TWI907564B - 用於預測對免疫抗癌劑的治療反應的生物標誌物及其用途 - Google Patents

用於預測對免疫抗癌劑的治療反應的生物標誌物及其用途

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Abstract

本發明涉及預測癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性的方法、用於預測治療反應性的組合物以及用於預測治療反應性的試劑盒、由此、可以預先區分具有免疫抗癌劑效果的患者組和沒有效果的患者組、因此可以顯著提高使用免疫抗癌劑的抗癌治療效率。

Description

用於預測對免疫抗癌劑的治療反應的生物標誌物及其用途
本發明涉及用於預測對免疫抗癌劑的治療反應的生物標誌物及其用途。
現有的癌症治療方法是通過手術、放射線療法和化學治療法盡可能地去除患者體內的癌細胞的方法。然而、手術和放射線療法只有在沒有發生轉移的較早癌症的情況下完全去除癌細胞時才具有治療效果、化學治療法可用於廣泛的癌症治療、但在大多數實體癌中治療率較差並出現各種副作用。為了改善這些現有問題、最近出現了使用免疫抗癌劑的免疫治療。
在代表性的免疫抗癌劑中、有阻斷PD-1/PD-L1路徑的抗體、如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體等。它在大量高難治性癌症患者中顯示出優異的體內持久性和良好的臨床效果。然而、儘管相當多的癌症患者通過阻斷PD-1/PD-L1路徑的治療顯示出抗癌效果、但存在許多患者根本沒有臨床效果的問題。因此、對於沒有效果的患者來說、對抗PD-1/PD-L1免疫抗癌劑治療的成本和時間被浪費。
因此、需要一種能夠正確預測腫瘤對免疫抗癌劑治療的反應與否並篩選對特定治療法有效的患者組的方法、這種方法的開發有望對提高患者的生存率和治療效率做出巨大貢獻。
發明所欲解決之問題
本發明的目的在於、解決上述現有技術的問題。
本發明的目的在於、提供能夠預測對免疫抗癌劑的治療反應性的生物標誌物、組合物、試劑盒（kit）以及資訊的提供方法。 解決問題之技術手段
為了實現上述目的、本發明人致力於開發一種能夠預測對免疫抗癌劑、例如抗PD-L1抗體、抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體等免疫檢查點抑制劑、優選抗PD-L1抗體的治療反應性的生物標誌物（biomarker）、通過確認根據免疫抗癌劑的施用對癌症治療效果的有無或程度顯示出表達水準差異的生物標誌物、從而完成了本發明。
根據本發明的一方面、提供用於預測癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性的選自由OPN、POSTN及IGFBP-3組成的組中的一個或多個基因的mRNA或其蛋白質的表達水準的用途。
根據本發明的另一方面、提供用於預測癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性的組合物、其包含能夠測量選自由OPN、POSTN及IGFBP-3組成的組中的一個或多個基因的mRNA或其蛋白質的表達水準的製劑。
根據本發明的又一方面、提供用於預測癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性的試劑盒、其包括上述組合物。
根據本發明的又一方面、提供用於預測癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性的資訊的提供方法、其包括如下步驟：在從癌症患者獲得的生物試樣中、測量選自由OPN、POSTN及IGFBP-3組成的組中的一個或多個基因的mRNA或其蛋白質的表達水準；以及基於上述測量的mRNA或蛋白質表達水準、評價上述患者對免疫抗癌劑的治療反應性。
根據本發明的又一方面、提供基於癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性的癌症治療方法、其包括如下步驟：（i）向癌症患者施用免疫抗癌劑；以及（ii）在施用上述免疫抗癌劑之前、之後或之前和之後、在從癌症患者獲得的上述生物試樣中、測量選自由OPN、POSTN及IGFBP-3組成的組中的一個或多個基因的mRNA或其蛋白質的表達水準。 對照先前技術之功效
本發明人通過對各種癌症患者施用免疫抗癌劑之前和之後分離的生物試樣中可溶性因數水準進行分析、確認了血清內POSTN、OPN及IGFBP-3的表達水準是預測對免疫抗癌劑的治療反應性的重要指標。
若使用根據本發明的用於預測對免疫抗癌劑的治療反應性的生物標誌物、則能夠預先或在治療初期區分具有免疫抗癌劑效果的患者組和沒有效果的患者組、因此可以顯著提高使用免疫抗癌劑的抗癌治療效率。
以下、對本發明進行詳細說明。
根據本發明的一方面、提供用於預測癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性的組合物、其包含能夠測量選自由OPN、POSTN及IGFBP-3組成的組中的一個或多個基因的mRNA或其蛋白質的表達水準的製劑。
在本發明中、“預測癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性”是指預測癌症患者對免疫抗癌劑的選擇性或不選擇性反應與否、預測對免疫抗癌劑的耐藥性風險、以及預測免疫治療後患者的預後、即復發、轉移、存活等。根據本發明的組合物可以提供用於選擇對癌症患者最合適的免疫治療方式的資訊。更具體地、根據本發明的組合物可以通過預測免疫抗癌劑是否會對患者產生選擇性或不選擇性反應來提供易於選擇免疫抗癌劑和提高治療反應性的資訊。
本說明書所用的術語“OPN（osteopontin（骨橋蛋白））”是指分泌性粘性糖蛋白或編碼該蛋白的基因、大小為33kDa、可在免疫系統中作用於細胞因數的分泌調節或細胞的運動。另外、已知OPN在多種實體癌細胞瘤中過度表達、因此可以是用於診斷各種癌症的標誌物。在本發明中、OPN可以是用於預測免疫抗癌劑的治療反應性的生物標誌物。例如、上述OPN基因可以是NCBI Gene ID 6696、並且可以作為屬於4號染色體的基因存在於各種物種中。具體地、上述OPN基因可以是由NCBI參考序列NM_001040058.2的核苷酸序列組成的多核苷酸。
