UA125478C2

UA125478C2 - Трансгенна рослина тютюну

Info

Publication number: UA125478C2
Application number: UAA201802119A
Authority: UA
Inventors: Люсьєн Бове; Люсьен БОВЕ
Original assignee: Філіп Морріс Продактс С.А.; Филип Моррис Продактс С.А.
Priority date: 2015-09-09
Filing date: 2016-09-06
Publication date: 2022-03-30
Also published as: WO2017042162A1; RU2018112407A3; KR102207550B1; EP3346826B8; EP3346826C0; ZA201708411B; RU2742725C2; RU2018112407A; JP2018527934A; ES3014919T3; AU2016318423A1; AU2016318423B2; PL3346826T3; CN107920489A; CA2998286C; EP3346826A1; KR20180051530A; JP6810134B2; NZ738897A; AR105968A1

Abstract

Винахід стосується трансгенної рослини тютюну або її частини, яка характеризується зниженою експресією або активністю аспарагінсинтетази, причому експресія або активність аспарагінсинтетази знижена у порівнянні з контрольною рослиною, при цьому зазначена знижена експресія або активність аспарагінсинтетази забезпечує зниження рівня аспарагіну в обробленому або висушеному листі, що одержане із даної трансгенної рослини або частини рослини, щонайменше на 17 % у порівнянні з рівнем аспарагіну в обробленому або висушеному листі, що одержане з контрольної рослини, і зазначена знижена експресія або активність аспарагінсинтетази забезпечує зниження рівня акриламіду в аерозолі, який утворюється після нагрівання або згорання обробленого або висушеного листя, що одержане із даної трансгенної рослини або частини рослини, щонайменше на 20 % у порівнянні з обробленим або висушеним листям, що одержане з контрольної рослини, і рівень нікотину в обробленому або висушеному листі із даної трансгенної рослини або частини рослини знаходиться в межах +/-20 % відносно рівня нікотину в обробленому або висушеному листі контрольної рослини. Також винахід стосується рослинного матеріалу, способу одержання рослинного матеріалу зі зниженими рівнями аспарагіну та зниженими рівнями акриламіду в аерозолі, тютюнового продукту або курильного виробу.

Description

активність аспарагінсинтетази забезпечує зниження рівня акриламіду в аерозолі, який утворюється після нагрівання або згорання обробленого або висушеного листя, що одержане із даної трансгенної рослини або частини рослини, щонайменше на 20 95 у порівнянні з обробленим або висушеним листям, що одержане з контрольної рослини, і рівень нікотину в обробленому або висушеному листі із даної трансгенної рослини або частини рослини знаходиться в межах -/-20 95 відносно рівня нікотину в обробленому або висушеному листі контрольної рослини.

Також винахід стосується рослинного матеріалу, способу одержання рослинного матеріалу зі зниженими рівнями аспарагіну та зниженими рівнями акриламіду в аерозолі, тютюнового продукту або курильного виробу.

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ

У даному винаході розкриті полінуклеотидні послідовності генів, що кодують аспарагін синтетазу із Місоїйапа їабасит, та варіанти, гомологи і фрагменти зазначених послідовностей.

Також розкриті поліпептидні послідовності, що кодуються зазначеними послідовностями, та варіанти, гомологи і фрагменти даних послідовностей. Також розкрита модифікація експресії одного або декількох генів або активності білка або білків, що кодуються зазначеними генами, для модулювання рівнів аспарагіну у рослині.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Акриламід являє собою хімічну сполуку формули СзНьМО (назва згідно з ІЮПАК,

Міжнародному союзу теоретичної та прикладної хімії, проп-2-енамід), і потенційна токсичність даної сполуки викликає стурбованість. Джерелом акриламіду в аерозолі курильних виробів, що містять тютюн, може бути амінокислота аспарагін, яка може бути присутньою у тютюновому матеріалі, що використовується для виробництва зазначених курильних виробів. Внаслідок цього може бути бажано знизити рівні певних амінокислот, таких як аспарагін, у рослинах, зокрема, у тих рослинах, які використовують для виробництва тютюну.

У публікації 052013/0068240 описані генетично модифіковані рослини тютюну та тютюнові продукти, в яких знижений рівень щонайменше однієї амінокислоти, у результаті чого після нагрівання та/(або горіння у тютюні утворюються знижені рівні сполуки, що утворюється з щонайменше однієї амінокислоти, у порівнянні з немодифікованою батьківською рослиною тютюну. Був описаний мутагенез насіння із застосуванням етилметансульфонату (ЕМС) для одержання мутантних ліній тютюну зі зниженими рівнями аспарагіну та зниженими рівнями акриламіду у сигаретному диму. Різні мутанти ЕМС описані у публікації О52013/0068240. У листі верхньої частини стебла після парової обробки (томління) три мутанти ЕМС, а саме ЕС Ор 1ОМН-5, ЕС Ор ТОМН-18 ї ЕС-Ор 1ОМН-23, продемонстрували: (ії) зниження рівня аспарагіну на 71 ув, ЗО 9о і 62 9о, відповідно; (ії) зниження рівня акриламіду у тютюновому диму на 47 95, 42 9б і 44 95, відповідно; і (ії) зниження на 3895, підвищення на 111 95 і зниження на 19 95 рівня нікотину у тютюні верхньої частини стебла після парової обробки, відповідно. Таким чином, найбільше зниження рівня аспарагіну й акриламіду, що становить 71 95 і 47 95, відповідно, було досягнуто у випадку мутанта ЕС Ор 10МН-5. Однак у даному мутанті спостерігалося зниження

Зо рівнів нікотину на 38 95 у порівнянні з контролем. У листях середньої частини стеблини після парової обробки три мутанта ЕМС, а саме ЕС міатлтоМмн-5, ЕС Ор ТОМН-18 ї ЕС-Ор Т1ОМН-23, продемонстрували: () зниження на 695, підвищення на 53195 і зниження на 2995 рівня аспарагіну, відповідно; (ії) зниження на 19 95, підвищення на 140 95 і підвищення на 200 95 рівня акриламіду у тютюновому диму, відповідно; і (ії) зниження на 36 95, підвищення на 113 95 і зниження на 19 95 рівня нікотину у тютюні середньої частини стебла після парової обробки, відповідно. Таким чином, найбільше зниження рівня акриламіду, що становить 19 95, було досягнуто у випадку ЕС Ор 10МН-5, однак рівень аспарагіну був знижений лише на 6 95, і рівень нікотину був знижений на 36 95.

Найбільше зниження рівня аспарагіну й акриламіду, що становить 71 95 і 47 95, відповідно, було виявлено у листі верхньої частини стебла ЕС Ор ТОМН-5 після парової обробки. Однак у даному мутанті спостерігалося зниження рівнів нікотину на 38 95 у порівнянні з контролем. У листі середньої частини стебла ЕС Ор 1О0МН-5 після парової обробки рівень акриламіду був знижений лише на 19 95, рівень аспарагіну був знижений лише на 6 95, і знову спостерігалося зниження рівнів нікотину (що становить 36 95) у порівнянні з контролем.

Зниження рівня нікотину є небажаним, оскільки споживач тютюнового продукту буде змушений вживати більше тютюну для отримання того ж рівня нікотину. Також з результатів, що представлені у публікації 052013/0068240, очевидно, що рівні аспарагіну, акриламіду та нікотину широко та довільним чином варіюють серед різних мутантів ЕМО.

Бажано виявити альтернативні способи зниження рівнів аспарагіну у рослині та за допомогою цього мінімізувати кількість акриламіду в аерозолі, що утворений з нагрітої або згорілої частини рослини. Також бажано знайти способи додаткового зниження кількості акриламіду до рівнів нижче рівнів, що розкриті у публікації 052013/0068240. Також бажано зберегти рівні нікотину у рослині. Також бажано розробити способи, які дозволять стабільно одержувати рослини з даними властивостями. Даний винахід направлений на задоволення цієї потреби.

КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Було ідентифіковано шість генів повнорозмірної аспарагін синтетази у Місоїапа їабасит, які називають МАБМ1-5 (5ЕО ІЮ МО: 1), МАБМ1-Т (5ЕО ІЮО МО: 3), МА5БМ3-5(5БО ІЮО МО: 9),

МАБМЗ-Т (5ЕО ІЮ МО: 11), МІАБМ5-5 (ЗЕО ІЮ МО: 5) і МАБМ5-Т (5ЕО ІО МО: 7). Було виявлено, 60 що гени АЗМ3-5 і АБМЗ3-Т виключно слабо експресуються у ході обробки, тоді як несподівано було виявлено, що МАБМ1-5, МАБМ1-Ї, МАБМ5-5 і МАБМО-Ї у високому ступені експресуються у ході обробки, наприклад, протягом перших 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 або 100 годин обробки. Переважно, гени А5М3-5 або А5МЗ-Т або білки, що кодуються зазначеними генами, не застосовують у даному винаході. У даному документі показано, що зниження експресії МАМІ і/або МАМО або активності білка або білків, що кодуються зазначеними генами, сприяє зниженню рівнів аспарагіну в обробленому листі - такому як оброблене листя середньої-нижньої частини стебла. Це, у свою чергу, призводить до зниження рівнів акриламіду в аерозолі, який утворюється після нагрівання або згоряння обробленого листя. На відміну від результатів, що одержані у публікації О52013/0068240, зниження експресії МІАБМІ або МІА5М5 не тільки призводить до зниження рівня аспарагіну у листі, але також стабільно призводить до зниження рівня акриламіду в аерозолі. Стабільне зниження рівнів аспарагіну й акриламіду супроводжується рівнями нікотину в обробленому листі, які є приблизно еквівалентними, якщо не більшими, ніж рівні у контрольній рослині. Переважно, у деяких варіантах реалізації даного винаходу можна одержати більше низькі значення, що відповідають приблизно 89 95 зниженню рівня аспарагіну та приблизно 70 95 зниженню рівня акриламіду, з по суті мін мальним впливом або відсутністю впливу на вміст нікотину.

Без обмеження будь-якою теорією, також визначили, що акриламід, що утворюється в аерозолі тютюну, залежить від пулу аспарагіну, який утворюється у ході обробки листя.

Відповідно, рівні акриламіду в аерозолі можна модулювати (наприклад, знижувати) за допомогою зниження пулу аспарагіну, який утворюється у ході обробки або сушіння, за допомогою модулювання (наприклад, зниження) експресії або активності аспарагінсинтетази, яка активна протягом ранньої фази обробки або сушіння. Описані рослини, які характеризуються зниженим вмістом аспарагіну та демонструють знижену експресію або функцію аспарагінсинтетази. У варіантах реалізації, цього досягають із застосуванням РНК- інтерференції або мутації послідовностей, що кодують аспарагінсинтетазу, що описані у даному документі, які експресуються у ході обробки або сушіння. Зниження рівнів аспарагіну знижує кількість акриламіду, що присутній в аерозолі. Стосовно тютюну, це призводить до менших кількостей акриламіду, що присутній в аерозолі, який вдихає споживач курильного виробу, включаючи нагрітий або згорілий тютюновий продукт. Решта переваг даного винаходу описана

Зо у даному документі.

АСПЕКТИ ТА ВАРІАНТИ ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ

Аспекти та варіанти здійснення даного винаходу викладені у прикладеній формулі винаходу.

В одному аспекті запропонована мутантна, що не зустрічається у природі або трансгенна рослина або її частина, яка характеризується зниженою експресією або активністю аспарагінсинтетази, причому зазначена аспарагінсинтетаза містить, складається з або складається по суті з: (ї) полінуклеотидної послідовності, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 7295 або щонайменше 9095 з 5ЕО ІЮ МО: 1 або ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з БЕО ІЮО МО: 3, або ЗЕО ІО МО: 5, або 5ЕО ІЮ МО: 7; або (ії) поліпептиду, що кодується полінуклеотидом, що описаний в (ї); або (ії) поліпептиду, який характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з ЗЕО ІЮ МО: 2, або 5ЕО ІЮО МО: 4, або 5ЕО ІЮ

МО: 6, або ЗЕО ІО МО: 8; причому експресія або активність аспарагінсинтетази, що викладена в (і), (ії) або (ії), знижена у порівнянні з контрольною рослиною.

Переважно, рослина містить щонайменше одну генетичну зміну у регуляторній області або у кодуючій послідовності полінуклеотиду, що кодує аспарагінсинтетазу.

Переважно, знижена експресія або активність аспарагінсинтетази забезпечує зниження рівня аспарагіну в обробленому або висушеному листі, що одержаний з мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, у порівнянні з рівнем аспарагіну в обробленому або висушеному листі, що одержаний з контрольної рослини, причому, переважно, рівень аспарагіну знижений щонайменше приблизно на 17 95 у порівнянні з контрольною рослиною.

Переважно, знижена експресія або активність аспарагінсинтетази забезпечує зниження рівня акриламіду в аерозолі, який утворюється після нагрівання або згоряння обробленого або висушеного листя, що одержане з мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, у порівнянні з обробленим або висушеним листям, що одержане з контрольної рослини, причому, переважно, рівень акриламіду в аерозолі знижений щонайменше на 20 95 у порівнянні з обробленим або висушеним листям контрольної рослини.

Переважно, рівень аспарагіну в обробленому або висушеному листі, що одержаний з бо мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, є щонайменше приблизно на 22 95 меншим, і кількість акриламіду в аерозолі, який утворюється після нагрівання або згоряння обробленого або висушеного листя, що одержане з мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, є щонайменше на 24 95 меншим, ніж в обробленому або висушеному листі й аерозолі з контрольної рослини; причому, переважно, рівень аспарагіну в обробленому або висушеному листі, що одержаний з мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, є щонайменше приблизно на 44 95 меншим, і кількість акриламіду в аерозолі, який утворюється після нагрівання або згоряння обробленого або висушеного листя, що одержане з мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, є щонайменше на 66 95 нижче у порівнянні з обробленим або висушеним листям й аерозолем з контрольної рослини; причому, переважно, рівень аспарагіну в обробленому або висушеному листі, що одержаний з мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, є щонайменше приблизно на 70 95 меншим, і кількість акриламіду в аерозолі, який утворюється після нагрівання або згоряння обробленого або висушеного листя, що одержане з мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, є щонайменше приблизно на 88 95 нижче у порівнянні з обробленим або висушеним листям й аерозолем з контрольної рослини.

Переважно, рівень нікотину в обробленому або висушеному листі з мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини або частини зазначеної рослини є по суті таким самим, як і рівень нікотину в обробленому або висушеному листі контрольної рослини.

Переважно, утворення глутаміну, аспарагінової кислоти і глутамінової кислоти підвищене в обробленому або висушеному листі, що одержаний з мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, у порівнянні з обробленим або висушеним листям контрольної рослини.

Переважно, рослина вибрана з групи, що складається з тютюну або чаю (Сатеїа 5іпепвів).

Переважно, рослина тютюну являє собою рослину тютюну Місоїйапа їабасит, переважно, рослину тютюну Місоїапа їабасит типу Берлі.

Переважно, рослина містить щонайменше одну мутацію у кожній копії полінуклеотидної послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка викладена в (Її), (ії) або (ії), переважно, стоп-

Зо мутацію або мутації та/"або фрагмент або фрагменти гена, які перешкоджають трансляції РНК- транскрипту, що кодує аспарагін синтетазу.

Переважно, нуклеотидна послідовність аспарагінсинтетази містить нуклеотидну послідовність, що кодує стоп-мутацію у положенні, яке еквівалентне розташуванню нуклеотидної послідовності, що кодує стоп-мутацію, у ЗЕО ІЮ МО. 19, 21 ї 23, або причому аспарагінсинтетаза містить нуклеотидну послідовність, що кодує стоп-кодон, у положенні, яке еквівалентне розташуванню стоп-кодона у 5ЕО ІЮ МО. 20, 22 і 24.

Переважно, аспарагінсинтетаза містить нуклеотидну послідовність, яка вибрана з групи, що складається з 5ЕО ІО МО. 19, 21 і 23, або кодується нуклеотидною послідовністю, яка вибрана з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО. 19, 21 і 23, або містить, складається з або складається по суті з поліпептидної послідовності, що представлена у ЗЕО ІЮ МО. 20, 22 і 24.

Переважно, кількість біомаси листя з мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини або частини зазначеної рослини є по суті такою самою, як і кількість біомаси листя з контрольної рослини.

Переважно, листя обробляють за допомогою повітряної обробки, причому, переважно, листя, що оброблене за допомогою повітряної обробки, є обробленим на сонці або обробленим за допомогою вогневої обробки.

Переважно, листя висушують за допомогою повітряного сушіння, причому, переважно, листя, що висушене за допомогою повітряного сушіння, є обробленим на сонці або висушеним за допомогою вогневого сушіння.

В іншому аспекті запропонований рослинний матеріал або оброблений або висушений рослинний матеріал з рослини згідно з даним винаходом.

В іншому аспекті запропонований рослинний продукт, що містить щонайменше частину рослини або рослинного матеріалу згідно з даним винаходом.

В іншому аспекті запропонований спосіб одержання рослинного матеріалу зі зниженими рівнями аспарагіну та зниженими рівнями акриламіду в аерозолі, що одержаний із зазначеного рослинного матеріалу, у порівнянні з рослинним матеріалом з контрольної рослини, причому зазначений спосіб включає наступні стадії: (а) забезпечення рослини або частини зазначеної рослини, яка містить полінуклеотид, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності 60 щонайменше 7295 або щонайменше 9095 з 5ЕО ІЮ МО: 1 або ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з ЗЕО ІЮО МО: 3, або ЗЕО ІЮ МО: 5, або 5ЕО ІО МО: 7; (5) зниження експресії полінуклеотиду або активності білка, що кодується зазначеним полінуклеотидом, у рослині або частині зазначеної рослини; (с) збирання рослинного матеріалу з рослини або частини зазначеної рослини; (4) обробку або сушіння рослинного матеріалу; (е) необов'язково, вимірювання рівнів аспарагіну у рослині або частині зазначеної рослини і/або вимірювання рівнів акриламіду в аерозолі, що одержаний з рослини або частини зазначеної рослини; й (1) одержання обробленого або висушеного рослинного матеріалу зі зниженими рівнями аспарагіну та зниженими рівнями акриламіду в аерозолі, що одержаний із зазначеного рослинного матеріалу, причому, переважно, рівень нікотину є по суті таким самим, як і рівень нікотину у контрольній рослині; причому, переважно, утворення глутаміну, аспарагінової кислоти і глутамінової кислоти підвищене у порівнянні з обробленим або висушеним листям контрольної рослини.

Переважно, рослинний матеріал обробляють або висушують протягом щонайменше приблизно З днів після збирання.

Переважно, рослинний матеріал обробляють за допомогою повітряної обробки, причому, переважно, оброблене за допомогою повітряної обробки листя є обробленим на сонці або обробленим за допомогою вогневої обробки.

Переважно, рослинний матеріал висушують за допомогою повітряного сушіння або сушіння на сонці, або висушують за допомогою вогневого сушіння.

Також розкритий рослинний матеріал, що одержаний або одержується за допомогою даного способу.

В іншому аспекті запропонований спосіб ідентифікації одного або декількох генетичних змін у рослині, які корелюють зі зниженими рівнями аспарагіну в обробленому або висушеному рослинному матеріалі з рослини і зниженими рівнями акриламіду в аерозолі, що одержаний з обробленої або висушеної рослини або частини зазначеної рослини, у порівнянні з контрольною рослиною, яка не містить однієї або декількох генетичних змін, причому зазначений спосіб включає наступні стадії: (а) ідентифікацію обробленої або висушеної рослини зі зниженими рівнями аспарагіну у рослинному матеріалі з рослини і зниженими рівнями акриламіду в аерозолі, що одержаний з обробленого або висушеного рослинного матеріалу, у

Зо порівнянні з рослинним матеріалом з контрольної рослини; (5) забезпечення зразка нуклеїнової кислоти з рослини, що ідентифікована на стадії (а); й (с) ідентифікацію у зразку нуклеїнової кислоти зі стадії (Б) однієї або декількох генетичних змін у полінуклеотидній послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 9о або щонайменше 90 95 з БЕО ІЮ МО: 1 або ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з ФЕО

ІО МО: 3, або 5ЕО ІО МО: 5, або 5ЕО ІЮО МО: 7.

В іншому аспекті запропонований спосіб одержання рослинного матеріалу зі зниженими рівнями аспарагіну та зниженими рівнями акриламіду в аерозолі, що одержаний з обробленого або висушеного рослинного матеріалу, у порівнянні з контрольною рослиною, причому зазначений спосіб включає наступні стадії: (а) забезпечення рослини або рослинного матеріалу згідно з даним винаходом; (Б) збирання рослинного матеріалу з рослини; (с) обробку або сушіння рослинного матеріалу протягом періоду часу; й (4) одержання обробленого або висушеного рослинного матеріалу, який містить знижені рівні аспарагіну та знижені рівні акриламіду в аерозолі, що одержаний з обробленого або висушеного рослинного матеріалу, причому, переважно, рівень нікотину є по суті таким самим, як і рівень нікотину у контрольній рослині; причому, переважно, утворення глутаміну, аспарагінової кислоти і глутамінової кислоти підвищене у порівнянні з контрольною рослиною.

В іншому аспекті запропонована виділена полінуклеотидна послідовність, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 або щонайменше 90 95 з БЕО

БО ІО МО: 1 або ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з ЗЕО ІО МО: 3, або 5ЕО ІЮ МО: 5, або 5ЕО ІЮО МО: 7, або що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з

ЗБО ІО МО 19, 21 ї 23, за умови, що послідовність, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з БЕО ІЮ МО 19, 21 і 23, містить нуклеотидну послідовність, що кодує стоп-кодон, у положенні, що еквівалентне розташуванню стоп-кодона у 5ЗЕО ІЮ МО. 19, 21 і 23, причому, переважно, зазначений виділений полінуклеотид являє собою синтетичний полінуклеотид або кКДНК.

В іншому аспекті запропонований виділений поліпептид, який кодується полінуклеотидом, що описаний у даному документі. 60 В іншому аспекті запропонований виділений поліпептид, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з ЗЕО ІЮ МО: 2, або 5ЕО ІЮО МО: 4, або 5ЕО ІЮ

МО: 6, або 5ЕО ІЮ МО: 8, ЗЕО ІО МО: 20, або 5ЕО ІЮ МО: 22, або 5ЕО ІЮ МО: 24, або що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу,

Б яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з БЕО ІЮ МО: 2, або 5ЕО І

МО: 4, або ЗЕО ІЮ МО: 6, або 5ЕО ІО МО: 8, або 5ЕО ІО МО: 20, або 5ЕО ІО МО: 22, або ЗЕО ІЮ

МО: 24, за умови, що послідовність, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з ЗЕО ІЮ МО: 20, або 5ЕО ІЮ МО: 22, або 5ЕО ІЮО МО: 24, містить стоп-кодон у положенні, яке еквівалентне розташуванню стоп-кодона у 5ЕО ІЮ МО: 20, або ЗЕО ІО МО: 22, 10 або ЗЕО ІО МО: 24, причому, переважно, зазначений виділений полінуклеотид являє собою синтетичний полінуклеотид або кКДНК.

В іншому аспекті запропонована конструкція, вектор або вектор експресії, що містить виділений полінуклеотид, що описаний у даному документі.

В іншому аспекті, запропонована клітина мутантної, що не зустрічається у природі або 15 трансгенної рослини з рослини, яка описана у даному документі.

В іншому аспекті запропонований оброблений або висушений рослинний матеріал, що містить клітину, яка описана у даному документі.

В іншому аспекті запропонований тютюновий продукт або курильний виріб, що містить рослинний матеріал, який описаний у даному документі. 20 Також розкриті комбінації одного або декількох викладених варіантів реалізації.

ДЕЯКІ ПЕРЕВАГИ

У даному документі показано, що аспарагін активно утворюється у ході обробки. Було показано, що дане накопичення аспарагіну призводить до утворення акриламіду в аерозолі, який утворюється, коли оброблений рослинний матеріал нагрівають або спалюють. Переважно, 25 МАБМ1-55 МАБМІ1-Т, МАБМ5-51 МАБМ5-Т у високому ступені експресуються у ході обробки, особливо, з самого початку обробки. Зниження експресії одного або декількох з даних генів може призвести до більше низьких рівнів акриламіду в аерозолі, оскільки рівень аспарагіну може бути знижений протягом процесу обробки.

Спостерігається обмежений вплив на рівні нікотину в модифікованих рослинах, що описані у 30 даному документі, який є бажаним, коли модифіковані рослини передбачається використовувати для одержання рослин тютюну.

Способи, що описані у даному документі, послідовно призводять до одержання рослин, в яких знижене накопичення аспарагіну у ході обробки або сушіння, а також знижене утворення акриламіду в аерозолі. 35 Спостерігається обмежений вплив на біомасу листя та фенотип, що характеризується перевагою при використанні модифікованих рослин, що описані у даному документі, для комерційних цілей.

Даний винахід дозволяє створювати рослини, що не модифіковані генетичним способом, які можуть бути більше придатними для споживачів. 40 Даний винахід не обмежений застосуванням мутантних рослин ЕМС, як у публікації

О52О13/0068240. Мутантна рослина ЕМС може характеризуватися меншим потенціалом передавати поліпшені властивості врожаю після селекції. Після початку селекції бажана характеристика або характеристики мутантної рослини ЕМС можуть бути втрачені з різних причин. Наприклад, може знадобитися декілька мутацій, мутація може бути домінантною або 45 рецесивною, й ідентифікація точкової мутації у гені-мішені може бути важко досяжною. Навпаки, у даному винаході використовують застосування певних генів, з якими можна специфічно маніпулювати й/або які можна нокаутувати для одержання рослин з бажаним фенотипом. Даний винахід можна застосовувати у відношенні інших різновидів або сільськогосподарських культур тютюну, і за допомогою цього пропонувати бажане рішення для зниження щонайменше рівня 50 акриламіду.

КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

На фігурі 1 представлений вміст аспартату (А5р), глутаміну (Сі), аспарагіну (Авп) та сумарних вільних амінокислот (АК) у З різних тютюнах Берлі, які культивували на одному полі (середнє з 5 повторів для ділянки) й обробляли одночасно. Три Берлі являли собою ТМО9О (А), 55 Бенкет А! (В) і Кентуккі 14 (С).

На фігурі 2 представлені залежності від часу процесу змінення рівня аспарагіну, глутаміну й аспартату в ході обробки листя Берлі.

На фігурі З представлений шлях активності аспарагін синтетази.

На фігурі 4 представлена кореляція, що існує між присутністю аспарагіну в окремих сортах тютюну Вірджинія (ЕС), Орієнтал (ОК), Кастурі (К5) або Берлі (ВМ) і в композиції, що містить суміш Вірджинії (ЕС), Кастурі (К5) й Орієнтал (ОК) (позначена КЕР).

На фігурі 5 представлені результати, що одержані, коли швейцарський Берлі Стелла вирощували у Швейцарії й обробляли або у коморі для повітряної обробки протягом 10 тижнів (класична сільськогосподарська методика, ВО-АС), або у печі для парової обробки, точно так само, як у випадку швейцарського тютюну Вірджинія (ВО-ЕС). Після обробки листову пластинку подрібнювали і проводили визначення аспарагіну (А). Готували гомогенізований порошок тютюнового матеріалу (менше або дорівнює 200 мікрон). Гомогенізований тютюновий матеріал використовували у виробі, що генерує аерозоль, по суті як описано у публікації УУО 2013098405, для застосування з пристроєм, що генерує аерозоль. Виріб, що генерує аерозоль, викурювали із застосуванням режиму викурювання згідно з Міністерством охорони здоров'я Канади для визначення вмісту акриламіду в аерозолі (В).

На фігурі б представлене філогенетичне дерево амінокислотних послідовностей, які передбачені на основі генів тютюну, що відповідають МІА5М1-5, МАБМ1-Т, МАБМЗ3-5, МА5МЗ-

Т, МАБМ5-5, МА5БМО-Т, у порівнянні з білками арабідопсису АІАБМІ (АїЗ947340), АТАБМ2 (Агї5965010) й АТАБМІЗ (Аї5910240) і білками томата 5оїусоб9007180 і оїус0о49055200.

На фігурі 7 представлена експресія генів А5М у ході обробки тютюну швейцарський Берлі (Стелла), що вирощений у Швейцарії у 2010 році. АКМ виділяли зі зразків листя (що розташоване у середній частині стебла), які відібрані в залежності від часу у полі (-4 години) і в коморах для повітряної обробки до 96 годин обробки. Експресію генів на специфічних зондах визначали за допомогою використання мікроматричного аналізу з чіпами Абутейіх Тобва!тау.

На фігурі 8 представлена експресія генів АБМ у тютюні швейцарський Берлі (Стелла, А і С) швейцарська Вірджинія (Брайт, ІТВ 683, В і В) через 48 годин обробки.

На фігурі 9 представлена післязбиральна експресія АБМІ, АБМ5 (А) й АЗМЗ (В) через 60 годин повітряної обробки у 4 різних листі Берлі (що розташоване у нижній частині стебла), яке вирощене на полі Пайєрн у 2013 році.

На фігурі 10 представлена експресія АБМІ, АБМ5О (ліве креслення) й АБМЗ (праве креслення) у 8 тканинах, що відібрані від зрілого тютюну Берлі, що вирощений у полі (Незріла квітка (Незріл. квітка; Лист з нижньої, НС, середньої, СС і верхньої, ВС, частини стебла;

Пелюсток, Корінь, Чашолисток і Стебло).

На фігурі 11 представлений вміст аспарагіну у рослинах АБМ1-КМАЇ, що вирощені у теплиці, під контролем промотору МММ або Е4 і рівні транскрипту АЗМІ, що визначені через З дні обробки. Кількість аспарагіну визначали у листі, що розташований у середній-нижній частині стебла, від 15 рослин від кожної події трансформації (А). Відносну експресію транскрипту АЗМІ1 оцінювали методом кПЛР (кількісної полімеразної ланцюгової реакції) із застосуванням РНК, що відібрана через З дні обробки, у 15 рослинах від кожної події трансформації (В).

На фігурі 12 представлений вміст глутаміну, аспартату, глутамату та нікотину у рослинах

АБМ1-ЕМАЇ, що вирощені у теплиці, під контролем промотору ММУ або Е«4. Кількість іп (А), А5р (В), Сім (С) та нікотину (0) вимірювали у листі, що розташований у середній-нижній частині стебла, від 15 рослин від кожної події трансформації.

На фігурі 13 представлений вміст аспарагіну у рослинах АБМ5-КМАЇ, що вирощені у теплиці, під контролем промотору МММ або Е4 ії рівні транскрипту АБМ5, що визначені через З дні обробки. Кількість аспарагіну визначали у листі, що розташований у середній-нижній частині стебла, від 15 рослин від кожної події трансформації (А). Відносну експресію транскрипта АБМ5 оцінювали методом кПЛР (кількісної полімеразної ланцюгової реакції) із застосуванням РНК, що відібрана через З дні обробки, у 15 рослинах від кожної події трансформації (В).

На фігурі 14 представлений вміст глутаміну, аспартату, глутамату та нікотину у рослинах

АБМ5-ЕМАЇ, що вирощені у теплиці, під контролем промоторів МММ або Е4. Кількість Сіп (А),

Азр (В), Сім (С) та нікотину (0) вимірювали у листі, що розташований у середній-нижній частині стебла, від 15 рослин від кожної події трансформації.

На фігурі 15 представлена біомаса листя ліній АЗМ1- й АЗМ5-ЕКМА. Відбирали чотири листа у середній частині стебла від 4 рослин від кожної події трансформації, що вибрані випадковим чином і зважені. Показані середні значення маси та стандартне відхилення.

На фігурі 16 представлена експресія СУР82Е4 протягом ранніх етапів повітряної обробки швейцарського Берлі (Стелла). Транскрипти визначали із застосуванням чипів Тобатау

АпПутеїгіх на основі специфічного зонда МІРМІатд2е2 5ї для цитохром Р450-монооксигенази

СУРВ2ЕЯ4.

На фігурі 17 представлений відсоток зниження рівня аспарагіну у варіантах АБ5М. Відсоткові значення розраховували у порівнянні з аут-сегрегантами ДТ (дикого типу) для кожної лінії варіанта.

На фігурі 18 представлена біомаса обробленого листя (4), що відібране у середній-нижній

Б частині стебла.

На фігурі 19 представлене визначення акриламіду в аерозолі, який одержаний у результаті нагрівання виробу, що утворює аерозоль, як описано у публікації М/О2013/098405, що виготовлений з А5М1-ВМАЇ, А5М5-КМАЇ та відповідного контрольного листя зазначених рослин.

Аспарагін визначали у подрібненому порошку з АБМ1-АМАЇ, АБМ5-КМАЇ та контрольному листі (див. Фігуру 11 і фігуру 13) після перемішування з 50 9о тютюном Вірджинія (А, С). Суміш тютюну перетворювали у формоване листя та нагрівали у виробі, що утворює аерозоль. Потім в аерозолі визначали акриламід (В, 0).

На фігурі 20 представлене визначення акриламіду у диму горючої сигарети, що виготовлена з різаного наповнювача А5М1-КМАЇї та відповідного контролю листової пластинки середньої частини стебла. Аспарагін (креслення А) визначали у різаному наповнювачі, що одержаний з

АБМ1-КЕМАЇ та контрольного листя. Горючі сигарети викурювали, і в диму аналізували акриламід.

На фігурі 21 представлене визначення акриламіду в аерозолі з виробу, що генерує аерозоль, який виготовлений з листя АЗМ1-5 стоп-мутанта та контролю (аут-сегрегант ДТ).

Аспарагін визначали у подрібненому порошку з АЗМ1-5 стоп-мутанта та контрольного листя після перемішування з 5095 тютюном Вірджинія (А). Суміш тютюну перетворювали у формоване листя, і аерозоль одержували з виробу, що генерує аерозоль. Потім в аерозолі визначали акриламід (В).

На фігурі 22 представлені приклади векторів, які використані для одержання рослин АБІМ-

АМАЇ.

ВИЗНАЧЕННЯ

Технічним термінам і виразам, що використовуються у межах обсягу даної заявки, слід надавати значення, яке зазвичай застосовується до них у даній галузі біології рослин і молекулярної біології. Всі нижченаведені визначення термінів застосовують до всього змісту даної заявки. Слово "що містить" не виключає інші елементи або стадії, а форми однини не виключають множину. Одна стадія може виконувати функції декількох ознак, викладених у формулі винаходу. Терміни "приблизно", "головним чином" і "близько" в контексті даного цифрового значення або діапазону відносяться до значення або діапазону, який знаходиться в межах 20 95, в межах 10 95, або в межах 5 95, 4 9б, З 9, 2 Уо або 1 95 від заданого значення або діапазону.

Термін "виділений" відноситься до будь-якого об'єкта, який взятий з його природного середовища, але цей термін не передбачає будь-який ступінь очищення. "Вектор експресії" являє собою засіб доставки нуклеїнової кислоти, який містить комбінацію компонентів нуклеїнової кислоти для забезпечення експресії нуклеїнової кислоти. Підходящі вектори експресії включають в себе епісоми, що здатні до поза хромосомної реплікації, такі як кільцеві плазміди з двониткової нуклеїнової кислоти; лінеаризовані плазміди з двониткової нуклеїнової кислоти та інші функціонально еквівалентні вектори експресії будь-якого походження. Вектор експресії містить щонайменше промотор, що розташований вище за ланцюгом ї функціонально пов'язаний з нуклеїновою кислотою, конструкцією нуклеїнових кислот або кон'югатом нуклеїнових кислот, як визначено нижче.

Термін "конструкція" відноситься до двониткового фрагмента рекомбінантної нуклеїнової кислоти, який містить один або декілька полінуклеотидів. Конструкція містить "матричний ланцюг", основи якого є спареними з комплементарним "сенсовим або кодуючим ланцюгом".

Дана конструкція може бути вбудованою у вектор у двох можливих орієнтаціях, або в тій самій (або сенсовій) орієнтації, або у зворотній (або антисенсовій) орієнтації по відношенню до орієнтації промотора, що розташований у векторі, такому як вектор експресії. "Вектор" відноситься до способу доставки нуклеїнової кислоти, який містить комбінацію компонентів нуклеїнової кислоти для забезпечення перенесення нуклеїнової кислоти, конструкцій нуклеїнових кислот і кон'югатів нуклеїнових кислот і тому подібного. Підходящі вектори включають в себе епісоми, що здатні до позахромосомної реплікації, такі як кільцеві плазміди з двониткової нуклеїнової кислоти; лінеаризовані плазміди з двониткової нуклеїнової кислоти та інші вектори будь-якого походження. "Промотор" відноситься до елемента/послідовності нуклеїнової кислоти, що, як правило, розташована вище за ланцюгом і функціонально з'єднана з фрагментом двониткової ДНК. 60 Промотори можуть бути одержані цілком з областей поблизу нативного гена, що являє інтерес,

або можуть складатися з різних елементів, що одержані з різних нативних промоторів або сегментів синтетичної ДНК.

Терміни "гомологія, ідентичність або схожість" відносяться до ступеня схожості послідовностей між двома поліпептидами або між двома молекулами нуклеїнових кислот, що порівнюються шляхом вирівнювання послідовностей. Ступінь гомології між двома окремими послідовностями нуклеїнових кислот, що порівнюються, є функцією кількості ідентичних або співпадаючих нуклеотидів у зіставлених положеннях. Відсоток ідентичності може бути визначений шляхом візуального огляду та математичних розрахунків. Як альтернатива, відсоток ідентичності двох послідовностей нуклетнових кислот можна визначити шляхом порівняння інформації про послідовності з використанням комп'ютерної програми, такої як Сіивіаму, ВІ А5Т,

ЕА5ЗТА або Зтіїйп-У/агептап. Відсоток ідентичності двох послідовностей може набувати різних значень в залежності від: () методу, що використовується для вирівнювання послідовностей, наприклад, Сіивіаму, ВГАБТ, ЕАБЗТА, Зтіїп-УМагектап (що використовуються у різних програмах), або структурного вирівнювання з ЗЮО-порівняння; і (її) параметрів, що використовуються способом вирівнювання, наприклад, локального у порівнянні з глобальним вирівнюванням, матриці замін пар, що використовується, (наприклад, ВГОБИОМ6б2, РАМ250О,

Соппеї і т. п), і штрафу за пропуск, наприклад, функціональної форми та констант. Після проведення вирівнювання існують різні способи підрахунку відсотка ідентичності між двома послідовностями. Наприклад, можна розділити кількість ідентичностей на: (ї) довжину найкоротшої послідовності; (ії) довжину вирівнювання; (ії) середню довжину послідовності; (ім) кількість положень без пропуску; або (ім) кількість еквівалентних положень, виключаючи виступаючі кінці. Більше того, слід розуміти, що відсоток ідентичності також є суворо залежним від довжини. Внаслідок цього чим більше короткою є пара послідовностей, тим більшу ідентичність послідовностей, що виникла випадково, можна очікувати. Популярна програма для множинного вирівнювання Сіивіаіму (Мисієїс Асіа5 Незеагсі! (1994) 22, 4673-4680; Мисівїс Асійв5

Везеагсі (1997), 24, 4876-4882) є підходящим способом одержання множинних вирівнювань поліпептидів або полінуклеотидів. Підходящі параметри для СіивіаіМу можуть бути наступними:

Для вирівнювань полінуклеотидів: Штраф за відкриття пропуску-15,0, штраф за подовження пропуску-6,66, і матриця-Ідепійу. Для вирівнювань поліпептидів: Штраф за відкриття

Зо пропуску-10,0, штраф за подовження пропуску:0,2, і матриця:Соппеї. Для вирівнювань ДНК і білка: ЕМОСАР:--1 і САРОІЗТ-4. Фахівцям у даній галузі техніки відомо, що може бути необхідно варіювати дані та інші параметри для оптимального вирівнювання послідовності.

Переважно, потім проводять розрахунок відсотка ідентичностей на основі такого вирівнювання у вигляді (М/Т), де М являє собою кількість положень, в яких у послідовностях присутній ідентичний залишок, і Т являє собою загальну кількість порівнюваних положень, включаючи пропуски, але виключаючи виступаючі кінці. "Варіант" означає по суті аналогічну послідовність. Варіант може мати аналогічну функцію або по суті аналогічну функцію відносно послідовності дикого типу. У випадку аспарагінсинтетази аналогічна функція являє собою щонайменше приблизно 50 95, 60 бо, 70 95, 80 95 або 90 95 від функції ферменту дикого типу з перетворення аспартату в аспарагін з в однакових умовах. У випадку аспарагінсинтетази по суті аналогічна функція являє собою щонайменше приблизно 90 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95 від функції ферменту дикого типу з перетворення аспартату в аспарагін в однакових умовах. Варіанти можуть містити одну або декілька сприятливих мутацій, які призводять до одержання ферменту, що характеризується зниженим рівнем активності аспарагінсинтетази у порівнянні з поліпептидом дикого типу. Варіанти можуть містити одну або декілька сприятливих мутацій, які призводять до нокауту активності аспарагінсинтетази зазначених варіантів (тобто, 100 95 інгібінування та, таким чином, нефункціонального поліпептиду). Ілюстративний варіант АБМ1-5 дикого типу являє собою АЗМ1-5 МУ156"7" (5ЕО ІО МО 19 ї 20), що містить сприятливу стоп-мутацію, яка призводить до зниження рівня аспарагіну приблизно на 17 95 у порівнянні з поліпептидом АЗМ1- 5 дикого типу. Ілюстративний варіант АЗМ1-Т дикого типу являє собою АЗМ1-Т М/156755БО І

МО 21 їі 22), що містить сприятливу стоп-мутацію, яка призводить до зниження рівня аспарагіну приблизно на 83 95 у порівнянні з поліпептидом А5М1-5 дикого типу. Ілюстративний варіант

АБМ5-5 дикого типу являє собою АБМ5-5 066" (ЗЕО ІЮО МО 23 та 24), що містить сприятливу стоп-мутацію, яка призводить до зниження рівня аспарагіну приблизно на 44 95 у порівнянні з поліпептидом А5М1-5 дикого типу.

Термін "рослина" відноситься до будь-якої рослини або частини рослини на будь-якій стадії її життєвого циклу або розвитку, а також до її потомства. В одному варіанті здійснення рослина являє собою "рослину тютюну", яка відноситься до рослини, що належить до роду Місойбапа. бо Переважні види рослини тютюну описані у даному документі. Переважно, рослина являє собою мутантну, що не зустрічається у природі або трансгенну рослину, в якій експресію одного або декількох генів або активність одного або декількох білків модулюють у порівнянні з контрольною рослиною. Переважно, зміна, яка робить рослину мутантою, такою, що не зустрічається у природі або трансгенною рослиною, призводить до модуляції експресії одного або декількох генів або модуляції активності одного або декількох білків. У деяких варіантах реалізації зміна являє собою генетичну зміну або генетичну модифікацію. "Частини рослини" включають клітини рослини, протопласти рослин, тканинні культури клітин рослин, з яких можна регенерувати цілу рослину, калуси рослин, кореневища рослин і клітини рослин, які є інтактними у рослинах або частинах рослин, таких як зародки, пилок, пиляки, насінні зачатки, насіння, листя, квіти, стебла, гілки, плід, коріння, кінчики коренів і т. п.

Потомство, варіанти та мутанти регенерованих рослин також включені в обсяг даного розкриття за умови, що вони містять введені полінуклеотиди, які описані у даному документі. Листя рослин є особливо переважними для застосування у даному винаході. "Клітина рослини" відноситься до структурної та фізіологічної одиниці рослини. Клітина рослини може знаходитися у вигляді протопласту без клітинної стінки, окремої клітини, що виділена, або культивованої клітини або може бути представлена як частина більше високоорганізованої одиниці, такої як, без обмеження, рослинна тканина, орган рослини або ціла рослина.

Термін "рослинний матеріал" відноситься до будь-якої твердої, рідкої або газоподібної композиції, або їх комбінації, що одержується з рослини, включаючи біомасу, листя, стебла, коріння, квітки або частини квітки, плоди, пилок, яйцеклітини, зиготи, насіння, черенки, секрети, екстракти, клітинні або тканинні культури, або будь-які інші частини або продукти рослини. В одному варіанті здійснення рослинний матеріал містить або складається з біомаси, стебел, насіння або листя. В іншому варіанті здійснення рослинний матеріал містить або складається з листя.

