UA122764C2 - Ячмінь з дуже низьким вмістом гордеїнів та харчовий продукт на основі солоду - Google Patents

Ячмінь з дуже низьким вмістом гордеїнів та харчовий продукт на основі солоду Download PDF

Info

Publication number
UA122764C2
UA122764C2 UAA201600247A UAA201600247A UA122764C2 UA 122764 C2 UA122764 C2 UA 122764C2 UA A201600247 A UAA201600247 A UA A201600247A UA A201600247 A UAA201600247 A UA A201600247A UA 122764 C2 UA122764 C2 UA 122764C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
grain
malt
flour
hordeins
barley
Prior art date
Application number
UAA201600247A
Other languages
English (en)
Inventor
Грегорі Джон Таннер
Грэгори Джон Таннэр
Кріспін Александер Хауітт
Криспин Александер Хауитт
Мішель Лайза Колгрейв
Мишэль Лайза Колгрэйв
Малколм Джеймс Бланделл
Малколм Джэймс Бланделл
Original Assignee
Коммонвелт Сайнтіфік Енд Індастріел Рісерч Організейшн
Коммонвелт Сайнтифик Энд Индастриел Рисерч Организэйшн
Грейнз Рісерч Енд Дівелопмент Корпорейшн
Грэйнз Рисерч Энд Дивелопмент Корпорэйшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2013902140A external-priority patent/AU2013902140A0/en
Application filed by Коммонвелт Сайнтіфік Енд Індастріел Рісерч Організейшн, Коммонвелт Сайнтифик Энд Индастриел Рисерч Организэйшн, Грейнз Рісерч Енд Дівелопмент Корпорейшн, Грэйнз Рисерч Энд Дивелопмент Корпорэйшн filed Critical Коммонвелт Сайнтіфік Енд Індастріел Рісерч Організейшн
Publication of UA122764C2 publication Critical patent/UA122764C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/10—Cereal-derived products
    • A23L7/198—Dry unshaped finely divided cereal products, not provided for in groups A23L7/117 - A23L7/196 and A23L29/00, e.g. meal, flour, powder, dried cereal creams or extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D13/00—Finished or partly finished bakery products
    • A21D13/40—Products characterised by the type, form or use
    • A21D13/41—Pizzas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4624—Hordeum vulgarus [barley]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D13/00—Finished or partly finished bakery products
    • A21D13/02—Products made from whole meal; Products containing bran or rough-ground grain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D13/00—Finished or partly finished bakery products
    • A21D13/04—Products made from materials other than rye or wheat flour
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D13/00—Finished or partly finished bakery products
    • A21D13/04—Products made from materials other than rye or wheat flour
    • A21D13/047—Products made from materials other than rye or wheat flour from cereals other than rye or wheat, e.g. rice
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D13/00—Finished or partly finished bakery products
    • A21D13/06—Products with modified nutritive value, e.g. with modified starch content
    • A21D13/064—Products with modified nutritive value, e.g. with modified starch content with modified protein content
    • A21D13/066—Gluten-free products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D13/00—Finished or partly finished bakery products
    • A21D13/30—Filled, to be filled or stuffed products
    • A21D13/32—Filled, to be filled or stuffed products filled or to be filled after baking, e.g. sandwiches
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D13/00—Finished or partly finished bakery products
    • A21D13/40—Products characterised by the type, form or use
    • A21D13/42—Tortillas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D13/00—Finished or partly finished bakery products
    • A21D13/40—Products characterised by the type, form or use
    • A21D13/43—Flatbreads, e.g. naan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D13/00—Finished or partly finished bakery products
    • A21D13/40—Products characterised by the type, form or use
    • A21D13/44—Pancakes or crêpes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D13/00—Finished or partly finished bakery products
    • A21D13/40—Products characterised by the type, form or use
    • A21D13/45—Wafers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D13/00—Finished or partly finished bakery products
    • A21D13/40—Products characterised by the type, form or use
    • A21D13/46—Croutons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D13/00—Finished or partly finished bakery products
    • A21D13/60—Deep-fried products, e.g. doughnuts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
    • A23L11/70—Germinated pulse products, e.g. from soy bean sprouts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Preparation or treatment thereof
    • A23L2/38—Other non-alcoholic beverages
    • A23L2/382—Other non-alcoholic beverages fermented
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
    • A23L29/206—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin
    • A23L29/212—Starch; Modified starch; Starch derivatives, e.g. esters or ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/10—Cereal-derived products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/20—Malt products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C1/00—Preparation of malt
    • C12C1/02—Pretreatment of grains, e.g. washing, steeping
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C12/00—Processes specially adapted for making special kinds of beer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C2200/00—Special features
    • C12C2200/01—Use of specific genetic variants of barley or other sources of fermentable carbohydrates for beer brewing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Cereal-Derived Products (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Alcoholic Beverages (AREA)
  • Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Noodles (AREA)

Abstract

Винахід стосується способу одержання харчового інгредієнта або інгредієнта напою на основі солоду або харчового продукту або напою на основі солоду, причому спосіб включає (i) переробку ячмінного зерна, що містить 50 м. ч. або менше гордеїнів, для одержання солоду, сусла, борошна або цільнозернового борошна та/або (ii) змішування ячмінного зерна або солоду, сусла, борошна або цільнозернового борошна, одержаних із вказаного зерна, зі щонайменше одним іншим харчовим інгредієнтом або інгредієнтом напою, причому ячмінне зерно, солод, сусло, борошно або цільнозернове борошно містять 50 м. ч. або менше гордеїнів, тим самим одержуючи харчовий інгредієнт або інгредієнт напою на основі солоду, харчовий продукт або напій на основі солоду. Винахід також стосується рослини ячменю, яка продукує зерно, що містить близько 50 м. ч. або менше загальних гордеїнів; способу отримання зерна ячменю; харчового інгредієнту або інгредієнту напою на основі солоду або харчового продукту або напою-продукту на основі солоду, одержаних з рослини ячменю або зерна.