本說明書所用的術語“POSTN（periostin（骨膜蛋白））”是指調節細胞粘附及細胞外基質的相互作用的大小為90kDa的蛋白質或編碼該蛋白質的基因。POSTN作為在各種上皮癌如卵巢癌及乳腺癌中過度表達的蛋白質、可以是用於診斷各種癌症的標誌物。在本發明中、POSTN可以是用於預測免疫抗癌劑的治療反應性的生物標誌物。例如、上述POSTN基因可以是NCBI Gene ID 10631、並且可以作為屬於13號染色體的基因存在於各種物種中。具體地、上述POSTN基因可以是由NCBI參考序列NM_006475.3的核苷酸序列組成的多核苷酸。
本說明書使用的術語“IGFBP-3（insulin-like growth factor binding protein-3（胰島素樣生長因數結合蛋白-3））”是指與胰島素樣生長因數（IGF）-1和-2結合的多種蛋白質中的一種或編碼該蛋白質的基因。與其他蛋白質不同、IGFBP-3在與IGF-1或IGF-2結合後具有與酸不穩定亞基（ALS）結合的獨特特性。另外、已知IGFBP-3與IGF無關地可抑制乳腺癌、前列腺癌等的生長、因此可以是用於診斷各種癌症的標誌物。在本發明中、IGFBP-3可以是用於預測免疫抗癌劑的治療反應性的生物標誌物。例如、上述IGFBP-3基因可以是NCBI Gene ID 3486、並且可以作為屬於7號染色體的基因存在於各種物種中。具體地、上述IGFBP-3基因可以是由NCBI參考序列NM_001013398.2的核苷酸序列組成的多核苷酸。
在一實例中、上述一個或多個基因可以包含OPN。
在一實例中、上述一個或多個基因可以包含OPN及POSTN。
在一實例中、上述一個或多個基因可以包含OPN、POSTN及IGFBP-3。
在本發明中、上述免疫抗癌劑可以是任意可用於抗癌免疫療法的免疫抗癌劑、例如免疫檢查點抑制劑。
在一實例中、上述免疫抗癌劑可以用於抑制PD-L1和PD-1之間的結合。
在一實例中、上述免疫抗癌劑可以是抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或抗CTLA-4抗體。優選地、上述免疫抗癌劑可以是抗PD-L1抗體。更優選地、與上述抗PD-L1抗體相關的內容可以參考國際公開公報WO2017/0132562所公開的內容。例如、上述抗PD-L1抗體可以包含重鏈可變區、其包含與SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列、並且可以包含輕鏈可變區、其包含與SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。另外、上述抗PD-L1抗體可以包含SEQ ID NO:5、6及7所示的氨基酸序列的重鏈互補決定區（Complementarity Determining Regions; CDRs）以及SEQ ID NO:8、9及10所示的氨基酸序列的輕鏈CDRs。此外、上述抗PD-L1抗體可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重鏈可變區以及SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的輕鏈可變區。此外、上述抗PD-L1抗體可以包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的輕鏈。
在一實例中、能夠測量上述mRNA表達水準的製劑可以是與上述基因的mRNA互補結合的反義核苷酸、引物或探針、但不限於此。
本說明書所用的術語“反義核苷酸”是指具有與靶基因或多核苷酸互補的序列並且可以與靶基因或多核苷酸形成二聚體的基於核酸的分子、可用于檢測靶基因。上述反義多核苷酸可以具有適當的長度以增加檢測特異性。
本說明書所用的術語“引物”是指可以與試樣中的基因或多核苷酸的互補範本（template）形成堿基對（base pair）並用作範本鏈複製的起點的核酸序列。引物的序列不一定與範本的序列完全相同、只要足夠互補以與範本雜交即可。引物可以在適當的緩衝溶液、溫度下以及在用於聚合反應的製劑和4種不同的核苷三磷酸（nucleoside triphosphate）的存在下引發DNA合成。PCR條件、正義和反義引物的長度可以基於本領域公知的進行修改。
本說明書所用的術語“探針”是指可以與試樣中待檢測的基因或多核苷酸特異性結合並通過上述結合特異性地確認試樣中的基因或多核苷酸的存在的物質。探針可以以寡核苷酸探針、單鏈DNA探針、雙鏈DNA探針、RNA探針等的形式製作。合適的探針的選擇及雜交條件可以基於本領域公知的進行修改。
上述反義核苷酸、引物或探針可以根據待檢測的基因或多核苷酸、使用本領域公知的知識及技術來優選地設計。
在一實例中、能夠測量上述蛋白質的表達水準的製劑可以是與上述蛋白質特異性結合的寡肽、抗體（單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合（chimeric）抗體等）、配體、肽核酸（Peptide nucleic acid、 PNA）或適配體（aptamer）。
優選地、能夠測量上述蛋白質的表達水準的製劑可以是與由上述基因編碼的蛋白質特異性結合的抗體、但不限於此。
本說明書所用的術語“抗體”與本領域已知的含義相同、可以指對抗原位點誘導的特異性蛋白質分子。在本發明中、抗體的形式沒有特別限制、可以包括多克隆抗體、單克隆抗體、或者其一部分、只要具有抗原結合性即可、也可以包括所有的免疫球蛋白抗體、還可以包括特殊抗體如人源化抗體。例如、抗體既可以包括具有兩條全長輕鏈以及兩條全長重鏈的完整形式、還可以包括抗體分子的功能片段。抗體分子的功能片段是指至少保留抗原結合功能的片段、例如、可以是Fab、F(ab') 、F(ab')2、Fv等、但不限於此。
在一實例中、上述癌症可以為實體癌。上述癌症可以為選自下組的一種或多種：膽管癌、結腸癌、腺癌、直腸癌、乳腺癌、滑膜肉瘤、軟骨肉瘤、甲狀腺癌、胃癌、胸腺癌、宮頸癌、膠質瘤、腦癌、黑色素瘤、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、腎癌、肝癌、大腸癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、子宮癌、口腔癌、支氣管癌、鼻咽癌、喉癌、皮膚癌、血癌、甲狀旁腺癌以及輸尿管癌、但不限於此。另外、上述癌症可以為大腸癌。
根據本發明的另一方面、提供包括上述組合物的、用於預測癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性的試劑盒。在上述試劑盒中、“預測癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性”以及“癌症”的定義如上所述。