Термін "різновид" відноситься до популяції рослин, які розділяють постійні характеристики, що відділяють їх від інших рослин того самого виду. Маючи одну або декілька відмітних ознак, різновид додатково характеризується дуже невеликим загальним варіюванням між особинами в межах цього різновиду. Різновид часто продається на комерційній основі.

Зо Термін "лінія" або "селекційна лінія", що використовується у даному документі, означає групу рослин, які використовують при селекції рослин. Лінія відрізняється від різновиду, оскільки демонструє невелику варіабельність між особинами за однією або декількома ознаками, що являють інтерес, хоча може бути присутня певна варіабельність між особинами за іншими ознаками.

Термін "що не зустрічається у природі" у цьому документі описує об'єкт (наприклад, полінуклеотид, генетичну мутацію, поліпептид, рослину, клітину рослини та рослинний матеріал), який не утворений природою або не існує у природі. Такі об'єкти, що не зустрічаються у природі, або штучні об'єкти можна створити, синтезувати, виробити, модифікувати, піддати втручанню або маніпулюванню способами, що були описані у даному документі, або які відомі з рівня техніки. Такі об'єкти, що не зустрічаються у природі, або штучні об'єкти можна створити, синтезувати, виробити, модифікувати, піддати втручанню або маніпулюванню людиною. Таким чином, як приклад, рослину, що не зустрічається у природі, клітину рослини, що не зустрічається у природі, або рослинний матеріал, що не зустрічається у природі, можна створити з використанням методик маніпуляції з генами, наприклад, з використанням антисенсової РНК, інтерферуючої РНК, мегануклеази та їм подібних. Як додатковий приклад, рослину, що не зустрічається у природі, рослинну клітину, що не зустрічається у природі, або рослинний матеріал, що не зустрічається у природі, можна створити з використанням інтрогресії або шляхом перенесення однієї або декількох генетичних мутацій (наприклад, одного або декількох поліморфізмів) від першої рослини або рослинної клітини до другої рослини або рослинної клітини (які самі по собі можуть бути такими, що зустрічаються у природі), таким чином, що одержана рослина, рослинна клітина або рослинний матеріал або їх потомство містить генетичну структуру (наприклад, геном, хромосому або її сегмент), яка не утворена природним шляхом або яка не існує у природі. Одержана рослина, клітина рослини або рослинний матеріал, таким чином, є штучними або такими, що не зустрічаються у природі. Відповідно, рослину або клітину рослини, що є штучними або такими, що не зустрічаються у природі, можна створити шляхом модифікації генетичної послідовності в рослині або клітині рослини, що першими зустрічаються у природі, навіть якщо одержана генетична послідовність зустрічається у природі в другій рослині або клітині рослини, яка містить інший генетичний фон з першої рослини або рослинної клітини.

Термін "модулювання" може відноситися до зниження, інгібування, підвищення або іншого впливу на експресію або активність поліпептиду. Цей термін може також відноситися до зниження, інгібування, підвищення або іншого впливу на активність гена, що кодує поліпептид, який може включати в себе, крім іншого, модулювання транскрипційної активності.

Термін "зниження" або "знижений", що використовується у даному документі відноситься до зниження від приблизно 10 956 до приблизно 99 95, або зниження, що становить щонайменше 1095, щонайменше 2095, щонайменше 2595, щонайменше 3095, щонайменше 40 95, щонайменше 50 95, щонайменше 60 956, щонайменше 70 95, щонайменше 7595, щонайменше 80956, щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або щонайменше 100 95 або більше від кількості або активності, такої як, крім іншого, поліпептидна активність, транскрипційна активність й експресія білка.

Термін "інгібувати" або "інгібований", що використовується у даному документі, відноситься до зниження від приблизно 9895 до приблизно 10095, або зниження, що становить щонайменше 98 95, щонайменше 99 95, але особливо 100 95 від кількості або активності, такої як, крім іншого, поліпептидна активність, транскрипційна активність й експресія білка.

Трансформація клітини може бути стабільною або тимчасовою. Термін "тимчасова трансформація" або "тимчасово трансформований" або варіанти зазначеного терміна означають введення одного або декількох екзогенних полінуклеотидів у клітину за відсутності вбудовування екзогенного полінуклеотиду у геном клітини-хазяїна. Навпаки, термін "стабільна трансформація" або "стабільно трансформований" означає введення й інтеграцію одного або декількох екзогенних полінуклеотидів у геном клітини. Термін "стабільний трансформант" означає клітину, в яку стабільно інтегрували один або декілька екзогенних полінуклеотидів у геномну ДНК або ДНК органел. Слід розуміти, що організм або його клітина, яка трансформована нуклеїновими кислотами, конструкціями та/(або векторами згідно з даним винаходом, можуть бути тимчасово, а також стабільно трансформованими. У деяких варіантах реалізації стабільна трансформація є переважною.

Термін "підвищення" або "підвищений" у даному документі відноситься до підвищення від приблизно 595 до приблизно 9995, або підвищення, що становить щонайменше 5 95, щонайменше 10 95, щонайменше 20 95, щонайменше 25 95, щонайменше 30 95, щонайменше 4095, щонайменше 5095, щонайменше 6095, щонайменше 7095, щонайменше 75 95, щонайменше 80 95, щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або щонайменше 100 95 або більше від кількості або активності, такої як, крім іншого, поліпептидна активність, транскрипційна активність й експресія білка.

Термін "по суті" у цьому документі та при використанні у контексті кількості означає, що кількість становить щонайменше приблизно 10 95, щонайменше приблизно 9 95, щонайменше приблизно 895, щонайменше приблизно 795, щонайменше приблизно 695, щонайменше приблизно 595, щонайменше приблизно 495, щонайменше приблизно 395, щонайменше приблизно 2 965, щонайменше приблизно 1 95 або щонайменше приблизно 0,1 95 від кількості, З якою її порівнюють.

Термін "контроль" у контексті контрольної рослини або контрольної рослинної клітини та т. п. означає рослину або рослинну клітину, в яких експресія або активність гена або білка, що являє інтерес, не були модульовані, і тому даний контроль може забезпечити порівняння або еталон відносно рослини або рослинної клітини, в яких експресія або активність ферменту була модифікована. Таким чином, у контексті даного винаходу контроль не буде містити щонайменше одну генетична зміну, яка знижує експресію або активність аспарагінсинтетази.

Контрольна рослина або рослинна клітина може містити порожній вектор. Контрольна рослина або рослинна клітина може відповідати рослині дикого типу або рослинній клітині дикого типу та т. п. У всіх таких випадках досліджувану рослину та контрольну рослину культивують та збирають з використанням однакових протоколів для цілей порівняння. Зміни рівнів, співвідношень, активності або розподілу генів або поліпептидів, що описані у даній заявці, або зміни фенотипу рослини, особливо, зниження накопичення аспарагіну та/або зниження накопичення акриламіду, і/або підвищення накопичення глутаміну, і/або підвищення накопичення аспарагінової кислоти, і/або підвищення накопичення глутамінової кислоти, можна вимірювати за допомогою порівняння рослини, про яку йде мова, з контрольною рослиною, причому, переважно, рослину, про яку йде мова, і контрольну рослину культивували і/або збирали із застосуванням однакових протоколів. Контрольна рослина може забезпечувати еталонну точку для вимірювання змін фенотипу досліджуваної рослини. Показник змін у фенотипі можна вимірювати у будь-який момент часу для рослини, у тому числі, під час розвитку рослини, старіння або після обробки. Показник змін фенотипу можна вимірювати у 60 рослин, що вирощуються у будь-яких умовах, у тому числі у рослин, що вирощуються у вегетаційній камері, теплиці або у полі. Зміну фенотипу можна вимірювати за допомогою вимірювання вмісту аспарагіну та/або вмісту глутаміну, і/або вмісту аспарагінової кислоти, і/або вмісту глутамінової кислоти (як описано у публікації МоІдомеапи (2005)), і/або вмісту акриламіду (як описано у публікаціях РароизекК еї аї., 2014 й/"або Опоа еї аї., 2003, й/«або Опйей 5(а(е5

Епмігоптепіа! Ргоїесіоп Адепсу Меїной 8032А - Асгуіатіде бу Саз Спготаїйодгарну, Вемівіоп 1,

Ресетрег 1996), і/або вміст нікотину (за допомогою Соорегайоп Сепіге Тог Зсієпійіс Везвєагсп

Веїаїйме юю Торассо Кесоттепаей (СОВЕЗТА) Меїнод Митбег 62, Оеєїептіпайоп ої пісоїіпе іп їорассо апа їорассо ргодисіє Бу да5 сПпготаїйодгарпіс апаїузіз (Бербгчагу 2005)) можна контролювати до та/або протягом і/або після обробки або сушіння із застосуванням способів, що добре відомі у даній галузі техніки. Аналіз вільних амінокислот проводять із застосуванням способу на основі матеріалів МоІдомеапи (2005).

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС

В одному варіанті здійснення запропонований виділений полінуклеотид, що містить, складається з або складається по суті з полінуклеотидної послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 60 95 з будь-якою з послідовностей, що описані у даному документі, включаючи будь-який з полінуклеотидів, що представлені у переліку послідовностей. Переважно, виділений полінуклеотид містить, складається з або складається по суті з послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 60 95, 61 96, 62 95, 63 95, 64 90, 65 9, 66 о, 67 о, 68 90, 69 90, 70 90, 71 Фо, 72 о, 73 Уо, 74 90, 75 дю, 78 Фо, 80 95, 85 Фо, 87 Уо, 88 90, 89 о, 90 90, 91 У, 92 90, 93 У, 94 90, 95 90, 96 9, 97 Уо, 98 У, 99 95 або 10095 із зазначеною послідовністю. Більше переважно, виділений полінуклеотид містить, складається з або складається по суті з послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 Фо, 73 90, 74 90, 75 о, 78 90, 80 Фо, 85 У, 87 Уо, 88 У, 89 95, 90 9о, 91 95, 92 95, 93 90, 94 95, 95 о, 96 90, 97 У, 98 9, 99 95 або 100 95 із зазначеною послідовністю.

Вирівнювання послідовностей, що описані у даному документі, показані у таблиці 1.

В іншому варіанті здійснення запропонований виділений полінуклеотид, що містить, складається з або складається по суті з полінуклеотидної послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 60 95 з ЗЕО ІЮ МО: 1, або 5ЕО ІЮ МО: 3, або 5ЕО ІЮ

МО: 5, або 5ЕБЕО ІЮ МО: 7, або 5ЕБО ІЮО МО: 9, або 5ЕБЕО ІЮ МО: 11. Переважно, виділений

Ко) полінуклеотид 5ЕО ІЮ МО: 1, або 5БЕО ІО МО: 3, або 5БЕО ІЮ МО: 5, або 5ЕО ІО МО: 7, або 5ЕО

ІО МО: 9, або ЗЕО ІО МО: 11 містить, складається з або складається по суті з послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 60 95, 61 9о, 62 Фо, 63 9, 64 оо, 65 95, 66 95, 67 Фо, 68 90, 69 о, 70 90, 75 90, 78 9Уо, 80 90, 85 Фо, 87 Фо, 88 9, 89 90, 90 Фо, 91 Фо, 92 96, 93 95, 94 95, 95 95 96 Фо, 97 90, 98 95, 99 Фо, 99,1 95, 99,2 95, 99,3 Уо, 99,4 90, 99,5 Уо, 99,6 95, 99,7 9, 99,8 95, 99,9 95 або 100 95 з ЗЕО ІЮО МО: 1, або 5ЕО ІО МО: 3, або 5ЕО ІО МО: 5, або 5ЕО

ІО МО: 7, або 5ЕО ІО МО: 9, або 5ЕО ІЮ МО: 11. Більше переважно, виділений полінуклеотид містить, складається з або складається по суті з послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95, 73 Уо, 74 90, 75 о, 78 Фо, 80 Фо, 85 90, 87 Фо, 88 о, 89 то, 90 то, 91 зо, 92 то, 93 то, 94 то, 95 95 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або 100 95 з БЕО ІЮ МО: 1, або 5ЕО ІЮ МО: 3, або 5ЕО ІЮО МО: 5, або 5ЕО ІЮ МО: 7, або 5ЕО ІЮ МО: 9, або 5ЕО ІЮО МО: 11.

Більше переважно, виділений полінуклеотид містить, складається з або складається по суті з послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 90 95, 91 95, 92 9, 93 9», 94 90, 95 Уь 96 90, 97 У, 98 Фо, 99 95 або 100 95 з БЕО ІЮО МО: 1.

Більше переважно, виділений полінуклеотид містить, складається з або складається по суті з послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95, 7З 965, 7490, 7595, 78 Фо, 80 Фо, 85 9, 87 Уо, 88 Фо, 89 95, 90 9о, 91 Фо, 92 95, 93 У, 94 90, 95 Фо 96 95, 97 Фо, 98 Фо, 99 95 або 100 95 з ЗЕО ІЮО МО: 3, або ЗЕО ІЮО МО: 5, або 5ЕО ІЮ МО: 7, або ЗЕО ІО МО: 9, або ЗЕО ІЮ МО: 11.

В іншому варіанті реалізації запропонований виділений полінуклеотид, що містить, складається з або складається по суті з полінуклеотидної послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 60 95 з БЕО ІЮО МО: 19, або 5ЗЕО ІЮ МО: 21, або 5ЕО ІЮ

МО: 23, за умови, що зазначений виділений полінуклеотид містить мутацію, що кодує стоп- кодон, у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у 5ЕО ІЮО МО: 19, або 5ЕО

ІО МО: 21, або 5ЕО ІЮ МО: 23.

Переважно, виділений полінуклеотид містить, складається з або складається по суті з послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 60 95, 61 96, 62 95, 63 95, 64 90, 65 9, 66 о, 67 о, 68 90, 69 90, 70 90, 75 Фо, 78 Фо, 80 9о, 85 95, 87 Фо, 88 9, 8995, 90 90, 91 95, 92 95, 9395, 94 95, 9595 96 95, 97 95, 9895, 99 95, 99,1 95, 99,2 95, 99,3 95, 99,4 95, 99,5 95, 99,6 95, 99,7 90, 99,8 95, 99,9 95 або 100 95 з БЕО ІО МО: 19, або 5ЕО ІЮ МО: 21, 60 або 5ЕО ІЮ МО: 23. Більше переважно, виділений полінуклеотид містить, складається з або складається по суті з послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 то, 73 то, 74 Зо, 75 б, 78 то, 80 то, 85 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 Фо, 94 95, 95 90 96 Фо, 97 95, 98 У, 99 95 або 100 95 з БЕО ІЮО МО: 19, або 5ЕО ІЮО МО: 21, або

ЗЕО І МО: 23.

В іншому варіанті здійснення запропонований полінуклеотид, що містить, складається з або складається по суті з полінуклеотиду зі значною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або суттєвою ідентичністю з 5ЕО ІЮ МО: 1, або 5БЕО ІЮ МО: 3, або 5ЕО ІЮ МО: 5, або 5ЕО ІО МО: 7, або 5ЕО ІЮО МО: 9, або 5ЕО ІО МО: 11.

В іншому варіанті реалізації запропонований полінуклеотид, що містить, складається з або складається по суті з полінуклеотиду із значною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або значною ідентичністю з 5ЕО ІЮО МО: 19, або 5БЕО ІЮО МО: 21, або 5ЕО ІО МО: 23, за умови, що зазначений виділений полінуклеотид містить мутацію, що кодує стоп-кодон, у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у ЗЕО ІЮ МО: 19, або 5ЕО ІЮ МО: 21, або 5ЕО ІО

МО: 23.

В іншому варіанті здійснення запропоновані варіанти полінуклеотиду, які характеризуються ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 60 95, 61 95, 62 95, 63 о, 64 95, 65 У, 66 бо, 67 95, 68 Фо, 69 Фо, 70 90, 75 о, 78 Уо, 80 90, 85 У, 87 Фо, 88 Уо, 89 Ус, 90 Фо, 91 90, 92 95, 93 Фо, 94 о, 95 95 96 95, 97 Фо, 98 Ус, 99 Фо, 99,1 95, 99,2 Фо, 99,3 95, 99,4 Фо, 99,5 95, 99,6 о, 99,7 95, 99,8 95 або 99,9 95 з послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 1, або 5ЕО ІЮ МО: 3, або 5ЕО ІЮО МО: 5, або 5ЕО ІЮО МО: 7, або 5ЕО ІО МО: 9, або 5ЕО ІО МО: 11. Переважно, запропоновані варіанти полінуклеотиду, які характеризуються ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 72 95, 73 90, 74 90, 75 95, 78 Ув, 80 95, 85 95, 87 Усю, 88 о, 89 95, 90 9, 91 Ус, 92 У, 93 95, 94 У, 95 Уо 96 Ус, 97 У, 98 90, 99 о, 99,1 95, 99,2 Фо, 99,3 Ус, 99,4 95, 99,5 95, 99,6 Фо, 99,7 У, 99,8 95 або 99,9 95 з послідовністю ЗЕО

ІО МО: 1, або ЗЕО ІЮ МО: 3, або 5ЕО ІО МО: 5, або 5ЕО ІО МО: 7, або ЗЕО ІЮ МО: 9, або ЗЕО ІЮ

МО: 11.

Переважно, запропоновані варіанти полінуклеотиду, які характеризуються ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 9495, 95 95 96 95, 97 У, 98 бо, 99 Фо, 99,1 95, 99,2 95, 99,3 У, 99,4 Фо, 99,5 95, 99,6 о, 99,7 Фо, 99,8 95 або 99,9 95 з послідовністю

ЗЕО ІЮО МО: 1.

Зо Переважно, запропоновані варіанти полінуклеотиду, які характеризуються ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 72 95, 73 о, 7490, 75905, 78 90, 80 95, 85 95, 87 95, 88 95, 8996, 90 96, 91 96, 9295, 93 95, 94 95, 95590 9695, 97 ув, 9895, 99 Ув, 99,1 Ув, 99,2 У, 99,3 95, 99,4 965, 99,5 95, 99,6 95, 99,7 У, 99,8 95 або 99,9 95 з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 3, або 5ЕО ІЮ

МО: 5, або ЗЕО ІЮ МО: 7, або ЗЕО ІЮ МО: 9, або ЗЕО ІО МО: 11.

В іншому варіанті реалізації запропоновані варіанти полінуклеотиду, які характеризуються ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 60 95, 61 95, 62 95, 63 о, 64 95, 65 У, 66 бо, 67 95, 68 Фо, 69 Фо, 70 90, 75 о, 78 Уо, 80 90, 85 У, 87 Фо, 88 Уо, 89 Ус, 90 Фо, 91 90, 92 95, 93 Фо, 94 о, 95 95 96 95, 97 Фо, 98 Ус, 99 Фо, 99,1 95, 99,2 Фо, 99,3 95, 99,4 Фо, 99,5 95, 99,6 о, 99,7 95, 99,8 95 або 99,9 95 з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 19, або 5ЕО ІЮО МО: 21, або 5ЕО ІО МО: 23, за умови, що зазначені варіанти полінуклеотиду містять мутацію, що кодує стоп-кодон, у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у ЗЕО ІЮ МО: 19, або 5ЕО ІЮ МО: 21, або 5ЕО ІО

МО: 23. Переважно, запропоновані варіанти полінуклеотиду, які характеризуються ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 72 95, 73 о, 7490, 75905, 78 90, 80 95, 85 95, 87 95, 88 95, 8996, 90 96, 91 96, 9295, 93 95, 94 95, 95590 9695, 97 ув, 9895, 99 Ув, 99,1 Ув, 99,2 У, 99,3 95, 99,4 965, 99,5 95, 99,6 95, 99,7 У, 99,8 95 або 99,9 95 з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 19, або 5ЕО ІОЮ

МО: 21, або 5ЕО ІО МО: 23, за умови, що зазначені варіанти полінуклеотиду містять мутацію, що кодує стоп-кодон, у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у ЗЕО ІЮ МО: 19, або ЗЕО ІО МО: 21, або 5ЕО ІЮО МО: 23. В іншому варіанті здійснення передбачені фрагменти

ЗЕО ІО МО: 1, або 5ЕО ІЮО МО: 3, або ЗЕО ІЮ МО: 5, або 5ЕО ІО МО: 7, або 5ЗЕО ІЮО МО:9, або

ЗЕО ІО МО:11 із суттєвою гомологією (тобто, схожістю послідовності) або суттєвою ідентичністю із зазначеними послідовностями, які мають щонайменше приблизно 60 95, 61 9, 62 9, 63 9, 64 Фо, 65 95, 66 Фо, 67 95, 68 У, 69 95, 70 У, 78 90, 75 У, 80 У, 85 У, 87 У, 88 У, 89 Ус, 90 У, 91 У, 92 чо, 93 95, 94 У, 95 95 96 Ус, 97 У, 98 У, 99 У, 99,1 У, 99,2 У, 99,3 Ус, 99,4 Ус, 99,5 Ус, 99,6 95, 99,7 У», 99,8 У, 99,9 95 або 100 95 ідентичність послідовності з відповідними фрагментами з ЗЕО

МО: 11.

В іншому варіанті реалізації запропоновані фрагменти 5ЕО ІЮ МО':1 зі значною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або значною ідентичністю із зазначеною послідовністю, які характеризуються ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 90 95, 91 9», 92 9», 93 9,

9495, 95965 9695, 97 95, 98 95, 99 90, 99,1 95, 99,2 95, 99,3 95, 99,4 95, 99,5 95, 99,6 95, 99,7 Фо, 99,8 9», 99,9 95 або 100 95 з відповідним фрагментом ЗЕО ІЮ МО: 1.

В іншому варіанті здійснення запропоновані фрагменти 5ЕО ІЮО МО: 3, або 5ЕО ІЮО МО: 5, або 5ЕБЕО ІЮ МО: 7, або 5ЕБЕО ІЮ МО: 9, або 5ЕО ІЮО МО: 11 із суттєвою гомологією (тобто, схожістю послідовності) або суттєвою ідентичністю із зазначеними послідовностями, які характеризуються ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 60 95, 61 9», 62 9», 63 9, 64 оо, 65 95, 66 95, 67 Фо, 68 90, 69 о, 70 90, 78 9о, 75 9Уо, 80 90, 85 Фо, 87 Фо, 88 9, 89 90, 90 Фо, 91 Фо, 92 96, 93 95, 94 95, 95 95 96 Фо, 97 90, 98 95, 99 Фо, 99,1 95, 99,2 95, 99,3 Уо, 99,4 90, 99,5 Уо, 99,6 95, 99,7 У», 99,8 Фо, 99,9 95 або 100 95 з відповідними фрагментами з 5ЕО ІЮО МО: 3, або 5ЕО ІЮО МО: 5, або ЗЕО ІЮ МО: 7, або ЗЕО ІЮ МО: 9, або ЗЕО ІЮ МО: 11.

Переважно, запропоновані фрагменти варіантів полінуклеотиду ЗЕО ІЮ МО: 1, або 5ЕО ІО

МО: 3, або 5ЕО ІЮО МО: 5, або 5ЕО ІЮО МО: 7, або 5ЕО ІЮО МО: 9, або 5ЕО ІЮО МО: 11 із значною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або значною ідентичністю із зазначеними послідовностями, які характеризуються ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 7290, 73 о, 74 о, 75 о, 78 Уо, 80 9о, 85 Фо, 87 9о, 88 9о, 89 Фо, 90 9, 91 о, 92 95, 93 Фо, 94 95, 95 о 96 96, 97 96, 98 96, 99 96, 99,1 96, 99,2 95, 99,3 96, 99,4 96, 99,5 95, 99,6 Уо, 99,7 У, 99,8 96 або 99,9 95 з відповідними фрагментами 5ЕО ІЮ МО: 1, або 5ЕО ІО МО: 3, або 5ЕО ІО МО: 5, або

ЗЕО ІЮ МО: 7, або 5ЕО ІЮО МО: 9, або 5ЕО ІЮО МО: 11.

Переважно, запропоновані фрагменти варіантів полінуклеотиду ЗЕО ІЮО МО: 1 зі значною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або значною ідентичністю із зазначеною послідовністю, які характеризуються ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 72 95, 7З ою, 74 95, 75 Фо, 78 9Уо, 80 9, 85 Уо, 87 Фо, 88 9о, 89 9о, 90 Фо, 91 90, 92 95, 93 90, 94 Фо, 95 90 96 о, 97 Зо, 98 9», 99 9, 99,1 У, 99,2 90, 99,3 90, 99,4 96, 99,5 90, 99,6 9, 99,7 Уо, 99,8 96 або 99,9 95 з відповідними фрагментами 5ЕО ІЮО МО: 1.

Переважно, запропоновані фрагменти варіантів полінуклеотиду 5ЕО ІЮО МО: 3, або 5ЕО ІЮ

МО: 5, або 5ЕО ІЮО МО: 7, або 5ЕО ІЮО МО: 9, або 5ЕО ІЮО МО: 11 із значною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або значною ідентичністю із зазначеними послідовностями, які характеризуються ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 72 95, 73 90, 74 90, 75 95, 78 9, 80 95, 85 Фо, 87 9о, 88 бо, 89 о, 90 Фо, 91 9, 92 90, 93 Фо, 94 95, 95 95 96 90, 97 о, 98 90, 99 Фо,

Зо 99,1 95, 99,2 95, 99,3 95, 99,4 95, 99,5 95, 99,6 95, 99,7 95, 99,8 956 або 99,995 з відповідними фрагментами 5ЕО ІЮО МО: 3, або 5ЕО ІЮ МО: 5, або 5ЕО ІЮ МО: 7, або 5ЕО ІЮ МО: 9, або 5ЕО

ІО МО: 11.

В іншому варіанті реалізації запропоновані фрагменти полінуклеотиду 5ЕО ІЮ МО: 19, або

ЗЕО ІЮО МО: 21, або 5ЕО ІО МО: 23 із значною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або значною ідентичністю із зазначеними послідовностями, які характеризуються ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 60 95, 61 95, 62 95, 63 95, 64 95, 65 95, 66 о, 67 95, 68 бо, 69 оо, 70 95, 78 Фо, 75 9Уо, 80 9, 85 Уо, 87 Фо, 88 9о, 89 9о, 90 Фо, 91 90, 92 95, 93 90, 94 Фо, 95 90 96 о, 97 Зо, 98 96, 99 96, 99,1 96, 99,2 9Уо, 99,3 У, 99,4 95, 99,5 96, 99,6 95, 99,7 Уо, 99,8 95, 99,9 95 або 100 95 з відповідними фрагментами 5ЕО ІЮО МО: 19, або 5ЕО ІЮО МО: 21, або 5ЕО ІЮ МО: 23, за умови, що зазначені фрагменти містять мутацію, що кодує стоп-кодон, у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у ЗЕО ІЮ МО: 19, або 5ЕО ІЮ МО: 21, або 5ЕО ІО

МО: 23. Переважно, запропоновані фрагменти варіантів полінуклеотиду 5ЕО ІЮ МО: 19, або

ЗЕО ІЮО МО: 21, або 5ЕО ІО МО: 23 зі значною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або значною ідентичністю із зазначеними послідовностями, які характеризуються ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 72 95, 73 о, 7490, 75905, 78 90, 80 95, 85 95, 87 95, 88 95, 8995, 90 90, 91 95, 92 95, 9395, 94 95, 9595 96 95, 97 95, 9895, 99 95, 99,1 95, 99,2 95, 99,3 95, 99,4 95, 99,5 95, 99,6 95, 99,7 У, 99,8 95 або 99,9 95 з відповідними фрагментами 5ЕО ІЮ МО: 19, або ЗЕО ІЮО МО: 21, або ЗЕО ІЮО МО: 23, за умови, що зазначені фрагменти містять мутацію, що кодує стоп-кодон, у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у 5ЕО ІЮ МО: 19, або 5ЕО ІО МО: 21, або 5ЕО ІЮО МО: 23.

В іншому варіанті здійснення запропоновані полінуклеотиди, що містять достатню або суттєву ступінь ідентичності або схожості з ЗЕО ІО МО: 1, або 5ЕО ІЮ МО: 3, або БЕО ІО МО: 5, або 5ЕО ІЮ МО: 7, або 5ЕО ІО МО: 9, або 5ЕО ІО МО: 11, які кодують поліпептид, що функціонує як аспарагінсинтетаза. Переважно, полінуклеотид або полінуклеотиди, що описані у даному документі, кодують білок з активністю аспарагінсинтетази, яка становить щонайменше приблизно 60 95, 70 95, 80 95, 90 95, 95 95, 96 95, 97 У, 98 95, 99 95 або 100 95 або більше від активності білка, що викладений у ЗЕО ІЮ МО: 2, або 5ЕО ІО МО: 4, або 5ЕО ІЮО МО: 6, або ЗЕО

ІО МО: 8, або ЗЕО ІЮ МО: 10, або 5ЕО ІЮ МО: 12. Щоб визначити, чи функціонує поліпептид як аспарагінсинтетаза, можна використовувати аналіз, що описаний у публікації Котадпі 5 Юауап 60 (2000) ) Адгс Роод Спет. Мау; 48(5):1692-6. В іншому варіанті реалізації запропоновані полінуклеотиди, що містять достатній або значний ступінь ідентичності або схожості з ЗЕО ІЮ

МО: 19, або 5ЕО ІО МО: 21, або 5ЕО ІО МО: 23, які кодують поліпептид, що функціонує як аспарагінсинтетаза, за умови, що зазначені полінуклеотиди містять мутацію, що кодує стоп- кодон, у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у ЗЕО ІЮ МО: 19, або ЗЕО

ІО МО: 21, або 5ЕО ІО МО: 23. Переважно, полінуклеотид або полінуклеотиди, що описані у даному документі, кодують білок з активністю аспарагінсинтетази, яка становить щонайменше приблизно 60 95, 70 95, 80 95, 90 95, 95 95, 96 95, 97 У, 98 95, 99 95 або 100 95 або більше від активності білка, що викладений у 5ЕО ІЮ МО: 19, або 5ЕО ІЮО МО: 21, або 5ЕО ІЮО МО: 23.

У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з БЕО ІЮО МО: 1, і 5ЗЕО ІЮ МО: 3, і ЗЕО ІЮ МО: 5, і ЗЕО ІЮ МО: 7.

У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 90 95 з БЕО ІЮО МО: 1.

У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з БЕО ІЮО МО: 3, і 5ЕО ІЮ МО: 5, і ЗЕО ІЮ МО: 7.

У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з ЗЕО ІЮ МО: 1, або 5ЕО ІЮ

МО: 3, або ЗЕО ІЮ МО: 5, або ЗЕО ІЮ МО: 7.

У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з ЗЕО ІЮ МО: 3, або 5ЕО ІЮ

Зо МО: 5, або ЗЕО ІЮ МО: 7.

У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з БЕО ІЮ МО: 1 і 5ЕО ІЮ МО: 3.

У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 9095 з 5ЕО ІО МО: 1 й ідентичністю послідовності щонайменше 72905 з 5БЕО ІЮО МО: 3. У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з БЕО

ІО МО: 5 і БЕО ІО МО: 7. У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з БЕО ІЮО МО: 1, і ЗЕО ІО

МО: 3, і ЗЕО ІО МО: 5 і/або ЗЕО ІО МО: 7. У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 90 95 з БЕО

ІО МО: 1 й ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з БЕО ІЮ МО: 3, і ЗЕО ІЮО МО: 5, і/або

ЗЕО ІЮ МО: 7. У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з 5ЕО ІЮ МО: 1 і/або 5ЕО ІЮ

МО: З, 5ЕО ІЮО МО: 5, ії 5ЕО ІЮ МО: 7. У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 90 95 з БЕО

ІО МО: 1 й/або ідентичністю послідовності щонайменше 72 956 з ЗЕО ІЮ МО: 3, і ЗЕО ІЮО МО: 5 і

ЗЕО ІЮО МО: 7.

У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 956 з БЕО ІЮ МО: 19, і ЗЕО ІЮ МО: 21, ії 5ЕО ІО МО: 23, за умови, що зазначені полінуклеотиди містять мутацію, що кодує стоп- кодон, у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у 5ЕО ІЮО МО: 19, або 5ЕО 60 ІО МО: 21, або ЗЕО ІЮ МО: 23.

У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з 5ЕО ІЮО МО: 19, або 5ЕО ІЮ

МО: 21, або 5ЕО ІО МО: 23, за умови, що зазначені полінуклеотиди містять мутацію, що кодує стоп-кодон, у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у 5ЕО ІО МО: 19, або

ЗЕО ІЮ МО: 21, або ЗЕО ІЮ МО: 23.

У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з БЕО ІЮ МО: 19 ії 5ЕО ІЮ МО: 21, за умови, що зазначені полінуклеотиди містять мутацію, що кодує стоп-кодон, у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у ЗЕО ІЮ МО: 19 ії ЗЕО ІЮ МО: 21.

У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з БЕО ІЮ МО: 21 ії 5ЕО ІЮ МО: 23, за умови, що зазначені полінуклеотиди містять мутацію, що кодує стоп-кодон, у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у ЗЕО ІЮ МО: 21 і 5ЕО ІЮ МО: 23.

У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 956 з БЕО ІЮ МО: 19, і ЗЕО ІЮ МО: 21 і/або ЗЕО ІО МО: 23, за умови, що зазначені полінуклеотиди містять мутацію, що кодує стоп- кодон, у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у ЗЕО ІЮ МО: 19, 5ЕО ІО

МО: 21 і 5ЕО І МО: 23.

У деяких варіантах реалізації модулюють експресію полінуклеотиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з ЗЕО ІЮ МО: 19, і/або 5ЕО ІЮ

МО: 21, ії ЗЕО ІЮ МО: 23, за умови, що зазначені полінуклеотиди містять мутацію, що кодує стоп- кодон, у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у ЗЕО ІЮ МО: 19, 5ЕО ІО

МО: 21 і 5ЕО І МО: 23.

Полінуклеотид, що описаний у даному документі, може включати в себе полімер

Зо нуклеотидів, який може бути немодифікованою або модифікованою дезоксирибонуклеїновою кислотою (ДНК) або рибонуклеїновою кислотою (РНК). Відповідно, полінуклеотид може бути, без обмеження, геномною ДНК, комплементарною ДНК (кДНК), ІРНК або антисенсовою РНК або їх фрагментом(фрагментами). Крім того, полінуклеотид може бути однонитковою або двонитковою ДНК, ДНК, яка є сумішшю однониткових і двониткових ділянок, гібридною молекулою, що містить ДНК і РНК, або гібридною молекулою із сумішшю однониткових і двониткових ділянок або їх фрагментом(фрагментами). Крім того, полінуклеотид може бути складений з триниткових ділянок, що містять ДНК, РНК або обидві, або їх фрагмент(и).

Полінуклеотид може містити одну або декілька модифікованих основ, таких як фосфоротіоати, і може являти собою пептидну нуклеїнову кислоту. Як правило, полінуклеотиди можуть бути зібрані з виділених або клонованих фрагментів кКДНК, геномної ДНК, олігонуклеотидів або окремих нуклеотидів, або комбінації вищепереліченого. Хоча полінуклеотидні послідовності, що описані у даному документі, представлені у вигляді послідовностей ДНК, послідовності включають в себе їх відповідні послідовності РНК та їх комплементарні (наприклад, повністю комплементарні) послідовності ДНК або РНК, в тому числі, їх зворотно комплементарні ланцюги.

Полінуклеотид, що описаний у даному документі, зазвичай містить фосфодіефірні зв'язки, хоча у деяких випадках включені полінуклеотидні аналоги, які можуть мати альтернативні основи, що містять, наприклад, фосфороамідатні, фосфоротіоатні, фосфородитіоатні або О- метилфосфороамідитні зв'язки; і пептидні полінуклеотидні кістяки та зв'язки. Інші аналоги полінуклеотидів включають в себе полінуклеотиди з позитивно зарядженими каркасами, неіїонними каркасами та безрибозними каркасами. Модифікації рибозофосфатного каркаса можна робити з цілого ряду причин, наприклад, для підвищення стабільності та періоду напівжиття таких молекул у фізіологічних середовищах або як зонди на біочипі. Можна одержувати суміші природних полінуклеотидів й аналогів; як альтернатива, можна одержувати суміші різних полінуклеотидних аналогів і суміші природних полінуклеотидів й аналогів.

Відома множина полінуклеотидних аналогів, включаючи, наприклад, фосфороамідатні, фосфоротіоатні, фосфородитіоатні або О-метилфосфороамідитні зв'язки і пептидні полінуклеотидні каркаси та зв'язки. Інші аналоги полінуклеотидів включають в себе полінуклеотиди з позитивно зарядженими каркасами, неїонними каркасами та безрибозними каркасами. Полінуклеотиди, що містять один або декілька карбоциклічних цукрів, також є включеними.

Інші аналоги включають в себе пептидні полінуклеотиди, які являють собою пептидні полінуклеотидні аналоги. Ці кістяки є головним чином неїонними в нейтральних умовах на відміну від високозарядженого фосфодіефірного каркаса полінуклеотидів, що зустрічаються у природі. Це може давати переваги. По-перше, пептидний полінуклеотидний кістяк може характеризуватися покращеною кінетикою гібридизації. Пептидні полінуклеотиди характеризуються більше значними змінами температури плавлення для невідповідних у порівнянні з парами основ, що ідеально співпадають. ДНК і РНК, як правило, проявляють зниження температури плавлення на 2-4 "С через внутрішню розбіжність. У випадку неіонного пептидного полінуклеотидного каркаса падіння становить ближче до 7-9 "С. Подібним чином, через їх неіонну природу, гібридизація основ, що приєднані до цих каркасів, є відносно нечутливою до концентрації солей. Крім того, пептидні полінуклеотиди можуть не руйнуватися або руйнуватися в меншій мірі клітинними ферментами, і, таким чином, можуть бути більше стабільними.

Серед застосувань розкритих полінуклеотидів та їх фрагментів знаходиться застосування фрагментів як зондів в аналізах із гібридизацією нуклеїнових кислот або праймерів для застосування в аналізах з ампліфікацією нуклеїнових кислот. Такі фрагменти зазвичай містять щонайменше приблизно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 або більше суміжних нуклеотидів із послідовності ДНК. В інших варіантах здійснення фрагмент ДНК містить щонайменше приблизно 10, 15, 20, 30, 40, 50 або 60 або більше суміжних нуклеотидів із послідовності ДНК. Таким чином, в одному аспекті також запропонований спосіб детектування полінуклеотиду, що кодує білок з активністю аспарагінсинтетази або кодує фермент аспарагінсинтетазу, причому зазначений спосіб включає застосування зондів або праймерів, або того й іншого. Ілюстративні праймери викладені у ЗЕО ІЮ МО: 13-16. Відповідно, наступний аспект відноситься до олігонуклеотидного праймера, що містить, складається з або складається по суті з нуклеотидної послідовності з ідентичністю послідовності щонайменше 60 95, 61 95, 62 Фо, 63 9, 64 Фо, 65 95, 66 У, 67 95, 68 У, 69 95, 70 У, 75 Зо, 80 У, 85 У, 87 У, 88 Ус, 89 У, 90 У, 91 ув, 92 Ув, 93 У, 94 Ув, 9595 96 У, 97 95, 98 9, 99 95, 99,1 95, 99,2 95, 99,3 95, 99,4 У, 99,5 9,

Зо 99,6 Фо, 99,7 У, 99,8 9о, 99,9 96 або 100 95 з БЕО ІО МО: 13, або 5ЕО ІО МО: 14, або 5ЕО ІО МО: 15, або ЗЕО ІЮ МО: 16. Також розкритий спосіб застосування даних праймерів для детектування полінуклеотиду, що кодує білок з активністю аспарагін синтетази, і варіанти застосування зазначеного білка.

Основні параметри, що впливають на вибір умов гібридизації для полінуклеотидів, і керівництво для розробки підходящих умов описані у публікації Затьгоок ., Е. Р. Рій5сп і Т.

Мапіаїіх (1989, МоІесшаг Сіопіпа: А І арогаїюгу Мапиаї, Со бргіпу Нагбог І арогаїогу Ргезз, Соїй

Зргіпд Нагрог, М.М.). Використовуючи дані про генетичний код у комбінації з амінокислотними послідовностями, що описані у даному документі, можна одержати набори вироджених олігонуклеотидів. Такі олігонуклеотиди застосовні як праймери, наприклад, у полімеразних ланцюгових реакціях (ПЛР), за допомогою яких виділяють й ампліфікують фрагменти ДНК. У певних варіантах здійснення вироджені праймери можна використовувати як зонди для генетичних бібліотек. Такі бібліотеки будуть включати в себе, крім іншого, бібліотеки кКДНК, геномні бібліотеки і навіть електронні бібліотеки міток експресованих послідовностей або ДНК.

Гомологічні послідовності, що ідентифіковані цим способом, будуть потім використані як зонди для ідентифікації гомологів послідовностей, що зазначені у даному документі.

Крім того, потенціал використання мають полінуклеотиди й олігонуклеотиди (наприклад, праймери або зонди), які гібридизуються в умовах зниженої жорсткості, як правило, в умовах середньої жорсткості, і звичайно, в умовах високої жорсткості З полінуклеотидом(полінуклеотидами), що описаний (описані) у даному документі. Основні параметри, що впливають на вибір умов гібридизації, і керівництво для розробки підходящих умов можуть з легкістю визначити середні фахівці у даній галузі техніки на основі, наприклад, довжини або складу основ полінуклеотиду. Один із шляхів досягнення умов середньої жорсткості включає використання розчину для попереднього відмивання, що містить 5х стандартний цитрат натрію, 0,5 96 додецилсульфату натрію, 1,0 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти (рН 8,0), буфера гібридизації з приблизно 50 95 формаміду, бх стандартного цитрату натрію та температури гібридизації приблизно 55 "С (або інших подібних розчинів гібридизації, таких що містять приблизно 50 95 формаміду з температурою гібридизації близько 42 "С) й умов відмивання з приблизно 60 "С із застосуванням 0,5х стандартного цитрату натрію, 0,1 95 додецилсульфату натрію. Як правило, умови високої жорсткості визначаються як умови 60 гібридизації, як описано вище, але з відмиванням при приблизно 68 "С, 0,2х стандартним цитратом натрію, 0,1 95 додецилсульфатом натрію. 55РЕ (1х 55РЕ являє собою 0,15 М хлориду натрію, 10 мМ фосфату натрію, 1,25 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти, рН 7,4) може бути замінений на стандартний цитрат натрію (їх стандартний цитрат натрію являє собою 0,15 М хлориду натрію та 15 мМ цитрату натрію) у буферах гібридизації та буферах відмивання; при цьому омивання виконують протягом 15 хвилин після завершення гібридизації. Слід розуміти, що температуру відмивання та концентрацію солей для відмивання можна скоригувати в міру необхідності для досягнення необхідного ступеня жорсткості із застосуванням основних принципів, які регулюють реакції гібридизації та стабільність подвійної спіралі, як це відомо фахівцям у даній галузі та додатково описано нижче (див., наприклад, затюоюгоок, у., Е. Р. Егії5сп и Т. Мапіаї5 (1989, МоїІесшаг Сіопіпуд: А Гарогаїгу Мапиаї, Соїа Зргіпд Нагброг І арогайюгу Ргевз5, бої Зргіпд Нагброг, М.М). При гібридизації полінуклеотиду з цільовим полінуклеотидом з невідомою послідовністю довжина гібриду передбачається такою, як у полінуклеотиду, що гібридизується. Коли гібридизують полінуклеотиди з відомими послідовностями, довжина гібриду може бути визначена шляхом вирівнювання послідовностей полінуклеотидів й ідентифікації ділянки або ділянок з оптимальною комплементарністю послідовності.

