UA123272U - Спосіб одержання мезенхімальних стовбурових клітин для використання у клітинній медицині - Google Patents

Abstract

Спосіб одержання мезенхімальних стовбурових клітин для використання в клітинній медицині при якому клітини після культивування піддають спеціальній очистці від компонентів розчинів, що використовують на попередніх стадіях їх обробки, шляхом перенесення вихідного розчину, що представляє собою культуральне середовище з клітинами, на проміжний розчин, який є інертним відносно клітин і містить допоміжні речовини, які підвищують його щільність до значень 1,001-1,070 г/мл. За проміжним розчином розміщують кінцевий нижній розчин зі щільністю, що перевищує щільність проміжного розчину. Після цього одержану систему розчинів піддають центрифугуванню в режимі g=100-2000. Очищені клітини, які поступили на поверхню кінцевого розчину, відбирають і поміщують у придатне для подальшого використання середовище.

Description

Корисна модель належить до біотехнології, а саме до способу одержання мезенхімальних стовбурових клітин (МОСК), та може бути використана, наприклад, при одержанні препаратів для клітинної медицини.

Найбільш перспективними препаратами для клітинної медицини є препарати на основі МОСК, які мають здатність до самовідновлення, мультилінійного диференціювання та проявляють значні імунокоригуючі властивості, які привертають увагу фахівців у галузі клінічної біотехнології та клінічної медицини.

Вказані вище аутологічні та алогенні МСК активно використовуються як субстрати замісної та відновної терапії широкого спектра захворювань, у тому числі таких, що раніше вважалися невиліковними.

До більш сучасних джерел МОСК на сьогоднішній день відносять тканину кісткового мозку, жирову тканину, плаценту, кордову кров, пуповинну тканину.

Кожна різновидність МСК, що одержана із перерахованих вище джерел, має свої специфічні особливості, які відносяться як до процедури одержання, так і до процедури подальшого їх використання, збереження морфо-функціональних властивостей клітки.

Наприклад популярним методом клітинної терапії є використання аутологічних або аутогенних МСК, отриманих з кісткового мозку. Але процес отримання клітин з цього органу є досить небезпечним та недостатньо ефективним.

Відомо спосіб одержання кістковомозкових клітин (ВО 2323250, МПК С12М 55/02, публ.27.04.2008). Спосіб включає зв себе виділення з кісткового мозку ядровмісних кістковомозкових клітин, їх культивування у ростовому середовищі до одержання заданої кількості МОСК. В процесі кожного з двох циклів культивування висіюють виділені клітини у відповідну культуральну ємність, в якій у ростовому середовищі збільшують популяцію МОСК до утворення в ній складного моношару, який витягають з культуральної ємності шляхом обробки моношару МОСК розчином трипсину. Протягом кожного циклу культивування регулярно визначають рН ростового середовища та замінюють його на середовище, рН якого знаходиться у межах 6,0-8,0, для обробки моношару МОСК використовують 0,03-0,1 У5-ий розчин трипсину.

Як ростове середовище у даному винаході був використаний мінерально-сольовий розчин, що містить амінокислоти, антибіотики, І-глутамін та 15 95-ну ембріональну телячу сироватку.

Відомий спосіб дозволяє за приблизно 40 діб виростити 0,5-1,0 млн. пунктату кісткового мозку, що в окремих випадках може задовольнити потреби терапії.

Однак в патенті нема вказівок на існування процедур очистки клітин, одержаних після культивування, від домішок попереднього розчину. У зв'язку з чим можна з певністю стверджувати, що суттєвим недоліком цього та інших аналогічних патентів (ША 15680, 115067,

Ви 2323250) є ксеногенні ризики, у першу чергу, а крім того негативний вплив на властивості клітин інших компонентів, що входять до складу спеціальних розчинів ростового середовища.

Великий практичний інтерес серед типів МСК мають клітини внутрішньої тканини пуповини.