Description

зерно, солод, сусло, борошно або цільнозернове борошно містять 50 м. ч. або менше гордеїнів, тим самим одержуючи харчовий інгредієнт або інгредієнт напою на основі солоду, харчовий продукт або напій на основі солоду.
Винахід також стосується рослини ячменю, яка продукує зерно, що містить близько 50 м. ч. або менше загальних гордеїнів; способу отримання зерна ячменю; харчового інгредієнту або інгредієнту напою на основі солоду або харчового продукту або напою-продукту на основі солоду, одержаних з рослини ячменю або зерна.
ГАЛУЗЬ ЗАСТОСУВАННЯ ВИНАХОДУ
Цей винахід відноситься до способів отримання харчових продуктів або напоїв на основі солоду, які придатні для споживання суб'єктом із захворюванням целіакією. Зокрема, цей винахід відноситься до способів отримання харчових продуктів або напоїв на основі солоду з дуже низьким вмістом гордеїнів. У цьому винаході також представлені рослини ячменю, які продукують зерно, що може використовуватися у способах за цим винаходом.
РІВЕНЬ ТЕХНИКИ
Захворювання целіакією (З3Ц) являє собою ентеропатію, опосередковану Т-клітинами, яка стимулюється споживанням проламінів зернових, таких як пшениця, ячмінь та жито. Клінічні симптоми ЗЦ включають втомлюваність, діарею, здуття живота, втрату маси тіла, анемію та неврологічні порушення (сгееп еї аї., 2006). ЗЦ пов'язане з підвищеною частотою виникнення шлунково-кишкових злоякісних утворень, таких як 10-кратне збільшення ризику раку кишковика, від 3- до б-кратного збільшення ризику неходжкінської лімфоми та 28-кратне збільшення ризику
Т-клітинної лімфоми кишковика (сгееп еї аї., 2009), а також підвищеною частотою виникнення анемії, остеопорозу, неврологічних розладів і додаткових аутоїмунних порушень, таких як діабет (ЗКомбієгу еї а!., 2005). У випадку найбільш вивчених білків проламіну, а-гліадину, токсичність у значній мірі опосередкована єдиним глутаміном в єдиному пептиді (Апаегзоп еї аї., 2000; 5пап еї аїІ,, 2002), який викликає руйнівний каскад реакцій, які у кінцевому рахунку пошкоджують ворсинки тонкого кишковика, знижуючи поглинання поживних речовин та впливаючи на здоров'я. До теперішнього часу детально картовані токсичні епітопи целіакії для всіх відомих білків проламінів пшениці, ячменю та жита з використанням незміщених популяцій Т-клітин, виділених з периферійної крові НГА-002: хворих целіакією після короткочасного прийму в їжу пшениці, ячменю та жита (Туе-Оіп еї аї., 2010). Неочікувано виявилося, що лише три високоїмуногенні пептиди, які походять з а-глаадину (ЕГОРЕРОРЕГРУРОРО, ЗЕО ІЮО Мо: 1), Ф- гліаадину/С-гордеїну (ЕОРЕРОРЕОРЕРУМОР, ЗЕО ІО Мо: 2) та В-гордеїну (ЕРЕОРІРЕОРОРМРОО, 5ЕО ІЮ Мо: 3), можуть забезпечувати 9095 целіакієспецифічної реакції, викликаної повним набором білків пшениці, ячменю і жита.
Єдиним сучасним методом лікування ЗЦ є виключення, яке триває все життя, харчового глютену, що складається з родини подібних білків, виявлених у пшениці (гліадини, глютеніни),
Зо жита (секаліни), ячменю (гордеїни) та вівсі (авеніни). Однак, такі типи дієт є високовартісними (бееє еї аЇ., 2007) та пов'язаними з низьким споживанням харчових волокон і високим споживанням цукрів (Киррег еї аї., 2005; Ума еї аї., 2010; Опішипа еї аї., 2010), які самі по собі несуть ризики для здоров'я. Виключення харчового глютену призводить до нормалізації медичної статистики у більшості, але не у всіх хворих целіакією (І апліпі еї аІ., 2009; Кибіо-Таріа еї аІ., 2010). Близько 1 95 із більшості популяцій у всьому світі страждають від захворювання целіакією, однак, залишається до 50 95 дорослих з недіагностованим захворюванням або таких, що не проявляють явних симптомів (Саїавзві еї аї., 1994; Еом'еї! еї аї., 2006).
Основні родини білків насіння у зернових культур Тгісіссєає представлені альбумінами, глобулінами та глютеноподібними білками, збирально названими проламінами (Зпемжмгу та
Ташат, 1990). Альбуміни та глобуліни широко розповсюджені серед квіткових рослин, але проламіни обмежено зустрічаються у трав'янистих рослинах, зокрема у підродині Рооідеаеє (Нашзсп еї аї., 2002). Проламіни так названі через те, що вони містять високе співвідношення амінокислот проліну і глутаміну, що перешкоджають протеолізу під час травлення (Нашзсн еї аї., 2002). Ген а-гліадину був першим клонованим геном проламіну і, у теперішній час, багато відомо про роль цього білка при захворюванні целіакією (Казагаа еї а!., 1984). Токсичність цього проламіну зосереджена на єдиному пептиді 57-ОЇ ОРЕРОРОЇ РУИРОРОБ-73 (5ЕО ІЮ Мо: 4) із залишком глутаміну 065, який є ключовою амінокислотою. Мутація цього єдиного глутаміну на, наприклад, лізин ліквідує целіакальну токсичність цього проламіну (Апдегхоп еї аї., 2000).
Частково гідролізовані пептиди проходять через епітелій та досягають власну пластинку слизової оболонки завдяки невідомому механізму; тут 065 дезамідується за допомогою тканинної трансглутамінази (ІТС) з утворенням Еб5 (глутамат), збільшуючи імуностимулюючий потенціал пептиду (ЗКомбієгу еї аї.,, 2004). Негативний заряд полегшує зв'язування пептиду з рецепторами 0О2 (або рідше БО8) на поверхні антигенпрезентуючих клітин, забезпечуючи презентацію пептидів особливим глютеноспецифічним, обмеженим за 002, СО4- Т-клітинам, які націлені на кишковик. Активовані таким чином СО4 Т-клітини проходять клональне розмноження та, у свою чергу, сприяють розмноженню глютеноспецифічних та То2- специфічних В-клітин з результуючою продукцією анти-ЇО2 та антиглютенових антитіл, характерних для захворювання целіакією. Клітинно-опосередкована ТП1-реакція відбувається за посередництвом секреції запальних цитокінів (Тіоп еї аї., 2010). Таким чином, проста білкова 60 взаємодія, полегшена введенням єдиного негативно зарядженого залишку, ініціює серії специфічних і направлених каскадів, що у кінцевому рахунку призводять до руйнування кишкових ворсинок.
Ячмінь (Ногдешт мцідаге Ї.) являє собою повсюдно культивовану зернову культуру, яка використовується для одержання солоду для пивоваріння та харчової промисловості.
Осолоджений ячмінь є основним інгредієнтом у пиві, забезпечуючи вуглеводне джерело для ферментації. Нажаль, для хворих целіакією ячмінне пиво також містить низьку, але целіакальну токсичну концентрацію гордеїну (глютену) (Оов5іарек еї аї.,, 2006). Гордеїни відповідають за половину білка ячмінного зерна (Могаусома еї аї., 2009) і складаються з чотирьох мультигенних родин: В-гордеїни (30-45 кДа; 7095 вмісту гордеїну) та С-гордеїни (45-75 кДа; 2095 вмісту гордеїну) переважають у складі гордеїну зерна, тоді як О- (105 кДа) та у-гордеїни (35-40 кДа) є мінорними компонентами (Зпемлу еї аїЇ., 1999). Осолоджене сорго, пшоно та гречка використовуються як безглютенові альтернативні варіанти для одержання пива (М/і|пдааго еї аї., 2007), однак, для цих зернових культур складно отримати відтворювану якість і низьку вартість одержання як для ячмінного пива.
Стандартне визначення ВООЗ для безглютенових харчових продуктів, прийняте Кодексом
Аліментаріус у 2008 р., вимагає щоб «безглютеновим» маркувався харчовий продукт, приготований з зернових культур, таких як пшениця і ячмінь, повинен містити менше 20 мг/кг (20 м.ч.) глютену. Точний кількісний метод для оцінки вмісту глютену у харчових продуктах і напоях з використанням мас-спектрометрії представлений Со|ідгаме еї а!. (2012).
У публікації УМО2009/021285 описано отримання зерна ячменю, в якому було зменшено вміст гордеїну до менше 10 95 від вмісту у зерні дикого типу, особливо за гордеїнами В та С.
Однак, залишається необхідність у зерні з набагато меншими концентраціями гордеїнів для одержання харчових продуктів і напоїв, які можуть споживатися людьми з ЗЦ.
Отже, існує необхідність в ячмені зі значно більш низьким вмістом індукуючих ЗЦ гордеїнів, який міг би використовуватися у харчових продуктах та напоях для чутливих до ЗЦ суб'єктів.
СУТЬ ВИНАХОДУ
Ці винахідники отримали зерно ячменю з дуже низьким вмістом гордеїнів. Це зерно може використовуватися для одержання великого розмаїття харчових продуктів та напоїв на основі солоду, які можуть бути спожиті суб'єктами, що страждають від захворювання целіакією.
Зо У першому аспекті у цьому винаході представлено спосіб одержання харчового інгредієнта або інгредієнта напою на основі солоду, або харчового продукту або напою на основі солоду, причому спосіб включає (ї) переробку ячмінного зерна для одержання солоду, сусла, муки або цільнозернової крупи та/або (ії) змішування ячмінного зерна або солоду, сусла, муки або цільнозернової крупи, одержаних із вказаного зерна, з щонайменше одним іншим харчовим інгредієнтом або інгредієнтом напою, причому ячмінне зерно, солод, сусло, мука або цільнозернова крупа містять близько 50 м.ч. або менше гордеїнів, тим самим одержуючи харчовий інгредієнт або інгредієнт напою на основі солоду, харчовий продукт або напій на основі солоду.
В аспекті у цьому винаході представлено спосіб одержання харчового інгредієнта або інгредієнта напою на основі солоду, харчового продукту або напою на основі солоду, причому спосіб включає (ї) переробку ячмінного зерна, що містить близько 50 м.д. або менше гордеїнів, для одержання солоду, сусла, муки або цільнозернової крупи та/або (ії) змішування ячмінного зерна або солоду, сусла, муки або цільнозернової крупи, одержаних із вказаного зерна, з щонайменше одним іншим харчовим інгредієнтом або інгредієнтом напою, причому ячмінне зерно або солод, сусло, мука або цільнозернова крупа містять близько 50 м.ч. або менше гордеїнів, тим самим одержуючи харчовий інгредієнт або інгредієнт напою на основі солоду, харчовий продукт або напій на основі солоду.
У варіанті реалізації винаходу зерно, солод, сусло, мука або цільнозернова крупа містять близько 20 м.ч. або менше, близько 10 м.ч. або менше, близько 5 м.ч. або менше, від близько
БО 0,05 м.ч. до близько 50 м.ч. або від близько 0,05 м.ч. до близько 20 м.ч., від близько 0,05 м.ч. до близько 10 м.ч., від близько 0,05 м.ч. до близько 5 м.ч., від близько 0,1 м.ч. до близько 5 м.ч., близько 3,9 м.ч. або близько 1,5 м.ч. гордеїнів.
В іншому варіанті реалізації винаходу середня маса зернівки складає щонайменше близько 35 мг, щонайменше близько 39 мг, щонайменше близько 41 мг, щонайменше близько 47 мг, від близько 35 мг до близько 60 мг, від близько 40 мг до близько 60 мг, від близько 45 мг до близько 60 мг, близько 39,1 мг, близько 41,8 мг або близько 47,2 мг.
У додатковому варіанті реалізації винаходу зерно, солод, сусло, мука або цільнозернова крупа містять 20 м.ч. або менше гордеїнів, а середня маса зернівки складає від близько 40 мг до близько 60 мг. В іншому варіанті реалізації винаходу зерно, солод, сусло, мука або бо цільнозернова крупа містять 20 м.ч. або менше гордеїнів, а середня маса зернівки складає від близько 45 мг до близько 60 мг. Спеціальне згадування цих комбінацій не виключає інші комбінації цих ознак.
У додатковому варіанті реалізації винаходу щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 90 95, щонайменше близько 95 95, від близько 80 95 до близько 98 95 або від близько 80
Фо до близько 93 95 зерна не проходить через сито з розміром комірок 2,8 мм.
У додатковому варіанті реалізації винаходу зерно, солод, сусло, мука або цільнозернова крупа містять 20 м.ч. або менше гордеїнів, середня маса зернівки складає від близько 40 мг до близько 60 мг та щонайменше близько 8095 зерна не проходить через сито з розміром комірок 2,8 мм. В іншому варіанті реалізації винаходу зерно, солод, сусло, мука або цільнозернова крупа містять 20 м.ч. або менше гордеїнів, середня маса зернівки складає від близько 45 мг до близько 60 мг та щонайменше близько 80 95 зерна не проходить через сито з розміром комірок 2,8 мм. Спеціальне згадування цих комбінацій не виключає інші комбінації цих ознак.
У ще одному додатковому варіанті реалізації винаходу зерно отримане з рослини, яка має збиральний індекс щонайменше 40 95, від близько 40 95 до близько 60 95, від близько 40 95 до близько 55 95 або від близько 40 95 до близько 50 95. У переважному варіанті реалізації винаходу зерно отримане з рослини, яка має збиральний індекс від близько 40 95 до близько 50 до.
В іншому варіанті реалізації винаходу зерно має співвідношення довжини до товщини менше ніж близько 5, менше ніж близько 4, менше ніж близько 3,8; від близько 2 до близько 5 або від близько 2,5 до близько 3,8.
У додатковому варіанті реалізації винаходу мука або цільнозернова крупа, одержана із зерна, містить близько 10 м.ч. або менше, близько 5 м.ч. або менше, від близько 0,05 м.ч. до близько 10 м.ч. або від близько 0,05 м.ч. до близько 5 м.ч., близько 3,9 м.ч. або близько 1,5 м.ч. гордеїнів.
У варіанті реалізації винаходу солод або сусло, одержане із зерна, містить менше ніж близько 50 м.ч. або менше ніж близько 20 м.ч. гордеїнів.
У додатковому варіанті реалізації винаходу зерно або солод, сусло, мука або цільнозернова крупа, одержані з вказаного зерна, містять концентрацію менше 10 95, менше 5 95 або менше 2
Фо від концентрації дикого типу, або в них присутній один або більше одного або всі 3: і) В-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як 5ЕО ІЮ Мо: 53, ії) В-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як БЕО ІО Мо: 54, ії) С-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як ЗЕО ІЮ Мо: 55, та їм) О-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як ЗЕО ІЮО Мо: 56, причому кожна з концентрацій складає менше 10 95, менше 5 95 або менше 2 95 відносно концентрації в ячмінному зерні дикого типу або солоді, суслі, муці або цільнозерновій крупі, одержаним з вказаного зерна, що відноситься до різновидів ячменю Воті, Зіоор, Вацаїйп, адап,
Ніпатагєй або Соттапавег.
У варіанті реалізації винаходу В-гордеїни представлені щонайменше В1-гордеїном (наприклад, таким, що містить амінокислотну послідовність, представлену як ЗЕО ІЮО Мо: 78) та
ВЗ-гордеїном (наприклад, таким, що містить амінокислотну послідовність, представлену як ХЕО
ІЮ Ме: 79). У додатковому прикладі С-гордеїни містять амінокислотну послідовність, представлену як ЗЕО ІО Мо: 80. У ще одному іншому прикладі ЮО-гордеїни містять амінокислотну послідовність, представлену як ЗЕО ІЮ Мо: 76.
У варіанті реалізації винаходу зерно або солод, сусло, мука або цільнозернова крупа, одержані з вказаного зерна, додатково містять концентрацію менше 10 95, менше 5 95 або менше 2 95 від концентрації дикого типу, або в них додатково відсутні: ї) у-гордеїни, які містять послідовність амінокислот, представлену як ЗЕО ІО Ме: 57, та/або ії) авеніноподібні А-білки, які містять послідовність амінокислот, представлену як 5ХЕО ІЮ Мо: 52, причому кожна з концентрацій складає менше 10 95, менше 5 95 або менше 2 95 відносно концентрації в ячмінному зерні дикого типу або солоді, суслі, муці або цільнозерновій крупі, одержаним з вказаного зерна, що відноситься до різновидів ячменю Воптпті, зіоор, Вацаїп, адап,
Ніпатагєй або Сотітапаег. В одному прикладі у-гордеїни містять амінокислотну послідовність, представлену як 5ХЕО ІЮО Мо: 81. У ще одному іншому прикладі авеніноподібні А-білки містять амінокислотну послідовність, представлену як 5ЕО ІЮ Мо: 84.
Переважно у вищенаведеному варіанті реалізації винаходу наведені у-гордеїни у1-гордеїни та уг-гордеїни.
У варіанті реалізації винаходу зерно є гомозиготним за алелем локусу Ног2, в якому більшість або всі кодуючі В-гордеїни гени видалені, або солод, сусло, мука або цільнозернова крупа, одержані з вказаного зерна, містять ДНК, що включає алель локусу Ног2, в якому більшість або всі кодуючі В-гордеїни гени видалені.
В іншому варіанті реалізації винаходу зерно є гомозиготним за нульовим алелем гена, що кодує Ю-гордеїн в локусі Ног3, або солод, сусло, мука або цільнозернова крупа, одержані з вказаного зерна, містять ДНК, що включає нульовий алель гена, який кодує Ю-гордеїн, при цьому нульовий алель переважно містить стоп-кодон, мутацію сайту сплайсингу, мутацію із зсувом рамки, інсерцію, делецію або кодує усічений О-гордеїн, або в ньому більшість або всі кодуючі Ю-гордеїни гени видалені.
У додатковому варіанті реалізації винаходу усічений Ю-гордеїн має стоп-кодон у триплеті, що кодує амінокислоту номер 150.
В іншому варіанті реалізації винаходу зерно є гомозиготним за алелем у локусі І увз3 ячменю, що призводить до відсутності у зерні С-гордеїнів, або солод, сусло, мука або цільнозернова крупа, одержані з вказаного зерна, містять ДНК, що включає алель у локусі ГГ у53.
У додатковому варіанті реалізації винаходу зерно, солод, сусло, мука або цільнозернова крупа містять близько 1 95 або менше, близько 0,01 95 або менше, близько 0,007 95 або менше, близько 0,0027 95 або менше, від близько 0,001 95 до близько 1 95, від близько 0,001 95 до близько 0,01 95, близько 0,007 95 або близько 0,0027 95 концентрації гордеїнів у порівнянні з зерном із відповідної рослини ячменю дикого типу, або солодом, суслом, мукою або цільнозерновою крупою, одержаними таким самим способом із зерна із відповідної рослини ячменю дикого типу.
У ще одному іншому варіанті реалізації винаходу зерно одержано з рослини, яка має щонайменше 60 95, щонайменше 80 95, щонайменше 90 95, від близько бодо 100 95, від близько 70 до 100 95, від близько 80 до 100 95, близько 60 95, близько 70 95, близько 80 95 або близько 90 до врожайності зерна рослини ячменю дикого типу.
В іншому варіанті реалізації винаходу середня маса зернівки складає щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 90 95, щонайменше близько 95 95 або близько 100 95 зернівки рослини ячменю дикого типу.
У ще одному додатковому варіанті реалізації винаходу зерно або солод, сусло, мука або цільнозернова крупа, одержані з вказаного зерна, містять близько 10 95 або менше, близько 5 95
Ко) або менше, близько 2 95 або менше, від близько 0,1 95 до близько 10 95 або від близько 0,1 95 до близько 10 95 одного або більше одного або всіх із наступних компонентів у порівнянні з відповідною рослиною ячменю дикого типу: і) В-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як БЕО ІО Мо: 53, ії) В-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як ЗЕО ІО Мо: 54, ії) С-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як ЗЕО ІЮ Мо: 55, та їм) О-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як ХЕО ІО Мо: 56.
В іншому варіанті реалізації винаходу зерно або солод, сусло, мука або цільнозернова крупа, одержані з вказаного зерна, додатково містять близько 10 95 або менше, близько 5 95 або менше, близько 1 95 або менше, від близько 0,1 95 до близько 10 95 або від близько 0,1 95 до близько 10 95 з наступних компонентів у порівнянні з відповідною рослиною ячменю дикого типу: ї) у-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як 5ЕО ІО Ме: 57, та/або ії) авеніноподібних А-білків, які містять послідовність амінокислот, представлену як ЗЕО ІЮ
Мо: 52.
В іншому варіанті реалізації винаходу зерно або солод, сусло, мука або цільнозернова крупа, одержані з вказаного зерна, додатково містять уЗ-гордеїн у кількості близько 60 95 або менше у порівнянні з кількістю у відповідній рослині ячменю дикого типу, уЗз-гордеїн, що містить амінокислоти, послідовність яких представлена як 5ЕО ІЮО Мо: 58, такий як уЗ-гордеїн, що містить амінокислоти, послідовність яких представлена як 5ЕО ІЮО Мо: 83.
Приклади рослини ячменю дикого типу включають, але не обмежуються сортами Вопті,
ЗіІоор, Вацаїйп, Хадап, Ніпатагєй або Сотітапаег.
В іншому варіанті реалізації винаходу вміст крохмалю зерна складає щонайменше близько 5095 (мас./мас.). Переважно вміст крохмалю зерна складає від близько 5095 до близько 70905 (мас./мас.).
У додатковому варіанті реалізації винаходу целіакальна токсичність муки, одержаної з цього зерна, складає менше ніж близько 595 або менше ніж близько 195 відносно муки, одержаної із зерна відповідної рослини ячменю дикого типу.
У додатковому варіанті реалізації винаходу середня маса зернівки складає щонайменше в 1,05 раз, щонайменше в 1,1 рази або від 1,05 до 1,3 раз більше, ніж маса зернівки, яка є її гомозиготною за алелем локусу Ног-, в якому більшість або всі кодуючі В-гордеїни гени 60 видалені,
ії) гомозиготною за алелем в локусі Гу5з3 ячменю, що призводить до відсутності у зерні С- гордеїнів, та ії) гомозиготною за алелем дикого типу О-гордеїну, кодуючим повнорозмірний білок.
У ще одному додатковому варіанті реалізації винаходу зерно одержане з рослини, яка має врожайність зерна щонайменше в 1,20 раз або щонайменше 1,35 раз, або від 1,2 до 1,5 раз, або від 1,2 до 2,0 раз більше, ніж врожайність зерна з рослини, яка є її гомозиготною за алелем локусу Ног-, в якому більшість або всі кодуючі В-гордеїни гени видалені, ії) гомозиготною за алелем в локусі Гу5з3 ячменю, що призводить до відсутності у зерні С- гордеїнів, та ії) гомозиготною за алелем дикого типу О-гордеїну, кодуючим повнорозмірний білок.
Наприклад, приймаючи до уваги два вищенаведених варіанти реалізації винаходу, зерно з ознаками, визначеними у пп. від ї) до ії) може бути зерном 01", описаним у публікації УМО 2009/021285.
В іншому варіанті реалізації винаходу щонайменше близько 50 95, щонайменше близько 60
Фо, щонайменше близько 70 96, щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 90 95 або щонайменше близько 95 95 генома зерна ячменю ідентично геному ячменю сорту дикого типу такого, як, але не обмеженого 5іоор, Ніпатагвй, Охіога або Магайітпе.
У варіанті реалізації винаходу зерно отримано від нетрансгенної рослини.
В альтернативному варіанті реалізації винаходу зерно отримано від трансгенної рослини.
У додатковому варіанті реалізації винаходу рослина містить трансген, що кодує полінуклеотид, який пригнічує у зерні продукцію щонайменше одного гордеїну. Переважно, полінуклеотид цього варіанту реалізації винаходу являє собою антисмисловий полінуклеотид, смисловий полінуклеотид, каталітичний полінуклеотид, штучну мікроРНК або дуплексну молекулу РНК, яка пригнічує експресію одного або переважно більше генів, кодуючих гордеїни.
В іншому варіанті реалізації винаходу спосіб включає одержання з такого зерна муки або цільнозернової крупи.
У додатковому варіанті реалізації винаходу спосіб включає одержання з такого зерна солоду.
Зо У варіанті реалізації винаходу напій на основі солоду являє собою пиво, а спосіб включає пророщування зерна або подрібнення одержаного таким чином зерна. У варіанті реалізації винаходу спосіб додатково включає фракціонування висушеного пророщеного зерна на дві і більше фракції ендосперму, фракції ендотеліального шару, фракції лушпиння, фракції проростків ії фракції солодових ростків, та з'єднання і змішування попередньо визначених кількостей двох або більше з цих фракцій.
У варіанті реалізації винаходу щонайменше близько 50 95 зерна проростає у межах 3 діб після набухання.
У додатковому варіанті реалізації винаходу харчовий інгредієнт або інгредієнт напою на основі солоду являє собою муку, крохмаль, солод або сусло, або харчовий продукт являє собою хлібопродукти на заквасці або без закваски, макаронні вироби, локшину, сухі сніданки, закусочні харчові продукти, коржі, кондитерські вироби або продукти, які містять соуси на основі муки.
У варіанті реалізації винаходу напій на основі солоду являє собою пиво або віскі.
У варіанті реалізації винаходу харчовий продукт або напій на основі солоду призначений для споживання людьми.
У додатковому варіанті реалізації винаходу після споживання такого харчового продукту або напою щонайменше один симптом захворювання целіакією не проявляється у суб'єкта з вказаним захворюванням.
В іншому аспекті у цьому винаході представлена рослина ячменю, яка продукує зерно, що
БО містить близько 50 м.ч. або менше гордеїнів.
Представлено також зерно рослини ячменю за цим винаходом.
Зерно винаходу та/або зерно рослини ячменю за цим винаходом може містити одну або більше ознак, визначених вище.
У варіанті реалізації винаходу зерно ячменю здатне продукувати рослину ячменю за цим винаходом.
У варіанті реалізації винаходу зерно переробляється таким чином, що воно не здатне до пророщування.
У варіанті реалізації винаходу зерно є позбавленим оболонки.
В іншому аспекті у цьому винаході представлено спосіб отримання зерна ячменю, причому 60 спосіб включає:
а) вирощування рослини ячменю за цим винаходом, р) збір зерна та с) необов'язково, переробку зерна.
У варіанті реалізації винаходу спосіб включає вирощування щонайменше 10000 рослин у польових умовах на площі щонайменше один гектар.
В іншому аспекті у цьому винаході представлено спосіб одержання муки, цільнозернової крупи, крохмалю, солоду, сусла або іншого продукту, одержуваного із зерна, причому спосіб включає: а) отримання зерна за цим винаходом та
Б) переробку зерна для одержання муки, цільнозернової крупи, крохмалю, солоду, сусла або іншого продукту.
Представлено також продукт, отримуваний з рослини ячменю за цим винаходом або зерна за цим винаходом.
В одному варіанті реалізації винаходу продукт являє собою харчовий інгредієнт, інгредієнт напою на основі солоду, харчовий продукт або продукт-напій на основі солоду.
У варіанті реалізації винаходу продукт-напій на основі солоду являє собою пиво або віскі.
У додатковому варіанті реалізації винаходу продукт являє собою нехарчовий продукт.
Приклади включають, але не обмежуються плівками, покриттями, адгезивними речовинами, будівельними матеріалами та пакувальними матеріалами.
Також представлено харчовий продукт або напій на основі солоду з використанням способу за цим винаходом.
В іншому аспекті винаходу представлено пиво, що містить один або більше білків зерна ячменю та менше 0,9 м.ч. гордеїнів.
У варіанті реалізації винаходу пиво містить щонайменше близько 2 95, щонайменше близько
З 96, щонайменше близько 4 95 або щонайменше близько 5 95 етанолу.
В іншому аспекті у цьому винаході представлена мука або цільнозернова крупа, що містить один або більше білків зерна ячменю та менше ніж близько 50 м.ч. або менше ніж близько 20 м.ч. гордеїнів.
В іншому аспекті у цьому винаході представлено солод або сусло, що містить один або
Зо більше білків зерна ячменю та менше ніж близько 50 м.ч. або менше ніж близько 20 м.ч. гордеїнів.
У додатковому аспекті у цьому винаході представлено метод ідентифікації алеля гена Ю гордеїну ячменю, який кодує усічений О гордеїн, причому спосіб включає ї) отримання зразка, що містить нуклеїнову кислоту з рослини ячменю, та ії) проведення аналізу зразка на наявність або відсутність залишку гуаніну у положенні 450 відкритої рамки зчитування, кодуючої О гордеїн, причому наявність гуаніну вказує на те, що ген О гордеїну кодує усічений О гордеїн.
У варіанті реалізації винаходу етап Б) включає ампліфікацію геномної ДНК з використанням праймерів ЗССААТАСОСАССАССАААС (5ЕО ІЮ Мо: 66) та ССТСТОТСоСтТОСОСТТетТтТОТте (5ЕО І
Мо: 67) або варіант одного або їх обох, та приведення до контакту продуктів ампліфікації з ферментом рестрикції Крпі, причому відсутність розщеплення вказує на те, що ген О гордеїну кодує усічений О гордеїн.
У додатковому аспекті у цьому винаході представлено спосіб запобігання або зменшення частоти виникнення або важкості захворювання целіакією у суб'єкта, причому спосіб включає пероральне введення суб'єкту харчового продукту або напою на основі солоду за цим винаходом або зерна за цим винаходом, при цьому зменшення частоти виникнення або важкості захворювання целіакією порівнюється з тим, коли суб'єкту перорально вводиться така ж кількість відповідного харчового продукту або напою на основі солоду, приготованого із зерна ячменю дикого типу.
Представлено також застосування харчового продукту або напою на основі солоду за цим винаходом або зерна за цим винаходом для виробництва харчового продукту або напою для перорального введення суб'єкту для запобігання або зменшення частоти виникнення або важкості захворювання целіакією.
У додатковому аспекті у цьому винаході представлено спосіб ідентифікації ячмінного зерна, яке може застосовуватися для одержання харчового продукту та/або напою на основі солоду для споживання суб'єктом із захворюванням целіакією, що включає а) отримання одного або більше з наступних матеріалів: ї) зразка з рослини, здатної продукувати вказане зерно, і) зерна, бо ії) солоду, одержаного з цього зерна, та/або ім) екстракту з вказаного зерна,
Юр) проведення аналізу матеріалу з етапу а) для визначення концентрацій В, С та О гордеїнів, пептидів, отриманих з В, С та О гордеїнів, та/або алелів генів В, С та О гордеїнів, с) відбір зерна, що містить близько 50 м.ч. або менше гордеїнів, для одержання харчового продукту та/або напою на основі солоду для споживання суб'єктом із захворюванням целіакією.
У варіанті реалізації винаходу матеріал з етапу а) містить геномну ДНК та на етапі Б) включає ідентифікацію наявності або відсутності алелів генів, кодуючих один або більше або всі 3: і) В-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як БЕО ІО Мо: 53, ії) В-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як БЕО ІЮ Мо: 54, ії) С-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як ЗЕО ІЮ Мо: 55, та їм) О-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як ХЕО ІО Мо: 56, причому відсутність алелів виявляє зерно, що містить близько 50 м.ч. або менше гордеїнів.
Будь-який варіант реалізації винаходу повинен прийматися по відношенню будь-якого іншого варіанту реалізації винаходу для здійснення тиїаїі5 тиїапаїі5, якщо тільки спеціально не вказано інше.
Цей винахід не повинен обмежуватися в обсязі спеціальними варіантами реалізації винаходу, які призначені лише для цілей ілюстрації. Функціонально еквівалентні продукти, композиції і способи безумовно знаходяться у межах обсягу винаходу, як описано у цьому документі.
У всьому цьому описі, якщо спеціально не вказано інше або контекстом вимагається протилежне, посилання на один етап, композицію речовин, групу етапів або групу композицій речовин повинно сприйматися як охоплююче один елемент або множину (тобто один або більше) з цих етапів, композицій речовин, груп етапів або групу композицій речовин.
Цей винахід у подальшому описується за допомогою наступних не обмежуючих Прикладів та з посиланням на супроводжуючі фігури.
КОРОТКИЙ ОПИС СУПРОВОДЖУЮЧИХ ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛОВ
Фігура 1. Схематичне представлення хромосоми 1 ячменю.
Фігура 2. Відносний кількісний вміст гордеїнів у видах пива. Площа піків вибраних пептидів, що представляють найбільш розповсюджені гордеїни або споріднені поліпептиди, виявлені у пиві (АХ ООССОРІ АОЇБЕОАК (5ЕО І Мо: 5), який представляє авеніноподібний А-білок; (В)
МЕГОСОСЗРММАК (ЗЕО ІО Мо: 53), який представляє В1-гордеїн; (С) МЕ О0ООСЗРМРМРОК (5ЕО
ІО Мо: 54), який представляє ВЗ-гордеїн; (Ю) ЕГОЕБ5І ЕАСЕК (5ЕО ІО Ме: 56), який представляє
О-гордеїн, та (Е) ООССООЇ АМІМЕОЗК (5ЕБО ІЮ Мо: 58), який представляє у-гордеїн-3. Ці репрезентативні пептиди використані для ілюстрації відносної кількості основних білків гордеїнів у видах пива дикого типу (ЗіІоор) та двох видів з делецією гордеїнів, приготованих з сортів Кізо 56 та Кібе 1508, відповідно, та в 60 комерційних видах пива. Мала площа піка спостерігалася для безглютенових видів пива 17, 47, 49-52, 54 через низький рівень шуму у сигналі, а не через детекцію гордеїну.
Фігура 3. Порівняння амінокислотних послідовностей О гордеїну з сортів 5іоор (дикий тип) та
ЕМШіоріа К118 (нульовий).
Фігура 4. Порівняння амінокислотних та кодуючих нуклеотиди послідовностей О гордеїну з сортів Зіоор (дикий тип) та Е(віоріа К118 (нульовий). Положення праймерів для детекції кожного алеля показано разом з сайтом розщеплення Крп!, представленим лише у послідовності дикого типу.
Фігура 5. Визначення вмісту гордеїну ліній (33.0 методом МКМ-МС за площею піку та показуюче відсотковий вміст відносно сорту Біоор (100 95).
Фігура 6. Визначення вмісту гордеїну ліній (33.0 методом МКМ-МС за площею піку та показуюче відсотковий вміст відносно сорту Біоор (100 95).
Фігура 7. Визначення вмісту гордеїну пива з Ш.3.0 методом МАКМ-МС у вигляді площі піку для визначення певних пептидів. Показані площі піків та відсотковий вміст відносно сорту Біоор (100 об).
Фігура 8. Детекція гордеїнів та гордеїноподібних білків методом МЕМ-МС у муці з перспективних ліній ШІ «33.0 (12-4-8) та 03.2, у порівнянні з різновидами дикого типу Зіоор,
Вашадіп, Соттапаег та Ніпатаг5й. На кожному графіку показано середнє значення -/- СО для сумарної площі піків (3 МЕКМ-переходи) для репрезентативного пептиду з кожної родини гордеїнів. У кожному випадку пептид (послідовність, яка вказана на графіку) картується будь- яким з авеніноподібного А-білка, В1-, В3-, С-, О-, у1- або уЗз-гордеїну. Номер доступу у базі даних
Опіргої приведений у легенді (наприклад, Е2ЕСО5 для першого прикладу). 60 ВИЗНАЧНИК ДО ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНІСТЕЙ
ЗЕО ІЮО МоМо: 1 та 4 - пептиди а-гліадину пшениці.
ЗЕО ІЮ МоМо 2, 3, від Є до 11, від 16 до 59 та 85 - пептиди гордеїнів ячменю.
ЗЕО ІЮ Мо: 5 - авеніноподібний А-пептид пшениці.
ЗЕО ІЮ МоМе від 12 до 15 - пептиди проламінів жита.
ЗЕО ІЮ МоМе від 60 до 71 - олігонуклеотидні праймери.
ЗЕО ІЮО Мо: 72 - геномна ділянка, що кодує Ю-гордеїн сорту 5іоор ячменю.
ЗЕО ІЮО Мо: 73 - геномна ділянка, що кодує Ю-гордеїн сорту ЕІШПіоріа К118 (нульовий).
ЗЕО ІЮО Мо: 74 - Ю-гордеїн сорту Біоор ячменю.
ЗЕО ІЮО Мо: 75 - Ю-гордеїн сорту ЕІПіоріа К1118 ячменю.
ЗЕО ІЮ Ме: 74 - Ю-гордеїн сорту Зіоор ячменю.
ЗЕО ІЮО Мо: 75 - Ю-гордеїн сорту ЕІПіоріа К118 ячменю.
ЗЕО ІЮО Ме: 76 - відкрита рамка зчитування, що кодує гордеїн О сорту 5іоор ячменю.
ЗЕО ІЮО Мо: 77 - відкрита рамка зчитування, що кодує гордеїн О сорту ЕМПіоріа К118 ячменю.
ЗЕО ІЮО Ме: 78 - приклад В1-гордеїну ячменю дикого типу (номер доступу: 040020).
ЗЕО ІЮ Ме: 79 - приклад ВЗ-гордеїну ячменю дикого типу (номер доступу: 040351).
ЗЕО ІЮ Мо: 80 - приклад С-гордеїну ячменю дикого типу (номер доступу: 240055).
ЗЕО ІЮО Ме: 81 - приклад у1-гордеїну ячменю дикого типу (номер доступу: Р17990).
ЗЕО ІО Ме: 82 - приклад уг-гордеїну ячменю дикого типу (номер доступу: 270184).
ЗЕО ІЮ Ме: 83 - приклад уЗ-гордеїну ячменю дикого типу (номер доступу: РбВО198).
ЗЕО ІЮ Мо: 84 - приклад авеніноподібного А-білку (номер доступу: Е2ЕСО5).
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Загальні методики та визначення
Якщо спеціально не визначено інше, всі технічні та наукові терміни, використані у цьому документі, повинні прийматися як такі, що мають такі ж значення, які звичайно зрозумілі середньому фахівцю у цій галузі техніки (наприклад, у рослинництві, харчовій технології, культивуванні клітин, молекулярній генетиці, імунології, білковій хімії та біохімії).
Якщо не вказано протилежне, методики роботи з рекомбінантним білком, культивування клітин та імунологічні методики, які використовуються у цьому винаході, є стандартними процедурами, добре відомими фахівцям у цій галузі техніки. Такі методики описані та роз'яснені
Зо всюди у літературі, у таких джерелах як 9. Регбраї, А Ргасіїса! Сціде то МоїІесшаг Сіопіпд, допп
УмМіеу та Боп5 (1984), У. Затрьгоок еї аї., МоІесшаг Сіопіпд: А Гарогаюгту Мапиаї, Соїд 5ргіпд
Наїбоиг Іарогагу Рге55 (1989), Т.А. Вгомуп (едійог), Евзепіїа! Моїесшіаг Віоіоду: А Ргасіїсаї
Арргоасі, Моїштез 1 та 2, ІК! Ргез5 (1991), О.М. Сіомег та В.О. Натез (еайоге5), ОМА Сіопіпд: А
Ргасіїса! Арргоаси, Моїштевз 1-4, ІК. Ргез5 (1995 та 1996) та Г.М. А!йзибеї еї а. (еайогв), Сиггепі
Ргоїосої5 іп МоІесшіаг Віоіоду, сгеепе Рир. Авзосіасез5 та Уміеу-Іп(егзсіепсе (1988, включаючи всі перевидання до теперішнього часу), ЕЯ Нагіом/ та Юамід Гапе (едйог5) Апііродієв: А І арогаїгу
Мапиаї, Соїа Зргіпд Нагброиг І арогайгу, (1988) та У.Е. Соїїдап еї аї. (еайог5) Сцтепі Ргоїосої!5 іп
Іпптипоіоду, доп Уміеу 4 50п5 (включаючи всі перевидання до теперішнього часу).
Як використовується у цьому документі термін «ячмінь» відноситься до будь-яких видів роду
Ногдеєит, включаючи їх попередників, а також їх потомство, отримане схрещуванням з іншими видами. Переважною формою ячменю є вид Ногаєит упцідаге. Зерно більшості сортів ячменю, що вирощують сьогодні у світі у комерційних масштабах, має покриті (з оболонкою) зернівки, в яких так звана оболонка, яка складає зовнішню лему та внутрішню луску, у зрілому стані з'єднана з епідермісом перикарпу. Інші сорти, названі позбавленими оболонки або голозерні ячмені, вільно обмолочуються та оболонки легко видаляються у процесі молотіння. Голозерне ячмінне зерно переважно використовується для споживання людьми, хоча зерно з оболонкою може використовуватися після лущення, оскільки ячмінне зерно з оболонкою переважно використовується для пивоварної промисловості та для годівлі тварин. Ознака позбавленого оболонки зерна контролюється єдиним рецесивним геном, позначеним пиЯ, розташованим на довгому плечі хромосоми 7Н (КікКиспі єї а!., 2003).
Захворювання целіакією або глютенова хвороба являє собою аутоїмунне порушення тонкого кишковика, яке зустрічається у генетично схильних індивідів у всіх вікових групах після періоду раннього дитинства. Воно вражає близько 195 індоєвропейської популяції, хоча і у значній мірі рідко діагностується. Захворювання целіакією викликано реакцією на білок гліадин, глютен, виявлений у пшениці (та подібних білках рослин Тгйісеає, які включають інші види, такі як ячмінь та жито). Під дією гліадину фермент тканинна трансглутаміназа модифікує білок, а імунна система перехресно реагує з тканиною кишковика, викликаючи запальну реакцію. Цей процес призводить до сплощення слизової оболонки тонкого кишковика, яке порушує абсорбцію поживних речовин. Єдиним ефективним методом лікування є безглютенова дієта, що триває бо все життя. Цей патогенний стан має кілька інших назв, що включають: захворювання ссеїїас (з лігатурою), спру-целіакія, нетрофічна спру, ендемічна спру, глютенова ентеропатія або глютензалежна ентеропатія та непереносимість глютену. Симптоми захворювання целіакією у широкому діапазоні відрізняються серед різних людей. Симптоми захворювання целіакією можуть включати один або більше з наступних: утворення газів, періодичне здуття і біль, хронічна діарея, закріп, блідість, неприємний запах або масляний стул, втрата маси/набирання маси тіла, відчуття втоми, анемія невиясненої етіології (низьке число червоних кров'яних клітин, що викликає відчуття втоми), біль у кістках та суглобах, остеопороз, остеопенія, зміна поведінки, відчуття оніміння у ногах (через пошкодження нервів), м'язові судоми, конвульсії, порушення з менструальними циклами (часто через інтенсивну втрату маси), безпліддя, звичне невиношування, затримка росту, зниження набирання маси тіла у грудних дітей, бліді язви на слизовій рота, названі афтозними язвами, знебарвлення зубів або втрата емалі та сверблячий висип на шкірі, названий герпетиформним дерматитом. Деякі з більш частих симптомів включають: втомлюваність, рецидивуючу діарею, біль у животі або судоми, нетравлення, здуття кишковика, здуття живота та втрата маси. Захворювання целіакією може діагностуватися, наприклад, як описано у публікації УМО 01/025793.
Як використовується у цьому документі, термін «нульовий алель гена, що кодує Ю-гордеїн у локусі Ног3» відноситься до будь-якого алеля цього локусу, який не кодує білок Ю-гордеїн або, якщо білок кодується, він не є імуногенним для суб'єкта з захворюванням целіакією (такий як усічений ЮО-гордеїн, представлений на фіг. 3).
Як використовується у цьому документі, термін «відсутність», що використаний у цьому документі у контексті декламованої речовини, означає, що ця речовина видалена із зерна ячменю, або продукту, одержаного з нього, за цим винаходом, або що речовина не виявлена у зерні або продукті за цим винаходом, коли проводяться аналізи на вміст цієї речовини з використанням методу, відомого у цій галузі техніки. Інакше кажучи, речовина може бути присутньою у концентрації, яка недостатня для виявлення, або вона знаходиться у межах стандартної похибки для аналізу на цю речовину. Наприклад, у контексті декламованого гордеїну, термін «відсутність» означає, що специфічний гордеїн не виявляється у аналізі, такому як, наприклад, аналіз МКАМ-МС, аналіз ІФА або аналіз 20-гель-електрофорезу, такі як приведені у цьому документі. Речовина, яка відсутня, може бути такою, що не виявляється при проведенні одного виду аналізу або кількох видів аналізів. Необхідно розуміти, що речовина, яка вказана як відсутня у зерні або продукті за цим винаходом, присутня у відповідному зерні або продукті з рослини дикого типу, як легко визначається аналізом, відомим у цій галузі техніки.
Як використовується у цьому документі, термін «гордеїн», наприклад, коли використовується у фразі «близько 50 м.ч. або менше гордеїнів» та подібних фразах, відноситься до загального вмісту гордеїнів, який включає В-, С-, О- та у-гордеїни.
Терміни «насіння» та «зерно» застосовуються у цьому документі як взаємозамінні. «Зерно» у більшості випадків відноситься до зрілого зібраного зерна, але також може відноситься до зерна після переробки, такої як, наприклад, подрібнення або лущення, коли більшість зерен залишається неушкодженим, або після набухання або пророщування, у відповідності з контекстом. Зріле зерно найчастіше має вміст вологи менше ніж близько 18-2095. Зерно ячменю дикого типу (цільне зерно) у більшості випадків містить 9-12 95 білка та близько 30-50 95 з нього, як правило 35 95, є протаміном, таким чином, зерно ячменю дикого типу містить за масою близько 3-4 95 проламіну. Проламіни виявлені практично виключно в ендоспермі, який складає близько 7095 маси цільного зерна.
Як використовується у цьому документі, термін «збиральний індекс» відноситься до маси зібраного зерна та виражається як відсотковий вміст зерна до загальної маси рослини.
Як використовується у цьому документі, термін «відповідна дикому типу» рослина ячменю відноситься до рослини, що містить щонайменше 50 95, переважно щонайменше 75 95, переважніше щонайменше 95 956, переважніше щонайменше 97 95, переважніше щонайменше 99 956 та ще переважніше 99,5 96 генотипу рослини за цим винаходом, але продукує зерно з немодифікованим вмістом гордеїнів. В одному варіанті реалізації винаходу «відповідна дикому типу» рослина ячменю являє собою сорт, використовуваний в експериментах у рослинництві для впровадження генетичних варіантів, що призводять до зменшеної продукції гордеїнів у зерні. В іншому варіанті реалізації винаходу «відповідна дикому типу» рослина ячменю являє собою вихідний сорт, в який введений трансген, що зменшує продукцію гордеїнів у зерні. У додатковому варіанті реалізації винаходу «відповідна дикому типу» рослина ячменю являє собою сорт, який застосовується на момент подання заявки для комерційного виробництва зерна ячменю, такий як, але не обмежений сортами Воті, Зіоор, Сагізрего ІІ, К8, 11, Матіпой, 60 0 БІШіпа, Натеїйп, 5споопег, Вацаїп, Соттапавег", Саїгапег, ВиоКе, УМІ3586-1747, МІ3416, Ріадзпір,
Сомарбріє, ЕгапКіп, ЗіоорбА, Біоорміс, Оцазаг, МВ9104, Стіттей, Сатео"Агиро 31-04, Рог,
Зспоопег, Опісогп, На!гтіпдіоп, Тотепз5, СаПеоп, Могех, Опом, Сарвіап, Рієвї, Кеєї, Маїтйіте,
Уата, бази, ОооіІшир, ЕРйгдегтад, Моїоу, Мипаан, Охіога, Опвіому, ЗК, Опісогпп, Мадап, Спебес,
Ніпатагей, Спагіої, Оіатапі, Кога!ї, КЕибіп, Вопи5, 7епії, АКсепі, Богит, Атишеї, Тоїаг, Негів,
Магезі, І апдога, Сагизо, Мікаїїх, МіКіпдеїй!ї Вгізе, Сагизо, Ройег, Разадепа, АппабеїЇ, Маца, Ехігасі, заїІооп, Ргевзіїде, Авіогіа, ЕІо, СогК, Ехігасі, І ага. У варіанті реалізації винаходу «відповідна дикому типу» рослина ячменю продукує зерно з немодифікованим вмістом гордеїнів, оскільки воно містить повний набір функціональних генів гордеїнів, кодуючих функціональні білки гордеїни, що включають В, С, О та у-гордеїни, кодовані локусами Нога, Но, НогзЗ та Ног5.
Як використовується у цьому документі термін «один або більше білків зерна ячменю» відноситься до білків, що зустрічаються у природі, які продукуються зерном ячменю, що відрізняються від гордеїнів. Приклади таких білків відомі фахівцям у цій галузі техніки.
Спеціальні приклади включають, але не обмежуються, альбумінами ячменю, такими як білок 1 перенесення ліпідів масою 9 кДа (ТР) (див. Юоцііе еї а. (2000) для огляду та, наприклад, має
Мо доступу бази даних БЗм/із5-ргої Мо РО7597), інгібітори а-амілази/трипсину (СМа, СМ, СМа), білок 7 (див. Вгапаї еї аі. (1990) та номер доступу бази Сепрапк Мо РОб293) і білки, ідентифіковані у статті СоЇдгаме еї аї. (2012), включаючи їх процесування (зрілі) форми, а також денатуровані форми та/або їх фрагменти, що утворилися в результаті одержання солоду, муки, цільнозернової крупи, харчового продукту або напою на основі солоду за цим винаходом.
Як використовується у цьому документі, «середню масу зернівки» переважно визначають отриманням щонайменше 25, щонайменше 50 або щонайменше 100, переважніше близько 100, окремих зерен з рослини (або генетично ідентичних рослин, вирощених в однакових умовах) та визначенням середньої маси зерна.
Як використовується у цьому документі, термін «солод» використовується у відношенні ячмінного солоду, «мука» - у відношенні ячмінної муки, «цільнозернова крупа» - у відношенні ячмінної цільнозернової крупи, а «пиво» - у відношенні пива, яке одержано з використанням ячменю, як основного інгредієнта, що забезпечує вуглеводи, які ферментується, за виключенням того, що солод, мука, цільнозернова крупа або пиво явно вказані як такі, що походять з джерела, яке відрізняється від ячменю. Як використовується у цьому документі,
