UA125246C2 - Спосіб здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинних геномів із застосуванням неуспадковуваних матеріалів - Google Patents

Спосіб здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинних геномів із застосуванням неуспадковуваних матеріалів Download PDF

Info

Publication number
UA125246C2
UA125246C2 UAA201709693A UAA201709693A UA125246C2 UA 125246 C2 UA125246 C2 UA 125246C2 UA A201709693 A UAA201709693 A UA A201709693A UA A201709693 A UAA201709693 A UA A201709693A UA 125246 C2 UA125246 C2 UA 125246C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
plant
gene
target
site
sequence
Prior art date
Application number
UAA201709693A
Other languages
English (en)
Inventor
Цайся ГАО
Чжень Лян
Яньпен Ван
Цівей Шань
Цивей Шань
Цяньна Сун
Original Assignee
Інстітьют Оф Генетікс Енд Дівелопментл Байолоджі, Чайніз Екадемі Оф Сайнсис
Инститьют Оф Генетикс Энд Дивелопментл Байолоджи, Чайниз Экадеми Оф Сайнсис
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Інстітьют Оф Генетікс Енд Дівелопментл Байолоджі, Чайніз Екадемі Оф Сайнсис, Инститьют Оф Генетикс Энд Дивелопментл Байолоджи, Чайниз Экадеми Оф Сайнсис filed Critical Інстітьют Оф Генетікс Енд Дівелопментл Байолоджі, Чайніз Екадемі Оф Сайнсис
Publication of UA125246C2 publication Critical patent/UA125246C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C12N9/222—Clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]-associated [CAS] enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Винахід належить до способу використання негенетичної речовини для здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинного генома шляхом здійснення таких етапів: введення негенетичної речовини в клітину, тканину або частину рослини-мішені, при цьому згадана негенетична речовина являє собою нуклеазу, специфічну для цільового фрагмента, або мРНК, що експресує згадану нуклеазу, при цьому згадана нуклеаза являє собою нуклеазу системи коротких паліндромних повторів, регулярно розміщених групам (CRISPR/Cas9), при цьому вказана нуклеаза розрізає цільовий сегмент, після чого сайт-спрямована модифікація цільового фрагмента завершується шляхом репарації ДНК рослини.

Description

Галузь техніки
Цей винахід належить до галузі генної інженерії рослин і стосується способу здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинних геномів із застосуванням неуспадковуваних матеріалів, зокрема, нетрансгенного способу здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинного генома із застосуванням білка або мРНК.
Передумови створення винаходу
Технологія редагування генома є найбільш перспективним засобом дослідження функції генів та генетичного поліпшення сільськогосподарських культур. Доступні на цей час технології редагування генома включають цинковопальцеві нуклеази (2ЕМ), транскрипційні активатор- подібні ефекторні нуклеази (ТАГЕМ) і системи коротких паліндромних повторів, регулярно розміщених групами/СКІЗРЕ-асоційованих білків (СРІЗРЕ/Сав5з9), які називають сіквенс- специфічними нуклеазами (З5М). Їх спільною особливістю є те, що вони можуть діяти як ендонуклеази для розщеплення специфічних послідовностей ДНК, продукуючи дволанцюговий розрив (058) ДНК. Згаданий дволанцюговий розрив може активувати внутрішній репараційний механізм клітини, сполучення негомологічних кінців (МНЕ.)) ії гомологічну рекомбінацію (НЕ), щоб здійснити репарацію пошкоджень ДНК. Таким чином, може бути сформований сайт- спрямований субституційний або інсерційний мутант. Наразі технології редагування генома, які демонструють значний потенціал щодо поліпшення агрономічних властивостей важливих сільськогосподарських культур, ефективно використовують на деяких рослинах (таких як рис,
Агарідорзі5, кукурудза, пшениця) для модифікування генома рослини.
Однак, незважаючи на те, що редагування генома надає шанс на поліпшення в майбутньому сільськогосподарських культур, все ще залишається велика проблема. Для проведення редагування генома сіквенсо-специфічна нуклеаза має бути експресована в клітині.
Наразі способом експресії сіквенсо-специфічної нуклеази в рослинних клітинах є доставка експресійного вектора або фрагмента ДНК, що експресує нуклеазу, в згадані клітини із застосуванням традиційних трансформаційних методів (Адгобасіегіит-опосередкованої трансформації, бомбардування частинками, ін'єкції тощо). Ці успадковувані матеріали довільно інтегрують в рослинну хромосому і транскрибують для здійснення редагування. Згадані традиційні трансформаційні методи передбачають інтеграцію екзогенних генів в рослинний
Зо геном і потребують селекційних маркерів (селекційний тиск) в процесі трансформації, що може призвести до утворення небажаних фенотипів. Застосування одержаних рослин підлягає регулюванню згідно з нормативними документами щодо ГМО. Таким чином, необхідно створити спосіб проведення редагування генома в рослинах без необхідності введення успадковуваного матеріалу ДНК.
Суть винаходу
Метою цього винаходу є надання способу здійснення сайт-спрямованої модифікації цільового фрагмента гена-мішені в рослині.
Спосіб, запропонований цим винаходом для проведення сайт-спрямованої модифікації цільового фрагмента гена-мішені в рослині, зокрема, включає такі етапи: введення неуспадковуваного матеріалу в клітину, тканину або частину рослини, що становить інтерес; при цьому згаданий неуспадковуваний матеріал являє собою нуклеазу, специфічну для згаданого цільового фрагмента, або мРНК, що експресує згадану нуклеазу, в результаті чого цільовий фрагмент розщеплюється згаданою нуклеазою, і сайт-спрямована модифікація цільового фрагмента досягається через репарацію ДНК в рослині.
За запропонованим способом неуспадковуваний матеріал вводять в клітину, тканину або частину рослини, що становить інтерес. Згаданий неуспадковуваний матеріал може експресувати нуклеазу для проведення сайт-спрямованої модифікації цільового фрагмента, або згаданий неуспадковуваний матеріал може безпосередньо впливати на цільовий фрагмент із досягненням сайт-спрямованої модифікації. Під час або після сайт-спрямованої модифікації, згаданий неуспадковуваний матеріал може бути зруйнований метаболічним механізмом клітини. Модифікована клітина або тканина може бути регенерована в інтактну рослину із застосуванням звичайної культури тканини. Таким чином, одержують рослину-мутант, що не містить трансгену, в якій модифікованим є тільки цільовий фрагмент і в яку не введений екзогенний успадковуваний матеріал.
За запропонованим способом згадана о нуклеаза являє собою нуклеазу ТАГЕМ, пальцевоцинкову нуклеазу, нуклеазу СКІЗРК/Са5з9 або будь-яку іншу нуклеазу, яка може забезпечити редагування генома.
Відповідно, неуспадковуваний матеріал може бути вибраний з-посеред будь-якого з нижченаведених матеріалів (а)-(с). бо (а) Неуспадковуваний матеріал являє собою нуклеазу ТА ЕМ або мРНК, здатну експресувати спаровані білки ТАГ ЕМ; при цьому білок ТА ЕМ складається з домену зв'язування
ДНК, здатного розпізнавати цільовий фрагмент та зв'язуватись із цим цільовим фрагментом, та домену ЕокК І.
За одним із варіантів здійснення цього винаходу (Приклад 1) згаданий неуспадковуваний матеріал складається з мРНК послідовностей ЗЕО ІЮ МО: З ії БЕО ІЮО МО: 4. За іншим варіантом здійснення цього винаходу (Приклад 2), згаданий неуспадковуваний матеріал складається з білків послідовностей 5ЗЕО ІЮО МО: 7 і 5ЕО ІЮО МО: 8. (Б) Неуспадковуваний матеріал являє собою цинковопальцеву нуклеазу або мРНК, здатну експресувати спаровані білки ЕМ; при цьому білок 2ЕМ складається з домену зв'язування ДНК, здатного розпізнавати та зв'язуватись із цільовим фрагментом, та домену Рок І. (с) Неуспадковуваний матеріал складається з білка Са59 або мРНК, здатної експресувати білок Са59, і РНК-гіда; при цьому згадана РНК-гід являє собою РНК з паліндромною структурою, яка утворюється частковим паруванням основ між сгкМА та ігастеМА; згадана стеМА містить фрагмент РНК, здатний до комплементарного зв'язування з цільовим фрагментом.
За одним з варіантів здійснення цього винаходу (Приклад 3) згаданий неуспадковуваний матеріал складається з білка, який має послідовність ЗЕО ІЮ МО: 10, ї 5б9ЕМА, яка має послідовність ЗЕ ОО МО: 11. За іншим варіантом здійснення цього винаходу (Приклад 4) згаданий неуспадковуваний матеріал складається з білка, який має послідовність БЕО ІЮ МО: 10, і ДМА, яка має послідовність 5ЕО ІЮ МО: 12.
Відповідно до запропонованого способу згадана клітина може бути будь-якою клітиною, в яку може бути введений неуспадковуваний матеріал і яка може регенерувати в інтактну рослину через культуру тканини. Згадана тканина може бути будь-якою тканиною, в яку може бути введений неуспадковуваний матеріал і яка може регенерувати в інтактну рослину через культуру тканини. Згадана частина рослини являє собою частину інтактної рослини (не ех мімо частину), в яку може бути введений неуспадковуваний матеріал.
Зокрема, згаданою клітиною може бути протопласт або клітина суспензійної культури.
Згаданою тканиною може бути калюс, незрілий зародок або зрілий зародок. Згаданою частиною рослини може бути лист, верхівка пагону, гіпокотиль, молодий колос або пилкова трубка.
Відповідно до згаданого способу методом введення неуспадковуваного матеріалу в клітину, тканину або частину рослини, що становить інтерес, може бути бомбардування частинками,
ПЕГ-опосередкована трансформація протопластів, метод з використанням пилкових трубок або будь-який інший метод, який може бути використаний для доставки неуспадковуваного матеріалу.
Відповідно до згаданого способу сайт-специфічна модифікація являє собою інсерцію, делецію та/або заміну нуклеотиду в цільовому фрагменті.
Ще одною метою цього винаходу є надання способу одержання рослини-мутанта, що не містить трансгену.
Запропонований цим винаходом спосіб одержання рослини-мутанта, що не містить трансгену, може включати такі етапи: проведення сайт-спрямованого модифікування цільового фрагмента гена-мішені в рослині, яка становить інтерес, з одержанням таким чином рослини, в якій функції гена-мішені є втраченими або зміненими, і її геном не містить інтегрованого екзогенного гена.
За цим винаходом згадана рослина може бути однодольною або дводольною. За деякими варіантами здійснення цього винаходу згаданою рослиною є рис, кукурудза, пшениця або тютюн.
У порівнянні з успадковуваним матеріалом ДНК, білок і мРНК являють собою два типи неуспадковуваного матеріалу, які можуть бути легко розкладені в клітині із використанням механізму захисту. Завдяки транзієнтному введенню мРНК або білка сіквенсо-специфічної нуклеази, мутанти з сайт-спрямованими нокаутованими генами можуть бути одержані без інтеграції гена сіквенс-специфічної нуклеази або векторного фрагмента в рослинний геном, а саме без трансгенів. Спосіб за цим винаходом забезпечує більшу біологічну безпеку, а різновиди сільськогосподарських культур, одержані за згаданим способом, не будуть підлягати регулюванню згідно з нормативними документами щодо ГМО. Цей винахід має значну цінність для фундаментальних досліджень і селекції сільськогосподарських культур.
