TWM618792U - 高濃度血小板血漿分離套組 - Google Patents

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TWM618792U
TWM618792U TW109213608U TW109213608U TWM618792U TW M618792 U TWM618792 U TW M618792U TW 109213608 U TW109213608 U TW 109213608U TW 109213608 U TW109213608 U TW 109213608U TW M618792 U TWM618792 U TW M618792U
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劉華昌
林峰輝
顏君哲
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華元生醫股份有限公司
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本揭露提供一種高濃度血小板血漿分離套組，包含一第一分離管以及一第二分離管。該第一分離管包含一第一開口以及一第二開口，且該第二分離管包含一第一部分、一第二部分，以及一濾膜；其中該第一部分具有一第三開口，該濾膜設置在該第一部分與該第二部分之間， 該第二開口的直徑介於1至5 mm的範圍內，且該濾膜的孔徑介於1.5至4 μm的範圍內。

Description

高濃度血小板血漿分離套組
本揭露涉及一種高濃度血小板血漿分離套組及使用其之方法。
已引入含有高濃度血小板(Platelet-rich plasma，PRP)及生長因子的血沉棕黃層，對組織修復具有較佳的效果，特別是在骨骼、軟骨、皮膚、牙槽組織中，甚至作為藥物/細胞載體以控制釋放。
高濃度血小板(PRP)為包含高於基準含量的血小板的血漿。其可透過添加凝血酶或氯化鈣(CaCl 2)進行活化，其中凝血酶或氯化鈣將從α顆粒中釋放出生長因子，例如纖維母細胞生長因子2 (fibroblast growth factor-2，FGF-2)、轉化生長因子β1 (transforming growth factor-beta 1，TGF-ß1)、骨成形性生長因子-2 (bone morphogenic growth factor-2，BMP2)、類胰島素生長因子1 (insulin-like growth factors 1，IGF1)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)，以及其他細胞激素。 這些在刺激、訊息傳遞，以及促進細胞參與組織修復過程中很有價值。 迄今為止，市面上有各種市售PRP套組，每種套組在最終產品中顯示出不同的優勢，例如，收穫的血小板數量、白血球或紅血球的百分比、PRP的最終含量、價格，以及操作時間。 市面上許多的市售PRP製備套組都遵循與纖維蛋白膠製備一樣的方法；其可能會造成血小板含量較少、血小板數目有限、白血球/紅血球過多，以及纖維蛋白超微結構不足。目前，市面上出現數種新的PRP設備或套組，它們通常比以前的套組更容易使用並且對使用者更友善，雖然第一線臨床人員仍不滿意大多數的PRP套組，無論是對PRP的最終含量、血小板數量、生長因子的濃度、白血球/紅血球的數量，或對纖維蛋白超微結構不滿意。
市售的PRP套組可分為兩類：基於血漿的套組以及基於血沉棕黃層的套組；其可簡要描述如下。按照常規方法透過離心過程從全血中收集血小板，將全血分為三層：(1) 頂部的血漿層約佔全血的55%，主要由密度最小的成分組成，(2) 血沉棕黃層停留在中間層，不到全血的1%，且具有高濃度白血球及血小板，(3) 底部的紅血球約佔全血的45%。 16基於血漿的套組僅收穫頂部血漿層，而血小板較少；相反地，血沉棕黃層套組收穫血漿層與血沉棕黃層，具有較高的血小板濃度，即所謂的高濃度血小板血漿，簡稱PRP。血小板可釋放更多的生長因子以誘導局部細胞或間質幹細胞在組織癒合過程中參與修復過程；因此血沉棕黃層套組在組織修復或再生中更受歡迎。目前市售的血沉棕黃層套組的作用通常基於血液成分的密度。然而，血液中各元素的密度非常接近，如果僅透過傳統的離心分離血液中各元素將是個大挑戰。 因此，前述市售的血沉棕黃層套組通常被白血球污染，白血球會引起局部發炎反應以惡化癒合過程，或被紅血球過濾所污染，這可能導致局部細胞壞死。 此外，PRP中顆粒性白血球的數量會干擾纖維蛋白超結構的形成，例如纖維蛋白直徑、孔徑，以及孔隙度等，這可能與癒合過程中的細胞遷移有關。