Зо «сусло» відноситься до рідини, екстрагованої у процесі затирання під час одержання пива або віскі Сусло містить цукри, які будуть ферментовані дріжджами, що зброджують, для продукування спирту. Конкретніше, джерело солоду, сусла, муки, пива, цільнозернової крупи, харчового продукту тощо, за цим винаходом одержане при переробці (наприклад, подрібненні та/або ферментації) зерна ячменю. Зерно, солод, сусло, мука, цільнозернова мука або пиво за цим винаходом можуть перемішуватися або змішуватися з зерном, солодом, суслом, мукою, цільнозерновою крупою або пивом, які одержані з ячменю. Ці терміни включають солод, сусло, муку, пиво, цільнозернову крупу, харчовий продукт тощо, одержані з суміші зерен, що включає ячмінь. У переважному варіанті реалізації винаходу щонайменше 1095 або щонайменше 5095 зерна, яке використовується для одержання солоду, сусла, муки, пива, цільнозернової крупи, харчового продукту тощо, є ячмінним зерном.
Термін «рослина», як використовується у цьому документі як іменник, відноситься до цілої рослини, такої як, наприклад, рослини, вирощеної у польових умовах для комерційного виробництва ячменю. «Частина рослини» відноситься до рослинних вегетативних структур (наприклад, листя, стебел), коренів, квіткових органів/структур, насіння (включаючи ембріон, ендосперм та оболонку насіння), рослинної тканини (наприклад, судинна тканина, покривна тканина тощо), клітини, гранули крохмалю або такому ж потомству. «Трансгенна рослина», «генетично модифікована рослина» або їх варіації відносяться до рослини, яка містить генну конструкцію («трансген»), не виявлену у рослині дикого типу такого ж виду, різновиду або сорту. «Трансген», як відмічено у цьому документі, має звичайне значення у галузі біотехнології та включає генетичну послідовність, яка одержана або змінена за допомогою технології рекомбінантної ДНК або РНК і яка введена до клітини рослини. Трансген може містити генетичну послідовність, отриману з рослинної клітини. Як правило, трансген вводиться до рослини шляхом маніпуляції людини, такої як, наприклад, трансформація, але може бути використаний будь-який спосіб, визнаний фахівцем у цій галузі техніки. «Молекула нуклеїнової кислоти» відноситься до полінуклеотиду, такому як, наприклад, ДНК,
РНК або олігонуклеотиди. Вона може бути ДНК або РНК геномного або синтетичного походження, дволанцюговою або одноланцюговою, та поєднуватися з вуглеводом, ліпідами, білком або іншими речовинами для виконання конкретної дії, визначеної у цьому документі.
Термін «функціонально зв'язаний», як використовується у цьому документі, відноситься до бо функціонального зв'язка між двома або більше сегментами нуклеїнових кислот (наприклад,
ДНК). Як правило, він відноситься до функціонального зв'язка транскрипційного регуляторного елементу (промотору) з послідовністю, що транскрибується. Наприклад, промотор функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю, такою як полінуклеотид, визначений у цьому документі, якщо вона стимулює або модулює транскрипцію кодуючої послідовності у відповідній клітині. У більшості випадків, транскрипційні регуляторні елементи промоторів, які функціонально зв'язані з послідовністю, що транскрибується, фізично розташовані послідовно з послідовністю, що транскрибується, тобто вони є ссіє-діючими. Тим не менш, деякі транскрипційні регуляторні елементи, такі як енхансери, не потребують послідовного фізичного розташування або розташовані у безпосередній близькості з кодуючими послідовностями, транскрипцію яких вони посилюють.
Як використовується у цьому документі, термін «ген» повинен прийматися у своєму самому широкому контексті та включає дезоксирибонуклеотидні послідовності, що містять кодуючу білок ділянку структурного гена та включають послідовності, розташовані по сусідству з кодуючою ділянкою на обох 5'- та 3-кінцях на відстані щонайменше близько 2 т.н. на будь- якому кінці, який приймає участь в експресії гена. Послідовності, які розташовані на 5'-кінці кодуючої ділянки і які представлені на мРНК, називаються 5'-нсетранслюємими послідовностями.
Послідовності, які розташовані на 3-кінці або у прямому напрямку кодуючої ділянки і які представлені на мРНК, називаються З3'-нетранслюємими послідовностями. Термін «ген» охоплює як КкКДНК так і геномні форми гена. Геномна форма або клон гена містить кодуючу ділянку, яка може перериватися некодуючими послідовностями, названими «інтронами» або «проміжними ділянками» або «проміжними послідовностями». Інтрони представляють собою сегменти гена, які транскрибуються в ядерні РНК (ппеЕМА); інтрони можуть містити регуляторні елементи, такі як енхансери. Інтрони видаляються або «сплайсуються» з ядерного або первинного транскрипта; тому інтрони відсутні у транскрипті матричної РНК (мРНК). мРНК функціонує під час трансляції для визначення послідовності або порядку амінокислот у поліпептиді, що утворюється. Термін «ген» включає синтетичну або гібридну молекулу, яка кодує всі або частину білків за цим винаходом, описаних у цьому документі, та комплементарну нуклеотидну послідовність до будь-якого з вищевказаних елементів.
Як використовується у цьому документі, термін «інший інгредієнт харчового продукту або напою» відноситься до будь-якої речовини, прийнятної для споживання твариною, переважно будь-якої речовини, прийнятної для споживання людиною, при використанні у вигляді частини харчового продукту або напою. Приклади включають, але не обмежуються, зерном з іншого виду рослин, цукром тощо, але виключають воду.
Рослини за цим винаходом, як правило, мають одну або більше генетичних варіацій, кожна з яких призводить до зменшеного вмісту щонайменше одного гордеїну, переважніше щонайменше В, С та О-гордеїнів. Як використовується у цьому документі, термін «генетична варіація, кожна з яких призводить до зменшеного вмісту щонайменше одного гордеїну» відноситься до будь-якого поліморфізму рослини ячменю, який зменшує продукцію гордеїну.
Генетична варіація може містити, наприклад, делецію гордеїнового(их) гена(ів) або його(їх) частини, або мутацію, яка зменшує транскрипцію гена ячменю. Приклади таких генетичних варіацій представлені у лініях Кізо 56, Кізо 527 і Кіз 1508, та ЕЄПіоріа К118. З цієї причини, такі рослини можуть використовуватися як вихідні рослини для отримання рослин за цим винаходом. Рослина за цим винаходом може походити з потомства від перехресного схрещування між будь-якими з цих мутантів ячменю. У переважному варіанті реалізації винаходу рослина за цим винаходом не є потомством від перехресного схрещування між лініями Кізао 56 та Кіз 1508, які містять мутації пог2 та Іуз3, що присутні у цих лініях, та які є диким типом за геном, що кодує О-гордеїн. У варіанті реалізації винаходу рослина кодує уЗ- гордеїн, що містить амінокислоти, послідовність яких представлена як 5ЕО ІО Мо: 58, така як уЗ- гордеїн, що містить амінокислоти, послідовність яких представлена як 5ЕБО ІЮО Мо: 83.
Наприклад, рослина може мати функціональний ген уЗ-гордеїну дикого типу, такий як ген узЗ- гордеїну сорту ячменю Воті, 5іоор, Вацадіп, Мадап, Ніпатаг5й або Сотртапаег. У варіанті реалізації винаходу рослина не є потомством від перехресного схрещування між лініями Кізе 527 та Кіз 1508.
Як використовується у цьому документі, якщо не вказане протилежне, фраза «близько» відноситься до будь-якого обгрунтованого діапазону у світлі значення, що обговорюється. У переважному варіанті реалізації винаходу термін «близько» відноситься до /-1095, переважніше ж/-595, переважніше ж/-195 від значення, що визначається.
Якщо не визначено інше, у відношенні маси та відсоткового вмісту одиницями вимірювання є мас./мас.
Термін «та/або», наприклад, «Х та/або У» повинен розумітися як позначення або «Х та У» або «Х або У» та повинен прийматися як представлення явного підкріплення обох позначень або будь-якого позначення.
У всьому обсязі цього опису слово «включення», або такі варіації як «включає» або «такий, що включає», повинні розумітися як такі, що мають на увазі включення вказаного елементу, цілого числа або етапу, або групи елементів, цілих чисел або етапів, але не виключення будь- якого іншого елементу, цілого числа або етапу, або групи елементів, цілих чисел або етапів.
Проламіни та гордеїни
Проламіни зернових культур (відомі як гліадини у пшениці, гордеїни у ячмені, секаліни у житі, авеніни у вівсі та зеїни у кукурудзі) є основними запасними білками ендосперму у всіх зернах злаків, за виключенням вівса та рису (Зпемггу та Найїога, 2002). Гордеїни представляють 35-50 95 від загального вмісту білка в ячмені (дагадаї, 1991). Вони класифіковані за чотирма групами А (також відомими як у-гордеїн, В, С та 0, у порядку зменшення рухливості (Рієїа еї аї., 1982). В, С, О та у-гордеїни кодуються локусами Ног2, Ної1, НогЗ та Ног5, відповідно, на хромосомі 1Н, яка схематично представлена на фіг. 1.
В гордеїни представляють собою основну білкову фракцію, відрізняються від С гордеїнів за їх вмістом сірки (Кгеї5 та Зпемгу, 1989). В гордеїни відповідають за 70-80 9о загального вмісту, а
С гордеїни - за 10-20 95 (Оамієв еї а!., 1993). А гордеїни у більшості випадків не розглядаються такими, що представляють запасну фракцію, тоді як Ю гордеїни гомологічні глютенінам з високою молекулярною масою. Гордеїни, разом з рештою споріднених проламінів зернових культур, не експресуються у самому зиготному ембріоні, на відміну від інших запасних білків, таких як напіни; передбачається, що вони експресуються виключно у крохмалистому ендоспермі під час середньопізніх стадій розвитку насіння.
Приклади амінокислотних послідовностей гордеїнів ячменю та кодуючих їх генів представлені у публікації УМО 2009/021285.
Осолоджування
Напій на основі солоду, що представлений цим винаходом, охоплює алкогольні напої (включаючи напої, одержані перегонкою) та безалкогольні напої, які одержують з використанням солоду як частини або всієї вихідної сировини. Приклади включають пиво,
Зо хапошу (пивний напій з низьким вмістом солоду), віскі, слабоалкогольні напої на основі солоду (наприклад, напої на основі солоду, що містять менше 1 95 спирту) та безалкогольні напої.
Осолоджування являє собою процес контрольованого замочування та пророщування з наступним висушуванням зерна ячменю. Ця послідовність перетворень важлива для синтезу багаточисленних ферментів, які викликають модифікацію зерна, процес, який головним чином деполімеризує стінки мертвих клітин ендосперму та мобілізує поживні речовини зерна. У подальшому процесі висушування завдяки хімічним реакціям обсмажування створюється смак, аромат і колір. Не зважаючи на початкове застосування солоду для одержання напоїв, він також може використовуватися для інших промислових процесів, наприклад, як джерело ферментів у хлібопекарній промисловості, або як смакова ароматизуюча речовина або забарвлююча речовина у харчовій промисловості, наприклад, як солод або солодова мука, або опосередковано як солодовий сироп тощо.
В одному варіанті реалізації цей винахід відноситься до способів одержання солодової композиції. Спосіб переважно включає етапи: () отримання зерна рослини ячменю за винаходом, (ії) замочування вказаного зерна, (ії) пророщування замочених зерен у попередньо визначених умовах та (м) висушування вказаних пророслих зерен.
Наприклад, солод може вироблятися будь-яким із способів, описаних у виданні Нозепеу (Ргіпсірієз ої Сегеа! Зсіепсе апа Тесппоіоду, Зесопа Еайіоп, 1994: Атетгісап Аззосіайоп ої Сегеаї
Спетівів, БІ. Раці, Міпп.). Тим не менш, будь-якій підходящий спосіб одержання солоду також може використовуватися з цим винаходом, такі як способи одержання спеціальних солодів, що включають, але не обмежуються способами обжарювання солоду. Одним не обмежуючим прикладом є описаний у Прикладі 6.
Солод може готуватися лише з використанням зерна, отриманого з рослин ячменю за цим винаходом, або сумішей, які містять інші зерна.
Солод в основному використовується для виробництва пива, але також для виробництва міцних напоїв, одержуваних перегонкою. Виробництво пива включає одержання сусла, основну і вторинну ферментації та витримування. Спочатку солод подрібнюють, замішують з водою та підігрівають. Під час цього «затирання» ферменти, активовані у процесі осолоджування,
руйнують крохмаль зерен до цукрів, що ферментуються. Одержане сусло освітлюють, додають дріжджі, суміш ферментують та проводять витримування.
В іншому варіанті реалізації винаходу композиції сусла можуть готуватися з солоду. Указане сусло може бути первинним та/або вторинним та/або додатковим суслом. Загалом, композиція сусла буде мати високий вміст амінного азоту та вуглеводів, що ферментуються, головним чином мальтози. Як правило, сусло готують інкубуванням солоду з водою, тобто затиранням.
Під час затирання композиція солод/вода може доповнюватися додатковими багатими вуглеводами композиціями, наприклад, добавками з ячменю, кукурудзи або рису. Неосолоджені добавки із зернових культур звичайно не містять активних ферментів і, тому, покладаються на ферменти солоду або екзогенні ферменти для забезпечення ферментами, необхідними для конверсії цукрів.
Загалом, першим етапом у процесі одержання сусла є подрібнення солоду для того, щоб вода могла отримати доступ до часток зерна у фазі затирання, яке суттєво впливає на тривалість процесу осолоджування з ферментною деполімеризацією субстратів. Під час затирання подрібнений солод інкубують з рідкою фракцією, такою як вода. Температуру або підтримують постійною (ізотермічне затирання) або поступово підвищують. У будь-якому випадку розчинні речовини, отримані при осолоджуванні та затиранні, екстрагуються у вказану рідку фракцію перед їх відділенням фільтрацією у сусло, а тверді частки, що залишилися, називаються пивною дробиною. Це сусло також може називатися первинним суслом. Після фільтрації одержують вторинне сусло. Додаткові сусла можуть одержуватися повторенням цієї процедури. Не обмежуючі приклади процедур, що підходять для приготування сусла, описані у виданні Нозепеу (вище).
Композиція сусла також може готуватися інкубуванням рослин ячменю за цим винаходом або їх частин з одним або більше підходящих ферментів, таких як ферментні композиції або змішані ферментні композиції, наприклад ОКгайо або Сегейо (Момолутев). Композиція сусла також може готуватися з використанням суміші солоду та неосолоджених рослин ячменю або їх частин, необов'язково доданням одного або більше підходящих ферментів під час вказаного приготування. На додаток до цього, ферменти пролілендопептидаз, які специфічно руйнують токсичні амінозв'язки, що приймають участь у прояві захворювання целіакією, можуть
Зо додаватися під час ферментації сусла для зменшення токсичності залишкових гордеїнів (Ое
Апавїїз єї аї!., 2007; Мапі єї аї!., 2005; єтерпіак еї а!., 2006).
Переробка зерна
Зерно ячменю за цим винаходом може перероблятися для одержання харчового інгредієнта, інгредієнта напою, харчового продукту або напою або нехарчового продукту з використанням будь-якої технології, відомої у цій галузі техніки.
В одному варіанті реалізації винаходу продукт являє собою цільнозернову муку (цільнозернова мука надтонкого помелу, така як цільнозернова мука надтонкого помелу; цільнозернова мука або мука, виготовлена на близько 10095 із зерна). Цільнозернова мука включає компонент рафінованої муки (рафінованої муки або рафінована мука) та крупну фракцію (крупна фракція надтонкого помелу).
Рафінована мука може бути мукою, яку отримують, наприклад, перемелюванням та просіюванням очищеного ячменю. Управління з контролю харчових продуктів і лікарських засобів (ЕСА) вимагає, щоб мука відповідала певним стандартам за розміром часток для того, щоб бути включеною до категорії рафінованої муки ячменю. Розмір часток рафінованої муки описує муку, в якій не більше 9895 проходить через тканину, що має отвори не більше таких у дротовій тканині, позначеній «212 мікрометрів (стандарт 0.5. Уміге 70)».
Крупна фракція включає щонайменше один з компонентів: висівки та зародки. Наприклад, зародок являє собою ембріональну рослину, що знаходиться всередині зерна ячменю. Зародок включає ліпіди, волокна, вітаміни, білок, мінеральні речовини та фітонутрієнти, такі як флавоноїди. Висівки включають кілька шарів клітин і мають значну кількість ліпідів, волокон, вітамінів, білка, мінеральних речовин та фітонутріентів, таких як флавоноїди. Додатково крупна фракція може включати алейроновий шар, який також включає ліпіди, волокна, вітаміни, білок, мінеральні речовини та фітонутрієнти, такі як флавоноїди. Алейроновий шар, у той самий час технічно вважається частиною ендосперму, проявляє багато тих самих властивостей що й висівки, і тому, як правило, видаляється з висівками і зародком під час процесу подрібнення.
Алейроновий шар містить білки, вітаміни та фітонутрієнти, такі як ферулова кислота.
Додатково крупна фракція може змішуватися з компонентом рафінованої муки. Переважно, крупна фракція може гомогенно змішуватися з компонентом рафінованої муки. Гомогенне змішування крупної фракції та компонента рафінованої муки може допомогти у зменшенні бо розшаруванні часток за розміром при перевезенні. Груба фракція може змішуватися з компонентом рафінованої муки з утворенням цільнозернової муки, забезпечуючи таким чином одержання цільнозернової муки зі збільшеною поживною цінністю, вмістом волокон і антиоксидантною здатністю у порівнянні з рафінованою мукою. Наприклад, крупна фракція або цільнозернова мука може використовуватися у різних кількостях для заміни рафінованої або цільнозернової муки у хлібобулочних виробах, закусочних продуктах та харчових продуктах.
Цільнозернова мука за цим винаходом (тобто цільнозернова мука надтонкого помелу) також може реалізовуватися безпосередньо споживачам для використання у приготуванні домашніх мучних виробів. У типовому варіанті реалізації винаходу профіль крупності цільнозернової муки такий, що 9895 за масою часток цільнозернової муки складає менше 212 мікрометрів.
У додаткових варіантах реалізації винаходу ферменти, що знаходяться всередині висівок та зародків цільнозернової муки та/або крупної фракції інактивуються для того, щоб стабілізувати цільнозернову муку та/або крупну фракцію. Цим винаходом припускається, що інактивований також може означати інгібований, денатурований тощо. Стабілізація являє собою процес, в якому використовується пара, нагрів, радіація або інші види обробки для інактивації ферментів, що знаходяться у шарі висівок або зародків. Ферменти, які зустрічаються у природі у висівках та зародках, будуть каталізувати зміни сполук у муці, несприятливо впливаючи на кулінарні властивості муки та термін придатності. Інактивовані ферменти не каталізують зміни сполук, що знаходяться у муці, тому, мука, яку стабілізували, зберігає свої кулінарні властивості і має більш тривалий термін придатності. Наприклад, у цьому винаході може застосовуватися двопоточна методика подрібнення для перемелювання крупної фракції. Відразу крупна фракція відділяється та стабілізується, потім крупна фракція перемелюється на подрібнювачі, переважно на валковому млині з утворенням крупної фракції, що має розподіл за розмірами часток менших або рівних близько 500 мікрометрів. У типовому варіанті реалізації винаходу окружна швидкість валкового млина звичайно складає між від 115 м/с до 144 м/с, при високій окружній швидкості утворюється тепло. Тепло, що виділяється під час процесу, і потік повітря призводять до зменшення мікробного навантаження крупної фракції. У додаткових варіантах реалізації винаходу перед перемелюванням на валковому млині крупна фракція може мати число аеробних мікроорганізмів при посіві на чашки 95000 колонієутворюючих одиниць/грам (КУО/г), а середнє число коліформ - 1200 КУО/г. Після проходження через валковий млин
Зо крупна фракція може мати середнє число аеробних мікроорганізмів при посіві на чашки 10000
КУО/г, а середнє число коліформ - 900 КУО/г. Таким чином, мікробне навантаження може бути помітно зменшене у крупній фракції за цим винаходом. Після просіювання будь-яка перемелена крупна фракція, що має розмір часток більше 500 мікрометрів, може бути повернена у процес для подальшого подрібнення.
У додаткових варіантах реалізації винаходу цільнозернова мука або крупна фракція може бути компонентом харчового продукту. Наприклад, харчовий продукт може бути бубликом, бісквітом, хлібом, булочкою, круасаном, пельменем, англійським кексом, кексом, хлібом піта, квікбредом, охолодженими/замороженими тістовими заготовками, тістом, тушкованою квасолею, буріто, чилі, тако, тамалом, тортілою, закритим пирогом, готовим до споживання зерновим продуктом, готовим до споживання сухим пайком, начинням, їжею для приготування у мікрохвильовій печі, шоколадним тістечком, тістечком, чізкейком, булочкою до кави, печивом, десертом, кондитерським виробом, здобною булочкою, шоколадним батончиком, коржем пирога, начинням пирога, дитячим харчуванням, сумішшю для випічки, млинцевим тістом, паніруванням, сумішшю для підливи, модифікатором м'яса, замінювачем м'яса, сумішшю спецій, суповою сумішшю, підливою, ру, заправкою для салату, супом, сметаною, локшиною, вермішеллю, локшиною рамен, локшиною чоу-мейн, локшиною ло-мейн, наповнювачем морозива, брикетом морозива, ріжком морозива, сендвічем морозива, крекером, крутоном, пончиком, яєчним рулетом, формованою закускою, фруктово-зерновим батончиком, закусочним продуктом для приготування у мікрохвильовій печі, поживним батончиком, млинцем, заготовкою хлібобулочного виробу, кренделем, пудингом, продуктом на основі гранолі, закусочним чіпсом, закусочним продуктом, сумішшю для закуски, вафлею, основою для піци, кормом для тварин або кормом для домашніх тварин.
В альтернативних варіантах реалізації винаходу цільнозернова мука або крупна фракція може бути компонентом харчової добавки. Наприклад, харчова добавка може бути продуктом, який додається до дієти, що містить один або більше інгредієнтів, який як правило включає: вітаміни, мінеральні речовини, рослинні добавки, амінокислоти, ферменти, антиоксиданти, рослинні добавки, спеції, пробіотики, екстракти, пребіотики та волокна. Цільнозернова мука або крупна фракція за цим винаходом включає вітаміни, мінеральні речовини, амінокислоти, ферменти та волокна. Наприклад, крупна фракція містить концентровану кількість дієтичних 60 волокон, а також інші незамінні поживні речовини, такі як В-вітаміни, селен, хром, марганець,
магній та антиоксиданти, які незамінні для здорового харчування. Наприклад, 22 грами крупної фракції за цим винаходом забезпечує отримання 33 95 рекомендованого індивідуального добового споживання волокон. Додатково, 14 грам дає все необхідне для забезпечення отримання 20 95 рекомендованого індивідуального добового споживання волокон. Таким чином, крупна фракція являє собою чудове додаткове джерело для індивідуального споживання волокон. Тому, у цьому варіанті реалізації винаходу цільнозернова мука або крупна фракція може бути компонентом харчової добавки. Харчова добавка може включати будь-які відомі поживні інгредієнти, які будуть покращувати загальне самопочуття індивіда, приклади включають, але не обмежуються вітамінами, мінеральними речовинами, іншими компонентами- волокнами, жирними кислотами, антиоксидантами, амінокислотами, пептидами, білками, лютеїном, рибозою, омега-3 жирними кислотами та/або іншими поживними інгредієнтами.
У додаткових варіантах реалізації винаходу цільнозернова мука або крупна фракція може бути харчовою добавкою волокон або їх компонентом. Багато сучасних добавок волокон, таких як лушпиння подорожника, похідні целюлози та гідролізована гуарова камідь, мають обмежену цінність не враховуючи їх вмісту волокон. На додаток до цього, багато харчових добавок волокон мають неприйнятну текстуру і неприємний смак. Харчові добавки волокон, приготовані з цільнозернової муки або крупної фракції можуть сприяти постачанню волокнами, а також білками та антиоксидантами. Харчова добавка волокон може постачатися, але не обмежуватися наступними формами: сумішами розчинних напоїв, готовими до застосування напоями, поживними батончиками, вафлями, печивом, крекерами, гелевими коктейлями, капсулами, жуйками, жувальними таблетками та пігулками. В одному варіанті реалізації винаходу запропонована харчова добавка волокон у формі ароматизованого коктейлю або напою солодового типу, цей варіант реалізації винаходу може бути особливо привабливими як харчова добавка волокон для дітей.
У додатковому варіанті реалізації винаходу процес подрібнення може використовуватися для одержання багатозернової муки, муки з кількох сортів ячменю або багатозернової крупної фракції. Наприклад, висівки та зародки з одного типу ячменю можуть перемелюватися і змішуватися з перемеленим ендоспермом або цільнозерновою ячмінною мукою ячменю іншого типу. В альтернативному варіанті, висівки та зародки з одного типу ячменю можуть
Зо перемелюватися і змішуватися з перемеленим ендоспермом або цільнозерновою мукою зерна іншого типу. У додатковому варіанті реалізації винаходу висівки та зародки з першого типу ячменю або зерна можуть змішуватися з висівками та зародками з іншого типу ячменю або зерна для одержання багатозернової крупної фракції. Припускається, що цей винахід охоплює змішування будь-якої комбінації одного або більше типів висівок, зародків, ендосперму та цільнозернової муки одного або більше типів зерна. Цей підхід з використанням кількох видів зерна, кількох видів ячменю може застосовуватися для одержання оригінальної муки та покращення якісних властивостей і поживного вмісту, використовуючи багато видів зерна або ячменю для одержання однієї муки.
Цільнозернова мука за цим винаходом може виготовлятися за допомогою різноманітних процесів подрібнення. У типовому варіанті реалізації винаходу задіюється перемелювання зерна в одному потоці без розділення ендосперму, висівок та зародків зерна на окремі потоки.
Очищене та кондиціоноване зерно подається на подрібнювач першого проходу, такого як молотковий млин, ролерний млин, штифтовий млин, ударний млин, дисковий млин, повітряно- фрикційний млин, валковий млин тощо. В одному варіанті реалізації винаходу подрібнювач може бути валковим млином. Після перемелювання зерно вивантажується та подається на просіювач. Може використовуватися будь-який відомий у цій галузі техніки просіювач для просіювання перемелених часток. Речовина, що проходить через сито просіювача, являє собою цільнозернову муку за цим винаходом та не потребує подальшої переробки. Речовина, що залишається на ситі, називається другою фракцією. Друга фракція вимагає додаткового зменшення розміру часток. Тому, друга фракція може подаватися на подрібнювач другого проходу. Після подрібнення друга фракція може подаватися на другий подрібнювач. Речовина, що проходить крізь сито другого просіювача, являє собою цільнозернову муку за цим винаходом. Речовина, що залишається на ситі, називається четвертою фракцією та вимагає подальшої переробки для зменшення розміру часток. Четверта фракція на ситі другого просіювача подається назад або на подрібнювач першого проходу або подрібнювач другого проходу для подальшої переробки через петлю зворотної подачі. В альтернативному варіанті реалізації винаходу процес може включати багато подрібнювачів першого проходу для забезпечення більшої пропускної здатності системи.
Припускається, що цільнозернова мука, крупна фракція та/або зернопродукти за цим бо винаходом можуть виготовлятися будь-яким процесом перемелювання, відомим у цій галузі техніки. Додатково припускається, що цільнозернова мука, крупна фракція та/або зернопродукти за цим винаходом можуть модифікуватися або покращуватися шляхом багаточисельних інших процесів, таких як: ферментація, інстанізація, екструзія, інкапсулювання, піджарювання, обжарювання тощо.
Полінуклеотиди, що пригнічують продукцію гордеїну
В одному варіанті реалізації винаходу зерно за цим винаходом та/або те, що використовується у способах за цим винаходом, отримують з трансгенної рослини ячменю, яка містить трансген, що кодує полінуклеотид, який пригнічує в зерні продукцію щонайменше одного гордеїну. Приклади таких полінуклеотидів включають, але не обмежуються, антисмисловим полінуклеотидом, смисловим полінуклеотидом, каталітичним полінуклеотидом, штучною мікроРНК або дуплексною молекулою РНК. Кожний з цих полінуклеотидів, коли він присутній у зерні, призводить до зменшення доступної для трансляції мРНК гордетїну.
Антисмислові полінуклеотиди
Термін «антисмисловий полінуклеотид» повинен застосовуватися у значенні ДНК або РНК, або їх комбинації, молекули, що є комплементарною щонайменше до частини специфічної молекули мРНК, яка кодує гордеїн та здатна взаємодіяти на посттранскрипційну подію, таку як трансляція МРНК Застосування способів з антисмисловими молекулами добре відомо у цій галузі техніки (див наприклад книгу З Нагітапп та 5 Епаге5, Мапиаї ої Апіїзепзе Меїподо!оду,
КіІшуег (1999)). Застосування методик з антисмисловими молекулами зібрано в оглядах Воигдие (1995) та бепіог (1998). Автором Зепіог (1998) вказано, що способи з антисмисловими молекулами у теперішній час є надійно відпрацьованою методикою для маніпулювання генною експресією.
Антисмисловий полінуклеотид в рослині ячменю за цим винаходом буде гібридизувати з цільовим полінуклеотидом у фізіологічних умовах. Як використовується у цьому документі термін «антисмисловий полінуклеотид, що гібридизується у фізіологічних умовах» означає, що полінуклеотид (який повністю або частково одноланцюговий) є щонайменше здатним утворювати дволанцюговий полінуклеотид з мРНК, кодуючою білок, такий як гордеїн ячменю, у клітині ячменю в нормальних умовах.
Антисмислові молекули можуть включати послідовності, які відповідають структурним генам або послідовностям, що здійснюють контроль над генною експресією або подією сплайсингу.
Наприклад, антисмислова послідовність може відповідати таргетуємій кодуючій ділянці генів за цим винаходом або 5'-нетранслюємій ділянці (0ОТЕК) або 3-ОТК або комбінаціям цих елементів.
Вона може бути комплементарною зокрема до інтронних послідовностей, які можуть видалятися сплайсингом під час або після транскрипції, переважно лише до екзонних послідовностей цільового гена. Приймаючи до уваги загальну більшу дивергенцію ШТЕ, таргетування цих ділянок забезпечує більшу специфічність інгібування гена.
Довжина антисмислової послідовності повинна бути рівною щонайменше 19 послідовним нуклеотидам, переважно щонайменше 50 нуклеотидам та переважніше щонайменше 100, 200, 500 або 1000 нуклеотидам. Може використовуватися повнорозмірна послідовність комплементарна цілому генному транс крипту. Найбільш переважною є довжина 1000-2000 нуклеотидів. Ступінь ідентичності антисмислової послідовності транскрипта, що таргетується, повинна бути щонайменше 90 95 та переважніше 95-100 95. Антисмислова молекула РНК звичайно може містити неспоріднені послідовності, які можуть функціонувати з метою стабілізації молекули.
Каталітичні полінуклеотиди
Термін каталітичний полінуклеотид/нуклеїнова кислота відноситься до молекули ДНК або
ДНК-місної молекули (також відомої у цій галузі техніки як «дезоксирибозим») або РНК або РНК- місної молекули (також відомої як «рибозим»), яка специфічно розпізнає окремий субстрат та каталізує хімічну модифікацію цього субстрату. Основи нуклеїнових кислот у каталітичній нуклеїновій кислоті можуть бути основами А, С, б, Т (та О для РНК).
Як правило, каталітична нуклеїнова кислота містить антисмислову послідовність для специфічного розпізнавання цільової нуклеїнової кислоти, та нуклеїнову кислоту з розщеплюючою ферментною активністю (також названою у цьому документі як «каталітичний домен»). Типи рибозимів, які особливо придатні до застосування у цьому винаході, являють собою рибозим типу головки молотка (Назейой та Сегпіасі, 1988, Регтітап еї аї., 1992) і рибозим типу шпильки (ЗПірру еї аї., 1999).
Рибозими рослини ячменю за цим винаходом та кодуючі ДНК рибозими можуть бути хімічно синтезовані з використанням способів, добре відомих у цій галузі техніки. Рибозими також можуть бути отримані з молекули ДНК (яка при транскрипції дає молекулу РНК) функціонально бо зв'язану з промотором РНК-полімерази, наприклад, промотором РНК-полімерази Т7 або РНК-
полімерази 5Рб. Коли вектор також містить промотор РНК-полімерази функціонально зв'язаний з молекулою ДНК, то рибозим може продукуватися іп міїго при інкубації з РНК-полімеразою та нуклеотидами. В окремому варіанті реалізації винаходу ДНК може бути вставлена в експресійну касету або транскрипційну касету. Після синтезу молекула РНК може модифікуватися лігуванням з молекулою ДНК, що має здатність стабілізувати рибозим і робити його стійким до
РНКази.
Як ії з антисмисловими полінуклеотидами, описаними у цьому документі, каталітичні полінуклеотиди також повинні бути здатними до гібридизації з молекулою цільової нуклеїнової кислоти (наприклад, мРНК, кодучій гордеїн ячменю) у «фізіологічних умовах», а саме тих умовах, які притаманні клітині ячменю.
РНК-інтерференція
РНК-інтерференція (КМАЇї) є особливо підходящим способом для специфічного інгібування продукції конкретного білка. Хоча автори не бажають бути обмеженими конкретною теорією, в статті М/аїегпоизе еї а (1998) представлено модель механізму, за допомогою якого дд4аРНК (дуплексна РНК) може використовуватися для зменшення продукції білка. Ця технологія заснована на присутності молекул дцРНК, які містять послідовність, що є переважно ідентичною
МРНАК гена, що представляє інтерес, або його частині, у цьому випадку мРНК, яка кодує поліпептид у відповідності з цим винаходом. З метою зручності, д4ДРНК може продукуватися з єдиного промотору у рекомбінантному векторі або клітині-хазяїні в якому смислова та антисмислова послідовності фланковані неспорідненими послідовностями, які дають можливість смисловій та антисмисловій послідовностям гібридизуватися з утворенням молекули ддцРНК, що утворює з неспорідненою послідовністю петльову структуру. Схема та продукція підходящих молекул ддцРНК для цього винаходу узгоджується з можливістю фахівця у цій галузі, особливо приймаючи до уваги публікації Ууагегпоизе еї а! (1998), Зтій еї а! (2000),
УМО 99/32619, УМО 99/53050, УМО 99/49029 та УМО 01/34815.
В одному прикладі ДНК вводиться таким чином, що вона направляє синтез щонайменше частково дволанцюгового (дуплексного) продукту(ів) РНК з гомологією до цільового гена, який потрібно інактивувати. Отже, ДНК містить як смислову так і антисмислову послідовності, які, при траскрибуванні в РНК, можуть гібридизуватися з утворенням дволанцюгової ділянки РНК. У
Зо переважному варіанті реалізації винаходу смислова і антисмислова послідовності розділені спейсерною ділянкою, яка містить інтрон, що при траскрибуванні в РНК видаляється сплайсингом. Показано, що ця комбінація призводить до більшої ефективності генного сайленсингу. Дволанцюгова ділянка може містити одну або дві молекули РНК, що транскрибуться або з однієї ділянки ДНК або з двох. Припускають, що присутність дволанцюгової молекули запускає відповідь від ендогенної системи рослини, яка руйнує і дволанцюгову РНК, а також гомологічний РНК-транскрипт з цільового гена рослини, ефективно зменшуючи або усуваючи активність цільового гена.
Довжина смислової та антисмислової послідовністей, які гібридизуються, повинна бути рівною кожна щонайменше 19 послідовним нуклеотидам, переважно щонайменше 30 або 50 нуклеотидам та переважніше щонайменше 100, 200, 500 або 1000 нуклеотидам. Може використовуватися повнорозмірна послідовність, що відповідає цілому генному транс крипту.
Найбільш переважними є довжини 100-2000 нуклеотидів. Ступінь ідентичності смислової та антисмислової послідовностей транскрипта, що таргетується, повинна бути щонайменше 85 95, переважніше 90 95 та переважніше 95-100 95. Молекула РНК звичайно може містити неспоріднені послідовності, які можуть функціонувати з метою стабілізації молекули. Молекула
РНК може експресуватися під контролем промотору РНК-полімерази ІІ або РНК-полімерази ПІ.
Приклади останніх включають промотор тРНК або мяРНК.
Переважні молекули малих інтерферуючих РНК («міРНК») містять нуклеотидну послідовність, яка ідентична близько 19-21 послідовним нуклеотидам у цільовій мРНК.
Переважно послідовність цільової МРНК починається з динуклеотиду АА, включає осС-вміст близько 30-70 95 (переважно, 30-60 95, переважніше 40-60 95 та переважніше близько 45 95-55
Фо), та не має високого відсотку ідентичності до будь-якої нуклеотидної послідовності, що відрізняється від цільової, у геномі рослини ячменю, в який вона вводиться, наприклад, як визначається стандартним пошуком у програмі ВІ А5Т.
МікроРНК
Регуляція за допомогою мікроРНК безсумнівно є спеціалізованим відгалуженням механізму сайленсингу РНК, який залучений у генную регуляцію, відходячи від традиційного механізму
ЕМАЇ/РТО5 МікроРНК являє собою специфічний клас малих РНК, які закодовані у геноподібніх елементах, організованих у характерні інвертовані повтори. При транскрипції гени мікроРНнК бо забезпечують зростання кількості стеблово-петльових попередників РНК, з яких у подальшому процесуються мікроРНК МікроРНК, як правило, складаються у довжину з близько 21 нуклеотиду. Вивільнені мікроРНК інкорпоруються у КІ5ЗС-подібні комплекси, що містять конкретний піднабір білков-аргонавтів, які викликають репресію послідовність-спеціфичних генів (див., наприклад, статті Мійаг та Умагегпоизе, 2005; Раздпіпеїїї еї аї., 2005; АІтеїйда та АЇЇ5Піге, 2005).
Косупресія
Іншим молекулярно-біологічним підходом, який може використовуватися, є косупресія.
Механізм косупресії не є чітко зрозумілим, але припускається, що він залучений до посттранскрипційного сайленсингу генів (РТО5) та, у цьому відношенні, може бути дуже подібним до багатьох прикладів антисмислової супресії. У ньому залучено введення додаткової копії гена або його фрагмента у рослину, у смисловій орієнтації по відношенню до промотору, для його експресії. Розмір смислового фрагмента, його відповідність цільовим генним ділянкам та ступінь його ідентичності послідовності з цільовим геном є такими як для антисмислових послідовностей, описаних вище. У деяких випадках додаткова копія генної послідовності впливає на експресію цільового гена рослини. Для способів здійснення підходів косупресії приводяться посилання на публікації МО 97/20936 та ЕР 0465572.
Конструкції нуклеїнових кислот
Конструкції нуклеїнових кислот, придатні для отримання трансгенних рослин, можуть легко створюватися з використанням стандартних методик.
При інсерції ділянки, кодуючої мРНК, конструкція може містити інтронні послідовності. Ці інтронні послідовності можуть сприяти експресії трансгена в рослині. Термін «інтрон» використовується у своєму звичайному смислі у значенні генетичного сегмента, який транскрибується, але не кодує білок, і який видаляється сплайсингом з РНК перед трансляцією.
Інтрони можуть вводитися у 5-ШТЕК або кодуючу ділянку, якщо трансген кодує продукт, що транслюється, або у будь-яке місце ділянки, що транскрибується, якщо - не кодує. Однак, у переважному варіанті реалізації винаходу будь-яка кодуюча поліпептид ділянка представлена як єдина відкрита рамка зчитування. Фахівець, що отримує завдання, повинен розуміти, що такі відкриті рамки зчитування можуть бути отримані зворотним транскрибуванням мРНК, що кодує поліпептид.
Для забезпечення відповідної експресії гена, який кодує МРНК, що представляє інтерес, конструкція нуклеїнової кислоти, як правило, містить один або більше регуляторних елементів, таких як промотори, енхансери, а також послідовності термінації транскрипції і послідовності поліаденилювання. Такі елементи добре відомі у цій галузі техніки.
Ділянка транскрипційної ініціації що містить регуляторний(ї) елемент(и), може забезпечувати в рослині регульовану або конститутивну експресію. Переважно, експресія щонайменше відбувається у клітинах насіння.
Описаний набір конститутивних промоторів, які активні у рослинних клітинах. Підходящі промотори для конститутивної експресії у рослинах включають, але не обмежуються, промотором 355 вірусу мозаїки кольорової капусти (СамуМм), 355 вірусу мозаїки норичнику (ЕММ), промотором бацилоподібного вірусу цукрової тростини, промотором вірусу жовтої крапчастості комеліни, промотором, що індукується світлом, з малої субодиниці рибулозо-1,5- біс-фосфаткарбоксилази, промотором цитозольної триозофосфатізомерази рису, промотором аденінфосфорибозилтрансферази Агарідорзіз, промотором гена актину 1 рису, промоторами манопінсинтази та октопінсинтази, промотором лай, промотором сахарозосинтази, промотором
В-генного комплексу та промотором гена хлорофіл-а/В-зв'язуючого білка. Ці промотори застосовують для створення ДНК-векторів, які експресуються у рослинах; див., наприклад, публікацію УМО 84/02913. Усі ці промотори застосовують для створення різних типів рекомбінантних ДНК-векторів, що експресуються у рослинах.
Промотор може модулюватися такими факторами як температура, світло або стресовий вплив. Звичайно, регуляторні елементи будуть знаходитися на 5'-кінці генетичної послідовності, яку потрібно експресу вати. Конструкція також може містити інші елементи, які посилюють транскрипцію, такі як ділянки поліааденилювання поз 3' або ос5 3 або термінатори транскрипції.
Б'-сетранслюєма лідерна послідовність може бути отримана з промотору, вибраного для експресії гетерологичної генної послідовності та, якщо потрібно, може бути специфічно модифікованою для збільшення трансляції мРНК. Для отримання огляду оптимизації експрессии трансгенів, див статтю Ко/ієї еї а! (1996). 5'-нсетранслюємі ділянки також можуть бути отримані з вірусних РНК рослин (серед інших, вірусу тютюнової мозаїки, вірусу гравірування тютюну, вірусу карликової мозаїки кукурудзи, вірусу мозаїки люцерни) з підходящих еукаріотичних генів, генів рослин (лідера гена хлорофіл-а/Ю-зв'язуючого білка бо пшениці і кукурудзи) або з синтетичної генної послідовності. Цей винахід не обмежений використанням конструкцій, в яких ділянка, що не транслюється, отримана з 5'-четранслюємої послідовності, що супроводжує промоторну послідовність. Лідерна послідовність також може бути отримана з неспорідненого промотору або кодуючої послідовності Лідерні послідовності, придатні у контексті цього винаходу, включають лідер кукурудзи Нер70 (05 5362865 та 05 5859347) і елемент омега ВТМ.
Термінація транскрипції проводиться 3'-нетранслюємою послідовністю ДНК, функціонально зв'язаною в химерному векторі з полінуклеотидом, що представляє інтерес 3'-гсетранслюєма ділянка рекомбінантної молекули ДНК містить сигнал поліаденилювання, який функціонує в рослинах, обумовлюючи додавання аденілатних нуклеотидів до 3'-кінця РНК 3'-нетранслюєма ділянка може бути отримана з різних генів, які експресуються у клітинах рослин. У зв'язку з цим звичайно використовують 3'-сетранслюєму ділянку нопалінсинтази, 3'-нетранслюєму ділянку з малої субодиниці гена рибулозобісфосфаткарбоксилази гороху, 3'-нетранслюєму ділянку з гена 75 запасного білка насіння сої. Придатні також 3'-транскрибуємі нетранслюємі ділянки, що містять сигнал поліаденилювання плазмідних генів Адгобасієл ит, що індукують пухлини (Ті).
Як правило, конструкція нуклеїнової кислоти містить маркер, що селектується. Маркери, що селектуються, допомагають при ідентифікації та скринінгу рослин або клітин, яких трансформували молекулою екзогенної нуклеїнової кислоти. Маркерний ген, що селектується, може забезпечувати стійкість до антибіотиків або гербіцидів клітин ячменю або дозволяє засвоювати субстрати, такі як занозу. Маркер, що селектується, переважно надає клітинам ячменю стійкість до гігроміцину.
Переважно, конструкція нуклеїнової кислоти стабільно інкорпорується в геном рослини.
Відповідно, нуклеїнова кислота містить підходящі елементи, які дозволяють молекулі інкорпоруватися в геном, або конструкція поміщається у підходящий вектор, який може бути інкорпорований у хромосому клітини рослини.
Один варіант реалізації за цим винаходом включає застосування рекомбінантного вектора, який включає щонайменше трансген, відмічений у цьому документі, вставлений у будь-який вектор, здатний доставляти молекулу нуклеїнової кислоти в клітину-хазяїна. Такий вектор містить гетерологічні послідовності нуклеїнових кислот, які являють собою послідовності нуклеїнових кислот, що у природі не знаходяться по сусідству з молекулами нуклеїнових кислот за цим винаходом і які переважно походять з видів, що відрізняються від видів, з яких походить(ять) молекула(и) нуклеїнових кислот. Вектор може бути РНК або ДНК, прокаріотичною або еукаріотичною і, як правило, є вірусною або плаз мідною.
Набір векторів, підходящих для стабільної трансфекції рослинних клітин або для розробки трансгенних рослин описаний, наприклад, у публікаціях Роцмеї5 еї аїЇ., Сіопіпа Месіогв: А
Іарогаїогу Мапиа!ї, 1985, вирр 1987; М/еізврасп апа МУеізвраси, Меїподь ог Ріапі Мо!Іесшаг
Віоіоду, Асадетіс Ргез55, 1989 та СеМміп еї а!., Ріапі Моїесшіаг Віоїоду Мапиаї, Кішмег Асадетіс