Короткий опис фігур
На Фіг. 1 показано, що мутації гена Тасуу2 спричинені трансформуванням незрілого зародка пшениці мРНК Са59 та зоКкМА. А: гель-електрофоретограма мРНК сСавз9, транскрибованої іп міїго із застосуванням транскрипційного набору мРНК (АМ1344, Атрбіоп). В:
Результати РСЕУКЕ, які показують мутації у цільовому сайті Тасум2 рослин ТО, спричинені бо МРНК Саз9 та здеЕМА-саУуУ2-С14. С: результати секвенування показують мутації, індуковані на цільовому сайті іп мійго транскрибованою мРНК Саб59 та 5дЕМА-СМУ2-С14. УТ означає послідовність гена дикого типу, "-" означає послідовність з делецією, "-" означає послідовність з інсерцією, число після "-/4" означає кількість видалених або вставлених нуклеотидів.
На Фіг. 2 показано, що мутації гена О5ВАОН2 були спричинені транзієнтним трансформуванням протопластів рису мРНК-ТАГЕМ. А: гель-електрофоретограма, що показує іп мійго транскрипцію Т-ВАОН2Б-Ї ії Т-ВАОН2Ь-К транскрипційним набором мРНК (АМ1344,
Атріоп); полі(А)-хвіст доданий до 3'-кінця МРНК. В: Результати РСЕ/КЕ, що показують мутації у цільовому сайті, спричинені іп міго транскрибованою мРНК в протопластах. С: результати секвенування показують мутації, індуковані на цільовому сайті іп міго транскрибованою мРНК.
МЛ означає послідовність гена дикого типу, "-" означає послідовність з делецією, "-" означає послідовність з інсерцією, число після "-/я" означає кількість видалених або вставлених нуклеотидів.
На Фіг. З показано мутагенез гена МІ О пшениці в результаті трансформації протопластів пшениці білками МІ О-ТАГЕМ. А: Результати 50О5-РАСЕ, які показують прокаріотичну експресію та очищення Т-МІО-Ї та Т-МІГО-К для цільового сайту МО. В: Результати РСЕ/КЕ, що показують мутації у цільовому сайті, спричинені білками ТАГЕМ в протопластах. С: результати секвенування показують мутації, індуковані на цільовому сайті іп міго одержаними білками
ТАГЕМ. УМТ означає послідовність гена дикого типу, "-" означає послідовність з делецією, "ж" означає послідовність з інсерцією, число після "-/«" означає кількість видалених або вставлених нуклеотидів.
На Фіг. 4 показано мутагенез гена пшениці ТасА5Кк7 в результаті трансформації протопластів пшениці білююом Са59 та іп міго транскрибованою 5дкМА. А: Результати 505-
РАСЕ, які показують прокаріотичну експресію та очищення білка Са59. В: Результати РСЕ/КЕ, що показують мутації у цільовому сайті, спричинені білком Са59 та іп міго транскрибованою 5ОКМА. С: результати секвенування показують мутації, спричинені на цільовому сайті іп міго одержаним білком Са59 та іп міго транскрибованою 5д9ЕМА. УМ/Т означає послідовність гена дикого типу, "-" означає послідовність з делецією, "я" означає послідовність з інсерцією, число після "-/«" означає кількість видалених або вставлених нуклеотидів.
На Фіг. 5 показано, що мутації гена МІРУМ були спричинені котрансформацією білка Са59 та
Зо іп мйго транскрибованої 5З9ЕМА у протопласти тютюну, і рослини-мутанти були одержані регенерацією. А: результати РСК/КЕ, що показують мутації в цільовому сайті, спричинені білком Саз59 та іп міго транскрибованою 5здКМА в протопластах. В: результати секвенування показують мутації цільового сайту, індуковані котрансформацією іп міго одержаного білка Са59 та іп міго транскрибованої 5хФЕМА у протопласти тютюну. С: Виявлення рослин-мутантів, регенерованих з протопластів, та результати секвенування цільових сайтів. УТ означає послідовність гена дикого типу, "-" означає послідовність з делецією, "«" означає послідовність з інсерцією, число після "-/4" означає кількість видалених або вставлених нуклеотидів.
Докладний опис прикладів здійснення
Всі експериментальні методи, використані в нижченаведених Прикладах, є звичайними методами, якщо не зазначено інше.
Всі матеріали, реагенти, використані в нижченаведених Прикладах, є наявними у продажу, якщо не зазначено інше.
Пшениця сорту ВоБбу/піе описана у "УуУеек5, 9.Т. еї аїЇ., Карій ргодисіоп ої тийіріе іпдерепаепі Іпе5 ої ТепіШе іапздепіс мпеаї. Ріапі Рнувіої. 102: 1077-1084, (1993)", і її можна одержати з Інституту генетики і еволюційної біології Китайської Академії наук.
Вектор Т-МГІО на основі нуклеази ТАГЕМ, геном-мішенню для якого є ген Там о пшениці, описаний у "Уапод, У., Спепд, Х., 5пап, О., 2Напа, М., ім, уУ., бас, С., апа Ом, У... (2014).
Зітийапеоиз еєайіпу ої їпгее потоеоаїІє!ез іп Нехаріоїд бгеай упеаї сопіег5 Пепабіє гезівїапсе юЮ ромаеєгу тіідем/. Маїшге Віоїесппоіоду. 32, 947-951", і його можна одержати з Інституту генетики і еволюційної біології Китайської Академії наук.
Експресійний вектор рОЕХ-4Т на основі прокаріотичних генів одержували від Зпаподпаї
ВеїМмио Віотесппоіоду Со. Ца., номер за каталогом 1110024.
Іп міго транскрипційний вектор рХТ7-Са59 на основі Са5з9-птЕМА розкритий в "Спапод М., Зип
С., сао Г.., 2пи 0., Хи Х., єї а)., 2013. Сепоте еайіпд м/п АМА-диїдей Саз9 писієавзе іп 2ебгаїїви етрбгуоз. Сеї! гезвагсп 23:465-72", і його можна одержати від авторів цього винаходу.
Вектор рГ7/-чкМА розкритий в "А ргодгаттабіє ачаІ-АМА-днідеа ОМА епдописієавзе іп адаріїме Басієтіа! іттипйу. Зсієпсе 337(6096): 816-821", і його можна одержати з Інституту генетики і еволюційної біології Китайської Академії наук.
Кукурудза сорту НІЇЇ розкрита в "Аптвігопоу, С.Ї., Стееп, С.Е. 6. РНйірв, В.І. Юемеіортепі апа 60 амайаріїйу ої дептріазт ул Нідн їтуре ІІ сийиге Топтаїйоп гезроп5е. Маїге Сепеї. Соор. Мемуз І ей.
65,92-93 (19913", ії її можна одержати з Інституту генетики і еволюційної біології Китайської
Академії наук.
Розчини, використані при одержанні та перетворенні протопластів рису, наведені в
Таблицях 1-5.
Таблиця 1 50 мл ензимолітичного розчину 11111111 | о Доданакількість | Кінцева концентрація
Целюлаза ВТО
Мацерозим К10 0,375 г 0,75 90 5,51 г .7иЙ7Л/щ06М ГщЮ 2-(М-морфоліно)етансульфонова кислота 0,1066 г
Доливають до 50 мл двічі дистильованою водою, рН доводять до 5,7 додаванням КОН, інкубують на водяній бані (552С) протягом 10 хв, і охолоджують до кімнатної температури перед доданням 0,0735 г
Фільтрують із застосуванням 0,45 мкм фільтра
Таблиця 2 500 мл МУ5 11111111 | о Доданакількість | Кінцева концентрація 154 ММ 9,189 г 125 ММ 0,1864 г 2-(М-морфоліно)етансульфонова кислота 0,2132 г
Доливають до 500 мл двічі дистильованою водою, рН доводять до 5,7 додаванням маон
Таблиця З мл розчину ММО 11111111 | Доданакількість | Кінцева концентрація
Маніт (0,8 М)
Мосіг (1 М 2-(М-морфоліно)етансульфонова кислота (200 мМ) 0,2 мл 4 ММ (Двічидистильованавода.д//-:/ | доїбмл/// | : Ф (
Таблиця 4 4 мл розчину ПЕГ 11111111. | Доданакількість | Кінцева концентрація
РЕС40О00
Маніт (0,8 М)
Сась (і м (Двічидистильованавода.д//-:/ | доїмл/// | //::/С/
Таблиця 5 250 мл розчину УМІ 11111111 | Доданакількість | Кінцева концентрація 27,324 г 7иЙЛищ06М' ГщЮЖ 0,07456 г 2-(М-морфоліно)етансульфонова кислота 0,2135 г 4 ММ 200 мМ
Доливають до 250 мл двічі дистильованою водою, рН доводять до 5,7 додаванням КОН 10
У вищенаведених Таблицях 1-4 95 означає відсоткове відношення маса/об'єм, г/100 мл.
Середовища, використані для культури клітин тканини пшениці, включають:
Гіпертонічне середовище: мінімальне середовище М5, маніт (90 г/л), 2,4-О (5 мг/л), сахароза (30 г/л) і фітогель (З г/л), рН 5,8.
Індукційне середовище: мінімальне середовище М5, 2,4-О (2 мг/л), сульфат міді (0,6 мг/л), казеїнові гідролізати (0,5 мг/л), сахароза (30 г/л) і фітогель (З г/л), рН 5,8.
Диференціювальне середовище: мінімальне середовище М5, кінетин (0,2 мг/л), сахароза (30 г/л) і фітогель (З г/л), рН 5,8.
Укорінювальне середовище: мінімальне середовище М5 (1/2), етансульфонова кислота (0,5 мг/л), а-нафтилоцтова кислота (0,5 мг/л), сахароза (30 г/л) і фітогель (З г/л), рН 5,8.
Приклад 1. Сайт-спрямоване редагування Тасму?2 шляхом трансформування незрілого зародка пшениці іп міго транскрибованою мРНК Савз9 та здаеЕМА
І. Конструювання цільового фрагмента: мішень-С14
Мішень-С14: 5-ССбАсСсаАТавасТАТТТСТАСАСО-3 (на консервативній ділянці екзону 8 пшениці Тасум2, Групи А, В і 0).
І. Тп міго транскрипція і очищення Са59-ме НК 1. Вектор рХтТ7-Саз59 гідролізували за допомогою Хваї. Гідролізований продукт очищали із застосуванням набору для очищення (Ахудеп) до концентрації вище ніж 100 нг/мкл, і позначали як рХТ7-Са59-Хваї. 2. Очищений продукт рХТ7-Сав5з9-Хба! транскрибували із застосуванням транскрипційного набору іп міго (АМ1344, Атбіоп). Продукт очищали із застосуванням набору для очищення
МРНК (АМ1908, Атбіоп) до концентрації вище ніж 500 нг/мкл. На Фіг. ТА показана агарозна гель-електрофоретограма іп міго транскрибованої Са59-мРНК.
ШІ. Тп міго транскрипція З9ДКМА проти цільового сайту 1. Цільовий сайт Тасуу2 вбудовували у вектор рТаб-двВМА
Синтезували такі одноланцюгові олігонуклеотиди з липкими кінцями (підкреслені):
С14г: 5-СстТаСАасаАтТасаатТАТТТСТАа-3";
С148: У-АААССТАСАААТАССССАТОСТОИ-3".
Дволанцюгову ДНК з липкими кінцями одержували із застосуванням процесу відпалу між
Зо С14Р/С14К, і вставляли між двома сайтами рестрикції Вр5І в плазміду рТтайб-деМА з одержанням плазміди рГайб-дкМА, яка містить сайт С14. Позитивну плазміду підтверджували секвенуванням. Рекомбінантна плазміда, яку одержали інсерцією фрагмента ДНК, як показано в 5-сттасяласАтТасаастТАТТТСТАС-3, у прямому напрямку на сайті рестрикції Вр5іІ плазміди ртТайб-9еМА, була позитивною, і її позначили як рТайб-аАМА-С5. 2. Іп міго ампліфікація та очищення фрагмента ДНК Т7-Тасху2-двМА
Конструкція праймера
Т7-Тайму2-г: ТААТАСИАСТСАСТАТАСССАсСалтасвсаТАТТТСТАС; 9АМА-РСВ-В: АСАСССАСТОСИОИТасСсСАСТТ.