Ці клітини є онтогенетично ранньою популяцією клітин, які за широтою диференціювання займають проміжне місце між плюрипотентними та мультипотентними. На відміну від ембріональних МСК клітини пуповини не здатні утворювати тератоми, що робить цей тип клітин більш контрольованим та безпечним для клінічного застосування. Важливим для використання

МСК тканини пуповини є етичний аспект, отримання клітки з пуповини не пов'язано з морально- етичними протиріччями, що має місце для інших типів МОСК.

На цей час відомо спосіб одержання клітин із пупкового канатику новонародженого (ВИ 2384618, 27.03.2008), в якому передбачені стандартні загальноприйнятні процедури відмивання його від згустків крові і слизу у розчині Хенкса, промивання вени пупкового канатику із додаванням антибіотика і фунгізону, розрізання канатику на фрагменти, промивання їх розчином Хенкса. Одержані фрагменти гомогенізують, додають суміш розчинів колагенази 1 та колагенази ІМ (співвідношення 1:1). Ферментування матеріалу проводять при інкубації подрібненої пуповини, одержану суспензію очищають від неферментованих залишків тканини та надлишку колагенази. Осад клітин МСК одержують шляхом центрифугування.

Наступне культивування клітин полягає у ресуспендуванні осаду клітин у ростовому середовищі, наприклад, ОМЕМ/Е-12.

Культури пасерують при досягненні клітинами 70-80 95 конфлюентності.

На всіх термінах культивування клітини зберігають диплоїдний каріотип і високу проліферативну активність протягом 4-6 пасажів.

Одержані клітини з пупкового канатику людини експресують віментин, колаген 1 і 4 типу, альфа-актин та інше. Не експресують СВ45, С СДІ11в, СД14, мають низьку експресію антигенів гістосумісності.

Але одержані МОСК в даному способі не піддають очистці від компонентів попередніх розчинів, що може змінювати їх характеристики і впливати на їх терапевтичний потенціал.

У вищеописаних технічних рішеннях для різних джерел описані прийоми отримання та культивування в стандартних умовах, які передбачають механічне та ферментативне ізолювання клітин, введення кількох пасажів на спеціальних середовищах та процедури пересіву.

В статті (2) представлено комплекс дій, направлених на виділення МОСК, зокрема клітин кісткового мозку людини. Аспірат розводили у співвідношенні 1:3 середовищем ЮОМЕМ/Е12, після чого суміш центрифугували при градієнті щільності 750 д на протязі 20 хвилин, потім мононуклеари виділяли з межі розподілу фаз, двічі їх промивали і ресуспендували в середовищі

ОМЕМ/Е12.

Відомий спосіб передбачає промивання клітин, знятих з межі розподілу фаз, але ця операція є проміжною перед ресуспендуванням і не направлена на використання їх для клінічного лікування.

Для того, щоб одержані МСК ефективно використовувати для введення у організм людини, їх необхідно очистити від домішок попередніх розчинів, що не передбачено відомими рішеннями.

Задачею цієї корисної моделі є вдосконалення способу одержання МСК шляхом очистки клітин, одержаних після культивування, в спеціальних умовах, в результаті чого досягається максимальний вихід очищених клітин, поліпшуються їх властивості, які необхідні для подальшого використання, зокрема, як препарату для клітинного лікування.

Поставлена задача вирішується тим, що у способі одержання мезенхімальних стовбурових клітин для використання в клітинній медицині, згідно винаходу, клітини після культивування піддають спеціальній очистці від компонентів розчинів, що використовують на попередніх стадіях обробки клітин, шляхом перенесення вихідного розчину, що представляє собою культуральне середовище з клітинами, на проміжний розчин, який є інертним відносно клітин і містить допоміжні речовини, які підвищують його щільність до значень 1,001-1,070 г/мл, за проміжним розчином розміщують кінцевий нижній розчин зі щільністю, що перевищує щільність проміжного розчину, після чого одержану систему розчинів піддають центрифугуванню в режимі

Зо 9-100-2000, потім очищені клітини, які надійшли на поверхню кінцевого розчину, відбирають і поміщують у придатне для подальшого використання середовище.