Температура гібридизації для гібридів, які, ймовірно, становитимуть менше ніж 50 пар основ у довжину, повинна бути на 5-10 "С менше, ніж температура плавлення гібриду, де температуру плавлення визначають відповідно до наступних рівнянь. Для гібридів, довжина яких становить менше 18 пар основ, температура плавлення (С) - 2(кількість основ А«Т)н4А(кількість основ

СС). Для гібридів, довжина яких становить більше 18 пар основ, температура плавлення (С)-81,5--16,6(0910 |Мач1)-0,41(95 (3-02)-(600/М), де М - кількість основ в гібриді та (Мат - концентрація іонів натрію у буфері для гібридизації (Мах| для 1х стандартного цитрату натрію - 0,165 М). Як правило, кожний такий полінуклеотид, що гібридизується, має довжину, яка становить щонайменше 25 95 (зазвичай, щонайменше 50 95, 60 95 або 70 95, і найбільше часто, щонайменше 80 95) від довжини полінуклеотиду, з яким він гібридизується, і характеризується щонайменше 60 95 ідентичністю послідовності (наприклад, щонайменше 70 95, 75 905, 80 Ор, 8596, 9095, 9595, 9695, 97905, 98905, 9996 або 10095) з полінуклеотидом, з яким він гібридизується.

Як буде зрозуміло фахівцю у даній галузі, лінійна ДНК має дві можливі орієнтації: напрямок

Зо 5-3 ії напрямок 3-5. Наприклад, якщо еталонна послідовність розташована у напрямку 5'-3, й якщо друга послідовність розташована у напрямку 5-3 в тій самій полінуклеотидній молекулі/ланцюгу, то еталонна послідовність та друга послідовність орієнтовані в одному напрямку або мають однакову орієнтацію. Як правило, послідовність промотору та ген, що представляє інтерес, який знаходиться під контролем даного промотору, розташовані в однаковій орієнтації. Однак якщо по відношенню до еталонної послідовності, що розташована у напрямку 5-3, друга послідовність розташована у напрямку 3-5 в тій самій полінуклеотидній молекулі/ланцюгу, тоді еталонна послідовність та друга послідовність орієнтовані в антисенсовому напрямку або мають антисенсову орієнтацію. Дві послідовності, що мають антисенсові орієнтації по відношенню одна до одної, можуть бути альтернативно описані як ті, що мають однакову орієнтацію, якщо еталонна послідовність (напрямок 5-3) та зворотна комплементарна послідовність еталонної послідовності (еталонної послідовності, що розташована в 5-3) розташовані в межах однієї полінуклеотидної молекули/ланцюга.

Послідовності, що викладені у даному документі, показані у напрямку 5-3".

Рекомбінантні конструкції, що запропоновані у даному документі, можуть бути використані для трансформації рослин або рослинних клітин для модулювання рівнів експресії й/або активності білка. Рекомбінантна полінуклеотидна конструкція може містити полінуклеотид, який кодує один або декілька полінуклеотидів, що описані у даному документі, які функціонально зв'язані з регуляторною ділянкою, що підходить для експресії поліпептиду. Таким чином, полінуклеотид може містити кодуючу послідовність, яка кодує поліпептид, що описаний у даному документі. Рослини або рослинні клітини, в яких модулюють рівні експресії й/або активності білка, можуть включати в себе мутантні рослини, рослини, що не зустрічаються у природі, трансгенні рослини, рослини або рослинні клітини, що створені людиною або одержані за допомогою методик генної інженерії. Переважно, рослина або рослинна клітина містить геном, який був змінений за допомогою стабільної інтеграції рекомбінантної ДНК. Рекомбінантна

ДНК включає в себе ДНК, яка була одержана за допомогою методик генної інженерії та сконструйована поза клітини, і включає в себе ДНК, що містить ДНК, що зустрічається у природі, або кКДНК, або синтетичну ДНК. Рослина може включати в себе рослину, що регенерована з клітини рослини, яка була спочатку трансформована, і рослини-потомство від більше пізніх поколінь або схрещувань трансформованої рослини. Переважно, модифікація змінює експресію або активність полінуклеотиду або поліпептиду, що описаний у даному документі, у порівнянні з контрольною рослиною.

Поліпептид, що кодується рекомбінантним полінуклеотидом, може бути нативним поліпептидом, або може бути гетерологічним по відношенню до клітини. У деяких випадках рекомбінантна конструкція містить полінуклеотид, що модулює експресію, який функціонально зв'язаний з регуляторною ділянкою. Приклади підходящих регуляторних ділянок описані у даному документі.

Також передбачені вектори, що містять рекомбінантні полінуклеотидні конструкції, такі як описані у даному документі. Підходящі основи для векторів включають в себе, наприклад, ті, які зазвичай використовують у даній галузі, такі як плазміди, віруси, штучні хромосоми, штучні хромосоми бактерій, штучні хромосоми дріжджів або штучні хромосоми бактеріофагів.

Підходящі вектори експресії включають в себе, без обмеження, плазміди та вірусні вектори, які одержані, наприклад, з бактеріофага, бакуловірусів і ретровірусів. Численні вектори та системи експресії є комерційно доступними. Вектори можуть включати в себе, наприклад, точки початку реплікації, ділянки зв'язування з ядерним матриксом або маркери. Маркерний ген може забезпечувати фенотип рослинної клітини, що селектується. Наприклад, маркер може надавати біоцидну стійкість, таку як стійкість до антибіотика (наприклад, до канаміцину, 5418, блеоміцину або гігроміцину), або до гербіциду (наприклад, до гліфосату, хлорсульфурону або фосфінотрицину). Крім того, вектор експресії може включати в себе послідовність мітки, яка призначена для полегшення маніпуляцій або виявлення (наприклад, очищення або локалізації) експресованого поліпептиду. Послідовності міток, такі як послідовності люциферази, бета- глюкуронідази, зеленого флуоресцентного білка, глутатіон 5-трансферази, полігістидину, с-тус або гемаглютиніну, як правило, експресуються у вигляді зливання з поліпептидом, що кодується. Такі мітки можуть бути вставлені у будь-якому місці в межах поліпептиду, в тому числі на карбоксильному або аміно-кінці.

Рослину або рослинну клітину можна трансформувати шляхом інтегрування рекомбінантного полінуклеотиду в її геном з одержанням стабільної трансформації. Рослина або рослинна клітина, що описана у даному документі, може бути стабільно трансформованою.

Стабільно трансформовані клітини, як правило, зберігають введений полінуклеотид з кожним

Зо клітинним поділом. Рослина або рослинна клітина також можуть бути тимчасово трансформованими, так що рекомбінантний полінуклеотид не інтегрується в їх геном.

Тимчасово трансформовані клітини, як правило, втрачають ввесь введений рекомбінантний полінуклеотид або певну його частину з кожним клітинним поділом, так що введений рекомбінантний полінуклеотид не можна виявити в дочірніх клітинах після достатнього числа клітинних поділів. Також розглядається використання редагування генома.

Існує ряд способів, доступних у цій галузі для трансформації клітини рослини, кожний з яких охоплений у даному документі, в тому числі, біолістика, методи із застосуванням генної гармати, Адгобасіегішт-опосередкована трансформація, опосередкована вірусним вектором трансформація й електропорація. Система Адгобасіегічшт для інтеграції чужорідної ДНК в хромосоми рослин була ретельно вивчена, модифікована та використана для генної інженерії рослин. Молекули депротеїнізованої рекомбінантної ДНК, що містять послідовності ДНК, які відповідають очищеному білку, що досліджується, функціонально зв'язані в сенсовій або антисенсовій орієнтації з регуляторними послідовностями, з'єднують 3 відповідними послідовностями Т-ДНК за допомогою звичайних способів. Дані молекули вводять у протопласти за допомогою методики на основі поліетиленгліколю або методики електропорації, кожна з яких є стандартною. Як альтернатива, такі вектори, що містять молекули рекомбінантної ДНК, які кодують очищений білок, що досліджується, вводять в живі клітини

Адгорасіегішт, які потім переносять ДНК в клітини рослини. Трансформацію за допомогою депротеїнізованої ДНК без супутніх векторних послідовностей Т-ДНК можна виконувати за допомогою зливання протопластів з ДНК-вмісними ліпосомами або за допомогою електропорації. Депротеїнізовану ДНК без супутніх векторних послідовностей Т-ДНК також можна використовувати для трансформації клітин за допомогою інертних, високошвидкісних мікрочастинок.

Якщо клітину або культивовану тканину використовують як реципієнтну тканину для трансформації, рослину можна, за бажанням, регенерувати з трансформованих культур за допомогою методів, що відомі фахівцям у даній галузі техніки.

Вибір регуляторних ділянок, які будуть включені у рекомбінантну конструкцію, залежить від декількох факторів, у тому числі без обмеження від ефективності, селективності, індуцибельності, бажаного рівня експресії та клітинної або тканинної переваги експресії. бо Звичайною справою для фахівця у даній галузі техніки є модулювання експресії кодуючої послідовності шляхом відповідного вибору та розміщення регуляторних ділянок по відношенню до кодуючої послідовності. Транскрипцію полінуклеотиду можна модулювати подібним чином.

Деякі підходящі регуляторні ділянки ініціюють транскрипцію виключно або переважно у певних типах клітин. Способи ідентифікації та встановлення характеристик регуляторних ділянок в геномній ДНК рослин добре відомі у даній галузі.

Приклади промоторів включають в себе тканиноспецифічні промотори, що розпізнаються тканиноспецифічними факторами, що присутні в різних типах тканин або клітин (наприклад, специфічні для кореня промотори, специфічні для пагона промотори, специфічні для ксилеми промотори), або присутні на різних стадіях розвитку, або присутні у відповідь на різні умови навколишнього середовища. Приклади промоторів включають в себе конститутивні промотори, які можуть активуватися у більшості типів клітин без необхідності у специфічних індукторах.

Приклади промоторів для контролю над утворенням поліпептиду РНКі включають в себе промотор 355 вірусу мозаїки цвітної капусти (Самм/355), 55), ОС5, ІїБ4, изр, 5ТІ 51, В33, по5 або промотори убіквітину або фазеоліну. Фахівці у даній галузі можуть створювати множину варіантів рекомбінантних промоторів.

Тканиноспецифічні промотори являють собою елементи керування транскрипцією, які є активними тільки у певних клітинах або тканинах у певний час в ході розвитку рослин, наприклад, у вегетативних тканинах або репродуктивних тканинах. Тканино специфічна експресія може бути переважною, наприклад, коли експресія полінуклеотидів у певних тканинах є переважною. Приклади тканиноспецифічних промоторів під керуванням розвитку включають в себе промотори, які можуть ініціювати транскрипцію тільки (або в основному тільки) у певних тканинах, таких як вегетативні тканини, наприклад, коріння або листя, або репродуктивні тканини, такі як плоди, насінні зачатки, насіння, пилок, тичинки, квіти або будь-яка ембріональна тканина. Промотори, що є специфічними для репродуктивних тканин, можуть бути, наприклад, специфічними для пильовика, специфічними для насінного зачатка, специфічними для зародка, специфічними для ендосперми, специфічними для інтегументу, специфічними для насіння та шкірки насіння, специфічними для пилку, специфічними для пелюстка, специфічними для чашолистка або їх комбінаціями.

Приклади специфічних для листа промоторів включають в себе промотор гена

Зо піруватортгофосфатдикінази (РРОК) з С4-рослини (маїсу), промотор сар-птіСав2 з маїсу, промотор споріднених тур генів з Агарідорбіз (пайапа (Айтпурб5), промотори генів рибулозобіфосфаткарбоксилази (КВС5) (наприклад, генів томату ЕВОСЗ 1, ЕВСО52 і ЕВС5ЗА, що експресовані в листках і саджанцях, що вирощені на світлі, КВС51 і КВСО52, що експресовані у плодах томату, або промотор гена рибулозобіросфаткарбоксилази, що експресований на високих рівнях майже виключно в клітинах мезофілу листових пластинок і листових пазух).

Приклади специфічних для старіння промоторів включають в себе промотор томату, що є активним під час дозрівання плодів, старіння й опадання листя, промотор гена, що кодує цистеїнову протеазу маїсу, промотор гена 82ЕЯ4 і промотор генів БАО.

У деяких варіантах реалізації промотор, що специфічний для старіння, є прийнятним.

Переважно, промотор може являти собою промотор Е4. Повідомлялося, що промотор Е4 є підходящим промотором, який специфічний для старіння, для тютюну із застосуванням 55 в якості репортерного гена у публікації Ріапі Мо! Віої. (2008) Маг 66(4):415-27. Інший ілюстративний промотор являє собою промотор 5АС12, що описаний у публікації Ріапі СеїЇ. (1999) дип;11(6):1073-80.

Промотори, що специфічні до пиляка, являють собою наступні приклади. Можна вибрати промотори для експресії переважно у корінні, що відомі фахівцям у даній галузі техніки.

Промотори для експресії переважно у насінні включають в себе як специфічні для насіння промотори (промотори, що є активними у процесі розвитку насіння, такі як промотори запасних білків насіння), так і промотори насіння, що проростає (промотори, що є активними під час проростання насіння). Такі переважні для насіння промотори включають в себе без обмеження промотор гена Сіт! (цитокінін-індукований сигнал); сС21981 (19 кДа зеїн кукурудзи); тіїр5 (міоїінозитол-1-фосфат синтаза); т2Е40-2, також відомий як 2т-40; писіс ії сеіА (целюлозо синтаза). Промотор гена гамма-зеїну являє собою специфічний для ендосперми промотор.

Промотор гена Сіор-ї являє собою специфічний для зародка промотор. Для дводольних рослин, промотори, що є специфічними для насіння, включають в себе без обмеження промотор гена бета-фазеоліну квасолі, гена напіну, гена Др-конгліциніну, гена лектину сої, гена круциферину та їм подібні. Для однодольних рослин промотори, що є специфічними для насіння, включають в себе без обмеження промотор гена 15 кДа зеїну, промотор гена 22 кДа бо зеїну, промотор гена 27 кДа зеїну, промотор гена д-зеїну, промотор гена 27 кДа гамма-зеїну

(такий як промотор 972ми64А, див. номер доступу 578780 з СепрапКк), промотор гена маху, промотор гена 5ПгипКеп 1, промотор гена 5пгипКеп 2, промотор гена глобуліну 1 (див. номер доступу 22344 в СепрапкК), промотор гена праг, промотор гена сіт!, промотори генів епа1 й епа2 кукурудзи, промотор гена пис1, промотор гена 2т40, промотор гена еер1 й єер2; промотор гена Іес1ї7, промотор гена тіоредоксину Н; промотор тіїр!5 гена, промотор гена РСМА2 і промотор гена 5ПгипКеп-2.

Приклади індуцибельних промоторів включають в себе промотори, що реагують на вплив патогенів, анаеробні умови, підвищену температуру, світло, посуху, низьку температуру або високу концентрацію солей. Патоген-індуцибельні промотори включають в себе промотори, що зв'язані з патогенезом білків (білки РК), які індукуються після інфікування патогеном (наприклад, білки РЕ, білки ЗАК, бета-1,3-глюканаза, хітиназа).

На додаток до рослинних промоторів можна одержати інші підходящі промотори бактеріального походження (наприклад, промотор гена октопін синтази, промотор гена нопалін синтази та інші промотори, що одержані з Тіплазмід), або їх можна одержати з вірусних промоторів (наприклад, 355 і 195 РНК промотори вірусу мозаїки цвітної капусти (Саму), конститутивні промотори вірусу тютюнової мозаїки, промотори 195 і 355 вірусу мозаїки цвітної капусти (Самм) або промотор 355 вірусу мозаїки норичнику). У деяких варіантах реалізації промотор вірусу мозаїки мірабіліс (Мігабійє Мозаїс Міги5, МММУ) є переважним. У деяких варіантах реалізації промотор 355 є переважним.

В іншому аспекті запропонований виділений поліпептид, що містить, складається з або складається по суті з поліпептидної послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 60 95 з будь-якою з поліпептидних послідовностей, що описані у даному документі, включаючи будь-які поліпептиди, які наведені у переліку послідовностей.

Переважно, виділений поліпептид містить, складається з або складається по суті з послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 60 95, 61 95, 62 Об, 6З 9, 64 Фо, 65 Фо, 66 90, 67 У, 68 Уо, 69 90, 70 Фо, 75 о, 76 90, 77 Чо, 78 Чо, 79 90, 80 90, 85 бю, 87 Уо, 88 95, 89 95, 90 95, 91 У, 92 95, 93 Уо, 94 Уо, 95 о 96 95, 97 Уо, 98 У, 99 Фо, 99,1 Фо, 99,2 95, 99,3 о, 99,4 95, 99,5 95, 99,6 95, 99,7 95, 99,8 95, 99,9 95 або 100 95 із зазначеними послідовностями.

В одному варіанті реалізації виділений поліпептид містить, складається з або складається по суті з послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 60 95, 61 95, 62 Фо, 63 Фо, 64 95, 65 У, 66 Уо, 67 90, 68 о, 69 Фо, 70 Уо, 75 о, 76 о, 77 90, 78 90, 79 Фо, 80 Уо, 8595, 87 Уо, 88 95, 89 95, 90 о, 91 95, 92 95, 93 90, 9495, 95 95 96 95, 97 У, 98 Уо, 99 У, 99,1 о, 99,2 95, 99,3 95, 99,4 9, 99,5 95, 99,6 У, 99,7 У, 99,8 95, 99,9 95 або 100 95 з 5БЕО ІЮ МО: 2, або

ЗЕО ІЮ МО: 4, або 5ЕО ІО МО: 6, або ЗЕО ІЮО МО: 8, або ЗЕО ІЮО МО: 10, або 5ЕО ІО МО: 12. В іншому варіанті реалізації виділений поліпептид містить, складається з або складається по суті з послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95, 79 965, 8095, 85 95, 87 95, 88 о, 89 95, 90 96, 91 95, 92 9ю, 93 У, 94 95, 9595 96 Ус, 97 90, 98 Фо, 99 о, 99,1 95, 99,2 95, 99,3 95, 99,4 Фо, 99,5 Ус, 99,6 Фо, 99,7 о, 99,8 Ус, 99,9 95 або 100 95 з ЗЕО ІЮ МО: 2, або 5ЕО ІЮО МО: 4, або 5ЕО ІО МО: 6, або ЗЕО ІО МО: 8, або ЗЕО ІЮ МО: 10, або 5ЕО ІО МО: 12.

В одному варіанті реалізації виділений поліпептид містить, складається з або складається по суті з послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 60 95, 61 95, 62 Фо, 63 Фо, 64 95, 65 У, 66 Уо, 67 90, 68 о, 69 Фо, 70 Уо, 75 о, 76 о, 77 90, 78 90, 79 Фо, 80 Уо, 8595, 87 Уо, 88 95, 89 95, 90 о, 91 95, 92 95, 93 90, 9495, 95 95 96 95, 97 У, 98 Уо, 99 У, 99,1 о, 99,2 95, 99,3 95, 99,4 90, 99,5 9, 99,6 Ус, 99,7 У, 99,8 95, 99,9 95 або 100 95 з ЗЕО ІЮ МО: 20, або

ЗЕО ІЮО МО: 22, або 5ЕО ІЮ МО: 24, за умови, що зазначений поліпептид містить стоп-кодон мутацію у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у ЗЕО ІЮ МО: 20, або 5ЕО

ІО МО: 22, або ЗЕО ІЮ МО: 24.

В іншому варіанті реалізації виділений поліпептид містить, складається з або складається по суті з послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95, 79 Уо, 80 Фо, 85 90, 87 Уо, 88 Ус, 89 Уо, 90 Фо, 91 90, 92 Фо, 93 9Уо, 94 ую, 95 Фо 96 У, 97 Уо, 98 Ус, 99 о, 99,1 95, 99,2 95, 99,3 9, 99,4 9, 99,5 У, 99,6 о, 99,7 95, 99,8 95, 99,9 95 або 100 95 з ЗЕО ІЮ МО: 20, або 5ЕО ІО МО: 22, або 5ЕО ІО МО: 24, за умови, що зазначений поліпептид містить стоп- кодон мутацію у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у 5ЕО ІЮ МО: 20, або 5ЗЕО ІО МО: 22, або 5ЕО ІЮ МО: 24.8 іншому варіанті реалізації запропонований варіант поліпептиду, що містить, складається з або складається по суті з амінокислотної послідовності, що кодується варіантом полінуклеотиду з ідентичністю послідовності щонайменше приблизно б6О 95, 61 Фо, 62 Фо, 63 90, 64 У, 65 Уо, 66 90, 67 Фо, 68 Фо, 69 о, 70 о, 75 о, 76.90, 77 90, 78 Фо, 79 о, 8095, 85 95, 87 95, 88 о, 89 95, 90 96, 91 95, 92 9ю, 93 У, 94 95, 9595 96 Ус, 97 90, 98 Фо, 99 о, 99,1 95, 99,2 95, 99,3 Ус, 99,4 95, 99,5 У, 99,6 о, 99,7 Ус, 99,8 95, 99,9 95 з ЗЕО ІЮ МО: 2, або ЗЕО 60 ІО МО: 4, або 5ЕО ІО МО: 6, або 5ЕО ІО МО: 8, або 5ЕО ІО МО: 10, або 5ЕО ІО МО: 12.

В іншому варіанті реалізації запропонований варіант поліпептиду, що містить, складається з або складається по суті з амінокислотної послідовності, що кодується варіантом полінуклеотиду з ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 60 95, 61 95, 62 95, 63 Зо, 64 о, 65 Ус, 66 95, 67 95, 68 Фо, 69 Фо, 70 90, 7590, 76 Уо, 77 Уо, 78 Чо, 79 Фо, 80 Уо, 85 Ус, 87 Фо, 88 90, 89 95, 90 Фо, 91 о, 92 95, 93 У, 94 Фо, 95 95 96 Фо, 97 90, 98 У, 99 Уо, 99,1 95, 99,2 95, 99,3 Фо, 99,4 Фо, 99,5 Зо, 99,6 90, 99,7 95, 99,8 95, 99,9 956 з ЗЕО ІЮ МО: 20, або ЗЕО ІО МО: 22, або 5ЕО ІО МО: 24, за умови, що зазначений поліпептид містить стоп-кодон мутацію у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у ЗЕО ІО МО: 20, або 5ЕО ІО МО: 22, або 5ЕО ІЮ МО: 24.В іншому варіанті реалізації запропоновані фрагменти поліпептиду 5ЕО ІЮО МО: 2, або 5ЕО ІЮ МО: 4, або ЗЕО ІЮ

МО: 6, або 5ЕО ІЮО МО: 8, або 5ЕО ІЮ МО: 10, або 5ЕО ІО МО: 12 або фрагменти 5ЕО ІО МО: 2, або ЗЕО ІЮ МО: 4, або ЗЕО ІЮ МО: 6, або 5ЕО ІО МО: 8, або 5ЕО ІО МО: 10, або 5ЕО ІО МО: 12, які характеризуються ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 60 95, 61 95, 62 Об, 6З 9, 64 Фо, 65 Фо, 66 90, 67 У, 68 Уо, 69 90, 70 Фо, 75 о, 76 90, 77 Чо, 78 Чо, 79 90, 80 90, 85 бю, 87 Уо, 88 95, 89 У, 90 У, 91 95, 92 ую, 93 У, 94 95, 95 Уо, 96 У, 97 Уо, 98 Фо, 99 90, 99,1 90, 99,2 У, 99,3 о, 99,4 95, 99,5 90, 99,6 У, 99,7 95, 99,8 Ус, 99,9 95 або 100 95 з відповідними фрагментами 5ЕО ІЮ

МО: 2, або 5ЕО ІЮО МО: 4, або 5ЕО ІЮ МО: 6, або ЗЕО ІО МО: 8, або 5ЕО ІЮ МО: 10, або 5ЕО ІЮ

МО: 12.

В іншому варіанті реалізації запропоновані фрагменти поліпептиду ЗЕО ІЮ МО: 20, або 5ЗЕО

ІО МО: 22, або 5ЗЕО ІО МО: 24 або фрагменти ЗЕО ІО МО: 20, або 5ЕО ІЮО МО: 22, або 5ЕО ІОЮ

МО: 24, які характеризуються ідентичністю послідовності щонайменше приблизно 60 95, 61 Об, б2 95, 63 Фо, 64 Фо, 65 90, 66 У, 67 Уо, 68 90, 69 Фо, 70 Фо, 75 о, 76 У, 77 Чо, 78 90, 79 90, 80 Фо, 85 о, 87 95, 88 У, 89 95, 90 Фо, 91 95, 92 Фо, 93 90, 94 Фо, 95 90, 96 Уо, 97 У, 98 Зо, 99 У, 99,1 Зо, 99,2 о, 99,3 95, 99,4 95, 99,5 95, 99,6 У, 99,7 9Уо, 99,8 95, 99,9 95 або 100 95 з відповідними фрагментами

ЗЕО ІЮ МО: 20, або 5ЕО ІЮО МО: 22, або 5ЕО ІЮО МО: 24, за умови, що зазначений поліпептид містить стоп-кодон мутацію у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у 5БЕО

ІО МО: 20, або 5ЕО ІЮО МО: 22, або 5ЕО ІО МО: 24.У деяких варіантах реалізації модулюють активність поліпептиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з

ЗЕО ІЮО МО: 2, або 5ЕО ІЮО МО: 4, або 5ЕО ІЮО МО: 6, або 5ЕО ІЮ МО: 8. У деяких варіантах реалізації модулюють активність поліпептиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з БЕО ІЮО МО: 2, і ЗЕОІЮО МО: 4, і 5ЕОІЮО МО: 6, ії 5ЕО ІЮ МО: 8. У деяких варіантах реалізації модулюють активність поліпептиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 7895 3 5БО ІО МО: 2 і 5ЕБЕО ІЮО МО: 4. У деяких варіантах реалізації модулюють активність поліпептиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 7895 3 БО ІО МО: б і 5ЕБО ІЮО МО: 8. У деяких варіантах реалізації активність поліпептиду, що містить, складається з або по складається суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з БЕО ІЮ МО: 2, і БЕО ІЮО МО: 4, і ЗЕО ІЮО МО: 6, і/або ЗЕО ІО МО: 8. У деяких варіантах реалізації модулюють активність поліпептиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з БЕО ІЮО МО: 2, і/або ЗЕО ІЮ МО: 4, і ЗЕО ІЮ МО: б, ії 5ЕОІЮ МО: 8.

У деяких варіантах реалізації модулюють активність поліпептиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з БЕО ІЮО МО: 20, або 5ЗЕО ІЮ МО: 22, або 5ЕО ІЮ

МО: 24, за умови, що зазначений поліпептид містить стоп-кодон мутацію у положенні, яке

БО еквівалентне положенню, що представлене у ЗЕО ІЮ МО: 20, або 5ЕО ІЮ МО: 22, або 5ЕО ІО

МО: 24.

У деяких варіантах реалізації модулюють активність поліпептиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з БЕО ІЮО МО: 20, і БЕО ІЮО МО: 22, і БЕО ІЮ МО: 24, за умови, що зазначений поліпептид містить стоп-кодон мутацію у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у 5ЕО ІЮ МО: 20, і БЕО ІЮО МО: 22, і 5ЕО ІЮ МО: 24.

У деяких варіантах реалізації модулюють активність поліпептиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з БЕО ІЮ МО: 20 ії 5БЕО ІЮО МО: 22, за умови, що зазначений поліпептид містить стоп-кодон мутацію у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у БЕО ІЮ МО: 20 і БЕО ІО МО: 22.

У деяких варіантах реалізації модулюють активність поліпептиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з БЕО ІЮО МО: 22 і 5ЕО ІЮО МО: 24, за умови, що зазначений поліпептид містить стоп-кодон мутацію у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у БЕО ІЮ МО: 22 і БЕО ІО МО: 24.

У деяких варіантах реалізації модулюють активність поліпептиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з БЕО ІЮ МО: 20 ії 5ЕО ІЮО МО: 24, за умови, що зазначений поліпептид містить стоп-кодон мутацію у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у БЕО ІЮ МО: 20 і БЕО ІО МО: 24.

У деяких варіантах реалізації модулюють активність поліпептиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з 5ЕО ІЮО МО: 20, і 5ЕО ІЮО МО: 22, і/або 5ЕО ІЮ

МО: 24, за умови, що зазначений поліпептид містить стоп-кодон мутацію у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у 5ЕО ІЮО МО: 20, і БЕО ІЮО МО: 22, і/або 5ЕО ІЮ МО: 24.

У деяких варіантах реалізації модулюють активність поліпептиду, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з 5ЕО ІЮО МО: 20, і/або 5ЕО ІЮО МО: 22, і 5ЕО ІЮ

МО: 24, за умови, що зазначений поліпептид містить стоп-кодон мутацію у положенні, яке еквівалентне положенню, що представлене у 5ЕО ІЮ МО: 20, і/або 5ЕО ІО МО: 22, і ЗЕО І МО: 24.Поліпептид може містити фрагменти послідовностей, які характеризуються достатнім або значним ступенем ідентичності або схожості для функціонування як аспарагінсинтетаза.

Фрагменти поліпептиду або поліпептидів, зазвичай, зберігають деякий ступінь активності або повну активність повнорозмірної послідовності - наприклад, щонайменше приблизно 95 95, 96 9, 97 У, 98 У, 99 У, 99,1 95, 99,2 У, 99,3 У, 99,4 Ус, 99,5 У, 99,6 95, 99,7 У, 99,8 95, 99,9 Уо або 100 95 активності.

Як розглядається у даному документі, поліпептиди також включають в себе мутантів, що одержані за рахунок введення будь-якого типу змін (наприклад, вставок, делецій або замін амінокислот, змін у сайтах глікозилювання, змін, які впливають на рефолдинг або ізомеризацію, тривимірні структури або стани самоасоціації), за умови, що зазначені мутанти все ще зберігають деякий ступінь або повну свою функцію або активність як аспарагінсинтетаза.

Переважно, функцію або активність як аспарагінсинтетаза модулюють, знижують або інгібують.

Переважно, функцію або активність як аспарагінсинтетаза інгібують так, що активність аспарагінсинтетази стає невиявленою.

Поліпептиди включають в себе варіанти, які одержані шляхом введення будь-якого типу альтерацій (наприклад, вставлення, делеції або заміни амінокислот, зміни рівнів глікозилювання, зміни, які впливають на рефолдинг або ізомеризацію, тривимірні структури або стани самоасоціації), які можуть бути навмисно сконструйовані або легко виділені. Варіант може мати альтерації, які роблять зміну, що мовчить, і призводять в результаті до утворення функціонально еквівалентного білка. Навмисні амінокислотні заміни можна здійснювати, виходячи зі схожості полярності, заряду, розчинності, гідрофобності, гідрофільності й амфіпатичної природи залишків за умови, що вторинна активність по відношенню до зв'язування речовини зберігається. Наприклад, негативно заряджені амінокислоти включають в себе аспарагінову кислоту та глутамінову кислоту, позитивно заряджені амінокислоти включають в себе лізин й аргінін, й амінокислоти з незарядженими полярними кінцевими групами з подібними значеннями гідрофільності включають в себе лейцин, ізолейцин, валін, гліцин, аланін, аспарагін, глутамін, серин, треонін, фенілаланін і тирозин. Консервативні заміни можна здійснювати, наприклад, згідно з наведеною нижче таблицею. Амінокислоти в одному і тому самому блоці в другому стовпці та переважно в одному і тому самому рядку в третьому стовпці можна замінювати одну на іншу:

АРОМАТИЧНІ (| 77777771 | нівРпетрту:/З

Поліпептид може бути зрілим білком або незрілим білком, або білком, одержаним із незрілого білка. Поліпептиди можуть бути у лінійній формі або циклізованими з використанням відомих способів. Поліпептиди, зазвичай, містять щонайменше 10, щонайменше 20, щонайменше 30, або щонайменше 40, або щонайменше 50, або щонайменше 100, або щонайменше 200, або щонайменше 300, або щонайменше 400, або щонайменше 500, або щонайменше 600 безперервних амінокислот.

Також розкритий поліпептид, що кодується 5ЕО ІЮ МО: 2, або 5ЕО ІО МО: 4, або 5ЕО ІО МО: б, або 5ЕО ІО МО: 8, або 5ЕО ІО МО: 10, або 5ЕО ІО МО: 12, або 5ЕО ІЮО МО: 20, або 5ЕО ІЮ

МО: 22, або 5ЕО ІЮО МО: 24, яка характеризується ідентичністю послідовності 100 95 із зазначеними послідовностями, або поліпептид, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, яка викладена в ЗЕО ІЮО МО: 2, або 5ЕО ІО МО: 4, або 5ЕО ІО МО: 6, або

ЗЕО ІЮ МО: 8, або 5ЗЕО ІЮО МО: 10, або 5ЕО ІЮ МО: 12, або ЗЕО ІО МО: 20, або 5ЕО ІЮ МО: 22, або 5ЕО ІЮО МО: 24.

Поліпептид можна одержати шляхом культивування трансформованих або рекомбінантних клітин-господарів в умовах культивування, що є підходящими для експресії поліпептиду.

Одержаний експресований поліпептид потім можна очистити з такої культури за допомогою відомих способів очищення. Очищення поліпептиду може включати в себе використання афінної колонки, що містить засоби, які з'єднуються з поліпептидом; одну або декілька стадій з використанням колонки з такими афінними смолами; одну або декілька стадій за участю хроматографії з гідрофобною взаємодією або імунноафінну хроматографію. Як альтернатива, поліпептид може бути експресованим у формі, яка буде полегшувати очищення. Наприклад, він може бути експресований у вигляді поліпептиду злиття, наприклад, мальтозозв'язуючим поліпептидом, глутатіон-5-трансферазою, гістидиновою міткою або тіоредоксином. Набори для експресії й очищення поліпептидів злиття є комерційно доступними. Поліпептид можна мітити епітопом і потім очищувати з використанням специфічного антитіла до такого епітопу. Одну або декілька стадій рідинної хроматографії, такої як звернено-фазова високоефективна рідинна хроматографія, можна використовувати для додаткового очищення поліпептиду. Деякі або всі з

Зо вищезазначених стадій очищення у різних комбінаціях можна використовувати для одержання практично гомогенного рекомбінантного поліпептиду. Очищений таким чином поліпептид може бути практично вільним від інших поліпептидів і визначений у даному документі як "практично очищений поліпептид"; такі очищені поліпептиди включають поліпептиди, фрагменти, варіанти тощо. Експресію, виділення й очищення поліпептидів і фрагментів можна виконувати за допомогою будь-якої підходящої методики, в тому числі, крім іншого, способами, що описані у даному документі.

Крім того, можна використовувати афінну колонку, наприклад, з моноклональним антитілом, що створене проти поліпептидів, для афінного очищування експресованих поліпептидів. Ці поліпептиди можна видаляти з афінної колонки за допомогою загальноприйнятих методик, наприклад, в елюючому буфері з високим вмістом солей з наступним діалізом у буфері з низьким вмістом солей для використання, або за допомогою зміни рН або інших компонентів у залежності від афінної матриці, що використовується, або шляхом конкурентного видалення за допомогою природного субстрату афінного фрагмента.

Розкриті виділені або практично очищені полінуклеотиди або композиції білків. "Виділений" або "очищений" полінуклеотид або білок, або його біологічно активна частина практично або, по суті, не містить компоненти, які зазвичай супроводжують полінуклеотид або білок або взаємодіють з ними при знаходженні в його природному оточенні. Таким чином, виділений або очищений полінуклеотид або білок по суті не містить інший клітинний матеріал або культуральне середовище при одержанні за допомогою методик рекомбінації, або по суті не містить хімічних сполук-попередників або інших хімічних сполук при одержанні шляхом хімічного синтезу. В оптимальному випадку "виділений" полінуклеотид не містить послідовностей (оптимально, білок-кодуючих послідовностей), які у природних умовах фланкують полінуклеотид (наприклад, послідовностей, що розташовані на 5'- і 3'і-кінцях полінуклеотиду) в геномній ДНК організму, з якого одержаний полінуклеотид. Наприклад, у різних варіантах реалізації виділений полінуклеотид може містити менше приблизно 5 т.о., 4 т.о., З т.0о., 2 т.0., 1 т.о., 0,5 т.о. або 0,1 т.о. нуклеотидної послідовності, яка у природних умовах фланкує полінуклеотид у геномній ДНК клітини, з якої одержаний полінуклеотид. Білок, який практично не містить клітинний матеріал, включає препарати білка, що характеризується вмістом контамінуючого білка, що становить менше приблизно 30 95, 2095, 10 95, 5 90 або 1 95 (з розрахунку на суху масу).

Поліпептид можна також одержувати за допомогою відомих загальноприйнятих методик хімічного синтезу. Способи конструювання поліпептидів або їх фрагментів способами синтезу відомі фахівцям у даній галузі. Синтетично сконструйовані поліпептидні послідовності завдяки спільним первинним, вторинним або третинним структурним, або конформаційним характеристикам з нативними поліпептидами можуть мати спільні з ними біологічні властивості, включаючи біологічну активність.

Відмінності у генетичному фоні можна виявити за фенотиповими відмінностями або за допомогою методик молекулярної біології, що відомі у даній галузі, таких як секвенування нуклеїнових кислот, визначення наявності або відсутності генетичних маркерів (наприклад, маркерів мікросателітної РНК).

Також передбачені антитіла, які є імунореактивними по відношенню до поліпептидів, описаних у даному документі. Поліпептиди, фрагменти, варіанти, поліпептиди злиття та їм подібні, що викладені у даному документі, можна використовувати як "імуногени" в одержанні антитіл, які є імунореактивними по відношенню до них. Такі антитіла можуть специфічно пов'язуватися 3 поліпептидом через антигензв'язуючі сайти антитіла. Антитілами, що специфічно зв'язуються, є такі антитіла, які будуть специфічно розпізнавати поліпептид, гомологи та варіанти і зв'язуватися з ними, а не з іншими молекулами. В одному варіанті здійснення антитіла є специфічними для поліпептидів, що мають амінокислотну послідовність, яка викладена у даному документі, і не взаємодіють перехресно з іншими поліпептидами.

Більше конкретно, поліпептиди, фрагменти, варіанти, поліпептиди злиття та їм подібні містять антигенні детермінанти або епітопи, які викликають утворення антитіл. Дані антигенні детермінанти або епітопи можуть бути лінійними або конформаційними (переривчастими).

Лінійні епітопи складаються з одного відрізка амінокислот поліпептиду, тоді як конформаційні або переривчасті епітопи складаються з амінокислотних частин із різних ділянок поліпептидного ланцюга, які були наведені до безпосередньої близкості при згортанні поліпептиду. Епітопи можна ідентифікувати будь-якими способами, що відомі у даній галузі. Крім того, епітопи з поліпептидів можна використовувати як реагенти для дослідження в аналізах і для очищення антитіл, які специфічно зв'язуються, з речовин, таких як поліклональні сироватки або супернатанти з культивованих гібридів. Такі епітопи або їх варіанти можна одержувати з використанням методик, що відомі у даній галузі, наприклад, шляхом твердофазного синтезу, хімічного або ферментативного розщеплення поліпептиду, або за допомогою технології рекомбінантної ДНК.

Як поліклональні, так і моноклональні антитіла до поліпептидів можна одержувати за допомогою загальноприйнятих методик. Клітинні лінії гібридів, які продукують моноклональні антитіла, що є специфічними для поліпептидів, також розглядаються у даному документі. Такі гібридоми можна одержувати й ідентифікувати за допомогою загальновідомих методик. Для одержання антитіл, різних тварин-господарів можна імунізувати шляхом введення поліпептиду, його фрагмента, варіанта або мутантів. Наприклад, такі тварини-господарі можуть включати, крім іншого, кроликів, мишей та пацюків. Різні ад'юванти можна використовувати для підвищення імунологічної відповіді. В залежності від виду господаря такі ад'юванти включають, крім іншого, ад'юванти Фрейнда (повні та неповні), мінеральні гелі, такі як гідроксид алюмінію, поверхнево-активні речовини, такі як лізолецитин, плюронілові поліоли, поліаніони, пептиди, олійні емульсії, гемоціанін лімфи равлика, динітрофенол і потенційно придатні ад'юванти людини, такі як ВСО (бацила Кальметта-Герена) та Согуперасієгїцт раг/лит. Моноклональні антитіла можна виділяти за допомогою загальноприйнятих методик. Такі моноклональні антитіла можуть бути імуноглобулінами будь-якого класу, в тому числі дес, ДМ, ЧЕ, ІдА, дО і будь-якого їх підкласу.

Антитіла можна також використовувати в аналізах для виявлення присутності поліпептидів або фрагментів або іп міо, або іп мімо. Антитіла можна також використовувати для очищення поліпептидів або фрагментів за допомогою імуноафінної хроматографії.

Також розкриті фрагменти полінуклеотидів і поліпептидів, що кодуються зазначеними полінуклеотидами. Фрагменти полінуклеотиду можуть кодувати фрагменти білка, які зберігають бо біологічну активність нативного білка. Як альтернатива, фрагменти полінуклеотиду, що застосовані як зонди для гібридизації або ПЛР-праймерів, зазвичай, не кодують фрагмент білка, що зберігає біологічну активність. Крім того, фрагменти розкритих нуклеотидних послідовностей включають в себе такі фрагменти, які можуть бути зібрані у рекомбінантні конструкції, як описано у даному документі. Фрагменти полінуклеотидної послідовності можуть варіювати від щонайменше приблизно 25 нуклеотидів, приблизно 50 нуклеотидів, приблизно 75 нуклеотидів, приблизно 100 нуклеотидів, приблизно 150 нуклеотидів, приблизно 200 нуклеотидів, приблизно 250 нуклеотидів, приблизно 300 нуклеотидів, приблизно 400 нуклеотидів, приблизно 500 нуклеотидів, приблизно 600 нуклеотидів, приблизно 700 нуклеотидів, приблизно 800 нуклеотидів, приблизно 900 нуклеотидів, приблизно 1000 нуклеотидів, приблизно 1100 нуклеотидів, приблизно 1200 нуклеотидів, приблизно 1300 нуклеотидів або приблизно 1500 нуклеотидів, приблизно 2000 нуклеотидів, приблизно 3000 нуклеотидів, приблизно 4000 нуклеотидів, приблизно 5000 нуклеотидів, приблизно 6000 нуклеотидів, приблизно 7000 нуклеотидів, приблизно 8000 нуклеотидів, приблизно 9000 нуклеотидів, приблизно 10000 нуклеотидів, приблизно 15000 нуклеотидів, приблизно 20000 нуклеотидів і до повнорозмірного полінуклеотиду, що кодує поліпептиди, що описані у даному документі. Фрагменти поліпептидної послідовності можуть варіювати від щонайменше приблизно 25 амінокислот, приблизно 50 амінокислот, приблизно 75 амінокислот, приблизно 100 амінокислот, приблизно 150 амінокислот, приблизно 200 амінокислот, приблизно 250 амінокислот, приблизно 300 амінокислот, приблизно 400 амінокислот, приблизно 500 амінокислот, приблизно 600 амінокислот і до повнорозмірного поліпептиду, що описаний у даному документі.

Слід розуміти, що зниження експресії або активності аспарагін синтетази або аспарагін синтетаз, що описані у даній заявці, можна досягти різними способами. У деяких варіантах реалізації зниження експресії аспарагін синтетази або аспарагін синтетаз можна здійснити на геномному рівні та/або на рівні транскрипту із застосуванням множини молекул, які перешкоджають транскрипції та/або трансляції, включаючи, без обмеження, молекули антисенсової, міРНК, рибозиму або дезоксирибозиму. Також можна використовувати вбудовування однієї або декількох мутацій у щонайменше один ген, включаючи делеції, вставки, сайт-специфічні мутації, нуклеази "цинкового пальця" та т. п. Згідно з іншими варіантами реалізації експресію можна заїінгібувати на рівні білка із застосуванням антагоністів

Зо або ферментів, які розщеплюють поліпептид, і т. п.

