UA120572C2 - Штам бактерій bacillus subtilis imb b-7724 - продуцент цитотоксичних речовин з протипухлинною дією - Google Patents

Abstract

Винахід стосується штаму Bacillus subtilis IMB В-7724, що є продуцентом цитотоксичних речовин з протипухлинною дією, що зареєстрований у Депозитарії Інституту мікробіології та вірусології (IMB) ім. Д.К. Заболотного НАН України за номером IMB В-7724.

Description

Корисна модель, що заявляється, належить до галузі мікробіології і біотехнології, а саме культивування мікроорганізмів - штамів бактерій Васіййв5 5ибійв, і може бути використаний для одержання біологічно активних речовин лектинової та протеазної природи з цитотоксичною активністю відносно до пухлинних клітин.

Відомі штами Васіпйи5 з,иБійв5 ІМВ 7025, Васіїїи5 5,иБій5 З16М та Васіїїи5 роїутуха 102 КДУ, які продукують біологічно активні речовини лектинової та протеазної природи з протипухлинною активністю (11. Проте, їх продуктивність не забезпечує необхідний рівень останньої.

Найбільш близьким штамом до запропонованого є Васійи5 зибійв ІМВ В-7025 |2І|, який продукує біологічно активні речовини лектинової природи з цитотоксичною протипухлинною активністю відносно до пухлинних клітин різного гістогенезу (саркома 37, аденокарцинома

Ерліха, лімфома МК/Л у, лімфосаркома ОН-2, плазмоцитома ОН-3, карцинома легені Льюїс).

Порівняно з вищевказаними штамами Васійй5 5!ибБійв ІМВ В-7025 продукує більшу кількість речовини лектинової природи. Однак його використання не завжди ефективне через недостатньо високу протипухлинну активність.

В основу корисної моделі була поставлена задача одержати штам Васіїнв5 5ибійв, більш ефективний та стабільний по продукуванню цитотоксичної речовини, зокрема лектинової та протеазної природи, з високою протипухлинною активністю.

Поставлена задача вирішена шляхом одержання за допомогою методів аналітичної селекції нового штаму Васіїїш5 в5иЇибБій5. Новий штам виділений із штаму Васійи5 5!,ибБійв 7 шляхом відбору окремих колоній з підвищеною здатністю до продукції цитотоксичних речовин при культивуванні в конкурентних умовах із штамами мікроорганізмів Єіеріососсив руодепіє та Збетайа тагсезсеп5 і депонований у колекції Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного (МВ) НАН України під номером ІМВ В-7724 (Свідоцтво про первісне депонування штаму мікроорганізму від 12.03.2018 року). Штам ідентифікований за "Кратким определителем бактерий Берги" ІЗ). В результаті селекційної роботи даний штам набуває таких культурально- морфологічних та фізіолого-біохімічних властивостей, які забезпечують його здатність до високої продуктивності цитотоксичних речовин з протипухлинною активністю.

Культурально-морфологічні ознаки. Даний штам Васійи5 5!Иирійв добре росте при температурі 28-40 "С на м'ясо-пептонному бульйоні (МПБ), м'ясо-пептонному агарі (МЛА),

Зо напівсинтетичному середовищі Гаузе, 10 9о екстракті пшеничних висівок. Мікроорганізм являє собою грампозитивну, паличковидну клітину шириною 0,7-0,8 мкм та довжиною 2-3 мкм; характерною ознакою є наявність ендоспор, які утворюються в присутності кисню, форма - овальна. Клітини розташовуються поодиноко або ланцюжком.

Оптимальні умови вирощування наступні: температура 37 С; рН середовища 6,5-8,5.

При вирощуванні протягом 24-48 год. на твердому живильному середовищі (МПА) спостерігається дисоціація колоній наступних варіантів/типів: В-форма - пласка, з шорсткою поверхнею, матова, суха, має порізаний край, розмір колоній 4-5 мм; О-форма - випукла, гладенька, слизиста, має рівний край, розмір колоній 3-4 мм; 5-форма - пласка, гладенька, пастоподібна, має злегка хвилястий край, розмір колоній 3-5 мм.

При культивуванні на рідких живильних середовищах (МПБ, середовище Гаузе, 10 95 екстракт пшеничних висівок) бактерії утворюють щільну поверхневу плівку.

Фізіолого-біохімічні властивості. Мікроорганізм має аеробні властивості, гідролізує крохмаль, зменшує в'язкість желатини, розкладає казеїн, утворює кислоту 3 глюкози. Генетичні особливості штаму (ауксотрофність) - неауксотрофний. Даний штам продукує комплекс цитотоксичних лектинів та протеаз.