具體地、上述試劑盒由一種或多種適用於分析方法的其他組分組合物、溶液或裝置組成。
在一實例中、上述試劑盒可以是用於測量上述基因的mRNA表達水準的試劑盒、例如、包括用於進行RT-PCR的必需元素的試劑盒。上述試劑盒例如可以包括本領域已知的進行RT-PCR所需的其他試劑。
在一實例中、上述試劑盒可以是用於測量上述蛋白質的表達水準的試劑盒、例如可以是酶聯免疫吸附測定（Enzyme-linked immunosorbent assay、 ELISA）試劑盒。上述試劑盒可以包括本領域已知的抗體免疫檢測所需的其他試劑。
根據本發明的又一方面、提供用於預測癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性的資訊的提供方法、包括如下步驟：在從癌症患者獲得的生物試樣中、測量選自由OPN、POSTN及IGFBP-3組成的組中的一個或多個基因的mRNA或其蛋白質的表達水準；以及基於上述測量的mRNA或蛋白質表達水準、評價上述患者對免疫抗癌劑的治療反應性。在上述方法中、基因、mRNA表達水準的測量、蛋白質表達水準的測量、癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性的預測如上所述。
本說明書所用的術語“生物試樣”是指從個體獲得的任意生物樣本、例如包括確認免疫抗癌劑的治療反應性的個體、例如包括從癌症患者獲得的血液、血清、血漿、淋巴液、唾液或尿液等試樣、但不限於此。
在一實例中、上述方法還可以包括根據上述患者對免疫抗癌劑的治療反應性、確定上述患者是否接受免疫抗癌劑的治療或繼續治療的步驟。
在一實例中、上述方法還可以包括向上述患者施用上述免疫抗癌劑的步驟。上述施用步驟在測量一個或多個基因的mRNA或其蛋白質的表達水準的步驟之前、之後或之前和之後均可執行。例如、上述表達水準可以在施用免疫抗癌劑之前進行測量、並且可以在第一次施用免疫抗癌劑20天至60天、25天至50天、30天至45天或者35天至43天后進行測量。例如、從癌症患者採集血液樣本後、測量OPN、POSTN及IGFBP-3中的一個或多個基因的表達水準、在開始免疫抗癌劑治療40天后再次測量同一基因的表達水準、比較免疫抗癌劑治療前後的表達水準、從而可以評價對免疫抗癌劑的治療反應性。此時、可以根據表達水準的增減評價治療反應性、其模態（Modality）取決於各基因或從其中表達的蛋白質而不同。
另外、基於上述測量的mRNA或蛋白質表達水準、評價上述患者對免疫抗癌劑的治療反應性的步驟、包括：將施用免疫抗癌劑之前（和/或之後）的上述癌症患者的表達水準與施用免疫抗癌劑之前（和/或之後）的其他對照癌症患者的表達水準進行比較的步驟。上述施用免疫抗癌劑之前和/或之後的其他對照癌症患者的表達水準可以是從施用免疫抗癌劑之前和/或之後獲得的多個對照癌症患者的生物試樣中確認的平均表達水準、該生物試樣已確認為對免疫抗癌劑具有治療反應性或者沒有治療反應性。
在一實例中、當在施用免疫抗癌劑之前和之後測量上述表達水準且上述基因為OPN或POSTN時、在施用免疫抗癌劑之後的上述測量的表達水準顯著高於施用之前的情況下、可以將上述患者的治療反應性評價為低。例如、當OPN時、在施用免疫抗癌劑之後測量的表達水準是施用免疫抗癌劑之前測量的水準的1.1倍至2倍、1.2倍至2倍或1.5倍至1.8倍的情況下、可以將該癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性評價為低。另外、在施用免疫抗癌劑之後測量的表達水準是施用免疫抗癌劑之前測量的水準的0.4倍至1倍、0.4倍至0.9倍或0.5倍至0.8倍的情況下、可以將該癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性評價為高。例如、當POSTN時、在施用免疫抗癌劑之後測量的表達水準是施用免疫抗癌劑之前測量的水準的1.1倍至2倍、1.2倍至2倍或1.5倍至1.8倍的情況下、可以將該癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性評價為低。另外、在施用免疫抗癌劑之後測量的表達水準是施用免疫抗癌劑之前測量的水準的0.4倍至1倍或0.5倍至0.8倍的情況下、可以將該癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性評價為高。
在一實例中、當在施用免疫抗癌劑之前或之後測量上述表達水準且上述基因為OPN或POSTN時、在上述測量的表達水準顯著高於施用免疫抗癌劑之前或之後的其他對照癌症患者（例如、治療反應性被評價為高的患者）的表達水準的情況下、可以將上述患者的治療反應性評價為低。
在一實例中、當在施用免疫抗癌劑之前和之後測量上述表達水準且上述基因為IGFBP-3時、在施用免疫抗癌劑之後的上述測量的表達水準顯著低於施用之前的情況下、可以將上述患者的治療反應性評價為低。例如、在施用免疫抗癌劑之後測量的表達水準是施用免疫抗癌劑之前測量的水準的0.4倍至1倍、0.4倍至0.9倍或0.5倍至0.8倍的情況下、可以將該癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性評價為低。例如、在施用免疫抗癌劑之後測量的表達水準是施用免疫抗癌劑之前測量的水準的1.1倍至2倍、1.2倍至2倍或1.5倍至1.8倍的情況下、可以將該癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性評價為高。
在一實例中、當在施用免疫抗癌劑之前或之後測量上述表達水準且上述基因為IGFBP-3時、在上述測量的表達水準顯著低於施用免疫抗癌劑之前或之後測量的其他對照癌症患者（例如、治療反應性被評價為高的患者）的表達水準的情況下、可以將上述患者的治療反應性評價為低。
在一實例中、上述mRNA的表達水準可以通過選自由原位雜交（in situ hybridization）、逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、競爭性逆轉錄聚合酶鏈式反應（competitive RT-PCR）、即時逆轉錄聚合酶鏈式反應（real-time RT-PCR）、RNA酶保護實驗（RNase protection assay; RPA）、微陣列（microarray）以及RNA印跡（northern blotting）組成的組中的一種或多種方法進行測量、但不限於此。