ПЛР-ампліфікацію виконували з рташб-днМА-С14 у ролі матриці. Продукт ПЛР очищали із застосуванням набору для очищення ПЛР (АР-Х-25005, Ахудеп) до концентрації вище ніж 100 нг/мкл. Одержаний продукт ПЛР являє собою 5дЕМА, що містить промотор 17 та цільовий сайт
Тасуу2, і його позначили як Т7-Тасх/2-дАМА. 3. Іп міго транскрипція З9КМА, що містить цільовий сайт Тасуу2 59АМА-сУУ2-С14 (як показано в послідовності ЗЕО ІЮ МО: 17) транскрибували іп міїго із застосуванням іп міго транскрипційного набору Т7 (Е20405, МЕВ).
ІМ. Сайт-спрямоване редагування гена Тасуум2 пшениці шляхом трансформації із застосуванням бомбардування частинками іп міго транскрибованої Сабз9-птЕМА та іп міго транскрибованої ЗхдаеЕМА 1. Завантаження іп міго транскрибованої Са59-тЕМА та іп міго транскрибованої 5Зд9ЕМА у 0,6 нм золотий порошок 5 мкл 0,6 нм золотого порошку, З мкл Саб59-птЕМА, 1 мкл зда МА-СУУ2-С14, 1 мкл 5 М розчину ацетату амонію, 20 мкл ізопропанолу змішували, і осаджували при -202С протягом 1 год. для того, щоб уможливити прикріплення Са59-пЕМА і здаЕМА-сМуУ2-С14 до золотого порошку. Суміш центрифугували при 1000 об/хв протягом 5 с, і промивали в 100 мкл зневодненого спирту після видалення супернатанту, а потім знову центрифугували при 1000 об/хв протягом 5 с, і ресуспендували в 20 мкл зневодненого спирту після видалення супернатанту. 2. Трансформація матеріалів-реципієнтів пшениці із застосуванням бомбардування частинками бо 1) Брали незрілий зародок пшениці сорту КМ199 і обробляли протягом 4 год. у гіпертонічному середовищі. 2) Для бомбардування незрілого зародка пшениці, культивованого на етапі 1) у гіпертонічному середовищі, застосовували пристрій для бомбардування частинками. 20 мкл суміші ЗФДЕМА-Са59-пЕМА наносили на мембрану, і здійснювали бомбардування; відстань для кожного бомбардування дорівнювала 6 см, тиск бомбардування становив 1100 фунтів/дюйм? (7,584 МПа), діаметр бомбардування дорівнював 2 см. 3) Незрілий зародок пшениці, бомбардований на етапі 2), культивували протягом 16 год. у гіпертонічному середовищі. 4) Незрілий зародок пшениці, культивований на етапі 3) у гіпертонічному середовищі, у подальшому послідовно піддавали культивуванню протягом 14 днів для індукування утворення калюсної тканини, культивуванню протягом 28 днів для диференціювання і культивуванню для вкорінення для того, щоб одержати рослини пшениці. 5) З розсади пшениці, одержаної на етапі 4), екстрагували ДНК, і мутанти з нокаутованим геном (у сайт-спрямований спосіб) виявляли із застосуванням методів РСЕ/КЕ (полімеразна ланцюгова реакція/рестрикційний гідроліз) (конкретний метод випробування, дивись етап ІМ). Як контроль використовували пшеницю сорту Кп199 дикого типу.
Оскільки існує послідовність, розпізнавана рестрикційною ендонуклеазою Хваї у цільовому фрагменті ендогенного гена Тасуу2 пшениці, для проведення тестів РСЕ/КЕ використовували храї. Праймери, використані для ПЛР-ампліфікації, являють собою праймери, специфічні для
Груп А, В та 0, і мають такі послідовності:
Тасхмуг-АЕ: 5-стТассСАТТАСТТТаТтТАТТТТОасСТААТА-З";
Тасхму2г-ВвВЕ: 5-аТСсАпАТааСААТСТАДААСТТ-3";
Тасхжуг-ОЕ: У-аСАТатТАСТІ ТОАТтТаттасСатаА-3";
Тасхуг-н: 5-ТОСТОСТОТСТТАССАСТТОСО-3".
Результати деяких тестів на виявлення вказують на те, що на цільовому сайті гена Тасшу2 пшениці відбулись мутації. Смуги були відновлені для секвенування. Результати секвенування вказують на те, що на цільовому сайті гена Тасуу2 пшениці відбулась інсерція/делеція (індел) (Фіг. 18 і фіг. С).
Приклад 2. Сайт-спрямоване редагування гена О5ВАОН2 шляхом трансформування
Зо протопластів рису іп міго транскрибованою мРНК ТАГЕМ
І. Цільовий фрагмент ТАГЕМ
Послідовність гена ВАСНЕІ рису показана послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 1.
Цільовий фрагмент ТАГЕМ розташований у четвертому екзоні гена ВАОНІ рису і має таку послідовність: 5-астапАТтасттталдатТАстосадаїснасадад ТССТТасАСАДАДАСс(аС-3 (позиції 1589-1640 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1); малі літери посередині означають послідовність спейсера; і розташовані з обох сторін великі літери означають послідовності, що розпізнаються модулями
ТАГЕМ (позначеними як І -р та К-Б). Підкресленою є послідовність, що розпізнається ВО.
ІЇ. Конструювання та синтез генів кодування ТАГЕМ
Білок ТАГ ЕМ, який розпізнає І -5 у цільовій послідовності, позначений як Т-ВАОНЕАаБ-Ї, тоді як кодувальна послідовність показана позиціями 7-2952 послідовності ХЕО ІЮ МО: 2. Позиції 7-27 послідовності 5ЕО ІЮ МО: 2 кодують сигнал ядерної локалізації (МІ 5); позиції 463-2154 кодують білок, що розпізнає модуль послідовності І -б; позиції 2350-2953 (603 п.н.) кодують ендонуклеазу
ЕоК І.
Білок ТАГЕМ, який розпізнає К-Бр у цільовій послідовності, позначений як Т-ВАЮОНО2Б-К, тоді як послідовність кодування показана позиціями 3085-6018 послідовності 560 ІЮ МО: 2. Позиції 3085-3105 послідовності зХЕО ІЮ МО: 2 кодують сигнал ядерної локалізації (МІ 5); позиції 3541- 5232 кодують білок, що розпізнає модуль послідовності І -Б; позиції 5428-6018 (591 п.н.) кодують ендонуклеазу РОК І.
БО Позиції 2953-3006 послідовності 5ЕО ІО МО: 2 кодують Т2А, який складається з 18 амінокислот і який дозволяє білкам Т-ВАОНаБ-Ї ії Т-ВАОН2р-К, експресованим в одному і тому самому полігенному експресійному кластері, розділятись на два окремі білки.
І. Тп міго синтез мРНК гена ТАГЕМ
Два компоненти ТАГЕМ гена ВАЮН2 рису, Т-ВАОН2Б-Ї і Т-ВАОН2бБ-К, транскрибували іп міго із застосуванням транскрипційного набору мРНК (Атрбіоп), використовуючи промотор Т7 для ініціювання транскрипції. Одержали меРНК-Ї -Т-оО5ВАОНІ2Ь ії мРНК-А-Т-О5ВАОНЕа, а полі(А)- хвости додавали до їхнього 3'-кінця, для підвищення стабільності мРНК.
Послідовність мРНК-Ї -Т-О5ВАОН2Ь показана послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 3, а послідовність
МРНК-А-Т-О5ВА0Н2Ь показана послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 4. бо ІМ. Введення суміші двох мРНК ТАГЕМ, одержаних транскрипцією іп міго, в протопласти рису 1. Одержання матеріалів
Використовують рис сорту Мірропбаге. Зерна промивають 75 95 етанолом, потім обробляють 2,5 95 розчином натрію гіпохлориту протягом 20 хв, промивають стерильною водою більше 5 разів, і культивують на середовищі 1/2 М5 протягом 7-10 днів при температурі 262С та 12- годинному освітленні (150 мкмоль-м--с7"). 15 зерен можна культивувати у великому скляному культуральному флаконі. Для одного експерименту потрібно 40-60 проростків, а кількість ізольованих протопластів є достатньою для трансформації 6 плазмід. 2. Виділення протопластів 1) Для виділення протопластів використовували паростки та листкові піхви. Їх нарізали на 0,5 мм смужки. 2) Згадані смужки негайно переносили до 0,6 М розчину маніту, і витримували в темряві протягом 10 хв. 3) Розчин маніту видаляли фільтруванням, смужки переносили в ензимолітичний розчин, і обробляли протягом 30 хв при створюваному вакуумним насосом тиску від -15 мм рт. ст. (-2,0 кПа) до -20 мм рт. ст. (-2,7 кПа) у темряві. 4) Зразки додатково гідролізували протягом 4-5 год. з обережним струшуванням (на шейкері із частотою 10 об/хв). 5) Після гідролізу додавали рівний об'єм розчину М/5, і розчин струшували протягом 10 с для вивільнення протопластів. б) Протопласти відфільтровували в 50 мл круглодонну центрифугальну пробірку, використовуючи 40 мкм нейлонову фільтрувальну мембрану, і для промивання додавали розчин УМ5. 7) Центрифугували при 2509 протягом З хв для осадження протопластів, і супернатант видаляли. 8) Протопласти ресуспендували в 10 мл М/5, центрифугували при 2509 протягом 5 хв, і супернатант видаляли. 9) Протопласти ресуспендували додаванням відповідної кількості розчину ММО.
Концентрація протопластів становила 2х106/мл, як визначили шляхом підрахунку із застосуванням гемоцитометра.
Примітка: всі описані вище етапи виконували при кімнатній температурі. 3. Трансформація протопластів 1) У 2 мл центрифугальну пробірку вміщували 10 мкг мРНК-І -Т-О5ВАОНАІ2Ь та 10 мкг мРеНК-
В8-Т-О5ВАОНЗ2Ь. Додавали 200 мкл протопластів (приблизно 4х105 клітин). Потім додавали 220 мкл свіжого розчину ПЕГ, і змішували. Трансформацію проводили в темряві протягом 10-20 хв при кімнатній температурі. 2) Після завершення трансформації повільно додавали 880 мкл МУ5, перемішували перевертанням, центрифугували при 2509 протягом З хв, і супернатант видаляли. 3) Протопласти ресуспендували додаванням 1 мл МІ, і переносили на б-лунковий планшет (із заздалегідь доданим 1 мл МІ), після чого культивували при кімнатній температурі або при 282С в темряві протягом 6-16 год. (протягом 48 год., якщо протопласти використовували для екстракції геномної ДНК). 4. Використання РСК/КЕ (полімеразна ланцюгова реакція/рестрикційний гідроліз) експериментів для аналізу мутагенезу ендогенного гена ВАЮН2 рису, що є результатом використання іп міго транскрибованої ТАГ ЕМ
Через 48 год. після трансформації протопластів екстрагували геномну ДНК, яку використовували як матрицю для аналізу з РСЕК/КЕ (полімеразна ланцюгова реакція/рестрикційний гідроліз) експериментами. Протопласти рису сорту Мірропраге дикого типу одночасно використовували як контроль. Метод аналізу з РСЕ/КЕ базується на 5Впап, о. еї аї., Варій апа ейісіепі депе тодаіййсайоп іп се апа Вгаспуродішт ивіпа ТАГЕМ5. Моїесшіаг Ріапі (2013). Оскільки цільовий сайт ендогенного гена ВАОН2 рису містить послідовність розпізнавання рестрикційної ендонуклеази ВО, згадану рестрикційну ендонуклеазу ВОЇЇЇ використовували в експерименті для проведення тесту РСЕ/КЕ. Праймерами, використаними в
РСВ-ампліфікації, були:
О5ВАОН-Е: У-САТосСсаса,аСсассластоттсатоа-9";
О5БВАОН2-В: 5-САСИаААТААДААТСТСАААТатсСТТСААСТТ-3".