Культуральна рідина має антимікробну активність відносно до 5ї. ашгеив (в розведенні 1:100), аглютинуючу активність до еритроцитів крові та протипухлинну цитотоксичну і цитолітичну активність відносно до пухлинних клітин різного гістогенезу (аденокарциноми

Ерліха, карциносаркоми Уокер, карциноми легені Льюїс, меланоми В-16).

На ефективність процесів бактеріального біосинтезу суттєво впливають фактори зовнішнього середовища та умови культивування. За різних умов вирощування одна і та ж бактеріальна культура може повністю припинити утворення тих чи інших біологічно активних речовин, і навпаки - одночасно продукувати різні сполуки. До зовнішніх факторів, що впливають на біосинтетичну активність бактерій, належать склад поживного середовища, природа і концентрація джерел вуглецю і азоту, рН середовища, а також способи ведення процесу культивування.

Для відпрацювання режиму культивування Васійи5 5ибБійв ІМВ В-7724 використано загальноприйняте стандартне середовище - МПБ та напівсинтетичне середовище Гаузе.

Суттєвий вплив на біосинтез цитотоксичних речовин чинить вік і кількість посівного матеріалу. бо Для засіву живильного середовища (МПБ та середовище Гаузе) використовували вегетативні

(20-24-годинні) форми культури, попередньо вирощені в стаціонарних умовах при 37 "с.

Одержану культуру вносили в середовище для культивування в кількості від 1,5 до 15 95 (об'ємних) і визначали в динаміці інтенсивність накопичення синтезованих цитотоксичних речовин. Встановлено, що максимальний біосинтез цитотоксичних речовин продуцентом спостерігався при використанні 7-10 95 посівного матеріалу.

Оптимальні параметри біосинтезу цитотоксичних речовин при вирощуванні штаму Васіїшв 5,иБій5 ІМВ В-7724 в стаціонарних умовах (термостат) та в умовах періодичного культивування (качалки) були практично однаковими. Відмінність полягала лише в тому, що ріст і розвиток (тобто накопичення активних речовин) продуценту в термостаті подовжувалось в часовому проміжку.

Встановлено, що цитотоксичний вплив культуральної рідини Васійй5 5,ирійв5 ІМВ В-7724 на пухлинні клітини складається з двох етапів: на першому етапі інкубації відбувається аглютинація пухлинних клітин, утворення конгломератів клітин; на другому - при більш тривалій інкубації, відбувається лізис пухлинних клітин. Це може свідчити про те, що культуральна рідина має як аглютинуючу, так і ферментативну активність, в даному випадку протеолітичну, тобто є біфункціональною, або містить, як мінімум, дві речовини з різною біологічною активністю.

Виходячи з цього, для культивування даного штаму були досліджені поживні середовища, оптимізовані для синтезу лектинів - напівсинтетичне середовище Гаузе і середовище на основі пшеничних висівок (1095 екстракт), яке використовують для біосинтезу протеолітичних ферментів.

В процесі росту Васійш5 в5иИиБій5 ІМВ В-7724 на досліджуваних живильних середовищах вивчали гемаглютинуючу активність (ГАА) культуральної рідини мікроорганізму відносно до еритроцитів кроля |4| та цитотоксичну активність іп міго відносно до клітин різних модельних пухлин (асцитна форма аденокарциноми Ерліха, саркома-37, карциносаркома Уокер) (51.

Порівняльне вивчення динаміки накопичення цитотоксичних речовин в культуральній рідині

Васійи5 вирій ІМВ В-7724 показало, що такі речовини синтезуються при рості даного мікроорганізму на всіх досліджуваних середовищах. Пік цитотоксичної дії на пухлинні клітини культуральної рідини бактерій, які вирощені на трьох поживних середовищах (МПБ, Гаузе, 10 95 екстракт пшеничних висівок), спостерігається на 5-8 добу росту культури, однак кількісне співвідношення синтезованих цитотоксичних речовин, а, можливо і їх природа, різні.

Суть корисної моделі підтверджують приклади 1 і 2, таблиці (табл. 1, табл. 2 і табл. 3) та креслення.

Приклад 1.

Культуральна рідина бактерій, культивованих на МПБ і середовищі Гаузе, в перші 10-15 хвилин інкубації з пухлинними клітинами призводила до аглютинації 90-100 95, а в кінці інкубації викликала повний або частковий лізис пухлинних клітин (табл. 1, табл. 2).