在一實例中、上述蛋白質的表達水準可以通過選自由蛋白質印跡法（western blotting）、放射免疫分析法（radioimmunoassay; RIA）、放射免疫擴散法（radioimmunodiffusion）、酶聯免疫吸附測定法（ELISA）、免疫沉澱法（immunoprecipitation）、流式細胞術（flow cytometry）、免疫螢光染色法（immunofluorescence）、免疫雙擴散法（Ouchterlony）、補體結合分析法（complement fixation assay）以及蛋白質晶片（protein chip）組成的組中的一種或多種方法進行測量、但不限於此。
根據本發明的又一方面、提供基於癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性的癌症治療方法、包括如下步驟：（i）向癌症患者施用免疫抗癌劑；以及（ii）在施用上述免疫抗癌劑之前、之後或之前和之後、在從癌症患者獲得的上述生物試樣中、測量選自由OPN、POSTN及IGFBP-3組成的組中的一個或多個基因的mRNA或其蛋白質的表達水準。
在一實例中、上述方法還可以包括基於上述測量的mRNA或蛋白質表達水準、評價上述患者對免疫抗癌劑的治療反應性的步驟。
在一實例中、上述方法還可以包括根據對上述患者對免疫抗癌劑的治療反應性的評價、確定上述患者是否接受免疫抗癌劑的治療或繼續治療的步驟。
關於上述方法、免疫抗癌劑、基因、癌症、生物試樣、mRNA表達水準的測量、蛋白質表達水準的測量、治療反應性的評價等如上所述。
以下、通過實施例詳細說明本發明。然而、下述實施例僅用於說明本發明、而本發明不限於下述實施例。 實施例1.材料及方法 實施例1.1.患者組資訊及樣本的收集
對轉移性實體癌或局部晚期實體癌患者進行使用抗PD-L1抗體（包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的重鏈以及具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的輕鏈的抗PD-L1抗體（IMC-001）的免疫抗癌治療、並從中獲取血液樣本。
具體地、根據標準3+3劑量遞增的設計、每兩周靜脈給藥IMC-001抗體、直至疾病進展或出現不可接受的毒性。共15名患者（男性8名、女性7名、平均年齡58歲）包括在5個劑量遞增佇列（2、5、10、15、20mg/kg）中。
在開始給藥前（Day1）、給藥3天及8天后（Day3及Day8）、給藥15天及43天后（Day15及Day43）採集上述患者的血液樣本。離心分離後採集血清樣本、所有樣本立即分離、冷凍、保存在-80℃直至使用。根據採集日期的血液樣本的癌症類型和BOR資訊如下表1所示。 表1
血液樣本 癌症類型 BOR
Day1、3、8、15、43 膽管癌/肝轉移 SD
Day1、3、8、15、43 膽囊腺癌/淋巴轉移
Day1、3、8、15、43 膽管癌/肝轉移
Day1、3、8、15、43 胸腺癌/肺、骨轉移
Day1、3、8、15、43 直腸癌/淋巴轉移 SD-＞PR
Day1、3、8、15、43 直腸癌/肺、肝轉移 PD
Day1、3、8、15、43 胸腺癌/肺、肝轉移
Day1、3、8、15、43 甲狀腺癌/肺、脾臟、淋巴轉移 NE
Day1、3、8、15 結腸癌/肝轉移 PD
Day1、3、8、15 直腸癌/肺轉移
Day1、3、8、15 乳腺癌
Day1、3、8、15 滑膜肉瘤/肺、肝轉移
Day1、3、8、15 軟骨肉瘤/肺、骨轉移
Day1、3、8、15 胃癌/直腸轉移
Day1、3、8、15 直腸癌/肺轉移
BOR（best overall response（最佳總體反應））：從開始給藥到疾病進展/復發記錄的最大總體反應。SD（stable disease）：病情穩定、PD（progressive disease）：病情進展、PR（partial response）：部分反應、NE（not evaluable）：不可評估。患者總數為15名、其中SD為4例、PR為1例、PD為9例、NE為1例。 實施例1.2.多重分析法
使用Luminex的xMAP技術來分析血清樣本、從上述患者組的血液樣本中篩選出55種可溶性因數中的每一種、上述技術是一種使用基於自動化珠子的技術的定量多重免疫測定。 表2
迴圈腫瘤標誌物 甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein、 AFP） 成纖維細胞生長因數2（Fibroblast growth factor 2、 FGF-2） 人附睾蛋白4（Human epididymis protein 4、 HE4） 肝細胞生長因數（Hepatocyte growth factor、 HGF） 白細胞介素6（Interleukin-6、 IL-6） 白細胞介素8（Interleukin-8、 IL-8） 瘦蛋白（Leptin） 巨噬細胞遷移抑制因數（Macrophage migration inhibitory factor、 MIF） 骨橋蛋白（Osteopontin、 OPN） 催乳素（Prolactin） 幹細胞因數（Stem cell factor、 SCF） 腫瘤生長因數α（Tumor growth factor α、 TGF- α） 腫瘤壞死因數α（Tumor necrosis factor α、 TNF- α） TNF相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis inducing ligand、 TRAIL） 血管內皮生長因數（Vascular endothelial growth factor、 VEGF） 癌抗原125（Cancer antigen 125、 CA125） 癌抗原15-3（Cancer antigen 15-3、 CA15-3） 鐵蛋白（Ferritin） 半乳糖凝集素3（Galectin3） 胰島素生長因數結合蛋白3（Insulin growth factor binding protein-3、 IGFBP-3） 髓過氧化物酶（Myeloperoxidase、 MPO）