Результати РСЕ/КЕ експериментів зображені на Фіг. 2В, і ці результати показали, що на цільовому сайті гена ВАСНАа відбулись мутації, і ефективність мутагенезу становить приблизно 5 95. Смуги на цій фігурі були відновлені і секвеновані. Результати секвенування показали, що бо на цільовому сайті гена ВАОСНЗ відбулась інсерція/делеція (індел) (Фіг. 25).
Приклад 3. Експресія і очищення білків ТАГЕМ в прокаріотичній експресійній системі та трансформація цих білків на протопласти або незрілі зародки пшениці для сайт-спрямованої модифікації гена МО
І. Вибір цільових послідовностей і конструювання білків ТА ЕМ
Консервативну ділянку в екзоні 2 гена МГО пшениці використовували як цільову послідовність для конструювання пари білків ТАГ ЕМ (що складається з білка ТАЇ -МІ 0-1 і білка
ТАІ-МІО-К; білок ТАЇ-МІО-Ї складається з двох функціональних фрагментів, а саме фрагмента, який специфічно зв'язується з висхідними нуклеотидами цільової послідовності, та ендонуклеази ЕБокК | з ЕЇ -мутацією; білок ТАГ-МІГО-К складається з двох функціональних фрагментів, а саме фрагмента, який специфічно зв'язується з низхідними нуклеотидами цільової послідовності, та ендонуклеази ЕоК І з КК-мутацією). Цільові послідовності згаданих білків ТАГЕМ в генах Там о-А, Там! Оо-В та Там! о-о0 виглядають так:
Ген Там о-А: 5е-тоастастастоасСсСстТсасоасаддасссааіссісс!;сО)СсАТАТаСАТСТОССА-3";
Ген Там о-вВ: 5е-тсастастастоассСстТдасосаддассссаїсіссСЇСс:сАТАТаСАТСТОСОДА-3;
Ген Там 0-0: 5е-тсастастастоасСсСстТдасасаддасссааїссСасАТАТаСАТСТОСОЇДА-3.
У клітині пшениці, коли фрагмент ТАГ--Ї та фрагмент ТАГ-К зв'язані з відповідною ділянкою зв'язування, дві різні мономерні ендонуклеази бок І (ендонуклеаза БоК І з ЕЇ -мутацією та ендонуклеаза Рок І з КК-мутацією) можуть утворити активну димерну ендонуклеазу Рок І, яка розщеплює ділянку цільової послідовності (включаючи цільову послідовність і фланкуючі послідовності) з утворенням дволанцюгового розриву. Протягом репарації згаданого розриву згаданою клітиною може бути введена будь-яка кількість мутацій. У цьому описі термін "мутація" має широке значення, включаючи інсерцію, делецію, заміну тощо, більшість з яких призводить до втрати функції генів.
У вищенаведених цільових послідовностях підкреслена частина являє собою послідовність розпізнавання рестрикційної нуклеази АмаїІ, яка може бути розрізана із застосуванням АмаїЇ.
Після утворення розриву, якщо відбувається мутація, яка руйнує послідовність розпізнавання
Зо АмаїІ, цільова послідовність не може бути розрізана із застосуванням Амаї!; якщо мутація не відбувається, цільова послідовність може бути розрізана із застосуванням Амаї!.
ІІ. Експресія і очищення білків ТАГЕМ для гена-мішені МО в прокаріотичній експресійній системі 1. Конструювання прокаріотичних експресійних векторів для експресії білків ТА ЕМ 1) Кодувальні ділянки ТАГ-І/. (послідовність 5ЕО ІЮ МО: 5) і ТАГ-К (послідовність 5ЕО ІО МО: б) гена ТАГЕМ вбудовували в прокаріотичний експресійний вектор рОЕХ-4Т, так що одержали рекомбінатний вектор з кодувальною ділянкою ТАЇ-І. (послідовність ЖЕО ІЮО МО: 5), вставленою між сайтами Ватні та Храї роЕХ-4Т у прямому напрямку, тоді як кодувальна ділянка ТА! -А (послідовність ЗЕО ІЮ МО: 6) була вставлена між сайтами Хваї та Ватні роЕХ-4Т у прямому напрямку. Рекомбінантний вектор перетворювали на ВІі/21 Е.соїї Позитивну колонію інокулювали в середовище І В, доповнене ампіциліном та хлорамфеніколом, і культивували при 372С протягом ночі. Після цього згадану культуру інокулювали в 5 мл свіжого середовища ГІ В у співвідношенні 1:100, культивували при 372С при 225 об/хв до О0060020,5. Як негативний контроль (без індукції) відібрали 1 мл згаданої культури. Також одержували контролі порожнього вектора рОЕХ-4Т з індукцією або без неї. До решти культури додавали ІРТО (кінцева концентрація 1 мМ) для індукування експресії при 372С при 225 об/хв протягом 8 год. 2) Відбирали по 1 мл кожної з контрольної або індукованої культур, і центрифугували при 12000 об/хв протягом 10 хв для збору бактеріальних клітин, видаляючи супернатант. Зібрані клітини ресуспендували додаванням 50 мкл буфера, призначеного для завантаження білка, і кип'ятили протягом 7 хв. Супернатант аналізували із застосуванням електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності 1095 додецилсульфату натрію (1095 505-РАСЕ).
Молекулярна маса кожного білка ТАГЕМ становила приблизно 100 кДа. Амінокислотна послідовність білка ТАЇГ-МІО-Ї показана послідовністю 5ЕБЕО І МО: 7. Амінокислотна послідовність білка ТА! -МІ О-Е показана послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 8. 2. Очищення білків ТАГЕМ
Бактеріальну культуру центрифугували при 42С протягом 10 хв для збору бактеріальних клітин. В утворений осад додавали 10 мл лізисного буфера (50 мМ Трис-НСІ, 2 мМ ЕОТА, 100
ММ Масі, 1 мг/мл лізоциму, рН8,5), і перемішували на льоду протягом 45 хв. Після обробки ультразвуком, збирали осад центрифугуванням, промивали 4М розчином імідазолу. Осад, бо одержаний після подальшого центрифугування, розчиняли у 50 мМ фосфатному буфері (що містив 8М сечовини) при рН 7,4. (Фіг. ЗА).
І. Введення очищених білків ТАГЕМ у протопласти пшениці для сайт-спрямованого редагування гена МО
Очищені білюи ТАГЕМ проти цільового сайту гена МГО вводили в протопласти пшениці сорту Ворул/піїе із застосуванням РЕС-опосередкованого методу, описаного нижче. 1. Вирощування паростків пшениці
Зерна пшениці пророщували в культуральній кімнаті при 25:522С, освітленості 1000 люкс, при 14-16-годинному освітленні на добу, протягом приблизно 1-2 тижнів. 2. Виділення протопластів 1) Брали тонке листя пшениці, і його середню частину розрізали різальним інструментом на 0,5-1 мм смужки, уміщували в 0,6М розчин маніту (як розчинник використовували воду) на 10 хв в темряві. Потім суміш фільтрували через фільтр, після чого уміщували в 50 мл ензимолітичного розчину для гідролізу протягом 5 год. (0,5 год. - ензимолізис у вакуумі, потім 4,5 год. - повільне струшування при 10 об/хв).
Примітка: Температуру під час ензимолізису слід підтримувати на рівні 20-252С, реакцію слід проводити в темряві; і розчин слід обережно струшувати після реакції для вивільнення протопластів. 2) Продукт ензимолізису розбавляли додаванням 10 мл М/5, і відфільтровували в 50 мл центрифугальну пробірку з круглим дном із застосуванням 75 мкм нейлонової фільтрувальної мембрани.
Примітка: Нейлонову фільтрувальну мембрану слід занурити в 75 95 (у відсотках за об'ємом) етанол, промити водою, після чого просочити М/5 протягом 2 хв перед використанням. 3) Центрифугували при 232С протягом З хв при 1009, і супернатант видаляли. 4) Осад суспендували в 10 мл УУ5, витримували на льоду протягом 30 хв; протопласти в кінцевому підсумку утворювали осад, і супернатант видаляли. 5) Протопласти суспендували додаванням відповідної кількості розчину ММО, витримували на льоду до трансформації.
Примітка: Концентрацію протопластів слід визначити методом мікроскопії (х100). Кількість протопластів має становити від 2х10»/мл до 1х106/мл.
Зо 3. Трансформація протопластів пшениці 1) 15 мкг білків ТАГ ЕМ (білок ТАЇ -МІ 0-1. і білок ТАГ-МІ О-Е, змішані в рівних кількостях) або 20 мкг вектора Т-МІ О (контроль) вміщували в 2 мл центрифугальну пробірку. Із застосуванням піпетки додавали 200 мкл виділених протопластів, після чого перемішували легким постукуванням, і відстоювали протягом 3-5 хв. Потім додавали 250 мкл РЕС4000, і перемішували легким постукуванням. Трансформацію здійснювали в темряві протягом 30 хв. 2) Додавали 900 мкл МУУ5 (кімнатна температура), і перемішували перекиданням, центрифугували протягом З хв при 1009, і супернатант видаляли. 3) Додавали 1 мл МУУ5, і перемішували перекиданням, вміст обережно переносили на 6- лунковий планшет (із заздалегідь доданим 1 мл Му5), після чого культивували протягом ночі при температурі 2320. 4. Використання РСЕ/КЕ експериментів для аналізу мутагенезу ендогенного гена МІ о, що є результатом використання очищених білків ТА ЕМ
Через 48 год. після трансформації протопластів пшениці екстрагували геномну ДНК, яку використовували як матрицю для аналізу РСК/КЕ (полімеразна ланцюгова реакція/рестрикційний гідроліз) експериментами. Одночасно протопласти, трансформовані плазмідою Т-МІ О, або протопласти пшениці сорту Вобм/піе дикого типу використовували як контроль. Метод аналізу з РСБ/КЕ базується на Зпап, 0. еї аї.,, Карій ап ейсієепі депе тоаїйїсайоп іп гісе апа Вгаспуродішт ибзіпд ТАГЕМ»5. Моїесшціаг Ріапі (2013). Оскільки цільовий фрагмент ендогенного гена МГО пшениці містив послідовність розпізнавання рестрикційної ендонуклеази Амаї!, згадану рестрикційну ендонуклеазу Амаї! використовували в експерименті для проведення тесту РСК/НЕ. Праймерами, використаними в РСК-ампліфікації, були:
ТамгГо-г: 5-ТСАТССсТСТОССЯТОоСТОСТОаАаТсСА-З;
Тамі о-в: 5-таапТАТТССААлСОАСсаСсватотстатст-3.
Результати РСК/КЕ експериментів показали, що на цільовому сайті гена МО відбулись мутації. Смуги були відновлені і секвеновані. Результати секвенування показали, що на цільовому сайті гена МГ О відбулась інсерція/делеція (індел) (Фіг. ЗВ і фіг. 3).
ІМ. Сайт-спрямоване редагування гена МО введенням білків ТА ЕМ із застосуванням бомбардування частинками
Як правило, при трансформації експресійної плазміди в клітинах бомбардуванням бо частинками золотий порошок використовують як носій, який переносить ДНК-плазміду у клітини.