有鑑於此，需要一種改良的方法，該方法能夠有效地從血漿中分離血小板，具體而言是從白血球及紅血球中分離血小板，並獲得高濃度血小板血漿。
本揭露提供之一方面為一種高濃度血小板血漿分離套組，包含：一第一分離管以及一第二分離管。該第一分離管包含一第一開口以及一第二開口，該第二分離管包含一第一部分、一第二部分，以及一濾膜；其中該第一部分具有一第三開口，該濾膜設置在該第一部分與該第二部分之間，該第二開口的直徑介於1至5 mm的範圍內，且該濾膜的孔徑介於1.5至4 μm的範圍內。
本揭露提供之另一方面為一種高濃度血小板血漿分離之方法，包含： 提供本揭露之套組；通過該第一開口將一血液樣本置於該第一分離管中；離心該第一分離管以分離一底層、一血沉棕黃層，以及一上層；從該第二開口丟棄該底層；通過該第三開口將該血沉棕黃層以及該上層轉移至該第二分離管；以及離心該第二分離管以在該第二部分中收集該高濃度血小板血漿。
當結合附圖時，根據以下詳細描述，本揭露之其他目的、優點，以及特徵將變得更加明顯。
當結合附圖閱讀時，做出以下具體實施例以清楚展現本揭露之上述及其他技術內容、特徵，以及效果。通過特定的具體實施例之說明，人們將進一步理解為了實現上述目的而採用的本揭露之技術手段及效果。此外，由於本領域技術人員可容易地理解並實施本揭露所公開之內容，因此在不脫離本揭露之概念的所有等同改變或修改將由所附申請專利範圍所涵蓋。
此外，說明書及申請專利範圍中記載的序數例如「第一」、「第二」等目的僅在描述請求保護的元件，並不暗示或表示請求保護的元件具有任何進行的序數，亦非暗示一個請求保護的元件與另一請求保護的元件之間或一製造方法的步驟間的順序。這些序數僅是用於區分具有特定名稱的一個請求保護的元件與具有相同名稱的另一請求保護的元件。
此外，說明書與申請專利範圍中所述之術語，例如「在……上」不僅表示與另一元件直接接觸，而且還表示與另一元件間接接觸。
高濃度血小板血漿(PRP)分離套組
請參閱圖1及圖2。該PRP分離套組包含一第一分離管100以及一第二分離管200。該第一分離管100具有一第一開口101以及一第二開口102。於一較佳具體實施例中，該第一開口101的直徑大於該第二開口102的直徑。於一更佳具體實施例中，該第二開口102的直徑範圍為1至5mm。一第一蓋體110設置在該第一開口101上，且一第二蓋體120設置在該第二開口102上。如圖1所示，該第一分離管100的直徑在接近該第二開口102的部分縮小，並因此形成尖形。
該第二分離管200包含一第一部分210、一第二部分220，以及一濾膜230。該第一部分210具有一第三開口201。該第一部分210與該第二部分220彼此連接，且該濾膜230設置在該第一部分210與該第二部分220之間。該濾膜230的孔徑介於1.5至4μm的範圍內。一第三蓋體設置在該第三開口上。因此，於本揭露中，該第一、第二，以及第三蓋體110、120、240將分別覆蓋該第一、第二，以及第三開口101、102、201。
於一特定具體實施例中，該第一部分210與該第二部分220的比率在45：55至35：65之間。於一較佳具體實施例中，該第一部分210與該第二部分220的比率約為40：60。
於一特定具體實施例中，該第一分離管100與該第二分離管200的長度介於10至20cm之間。
於一特定具體實施例中，該第一部分210與該第二部分220為可拆卸的。然而，於另一具體實施例中，該第一部分210與該第二部分220為一體的。
實施例1 血液樣品之製備以及高濃度血小板血漿(PRP)之分離
透過頸內靜脈穿刺補充ACD-A抗凝劑(GBiosciences公司，美國)從豬隻中採集的全血總體積為500 ml。 如表1所示，將血液樣本分為八組以透過不同的方法分離PRP。
表1
組別 分離產物的縮寫 描述
全血 WB 直接從一供體採集的全血
常規方法 CP-PRP 從一供體中收集全血，並以1600 g的離心力進行一次離心，將全血分成三層。收集頂部二層，捨棄底層。