Таблиця 1

Цитотоксична та аглютинуюча активність культуральної рідини штамів Васіїйив5 зибійв5 ІМВ В-7025 (прототип) та Васійив5 5,ибрійв ІМВ В-7724 (що заявляється) при культивуванні на середовищі МПБ ультуральна

Доба рідина що що що заявляється заявляється заявляється тей 72 | 0 | 0 101 0 101 0 тен ле | 30 | 40 | 0 | щ0 | 70 | 20 тен ле | 40 | 50 | 0 | щ0 | 40 | 50 лоба ЮЗЗ«8А о 5 Я 5 5 5 6 6 6 112 | 45 | 55 | 0 | 0 | 55 | 60 7.2 | 90 | 95 | 40 | 50 | 60 | 7 ин шши ши шшипшшш ши ше 712 | 90 | 95 | 90 | 9 | 85 | 9 7.12 | ло | 700 | 80 | в85 | 90 | 95 ее 712 | 70 | 80 | 40 | 50 | 90 | 95 оо атмвна ЮЗ0 5:35 -- 5 ---- 5 52 о 4Л- 712 | 50 | 60 | 50 | 60 | 85 | 9 12 | 70 | 75 | 50 | 60 | 80 | 85 (

Таблиця 2

Цитотоксична та аглютинуюча активність культуральної рідини штамів Васіїйив5 зибійв5 ІМВ В-7025 (прототип) та Васійив 5,ибрій5 ІМВ В-7724 (що заявляється) при культивуванні на середовищі

Гаузе

Культуральна - юнкНН- : що що що заявляєтьо заявляється заявляється

Дт в т В ТО В ТО В ТО В" ТВ НО": Я 712 | 0 | 0 1 0 1 0 1 0 1 0

Дт в То С ТО ТО ТО ТО ТТ ТО то ЕТ 712 | 0 ЇЇ 0 1 0 1 0 1 20 1 з

НН

712 | 15 | 30 | 0 | що0 1 45 1 Ююж 50 712 | 20 | 50 | 20 | 50 | 60 | 7

Кляп ши пиши ши ши ши 712 | 20 | 45 | 20 | 40 | 70 | ющ 80 / 12 | 30 | 7 | 30 | 60 | 90 | 95 нн 712 | 20 | 60 | 20 | 50 | 90 | 98 / ово ати 02082600 --0 3-00 -- 56 - 5 « -

Книш ши ши шш ши пиши 12 | ло | 40 | ло | 40 | 80 | 85

Для вивчення властивостей культуральної рідини мікроорганізмів обох штамів використовували реакцію гемаглютинації, в основі якої лежить специфічне зв'язування лектинів з розміщеними на поверхні еритроцитів вуглеводами, і виражали як титр" РГА (креслення). На кресленні представлені графіки виявлення гемаглютинуючої лектинової активності культуральної рідини штамів Васійив5 взибійїв ІМВ В-7025 (прототип) та Васіїив5 5иЇибійїїв ІМВ В-7724 (що заявляється) при культивуванні на середовищі Гаузе.

Штам, що заявляється, має більшу стабільність в продукуванні цитотоксичних речовин ніж штам-прототип, що наглядно видно з представлених графіків.

Приклад 2.

Культуральна рідина бактерій, які вирощували на 10 95 екстракті пшеничних висівок, проявляла лізуючу дію на пухлинні клітини (100 95 клітин) при повній відсутності аглютинуючої активності відносно до останніх (табл. 3). Це може свідчити про синтез на даному середовищі, головним чином, речовин з протеолітичною активністю нелектинової природи. Підтвердженням цього висновку є наявність в культуральній рідині мікроорганізму, вирощеного на цьому середовищі, загальної протеолітичної активності, виявленої електрофоретично з використанням желатини як субстрату |бІ.

Таблиця З

Цитотоксична та аглютинуюча активність культуральної рідини штамів Васіїйив5 зибійв5 ІМВ В-7025 (прототип) та Васійив5 5,ибрій5 ІМВ В-7724 (що заявляється) при культивуванні на 10 Фо екстракті пшеничних висівок

Культуральна ---- :

Доба| рідина тен ен Шев, ен заявляється заявляється заявляється

Дт тв но то в то В то НН пТМН НН" т В. ТИ 712 | 0 ЇЇ щ0 101 10 | 0 0

Дт нив во ств в "то В т НН тт НН" т В. ТИ 712 | 10 | 20 | го | 3 | 0 0

Дт вв нос тв В г. В т НТ" Я" НО А ТИ 712 | 95 | щ98 | 20 | 3 | 0 0 ло обатмвна ЗНА 5 5 5 5 И« 5 Л5 й 712 | 98 | щ9 | 30 | 4 | 0 0

Боба ЗА - 50 - 500 5 5 5 5 1 Л5 й 712 | ло0 | 100 | 35 | 50 | 0 | 0

Книш ши ши ши шшш шшш ше 712 | ло | ло | 80 | щ9 | 0 0

Дт вв но гл В п" Вл НН "т Я" НО А ТИ 712 | ло | ло | 60 | 7 | 0 0 вовна ЗНА - 500-09-51 -0-- 17112 | ло | лоб | 15 | 25 | 0 | 0

Дт т тт о ТТ в Тов ТК ОВТ ТО 712 | 70 | 80 | 710 | 20 | 0 0 ото бативна З 565 6 5 6 о 5 0 - Я 712 | 50 | 60 | 0 | 20 | 0 1 0

Таким чином, штам Васійшив5 5,ирійв ІМВ В-7724, що заявляється, продукує цитотоксичні речовини з протипухлинною властивістю при вирощуванні на всіх досліджуваних поживних середовищах (МПБ, середовище Гаузе та 10 95 екстракт пшеничних висівок). Тобто, штам є невимогливим до поживних речовин, які необхідні для біосинтезу біологічно активної речовини.