Проте для білків золотий порошок як носій є непридатним, оскільки білок важко зв'язати із золотим порошком. За цим винаходом для трансформації білків із бомбардуванням частинками як носій використовують кремнезем. 1. Завантаження білків у кремнезем
Як носій використовували кремнезем-Аи-М5М (розмір чарунок сита 10 нм). До 5 мл фосфатного буфера (РВ5), рн7,4, додавали 20 мг А!и-М5М для обробки ультразвуком, потім додавали 7 мг очищеного білка ТАЇ -МІ О-І. та білка ТАІ -МІ О-К. Суміш перемішували при 2226 протягом 24 год., центрифугували при 12000 об/хв. Супернатант видаляли. Осад суспендували фосфатним буфером. 2. Трансформація матеріалів-реципієнтів пшениці із застосуванням бомбардування частинками 1) Брали незрілий зародок пшениці сорту Вобм/пйе, і обробляли його протягом 4 год. у гіпертонічному середовищі. 2) Для бомбардування незрілого зародка пшениці, культивованого на етапі 1) у гіпертонічному середовищі, застосовували пристрій для бомбардування частинками. А!и-М5М, навантажений білками ТАГЕМ (5 мкл, 20 мкг/мл), завантажували на мембрану, і піддавали бомбардуванню; відстань для кожного бомбардування становила 6 см, тиск бомбардування становив 1100 фунтів/дюйм: (7,584 МПа), діаметр бомбардування становив 2 см. 3) Незрілий зародок пшениці, бомбардований на етапі 2), культивували протягом 16 год. у гіпертонічному середовищі. 4) Незрілий зародок пшениці, культивований на етапі 3) у гіпертонічному середовищі, у подальшому послідовно піддавали культивуванню протягом 14 днів для індукування утворення калюсної тканини, культивуванню протягом 28 днів для диференціювання і культивуванню протягом 14-28 днів для вкорінення для того, щоб одержати рослини пшениці. 5) З паростків пшениці, одержаних на етапі 4), екстрагували ДНК, і із застосуванням РСК/КЕ виявляли мутантів з нокаутованим (сайт-спрямованим шляхом) геном (стосовно конкретного методу випробувань, будь ласка, зверніться до етапу І). Як контроль використовували пшеницю сорту Вобж/пце дикого типу.
Результати виявлення декількох мутантів вказують на те, що на цільовому сайті гена МО
Зо пшениці відбулись мутації. Смуги були відновлені для секвенування. Результати секвенування показують, що на цільовому сайті гена МІ О відбулась інсерція/делеція (індел).
Вищенаведені результати показують, що сайт-спрямоване редагування цільового сайту може бути досягнуте введенням в пшеницю нуклеазного білка. Мутанти, одержані цим способом, не містять екзогенної ДНК, а введений білок буде зруйнований клітиною рослини.
Тому мутанти, одержані за цим способом, являють собою рослини, що не містять трансгену, які мають високу біобезпечність.
Приклад 4. Сайт-спрямоване редагування гена ТазА5К7 котрансформацією білка Саз59, експресованого і очищеного в прокаріотичній експресійній системі, та іп міго транскрибованої 5авВМА
І. Конструювання цільового фрагмента: мішень-С5
Мішень-С5: 5-СсССсОаССбасаСАССТАСОасСААС-3 (у гена ТасАЗК?7, як показано в номері депонування сСепрапк ЕОО95332, позиції 248-268).
ІІ. Експресія в прокаріотичній системи і очищення білка Са59 1. Ген Са59 (оптимізований для використання в кодоні рослинної клітини і доданий з Мі 5 на обох кінцях) вбудовували в прокаріотичний експресійний вектор рОЕХ-4Т, так що одержували рекомбінатний вектор з геном Са59 послідовності 5ЕО І МО: 9 (оптимізований для використання в кодоні рослинної клітини і доданий з МІ 5 на обох кінцях), вставлений між сайтами Ватні та 5реї! вектора роєЕХ-4Т. Рекомбінантний вектор перетворювали на Ес.соїї ВІ 21.
Позитивну колонію інокулювали в середовище І В, доповнене ампіциліном та хлорамфеніколом, і культивували при 372С протягом ночі. Після цього згадану культуру інокулювали в 5 мл свіжого середовища І В у співвідношенні 1: 100, культивували при 372С при 225 об/хв до 00600 20,5. 1 мл згаданої культури відбирали як негативний контроль (без індукції). Також одержували контролі порожнього вектора реЕХ-41 з індукцією або без індукції. До решти культури додавали
ІРТО (кінцева концентрація 1 мМ) для індукування експресії при 372С при 225 об/хв протягом 8 год. 2. Відбирали по 1 мл кожної з контрольної або індукованої культур, і центрифугували при 12000 об/хв протягом 10 хв для збору бактеріальних клітин, видаляючи супернатант. Клітини ресуспендували, додаванням 50 мкл буфера, призначеного для завантаження білка, і кип'ятили протягом 7 хв. Супернатант аналізували із застосуванням електрофорезу у поліаакриламідному 60 гелі у присутності 10 95 додецилсульфату натрію (10 95 505-РАСЕ). Молекулярна маса білка
Са59 становила приблизно 200 кДа. Амінокислотна послідовність білка Са59 показана послідовністю 5ЕО ІО МО: 10. 2. Очищення білка Са59
Бактеріальну культуру центрифугували при 42С протягом 10 хв для збору бактеріальних клітин. В утворений осад додавали 10 мл лізисного буфера (50 мМ Трис-НСЇІ, 2 мМ ЕОТА, 100
ММ Масі, 1 мг/мл лізоциму, рНеВ,5), і перемішували на льоду протягом 45 хв. Після обробки ультразвуком осад збирали центрифугуванням, промивали 4М розчином імідазолу. Осад, одержаний після подальшого центрифугування, розчиняли у 50 мМ фосфатному буфері (що містить 8М сечовини) при рн 7,4. (Фіг. 4А).
І. Тп міго транскрипція З9ДКМА цільового сайту 1. Цільовий сайт ТасА5кК7 вбудовували у вектор рТ7-д8МА.
С5 являє собою послідовність ДНК, що кодує РНК, яка може комплементарно зв'язуватись з мішенню-С5.
Синтезували такі одноланцюгові олігонуклеотиди з липкими кінцями (підкреслені):
Сг: 5-СТТатта,асСсатаааЙтасссоа(а-9";
С5А: 5-АААсСсСааваСАССТАСИасАА-З".
Дволанцюгову ДНК з липкими кінцями одержували із застосуванням процесу відпалу олігонуклеотидів, і вставляли між двома сайтами рестрикції ВБбБ5І в плазміду рГ7/-9сКМА з одержанням плазміди рГ7-деЕМА, яка містить сайт С5. Позитивну плазміду підтверджували секвенуванням. Рекомбінантна плазміда, яку одержали інсерцією фрагмента ДНК, як показано в 5Б-статасСатаа,аатасссбас-3, у прямому напрямку на сайті рестрикції ВБр5іІ плазміди рТ7- 9ЕМА, була позитивною, і її позначили як рТ7-дАМА-С5. 2. Іп міго транскрипція З9ДКМА, що містить цільовий сайт ТасАЗК7
З використанням промотора Т7 для ініціації транскрипції, 59ЕМА для гена Тасдо5кК7 транскрибували іп міго із застосуванням транскрипційного набору мРНК (Атріоп) в здЕеЕМА-
СА5БІА7-С5 (послідовність зЗЕО ІЮО МО: 11), і полі(А)-хвіст додавали до 3'-кінця для підвищення стабільності МРНК.
ЇМ. Редагування гена Тасд5К7 котрансформацією білка Са59 та іп міго транскрибованої 59АМА у протопласти пшениці
Зо 1. Процес одержання протопластів є ідентичним процесу Прикладу 3. 2. Трансформація протопластів 1) У 2 мл центрифугальну пробірку вміщували 15 мкг очищеного білка Са59 і 20 мкг ЗдЕМА-
САБНА7-С5. Додавали 200 мкл протопластів (приблизно 4х10» клітин), потім додавали 250 мкл свіжого розчину ПЕГ, і перемішували. Трансформацію проводили в темряві протягом 30 хв. 2) Додавали 900 мкл М/5 (кімнатна температура), і перемішували перевертанням, центрифугували при 1009 протягом З хв, і супернатант видаляли. 3) Додавали 1 мл МУ/5, і перемішували перевертанням, вміст обережно переносили на 6- лунковий планшет (із заздалегідь доданим 1 мл МУУ5), після чого культивували при 232С протягом ночі.
З. Використання РСК/КЕ (полімеразна ланцюгова реакція/рестрикційний гідроліз) експериментів для аналізу мутагенезу ендогенного гена ТасзА5К7 пшениці, що є результатом використання очищеного білка Са59 та іп міго транскрибованої гдаеЕМА
Через 48 год. після трансформації протопластів пшениці екстрагували геномну ДНК, яку використовували як матрицю для аналізу з РСЕК/КЕ (полімеразна ланцюгова реакція/рестрикційний гідроліз) експериментами. Протопласти пшениці сорту Ворм/пйе дикого типу одночасно використовували як контроль. Метод аналізу з РСЕ/КЕ базується на 5Впап, о. еї а!., Наріа апа ейісієпі депе тодіїсайоп іп гісе апа Вгаспуродіит ивіпд ТАГЕМ5. Моїесшаг Ріапі (2013). Оскільки цільовий сайт (позиції 248-268, номер депонування Сепрапк ЕШО95332) ендогенного гена ТасздА5БкК7/ пшениці (номер депонування Сепрапк ЕШО95332) містив послідовність розпізнавання (5'-605(303-3) рестрикційної ендонуклеази Месії, згадану рестрикційну ендонуклеазу Месії використовували в експерименті для проведення тесту РСЕ/КЕ.
Праймерами, використаними в РСК-ампліфікації, були:
Тапд5НА?-Е: 5-СссАсатадтааадаатаскса(в(а-9";
Тасад5н7-В: 5-стасаАа,асасСААТТСАСАТасСсСА-3".
Результати з РСК/КЕ експериментів показали, що на цільовому сайті гена Тасд5кК7 відбулись мутації. Смуги на фігурі були відновлені і секвеновані. Результати секвенування показали, що на цільовому сайті гена ТасАд5К7 відбулась інсерція/делеція (індел) (Фіг. 4В і Фіг. 4С).
М. Сайт-спрямоване редагування гена ТасАд5К7 пшениці трансформацією бомбардуванням 60 частинками очищеного білка Са59 та іп міго транскрибованої ЗдЕМА
1. Завантаження очищеного білка Савз9 та іп міго транскрибованої З5дФеЕМА у кремнезем
Як носій використовували кремнезем-Аи-М5М (розмір чарунок сита 10 нм). До 5 мл фосфатного буфера (РВ5), рН7,4, додавали 20 мг Аи-М5М для обробки ультразвуком. Потім додавали 7 мг очищеного білка Са59. Суміш перемішували при 222С протягом 24 год., центрифугували при 12000 об/хв. Супернатант видаляли. Осад суспендували фосфатним буфером. До 10 мкл білка Савз-носія А!ц-МеМ (10 мкг/мкл)у додавали 4 мкл іп мійго транскрибованої З9дЕМА (250 нг/мкл). Потім додавали 12,5 мкл 2,5 М розчину СасСігі 5 мклО1 М розчину спермідину, центрифугували при 5000 об/хв протягом 15 с, і супернатант видаляли. А!й-
М5М, що несе білок Саб59 і є покритим мРНК, двічі промивали 10095 етанолом, і ресуспендували у 5 мкл 100 95 етанолу, утворену суспензію позначали як Зх9ФІКМА-Саз9-Аи-М5М. 2. Трансформація матеріалів-реципієнтів пшениці із застосуванням бомбардування частинками 1) Брали незрілий зародок пшениці сорту Вобм/пйе, і обробляли його протягом 4 год. у гіпертонічному середовищі. 2) Для бомбардування незрілого зародка пшениці, культивованого на етапі 1) у гіпертонічному середовищі, застосовували пристрій для бомбардування частинками. 5 мкл 59АМА-Са59-Ац-М5М завантажували на мембрану, і піддавали бомбардуванню; відстань для кожного бомбардування становила б см, тиск бомбардування становив 1100 фунтів/"дюйм? (7,584 МПа), діаметр бомбардування становив 2 см. 3) Незрілий зародок пшениці, бомбардований на етапі 2), культивували протягом 16 год. з у гіпертонічному середовищі. 4) Незрілий зародок пшениці, культивований на етапі 3) у гіпертонічному середовищі, у подальшому послідовно піддавали культивуванню протягом 14 днів для індукування утворення калюсної тканини, культивуванню протягом 28 днів для диференціювання і культивуванню протягом 14-28 днів для вкорінення для того, щоб одержати рослини пшениці. 5) З паростків пшениці, одержаних на етапі 4), екстрагували ДНК, і із застосуванням РСЕ/КЕ виявляли мутантів з нокаутованим (сайт-спрямованим шляхом) геном (стосовно конкретного методу випробувань, будь ласка, зверніться до етапу ІМ). Як контроль використовували пшеницю сорту Вобж/пце дикого типу.