В одному аспекті описана мутантна рослина або частина зазначеної рослини, що містить щонайменше одну мутацію та (ї) полінуклеотид, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагін синтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з БЕО ІЮО МО: 1, або 5ЕО ІЮ МО: 3, або 5ЕО ІЮО МО: 5, або 5ЗЕО

ІО МО: 7; (ії) поліпептид, що кодується полінуклеотидом, який описаний в (і); (ії) поліпептид, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагін синтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з БЕО ІЮО МО: 2, або 5ЕО ІЮ

МО: 4, або ЗЕО ІЮ МО: 6, або 5ЕО ІЮ МО: 8; або (ім) конструкцію, вектор або вектор експресії, що містить виділений полінуклеотид, який викладений в (ї), причому щонайменше одна мутація знижує експресію або активність аспарагін синтетази у порівнянні з контрольною рослиною, що не містить щонайменше одну мутацію. В іншому аспекті описана мутантна рослина або частина зазначеної рослини, що містить щонайменше одну мутацію та (і)полінуклеотид, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагін синтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 9095 з ЗЕБЕО І МО: 1 або ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з ЗЕО ІЮ МО: 3, або 5ЕО ІЮ МО: 5, або 5ЕО ІО

МО: 7; (ії) поліпептид, що кодується полінуклеотидом, який описаний в (і); (ії) поліпептид, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагін синтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з БЕО ІЮО МО: 2, або 5ЕО ІЮ

МО: 4, або ЗЕО ІЮ МО: 6, або 5ЕО ІЮ МО: 8; або (ім) конструкцію, вектор або вектор експресії, що містить виділений полінуклеотид, який викладений в (і), причому щонайменше одна мутація знижує експресію або активність аспарагін синтетази у порівнянні з контрольною рослиною, що не містить щонайменше одну мутацію.

Рослина або клітина рослини внаслідок цього може містити одну або декілька мутацій у

МАБМ1-5 (5ЕО ІО МО: 1) і/або МАБМ1-Т (5ЕО ІО МО: 3), або МАБМЗ3-5 (ЗЕО ІЮ МО: 9), і/або

МАБМЗ3-ЇТ (5ЕО ІЮО МО: 11), або МАБМ5-5 (ЗЕО ІЮ МО: 5), або МАБМ5-Т (5ЕО ІО МО: 7), причому зазначена мутація призводить до зниження експресії або зниження функції зазначеного гена або білка, що кодується зазначеним геном. Рослина або клітина рослини може містити одну або декілька мутацій в МАБМ1-5(ЗЕО ІЮ МО: 1) або МІА5М1-Т (5ЕО ІО МО: 3), або

МАБМ5Ь-5(5ЕО ІО МО: 5), або МІА5М5-Т (ЗЕО ІЮ МО: 7), як описано, причому зазначена мутація 60 призводить до зниження експресії або зниження функції зазначеного гена або білка, що кодується зазначеним геном. Рослина або клітина рослини може містити одну або декілька мутацій (наприклад, нонсенс-мутації або т. п., як описано у даному документі) в МІА5М1-5(5ЕО

ІО МО: 1) ї МІАЗМ1-Т (ЗЕО ІЮ МО: 3) або МІАД5М5-5 (5ЕО ІО МО: 5) і МІА5М5-Т (ЗЕО ІЮ МО: 7), як описано, причому зазначена мутація призводить до зниження експресії або зниження функції зазначеного гена або білка, що кодується зазначеним геном. Експресію або функцію мутанта або мутантів можна модулювати, інгібувати або знижувати. Крім однієї або декількох мутацій, що описані у даному документі, мутантна рослина або клітина рослини можуть містити одну або декілька додаткових мутацій в одному або декількох інших генах або поліпептидах. У деяких варіантах реалізації мутанти можуть містити одну або декілька додаткових мутацій в одному або декількох інших генах або поліпептидах. У даному документі описані мутанти МІАБМ1-5,

МАБМ1-Т, МЕАБМ5-5:5й АБМ5О-Ї. У деяких варіантах реалізації одна або декілька мутацій знаходяться у домені глутамінази.

Три стоп-мутації ідентифіковані у копіях АБМ1-5 (АБМ1-5 МУ156"7 - БЕО ІЮ МО 19 і 20), АБМ1-

Т (АБМ1-Т М/1567 - БЕО ІЮ МО 21 і 22) й АБМ5-5:А5М5-5 0667 - ЗЕО ІЮ МО 23 і 24), але не у копії АБМ5О-Т. Оскільки в А5М5-Т не були ідентифіковані стоп-мутації, мутація, яка відрізняється від стоп-мутації, була ідентифікована як потенційний кандидат. Спостерігалася однозначна тенденція до зниження рівня аспарагіну в АЗМ1-5 МУ156", АБМІ1-Т М/1567 й АЗМ5-5 066" у порівнянні з їх відповідними сегрегантами ДТ, але не для АБМ5-ЇТ 590. Найбільше зниження спостерігалося для АЗМ1-Т МУ1567 (83 95), потім для АЗМ5-5 066" (44 95) і, нарешті, для АБМ1-

З МУ156" (17 95). У лінії АБМ5-Т 5590 спостерігалося незначне підвищення рівня аспарагіну.

Стоп-мутації в А5М1-5 й А5БМ5О-5 не мали вплив на біомасу та розмір рослин. Згідно з публікацією Сапайез еї аї., 2012, мутації у всіх генах МІ-АБМ розташовані у домені глутамінази, яка вивільняє амоній з глутаміну, домені синтетази, що розташований у МЕАБЗМ від амінокислоти К211 до 0451 консенсусної області.

Зазначені мутантна рослина або клітина рослини можуть бути гетерозиготними або гомозиготними за мутацією або мутаціями. Зазначені мутантна рослина або клітина рослини можуть бути гетерозиготними щонайменше за однією мутацією та гомозиготними щонайменше за однією мутацією, що відрізняється. Переважно, мутантна рослина або клітина рослини є гомозиготними за мутацією або мутаціями.

Зо Мутант може містити мутацію (наприклад, нонсенс-мутацію, яка призводить до появи стоп- кодона) у положенні, яке еквівалентне положенню амінокислоти 156 5ЕО ІЮ МО: 2. Приклад такого мутанта являє собою АЗМ1-5 УМ156", як описано у даному документі.

Мутант може містити мутацію (наприклад, нонсенс-мутацію, яка призводить до появи стоп- кодона) у положенні, яке еквівалентне положенню амінокислоти 156 5ЕО ІЮ МО: 4. Приклад такого мутанта являє собою АЗМ1-Т УМ156", як описано у даному документі.

Мутант може містити мутацію (наприклад, нонсенс-мутацію, яка призводить до появи стоп- кодона) у положенні, яке еквівалентне положенню амінокислоти 66 5ЕО ІЮО МО: 6. Приклад такого мутанта являє собою АЗМ5-5 066", як описано у даному документі.

Також передбачені комбінації даних мутацій. Зазначені комбінації можуть включати у себе комбінацію АЗМ1-5 УМУ1567" й АЗМ1-Т УМ1567; або комбінацію АБМ1-5 УМ1567 й АБМ5-5 О66"; або комбінацію АЗМ1-Т УУ1567 й АЗМ5-5 066"; або комбінацію А5М1-5 МУ156", АБМ1-Т МУ/156" й АЗМ5-5 066".

В іншому аспекті запропонований спосіб зниження рівня аспарагіну у рослині або у рослинному матеріалі, що одержаний з рослини, причому зазначений спосіб включає введення у геном зазначеної рослини однієї або декількох мутацій, які знижують експресію щонайменше одного гена аспарагін синтетази, причому зазначений щонайменше один ген аспарагін синтетази кодує МІА5М1-5, МАБМ1-Т, МА5М5-5 або МЕ АБМ5-Т. Переважно, крім мутації або мутацій у МАБМ1-5, МАБМ1-Т, МАБМ5-5 або МІА5М5-Т, одна або декілька мутацій також можуть бути введені у щонайменше одну алель щонайменше одного, двох або трьох або більше додаткових генів аспарагін синтетази. Також передбачені мутації у МАБМ1-5 і МАЗМ1-Т або МА5БМ5-5 і МАБМ5-Т.

Також запропонований спосіб ідентифікації рослини зі зниженими рівнями аспарагіну, причому зазначений спосіб включає здійснення скринінгу зразка нуклеїнової кислоти з рослини, що представляє інтерес, для детектування присутності однієї або декількох мутацій у МІА5М1-5,

МАБМ1-Т, МАБМ5-5 або А5М5-Т. Переважно, зазначений спосіб також включає здійснення скринінгу зазначеного зразка нуклеїнової кислоти або іншого зразка нуклеїнової кислоти від зазначеної рослини, що представляє інтерес, для детектування присутності мутації у МІА5М1-5, присутності мутації у МАБМІ1-Т, або присутності мутації у МІА5М5-5, або присутності мутації у

МАБМ5Б-Т.

Також розкриті рослина або клітина рослини, які є гетерозиготними або гомозиготними за однією або декількома мутаціями у гені, що кодує МІА5М1-5, МАБМ1-Т, МАБМ5-5 або МАБМ5-

Т, причому зазначена мутація або мутації призводять до зниження експресії гена або зниження функції білка, що кодується зазначеним геном.

У деяких варіантах реалізації сприятливу мутацію або мутації вводять у рослину або клітину рослини з використанням підходу мутагенезу, і введену мутацію ідентифікують або піддають відбору із застосуванням способів, що відомі фахівцю у даній галузі техніки, таких як аналіз методом Саузерн-блоттингу, секвенування ДНК, ПЛР-аналіз або фенотиповий аналіз. Мутації, які впливають на експресію генів або які порушують функцію кодованого білка, можна визначати із застосуванням способів, що добре відомі з рівня техніки. Інсерційні мутації в екзонах гена, зазвичай, призводять до утворення нефункціональних мутантів. Мутації у консервативних залишках можуть бути особливо ефективними для інгібування або зниження метаболічної функції білка, що кодується.

Також розкриті способи одержання мутантних полінуклеотидів і поліпептидів. Будь-яку рослину, що представляє інтерес, у тому числі клітину рослини або рослинний матеріал, можна генетично модифікувати різними способами, за допомогою яких, як відомо, індукується мутагенез, у тому числі сайт-спрямований мутагенез, олігонуклеотид-спрямований мутагенез, мутагенез, що індукований хімічними сполуками, мутагенез, що індукований іонізуючим випромінюванням, мутагенез з використанням модифікованих основ, мутагенез з використанням двоспіральної ДНК, яка містить розриви, мутагенез з двонитковими розривами, мутагенез з використанням штамів господарів з порушеною репарацією, мутагенез за допомогою синтезу повного гена, шафлінг ДНК та інші еквівалентні способи.

Мутантні варіанти поліпептиду можна використовувати для створення мутантних, що не зустрічаються у природі або трансгенних рослин (наприклад, мутантних, що не зустрічаються у природі, трансгенних, створених людиною рослин або рослин, що одержані за допомогою методик генної інженерії) або рослинних клітин, які містять один або декілька мутантних варіантів поліпептиду. Переважно мутантні варіанти поліпептиду зберігають активність немутантного поліпептиду. Активність мутантного варіанта поліпептиду може бути вище, нижче або приблизно такою самою, як немутантного поліпептиду.

Зо Мутації у нуклеотидних послідовностях і поліпептидах, що описані у даному документі, можуть включати в себе мутації, що внесені людиною, або синтетичні мутації, або мутації, що створені за допомогою генної інженерії. Мутації у нуклеотидних послідовностях і поліпептидах, що описані у даному документі, можуть бути мутаціями, які одержані або які можна одержати за допомогою способу, що включає в себе стадію маніпулювання іп міго або іп мімо. Мутації у нуклеотидних послідовностях і поліпептидах, що описані у даному документі, можуть бути мутаціями, які одержані або які можна одержати за допомогою способу, що включає в себе втручання людини. Як приклад, спосіб може включати в себе мутагенез із застосуванням екзогенно доданих хімічних сполук, таких як мутагенні, тератогенні або канцерогенні органічні сполуки, наприклад етилметансульфонат (ЕМС), які призводять до випадкових мутацій в генетичному матеріалі. Як додатковий приклад, спосіб може включати в себе один або декілька етапів генної інженерії, таких як один або декілька етапів генної інженерії, які описані у даному документі, або їх комбінації. Як додатковий приклад спосіб може включати в себе одну або декілька стадій схрещування рослин.

Активність одного або декількох поліпептидів аспарагін синтетази у рослині знижується або інгібується зідно з даним винаходом, якщо активність з перетворення є статистично меншою, ніж активність з перетворення того самого поліпептиду або поліпептидів аспарагін синтетази у рослині, яка не була модифікована з метою інгібування активності з перетворення даного поліпептиду аспарагін синтетази, й яку культивували та збирали з використанням тих самих протоколів. Активність поліпептиду аспарагін синтетази у рослині вважається усуненою, якщо дана активність є такою, що не виявляється за допомогою аналітичних методів, що описані у даному документі. Способи визначення активності поліпептиду аспарагін синтетази описані у даному документі.

Окрім мутагенезу, композиції, які можуть модулювати експресію або активність одного або декількох полінуклеотидів або поліпептидів, що описані у даному документі, включають в себе, без обмеження, специфічні відносно послідовності полінуклеотиди, які можуть перешкоджати транскрипції одного або декількох ендогенних генів; специфічні відносно послідовності полінуклеотиди, які можуть перешкоджати трансляції РНК-транскриптів (наприклад, двониткові

РНК, міРНК, рибозими); специфічні відносно послідовності поліпептиди, які можуть перешкоджати стабільності одного або декількох білків; специфічні відносно послідовності 60 полінуклеотиди, які можуть перешкоджати ферментативній активності одного або декількох білків або активності зв'язування одного або декількох білків з відповідними субстратами або регуляторними білками; антитіла, які проявляють специфічність відносно одного або декількох білків; низькомолекулярні сполуки, які можуть перешкоджати стабільності одного або декількох білків або ферментативній активності одного або декількох білків або активності зв'язування одного або декількох білків; білки "цинкові пальці", які зв'язують один або декілька полінуклеотидів; і мегануклеази, які мають активність відносно одного або декількох полінуклеотидів. Технології редагування гена, генетичні технології редагування та технології редагування генома добре відомі у даній галузі.

Один зі способів редагування гена передбачає використання ефекторних нуклеаз (ТАГЕМ), що є подібними активатору транскрипції, які викликають двониткові розриви, на які клітина може відповідати із залученням механізмів репарації. Негомологічне з'єднання кінців повторно зчеплює ДНК з обох сторін двониткового розриву, де має місце незначне, або зовсім відсутнє перекривання послідовності для комплементарного зв'язування. Цей механізм репарації індукує помилки в геномі за допомогою вставлення або делеції, або хромосомної перебудови. Будь-які такі помилки можуть зробити генні продукти, що закодовані в цьому місці, нефункціональними.

Інший спосіб редагування гена передбачає використання бактеріальної системи СКІЗРЕ/Сав.

Бактерії й архебактерії характеризуються хромосомними елементами, що звуться короткими паліндромними повторами, групами (СКІЗРЕК), що регулярно розташовані, які є частиною адаптивної імунної системи, що захищає від проникнення вірусної та плазмідної ДНК. У системах СКІЗ5РК ІІ типу, СКІБРК РНК (сгКМА) функціонує з трансактивуючою сгКМА (їгастеМА) та СЕКІ5РЕ-асоційованими (Са5) білками з внесенням двониткових розривів у цільову ДНК.

Цільове розщеплення за допомогою Са59 потребує парування основ сгеЕМА та ігастеМА, а також парування основ сгЕМА та цільової ДНК. Цільове розпізнавання полегшується при наявності короткого мотиву, що зветься прилеглим до протоспейсера мотивом (РАМ), який відповідає послідовності МС. Дану систему можна використовувати для редагування геному.

Са59 зазвичай програмується подвійною РНК, що складається з сгеМА та ігасгеМА. Проте, компоненти ядра цих РНК можуть бути об'єднані в єдину гібридну "направляючу РНК" для націлювання Са59. Використання некодуючої направляючої РНК з націлюванням ДНК для сайт- специфічного розщеплення обіцяє бути значно більше простим, ніж існуючі технології, такі як

Зо ТАГЕМ. Використання стратегії СКІЗРК/Саз з перенацілюванням нуклеазного комплексу потребує лише введення нової послідовності РНК і немає необхідності у перебудові специфічності факторів транскрипції білка.

Технологія застосування антисенсових олігонуклеотидів являє собою інший добре відомий спосіб, який можна використовувати для модулювання експресії поліпептиду. Полінуклеотид гена, який підлягає репресії, клонують та функціонально зв'язують з регуляторною ділянкою та послідовністю термінації транскрипції, так що антисенсова нитка РНК транскрибується. Потім рекомбінантною конструкцією трансформують клітину рослини й одержують антисенсову нитку

РНК. Полінуклеотид необов'язково є повною послідовністю гена, який підлягає репресії, але, як правило, буде практично комплементарним щонайменше частині сенсової нитки гена, який повинний бути репресованим.

Полінуклеотид може бути транскрибований в рибозим або каталітичну РНК, яка впливає на експресію ІРНК. Рибозими можна сконструювати для специфічного парування практично з будь- якою цільовою РНК і розщеплення фосфодіефірного кістяка у певному місці, тим самим функціонально інактивуючи цільову РНК. Гетерологічні полінуклеотиди можуть кодувати рибозими, що сконструйовані для розщеплення конкретних транскриптів ІРНК, запобігаючи таким чином експресії поліпептиду. Рибозими типу паттегеай є такими, що застосовуються для руйнування конкретних ІРНК, хоча можна використовувати різні рибозими, які розщеплюють

ЇРНК у послідовностях сайт-специфічного розпізнавання. Рибозими типу Ппаттетжйеай розщеплюють іРНК в місцях, що визначаються фланкуючими ділянками, які формують комплементарні пари основ з цільовою ІРНК. Єдиною вимогою є те, що цільова РНК повинна містити нуклеотидну послідовність 5'-003-3 Конструювання й одержання рибозимів типу

Патттегпеай відоме у даній галузі. Послідовності рибозимів типу Ппаттегтшйеай можна вбудовувати в стабільну РНК, таку як транспортна РНК (тРНК) для підвищення ефективності розщеплення іп мімо.

В одному варіанті здійснення специфічний до послідовності полінуклеотид, який може порушувати трансляцію транскрипту(транскриптів) РНК, являє собою інтерферуючу РНК. РНК- інтерференція або РНК-сайленсинг являє собою еволюційно консервативний процес, в якому конкретні ІРНК можуть бути націленими для ферментативної деградації. Двониткову РНК (двониткова РНК) вводять в клітину або одержують в клітині (наприклад, двонитковий РНК-вірус бо або полінуклеотиди інтерферуючої РНК) для ініціації шляху інтерферуючої РНК. Дволанцюгову

РНК можна перетворити на декілька подвійних спіралей малих інтерферуючих РНК 21-23 111. о. у довжину за допомогою РЕНКази І, яка являє собою специфічну для дволанцюгової РНК ендонуклеазу. Малі інтерферуючі РНК можна потім розпізнати РНК-індукованими комплексами сайленсингу, які сприяють розкручуванню малих інтерферуючих РНК за допомогою АТФ- залежного процесу. Розкручена антисенсова нитка малої інтерферуючої РНК направляє активовані РНК-індуковані комплекси сайленсингу до націленої іРНК, що містить послідовність, яка є комплементарною до антисенсової нитки малої інтерферуючої РНК. Націлена іРНК й антисенсова нитка можуть утворювати А-форму спіралі, і велику борозенку А-форми спіралі можна розпізнавати активованими РНК-індукованими комплексами сайленсингу. Цільову ІРНК можна розщепити за допомогою активованих РНК-індукованих комплексів сайленсингу в одному сайті, що визначений сайтом зв'язування 5'-кінця ланцюга малої інтерферуючої РНК. Активовані

РНК-індуковані комплекси сайленсингу можуть повторно використовуватися для каталізу ще однієї події розщеплення. Приклад кодуючої послідовності з МАБМ1-5, яку можна використовувати для сайленсингу копій як МІА5М1-5, так і МІАЗ5М1-Т, представлений у 5ЕО ІЮ

МО: 17. Внаслідок цього наступний аспект відноситься до нуклеотидної послідовності, що представлена у ЗЕБЕО ІЮ МО: 17, або послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 Фо, 73 90, 74 90, 75 ую, 80 95, 85 9о, 87 Уо, 88 Уо, 89 Фо, 90 90, 91 9о, 92 Фо, 93 Фо, 94 Фо, 95 Фо 96 Фо, 97 Фо, 98 9, 99 95 із зазначеною послідовністю. Приклад кодуючої послідовності з МІА5М5-Т, яку можна використовувати для сайленсингу копій як МІА5М 1-5, так і

МАБМІ1-Т, представлений у 5ЕО ІЮО МО: 18. Внаслідок цього наступний аспект відноситься до нуклеотидної послідовності, що представлена у 5ЕО ІЮО МО: 17. Внаслідок цього наступний аспект відноситься до нуклеотидної послідовності, що представлена у 5ЕО ІЮ МО: 18, або послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95, 73 о, 74 о, 7596, 80 У, 85 У, 87 У, 88 Ус, 89 Ус, 90 У, 91 Ус, 92 У, 93 Ус, 94 У, 95 Уо 96 95, 97 Ус, 98 Ус, 99 Уо із зазначеною послідовністю. Також передбачений спосіб сайленсингу генів із застосуванням даних кодуючих послідовностей та варіанти застосування зазначеного способу.

Вектори експресії інтерферуючої РНК можуть містити конструкції інтерферуючої РНК, що кодують полінуклеотиди інтерферуючої РНК, які виявляють активність по відношенню до РНК- інтерференції шляхом зниження рівня експресії ІРНК, пре-іІРНК або споріднених варіантів РНК.

Зо Ілюстративні конструкції представлені на фігурі 22. Вектори експресії можуть містити промотор, що розташований вище за ланцюгом і функціонально зв'язаний з конструкцією інтерферуючої

РНК, як додатково описано у даному документі. Вектори експресії інтерферуючої РНК можуть містити підходящий мінімальний коровий промотор, конструкцію інтерферуючої РНК, що представляє інтерес, регуляторну ділянку, що розташована вище за ланцюгом (5), регуляторну ділянку, що розташована нижче за ланцюгом (3), у тому числі сигнали термінації транскрипції та поліаденілювання, та інші послідовності, що відомі фахівцям у даній галузі техніки, такі як різні селективні маркери.

Полінуклеотиди можна одержати у різних формах, у тому числі у вигляді двониткових структур (тобто, двониткова молекула РНК, що містить антисенсову нитку та комплементарну їй сенсову нитку), двониткових шпилькоподібних структур або однониткових структур (тобто, молекула 55КМА, що містить тільки антисенсову нитку). Структури можуть містити вторинну структуру у вигляді подвійної спіралі, асиметричної подвійної спіралі, шпильки або асиметричної шпильки, що має самокомплементарну сенсову й антисенсову нитки. Двониткову інтерферуючу

РНК можна перетворити ферментативним шляхом у двониткові малі інтерферуючі РНК. Одну з ниток подвійної спіралі малої інтерферуючої РНК можна відпалити з комплементарною послідовністю в цільовій іРНК і споріднених варіантах РНК. Подвійні спіралі малої інтерферуючої РНК/РНК розпізнаються РНК-індукованими комплексами сайленсингу, які можуть розщеплювати РНК у декількох сайтах способом, що залежить від послідовності, призводячи в результаті до руйнування цільової ІРНК і споріднених варіантів РНК.

Молекули двониткової РНК можуть включати в себе молекули малої інтерферуючої РНК, які зібрані з одного олігонуклеотиду в структурі стебло-петля, де самокомплементарні сенсові й антисенсові ділянки молекули малої інтерферуючої РНК поєднані за допомогою лінкера (лінкерів), що заснований на полінуклеотидах або не заснований на полінуклеотидах, а також кільцеву однониткову РНК з двома або більше петлевими структурами та стеблом, що містить самокомплементарні сенсові й антисенсові нитки, де кільцеву РНК можна процесувати або іп мімо, або іп мйго з утворенням активної молекули малої інтерферуючої РНК, яка здатна опосередковувати інтерференції РНК.

Також передбачається використання молекул малої РНК, що утворює шпильки. Вони містять специфічну антисенсову послідовність на додаток до зворотньо комплементарної 60 (сенсової) послідовності, як правило, відокремленої спейсером або послідовністю петлі.

Розщеплення спейсера або петлі забезпечує молекулу однонитковою РНК та її зворотньо комплементарну нитку, так що їх можна відпалити з утворенням двониткової молекули РНК (необов'язково, з додатковими стадіями обробки, які можуть призвести в результаті до додавання або видалення одного, двох, трьох або більше нуклеотидів 3'-кінця або 5'-кінця однієї або обох ниток). Спейсер може мати достатню довжину для забезпечення можливості комплементарного зв'язування антисенсової та сенсової послідовностей і утворення двониткової структури (або стебла) до розщеплення спейсера (і, необов'язково, наступних стадій обробки, які можуть призвести в результаті до додавання або видалення одного, двох, трьох, чотирьох або більше нуклеотидів з 3'-кінця або з 5'-кінця однієї або обох ниток).

Спейсерна послідовність являє собою, як правило, неспоріднену нуклеотидну послідовність, яка знаходиться між двох комплементарних ділянок нуклеотидної послідовності, що при комплементарному зв'язуванні у двонитковий полінуклеотид містить малу шпилькову РНК.

Спейсерна послідовність зазвичай містить від приблизно З до приблизно 100 нуклеотидів.

Будь-який полінуклеотид РНК, що представляє інтерес, можна одержати шляхом підбору підходящої композиції послідовності, розміру петлі та довжини стебла для одержання подвійної спіралі шпильки. Підходящий діапазон для конструювання довжини стебла подвійної спіралі шпильки включає в себе довжину стебла щонайменше приблизно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 нуклеотидів, наприклад, приблизно 14-30 нуклеотидів, приблизно 30-50 нуклеотидів, приблизно 50-100 нуклеотидів, приблизно 100-150 нуклеотидів, приблизно 150-200 нуклеотидів, приблизно 200-300 нуклеотидів, приблизно 300-400 нуклеотидів, приблизно 400- 500 нуклеотидів, приблизно 500-600 нуклеотидів і приблизно 600-700 нуклеотидів. Підходящий діапазон для конструювання довжини петлі подвійної спіралі шпильки включає в себе довжину петлі у приблизно 4-25 нуклеотидів, приблизно 25-50 нуклеотидів або довше, якщо довжина стебла подвійної спіралі шпильки є значною. У певних варіантах здійснення молекула двониткової РНК або 55КМА становить від приблизно 15 до приблизно 40 нуклеотидів у довжину. В іншому варіанті здійснення молекула малої інтерферуючої РНК являє собою молекулу двониткової РНК або 5544МА від приблизно 15 до приблизно 35 нуклеотидів у довжину. В іншому варіанті здійснення молекула малої інтерферуючої РНК являє собою молекулу двониткової РНК або 5544МА від приблизно 17 до приблизно 30 нуклеотидів у

Зо довжину. В іншому варіанті здійснення молекула малої інтерферуючої РНК являє собою молекулу двониткової РНК або 5544МА від приблизно 19 до приблизно 25 нуклеотидів у довжину. В іншому варіанті здійснення молекула малої інтерферуючої РНК являє собою молекулу дволанцюгової РНК або 55РНК від приблизно 21 до приблизно 23 нуклеотидів у довжину. У певних варіантах здійснення структури у вигляді шпильки з ділянками подвійної спіралі, що є довшими, ніж 21 нуклеотид, можуть сприяти ефективному сайленсингу, що керований малою інтерферуючою РНК, незалежно від послідовності та довжини петлі.

Приклади кодуючих послідовностей, що використовуються для РНК-інтерференції, викладені у

ЗЕО ІЮ МО: 17 і 18.

Цільова послідовність ІРНК становить, як правило, від приблизно 14 до приблизно 50 нуклеотидів у довжину. Цільову ІРНК можна, таким чином, перевірити на наявність ділянок від приблизно 14 до приблизно 50 нуклеотидів у довжину, які переважно відповідають одному або більше з наступних критеріїв для цільової послідовності: співвідношення А«Т/З-С становить від приблизно 2:11 до приблизно 1:2; динуклеотид АА або динуклеотид СА на 5'-кінці цільової послідовності; послідовність з щонайменше 10 суміжних нуклеотидів, які є унікальними для цільової ІРНК (тобто, послідовність є відсутньою в інших послідовностях ІРНК з цієї самої рослини); і немає "смуг" з більше ніж трьох суміжних гуанінових (С) нуклеотидів або більше ніж трьох суміжних цитозинових (С) нуклеотидів. Дані критерії можна оцінювати за допомогою різних методик, що відомі у цій галузі, наприклад, комп'ютерні програми, такі як ВГ А5Т, можна використовувати для пошуку в загальнодоступних базах даних, щоб визначити, чи є вибрана цільова послідовність унікальною для цільової ІРНК. Як альтернатива, можна вибрати цільову послідовність (і сконструювати послідовність малої інтерферуючої РНК) за допомогою комерційно доступного комп'ютерного програмного забезпечення (наприклад, ОіідоЕпдіпе,

Тагеї Ріпаег і Оезідп Тооі для малих інтерферуючих РНК, які є комерційно доступними).

В одному варіанті здійснення вибрані цільові послідовності ІРНК, які становлять від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів у довжину та відповідають одному або більше критеріям, що зазначені вище. В іншому варіанті здійснення вибрані цільові послідовності, які становлять від приблизно 16 до приблизно 30 нуклеотидів у довжину та відповідають одному або декільком критеріям, що зазначені вище. У додатковому варіанті здійснення вибрані цільові послідовності, які становлять від приблизно 19 до приблизно 30 нуклеотидів у довжину та бо відповідають одному або декільком критеріям, що зазначені вище. В іншому варіанті здійснення

Зо вибрані цільові послідовності, які становлять від приблизно 19 до приблизно 25 нуклеотидів у довжину та відповідають одному або декільком критеріям, що зазначені вище.

В ілюстративному варіанті здійснення молекули малої інтерферуючої РНК містять специфічну антисенсову послідовність, яка є комплементарною щонайменше 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 або більше суміжним нуклеотидам із будь-яких полінуклеотидних послідовностей, що описані у даному документі.

Специфічна антисенсова послідовність, що міститься в молекулі малої інтерферуючої РНК, може бути ідентичною або практично ідентичною комплементарному ланцюгу цільової послідовності. В одному варіанті здійснення специфічна антисенсова послідовність, що міститься в молекулі малої інтерферуючої РНК, є щонайменше приблизно на 75 95, 80 Фо, 85 95, 9096, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 ідентичною комплементарному ланцюгу послідовності цільової ІРНК. Способи визначення ідентичності послідовності відомі у даній галузі, та її можна визначити, наприклад, за допомогою програми ВГАЗТМ програмного забезпечення Сотршиїег сгоир (50) Університету штату Вісконсін, або наданої на веб-сайті

МСВІ.

Специфічна антисенсова послідовність молекул малої інтерферуючої РНК може проявляти варіабельність по відношенню до відмінностей (наприклад, нуклеотидної заміни, в тому числі, транзиції або трансверсії) за одним, двома, трьома, чотирма або більше нуклеотидами послідовності цільової ІРНК. Якщо такі нуклеотидні заміни знаходяться в антисенсовому ланцюзі молекули двониткової РНК, то комплементарний нуклеотид в сенсовому ланцюзі, з яким заміщений нуклеотид, як правило, повинен утворювати водневі зв'язки при паруванні основ, може бути або може не бути відповідно заміщеним. Молекули двониткової РНК, в яких одна або більше нуклеотидних замін відбуваються у сенсовій послідовності, але не в антисенсовій нитці, також передбачені. Якщо антисенсова послідовність молекули малої інтерферуючої РНК містить один або декілька незбігів між нуклеотидною послідовністю малої інтерферуючої РНК і цільовою нуклеотидною послідовністю, як описано вище, ці невідповідності можуть бути виявлені на 3'-кінці, 5'-кінці, або в центральній частині антисенсової послідовності.

В іншому варіанті здійснення молекули малої інтерферуючої РНК містять специфічну антисенсову послідовність, яка здатна селективно гібридизуватися в жорстких умовах з

Зо частиною цільового гена, що зустрічається у природі, або цільової ІРНК. Як відомо фахівцям у даній галузі, варіації жорсткості умов гібридизації можуть бути досягнуті шляхом зміни часу, температури або концентрації розчинів, що використовуються для стадій гібридизації та відмивання. Підходящі умови можуть також частково залежати від конкретних нуклеотидних послідовностей, що використовуються, наприклад, послідовності цільової ІРНК або гена.

Одним зі способів індукції сайленсингу двониткової РНК в рослинах є трансформація генною конструкцією, що виробляє РНК, яка утворює шпильки (див. Зітійй єї аї. (2000) Майте, 407, 319- 320). Такі конструкції містять інвертовані ділянки послідовності цільового гена, що є відокремленими відповідним спейсером. Вставка функціональної інтронної ділянки рослини як спейсерний фрагмент додатково підвищує ефективність індукції сайленсингу гена за рахунок вироблення РНК, яка утворює шпильки, що сплайсована з інтроном (Умезієу єї аї!. (2001) Ріапі .)., 27, 581-590). Переважно довжина стебла становить від приблизно 50 нуклеотидів до приблизно 1 тисячі нуклеотидів у довжину. Способи одержання РНК, яка утворює шпильку, що сплайсована з інтроном, добре описані у даній галузі (див. наприклад, Віозсієпсе, Віоїесппоіоау, апа Віоспетівігу (2008) 72, 2, 615-617).

Молекули інтерферуючої РНК, що мають двоспіральну або двониткову структуру, наприклад, двониткова РНК або мала РНК, яка утворює шпильки, можуть мати тупі кінці, або можуть мати липкі 3'- або 5'-кінці. Використовуваний у цьому документі термін "липкий кінець" відноситься до непарованого нуклеотиду або нуклеотидів, які виступають з двоспіральної структури, якщо 3'-кінець однієї нитки РНК виходить за межі 5'-кінця іншої нитки (липкий 3'- кінець), або навпаки (липкий 5'-кінець). Нуклеотиди, що являють собою липкі кінці, можуть бути рибонуклеотидами, дезоксирибонуклеотидами або їх модифікованими версіями. В одному варіанті здійснення щонайменше одна нитка молекули інтерферуючої РНК має липкий 3'-кінець від приблизно 1 до приблизно 6 нуклеотидів у довжину. В інших варіантах здійснення липкий 3'- кінець становить від приблизно 1 до приблизно 5 нуклеотидів, від приблизно 1 до приблизно З нуклеотидів і від приблизно 2 до приблизно 4 нуклеотидів у довжину.

Якщо молекула інтерферуючої РНК містить липкий 3'-кінець на одному кінці молекули, інший кінець може бути з тупим кінцем, або також мати липкий кінець (5 або 3). Якщо молекула інтерферуючої РНК містить липкий кінець з обох кінців молекули, довжина липких кінців може бути однаковою або різною. В одному варіанті здійснення молекула інтерферуючої РНК містить бо липкі 3"-кінці від приблизно 1 до приблизно З нуклеотидів у довжину на обох кінцях молекули. У додатковому варіанті здійснення молекула інтерферуючої РНК являє собою двониткову РНК, що має липкий 3'-кінець з 2 нуклеотидів з обох кінців молекули. В ще одному варіанті здійснення нуклеотиди, що являють собою липкий кінець інтерферуючої РНК, є динуклеотидами ТТ або динуклеотидами ШИ.

При визначенні відсоткової ідентичності молекули інтерферуючої РНК, що містить один або більше липких кінців, з послідовністю цільової ІРНК, липкий кінець(кінці) може враховуватися або не враховуватися. Наприклад, нуклеотиди з липкого 3'-кінця та до 2 нуклеотидів з 5'- або 3'- кінця подвійного ланцюга можуть бути модифікованими без суттєвої втрати активності молекули малої інтерферуючої РНК.

Молекули інтерферуючої РНК можуть містити одну або декілька 5' або 3-кеп структур.

Молекула інтерферуючої РНК може містити кеп-структуру на 3'-кінці сенсового ланцюга, антисенсового ланцюга або як сенсового, так й антисенсового ланцюгів; або на 5'-кінці сенсового ланцюга, антисенсового ланцюга або як сенсового, так й антисенсового ланцюгів молекули інтерферуючої РНК. Як альтернатива, молекула інтерферуючої РНК може містити кеп-структуру як на 3'-кінці, так і на 5'-кінці молекули інтерферуючої РНК. Термін "кеп-структура" відноситься до хімічної модифікації, що включена з будь-якого кінця олігонуклеотиду, яка захищає молекулу від руйнування ендонуклеазами та може також полегшувати доставку або локалізацію всередині клітини.

Іншою модифікацією, що застосовується до молекул інтерферуючої РНК, є хімічне зв'язування з молекулою інтерферуючої РНК одного або більше фрагментів або кон'югатів, які підвищують активність, клітинний розподіл, клітинне захоплення, біодоступність або стабільність молекули інтерферуючої РНК. Полінуклеотиди можна синтезувати або модифікувати за допомогою способів, що є загальноприйнятими у даній галузі. Хімічні модифікації можуть включати без обмеження 2'-модифікації, введення неприродних основ, ковалентне приєднання ліганду та заміщення фосфатних зв'язків тіофосфатними зв'язками. У даному варіанті здійснення цілісність двоспіральної структури підсилюють за допомогою щонайменше одного та, як правило, двох хімічних зв'язків. Хімічне зв'язування може забезпечуватися за допомогою будь-якої з множини добре відомих методик, наприклад, шляхом введення ковалентних, іонних або водневих зв'язків; гідрофобних взаємодій, Ван-дер-

Ваальсових або стекінгових взаємодій; за допомогою координації іонами металів або завдяки використанню аналогів пурину.

Нуклеотиди одного або обох з двох одинарних ланцюгів можна модифікувати для модулювання активації клітинних ферментів, таких як, наприклад, без обмеження певні нуклеази. Методики для зниження або інгібування активації клітинних ферментів відомі у даній галузі та включають без обмеження 2'-аміно модифікації, 2'-фтор модифікації, 2'-алкіл модифікації, модифікації незарядженого каркаса, морфолінові модифікації, 2'-О-метил модифікації та фосфорамідат. Таким чином, щонайменше одну 2'-гідроксильну групу нуклеотидів двониткової РНК заміщають хімічною групою. Також щонайменше один нуклеотид можна модифікувати з утворенням закритого нуклеотиду. Такий закритий нуклеотид містить метиленовий або етиленовий місток, який з'єднує 2'-кисень рибози з 4"-вуглецем рибози.

Введення закритого нуклеотиду в олігонуклеотид покращує афінність до комплементарних послідовностей та підвищує температуру плавлення на декілька градусів.

Можна кон'югувати ліганди з молекулою інтерферуючої РНК, наприклад, для підвищення по відношенню до її клітинної абсорбції. У певних варіантах здійснення гідрофобний ліганд кон'югує з молекулою для полегшення прямого проникнення крізь клітинну мембрану. Дані підходи використані для полегшення проникнення в клітину антисенсових олігонуклеотидів. У певних випадках кон'югація катіонного ліганду з олігонуклеотидами часто призводить до покращеної стійкості до нуклеаз. Типові приклади катіонних лігандів включають пропіламоній та диметилпропіламоній. Антисенсові олігонуклеотиди можуть зберігати свою високу афінність зв'язування з ІРНК, коли катіонний ліганд розподілений за всім олігонуклеотидом.

Молекули та полінуклеотиди, що описані у даному документі, можна одержати за допомогою добре відомих методик твердофазного синтезу. Будь-які інші засоби для такого синтезу, що відомі у даній галузі, можна використовувати додатково або в якості альтернативи.

Різні варіанти здійснення спрямовані на вектори експресії, що містять один або більше полінуклеотидів або одну або більше конструкцій інтерферуючої РНК, які описані у даному документі. Ілюстративні конструкції представлені на фігурі 21.

Різні варіанти здійснення спрямовані на вектори експресії, що містять один або більше полінуклеотидів або одну або більше конструкцій інтерферуючої РНК, які кодують один або більше полінуклеотидів інтерферуючої РНК, що описані у даному документі, які здатні до бо самовідпалювання з утворенням структури у вигляді шпильки, в яких конструкція містить (а)

один або більше полінуклеотидів, що описані у даному документі; (Б) другу послідовність, що кодує спейсерний елемент, який утворює петлю структури у вигляді шпильки; і (с) третю послідовність, що містить зворотно комплементарну послідовність першої послідовності, яка розташована в тій самій орієнтації що і перша послідовність, де друга послідовність розташована між першою послідовністю та третьою послідовністю, і третя послідовність функціонально зв'язана з першою послідовністю та третьою послідовністю.

Розкриті послідовності можна використовувати для конструювання різних полінуклеотидів, які не утворюють структури у вигляді шпильки. Наприклад, двониткова РНК може бути утворена за допомогою (1) транскрибування першого ланцюга ДНК шляхом функціонального зв'язування з першим промотором і (2) транскрибування зворотньо комплементарної послідовності фрагмента ДНК першого ланцюга шляхом функціонального зв'язування з другим промотором.

Кожний ланцюг полінуклеотиду можна транскрибувати з одного вектора експресії, або з різних векторів експресії. Подвійну спіраль РНК, що має активність по відношенню до РНК- інтерференції, можна ферментативно перетворити в малі інтерферуючі РНК для модулювання рівнів РНК.

Таким чином, різні варіанти здійснення спрямовані на вектори експресії, що містять один або більше полінуклеотидів або конструкцій інтерферуючої РНК, що описані у даному документі, які кодують полінуклеотиди інтерферуючої РНК, є здатними до самовідпалювання, в яких конструкція містить (а) один або більше полінуклеотидів, що описані у даному документі; і (Б) другу послідовність, що містить комплементарну (наприклад, зворотньо комплементарну) послідовність першої послідовності, яка розташована в тій самій орієнтації, що і перша послідовність.

Передбачені різні композиції та способи для модулювання рівнів ендогенної експресії одного або декількох поліпептидів, що описані у даному документі (або будь-якої їх комбінації, що описана у даному документі) шляхом стимулювання ко-супресії експресії гена. Явище ко- супресії виникає як результат введення множини копій трансгена в рослинну клітину-господаря.

Інтеграція множини копій трансгена може призводити до модулювання експресії трансгена та націленого ендогенного гена. Ступінь ко-супресії залежить від ступеня ідентичності послідовності між трансгеном і націленим ендогенним геном. Сайленсинг як ендогенного гена,

Зо так і трансгена може відбуватися через інтенсивне метилування пригнічуваних локусів (тобто, ендогенного промотора та ендогенного гена, що представляє інтерес), що може порушувати транскрипцію. Як альтернатива, у деяких випадках ко-супресія ендогенного гена та трансгена може відбуватися за допомогою пост-транскрипційного сайленсингу гена, при якому транскрипти можуть бути одержані, але підвищені рівні руйнування перешкоджають накопиченню транскриптів. Механізм ко-супресії за допомогою пост-транскрипційного сайленсингу генів, як вважають, нагадує РНК-інтерференцію в тому, що РНК, певно, є важливою як ініціатор і мішень у цих процесах, і може бути опосередкованим, щонайменше частково, тим самим молекулярним механізмом, можливо, через РНК-керовані руйнування

ІРНК.

Ко-супресію нуклеїнових кислот можна досягти шляхом введення множини копій нуклеїнової кислоти або її фрагментів як трансгенів до генома рослини, що представляє інтерес. Рослину- господар можна трансформувати вектором експресії, що містить промотор, який функціонально зв'язаний з такою нуклеїновою кислотою або її фрагментами. Різні варіанти здійснення спрямовані на вектори експресії для стимулювання ко-супресії ендогенних генів, що містять промотор, який функціонально зв'язаний з полінуклеотидом.

Різні варіанти здійснення спрямовані на способи модулювання рівня експресії одного або більше полінуклеотидів, що описані у даному документі (або будь-якої їх комбінації, як описано у даному документі), шляхом інтеграції множини копій полінуклеотиду або полінуклеотидів у геном рослини, включаючи: трансформацію рослинної клітини-господаря вектором експресії, що містить промотор, який функціонально зв'язаний з полінуклеотидом.

Різні композиції та способи передбачені для модулювання рівня експресії ендогенного гена шляхом модулювання трансляції ІРНК. Клітину рослини-господаря можна трансформувати вектором експресії, що містить: промотор, який функціонально зв'язаний з полінуклеотидом, що розташований в антисенсовій орієнтації відносно промотора для забезпечення можливості експресії полінуклеотидів РНК, що містять послідовність, яка є комплементарною частині мРНК.