Для того, щоб перейти від клітин, які виросли на поверхні ємності для культивування, до клітин, які безпосередньо у вигляді клітинного препарату вводять в організм людини, їх необхідно для досягнення максимальної ефективності лікування ретельно очистити від усіх можливих домішок попередньо використаних розчинів, починаючи з початкової обробки джерела цих клітин.

При пошуку можливих процедур очистки культивованих МОСК автори керувалися тим, що кожна можлива процедура очистки клітин шкідлива для них, оскільки вони травмуються і як наслідок знижується їх кількість та ефективність лікувального процесу. У зв'язку із вищенаведеним здійснена спроба знайти найбільш раціональний, технологічно простий варіант очистки одержаних МОСК незалежно від їх конкретних різновидів та особливостей одержання.

В результаті запропоновано спосіб одержання МОСК, який включає очистку клітин, взятих після їх культивування і підданих очистці в один етап.

Запропонована процедура очистки клітин базується на тому, що верхній або вихідний розчин (середовище культивування) містить суміш клітин з дебрисом, молекулярними компонентами різного розміру (білків, ліпополісахаридів, нуклеїнових кислот, полісахаридів та ін.), при малих та середніх значеннях тяжіння, яке створює центрифуга, крізь більш щільний проміжний розчин клітини пройдуть, а усі домішки залишаться в ньому.

Розчин, який застосовують знизу, або проміжний розчин, має бути менш щільним, ніж плавуча щільність клітин. Крім цього щільний розчин не повинен бути шкідливим для клітин.

Для того, щоб забезпечити необхідну для проміжного розчину щільність, до нього додають передбачену даним винаходом речовину, зокрема, це можуть бути сахароза, альбумін, декстрани та інше.

Кількість вказаних добавок регламентується досягненням щільності проміжного розчину в межах 1,001-1,070.

Запропонований авторами інтервал щільності проміжного розчину пояснюється тим, що верхня межа щільності визначена можливістю входження клітин із вихідного розчину у проміжний. При більш високих значеннях щільності проміжного розчину клітини не зможуть подолати щільний "бар'єр" і залишаться на межі вихідний розчин - проміжний розчин, нижня межа щільності вибрано таким чином, щоб клітини могли повільно і рівномірно долати цей розчин.

Клітини поступово проходять через проміжний розчин, при цьому вони вивільнюються від домішок попередніх розчинів.

Для того, щоб довести принцип, взятий у основу технічного рішення, що розглядається, клітини у вихідному розчині були забарвлені барвником, який готували на 0,14 М розчині хлористого натрію. Ефект виходу з клітин домішок підтверджувався тим, що проміжний розчин поступово забарвлювався. Іншими словами, барвник - модель забруднюючих речовин у суспензії клітин.

Кінцевим є розчин, аналогічний за складом проміжному, але його щільність вище, ніж проміжного, за рахунок чого на межі цих розчинів відбувається осадження вільних від домішок клітин.

Слід зауважити, що щільність кінцевого розчину вища за плавучу щільність живих клітин, але нижча за плавучу щільність мертвих клітин. Мертві або ушкоджені клітини проходять шар кінцевого розчину та осаджуються на дні центрифужної ємності.

Таким чином, можна констатувати, що відбувається очищення клітин від супутніх компонентів їх обробки, а також відбувається розподіл живих клітин від мертвих або ушкоджених клітин.

Зняті з поверхні кінцевого розчину клітини поміщають у придатні для подальшого медичного використання розчини, наприклад, таким розчином може бути фізрозчин.

Що стосується центрифугування в режимі градієнту щільності 9-100-2000, то саме такий режим забезпечує оптимальну сукупну взаємодію усіх розчинів з клітинами.

Корисна модель пояснюється прикладами конкретного виконання.

Приклад 1. Виділення і очистка МОСК, отриманих з пуповини людини.