Зо Результати виявлення деяких мутантів вказують на те, що на цільовому сайті гена ТасА5К7 пшениці відбулись мутації. Смуги були відновлені для секвенування. Результати секвенування показують, що на цільовому сайті гена ТасА5К7 пшениці відбулась інсерція/делеція (індел).
Приклад 5. Сайт-спрямоване редагування ендогенного гена 7тіРК кукурудзи введенням очищеного білка Са59 та З59ЕМА в рослину за методом з використанням пилкових трубок
І. Конструювання цільового фрагмента: мішень-С2
Мішень-С2: 5-СсССбСсАаСТопАССАСасССасСсСОоАС-3 (позиції 393-415 гена 7тіІРК, як показано у номері депонування сепрапк АХ172635).
ІЇ. Прокаріотична експресія та очищення білка Са59
Аналогічно Прикладу 3, етап ІІ.
І. Тп міго транскрипція З9ДКМА цільового сайту 1. Цільовий сайт 27тіРК вбудовували у вектор рТ7-дВМА
С2 являє собою послідовність ДНК, яка кодує РНК, яка може комплементарно зв'язуватись із мішенню-С2.
Синтезували такі одноланцюгові олігонуклеотиди з липкими кінцями (підкреслені): бг-1г: 5-дасаатсавсасвсасатаатоаАОст-8"; б2-18: У-АААсАаастоаАССАСаССа,аССаАо-3.
Дволанцюгову ДНК з липкими кінцями одержували із застосуванням процесу відпалу олігонуклеотидів, і вставляли між двома сайтами рестрикції ВБбБ5І в плазміду рГ7/-9сКМА з одержанням плазміди рГ7-деЕМА, яка містить сайт С2. Позитивну плазміду підтверджували секвенуванням. Рекомбінантна плазміда, яку одержали інсерцією фрагмента ДНК, як показано в в-дасадатосаса,васстаатсцАсСсСтТ-3, у прямому напрямку на сайті рестрикції Врб5і плазміди рТ7-деМА, була позитивною, і її позначили як рТ7-дАМА-С2. 2. Іп міго транскрипція 5З9КМА, яка містить цільовий сайт 2тіРК
З використанням промотора Т7 для ініціації транскрипції, 59КМА для гена 2тіРк транскрибували іп міїго із застосуванням транскрипційного набору мРНК (Атрбіоп) в ЗдПЕМА-ІРО-
С2 (послідовність ЗЕО ІО МО: 12), ії полі(А)-хвіст додавали до 3'-кінця для підвищення стабільності МРНК.
ІМ. Сайт-спрямоване редагування ендогенного гена 27тіРК кукурудзи введенням очищеного білка Са59 та іп міго транскрибованої зхд9ЕМА за методом з використанням пилкових трубок бо Як матеріали-реципієнти в польових умовах вибирали сильні рослини кукурудзи інбредної лінії НІЇЇ. Рослини піддавали самозапиленню о 14:00-16:00 сонячного дня. Через 16-20 год. після запилення, а саме о 10:00-12:00 наступного дня, маточки реципієнтів вирізали. На розрізи наносили краплями суміш білка Са59 (10 мкг/мкл) та 5ФдКМА (250 нг/мкл). Приймочки вкривали мішечками до плодоношення. Одержані зерна кукурудзи вирощували, і геномну ДНК екстрагували, і використовували в РСК/КЕ експерименті як матрицю. Кукурудзу сорту НІЇ дикого типу використовували як контроль. Метод аналізу з РСЕ/КЕ базується на 5пап, о). еї аї.,
Варіа апа ейісіеєпі депе тодаіїісайоп іп гісе апа Вгаспуродіит ивіпуд ТАГЕМ5. Моїесшаг Ріапі (2013). Оскільки цільовий фрагмент (позиції 393-415, номер депонування сСепрапк АХ172635) ендогенного гена 2тіІРК кукурудзи (номер депонування Сепрапк АМм172635) містив послідовність розпізнавання (5-С4АССТО-3) рестрикційної ендонуклеази Засі, згадану рестрикційну ендонуклеазу Засі використовували в експерименті для проведення тесту
РСЕ/КЕ. Праймерами, використаними в РСЕК-ампліфікації, були: 2тіІРК-ТЕ: 2-ТсСаСАасасооСта,аСА,сАасСАд-З"; 2тіІРК-1А: 5-СсАСАССТасаАаАда,ааАспСАСаавАТОС-З".
Результати РСЕ/КЕ експериментів показали, що на цільовому сайті гена 2тіРК відбулись мутації. Нерозрізані смуги були відновлені і секвеновані. Результати секвенування показали, що на цільовому сайті гена 2тіРК відбулась інсерція/делеція (індел).
Приклад 6. Сайт-спрямоване редагування гена МІРМУ котрансформацією білка Сав59, експресованого і очищеного в прокаріотичній експресійній системі, та іп міго транскрибованої 5О9КМА у протопласти тютюну і регенерація в рослини
І. Конструювання цільового фрагмента: мішень-Р4А
Мішень-Р4: 5-ТаАТАССАССТА,СТАТАСАСОЇа-з"
ІІ. Процес прокаріотичної експресії та очищення білка Са59 є аналогічним описаному у
Прикладі 3.
І. Тп міго транскрипція З9ДКМА цільового сайту 1. Цільовий сайт МІРУМ вбудовували у вектор РНОМ401
Р4 являє собою послідовність ДНК, яка кодує РНК, яка може комплементарно зв'язуватись із мішенню-Ра.
Синтезували такі одноланцюгові олігонуклеотиди з липкими кінцями (підкреслені):
Зо РА-Е: У-АТТатТаАТАССАССТасасСТАТАСА-3";
РА-В: У-АААСТИТАТАСССАаСтТаатТАТСА-3.
Дволанцюгову ДНК з липкими кінцями одержували із застосуванням процесу відпалу олігонуклеотидів, і вставляли між двома сайтами рестрикції В5аі в плазміду рРНЗМ401 з одержанням плазміди рНеМ401, яка містить Рі. Позитивну плазміду підтверджували секвенуванням. Рекомбінантна плазміда, яку одержали інсерцією фрагмента ДНК, як показано в 5-АТТаТОАТАССАСаСТОассТАТАСА-3, у прямому напрямку на сайті рестрикції Вза! плазміди рноімМао1, була позитивною, і її позначили як рНнОМ401-РА. 2. Іп міго транскрипція 5З9КМА, яка містить цільовий сайт МТРУУ
З використанням промотора Т7 для ініціації транскрипції, 59КЕМА для гена МТРУУ (послідовності ЗЕО ІЮ МО: 13, 14, 15) транскрибували іп міїго із застосуванням транскрипційного набору мРНК (Атбіоп) в здеЕМА-РУХ-РА (послідовність ЗЕО ІЮ МО: 16).
ЇМ. Редагування гена МІРУМ котрансформацією білка Са59 та іп міго транскрибованої здаеЕМА у протопласти тютюну 1. Одержання матеріалів
Використовували тютюн сорту Нопдпша Ваїіпучап. Насіння обробляли 20 95 розчином натрію гіпохлориту протягом 20 хв, і 5 разів промивали стерильною водою. Після цього насіння культивували на середовищі 1/2 М5 при 252С з освітленням протягом 16 год. 2. Виділення протопластів 1) Відбирали б листків ЗО-денних рослин тютюну, і за стерильних умов розрізали їх на сегменти величиною приблизно 1 см. Ці сегменти вміщували в культуральний планшет, який містить 15 мл ензимолітичного розчину. Планшет герметизували, і витримували в темряві при 252С протягом ночі (найбільша перевага віддається проміжку часу, який становить 12 год.). 2) Після реакції ензимолізу додавали відповідну кількість розчину М/5. Планшет обережно струшували для того, щоб вивільнити протопласти. Потім суспензію протопластів фільтрували через 100 мкм і 40 мкм стерильні фільтри, центрифугували при 709 протягом 5 хв, і супернатант видаляли. 3) Протопласти ресуспендували додаванням 5 мл 22 95 розчину сахарози. Потім додавали 2 мл розчину М/5, і центрифугували при 709 протягом 5 хв. Суспендовані протопласти знаходилися на поверхні розділу. бо 4) Протопласти знімали з поверхні розділу. Додавали 5 мл розчину МУ5, і перемішували з подальшим центрифугуванням при 709 протягом 5 хв. 5) Супернатант видаляли. Для ресуспендування протопластів додавали 1 мл трансформаційного розчину ММО. Вихід протопластів визначали із застосуванням мікроскопа. 3. Трансформація та регенерація протопластів 1) У 14 мл центрифугальну пробірку вміщували 20 мкг очищеного білка Са59 і 20 мкг теМА-
РМУ-Р4. Додавали 300 мкл протопластів (приблизно 5х105 клітин). Потім додавали 300 мкл свіжого розчину ПЕГ, перемішували, і витримували в темряві протягом 20 хв. 2) Додавали 10 мл УУ5, перемішували, центрифугували при 709 протягом З хв, і супернатант видаляли; цей етап повторювали. 3) Додавали 1 мл середовища КЗ:Н, яке містило 0,6 95 агарози 5еа Ріадце " (інкубованого на водяній бані (40-45 "С) перед використанням), та перемішували. Суміш переносили на стерильний 30 мм культуральний планшет. 4) Після затвердіння середовища планшет витримували в темряві при 242С протягом 24 год., і знову культивували у темряві протягом 6 діб до першого поділу клітин. 5) Агарозний гель переносили на 90 мм культуральний планшет, і додавали відповідну кількість рідкого середовища А. Культивування продовжували в темряві при температурі 24260. 6) Через 3-4 тижні в чашці з'являвся видимий калюс. Після 5-6б-тижневого культивування діаметр калюса досягав 8-10 мм. 7) Калюси переносили на диференціювальне середовище, і культивували протягом 1-2 тижнів до утворення на поверхні адвентивних бруньок. 8) 3-4 см адвентивні бруньки зрізали, і переносили на укорінювальне середовище для індукування утворення коренів до одержання інтактних рослин. 9) Проростки пересаджували в грунт після досягнення корінням певної довжини.
ДНК трансгенного тютюну екстрагували, і використовували як матрицю для аналізу з
РСРЕУКЕ (полімеразна ланцюгова реакція/рестрикційний гідроліз) експериментами. Одночасно використовували ДНК тютюну дикого типу як контроль. Метод аналізу з РСЕ/КЕ базується на зпап, О. єї аї., Варіа апа ейісіеєпі депе тоаійісайоп іп гісе апа Вгаспуродіит ивіпа ТАГЕМВ5.