РибіїзНегв, 1990. Як правило, експресійні вектори для рослин включають, наприклад, один або більше генів рослин, що клонують під транскрипційним контролем з 5'- та З3З'-регуляторних послідовностей, та домінантний маркер, що селектується. Такі експресійні вектори для рослин також можуть містити промоторну регуляторну ділянку (наприклад, регуляторну ділянку, що контролюється індуцибельно або конститутивно, регулюється оточуючими умовами або стадіями розвитку, або клітинно- або тканевоспецифічна для експресії), стартовий сайт ініціації транскрипції, зв'язуючий рибосоми сайт, сигнал процесингу РНК, сайт термінації транскрипції та/або сигнал поліаденилювання.
Трансгенні рослини
Трансгенні рослини ячменю, як визначені у контексті цього винаходу включають рослини (а також частини та клітини вказаних рослин) та їх потомство, яке генетично модифіковано з використанням рекомбінантних методик, що обумовлюють продукцію щонайменше одного полінуклеотиду та/або поліпептиду у потрібній рослині або органі рослини. Трансгенні рослини можуть бути отримані з використанням методик, відомих у цій галузі техніки, таких як ті, що загалом описані у публікаціях А Зіагїег еї аї., Ріапі ВіотесппоІоду - Те Сепеїїс Мапіршіайоп ої
Ріапі5, Охтога Опімегейу Ргезз (2003) і Р Спгівои та Н Кієє, Напабоок ої Ріапі ВіоїесппоІоду, допп
УМіеу апа оп (2004).
У переважному варіанті реалізації винаходу трансгенні рослини гомологічні за кожним окремим геном, який був введений (трансген) потомству, не сегрегують за потрібним фенотипом. Трансгенні рослини також можуть бути гетерозиготними за введеним(ими) трансгеном(ами), такими як, наприклад, у потомстві ЕТ, яке вирощується з гібридної рослини.
Такі рослини можуть надавати переваги, такі як гібридну життєздатність, добре відомі у цій галузі техніки.
Описано чотири загальних типів способів для прямої доставки гена в клітини: (1) хімічні способи (Ссгапат еї аї., 1973); (2) фізичні способи, такі як використання мікроіїн'єкції (Сарессопі, 1980); електропорації (див., наприклад, УМО 87/06614, 05 5472869, 5384253, МО 92/09696 та
МО 93/21335) і генної гармати (див., наприклад, 05 4945050 та 05 5141131); (3) використання вірусних векторів (Сіарр, 1993; їи еї аї.,, 1993; ЄЕдійі5 еї аїЇ.,, 1988) та (4) використання рецепторопосередкованих механізмів (Сигівї! еї а!., 1992; М/адпег еї а!., 1992).
Способи з використанням прискорення, які можуть використовуватися, включають, наприклад, бомбардування мікрочастками та подібні способи. Одним прикладом способу для доставки молекул, що трансформують нуклеїнові кислоти, в рослинні клітини є бомбардування мікрочастками. Цей спосіб розглянутий у статті Мапа еї аї., Рагіїсіє Вотбрагатепі Тесппоіоду їог
Сепе Тгапотег, Охіога Ргез55, ОхІога, Епдіапа (1994). Небіологічні частки (мікроснаряди), які можуть покриватися нуклетновими кислотами та доставлятися в клітини реактивною силою.
Типові частки включають частки, що містять вольфрам, золото, платину та подібні речовини.
Особлива перевага бомбардування мікрочастками, у доповнення до того, що вона є ефективним способом відтворюваної трансформації однодольних, полягає у тому, що не потребує ні виділення протопластів ні сприйнятливість до інфекції Адгобасівелит.
Ілюстративним варіантом реалізації способу доставки ДНК в клітини 7е6а тауз шляхом прискорення є біолістична система доставки с-часток, яка може використовуватися для проштовхування часток, вкритих ДНК, через сито, таке як сито з нержавіючої сталі або матеріалу Мугех, на поверхні фільтра, вкритого клітинами кукурудзи, які культивують у суспензії.
Система доставки часток, що підходить для використання у цьому винаході, являє собою гармату для прискорення гелієм РОЗ-1000/Не, що постачається компанією Віо-Най І арогаюгієв5.
Для бомбардування клітини у суспензії можуть бути сконцентрованими на фільтрах.
Фільтри, що містять клітини, які потребують бомбардування, розташовують на підходящій відстані нижче пластини, яка зупиняє мікроснаряди. Якщо потрібно, одне або більше сит також розташовується між гарматою та клітинами, що потребують бомбардування.
В альтернативному варіанті незрілі ембріони або інші клітини-мішені можуть розподілятися на щільному середовищі для культивування. Клітини, що потребують бомбардування, розташовують на підходящій відстані нижче пластини, що зупиняє мікроснаряди. Якщо
Зо потрібно, одне або більше сит також розташовують між пристроєм прискорення та клітинами, що потребують бомбардування. Завдяки тому, що застосування методик викладено у цьому документі, хтось може отримати аж до 1000 або більше фокусів клітин, транзієнтно експресуючих маркерний ген. Кількість клітин у фокусі, які експресують екзогенний генний продукт через 48 годин після бомбардування, часто знаходиться у діапазоні від однієї до десяти та у середньому складає від однієї до трьох.
При трансформації шляхом бомбардування хтось може оптимізувати умови культивування перед бомбардуванням та параметри бомбардування для виходу максимальних кількостей стабільних трансформантів. У цій технології важливими є як фізичні так і біологічні параметри бомбардування. Фізичні фактори - ті, які супроводжують маніпулювання осадженням
ДНК/мікроснарядах, або ті, які впливають на політ та швидкість як макро- так і мікроснарядів.
Біологічні фактори включають всі етапи, задіяні при маніпулюванні клітинами перед та безпосередньо після бомбардування, осмотичної корекції клітин-мішеней для допомоги у пом'якшенні травми, пов'язаної з бомбардуванням, а також природа трансформуючої ДНК, такої як лінеаризована ДНК або інтактні суперспіралізовані плазміни. Вважається, що маніпуляції перед бомбардуванням особливо важливі для успішної трансформації незрілих ембріонів.
В іншому альтернативному варіанті реалізації винаходу можуть бути стабільно трансформовані пластиди. Спосіб, що описує трансформацію пластид вищих рослин, включає доставку ДНК з використанням гармати для часток, що містять маркер, який селектується, і таргетуючих ДНК в геном пластид за посередництвом гомологічної рекомбінації (патенти 0.5 5451513, 00.5 5545818, 0.5 5877402, Ш.5 5932479 та УМО 99/05265).
Відповідно, припускається, що хтось може захотіти скоректувати різні аспекти параметрів бомбардування у маломасштабних дослідженнях для повної оптимізації умов. Перш за все, хтось може захотіти скоректувати фізичні параметри, такі як відстань проміжку, відстань польоту, відстань до тканини та тиск гелію. Хтось може також мінімізувати фактори, що зменшують травму шляхом модифікації умов, які впливають на фізіологічний стан клітин- реципієнтів і які, внаслідок цього, впливають на ефективність трансформації та інтеграції.
Наприклад, осмотичний стан, гідратація тканин та стадія субкультивування або клітинний цикл клітин-реципієнтів можуть бути скоректовані для оптимальної трансформації. Виконання інших рутинних коректувань стануть відомими фахівцям у цій галузі техніки у світлі цього опису.
Опосередковане бактеріями Адгобрасієйіцт перенесення є широко використованою системою для введення генів у рослинні клітини, тому що ДНК може бути введення у цілі тканини рослин, тим самим оминаючи потребу у регенерації інтактної рослини з протопласта.
Використання опосередкованих Адгобасієгіит інтегруючих векторів рослин для введення ДНК у рослинні клітини добре відомо у цій галузі техніки (див., наприклад, патенти О5 5177010, 05 5104310, 005 5004863, 05 5159135). Додатково, інтеграція Т-ДНК є відносно точним процесом, що призводить до незначних перебудов. Ділянка ДНК, яку потрібно перенести, визначається граничними послідовностями, а проміжна ДНК звичайно вставляється в геном рослини.
Сучасні трансформаційні вектори Адгобрасієгішт здатні до реплікації в Е соїї, також як в
Адгорасієгішт, дозволяючи виконувати зручні маніпуляції, як описано авторами (Кіеве еї аї., В:
Ріапї ОМА Іп'есійои5 Адепів, Нопп та зспеї, еаз., Зргіпдег-Мепад, Мем/ МоїКк, рр 179-203 (1985).
Більш того, технологічний прогрес щодо векторів для опосередкованого Аагобасієгійт перенесення генів покращив упорядкування генів і сайтів рестрикції у векторах для полегшення конструювання векторів, здатних експресувати різні кодуючі поліпептиди гени. Описані вектори мають зручні мультилінкерні ділянки, фланковані промотором та сайтом поліаденилювання для прямої експресії генів, які вставляють, кодуючих поліпептиди, та є підходящими для цілей цього винаходу. На додаток до цього, для трансформацій можуть використовуватися Аадагобасієгіит, що містять Ті-гени як наділені плечима так і не наділені плечима. У таких різновидах рослин, в яких ефективна опосередкована Аагорасієгішт трансформація, це є переважним способом через визначену природу перенесення генів, яка легко піддається впливу.
Трансгенна рослина, утворена при використанні трансформаційних способів з
Адгорасієгйт, як правило, містить єдиний генетичний локус на одній хромосомі. З такими трансгенними рослинами можуть поступати як з гемізиготними за доданим геном. Переважно використовувати трансгенну рослину, яка гомозиготна за доданим структурним геном; тобто трансгенну рослину, яка містить два доданих гена, по одному гену в однаковому локусі на кожній хромосомі хромосомної пари. Гомозиготна трансгенна рослина може бути отримана шляхом статевого схрещування (самозапилення) незалежної сегрегантної трансгенної рослини, яка містить єдиний доданий ген, пророщуванням кількох насінин, отриманих і проаналізованих результуючих рослин на предмет вмісту гена, що представляє інтерес.
Зо Повинно також бути зрозумілим, що дві різні трансгенні рослини також можуть схрещуватися для отримання потомства, яке містить два незалежно сегрегуючих екзогенних генів.
Самозапилення відповідного потомства може створити рослини, які гомозиготні за обома екзогенними генами. Мається на увазі також зворотне схрещування вихідної рослини та неспоріднене схрещування з нетрансгенною рослиною, так само як і вегетативне розмноження.
Опис інших способів розведення, які звичайно використовуються для отримання різних ознак і культур, можуть бути знайдені у автора Рейг, у: Вгеєдіпд Меїйодь5 їог Сийімаг ЮОемеІортепі,
Мїсох У єд., Атегісап босівєїу ої Адгопоту, Мадібзоп М/і5 (1987).
Трансформація протопластів рослин може бути досягнута з використанням способів, заснованих на осадженні фосфату кальцію, обробці поліетиленгліколем, електропорації та комбінаціями цих обробок. Використання цих систем до різних різновидів рослин залежить від здатності регенерувати такий конкретний рослинний штам з протопластів. Описані ілюстративні способи для регенерації зернових культур з протопластів (Еціїтига еї аї!., 1985; Тогіуата еї аї., 1986; Арашпіан еї а)ї., 1986).
Можуть також використовуватися інші способи трансформації клітин та включати, але не обмежуватися введенням ДНК у рослини прямим перенесенням ДНК у пилок, прямою ін'єкцією
ДНК у репродуктивні органи рослини або прямою ін'єкцією ДНК у клітини незрілих ембріонів після регідратації висушених ембріонів
Регенерація, розвиток та культивування рослин з протопластів-трансформантів єдиної рослини або з різних трансформованих експлантатів добре відомі у цій галузі техніки (Ууеі55Басі еї аї., в: Меїйод3з тог Ріапі МоїІесшіаг Віоіоду, Асадетіс Ргезз, Зап Оіедо, Саїї., (1988).
Цей процес регенерації і росту, як правило, включає етапи відбору трансформованих клітин, культивування цих індивідуалізованих клітин за посередництвом звичайних стадій ембріонального розвитку через стадію вкорінення ростків. Трансгенні ембріони та насіння регенеруюють подібним чином. Після цього отримані в результаті трансгенні вкорінені паростки вирощують у підходящому середовищі для вирощування рослин, такому як грунт.
Розвиток або регенерація рослин, що містять чужерідний екзогенний ген, добре відомі у цій галузі техніки. Переважно, регенеровані рослини є самозапилюючими, що забезпечує отримання трансгенних рослин. У протилежному випадку, пилок з регенерованих рослин схрещують з вирощеними з насіння рослинами агрономічно значимих ліній. | навпаки, пилок з бо рослин цих значимих ліній використовують для опилення регенерованих рослин. Трансгенна рослина за цим винаходом, що містить потрібну екзогенну нуклеїнову кислоту, культивується з використанням способів добре відомих фахівцю у цій галузі техніки.
Способи трансформування дводольних, головним чином з використанням бактерій
Адгорасієгішт Шшптеїгасіеєп5, та отримання трансгенних рослин опубліковано для бавовни (0.5 5004863, 0.5 5159135, Ш.5 5518908); сої (0.5 5569834, 0.5 5416011); капусти (0.5 5463174); арахісу (Спепо еї а1., 1996) та гороху (Огапі еї аї., 1995).
Способи трансформації зернових рослин, таких як ячмінь для введення генетичної варіації у рослині введенням екзогенної нуклеїнової кислоти та для регенерації рослин з протопластів або незрілих ембріонів рослин добре відомі у цій галузі техніки, див наприклад, патенти СА 2092588,
А 61781/94, А 667939, 05 6100447, РСТ/О59У7/10621, 005 5589617, 05 6541257 та УМО 99/14314. Переважно, трансгенні рослини ячменю отримують шляхом опосередкованих
Адгорасієгішт їштеїасієпе трансформаційних процедур. Вектори, що несуть потрібну конструкцію нуклеїнової кислоти, можуть вводитися у клітини ячменю, що регенеруються, тканини рослин, що культивуються, або експлантати, або у підходящі рослинні системи, такі як протопласти.
Клітини ячменю, що регенеруються, переважно виділяють з щитка незрілих ембріонів, зрілих ембріонів, отриманого з них калусу або меристематичної тканини.
Для підтвердження наявності трансгенів у трансгенних клітинах і рослинах, може проводитися ампліфікація полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР) або аналіз Саузерн- блотингу, використовуючи методи, відомі фахівцям у цій галузі техніки. Продукти експресії трансгенів можуть детектуватися будь-яким з різноманітних способів, у залежності від природи продукту і включають вестерн-блотинг та ферментний аналіз. Один особливо підходящий спосіб кількісного визначення експресії білків та детекції реплікації у різних тканинах рослин являє собою використання репортерного гена, такого як 55. Як тільки отримують трансгенні рослини, вони можуть вирощуватися для отримання тканин або частин рослин, які мають потрібний фенотип. Можуть бути заготовлені тканини рослин або частини рослин та/або зібране насіння. Насіння може служити джерелом для вирощування додаткових рослин з тканинами або частинами, які мають потрібні властивості.
Отримання мутантних рослин
Зо Існує багато методик, відомих у цій галузі техніки, які можуть використовуватися для отримання ячменю зі зменшеним вмістом гордеїнів методом мутування ендогенних генів гордеїнів, які включають без обмеження, метод ТІШІМО, використання цинк-пальцевої нуклеази, ТА -ефекторної нуклеази (ТАГЕМ) та коротких паліндромних повторів, регулярно розташованих групами (СК5РК).
ТІШІМа
Рослини за цим винаходом можуть отримувати з використанням процесу, відомого як
ТІССІЮО (індуковані таргетингом локальні порушення у геномах). На першому етапі отримують введенні мутації, такі як індуковані у популяції рослин зміни, що раніше не існували, в одній парі основ шляхом обробки насіння (або пилку) хімічним мутагеном, та потім розводять рослини до отримання генерації, в якій мутації будуть стабільно успадковуватися ДНК виділяють і збирають насіння від усіх представників популяції для створення джерела, до якого можна повторно отримувати доступ протягом тривалого часу.
Для аналізу ТІ. ІМО, розроблені ПЛР-праймери для специфічної ампліфікації єдиного гена- мішені, що представляє інтерес. Специфічність особливо важлива, якщо мішень є представником родини генів або частиною поліплоїдного генома. Далі, для ампліфікації ПЛР- продуктів з об'єднаної ДНК з багатьох окремих рослин можуть застосовуватися мічені барвником праймери. Ці ПЛР-продукти денатурують та вторинно відпалюють так, щоб дати можливість утворюватися некомплементарним парам основ. Місматчі або гетеродуплекси, обидва представляють типи однонуклеотидного поліморфізму (ОНП), що зустрічаються у природі (тобто кілька рослин з популяції з ймовірністю несуть такий поліморфізм), так і індуковані ОНП (тобто лише поодинокі окремі рослини з ймовірністю проявляють мутацію).
Після утворення гетеродуплекса ключовим моментом для виявлення ОНП, що раніше не існували, у межах популяції після використання методу ТІССІМО є застосування ендонуклеази, такої як Се! І, яка розпізнає і розщеплює некомплементарну ДНК.
З використанням цього підходу можуть проходити скринінг тисячі рослин для ідентифікації будь-якої окремої однонуклеотидної зміни, а також малих інсерцій і делецій (1-30 п.н.) у будь- якому гені або специфічній ділянці генома. Геномні фрагменти, що аналізують, можуть знаходитися у діапазоні будь-якого розміру від 0,3 до 1,6 т.н. При 8-кратному об'єднанні визначають фрагменти розміром 1,4 т.н (ігноруючи кінці фрагментів, де детекція. ОНП бо проблематична через шум) та 96 доріжок за один аналіз, ця комбінація дозволяє проводити скринінг аж до мільйону пар основ геномної ДНК у єдиному аналізі, що робить ТІ ГІМО високопродуктивною методикою.
Метод ТІСГІМО додатково описаний у статтях 5іаде та Кпашцї (2005) і Непікої еї аї., (2004).
На додаток до цього, цей метод дозволяє ефективно детектувати мутації, високопродуктивна технологія ТІСГІМО є ідеальною для детекції природних типів поліморфізму.
Отже, детальне дослідження невідомої гомологічної ДНК шляхом утворення гетеродуплексів з відомою послідовністю виявляє кількість та положення поліморфних сайтів. Ідентифікують як нуклеотидні зміни так і малі інсерції і делеції, що включають щонайменше деяку кількість типів поліморфізму, що повторюється. Цей процес був названий Есойіпа (Сопаї еї аї., 2004).
Кожний тип ОНП записується за його приблизним положенням у межах кількох нуклеотидів.
Таким чином, може бути досягнуто визначення кожного гаплотипу на основі його мобільності.
Дані щодо послідовностей можуть бути отримані з відносно малими поступово зростаючими затратами з використанням аліквот таких самих ампліфікованих ДНК, які використовуються для аналізу з місматч-розщепленням. Лівий або правий праймер для секвенування для єдиної реакції вибирають за його наближенням до поліморфізму. Програмне забезпечення секвенсера виконує множинне вирівнювання та виявляє зміну основ, яка у кожному випадку підтверджується полосою у гелі.
Метод Есоїіпуд може виконуватися з меншими затратами, ніж повне секвенування, у теперішній час цей метод використовується у більшості досліджень ОНП. Планшети, що містять упорядковані екотипові ДНК, можуть проходити скринінг простіше, ніж об'єднання ДНК з рослин, що мутували. Через те, що детекція проводиться на гелях з розрізненням майже до пари основ, а фонові патерни однорідні серед доріжок, то можуть співпадати полоси, які мають ідентичний розмір, таким чином виявлення і генотипування ОНП проходить за один етап. Отже, більш детальне секвенування за ОНП є простим і ефективним та досягає фактично більшого, ніж використання аліквот таких самих ПЛР-продуктів, що застосовуються для скринінгу, які можуть бути предметом ДНК-секвенування.
Редагування генома з використанням сайт-специфічних нуклеаз
При редагуванні генома застосовуються сконструювані нуклеази, що містять послідовності специфічних доменів, що зв'язують ДНК, гібридизовані з неспецифічним модулем, що
Зо розщеплює ДНК. Ці химерні нуклеази здатні створювати ефективні і точні генетичні модифікації індукуванням направлених розривів дволанцюгової ДНК, які стимулюють механізми клітини з репарації ендогенної клітинної ДНК для репарації індукованого розриву. Такі механізми включають, наприклад, негомологічне з'єднання кінців, що допускає помилки (МНЕ), та гомологічно направлену репарацію (НОК).
У присутності плазміди-донора з додатковими гомологічними плечима, НОК може приводити до введення одного або багатьох трансгенів для корекції або заміни існуючих генів. У відсутності плазміди-донора МНЕ.)-опосередкована репарація залишає малі інсерційні та делеційні мутації мішені, які викликають руйнування гена.
Сконструйовані нуклеази придатні для способів за цим винаходом включають цинк-пальцеві нуклеази (2ЕМ) та подібні активатору транскрипції (ТАГ) ефекторні нуклеази (ТАЇ ЕМ).
Як правило, нуклеази, які кодують гени, доставляються у клітини плазмідними ДНК, вірусними векторами або мРНК, що транскрибуються іп мйго. Використання флуоресцентних сурогатних репортерних векторів також дозволяє проводити збагачення 2ЕМ- та ТАЇГЕМ- модифіковані клітини. Як альтернатива системам доставки 2ЕМ-генів, клітини можуть контактувати з очищеними 2ЕМ-білками, які здатні перетинати клітинні мембрани та індукувати руйнування ендогенних генів.
Складні геноми часто містять багато копій послідовностей, які ідентичні або найвищою мірою гомологічні з ймовірною ДНК-мішенню, що потенційно призводить до нецільової активності та клітинної токсичності. Для вирішення цього питання може використовуватися структура (Мійег еї аї., 2007; 52с7ерек еї аї., 2007) та засновані на відборі підходи (ЮОсуоп еї аї., 2011; бицо сеї аї, 2010) для створення покращених гетеродимерів 2ЕМ та ТАЇЕМ з оптимізованою специфічністю розщеплення та зменшеною токсичністю.
Цинк-пальцева нуклеаза (2ЕМ) містить ДНК-зв'язуючий домен та ДНК-розщеплючий домен, причому ДНК-зв'язуючий домен містить щонайменше один цинковий палець та функціонально зв'язаний з ДНК-розщеплюючим доменом. Цинк-пальцевий ДНК-зв'язуючий домен знаходиться на М-кінці білка, а ДНК-розщеплюючий домен розміщений на С-кінці вказаного білка.
ЕМ повинна мати щонайменше один цинковий палець. У переважному варіанті реалізації винаходу 2ЕМ повинна мати щонайменше три цинкових пальця для того, щоб мати достатню специфічність, щоб бути придатною для направленої генетичної рекомбінації у клітині-хазяїні або організмі. Як правило, 2ЕМ, яка має більше трьох цинкових пальців, повинна мати пропорційно більшу специфічністю з кожним додатковим цинковим пальцем.
Цинк-пальцевий домен може походити з будь-якого класу або типу цинкового пальця. У конкретному варіанті реалізації винаходу цинк-пальцевий домен містить цинковий палець типу
Сів2Нівєг, який широко представлений у більшості випадків, наприклад, у цинк-пальцевих факторах транскрипції ТЕША або 5р1і. У переважному варіанті реалізації винаходу цинк- пальцевий домен містить три цинкових пальця типу Сіб2Ніб». Розпізнавання ДНК та/або специфічність зв'язування 2ЕМ може бути змінена для того, щоб провести направлену генетичну рекомбінацію у будь-якому вибраному сайті у клітинній ДНК. Такі модифікації можуть виконуватися з використанням відомих молекулярно-біологічних та хімічних методик синтезу (див., наприклад, статтю ВіБрікома еї аї!., 2002).
ДНК-розщеплючий домен 2ЕМ отримують з класу неспецифічних ДНК-розщеплюючих доменів, наприклад, ДНК-розщеплюючий домен ферменту рестрикції ІІ типу, такого як ЕокКіІ (Кіт еї а!., 1996). Інші підходящі ендонуклеази можуть включати, наприклад, Нпаї, Ніпап, Мой, Врмисі,
ЕсСОКІ, Ва та АМІ!.
Лінкер, якщо він присутній між розщеплюючим і розпізнаючим доменами 2ЕМ, містить послідовність амінокислотних залишків, вибраних таким чином, щоб результуючий лінкер був гнучким. Або, для максимальної специфічності до цільового сайту, створюють безлінкерну конструкцію. Безлінкерна конструкція має сильну перевагу для зв'язування та наступного розщеплення між сайтами розпізнавання, які знаходяться на відстані 6 п.н. Тим не менш, для довжин лінкерів між 0 та 18 амінокислотами у довжину 2ЕМ-опосередковане розщеплення відбувається між сайтами розпізнавання, які знаходяться на відстані між 5 та 35 п.н. Для даної довжини лінкерів буде існувати межа відстані між сайтами розпізнавання, яка узгоджується як зі зв'язуванням так і з димеризацією (Вірікома еї аї.,, 2001). У переважному варіанті реалізації винаходу відсутній лінкер між розщеплючим і розпізнаючим доменами, а цільовий локус містить сайти розпізнавання з двох-дев'яти нуклеотидів у зворотній орієнтації по відношенню один до одного, розділені спейсером з шести нуклеотидів.
Для того, щоб направити генетичну рекомбінацію або мутацію у відповідності з переважним варіантом реалізації за цим винаходом у хазяйській ДНК повинні бути ідентифіковані дві
Зо послідовності, що розпізнають ДНК, з цинковим пальцем з 9 п.н. Ці сайти розпізнавання повинні знаходитися в інвертированій орієнтації по відношенню один до одного та розділені близько 6 п.н. ДНК Потім створюють 2ЕМ розробкою та отриманням комбінацій цинкових пальців, які специфічно зв'язують ДНК у цільовому локусі, а потім зв'язуючи цинкові пальці з ДНК- розщеплюючим доменом.
Активність 2ЕМ може бути покращена за посередництвом застосування транзієнтних гіпотермічних умов культивування для збільшення рівнів експресії нуклеаз (Осуоп еї аї., 2010) та спільною доставкою сайт-специфічних нуклеаз з ферментами, що процесуються на кінцях ДНК (Сепо єї аї., 2012). Специфічність 2ЕМ-опосередкованого редагування генома може бути покращена використанням цинк-пальцевих ніказ (2ЕМ-ніказ), які стимулюють НОЕ. без активації механізму репарації, що допускає помилки МНЕ-/ (Кіт еї аї., 2012; Мапа еї аї., 2012; Натіге? єї аі., 2012; МеСоппеї! тій єї аї., 2009).
Подібна активатору транскрипції (ТАГ) ефекторна нуклеаза (ТАГЕМ) містить ТАЇ- ефекторний ДНК-зв'язуючий домен та ендонуклеазний домен.
ТАЇ -ефектори представляють собою білки патогенних для рослин бактерій, які ін'Є(кКюЮюТтьСсЯя патогеном у рослинну клітину, в якій вони переміщуються в ядро та функціонують як фактори транскрипції, активуючі специфічні гени рослин. Первинна амінокислотна послідовність ТАЇ - ефектору обумовлює нуклеотидну послідовність з якою вона зв'язується. Таким чином, цільові сайти можуть бути передбачені для ТАЇ -ефекторів, а ТАЇ -ефектори можуть конструюватися та створюватися з метою зв'язування з конкретними нуклеотидними послідовностями.
Гібридизовані з послідовностями нуклеїнових кислот, що кодують ТАЇ -ефектори, представляють собою послідовності, які кодують нуклеазу або частину нуклеази, як правило, неспецифічний розщеплюючий домен ендонуклеази рестрикції ІЇ типу, такий як ЕокКі (Кіт еї аї., 1996). Інші підходящі ендонуклеази можуть включати, наприклад, Ннаї, Ніпапп, Моа, Врмисі,
ЕсСоКІ, Ва та АМ/І. Той факт, що деякі ендонуклеази (наприклад, РОКІ) функціонують лише у вигляді димерів, може бути використаним для посилення цільової специфічності ТАЇ -ефектору.
Наприклад, у деяких випадках кожний мономер РОКІ може гібридизуватися з ТАЇ -ефекторною послідовністю, яка розпізнає різні послідовності ДНК-мішеней, та коли лише два сайти розпізнавання знаходяться у безпосередній близькості, приводить неактивні мономери до об'єднання для утворення функціонального ферменту. Якщо потрібне зв'язування ДНК для бо активації нуклеази може бути створений високоактивний сайт-специфічний фермент рестрикції.
Послідовність-специфічна ТАГЕМ може розпізнавати конкретну послідовність у попередньо вибраній цільовій нуклеотидній послідовності, що присутня в клітині. Таким чином, у деяких варіантах реалізації винаходу цільова нуклеотидна послідовність може скануватися на наявність сайтів розпізнавання нуклеаз, та на основі цільової послідовності може вибиратися конкретна нуклеаза. В інших випадках ТАГЕМ може конструюватися для таргетування конкретної клітинної послідовності.
Редагування генома з використанням програмованих РНК-направляємих ДНК-ендонуклеаз
Система з використанням коротких паліндромних повторів, регулярно розташованих групами (СКІЗБРК)УСав5, яка відрізняється від сайт-специфічних нуклеаз, описаних вище, є альтернативою 2ЕМ та ТАГЕМ в індукуванні направлених генетичних змін. У бактеріях система
СКІЗБРК забезпечує набутий імунітет проти проникнення чужорідної ДНК за посередництвом
РНК-направленого розщеплення ДНК.
Системи СКІ5БРЕК засновані на СКІБРЕ РНК (стеМА) та трансактивуючій РНК (ІгастеМА) для послідовність-специфічного сайленсингу проникаючої чужорідної ДНК. Існує три типи систем
СКІБРК/Са5: у системах І типу Саз9 служить РНК-направляємою ДНК-ендонуклеазою, яка розщеплює ДНК при направленому розпізнаванні сгеЕМА-мгастЕМА. Основи СКІ5РК РНК спарюються з ігастеМА з утворенням подвійної РНК-структури, яка направляє ендонуклеазу
Са59 до комплементарних сайтів ДНК для розщеплення.
Система СКІЗРК може переноситися у рослинні клітини спільною доставкою плазмід, що експресують ендонуклеазу Са5 та необхідні компоненти сгЕМА. Ендонуклеаза Са5 може перетворюватися у ніказу для забезпечення додаткового контролю над механізмом репарації
ДНК (Сопо єї а!., 2013).
Локуси СКІ5РК є відмінним класом коротких повторів послідовностей (55К), що перемежовуються, які спочатку були розпізнані у Е соїї (Ізпіпо еї аї., 1987; МакКаїа еї а!., 1989).
Подібні 55К, що перемежовуються, були ідентифіковані у бактеріях Наїіоїегах теаіетапві, зігеріососсив руодепез, Апараєпа та Мусобасієгійт шбегсціовів (Спгоепеп еї а!., 1993; Нов вї аї., 1999; Мазеропні евї а!., 1996; Моїіса еї а!., 1995).
Локуси СКІ5БРЕ відрізняються від інших З5К структурою повторів, які були названі короткими регулярно розділеними повторами (ЗК5ЕК) (Чапз5зеп еї аї., 2002; Моїса еї аї!., 2000).
Зо Повтори представляють собою короткі елементи, які зустрічаються у кластерах, що завжди регулярно розділені проміжними послідовностями постійної довжини (Мо)їіса еї аї., 2000). Хоча послідовності, що повторюються, є висококонсервативними серед штамів, кількість повторів, що перемежовуються, та послідовностей спейсерних ділянок відрізняється від штаму до штаму (мап Етбраєетп еї аї., 2000).
Звичайні структурні властивості локусів СКІЗРЕ описані у статті Уапзеп еї аї., (2002) такі як () присутність багатьох коротких прямих повторів, які не показують або проявляють дуже малу варіацію послідовностей у межах даного локусу; (ії) присутність спейсерних послідовностей, що не повторюються, між повторами подібного розміру; (ії) присутність звичайної лідерної послідовності з кількох сотень пар основ у більшості видів, які містять багато локусів СКІЗБРЕ; (ім) відсутність довгих відкритих рамок зчитування всередині локусу та (м) присутність одного або більше генів сав.
Як правило, СКІ5РЕ представляють собою короткі частково паліндромні послідовності з 24- 40 п.н., що містять внутрішні та кінцеві обернені повтори розміром аж до 11 п.н. Хоча були детектовані ізольовані елементи, у більшості випадків вони упорядковані у кластери з аж до 20 або більше на геном) одиниць, що повторюються, розділених унікальними послідовностями, що перемежовуються, з 20-58 п.н. У більшості випадків СЕІЗРЕ. гомогенні всередині даного геному, більшість з них є ідентичними Тим не менш, існують приклади гетерогенності, наприклад, у статті Агопаєа (Мо)їіса еї аї., 2000).
Як використовується у цьому документі термін «ген сазх» відноситься до одного або більше генів саб5, які у більшості випадків зчеплено асоційовані або близько розташовані або знаходяться по сусідству з фланкованими СКІЗРЕК локусами. Вичерпний огляд родини білків
Са представлений у статті Най еї а! (2005). Кількість генів саз5 у цьому локусі СКІЗРК серед видів може сильно варіювати.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1 Матеріали та методи
Рослинний матеріал
Лінія ячменю сорту Зіоор (дикий тип) отримана з австралійської колекції озимих зернових культур (м Темворт, Австралія). Лінії Кіз 56 (не експресуюча В-гордеїни) та Кіз 1508 (не експресуюча С-гордеїни та експресуюча меншу кількість Ю- та В-гордеїнів) (ої, 1973; ої, бо 1983) отримані зі скандинавського банку зародкової плазми (м Алнарп, Швеція). Лінія Кіхе 1508 є індукованим етиленіміном мутантом, що несе мутацію у гені м(узєЗа на хромосомі 5Н, яка зменшує накопичення С-гордеїнів. Кожна з цих ліній є загальнодоступною. Рослини вирощували в умовах теплиці при 25 "С вдень та 20 "С вночі, а зібране насіння перевіряли, щоб виключити контамінацію. Для експериментів по осолоджуванню та варінню пива рослини сортів Біоор, Кізо 56 та Кізо 1508 вирощували поруч у польових умовах на дослідній станції С5ІКО Гініндера, м
Канбера, та зібрали по 10 кг зерна кожного сорту. Зерно осолоджували та варили партії по 20 л пива з використанням стандартних методик.
Екстракція проламінів з муки
Для екстракції проламінів (спирторозчинних білків) перемелювали зерно у цільнозернову муку з використанням стандартних методик. Проламіни з промитої водою цільнозернової муки (10 г) розчиняли у розчині 55 95 (об./06.) пропан-2-олу (ступінь чистоти для ВЕРХ), 2 95 (мас./об.) дитіотреїтолу (ДТТ) інкубацією при 65 "С протягом 45 хв та осаджували двома об'ємами пропан- 2-олу при -20 "С протягом ночі. Осаджені проламіни розчиняли у розчині 8 М сечовини, 1 90
ДТТ, 25 мМ триетаноламіну-НСЇІ (рН 6) та очищували рідинною експрес-хроматографією білків (ЕРІС) на колонці Кезоцгсе КРС об'ємом 4 мл (ЗЕ Неайсаге, м Сідней, НПУ, Австралія) елююванням 30 мл лінійного градієнту (при 2 мл/хв) від З до 60 95 ацетонітрилу з 1 95 (06./06.) трифтороцтової кислоти (ТФО).
Метод підготовки зразків з використанням фільтрації (ЕА5Р)
П'ятдесят мкл екстракту гордеїнів переносили на фільтр РА Мапозер з номінальним відсіканням за молекулярною масою (НВММ) 10 кДа. Додавали 200 мкл 8 М сечовини (5ідта) у 0,1 М трис/НСІ рн 8,5 (розчин ОА) і отриману суміш центрифугували при 14000 об/хв протягом 15 хв при близько 20 "С. фільтрат з пробірки відкидали. До фільтруючого елементу додатково додавали 200 мкл розчину ОА та повторно центрифугували при 14000 об/хв протягом 15 хв.
Додавали 100 мкл розчину ІАА (0,05 М йодацетаміду в ДА) та зразок змішували при 600 об/хв у термозмішувачі установленому на 20 "С протягом 1 хв, а потім інкубували без перемішування протягом 20 хв. До фільтруючого елементу додавали 100 мкл розчину ЦА і центрифугували при 14000 х д протягом 15 хв Цей етап повторювали двічі. До фільтруючого елементу додавали 100 мкл 0,05 М МНАНСсО: (бікарбонат амонію, розчин АВС) у воді та центрифугували при 14000 х д протягом 10 хв. Цей етап повторювали двічі. Додавали 40 мкл розчину АВС з 15 мкл маточного
Зо розчину трипсину (1,5 мкг/мкл, бідта) і кожний зразок змішували при 600 об/хв у термозмішувачі протягом 1 хв. Фільтруючі елементи інкубували у вологій камері при 37 "С протягом 4-18 год для проходження ферментативного розщеплення. Фільтруючі елементи переносили у новий набір пробірок та центрифугували при 14000 об/хв протягом 10 хв.
Додавали 40 мкл розчину АВС та фільтруючі елементи центрифугували при 14000 об/хв 35 протягом 10 хв. Цей етап повторювали двічі. Фракцію фільтрату підкислювали додаванням 15 мкл 5 956 мурашиної кислоти та ліофілізували. Екстраговані висушені пептиди ресуспендували у мкл 0,5 956 мурашиної кислоти для проведення аналізу методом МЕМ.
Одержання сусла і пива
Ячмінь осолоджували у системі мікроосолоджування Джо Уайта у кількох баках на 800 г сировини. Режим замочування включав: 8 год вимочування, 9 год вистоювання, 5 год вимочування при 17 "С (5іІоор); 8 год вимочування, 10 год вистоювання, 5 год вимочування при 17 "С (Кізе 56) та 7 год вимочування, 8 год вистоювання, З год вимочування при 17 "С (Кізе 1508). Пророщування проходило протягом 94 год при 16 "С для сорту 5іоор та 15 "С для двох мутантів з делеціями гордеїнів Програма сушіння проходила протягом 21 год при температурі між 50-80 "С. Висушений солод затирали, як детально описано у статті СоЇдгаме еї аї (2012).
Після вказаного часу вистоювання для дії амілази затор переносили у бойлер і кип'ятили протягом 1 год для одержання сусла. Під час кип'ятіння кипляче сусло робили гірким за допомогою шишок хмелю до досягнення значень 21-22 ІВО. Сусло охолоджували протягом ночі при 20 "С, а потім ферментували з дріжджами Регптепіїв 05-05 при 18-20 "С до завершення бродіння через близько 2 тижні. Нефільтроване пиво переносили у бочонки та перед розливом у пляшки примусово насичували вуглекислотою.
Аналіз пива
Вибір 60 комерційних видів пива проведений, як перелічено у додатковій таблиці 1 статті
Соїідгаме еї аї (2012). З двох різних пляшок кожного виду трикратно відбирали зразки (1 мл) та проводили дегазацію під зниженим тиском для видалення СО». Відбирали аліквоти (100 мкл) дегазованого пива та відновлювали їх додаванням 20 мкл 50 мМ ДТТ під М2 протягом 30 хв при 60 "С. До цих розчинам добавляли 20 мкл 100 мМ йодацетаміду (ІАМ) та зразки інкубували протягом 15 хв при кімнатній температурі. До кожного розчину додавали 5 мкл 1 мг/мл трипсину (Зідта) або хімотрипсину (Зідта) і зразки інкубували при 37 "С протягом ночі. Розщеплений бо пептидний розчин підкисляли додаванням 10 мкл 5 95 мурашиної кислоти і пропускали через фільтр з відсіканням за ММ 10 кДа (Раїї, Австралія). Фільтрат ліофілізували, розчиняли у 1 95 мурашиній кислоті і зберігали при 4 "С до проведення аналізу.
Аналіз нерозщепленого сусла і пива
Сусло і пиво (0,1 мл), одержані з ячменю дикого типу (Зіоор) та мутантів з делеціями гордеїнів, пропускали через фільтр з відсіканням за молекулярною масою 10 кДа (Раї) центрифугуванням при 14000 об/хв протягом 30 хв для отримання пептидної фракції, придатної для аналізу ЖХ-МС/МС. Пептидну фракцію (10 мкл) аналізували на мас-спектрометрі О51аг
ЕпІйе.
МС з О-ТОГ
Зразки хроматографічно розділяли на системі для нано-ВЕРХ Зпітайд?и (Зпітаа?и Зсіепійіс, м Райдалмір, Австралія), використовуючи колонку Мудас М5 С18 300 А (150 мм х 0,3 мм) з розміром часток 5 мкм (Сгасе Оамізоп, м Дирфільд, США) з використанням лінійного градієнту 2-42 95 розчинника В протягом 20 хв при швидкості потоку З мкл/мл. Рухомі фази складалися з розчинника А (0,1 95 мурашиної кислоти) та розчинника В (0,1 96 мурашиної кислоти/90 95 ацетонітрилу/10 до води). Мас-спектрометр з квадрупольним часопролітним детектором для кількісного аналізу ОДТОЕ О51аг ЕІШЩе використовували у стандартному МС/МС інформаційно- залежному режимі збору даних з нано-електророзпилюючим джерелом іонізації. Оглядові МО- спектри збирали (Іт/2 400-1800) протягом 1 с наступними трьома МС/МС-вимірюваннями іонів- попередників з найбільшою інтенсивністю (10 імпульсів/друге порогове значення, заряджений стан від 24 до 5- та діапазоном мас для МС/МС т/72 100-1600) з використанням програми виробника «5таїгї Ехії». Родоначальні іони, що потрапили раніше, виключали з циклів збору даних МС/МС, що повторювалися, протягом 30 с (допустиме відхилення за масою 100 мдДа).
МС з лінійною іонною пасткою (потрійний квадрупіль)
Відновлені та алкільовані триптичні пептиди аналізували на мас-спектрометрі з ОТВАР
Арріїей Віозубієт5 4000 (Арріїей Віозубіет5, м Фремінгхем, Масачусетс, США), обладнаним джерелом іонізації тигром, що функціонувало у режимі генерації позитивних іонів. Зразки хроматографічно розділяли на НВЕРХ ЗпПітайд7и Мехега (Зпітайд7и) з використанням колонки
Рпепотепех Кіпеїех С18 (2,1 мм х 10 см) з лінійним градієнтом з 5-45 95 ацетонітрилу (АСМ) протягом 15 хв зі швидкістю потоку 400 мкл/хв. Елюент з ВЕРХ безпосередньо подавали на
Зо мас-спектрометр. Дані отримували та обробляли з використанням Апаїувзі 1.5 зоїймаге"М,
Аналізи з інформаційно-залежним збором даних (ІА) проводили з покращеним Мо- скануванням (ЕМ5) у діапазоні мас 350-1500 як оглядовим скануванням, так і з активізацією при зборі тандемних мас-спектрів. Відбирали два найбільш інтенсивних іона із зарядженим станом 2-5, який перевищив певне порогове значення (100000 імпульсів) і спочатку піддавали їх скануванню з покращеним розрізненням (ЕК) перед збиранням даних покращеного сканування продуктів (ЕРІ) у діапазоні мас 125-1600.
Аналіз мас-спектрів і пошук у базах даних
Для ідентифікації білків використовували програмне забезпечення РгоїеіпРіїої М 4.0 (Арріїєй
Віозузіет5) з алгоритмом Рагадоп. Дані тандемної мас-спектрометрії вивчали у порівнянні з даними триптичного або хімотриптичного розщеплень іп 5іїїсо білків Тгйісеае з баз даних Опіргої (версія 2011/05) та МСВІ (версія 2011/05). Усі параметри пошуку визначали як модифікацію йодацетамідом з алкілюванням цистеїнів з використанням як ферменту розщеплення трипсину або хімотрипсину. Модифікації встановлювали як набори модифікацій «опрацювання генерика» або «біологічний препарат», представлені з цим програмним пакетом, які містили 126 можливих модифікацій, наприклад, ацетилювання, метилювання та фосфорилювання. Набір модифікацій для опрацювання генерика містить 51 потенційну модифікацію, які можуть проходити в результаті підготовки зразків, наприклад, окиснення, дегідратація та дезамінування. Пептиди з одним пропущеним розщепленням були включені до аналізу.
Створення і використання спеціально розробленої бази даних для зернових культур
Спеціальну базу даних без резервування запасних білків насіння зернових культур створювали включенням всіх опублікованих білкових послідовностей з нуклеотидних елементів у МСВІ, індексів генів ТІСЕК або наборів транскриптів рослин ТІСК, що належать видам Тийісит,
Ногдецт, Амепа, бесаІє та Тийісозесаіє. Нуклеотидні послідовності для вищевказаних видів транслювали в шести рамках, обрізаних так, щоб містити лише саму довгу рамку зчитування.
Набір результуючих білкових послідовностей потім робили нерезервованим. Тільки послідовності зі 100 95 відповідністю від початку до кінця з'єднували разом для збереження усіх варіацій. Нарешті, ці файли фільтрували так, щоб зберегти лише елементи, що містили слова глютен, гліадин, глютенін, гордеїн, авенін або декалін. Проводили пошук даних тандемної мас- спектрометрії у порівнянні зі спеціальною базою даних зернових культур. бо Вирівнювання білків та ідентифікація прототипних пептидів
Вирівнювали всі відомі білки гордеїни у базі даних Опіргої та ймовірні білки гордеїни в базі даних ТІСК. Всередині кожної родини (В, С, О або у) пептиди, які були розповсюдженими, вибирали в якості представника родини. Для кожного пептиду визнали МКМ-переходи, в яких значення т/7 іона-попередника (01) базувалося на розмірі та очікуваному заряді, а значення т/2 фрагментарних іонів (293) передбачали з використанням шаблонів фрагментації та/або даних, зібраних у послідовностях операцій з визначення характеристик. У попередніх аналізах використовували аж до шести переходів, МЕМ-переходи деталізували та відбирали два кращих
МАМ-переходи на пептид для використання у кінцевому методі, причому найбільш інтенсивний
МАМ-перехід використовували як кількісний параметр, а другий найбільший інтенсивний перехід використовували як якісний параметр.
Мас-спектрометрія з МЕМ
Експерименти з МЕМ використовували для кількісного визначення триптичних пептидів, що походять з горденів. Для обох ІША- та МЕМ-ініційованих експериментів МС/МС швидкість сканування встановлювали 1000 Да/с та пептиди фрагментували у комірці зіткнень з газом азотом з використанням енергії зіткнення, що біжить, у залежності від розміру та заряду іона- попередника. Кількісне визначення пептидів гордеїнів досягли з використанням спланованих експериментів з МКМ-сканування, використовуючи вікно детекції на 120 с для кожного МАКМ- переходу і тривалість циклу 1 с. Перший квадрупіль використовували для вибору співвідношення маса-заряд (Іп/72) аналіту, так названого іона-попередника. Іон-попередник потім передавався у комірку зіткнень (другий квадрупіль). Відбувалася індукована зіткненнями дисоціація (СІЮ), що приводила до отримання фрагментованих іонів, які передавалися на третій квадрупіль. Друга стадія відбору за масою проходила специфічно, орієнтуючись на значення т/2 відомих фрагментованих іонів. Дві стадії відбору за масою відомі як О1 та О3, прив'язуючись до квадруполів, в які вони потрапляють. Таким чином, перехід від 01 до О3, відомий як МЕМ-перехід, є високоспецифічним та вибірковим для аналіту, що вибирається.
Відносне кількісне визначення гордеїнів
Відносне кількісне визначення кожного гордеїну проводили інтегруванням площі піку найбільш інтенсивного МКМ-переходу для кожного пептиду. Середню площу піків визначали отриманням середньої з двох повторностей інжекцій (у різні дні) з пляшок А та В (що
Зо представляють біологічні повторності). Результати представлені у вигляді відсоткового вмісту кожного білка гордеїну відносно середнього вмісту гордеїну у всіх видах пива, що містять глютен.
Приклад 2 Визначення характеристик гордеїнів в ячмінній муці
Гордеїни, екстраговані з ячмінної муки (сорт дикого типу 5ібор) солюбілізацією у спиртовому розчині, очищували ЕРІ С як описано у Прикладі 1. Очищені фракції гордеїнів відновлювали, алкілували та піддавали розщепленню трипсином або хімотрипсином. Після ферментативного розщеплення субфракцію до 10 кДа аналізували методом ЖХ-МС/МС для ідентифікації гордеїнів, що були присутні в очищеній фракції проламінів з муки, для отримання повного набору білків гордеїнів, які очікувано могли бути знайдені у пиві, звареному з цієї муки.
Використовуючи рівень хибнопозитивних результатів (РОК) 1 95, після розщеплення трипсином всього ідентифікували 144 білка, а після розщеплення хімотрипсином всього ідентифікували 55 білків.
У табл 1 перелічені білкові продукти гордеїнів, виявлені у муці після розщеплення трипсином. Серед виявлених найбільш розповсюджених білків були раніше опубліковані В3- гордеїн (Ме доступу РОб6471, КгівіоїПегзеп еї аї., 2000), у-3-гордеїн (Р8О198, Равоїї єї аї., 2010) та ймовірний у-1-гордеїн (Р17990, Сатегоп-Мій5 еї аї., 1988). Аналогічним чином виявили у надлишку ЮО-гордеїн (Опіргої: 2841 Е9, би еї аї., 2003). Інші виявлені менш розповсюджені білки включали два у-гордеїни та В1-гордеїн, які були відсутні як у базі даних МСВІ так і в Опіргої (табл 1). Ці білки ідентифікували пошуком у спеціально розробленій базі даних, що містить білки, що транслюються, зернових культур з нуклеотидних елементів у МСВІ, індексів генів ТІ або наборів транскриптів рослин ТІСЕ. Виявлено кілька пептидів, що відповідали ймовірним у- гліадину і глютенінам (з пшениці) та авеніноподібному білку-А (з пшениці та колінниці).