血管生成標誌物 血管生成素2（Angiopoietin 2、 Ang2） 骨形態發生蛋白9（Bone morphogenetic protein 9、 BMP-9） 表皮生長因數（Epidermal growth factor、 EGF） 內皮糖蛋白（Endoglin） 成纖維細胞生長因數1（Fibroblast growth factor 1、 FGF-1） 粒細胞集落刺激因數（Granulocyte colony stimulating factor、 G-CSF） 肝素結合表皮生長因數樣生長因數（Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor、 HB-EGF） 胎盤生長因數（Placental growth factor、 PLGF） 血管內皮生長因數C（Vascular endothelial growth factor C、 VEGF-C） 血管內皮生長因數D（Vascular endothelial growth factor D、 VEGF-D）
轉移標誌物 Dickkopf 1（DKK-1） 生長分化因數15（Growth differentiation factor 15、 GDF-15） 骨膜蛋白（Periostin、 POSTN）
細胞因數/趨化因數 干擾素γ（Interferon γ、 IFN-γ） 白細胞介素1α（Interleukin 1α、 IL-1α） 白細胞介素1β（Interleukin 1β、 IL-1β） 白細胞介素1受體拮抗劑（Interleukin 1 receptor antagonist、 IL-1rα） 白細胞介素2（Interleukin 2、 IL-2） 白細胞介素4（Interleukin 4、 IL-4） 白細胞介素10（Interleukin 10、 IL-10） 白細胞介素12（Interleukin 12、 IL-12） 白細胞介素15（Interleukin 15、 IL-15） 白細胞介素17α（Interleukin 17α、 IL-17α） C-X-C基序配體9（C-X-C motif ligand 9、 CXCL9） C-X-C基序配體10（C-X-C motif ligand 10、 CXCL10） 血小板衍生生長因數AB（Platelet-derived growth factor AB、 PDGF-AB） 血小板衍生生長因數BB（Platelet-derived growth factor BB、 PDGF-BB） Tie-2 趨化因數配體5（Chemokine ligand 5、 CCL5） 單核細胞趨化蛋白1（Monocyte chemotactic protein 1、 MCP-1） 單核細胞趨化蛋白3（Monocyte chemotactic protein 3、 MCP-3） 趨化因數配體22（Chemokine ligand 22、 CCL22） 巨噬細胞炎症蛋白1α（Macrophage inflammatory protein 1 alpha、 MIP-1α） 巨噬細胞炎症蛋白1β（Macrophage inflammatory protein 1 beta、 MIP-1β）
用於製作柔性面板的人預混多重分析劑盒購自R&D Systems（目錄編號LXSAHM-06、10、18、21）。使用Koma Biotech（韓國、首爾）的Luminex 100進行xMAP血清分析。使用MasterPlex QT 2010軟體的5個參數曲線擬合分析實驗資料。 實施例2.施用免疫抗癌劑前後可溶性因數的分析結果
從Koma Biotech獲得上述實施例1.2的分析結果、通過分析55個因數的血清水準進行SD組和PD組的比較。根據55個可溶性因數的分析結果、得出可以確認免疫抗癌劑治療反應性的顯著的實驗結果的因數被確認為POSTN、OPN及IGFBP-3。
實施例2.1.在SD組中、POSTN及OPN在基線和抗PD-L1抗體治療後均顯示低水準。
POSTN及OPN分析結果如圖1至圖4所示。骨膜蛋白（POSTN）是一種粘附分子、而骨橋蛋白（OPN）是一種細胞內分泌的糖蛋白。
分析結果表明、PD組的POSTN水準在基線上高於SD組、直到第43天為止顯著增加、而SD組的POSTN水準在測試期間持續保持低水準（SD組的平均POSTN水準範圍：153316.0-158397.3pg/mL、參見圖1）。
在SD組中、OPN逐漸下降直至第43天、而在PD組中、OPN從基線開始高於SD組、隨著時間的推移沒有顯著變化（SD組OPN水準的平均範圍：27687-41942.3pg/mL、參見圖3）。
在BOR從SD變為PR的患者樣本中、POSTN及OPN的水準逐漸下降直至第43天、在第43天最低（見圖2和圖4）。
因此、當癌症患者組的POSTN及OPN顯示較低的基線水準、或者與免疫抗癌劑治療前相比治療後的OPN水準降低時、可以選擇為適合免疫抗癌劑治療的患者組。
實施例2.2.PD組在施用抗PD-L1抗體後第43天顯示低水準的IGFBP-3。
SD組和PD組的IGFBP-3水準在基線上沒有顯著差異。然而、在使用抗PD-L1抗體的治療過程中、IGFBP-3的水準發生了顯著變化（圖5）。施用抗PD-L1抗體後、PD組患者的血清中IGFBP-3水準減少、而治療前後SD組的血清中IGFBP-3水準略有升高。
該結果表明、若施用抗PD-L1抗體後IGFBP3水準較低、則可能是表示患者對該抗體沒有反應的生物標誌物。 實施例3.利用大腸癌小鼠模型的動物實驗
委託百奧賽圖（Biocytogen）和集萃藥康（Gempharmatech）進行了利用大腸癌小鼠模型的動物實驗。Biocytogen製作了C57BL/6小鼠和使用MC38-hPD-L1腫瘤細胞的大腸癌小鼠模型、Gempharmatech製作了BALB/c小鼠和使用CT26-hPD-L1/hCD47腫瘤細胞的大腸癌小鼠模型。 實施例3.1.對IMC-001給藥的治療反應性（生物標誌物：OPN） 實施例3.1.1.在MC38-hPD-L1腫瘤模型中IMC-001給藥後腫瘤體積的變化
在作為大腸癌模型的C57BL/6小鼠的MC38-hPD-L1腫瘤治療中評價了IMC-001的體內功效。
為了腫瘤的發展、將懸浮在0.1mL PBS中的5X10 5個MC38-hPD-L1腫瘤細胞皮下注射到C57BL/6小鼠的右前腹。將平均腫瘤大小約為100mm 3的荷瘤小鼠隨機分配到hIgG1 20mg/kg組、IMC-001 3mg/kg組和IMC-001 10mg/kg組（每組由8只小鼠組成）。以每週3次的頻率將所有測試物質腹腔給藥到荷瘤小鼠、持續3周。
第21天處死小鼠。使用GraphPad Prism 8軟體繪製腫瘤體積圖、使用Dunnett多重比較核對總和雙向ANOVA進行組間比較（p-值；*＜0.05、**＜0.01、***＜0.001、****＜0.0001）（圖6A）。 實施例3.1.2.經ELISA法確定小鼠OPN血清濃度
在實施例3.1.1中進行小鼠處死時收集所有血清樣本並保存在-80℃直至分析。