Моїесшіаг Ріапі (2013). Оскільки цільовий фрагмент ендогенного гена МІРМУ тютюну містив послідовність розпізнавання (5-САССТ(О-3) рестрикційної ендонуклеази РуціІ, згадану
Зо рестрикційну ендонуклеазу Рмші! використовували в тесті з РСК/КЕ. Праймерами, використаними в РСВ-ампліфікації, були:
МЕРММУ-Е: 5-ТаОСАТТАСАТОИ ТТ ТТ САААТОаС-3";
МЕРМУ-В: 5-САТ ТО ТІ ТаОСсСОасАСО,сАСАДА-З.
Результати з РСЕ/КЕ експериментів показали, що в результаті котрансформації білка Са59 та іп міго транскрибованої З9ОЕМА у протопласти тютюну на цільовому сайті гена МРУУ відбулися мутації. Нерозрізані смуги були відновлені і секвеновані. Результати секвенування показали, що на цільовому сайті гена МІЕРУМУ відбулась інсерція/делеція (індел) (Фіг. 5А і фіг. 5В).
Крім того, регенеровані трансгенні рослини тютюну також демонстрували мутацію на цільовому сайті гена МІРМУ. Результати секвенування показали, що на цільовому сайті гена МШМРУУ відбулась інсерція/делеція (індел) (Фіг. 5С).
Розчини для виділення та культивування протопластів тютюну наведені в Таблицях 6-10.
Таблиця 6 11111111 | 1 Доданакількість | Кінцеваконцентрація. З:
Целюлазав!0 //-/-://///Ї7777777777171С170611111111111Ї111111стеовсСсСС при 70004 протягом 10 хв; фільтрують через 0,22 мкм фільтр.
Таблиця 7 11111111 | Доданакільксть | Кінцеваконцентрація. З:
Доливають до 500 мл двічі дистильованою водою, рН доводять до 5,8 додаванням КОН,
Таблиця 8 11111111 | Доданакільксть | Кінцеваконцентрація. З: автоклавують.
Таблиця 9 11111111. | Доданакільксть | Кінцеваконцентрація. З:
Сагїмов)аїд/////С1СЇ111111111111111Г111111омсИЙИЙ2 автоклавують.
Таблиця 10
Концентрований розчин для виділення та культивування протопластів тютюну мМнаМоз 7 Ї777717717171717171717Ї171117401 17111301 7125 | 825 (мнааяОї 7 ЇЇ 70 ЇЇ 0 1 25 | 0 ЇЇ 0
КНРО 7777777 71171011 136 | 17 | 0 | 17 манггої 7 Ї7770117 11110 1 15 | 0 1 щж0 (мнЯесукцинат-/:/ | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 банРох// ЇЇ 70 Її 0 1 0 1 5 ЇЇ 0 111110 |лоо |7лоо | лоб | лоо | ло
Ю-сорбії 7 Ї777170117 17111011 1455 | 20 | 0
Ю-мант// Ї7711701 11110 | 455 | 20 | 0
Гормони (мг/л) (кінцева концентрація) 71240 110 | 15 | 5 | 15 | 0
Кнетин///////// ЇЇ 7770 Її 0 ЇЇ 0 ЇЇ 0 11 02
Продовження таблиці 10 (Нікотиновакислота | 0 2 | 05 | 05 | 05 | 05
Інші органічні речовини (мг/л) (кінцева концентрація) -сглутамно 777010 ЇЇ 0 1 877 | 0 саспарагніо///////Ї77717077 17711010 | 266 | 0 (Казеїнутідролзат | 400 | 400 | 40 | 0 | 0

Claims (6)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб здійснення сайт-спрямованої модифікації цільового фрагмента гена-мішені в рослині, який включає такі етапи: введення неуспадковуваного матеріалу в тканину або частину відповідної рослини методом бомбардування частинками, при цьому згаданий неуспадковуваний матеріал являє собою нуклеазу системи коротких паліндромних повторів, регулярно розміщених групами/СкКІЗРЕ асоційованих білків, специфічну для згаданого цільового фрагмента, в результаті чого цей цільовий фрагмент розщеплюється згаданою нуклеазою і сайт-спрямована модифікація цільового фрагмента досягається через репарацію ДНК в рослині; при цьому згадана тканина являє собою калюс, незрілий зародок або зрілий зародок; або згадана частина рослини являє собою лист, верхівку пагона, суцвіття або пилкову трубку.
2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що згадана нуклеаза являє собою нуклеазу СВІБРА/Саз9.
3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що неуспадковуваний матеріал складається з білка Саз9 і РНК-гіду; при цьому згадана РНК-гід являє собою РНК з паліндромною структурою, яка утворюється частковим паруванням основ між сгеЕМА та їгастеМА, при цьому згадана сгеЕМА містить фрагмент РНК, здатний до комплементарного зв'язування з цільовим фрагментом.
4. Спосіб за будь-яким із пп. 1-3, який відрізняється тим, що згадана тканина являє собою будь-яку тканину для введення неуспадковуваного матеріалу і регенерування в інтактну рослину через культуру тканини; або згадана частина рослини являє собою будь-яку частину інтактної рослини для введення неуспадковуваного матеріалу.
5. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, який відрізняється тим, що сайт-спрямована модифікація являє собою інсерцію, делецію та/або заміну нуклеотиду в цільовому фрагменті.
6. Спосіб одержання мутантної рослини, яка не містить трансгену, який включає такі етапи: проведення сайт-спрямованої модифікації цільового фрагмента гена-мішені у відповідній рослині за способом за будь-яким з пп. 1-5, з одержанням таким чином рослини, в якій функції Зо гена-мішені є втраченими або зміненими, і геном якої не містить інтегрованого екзогенного гена.
ка АЖ В ШИМИ и п шо шко ші Як б к- молоко вк ук нок вместе а ірупа В Що ТОЛЯ ни С їванаеві сАесукВНУ АТЕТОКАВМІВ ТОНИ МАКСА МУК ТОМИ ШАССВУМОКОТА ТКУ ж-ї ДА ЄдопУопесатУР.
ТАОМИВ «Рв, ПАЛИТИ ТММ в.
ВХ СВОСВТСОЗКОТА хо ТВО «дж.
ОДНУ КАТАТИ КІ КАНА.
КР вв, ЩІ ОЄАЧО засн х юки ДОМІ -13 вав.
ПАПСАДЖОЄ НАЕК АЛЛО із.
ТАЗ ВІ МАСЛОВ ЕУ ГУ ЯЗ яв, Її ОКОВЦАКРЦОМОТАТР РОС зі пи.
Т-8 ДІ САСОДТУ, ххх хо ВАВ «ви САМОВИКЕНУТА є ОВО -В Ви.
МА СКАЦОДЖУО о кох хх КАК «ня.
МК ПДАТУ а АН і в, КОП ЖОТАТИЕ ВІ.
МАЄ «В. те Ві СЛОВА СТАТТ СО КАВИ іа; САТ НННУТ АЮ» я я ХВОЯ -З в.
І Сугхллухи тека ках ЙО «І в.
ПОЕВАТИОВОКАТ» «з ВКДАКИ «З, Те ВУ КАВА ОТАТУ КМУ Я в.
МТ САВКА ТАСВИКИ ЕВ, СВО ТИНИ сет етикох -Я ня же ВІ КВООВАЖО лані чужитоти «Чтв.
ПАСА КСВ А ЖІ дах.
ПІ ОСАОУА ВНИХ АКОТ МІ ЖЕ САССВАЛЕЄНУЗОК з котел «Ів.
ФІГ І
А Ж В вд зх К Ф с х ж
Є. КУ амо шк ШК Є ж ; я учик ; Кк КК НИ МК М о шНиМА ск єв як ФУ У Ей ооо ок оос восковою м А Ак Бе у ДО КОН Ох і і й пок вв ИН в Ки Ве ВО
ПИ. ТИЙ и ит КОН и Кук КОЖ я КОЖ пр ва с о Пн пот Я 0 м ша Я ЯК ПО с ши ПВ КВ МОЯ ПЕКИ КК ОК АК І, Кто ен и ПО НН є і і і Ши а я в Кн Кн 5 2 ТВАМАТ-ОБВАЮНЯВ ТОСТОЦАТОСТ ВОДОЮ оуентяк сх оса ця АТО ОА вс ВОСТОПАТССЕ ТИВ ВОК ЦНС АТО КТС сн ТОСТОСАТОСТТТИАВТВЕ ВОВК ЦВК ТТ СААВАСА ек ТЕСТОМ АВТАСК ЗОВ КОК І СаАТКСТАСАЛАВЯ ЦІ ЖИСТНМАТОМ ТТ ТОАЮІТВСВКІОсВц БОКОВА АЛ ОСА ІН ТОСТОКАТУТТОАСІАОКТ пово АСВАЛАВОСА ЗА
ФІГ. 2 У ек МЕ А ех - в м ії з 44 а їй ей В о ВХ в КУ З16 Дудії ШЕ. «В як я УМ Де др, мекв ЕВ. хеелоковеєткикоксв ш- о ю(Д(Д(Ю КА яко й : ЯНВ оон понвкокоюсококненннннй? ЕХ кЛе ТЕ. ще Нім, ки е на У ХМ Ше: нн НН. нь: Мити ит ді п -: МОМ ЧНО СК ВІКОВА ЗЛ зако су он и МИ Ж КІ ес що: КОКСТУЄСХВО КН апа» «жест КНЕСАНККСВ й ЗКЖДВ се и мо склих М: ЖЕН В Кун хх МКК НВ АХ нм Й і НН в і и Й кри нан ни А нс Я: ДЕКО И КООКаМЮ сс сх ПАКОМСА ЯМ свв р зи Мбх ТОБТО В КО ОН о Коко ВІК ВВ
ФІГ. 3
А а мМм' З 4 жк 7 бу А хи и р Не ЗВ СУК Зорвввовв: новні ПЕПИКИЕК о ит ун падків КИ а ни км Повна и ИИИИ ис Коок ох вок осені п шо о ее и мене чен - шк ЗИ ит и КК КЛИН ТИ М ОМ ПИМИИДИИМ ПИННН й ПИ: ми и и ННЯ ід АБН Є МЕ одн в цк МЕ ке в о М В в НИ ин а а в он ин сИПМУНС Ти В ТИКИ ОВТТОКЯ кі ИЙ Ли КП АН ВИХ и ти ИН рожі ев ваии и в И ИКЕ Ежу к ки чя ЖОВ, нити . пики При ТИ С КУМЕ ТУ Оп ЛТИеМИЯ ту МІ ВН ИН я нн нен НН и УКУСІ КИМ БУМ ОВ а и НО НН НН ан НЕК ЕНН УА в ВЕ С с У ОМ СБ на на вве Ме нки зе і ВД оз Не и Оу Ж УА Мотя иЙ т тн ХП КК єму КК ЕЕ ОВ Її ся І
А вМвВУК ре КОрутАссАо т тАтАсАСоВ ЧЕВОЗЕПЛЬНИЙ РОЗШЩЕВНЯ ВВ КУЦЇ ружвне Я. рю то: фе шу БІДА ВАЛРСТСАТВИСДАНСТ ВАЛОВА АХ АТУЖК МУ ВІТА ДЕД лю кт тетттюю м жетжю межючю ем мн ОВТ ВО АТАК ДО АОТАМНУАЛАТСТОА АССВОС У ни СТА МУТАТОСТ В ОВТАКИК ОВ РОЗПИУЦТНИЙ РУКА й ; й о ву яд І че я І г Гоися живе ВВ 7 ЕЕ як - ОУН о вка х МКК КК ВН ЕЕ дикий ТВ: СУКА ВААС ТАТАССТВМ У КАКАО ВТО ТОНАХ МтуйеЯі ФАК осонні у петлю де вок ток ік ВЕУ ТО АТАК І Муфта нй: ТАБАКОВ АВНІСТВАХАЦИД не ВМТ АНОДА ТКУ В Її ТАБУ АААКС ТАКА т хо КУ А КОВО СТАТ ФІГ 5
UAA201709693A 2015-03-16 2016-03-14 Спосіб здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинних геномів із застосуванням неуспадковуваних матеріалів UA125246C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510114017 2015-03-16
PCT/CN2016/076244 WO2016155482A1 (zh) 2015-03-16 2016-03-14 一种利用非遗传物质对植物基因组进行定点改造的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA125246C2 true UA125246C2 (uk) 2022-02-09

Family

ID=57005578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201709693A UA125246C2 (uk) 2015-03-16 2016-03-14 Спосіб здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинних геномів із застосуванням неуспадковуваних матеріалів

Country Status (10)

Country Link
US (1) US12043835B2 (uk)
EP (1) EP3279321A4 (uk)
JP (3) JP2018508221A (uk)
KR (1) KR102194612B1 (uk)
CN (1) CN105985943B (uk)
AR (1) AR103926A1 (uk)
AU (1) AU2016239037B2 (uk)
EA (1) EA038896B1 (uk)
UA (1) UA125246C2 (uk)
WO (1) WO2016155482A1 (uk)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
BR112018008134A2 (pt) 2015-10-20 2018-11-06 Pioneer Hi Bred Int método para restaurar a função de um produto gênico não funcional no genoma de uma célula, método para editar uma sequência nucleotídica no genoma de uma célula, planta ou planta de progênie, método para editar uma sequência nucleotídica no genoma de uma célula sem o uso de um molde polinucleotídico de modificação e método para entregar um complexo de rna guia/endonuclease cas numa célula
IL310721B2 (en) 2015-10-23 2025-11-01 Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
CN110214183A (zh) 2016-08-03 2019-09-06 哈佛大学的校长及成员们 腺苷核碱基编辑器及其用途
WO2018031683A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