Повідомлялося, що авеніноподібні А-білки повинні бути присутніми у пиві (РісагіеПо еї аї., 2011) на основі даних детекції пептиду з 15 амінокислот (ФОССОРІГАОІЗЕОАК, 5ЕО ІЮО Мо: 5), що отримувався в результаті триптичного розщеплення полоси білка масою 16-17 кДа, виділеного електрофорезом з ДСН-ПААГ. Ця пептидна послідовність співпадала з послідовністю єдиного білка з ячменю при пошуку за допомогою ВГАБТр, разом з додатковим пептидом з 13 амінокислот (ак), співпавши з такою ж ймовірною білковою послідовністю (Опіргої: Е2ЕСО5).
При картуванні також виявлений пептид з 11 ак (ММ'ОТІ РЗМСК, 5ЕО ІО Мо: б), що відповідає 60 авеніноподібному А-білку (Опіргої О2А782) з Аедіюорз суїїпагіса (збиральна назва колінниця).
Подальший пошук у базі даних ЕЗТ(ТІСЕ) білків, що транслюються, виявив білок Н мцЇдаге, який пояснив присутність пептиду з 11 ак. На основі гомології між ймовірним авеніноподібним білком-
А та білками у-гордеїнів, вони були включені у подальші аналізи.
Ідентифікації за окремими білками вказали на присутність С-гордеїнів всередині фракції гордеїнів, однак, вирівнювання послідовностей відомих білків С-гордеїнів виявило відсутність сайтів триптичного розщеплення всередині цих багатих глютаміном білків. Внаслідок цього, хімотриптичні розщеплення фракції гордеїнів привело до ідентифікації С-гордеїнів з аж до 80 90 перекривання послідовностей (табл 2), підкреслюючи необхідність пошуку альтернативної стратегії розщеплення для визначення властивостей цього класу горденів.
Таблиця 1
Білки проламіни, ідентифіковані в очищеній ЕРІ С фракції ячмінної муки після розщеплення трипсином
Мо
Мо доступ Мо доступ . Перекриван-| Пепти
Опіргої 7-0... - 1 ВЕ454297 | ВЗ-торден'" 15703 |87 -:/ І|52 оРІ7Т990| 123464 | ---- | улорденї 12770 174723 1-0 - | ТАЗОЇ39 4513) угордеїняя 71895 455 2 щЩ - 24 040351) 122220129) - | ВЗ-торден" 15,55 |157 - о РОбА72| 123460 | - | Сторден" 14,56 |239 2 щ |4 ( о СТЕВІ6| 255348358) - | Влорден" 1400 |224 2-Й |22 о О2А?82| 122238432 | - | Авеніноподібний А-білок" 4,00 |144 |2 оБгХАНЄЇ 327365751| - | у-ладин" 1389 195 2 Щ 3 1-0... - | тА2г9452 4513 Вісордеїн'" 13,87 |522 2 |18 ( о РІ7991| 123461 | - | Сторден" 13,87 Щ|958 2 щЩ |З ( 1-0 Ї- | АШЯЗ33315 | уордеїняя 13,53 1991 ющ жЛ 19
О-гордеїн (подібний до овеуент| оговаивв 00 отннузвммє (200 609
ОЗМАРО| 122217636) - | Влорден" 12500 |217 -:: |8
В-гордеїн (подібний до вве! 010000 ловниуонммуть 200 2727
В-гордеїн (подібний до орав! 0100000 ловнюуонммує 200 192 я
О-гордеїн (подібний до оовезно твіввююе | оннузвммє (200 506 (о Б2ЕСОБ| 326501830| - | Авеніноподібний А-білок"ї2,00 |16б2 |2
Перелічені номери доступу для кожного білка: " вказує на те, що ідентифікація білка підтверджена анотованим доказом транскрипта (Опіргою); "7" вказує на те, що ідентифікація білка підтверджена ймовірним білком, що походить з генома (ОпіргоюЮ; 7" вказує на те, що ідентифіковано новий білок при пошуку у базі даних у порівнянні з неанотованими Е5Т з тав
Таблиця 2
Білки проламіни, ідентифіковані в очищеній ЕРІ С Фракції ячмінної муки після розщеплення хімотрипсином
Мо доступу! Ме доступ Мо доступ й Перекриван- | Пептид о сой1210 | 75102504) - | Сторден" | 50ЛО| 887 | 44 о РВОТОВ | 1708280 ) ТА29416 4513| утордеїн-3 / 3638| 699 / 19 оюе| тю 1000000 зе сві ве 1-1 - | ТАЗОТ39 4153) у-гордетн'ї 2131592 о РОБАТО | 123458... - | Віторден | 7103 251 | 14 о СОРІМБ | 110832715) -- | В-торден" | 1000| 624 | 22 о РІВ9О | 123464 | - | уторденї" 8001 509 | 7 о РІ992 | 123462 | - | Сторден" | 602| 651 | 7 совлне| теено ві ев до о-гліадину) 7-0 - | тА29452 4513) Вістордеїн"" | 2и13| 5954 | 14 о СТ7ЕВІ6 | 255348358)..// - | Вторден" | 202| 69 | 15
НИЖИШЕШНСТтоЬ С МННИСЛН СНИ гордеїну 7-3. юр - | валбеза Ро) ВЗ-сордеїн | 200; 85 | 32 77111171 віз5о745 Р1 | ВЗ-ордеїну? | 200; 336 | 15
В-гордеїн (подібний рент ні опе! яке 00 ГК ово
ОБРИ42 56126405 до глютеніну з 2,00 22,6
НММ) 7 (о смоез55| 57118089| - | ВЗ-торден" | 200| 240 | 6
Перелічені номери доступу для кожного білка: " вказує на те, що ідентифікація білка підтверджена анотованим доказом транскрипта (Опіргою); "7" вказує на те, що ідентифікація білка підтверджена ймовірним білком, що походить з генома (ОпіргоюЮ; 7" вказує на те, що ідентифіковано новий білок при пошуку у базі даних у порівнянні з неанотованими Е5Т з тав
Приклад З Визначення властивостей гордеїнів у суслі і пиві
Потім проводили аналіз сусла - рідини, екстрагованої у процесі затирання під час варіння пива, і пива та ідентифікували подібний набір проламінів (табл. 3). Усього ідентифікували 27 білків у суслі та 79 білків у пиві, найбільше розповсюджені білки були білком 1 неспецифічного перенесення ліпідів (СТР) та інгібіторами а-амілази/трипсину (СМа, СМБ, СМа). Білки глютени, ідентифіковані у суслі, включали авеніноподібний А-білок (18 пептидів), у-гордеїн-3 (10 пептидів) та О-гордеїн (4 пептиду), які раніше виявили у збагаченій фракції горденів. Однак, примітно, що 250 965 пептидів були семі-триптичними (розщепленими на одному кінці за сайтом, що відрізняється від І уз/Агу), що передбачає значну деградацію білків, що пройшла протягом процесу варіння пива. Виявлений авеніноподібний А-білок (Мо доступу у базі даних СепВапк
ВЕ195337), ідентифікований при пошуку у базі даних Е5БТ, з »60 95 перекриванням послідовностей (12 пептидів), збільшуючи достовірність цієї ідентифікації білка.
Примітно, що у пиві до порогу виявлення були відсутніми білки С-гордеїни, але щоб переконатися, що це не хибнопозитивний результат з причини низької кількості триптичних сайтів, проводили хімотриптичне розщеплення, яке підтвердило відсутність у пиві С-гордеїнів (табл. 3). Переважно, відсутність С-гордеїнів пов'язано з їх нерозчинністю у воді С-гордеїни
Зо складаються з багатьох октапептидних повторів з консенсусною послідовністю РООРЕРОС (ЗЕО ІО Мо: 7), що надають їм високу нерозчинність. У суслі ідентифікували багатьох з продуктів деградації С-гордеїнів, але вони не зберігалися після етапів варіння і фільтрації, що приводять до одержання пива.
Для того, щоб охарактеризувати пептидні фрагменти, сусло і пиво пропускали через фільтр з відсіканням за молекулярною масою 10 кДа та аналізували без ферментативного розщеплення. При 10-ПААГ аналізі виявили, що етап фільтрації був ефективним для видалення білків з пива МС-аналіз виявив присутність кількох усічених продуктів гордеїнів або продуктів гордеїнів, що деградували. У табл 4 перелічені ідентифіковані пептидні фрагменти.
На додаток до пептидів гордеїнів у пиві і суслі ідентифікували пептиди, що походять з більшої кількості білків ячменю, які включали серпін-274, білок 1 неспецифічного транспорту ліпідів, а- амілазу, В-амілазу, гордоіндоли (В1, В2) та САРОН (перелічені у табл. 4 та додатковій таблиці 2 у статті СоЇдгаме еї аї., 2012). Цікаво, що була велика кількість фрагментів С-гордеїну, виявлених у суслі, при лише слідовому вмісті пептидів С-гордеїнів, виявлених у пиві.
Визначення властивостей пива у відсутності ферментативного розщеплення чітко демонструє, що у доповнення до інтактних гордеїнів була присутня велика кількість фрагментів гордеїнів, що частково деградували, і вони також можуть впливати на целіакальну токсичність.
Багато з цих фрагментів пептидів містили серії Сіп та Рго, які можуть викликати імунологічну відповідь щодо целіакії. Приклади виявлених потенціальних імуногенних пептидів включають
ЕМОРОООРЕРІГОРНОР (авеніноподібний А-білок; СепВапк: ТАЗ1086, ЗЕО ІЮ Мо: 8),
МРЕОРООРЕРМООРТ (у-1-гордеїн; Р1І7990, ЗЕО ІО Мо: 9), І ЕВРООЇ ЕРОМ/ОРІ РООРР. (у-3- гордеїн; РВО198, ЗЕО ІЮО Ме: 10) та ЦІРООРООРЕРІГОРНОР (С-гордеїн; Р17991, 5ЕО ІО Ме: 11), де підкреслена послідовність має високу гомологію з імуногенними пептидами, опублікованими раніше (Туе-Оіп еї а!., 2010; Капіепбега еї а!ї., 2006).
Таблиця З
Проламіни, ідентифіковані у суслі (розщеплені трипсином)
Ме Мо Мо доступу 7 МОВ лев Назва Оцінка | Перекривання| Пептиди
Опіргої
А-білок
РВОТ9В | 1708280 0 ДЛЯ гордеїн-З 18,05
ВЕЇ95337 | Мвеніноподібний | 44 00 47,0
А-білок
Проламіни, ідентифіковані у пиві (розщеплені трипсином)
Мо . доступу Мо лову Мо поступу Назва Оцінк Перекриванн Пептиди
Опіргої
РОБАТІ 18914 | НУВЗНОВО 17,81| 246 | 9
РІ7990 | 123464 | - | уторденї" | 1698. 319 | 9 ілок сСдез55| 57118089 - | ВЗторден" | 548| 126 | 6
О-гордеїн (подібний 0941 5 75250230 до глютеніну з 2,00 4,6 вВММ)
Проламіни, ідентифіковані у пиві (розщеплені хімотрипсином)
Мо . доступу Мо лову Мо поступу Назва Оцінк Перекриванн Пептиди
Опіргої сдоо2г2 | 829269 | - | Вілорден" | 13,80, 514 | 9
Рі7990 | 123464 | - | уторденї" 559) 2 щ 225 | З
В-гордеїн (подібний
ЕБАТИаб до глютеніну з 2,00 23,2 5
НММ) 7
ОбЕЕЛОЇ /- | р - | уторден3" | 200) 258 | г
Перелічені номери доступу для кожного білка: "7 вказує на те, що ідентифікація білка підтверджена анотованим доказом транскрипта (піргою; "" вказує на те, що ідентифікація білка підтверджена ймовірним білком, що походить з генома (піргоЮ; "7" вказує на те, що ідентифіковано новий білок при пошуку у базі даних у порівнянні з неанотованими Е5Т з тав
Таблиця 4. Пептиди, що походять з білків гордеїнів, виявлені у субфракції пива 10 кДа
Епітопи, відмічені жирним шрифтом, показують високу гомологію послідовностей з епітопами глютену, які розпізнані МАБ Мепаеє КА, у порівнянні з протамінами жита (ФОРЕР (5ЕО ІЮ Мо: 12), ООФОРЕР (ЗЕО ІО Мо: 13), ГОРЕР (ЗЕО ІО Ме: 14), ОЇ РЕР (ЗЕО ІЮ Мо: 15))2 Ці пептиди можуть викликати імунну відповідь у пацієнтів з ЗЦ.
Таблиця 4
Назва? Достов Пептид т/2 Маса Ат і (м.ч.) вн в РУМПРООГ СО! РУУЗТО (5ЕО І Ме: 16) 891,99 | 1781,97| 13,41 199 Її МУроОгМСОРМУБТОІ. (ЗЕО ІО Ме: 17 870,45 | 1738,89| 19,72 199 Її ММрООГМСОРМЗТО (5ЕО ІЮ Ме: 18 813,93 | 1625,85 010099 | ММрООГ МОЇ РМУ (ЗЕО ІЮ Мо: 19) 691,38 | 1380,74 1199 | ОГМСОГРМУБТОЇ (5ЕО ІЮ Мо: 20) 649,85 | 1297,68| 16,25 11111199 | ОГМСОГРУУ5ТО (5ЕО ІЮ Ме: 21) 593,30 | 1184,59| 22,03 010099 | ГМООГРМУВЗТОГОМ (5ЕО І Ме: 22 715,37 | 1428,73| 12,46 010099 | ГМООГРМ/БТОЇ. (5ЕО ІЮ Мо: 23 585,83 | 1169,65 010099 | ГМООГРМУБТО (5ЕО ІЮ Ме: 24) 529,28 | 1056,54| 14,86 010099 Її МООГРМБТОГОМ (5ЕО 0 Ме: 25) 658,83 | 1315,64| 14,06 010099 | МО РМ/БТОЇ (5ЕО ІО Ме: 26) 529,28 | 1056,54| 16,75 в (БоГААОГРАМСВІЕСВІГекомАєї (ЗЕО1О Ме: | ввумі | 177280! 22,05 вв Ми гоОтЕМРВКОВЕУРООТАНР (БЕОІЮ 927,12 | 277835 трвртовн ЩЕ ЕМ РОООАОЕКУМСЗ (5ЕО ІО Ме: 29) 838,46 | 1674,90 1099 | РМГРОООДОБЕ (5ЕО ІО Мо: 30) 603,31 | 1204,61| 12,54 1199 Ї АІММОООМОООМОНОРЕ (5ЕО І Ме: 31 899,43 | 1796,85| 28,60 199 | СЕВРООГЕРОМ/ОРІ РООРР (5ЕО ІЮ Ме: 32 776,41 | 2326,19| 12,21 1099. Її СЕРОМОРІ РООРР (5ЕО І Ме: 33) 788,41 | 1574,82 199. Її СООГСОСМРІО!. (5ЕО ІЮ Ме: 34) 663,85 | 1325,69| 16,98 010095 | ММОБІМОТ (5ЕО ІЮ Ме: 35) 458,27 | 914,53 тота ЩЕ ГООРОНОЕРОРТООЕРОВРП (ЗЕО О Ме: 36) | 777,39 | 2329415 1199. ЇЇ МРЕОРООРЕРМООРТ (5ЕО ІЮ Ме: 37 935,93 | 1889,84| 16,15 199 | СММОРООГАОМЕ (5ЕО ІО Ме: 38) 664,31 | 1326,61| 41,08 1199 ЇЇ ІДОРОНОЕРРОРТООЕРОРР (5ЕО ІЮ Мо: 39) 691,33 | 2070,98| 9,90
Авеніноподібний
А-білок ЕМОРОООМРМЕЇ!ТЕ (5ЕО І Ме: 40) 834,94 | 1667,87| 19,61
ВЕ195337 7 10099 ЇЇ ЕМОРОООМРМЕЇ (5ЕО І Мо: 41 706,37 | 1410,72| 18,78 суоодеїн ПШРООРООРЕРІ ОРНОР (5ЕО ІЮ Ме: 42) 1053,59| 2105,17| 14,82 11199 | ПРООРООРЕРГОРНОР (5ЕО ІЮ Ме: 43) 997,05 | 1992,08| 13,40 повен МОМОІРЕМНРЗІ (ЗЕО ІЮ Ме: 44) 682,38 | 1362,74| 16,22
Авеніноподібний
А-білок (Є2ЕСО5 ЗЕСОРОООМРМЕММЕ (5ЕО ІО Ме: 45) 865,43 | 1728,84| 13,0
С-гордеїн ПРООРЕРГОРОРЕРООРООРІ РОРООР (5ЕО 0400537 І Ме: 46) 1081251 3240,73| 11,08 стае зжх ІРОРО|ДезаїОРЕРООРР (5ЕО ІЮ Ме: 47) 808,40 | 1614,79| 30,53 а Капієпрего еї а! (2006). р. Перелічені номери доступу для кожного білка: 7" вказує на те, що ідентифікація білка підтверджена анотованим доказом транскрипта (Опіргою; 7" вказує на те, що ідентифікація білка підтверджена ймовірним білком, що походить з генома (Опіргої); 7" вказує на те, що ідентифіковано новий білок при пошуку у базі даних у порівнянні з неанотованими Е5Т з ТІК
Приклад 4 Відносне кількісне визначення гордеїнів у пиві методом мас-спектрометрії з МЕМ
Визначення протеомних властивостей очищених гордеїнів і пива у Прикладах 2 та З дало можливість встановити основні білки гордеїни, що були присутні у ячмені. Ідентифікували метод моніторингу множинних реакцій (МКМ) як корисний інструмент для кількісного визначення пептидів та білків. У цьому методі після триптичного розщеплення білків протеолітичні фрагменти хроматографічно розділяли методом ВЕРХ та аналізували методом мас-
спектрометрії з МКМ. Перший квадрупіль (01) вибирав значення першого пептиду т/7 (маса попередника) та передавав цей іон у комірку зіткнень (02). Індукована зіткненнями дисоціація приводила до отримання серій фрагментарних іонів, пов'язаних з амінокислотною послідовністю протеолітичних фрагментів. Потім діагностичні фрагментарні іони відбирали у третьому квадруполі (03) та передавали на детектор, що дозволяв кількісно визначати пептиди, що представляють інтерес. Як правило, застосовували три МЕКМ-переходи на пептид та аналізували щонайменше два пептиди на білок.
З кожної з родин білків вибирали одну ізоформу для моніторингу вмісту глютену у сортах пива, зварених з селективно-виведених ліній ячменю (див нижче). Для розробки кількісного аналізу вибирали множину триптичних пептидів (22 пептидів/білок). У дослідницьких експериментах, в яких ці пептиди були раніше виявлені, т/7 пептиду та інформацію про фрагментарний іон використовували для визначення у передбаченому МЕМ-переході. Набір пептидів, які спочатку не були ідентифіковані, включали у МЕМ-аналіз таким чином, щоб використовувалося мінімум два пептиди на білок. У таких випадках значення значення часу утримування не були відомі, і не можна було спланувати МЕМ-переходи в експериментах першого проходу. Визначали значення часу утримування пептидів та використовувалися у наступних експериментах спланованих МКМ-переходів.
Пиво, одержане з єдиного елітного австралійського пивовареного ячменю ("Біоор"), використовували для розробки і вдосконалення методу МКМ, оскільки воно містило повний набір білків гордеїнів, тоді як варіанти ячменю (Кіз 56 та Кібзе 1508), як очікувалося, мали низький вміст або були позбавлені В- та С-гордеїнів. Коли види пива зі зразків зерна ячменю дикого типу та двох мутантних за гордеїнами сортів зерна ячменю (Кіз 56 та Кізе 1508) проаналізували з використанням МКМ-аналізу, у пиві з ячменю дикого типу було чітко виявлені вісім відібраних пептидів (три МЕМ-переходи на пептид). У пиві з Кіз 56 виявлено близько трьохкратне зменшення кількості пептидів ЮО-гордеїнів, а пептиди В-гордеїнів до порогу виявлення були відсутніми. У пиві з Кіз 1508 виявлено додаткове зменшення кількості кожного виміряного пептиду, але виявлено слідову кількість авеніноподібного А-білка.
Відтворюваність аналітичного методу оцінювали дослідженням пива з одного сорту ячменю ("Біоор"). По-перше, пиво піддавали кільком циклам заморожування-відтаювання (будь-яка
Зо кількість з 1, 10, 20 або 50 циклів) і не виявили статистично значимої різниці (коефіцієнт варіації,
КВ, «15 95) для площ піків для кожного з МЕ М-переходів, що проходили моніторинг, навіть після 50 циклів. По-друге, ефективність розщеплення досліджували у шести повторностях розщеплень, що дали КВ «1595. Аналітичну відтворюваність оцінювали проведенням інжектувань чотирьох повторностей для кожного розщеплення з КВ «15 95. Нарешті, оцінювали варіацію вмісту гордеїнів між двома різними пляшками пива і знайшли її рівною «10 Ор.
Аналіз комерційних сортів пива
Провели додаткову валідацію методу МКМ для кількісного визначення гордеїнів у пиві аналізом вмісту глютену у виборці з 60 комерційних видів пива, включаючи види пива, марковані як такі, що мають низький вміст глютену та безглютенові. Дубльовані зразки з окремих пляшок обробляли для відновлення, алкілування і розщеплення (Приклад 1) та аналізували методом мас-спектрометрії з МЕМ На фіг. 2 показано відносний кількісний вміст авеніноподібних А-білків (А), В-гордеїнів (В, С), О-гордеїнів (0) та у-гордеїнів (Е) у комерційних видах пива у порівнянні з пивом зі Біоор. У порівнянні з середніми значеннями для безглютенових видів пива у комерційних видах пива виявлено варіювання у типі (присутність родин гордеїнів) та кількості (між 1-380 95 у порівн з середнім для будь-якого заданого білка гордеїну). Вісім видів пива (МоМо 17, 47, 49, 50, 51, 52, 58 та 60) були марковані як безглютенові, оскільки вони зварені з солоду сорго, тефу, рису, проса або кукурудзи. У цих зернових культурах відсутні білки глютени, що присутні в ячмені і пшениці МКЕКМ-аналіз підтвердив, що вони були позбавлені вмісту білків гордеїнів та шуканих білків, споріднених гордеїнам (авеніноподібний А-білок). Види пива 17 та 50-52 виготовлені на основі сорго, на пиві 47 не вказано з чого воно було виготовлено, пиво 49 виготовлене з проса, пиво 58 зварене з солоду сорго, тефу і рису, а пиво 60 було пивом не зернового походження. При перевірці двох видів пива (57 і 59) вони були класифіковані як такі, що мали низький вміст глютену («10 м.ч.,, відносний вміст гордеїну не відрізнявся від середнього вмісту гордеїну серед цього діапазону досліджених видів пива. У пиві 57 виявлено низький вміст авеніноподібного А-білка (50 95 у порівн з середнім), але неочікувано виявлено значні рівні пептидів, що походять з В1- (5300 95 у порівн з середнім), О- («105 95) та уЗз-гордеїнів (62 95). У пиві 59 виявлено низькі, але значні рівні В1-, О- та у-гордеїнів (55595, 4295 та 9295, відповідно) та еквівалентний вміст авеніноподібного А-білка у порівнянні з виявленими у видах пива, що містять глютен. бо Висновки
Види пива, виготовлені з ячменю, містили глютен, що походить із зерна, яке використано у процесі варіння пива. Рівень глютену у пиві може вимірюватися з використанням ІФА, однак, існує багато обмежень, пов'язаних з точним вимірюванням вмісту гордеїнів з використанням технології ІФА. У вищевказаних Прикладах було розроблено мас-спектрометричний аналіз для визначення властивостей повного набору гордеїнів в очищених препаратах гордеїнів, сусла і пива та проведення ідентифікації найбільш розповсюджених білків горденів. Аналіз з використанням мас-спектрометрії був робастним та чутливим для вимірювання гордеїну (глютену) у муці, суслі і пиві та міг легко застосовуватися для солоду.
Приклад 5 Ідентифікація нульової мутації в гені НоїЗ ячменю
Поліпептид Ю-гордеїну ячменю масою 105 кДа кодується геном НоїЗ на довгому плечі хромосоми 1Н (Си еї аї., 2003). Дика раса ячменю, позначена ЕїШПіоріап К118, ідентифікована як така, що не накопичує Ю-гордеїни (Вгеппап еї аї., 1998), та отримана із загальнодоступної колекції зародкової плазми у Центрі відкритих колекцій Джона Інеса (Ме доступу 3771). Ця лінія була дикою расою ячменю, що у найвищій мірі не підходяща для комерційного виробництва зерна
Зерно ЕШіоріа К118 вирощували у теплиці. Виявлено, що отримані рослини сегрегували на 2-рядний і б-рядний фенотипи та на чорне пігментоване насіння і зелене насіння. Вибирали дворядну лінію, яка продукувала зелене насіння, і схрещували її з сортом 5іоор. Відбирали половини зерен ЕГ2, які були негативними за продукцією Ю-гордеїну. Рослини цієї лінії зворотно схрещували з диким типом Зіоор, і знову відбирали рослину Е2, яка була нульовою за О- гордеїном. Цю рослину зворотно схрещували з сортом 5іоор і рослину-нащадок знову зворотно схрещували для отримання лінії ВСо, яка була негативною за продукцією ЮО-гордеїну у генетичному оточенні, що склало близько 87,5 95 генома Зіоор.
Ген, кодуючий ЮО-гордеїн, ампліфікували з геномної ДНК, виділеної з кожної з негативних за р-гордеїном рослин 5іІоор ВС», отриманих з сорту ЕІШПіоріа К118 та дикого типу Зіоор. Виділення провели методом ПЛР у стандартних умовах і створили серії з З фрагментів, що перекриваються. Пари праймерів, використані при ампліфікації були такими:
Фрагмент 1 5 Огорї ЗПАСАСАТАТТСТОССАААДАСССС (ЗЕО ІО Мо: 60) та
Коо) З ЮОгор3з АССДОСОСОАСОСАТТАССОС (ЗЕО ІЮ Мо: 61)
Фрагмент 2 5 Огорїюї ССАСБАТСААТТСАТТОАСАСТССАСС (ЗЕО ІО Мо: 62) та
З Огор! СТТОТССТОАСТОСТОСОСАСААА (ЗЕО ІЮ Мо: 63)
Фрагмент З 5 Огор2 ОПСААСАДОСАСАСТАСССААСТАТО (5ЕО ІЮ Мо: 64) та
З" Огор2 ОПСТОСАСААТОАДОСТОАСАСАТОТАС (ЗЕО ІЮ Мо: 65)
Очищали продукти ампліфікації та визначали нуклеотидну послідовність з кожної рослини.
Підібрана послідовнісь з сорту 5іоор була 2838 п.н довжиною (ЗЕО ІЮ Мо: 72), а послідовність, отримана з ЕвШПіоріа Е118, була 2724 п.н довжиною (ЗЕО ІО Ме: 73). Ймовірний стартовий кодон трансляції АТО для обох білків знаходився у положенні 398-400 відповідних послідовностей.
Для сорту Зіоор кодон термінації знаходився у нуклеотидному положенні 2641-2643, кодуючому білок з 747 амінокислотних залишків. Аналіз послідовності з сорту Е(Піоріа К118 виявив, що у порівнянні з Біоор була зміна С на б у положенні 848 (положення 450 відносно стартового кодону), яка введена у стоп-кодон ТАС всередині рамки у ген НогЗ3, що приводило до усічення у білку поліпептиду у положенні 150 (фіг 3). Це усічення поліпептиду ЮО-гордеїну знаходилося перед доменом багатим проліном та глутаміном, який містить епітопи, ідентифіковані як імуногенні для прояву целіакії.
Ця нуклеотидна заміна ліквідує сайт Крпі, який був присутній у нуклеотидній послідовності дикого типу у сорті Біоор, та дозволила розробити кодомінантний маркер САР5 З цією метою ампліфікували фрагмент ДНК з 272 п.н з використанням праймерів 5' Юхор-маркер (ОССААТАСОАССАССАААС, 5ЕО ІО Мо: 66) та 3' Огор-маркер (ССТСТОТССТООСТТОТТОТС,
ЗЕО ІЮ Мо: 67) (фіг. 4). Продукти ампліфікації потім інкубували з ферментом рестрикції Крпі та проаналізували електрофорезом на агарозних гелях. Фрагмент з ячменю дикого типу Зіоор розщеплювали Крпі для отримання двох фрагментів з 164 п.н та 108 п.н. У протилежність цьому, фрагмент з 272 п.н з О-нульового сорту ЕШіоріа К1І18 не розщеплювався. Отже, цей спосіб чітко розпізнавав алелі дикого типу та нульові алелі гена, що кодує ЮО-гордеїн.
Приклад 6 Ідентифікація молекулярного маркера для делеційної мутації у локусі Ног2 ячменю
Локус Ног2 на короткому плечі хромосоми 1Н у ячмені містить родину з близько 20-30 генів, бо кожний кодує В-гордеїн у діапазоні розмірів близько 36-45 кДа (Апдегзоп еї аї., 2013). Лінія Кізо
56 є індукованою гама-випромінюванням мутацією, яка має делецію з близько 86 п.н., включаючи всі або майже всі гени В-гордеїнів Кгеїв5 єї аї., (1983). Цю мутацію використовували для створення подвійної мутації Ног2-Іузза, як раніше описано у статті Таппег еї аїЇ (2010), що експресує значно зменшені рівні всіх горденів.
Конструювали молекулярний маркер та випробували його для виявлення локусу Ног2 дикого типу та розрізнення його від Ног2-делетованого локусу наступним чином з використанням стандартних умов ПЛР. Відсутність полоси ПЛР для В1-гордеїну з 800 п.н було діагностичною ознакою відсутності (делеції) локусу Ног2, тобто наявності мутантного алеля
Ногг2 Пари праймерів, використані при ампліфікації були такими:
З ВІ Гор ТСССАСОСАТССТОТАСААСО (ЗЕО ІЮ Мо: 68) 5 В1 Гор СААСААТСААСАССТТСОСТС (ЗЕО ІЮ Мо: 69)
Для кожного зразка ДНК також проводили контрольну реакцію ПЛР, яка відтворювала характерну полосу ПЛР з 450 п.н., яка вказувала на присутність локусу гама-гордеїну і підтверджувала, що якість зразка ДНК була достатня для реакції на Ног2, використовуючи пари праймерів: 5 гама Гор З СВАСААДОСТАССАТТАСТССАС (ЗЕО ІЮ Мо: 70)
З гама З цілий АСЗТААСААТОААОСТССАТСО (5ЕО ІЮ Мо: 71)
Приклад 7 Створення тричі нульового мутанта ячменю
Рослини Е5 двічі мутантної за Ноге-ІузЗа лінії ячменю, ідентифіковані як 1" у публікації
МО2009/021285, вирощували у теплиці для отримання потомства Еб. Рослини Еб потім вирощували у польових умовах для отримання потомства Е7. Для комбінування мутацій Ногг-
ІуєЗа з нульовою мутацією НогЗ, рослини генерації Е7 схрещували з негативними за О0- гордеїном рослинами ВС», що походили з сорту ЕМШіоріа К118 (Приклад 5), та покоління Е1, самозапиленого для отримання насіння Е2. Насіння Е2 розрізали навпіл, половини з зародками пророщували та проводили скринінг паростків методом ПЛР на В- та Ю-гордеїни, як у Прикладах 5 та 6, і на гама-гордеїн. Половину кожного насіння, що залишилася та містила ендосперм, занурювали у розчин, який містив 8М сечовину, 195 ДТТ, і екстраговані білки розділяли електрофорезом з ДСН-ПААГ. Відсутність характерних полос білків з масою близько 50 кДа вказувала на відсутність білків С-гор З близько 300 рослин Е2 ідентифікували три тричі-
Зо нульових мутанта, позначених Т1, Т2 та Т3. Очікувана частота для комбінації трьох рецесивних мутацій, кожної у гомозиготному стані, за генетикою Менделя склала 1/64, що передбачає, що локуси Ногг (В-гордеїни) та НогЗ (О-гордеїни) розділені на хромосомі 1Н достатньо сильно для проходження легкої рекомбінації.
Ці три рослини, які були гомозиготними за кожною з трьох мутацій (Ногг2-ІузЗа-Ногг), позначенні Т1, Т2 та ТЗ, підтримували і розмножували через три генерації покоління однієї насінини, відбираючи у кожній генерації 12 найбільш важких насінин. Середні маси насінин з насіння ЕЗ цих ліній склали: Т1, 38,2 мг; 12, 37,0 мг; Т3, 39 мг. Вимірювали врожайність насіння на лінію (грам насіння на 20 колосків) та висоту рослин. Рослини, які продукували погано наповнені колоски, відкидали. Відібрали дві лінії Б4: Т2-4-8 та Т2-6-А5, провели додаткові випробування у польових умовах З них вибрали 12-4-8, як таку, що мала трохи кращу врожайність зерна, і позначили її як ячмінь ШІ (53.0.
Важливим фенотипом ячмінного зерна, пов'язаним з розміром зерна, формою та індикатором врожайності зерна, є відсотковий вміст зерна, яке не проходить через сита з розмірами меш 2,8; 2,5; 2,2 та 2,0 мм, особливо сито на 2,8 мм. Менше зерно робить переробку і осолоджування менш ефективними у порівнянні з ячменем дикого типу. Цей фенотип називається "відсів 2,8 мм" і вказується як відсотковий вміст зерна, яке не проходить через конкретне сито. Для сортів дикого типу, таких як Зіоор, параметр відсіву 2,8 мм, як правило, складає 95-98 95. Для дефіцитних за гордеїнами ліній, таких як подвійний мутант Ноге-Іузза (02.0), параметр відсіву 2,8 мм у більшості випадків склав близько 53 95. Інколи, в залежності від умов росту, наприклад, засухи, він був менше 10 95, а більшість зерен могло проходити крізь сито 2,5 мм. Для Ш.3.0 параметр відсіву 2,8 мм склав близько 54 95. Середні маси (мг) вирощених у польових умовах зерен склали: Зіоор, 53,6-/-0,9, ШІ (32.0, 33,5-/-0,4; ШІ С3.0, 39,1-/-0,3. Отже, лінія ШІ 53.0 забезпечила врожайність зерна 69 95, у порівнянні з ОЇ 2.0 з 5095, відносно сорту Біоор дикого типу (100 95). Отже, лінія ШІ (53.0 представила значне покращення врожайності зерна, у порівнянні з лінією ШІ 2.0. Тим не менш, параметр відсіву 2,8 мм залишився проблемним питанням для ячменю ЦІ (3.0.
Приклад 8 Створення додаткових тричі нульових мутантів ячменю зі збільшеною врожайністю
Хоча лінія ячменю ШІ.3.0 продукувала збільшену врожайність зерна у порівнянні з ШІ (32.0, бо усе таки потрібно її додатково збільшити. У зв'язку з чим, рослини ШІ 53.0 схрещували з рослинами сортів дикого типу Зіоор, Вацаїіп та "адап, і рослини тричі нульових за гордеїнами ліній ідентифікували як такі, що містили 5095 кожної вихідної зародкової плазми. Ці тричі нульові за гордеїнами лінії перехресно схрещували і схрещували також з сортами дикого типу
Ніпатагй та Сотютапаег. Потомство, що містило всі три нульові мутації, двічі зворотно схрещували з рослинами Зіоор, Вацаійп, Ніпатаг5пй та Соттапаег та кількома гомозиготними лініями, які відтворені потомством однієї насінини З множини відібрали одну результуючу лінію, яка була продуктивною, і позначили її як ячмінь ШІ (53.1.
З результатів перехресних схрещувань з рослинами Зіоор, адап та Вацаїйп, виконали другий цикл перехресних схрещувань для комбінування генетичних оточень усіх трьох вихідних сортів, починаючи з рослин, кожна з яких містила три нульові мутації. З рослин Е1 від перехресних схрещувань очікували всього потомства, що містило всі три мутації. Близько 1000 насінин Е2 на породу висадили у борозни у польових умовах та відбирали рослини Г2, які були відносно більш короткими і давали насіння ЕЗ, яке було більше, з добре наповненими колосками. Відбирали рослини як раннього, так і пізнього визрівання. У наступній генерації, що виросла у польових умовах, відбирали лінії, які додатково проявили відносно високий вміст у зерні амілази, відносно високий збиральний індекс та довжину колоса, оптимальну висоту (напівкарлик), відсутність вилягання та стійкість до захворювання мучнистою росою З 1500 родин вибрали близько 20 найкращих. Дані щодо 20 найкращих ліній представлені у табл. 5.
Маси окремих насінин (маса зернівки) були значно покращені, перевершуючи масу ШІ о 3.0 до 41,8 мг/насінину, з найбільшою масою насінини 48,4 мг/насінину, яку спостерігали для лінії
РІ2072-2 Це збільшення розміру насінин супроводжувалося збільшеним збиральним індексом, при вимірюванні ефективності утворення насіння близько 40 95 мало найбільший збиральний індекс з 46,5 95 виміряних у лінії Р1І2124-1. Найголовніше, відсотковий вміст відсівів 2,8 мм також покращено з 53,5 95 для ШІ (53.0 до більше ніж 80 95, з найбільшим значенням 97,3 95 для лінії РІ2140-1.
Одну відібрану лінію зафіксували поколінням однієї насінини для отримання рослин, які гомозиготні за трьома нульовими алелями за Ног2-ІузЗа-НогЗ, та позначили її ШІ 3.2.
Параметр відсіву 2,8 мм для 0.3.2 знаходився у діапазоні 80-93 95 у кількох повторностях, в яких ріст у польових умовах склав у порівнянні близько 97 95 - для Зіоор, 85 95 - для Ніпатагвй, 96 95 - для сорту Охіога дикого типу та 98 95 - для Магаййте.
Середні маси насінин та їх товщина були такими: ШІ 2.0, 33,4 мг, 2,4 мм; 03.0, 41,8 мг, 2,5 мм; Ш.О3.2, 47,2 мг, 2,8 мм.
Таблиця 5
Другий відбір ліній ШІ о 3.2, червень 2012 р.
ІО Ме Середня Середня Збиральний Кіл-ть Маса Фо відсіву роспини довжина довжина індекс (90) пагонів зернівки 2,8 мм пагона (см) | колоса (см) орРІ2О7Ла 2 | 847 | 83 | 39095 | 9 | 484 | 883 орРІ2ОЗВА-Ї | 750 | .ЮюЮЙ7О | 39496 | 8 | 472 | 867 орРІ2І40-1 | 1057 | 90 | Заабь | 15 | 459 | 973 орРІ2ОВВ2 | 727 | 63 | 42бо6 | 8 | 454 | 907 орРІ2І25-2 | 717 | 53 | 455395 | 8 | 450 | 950 орРІ2Од3-2 | 867 | 90 | 29,5956 | 12 | 447 | 854 орРІгОБО-ї | 643 | 60 | 36595 | 4 | 444 | 936 орРІ2І48-1. | 933 | 73 | 35095 | 14 | 442 | 900 орРІ2І49-1, | 1033 | 80 | Заузь | 15 | 440 | 912 орРІ2І24-1 | 793 | 73 | 46595 | 8 | 437 | 968 орІ2ІБ2а-2 | 983 | 90 | 348956 | 9 | 435 | 915 орРІ2І2в-1 | 730 | 60 | 37096 | 10 | «31 | 980 орРІ2І22-1 | 647 | 60 | 45495 | 5 | 428 | 908 оРІ2ІЗ9-1 | 137 | 83 | 339956 2 щ| 8 | 422 | 881 орРІ2І2О-2 | 750 | 68 | 396956 | 18 | 40 | 840 с я в» | 5ерзю ох відбору
Приклад 9 Вимірювання вмісту гордеїнів у тричі нульових мутантів ячменю
Визначення вмісту гордеїнів у муці з 033.0 методом мас-спектрометрії з моніторингом множинних реакцій (МКАМ-МС)
Для точного вимірювання вмісту гордеїнів використовували МКМ-МС наступним чином.
Перемелювали зерно або половини зерен для одержання цільнозернової муки, яка мала такий самий склад, що й цільне зерно. Поліпептиди проламінів з 20 мг зразків муки екстрагували з використанням 200 мкл розчину, що містив 5595 (06б./06.) ізопропанолу та 2 95 (мас./об.) дитіотреїтолу (ДТТ). Аліквоту екстракту, еквівалентну 5 мг муки, піддавали заміні буферного розчину на розчин 8М сечовини у 0,1 М трис-НСЇІ, рН 8,5, трьеохкратним центрифугуванням з використанням фільтруючого елементу з відсіканням ММ 10 кДа Цистеїни у поліпептидах алкілювали додаванням 100 мкл 50 мМ йодацетаміду та інкубацією протягом 1 год при кімнатній температурі. Буферний розчин замінювали на 100 мкл 50 мМ бікарбонату амонію, рН 8,5, і поліпептиди розщеплювали 10 мкл (20 мкг) трипсину протягом 18 год при 37 "С. Пептиди збирали фільтрацією через фільтр на 10 кДа, висушували і розчиняли у 30 мкл 1 95 (0б6./06.) мурашиної кислоти. Пептиди розділяли рідинною хроматографією на ВЕРХ 5пітаа7и Мехега з колонкою Рпепотетепех (Кіпетех, 1,7 мкм, С18, 100 х 2,1 мм) з градієнтом від 5 905 В до 40 95 В протягом 10 хв при швидкості потоку 0,4 мл/хв.. Розчинник А представляв собою 0,1 95 (об./о6б.) водну мурашину кислоту, розчинник В представляв собою 90 95 (об./о6.) ацетонітрил, що містив 0,1 95 (06./06.) мурашину кислоту. Елюат після ВЕРХ безпосередньо подавали на мас- спектрометр і МАЕМ-аналіз виконували на мас-спектрометрі 4000 ОТКАР, націленому на виявлення триптичних пептидів, що походять з горденів. Дані аналізували з використанням програмного забезпечення АпаїЇубхі м1.5 та програмного забезпечення МийіОцапі м2.0.2 (інтегрування площ піків).
На фіг. 5 показані дані, отримані для вибраних В-гордеїнів, С-гордеїну, Ю-гордеїну, гама-3- гордеїну (53) та гамма-1-гордеїну (1). На фіг. 5 представлена середня площа піка для кожного пептидного МКМ-переходу, нормалізованого до вмісту у Зіоор (100 95), для чотирьох повторних інжектувань з кожної половини зерна з контрольного ячменю (дикий тип, сорт зіоор), однонульових за гордеїнами ліній: Кізе 56, Кіз 1508 та О-нульової лінії, що походить з сорту
ЕШіоріа К118, двічі нульової за гордеїнами лінії 0.2.0 та тричі нульових ліній 12-4-8 та Т2-6-
АБ (відмічено колом). Для представлення кожної родини гордеїнів вибирали по одному прототипному пептиду, а саме: для В-гордеїну, ТГРТІМСЗМММРІ МК (5ЕБО ІО Мо: 48); для 0- гордеїну, ОМБРЕСКРМАЇ ЗОММК (5ЕО ІЮ Мо: 49); для С-гордеїну, ЇРОКРЕРМООРЕ (5ЕО ІЮ Мо: 50); для З-гордеїну, ООССООЇАМІМЕОЗК (ЗБО ОО Ме: 50), та для С1-гордеїну,
СТАІО5БІМНАІРМООСК (5БО ІО Ме: 51). Ці пептиди зустрічалися часто та були відносно розповсюджені у ячмені дикого типу, та виходячи з чого і були вибрані.
Показано, що тричі нульове зерно Ш-3.0 з лінії Т2-4-8 та другої тричі нульової лінії Т2-6-А5 не мало рівнів, що детектуються, вмісту В-, С-, ЮО- або, найбільш дивно, гама-1-гордеїну. Інакше кажучи, виявлено менше 1 95 вмісту відносно дикого типу. Таким же чином, гама-2-гордеїн не виявлявся у зерні ШІ (53.0. В ньому містився відносно низький вміст гама-3-гордеїну (відмічено колом), що був присутнім на рівні близько 20 95 у порівнянні з вмістом 3 у сорті Зіоор Гама-3 гордеїн був мінорним гордеїном; вміст гама-3 гордеїну у 5Біоор набагато менше ніж 1 95 від загального вмісту горденів. Однонульові і двічі нульові зерна не накопичували відповідний гордеїн, наприклад, як очікувалось, КізО56 та ШІ 32.0 не накопичували В-гордеїни, а Кізхб1508 та 02.0, як очікувалось, не накопичували С-гордеїни У О-нульовому зерні проявився вміст В- та С-гордеїнів дикого типу, але не накопичувався ЮО-гордеїн.
Коли повторили аналіз з використанням кількох різних пептидних послідовностей, зокрема, пептиду Ю-гордеїну АФОГААДОЇ РАМОК (5ЕБЕО ІЮО Мо: 85), який являє собою білок Ю-гордеїну дикого типу, у напрямку С-кінця значно далі положення стоп-кодону у мутантному В-гордеїні, то отримували подібний результат (фіг. 6). У муці також був відсутнім авеніноподібний А-білок.
Зо Було ясно, що зерно, отримане з тричі нульових за гордеїнами Т2-4-8 та Т2-6-А5, не містило рівні, що детектуються, В-, С-, Ю-гордеїнів та вибраних гама-1 (Р17990) та гама-2 гордеїнів.
Виявлення гама-1 та гама-2 гордеїнів було найбільш неочікуваним для винахідників, так як невідомо, щоб тричі нульові мутантні лінії містили які-небудь мутації, які не могли би повністю заглушити відповідні гени.
Низький вміст гордеїнів у зерні Ш/.О3.0, визначений методом МЕМ, було підтверджено методом двомірного гель-електрофорезу, наступним чином. П'ятдесят мкг спирторозчинного білка з екстрактів муки з кожної нульової за гордеїнами лінії Т2-4-8 та Т2-6-А5, а також з контрольного ячменю сорту Кізо 56, кожна проба з добавкою 1 мкг з поліпептидних стандартів
БСА Іапатагк, інгібітору трипсину сої і міоглобіну коня забарвлювали 0,006 95 (мас./об.) колоїдного Кумасі 5250 згідно Таппег єї а! (2013) та порівнювали зі стандартними білками 20, 30, 40, 50, 60, 80 та кДа (М; набір білків порівняння, Іпмігодеп). Плями вирізали з 20-гелю та з контрольної лінії Кіз 56 ідентифікували наступні білки методом мас-спектрометрії триптичних пептидів: С-гордеїн, гама-2-гордеїн (у2), гама-3-гордеїн (у3) та гама-1-гордеїн (у1). У гелях для зерна Ш0ГО3.0 ідентифікували ймовірні положення гама-1-, гама-2 та гама-3-гордеїнів порівнянням з гелем для Кіз 56. У муці з 03.0 виявили лише гама-3-гордеїн, решта три поліпептиду виявлені не були Концентрацію гама-3 гордеїну у кожній плямі вимірювали трьома методами: 1) як відсотковий вміст від усіх об'ємів плям для 50 мкг білка: середній вміст уЗ у
ОГО3.0 склав 13,5:-1,6 м.ч.; 2) по відношенню до інтенсивності плями для 1 мкг БСА: середній вміст уЗ у 03.0 склав 10,9-471,3 м.ч.; 3) по відношенню до об'єму плями для 1 мкг БСА: середній вміст уЗ у ОСО3.0 склав 3,4520,41 м.ч.
Низький вміст гордеїнів у зерні 053.0, визначений методом МЕМ, було додатково підтверджено методом ІФА, наступним чином. Двадцять мг зразків цільнозернової муки або ендосперму половин насінин подрібнювали і тричі промивали 0,5 мл води якості МіО струшуванням на швидкості З0/сек протягом З х 30 сек у 96-луночному вібраційному млині (Кеїбєсп. Стр, КПеїіпізспе) та центрифугували при 14000 об/хв протягом 5 хв. Проламіни із зразків муки екстрагували у спиртовий розчин, що містив 0,5 мл 50 95 (0б./о6.) ізопропанолу/1 95 (мас./об.) ДТТ, для контрольних ліній біоор, Кізе56, Кізб1508 та для ШІ 2.0, тричі нульових за гордеїнами ліній Т1, Т2 ї ТЗ та потомства покоління однієї насінини з ліній Т2-4-8 та Т2-6-А5.
Концентрації білків визначали у відповідності з методом Вгаа'тога (1976) і для цього 40 нг (1900 бо нг для тричі нульових ліній зерна) спирторозчинного білка, розбавляли розчином, що містив розчинники ЕГІЗА 5увіет»5 з постійним надлишком 0,2 мМ НегО», що додавався для видалення будь-яких залишків ДТТ з вихідного екстракту. Розчини розбавлених білків добавляли у лунки планшета ІФА (ЕГІЗАБЗузіетв5, м Вінзор, Квінсленд, Австралія), промивали та проявляли при 37 "С протягом 15 хвилин, згідно інструкцій виробника. Кількість гордеїну у контрольних екстрактах калібрували у порівнянні зі стандартом 0-50 нг загального білка Зіоор. Вміст гордеїну у тричі нульових лініях калібрували у порівнянні зі стандартом 0-5 нг загального білка ШІ 2.0.
Гордеїни 5іІоор та ШІ 52.0 отримували, як описано авторами Таппег еї а! (2010).
За результатами методу ІФА загальний вміст гордеїнів двічі нульових зразків муки склав 2,9 Чо у порівнянні з сортом Зіоор дикого типу, тоді як вміст залишкових гордеїнів у двох відібраних тричі нульових за гордеїнами лініях, 12-4-8 та Т2-6-А5, склало 3,9 та 1,5 мкг/г (мільйонних часток, м.ч.; табл.. б) обидва значення були значно нижче законодавчо дозволеного рівню ЕЗАМА, рівного 20 м.ч для глютену у безглютеновому харчовому продукті, та приблизно у 15000 раз нижче, ніж у зерні сорту Біоор дикого типу.
Визначення вмісту гордеїнів у пиві з ШІ/3.0 методом мас-спектрометрії з моніторингом множинних реакцій (МАМ-МС).
Вміст гордеїнів у пиві, звареному із зерна ячменю ШІ 3.0, вимірювали методом МКМ-МС, що виявив специфічні пептидні послідовності з використанням методів, описаних у Прикладах З та 4, з незначними модифікаціями. Ці дані представлені на фіг. 7. Результати аналізів показали відсутність авеніноподібного А-білка, В1- і ВЗ-гордеїнів, О-гордеїну та зменшений вміст гама-1- гордеїну і гама-3-гордеїну, оскільки вони не були виявлені, як такі, що перевищили фоновий шум при проведенні мас-спектрометрії (фіг. 7). Ці аналізи також показали відсутність С- гордеїну.
Таблиця 6
Зведені дані щодо вмісту гордеїнів в одно-, двічі та тричі нульових лініях
Визначення вмісту гордеїнів у муці з ШІ (53.1 та ШІ 53.2 0 методом МАМ-МС
Вміст гордеїнів у муці, одержаній перемелюванням зерен лінії ШІ (53.1 та 10 перспективних ліній ШІ (53.2, визначали методом МКМ-МС, описаним для зерна ШІ 53.0. Половини зерен перемелювали у муку і білки проламіни з 20 мг муки (п-4 повторності) екстрагували, алкілювали, розщеплювали трипсином та аналізували методом МКЕМ-МС, як описано вище.
Дані відображені на фіг. 8, які показують середню площу піка для кожного пептиду (сума трьох
МАМ-переходів) з кожної половини зерна Ш/(03.1 та ліній, що виникли від подвійного перехресного схрещування вихідних ліній, позначених 043-2 - 148-2. Ці дані відображені у порівнянні з контрольним ячменем (сорти дикого типу 5іоор, Вацаїп, Соттапаег та Ніпатаг»5п) і тричі нульовою лінією Т2-4-8. Площа піка показана для вибраного прототипного пептиду, представника кожної родини гордеїнів, Мо доступу у базі даних Опіргої та амінокислотні послідовності наступні:
А-Р2Е60О5 ООССОРІАОІЗЕОАК (5БО ОО Ме 52; з Б2БЕ60О5, центральний в авеніноподібному А-білку)
В1-040020 МЕ ОСОС5РМК (5ЕО ІО Мо: 53; близький до М-кінця В1-гордеїну) вВ3-0405351 УМЕГОСОС5РМРМРОК (5ЕО ІО Мо: 54) б-040055 ОЇ МРЗНОЕГОЗРООРКНІ К (ЗЕО ІО Мо: 55; близький до М-кінця С-гордеїну) 0-0841Е9 ЕГОЕБ55І ЕАСВ (5ЕО І Мо: 56; з 0841 Е9, перед стоп-кодоном на М150)
Сс1-Р17990 АРЕМОУУТОМУССО (ЗЕО ІО Мо: 57; з Р17990, С-кінцевий пептид) та
С23-РВО198 ООССООЇ АМІМЕО5РЕ (5ЕО ІЮ Ме: 58; з РВО198, центральний у уЗ-гордеїні).
Вміст О-гордеїну в зернах подвійного перехресного схрещування вихідних ліній, показаний на фіг. 8, був подібний до вмісту у зерні з ШІ 2.0 та у тричі нульових за гордеїнами лініях 12-4-8 і Т2-6-А5, близько нуля, що підтверджує спостереження, зроблене при використанні 20-ПААГ- електрофорезу, коли ЮО-гордеїни не виявили в зерні ліній Т2-4-8 і Т2-6-А5. Вміст гама-1-гордеїну у цьому зерні двічі перехресно схрещених вихідних ліній, був подібний з вмістом у ШІ 2.0 та у тричі нульових за гордеїнами лініях 12-4-8 і Т2-6-А5. Кілька ліній 053.2 мали близький до нульового вмісту пептиду АРЕМОУММТОМОСО (5ЕБО ІЮ Ме: 59). Гама-1-гордеїн не виявлявся методом 20-ПААГ-електрофорезу ліній Т2-4-8 і Т2-6-А5. Вміст гама-З-гордеїну в зернах подвійного перехресного схрещування вихідних ліній, був також подібним з вмістом у ШІ («2.0 та у тричі нульових за гордеїнами лініях, за виключенням лінії 124.1 (0Ї 3.2), в якій він був дуже низьким. Гама-З-гордеїн також виявлявся зі зменшеним вмістом методом 20-ПААГ- електрофорезу ліній Т2-4-8 і Т2-6-А5.
Цікаво, що виявлена синергічна дія мутацій Ног2 та музза щодо зменшення вмісту ЮО- гордеїнів у ШІ (52.0, не дивлячись на те, що була відсутня мутація НогЗ3 (О-гордеїн). Подібним чином, наявність усіх трьох мутацій (Ног2-ІузЗа-Ног3) мала синергічну дію щодо зниження накопичення гама-1- та гама-2-гордеїнів, як визначено за вмістом пептидів вище.
Приклад 10 Створення позбавлених оболонок тричі нульових мутантів ячменю
Усі зерна ячменю селекційних варіантів ШІ «53.0, ШІ (53.1 та ШІ 3.2 були з оболонками, що є перевагою для пивовареної промисловості, оскільки відпрацьоване лушпиння утворює фільтруючий шар під час фінальних стадій фільтрації сусла (зціджування). Однак, оболонки зерен ячменю мають велику кількість дрібних силікатних голок і тому оболонки перед споживанням людьми необхідно видаляти лущенням. Альтернативний підхід полягає в отриманні позбавленого оболонок зерна генетичними способами. Виходячи з цього, рослини
ОСОо3.0 схрещували з позбавленим оболонок різновидом ячменю, позначеним Вагіеутах ІЇ (М/О2011/011833), та вибраною позбавленою оболонки тричі нульовою за В-, С-, О-гордеїнами мутантною (Ног2-ІузЗа-Ног3) рослиною, яка була лінією дикого типу за геном 551га.
Кілька тричі нульових за гордеїнами позбавлених оболонок селекційних варіантів Еб (наприклад, А7 1), що містили менше 0,1 м.ч загальної кількості гордеїну у муці, вибрали після трьох циклів отримання покоління однієї насінини.
Приклад 11 Мутагенез ячменю
Для виділення мутантів за вибраними генами у ячмені проводили мутагенез з етилметансульфонатом (ЕМС), описаний автором Саїдмжей (2004). Близько 45000 (1,5 кг) насінин ШШІ.3.0 використовували для мутагенезу наступним чином: зерно замочували у 2,5 л дистильованої води протягом 4 год при кімнатній температурі з аерацією. Воду міняли кожну годину під час замочування. Потім насіння інкубували у 2,5 л свіжоприготовленого 30 мМ ЕМС у
Зо 0,1 М фосфатному буферному розчині (рН7) протягом 16 год при кімнатній температурі з аерацією. Потім насіння промивали 2,5 л 100 мм розчином тіосульфату натрію протягом 10 хв при кімнатній температурі. Промивання тіосульфатом повторювали і потім зерна ретельно ополіскували 2 х 2 л дистильованої води протягом 30 хв при кімнатній температурі з аерацією.
Насіння висушували під потоком повітря протягом ночі на абсорбентному фільтрувальному папері перед висаджуванням на наступний день у польових умовах. Основну масу насіння М2 збирали, об'єднували та аналізували на наявність мутантів. Після такої обробки мутаційна частота склала приблизно 1 мутант у гені, що представляє інтерес, на 1000 насінин. Насіння піддавали скринінгу на втрату експресії гама-3 гордеїну методом дот-блотингу для половин насінин з використанням специфічного моноклонального антитіла до гама-3 гордеїну, та з кількох десятків тисяч насінин М2 ідентифікували 40 насінин, які дали негативний сигнал.