通過使用小鼠OPN duoset ELISA試劑盒（DY411、 R&D Systems、 Minneapolis、 Massachusetts、 USA）的酶聯免疫吸附測定法（ELISA）測量小鼠血清OPN、並根據該試劑盒製造商的說明書進行上述過程。
在標準曲線範圍內、使用Duoset Ancillary Reagent kit 2（DY008、 R&D Systems）的1X Reagent diluent concentrate 2以1:8000的比例稀釋所有樣品。所有樣本一式兩份運行。
使用GraphPad Prism 8軟體表示可變資料後、使用Pearson相關分析確認兩個參數（血清內OPN及相對腫瘤體積）之間的相關性（圖6B）。然後、使用unpaired t-test比較兩組之間的差異、p-值小於0.05被認為具有統計學意義（p-值；*＜0.05、**＜0.01、***＜0.001、****＜0.0001）（圖6C）。在圖6C中、進行IMC-001給藥的共16只小鼠以相對腫瘤體積為基準分為兩組、每組8只小鼠、即分為腫瘤生長較大組（反應性較差組（Vt/V0＞15）、n=8）和腫瘤生長較小組（反應性較優組（Vt/V0＜15）、n=8）來測量OPN。 實施例3.1.3.在CT26-hPD-L1/hCD47腫瘤模型中IMC-001給藥後腫瘤體積的變化
在作為大腸癌模型的BALB/c小鼠的CT26-hPD-L1/hCD47腫瘤治療中評價了IMC-001的體內功效。
為了腫瘤的發展、將懸浮在0.1mL PBS中的2X10 6個CT26-hPD-L1/hCD47腫瘤細胞皮下注射到BALB/c小鼠的右前腹。將平均腫瘤大小約為100mm 3的荷瘤小鼠隨機分配到hIgG1 21.4mg/kg組、IMC-001 2.1mg/kg組和IMC-001 10.7mg/kg組（每組由8只小鼠組成）。在前2周、以每週2次的頻率將所有測試物質腹腔給藥到荷瘤小鼠、然後再進行兩周的腫瘤體積測量。
第一次IMC-001給藥後第28天處死小鼠。使用GraphPad Prism 8軟體繪製腫瘤體積圖、使用Dunnett多重比較核對總和雙向ANOVA進行組間比較（p-值；*＜0.05、**＜0.01、***＜0.001、****＜0.0001）（圖7A）。 實施例3.1.4.經ELISA法確定小鼠OPN血清濃度
在實施例3.1.3中進行小鼠處死時收集所有血清樣本並保存在-80℃直至分析。
通過使用小鼠OPN duoset ELISA試劑盒（DY411、 R&D Systems、 Minneapolis、 Massachusetts、 USA）的酶聯免疫吸附測定法（ELISA）測量小鼠血清OPN、並根據該試劑盒製造商的說明書進行上述過程。在標準曲線範圍內、使用Duoset Ancillary Reagent kit 2（DY008、 R&D Systems）的1X Reagent diluent concentrate 2以1:8000的比例稀釋所有樣品。所有樣本一式兩份運行。
使用GraphPad Prism 8軟體表示可變資料後、使用Pearson相關分析確認兩個參數（血清內OPN及相對腫瘤體積）之間的相關性（圖7B）。然後、使用unpaired t-test比較兩組之間的差異、p-值小於0.05被認為具有統計學意義（p-值；*＜0.05、**＜0.01、***＜0.001、****＜0.0001）（圖7C）。在圖7C中、進行IMC-001給藥的共16只小鼠以相對腫瘤體積為基準分為兩組、每組8只小鼠、即分為腫瘤生長較大組（反應性較差組（Vt/V0＞13）、n=8）和腫瘤生長較小組（反應性較優組（Vt/V0＜13）、n=8）來測量OPN。 實施例3.1.5.結果
在實施例3.1.1至3.1.4所使用的兩種大腸癌小鼠模型（MC38和CT26）中、與每個對照組（hIgG1）相比、IMC-001給藥組的腫瘤生長受到抑制（圖6A和7A）。
另外、如圖6C（Vt/V0＞15的OPN平均值：1294.8ng/mL（SEM值：184.3）；Vt/V0＜15的OPN平均值：409.8ng/mL（SEM值：44.8））、圖7C（Vt/V0＞13的OPN平均值：1836.6ng/mL（SEM值：214.4）；Vt/V0＜13的OPN平均值：319.5ng/mL（SEM值：121.7））所示、在IMC-001給藥組（n=16）中、腫瘤生長較小組（反應性較優組、n=8）的血清OPN水準顯著低於腫瘤生長較大組（反應性較差組、n=8）。
從該結果證實、IMC-001給藥組中相對腫瘤體積越小、OPN水準越小、因此OPN可以用作預測如IMC-001等的抗PD-L1抗體是否發揮治療作用的生物標誌物。 實施例3.2.對IMC-001給藥的治療反應性（生物標誌物：IGFBP-3） 實施例3.2.1.在MC38-hPD-L1腫瘤模型中IMC-001給藥後腫瘤體積的變化
在作為大腸癌模型的C57BL/6小鼠的MC38-hPD-L1腫瘤治療中評價了IMC-001的體內功效。
為了腫瘤的發展、將懸浮在0.1mL PBS中的5X10 5個MC38-hPD-L1腫瘤細胞皮下注射到C57BL/6小鼠的右前腹。將平均腫瘤大小約為100mm 3的荷瘤小鼠隨機分配到hIgG1 20mg/kg組、IMC-001 3mg/kg組和IMC-001 10mg/kg組（每組由8只小鼠組成）。以每週3次的頻率將所有測試物質腹腔給藥到荷瘤小鼠、持續3周。
第21天處死小鼠。使用GraphPad Prism 8軟體繪製腫瘤體積圖、使用Dunnett多重比較核對總和雙向ANOVA進行組間比較（p-值；*＜0.05、**＜0.01、***＜0.001、****＜0.0001）（圖6A）。 實施例3.2.2.經ELISA法確定小鼠IGFBP-3血清濃度
在實施例3.2.1中進行小鼠處死時收集所有血清樣本並保存在-80℃直至分析。
通過使用小鼠IGFBP-3 duoset ELISA試劑盒（DY775、 R&D Systems、 Minneapolis、 Massachusetts、 USA）的酶聯免疫吸附測定法（ELISA）測量小鼠血清IGFBP-3、並根據該試劑盒製造商的說明書進行上述過程。在標準曲線範圍內、使用Duoset Ancillary Reagent kit 3（DY009、 R&D Systems）的1X Reagent diluent concentrate 3以1:2000的比例稀釋所有樣品。具體地、根據製造商的建議、使用含有2％熱滅活正常山羊血清（DY005、Reagent Additive 1、R&D Systems）的1X Reagent diluent concentrate 3稀釋檢測抗體。所有樣本一式兩份運行。