Різні вектори експресії для модулювання трансляції ІРНК можуть містити: промотор, який функціонально зв'язаний з полінуклеотидом, в антисенсовій орієнтації по відношенню до промотора. Довжина полінуклеотидів антисенсової РНК може варіюватися та становити від приблизно 15-20 нуклеотидів, приблизно 20-30 нуклеотидів, приблизно 30-50 нуклеотидів,

приблизно 50-75 нуклеотидів, приблизно 75-100 нуклеотидів, приблизно 100-150 нуклеотидів, приблизно 150-200 нуклеотидів і приблизно 200-300 нуклеотидів.

Також на гени можна цілеспрямовано впливати для інактивації шляхом введення транспозонів (наприклад, ІЗ-елементів) в геноми рослин, що представляють інтерес. Дані мобільні генетичні елементи можна ввести за допомогою статевого перехресного запилювання та мутантів зі вставками можна перевірити щодо втрати активності білка. Зруйнований ген батьківської рослини можна ввести в інші рослини шляхом схрещування батьківської рослини з рослиною, що не піддавалася мутагенезу, який індукований транспозоном, наприклад, шляхом статевого перехресного запилювання. Можна використовувати будь-які стандартні методики селекції, що відомі фахівцям у даній галузі. В одному варіанті здійснення один або більше генів можна інактивувати шляхом вставки одного або більше транспозонів. Мутації можуть призвести до гомозиготного руйнування одного або більше генів, до гетерозиготного руйнування одного або більше генів, або до комбінації гомозиготних і гетерозиготних руйнувань, якщо більше ніж один ген зруйнований. Підходящі мобільні елементи включають в себе ретротранспозони, ретропозони та ЗІМЕ-подібні елементи. Такі способи відомі фахівцям у даній галузі.

Як альтернатива, на гени можна цілеспрямовано впливати для інактивації шляхом введення рибозимів, одержаних з ряду малих кільцевих РНК, які здатні до саморозщеплення та реплікації в рослинах. Дані РНК можуть реплікуватися або самостійно (РНК віроїду), або за участю вірусу- помічника (сателітні РНК). Приклади підходящих РНК включають одержані з віроїду сонячної плямистості авокадо та сателітні РНК, які одержані з вірусу кільцевої плямистості тютюну, вірусу тимчасової смугастості люцерни, вірусу оксамитової плямистості тютюну, вірусу плямистості Зоїапит поашогит і вірусу плямистості конюшини підземної. Різні рибозими, які є специфічними до цільової РНК, відомі фахівцям у даній галузі.

Як обговорювалося у даному документі, експресію одного або декількох поліпептидів можна модулювати нетрансгенними засобами, як наприклад, шляхом створення однієї або декількох мутацій в одному або декількох генах, як обговорювалося у даному документі. Способи, за допомогою яких вводять випадкову мутацію у генну послідовність, можуть включати хімічний мутагенез, мутагенез за допомогою ЕМ5 і радіаційний мутагенез. Способи, за допомогою яких вводять одну або декілька цільових мутацій в клітину, включають, без обмеження, технологію

Зо редагування генома, зокрема, мутагенез, що опосередкований нуклеазою з мотивом "цинкового пальця", а також цілеспрямовані індуковані локальні пошкодження в геномі (ТІМ), гомологічну рекомбінацію, олігонуклеотид-спрямований мутагенез і мутагенез, що опосередкований мегануклеазою. В одному варіанті реалізації використовують ТІ ГІМО. Він являє собою технологію мутагенезу, яку можна використовувати для створення й/або ідентифікації полінуклеотидів, що кодують поліпептиди з модифікованою експресією й/або активністю. ТІССІМО також припускає відбір рослин, що несуть такі мутації. В ТІССІМО комбінують мутагенез високої щільності зі способами високопродуктивного скринінгу. Способи для проведення ТІ ІМО добре відомі у даній галузі (див. МеСаїїшт еї а!., (2000) Маї Віотеснпо! 18: 455-457 і етріє (2004) Маї Рем Сепеї 5(2): 145-50).

Деякі необмежуючі приклади мутацій являють собою делеції, вставки та місенс-мутації щонайменше одного нуклеотиду, однонуклеотидні поліморфізми та просту послідовність, що повторюється. Після внесення мутації можна провести скринінг для ідентифікації мутацій, які створюють ранні стоп-кодони або іншим чином нефункціональні гени. Після внесення мутації можна провести скринінг для ідентифікації мутацій, які створюють функціональні гени, що є здатними експресуватися на підвищених рівнях. Скринінг мутантів можна виконати шляхом секвенування, або з використанням одного або декількох зондів або праймерів, які є специфічними для даного гена або білка. Можна також створити у полінуклеотидах конкретні мутації, які призводять в результаті до модулювання експресії гена, модулювання стабільності

ІРНК або модулювання стабільності білка. Такі рослини названі у даному документі як рослини, що "не зустрічаються у природі" або "мутантні". Як правило, мутантні або рослини, що не зустрічаються у природі, будуть включати в себе щонайменше частину чужорідної або синтетичної, або нуклеїнової кислоти, що створена людиною (наприклад, ДНК або РНК), яка не є представленою в рослині до проведення з нею маніпуляцій. Чужорідна нуклеїнова кислота може бути одним нуклеотидом, двома або більше нуклеотидами, двома або більше суміжними нуклеотидами або двома або більше несуміжними нуклеотидами, наприклад, щонайменше 10, 20, 30, 40, 50,100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 або 1500 більше суміжними або несуміжними нуклеотидами.

Мутантні рослини або рослини, що не зустрічаються у природі, або клітини рослини можуть містити будь-яку комбінацію однієї або декількох мутацій в одному або декількох генах, що бо призводить до модулювання рівнів білка. Наприклад, мутантні рослини або рослини, що не зустрічаються у природі, або клітини рослини можуть містити одну мутацію в одному гені; декілька мутацій в одному гені; одну мутацію в двох або більше, або трьох або більше генах; або декілька мутацій в двох або більше, або трьох або більше, або чотирьох або більше генах.

Приклади таких мутацій описані у даному документі. Як додатковий приклад, мутантні рослини або рослини, що не зустрічаються у природі, або клітини рослини можуть містити одну або декілька мутацій в конкретній частині генас-ів), наприклад, в ділянці гена, яка кодує активний сайт білка або його частину. Як додатковий приклад, мутантні рослини або рослини, що не зустрічаються у природі, або клітини рослини можуть містити одну або декілька мутацій в ділянці поза одним або більше генами, наприклад, в ділянці, що розташована вище за ланцюгом або нижче за ланцюгом відносно гена, який він регулює, за умови, що вони модулюють активність або експресію гена(-ів). Елементи, що розташовані вище за ланцюгом, можуть включати в себе промотори, енхансери або транскрипційні фактори. Деякі елементи, такі як енхансери, можуть розташовуватися вище за ланцюгом або нижче за ланцюгом гена, який вони регулюють. Елемент(елементи) - необов'язково розташований(розташовані) поруч з геном, який він(вони) регулює(регулюють), оскільки деякі елементи, як було виявлено, розташовані протягом декілька тисяч пар основ вище за ланцюгом або нижче за ланцюгом гена, який вони регулюють. Мутантні рослини або рослини, що не зустрічаються у природі, або клітини рослини можуть містити одну або декілька мутацій, які розташовані у межах перших 100 нуклеотидів гена(-ів), у межах перших 200 нуклеотидів гена(-ів), у межах перших 300 нуклеотидів гена(-ів), у межах перших 400 нуклеотидів гена(с-ів), у межах перших 500 нуклеотидв генас-ів), у межах перших 600 нуклеотидів генас-ів), у межах перших 700 нуклеотидів генас-ів), у межах перших 800 нуклеотидів гена(-ів), у межах перших 900 нуклеотидів генас-ів), у межах перших 1000 нуклеотидів генас-ів), у межах перших 1100 нуклеотидів генас-ів), у межах перших 1200 нуклеотидів генас-ів), у межах перших 1300 нуклеотидів генас-ів), у межах перших 1400 нуклеотидів гена(-ів) або у межах перших 1500 нуклеотидів гена(-ів). Мутантні рослини або рослини, що не зустрічаються у природі, або клітини рослини можуть містити одну або декілька мутацій, що розташовані у першому, другому, третьому, четвертому, п'ятому, шостому, сьомому, восьмому, дев'ятому, десятому, одинадцятому, дванадцятому, тринадцятому, чотирнадцятому або п'ятнадцятому наборі з 100 нуклеотидів гена(-ів) або їх комбінації. Розкриті

Зо мутантні або рослини, що не зустрічаються у природі, або клітини рослини (наприклад, мутантні, трансгенні або рослини, що не зустрічаються у природі, тощо, як описано у даному документі), які містять варіанти мутантного поліпептиду.

В одному варіанті здійснення насіння рослин піддають мутагенезу та потім вирощують з них мутантні рослини першого покоління. Потім рослинам першого покоління дають самозапилитися та з насіння від рослин першого покоління вирощують рослини другого покоління, які потім перевіряють на наявність мутацій в їх локусах. Не дивлячись на те, що рослинний матеріал, який був підданий мутації, можна перевірити на наявність мутацій, перевагою скринінгу рослин другого покоління є те, що всі соматичні мутації відповідають мутаціям в зародкових лініях. Фахівцю у даній галузі буде зрозуміло, що різний рослинний матеріал, у тому числі без обмеження насіння, пилок, рослинні тканини або рослинні клітини, можна піддати мутагенезу для створення мутантних рослин. Однак тип рослинного матеріалу, що був підданий мутагенезу, може мати значення, коли нуклеїнову кислоту рослини перевіряють на наявність мутацій. Наприклад, коли пилок піддають мутагенезу до запилення рослини, що не піддавалася мутагенезу, з насіння, яке одержане при цьому запиленні, вирощують рослини першого покоління. Кожна клітина рослин першого покоління буде містити мутації, що утворені у пилку; таким чином, ці рослини першого покоління можна потім перевірити на наявність мутацій замість того, щоб чекати появи другого покоління.

Мутагени, які утворюють головним чином точкові мутації та короткі делеції, вставки, трансверсії та/або транзиції включаючи хімічні мутагени й опромінювання, можна використовувати для утворення мутацій. Мутагени включають без обмеження етилметансульфонат, метилметансульфонат, М-етил-М-нітрозосечовину, триетилмеламін, М- метил-М-нітрозосечовину, прокарбазин, хлорамбуцил, циклофосфамід, діетилсульфат, мономер акриламіду, мельфалан, азотистий іприт, вінкристин, диметилнітрозамін, М-метил-М'- нітро-нітрозогуанідин, нітрозогуанідин, 2-амінопурин, 7,12-диметил-бенз(а)зантрацен, етиленоксид, гексаметилфосфорамід, бусульфан, діепоксіалкани (діепоксіоктан, діепоксибутан тощо), 2-метокси-6-хлор-9І3-(етил-2-хлоретил)амінопропіламіноїакридину дигідрохлорид «(КІ формальдегід.

Спонтанні мутації в локусі, які можуть не бути безпосередньо викликаними мутагеном, також розглядаються, за умови, що вони призводять в результаті до бажаного фенотипу. Підходящі бо мутагенні засоби можуть також включати в себе, наприклад, іонізуюче випромінювання,

наприклад, рентгенівське випромінювання, гамма-випромінювання, випромінювання швидких нейтронів й ультрафіолетове випромінювання. Будь-який спосіб одержання нуклеїнової кислоти рослини, що відомий фахівцям у даній галузі можна використовувати для одержання нуклеїнової кислоти рослини для скринінгу мутацій.

Нуклеїнову кислоту, яка одержана з окремих рослин, клітин рослини або рослинного матеріалу можна необов'язково з'єднати для того, щоб прискорити скринінг по відношенню до мутацій у популяції рослин, які походять з рослинних тканин, клітин або матеріалу, що були піддані мутагенезу. Можна перевірити одне або більше наступних поколінь рослин, клітин рослини або рослинного матеріалу. Розмір необов'язково з'єднаної групи залежить від чутливості способу скринінгу, який використовується.

Після того, як зразки нуклеїнових кислот необов'язково з'єднали, їх можна піддати методикам полінуклеотид-специфічної ампліфікації, таким як полімеразна ланцюгова реакція.

Будь-який один або більше праймерів або зондів, що є специфічними для гена або послідовностей, які безпосередньо примикають до гена, можна використовувати для ампліфікації послідовностей в необов'язково з'єднаному зразку нуклеїнових кислот. Приклади олігонуклеотидних праймерів викладені у ХЕО ІЮО МО: 13, або 5ЕО ІЮ МО: 14, або 5ЕО ІЮ МО: 15 і ЗЕО ІЮ МО: 16. Переважно, 5ЕО ІЮ МО: 13 і ЗЕО ІЮО МО: 14 використовують у комбінації для детектування МіАзп-1. Переважно, ЗЕО ІЮ МО: 15 ії 5ЕО ІЮ МО: 16 використовують у комбінації для детектування МіІАзп-5. Переважно один або більше праймерів або зондів конструюють для ампліфікації ділянок локусу, в яких з найбільшою ймовірністю виникають корисні мутації.

Найбільше переважно праймер конструюють для виявлення мутацій на ділянках полінуклеотиду. Додатково, переважним для праймера(праймерів) і зонда(зондів) було би уникати відомих поліморфних сайтів для полегшення скринінгу точкових мутацій. Для полегшення виявлення продуктів ампліфікації один або більше праймерів або зондів можна мітити з використанням будь-якого загальноприйнятого способу введення мітки.

Праймер(праймери) або зонд(ізонди) можна сконструювати на основі послідовностей, що описані у даному документі, за допомогою способів, які добре відомі у даній галузі.

Для полегшення виявлення продуктів ампліфікації праймер(праймери) або зонд(зонди) можна помітити з використанням будь-якого загальноприйнятого способу введення мітки. Їх можна сконструювати на основі послідовностей, що описані у даному документі, за допомогою способів, які добре відомі у даній галузі. Поліморфізми можна ідентифікувати за допомогою засобів, що відомі у даній галузі, і деяких з описаних у літературі.

У додатковому аспекті передбачений спосіб одержання мутантної рослини. Спосіб включає одержання щонайменше однієї клітини рослини, що містить ген, який кодує функціональний полінуклеотид, що описаний у даному документі (чи будь-яку з комбінацій, що описані у даному документі). Далі, цю щонайменше одну клітину рослини обробляють в умовах, які ефективні для модулювання активності полінуклеотиду(полінуклеотидів), що описаний(описані) у даному документі. Щонайменше одну мутантну клітину рослини потім розмножують в мутантну рослину, де мутантна рослина має модульований рівень поліпептиду(поліпептидів), що описаний, (або будь-якої їх комбінації, що описана у даному документі) у порівнянні з рівнем у контрольній рослині. В одному варіанті здійснення даного способу одержання мутантної рослини стадія обробки включає вплив щонайменше на одну клітину хімічним мутагенним засобом, описаним вище, і в умовах, що ефективні для одержання щонайменше однієї мутантної клітини рослини.

В іншому варіанті здійснення даного способу стадія обробки включає піддавання щонайменше однієї клітини впливу джерела іонізуючого випромінювання в умовах, що ефективні для одержання щонайменше однієї мутантної клітини рослини. Термін "мутантна рослина" включає мутантні рослини, в яких генотип є модифікованим у порівнянні з контрольною рослиною, переважно за допомогою засобів, які відрізняються від генної інженерії та генетичної модифікації.

У деяких варіантах здійснення мутантна рослина, мутантна клітина рослини або мутантний рослинний матеріал може містити одну або більше мутацій, які зустрічаються у природі в іншій рослині, клітині рослини або рослинному матеріалі та забезпечують бажану ознаку. Дану мутацію можна ввести (наприклад, шляхом інтрогресії) в іншу рослину, клітину рослини або рослинний матеріал (наприклад, рослину, клітину рослини або рослинний матеріал з генетичним фоном, що відрізняється від такої рослини, з якої відбувається мутація) для створення мутації, яка не зустрічається у природі у даній рослині, і для забезпечення у зазначеної рослини даної ознаки. Таким чином, як приклад, мутацію, яка зустрічається у природі у першій рослині, можна ввести в другу рослину, наприклад, другу рослину з іншим генетичним фоном відносно першої рослини. Фахівець у даній галузі, таким чином, може здійснювати пошук бо й ідентифікувати рослину, що несе у природних умовах в своєму геномі одну або більше мутантних алелей генів, що описані у даному документі, які забезпечують бажану ознаку.

Мутантний алель(алелі), який(які) зустрічається (зустрічаються) у природі, можна перенести в другу рослину різними способами, включаючи селекцію, зворотне схрещування й інтрогресію з одержанням ліній, сортів або гібридів, які мають одну або більше мутацій в генах, що описані у даному документі. Рослини, що демонструють бажану ознаку, можна відібрати з пулу мутантних рослин. Переважно відбір здійснюють з використанням даних про нуклеотидні послідовності, що описані у даному документі. Відповідно, можна здійснювати відбір за генетичною ознакою у порівнянні з контролем. Такий скринінговий підхід може включати застосування загальноприйнятих методик ампліфікації та/або гібридизації нуклеїнових кислот, як обговорюється у даному документі. Таким чином, наступний аспект відноситься до способу ідентифікації мутантної рослини, причому зазначений спосіб включає наступні стадії: (а) забезпечення зразка, що містить нуклеїнову кислоту з рослини; і (б) визначення послідовності нуклеїнових кислот полінуклеотиду, де відмінність у послідовності полінуклеотиду у порівнянні з полінуклеотидною послідовністю контрольної рослини свідчить про те, що зазначена рослина є мутантною рослиною. В іншому аспекті запропонований спосіб ідентифікації мутантної рослини, що накопичує знижені рівні аспарагіну у порівнянні з контрольною рослиною, причому зазначений спосіб включає наступні стадії: (а) забезпечення зразка з рослини, що підлягає скринінгу; (Б) визначення того, чи містить зазначений зразок одну або декілька мутацій в одному або декількох полінуклеотидах, що описані у даному документі; і (с) визначення вмісту щонайменше аспарагіну в зазначеній рослині.

В іншому аспекті запропонований спосіб одержання мутантної рослини, яка характеризується зниженими рівнями аспарагіну у порівнянні з контрольною рослиною, причому зазначений спосіб включає наступні стадії: (а) забезпечення зразка з першої рослини; (Б) визначення того, чи містить зазначений зразок одну або декілька мутацій в одному або декількох полінуклеотидах, що описані у даному документі, які призводять до зниження рівнів аспарагіну; і (с) перенесення однієї або декількох мутацій в другу рослину. Мутацію(мутації) можна перенести в другу рослину за допомогою різних способів, які відомі у даній галузі, наприклад, за допомогою генної інженерії, маніпуляції з генами, інтрогресії, селекції рослин, зворотнього схрещування та їм подібних. В одному варіанті здійснення перша рослина є

Зо рослиною, що зустрічається у природі. В одному варіанті здійснення друга рослина має генетичний фон, що відрізняється відносно першої рослини.

В іншому аспекті запропонований спосіб одержання мутантної рослини, яка характеризується зниженими рівнями аспарагіну у порівнянні з контрольною рослиною, причому зазначений спосіб включає наступні стадії: (а) забезпечення зразка з першої рослини; (Б) визначення того, чи містить зазначений зразок одну або декілька мутацій в одному або декількох полінуклеотидах, що описані у даному документі, які призводять до зниження рівнів аспарагіну; й (с) інтрогресію однієї або декількох мутацій з першої рослини в другу рослину. В одному варіанті здійснення стадія інтрогресії включає в себе селекцію рослин, необов'язково включаючи зворотне схрещування та їм подібні. В одному варіанті здійснення перша рослина є рослиною, що зустрічається у природі. В одному варіанті здійснення друга рослина має генетичний фон, що відрізняється відносно першої рослини. В одному варіанті здійснення перша рослина не є сортом або елітним сортом. В одному варіанті здійснення друга рослина являє собою сорт або елітний сорт.

Додатковий аспект відноситься до мутантної рослини (включаючи мутантну рослину сорту або елітного сорту), яка одержана або одержується за допомогою способів, що описані у даному документі. У деяких варіантах здійснення "мутантна рослина" може містити одну або декілька мутацій, які локалізовані лише у конкретній ділянці рослини, наприклад, у послідовності одного або декількох полінуклеотидів, що описані у даному документі. Згідно з даним варіантом здійснення інша геномна послідовність мутантної рослини буде такою самою або практично такою самою, як в рослині до мутагенезу.

У певних варіантах здійснення мутантні рослини можуть мати одну або більше мутацій, які локалізовані на більше ніж одній ділянці рослини, наприклад, у послідовності одного або більше полінуклеотидів, що описана у даному документі, і в одній або більше додаткових ділянках геному. Згідно з даним варіантом здійснення інша геномна послідовність мутантної рослини не буде такою самою або не буде практично такою самою, як в рослині до мутагенезу. У певних варіантах здійснення мутантні рослини можуть не мати одну або більше мутацій в одному або більше, двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше або п'яти або більше екзонах полінуклеотиду (полінуклеотидів), що описаний(описані) у даному документі; або не можуть мати одну або більше мутацій в одному або більше, двох, трьох, чотирьох або п'яти або більше бо інтронах полінуклеотиду(полінуклеотидів), що описаний(описані) у даному документі; або не можуть мати одну або більше мутацій у промоторі полінуклеотиду (полінуклеотидів), що описаний(описані) у даному документі; або не можуть мати одну або більше мутацій в 3'- нетрансльованій ділянці полінуклеотиду (полінуклеотидів), що описаний(описані) у даному документі; або не можуть мати одну або більше мутацій в 5'- нетрансльованій ділянці полінуклеотиду (полінуклеотидів), що описаний(описані) у даному документі; або не можуть мати одну або більше мутацій в кодуючій ділянці полінуклеотиду(полінуклеотидів), що описані(описаний) у даному документі; або не можуть мати одну або більше мутацій в некодуючій ділянці полінуклеотиду(полінуклеотидів), що описаний(описані) у даному документі; або будь-яку комбінацію двох або більше, трьох, чотирьох або більше, п'яти або більше, або шести або більше з їх частин.

У наступному аспекті запропонований спосіб ідентифікації рослини, клітини рослини або рослинного матеріалу, що містять мутацію в гені, який кодує полінуклеотид, що описаний у даному документі, причому зазначений спосіб включає: (а) здійснення мутагенезу рослини, клітини рослини або рослинного матеріалу; (Б) одержання зразка нуклеїнової кислоти із зазначеної рослини, клітини рослини або рослинного матеріалу або їх потомків; і (с) визначення послідовності нуклеїнових кислот гена, яка кодує полінуклеотид, що описаний у даному документі, або її варіантів або фрагментів, де різниця у зазначеній послідовності свідчить про одну або більше мутацій в ній.

Білки "цинкові пальці" також можна застосовувати для модулювання експресії або активності одного або декількох полінуклеотидів, що описані у даному документі. У різних варіантах здійснення послідовність геномної ДНК, що містить частину або всю кодуючу послідовність полінуклеотиду, модифікують шляхом мутагенезу, що опосередкований нуклеазою з мотивом цинкового пальця. У послідовності геномної ДНК здійснюють пошук унікального сайту зв'язування білка "цинковий палець". Як альтернатива, у послідовності геномної ДНК здійснюють пошук двох унікальних сайтів для зв'язування білка "цинковий палець", причому обидва сайти знаходяться на протилежних нитках і недалеко один від одного, наприклад, на відстані 1, 2, 3, 4, 5, 6 або більше пар основ один від одного. Відповідно, запропоновані білки "цинкові пальці", які зв'язуються з полінуклеотидами.

Білок "цинковий палець" можна сконструювати для розпізнавання вибраного цільового сайту

Зо в гені. Білок "цинковий палець" може містити будь-яку комбінацію мотивів, що одержані з природних ДНК-зв'язуючих доменів цинкового пальця та неприродних ДНК-зв'язуючих доменів цинкового пальця шляхом усічення або розширення або способу сайт-спрямованого мутагенезу у поєднанні зі способом відбору, таким як без обмеження відбір за допомогою фагового дисплея, відбір за допомогою бактеріальної дигібридної системи або відбір за допомогою бактеріальної одногібридної системи. Термін "неприродний ДНК-зв'язуючий домен цинкового пальця" належить до ДНК-зв'язуючого домену цинкового пальця, який зв'язує послідовність з трьох пар основ у цільовій нуклеїновій кислоті й який не походить з клітини або організму, що містить нуклеїнову кислоту, яка підлягає модифікації. Способи конструювання білка "цинковий палець", який зв'язує специфічні нуклеїнові послідовності, що є унікальними для цільового гена, відомі у даній галузі.

Нуклеазу з мотивом цинкового пальця можна сконструювати шляхом утворення зливання першого полінуклеотиду, що кодує білок "цинковий палець", який зв'язується з полінуклеотидом, і другого полінуклеотиду, що кодує неспецифічну ендонуклеазу, таку як без обмеження ендонуклеаза типу ІІ5. Білок злиття між білком "цинковий палець" та нуклеазою може містити спейсер, що складається з двох пар основ або, як альтернатива, спейсер, що складається з трьох, чотирьох, п'яти, шести, семи або більше пар основ. У різних варіантах здійснення нуклеаза цинкового пальця вводить дволанцюговий розрив у регуляторну область, яка кодує область або не кодує область послідовності геномної ДНК полінуклеотиду та призводить до зниження рівня експресії полінуклеотиду або зниження активності білка, що кодований ним.

Розщеплення за допомогою нуклеаз з мотивом цинкового пальця в результаті часто призводить до делеції ДНК в сайті розщеплення з подальшою репарацією ДНК шляхом з'єднання негомологічних кінців.

В інших варіантах здійснення білок "цинковий палець" можна вибирати для зв'язування з регуляторною послідовністю полінуклеотиду. Більше конкретно, регуляторна послідовність може містити сайт ініціації транскрипції, стартовий кодон, ділянку екзону, межу розподілу екзон- інтрон, термінатор або стоп-кодон. Відповідно, у даному винаході запропонована мутантна, трансгенна рослина або рослина, що не зустрічається у природі, або клітини рослини, які одержані за допомогою мутагенезу, що опосередкований нуклеазою з мотивом "цинкового пальця", поблизу від або в межах одного або більше полінуклеотидів, що описані у даному 60 документі, і способи створення такої рослини або клітини рослини за допомогою мутагенезу, що опосередкований нуклеазою з мотивом "цинкового пальця". Способи доставки білка "динковий палець" та нуклеази з мотивом "цинкового пальця" в рослину є подібними тим, що описані нижче, для доставки мегануклеази.

В іншому аспекті описані способи одержання мутантних, трансгенних або рослин, що не зустрічаються у природі, які генетично модифіковані іншим чином, з використанням мегануклеаз, таких як І-СтеІ. Мегануклеази, що зустрічаються у природі, а також рекомбінантні мегануклеази можна використовувати для того, щоб специфічно викликати двонитковий розрив в одному сайті або у відносно невеликому числі сайтів у геномній ДНК рослини з руйнуванням одного або більше полінуклеотидів, що описані у даному документі. Мегануклеаза може бути сконструйованою мегануклеазою зі зміненими властивостями розпізнавання ДНК. Білки мегануклеаз можна доставляти в клітини рослини за допомогою різних механізмів, що відомі у даній галузі.

Даний винахід також охоплює застосування мегануклеаз для інактивації полінуклеотиду або полінуклеотидів, що описаний у даному документі (або будь-якої комбінації полінуклеотидів, як описано у даному документі), в клітині рослини або в рослині. Зокрема, у даному винаході запропонований спосіб інактивації полінуклеотиду в рослині за допомогою мегануклеази, причому зазначений спосіб включає: (а) забезпечення клітини рослини, що містить полінуклеотид, що описаний у даному документі; (б) введення мегануклеази або конструкції, яка кодує мегануклеазу, в зазначену клітину рослини і (с) надання можливості мегануклеазі в значній мірі інактивувати полінуклеотид або полінуклеотиди.

Мегануклеази можна використовувати для розщеплення сайтів розпізнавання мегануклеази у кодуючих ділянках полінуклеотиду. Таке розщеплення часто призводить в результаті до делеції ДНК у сайті розпізнавання мегануклеази з подальшою репарацією мутагенної ДНК шляхом з'єднання негомологічних кінців. Такі мутації у кодуючій послідовності гена є, як правило, достатніми для інактивації гена. Цей спосіб модифікації клітини рослини включає, по- перше, доставку касети експресії мегануклеази до клітини рослини за допомогою підходящого способу трансформації. Для досягнення максимальної ефективності бажано зв'язати касету експресії мегануклеази з маркером, що селектується, і відібрати успішно трансформовані клітини у присутності селективного засобу. Цей підхід призведе до інтеграції касети експресії

Зо мегануклеази в геном, що, однак, може бути небажаним, якщо рослина, швидше за все, вимагатиме офіційного дозволу. У таких випадках касету експресії мегануклеази (і зв'язаний маркерний ген, що селектується) можна виділити з наступних поколінь рослини з використанням традиційних методик селекції. Як альтернатива, клітини рослини можна первісно трансформувати касетою експресії мегануклеази без селектованого маркера та можна виростити на середовищах без селективного засобу. У таких умовах частина оброблених клітин здобуде касету експресії мегануклеази та буде експресувати сконструйовану мегануклеазу тимчасово без інтеграції касети експресії мегануклеази в геном. Оскільки це не призводить до ефективності трансформації, остання процедура трансформації потребує скринінгу більшої кількості оброблених клітин для одержання бажаної модифікації генома. Описаний вище підхід можна також застосувати для модифікації рослинної клітини при використанні білка "цинковий палець" або нуклеази з мотивом цинкового пальця.

Після доставки касети експресії мегануклеази клітини рослини вирощують, спочатку, в умовах, які є типовими для конкретної процедури трансформації, яку використовували. Це може означати, що трансформовані клітини ростуть на середовищах при температурі нижче 26 26, найчастіше в темряві. Такі стандартні умови можна використовувати протягом періоду часу, переважно 1-4 дня, щоб дати рослинній клітині відновитися після процесу трансформації. У будь-який момент після цього початкового періоду відновлення температуру росту можна підвищити для стимулювання активності сконструйованої мегануклеази по відношенню до розщеплення та мутування сайту розпізнавання мегануклеази.

Для певних застосувань може бути бажаним точно видалити полінуклеотид з генома рослини. Такі застосування можливі з використанням пари сконструйованих мегануклеаз, кожна з яких розщеплює сайт розпізнавання мегануклеази по обидві сторони від передбачуваної делеції. Також можна використовувати ефекторні нуклеази ТАГ (ТАГ ЕМ), які здатні розпізнавати та зв'язуватися з геном і вносити двонитковий розрив у геном. Таким чином, в іншому аспекті пропонуються способи одержання мутантних, що не зустрічаються у природі, або трансгенних або іншим чином генетично модифікованих рослин, які описані у даному документі, за допомогою ефекторних нуклеаз ТАЇ.

Гени, які були ідентифіковані як залучені в синтез аспарагіну у ході обробки у різновиді

Берлі Місоїіпіа їабасит, можуть бути застосованими для інших рослин й інших різновидів рослин. Внаслідок цього даний винахід є, ймовірно, відтвореним в інших рослинах і застосовуваним для селекції з лініями варіантів.

Рослини, що є підходящими для використання у даному винаході, включають, без обмеження, однодольні та дводольні рослини і системи клітин рослин, у тому числі види з одного 3 наступних сімейств: Асапіпасеає, АЇіасеає, АЇбігоетегіасеає, АтагуїІаасеавє,

Аросупасеає, Агесасеає, Абвієгасеає, Вегрегідасеає, Віхасеає, Вгазввзісасеає, Вготеїасеєав,

Саппабасеає, СагуорпуПІасеає, Сернаіотахасеєає, Спепородіасеає, СоіІспісасеає, Сиситьіїасеає, ріозсогеасеає, Ерпедгасеає, Егуїпгохуіасеає, Еирпоїбіасеає, ЕРабасеєає, І атіасеєає, І іпасеає,

І усородіасеає, Маїмасеає, Меїапіпіасеає, Мизасеає, Мупасеає, Муз5засеєає, Рарамегасеєає,

Ріпасеає, Ріапіадіпасєає, Роасєає, Возасєає, Вибіасеєає, Заїїсасєає, Заріпдасеає, 5оЇІапасєає,

Тахасеає, Тпеасеає або Міїасеав.

Підходящі види можуть включати представників роду АреіІтозспи5, АбБіе5, Асег, Адговії5,

АйПит, АїІбігоетегіа, Апапах, Апагодгарні5, Апагородоп, Апйетівіа, Агипао, Аїгора, Вегбегів, Веїа,

Віха, Вгаззіса, Саієпашца, Сатеїйа, Сатріоїнеса, Саппабріх, Сарзісит, Сапнпатив, Саїйагапійив, Серпнаіюїахив, Спгузапптетит, Сіпспйопа, Сігии5, Сомїеа, СоІспісит, Соїєив5, Сиситів, Сиситойа,

Суподоп, Оаїцга, Оіапіпив, Оідйаїйв, Оіовзсогеа, ЕЇаєї5, ЕрПпеадга, Епапіпи5, Егуїйттохуїшт,

Еисаїуріи5, ЕРевзіиса, Егадапа, Саїапіпив, Сіусіпе, Совзвзурішт, Неїїапіпи5, Немєа, Ногадеит,

Нуозсуативх, дЧаїгорна, ІГасіиса, Гіпит, І оїїшт, І иріпи5, І усорегвісоп, Гусородішит, Мапіної,

Медісадо, Мепійа, Мівсапіпи5, Мива, Місойапа, Огуга, Рапісит, Рарамег, Рапйепішт,

Реппізешт, Решпіа, Ріаїагі5, РпІєит, Ріпив5, Роа, Роіпзеціа, Роршив, Нашмжоїа, Вісіпи5, Нова,

Засспагит, зЗаїїх, Запаціпайа, Зсороїйа, бесаіє, бБоїапит, Богдпит, Зрапіпа, Зріпасєа,

Тапасешт, Тахих5х, ТПпеоргота, Тгйсозесаїе, Тгійісит, Опіоїа, Мегаїгит, Міпса, Мі і 7еа.

Підходящі види можуть включати Рапісит 5рр., Зогайит врр., Мізсапіпив 5рр., Засспагит 5рр., Епапіпизх 5рр., Рорши5 5рр., Апагородоп дегагаії (бородач), Реппізешт ригригент (слонова трава), РІаїагі5 агипдіпасеа (двокісточник очеретоподібний), Суподоп адасіуюп (свинорий пальчастий), ебзіиса агипдіпасеа (вівсяниця очеретна), зЗрапіпа ресііпага (спартина гребешкова), Медісадо займа (люцерна), Агипдо допах (арудо очеретовий), ЗесаЇе сегеаїе (жито), Заїїх 5рр. (верба), Єисаїуріив 5рр. (евкаліпт), Тгйісозесаїе (тритікале), бамбук, Неїїапіпи5 аппииз (соняшник), Сагпатиз (іпсіогіи5 (сафлор красильний), даїгорпа сигсаз5 (ятрофа), Кісіпи5

Зо соттипів (рицина), ЕЇІаеї5 диїпеепвіз (олійна пальма), Гіпит изпаівззітит (льон), Вгазвіса )шпсеа, Веїа мцЇдагіє (цукровий буряк), Мапіпйої езсцшіепіа (маніою), Гусорегвісоп езсшепит (томат), І асіиса 5аїїма (латук), Мизусіїзе аїіса (банан), оїапит шбегозит (картопля), Вгавв5іса оЇегасеа (броколі, цвітна капуста, брюссельська капуста), Сатеїййа в5іпепв5і5 (чай), Егадагіа апапазза (суниця), Тпеобгота сасао (какао), СоПе усіїзеса (кава), Міїй5 міпітега (виноград),

Апапа5 сото5и5 (ананас), Сарзісит аппит (гіркий та солодкий перець), Аїшт сера (цибуля),

Сиситів теїо (диня), Сиситів 5займи5 (огірок), Сисигбйа тахіта (гарбуз гігантський), Сисигрка тозепаїа (гарбуз мускатний), бріпасеа оЇегасеа (шпинат), СйгиПи5 Іапаїи5 (кавун), АбеІтов5спи5 езсціепіи5 (бамія), Зоїапит теіІопдепа (баклажан), Коза 5рр. (троянда), Оіапіпи5 сагуорпуїШ5 (гвоздика), Решпіа 5рр. (петунія), Роіпзеціа риЇспегтіта (пуансетія), Гиріпих5 аби (люпін), Опіоїа рапісшіаса (овес), полевиця (Аадгобії5 5рр.), Рорши5 ігетпціоіде5 (тополь осикоподібний), Ріпи5 5рр. (сосна), Абіез 5рр. (ялиця), Асег 5рр. (клен), Ногдешт миЇдаге (ячмінь), Роа ргаїепвіб (тонконіг), ГоЇшт 5рр. (плевел) і РПїешт ргагепзе (тимофіївка), Рапісит мігдайит (просо), зЗогопиЗбусіїзеЗзбабо (сорго, суданська трава), Мізсапіпи5 дідапієи5 (міскантус), Засспагит 5р. (цукровий тростник), Рорши5 Баїзатіїтега (тополя), 7еа тау5 (кукурудза), Сіусіпе тах (соя),

Вгазвзіса париз (канола), Ттйісит аевіїмит (пшениця), Со55урішт пігешщит (бавовна), Огуга заїїма (рис), НеІйапіпи5 аппии5 (соняшник), Медісадо з5аїїма (люцерна), Веїа миЇдагіє5 (цукровий буряк) або Реппізешт діаисит (просо перлове).

Різні варіанти здійснення спрямовані на мутантні рослини, рослини, що не зустрічаються у природі, або трансгенні рослини або клітини рослини, що модифіковані для модулювання рівнів експресії гена, в результаті чого одержують рослину, наприклад, рослину тютюну або клітину рослини тютюну, в яких рівень експресії поліпептиду модульований в тканинах, що представляють інтерес, у порівнянні з контролем. Розкриті композиції та способи можна застосовувати для будь-якого виду роду Місойапа, в тому числі М. гивіїса і М. їабасит (наприклад, ГА В21, ЇМ КМУ171, ТІ 1406, Вазта, Саїрас, Регідие, Веїіппапй 1000-1 і Рейісо). Інші види включають М. асації5, М. аситіпаїа, М. айісапа, М. аІага, М. атедпіпої, М. атріехісаціїв, М. агепівії, М. анепиаїа, М. агатрцу)ає, М. репамідевії, М. бепінатіапа, М. рідеїомії, М. Бопагіепвів, М. самісоїа, М. сіємеїапай, М. согайойа, М. согутроза, М. дерпеуї, М. ехсеївіог, М. Тогудейапа, М. їгадгапв, М. діаиса, М. дішіпоза, М. дооазреедії, М. доззеї, М. пургіа, М. іпдиїба, М. КамжаКатії, М.

Кпідпіапа, М. Іапдзаотіі, М. Ппеагіє, М. Ююпойога, М. тагіййта, М. тедаІозірпоп, М. тіеєгвії, М. (510) посійога, М. пидісаціїв, М. оріи5ітоїїа, М. оссідепіаїййв5, М. оссідепіа!й5 зибз5р. пезретгів, М. оїорнпога,

М. рапісшіага, М. раисійога, М. решпіоіде5, М. ріштбадіпітоїа, М. диаадгімамів, М. гаітопаїї, М. герапда, М. ко5шШага, М. го5шШіага 5!Иирер. іпдира, М. гоїшпайойа, М. взеїспеїйі, М. вітшіапв5, М. 5оїапітоїіа, М. зредаягліпії, М. віосКюпії, М. зцамеоїепв, М. зуїмевігів, М. пут Шога, М. ютепіоза, М.

Тотепіовіїоптів, М. Мідопорпуйа, М. итбгаїййса, М. опашціага, М. меїшіпа, М. мідапайоідез і М. х 5апаегав.

Використання сортів тютюну й елітних сортів тютюну також розглядається у даному документі. Трансгенна, що не зустрічається у природі або мутантна рослина, відповідно, може бути сортом тютюну або елітним сортом тютюну, що містить один або більше трансгенів або одну або більше генетичних мутацій або їх комбінацію. Генетична мутація(мутації) (наприклад, один або більше поліморфізмів) можуть являти собою мутації, які не існують у природі, в окремому різновиді тютюну або сорті тютюну (наприклад, елітному сорті тютюну), або може являти собою генетичну мутацію(мутації), якас(які) існує(існують) у природі за умови, що мутація не існує у природі в окремому різновиді тютюну або сорті тютюну (наприклад, в елітному сорті тютюну).

Особливо застосовні різновиди Місоїйапа їарасит включають тютюн типу Берлі, темного типу, типу димового сушіння та східного типу. Необмежувальними прикладами різновидів або сортів є: ВО 64, СС 101,2 200,20 27, СС 301, СС 400, СС 500, СС 600, СС 700, СО 800, о 900, СоКег 176, СоКег 319, СоКег 371 Со, СоКег 48, СО 263, ОБЕ911, ОТ 538 І С Саї|Ірао юобассо,

СІ 26Н, І 350,1 600, І 737, 1 939, БІ 973, НВ 04Р, НВ 04Р ІС, НВЗЗ3О7РІ С, гібрид 4031 С, гібрид 4041 С, гібрид 501 1 С, К 149, К 326, К 346, К 358, КЗ394, К 399, К 730, КОН 959, КТ 200, Кт2041С, КМ10, КМ14, КМ 160, КМ 17, КМ 171, КМ 907, КМ9071С, КМУ14ХІ8 ІС, І їшШе

Стйепаєп, МеМаїг 373, МеМаїг 944, тек 14Хі 8, Матом І єаї Мадоїє, Мао І єаї Мадоїє 1 С,

МВН 98, М-126, М-7771 0, М-73711 0, МО 100, МО 102, МО 2000, МО 291, МО 297, МО 299, МО 3,

МО 4, МО 5, МО 6, МС7, МО 606, МО 71, МО 72, МО 810, МО ВН 129, МО 2002, Меа! тій Мадоїе,

ОХРОКО 207, РО 7302 1 С, РО 7309 ІС, РО 7312 І С, тютюн "Перик", РУНОЗ, РУНО9ЗУ, РУНІ19,

РМУН5БО, РУН5БТ, А 610, А 630, ВА 7-11, А 7-12, Ва 17, Ва 81, Ва Н5т1, Ван 4, Ван 51, 85 1410, зЗреїдні 168, Зреїдні 172, бреїдні 179, 5реїдні 210, 5реїдані 220, Зреїсні 225, 5реїдні 227, Зреїдні 234, Зреідні а-28, Зреїдні 1-70, 5реїдані Н-6, бреїдні Н2гО, бреїдні МЕЗ, ТІ 1406, ТІ 1269, ТМ 86,

ТМ86І С, ТМ 90, ТМ 97, ТМУ971 С, ТМ 094, ТМ 0950, ТА (Тот Воз55оп) Мадоїє, МА 309, МАЗ59, АА 0/0 37-1, ВІЗР, Хапійі (МіїспеїІ-Мог), ВеІ-м/ 3, 79-615, Затвзип Ноїте5 ММ, КТКОС номер 2 гібрид 49,

Берлі 21, Ку8959, КУ9, МО 609, РСО1, РОО4, РОТ, РО2, РОЗ, КО11, КО 8, МА509, А544, Бенкет

АТ, Вахта Огата В84/31, Вазта І /існпа 2РА/В, Вахта Хапні ВХ 2А, Ваїек, Везикі Уетрег,

С104, СоКег 347, СтіоПо Мізіопего, ЮеїЇсгеві, Біере! 81, ОМН 405, СаІрао Сотит, НВО4Р, Ніск5

Вгоадієаї, Каракшак ЕіІаззопа, Киїзаде ЕТ, ГА ВИ 21, МО 2326, МО 297, РМУН 2110, Ней Виззіап,

БЗатвзип, Заріак, бБіттавба, ТаЇдаг 28, М/ізіїса, Мауаідад, Риїєр НО-72, Ріїер Р23, Рійер РВ 156/1,

Риїєер РІ1І2-2/1, МаКка УК-48, Мака ОВ 125/3, ТІ-1068, КОН-960, ТІ-1070, ТМ/136, Вахта, ТКЕ 4028,

ІЇ8, ТКЕ 2002, 28141, Вахта хапіі, 5К149, ОК153, Реїй Намапа. Також передбачаються підрізновиди вищезазначеного з низьким рівнем перетворення нікотину в норнікотин, навіть якщо вони спеціально не зазначені у даному документі.