Відсутність гама-3 сгордеїну в цих зернах підтвердили методом Вестерн-блотингу з використанням моноклонального антитіла і мас-спектрометрією на специфічний пептид (ЗЕО ІЮ
Мо:58). Половини зерен, що містили ембріон з кожного негативної зернини, помістили на середовище для забезпечення проростання Ембріони більшості половин зерен не проросли, але кілька - проросли.
Приклад 12 Виробництво пива з ячменю з низьким вмістом гордеїнів
Випробування з варіння пива проводили з використанням солоду, одержаного із зерна
ОЦ о2.0 стандартними методиками, і результати порівнювали з контрольним сортом ячменю дикого типу Сзаігіпег. Саїхіпег являє собою високоврожайний напівкарликовий 2-рядний різновид ячменю середньопізнього визрівання, що повсюдно вирощують у всіх областях вирощування зернових культур Австралії. При сприятливих умовах він продукує належний розмір зерен, які дають помірні рівні екстракції, здатність до ферментації та діастатичну активність і, тому, є промисловим "стандартом", таким чином він є ідеальним для використання в якості контролю для оціночних випробувань при варінні пива Солод, одержаний з ШІ 2.0, мав трохи більш високий вміст вологи рівний 5,7 95, у порівнянні з солодом із Саїгапег (5,0 95), та значно відрізнявся від солоду з Саїгіпег зовнішнім виглядом, вираженим в тому, що зерно виглядало вищербленим та зморщеним. Діастатична активність (ДА) солоду з ШІ 2.0 склала 5АМК, набагато нижче, ніж ДА для Саїгіпег 299МУК "Осолоджений ячмінь у більшості випадків мав ДА щонайменше 250КМУ. Тим не менш, солод з ЦІ (32.0 був негативним за крохмалем через бо 20 хв тривалості затирання та досяг результату за І С рівного 1,7" Плато.
Солод перемелювали за два проходи через 2-ролерний млин та досягали задовільний ступінь дроблення зерна. Для цього солоду краще всього би підійшло більш комплексне перемелювання у шестиролерному млині через морфологію його зерна. В альтернативному варіанті для відділення сусла зручніше було би використовувати молотковий млин у поєднанні з фільтром для затору, ніж фільтраційний чан. Подрібнений продукт затирали стандартними способами при початковій температурі 65 "С протягом 20 хв, потім 74 "С протягом 5 хв з додаванням додаткової промивної води. Загалом, зморшкувата морфологія солоду з ШІ 2.0 створила складність для задовільного подрібнення та затирання у порівнянні зі звичайним солодом. Затерті продукти потім фільтрували, при цьому зморшкувата морфологія ЦІ 52.0 знову викликала ускладнення. Фільтруючий шар розвалився на частини з утворенням каналів, тому стало потрібним зупинити стікання та повторно розрихлити фільтруючий шар. Через неефективне подрібнення під час процесу фільтрування значна кількість потенційного екстракту було втрачено, що позначилося на досягненні загального значення у котлі 10,96? та 11,12"
Плато, тоді як метою було досягти значення 14" Плато. Значення рнН, кольоровості за ЕВС та рівню бета-глюкану були прийнятними. Недостатність подрібнення також значила, що не відбулося ефективне утворення шару лушпиння, що діяв як фільтруючий матеріал, що викликало зниження якості очікуваного екстракту. Прозорість фільтрату спочатку була дуже каламутною через погане утворення шару, хоча прозорість сусла покращилася до прийнятною після одержання 30 л фільтрату.
Результуюче сусло ферментували дріжджовим штамом басспаготусе5 цмагпит А при 18,5 7С протягом 120 год. Профіль ферментації був нормальним, була відсутня тривала лаг- фаза на початку ферментації, хоча значні рівні діацетилу залишалися навіть після заданою тривалості діацетильної фази відпочинку, після завершення ферментації була досягнута необхідна густина. Діацетильна пауза, при якій пиво залишають при підвищених температурах ферментації перед охолодженням пива до 0 "С, проводиться для того, щоб дозволити дріжджам реабсорбувати та метаболізувати діацетил. У більшості випадків вкінці ферментації потрібно 24 год., щоб дати дріжджам час для руйнування цього продукту. Цього не відбулося при двох пробних варках пива з Ш1/ 02.0. Ізомеризований екстракт хмелю додавали у концентрації 30 мг/л і рідину очищували додаванням силікатного гідро гелю. Готове освітлене
Зо пиво мало більш низьку фізичну стабільність, ніж контрольне пиво. Початкове помутніння при охолодженні вважалося високим, а помутніння при примусовому охолодженні вийшло за межі нормальної специфікації. Тим не менш помутніння при охолодженні не привело до утворення зважених часток.
Готове пиво піддали органолептичному аналізу групою навчених пивоварів та, не дивлячись на складність у процесах подрібнення та фільтрування, результати виявилися неочікувано добрими, приймаючи до уваги питання, пов'язані з ефективністю зброджування цього солоду
ДМС (диметилсульфід) був переважаючим у смаку і ароматі; однак це не виглядало об'єктивним. Наявність ДМС часто вважається дефектом смаку і аромату в австралійському пиві, але у більшості випадків є загальноприйнятим в європейських, особливо німецьких сортах пива. Коментарі пивоварів були такими, що види пива з ШІ 52.0 не були надто несхожими на контрольні види пива та що вони були дуже прийнятними в якості пива і нагадували німецькі сорти пива. Не було виражених "зернистих" або "зернових" типів смаків і ароматів та не було пекучості і в'яжучого смаку для пива з ШІ 2.0, як звичайно відбувається для комерційних видів пива, які просуваються на ринку як "безглютенові". Загальний смаковий та ароматичний букет був прийнятним та достатньо добрим.
Із зерна ячменю ШІ 3.0 таким самим способом як для зерна 02.0 було приготоване пиво, а також воно було приготоване із зерна ячменю ШІ 53.2. Осолоджування зерна ШІ 3.0 було кращим відносно зерна ШІ 3.0, головним чином завдяки етапу подрібнення, покращеному через те, що зерно було менш зморшкуватим. Пиво, приготоване із зерна ОЇ 3.0, мало кращу якість з прийнятним та достатньо добрим смаком і ароматом. Покращена морфологія зерна (розмір та форма) зерна з ШІ 53.2 передбачає більш легке подрібнення і фільтрування у процесі варіння пива, забезпечуючи одержання пива із загальним вмістом гордеїнів менше 1
М.ч.
Приклад 13 Виробництво харчових продуктів з використанням ячменю ШІ о
З використанням ліній ячменю ШІ (53.0 і ШІ 53.2 випікали два малоформатних хліба (10 г).
Малоформатні буханки випікали з метою випробування, але цей спосіб може легко бути масштабованим до комерційних обсягів. Один хліб готували зі 100 95 вмістом ячмінної муки з
ОГО в якості мучного інгредієнта, перемеленого, як описано вище, тоді як другий хліб готували із суміші 30 95 муки та 70 95 комерційної безглютенової муки, такої як рисова мука, в якості бо мучного інгредієнта Муку (13,02 г) та інші інгредієнти замішували у тісто для визначення часу пікового тістоутворення у міксографі 35-д. Рецепт, що використовувався, заснований у кожному випадку на 13,02 г муки, такий: мука 100 95, сіль 2 9о, сухі дріжджі 1,5 95, рослинне масло 2 95 та поліпшувач 1,595. Рівень додавання води заснований на величинах абсорбції води для мікромішалки з місильним органом 2-подібної форми, який може коректуватися при отримання повного рецепта Формування та укладення проводилися у двостадійні етапи з перевіркою при 40 "С та вологістю у приміщенні 85 9о. Випікання проходило у печі КоїеІ протягом 14 хв при 190 76.
Обидва хліба мали вміст глютену менше 20 м.ч та були придатними для споживання людьми, суб'єктами з ЗЦ.
Фахівцям у цій галузі слід розуміти, що для цього винаходу можуть бути створені багаточисельні варіації та/або модифікації, як показано у спеціальних варіантах реалізації винаходу, без відступу від суті та обсягу цього винаходу, як було розширено описано. Отже, ці варіанти реалізації винаходу повинні розглядатися у всіх відношеннях як ілюстративні та не обмежуючі.
У цій заявці заявлений пріоритет за заявкою АЮ 2013902140, поданою 13 червня 2013 р., та
Аи 2013902565, поданій 11 липня 2013 р., повний зміст обох заявок включено у цей документ як посилання.
Усі публікації, що обговорюються та/або згадуються у цьому документі, включені у цей документ у повному обсязі.
Будь-яке обговорення документів, актів, матеріалів, пристроїв, статей тощо, які було включені у даному описі, зроблено виключно з метою забезпечення контексту даного винаходу.
Не слід приймати як припущення, що будь-яке або всі з цих положень не утворюють частину попереднього рівню техніки або не становили звичайний відомий рівень техніки у галузі, що відноситься до цього винаходу, як якщо б вони не існували до пріоритетної дати кожного пункту формули винаходу цієї заявки.
ПОСИЛАННЯ
Арашіан еї а! (1986) Віотесппоіоду 4:1087.
АІтвіда апа АїІб5Ніге (2005) ТАЕМОЗ5 СеїЇ Віо! 15: 251-258.
Апаегзоп еї а! (2000) Майте Медісіпе 6:337-342.
Зо Апаегзоп вї а! (2013) СЧепоте 56:179-185.
Вірікома єї а! (2001) Мої Сеї! Віої! 21: 289-287.
Вірікома єї а! (2002) Сепеїїсв 161:1169-1175.
Вошигане (1995) Ріапі 5сі 105: 125-149.
Вгапаї сеї а! (1990) Єик ) Віоспет 194:499-505.
Вгеппап сеї а! (1998) у Сегеаї! сі 28:291--299.
Саіджеї! (2004) Тне Ріапі доштаї! 40:143--150.
Сатегоп-Мії5 еїа!., (1998). Ріапі Мої! Віо! 11: 449-461.
Саресснпі (1980) СеїІ 22:479-488.
Саїавззі єї а! (1994) І апсеї 343:200-203.
Сепо еї а! (2012) Маї Меїнодз 8:941-943.
Снепа еї а! (1996) Ріапі Сеї! Вер 15:653-657.
СіІарр (1993) Сіїп Регіпай! 20:155-168.
Соідгаме еї а!., (2012) У Ргоїєоте Нез 11: 386-396.
Сотаї еї а! (2004) Ріапі У 37: 778-786.
Ситпівї еї а! (1992) Нит Сеп ТНег 3:147-154.
Рамієз єї а! (1993) Сеї| Віоіоду Іпіегпайопаї! Верогів 17:195-202.
Ое Апаїїз єї а! (2007) У Роса Ргоїесійп 70:135-144. роїї (1983) Вагпеу з5еєей ргоївіп5 апа розвзірійев їТог (еїг ітргометепі В "Зеєй Ргоїеіп5:
Віоспетівігу, Сепеїйсв, Миїййіопа! Маїше", Сюойвснак МУ, Миїег НР (єдз). Мапіпиз МіЦной, Те
Надие:207-223. рої! еї а! (1973) Вапеу Сепеїйсз Мем/віеНег 3:12-13.
Бозіаїек егаї! (2006). Роса Адайімез апа Сопіатіпапів 23:1074-1078.
Роуоп вї а! (2010) Маї Меїштоаз 7:459-460.
Роуоп вї а! (2011) Маї Меїштоаз 8:74-79.
Евійіз єї а! (1988) Віотесппіднез 6:608-614.
ЕРавоїї єї а!., (2010). У Реоїєоте Нез 9: 5262-6269.
Рієїд еї а! (1982) Тнеогеїїса! апа Арріїєд Сепеїїйсв 62:329-336.
Еоугеї! еї а! (2006) Сут-ап Іпіегпайопаї! уоштпаї ої Медісіпе 99:453-460.
Ецітига еї а! (1985) Ріапі Тізвиє Сийиге І еНегв 2:74. 60 Станат еї а! (1973) Мігоіїоду 54:536-539.
Стапі єї а! (1995) Ріапі Сеї! Вер 15:254-258.
Стееп (2009) доигпаї ої їйе Атегісап Меадіса! Авзосіайоп 302и71225-1226.
Стееп апа даті (2006) Аппиа! ВРеміем ої Медісіпе 57 :207-221.
Стоепеп єї а! (1993) Мої Містобіо! 10:1057-1065.
Си ега! (2003) Сепоте 46:1084-1097.
Со еї а! (2010) У Мої Віої 400:96-107.
Наї еї а! (2005) Сотриіайопаї! Віоіоду 1(6):е60.
Назейої апа Сепасні (1988) Маште 334:585-591.
Наизсні єї а! (2002) Сазігоепієгоіоду 122:А180.
Непікоїї еї а! (2004) Ріапі Рпувзіої! 135: 630-636.
Ное сеї а! (1999) Єтега Іптесі Оів 5:254-263.
Ібєпіпо вї аї (1987) У Васієтіо! 169:5429-5433.
Уапзгзенп евї а! (2002) ОМІСЗ У Іпієа Віо! 6:23-33.
Уагадаї (1991) Тнеог Аррі Сепеї 83:164-168.
Капіепбегао еї а! (2006) Єштореап Роса Незеагсіп Тесппоіоду 222:78-82.
Казагаа вї а! (1984) РМА5 81:4712-4716.
Кікисні еї а!., (2003). Тнеог Аррі Сепеїісз 108: 73-78.
Кіт єї а! (1996) Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 93:1156-1160.
Кіт єї а! (2012) Ссепоте Вез 22:1327-1333.
Ко?ієї! еї а! (1996) Ріапі Мо! Віої! 32:393-405.
Ктєїз апа Зпемту (1989) ВіоЕззаувз 10:201-207.
Ктєїз вї а! (1983) Сеї!: 34:161-167.
Киівіоїегзеп еї аї., (2000) ЕІесіторпогевзів 21: 3693-3700.
Киррег (2005) Савігоєпіегоіоду 128:5121-127.
І апгіпі еїг а! (2009) Аітепіагу Рпаптасоіоду 4 Тнегарешісв 29:1299-1308.
Ї еє ега! (2007). доштаї! ої Нитап Мшйоп апа Оіевїеїйіс5 20:423-430.
ЇГ и еї а! (1993) У Ехр Меа 178:2089-2096.
Мапі еї а! (2005) У Рпаптасої Ехр Тпегареші 312:19-26.
Мазеропні еї а! (1996) Віоспіт Віорпуз Асіа 1307:26-30.
Ко) МесСоппеї! тій єї а! (2009) РМАБ5 106:5099-51 04.
МіПаг апа У/атетоизе (2005) Рипсі Іпіедг Сепотісв 5:129-135.
МіПег еї а! (2007) Маї Віоїеснпої 25:778-785.
Мо)іса єї а! (1995) Мої Місгобіо!.1 7:85-93.
Мо)іса єї а! (2000) Мої Містобіо! 36:244-246.
Могамсома вії а! (2009). дхдоитаї ої Спготаїоагарну а 1216:3629-3636.
Макаїа єї а! (1989) У Вастетіо! 171:3553-3556.
ОпПішпа еї а! (2010). дхоштаї ої Нитап Миїйоп апа Оієїеїісв 23:294-300.
Разаціпеїії еї а! (2005) Сит Оріп Сепеї ОємеІор 15: 200-205.
Ретітанп єї а! (1992) Сепе 113: 157-163.
РісагієПо еї а! (2011). Роса Спетівігу 124:1718-1726.
Ватіге? еї а! (2012) Мисівїс Асіа5 Не5 40:5560-5568.
Вибіо-Таріа єї а! (2010). Атегісап дошгпаї! ої СавігоєпіегоЇоду 105:1412-1420.
Зепіог (1998) Віоїєсн Сепеї Епдіп Немз 15: 79-119.
Зап еї а! (2002). Зсіеєпсе 297:2275-2279.
Зпемгу (1995) Віоіодіса! Немієм5 ої Те Сатбгідде РНніозорпіса! босієїу 70:375-426 зЗпемту апа Наїога (2002) Чоштаї ої Ехрегітепіа! Воїапу 53:947-958. зЗпемту апа Таїйат (1990) Віоспетісаї! удоштпаї 267:1-12.
Зпемгу, вї а!., (1999) Тне рооїатіп5 ої Ше Тиййсєає Іп б5еєдй Ргоївїп5, КІеуег: І опдоп, 1999; рр 35-78.
ЗПірру вї а! (1999) Мої Віоїесй 12: 117-129. зЗКомбіего єї а! (2005) Ріарейоіодіа 48:1416-1417.
ЗКоУбіего єї а!., (2004). Віосніт єї Віорпуз Асіа-Мої Вавз.ої біз 1690:220-230.
ЗіІаде апа Кпаші (2005) Тгтапздепіс Вез 14: 109-115.
Зтіїй єї а! (2000) Майшге 407: 319-320. зіерпіак єї а! (2006) Ат .) Рпузіо!-Сзавзігоїпіеві І їмег Рпузіо! 291:621-629.
З72с7ерек евї а! (2007) Маї Віотесппої 25:786-793.
Таппег еї а! (2013) Ріоз Опе: 8:е56456.
Таппег еї аї., (2010). АІтепі Рпагптасої Тег 32: 1184-1191.
Топ еї а! (2010) Іттиподепеїйсзв 62:641-651. 60 Топуата еї а! (1986) Тнеог Аррі Сепеї 205:34.
Туе-Оіп єї а! (2010) бсіепсе Тгапзіайопаї! Медісіпе 2:41-51. мап Етбваеп еї а! (2000) У Васіетої 182:2393-2401.
М/адпег єї а! (1992) Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 89:6099-6103.
Мапа еї а! (2012) Сепоте Вез 22:1316-1326.
УМУаїтетоивзе еї а! (1998) Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 95: 13959-13964.
Мі)пдаага апа Агепаї (2007) Вгеуег є різшег Іпіегпайопаї З: 31-32.
Ума еї а! (2010). АПтепіагу Рпаппасоіоду є Пегарешісв 32:573-581.
ПЕВЕЛЕК ПОСНІДОВНОСТЕМ
«ТМ неуконоспровислова лослідницьки організація спікдрувності
Зерновий немконосдослідницька кОоБорацья «і90» Ячмінь з дуже низьким вмістом гордеїнів хі 5РІВЕ «3505 ви ЗО139021О «5 ЗАЛУ «Майк ви ОБОВ «Мо ОЗ и «і» 85 «і» Версія Раїенттв З.5 «ще ії «ех Її «Бл» вілок
Ей КЕ веектуме ха у тів івм їв Бго вве Ро сів ге БВ очі ра тує га сій ще ів «Аа Я «й «Кік БІЛОК Й «ії» ногаеня Уувічаге «НЕ іш бів вто ва рРга сій Бе ів ба вра вв вко Тео бій го «і» 16 чеаех вілюх «843» Нокіа Увізаге «МЮх З бів го бів бів Бто Хі бго бів бів бге бій бто Тук Вре б3а ій і 5 іо ї5 «Ох Я «31» 17 «еаеж Білок й «3» ТЕТ ісюю аежкімОюВ що: 4 зій ні дів вка вве Бо Фів вко бій іч бте Тук вто бів бко й ї 5 іо їх
Бак «ою Я «а 35 «Вих БТЯЮК . «а» теж Срв аезтЕУи «ЦЮ 5 ій бій Сук Суб стій Рге іви АТа сій тів хеб біб бій й1а дае ії 5 13 15 «і» в ка» М «ВЕ» Білок й «вії» Магцеми чнідате
НО» 5 мес УЗЕ сей сій й іви вра Бег МЕХ сув Ага «Ох 7 «вії» 8 «ій» Вин «вій ногйеив Ууцідаге «НК 7 го бів ай его рве вро вій ов «2305 й «а» 1 «іс» Білак «іЗ» нок маідаге «НЕЮ» в
Ре хаі бів Рго бій бів бій бо вне бго фео бій вго Ні біз Рго ї З що ї5 «еще» З «15 «кій БІЛОК «233» ногавот Уівакв «нь З тут вге бів бій Бгто бій бій бго ве его тгрооів бів вго ствг 1 3 КЕ Кв «М 0 «ії 19 «йі2» вІіЛОЖ «ії» нога цівка «НМ» Що їв сій ага Рго Бій бій вен Бе вго оіа тїтробіяй его ву во бій ї 5 ій 15 віп реа ргоа «ее «ії» 18 «йї8з вівах «гії» наго Ууційаке «НО: ія: Хі Хі бго бів біп рез бів біл Бгто бе вго вен бів Рго нія ії 5 10 15 сів рго
«вій» 3 хаіїх 5 «іо» вВілек «її» бесвіє сегедів «Нюх 18 іп шій еге ра его ї 5 «М» 3 «їх й «Дії» віпак «233» Бесаїв сегевія «Же ІЗ зів бін бій не его ї 5 чен А «в 5. «іл» вілек «иїЗ» Зесвіє секедів «005 1 їен біз вго РВа рка ї З «2302» 15 «11 5 «йї1х» Білок «333» Зесаїв сегезів «не ій їей вра вне рко 3 5 «ВЦіх 16 «ві» 36 «239» ВіЛОК «тії» нога Ууцідаве «Мт ів ага уві ма! Ар осів бій се мі бік бій ем бо їгр бек ТвВке у 1 5 їв 15 «2105 15 хі» ії6 «10» вБіложЖ «із НагЧеою хмдача «й» 37
Уа Уа! ар бів біб сей Уві Біу Бій вен бо то бак Те сту зве ї 5 16 15 «230» 18 «з «гійх БІЛИК кгі3» Нагоени чціяйке «00» В
Узі Уа! ар ої зів бен Уа! 01у бій Мей во ста Бек тне діту ї 5 їй 15
«кв Ж «ром «26 Білок Й «ії» Немівмит еБідаге «ВК 15 ма! Уа ахв вів вв цен ма! є1у бів сви вго те «т» 20 «в 18 «елй» БІЛОК «Я» нОгбецюя Увідаге «Кв о сій мем уд! Ту ців Мем бка тер бек п сім цем 5. а НН «а» 21 «ії
Ї «іо» Білок Й «її» мегєбент УШідаге «МЛ бів ем ув! Є1У сів рев РКО ТРИ баг Я іх «ее с жклїїх 13 і «іл» вБілен «ій» огбецюя чуїдагае «Ми 3 їв уаї бі бій во иа Тер обеє Тег біу сен бій Мех «АН 23 хі» 1
Ї «30» вілек «ії» Ногбеші Уушідаге ень 8 зво чі біу бій ів ве тро Заг о тг обу ев
Е х 13 «240» й окЕіїх Зо і «азам Білок . «Іі» негйвци Уупідаге єн 23 івм ма! біж бів ен вге ТгроЗек Тне «Ту ї 5 іа хай» 25 «їх
Ї «212» Білок «3» Нокдеця хмідата «00» 25
Узі шїіУу вів сви го тво Зекє ТК біу ев бів мах
1 5 рт «МЕ ай «1»
Ї «лій» вілок «йїх» ного увідйте «юс
УВІ бі сій іє рга тгру Бе тве Щіу цу 1 5 30 «ФАО» 37 «гії» 15 і «ал» Білак «Кай» агави Уа щи ве М «йо МОЮ НЕ5 «й КК «223» підоглутамімова вислати «пед «айй» МОЮ КЕВ «ибйх (..515) «агїх гекенНаАсЄ «ие 37 о1я бе) АТ АТа Бій сей овко дів Має сСсує ага ї8у Бін бі бак 1 5 10 іх «їй» й «її» 26 «їй» Білак «М» нега миідаге «НЮ» 98
УРЕ які ага бій Тує сти ій ба Тео вії аї вго Зак кує Фі у 1 5 10 15
Зег рРМНЕ тує го сіу біуУу Тнг о Аїа го РО о 5 «АН 25 «й В «Філ» Білок Й «ВІЛ» нога оідакеа «Ве З
Бне уа! без во сій біп бій аіз бій бе гу Уві маі бі зак 1 5 ій їх «в» 30 «яЩі» «Ві» БІЛОК «иіЖе нога меідаге «Я 30
Ве та! іди Ре бів Бій Бій дів Бій РЕ ї КІ їв «05 «гії» 16 «під» БІЛОК «еіЗз нНОогоєцше ми їдаге
«Ве» ЗХ аіа хі уві Меї бій бій біп Уа! бів бів бів узі Ту ні Фіу вне ії а їб і5 «аа 2 «її» Її «ій» Біле «33» нега чмідага «ЩЕ їши віц аг вто бій бій сей рве РРО Бій ТкроБій веб їз ре й 1 5 їі із оп вро вго «йо» 35 «і В кій» Білов й «ії» вого мідна «ни З сви ва внз сій ТВ бій РРО без вте вів сі» вра вга
Х а о «Ех 34 «І «210» Білак «і» Негвще увідаге «м» а ге ів бій сх ву віп а1у Мет рр кте бій сви ії я їв «210» 35 «21ї1» З хаїї» Білок «Ії» ногаерт увідаге «Ні 35
Уві УВІ бу Зат рем чаї сів вій те «МЕ Б «її» 15 «Вій» ніяк Й «йїЗ» Ногцвож Умідася ев Зіп бів Бека сів Ніз ої Ре вРге вів вто тик Ві бів ме вго ня З ЕКЗ 4: сів Ага БК ка «і 35 «ій» Білак «віЗ» нагент відала «ЩО» 37
Тук ргао бій бій рго бій бій вга рРБе бге тт бів іп бго ТНК 3 5 10 13 «аіО» 38 «вії «ій» БІЛОК «йі3» Ногівцю хиідаке «КЮх З «Її мМаї чаї ів йко 51 дів Бан аїв бій мех 1 ну 5 ій «10х 38 «ме хаій» БІЛОК . «ії» наб «звід «ей» «Зі» Мой КЕ «жан КО «ВАЗ» піроглутамінова кислата «а 39 сій его бів нія ої1й Ре реа бій Бо таг одій бій йбе го бів Аго ї З 30 13 вто кед МІ «із «ій» БіЛОК . х2і1ї» Накбви чаідате «адм а бе Уві бів Рг бі бів біп мя! бго уві б Х16 ТР Аго і З ів «ай ях «ві» 3 «212» Білак «ФАХ» Номіецю «відаєе «Я» ве Уа! сій Рго бі" бій бів мя! Бгто ма? Фі 516 3 5 Ю «ЩЕ Я хі» вілок «23» ногавив «цізагео «МК й і8у Жіе Зіє Рго вій бів Рго біб бій бро Ре Ре) ем Ффій ге нія ї З 10 15 ота вга «З» я че Ж хеіа» БіЛОх «тії» негчівша Увідцке
«Я» 3
Ії лів Рг о Єїв бій РРО бів сій бге вйе бо ев бій Ро ніз вів 1 5 10 15
Ра «іо 4 «їх «гій» Білок «ії» неоРйеню тцідйие «НО» яд
Уві ій Уа! бів іє го вве узі нів Ркз зве їі ї 5 1 «віх я «з «віз БІЯОК хаїЯ» вечівня Умізаге «АЮ» 45
Звговне ші біп кго сій біз зів Узі ве УВ! сію Уаі ВУХ Агу ї 5 30 15 «ід» ай «аіж 28 чаї» ВІЙОК «й13» ваейвит Уо1даме «В 5
Ії жів вго вій в ВР Рйе го ген віп вт бій то вне ура вв зів вто бів зіп го без Рго Бій вро сів Бій бго х5 «В» 87 «їі 34 кад» Білок «Ті13» ногбвив тоідаке чех «йеї» МООЛНЕХ «аа» (Б.В І «баЯ» бЗапеу -віцтаніс всі СОКАХ) «це Я їіе вгв їівн бів его бів Біб ба Ре вро бій зів его ега ня 5 4 «Мі: 4 «ії» 14 «ій» Білок «вії» мамдеви «підвке «М» 48 тт Бен вго ТНК омеї Су бек узі дя УДі РКО БЕН ТУ" АГ 1 5 10 «Ен ЯЗ «із 6 «В3ї2» Білок
«813» вечіея умідаге «Оз 4 ав уні хек го Сів Сук Агфокго Уві діз іа бек сій маї Уа? дкО і 5 м 15 «іх 50 «її» 15 «війх Бійок «13» нагавию Уувідаге «Я 50 віп бів сСуз Суз сів бій іву АВ Ах Ті2 ази Бін бів Зев ага 1 5 їй їз «ех 53 каїїх 1 «їй» ВіЛВЕ хиїй» нагЯенив ецідаве «ще її сує тг Аїа їі ахр бек ї1є ма! нів діх Хі Ре мет бій бів є1у ії 5 16 15 ака «М 5 «вії» 35 «10» Білак киїї» нОогівнв Уумідаке «й» 53 бій бів Суб Сує сіп го вен а бів іє Зег бін бій АТ Ага 1 5 10 13 «Мі» 23 «вій «авБйх БІНОК «13» нНагавив Узідаге «НІ» 53 ма вне ви ой Б сій Сух ет вга тв! Ага ї і: с «М» За «еф 15 «Ва» вівоЖ «3» ногавот Уучіате «НюЮе
Узі вна гео бій бів сій бух бек Рг ущі го мех Рго сій аг «МНю 55 «Мі» 38 «їй» Білож Й «233» ногіавит Ууцідаке «00» 55
Сів бен Ажа РКО Бег Ні бій бій іео бїв бе Ро Бій Сів вге Рне ї 5 Та 15 ів вух «10» 56 «іїїх ЩЦЩ «Війх Білок «Ії» Нагавит Уучідаке «ВО» сів ем сів бін беб Заг бе; би Аїа суз Ага 3 х їй «23» 5 «їх І «ай» БІЛОК «13» Нагдвию Увідаке «0» 5 аїа во ве уді Зту маї щі тик вію чаї іх зів бів
Кх У 16 «Ай» 58 «її» 5 «ес» Білак «аі3» негоавут Уузідака «Ой 58 чів піп Куз сСуз щіп ій іви АЇЗ ашй Хі ази сій бів щег АКФ ї х 16 15 «ВО» 58 «іх 3 «їй» вілеюк «ВІ» Номівиєю тідака «Не 35 кіз вто вве уаі біу чаї маї ТВе зіу уаї сту бБіу вій
Х 5 30 «По» бо «її» 3 «ій» НЕ й й «215» штучна послідовність «ес й хаеї» блігонуклестинний праймей «каб» йо васасататт стоссвазак сс 23 «во «лай. 0 «аб» НЕ , й «2іїїх Цнучиа послідовність «дЕО0х «бах Опігонуклесвтидний прайнев «ою асзасидеоа сочаттаєсас о «2 ВІ «ії» 25 «Від» ДНК
«Ії» Штучна послідовність «ев й . : «кай3» Орлігонукавотианий прайщер «ню 65 пвовксавжжх састивсаВ с я «ЕМ 63 «ії» 88 «Фіг ДНК «13» Штучна послідовність «ве й «да3» Олігонуклавзтидний прайнер «Не 63 сетатсссва ск соцЯ два ях «210» 84 кої» 5 «ей» ДНК. «ТЗ» штучна послідовність «дзве «23» блігонуклеотидний праймер «Не па дсзасзаюва састасєссяа Фа 25 «ее «гії» 25 каже ДНК ; й «Її» Штучна послідовність
Сто п «йа3» онігонуклебтиними праймер «М 55 й зстдвевата адстововся Косвоа 2 «2305 б каїі 13 «іо» днк , чІі3» штучна послідовність «220 «823» блігонуклезтидний прайнерв «НК БЕ жсазтасра дсадсеває 13 «М» БУ «2іїх 20 яаайх ДНК «ЗА» щУзна яаслідовністе «ВО. «аЕ3» даЗговмуклевтивнмий гроакмеря «АП» 6? «ство очка 2 «2» Б «Мі г «йї22 ДНК «2А3» нтУзна послідовність
«О3У блігонуклестидний прайней «ВЕ БВ й хєдсвозаєє стотасавсо 20 «ох ба «вії» 20 «ій» ДНК й «еії» Штучна послідоаність «лох і «ва3» бяЗгонуклестидний праймер «0» 59 сазкватяза якос 2 «Зх 70 «і 22 «2і2з ДНК і «233» Бтучна прслідовність «Шк.
ЩО «ае3» олігонуклевтидний праймете «Но созозадиата ссвтсясткс 50 22 «ам» ТЕ «гі «2ібх ДНК «21» Штучна послідовність ки «ої» Олігонукиеотидний праймер «Нюх ТІ зосвасавіс засштєсате в і «М 7 «еЩЗії» 838 «ій ДНК «335» ногавуя Уучідаге «НЮю ТЕ Щі цасасактатт стдссазавс сссзозасля тантсастто ссусзувіе зрадзаєвей 5 тсвацатаса звгеджссвкд сттсаукава садтассссз звасівозат газоседнх їжа ассеЧсТЕЄ зесазнссяє ссвазаваас секс теасва встав кекс 150 твтсєваткт сттжтоатосєх зосаазетос зсттватссаа седатксттеє тсктссеВт сао тесті сіка зассзаєтав сесааєсову сасатадєса сасксядав тсттсВссе в діссствтва задсосвноєс затстосвса ажстсяєсає свссоваває зссозоаасс З зсазазстз) звоазесавітс зктЗасавес сассдазато дстааесоює сеускЕке 30 тотвесчата ассеїсосес ссасОстеЕ сассвссось сзасосоацяа ссаакодЗай о ствасясттссс сттозтаасс ддсествозся зстасватеє: озосоєцавє ссаоЗацва 340 сецреткуво зксотєсооє вобікоєора ссвасвоєта схов сксакоцао що сасовчассс садзсдезоє зстоссзаса яса зссзасессу зусоссвссс 5 сесоссстє збксадвісо совоосаата совосвесаз зесовобтує сасссваа Тт2о0 ввчатсстсс тасссораса оуасеуєвсс шесастоєаа сзасоавцає посовооає тво сестсцєаава сопкастяєс сарассааає стсттсцсаз савтєзтоце азофсався ко еповтвесве сзаноєсцтаз сттєвссюа зсавдеєадоа сСазодасаве авобатеєта що сесаЯактса аск ссає засаасеоаВ зсвацвзсна сзассаауає ване сс Зо асржсстає ссвзаціоква сттесссвся аквоссаю сваздоєаао зукваєсваов Зо жастаєсса язсосаастЕ сестретаса зссаоцасяа дпосазсава поєссвасса за пиотосазвст гстксакаас авссадойса зодасадоЗа сессаовнваца естаксавех аа тосаастксс ссрсатсаоє савозсзаєі здсзасизсоса зрасааацоє засадодота 3їю стдссєсвацЕ бевасттстс саснасвуєс додаснаоцо сзаасаваох зсесвевтає 3250 застксєтсса сазсазтсоо доасвзадоцса зсзастЗдоз сазодоєаве зассзодаса з2й додсваєва супсвессав псдсавескех фссасоаасао сезодасаве сорсавсааву ї3Ко шесствсссз адтасвасті сіссосвма Зсадрасна овосаасзвоа ботасаассє іно задтїсаваєт тетасосадс здскодозса звтосвасао стоодасаво досвакавоа з500
Зтваєтаєсса зстдсжастк єтсоєдсвса пссаодуасаа опсазсаяс сзрузсаацо ЗО чезаєваєся поса засаеставе зсазоовсна Сазсзайоає задає іо здазсастаєс ссвацтатаа сестссвся сесзваєзоєа сзвопосава забозсасса 1550 сссвазоска зсттстссоас адсвоксаца зсавщсва сазповтасс аск 1740 адсктсттса саооютсоа гасзацоюос атоссазсає зосвсассте сессдсзоса що доацосасаа дФдсоссзаа сежсттсясс зазосааову стаоцассох кобасовеє 15 цевсоовосї кабасвсвас адзавесадо бсамищвас ззсссвовс дасте зго
Чесдевссво сзапуєодюа дессспвсяо квустався взсооаосває сасвоввацю 1580 зазокадксз стссакіск звсзавссас ск сесесх саксаадУк засвавссас оч
ТтоЕстскссЕ сассводасс адсаваєссвє тУКсКЕсСсЄ саїсадовес зддсзааєсяє 2щмю тцтстссест сассвоцдес засваасеяс сусстсссся сассваЗяхс засзазсее 2160 саЕскосєюх какає зусваавссає саїєссюксю сСакєссороєє засвавсеяс 4229 тожстсксск саксаростс зосаваєсвс Фокстссссе сатссвовіс зосавассяє Іо тости сассВнюсс аасзаасевк такс сскт скатсадоасс зосзазееак 2340 сагстссжкт свксвопютє зокааассас свтжтсеєкек сатсаозоєє вдсвавссає вт) сетстсссск саксзооспкс звсавсссою созосавсск соте сє секс садка ЯЗКО заксассдка зебскрсаєс атоуссався дтксаасвад стукастасо зсавсскика 2550 ссвісставс зіодвосвос соссорссав сставаеціа дсаваовсоє адсабстсв 2580 ччкосзнаска семан ягсоадскаЗе (сво сОас барсскаїкцо ссадссавка 2550
Чкавдаанскст дасадсткоуєс акоутаєтов озсекасата саксттаосх згзсазівав. 2700 сровсної оскгосацк сеїсвівева стаоуасааз асскваєват васогавайс ВТ чав кексів звзаздзасза застовсУєх акзтатвоса тусастасвх 28 дкстсвоаєтх засво 2838 «23» Ди «ліїж нНогавиж киїдагя «КУ 73 васасехвтї сс-рМмсзавас кссзуаасза сазксвсттс сазан доза свя 50 ссаввавінса засоабссисо ссісзосвяа свотаєсссса застає кнвосесоВІЕ 120 вецдедоєттї зосадавссяї ссасвавайс Фоксстосав аестсосаакт сетесткосЕ 150 хатесватєтє сіток ик зсааяс астжктсза ссоакксток сстТКсосВто чо
Тктсттстта постваства сасвассуєо сасзсацдсса кодсссвдаа сеттсассіє 300 дтгестатоа даессадсс вакктссака зестсвккає сгассдадайс асководаке 350 псззаастао зщаксавтте аетЗасадеє сасспразака зстаацсє цс 320 удсопеаеа зксдєєцесс тсосоцетст свссассоєк дзасстоада ссвзехщова Зо саєсвтжкес спттовїіаесс дссстодука зстасаЗкає Зазсосолоє кекаададай 40 ссср зсукоссас здссоа ссазсвосто тод ссвоє ассатоово ща сакодоцетс садавеоєснат пстоєкавса дсттсаЗовс зксвоєєсссо авіоскцюсс вай сексом воссаоуєки босуасвака содвовоєва зсковостоє сакесваоца то зводаксстіє тара дуаєсусаєс дсєсвестоєаа свадязовах озсздзоаає то кестоказва сЗатаксвос свпаєкаавс тОсЇккоисва свзотесаєвос авдодкавсв Ки зіаставсасє сазаоєотаа сктстяжсся евасесвоа сзадансавс аа еса ОО сесацаєска зстксссєос зусивсосади зсазцдадасаз сазеосвода: зузацозокх о засів х ссзаостква сіттсскаса асвоссазай саводосава зосваввася ЗО зсаводзахвс тасссавсо сапстоюсст сстосадсса доаисазовоє аасвадодєс ЗО стаксавзавє осаакітієти сасавсвоєє: зорасваова саворвасааєс завацесста 1140 тссазктоса всттссссоє зісадссзоЗ зсазкодсая слассаоаає вазадсваса 1200 зваотаєсво скеваєкасєза сктсткеася асвосевза «аводасвас адек 260 задівсваєт їсСтстасаас ваїсощка зщнказсаа стввасаяо ддгавсааєс 1150 зодасзаооиа сазасянодоує зсссввотає засткттсєка саасняссвоа сзсазтоеа 1359 зсавосуссс тасссаадта савсткмтос зсаосяеса пазсазвус здасвазвацез ля свасссааає заастста сусаЗсазсс Збозсанио свасауттою ззсазадцєа 1500 всайчацкає сасесввмко саакткскх зсаясвоєка Фдзгазооох ззсацстаоя АБО зсавзаосав саасследцає атдовсвася фара додкавсаає заддасваци 620 зЗсваасзвозЗа састасссвя зіатавстс сссесвссаз звсводасазо досазанаяази і155О зсастаєссв зпеосаассі скссослоєз бссгаддасва бцасаасазо дасвссацес 1740 тадсозашеї тстссасацю ЗаксоЗтїса зудозсакас саскасвоса сакетїскке зо здсздсацева ФдсасаавовЕ зссаицесккх тгсассвааа сзадвоастою оса ЗБ5О ківсксовух зодаосЕкаса сасазсадва ассадойсва допсвсавсс садутозиве 1550 ткстссаста сассацсвав бордо свосоокацо стаасовасою засвассдєа 19580 ззЗазозаво своссафїксє згтассадса заєкактукєс теессстовес засво а що азассаскатс сессстсатс абротсвося зассастуєє тсжостевВіє задає ак вассаєтакс ексстсаєс зедексвока авссаставс фсСесстсате сподутсяка 1650 засеаскокс тессстсавс заоодтсавса вассвжтукє кессстсвоє сеудксаЗса 2520 заассзеснеєс тсссстсатс заздссадєв аассаксвеє ссссстсвВіє воодтснка ЗИ зассаєсокє тессесковсс знодтєваса зесседеова садсстеуєв окт ссо за тсвосазаес ассдсатесс сдсассатууз ссласаатеє засовуєтоє зссзсосвЯ зщю сесвтассах зсквосрсоа асазоєсоки Фсосадеста заветацсва водкосауса АК пстсвойса своєкоссоовюо сватотатсо дстопаводє бпсчасозєє каста д550 коза засто: пссеацю мксвса тсзсснсє ссзастакає 258 захаажнцто асист освокттжке асогавство сФфісвазассс аасаатвАта 2540 свзаасоцаа здссессса гссаваазва даасвазаєє оцсоєстакає зевотатоуєсв кю ствсвжніск сашщсжсвіта сно та «Мід» Я еле У «кій» Білок «13» ногбецю Унідаге «Юр 74 ме Аіз суз Аг ши Узі сем ра УДі Аїя та їїв Ууаі АЇВ ке ді 1 в їй КУ від вем тигб тб" Аза сів аг Єв ї18 а5еа зіу ди ажап тів веба сем зо 35 З хв Баг Аго бе аку біп без бів су Фім згу біЯ вес щі Фів дек 35 30 45
Заг сем овім аїа сСух ага Агу Уві Уві ар обів шій ів мі б1у ій 5а 55 50 ів его тТгр заг о твг біу сем бій мех бій суз сує зі бів ву де 55 2 т во азв Уві 5ег Вго зі Сук аку Рго уві вія єр бек бів Узі Уді Ак
КО У
Фів тук бім бів бій ТВе с18 УщІ Бгто Зак кує іу «Ту чек вна тТуг ню з о вга Бі сіб ТВг о АЇВ вро Рго їв Біб шій оіу у тое тер біу твк 115 З 155 ет уз! руб Т"В Тук ТУг го зв Бін ТВги Зак оЗек ів Бій баб Те цю 135 о бів оїу вій віп Ту п Ні дів Чех Уві ТК бек хек бів сів Рго і4х 15 155 збо
Зі сів сік бів бій біу бег туг Бго сіу баг тТвгР Ба Рго сій сій
165 и 175 го ту вів бу бій бій вго бі Бій АгФ бій Бго Ткробак тує го
То 3185 М ек Ай тТВР ге го Є1й бій Рго віу Бій БТУ їй щу вів бів" бу 195 зо 23
Тук тує РгОо БІ Аа їВг бБегоіви цеи сій РРО біу бій оту бій Тв а 315 820 іу га туб вій Берг АТЕ ТВе Бак Рг бій шій Ро ту вів вік бів 825 «30 235 тай шіу ні сій Зів тне ту бій Ре Афа тйгБ За вка нія бій вва віх
Ах «щі 255 сів тгтр бій бів го сіу сів оіу бій бій Ту Тук Туг Вго бак ма! 250 255 220 тТіаг бек вра біа бів Зеє сіу бій Ту 1 Те обі тує вго 5ег ТВг 275 28о 285
Тве БОР РО сів бій Жак обіу бій оеіу іп їй сей сбіу бій оту їй 230 2955 КІ) сів вго Біх вів ту бів бій оїу Тут вго вк Аа Же вне го бів
ЗО зІ0 315 320 сій вто сту бій тер бій сій ім 5яК їуг о вго бог так ТВ обег бго зах 330 335 сів Фій ек сіу сій бі віп бій біу їуг дело рго Заг іх ТВг ек кеВ) 45 ке
ТвВе о Бів вів го ЄТу бів жа! бія ої; ем щіу біп Єїу вів бів б1у 355 зо ЗБ
Тук Тут рга хе Ай ТВе Зве го бій бів Бра біу сія біу вів бій 370 375 38о їви Бі бів с1іу бів сів вве бі ні БІ їв бів ів жа? вів су 385 за 3а5 ой
Зіп вів вів біу віп вію ія ЗБ І1у Мія Тук бго бег Мей їВг бе со ч18 415 ге ніх ої твВе Чіу іп бі біб бух їж тує тує вго бве Ав хів 4328 495 о зе" рго Зій Зійп Заг Біу 83 сх іп бій біУу Тук бій го зак бі 355 48 45
Аїв ек 5ег бів бу Бег уві бій СТУ АТВ Су бі нів бек те бег ще 355 50 зек вга біп вій ій Ай сій біу сСкб бій ліз бег Бек во БУЄ «ІЙ ах 370 475 Зо біу Боеи біу жЖве сем тує Тук о Вго Зак ої АЇш тує Те ід Фі Ку» 455 що 4395 вт зіУ сій біу тук аа вка Бі Біу ТйР Бак вро рец нія віп зів 505 510
У У 5 ре оіу бі біу ви те тик Бі» Біп рго вів бі Оу
Зх ЗВ 525 б сій его ера ніх Се сій бій їй тйгБ оУві Заг вга нія бій ТУ
30 535 540 іп бій твек таб ма? беє рке нів бій бі бія бій Таб оте Уаї баг 585 ЗУ 555 БІ
Ре Ніз бів сїу бій бів так тик Уа! бек рго нія віп в1у вів вів 585 КЕ ких
ТНе ТНК Удї его вго нія «ій бТу бій шій Тве твт Уа! бег РКО нів
Б ЗВ 550 вій аіу дій бік ТВгОТВе Уа бег о рго нів Рг Бі бій сій ЯК Отак за5 ОО 535
Маї Зек вго нії бів біу бів Бів те тнК Уві Заг о бго нії вго у що 515 вав зів фія те Твт чаї бег рго нія сів бБіу бій бій тВРотВе ЖЖ Зв в 535 -що
Бго нія бів бі біб бів тйе Тне УВ' бек вро нія бій біж бів вів
Бі БО ко:
Те тег Уаї ха» вго ніх сів б'у шій «ій тТве тТвЕ Уа) ев РРО Ні вве БВ Бо сів єїу бів бій рго біу біз біз рго суб біу Ре вро ві бів вій 575 Во 885
Те тн чаї вет сви нія ніш сіу шій шій ев АбА ім Сей тую тує що 5 7 пі баг рго Тут нНіз Узі 5ек уві бів бій го 5ар аіа Бек с) Муз
У 710 735 а і вів суб аїв Бій бій іс АїВ АЇВ бій ви вбго Аїд вет суВ ага 725 73 735
Ме бі су І сіу і їв зва вій бек бів 74 745 «аз 143 «Вл» Білок хаі35 НогчЧеня Уувідаге «ОО 5
Меї Аїа гує Ага рен Ууді ви гне Уа вза Уа їв маї лів іве Уві
АїЇв фец Те Тае діа віз РРО бі) Хі ази 0іу аБи Абя ів РВЕ зей хо 25 зо аа йег ага зек сіу бів бу Бій Су сій а"о віч івн бів сід бве я 45
Заг івз Бі) аїа СуУуз АгУ ге ді ча! дя бів бій Бей Уві бїЖ їй ща 55 БИ зви РКО ТРроБєг ТВг обі бен бів Мет бів суб уз Біп бів Кей Аго
Ех КК 75 ко дев чаї Бег го бій сСух аго Рго уві діа іев бек бій зі УВІ ага 85 ща ща бів тТуУук сів бів бі» ке об уаЗї ро аг огцув Ту Бу Бек вне тук 198 Ме мо вго йіу біу ТВг о Аївз Вго виз їжу бій За ТУ е1У Тер те діу Твг о 353 КІ чего УЩі буз ТеротТує Туг го Аяав З)іп ТНе зегозег щі шій Бек тгр що 135 130 ва сіу бів їв віх «ие 768 «М А
З їз: Жде «відаге «00» ТК заїхскавос достат стос ря чтаатсека сестсотоцє теесассяєе 5 зссцезсота зазїсазіов даакзасат єссссевата десоєтеваа дсздесваео 32 хасзансдсо зоссссзоза дацессцеске озосотсс досодосоє драсєсвасав 155 стоБітовес азстоєсато фавсвсооцо стскаакос збо ся дсавсюкКод ав застсадск ссопатосс сессхсдсе сксадссадо ссесдацося зкасазосад зо саазссопвоЗ Коссатссва поозадатес їтстасссво осозоасесце аскосевсто ЗБ саосазаЗео озкадтоой засеїстаїв вавбовіаск асссвоаєся аасткстесв я саасацтсах язсаноаса зсааодотає сассзазосо сааскссєтс сседюсарса «Во цвасааск зпсааопотє стіасссадтї кевассттєс сревосансє зобаєсвазаа. за саасаассяа сасзизодса ссатодтсс татосвацдтіо свзастстссс всзасацюса ща цедсазоцас азоодсваси зоодтассвс ссводюосав скссскась пезоссвода. вав газдоцезає задпцесста ссвуадіока весксстєкає воусавссаці асавозаєао т2а пдзакассавиа зйвсстатся зкЕсодсааех ссссеврсакс зассзеваса атовсвазсва тво ссадужєвад досавсааво зсаскассса восасзаств сбссаєваєя фесбоцаєва 84 цюрюказваєсвюз добсасессвао басавсксст сесвагавсває свазйсаадо всвасвосеа жю
Ззазсазоазоє ззсавссаоц асзавошусяа сзафтасс сазососивє теевссвсвя. ЗБ «ашсаозас закодосзаса зоваїсстає сезнвеасяа скоса сх своюа цнео садшщмавс зни тасаа сссвазтвда «стжстасвс абсвоєсоово зсзазсосав. і08о5 сазстоодас ззопосаася запотастає ссазвтжаєва ссстссоі денна 1-43 саатдсавс аастаовся зодосваєсва ссводасата досавсавст зпртосввова 1290 сазсзасвво дзсазодосв асзавцвсає факссвавцта соасксскоє дсассаавса ій пдакзаоцас аззвааццата стасссаває певакктско сосвосзауєс зоадасзвода. 1350 садсзвацаву вссадсскаа хуоазосттсї тсясзовЗа сфросвано досто і18о сасвасасав ссср зсаосаноса сзапоцтаєє зи ткстє зссваадева зо здоостзодак соктотаста сссдауєоаа десказкасас засздазнсо зпудсззосВ 1100 тасвасєссяа дІдшнасттс їссостосає сгдсяаццою зводив свою ста 1550 псжсодавс аассосооє лодовавєво сеажтссаке десвоєвивс сота їв
«стсассаоа бесадсаває сасжакКсс сстсвісавю усовосаавс састастсх 18КО севсвісаца зісзасаазас састоєекес кетсассвою песацдсазає сассчтсос 174 сексвессацо чесадсваває свссцсстеє ссксвісацю Зксвасааас аск 10 теккабссца зксадсвавс састокстсс сктсакоаВО Згсаамазає сассахее і5БО сессатссос Яссаодслаає саскоакетес ссссатсвою дксаденаає светитевоє ІВ ссккахсВцО уксаздсанає сассакстсс ссесвісаві усспосазас сассостсє ї8о сетсзЕсацй Зксзосванс саксУКеЄкс кстсакквою десавсност ссцазкяу ма систосацск кесстазсса дсзазссаки укесстесквс зсозівесв са ссває 2 спаоттакаст асодезоєсє акхассасіЕ звсокосвок авссоксоює сивествайе 260 зеайснааой косаосвасу севсвосдєва стоссодсва касок оєт дове ЗО ппсопасскоє тодесадкса що зна «аю т хім 450 «еїйх ДНК «й» Нерівцюв чоіцаке «НЕ Я й зідпсктвашс достозєєст сектуковсо зсваксвтсу ссстовеооє соковссаюю щі аксрзакссо цитсавтою пзасввсяке їв засВ сс оса 330 текоаасвсо зосіссвода чищсїсвсс зазасесаєє фс жна 38 стовЕєюєєс воскдссако давсасачао скоса забоссаска дсазскево ве десдїсввсс ксуаотвеся ссссабсоєє сесацссаці ксеасБршоаса касова 00 «савасквасо їопскаїскаа додані Кістаєсою осоовасск вососсаєа ЗБ квосавюави здахачеовв азсктстаса ааабоукасх зсссацисса засто г савсаоїсак здусвадовса зсзаочакав 50 «Ж» 75 «ваійх 81 «Ей е Білок «33 нагода озна «ап В ін Аа куз біз УЗ ев іух Біш зго Зв Уаі Сух ів цем біл ме 3 З КІ ї5 і тТук Узі бій вро сер їіб рем бій бій Бе) аз ре с це ма га 2З а вне вен яп бів с1й Суз ек бто чаї вий Меб Бгзобіб вез КіЄ від 35 БТ ща заго чюг цій меб ех бій є1з Явг хебосух віз узі ев сія З їй 50 55 що їх Суз бій щій ве обко бів Хі Без Бій БІЛ РНе ака міх «ій АЇХ 75 що хів Ага АТа жі чаї Туг бег Хв Ве ве Бій бі» бів ге Бій яв 85 зо че
Бек УВІ фія іх Ма дек обій Рго бів Бій бій мей бів Бій т ота 10 30 ЦО
Ууаї біу бій бух Тук Ріє сів бій Бео бій ко 15 «ІЙ ев бі ай це 150 125 рга бій бів УЗ! кго бій баб узі Ре вен сій бео Між ій Же АВ що 135 140 бів веи Бій АТа Те аБи бег Те АТя ва аг Твгк оре вго ТВго ОМ 145 150 КХ зо
Суз хи Уді и Ма Ре бою о тук дв Хіє Ме Рг рве сбіу Уа? сту 155 зо 175
Те ага мі ві Уа що «кщ» 78 «аїже 876 «ййию вілОК «ІЗ» Могіавивт міка
Ме вує те РНе це) хів вве аз іо вежу Віз Ї36 АЇа АЇа Те ака твР жхїє ліз «ів бів бій го Ре рге бій Біб вро бій реє тує ге ій бій вто вій без тує Бгообів бій Ве Бе ве) ба бій бів Вб 35 0 45 ве рег) бій ої в; рго бйе тер отгр вів біб вге Узі бій Зек вів
Зб 55 во іп шій бо сух« зій ві» бій ій Те бго сен бго бій 1у іп бів 70 75 Во
Тук іп Риз рев їец Бій бій сів жів вВко Ре Уаї нія Вгообек уд! 5 о щі ме Біт бій ев аа вка Сух бу маї ве бе шій ій бій Су ек що 105 цо
Ргте уві вро Ммеї рт бій Аго її авіа Ага жаб шіп Ммеб сей бій ів я 125 25 его баг сСуз Ні уа!ї Кез зів єп бій сСух Сух бух вів меш Рго вів їз МІХ 150
Іа РКО біз бій вве ага ніж їм Аїв тв все АТа тіє Ії тук щек 345 1 КЕ з тів їі кеш сів бів бін бік сій і вів АБИ рве жа) іп рез сів їб5 70 175
ЗШбеїа бій рго бій Бій зее уві Бій БіУ Уа бат бій бек Бій 18 ів 85 ща ій хек бія бТй вгРО бів ге іх цій сСух бе ваш сій шіп во ся іч» Ре 205 ін бів бін ем о Біу ів сія вго вів вів біл бін ущі во ев тте гак і що дід вве ем жів Бгто Бій бій мех аа бій Бе) бін жа мех тВе век 2 230 Ек Я і АТа вев агО ТНК цей вго їВе меб сух аи Уві Ап УВІ реа ех
Ах 250 355 тут бі хів те те его узі РКО ев бегв уді бТу тнг сх чаї іх 250 455 зх вра тут «105 80 «8» 337 «012» Білає «йі3» нНагдфвию страте сю «221» із, тватуга «лях ІБ13. О.В й й Й «523» Хав зможе бути будьсянсю амінокислотою,. Що зустрічається у природі «0» о
Мет вує ТвгОРйє рей тег вне Уді вес іви ай мех вій Меї 5ег гів і 5 їв їх
У тТвВготвК Атія Ага Бій фам ай го Зеб о ніз ія БІВ сем дів бат
Р 5 зо
Ре щі бій вко РВе шо вух Січ бів бег о тує вен ші» бій рго Тут 35 БІ. 45 втз ій бія вбе Тук гер вро біз бій бга ве вго ТВе вБго ба бів
За 55 що че реа вго Туг ів Рго Біб бі тТве вВа реко вго беб хів бій вез то ух Во
Ап о рРГОо дев бій Рез біз біб во ре вго зей ій вго бів вго вто 85 з 95 іп бій го вва го мій Рго Бій бів Бко да Ро Бій бів Бго сів цю це о біп вто ре го Ага шів вго біз бів їів уаї Рг щЩів бій вго бій ца ї33 125 біп го вве вто бів бій еко бій дій ее Ре вео бій вко сів бій їю М зо
Бгео Рне его Тр бів рго шій сів кб вве їн сій вго ев ота це 145 159 155 що
Ха Рго цез бій дів бій бів бго че вго вен діп Рг Фів Бем реа ї55 179 5 реа орга бів бго бів бій бго Хів бік бів бій Рго бує ІВ бе це 186 185 1 іа хів бій реє бій бів тйг їі Бго бій бів бга ів бів Без вне 195 200 205
Бгто іже бій его бій бів бо вве вго бів бій вго бій бій РГО цем
Ж 2515 20 вто бій жів вго Біб бій Хі Жів бег бій бій го бій ів рго ле 255 230 35 0 го меи бів Ро сів бій го БвВе вра бій вВга бій БгО Ре вко бів ах 258 235 ів іп вго ій б1п ад ке го іш бів Рго бій бій Рго ве во 285 27 сім їн Заг віє ціп хів Хі ївР дій Бі Рго Ре рез вн бій вто 75 8 285 сі бій ів ее рго бів бій вго бій бів го іво Бо б16б рго бів о 25 за біб вто вве аву йій із вгб вух Туг ХЇа їіб бро бів бій Рго бів 505 КО 315 за зів вго вве вецівн бій Рг ні Бій Рго вів бій вто Тут 813 св 325 336 335
Фа аАзр жів тб Бег ази Ії Аїв веб івь бу
За 345 «З» 81 «гії» 05 кед» Білок хаіЗз номен Умідвке «0» 1 мет фує Хі ев її їй іви тВг о їії6 іви АЇВв Мет лід Же о тТвк вне ї 5 30 15 аіа тТвВг заг бів ет бій уві ап го бек о уді ій уві ій вго Те 20 2: зо пів Бій пів во тує го ім бек біл бів Кго бе хіїе зег бій 5ег 25 чо 45 ій бїп бій вне его бів бго бій бій го рве вго бій бій го Фів з 55 5 ів Рго бе Рго віп чвг вів біп Бій Суз веб біп щів Рго бів нів 55 70 75 во зів вве вго бій Рез Тве бів бій йж бго Бі АГРО РО рем о іжа вго 85 90 5
РВе Твг нії Бо КНе зви тТаг ОРЕ Ро АВ ОСІВ іец сен вро бів Рг ще 05 що
Рге нів сій бек ре йго сів рРго Бгто бів Чек Тук рго бів рго ге що 128 155
Шви дій вго вне вко бій бро его бій бів Бех тує во Зі бій га 150 35 їй віп чів рго вне вго Тв бів іп его тег оХтв оїв вен тує мей о1в 155 35 ї52 150
Фін бів сен Аби РОЗ Сух су« Фін Ре бер ей ІВ бій Суз за Его 155 ї20 175
Уа бег ін ге зер ТР Хі ТгооЗек бух Ха маї бів бій вк обет зо 185 о
Сух ака Узі Межб біп бін сів Сує Суб Мем шій іез Аїд Бій Хі в ща 0 пім сів Туг цу Суб ТБ оАЇВ 316 Ар Бег Її УдІ нів 434 Хе пе ій 215 2 меж бів бій о1іу біз Аго Бів бік уві вій ІТ хаї бів бій бій вго
325 230 235 40 бів орто Бів бів Узі зіу їй Суб жа? ву жа) сів Ту сів бу ма 45 25 35 чаї бій Рг Бій фій соб аі8 бів меє бів діа І16 Аг тТве сем ді
УБО 5 270 іїве бів 5ег о уаі РгОо Бек Меб Сух Ахп о БНе ап о Ууді Рг Ро Аж Суз 275 28а 85 зер отнт Ії ух Аа Рго бне Уві сії Уді ма! тТигоб1к Уві ві щу з 295 а еп 305 «302 82 «в1ї- 553 «210» лок «213» Могіема Уумідаєа «НОЮ» В
Мек бів ма! адап р бег узі бів уді шій бга тТве бі бів сів вго 1 5 30 в тус та Бій заг вів бБіп бго ве хі бек бій ЗБР віп вів вів рце го 35 зо
Бу єв Рго сій тя вчу вва вро вів ага йго фев Ген вка рве ТВе 4 Е
Нє впго Ве ре) ТНРобне Бго Ар бій бен ів бе бій бго бро нів що 55 ща ціп бек вве го сій Рг Ра сій бег тує Бра шій Ве рр фей сів
БЕ 78 75 що
Бкз вва Рго бів во во бів бів бу5 Тк вто ші сій Рге бів сій 85 Зо З5
Вго вне вто 1 сій" шій Бко ТвР оте бів Беб тує бе сів бій іп іо 305 о
Мей АБИ РРО туго зує біц Ре зуби без сів бі» бух Агу Бо Уа ек в 126 Не
Мен бе) ек тує бер ткр Бас рух Ї16 Уві бій біз 5ег бек Єж5 Ага ї35 1315 30 чУуі ват сви бів бів се суб ува бів веб вів Філ хів вбо ов їй їхз 155 155 150 туг ву Суз таб оаїв х1в Ар ек ут Уві ніх дів їів Ре меж сій 165 1475 175
Фів іїУ шій яко іа біу УВІ! біп її чаї біп Єва бій вро бій веє і8 155 з бів Бій Узі бБіх віп сСуз Маї ву уаї Бій біЖ бів бі чаї чаї вів 195 зо 205 ко шій бій цем Аіш дій мет бої Аа хів Ага тв шен ма? ки Фій 2130 215 га бевг о уві Вгао зер меж Су Ап Ре ап омаї Вго ргО Аа Суб бер Те 325 230 235 зай її ух А! рко Рак ма) зіж УВІ Узі Те обі Узі бу С1у бів 745 з а55 «ее» ЯЗ «їі» 89 «їх БІЛОК чаї» наглпецую Уунідаге «НЕ 3 ге Те о тТве тн Твг має бів КВ деп со Заг ооіу гав бів ев сів 1 5 ї 1
Ага го біп бій ів Ре рРго бів Ттробів Бго іву бго віп бів то
М, 2 БІО го бе веци бів Біб бів вго вів бій вго тує го бій б1л бів го а 45 рез вну бій вій бій брз бре бус бій бів Бго бів грец бто ні бів
ВО ні шій ве вБга біб бів ев вто бій бів бай Ре овго віп їй меж 53 о 5 ко го ев бій Рго бій бій Фів вве йко біз біб Ме вро во бі во 5 зо з5
Фіп бій бій рго біс бе оба біз бій суб Бго Ре Біу іп Тук бів
ЗО 155 З ів вро інв Те ойій іп вго туго Бко бів бів бів вго сем дія ст 335 Її 125
Зіп бій вто заг Хі бін біб бій Мі бій ін й5в ве) Суб вух СІВ 350 55 іо
Све іжу без Бів 1» Си ТНК бен АФ ТИ мух чаї вго баб фев бій 355 ї50 155 іо дек а) Тіє Зоре РВЕ реч ака рРео Ні Хі бег дій бій Ахай вк гу 185 ї70 175 сіп сей куз ака сів бів Сух Суз бів фій цес; Аїа аба Хів ав ЗУ 380 155 ІВ сій жак дгу Су Рго Аїа Хіє бій тВг їі ув! Ніз аїя їі уаї Меє 135 ОО 285 бів біл біп Уа! бій бій ціп Уді біу Мі5 бБіх вне уді вів Зак бів в: 215 зга їев сів дів во б1У бів біу мет РтО х16 бій ех ія с1я фія рго 255 3 щі фо
Оіу бій аз бе чаї ев бто віп бів Бій аіа бів ВБе уз ущі ві 245 250 235 вІУ Бег бен жа! Кі сій Твгоїац рго Ме сей сСуз ал та нія уд 250 Каво 270 вра Бге Туг сСуз аг орго Ре Біу бек мех Аїва ТВ Бі Зак бі є1у 83 2 85 ів «ві» Я. «їз 73
«217» Вілак І «її» ногуеню мита
Ме уз ТР о МежЖ вец Х16 мес віза іє6в Хів АЇїа РНє Аїд іа ТВгоЗег ї 5 10 35
Ята Узі Аа сій сей Ашр ОтТВе Те су Беб бій щі Тук біу сій сСуї
ЖИ й зо ів вів сів га бій сіп (їй ех йза їм су вів ла Яке їви Щи ів був 5ег Аго Ту Бго тує уаї іп бек вів меб Тгробій їв бек 55 50 сіуУу Сух бій іес меж або бів бів бух сук бій бго меи Аз дій Ме 55 то 75 во зак ій бів аїй ака су їй Аа Уа) сСух бБег мет аїа сів маії гів 8: Б 53 мет ага віп іп бій біУ бій бегорйе ТВ вій вВко шій бів бів бїв
КК 15 ца
Бек бій бек Ре пік сій Вега бів сів бів уві Веб узі бін оУаі МЕЖ 135 120 1 ага мет Уа вец бій Таб оБеу РКО щег мех Сує бак уаї аква хів Ро 130 135 140 біп тук суб тве оте тве еко Суд бек тТНе тів Тве ко те Хв тує
Її 155 і16о0 цег Хіє Рез мож дів АТ Тк осух аів Біх О1У ма Сух 355 КУ «ФМ» 85 «іх З «їм ВН «яї3: ногбвую твізаге «НИ» й5 ка віп бів фен аїж АТ бій ви бро ва Мет су Ага й й й

