3腫瘤細胞(人乳腺癌細胞，ATCC，貨號HTB-30)體外增殖的抑制活性。以不同濃度的化合物體外處理細胞，經6天培養後，採用CTG(Luminescent Cell Viability Assay，Promega，貨號：G7573)試劑對細胞的增值進行檢測，根據IC50值評價該化合物的體外活性。
U87MG和SK-BR-3細胞分別用10%FBS的EMEM培養基(GE，貨號SH30024.01)和含10%FBS的McCoy's 5A培養基(Gibco，貨號16600-108)培養。
取對數生長期的U87MG和SK-BR-3細胞，用PBS(磷酸鹽緩衝液，上海源培生物科技股份有限公司)洗滌1次之後，加入2-3ml胰蛋白酶(0.25 %Trypsin-EDTA(1x)，Gibico,Life Technologies公司)消化2-3min，待細胞消化完全後，加入10-15ml細胞培養液，將經過消化的細胞沖提下來，1000rpm離心5min，棄上清液，接著加入10-20ml細胞培養液將細胞重新懸浮，製成單細胞懸液。
將U87MG和SK-BR-3單細胞懸液混勻，用細胞培養液分別調整活細胞密度至2.75×103cells/ml和8.25×103cells/ml，將密度調整過後的細胞懸液混勻，以180μl/孔加入96孔細胞培養板。96孔板外周孔隻加入200ul培養基。將培養板在培養箱培養24小時(37℃，5%CO2)。
用DMSO(二甲基亞碸，上海泰坦科技股份有限公司)溶解化合物，配製成初始濃度為10mM的存儲液。
小分子化合物的起始濃度為500nM，配藥方法如下：
在96孔U型底配藥板第一列中分別加入30μl不同待測樣品，樣品濃度為100uM；第2列至第11列每孔中加入20ul DMSO。取第一列樣品10ul至第二列20ul DMSO中，混勻，取10ul至第三列中，以此類推至第10列。將配藥板中的藥每孔取5ul至95ul EMEM培養基中，混勻，待用。
加樣：向培養板中加入20μl配置的不同濃度的待測樣品，每個樣品兩複孔。將培養板在培養箱孵育6天(37℃，5%CO2)。
顯色：取出96孔細胞培養板，向每孔加入90μl CTG溶液，室溫孵育10分鐘。
讀板：取出96孔細胞培養板，置於酶標儀(BMG labtech，PHERAstar FS)中，用酶標儀測定化學發光。
數據分析：用Microsoft Excel，Graphpad Prism 5對數據進行處理分析。實驗結果參見表14。
<110> 上海翰森生物醫藥科技有限公司(Shanghai Hansoh BioMedical Co.,Ltd) 江蘇豪森藥業集團有限公司(Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Co.,Ltd.)
<120> 抗體-藥物偶聯物及其醫藥用途
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<150> 2020102153204
<151> 2020-03-24
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<221> 鏈
<222> (1)..(330)
<223> IgG1 C2
<400> 49
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222> (1)..(107)
<223> Ig kappa C
<400> 50

Claims (35)

  1. 一種通式(A)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，Ab-(L 2 -L 1 -D) y (A)其中，D是細胞毒性藥物；L1選自-O-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-、-O-CR5R6-(CRaRb)m-、-O-CR5R6-、-NH-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-或-S-(CRaRb)m-CR5R6-C(O)-；Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基、烷氧基、羥基、胺基、氰基、硝基、羥烷基、環烷基或雜環基；或者，Ra和Rb與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；R5選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；R6選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；或者，R5和R6與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；或者，Ra和R6與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；m選自0至4的整數；y選自1至10的數，y是小數或整數；L2為橋接單元，如通式(D)所示：-K1-K2-K3-K4- (D) 其中，K1為，s選自2至8的整數；K2選自-NR1(CH2CH2O)pCH2CH2C(O)-、-NR1(CH2CH2O)pCH2C(O)-、-S(CH2)pC(O)-或單鍵，p選自1至20的整數；R1選自氫、氘、羥基、胺基、烷基、鹵素、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；K3為四肽殘基；K4為-NR2(CR3R4)t-，R2、R3或R4各自獨立地為氫、氘、羥基、胺基、烷基、鹵素、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基，t選自1或2；Ab為抗TROP-2抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區和重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：4所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3；以及該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：7所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3。
  2. 如請求項1所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段選自鼠源抗體或其抗原結合片段、嵌合抗體或其抗原結合片段、人抗體或其抗原結合片段，或者人源化抗體或其抗原結合片段。
  3. 如請求項1所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區或其變體，該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人抗體κ鏈的輕鏈恆定區或其變體。
  4. 如請求項3所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：48，或如SEQ ID NO：49所示的重鏈恆定區，且該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：50所示的輕鏈恆定區。
  5. 如請求項1所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段包含選自以下序列所示的重鏈可變區，或與以下序列相比具有至少99%同一性的重鏈可變區：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25；和/或，選自以下序列所示的輕鏈可變區，或與以下序列相比具有至少99%同一性的輕鏈可變區：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26。
  6. 如請求項5所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段包含：SEQ ID NO：9所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：10所示的輕鏈可變區；或，SEQ ID NO：11所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：12所示的輕鏈可變區；或，SEQ ID NO：13所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區；或， SEQ ID NO：15所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：16所示的輕鏈可變區；或，SEQ ID NO：17所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：18所示的輕鏈可變區；或，SEQ ID NO：19所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：20所示的輕鏈可變區；或，SEQ ID NO：21所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：22所示的輕鏈可變區；或，SEQ ID NO：23所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：24所示的輕鏈可變區；或，SEQ ID NO：25所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：26所示的輕鏈可變區。
  7. 如請求項5所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗TROP-2抗體或其抗原結合片段含有選自如下序列所示的重鏈，或與以下序列相比具有至少99%同一性的重鏈：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47；和/或，選自以下序列所示的輕鏈，或與以下序列相比具有至少99%同一性的輕鏈：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：44。