Пуповини отримують від здорових породіль під час нормальних пологів. Надані частини пуповини транспортують у скляних пляшках при кімнатній температурі в середовищі ДМЕМ або фосфатному буферному розчині (ФБР) без сироватки з додаванням 10-кратної концентрації антибіотиків (пеніцилін та стрептоміцин, 1 мг та 1000 одиниць на см3, відповідно) та 1-кратної концентрації амфотерицину Б (2,5 мкг/мл).

Зо Сполучну тканину пуповини (пуповинний канатик) дістають з розчину, максимально відмивають від крові, на 20-30 хвилин поміщають в нове середовище ДМЕМ з антибіотиками (10-кратна концентрація) та антимікотиком у звичайній концентрації. Усі маніпуляції проводять у стерильних умовах. Перед початком обробки пуповини вилучають з наданого фрагмента судини - 2 артерії та 1 вену. Для цього пуповину ріжуть поперек на частки приблизно 1,5-2 см, добре відмивають їх від залишків крові, щоб досягти мінімальної кількості еритроцитів.

Проводять обрізання сполучної тканини (Вартонових драглів) (ВД) навколо вени, разом з артеріями, і вміщують їх в чашку Петрі в свіже середовище без антибіотиків і сироватки, звільняючись таким чином від вени. В отриманих шматках матриксу пуповини за допомогою пінцетів видаляють артерії. Очищені від судин фрагменти ВД, подрібнені ножицями до найменш можливого розміру 0,1-0,5 см, переносять в культуральний флакон з поверхнею 25 см? або 75 сме з ростовим середовищем ДМЕМ або о-МЕМ, з додаванням 10 95 ембріональної сироватки

КРОС, 2 мМ І-глутаміну та РОБ2 0,0025 мкг/мл, який знаходився перед цим при 37 "С в термостаті.

Коли середовище змінило колір в бік пожовтіння, проводять часткову його зміну свіжою порцією - одну третину або половину поживного середовища, в яких культивували експланти, замінюють свіжим. Таку процедуру виконують по мірі зміни кольору середовища, але не рідше ніж один раз на тиждень.

Через 7-15 днів з експлантів виходять МСК, які утворюють клони, розміри яких складають від 50 до 500 клітин. При появі перших клонів, слід вирощувати їх до досягнення 70 905 моношару. Середовище міняють не рідше одно разу на 5 діб по мірі його пожовтіння, як і на попередньому етапі не повністю, залишаючи одну третину або четверту частину кондиційованого середовища. Клітини в клонах являють собою матеріал нульового пасажу поза організмом.

Коли у флаконі нульового пасажу з'явилось декілька клонів, клітини до яких почали розмножуватись, шматочки пуповини переносять в інший культуральний флакон, залишаючи прикріплені МСК з поживним середовищем в старому. Додають свіже поживне середовище і продовжують культивування як описано на попередньому етапі. Таким чином, отримують наступні флакони теж нульового пасажу. Процедуру повторюють ще раз, поки в культуральних флаконах "другого етапу" не з'являються клони, які утворюють шар МСК теж нульового пасажу.

Для пересіву клітин з метою отримання МОСК першого, а потім і другого пасажів, використовують розчини Версену (0,02 956 розчин ЕДТА в ФБР) та трипсину (0,25 9б5), взяті в рівних об'ємах.

Клітини, які досягли необхідної стадії конфлуентності (приблизно 70 95), двічі швидко, але край обережно, не направляючи струмінь на клітини, промивають теплим (37 С) розчином

Версену, після чого заливають на них теплий розчин трипсину (на флакон 25 см: - 1 сму, на флакон 75 см? - 2 сму). Флакони видержують 2-5 хвилини в термостаті при 37 "С. Як тільки клітини стають округлими і частина їх відкріпляється, слід обережно за допомогою піпетки змити легким струменем клітини, що залишились прикріпленими, обережно ресуспендувати їх, додати кілька крапель фетальної сироватки ВРХ (для зупинки дії трипсину) та суспензію клітин віддентрифугувати при 8000-1000 х уд протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Розчин трипсину, що знаходиться в надосаді, відібрати, а клітини, які знаходяться в осаді, ретельно, але обережно, ресуспендувати в 1 см?" поживного середовища без сироватки (для запобігання утворення піни) і перенести в мікропробірку на 1,5 см3. Після підрахунку концентрації клітин в камері Горяєва під мікроскопом, висівають їх в культуральні флакони із рахунку 5х107 клітин на флакон 25 см: та 1,5х105 на флакон 75 см".