В одному варіанті реалізації використовують типовий сорт Місоїапа їабасит типу Берлі.

Інші рослини, що підходять для застосування у даному винаході, включають, без обмеження, чай (Сатеїа 5іпепвів).

Варіанти здійснення також спрямовані на композиції та способи одержання мутантних рослин, рослин, що не зустрічаються у природі, гібридних рослин і трансгенних рослин, які були модифіковані для модулювання експресії або активності полінуклеотиду(полінуклеотидів), що описаний(описані) у даному документі (або будь-якої їх комбінації, як описано у даному документі). Переважно, одержані мутантні рослини, рослини, що не зустрічаються у природі, гібридні рослини або трансгенні рослини можуть бути подібними або практично такими самими за спільним зовнішнім виглядом у порівнянні з контрольними рослинами. Різні фенотипові характеристики, такі як ступінь зрілості, кількість листків на рослині, висота стебла, кут вростання листків, розмір листка (ширина та довжина), відстань міжвузля та співвідношення листкова пластина-головна жилка можна оцінити шляхом польових спостережень.

Один аспект відноситься до насіння мутантної рослини, рослини, що не зустрічається у природі, гібридної рослини або трансгенної рослини, що описана у даному документі.

Переважно, насіння являють собою насіння тютюну. Наступний аспект відноситься до пилку або насінного зачатка мутантної рослини, рослини, що не зустрічається у природі, гібридної рослини або трансгенної рослини, що описана у даному документі. Крім того, передбачена мутантна рослина, рослина, що не зустрічається у природі, гібридна рослина або трансгенна рослина, що описана у даному документі, яка додатково містить нуклеїнову кислоту, що забезпечує чоловічу бо стерильність.

Також передбачена тканинна культура регенерованих клітин мутантної рослини, рослини, що не зустрічається у природі, гібридної рослини або трансгенної рослини або її частини, як описано у даному документі, при цьому з культури регенеруються рослини, які здатні експресувати всі морфологічні та фізіологічні батьківські характеристики. Регенеровані клітини включають без обмеження клітини з листя, пилку, зародків, сім'ядолей, гіпокотилів, коренів, кінчиків коренів, пиляків, квіток та їх частини, насінних зачатків, пагонів, стебел, черешків, серцевини та насіннєвих коробочок, або калюса, або протопластів, одержаних з них.

Ще один додатковий аспект відноситься до обробленого рослинного матеріалу, такого як оброблене листя або оброблений тютюн, що одержаний або одержується з мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини, або клітини, причому експресія одного або декількох полінуклеотидів, описаних у даному документі, або активність білка, який кодується ними, є зниженою, що призводить до зниження рівнів аспарагіну у зазначеній рослині.

Переважно, зовнішній вигляд зазначеної рослини або її частини (наприклад, листка) є по суті таким самим, як у контрольної рослини. Переважно рослина являє собою рослину тютюну.

Варіанти здійснення також спрямовані на композиції та способи для одержання мутантних, що не зустрічаються у природі або трансгенних рослин або клітин рослин, які були модифіковані для модулювання експресії або активності одного або декількох полінуклеотидів або поліпептидів, описаних у даному документі, що може призводити до одержання рослин або компонентів рослини (наприклад, листя, такі як оброблене або висушене листя) або клітин рослини зі зниженими рівнями аспарагіну.

Мутантні, що не зустрічаються у природі або трансгенні рослини, які одержані відповідно до способів, що описані у даному документі, за зовнішнім виглядом можуть бути подібними контрольним рослинам або практично такими самими. В одному варіанті здійснення вага листя у мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини, є практично такою самою, як у контрольної рослини. В одному варіанті здійснення кількість листків у мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини, є практично такою самою, як у контрольної рослини. В одному варіанті здійснення вага листя та кількість листків у мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини, є практично такими самими, як у контрольної рослини. В одному варіанті здійснення висота стебла в мутантних, що не зустрічаються у

Зо природі або трансгенних рослинах, є практично такою самою, як у контрольних рослин через, наприклад, один, два або три або більше місяців після пересадження у полі або через 10, 20, 30 чи 36 або більше днів після обрізання верхівок. Наприклад, висота стебла в мутантних, що не зустрічаються у природі або трансгенних рослинах, є не меншою, ніж висота стебла в контрольних рослинах. В іншому варіанті здійснення вміст хлорофілу в мутантних, що не зустрічаються у природі або трансгенних рослинах, є практично таким самим, як у контрольних рослинах. В іншому варіанті здійснення висота стебла в мутантних, що не зустрічаються у природі або трансгенних рослинах, є практично такою самою, як у контрольних рослинах, і вміст хлорофілу в мутантних, що не зустрічаються у природі або трансгенних рослинах, є практично таким самим, як у контрольних рослинах. В інших варіантах здійснення розмір або форма, або кількість або забарвлення листя в мутантних, що не зустрічаються у природі або трансгенних рослинах, є практично такою самою, як у контрольних рослинах. Переважно рослина являє собою рослину тютюну.

Згідно з іншим аспектом запропонований спосіб модулювання (наприклад, зниження) кількості аспарагіну щонайменше в частині рослини (наприклад, у листі, таких як оброблене або висушене листя, або в тютюні), причому зазначений спосіб включає наступні стадії: (і) модулювання (наприклад, зниження) експресії або активності одного або декількох поліпептидів, описаних у даному документі, причому, переважно, поліпептид або поліпептиди кодуються відповідною полінуклеотидною послідовністю, описаною у даному документі; (ії) вимірювання вмісту аспарагіну щонайменше в частині (наприклад, в листі, такому як оброблене листя) мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини, яка одержана на стадії (ї); й (ії) ідентифікацію мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини, в якій вміст аспарагіну був знижений у порівнянні з контрольною рослиною. Переважно зовнішній вигляд зазначеної мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини, є практично таким самим, як у контрольної рослини. Переважно рослина являє собою рослину тютюну.

В іншому аспекті запропонований спосіб зниження кількості аспарагіну щонайменше в частині обробленого або висушеного рослинного матеріалу, такого як оброблене або висушене листя, причому зазначений спосіб включає наступні стадії: (ї) зниження експресії або активності одного або декількох поліпептидів, описаних у даному документі, причому, переважно, 60 поліпептид або поліпептиди кодуються відповідною полінуклеотидною послідовністю, описаною у даному документі; (її) збирання рослинного матеріалу, такого як один або декілька листків, й обробка або сушіння протягом певного періоду часу; (ії) вимірювання вмісту аспарагіну щонайменше в частині рослинного матеріалу, що одержаний на стадії (ії); й (м) ідентифікацію обробленого або висушеного рослинного матеріалу, в якому вміст аспарагіну був знижений у порівнянні з контрольною рослиною.

Зниження експресії у порівнянні з контролем може становити від приблизно 595 до приблизно 100 95, або зниження може становити від щонайменше 10 95, щонайменше 20 95, щонайменше 25 9о, щонайменше 30 96, щонайменше 40 95, щонайменше 50 9565, щонайменше 6096, щонайменше 7095, щонайменше 7595, щонайменше 8095, щонайменше 90 95, щонайменше 9595, щонайменше 9895 або 10095, яке включає зниження транскрипційної активності або рівня експресії полінуклеотиду або рівня експресії поліпептиду або їх комбінації.

Зниження активності у порівнянні з контролем може становити від приблизно 595 до приблизно 100 95, або зниження може становити від щонайменше 10 95, щонайменше 20 95, щонайменше 25 9о, щонайменше 30 96, щонайменше 40 95, щонайменше 50 95, щонайменше 6096, щонайменше 7095, щонайменше 7595, щонайменше 8095, щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 98 95 або 100 95.

Полінуклеотиди та рекомбінантні конструкції що описані у даному документі, можна використовувати для модулювання експресії ферментів, описаних у даному документі, у видах рослин, що представляють інтерес, переважно в тютюні.

Множину способів на основі полінуклеотидів можна використовувати для збільшення рівня експресії генів, наприклад, у рослинах або клітинах рослин. Як приклад, можна одержувати конструкцію, вектор або вектор експресії що сумісні з рослиною, яка підлягає трансформуванню, що містить ген, що представляє інтерес, разом із промотором, який розташований вище за ланцюгом, що здатний здійснювати надекспресію гена в рослині або клітині рослини. Ілюстративні промотори описані у даному документі. Після трансформації та при зростанні у підходящих умовах промотор може керувати експресією з метою модулювання (наприклад, зниження) рівнів даного ферменту в рослині або в конкретній його тканині. В одному ілюстративному варіанті здійснення створюють вектор, що несе один або декілька полінуклеотидів, описаних у даному документі (або будь-яку їх комбінацію, як описано у даному

Зо документі) для надекспресії гена в рослині або клітині рослини. Вектор несе відповідний промотор, такий як промотор 355 вірусу мозаїки цвітної капусти Саму, вище за ланцюгом трансгена, що керує його конститутивною експресією у всіх тканинах рослини. Вектор також несе ген стійкості до антибіотика з метою забезпечення можливості відбору трансформованих калюсів і клітинних ліній.

Різні варіанти здійснення спрямовані на способи зниження рівня експресії одного або більше полінуклеотидів, що описані у даному документі шляхом інтеграції множини копій полінуклеотиду в геном рослини, причому зазначені способи включають: трансформацію клітини рослини-господаря вектором експресії, що містить промотор, який функціонально зв'язаний з одним або більше полінуклеотидами, що описані у даному документі. Поліпептид, що кодується рекомбінантним полінуклеотидом, може бути нативним поліпептидом, або може бути гетерологічним по відношенню до клітини.

Рослину, що несе мутантний алель одного або більше полінуклеотидів, описаних у даному документі, (або будь-якої комбінації полінуклеотидів, як описано у даному документі) можна використовувати у програмі селекції рослин для створення придатних ліній, різновидів і гібридів.

Зокрема, мутантний алель інтрогресують у комерційно важливі різновиди, що описані вище.

Таким чином, запропоновані способи селекції рослин, які передбачають схрещування мутантної рослини, рослини, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини, як описано у даному документі, з рослиною, що містить генетичні особливості, які відрізняються. Спосіб може додатково передбачати схрещування потомства рослини з іншою рослиною та, необов'язково, повторне схрещування до тих пір, поки не буде одержане потомство з бажаними генетичними ознаками або генетичним фоном. Однією з цілей, для якої підходять такі способи селекції, є введення бажаної генетичної ознаки в інші різновиди, селекційні лінії, гібриди або сорти, особливо ті, які являють комерційний інтерес. Іншою метою є полегшення накопичення генетичних модифікацій різних генів в окремих різновидах, лініях, гібридах або сортах рослин.

Передбачаються внутрішньовидові, а також міжвидові схрещування. Рослини-нащадки, які виникають в результаті таких схрещувань, також названі селекційними лініями, є прикладами рослин, що не зустрічаються у природі, згідно з даним винаходом.

В одному варіанті здійснення запропонований спосіб одержання рослини, що не зустрічається у природі, причому зазначений спосіб включає: (а) схрещування мутантної або бо трансгенної рослини з другою рослиною з одержанням насіння-нащадків тютюну; (Б)

вирощування насіння-нащадків тютюну в умовах зростання рослин з одержанням рослини, що не зустрічається у природі. Спосіб може додатково включати: (с) схрещування попереднього покоління рослини, що не зустрічається у природі, з самою собою або з іншою рослиною з одержанням насіння-нащадка тютюну; (4) вирощування насіння-нащадка зі стадії (с) в умовах зростання рослин з одержанням додаткових рослин, що не зустрічаються у природі; і (є) повторення стадій схрещування та вирощування (с) і (4) багато разів з одержанням наступних поколінь рослин, що не зустрічаються у природі. Спосіб може необов'язково передбачати перед стадією (а) стадію одержання батьківської рослини, що містить охарактеризовані генетичні особливості й є не ідентичною мутантній або трансгенній рослині. У деяких варіантах здійснення, в залежності від програми селекції, стадії схрещування та вирощування повторюють від О до 2 разів, від 0 до З разів, від 0 до 4 разів, 0 до 5 разів, від 0 до 6 разів, від 0 до 7 разів, від

О до 8 разів, від 0 до 9 разів або від 0 до 10 разів для створення поколінь рослин, що не зустрічаються у природі. Зворотне схрещування є прикладом такого способу, в якому нащадків схрещують з одним з його батьків або з іншою рослиною, що є генетично подібною його батькам, для одержання нащадка-рослини у наступному поколінні, який має генетичні особливості, що є більше близькими до одного з батьків. Методики селекції рослин, зокрема селекції рослин, добре відомі та можуть бути використані в способах згідно з даним винаходом.

У даному винаході додатково запропоновані рослини, що не зустрічаються у природі, які одержані за допомогою даних способів. Певні варіанти здійснення виключають стадію селекції рослини.

У деяких варіантах здійснення способів, що описані у даному документі, лінії, що одержані в результаті селекції та скринінгу варіантних генів, оцінюють у полі з використанням стандартних польових процедур. Включені контрольні генотипи, в тому числі вихідних батьків, що не піддавалися мутагенезу, і місця посадки рослин розташовані у полі згідно з рандомізованим повноблочним планом або згідно з іншим відповідним плануванням поля. Для тютюну використовують стандартні агротехнічні прийоми, наприклад, тютюн збирають, зважують та відбирають зразки для хімічного та іншого загальноприйнятого тестування до та під час обробки або сушіння. Статистичний аналіз даних виконують для підтвердження схожості вибраних ліній з батьківською лінією. Цитогенетичні аналізи вибраних рослин необов'язково виконують для

Зо підтвердження взаємозв'язків набору хромосом і кон'югації хромосом.

ДНК-фінгерпринтінг, однонуклеотидний поліморфізм, мікросателітні маркери або подібні технології можна використовувати у програмі селекції з вибором за допомогою маркера (МА5) для перенесення або розведення мутантних алелей гена в інших рослинах, як описано у даному документі. Наприклад, селекціонер може створити популяції, що розщеплюються, при гібридизації генотипу, що містить мутантну алель, з генотипом, що потребується з точки зору агрономії. Рослини з Е2 або зворотно схрещених поколінь можна піддати скринінгу з використанням маркера, що одержаний з геномної послідовності або її фрагмента, з використанням однієї з методик, що перелічені у даному документі. Рослини, які ідентифіковані як такі, що мають мутантний алель, можна піддати зворотному схрещуванню або самозапиленню для утворення другої популяції, яка підлягає скринінгу. В залежності від запропонованого способу наслідування або технології МА5, що використовується, може бути необхідним самозапилення для вибраних рослин перед кожним циклом зворотного схрещування для полегшення виявлення необхідних окремих рослин. Зворотне схрещування або іншу процедуру селекції можна повторювати до тих пір, поки необхідний фенотип рекурентного батька не відновиться.

У програмі селекції успішні схрещування дають рослини Е1, які є фертильними. Відібрані рослини Е1Ї можна схрещувати з одним із батьків, і рослини першого покоління зворотного схрещування самозапилюють з одержанням популяції, яку знову піддають скринінгу на експресію варіантного гена (наприклад, нульовій версії гена). Процес зворотного схрещування, самозапилення та скринінгу повторюють, наприклад, щонайменше 4 рази до тих пір, поки при остаточному скринінгу не одержать рослину, яка є фертильною та в достатній мірі подібною рекурентному батькові. Цю рослину, при необхідності, самозапиляють та потім потомство знову піддають скринінгу, щоб підтвердити, що рослина демонструє експресію варіантного гена. У деяких варіантах здійснення популяцію рослин у поколінні Е2 піддають скринінгу на наявність експресії варіантного гена, наприклад, рослину, яка не експресує поліпептид через відсутність гена, ідентифікують згідно зі стандартними способами, наприклад, за допомогою методики ПЛР з використанням праймерів, що створені на основі інформації про послідовність нуклеотидів для полінуклеотиду(полінуклеотидів), що описаний у даному документі (або будь-якої їх комбінації, що описана у даному документі).

Гібридні різновиди можна одержати шляхом запобігання самозапилення жіночих батьківських рослин (тобто, насіння батьків) першого різновиду, дозволяючи пилку з чоловічих батьківських рослин другого різновиду запліднити жіночі батьківські рослини, і забезпечуючи утворення гібридного насіння Е1 на жіночих рослинах. Самозапиленню жіночих рослин можна запобігти шляхом кастрації квіток на ранній стадії розвитку квітки. Як альтернатива, утворенню пилку на жіночих батьківських рослинах можна запобігти, використовуючи будь-яку форму чоловічої стерильності. Наприклад, чоловічу стерильність можна одержати за допомогою цитоплазматичної чоловічої стерильності (СМ5) або трансгенної чоловічої стерильності, де трансген проявляє мікроспорогенез й/або утворення пилку, або викликає самонесумісність.

Жіночі батьківські рослини, що містять СМ5, є особливо застосовними. У варіантах здійснення, в яких жіночі батьківські рослини мають СМ5, пилок збирають з чоловічих фертильних рослин і наносять вручну на рильця жіночих батьківських рослин з СМ5 і збирають одержане насіння Е1.

Різновиди та лінії, що описані у даному документі, можна використовувати для утворення простих гібридів Е1. У таких варіантах здійснення рослини батьківських різновидів можна вирощувати практично у вигляді однорідно з'єднаних популяцій для полегшення природного перехресного запилення з чоловічих батьківських рослин на жіночі батьківські рослини. Насіння

ЕТ, що утворилося на жіночих батьківських рослинах, вибірково збирають за допомогою звичайних засобів. Також можна виростити два різновиди батьківської рослини в масі та зібрати суміш гібридного Е1 насіння, що утворилося на жіночій особині, та насіння, що утворилося на чоловічій особині в результаті самозапилення. Як альтернатива, можна здійснити трьохлінійне схрещування, де простий гібрид ЕТ використовують як жіночу особину та схрещують з іншою чоловічою особиною. Як інша альтернатива, можна створити гібриди подвійного схрещування, де потомство Е1 двох різних простих гібридів схрещують самих з собою.

Популяцію мутантних, що не зустрічаються у природі або трансгенних рослин можна піддати скринінгу або відбору по відношенню до тих представників популяції, які мають необхідну ознаку або фенотип. Наприклад, популяцію потомків лінії з однією трансформацією можна піддати скринінгу на ті рослини, які мають рівень експресії, що потребується, або активності поліпептиду(поліпептидів), який кодується(кодуються) з її допомогою. Фізичні та біохімічні способи можна використовувати для виявлення рівнів експресії або активності. Вони включають

Зо аналіз за Саузерном або ПЛР-ампліфікацію для виявлення полінуклеотиду; нозерн-блоттинг, захист від РНКази 51, подовження праймера, або ПЛР-ампліфікацію в реальному часі для виявлення РНК-транскриптів; ферментативні аналізи для виявлення ферментативної або рибозимної активності поліпептидів і полінуклеотидів; і гель-електрофорез білків, вестерн- блоттинг, імунопреципітацію й імуноферментні аналізи для виявлення поліпептидів. Інші методики, такі як гібридизація іп 5йи, ферментативне фарбування й імунофарбування та ферментативний аналіз також можна використовувати для виявлення присутності або експресії, або активності поліпептидів або полінуклеотидів.

У даному документі описані мутантні, що не зустрічаються у природі, або трансгенні рослинні клітини та рослини, що містять один або більше рекомбінантних полінуклеотидів, одну або більше полінуклеотидних конструкцій, одну або більше двониткових РНК, один або більше кон'югатів або один або більше векторів/векторів експресії.

Без обмеження, рослини, що описані у даному документі, можна модифікувати для інших цілей або до того, або після того, як експресія або активність була модульована згідно з даним винаходом. Одна або більше наступних генетичних модифікацій можуть бути присутніми в мутантних, що не зустрічаються у природі, або трансгенних рослинах. В одному варіанті здійснення один або декілька генів, які беруть участь у перетворенні проміжних продуктів азотного обміну, модифікують з одержанням рослин (наприклад, листя), у яких в обробленому стані присутні більше низькі рівні щонайменше одного тютюн-специфічного нітрозаміну, ніж у контрольних рослин. Необмежувальні приклади генів, які можна модифікувати, включають, як описано у даному документі, гени, що кодують аспарагін синтетазу, такі як СУРВ2Е4, СУРВ82Е5 і

СМУРВ2ЕТО, які беруть участь у перетворенні нікотину в норнікотин і що описані у

МО2006091194, М/О2008070274, ММО2009064771 і РСТ/О52011/021088, і як докладно описано у даному документі. В іншому варіанті здійснення один або більше генів, які беруть участь у поглинанні важких металів або транспортуванні важких металів, модифікують з одержанням в результаті рослин або частин рослин (таких як листя), що мають більше низький вміст важких металів, ніж у контрольних рослин або їх частин без модифікації модифікацій). Необмежувальні приклади включають гени сімейства білків, що асоційовані з множинною лікарською стійкістю, сімейства посередників катіонної дифузії (СОР), сімейства 72п-, Ій-подібних білків (7ІР), сімейства катіонообмінників (САХ), сімейства транспортерів міді (СОРТ), сімейства АТФаз бо важких металів Р-типу (наприклад, НМА, як описано у УМО2009074325), сімейства гомологів білків, що асоційовані з природною стійкістю макрофагів (МКАМР) і сімейства транспортерів

АТФ-зв'язуючої касети (АВС) (наприклад, МЕР, що описані у УМО2012/028309, які беруть участь в транспортуванні важких металів, таких як кадмій. Термін важкий метал, що використовується у даному документі, включає в себе перехідні метали. Приклади інших модифікацій включають витривалість по відношенню до гербіцидів, наприклад, гліфосат є активним інгредієнтом багатьох гербіцидів широкого спектра дії. Стійкі до гліфосату трансгенні рослини були розроблені шляхом перенесення гена агоА (гліфосат ЕРЗР-синтетазу з ЗаітопейПа їуУрпітитгит й

Е.соїї). Стійкі до сульфонілсечовини рослини були одержані шляхом трансформації мутантного гена А! 5 (ацетолактат синтетаза) з Агабідорзіз. Білок ОВ фотосистеми І з мутантного

Атагапіпив пубгідиє був перенесений в рослини з одержанням атразин-стійких трансгенних рослин; і бромоксиніл-стійкі трансгенні рослини були одержані шляхом вбудовування гена рхп бактерії Кіерзієїа рпештопіає. Інші приклади модифікацій призводять в результаті до одержання рослин, які є стійкими до комах. Токсин Васійи5 Іпигіпдіепзі5 (ВО може забезпечити ефективний шлях затримання появи Ві-стійких шкідників, як нещодавно показано на брокколі, де пірамідальні сгуїАс і сту!С гени ВІ контролювали капустяну моль, яка є стійкою до будь- якого одного білка, і суттєво затримували розвиток стійких комах. Інша ілюстративна модифікація призводить до одержання рослин, які є стійкими до захворювань, що викликані патогенами (наприклад, вірусами, бактеріями, грибами). Були сконструйовані рослини, що експресують ген Хаг21 (стійкість до бактеріального некрозу) з рослинами, що експресують одночасно ген зливання Ві і ген хітинази (стійкість до жовтого стеблового пилильщика та стійкість до шипоуски злакової). Інша ілюстративна модифікація призводить до зміненої репродуктивної здатності, такої як чоловіча стерильність. Інша ілюстративна модифікація призводить в результаті до одержання рослин, які є витривалими по відношенню до абіотичного стресу (наприклад, посухи, зміненню температури, засоленості), і витривалі трансгенні рослини були одержані шляхом перенесення ферменту ацилгліцерол-фосфат-ацилтрансферази з

Агарідорзіб; генів, що кодують маннітол-дегідрогеназу та сорбітол-дегідрогеназу, які беруть участь в синтезі манніту та сорбіту, покращують стійкість до посухи. Інші ілюстративні модифікації можуть призводити в результаті до одержання рослин з покращеним накопиченням білків й олій, рослин з підвищеною ефективністю фотосинтезу, рослин з тривалим терміном

Зо зберігання, рослин з підвищеним вмістом вуглеводів і рослин, що є стійкими до грибів; рослин, що кодують фермент, який бере участь у біосинтезі алкалоїдів. Також розглядаються трансгенні рослини, в яких експресія 5-аденозилч-і -метіонін (ЗАМ) і/або цистатіонін-гамма-синтази (СО5) була модульованою.

Одну або декілька таких ознак можна інтрогресувати в мутантні, що не зустрічаються у природі, або трансгенні рослини, що належать до іншого сорту, або можна безпосередньо трансформувати в нього. Інтрогресія ознаки або ознак в мутантні, що не зустрічаються у природі, або трансгенні рослини може бути досягнута будь-яким способом селекції рослин, що відомий у даній галузі техніки, наприклад, селекцією на основі родовиду, зворотнім схрещуванням, селекцією подвійних гаплоїдів тощо (див. публікації М/егп5тап, Е. А, апа Кийпу,

А. 0. 1987. Спарієг Земепівеп. Тобассо. Раде5 669-698 в: Сийімаг Оемеіортепі. Стор 5ресієв. МУ.

Н. Еейг (еа.), МасМіМйап Рибіїєпіпуд Со, Іпс., Мем/ Могк, М.М 761 рр.). Методики на основі молекулярної біології, що описані вище, зокрема, ПДРФ (поліморфізм довжин рестрикційних фрагментів) і мікросателітні маркери, можна використовувати при таких зворотніх схрещуваннях для виявлення потомства з найвищим ступенем генетичної ідентичності з рекурентним батьком. Даний підхід дозволяє прискорити одержання різновидів, що характеризуються генетичною ідентичністю щонайменше 90 9о, переважно щонайменше 95 95, більше переважно щонайменше 99 95 з рекурентним батьком, ще більше переважно, генетично ідентичних з рекурентним батьком і додатково містять ознаку або ознаки, що інтрогресовані від донорського батька. Таке визначення генетичної ідентичності можна проводити на основі молекулярних маркерів, що відомі у даній галузі.

Останнє покоління зворотного схрещування можна піддати самозапиленню з одержанням потомків чистого розведення для нуклеїнової кислоти(нуклетових кислот), що підлягає перенесенню. Одержані рослини зазвичай практично характеризуються по суті всіма морфологічними та фізіологічними властивостями мутантних, що не зустрічаються у природі або трансгенних рослинна додаток до перенесеної ознаки або ознак (наприклад, однієї або декількох ознак, що визначаються одним геном). Точний протокол зворотного схрещування буде залежати від змінної ознаки для визначення відповідного протоколу випробувань. Хоча способи зворотного схрещування спрощуються, якщо ознака, що переноситься, являє собою домінантну алель, рецесивний алель також може переноситися. У даному випадку може бути необхідним застосовувати тест потомства з визначенням успішності перенесення бажаної ознаки.

У різних варіантах здійснення запропоновані мутантні рослини, рослини, що не зустрічаються у природі, або трансгенні рослини, а також біомаса, в яких рівень експресії полінуклеотиду (або будь-якої комбінації полінуклеотидів, як описано у даному документі) знижений для зниження вмісту аспарагіну в зазначених рослинах.

Частини таких рослин, зокрема рослин тютюну, і більше конкретно, листкову пластинку та середню жилку рослин тютюну, можна включити до виготовлення або використовувати у виготовленні різних продуктів споживання, включаючи без обмеження матеріали, що утворюють аерозоль, пристрої, що утворюють аерозоль, курильні вироби, вироби для куріння, бездимні продукти та тютюнові вироби. Приклади матеріалів, що утворюють аерозоль, включають, без обмеження, тютюнові композиції, види тютюну, тютюновий екстракт, різаний тютюн, різаний наповнювач, оброблений або висушений тютюн, підірваний тютюн, гомогенізований тютюн, відновлений тютюн і люльковий тютюн. Курильні вироби та вироби для куріння є, як правило, пристроями, що утворюють аерозоль. Приклади курильних виробів і виробів для куріння включають без обмеження сигарети, сигарили та сигари. Приклади бездимних продуктів включають в себе жувальний тютюн і нюхальний тютюн. У певних пристроях, що утворюють аерозоль, замість згоряння (або спалювання), тютюнову композицію або інший матеріал, що утворює аерозоль, нагрівають, наприклад, за допомогою одного або декількох електричних нагрівальних елементів або джерел тепла на основі вугілля з одержанням аерозолю. Як правило, у таких нагрівних курильних виробах аерозоль генерується в результаті передачі тепла від джерела тепла на фізично відділений субстрат або матеріал, що утворює аерозоль, який може бути розташований всередині, навколо або нижче за потоком відносно джерела тепла. Під час куріння леткі сполуки вивільняються із субстрату, що утворює аерозоль, шляхом передачі тепла від джерела тепла та захоплюються повітрям, що втягується через курильний виріб. У міру охолодження вивільнених сполук, вони конденсуються з утворенням аерозолю, що вдихається користувачем. Такі пристрої включають, наприклад, пристрої з електричним нагріванням, що генерують аерозоль, в яких аерозоль генерується в результаті передачі тепла від пристрою, що генерує аерозоль, на субстрат, що утворює аерозоль, нагрівного курильного

Зо виробу. Переважно, протягом нагрівання субстрату, що утворює аерозоль, згоряння або спалювання тютюну не відбувається. Підходящий виріб, що утворює аерозоль, описаний у публікації М/О2013/098405 і містить субстрат, що утворює аерозоль, для генерування інгсальованого аерозолю при нагріванні внутрішнім нагрівальним елементом пристрою, що генерує аерозоль. Даний виріб може містити пристрій, що генерує аерозоль, який нагрівається електричним способом, що містить внутрішній нагрівальний елемент. Даний виріб також може містити у лінійному послідовному розташуванні, субстрат, що утворює аерозоль, опорний елемент, що розміщений безпосередньо нижче за потоком від субстрату, що утворює аерозоль, елемент для охолодження аерозолю, що розміщений нижче за потоком від опорного елемента, і зовнішню обгортку, що оточує субстрат, що утворює аерозоль, опорний елемент й елемент для охолодження аерозолю. Опорний елемент може межувати з субстратом, що утворює аерозоль.

У субстрат, що утворює аерозоль, може проникати нагрівальний елемент пристрою, що генерує аерозоль.

У даному документі термін "згорання" означає окислювально-відновлювальну хімічну реакцію, в якій молекули, що вступають у реакцію, а саме, паливо й окислювач, перемішуються та перегрупуються, щоб стати молекулами продукту з одночасним вивільненням тепла.

Згоряння можна позитивно визначити на основі присутності відповідних кількостей оксидів азоту у газоподібних продуктах, які не утворилися у результаті розкладання нітратів, що присутні у вихідному субстраті, що вступає у реакцію, і однозначного доказу одночасного загального екзотермічного процесу. Змінення відповідних кількостей оксидів азоту у газоподібних продуктах для згоряння можна визначити за допомогою порівняння загальних кількостей оксидів азоту, які утворені в умовах, що представляють інтерес (наприклад, у повітрі), й оксидів азоту, які утворені у тих самих умовах, але при відсутності кисню (наприклад, в атмосфері чистого азоту або гелію). В іншому типі нагрівального пристрою, що утворює аерозоль, аерозоль одержують шляхом переміщення тепла від горючого паливного елемента або джерела тепла до фізично відокремленого матеріалу, що утворює аерозоль, який може бути розташований всередині, навколо або нижче за потоком щодо джерела тепла. Бездимні тютюнові вироби та різні тютюновмісні матеріали, що утворюють аерозоль, можуть містити тютюн у будь-якому вигляді, в тому числі у вигляді висушених частинок, шматків, гранул, порошків або суспензії, нанесених на інші інгредієнти, змішаних з іншими інгредієнтами, оточених іншими інгредієнтами або іншим бо чином об'єднаних з іншими інгредієнтами у будь-якому форматі, такому, як пластівці, плівки,

таблетки, піни або кульки. Термін "дим", що використовується у даному документі, використовують для опису типу аерозолю, який одержаний за допомогою курильних виробів, таких як сигарети, або при спалюванні матеріалу, що утворює аерозоль.

У деяких варіантах реалізації нагрівання без згорання або спалювання рослинного матеріалу є переважним.

В одному варіанті здійснення запропонований сушений рослинний матеріал із мутантних, трансгенних і рослин тютюну, що не зустрічаються у природі, які описані у даному документі.

Способи обробки зелених тютюнових листків відомі середнім фахівцям у даній галузі техніки та включають, без обмеження, повітряну обробку, вогневу обробку, парову обробку й обробку на сонці. Спосіб сушіння зелених тютюнових листків залежить від типу зібраного тютюну.

Наприклад, Берлі та певні темні різновиди зазвичай оброблюють повітряною обробкою, а люльковий тютюн, жувальний тютюн і нюхальний тютюн зазвичай оброблюють вогневою обробкою.

В іншому варіанті здійснення також запропонований висушений рослинний матеріал з мутантних, трансгенних і рослин, що не зустрічаються у природі, які описані у даному документі.

Способи сушіння листя відомі середнім фахівцям у даній галузі техніки та включають, без обмеження, повітряне сушіння та сушіння на сонці. Точний спосіб сушіння листя залежить від типу зібраної рослини. Переважно, рослинний матеріал висушують після збору. Таким чином, у даному документі передбачене застосування висушеного матеріалу та післязбирального висушеного матеріалу. Процес сушіння може активувати один або декілька генів, що поєднані зі старінням. Експресію активності генів і білків, що описані у даному документі, можна контролювати у ході обробки або сушіння. Аналогічно, рівні аспарагіну, нікотину, глутаміну, аспарагінової кислоти та глутамінової кислоти можна контролювати у ході обробки або сушіння.

Як приклад, вимірювання можна проводити через 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 або 100 годин обробки або сушіння. Як приклад, вимірювання можна проводити через 0 днів, 1 день, 2 дні, З дні, 4 дні, 5 днів або 10 днів або більше.

В іншому варіанті здійснення описані тютюнові продукти, в тому числі тютюновмісні матеріали, що утворюють аерозоль, які містять рослинний матеріал, такий як листки, переважно, оброблені або висушені листки, з мутантних рослин тютюну, трансгенних рослин

Зо тютюну або рослин тютюну, що не зустрічаються у природі, які описані у даному документі.

Тютюнові продукти, що описані у даному документі, можуть являти собою змішаний тютюновий продукт, який може додатково містити немодифікований тютюн.

Кількість аспарагіну у рослині, частині рослини, рослинному матеріалі, рослинному продукті або тютюновому продукті, що описаний у даному документі, після обробки або сушіння (наприклад, З днів обробки або сушіння) приблизно на 20 95, 25965, З0 Зо, 35 95, 40 9, 45 9, 5096, 5595, 60 бо, 6596, 7095, 75 90, 80 95, 8595, 90 Ую, 9595, 96 95, 97 Ус, 98 95, 99.90 І 100 96 нижче - наприклад, приблизно на 20095 або 30095 нижче, у порівнянні з контрольною рослиною. Переважно, кількість аспарагіну у рослині, частині рослини, рослинному матеріалі, рослинному продукті або тютюновому продукті, що описаний у даному документі, після обробки або сушіння (наприклад, З днів обробки або сушіння) щонайменше приблизно на 60 95, 65 95, 706, 75595, 80 96, 8595, 90 95, 9595, 96 в, 97 95, 9895, 99 90 і 100 95 нижче - наприклад, приблизно на 20095 або 30095 нижче - у порівнянні з контролем, більше переважно, щонайменше приблизно на 8095 нижче або щонайменше приблизно на 9095 нижче - у порівнянні з контролем.

Кількість аспарагіну у рослині, частині рослини, рослинному матеріалі, рослинному продукті або тютюновому продукті, що описаний у даному документі, після обробки або сушіння (наприклад, З днів обробки або сушіння) становить приблизно 40 мг/г сухої маси листя або менше, більше переважно, приблизно 35 мг/г сухої маси листя або менше, більше переважно, приблизно 30 мг/г сухої маси листя або менше, більше переважно, приблизно 25 мг/г сухої маси

БО листя або менше, більше переважно, приблизно 20 мг/г сухої маси листя або менше, більше переважно, приблизно 15 мг/г сухої маси листя або менше, більше переважно, приблизно 12 мг/г сухої маси, більше переважно, приблизно 10 мг/г сухої маси сухої маси листя або менше, або, більше переважно, приблизно 5 мг/г сухої маси листя або менше. Переважно, відбирають листя нижньої-середньої частини стебла рослини.

Кількість акриламіду в аерозолі, що одержаний з рослини, частини рослини, рослинного матеріалу, рослинного продукту або тютюнового продукту після обробки або сушіння й одержаний за допомогою нагрівання, щонайменше приблизно на 70 95 нижче у порівнянні з контролем. Як приклад, кількість акриламіду в аерозолі, що одержаний з тютюнового продукту після обробки або сушіння й одержаний за допомогою нагрівання, становить приблизно 1,5 мкг (516) на сигарету.

Кількість акриламіду в аерозолі, що одержаний з рослини, частини рослини, рослинного матеріалу, рослинного продукту або тютюнового продукту після обробки або сушіння й одержаний за допомогою згорання, щонайменше приблизно на 5595 нижче у порівнянні з контролем. Як приклад, кількість акриламіду в аерозолі, що одержаний з тютюнового продукту після обробки або сушіння й одержаний за допомогою згорання, становить приблизно 2,5 мкг на сигарету.

Переважно, кількість акриламіду в аерозолі, що одержаний з рослини, частини рослини, рослинного матеріалу, рослинного продукту або тютюнового продукту після обробки або сушіння й одержаний за допомогою згорання або нагрівання, щонайменше приблизно на від 5595 до приблизно 70 95 нижче у порівнянні з контролем. Як приклад, кількість акриламіду в аерозолі, що одержаний з тютюнового продукту після обробки або сушіння й одержаний за допомогою згорання або нагрівання, становить приблизно від 1,5 мкг на сигарету до 2,5 мкг на сигарету.

Кількість нікотину у рослині, частині рослини, рослинному матеріалі, рослинному продукті, тютюновому продукті або аерозолі може бути по суті такою самою, як кількість нікотину з рослин, частин рослин, рослинних матеріалів, виробів для куріння, бездимних продуктів й аерозолів з контрольної рослини. Наприклад, кількість нікотину може знаходитися в межах приблизно 20 95, 1595, 1095, 9905, 8 9, 7 У, б в, 5 о, 4 в, З У, 2 Уо або 1 95 або менше від кількості нікотину, яка присутня у контрольній рослині. Переважно, кількість нікотину може знаходитися в межах приблизно 10 95, 995, 8 в, 7 Зо, бо, 5 У, 4 9Ув, З У, 2 У або 1 95 або менше від кількості нікотину, яка присутня у контрольній рослині. Кількість нікотину, зазвичай, становить від приблизно 15 до 20 мг/г сухої маси біомаси листя.

В одному варіанті реалізації кількість аспарагіну у рослині, частині рослини, рослинному матеріалі, рослинному продукті або тютюновому продукті після обробки (наприклад, оброблене формоване листя) щонайменше приблизно на 20 95 нижче (наприклад, щонайменше приблизно на 22 95 нижче), і кількість акриламіду в аерозолі, що одержаний з рослини, частини рослини, рослинного матеріалу, рослинного продукту або тютюнового продукту після обробки (наприклад, оброблене формоване листя), щонайменше приблизно на 25 95 нижче (наприклад, щонайменше приблизно на 24 95 або нижче), ніж у контролі. В іншому варіанті реалізації

Зо кількість аспарагіну у рослині, частині рослини, рослинному матеріалі, рослинному продукті або тютюновому продукті після обробки (наприклад, оброблене формоване листя) становить приблизно 12 мг/г сухої маси або менше, і кількість акриламіду в аерозолі, що одержаний з рослини, частини рослини, рослинного матеріалу, рослинного продукту або тютюнового продукту після обробки (наприклад, оброблене формоване листя), становить щонайменше приблизно 2,5 мкг/сигарету або менше. Переважно, рівень нікотину є по суті таким самим, як і рівень нікотину у контролі.

В іншому варіанті реалізації кількість аспарагіну у рослині, частині рослини, рослинному матеріалі, рослинному продукті або тютюновому продукті після обробки (наприклад, оброблене формоване листя) щонайменше приблизно на 70 95 нижче (наприклад, щонайменше приблизно на 66 95 нижче), і кількість акриламіду в аерозолі, що одержаний з рослини, частини рослини, рослинного матеріалу, рослинного продукту або тютюнового продукту після обробки щонайменше приблизно на 45 95 нижче (наприклад, щонайменше приблизно на 44 95 нижче), ніж у контролі. В іншому варіанті реалізації кількість аспарагіну у рослині, частині рослини, рослинному матеріалі, рослинному продукті або тютюновому продукті після обробки (наприклад, оброблене формоване листя) становить приблизно 12 мг/г сухої маси або менше, і кількість акриламіду в аерозолі, що одержаний з рослини, частини рослини, рослинного матеріалу, рослинного продукту або тютюнового продукту після обробки, становить приблизно

З мкг/сигарету або менше. Переважно, рівень нікотину є по суті таким самим, як і рівень нікотину у контролі.

В іншому варіанті реалізації кількість аспарагіну у рослині, частині рослини, рослинному матеріалі, рослинному продукті або тютюновому продукті після обробки (наприклад, оброблене формоване листя) щонайменше приблизно на 90 95 нижче (наприклад, щонайменше приблизно на 8895 або нижче), і кількість акриламіду в аерозолі, що одержаний з рослини, частини рослини, рослинного матеріалу, рослинного продукту або тютюнового продукту після обробки, щонайменше приблизно на 70 95 нижче, ніж у контролі. В іншому варіанті реалізації кількість аспарагіну у рослині, частині рослини, рослинному матеріалі, рослинному продукті або тютюновому продукті після обробки (наприклад, оброблене формоване листя) становить приблизно 5 мг/г сухої маси або менше, і кількість акриламіду в аерозолі, що одержаний з рослини, частини рослини, рослинного матеріалу, рослинного продукту або тютюнового продукту після обробки, становить приблизно 1,5 мкг/сигарету або менше. Переважно, рівень нікотину є по суті таким самим, як і рівень нікотину у контролі.

В іншому варіанті реалізації модуляція експресії МАМІ за допомогою РНКІі може: (Її) знижувати кількість аспарагіну у рослині, частині рослини, рослинному матеріалі, рослинному продукті або тютюновому продукті після обробки або сушіння (наприклад, оброблене формоване листя) на від 24 95 до приблизно 8995 (наприклад, від приблизно 35 мг/г до приблизно 5 мг/г); (ії) зберігати рівень нікотину приблизно 20 95, 15 95, 10 95, 9 о, 8 95, 7 Ус, 6 У, 5 о, 4 о, З У, 2 У або 1 95 або менше від кількості нікотину, яка присутня у контрольній рослині (наприклад, на рівні приблизно 15 і 20 мг/г сухої маси біомаси листя); і (ії) знижувати рівень акриламіду в аерозолі щонайменше приблизно на 7095 до 1,5 З мкг/сигарету або менше.

Кількість біомаси листя, зазвичай, становить приблизно від 300 до 400 г.

В іншому варіанті реалізації модуляція експресії МАМО за допомогою РНКІі може: (Її) знижувати кількість аспарагіну у рослині, частині рослини, рослинному матеріалі, рослинному продукті або тютюновому продукті після обробки або сушіння (наприклад, оброблене формоване листя) на від приблизно 35 95 до приблизно 66 95 (наприклад, від приблизно 31 мг/г до приблизно 18 мг/г); (ії) зберігати рівень нікотину приблизно 20 95, 15 95, 10 Ов, 9 У», 8 Ов, 7 9, б, 5 9Уо, 4 90, З У, 2 Ую або 1 956 або менше від кількості нікотину, яка присутня у контрольній рослині (наприклад, на рівні приблизно 15 і 20 мг/г сухої маси біомаси листя); і (ії) знижувати рівень акриламіду в аерозолі щонайменше приблизно на 44 95 до приблизно З мкг/сигарету або менше. Кількість біомаси листя, зазвичай, становить приблизно від 300 до 400 г.

В іншому варіанті реалізації модуляція експресії МІА5МІ за допомогою мутагенезу може: (Її) знижувати кількість аспарагіну у рослині, частині рослини, рослинному матеріалі, рослинному продукті або тютюновому продукті після обробки або сушіння (наприклад, оброблене формоване листя) на від приблизно 17 95 до приблизно 83 95 (наприклад, до від приблизно 19,4 мг/г до приблизно 4,7 мг/г); і (ії) знижувати рівень акриламіду в аерозолі щонайменше приблизно на 24 95 до приблизно 2,5 мкг/сигарету або менше.