使用GraphPad Prism 8軟體表示可變資料後、使用Pearson相關分析確認兩個參數（血清內IGFBP-3及相對腫瘤體積）之間的相關性（圖8A）。使用unpaired t-test比較兩組之間的差異、p-值小於0.05被認為具有統計學意義（p-值；*＜0.05、**＜0.01、***＜0.001、****＜0.0001）（圖8B）。在圖8B中、進行IMC-001給藥的共16只小鼠以相對腫瘤體積為基準分為兩組、每組8只小鼠、即分為腫瘤生長較大組（反應性較差組（Vt/V0＞15）、n=8）和腫瘤生長較小組（反應性較優組（Vt/V0＜15）、n=8）來測量IGFBP-3。 實施例3.2.3.在CT26-hPD-L1/hCD47腫瘤模型中IMC-001給藥後腫瘤體積的變化
在作為大腸癌模型的BALB/c小鼠的CT26-hPD-L1/hCD47腫瘤治療中評價了IMC-001的體內功效。
為了腫瘤的發展、將懸浮在0.1mL PBS中的2X10 6個CT26-hPD-L1/hCD47腫瘤細胞皮下注射到BALB/c小鼠的右前腹。將平均腫瘤大小約為100mm 3的荷瘤小鼠隨機分配到hIgG1 21.4mg/kg組、IMC-001 2.1mg/kg組和IMC-001 10.7mg/kg組（每組由8只小鼠組成）。以每週2次的頻率將所有測試物質腹腔給藥到荷瘤小鼠、持續4周。
第一次IMC-001給藥後第28天處死小鼠。使用GraphPad Prism 8軟體繪製腫瘤體積圖、使用Dunnett多重比較核對總和雙向ANOVA進行組間比較（p-值；*＜0.05、**＜0.01、***＜0.001、****＜0.0001）（圖7A）。 實施例3.2.4.經ELISA法確定小鼠IGFBP-3血清濃度
在實施例3.2.3中進行小鼠處死時收集所有血清樣本並保存在-80℃直至分析。
通過使用小鼠IGFBP-3 duoset ELISA試劑盒（DY775、 R&D Systems、 Minneapolis、 Massachusetts、 USA）的酶聯免疫吸附測定法（ELISA）測量小鼠血清IGFBP-3、並根據該試劑盒製造商的說明書進行上述過程。在標準曲線範圍內、使用Duoset Ancillary Reagent kit 3（DY009、 R&D Systems）的1X Reagent diluent concentrate 3以1:2000的比例稀釋所有樣品。具體地、根據製造商的建議、使用含有2％熱滅活正常山羊血清（DY005、Reagent Additive 1、R&D Systems）的1X Reagent diluent concentrate 3稀釋檢測抗體。所有樣本一式兩份運行。
使用GraphPad Prism 8軟體表示可變資料。使用Pearson相關分析確認兩個參數（血清內IGFBP-3及相對腫瘤體積）之間的相關性（圖9A）。使用unpaired t-test比較兩組之間的差異、p-值小於0.05被認為具有統計學意義（p-值；*＜0.05、**＜0.01、***＜0.001、****＜0.0001）（圖9B）。在圖9B中、進行IMC-001給藥的共16只小鼠以相對腫瘤體積為基準分為兩組、每組8只小鼠、即分為腫瘤生長較大組（反應性較差組（Vt/V0＞13）、n=8）和腫瘤生長較小組（反應性較優組（Vt/V0＜13）、n=8）來測量IGFBP-3。 實施例3.2.5.結果
在實施例3.2.1至3.2.4所使用的兩種大腸癌小鼠模型（MC38和CT26）中、與每個對照組（hIgG1）相比、IMC-001給藥組的腫瘤生長受到抑制（圖6A和7A）。
另外、如圖8B（Vt/V0＞15的IGFBP-3平均值：900.1ng/mL（SEM值：56.6）；Vt/V0＜15的IGFBP-3平均值：1031.6ng/mL（SEM值：64.2））、圖9B（Vt/V0＞13的IGFBP-3平均值：713.1ng/mL（SEM值：46.3）；Vt/V0＜13的IGFBP-3平均值：880.6ng/mL（SEM值：33.7））所示、在IMC-001給藥組（n=16）中、腫瘤生長較小組（反應性較優組、n=8）的血清IGFBP-3水準高於腫瘤生長較大組（反應性較差組、n=8）、尤其是在CT26模型中顯著更高。
從該結果證實、IMC-001給藥組中相對腫瘤體積越小、IGFBP-3水準越高、因此IGFBP-3可以用作預測如IMC-001等的抗PD-L1抗體是否發揮治療作用的生物標誌物。
(無)
圖1示出用根據本發明一實例的抗PD-L1抗體治療之前和之後患者血清樣本中骨膜蛋白（POSTN）的水準（非參數（nonparametric）t檢驗；*、p＜0.05；**、p＜0.01；***、p＜0.005；****、p＜0.001）。 圖2示出每位元患者的血清樣本中POSTN的水準。 圖3示出用根據本發明一實例的抗PD-L1抗體治療之前和之後患者血清樣本中骨橋蛋白（OPN）的水準（非參數t檢驗；*、p＜0.05；**、p＜0.01；***、p＜0.005；****、p＜0.001）。 圖4示出每位元患者的血清樣本中OPN的水準。 圖5示出用根據本發明一實例的抗PD-L1抗體治療之前和之後患者血清樣本中IGFBP-3的水準（非參數t檢驗；*、p＜0.05；**、p＜0.01；***、p＜0.005）。 圖6A示出與實施例3.1.1及實施例3.2.1相關的C57BL/6小鼠中MC38-hPD-L1腫瘤（大腸癌）的腫瘤生長曲線。 圖6B示出在實施例3.1.2相關IMC-001給藥組中第21天收集的血清內OPN水準和相對腫瘤體積之間的相關關係。此時、V0表示第0天（給藥前）的腫瘤體積、Vt表示（第一次給藥後）第21天的腫瘤體積。 圖6C示出在實施例3.1.2相關IMC-001給藥組中第21天收集的血清內OPN水準。此時、OPN水準是基於相對腫瘤體積分為兩組而測定的值。 圖7A示出與實施例3.1.3及實施例3.2.3相關的BALB/c小鼠中CT26-hPD-L1/hCD47腫瘤（大腸癌）的腫瘤生長曲線。 圖7B示出在實施例3.1.4相關IMC-001給藥組中第28天收集的血清內OPN水準和相對腫瘤體積之間的相關關係。此時、V0表示第0天（給藥前）的腫瘤體積、Vt表示（第一次給藥後）第28天的腫瘤體積。 圖7C示出在實施例3.1.4相關IMC-001給藥組中第28天收集的血清內OPN水準。此時、OPN水準是基於相對腫瘤體積分為兩組而測定的值。 圖8A示出在實施例3.2.2相關IMC-001給藥組中第21天收集的血清內IGFBP-3水準和相對腫瘤體積之間的相關關係。此時、V0表示第0天（給藥前）的腫瘤體積、Vt表示第21天（第一次給藥後）的腫瘤體積。 圖8B示出在實施例3.2.2相關IMC-001給藥組中第21天收集的血清內IGFBP-3水準。此時、IGFBP-3水準是基於相對腫瘤體積分為兩組而測定的值。 圖9A示出在實施例3.2.4相關IMC-001給藥組中第28天收集的血清內IGFBP-3水準和相對腫瘤體積之間的相關關係。此時、V0表示第0天（給藥前）的腫瘤體積、Vt表示（第一次給藥後）第28天的腫瘤體積。 圖9B示出在實施例3.2.4相關IMC-001給藥組中第28天收集的血清內IGFBP-3水準。此時、IGFBP-3水準是基於相對腫瘤體積分為兩組而測定的值。