Як і у випадку попереднього пасажу (нульового) заміну поживного середовища проводять частково, починаючи з 3-5 дня в залежності від його кольору. Таким чином отримують клітини першого пасажу, які вирощують до досягнення конфлуентності 70 90, після чого знов пересівають згідно методики, описаної для клітин попереднього пасажу, вирощують і отримують

МСК 2 пасажу поза організмом, які використовують для введення в організм людини тварин.

Недоліком описаної процедури є те, що реципієнту вводять клітини, вирощені в середовищі з ксеногенним матеріалом (сироватка ембріона теляти). Крім цього до її складу входять синтетичні речовини, які використовують в культуральній роботі (це не повністю коректно, оскільки існують середовища без сироваток, а також середовища спеціальної градації для клінічного застосування). Також, суспензія клітин може містити різну кількість мертвих, деградованих клітин, які при потраплянні в організм можуть викликати небажану реакцію.

З метою очищення МСОСК-ВдДл від побічних інгредієнтів була застосована їх очистка. Готували 2 розчини - 8,5 95 сахарози (8,5 г сахарози розчиняли в 100 г стерильного фізіологічного

Зо розчину), що відповідає щільності 1,0320 г/мл, та 2095 сахарози (20 г сахарози розчиняли в 100 г стерильного фізіологічного розчину), що відповідає щільності 1,0635 г/мл. На дно центрифужної пробірки вносили більш щільний (20 95) розчин сахарози, а зверху бережно наносили розчин 8,5

Фо сахарозі. На розчин 8,5 95 сахарози наносили по краю центрифужної пробірки суспензію клітин. При акуратному нашаруванні перемішування не відбувається.

Таку утворену конфігурацію вміщували в центрифугу і центрифугували протягом 10 хвилин при 800 49. В результаті проведеної процедури клітини поступово проходили через проміжний розчин, визволялись від попереднього розчину, при цьому, проміжний розчин, по мірі проходження через нього клітин, звільнював їх від компонентів складу, який наносився. Рух клітин зупинявся на границі розподілу розчинів, звідки їх обережно відсмоктували і вносили в потрібний розчин для ін'єкцій, наприклад, фізіологічний розчин. Мертві клітини, які мають щільність вищу, за щільність живих клітин, проходили через нижній розчин і опинялись на дні центрифужної пробірки. Очищені таким чином клітини були перевірені на експресію поверхневих маркерів, характерних для МСК-СО73, 2090 та СО105. За ГАС5-аналізом вона становила вище 98 95, що свідчить про гомогенність популяції. Відсоток мертвих клітин становив всього 0,3 905, в той час в популяції клітин до очищення він був 2,5 95.

Приклад 2. Очищення МСК, виділених з жирової тканини людини.

Жирову тканину людини отримували внаслідок хірургічного видалення жирової складки живота. В лабораторію оперативний матеріал був доставлений в фізіологічному розчині протягом 2 годин після операції і одразу підданий обробці з метою виділення МСОК. 250 мл жиру центрифугували для відділення від крові протягом 15 хв. при 3000 49. при кімнатній температурі, після чого промивали 5 разів фізіологічним буферним розчином (ФБР) у співвідношенні 1:11 до повного зникнення кольору. Суміш перемішували та відстоювали протягом 3-5 хв. для розшарування, розчин відбирали знизу. До відмитої жирової тканини додавали підігрітий до 37 "С 0,1 95 розчин колагенази | типу на фосфатному буференому розчині (ФБР) з додаванням 1 95 бичачого сироваткового альбуміну (В5А) та 2мМ Сасі». Суміш качали на шейкері протягом 1 год., після чого центрифугували при кімнатній температурі протягом 5 хв. при 3004, ретельно струшували протягом 10 хв. і знов центрифугували при тому ж режимі. Зрілі жирові клітини, які знаходились зверху, та основну частину рідини видаляли, залишаючи близько 5 мл осаду клітин. Отриманий осад вміщували в 10 мл культурального бо середовища (ОМЕМ/Е12 з 10 95 телячої фетальної сироватки (ЕТО) та антибіотиками) та центрифугували 5 хв. при 300х9, при кімнатній температурі. Знов відбирали рідину, залишаючи мл осаду, додавали 10 мл культурального середовища і центрифугували при тому ж режимі.