Claims (35)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб одержання харчового інгредієнта або інгредієнта напою на основі солоду або харчового продукту або напою на основі солоду, причому спосіб включає (ї) переробку ячмінного зерна, що містить 50 м.ч. або менше гордеїнів, для одержання солоду, сусла, борошна або цільнозернового борошна та/або (ії) змішування ячмінного зерна або солоду, сусла, борошна або цільнозернового борошна, одержаних із вказаного зерна, зі щонайменше одним іншим харчовим інгредієнтом або інгредієнтом напою, причому ячмінне зерно, солод, сусло, борошно або цільнозернове борошно містить 50 м.ч. або менше гордеїнів, тим самим одержуючи харчовий інгредієнт або інгредієнт напою на основі солоду, харчовий продукт або напій на основі солоду.
2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що зерно відповідає одному або більше з наступного: ї) зерно містить 20 м.ч. або менше гордеїнів, і) зерно має співвідношення довжини до товщини менше ніж 5, ії) зерно одержане з рослини, яка має щонайменше 60 95 врожайності зерна відповідної рослини ячменю дикого типу, ім) середня маса зерна становить щонайменше 70 95 зерна з відповідної рослини ячменю дикого типу, і м) зерно одержане з нетрансгенної рослини, і мі) щонайменше 50 95 зерна проростає протягом З діб після набухання.
З. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що борошно або цільнозернове борошно, одержане із зерна, містить 10 м.ч. або менше гордеїнів.
4. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що солод або сусло, одержані із зерна, містять менше 20 м.ч. гордеїнів.
5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що зерно або солод, сусло, борошно або цільнозернове борошно, одержані з вказаного зерна, містять концентрацію менше 2 95 від концентрації дикого типу одного або більше одного, або всіх з: ї) О-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як БЕО ІЮ МО: 56, ії) В-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як БЕО ІЮ МО: 53, ії) В-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як ЗЕО ІЮО МО: 54, та їм) С-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як ЗЕО ІЮ МО: 55, причому концентрація становить менше 2 95 відносно концентрації в ячмінному зерні дикого типу або солоді, суслі, борошні або цільнозерновому борошні, одержаних з вказаного зерна, що належить до різновидів ячменю Воті, Зіоор, Вацаїйп, Хадап, Ніпатагей або Соттапаег.
б. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що зерно або солод, сусло, борошно або цільнозернове борошно, одержані з вказаного зерна, не містять одного або більше, або всіх з: ї) О-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як БЕО ІЮ МО: 56, ії) В-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як БЕО ІЮ МО: 53, ії) В-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як ЗЕО ІЮО МО: 54, та їм) С-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як ЗЕО ІЮ МО: 55.
7. Спосіб за п. 5 або 6, який відрізняється тим, що В-гордеїни представлені щонайменше В1- гордеїном та ВЗ-гордеїном.
8. Спосіб за будь-яким з пп. 1-7, який відрізняється тим, що зерно або солод, сусло, борошно або цільнозернове борошно, одержані з вказаного зерна, додатково містять концентрацію менше 2 95 від концентрації дикого типу наступних: ї) у-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як 5ЕО ІЮ МО: 57, і/або ії) авеніноподібних А-білків, які містять послідовність амінокислот, представлену як ЗЕО ІЮ МО: 52, причому концентрація становить менше 2 9о відносно концентрації в ячмінному зерні дикого типу або солоді, суслі, борошні або цільнозерновому борошні, одержаних з вказаного зерна, що належить до різновидів ячменю Воті, Зіоор, Вацаїйп, Хадап, Ніпатагей або Соттапаег.
9. Спосіб за будь-яким з пп. 1-8, який відрізняється тим, що зерно характеризується одним або більше, або всім з наступного: Зо ї) зерно є гомозиготним за алелем локусу Но!/-, в якому більшість або всі гени, які кодують В- гордеїни, видалені, або солод, сусло, борошно або цільнозернове борошно, одержані з вказаного зерна, містять ДНК, що включає алель локусу Но/!г, в якому більшість або всі гени, які кодують В-гордеїни, видалені, ї) зерно є гомозиготним за нульовим алелем гена, що кодує ЮО-гордеїн в локусі Ног3, або солод, сусло, борошно або цільнозернове борошно, одержані з вказаного зерна, містять ДНК, що включає нульовий алель гена, який кодує Ю-гордеїн, при цьому нульовий алель переважно містить стоп-кодон, мутацію сайта сплайсингу, мутацію із зсувом рамки, інсерцію, делецію або кодує усічений О-гордеїн, або у нього більшість або всі гени, які кодують ЮО-гордеїни, видалені, і ії) зерно є гомозиготним за алелем у локусі Гузх3 ячменю, що призводить до відсутності у зерні С-гордеїнів, або солод, сусло, борошно або цільнозернове борошно, одержані з вказаного зерна, містять ДНК, що включає алель у локусі / уза.
10. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, який відрізняється тим, що зерно, солод, сусло, борошно або цільнозернове борошно містять 0,01 96 або менше концентрації гордеїнів порівняно із зерном відповідної рослини ячменю дикого типу або солодом, суслом, борошном або цільнозерновим борошном, одержаними таким самим способом із зерна відповідної рослини ячменю дикого типу.
11. Спосіб за будь-яким з пп. 1-10, який відрізняється тим, що зерно або солод, сусло, борошно або цільнозернове борошно, одержані з вказаного зерна, містять 2 95 або менше одного, або більше одного, або всіх з наступних компонентів порівняно з відповідною рослиною ячменю дикого типу: ії) В-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як БЕО ІЮ МО: 53, ії) В-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як ЗЕО ІО МО: 54, ії) С-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як ЗЕО ІЮ МО: 55, та їм) О-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як 5ЕО ІЮО МО: 56.
12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що В-гордеїни представлені щонайменше гордеїнами ВІ та В3.
13. Спосіб за будь-яким з пп. 1-12, який відрізняється тим, що зерно або солод, сусло, борошно або цільнозернове борошно, одержані з вказаного зерна, додатково містять 10 95 або менше з наступних компонентів, порівняно з відповідною рослиною ячменю дикого типу: 60 ї) у-гордеїнів, які містять послідовність амінокислот, представлену як 5ЕО ІЮ МО: 57, та/або ії) авеніноподібних А-білків, які містять послідовність амінокислот, представлену як БЕО ІЮО МО: 52.
14. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, який відрізняється тим, що рослина ячменю дикого типу являє собою сорт Воті, Зіоор, Вацаїйп, Хадап, Ніпатагей або Соттапаег.
15. Спосіб за будь-яким з пп. 1-14, який відрізняється тим, що целіакійна токсичність борошна, одержаного з цього зерна, становить менше ніж 5 95 відносно борошна, одержаного із зерна відповідної рослини ячменю дикого типу.
16. Спосіб за будь-яким з пп. 1-15, який відрізняється тим, що середня маса зернівки становить щонайменше від у 1,05 до у 1,3 разу більше, ніж маса зернівки, яка є ї) гомозиготною за алелем локусу Но!/-, в якому більшість або всі гени, які кодують В-гордеїни, видалені, і) гомозиготною за алелем в локусі ГухЗ ячменю, що призводить до відсутності у зерні С- гордеїнів, та ії) гомозиготною за алелем дикого типу Ю-гордеїну, що кодує повнорозмірний білок.
17. Спосіб за будь-яким з пп. 1-16, який відрізняється тим, що зерно одержане з рослини, яка має врожайність зерна від у 1,2 до у 2,0 рази більше, ніж врожайність зерна з рослини, яка є ї) гомозиготною за алелем локусу Но!/-, в якому більшість або всі гени, які кодують В-гордеїни, видалені, і) гомозиготною за алелем в локусі ГухЗ ячменю, що призводить до відсутності у зерні С- гордеїнів, та ії) гомозиготною за алелем дикого типу ЮО-гордеїну, що кодує повнорозмірний білок.
18. Спосіб за будь-яким з пп. 1-17, який відрізняється тим, що зерно отримане від нетрансгенної рослини.
19. Спосіб за будь-яким з пп. 1-17, який відрізняється тим, що зерно отримане від трансгенної рослини.
20. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що рослина містить трансген, який кодує полінуклеотид, що пригнічує у зерні продукцію щонайменше одного гордеїну.
21. Спосіб за будь-яким з пп. 1-20, який включає одержання із зерна борошна або цільнозернового борошна або включає одержання із зерна солоду.
22. Спосіб за будь-яким з пп. 1-21, який відрізняється тим, що напій на основі солоду являє собою пиво, а спосіб включає пророщування зерна або подрібнення одержаного таким чином зерна.
23. Спосіб за п. 22, який додатково включає фракціонування висушеного пророщеного зерна на дві і більше фракцій ендосперму, фракції ендотеліального шару, фракції лушпиння, фракції проростків та фракції солодових паростків, та з'єднання і змішування попередньо визначених кількостей двох або більше з цих фракцій.
24. Спосіб за будь-яким з пп. 1-23, який відрізняється тим, що щонайменше 50 95 зерна проростає у межах З діб після набухання.
25. Спосіб за будь-яким з пп. 1-24, який відрізняється тим, що ї) харчовий інгредієнт або інгредієнт напою на основі солоду являє собою борошно, крохмаль, солод або сусло, або харчовий продукт являє собою хлібопродукти на заквасці або без закваски, макаронні вироби, локшину, сухі сніданки, закусочні харчові продукти, коржі, кондитерські вироби або продукти, які містять соуси на основі борошна, або ії) напій на основі солоду являє собою пиво або віскі.
26. Спосіб за будь-яким з пп. 1-25, який відрізняється тим, що харчовий продукт або напій на основі солоду призначений для споживання людьми.
27. Спосіб за будь-яким з пп. 1-26, який відрізняється тим, що після споживання харчового продукту або напою щонайменше один симптом захворювання на целіакію не проявляється у суб'єкта з вказаним захворюванням.
28. Рослина ячменю, яка продукує зерно, що містить близько 50 м.ч. або менше загальних гордеїнів, або її зерно, де - зерно є гомозиготним за алелем локусу Но!/г2, в якому більшість або всі гени, які кодують В- гордеїни, видалені; - зерно є гомозиготним за нульовим алелем гена, який кодує Ю-гордеїн в локусі Нога, і - в зерні відсутні С-гордеїни, які містять послідовність амінокислот, представлену як ЗЕО ІЮО МО:
55.
29. Рослина ячменю або зерно за п. 28, яке відрізняється тим, що зерно містить одну або більше ознак, визначених в пп. 2, 5-13, 16-19 або 24.
30. Спосіб отримання зерна ячменю, причому спосіб включає:
а) вирощування рослини ячменю, яка продукує зерно, що містить 50 м.ч. або менше загальних гордеїнів, і р) збирання зерна.
31. Спосіб за п. 30, який включає вирощування щонайменше 10000 рослин за п. 28 або 29 у польових умовах на площі щонайменше один гектар.
32. Спосіб одержання борошна, цільнозернового борошна, крохмалю, солоду або сусла, одержуваного із зерна за п. 28 або 29, причому спосіб включає: а) отримання зерна, яке містить 50 м.ч. або менше загальних гордеїнів, та р) переробку зерна для одержання борошна, цільнозернового борошна, крохмалю, солоду або сусла.
33. Харчовий інгредієнт або інгредієнт напою на основі солоду або харчовий продукт або напій- продукт на основі солоду, одержаний з рослини ячменю або зерна за п. 28 або п. 29, переважно одержаний з використанням способу за будь-яким з пп. 1-27.
34. Харчовий інгредієнт або інгредієнт напою на основі солоду або харчовий продукт або напій- продукт на основі солоду за п. 33, який являє собою: а) пиво, яке містить один або декілька білків зерна ячменю та менше 0,9 м.ч. гордеїнів, Б) борошно або цільнозернове борошно, що містить один або декілька білків зерна ячменю та менше ніж 10 м.ч. гордеїнів; або с) солод або сусло, які містять один або декілька білків зерна ячменю та менше ніж 50 м.ч. гордеїнів.
35. Харчовий інгредієнт або інгредієнт напою на основі солоду або харчовий продукт або напій- продукт на основі солоду за п. 33, який відрізняється тим, що напій-продукт на основі солоду являє собою пиво або віскі. Ногу Нога вні Вот Лннй МО хх: СО ОО М МО ЛО ОО Ла В В В ОВ г і ке Шо Хромосома ТМ і ; че кет ще вве уж аванс ее не 5 5 (ШЕ с. о шо НІ . . З В В ХЕ нн» ; Фігура 1 я : с ХУ є З : 5 Масенко АХ ЖЖ -- У ее жкуюкуюю іх. «Ве В локон жи Кк ся не ік шах я Ме ЧИН м МИ, ще і й Я КЗ КЗ КУ : жи и НН и нн В и иддиииимин дини МІВ Ей ее о у и НК МН ЕЕ М не пиши «ІЕЕ що ок. ВВЕ 5 Ва ВВЕ 00000000 однин Манн ХВ В КЕ Б КЕКВ ВЕК жк Зах ск ВЕ ЕЕ ххх х.. Маки МЕККА 4 ЗЕ Я : ин А а 5 нн АЗК нн в В В В ЕЕ В ЕК В ЕЕ У СКУ йо» жах Чигтра З я . ди й У Б З Ж й ра й де ВА оо: Со не я Ка в В УК вк о о ме КК р в оо ОО Й щ Й М Й х ї ш ї жо ї КУ ї Зк й УВІ й ІЕМ хор хм БТЖРЕОККЧАОВІУ У КУ КЕ КУКИ ОО ВВ Жемжц со» Ве КК ВК В КО АК В КО У В У ЗА їй й Іо шо МА шах лВ ке я КЕ ХЕ їщ шо ЗЕ в БУ х3И ЗЕ ЗХ ЛЕЖ. ла ЗЕ ВУ Я нн но и тк ок и В МО М й Ах й ж хе Зх Ух Ка Ко ве Зк дев Ко а о м ПК о по НН реа ПЕ. п Ле ТЕБЕ ЗМ пИПЕ ЧЕ ше м и м я зво дк що ху 33 ее ви ков ки м КЕ М ЦК У Бош Бон я ке ка вс туя зже пн и Кох КЕН М о ВИ КК КА Й ЧИ й т х й т и зісед век ПЕХЕЖОВВА Уа Фігура З її ЖЕО їЗ ЩІ ж щи КУ іон оце 0 ОКОМ БАВОВНА ВОСТІ ААНУА КСО АВ АНОХ З-нущ «ке нн м чо в а в п и и и до за 10 ЕІ ще З МЕ ІВа ІЩЕ Іо І ЩЕ ще ХМ біос сов ЗОБА ЕЕ АВ КК ВА беонуд «ха хх ШУМУ шу ХМ УЖ Є Ж Ву ж А хм ж ж жов ке ЗЕ ЕЕ ШЕ ХЕ ШО МЕНЕ : Я : : ї : Н Н ; ї 3 і ї Н пкт ххх гли фуксія ут ра юр юютт дк зняти Зіни ск 0 УРОВЕНЬ п-вен со ку хуютинмтюххй вому атм ке кмАВУу юю є ххх в АКА ТВ ЖК ХМ Іза За За зи Ж зд ІЩЕ Зіссем са УМОВА ВОАС КОВО КАТЕ КОВ ТК ВАСКО Монує «Фев юхжк йти тв УЮ я дуже тихе АЖМУХ М УЖ ТВ А А ЖЖ Ти АХ їй та ко ЗЕ Се БУ АЖ Знищ сою 0 пООеаВемвсваа еВ ОКА КАВОВЕ З хи Усне ЗИМ Яомум се Ухти муху нАКАУю ВКА кН МАКСА АККАЖЧЯ ТВ ААУХХ ВІ АААХ КАХ Зо ще За Се ГУ зх в ями опа КК М я КК В КК ТК КО ПО КК КК В ВН КК Ко о: У НН В п НК п п У М п а З о З М В З о З Я М-жуж сла ужжеии АТО АХА жМУЄЄ АХ АХЄЄ о кут АХА ЙТИ ААУ ТО ХАТУ мне: з І по п МК о п М и с, ЗІ З п ЗП НИ и А В Я Би ЗІ Ся а хо Й ЖЕ паси ода о Ко ЕК р аз ЕК ЕЕ СЕ Кок оо Ку кс и: ЕН: ММ ЗІ З СИМ ПИ М З В с С ПИ МИ ЗВ ЗВ ЗВ З СЯ дежум кан хо и р р р я м а І З с по ЕХ Во З п З В З З В ПИ о БУ жя Ки г Б й Й ех і: у ї г ї « І ї М 1 м Н в ан и и кн м чн и о з и М ЧК А Я а п и о в в В В Міо сов 0 ОМВО ОВК КК УКВ ТА ВО лм М М С о З У З З В о НВ СИ З З С КК Кожух «хх крони ун чини ниви ни ин и І НН СВ о п І І С В М З З М С С В М М ЗМ з У ЕЯ ЖЕ я ІБ то Ше ОЇ 0 БУКОВІ ХХ ОЗ ЕМ м о м І ЗІ ЗІ с З З ЗИ З М с М с В М М С ЗЕ Шум «ож гасу ААУ кАМУХТ г ААУ єс хкхєі сг ввАУ ХХ ТАКУ Х у и ПИ З ЗІ З о и З ЗМ КЕ СМ З В С М М М Фігтра 4 ши коа 5
«хх сутх сих ух чкхи чай ва а ня вч ня КІ ЄМ: - : : Н і І ї ї Н : : : : : : б фунт нирку ит Божих у ж дк вижити ке кинтї шко с ВОК КАВОВЕ СТАКАН АТАК сх ж в 5 Ж З хх ку г ту» В ха пУМЕИЕ «с вежа Т юю В Я жк ЖЖ АТ Жити ж жи тю М НЕ НК ПЕ М З с З з ЗИ с З ЗІ с ЗИ С ПИ с С М З Я ща з кх ВІ вай з: 854 маси ов УА АКОТ ОА ВОК ОККО КВАС х щ Ж дО М хх шо охо У ж З Б т Б її Б в в лов й їнмущш хом шюикахююсгй тиху ух АТ ТИЖ АКА Й Ж Аж зе Не З М З З З и З В В М В В В З В С БУ БУ БУ Без ВУ ШК МА : Е : : ї : : Ко ї тих: Кит розро МОВО ОК А АСК КВ ААУ КСО. у и З п З М З І и З с В С В бум хв «хх жі Машу ую тю є кю т яти ж юю ул ухюати шу ххх по вка БУ пд Мк зв ЖЕ шт Жічсн бок о ЗО ХУССООКТВОКОБАНКАВ КО КВКВ КККВВ КОКО ПАК ЕКИХ ІЕМ зи и І І НИ о В З В С В В ЗЕ В Бенжи ухО фжкююхАт ие АКА вжи ААЙ Й Ж ЖІ их АЛ Й ЙТИ МкКх БК защи Ма я 3532 3553 МІК : Ще ї С ї я : : : Ще ї Ше Н Ще семи ж и З нн в о и п А и МЕ М З КЕ МА о п м о и КМ ЧИ ЧЕ Жісююд со 0 СУК САЛАТ КУМ с ВАВ АККАУНТ Х х жк З кош їх з їх 5 5 ж хх хх Б З дов од хх М-еух «ке ууссгстжимилак ко жи КК тує иткхх хист юкюю уми юю мухи т юю ХЕ М МмащЕ МИ ВУ її КО «ї Н і : ї : ї Н і ї ПИШНІ : : пуссй сов ВЕН АВАКОВ ВОК КАКАО КНАКЮ х 5 в ох да З ж її й в ох в їх В ж 5 во щ В охо й миє сом ж ЖЕ юю ж жо сюокююжк є ж М М дою о ХК шк юю ж юку юю хх жк юки 1135 114 Але ТЕ МЕТ ВЖЕ ЖК МЕор ста 0 МАУС ОА АСК ВК КАСКО КО АК ОСКЛКА ВЕС щ й Ж в Ж ж Ж 5 Кк я т й в В 5 в Б 5 В шва Шемук «че вт чайок ую ж ик жа жмуттююкю еф ЮК юю юю ж жк ккя ІЕЕ ща.
МЕ ЕаеКУ КА ХМ КИЙ ї : Н і І і Н Н 1 : ї : ї : Жізча яки УВК АКОТ АСОВА КАТКИ ВАК КАСКАДУ з кА о щ Ж ж їх Б шо хх В в хх Фа В а ох шт денвуд дих й Й ЯК К КИю и ж и ЖК Ал Р КК А ою си ий й и хо кт ж и МК пояси г т КЕН ТЕН ВИ ХЛ Ялл ШЛЖ ЛО йапев с АВАКОВА ВВ АКТОВА ОКА ВОК АК АНА ЗМЕН п п М ка С В С М М С Не БМУВ ВНД сля клат тат хютьАКИУЄЄХ АНІ Кен ЮА МУКАХ хх хх кити ня ІІЗХ Мк ІК ШАТИ ї3Жа ШЕ ГУВЕ дфесе ом КВАСАКООТВО ААУ СВИК ОВ КО ВАВ АТО А ЕХ М нь з з З В ЗАМ Хо З ЗВ З В М в С З М МИ ЗЕ Шедка сих пат ААЮЮ ЙТИ ж Ж г ж ТИ Уж ж друж Й х й й Чигара й іпрепонження!
УК КЕ 1355 ЩА Би іх Іа Я : : 3 : : Що Рожа ян дини : : Влмще сх 0 КУМ КАК АСВ КК УКВ АНА ен з и М п с З о з п с ПИ п В З М В З о їМоКЖх. «хе ую ююи У ува УА МИХ ААУ ти АЖ ДЖ ЮА цк дащки КУ Хе Я МЕ М ме шщ СКК в о СЕС КЕ С о ЕК Ж КК В ему о мес з ж жа У ща в вх жов вк Т-МУуД ШИК о сзухсцхкдчкхвух воски є УВІ юки ях ув юююкх ІЗУх ДЕН їла Їх ІЇВЩщЕ їм ша кит ПН: фс іл ху та лалі няття вм ї 6. Вхаєсш ший 00 ,ВОАКМАОААСН КАСА А АКТ ВАСКО ТВА ЖОК з Ж п 5 5 Бош 5 Б Ж ж В о Бо в ап хв мух дю зок кю юю яю ин Мою фік кю дж Кт й кю я ж у хода юю юю ут ук юю ЗЕ ЛЮБЕ ЗО ке шМЕХ їі та Вхемщу сою 0 ВАВ ВАНЧАСАСЕАОО ММК АМОСОВА ОКО ВИК ВАМИ АНЕКОХ А М ІНЬ З І ЗМ ВН ЗІ ПМ В с КМ НИ ЗЕ С І МЕЖ ке У їх жа їх КУ вид ший 0 МУХА ОКА ЛОКК КУ т хх в а. її В ку з В фа А їйхнум сх ор юю жабки у Дж КК аю яю вже ки жав АХ МТЖХ АЛІ СН ХХ ХК щи її мли си 0 КМ АОС АСК СМ МЕ З НН а с а о М З о и ЗП п о ЗК СИНАМ бехжя сах хусцоччєтчучкухкасяччіччуот тими юю юю ХЕ чи МО Ал ХЕ іх 1 мікер с ЕК аАОТУРИ ТОМУ ТАКО АНО ВТМ НКИ КТК ВАЛОМ АК АСК САУ Км чок и а м и м и о а МІНІ їМІх ЗХ МКХЕ хиди Кр іа щдішерв Ой 0 КОЦИИМА А ОТиКК ККАКОАККОАВ ОК КМ КККККХ з со не В З З п Пс п В ВЕ С З ЗВ ПИ В З З СМ М У ВУ хм жна 1825 ХЕ Кращу ХЕ ши Зісув дод 0 ЗАЛА АСКОЕ СУе и и ЗВ о ВЕУ СО В НЕ ЗО М З НИ М І в а ЕМ С шИЖх п ЖЕ УТ ШІ Зш В Н НИ ї : ї ї Е ї Н а ї Н ї ї чих ифжхр кт лижі ки фу юю кю ками рин кати єю кю ної Зіссв бе АНТ АОИАААСОМММ ССО АНА АССВО ТОК К УА ІЩЕ ВВЕ а З ЗАМ В ВК СЕ С З В В З В М М ЗЕ СМС пежул ко им м о м я м и м и а км нн и о м я сову іх Я ЕХ дв Ж же усяких Фігура Я (врозовження;
а НИ НАЖО ХАЛУ міч Ох ІЖЕ яхУЄ Жоме пох 0 ЗВИСВСМУТСТОАСВ КВ АААСОВОМЕКО ОКО АОС КОКС О т У й В вх й В що хх до Вон о дю що Во Во 7 БУ мс и м М м М МЕ ИН З: п Б Ж ВМО МОЮ лат ух АЖ У у ит м АХ ЖЖ АЛ УХЧА АХА М МКК Ж КАЧА МАНІ КК АСУ ККУ их медик колож Ж МЕХ ХАТИ ЖИ ХА ше за Ха Шізоросок 0 ТООО ХАТКУ АВАНС ОК ВАВ АТМ ем в не с п оз п п и М о З я ЗЕ М З З В А А Мем хи. хм КАТА ЧАС ЗА ДИ ВИК АЛУКА ЛЕ АК ДК МА ЗА МА МА КУ АХ ВИ КАК СВД УК КА КА ДВА КАТ ЛИ МА КУЄ УНК ХУ ХУ ДОЮ КУА МА МИ МАМ АК ши ХХ ЖЖ х ЗЕ ЗЕЗЕ ща ХЕ Жізоб сей 0 ВОК АОС КАН О А АК КІ С НИ А І НВ І З З І У и не М А НУ Шевуй ск в анна М ЕКО СЕ о м п р В ШЕ р ЕК с М в м их ПИШИ ха Бе ВЕ ВжЩИ рН ХЕ Жар олив 0 БАСОВККИВКТО СОТ ТВА КОВА КК АСУТТИКА КЕ ООКАОСВА С НЕ І З З з В ОВ ЗО ЗНО ЗЕ В У СОМ М НЕ ЕЕ докии см: жмут Ок ж ж ю юю МУ кот м ск. хахх ТИ века ХАТИ хто Хай м А а и Ди НН и КО НН ЕЕ А с пн М вози ов 0 ВОК КАКАО АВТ КАК КИ ТОК АКА КК ВОК що ож мото оч ою, ж хв хіх її т Ом Ох Ох т ря й З ге КОоЩщКК х КУ ОМ сом З че ШЕ ве ХА до ХУ ХВ Н Н : ЗИ їсти Н -Е Н ї І. Я І юки би кт я бю лини вх кв кл их ючи нен ок яняи кі шхощи са 0 КЗ КАВА ОКА АК КВК мне не М З ІА А М З о В В п М З З ЕЕ: дхне оа кед шт ми юю юю я Ж я я Кк дю хх жжикю кю Кюви БОНКУ пкДе ШЕ ПТУБЕ ШК ХУ МК Н : : : : : : ГО : Й : о : : Бівсорв гак ММСАЖЕКОВМОВУХ АВМ ОО АВМ АВАКОВ Х ЕН З М М Зо В З М І В С В В ЗМ а М ИМЯ Мемуле сив. Уже ЖИВАННЯ ЖЖ АЖ Ж ЖЖ ЖЖ Ж Кум меж ю юю ух Іще ХМ ХА ХЕЛИ Ха Ох І КОХ В Я ОК ЕЕ У В КК В КК С КК КК СА М Кто зв пово ох Ж ж хх хв по ш В В ом дв щої о З и м м м у о м м м п м а нт ЕВ пЕВИ ДНО ШИН СТЕ ЖИМ ПЕ КВ В Се КК я СК о о ВОК СЕ ОХ о В ВОК КК Вк Оси Мекри сов Уж ЮХААККИ КИ Ух КОМУ ТУТ МАВАІ Я ТКА 2233 ді ДКЕИУ ХВ хе ХИТ їх Бісер щой ВО ВАКУМИТ ВВА ОСТАНОК АААВСВОА ВАК ОВ ААЖАВОВ В АВК божуд хх при и р и м и п о п а п м о а 3 ВЕУ ваз Ед п чи В а не а А Вам мих 0 МОХИ КАВКТМ ТВО КЕ ПОЖЕЖІ МО мя мя шию вес єю юки ж чи ще ол вв зв. В ЛУ Фігура я (преозваження) В ке - В Б ї -х ря Й ЕЕ й кж - СО жк ТІК НУ У С їй щк ! кух дк стих. до І. ЩІ ї ; пк Ж ї іо ї СУ ЯН я ї Я си кое Еш да ВО х 15 ке
ЩІ. я 5 я Х . жк Ко ком . Кк. я ГУ ї хто хе: ЖОВ се Е КЕ . У ко т ще ХХ - о шк Ж КВ ЩА Мій -Х Хі й Ж З сх я Е Я о С сус,
ой . ЩЕ І. . ж ши о МУ ;
г. ях х у ї і жк КУ Що К як о З. КУ Б і ххх 5 ях З АВІА У х а ТИМ М ЗВЕЕК ст «МК щи и Я га п с щи кн За а ще ска о севентюкн Я ки ЗИ З З З ОЕМ Кк як ж ох х ме -Х 2: хе жк х : -х ці-тпордан бі-товлаїн хх. ЕК ох к їх на ; ще ща як В хх : жк МІХ ще МК. Он дк й кох У я що 3 Ї КЕ кох КОЯ и 5 Я ОО ЩЕ Хі ХУ БО х ХО Х КО ох. ЕХ ХХ я З яко ХХ КОя ВА як Ж ди меш Я БО ка й я ВА ох ОКО ЖЖ Я Б - тих БО як ЖЖ ЖЕ КОХ Я ОЗ Е ак ВА Я З ЗБК У і СО я ке АСК КОН З «М есектвсеейй й ул ллАМТАли Є; У од З Ву З х х КУ СЯ х ЗМК я М - СЯ НС КЗ ОО дк я сх Чигутра З сх
UAA201600247A 2013-06-13 2014-06-13 Ячмінь з дуже низьким вмістом гордеїнів та харчовий продукт на основі солоду UA122764C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2013902140A AU2013902140A0 (en) 2013-06-13 Barley with very low levels of hordeins
AU2013902565A AU2013902565A0 (en) 2013-07-11 Barley with very low levels of hordeins
PCT/AU2014/000619 WO2014197943A1 (en) 2013-06-13 2014-06-13 Barley with very low levels of hordeins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA122764C2 true UA122764C2 (uk) 2021-01-06