В іншому варіанті реалізації модуляція експресії МІА5МО за допомогою мутагенезу може знижувати кількість аспарагіну у рослині, частині рослини, рослинному матеріалі, рослинному продукті або тютюновому продукті після обробки або сушіння (наприклад, оброблене

Зо формоване листя) на від приблизно 44 95 (наприклад, до приблизно 14,5 мг/г). Мутантні, що не зустрічаються у природі або трансгенні рослини можуть знайти інші варіанти застосування, наприклад, у сільському господарстві. Наприклад, мутантні, що не зустрічаються у природі, або трансгенні рослини, що описані у даному документі, можна використовувати для виготовлення корму для тварин і для продуктів харчування для людини.

У даному винаході також запропоновані способи одержання насіння, причому зазначені способи включають культивування мутантної рослини, рослини, що не зустрічається у природі, або трансгенної рослини, що описані у даному документі, і збирання насіння культивованих рослин. Насіння рослин, що описані у даному документі, можна кондиціонувати та пакувати у пакувальний матеріал за допомогою засобів, що відомі у даній галузі, з одержанням промислового виробу. Пакувальний матеріал, такий як папір або тканина, добре відомий у даній галузі. Упаковка насіння може мати етикетку, наприклад, ярлик або етикетку, що прикріплена до пакувального матеріалу, етикетку, що надрукована на упаковці, яка описує походження насіння, що містяться в ній.

Композиції, методи та набори для генотипування рослин для ідентифікації, відбору або селекції можуть включати в себе засоби для виявлення присутності полінуклеотиду (або будь- якої їх комбінації, як описано у даному документі) у зразку полінуклеотиду. Відповідно, описана композиція, що містить один або більше праймерів для специфічної ампліфікації щонайменше частини одного або більше полінуклеотидів і, необов'язково, один або більше зондів і, необов'язково, один або більше реагентів для проведення ампліфікації або виявлення.

Відповідно, розкриті ген-специфічні олігонуклеотидні праймери або зонди, що містять приблизно 10 або більше суміжних нуклеотидів, які відповідають полінуклеотиду або полінуклеотидам, що описані у даному документі. Зазначені праймери або зонди можуть містити або складатися з приблизно 15, 20, 25, 30, 40, 45 або 50 або більше суміжних нуклеотидів, які гібридизуються (наприклад, специфічно гібридизуються) з полінуклеотидом або полінуклеотидами, що описані у даному документі. У деяких варіантах здійснення праймери або зонди можуть містити або складатися з приблизно 10-50 суміжних нуклеотидів, приблизно 10-40 суміжних нуклеотидів, приблизно 10-30 суміжних нуклеотидів або приблизно 15-30 суміжних нуклеотидів, які можна використовувати у способах ідентифікації гена (наприклад, Саузерн- гібридизація), які залежні від послідовності, або виділення (наприклад, гібридизація іп 5йш 60 бактеріальних колоній або бляшок бактеріофага) або виявлення гена (наприклад, у вигляді одного або більше ампліфікуючих праймерів при ампліфікації та виявленні нуклеїнової кислоти).

Один або більше специфічних праймерів або зондів можна спроектувати та використовувати для ампліфікації та виявлення частини або всього полінуклеотиду (полінуклеотидів). Як конкретний приклад, два праймера можна використовувати у протоколі полімеразної ланцюгової реакції для ампліфікації фрагмента нуклеїнової кислоти, що кодує нуклеїнову кислоту, таку як ДНК або РНК. Полімеразну ланцюгову реакцію також можна проводити з використанням одного праймера, що одержаний з послідовності нуклеїнової кислоти, і другого праймера, що гібридизується з послідовністю вище за ланцюгом або нижче за ланцюгом відносно послідовності нуклеїнової кислоти, такої як послідовність промотору, 3'-кінець прекурсору мРНК-попередника або послідовність, що має походження з вектора. Приклади термічних й ізотермічних методик, що застосовуються для ампліфікації полінуклеотидів іп міо, добре відомі у даній галузі. Зразок може мати походження або його можна одержати з рослини, клітини рослини або рослинного матеріалу або тютюнового виробу, що виготовлений з рослини, клітини рослини або рослинного матеріалу, як описано у даному документі.

У наступному аспекті запропонований спосіб виявлення полінуклеотиду (полінуклеотидів), що описаний у даному документі (або будь-якої їх комбінації, що описана у даному документі) в зразку, який передбачає стадії: (а) одержання зразка, що містить, або імовірно містить полінуклеотид; (б) приведення зазначеного зразка в контакт з одним або більше праймерами або одним чи більше зондами для специфічного виявлення щонайменше частини полінуклеотиду (полінуклеотидів); і (с) виявлення присутності продукту ампліфікації, де присутність продукту ампліфікації свідчить про присутність полінуклеотиду (полінуклеотидів) у зразку. У наступному аспекті також запропоноване використання одного або більше праймерів або зондів для специфічного виявлення щонайменше частини полінуклеотиду (полінуклеотидів). Також запропоновані набори для виявлення щонайменше частини полінуклеотиду (полінуклеотидів), які містять один або більше праймерів або зондів для специфічного виявлення щонайменше частини полінуклеотиду (полінуклеотидів). Набір може містити реагенти для ампліфікації полінуклеотиду, наприклад реагенти для ПЛР або реагенти для технології виявлення з використанням гібридизаційного зонда, такого як Саузерн-блоттинг, нозерн-блоттинг, гібридизація іп 5йи або мікрочип. Набір може містити реагенти для технології

Зо виявлення зв'язування антитіл, такий як вестерн-блоттинг, ЕГІЗА, 5ЕЇ ОІ-мас-спектрометрія або тест-смужки. Набір може містити реагенти для секвенування ДНК. Набір може містити реактиви й інструкції з визначення щонайменше вмісту аспарагіну та/або вмісту акриламіду в аерозолі у рослинному матеріалі, обробленому або висушеному рослинному матеріалі, або обробленому або висушеному листі.

У деяких варіантах здійснення набір може містити інструкції для одного або більше описаних способів. Описані набори можуть бути застосовані для визначення генетичної ідентичності, філогенетичних досліджень, генотипування, гаплотипування, аналізу родоводу або селекції рослин, зокрема, з кількісною оцінкою кодомінантних ознак.

У даному винаході також запропонований спосіб генотипування рослини, клітини рослини або рослинного матеріалу, які містять полінуклеотид, що описаний у даному документі.

Генотипування забезпечує засоби розрізнення гомологів пари хромосом і може бути використане для розрізнення сегрегантів у популяції рослин. Молекулярні способи з використанням маркерів можна застосовувати для філогенетичних досліджень, що характеризують генетичні зв'язки між різновидами сільськогосподарських культур, виявлення гібридів або соматичних гібридів, локалізації хромосомних сегментів, що впливають на моногенні ознаки, клонування на основі генетичних карт і вивчення кількісного спадкування. У певному способі генотипування може використовуватися будь-яка кількість аналітичних методик з молекулярним маркером, включаючи поліморфізми довжини ампліфікованого фрагмента (АРГ Р). АРІ Р. є продуктом алельних відмінностей між фрагментами ампліфікації, що викликані волатильністю нуклеотидної послідовності. Таким чином, у даному винаході додатково запропоновані засоби для відстеження сегрегації одного або більше генів або нуклеїнових кислот, а також хромосомних послідовностей, що генетично зв'язані з даними генами або нуклеїновими кислотами, з використанням таких методик, як аналіз АРІ Р.

В одному варіанті здійснення також запропонований оброблений або висушений рослинний матеріал з мутантних, трансгенних і рослин, що не зустрічаються у природі, які описані у даному документі. Наприклад, способи обробки або сушіння тютюнових листків відомі фахівцям у даній галузі техніки та включають, без обмеження, повітряну обробку, вогневу обробку, парову обробку й обробку на сонці. Спосіб обробки зелених тютюнових листків залежить від типу зібраного тютюну, як описано у даному документі. бо В іншому варіанті здійснення описані тютюнові продукти, у тому числі тютюнові продукти, що містять рослинний матеріал, такий як листки, відповідно, оброблений рослинний матеріал, такий як оброблені або висушені листки, з мутантних, трансгенних і рослин, що не зустрічаються у природі, що описані у даному документі, або які одержані за способами, що описані у даному документі. Тютюнові вироби, що описані у даному документі, можуть додатково містити немодифікований тютюн.

В іншому варіанті здійснення описані тютюнові продукти, що містять рослинний матеріал, переважно листки, такі як висушені листки, з мутантних, трансгенних і рослин, що не зустрічаються у природі, що описані у даному документі. Наприклад, рослинний матеріал можна додати до внутрішньої або зовнішньої частини тютюнового виробу, так що при спалюванні вивільняється бажаний аромат. Тютюновий виріб відповідно до цього варіанта здійснення може навіть являти собою немодифікований тютюн або модифікований тютюн. Тютюновий виріб відповідно до цього варіанта здійснення може бути одержаний з мутантної, трансгенної або рослини, що не зустрічається у природі, яка має модифікації в одному або більше генах, що відрізняються від генів, які розкриті у даному документі.

Даний винахід додатково описаний у Прикладах нижче, які представлені для більше докладного опису даного винаходу. Ці приклади, в яких викладений переважний режим, що передбачений в даний час для здійснення даного винаходу, призначені для ілюстрації, а не для обмеження даного винаходу.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1 - Синтез аспарагіну в обробленому листі тютюну

В ході обробки листя тютюну та, особливо, листя сортів Берлі, активно утворюється аспарагін, який становить приблизно 50 95 від сумарної кількості амінокислот, що присутні в обробленому листі. На фігурі 1 показане підвищення рівня аспарагіну та сумарних вільних амінокислот, яке, головним чином, є наслідком підвищення рівня аспарагіну, в обробленому листі трьох сортів тютюну Берлі, що паралельно вирощені та висушені повітряною обробкою на одному і тому самому полі й у коморі. Несподівано було встановлено, що аспарагін є єдиною амінокислотою, яка накопичується у значних кількостях в ході обробки. Приймаючи до уваги той факт, що аспарагін синтезується протягом ранньої фази обробки, реакція у такому випадку залежить від активностей аспарагін синтетази, яка використовує як субстрат глутамін й

Зо аспартат. Однак, на фігурі 1, Азр ії бСіп демонструють виключно незначне підвищення у порівнянні з аспарагіном; це свідчить, що пули Сіп й Авбр, ймовірно, варіюють протягом тривалого процесу повітряної обробки (»2 місяців). Будь-які зміни пулу глутамату не спостерігалися (дані не показані).

Фігура 2 свідчить, що рівень Сіп збільшувався протягом перших 4 днів обробки (96 годин), а потім знижувався на початку накопичення аспарагіну. Навпаки, пул аспартату залишається, головним чином, постійним, незважаючи на те, що можуть спостерігатися деякі флуктуації. Не спираючись на будь-яку конкретну теорію, вважають, що пул глютаміну, що спостерігається, може виступати як субстрат для аспарагін синтетази або аспарагін синтетаз для утворення аспарагіну протягом перших 4-5 днів обробки (див. фігуру 3).

Як згадувалося вище, накопичення аспарагіну, що спостерігається в ході обробки, може бути наслідком специфічної активності аспарагін синтетази, що індукована старінням. Після нагрівання або згорання аспарагін і відновлювальні цукри мають потенціал утворювати в аерозолі акриламід за допомогою реакції Майяра. Існує гарна кореляція між аспарагіном, що накопичений в обробленому листі тютюну або сумішах тютюну, й акриламідом, що виміряний в аерозолі (див. фігуру 4). Не спираючись на будь-яку конкретну теорію, вважають, що ці дані свідчать, що підвищення рівня акриламіду в аерозолі суворо залежить від присутності аспарагіну. Крім того, присутність аспарагіну у тканинах листя також залежить від використаного способу обробки, як показано на фігурі 5.

Приклад 2 - Гени аспарагін синтетази у тютюні 6 генів повнорозмірної аспарагін синтетази були ідентифіковані у тютюні, які називають

МЕАБМ1-5, МАБМ1-Т, МЕАБМЗ3-5, МАБМЗ3-Т, МЕАБМО-5 і МАБМ5-Ї. Цікаво відзначити, що

Агарідорзіє5 містить З гени, що споріднені аспарагін синтетазі: АТАБМІ, АТАБМ2 й АТАБМЗ, а томат - тільки 2 повнорозмірних гени (Зоїус0об9007180 і Боїус049055200). Філогенетичний аналіз із застосуванням передбачуваних білкових послідовностей, що одержані з геномних послідовностей, які виділені з генома тютюну (5іето еї аї., 2014), свідчить, що у процесі еволюції дві групи аспарагін синтетази розділилися (див. фігуру 6). В дійсності, одна група, що містить ЗоїЇус044055200, АІА5М2 і 3, є близькою до МІА5М3-5 і МАЗМ3-Т. Продукт гена АЇА5М2, що належить до даної групи, розташований у флоемі й, мабуть, є значним для асиміляції, розподілу та ремобілізації азоту в зелених тканинах (Сашісноп еї аї., 2013 Ріапі Сеї! Епмігоп. бо Еер; 36 (2): 328-42.). Дана група відноситься до підкласу Дводольних класу ІІ. Друга група, що містить Зоїусоб9007180, АТАБЗМІ, МАБЗМ1-5, МАБМ1-Т, МАБМ5-5 і МАБМ5-Т, відноситься до підкласу Дводольних класу І (Сашіспоп еї аї., 2010 Апп Вої 2010 ДШип;105(7)71141-57.).

Надекспресія АТАБЗМІ сприяє підвищенню вмісту аспарагіну у квітах і розвитку стручків і підвищенню вмісту білка у насінні, що свідчить про підсилений транспорт аспарагіну з джерела у споживаючі тканини. Це свідчить, що група АТАЗМІ1 є більше підданою переміщенню джерела азоту в насіння для забезпечення належного проростання насіння та високої стійкості проростків до азот-лімітуючого субстрату (Гат еї а!., 2003 Ріапі Рнузіої. 2003 дип;132(2):926-35).

Відсоток ідентичності між продуктами гена дозволив з'ясувати, що МАБЗМ3-5 і МАБЗМ3-Т є ідентичними та дуже близькі до ЗоЇус049055200 й АІА5МІЗ (ідентичність 85 95); це свідчить, що даний кластер генів був відносно гарно збереженим протягом еволюції, ймовірно, для підтримки асиміляції азоту у вегетативних тканинах (див. вище). Цікаво відзначити, що кожна з виведених копій білка МАБМІ1-Б/МАБМ1-ЇТ і МАБМ5-Б/МАБМО-Ї М. звзумевзінів і М. їотетіозіоптів характеризується високим відсотком ідентичності, що близький до 9895. Це свідчить, що функція гена копій АБМІ й АБМ5 є, ймовірно, консервативною серед кожного предка тютюну та, ймовірно, дані гени походять від одного єдиного загального предка, як у томаті й арабідопсисі.

Більше того, МА5БМ5-5 має 9595 ідентичність з БоїЇус0об9007180, що свідчить про подібну функцію.

З урахуванням того, що рівень аспарагіну швидко збільшується протягом процесу повітряної обробки тютюну Берлі, утворення аспарагіну протягом ранньої фази обробки (див. фігуру 1 і фігуру 2) може не бути прямим наслідком протеолітичного розщеплення білків або поліпептидів, але наслідком синтезу депомо в ході обробки. У такому випадку й як згадується вище, синтез аспарагіну може виникати виключно за рахунок активної аспарагін синтетази або аспарагін синтетаз.

Для визначення експресії генів аспарагін синтетази в ході обробки аналізували дані, що зібрані у результаті мікроматричних аналізів із застосуванням генних чипів Торатау Апуптеїгіх (Мапіп єї аї. ВМО Сепотісв 2012 13: 674). РНК листя виділяли в залежності від часу протягом перших 96 годин обробки. Були ідентифіковані специфічні зонди (ідентичність 100 95), що збігаються з шістьма кодуючими послідовностями АБМ (МІРМІа1947375е1 5ї для АБМІ1-Т;

МЕРМІа1931395е1 5ї для АБМ1-5; МІРМІа1!925255е1 5ї для АБМ5-Ї; МІРМІа1957337е1 5 для

АБМ5-5; МІРМІа1т19152348в8е1 51 для АБМЗ-Т і МІРМІа19121582е1 5ї для А5М3-5). Для одержання

РНК листя відбирали у середній частині стебла Стелла (СН-Берлі) безпосередньо у полі (-4 години); час 0 був моментом, коли листя вивішували у коморі для повітряної обробки. А5М3-5 й

А5МЗ3-Т виключно слабо експресувалися у листі Берлі протягом повітряної обробки. Навпаки,

АБМ1-55 АБМ1-Ї й АБМ5-5 експресувалися на високих рівнях на початку обробки (фаза старіння, жовтіння), тоді як АБМ5О-Ї підвищуючи регулювався відразу після збирання, а потім постійно знижувався протягом перших 96 годин обробки (фіг. 7).

Для перевірки будь-якої перехресної гібридизації, яка може виникнути у мікроматричних аналізах, особливо у випадку генів, які характеризуються високою гомологією послідовності, аналізували експресію А5М1-5/1 й АБМ5-5/1 із застосуванням технології секвенування РНК.

Дані представлені на фігурі 8. У швейцарському Берлі "Стелла" (фіг. ВА) дані секвенування РНК підтвердили, що АБМ5-Т був менше індукованим в ході обробки, ніж три інші копії АБМ1/5 (див. фігуру 7), причому після двох перших днів повітряної обробки А5МІ1-Т був найбільш інтенсивно експресованим геном. Така активність гена А5М не виникає з подібною інтенсивністю у швейцарському Брайт Вірджинія "ІТВ 683", який класичним способом обробляють у печі. У такому тютюні через 48 годин обробки експресія АБМ1-5/1 й А5БМ5-5/Ї залишалася низькою. В обох видах тютюну експресія АБМЗ5/1Т не індукувалася обробкою (фігур 8С і Ю); таким чином, це підтверджує дані АПутеїгіх, що представлені на фігурі 7.

Для дослідження стійкості індукції гена АБМ протягом ранньої фази обробки Берлі з чотирьох різних зразків Берлі (ВО1-4: Сеплек, БенкетА!7, Стелла і ТМ90), що вирощені одночасно на швейцарському полі (2013), виділяли РНК листя до та після 60 годин обробки у коморі. Тимчасову точку виділення РНК збільшували до 60 годин, оскільки у Швейцарії ТМУО потрібно більше часу для початку жовтіння. Дані експресії (фіг. ЗА) демонструють, що у всьому листі Берлі АБМ1-Т й А5М5-Т були знову найбільше та найменше експресованими генами АБМ протягом повітряної обробки (за винятком АБМІ1І-Ї у ВИ2), відповідно, таким чином, це підтверджує дані, що представлені на фігурі 8. Транскрипти АБМ1-5 й А5БМ5-5 постійно та надійно експресуються протягом ранньої фази обробки у листі різних зразків Берлі. Фігура 98 підтверджує, що дві копії АБМЗ, що походять з М. (отепіозіїоптів і М. зуїмезігів, не індукувалися в ході обробки; це опосередковано підтверджує, що дані дві копії, які Є більше близькими до

АТАБМ2 (див. фіг. 6), ймовірно, характеризуються більш основною функцією у вегетативних бо тканинах рослини для підтримки фізіологічних пулів аспарагіну.

Аналіз відповідних транскриптів у 8 тканинах, що відібрані від рослин ТМО0 на стадії цвітіння та вирощені у полі, свідчить, що А5М5О-Т був більш активним у квітці, ніж у листі; копії РНК

А5М5О-ЇТ особливо виявлялися у незрілій квітці, пелюстці та чашолистку (див. фігуру 10, ліве креслення). Крім експресії у листі, А5М1-Т ії АБМ1-5 також інтенсивно експресувалися у пелюстці, можливо, для асиміляції нітрату, що є функцією, яка вже була описана в арабідопсисі (ат есеї аїІ., 2003 Ріапі Рпузіої. 2003 дип;/132(2):926-35) для ортологічного гена АЇА5МІ (див. фігуру 6). АБМ3-5/Ї характеризувався низькою основною експресією у всіх з даних 8 тканин (див. фігуру 10, праве креслення).

Приклад З - лінії АБМІ й АБМ5 ВМАї ТМУОєЄЗ

Сайленсинг копій А5М1-5/АБМ1-Т й АБМ5-5/АЗМ5-Т у рослинах тютюну Берлі досліджували для визначення того, чи сприяє даний підхід зниженню рівня аспарагіну в обробленому листі

Берлі. Специфічні фрагменти ДНК клонували між сильним конститутивним промотором МММУ (вірусу мозаїки мірабілісу або промотором Е4, що специфічний для старіння (аспарагін синтетази). Фрагмент гена АБМ фланкували між МММ або Е4 і 3 по5 термінаторною послідовністю гена нопалін-синтази Аагорасієтішт їшптегасієпв (Спепа єї аї!., 2003 Іп Міго Сеїшаг а ОемеІортенпіа! Віоіоду-Ріапі, 39 595 604). Діаграма конструкцій, що використані у даному дослідженні, представлена на фігурі 22. Лінію ТМУОе4ебе10 (2умегй) тютюну Берлі трансформували окремо кожній з п'яти конструкцій із застосуванням стандартних протоколів трансформації, що опосередкована Адгобасіегішт. ТМООед4ебе10 (7умегп) являє собою селекцію з популяції Берлі, що мутагенізована за допомогою етилметан сульфонату (ЕМС), яка містить нокаутні мутації у СУР8Ф2Е4, СУРВФ2Е5мМ2 і СУРВФ2Е10, головних генах аспарагін синтетази тютюну (І ем/і5 еї а!., 2010), для запобігання утворення норнікотину. Застосування такої фонової лінії може дозволити уникнути потенційних труднощів при інтерпретації майбутніх даних ТСНА (тютюно-специфічного нітрозаміна).

Для забезпечення відбору рослин, які експресують відповідні трансгени на високому рівні, щонайменше 10 окремих рослин ТО для кожної конструкції аналізували методом кПЛР. Насіння збирали від трьох ліній ТО кожної конструкції, які демонстрували найвищі рівні подій сайленсингу А5М. Для вивчення того, чи здійснює потомство Т1, яке успадкувало фрагмент або фрагменти гена РНКІі, ефективний сайленсинг гена, виділяли РНК з 4 рослин вибраних незалежних подій трансформації для одержання насіння Т2, що доступне для подальших польових випробувань (2016). Контрольні лінії ТМО9бе4ебе10 (7умег) використовували як фон для порівняння ефективності трансформації.

Три незалежних події трансформації вибирали у ТО рослинах АБМ1-КМАЇї й А5М5-ЕМАЇ на основі рівня транскриптів АБМІ й А5М5. Рослини АБМ1-ЕМАЇї одержували для сайленсингу копій як АБМІ1-Т, так й АБМ1-5 під контролем промотору МММУ або промотору Е4, і рослини АБМ5-

ЕМАї одержували для сайленсингу копій як АБМ5-ТЇ, так й АБМ5-5 під контролем промотору

ММУ або промотору Е4. Із застосуванням канаміцину вибирали п'ятнадцять рослин для кожної події трансформації та вирощували у теплиці. Після дозрівання від кожної рослини відбирали чотири листа у середньому-нижньому положенні та піддавали повітряній обробці протягом 7 тижнів.

Концентрації амінокислот і нікотину визначали методом ВЕРХ-МС (високоефективної рідинної хроматографії - мас-спектрометрії): Аліквоти (30 мг) подрібненого тютюну екстрагували сумішшю етанол-вода (1:11; б мл) протягом 45 хвилин при температурі 50 76.

Відцентрифуговані екстракти розводили у 10 разів. Розподіл методом рідинної хроматографії проводили на амідній колонці (У/агег5 Асдийу ВЕН атіае, 2,1х150 мм, 1,7 мкм) при температурі 45"С при елююванні градієнтом 2 мМ форміату амонію у водін0,25 96 мурашина кислота (елюент А) й ацетонітриляб0,1 95 мурашина кислота (елюент В), застосовуючи градієнт елюента (0 хв. - 10 95 А, 0,5 хв. - 10 Фо А, 4 хв. - 60 9о А, 4,5 хв. - 60 95 А, 4,6 хв. - 10 95 А, 6,8 хв. - 10 95 А; потік 0,5 мл/хв.). Для мас-спектрометричного детектування амінокислот використовували інструмент С) Ехасіїме (Тпегто зсіепійіс) у режимі електророзпилювання позитивно заряджених іонів, що дозволяє одержати повне сканування мас-спектра. Концентрації нікотину в екстрактах розраховували на основі площі його піка на кривій фотодіодного детектора в ультрафіолетовій та видимій області спектра при 260 нм.

Аспарагін вимірювали в обробленій листковій пластинці. Через З дні обробки протягом фази пожовтіння фрагмент пластинки екстрагували, РНК виділяли з кожної рослини та проводили

КПЛР. На фігурі 11А показано, що фрагмент гена РНКі А5МІ1 під контролем обох промоторів

ММУ і Е4 має вплив на рівень аспарагіну у зразках обробленого листя, кількість аспарагіну варіює у різних подіях трансформації. Е284-4 продемонстрував зниження рівня аспарагіну на 2495, тоді як Е284-6 продемонстрував зниження рівня аспарагіну на 8995 у порівнянні з бо фоновими рослинами ТМУОедебе10 (7умегп), що вирощені паралельно. Вміст аспарагіну корелював з рівнем РНК А5МІ, що виміряний через З дні обробки, для обох промоторів ММУ або Е4 (фігура 118); це підтверджує, що аспарагін синтезується в ході обробки, і що копії АБМ1-

Т й/або АБМ1-5 залучені в утворення аспарагіну протягом ранньої фази обробки. Як конститутивний промотор, такий як ММУ, так і промотор, що специфічний для старіння, такий як

Е4, є активними для сайленсингу А5МІ1. Ефективність промотору Е4 свідчить, що гени А5МІ є, головним чином, активними протягом старіння (пожовтіння), що сприяє утворенню аспарагіну в обробленому листі, ймовірно, для перерозподілу азоту з джерела - листя - у насіння. Через три дні обробки паралельно з аналізами транскрипції також вимірювали аспарагін, вже показавши подібні профілі зниження рівня аспарагіну для 6 досліджуваних ліній, незважаючи на те, що всього лише приблизно одна третина даної амінокислоти була синтезована після даного періоду обробки (16,4 мг/г у контролі ТМООе4ебе10 (7умег), дані не показані), даний пік аспарагіну є максимальним через 9-10 днів повітряної обробки після збирання листя (див. фігуру 2).

Аспарагін синтетаза переносить аміногрупу з глутаміну (СіІп), першої амінокислоти, яка фіксує амоній у формі азоту, що асимільований із запасів нітрату у листі, на аспартат (Азр).

Дана активність із застосуванням АТФ призводить до утворення аспарагіну (аспарагіну) та глутамату (Сім, див. також фігуру 3). Відповідно, можна висловити припущення, що сайленсинг

А5МІ призведе до підвищення рівня Сіп й Авр і зниження Си.

Внаслідок цього також аналізували кількість СіІп, Азр, Сім та нікотину в тих самих зразках. У зразках, в яких спостерігалося значне зниження рівня аспарагіну, спостерігалося супутнє підвищення рівня Сп, тобто Е281-6 і Е282-1, і навпаки: у зразках, в яких спостерігався низький рівень аспарагіну, спостерігалася менша кількість іп, тобто Е282-7 (фігура 12А). Як для Сп, так і для аспарагіну баланс амінокислот, який є наслідком сайленсингу генів АБМІ1, є модифікованим зворотнім способом в обробленому листі. Подібний ефект, але менше помітний, ніж для Сіп, також спостерігався для А5р і бій. Як Авр, так і Сім демонстрували підвищення рівня (в «1,5-3 рази) у всіх трансформованих лініях, демонструючи профілі, що подібні Сіп (за винятком Ар в Е282-7). При вивченні активності аспарагін синтетази (див. фігуру

З) підвищення рівня Сім не очікували.

Сайленсинг АБМІ не здійснював вплив на вміст нікотину ні в конструкціях МММ, ні в

Зо конструкціях Е4; це підтверджує, що активність АБМ1-5 й/або АБМ1-Т не поєднана зі шляхом синтезу нікотину й обмежена післязбиральним дозріванням листя протягом ранньої програми старіння.

Подібний експеримент проводили для сайленсингу А5М5-5 й А5М5-Ї із застосуванням трансгенних ліній РНКІі. Дані демонструють, що рівень аспарагіну ефективно знижувався, особливо, у двох лініях, коли фрагмент РНКі АБМ5 експресувався під контролем конститутивного промотору ММУМ, і не знижувався або знижувався виключно незначно під контролем промотору Е4 (фіг. 13А). Цікаво відзначити, що дані лише частково корелювали з рівнем мРНК АЗМ5, який оцінювали методом кПЛР через З дні обробки (фіг. 138). По-перше, у подіях трансформації під контролем промотору Е4 спостерігалися більші кількості МРНК А5М5, ніж під контролем ММУ; це підтверджує, що промотор Е4 є менш ефективним, ніж промотор

ММУ, для сайленсингу АБМ5; можливо, це свідчить, що програма синтезу білка А5М5 виникає швидше та раніше, ніж утворення білка АЗМ1 після збирання листя (фіг. 7). У певних лініях відсоток аспарагіну не корелював з рівнем мРНК, наприклад, порівняйте Е303-14 з Е303-16 або

Е305-5 з Е305-15. Дане спостереження може бути обумовлене тим фактом, що копія АБМ5Б-Т залучена в активностях, що не представлені або виключно незначно представлені в обробленому листі (фіг. 9), але представлені у квіткових тканинах (фіг. 10). Через три дні обробки також вимірювали аспарагін, і були продемонстровані подібні профілі зниження рівня аспарагіну для 6 ліній (дані не показані), як і для трансгенних ліній А5М'І (див. текст вище).

Кількість Сп, Азр, Сім та нікотину також вимірювали в лініях АБМ5-КМАЇ (фігурі 14). В лініях

АБМ1-ЕМАЇ у зразках, в яких спостерігалося значне зниженя рівня аспарагіну, спостерігалося супутнє підвищення рівня Сіп, тобто ЕЗ3ОЗ3-1 і ЕЗ303-16, і навпаки: у зразках, в яких спостерігався високий вміст аспарагіну, спостерігалася більше низька кількість СіІп, тобто Е303-14 й Е-305-16.

Е305-5 демонстрував зниження рівня аспарагіну менше ніж на 10 95 і підвищення рівня Сіп, А5р і Сім у порівнянні з контролем і сестринськими лініями Е-305-15 й ЕЗ305-16; це свідчить, що у конкретному випадку промотор Е4 може частково сайленсувати копії АБМ5. Лінія Е303-1 демонструвала максимальне зниження рівня мРНК (фігура 138), значне зниження рівня аспарагіну (66 95, фігурі 13А) і відповідне підвищення рівня Сіп (14-кратне), Азр (3-кратне) і Си (З-кратне) у порівнянні з контролем (фігурі 14А, В і С). Таким чином, у випадку рослин АБМ1-

ЕМАЇї сайленсинг АБМ5 призводив до помітного зниження рівня аспарагіну та підвищення рівня

Сіп, А5р і Сі. Рівень нікотину не змінювався у рослинах АБЗМ5-КМАЇї (фігурі 140), що спостерігали для ліній АБМ1-ЕКМАЇ; це свідчить, що реакція відокремлена від шляху нікотину.

Листя у середній частині стебла зважували у кожній події трансформації та контрольних лініях. Дані не продемонстрували помітних змін біомаси листя, коли рослини АБМ1- й АБМ5-

ЕМАЇ вирощували у контрольованих умовах, таких як теплиця (фіг. 15).

На заключення, сімейства генів АБМІ й А5М5 сайленсовані у відповідних лініях МММ КМАЇ, таким чином, це свідчить про те, що копії генів АБМІ й АБЗМ5 залучені у синтез аспарагіну в ході обробки Берлі.

Проводили аналізи методом перехресної кПЛР для визначення того, чи сайленсовані обидва сімейства транскриптів А5МІ й АБЗМ5 у відповідних рослинах АБМ1-ВАМАЇ й АБМ5-ВМАЇ під контролем промотору ММУ. Дані таблиці 2 демонструють, що у рослинах А5М5-АМАЇ обидва транскрипти АБМІ й А5БМ5 сайленсовані, але це менш очевидно у рослинах А5М1-АМАЇ, особливо, для ліній А5М1-1 й АБМ1-2. Дане спостереження, ймовірно, обумовлене тим фактом, що як гени АБМ5, так й А5МІ (5 і Т) є досить подібними та належать до одного кластера генів (фігура 6). Однак це може також свідчити про те, що для змінення синтезу аспарагіну в обробленому листі досить інактивувати тільки кластер гена АЗМІ1.

Аналіз експресії СУРВ2Е4 в ході обробки Берлі свідчить, що промотор Е4 стає повністю активним лише через 48 годин обробки; таким чином, це свідчить, що всі трансгенні конструкції або фрагменти генів під контролем промотору Е4 експресуються пізніше у ранній фазі обробки (248 годин). Внаслідок цього на основі даних, що представлені на фігурі 11 і фігурі 13, було висловлено припущення, що АЗМІ1-Т і -5 активуються пізніше протягом першої фази процесу обробки, оскільки сайленсинг А5МІ може у рівному ступені запускатися промоторами МММУ і Е4.

Промотор Е4 слабо контролює сайленсинг АБМ5, таким чином, це свідчить, що гени АБМІ1 контролюються послідовністю подій, що поєднані з індукованою програмою старіння листя.

Приклад 4 - Лінії варіанта А5М (мутанта ЕМС)

Були ідентифіковані ЕМС-мутанти А5М для двох копій АБМ1-5 і -Ї і двох копій А5М5-5 і -Т.

Проводили скринінг специфічних мутацій на геномній ДНК у передбачених послідовностях екзонів. Три стоп-мутації були ідентифіковані в копіях АБМ1-5 (АБМ1-5 М/1567), АБМ1-Т (АБМ1-

Т УМ156У й АБМ5-5 (АБМ5-5 066"), але не в копії А5М5О-ЇТ. Оскільки в А5М5-Ї не були

Зо ідентифіковані стоп-мутації, була вибрана мутація, яка відрізняється від стоп-мутації, що демонструє показник 5ІЕТ, який становить 0,0004, як потенційний кандидат, що може замінити стоп-кодон (АБМ5-Т (590).

Насіння нащадків від батьків М2, що несуть мутації (варіанти) або є немутованими у вибраних генах (аут-сегреганти ДТ), генотипували, ідентифікували та висаджували у полі. 10 рослин кожного вибраного варіанта вирощували збоку від 10 рослин їх відповідних аут- сегрегантів ДТ на окремих ділянках, щоб запобігти будь-якому впливу варіабельності поля (тобто негомогенного добрива нітратами та відмінностей грунту). Чотири листа з середньої- нижньої частини стебла відбирали у період збирання врожаю та підвішували на мотузках протягом 2 місяців у коморі для повітряної обробки. Листя розрізали і пластинку подрібнювали з одержанням дрібноподрібненого порошку. У кожному пулі листя визначали аспарагін (мг/г).

Незважаючи на те, що у зв'язку з варіабельністю від ділянки до ділянки спостерігалися деякі зміни, спостерігалася однозначна тенденція до зниження рівня аспарагіну в А5М1-5 М/1567,

АБМ1-Т М/1567 й А5БМ5-5 066" у порівнянні з їх відповідними сегрегантами ДТ, але не для

АБМ5О-Ї 590 (див. таблицю 3).

Відсоток зниження рівня аспарагіну показаний на фігурі 17. Найбільше зниження спостерігалося для АЗМ1-Т МУ1567 (83 95), потім для АЗМ5-5 066" (44 95) і, нарешті, для АБМ1-

Вміст аспарагіну у варіантах АЗМ корелював з рівнем активації генів в ході обробки. В дійсності,

А5МІ1-Т більш експресувався в ході обробки, ніж АЗМ5-5 й АЗМ1-5 через 48 годин і 60 годин обробки (див. фігуру 8 ії фігуру 9). Однак дане спостереження все ж необхідно приймати з обережністю, оскільки дані для АЗМ1-Т УМ1567 були одержані тільки з однієї ділянки на полі, й як рослини АБМ1-Т УМ156", так і рослини-аут-сегреганти ДТ для даної лінії демонстрували значне зниження біомаси у даному польовому експерименті (див. фігуру 18).

Зниження біомаси в АЗБМ1-Т УМ1567 та його відповідних аут-сегрегантах ДТ АБМ1-Т М/1", ймовірно, є наслідком іншої мутації або мутацій, які все ще присутні в обох варіантах ліній. В дійсності, трансгенні експерименти з лініями АЗМ1/5-ЕМАЇ, зазвичай, свідчать про те, що АБМІ1-

Т Її будь-які інші копії АБМІ й АБМ5 не мають впливу на висоту рослини і фенотип біомаси (див. фігуру 15). Схрещування з фоновим сортом ААЗ7 і подальше самозапилення рослин дозволило авторам даного винаходу зробити висновок про відсутність ефекту стоп-мутації АЗМ1-Т у 60 відношені розміру рослини. Фігура 18 також демонструє, що стоп-мутації в АБМ1-5 й АБМ5-5 не мали впливу на біомасу рослин. Це також справедливо для точкової мутації (3590 в А5М5-Т, яка, ймовірно, згідно з даними експресії (фіг. 7 і фіг. 8), переважно, залучена в інших тканинах, таких як квітка (див. фіг. 10).

Другий польовий тест проводили з подібними стоп-мутантами для А5БМІ1-Т (6 ділянок, включаючи 10 аут-сегрегантів рослин і 10 рослин стоп-мутантів), А5М1-5 (6 ділянок, включаючи аут-сегрегантів рослин і 10 рослин стоп-мутантів) й АБМ5-5 (9 ділянок, включаючи 10 аут- сегрегантів рослин і 10 рослин стоп-мутантів). Після обробки листя (6 листів середньої частини стебла) рослини-стоп-мутанти АЗМ1-Ї демонстрували зниження рівня аспарагіну у листковій пластинці на 1995 у порівнянні з аут-сегрегантами, рослини-стоп-мутанти АБМ1-5 10 демонстрували зниження рівня аспарагіну у листковій пластинці на 23 905 у порівнянні з аут- сегрегантами і, нарешті, рослини-стоп-мутанти АБМ5-5 демонстрували зниження рівня аспарагіну у листковій пластинці приблизно на 10 95 у порівнянні з аут-сегрегантами. Дані результати підтверджують попередні результати, що представлені у таблиці 3, які свідчать, що вибрані стоп-мутанти є ефективними для зниження рівня аспарагіну в обробленому листі. У порівнянні з даними для аспарагіну з ліній АЗМ-ЕМАЇ комбінація трьох стоп-мутантів АБМ!1-

Т МУ1567, АБМІ1-5 МУ1567 й АБЗМ5-5 0066" повинна забезпечити подібне зниження рівня аспарагіну у пластинці в обробленому листі.

На основі цих даних автори даного винаходу зробили висновок, що А5М1-5, А5БМ1-Т й

А5М5-5 залучені до утворення аспарагіну протягом повітряної обробки листя тютюну Берлі.

Приклад 5 - Вплив зниження рівня аспарагіну на трансгенних лініях АБМ на утворення акриламіду

Порошок пластинки листя трансгенних ліній МММ-А5М1-ЕМАЇ (лінія Е281-6 та її відповідний контроль, див. фігуру 11) і МММ-А5М5-КМАЇ (лінія Е303-1 та її відповідний контроль, див. фігуру 13) перемішували з 5095 порошком тютюну Вірджинія з одержанням суспендованого та формованого матеріалу листя відповідно до специфікації виробника. Одержували вироби, що утворюють аерозоль, й аерозоль, що генерований за допомогою нагрівання зазначених виробів, піддавали аналізу (у режимі згідно з Міністерством охорони здоров'я Канади) для вимірювання акриламіду. Результати показані на фіг. 19. Спостерігалося зниження рівня аспарагіну на 88 95 в лініях АБМ1-КМАЇї, яке перетворювалося у зниження рівня акриламіду 70 95 у порівнянні з

Зо відповідним контролем тютюну. Аналогічні дані були одержані з другими трансгенними лініями, де спостерігалося зниження рівня аспарагіну на 66 95 у листі ліній АБМ5-КМАЇ та зниження рівня акриламіду на 40 95 в аерозолі у порівнянні з контролем тютюну.

Акриламід являє собою біологічний маркер (Маша! єї аї., 2011) для курців. Утворення акриламіду також аналізували у диму горючих сигарет (фіг. 20). Горючі сигарети одержували з обробленого листя середньої частини стебла рослин А5М1-ЕМАЇ із застосуванням наступної процедури. Тютюнове листя витримували при температурі 22 "С і при вологості навколишнього середовища 60 95. Різаний наповнювач одержували з листкової пластинки після видалення центральної жилки. Сигарети виготовляли вручну, заповнювали за допомогою електричної інжекторної машини для сигарет "Рожегтаїййс 2" з використанням стандартних сигаретних трубок. Маса різаного наповнювача, що введений у сигарету, варіювала (приблизно 800 мг) для одержання опору затягуванню, що відповідає від 120 до 140 мм водяного стовпа. Потім міцність (твердість) кожної сигарети контролювали вручну. Після визначення параметрів для ряду подрібнених наповнювачів дані параметри підтримували для серій кожної виготовленої сигаретної палички (200 на зразок).

У контрольованих рослинах вміст аспарагіну у різаному наповнювачі тютюну (фіг. 20) був порівнянним з вмістом аспарагіну, що вимірюваний у змішаному порошку для формованого листя (див. фіг. 19), і був приблизно на 10 95 нижче у порівнянні з кількістю, що виміряна на фіг. 11. Така відмінність обумовлена положенням листя на стеблі під час збирання: після обробки

Берлі аспарагін присутній у більшій кількості у листі нижньої частини стебла, ніж у листі верхньої частини стебла. Однак зниження рівня аспарагіну в АБМ-КМАї у порівнянні з рослинами дикого типу було аналогічним даним, що представлені на фіг. 11 ї фіг. 19. Цікаво відзначити, що зниження рівня акриламіду було менш ефективним у диму горючих сигарет (57 95), ніж у виробі, що генерує аерозоль (70 95); можливо, це свідчить, що реакція Майяра, що призводить до утворення аспарагіну, є більш ефективною у нагрітій, ніж у горючій або спаленій тютюновій продукції.

Зниження рівня акриламіду також є ефективним в аерозолі з виробів, що утворюють аерозоль, які одержані з пластинки стоп-мутанта АЗБМ1-5 (фіг. 21). Однак у даному випадку дане зниження обмежене у зв'язку з обмеженим впливом єдиного АБМ1-5, який сприяє синтезу аспарагіну в обробленому листі, у порівнянні з, наприклад, А5М1-Т (на основі даних, що бо представлені на фіг. 17). Ці дані свідчать, що як у трансгенних лініях А5М-ЕМАЇ, так і в мутантних лініях А5БМ зниження рівня аспарагіну в обробленій пластинці супроводжується послідовним зниженням рівня акриламіду у диму горючих сигарет й аерозолі, що утворений в результаті нагрівання. Іншими словами, нокаут копій гена А5МІ1І й АБМ5 призводить до зниження рівня аспарагіну у матриці тютюну та зниження утворення акриламіду у диму горючих сигарет й аерозолі, що утворений в результаті нагрівання.

ПЕРЕЛІК ДЖЕРЕЛ

Сапаїез У, Виєда-І оре? М, Сгамеп-Вапіе В, Аміа С, Сапома5 ЕМ. (2012). Момеї іпвіднів іпіо геашаїйоп ої азрагадіпе зупіпеїавзе іп сопіїтегв. Егопі Ріапі сі. 3:100.

Їемліз 5, Вожеп ЗМУ, Кеоді МА апа Оємжеу ВЕ. (2010) Тнгеє пісоїїпе детеїНуїазе депев5 теаіаїє попісоїїпе бБіозупіпевзіє іп Місоїйапа їабасит 1.: їТпсіопа! сНагасієгігайоп ої Ше

СУРВ2Е10 депе. Рпуїоспетівігу 71: 17-18.