插入5 µm濾膜的試管 H5M 根據本揭露公開之方法分離高濃度血小板血漿，其中該濾膜的截留孔徑為5 μm。將該第二分離管置於一離心機中；然後透過2300 g的離心力將白血球進一步從產物中濾出。
插入3 µm濾膜的試管 H3M 根據本揭露公開之方法分離高濃度血小板血漿，其中該濾膜的截留孔徑為3 μm。將該第二分離管置於一離心機中；然後透過2300 g的離心力將白血球進一步從產物中濾出。
插入2 µm濾膜的試管 H2M                   根據本揭露公開之方法分離高濃度血小板血漿，其中該濾膜的截留孔徑為2 μm。將該第二分離管置於一離心機中；然後透過2300 g的離心力將白血球進一步從產物中濾出。
市售套組 VB 市售PRP套組
透過二步法來分離PRP。首先，透過該第一開口將一血液樣本放置於一第一分離管中。進行第一次離心以分離該第一分離管中的底層、血沉棕黃層，以及上層。從該第二開口丟棄該底層，然後將該血沉棕黃層以及該上層透過該第三開口轉移至該第二分離管，亦即，置於該第一部分中。進行第二次離心以使該第二分離管中的血漿下降。 結果，血漿通過濾膜且該PRP被收集在該第二部分中，而白血球被保留在該濾膜中。
實施例2  全血細胞計數
對血液細胞以及血小板的濃度進行計數，以評估分離的效率。表1中公開的分離組別透過一自動獸醫血液分析儀(IDEXX Procyte Dx)分別對其中的血小板、白血球，以及紅血球進行計數，以進行全血細胞計數(complete blood count，CBC)。結果如圖2及表2所示。
表3總結了對所有血液細胞成分進行計數及評估的公式。
除非另有說明，否則使用GraphPad Prism軟體6將本揭露內容中的實驗數據表示為平均值±S.D。透過單因子變異數分析(one-way ANOVA)對數據進行分析，然後進行Tukey多重比較檢驗，顯著性程度表示為*p ＜0.05、** p ＜0.01，以及*** p ＜0.001。
如圖2所示，CP-PRP組以及WB (全血)組的血小板濃度分別為239x10 3個/μl以及119x10 3個/μl；前者約為後者2倍濃度。H5M組、H3M組、H2M組，以及VB組的血小板數分別為8.5x10 3個/μl、17.0x10 3個/μl、22.0x10 3個/μl，以及13.0x10 3個/μl。其中，H2M組顯示出最高的血小板數。儘管CP-PRP組以及WB組的血小板濃度比H2M組高出許多，但是，從表2來看，CP-PRP組中的白血球(white blood cells，WBCs)產量比H2M組、H3M組，以及H5M組中的高出許多，因此CP-PRP組中收集的PRP可能導致局部發炎反應加劇。WB組含有過多的WBC以及紅血球(red blood cells，RBCs)，不僅可能引起局部發炎反應，而且會減慢癒合過程。
表2
PRP套組 初始 體積(ml) 最終體積(ml) 體積產量 (VY %) 血小板產量 (PY %) 紅血球產量 (RY %) 白血球產量 (WY %)
CP-PRP 30 15.65±1.32 50.24±4.40 100.90±8.83 0.18±0.03 27.83±15.94
H5M 4 1.93±0.09 48.13±2.29 3.44±0.16 0.05±0.02 0
H3M 4 1.82±0.09 45.39±2.37 6.48±0.34 0.01±0.00 0
H2M 4 1.82±0.09 45.39±2.37 8.39±0.44 0 0
市售套組 10 3.833±0.29 38.33±1.44 4.19±0.16 0 5.3
表3
Figure 02_image001
Figure 02_image003
Figure 02_image005
Figure 02_image007
表2所示為血液細胞計數以及分離出的PRP濃度的總結。相較於VB組的市售套組，採用本揭露之套組的根據本揭露之組別，包括H5M組、H3M組，以及H2M組，從全血中收集到相對較高的終體積以及PRP的體積產率。
成功且有效地分離了根據本揭露之組別的PRP，因為該濾膜僅讓血小板滲透並保留了其他細胞。
根據本揭露之H2M組、H3M組，以及H5M組可有效地將RBC以及WBC與PRP分離，尤其是H2M組。此外，H5M組以及H3M組中的RBC分別降低至0.05%及0.01%，這明顯低於CP-PRP (常規方法)組。