  8. 如請求項7所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗TROP-2抗體包含： SEQ ID NO：27所示的重鏈和SEQ ID NO：28所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：29所示的重鏈和SEQ ID NO：30所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：31所示的重鏈和SEQ ID NO：32所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：33所示的重鏈和SEQ ID NO：34所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：35所示的重鏈和SEQ ID NO：36所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：37所示的重鏈和SEQ ID NO：38所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：39所示的重鏈和SEQ ID NO：40所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：41所示的重鏈和SEQ ID NO：42所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：43所示的重鏈和SEQ ID NO：44所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：45所示的重鏈和SEQ ID NO：38所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：47所示的重鏈和SEQ ID NO：28所示的輕鏈。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該L1如通式(E)所示： 其中，R5為鹵烷基或環烷基，R6選自氫、鹵烷基或環烷基，或者，R5和R6與其相連接的碳原子一起形成環烷基。
  10. 如請求項9所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中： R5選自C1-6鹵烷基或C3-6環烷基，R6選自氫、C1-6鹵烷基或C3-6環烷基，或者，R5和R6與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；m選自0至4的整數。
  11. 如請求項9所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中：通式(E)選自以下取代基：
  12. 如請求項1至8中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中：p選自1至6的整數；該四肽殘基選自由兩個或多個苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、賴胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、谷胺酸、天冬胺酸中的胺基酸形成的肽殘基。
  13. 如請求項12所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中：該四肽殘基為GGFG的四肽殘基。
  14. 如請求項1至8中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該橋接單元L2，其K1端與Ab相連，K4端與L1相連。
  15. 如請求項1至8中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該-L2-L1-選自以下結構： 其中，K2為鍵；K3為GGFG的四肽殘基；R5選自鹵烷基或C3-6環烷基；R6選自氫、鹵烷基或C3-6環烷基；或者，R5和R6與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；R2、R3或R4各自獨立地選自氫或烷基；s選自2至8的整數；m選自0至4的整數。
  16. 如請求項15所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該-L2-L1-選自以下結構：
  17. 如請求項1至8中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該細胞毒性藥物選自毒素、化療藥物、抗生素、放射性同位素和核溶酶。
  18. 如請求項17所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該細胞毒性藥物選自：抑制細胞分裂的微管蛋白抑制劑或DNA拓撲異構酶抑制劑。
  19. 如請求項18所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該細胞毒性藥物選自：喜樹鹼衍生物、DM1、DM3、DM4、MMAF或MMAE。
  20. 如請求項19所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該細胞毒性藥物選自：依喜替康、依喜替康衍生物、SN-38、MMAE或MMAF。
  21. 如請求項20所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該細胞毒性藥物選自以下結構：
  22. 如請求項21所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗體-藥物偶聯物如通式(III)所示： 其中，L1、L2是橋接單元； y為1~10的數；Ab選自如請求項1至8中任一項所述的抗TROP-2抗體或其抗原結合片段。
  23. 如請求項22所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中y為2-8的數。
  24. 如請求項22所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中y為4-8的數。
  25. 如請求項22所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗體-藥物偶聯物如通式(IV)所示：其中，W選自C1-8烷基、C1-8烷基-環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該雜烷基包含1至3個選自N、O或S的雜原子，其中該C1-8烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；K2選自-NR1(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR1(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-或鍵，R1選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基，p1為1至20的整數；K3選自由2至7個胺基酸構成的肽殘基，胺基酸可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基為一個或多 個獨立地選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基；R2獨立地選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；R3和R4各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；R5選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；R6選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；或者，R5和R6與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；m選自0至4的整數；y選自1至10的數，y是小數或整數；Ab為抗TROP-2抗體或其抗原結合片段。
  26. 如請求項25所述的的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗體-藥物偶聯物如通式(IV-A)所示： 通式(IV-A)選自以下結構：
  27. 如請求項1所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其選自如下化合物： 其中，y選自2-10。
  28. 如請求項27所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，y選自4-8。
  29. 如請求項27所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，y選自6-8。
  30. 如請求項27所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，y選自7-8。
  31. 如請求項27所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，y選自8。
  32. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至31中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或該抗體-藥物偶聯物藥學上可接受的鹽，和一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
  33. 一種如請求項1至31中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或如請求項32所述的醫藥組成物在製備用於治療與人TROP-2相關疾病的藥物中的用途。
  34. 如請求項33所述的用途，其中，該與人TROP-2相關的疾病為TROP-2高表達的癌症，該癌症選自尿路上皮癌、人腦星形膠質母細胞瘤、人咽頭癌、腎上腺腫瘤、AIDS-相關癌症、腺泡狀軟組織肉瘤、星形細胞瘤、膀肮癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、促結締組織增生性小圓細胞腫瘤、室管膜細胞瘤、尤文腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維發育不全、骨纖維性發育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養細胞疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞瘤、卡波因肉瘤、腎癌、白血病、脂肪肉瘤、惡性脂肪瘤性腫瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤病、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合症、成神經細胞瘤、神經內 分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺瘤、小兒癌症、外周神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、後葡萄膜黑色素瘤、腎轉移性癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌和子宮癌。
  35. 如請求項34所述的用途，其中，該乳腺癌為三陰性乳腺癌，該肺癌為非小細胞肺癌。
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