Зразки з різних пробірок об'єднували, та до 100 мл перетравленого аспірату додавали 105 мл культурального середовища, ретельно перемішували та розсівали на 75 см? культуральні 5 флакони з розрахунку 12 мл на флакон. Клітини не підраховували, спираючись на дані літератури, що ефективність виділення МСК з жирової тканини з 250 мл ліпоаспірату складає приблизно 107-109 клітин.

Через 24 год змінювали поживне середовище, видаляючи не адгезовані клітини. В подальшому, зміну середовища проводили кожні З дні.

При досягненні 70-80 96 моношаровості проводили перший пересів клітин за допомогою суміші 0,25 95 розчину трипсину та 0,02 95 розчину Версена у співвідношенні 1:2 за стандартною методикою, а при досягненні ним такого же ступеня конфлюентності - другий. При цьому доза посіву клітин складала 5 тис./см.

Отримані клітини 2 пасажу, як і в прикладі 1, очищали центрифугуванням через розчин з підвищеною щільністю (фізіологічний розчин з 8,5 9о сахарози) і утворенням прошарку клітин, які знаходились на межі з розчином з більш високою щільністю (20 95 сахароза). Як і у випадку з

МОСК пуповини, очищені клітини перевіряли на цитофлюориметрі ГАС Ага на експресію поверхневих маркерів СО7З3, 20090, 00105 і порівнювали зі значеннями, отриманими для неочищених клітин. Експресія поверхневих маркерів СО7З3, 090, СО105 очищеними клітинами становила 99 95, в той час як у неочищених вона коливалась від 95 95 до 98 95. Відсоток мертвих клітин складав 0,1 95 у очищених і 1,5 95 у неочищених клітин.

Таким чином, корисна модель, що заявляється, має суттєві переваги в порівнянні з відомими рішеннями. Спосіб, що пропонується, дає можливість одержати МСК різного типу без домішок з попередніх розчинів обробки клітин. Як результат, одержані клітини мають максимальну ефективність, що відповідає вимогам до препаратів клітинної медицини.

Claims (2)

ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ

1. Спосіб одержання мезенхімальних стовбурових клітин для використання в клітинній 30 медицині, який відрізняється тим, що клітини після культивування піддають спеціальній очистці від компонентів розчинів, що використовують на попередніх стадіях їх обробки, шляхом перенесення вихідного розчину, що представляє собою культуральне середовище з клітинами, на проміжний розчин, який є інертним відносно клітин і містить допоміжні речовини, які підвищують його щільність до значень 1,001-1,070 г/мл, за проміжним розчином розміщують 35 кінцевий нижній розчин зі щільністю, що перевищує щільність проміжного розчину, після чого одержану систему розчинів піддають центрифугуванню в режимі 4-100-2000, потім очищені клітини, які надійшли на поверхню кінцевого розчину, відбирають і поміщують у придатне для подальшого використання середовище.

2. Спосіб одержання мезенхімальних стовбурових клітин для використання в клітинній медицині 40 за п. 71, який відрізняється тим, що допоміжними розчинами, що підвищують щільність проміжного та кінцевого розчинів, є альбумін, сахароза, декстрани та інші. 0000 Компютернаверстка О.Гергіль 00000000 Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601