因此，透過根據本揭露之套組(H2M、H3M，以及H5M)分離的PRP產生更好的體積及血小板濃度，這表示根據本揭露之套組及方法有效且成功地從全血樣品中分離了PRPs，並在最終產品中僅存在極低或甚至不存在紅血球及白血球。
實施例3  生長因子定量
使用ELISA套組(Wuhan USCN Business有限公司，美國)，根據使用者手冊說明對包括纖維母細胞生長因子2 (FGF-2)以及腫瘤生長因子β-1 (TGF-β1)在內的PRPs的生長因子定量。
製備的PRPs的生長因子定量如圖3所示。根據本揭露之H2M組、H3M組及H5M組，以及CP組製備的PRPs中的生長因子，FGF-2以及TGFβ-1的濃度均遠高於平均值。以其他市售套組製備的PRPs中生長因子的濃度波動很大。
至於FGF-2的濃度(圖3(A))，H5M組、H3M組、H2M組，以及CP組的濃度均高於750 pg/ml。VB組中的濃度低於500 pg/ml。
至於TGFβ-1的濃度(圖3(B))，H5M組、H3M組、H2M組，以及CP組的濃度均高於1750 pg/ml。VB組中的濃度低於1500 pg/ml。
該結果表示，使用根據本揭露之套組的組別中生長因子的濃度相對穩定並且遠高於平均值。
儘管已經在本揭露中顯示並描述本揭露之較佳具體實施例，但是對於本領域技術人員而言顯而易見的是，這些具體實施例僅以示例的方式提供並且可以組合地實現。在不脫離本揭露的情況下，本領域技術人員現在將想到許多變化、改變及替換。應當理解的是，本揭露描述之本揭露的具體實施例的各種替代方案可用於實施本揭露。意圖為以下述申請專利範圍限定本揭露之範圍，並且由此涵蓋這些申請專利範圍內之方法及結構及其等同物。
100:第一分離管 101:第一開口 102:第二開口 110:第一蓋體 120:第二蓋體 200:第二分離管 201:第三開口 210:第一部分 220:第二部分 230:濾膜 240:第三蓋體
為了說明本揭露，於附圖中顯示目前較佳之具體實施例。 但是，應該理解的是，本揭露不限於所示之較佳具體實施例。
於圖式中：
圖1所示為根據本揭露之套組的示意圖；(A) 第一分離管；(B) 第二分離管。
圖2所示為透過本揭露之套組、市售PRP套組、全血(whole blood，WB)，以及常規方法PRP (conventional protocol PRP，CP-PRP)分離的PRP的血小板數量。
圖3所示為表1中列出的所有組別從活化的PRP中釋放的生長因子的濃度：(A) FGF-2，(B) TGF-β1；相同的標記(a、b、c，或d)表示無統計學上的差異，且顯著性程度表示為* (p ＜0.05)、** (p ＜0.01)，以及*** (p ＜0.001)。
101:第一開口
200:第二分離管
201:第三開口
210:第一部分
220:第二部分
230:濾膜
240:第三蓋體

Claims (4)

  1. 一種高濃度血小板血漿分離套組，包含：一第一分離管，包含一第一開口以及一第二開口，以及一第二分離管，包含一第一部分、一第二部分，以及一濾膜；其中該第一部分具有一第三開口，該濾膜設置在該第一部分與該第二部分之間，該第二開口的直徑介於1至5mm的範圍內，且該濾膜的孔徑介於1.5至4μm的範圍內；其中該第二開口係對應該第三開口，自該第一分離管分離之血小板血漿經由該第二開口流出，再從該第三開口注入至該第二分離管。
  2. 如請求項1所述之套組，其中該第一部分以及該第二部分的比率介於45：55至35：65之間。
  3. 如請求項1所述之套組，其中該第一部分以及該第二部分為可拆卸的。
  4. 如請求項1所述之套組，進一步包含一第一蓋體、一第二蓋體，以及一第三蓋體，以分別覆蓋該第一開口、該第二開口，以及該第三開口。
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TWI775179B (zh) * 2020-10-15 2022-08-21 華元生醫股份有限公司 高濃度血小板血漿分離套組及使用其之方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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