Claims (25)

  1. 一種用於預測癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性的組合物，其包含能夠測量選自由POSTN及IGFBP-3組成的組中的一個或多個基因的mRNA或其蛋白質的表達水準的製劑，其中上述免疫抗癌劑為抗PD-L1抗體。
  2. 如請求項1之組合物，其中上述組合物進一步包含能夠測量OPN基因的mRNA或其蛋白質的表達水準的製劑。
  3. 如請求項1之組合物，其中上述一個或多個基因包含POSTN。
  4. 如請求項1之組合物，其中上述一個或多個基因包含IGFBP-3。
  5. 如請求項1之組合物，其中上述一個或多個基因包含POSTN及IGFBP-3。
  6. 如請求項1之組合物，其中上述免疫抗癌劑用於抑制PD-L1和PD-1之間的結合。
  7. 如請求項1之組合物，其中上述抗PD-L1抗體包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的輕鏈。
  8. 如請求項1之組合物，其中能夠測量上述mRNA表達水準的製劑是與上述基因互補結合的反義核苷酸、引物或探針。
  9. 如請求項1之組合物，其中能夠測量上述蛋白質表達水準的製劑是與上述基因的蛋白質特異性結合的抗體。
  10. 如請求項1之組合物，其中上述癌症為實體癌。
  11. 如請求項1之組合物，其中上述癌症為選自下組的一種或多種：膽管癌、結腸癌、腺癌、直腸癌、乳腺癌、滑膜肉瘤、軟骨肉瘤、甲狀腺癌、胃癌、胸腺癌、宮頸癌、膠質瘤、腦癌、黑色素瘤、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、腎癌、肝癌、大腸癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、子宮癌、口腔癌、支氣管癌、鼻咽癌、喉癌、皮膚癌、血癌、甲狀旁腺癌以及輸尿管癌。
  12. 一種用於預測癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性的試劑盒，其包括請求項1至11中任一項所述的組合物，其中上述免疫抗癌劑為抗PD-L1抗體。
  13. 一種用於預測癌症患者對免疫抗癌劑的治療反應性的資訊的提供方法，其中上述免疫抗癌劑為抗PD-L1抗體，該方法包括如下步驟： 在從癌症患者獲得的生物試樣中，測量選自由POSTN及IGFBP-3組成的組中的一個或多個基因的mRNA或其蛋白質的表達水準；以及 基於上述測量的mRNA或蛋白質表達水準，評價上述患者對免疫抗癌劑的治療反應性。
  14. 如請求項13之方法，其中上述方法進一步包含在從癌症患者獲得的生物試樣中，測量OPN基因的mRNA或蛋白質的表達水準。
  15. 如請求項13之方法，其中上述一個或多個基因包含POSTN。
  16. 如請求項13之方法，其中上述一個或多個基因包含POSTN及IGFBP-3。
  17. 如請求項13之方法，其中上述免疫抗癌劑用於抑制PD-L1和PD-1之間的結合。
  18. 如請求項13之方法，其中上述方法還包括： 根據上述患者對免疫抗癌劑的治療反應性、確定上述患者是否接受免疫抗癌劑的治療或繼續治療的步驟。
  19. 如請求項13之方法，其中在施用免疫抗癌劑之前、之後或之前和之後測量上述表達水準。
  20. 如請求項19之方法，其中當在施用免疫抗癌劑之前和之後測量上述表達水準且上述基因為POSTN時，在施用免疫抗癌劑之後的上述測量的表達水準顯著高於施用之前的情況下，將上述患者的治療反應性評價為低。
  21. 如請求項19之方法，其中當在施用免疫抗癌劑之前測量上述表達水準且上述基因為POSTN時，在上述測量的表達水準顯著高於其他對照癌症患者施用免疫抗癌劑之前的表達水準的情況下，將上述患者的治療反應性評價為低。
  22. 如請求項19之方法，其中當在施用免疫抗癌劑之前和之後測量上述表達水準且上述基因為IGFBP-3時，在施用免疫抗癌劑之後的上述測量的表達水準顯著低於施用之前的情況下，將上述患者的治療反應性評價為低。
  23. 如請求項19之方法，其中當在施用免疫抗癌劑之前測量上述表達水準且上述基因為IGFBP-3時，在上述測量的表達水準顯著低於其他對照癌症患者施用免疫抗癌劑之前的表達水準的情況下，將上述患者的治療反應性評價為低。
  24. 如請求項13之方法，其中上述mRNA的表達水準通過選自由原位雜交（in situ hybridization）、逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、競爭性逆轉錄聚合酶鏈式反應（competitive RT-PCR）、即時逆轉錄聚合酶鏈式反應（real-time RT-PCR）、RNA酶保護實驗（RNase protection assay; RPA）、微陣列（microarray）以及RNA印跡（northern blotting）組成的組中的一種或多種方法進行測量。
  25. 如請求項13之方法，其中上述蛋白質的表達水準通過選自由蛋白質印跡法（western blotting）、放射免疫分析法（radioimmunoassay; RIA）、放射免疫擴散法、酶聯免疫吸附測定法（ELISA）、免疫沉澱法（immunoprecipitation）、流式細胞術（flow cytometry）、免疫螢光染色法（immunofluorescence）、免疫雙擴散法（Ouchterlony）、補體結合分析法（complement fixation assay）以及蛋白質晶片（protein chip）組成的組中的一種或多種方法進行測量。
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