Ця властивість дає можливість використовувати для культивування мікроорганізму доступні і дешеві поживні середовища. Культуральна рідина штаму має біфункціональну активність (аглютинуючу та цитотоксичну) відносно до пухлинних клітин. При вирощуванні штаму Васійв5 5,иБій5 ІМВ В-7724 на середовищах МПБ і Гаузе культуральна рідина аглютинувала 90-100 Фо пухлинних клітин (що було пов'язано з синтезом на даних середовищах речовин лектинової природи з цитотоксичною активністю). При вирощуванні штаму на 10 95 екстракті пшеничних висівок культуральна рідина проявляла 100 95 лізуючу дію на пухлинні клітини (що пов'язано з синтезом на даному середовищі речовин з протеолітичною активністю). Штам, що заявляється, має більшу стабільність в продукуванні цитотоксичних речовин ніж штам-прототип.

Отже, штам Васійи5 вирій ІМВ В-7724, що заявляється, є більш ефективним та стабільним по продукуванню цитотоксичних речовин, зокрема лектинової та протеазної природи з високою протипухлинною активністю. Технічного результату корисної моделі досягнуто.

Джерела інформації: 1. Коваленко Е.О. Позаклітинні лектини бактерій роду ВасіПш5. Дис. ... д. біол. н. - Київ, 1999. 2. Патент Мо56348 ША. Штам бактерій Васійи5 виЇбБійв - продуцент протипухлинних цитотоксичних речовин / Потебня Г.П., Лісовенко Т.С, Черемшенко Н.Л. та ін. // Бюл. промислової власності. - 2003. - Мо 5. 3. Вегдєу5 Мапиаї ої Оєїеттіпаїїме Васієгіоіоду. Едіоп 8-й / Ед. Виснапап Р.Е., сірропзв К.Е. - Вайцітоге, УУШатв»в 5. МКіп5, 1974. - 1268 р. 4. Луцик М.Д., Панасюк Е.Н., Луцик А.Д. Лектинь. Львів: Вища школа, 1981. - 155 с 5. Дж Клаус. Лимфоцить!. Методь. М.: Мир, 1990. - 395 с.

6. Моїї 0О.М., Моипаіеїв а.Г., Новіп5Ку К.В., Оцідієу УР. Титог рготоїег-віїтціатей Ме 92000 деїаййпазе 5естеїва Бу поттаї апа таїїдпапі питанп сеїІ5. ІбоЇайоп апа сНагасіеєгізайоп ої епгуте їот НТ 1080 Штокг сеїЇІз // Сапсег Нез. - 1990. - М. 58, Мо 19. - Р. 6162-6170.

Фіг. Динаміка виявлення гемаглютинуючої лектинової активності культуральної рідини штамів Васійив5 вирій ІМВ В-7025 (прототип) та Васійй5 5!,Бій5 ІМВ В-7724 (що заявляється) при культивуванні на середовищі Гаузе

Позначення: по осі абсцис - час (доба), по осі ординат - ГАА (титр" РГА), 77 штам- прототип, 7777 - штам, що заявляється.

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Штам бактерій Васійи5 з,ибійв ІМВ В-7724 - продуцент цитотоксичних речовин з протипухлинною дією, що зареєстрований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім.

   Д.К.

   Заболотного НАН України за номером ІМВ В-7724. БК фретентееентюретестьнятя вени нини нини ши принт пн нн ї ! ! Е ше і І В ! і Н Н Н «7 : Е ( ху Е Н ! ЕЕ р нн інн зі нн зенн ки а п ан я ЕЯ стаж - нишишшиишишшши ше ше ни ши ши шини нина р ши ши ши; ши ШИ ши ше ; ; : і і і я Е : 1 ; -- 1 і | | їз Е : що ння фор винних в нн ни ни | спятеітятяяия и В : і ше : 1 ї ї ! ше | ЕВ Ї ї Е ! ДК : ШИ ШЕ І КІ Диня ; ин пен пи пен ААлтАМ пш нин вини и ті ше ми ше хни ши ши на ша шШШЬЯ ! ши атши ще ше виш ши чеше нин гани мин пох нн МН ; й Е рожі Е ; - її ! ЖК Ал М АдАдлАдтафакни іт тних пит тнюЯ Нед З и В ЕЕ и и и ЕЕ ВЕ З з КЗ З з Е я т а з м я