Family

ID=52021500

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201600247A UA122764C2 (uk) 2013-06-13 2014-06-13 Ячмінь з дуже низьким вмістом гордеїнів та харчовий продукт на основі солоду

Country Status (17)

Country Link
US (3) US10849345B2 (uk)
EP (1) EP3008161A4 (uk)
JP (2) JP7102096B2 (uk)
KR (1) KR102403071B1 (uk)
CN (1) CN105492591B (uk)
AU (2) AU2014280852B2 (uk)
BR (1) BR112015031257A2 (uk)
CA (1) CA2914687C (uk)
CL (1) CL2015003590A1 (uk)
EA (1) EA035876B1 (uk)
HK (1) HK1222197A1 (uk)
MX (2) MX387526B (uk)
NZ (1) NZ631602A (uk)
PH (1) PH12015502764B1 (uk)
SG (1) SG11201509675TA (uk)
UA (1) UA122764C2 (uk)
WO (1) WO2014197943A1 (uk)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2696250C (en) 2007-08-13 2016-12-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Barley with low levels of hordeins
SG11201509675TA (en) 2013-06-13 2015-12-30 Commw Scient Ind Res Org Barley with very low levels of hordeins
BR112017025724A2 (pt) 2015-05-29 2018-08-14 Arcadia Biosciences Inc. grãos com teor reduzido de glúten e compostos dos mesmos
CN105316425B (zh) * 2015-12-03 2018-10-26 山东省农业科学院作物研究所 一种小麦b-型avenin-like分子标记及其应用
EP3784058A1 (en) * 2018-04-25 2021-03-03 Carlsberg A/S Barley based beverages
US20230089545A1 (en) * 2020-02-05 2023-03-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Barley with reduced levels of alpha-amylase/trypsin inhibitors
CN111157659B (zh) * 2020-02-25 2022-11-11 大连工业大学 一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法
CN118190880B (zh) * 2024-02-19 2024-09-10 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 基于高光谱反射率与随机森林模型的小麦籽粒谷醇比早期估算方法和装置

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0131623B2 (en) 1983-01-17 1999-07-28 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
AU7360087A (en) 1986-04-30 1987-11-24 Boyce Thompson Institute For Plant Research Inc. Electric field mediated dna transformation of plant cells and organelles
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
SE455438B (sv) 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
US5932479A (en) 1988-09-26 1999-08-03 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5141131A (en) 1989-06-30 1992-08-25 Dowelanco Method and apparatus for the acceleration of a propellable matter
US5877402A (en) 1990-05-01 1999-03-02 Rutgers, The State University Of New Jersey DNA constructs and methods for stably transforming plastids of multicellular plants and expressing recombinant proteins therein
US5451513A (en) 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
ES2260886T3 (es) 1990-11-23 2006-11-01 Bayer Bioscience N.V. Procedimiento para transformar plantas monocotiledoneas.
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
US5518908A (en) 1991-09-23 1996-05-21 Monsanto Company Method of controlling insects
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
JPH07505531A (ja) 1992-04-15 1995-06-22 プラント・ジェネティック・システムズ・エヌ・ブイ 単子葉植物細胞の形質転換法
EP0688160B1 (en) 1993-03-11 1998-05-13 National Research Council Of Canada Enhanced regeneration system for cereals
CA2092588C (en) 1993-03-26 2008-07-08 Narender S. Nehra Enhanced regeneration system for cereals
US5362865A (en) 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
US5545818A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene Inc. Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids
GB9524938D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Zeneca Ltd Modification of starch synthesis in plants
EP0856060A2 (en) 1996-06-21 1998-08-05 Monsanto Company METHODS FOR THE PRODUCTION OF STABLY-TRANSFORMED, FERTILE WHEAT EMPLOYING $i(AGROBACTERIUM)-MEDIATED TRANSFORMATION AND COMPOSITIONS DERIVED THEREFROM
US6235529B1 (en) 1997-04-29 2001-05-22 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for plant transformation and regeneration
AR015136A1 (es) 1997-07-23 2001-04-18 Sanford Scient Inc Transforamacion de plastidos mejorada de plantas superiores y producccion de plantas transgenicas con resistencia a los herbicidas
NZ503137A (en) 1997-09-12 2000-10-27 Groupe Limagrain Pacific Pty L Sequence and promoters for starch branching enzyme I, starch branching enzyme II, soluble starch synthase I and starch debranching enzyme derived from Triticum tauschii to modulate gene expression
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6100447A (en) 1998-02-12 2000-08-08 Applied Phytologics, Inc. Method of barley transformation
CN101818145A (zh) 1998-03-20 2010-09-01 联邦科学和工业研究组织 控制基因表达
CN1202246C (zh) 1998-04-08 2005-05-18 联邦科学和工业研究组织 获得修饰表型的方法和措施
JP2002539824A (ja) 1999-03-29 2002-11-26 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア チオレドキシンを用いて形質転換した穀粒および種子の価値付加特性
US7074986B1 (en) 1999-08-16 2006-07-11 Sapporo Breweries Limited Construction of barley with reduced gel protein content
GB9923306D0 (en) 1999-10-01 1999-12-08 Isis Innovation Diagnostic and therapeutic epitope, and transgenic plant
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
AU2004269200B8 (en) 2003-08-27 2011-11-24 Orf Liftaekni Hf. Enhancing accumulation of heterologous polypeptides in plant seeds through targeted suppression of endogenous storage proteins
HUE044812T2 (hu) 2003-09-23 2019-11-28 Dsm Ip Assets Bv Prolinspecifikus endoproteázok alkalmazása peptidek és fehérjék hidrolízisére
EP1657300A1 (de) 2004-11-10 2006-05-17 N-Zyme BioTec GmbH Prolamin-reduzierte Getränke und Verfahren zur Herstellung
CA2696250C (en) * 2007-08-13 2016-12-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Barley with low levels of hordeins
ITFI20070267A1 (it) 2007-11-28 2009-05-29 Saeco Ipr Ltd "gruppo di infusione per la preparazione di bevande da confezioni monodose e macchina comprendente detto gruppo"
US7652202B2 (en) 2008-03-11 2010-01-26 Monsanto Technology, Llc Barley cultivar salute
IT1392414B1 (it) * 2008-12-23 2012-03-02 Giuliani Spa Procedimento di biotecnologia microbica per la completa degradazione di glutine nelle farine.
EA032207B1 (ru) 2009-07-30 2019-04-30 Коммонвелт Сайентифик Энд Индастриал Рисерч Организейшн Ячмень и его применение
US9311457B1 (en) 2011-11-02 2016-04-12 Google Inc. Platform for cloud application software
WO2013063653A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Arista Cereal Technologies Pty Limited High amylose wheat - ii
SG11201509675TA (en) * 2013-06-13 2015-12-30 Commw Scient Ind Res Org Barley with very low levels of hordeins

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018200993B2 (en) 2019-08-22
NZ631602A (en) 2019-09-27
CN105492591A (zh) 2016-04-13
KR20160029789A (ko) 2016-03-15
CL2015003590A1 (es) 2017-07-07
PH12015502764A1 (en) 2016-03-21
MX387526B (es) 2025-03-18
JP2016526882A (ja) 2016-09-08
JP7290591B2 (ja) 2023-06-13
AU2018200993A1 (en) 2018-03-01
CA2914687C (en) 2021-08-24
US10849345B2 (en) 2020-12-01
EA035876B1 (ru) 2020-08-25
AU2014280852B2 (en) 2017-11-09
CN105492591B (zh) 2019-09-13
EP3008161A4 (en) 2017-02-22
US20160128345A1 (en) 2016-05-12
JP7102096B2 (ja) 2022-07-19
EP3008161A1 (en) 2016-04-20
CA2914687A1 (en) 2014-12-18
JP2020110171A (ja) 2020-07-27
KR102403071B1 (ko) 2022-05-27
US20210051986A1 (en) 2021-02-25
MX2021005132A (es) 2021-06-15
HK1222197A1 (zh) 2017-06-23
AU2014280852A1 (en) 2015-12-10
PH12015502764B1 (en) 2021-03-24
EA201690013A1 (ru) 2016-05-31
BR112015031257A2 (pt) 2017-08-29
MX2015017009A (es) 2016-12-15
WO2014197943A1 (en) 2014-12-18
US20240065301A1 (en) 2024-02-29
SG11201509675TA (en) 2015-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA122764C2 (uk) Ячмінь з дуже низьким вмістом гордеїнів та харчовий продукт на основі солоду
JP6648191B2 (ja) 低レベルのホルデインを有するオオムギ
US12071629B2 (en) Wheat having high levels of beta-glucan
US20250031651A1 (en) Reduced gluten grains and compositions thereof
US20230089545A1 (en) Barley with reduced levels of alpha-amylase/trypsin inhibitors