KR102622411B1 (ko) 2016-10-14 2024-01-10 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
US20190264218A1 (en) 2016-11-04 2019-08-29 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Novel Plant Cells, Plants, and Seeds
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
JP6928416B2 (ja) 2016-12-27 2021-09-01 株式会社豊田中央研究所 Ｄｎａ二本鎖切断活性を有するタンパク質を用いた真核生物の育種方法
US12390514B2 (en) 2017-03-09 2025-08-19 President And Fellows Of Harvard College Cancer vaccine
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
KR20240116572A (ko) 2017-03-23 2024-07-29 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제
CN117051035A (zh) * 2017-05-05 2023-11-14 苏州齐禾生科生物科技有限公司 不使用转基因标记序列分离细胞的方法
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN107338309A (zh) * 2017-07-28 2017-11-10 华智水稻生物技术有限公司 一种水稻常用栽培品种香味基因badh2的SNP分子标记及应用
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
EP3676376B1 (en) 2017-08-30 2025-01-15 President and Fellows of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
KR20250107288A (ko) 2017-10-16 2025-07-11 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 아데노신 염기 편집제의 용도
US12406749B2 (en) 2017-12-15 2025-09-02 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
KR20210045360A (ko) 2018-05-16 2021-04-26 신테고 코포레이션 가이드 rna 설계 및 사용을 위한 방법 및 시스템
US12157760B2 (en) 2018-05-23 2024-12-03 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
GB201809273D0 (en) 2018-06-06 2018-07-25 Vib Vzw Novel mutant plant cinnamoyl-coa reductase proteins
US12522807B2 (en) 2018-07-09 2026-01-13 The Broad Institute, Inc. RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof
CN109371056B (zh) * 2018-09-16 2022-04-08 云南省烟草农业科学研究院 一种选育对辣椒脉斑驳病毒抗性的烟草植物的方法
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
GB201820109D0 (en) 2018-12-11 2019-01-23 Vib Vzw Plants with a lignin trait and udp-glycosyltransferase mutation
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
WO2020191233A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
JP7334898B2 (ja) * 2019-04-12 2023-08-29 国立大学法人東海国立大学機構 花粉への物質導入方法
US12473543B2 (en) 2019-04-17 2025-11-18 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
IL297761A (en) 2020-05-08 2022-12-01 Broad Inst Inc Methods and compositions for simultaneously editing two helices of a designated double-helix nucleotide sequence
CN113846117B (zh) * 2020-06-09 2025-01-28 山东舜丰生物科技有限公司 一种增强植物香味的方法
JP7345760B2 (ja) * 2020-10-07 2023-09-19 国立大学法人東海国立大学機構 花粉への物質導入方法
US20260078361A1 (en) * 2022-09-09 2026-03-19 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Dna polymerase-based genome editing system and method

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1288073C (en) 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
WO1995006740A2 (de) * 1993-09-03 1995-03-09 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Mittelkettenspezifische thioesterasen
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US6583335B1 (en) 1997-04-18 2003-06-24 Texas Tech University Direct transformation of higher plants through pollen tube pathway
US6518487B1 (en) 1998-09-23 2003-02-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cyclin D polynucleotides, polypeptides and uses thereof
US6846970B1 (en) * 1999-07-19 2005-01-25 Plant Bioscience Limited Transformation method and transgenic plants produced thereby
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
US20030135891A1 (en) 2001-12-04 2003-07-17 The Texas A&M University System Method of transforming intact plants
JP2011120478A (ja) 2008-03-31 2011-06-23 Japan Tobacco Inc アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法
JP5491039B2 (ja) * 2009-02-13 2014-05-14 国立大学法人岩手大学 リンゴ小球形潜在ウイルスベクターを用いたバラ科果樹の開花促進方法
TWI576432B (zh) 2009-04-07 2017-04-01 陶氏農業科學公司 序列特異性核酸酶之奈米粒子媒介式遞送技術
WO2011072246A2 (en) * 2009-12-10 2011-06-16 Regents Of The University Of Minnesota Tal effector-mediated dna modification
MX336846B (es) * 2010-01-22 2016-02-03 Sangamo Biosciences Inc Alteracion genomica dirigida.
CA2831144A1 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for producing a complex transgenic trait locus
US20130145488A1 (en) * 2011-12-06 2013-06-06 Iowa State University Research Foundation, Inc. Mesoporous silica nanoparticles suitable for co-delivery
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
AU2013266968B2 (en) 2012-05-25 2017-06-29 Emmanuelle CHARPENTIER Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription
AU2013293270B2 (en) 2012-07-25 2018-08-16 Massachusetts Institute Of Technology Inducible DNA binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
UA119135C2 (uk) * 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
US20140096284A1 (en) * 2012-10-01 2014-04-03 Iowa State University Research Foundation, Inc. Method for the delivery of molecules lyophilized onto microparticles to plant tissues
AU2013335451C1 (en) * 2012-10-23 2024-07-04 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target DNA comprising a guide RNA specific for the target DNA and Cas protein-encoding nucleic acid or Cas protein, and use thereof
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
CN103898099B (zh) * 2012-12-25 2017-08-25 袁晶 一种实现基因组定点修饰的蛋白表达载体的方法
CN103898155B (zh) * 2012-12-25 2016-06-15 中国科学院遗传与发育生物学研究所 利用基因枪获得转基因小麦的方法及其专用培养基
ES2953523T3 (es) * 2012-12-27 2023-11-14 Keygene Nv Método para inducir una translocación dirigida en una planta
WO2014144155A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota Engineering plant genomes using crispr/cas systems
CA2908403A1 (en) * 2013-04-02 2014-10-09 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in eukaryotes
WO2014194190A1 (en) 2013-05-30 2014-12-04 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing
JP2016521561A (ja) * 2013-06-14 2016-07-25 セレクティス 植物における非トランスジェニックのゲノム編集のための方法
CN103382468B (zh) * 2013-07-04 2015-04-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种水稻基因组定点改造方法
CN103343120B (zh) * 2013-07-04 2015-03-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
CN104293828B (zh) 2013-07-16 2017-07-21 中国科学院上海生命科学研究院 植物基因组定点修饰方法
CN120574876A (zh) 2013-08-22 2025-09-02 纳幕尔杜邦公司 使用向导rna/cas内切核酸酶系统的植物基因组修饰及其使用方法
CN103667338B (zh) 2013-11-28 2016-01-27 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种玉米基因组定点改造方法
CN103952405B (zh) * 2014-05-13 2016-02-10 扬州大学 一种山羊mstn基因定点修饰系统及其应用
CN104212778A (zh) * 2014-06-26 2014-12-17 绍兴市人民医院 基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统及应用
EP4194557A1 (en) 2014-08-06 2023-06-14 Institute for Basic Science Genome editing using campylobacter jejuni crispr/cas system-derived rgen
DE102015004187A1 (de) 2015-04-02 2016-10-06 Kws Saat Se Männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum

Also Published As

Publication number Publication date
JP2023018066A (ja) 2023-02-07
US12043835B2 (en) 2024-07-23
US20180163232A1 (en) 2018-06-14
JP2024160392A (ja) 2024-11-13
WO2016155482A1 (zh) 2016-10-06
CA2979290A1 (en) 2016-10-06
KR102194612B1 (ko) 2020-12-23
JP2018508221A (ja) 2018-03-29
AU2016239037B2 (en) 2022-04-21
EA038896B1 (ru) 2021-11-03
EP3279321A1 (en) 2018-02-07
KR20170126502A (ko) 2017-11-17
EP3279321A4 (en) 2018-10-31
AR103926A1 (es) 2017-06-14
CN105985943A (zh) 2016-10-05
EA201792036A1 (ru) 2018-06-29
AU2016239037A1 (en) 2017-08-10
BR112017016431A2 (pt) 2018-04-10
CN105985943B (zh) 2021-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA125246C2 (uk) Спосіб здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинних геномів із застосуванням неуспадковуваних матеріалів
US20220411810A1 (en) Method for conducting site-specific modification on entire plant via gene transient expression
CN101182523B (zh) 植物花药特异性启动子及其应用
CN113412333A (zh) 用于克隆植物生产的方法
CN102724865A (zh) 修饰的编码植物中生长和/或发育相关蛋白的转基因
US20260098273A1 (en) Immature inflorescence meristem editing
AU2007237251B2 (en) Method to produce sterile male flowers and partenocarpic fruits by genetic silencing, associated sequences and vectors containing said sequences
ES2750530T3 (es) Medios y procedimientos para producir rendimiento en plantas
KR20140056294A (ko) 웅성 감수분열 모세포의 세포내 프로세스에 체계적으로 영향을 가하는 방법
CN103060369B (zh) 杂交作物转基因安全控制的方法和实现该方法的基因删除系统
KR102453800B1 (ko) CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 SlMS10 유전자 녹아웃 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 웅성 불임 토마토 식물체
CN102286486B (zh) 花粉特异性启动子的分离、鉴定及其应用
Tehseen et al. Development of male sterility by silencing Bcp1 gene of Arabidopsis through RNA interference
Esmaeili et al. Genetic engineering in cotton: Techniques and practices
US20160281102A1 (en) DNA Having Anther-Specific Promoter Activity, and Utilization Thereof
CA2979290C (en) A method for making site-directed modification to plant genomes by using non-inheritable materials
WO2024065009A1 (en) Methods of plant manipulation
Elorriaga Functional Characterization and Classification of Genes Essential to Flower Induction, Flower Development, and Seed Development in Populus and Eucalyptus
JP2007060979A (ja) システインプロテアーゼ遺伝子を導入した葯の裂開を抑制する植物
HK40034402A (en) Systems and methods for cellular reprogramming of a plant cell
HK1195218A (en) Method for systemically influencing processes in the male meiocyte
BR112017016431B1 (pt) Método para conduzir modificação sítio-direcionada a fragmento alvo de gene alvo em planta e método para fabricar planta mutante livre de transgene