Моїідоуеапи 5С (2005) Апаїувзів ої Ргоїєїп Атіпо Асідв іп Тобассо Овіпуд Містожмаме Рідезійп ої

Ріапі Маїегіа!. Сопігіршіопв о Торассо Везвагсі 21: 451-465.

Маша! 25, Магапо КМ, Каїпйтап 5, М/ївоп СІ (2011) ОіМегепіїа! ехрозиге БіотагїКег Ієме!5 атопд сідагене взтоКег5 апа 5тоКеїе55 Юбассо сопбзитегв іп Ше Маїопа! Неайй апа Мийіоп

Ехатіпайоп Зигуєу 1999-2008. ВіотагКегв 16:222-235.

Опоа Н, Спидар МУ, ОНпізспі-Катеуатаа М, Н. Мадаа, М. ІвспігаКас, Н. Кобрауазнпіа 5 М.

Уозпідаа. 2003. Апаїувіз ої асгуіатіде Бу І! С-М5/М5 апа 20-м5 іп ргосеззей дарапезе /оод5.

Еоса Адайімез « Сопіатіпапів, 20: 215-220.

Рароизек еї а!. (2014) Оеіептіпайоп ої Асгуіатіде апа Астоїєїп іп ЗтоКе їтот Тобассо апа Е-

Сідагецевз, Спготаїйоагарніа 77: 1145-1151.

Зієїто М, Вайеу УМ, Оцаді 5, ВаКапег М, Вомеї І, УМід А, Соерієй 5, Реївсп МС апа Імапом

МУ. (2014) Тне юрассо депоте зедиепсе апа її сотрагізоп м/йй Шозе ої тай апа роїаю. Маї

Соттип. 5:3833.

Наступний аспект відноситься до мутантної, що не зустрічається у природі або трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, яка характеризується зниженою експресією або активністю аспарагін синтетази, причому зазначена аспарагін синтетаза містить, складається з або складається по суті з: () полінуклеотидної послідовності, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності

Ко) щонайменше 72 95 з БЕО ІЮО МО: 1, або 5ЕО ІЮ МО: 3, або 5ЕО ІО МО: 5, або 5ЕО ІЮО МО: 7; або (і) поліпептиду, що кодується полінуклеотидом, який описаний в (Її); або (іїї) поліпептиду, який характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з ЗЕО ІЮ МО: 2, або 5ЕО ІЮ

МО: 4, або ЗЕО ІО МО: б, або 5ЕО ІО МО: 8; причому експресія або активність аспарагін синтетази, що викладена в (Її), (ії) або (ії), знижена у порівнянні з контрольною рослиною.

Наступний аспект відноситься до способу одержання рослинного матеріалу зі зниженими рівнями аспарагіну та зниженими рівнями акриламіду в аерозолі, що одержаний із зазначеного рослинного матеріалу, у порівнянні з рослинним матеріалом з контрольної рослини, причому зазначений спосіб включає наступні стадії: (а) забезпечення рослини або частини зазначеної рослини, що містить полінуклеотид, що містить, складається з або складається по суті з послідовності, що кодує аспарагін синтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з БЕО ІЮ МО: 1, або ЗЕО ІО МО: 3, або ЗЕО ІЮО МО: 5, або ЗЕО ІЮО МО: 7; (Б) зниження експресії полінуклеотиду або активності білка, що кодується зазначеним полінуклеотидом, у рослині або частині зазначеної рослини; (с) збирання рослинного матеріалу з рослини або частини зазначеної рослини; (4) обробку або сушіння рослинного матеріалу; (є) необов'язково, вимірювання рівнів аспарагіну у рослині або частині зазначеної рослини і/або вимірювання рівнів акриламіду в аерозолі, що одержаний з рослини або частини зазначеної рослини; й () одержання обробленого або висушеного рослинного матеріалу зі зниженими рівнями аспарагіну та зниженими рівнями акриламіду в аерозолі, що одержаний із зазначеного рослинного матеріалу, причому, переважно, рівень нікотину є по суті таким самим, як і рівень нікотину в контрольній рослині; причому, переважно, утворення глутаміну, аспарагінової кислоти та глутамінової кислоти підвищене у порівнянні з обробленим або висушеним листям контрольної рослини.

Будь-яка публікація, що цитована або описана у даному документі, надає відповідну інформацію, що була розкрита до дати подання даної заявки. Заяви, що зроблені у даному документі, не повинні тлумачитися як такі, що допускають, що автори даного винаходу не мають права датувати більше ранньою датою такі розкриття. Всі публікації, що згадані у вищенаведеному описі, включені у даний документ за допомогою посилання. Різні модифікації та варіанти даного винаходу будуть очевидні спеціалістам у даній галузі техніки без виходу за рамки обсягу та суті даного винаходу. Незважаючи на те, що даний винахід був описаний на бо основі конкретних переважних варіантів здійснення, слід розуміти, що заявлений винахід не повинен занадто обмежуватись такими конкретними варіантами здійснення. Насправді різні модифікації описаних способів здійснення винаходу, які є очевидними фахівцям у клітинній, молекулярній біології та біології рослин або в суміжних областях, призначені знаходитися в межах об'єму формули винаходу, що додається.

Таблиця 1

Відсоток ідентичних залишків в областях вирівнювання без пропусків між продуктами гена аспарагін синтетази (А5М) тютюну, томата й арабідопсису

І І дІДОМІ| ДІАОМ2 | дім | МАЗМО- МІАЗМО- МАБЗМИ МАБМИ МАЗМУЇ кіАМ3-5 о600о7 49055 т З т З т 180 200

Таблиця 2

Аналіз методом кПЛР (відносні одиниці експресії генів) для визначення ступеня сайленсингу АЗМ1 й АБЗМ5 в трансгенних лініях АБМ1-ВМАЇ (А5М1-1, АБМ1-2 й АБМ1-3) й АБМ5-АМАЇ (А5М5-1, АБМ5-2 й АБМ5-3) із застосуванням специфічних праймерів АЗМІТр й АБМ5р. 11111111 ДАВМІр77777777777 А5МрСССсС у

Таблиця З

Аналіз аспарагіну (мг/г) у листі після повітряної обробки, що відібрані у нижній/середній частині стебла у чотирьох варіантах А5М: АЗМ1-5 УМ156" та його відповідні аут-сегреганти ДТ А5М15 МЛ", АБМ1-Т М/1567 та його відповідні аут-сегреганти

ДТ АБМ1-Т М/Т", А5М5-5 066" та його відповідні аут-сегреганти ДТ АЗМ5-5 У/1",

АБМ5-Т (590 та його відповідні аут-сегреганти ДТ АБМ5-Т М/Т".

Кожний варіант й аут-сегрегант ДТ висаджували поруч один з одним на окремих ділянках для запобігання будь-яких небажаних ефектів поля (тобто відмінностей нітратів і грунту).

З МУТяЯ 5 МУ1567| ТМУТя |ТМУ1567| 5 МУТя | 5 066 | ТТ М/Тя |Т са590 772. | 260 1 206 | | | 223 | 162 | 185 | 279 773 | 229 | 205 | | (| 220 | 152 | 177 | 280 1714 257 | 213 | .Ї777171717177771717171717117717171717171711 283 1287

Продовження Таблиці З 7.5 | 309 | 220 | |! їЇ! | | 254 | 319 76 | 774 | м. | ЙЙЇ Її ЇЇ Її її 77 | 784 | 7753 | (Її ЇЇ ЇЇ Її її

Бод ся ШИНИ НС ОО ПЕС НО СН Я

ПОСЛІДОВНОСТІ

ЗЕО ІЮ МО: 1 - МАБМ1-5, послідовність геномної ДНК ащіосддааєсноддсітшааЧнансідаїдансісаддесааааддансдідісісдадсісісісдсаддіааанатацссси спнсічтанонааюванаютнодсонанатандансіШаїдадааадіаднссідаасдацосаїШадааіаааадаадасіааад снНаадаіаданагаташадаїансндасдюддассіаїаіснадансасааіаіаайнсісддассаасіційадсаюдаснодіааад адідаїадаааадсідіданаанадіаддадіаайсашссаюнасаанасна!!снісіссісснодісподссасідсіададдса даїсіаїаанссіаснададіандаасасанйдаіастндааайноіаадідідсадшааіатонаааандааддннйаанасашіаї асоащдасоНаїаіадссісісіасссдсаіааддіаддддіаацдісідсдіасаааіаддсідайцсасісідюнсадндаасаааа сддсаїссассасідшносааацдсацддаадвоаааацдісаідссісаїсасідісасасаздантатататанааагцанста ааїсіїіанадідддіасідааіїсносіаасідаїсдандадааасаддаадсаїсдідавассаданддадддосідіаіїсаасащад дасідйцНаснддсасаїсадсдісіадстайундаїссідснссддідаїсаассістцаасдаадаїаадасчаноаноанНасдаюдаї дсішаашсаїдшасісісашснодсісадшШасідадаааасдааасіаадсідаїаасіаіїсаассааїсаассасаїасаадіадчд даїсдасіаіаїдансанНаіасстесісіансаааіадідаїданаашсаїдссааааашсаддіааадодададаїсіасааїсасд адсаасіїсдіаадсаааїдссіааісаіаадііссддасюдсадюдасідідащдісаносасассіадідадіасісаїсіссааснада ааасащдіащіагацдіаааанайсссіданаганаціасацнааісадіаїдаадаасадюдадааданюдіоддасадсіддащдадаї снсдсіоювнанддатасісдадаіаасадснісноПосісддадссапддааанаснссстшагандаоаноааддасідадаіаадча пссаїадайцнсісаснадчатонНайносаааюдаааюноаасснаїаюіасіаайондіаансюпнсснсісадоадісюіаюддайа ісаїсідадсйаададсндаащдаюдасідсдаасашідаадшісссассадддсасідіасісіадсаадаадюдсадстшадзчаяооі даїасааіссісспдднсісідаддссансснссасісонНаїдаїссснтаднсісаддсоідсстдаааашдідаднааїано Нау аааїддаїссаасаюіданаадосіаіагасаїшодсадасійагсаааадоандаюдасідагцісссстодойсіссісісс99949 дасісдансаїсстдонасіїсдацнасідсісдсіаснддсіддіасаааддсідссаадсадіддддадсасадснсанссісідічнао дссіндаддісадаіааісідадасноідайнасаасацааіаасдасаасассісанйсасаадсіадіааддісадсіаїаюааа(йсі даїассдашосндсешсассдаасаддоасісассодаїсісааддсідсаададаадндсдасіасндддаассунсассасдадії іїісасісассуйсадандаїдаадсаасістаннсасноаїсіаїсаїссіснсЯ ШсісстаШассідаддсааащдасадконаан тдсаддаюдаайдаїдсаанйдаададнащтассаїандадасаїасодацдіаасдасааісададсаадсасіссїтаюнсснаїдіс дсдіааданаадісасіаддадідаадаїддісаіаісюдадаадодаїсічадаадоашадодсіасноїаснісасааддсісссаа сааддаададіссасааддааасаїдісдсааддіаїаадааадідсносадіїссіаддшаааіаддасааддачідадааааюнад

Зо ашцшсссіадсадацнааадсдснсассааіацдасідснаададсааагаадісаасаісідсадддачнадаадсіададієсстео сіадаїааддаднсаїсааїдндссаюавдіайдаїссададіддадааднддіаадціадіідасссссаанундаїсдааіааасааїсаа сдісссіаааасіаюіашайсацісаданааассададсаааддаддайдаааадідддсістааддададсестндаюатдадда дсаїссНаїсісссаааддідіасіаааіїсдссаїшсааасщюашосаааданндааднаанацнаасааасіаасаашасісана санссндсадсасаїссідіаїаддсааааадаасаансадіда(дсаддосіаїаданддаїадаїддасісааадсасаїдсдаас аасащдідсунісааідасіааісаасдасцісіасідсіснашаіснессааїдснанднааадсдассдаддааасааанніссййї ааіїаддідассааіаддаюацШааїдснсасаїаайсссісаіаасасасссанасаааддаадсаіасіасіаїаддаюдайцнсода дсдсишсссасаддіаатойнсадагааїаададаашаюаїйааадчздасіаашасдша дісдашосаассиссаасааюд адсаадсісасаіааїісддаанннсаааіааіаацдсайцодаааїсаіааюдсіааайдадащтасішаассацднссісіассанні дайсідсадаайсадсідддсіаассуйссіддаддадсаадщідасодіадсасадсіааадсюіададчідададсненоддісаа адаассіїдаїсснсаддсаддасідсіапдадіасаїаасісддснададааїсаюіассідсіаддсіааюддаашдассаааа аааїсанддісдідосснсіадаїадааднддідсідсісссдадсісасааіааадаанад

ЗЕО ІО МО: 2 - МІАД5М1-5, передбачена амінокислотна послідовність

МСОП АМІ аС5ООБОАКАМУВМІ ЕІ ЗАВ КНАСИРОМ Ба МОНОИОСМІ АНОВІАІМОРАБЗОаВОРІ Е

МЕОКТІМУТУМОа ЕІ ММНЕОЇ ВКОМРМНКЕА ТаЗОСОМІАНІ МЕЕНСЕВСЕМОМІ ОСІРАРМО ОТ! ОМ5

ЕГМАВОАЇСІТ5І МІС СІ ОСЗМУІЗЗЕЇ КО МОЮОСЕНЕЕМЕРРОНІ УЗ5КМИасЕВАМУМРРМУ/ЕЗЕАЇ

РЗОТАМОРІ М АВАРЕМАМІКАВІ МТОУРЕСМ І СИ 0551 МАБІТАВМІ АФТКААКОУМСАОЇ НІЕСУС

ГЕСЗРОЇ КААВЕМАОМІ СТМННЕЕРНЕТМОВИа1рАІЕОМІМНІЕТМОМТТІВАЗТРМЕЇ МЗАКІКВІ СМКМ

МІЗаєЕО5ОЕМЕСИМмІ МЕНКАРМКЕЕРНКЕТСАКІКАЇ НОМОСІ ВАМКЗТЗАМ/ИЇ ЕАВУРЕГОКЕРІМУ

АМ5ІОРЕМУКІИКРЕОВАВІЕКУМУ А АВАБОСЕЕНРМІ РКНІ-МВОКЕОєЗОССУСУБУЛОІ КАНАЕОНМУ

ТМАММЕМАЗНІЕРРНМТРІТКЕАУУМАМІРГЕВЕЕРОМЗАСІ ТМРІСАЗМАСЗТАКАМЕМ ПВВАБМУЗКМІ О

РЗИВААІСУНМЗАМЕМНУРАМАМОМІ ТККІПСВУРЗМУЕМСААРЕЇ ТІК

ЗЕО ІЮ МО: З - МАБМІ1-Т, послідовність геномної ДНК бо ашщіосддааєсноддсіи шана нсідадайсісадддсааааддансо і йсісдадсісісісдсадаїааанатацссснс

Ішнсістандйааювандцдндсаюдсонанаансишаюдадааадвчіадціссідадсатодадсдсіасідандсеснодсатадааї ааааснаададданаїаашадаїансндасоаюдассіаіаєснадайсасаашісісддассаасідйннадсаїюдасноіатаюда тдНоаїагдааааосіцідднШадіаансашссаднасаанасіааісцсіссіаісііднснодссасідсіададдсадаісіаїаацс діаанададіайдаасасайдіастісаааанаіаадідсдсаашааіатонааааноаадоасннаанасадіатаісододісі сдіаіадссісісіасссаїдіааддісідсдіасасанасссдссссаїдсссісссоідаааїйшасідоадшоасюнанондаасатщі дісдсаїаїасто й сідіодааїсаааацдсцдісаїсідссасідйцдсааадсаддаадчздаааацдісаїдссісаїсасідісасасад чаншашататшаштанатаатдайсннсндаюдюдааасіанадодаоіасідаасіддсіаасідасіаадааасаддандаадс асоддассачанддадідддсідіаїсаасаюдодасіднасіддсасаїсадсцдісіадсіанудаїссідснесддідаїсаассї сюшаасдаадаіаадасчаноаі юнасддідадідсннаатнсаднштасісісаціспосісадшасідаюдаасаїдааасіаашда сіаїсааїсадссааіїсаассасдсНаайссаїасаадіадддаісдасіаїіаїдансанНаїасстесісіанссдданесіиШансаааї адндаданааніса(дссааааацйсаддіаааддададаїсіасааіїсасдадсааснсодсаадсаааїдссідаїсаїаадіссд дасюддаадіщдасідідащісаносасассіадідадіааісіаданНасісаїсіссааснаддааасашдіашдіанссссіданатшсаї сасщШайцдіасанааісадіадаадаасадюдадаадашоюддасасідвадодоасісдсішонасюдаасісдадаїаа садсшснойНосісдідаїдссанддаайнасносстаганоаднпаддодасндаюддіаадайссаїанацшінсісаснаданнонандс аааїдааїацндааєстагацдіадіаасіцідіаашодіїссісісадддісюціадодаасаїсідадснааддасндааюдайдасі дсдаасашіоаадійсссассаддасаснодіасісіадсаадааддсддастадодаддіддіасааїіссістуддйнсісідадоасіацс снессасісспнаюаїссснаднсісаддсасдсеснідааааююадчнананйннондааадчоаїссаасацнадісіааддсда агаїсандідсаддсідНаїсаааадундаїдасідаїдісєсстнда днсідсісіссдддддасісданйсаїсстдоносіїсданасід сссдсіаснддеддсасаааддсідссаадсадіддддадсасадснсансснсіюнддссндадаїсадаіааїтсідачатнсю

Щщайнасаасайнааіаасдассасассісансасаадсіадіааоддісадсіаїадаасідаїассдашоснуснісааасдаасадча даїсассддаїсісааддсідсаададааоНдсідасіасндддадаассонсассасдадсасіїсассонсаддіанда(дадсаа сістанндаснодаїсіаїсаіссісідсунсссіошассідаддсаааюдасайдідісдіашодсаддаддаайнодаюдсааноаадаї днащшассаїандадасаіасдаюдіаасдасааісададсаадсасіссіаї( НнссНашцісдсдіааданаадісасіаддадідааад адопнагаісюддоддаадасісдаїдаадвиотоддіддсіаснаїасцсасааддсісссаасааддаададіссасааддааасацці сдсааддіаїадааааадідйссаднісстшаааасснашаааіаддаіаадсаасаасаасаасаасаасссацдіаїааїсссасі адіддддісюаддааддаїанодідіа(дсадассНассссіасссіддддіадададдасіцісадагадааасісдасісссісссіссаа ааасснашаааіаддасааддачідадааааднодаїснссіссаїсісїіадсадацнааадсасіїсассааіаюдасідшаадад саааіаадісаасаїсідсадддадсНадаадсіададідссссіадаїааддаднсаїсааюндссаюдадіандаїссададодда

Зо адноадіаадіадідаассссаанундаїсдааіааасодаїсаасідісссіаааасснодіансіаїссашсаданааассададсааа дааддайдадаадіддосісїіааддаддассидаїдаїдадодадсаїсссіаїсісссаааддідаіасіаааіїсдссстісааасідаї посаадящданісдааюнаїанднаассааасіаасааціпаадасісдаїдаадиотоддіддсіаспаасшсасааддсісссаас ааадаададнссасааддааасащдісдсааддіаїаааааадідшссаднсспшаааасснташааагаддаїіаадсаасаас аасаасаасаасссадіаїааісссасіадіддадчісідаддадддіандідіадсадасснассссіасссюддаїадададоасдні садаїадааасісдасісссісссіссааааасснашаааіаддасааддадндадааааціїдаснтссіссаїсісіадсадана аадсасіїсассааїадасдЦаададсаааіаадісаасаїсідсадддоснНадаадсіададідсстссіадаіааддаднсаїс аа(дндссаюдавдіандаїссададддааднодаіаадіадндаассссаайо НОаїсдааіааасодаїсаасідісєссіаааасснодіа

Псіаїссацісаданааассададсаааддаддайдадаацдідддсісїіааддадддсстдаюдададдадсаїсссіаїсісссаа аддіддіасіаааіїсдсссійсааасічаштодсаадідайсдааюднаїаноунаассааасіаасаацасісанасашссідсадса саїссіаїасаддсадааадаасаансадідадасдіаддсіаїао ддаїадацддасісааадсасаїдсідаасаасацідсдше аадасіааіїсаасаасшсіаашнснащшасіссаадштдтаннааадсічаснадаантоатнсстаагадддодассааада адаїдснНаацдснсасаїаїансссісаїадасасассданасаааддаадсаїасіанаїаддаданнсдадсостШсссасадоїа ашоансаюіандідаддансаюдаїааанадсіааснадсідашісаасспдсаассіїссдаіаадісасапоподаднонанса аадсдадащшасішаассаюнссісюданндонсідсадаансадсддодсіаассоанйссюдаададсдадіаддсдщіадс асадсіааадсідіададіддчдадснснодісааадаассіндаїссісаддааддосідсіапддщіасаїаасісадснатдадааї саюаассідсіаїддсіаадддаашодссасаааааїсайодссдідсдссдісіаюддіадааа нддіоасідсісаїдадсісасааї аадачаднад

ЗЕО ІО МО: 4 - МІАД5М1-Т, передбачена амінокислотна послідовність

МЕОКТІМУТУМОа ЕІ ММНЕОЇ ВКОМРОНКЕВТабЗОоСОМІАНІ МЕЕНСЕОЕМОМІ ОСІРАЄМ І ОТ ОоМ5

ЕГМАВОВАЇСІТ5І МІС СІ ОСЗМУІЗЗЕЇ КО МООСЕНЕЕМЕРРОНІ УЗ5КМИасЕВАМУМРІ МУЕ5ЕАЇ

РЗТРМОРІ М АВВАРЕМАМІКВ МТОМРЕСМ І 5020 0551 МАБІТАВМІ АТКААКОМ/САОЇ НІЗЕСУС

МІЗаБєЕОБОЕМЕСИМІ МЕНКАРМКЕЕРНКЕТСАКІКАЇ НОМОСІ ВАМКЗТЗАМ/ОЇ ЕАВУРЕГОКЕРІМУ

АМ5ІОРЕМУКІИКРЕОВАВІЕКУМУ А АВАБОСЕЕНРМІ РКНІ-МВОКЕОєЗОССУСУБУЛОИЇ КАНАЕЄОНУ

ТМАММІ МАЗНІЕРНМТРІТКЕАУУУАМІРЕВРЕРОМЗБАСІ ТМРСАЗМАСЗТАКАМЕМ ОАЗМУЗКМІ Ю

РЗСИВААІСУНМЗАМЕМНЕРАМАМОМІ АТКІСВАРЗМУЕМСААНЕЇ ТІН5

ЗЕО ІЮ МО: 5- МАБМ5-5, послідовність геномної ДНК ашщіаддааіснаддстно надано садаїдайсісаддссаааадддчісдаднсндадсісісісдсаддсаашессстени бо сісішаїШацйцасіссаїсаіаіїаанайсіастсасстно кшаантсдандштастндсшснсашааюднснодсанодсісіадсіс сіаїасдааіааїаддадсіааадіааіїададічаадданатодадсаасддіаааднанноїагаднсасаданададссоїааа адсаднасіадідшосанадддіаадунцісіаїсаддааадаїаштодіадсаандассассстдасаааааанаюдсаіаааатана сіаспонандансааааааіащдасніоаасаїссідіаіадссіадіддсааадддчонсаааайшндаасасстандаансідой ісдісоНосідісіасаасасасісісдаадідсуддсснсссісааасссіасоідааіаюддаасдссіадідідссддаа(дссстадодс щадіааіададіасіа Ндаїагассіааааїасддаасіддсасдададаїаадансадаашагтадснаанашаааашатвсандца

ШайШйсаассададнсайсіадіададтнацідсаїаштдісдатодсассашаннааднсінодсанасістаашашаюдааїааїта адсіааасіаайчадшашцідащдіаасідасстаднддсадддадтодасіасндаашаааасааданаадасноіюдадноядса діаандшодаїасндаашадаасаадааіаааасааданаанааддаїасананссіаасссдддасссіаансіаїадандацайн ааашиснудассаассдісассдідассіднсаюдаїдідаддсаааадссаіааіасасндашсі шнсааннаааднснанаї їаїаснацазаіасндаааанацдадісааааїйнааіатонансснссоїадноасісааснддадіса(даааааааааааааа шШааасндідаїснааасаадісаїсдатаїадідідоноїдааісодссісонаддаїааадіадааатіаааднааасіашсдаа аїаааааадчіадаіаданндддасагасіаааааддаааіаасасаіааааддаасааадаацдіаіаїшадідайцнсасаїаїаїа іїсадіайндіаїсааааадс ддісадідаасісайдаасддадсіссаїссассіссдадіасюдсааса(дщдассддеоддсадад саасссНасдіассадддісаісідаассіадіаіаааіатацодідаааааїсссіаааашнсааіаанадіадацаааасснааїшаа аасіасаададнсадішааааістагацдісааассіаїсааданаааіссіддаїссассішосаїдідасадіасааіїадссннодіа андааасааататодаайоддіаасіашоаїсасаїадондаадсаісдіддассадапддадіддоааіаісаасадаюдантнас

НПадсасаїсаасуошадсаанаісдаїссіснсіддідаїсадссісюцаасаадаіаадасчанононасадідадідссісіаайі ассісннишешНн ин Шасодасосоаштаданашаюддадаааатаааншоанандчапаідодсіааайосаддісаадда дадашасааїсададаааснсдіааїснаюдссіааіїсасааднсадаасіддаадічандічаюпнандсасаїсноїдаднадшна спнсісайдассааснаддссадідаанаанаддаайсдадтодаїаюдісааацнадснагаадсаснанаїсааїшаасайн

Шаїссаїасасдіаасіднсайнсаїааадісанадсаснодаїдсісаїсаассіаї( НуУндадасісісдаааацдісадсссдаїадс ашсоддададіссдадсаасаїадсааїісаасіасішнааїсадупнааасдаасаїдсісаїадідаїіаассісіддаааааюднагадіаа анцадаааааштагцасдаїдісісасіаісддіадіандаїсадіадаадааіадчдадаааайндіддасадноададададнсісниї діапнодаїасосдсдаіаасадсшснасідсісдідадсаанодаанасіссссіаїаїанданддадасідашцдаїаадатсіаї асаашссаднадааанаааасюаадсіайссіашасіандаадааїсндаїасаднатоддіашсдісаюнонаїдісісадосі сююдіддацсаїсідадсіааааддайааадащдасцідаасаннодаадшісссісссддісасіндіасісдадсаадааідчзасо99а

Шаддадаюдіасааїссісааіддісісідаддсіанссаїсаааіїсснасдасссснадшідадасдідсснсдаааашіадосії одНаащдаасіадшщіасааіснддаднисісісдастдаіШадсасісааааадаіцісюіасааасдаїснодсіаїааадачідаі дчанаашшосадасінНагсааасданодащдассдащісссстодаїднсідсісіссддаддасндайсдістданосісідісасідс

Зо ісдсіасндасіддаасаааадсідсіаадсааддддадсасадснсансснсідюндоісісдаддісадасіаїсааїссідадсод адасаїзашоддосддаансіддайсаасідаасссандстоаднсодаассаїаіаасаааїссаадааааіаіаадацдідіасаїа іІааіїа(асасісайсідадссіасідасдсіадаіасіддасісдсстодісндадаснаїаагадааааіадатайнсааіассаацсї оишсшсідасідасадддсісассадаїсісааддсідсаададаадндсідасіатшддадаассодіїсассасдадісасснсаса діисаданціааасаідносіасіссдацайнсадюкюавдісіснеідіШНссіссіадааадсаасаацдіайнсацішосаддаддаайн даюсіандаададнащтассаїаісдадасаїасдацдіаасаасодаїсададсаадсасіссіаюнссНаідісдсдіаадчанаааї сасіщдддаднаадаїддісаіаіїсадддаааддсісададаасютододсддсіайоіаснссасааддсіссдаасааддаадаай ссадіддадасаїдісасааддіааіаааасасдісддсіссспддсаацдісідайсіссндісано ндісісдданддааааайносі аїаайсдадаадааанНааїссідсісшсасісодсаїдсадаіаааадсдснсассааіасдасінідададсаааіааддсаа саїсадсаїддддасНнадаадсіададіассашсіддаїааададнсаїсаасоносіаюадіаїісодаїіссідааїддаадаюдаа асаааасідадсіссаайдісааюдадаюдадаадсаїаасідааіадсасодйнсісіаааасіунШсаїссоінсаданааасасодаї саюддіаддаїсдадаадідаднсНнаддаадастідаюдаїдаддадсаасссіаісісссаааддіссасааадіса(днннссіасід ашодссданадіаддаїсаааасіаасадіншонсішШаюіасісідсадсайансіціассддсадааадаасаансадідадасодіа дасіаїаднддаїсдаддасісааадсаса(дсдаасаасацдідадснсіаааіаааіссадаасіацнасаїсунНаїсдіссааїшса шаїшосщісадсідаїснудааасаансінсісісаддщдасідаїаддаюдаїснаадсідсасаїаіснНеоссісасаасасіссаа сіасаааддаадсаіасіанасаддаїдашсдададдненсссасаддіаснаадсдсдадасіадааїсаїаагсіснааадада аасадаааааіаааддадда4нннсісстдааааадіашасіасіданааадсасснсансасссаїснусіаснсосоїасшас їааондідансіаааааадаадашадснодіаїанссаїсасдаддаадссасааааадансіаснаїаадааднддатасішааюд доададассідддааааассадсодддсінддсссааадссдасааіаїсасассаюнаададіаєсцтоснсдіШадссааасад іїасааіаадісаанцааассаднонасіананддатосадаансадсааддсіаасюнссюдаддассдадіаіадсндсадса садсіааадсіандаддддадснсоддісдаасаассідаїссносодіаддудсідсааісддщіасаїаасісддсНаюдасоаїс аїсіссссдадндаїаацюддаатподасасаасодаїсаїсдаіаацдідссдаддаддіаддадчідддісідсідсададсісасааї ааддадсіад

ЗЕО ІО МО: 6 - МІД5М5-5, передбачена амінокислотна послідовність мсаптГАасБрОБОАКАМУВМІ ЕІ ЗАВ КНАЯРОМУЗСИІМОНаИареЕмі АНОВІ АПОРАБаОарОРІ ЕМ

ООКТІМУТУМаєІММНЕКІ АМІ.МРМЯМНКЕА ТаЗОСОМІАНІ МЕЕМСЕМЕМОМІ ВСОМЕЗЕМ ОТАОМЗЕ

ГААВОАЇІСІТРІ МІС СІ ЮССЗМУМІЗЗЕЇ КОЇ МЕ ОСЕНЕЕМЕРРОНІ У55КМИаСЕВАМММРОМУ ЕЗЕАЇ

РБОМРЖМОРІ МГ АВАРЕМАМІКВІ МТОМРЕСМ І 5, 0551 МАЗМТАВМІ АТКААКОУМСАОЇ НІЕСУ

СГ ЕСЗРОЇ КААВЕМАВМІ ТУННЕЕТЕТМОратірАІЕОМІМНІЕТУОМТТІВАЗТРМЕЇ МЗАКІКВІ "УК

ММУІЗаЕаЗОЕЇ РаСМІ МЕНКАРМКЕЕЕНМЕТСНКІКАГ НОМОСІ ВАМКАТЗАМУаї! ЕАВУРРГЕЇ ОКЕРІМ бо МАМ5ІОРЕМКМІКНОНИВІЕКУУМІ ВКАРОРЕЕОРМІ РКНІ МВОКЕОРЗОсСМИахуБуУраі КАНАЕОН в2

МТОВММІ МААНІЕРНМТРІТКЕАУУУАМІРЕВЕЕРОМЗАВІ ТМРасРОІАСЗТАКАІЕУМУСАБУУЗММІ О

РЗБСИВААІСУНМЗАМООСНІ РОМЕаМОаМСОГТТОМУРАММУаМмаАААЕЇ ТІВ

ЗЕО ІЮ МО: 7 - МА5БМ5-Т, послідовність геномної ДНК адасдіадшадсндйсдіссасддсаіааааасоссіаїааанйсддіддісайтдоансашасадаасссасоаїгсаїсіщаю їайасанндсеснешаса дненсісісссааааіссідсаааїсТаасіаїсноссаїацшсісісссістсіс пси Наїстастасі асісіайпадіададсШаїссаанааацдісаїсіатапддаїаітадннасіасіастаєсноацддаааадаааадааіаааааанад адідісіаїайаадіаїаааааддідаааааіаааааадіадідаїсааісаюіцідаддаїснадоастонддаа щдіссадаїдансісаад ссааагадддайсдаансідадсісісісдсаддсаайсссстснісісіатацнасіссаїсаіанансаасіаїдашсасстщай шсаанааташасістнаснснсашаацнсносандсістаднссШаюддааїааіаддсіааадіааіїадчадідааддадіадад ісддадсаасддідаадсщісШасаюдаїгсіаіадсісасддунсассаіадаадсадссааддсдаадсіадаааансааіаадад тднспісспоссадоддасіадсааддаднсааацдістайШааїсааіаасаадіааїаннаіснаіадідааадсаассасіааїасі тюсашаддіаанадсідісіаїсаадддаадунацдціодіаадіадіддсдаадссадаашісунаадддаідісааааааіаааад іІааасаїассаддазанааддддадісааіасаїадіаіааасааіааштшацітассіадсіаїасадіаїанніссосдааддаса ссссНесіаїааддідасіссдссасіддідаїаадддаіддісаайдаасасссіїсдссдааааацнагасістдацчдідїаааатанасі аснкунНасідансааіаааїазашніодаааасссідсаїадісіадіадсааададіунйсаааанйдаасасашайноаайсісюдте дссасідсідісіасаїсасаіссснааддідсдаїснисдаасаціюдідаагасдддадссндіднссаддсдсссстадасіаа адіааіададіасдаіснаанснаюцдіоаїсаїагассідааасісддаасіддсасдададаїаіааайсадаашагадсааашагсай аднодсашоанааюднсндсанасісіааннйаюааїааіаадсіааасіаайдадштаюндаюіаасідассідадшаодсіасна аааднаааасааданаадасндідаднддсадсдандшнддагасндаасасданаааасаадацнаадасанаїдадсоагасайн анссіаассідддідддассіаайсіаїддайсананаааашсцнддасааассаїсассаїдаїсіднсаїдаюдшададсаааадсс аіааїасастацшсідіаїсасаасіасшаїасасаюнаіададнаааанантааатонайссіїдадісіссідаїайоасіссдс адааансаадаааааааааадааданнаааашагцадісдаааасаадссаїсодагаіадіцдідунонаагаассісонаддсаїа аадіадааайнаааднааасіацйсіаааіаадааааіаіаанонтштосагадасіааіааддааадіадасаадіааааіаааас ааадаадіаїашіаатдашттнссодідісаааааіцісадшадндаасндаасісандааасідддассадддіддадсааассна даїасддаддісаіїссдаассіадіаїдунаїатоідаааааісасіаааашсааїіаанасіадаїадааасснаайаааасіасаа щаддсадшнааааістааацдісааассдаіїсаадайааанаюдаїссасстааащцдісааассдасадіасааіадсснідсаа

Пдааасаааіаідааасанасашанааасіадішаанноддонасіаїйоданасаіадаоаадсаісдддассаданддадіддоаї аіаїсаасаюддічанцаснадсасаїсаасоашадсаайцаїсодаїссіасісіддідаїсадссісіШааїсаадагіаачасіанонаї їасадідадідссісїіаашассснинндіаддасааадсоноатшаданастаанаддсдаааатаааноанандчацпадідсес

Зо ааадндсаддісаадддадааашасааїсаюдадаааснсодіааїснНаї(дссіааіїсасааднсадаассдааадічандаідаюцнаї їдсасаїсноїдаднадшастасісаїсаассааснаддсіадідаансааадасддадсіадаа нодацдіаіададнсідааша даасаадаіааднасідддчнсддаагаданацадасаїанаадіаданіснаасасаааіасасддсссдадссодаадсіандуне їдссдаасссдіадсіадасіпдіадсіссдссайдадуаанаїаіааддааанісддчоутодадіаааснаіаадсюдісааанадсн аїаадсаснанаїісаашсаасацйсіаїссааасасдіаасіансансдайшадсасндаїдснаїісдасіасннааїсаднааасда асаддсісаїаддасааасісіадааааіадаїаноїааацадіадаадаашаїасдаїйдісісасіаісдаїашдіандаїсадіаюаа дааіаїддадаазанндюдасайноададдаоаіднсіснаанонодаїасдсдсдаїаасадсненосідсісддаїдсдацад аацасіссссісїаїанданпддддасіидаюддіааданнсіаїасаашссаадіадааайаааасідаадссанссаашосіанціа дааісндаатаюнатоддатшсаддсістідіддацйсаїстдаднаааддадсеснааададандідаасанідаадійнсссіссса дасасідіасісдадсаадаадюдсоаданаддадаюдодіасаассісаадднсісідадасі й ссаїсаааіссНнадассссНади сюаддсдідссіїсдаааацідадаааюдаа(єсіаддаддщтшесссісісдастоддаснадсасісіааааашодісдіасааасодаїсії дасіаїааддачіддачнонаашсодсаддасюванааасддідаїдассдащдіассстддюнсідсісіссддаадасідайсодісн данусісідісасідсісдсіаснддсіддаасаааадсідсіаадсааїддддадсдсадснсанссисідіднодісісдаддісацдіс ааїсааісідадіадаааааашаддаїсдансіддддшнааснаасісандсійодсісдаассаіаіадсаааїссааааадаша адаїдіагасаїаіааіаіаасасісансідадссіасдасосіадатасіддасідіасстоаісндадасітнодіаагадааааноаай сааїассаашсінсішо дасіаасаддосісассадаїсісааддсідсаададаадійсідастатдддаассунсассасдацді ісасснсасадіїсадаіндіаааісдсдаїдсіаснсаашайнсаююдадасіснсідіНссіасіадааадсаасадютщідсатціна дсаддасддаандаюсіандаадаюнатшассаїаісдадасдіаїдаціаасаасдаїсададсаадсассссіаднеснаціс дсдіааданаааісаснодадідаададісаіаіїсаддддааддсісадаї(даасішдуюддсіасндіаснссасааддсіссса асааддаадаайссасасддадасаїдісасаададіааіаааасасаїсддсаадісідансісстдісандтадісісдданодааїа аацйосіаїдансдадаіаддаащдаоднаадааацнааїсацннссансосадсадаїіаааадсосінсассааіасдасідтшоа дадсаааіааддсаасаїсадсаддадуснадаадсіададіассашсіддаіааададнсаїсаатайудсіаюдавдіаісдаюсда аддаадаїддіаадаааасідадсіссаандісааїдадасдадаадсаїаасідааіадсдсунсісіаааассд Нісаїссдщс аданааасасдаїсааддіаддаїсдадаадіддучнснаддааддснндаїдаїдаддадсассссіаісісссаааддіссасааас іїсазтаййссіасдатоссааїаацаддаїсаааасіаасадштоансіднНаюдіосісідсадсаїанндіассддсадааадаасааї іїсадсдчаюдііаддсіаїдунодаїсдаддододсісааадсасадсідаасаасацідадсіссНаагаааіссадаасіааюсадс оНасдіссаанндтуннасіаїсаасіаайнадісаюнадаюдштасснаддіасіадіШааддадчіннадісдідісаадааша псдсіддіааааааїадандааснссадіашісіасннанаюдсагацданддасідадададонаааддаасаасадандадда

Нааіаіїаассаанссааснданддаайдадасодісдіадіюповадаїсісадааасаайстісісісададасідаїаддаїадс

НаашдсйнсасаїаїісНноссісасаасасіссаасіасаааддаадсаіасіанасаддадацйшндададддестессасададіааіанад бо щададайнааааісіаїадаванатаюддсідадашаааїсагадацйснаадсісааааасіаааассаїдісссідстасюпачата садаайсадсаадасіаасічнссіддаддассдадіаїадсндсадсасддсіааадсіандадідддасдснсноддісдаасаасс

Поасснссддіадддсідсіаїсддащдіасагаасісадснаюдасодаїсаїсіасссданадіаадоадаацшодасасаасоаїсаїс даїаашцідссааддаддіаддадюдодснсідсададсісасааіїааддадсіад

ЗЕО ІО МО: 8 - МІАБМ5-Т, передбачена амінокислотна послідовність

МТ КНАаРОМУЗИаМОнНаИаремі АНОВІ АПОРТЗароРІ ЕМООКТІМУТУМОаєІММНЕКІ АМІ МР М

НКЕВТазосСоОмМІАНІ МЕЕМСЕМЕМОМІ ВС МЕЗЕМ І ОТАОМ5НЕ ААВОАІСІТРІ МІСУУСІЇ ОС, ЗУМІВ

ЗЕ Ка МООСЕНЕЕМЕРРОИНІ У55КМаСЕВАВУМУМРОМ ЕЗЕАМРЗМРМУОРІ М АВВАРЕМАМІКВІ МТ

ОМРЕРОаМИ За 0551 МАЗМТАВУЇ АЯТКААКОУ,АОЇ НІЕСМУаИІ ЕСЗРОЇ КААВЕМАЮСМ СТУНН

ЕЕТЕТМОрацірАІЕОМІМНІЕТМОМТТІВАЗТРМЕЇ МЗАКІКВІ СУКММІЗИаєаЗОБЇ ЕБСМІ МЕНКАРМ

КЕЕРНТЕТСНКІКАЇ НОМОСІ ВАМКАТЗАМ/аЇ ЕАВУРРЕЇ ОКЕРІМАМ5ІОРЕУКМІКНООССВІЕКУУ У

ІГАКАРООСЕЕНРМІ РКНІГМАОКЕОєЗРИаМачБуУ1раі КАНАЕОНУТОВММІ МАЗНІЕРНМТРТТКЕА жУУУАМІРГЕВЕРЕРОМЗАВІ ТУРСРБІАСЗТАКАЇЕМСВАБМЗММІ ОРБИВААІСУНМЗАМООНІ РОМБ мам тт ОМУРАММУСМУСАЗАЕЇ ТІНЗ

ЗЕО ІЮ МО: 9 - МАБМЗ-5, послідовність геномної ДНК адіаддааасіадсюннданодсандаїаасісісаддссаадсунсссдааїсаїсдаастессадааддашеснситайносі пссдацнсіасадсанснанснсюдддащісааюддіаїдсашдіи9нто9ддаатодсіансдаюдааснойсдстсісддчвіснсдашат паїсаашагааісадсуанннотадчаашйсісннааїсісісаааіаіацдасаніодацссісдадаааайнддсаншадайнснашда їаїдфІОднНаассссісдсісідсаїсдсісадсудсцаааасасдаадідадасіанадіааіасідстадчадіданандаанасанааа іІаасддонусіадіадаїсааансадаащдасацдідаааіаісісюдааасндааїссссодйсдайсдсюддіаааассіддсіааааа азадсШаїсісаааддададіаюдісасіддааанддіддіацюиондшаадоасаїдаїацдсідсіснаддуюдацдісаадаїдаїааа ссаїссіНсасасіадасісадстодіадсаснНасаїсісадіааісдаддаддаааасіадієдстндддосаанНаїассаааццісєсі іссіпо нисіадіду пд щшсісаадаайндааааассаасіасааіатадідаїіаіаанаасіаднаасісносід ід нНсідаааашссаа іїІіаайдадаадідшасіддісаанадіааадддадаасддааіїанійссістааадааснсістіссаїасадаадасцсіаїасаа дассіаадісєїіаашадцісдсодайаадсаїснсідддаасісасасідааадаадіадаасіадддадддадсаддісіадааадаї аайдснсадісашсісаіїаааааасандсісадісанаюдідсансаїаіададнодісаадсідсіаадсдадсіааіадіадаїадс ідідасісісдасааадіадундссіснададс Шаїсстодасіссдіааадаашстодддадддсіссададвюддаїадданунсісаї даїаадсідіаасассаасдааасаадссіндіадсідіддаадіссдаддададавюадвиавдадаіаювіваададнададчівдща аддачадддааддадідаададаадшаашааадаагадддсесндадаасішадіаддадсадсананананданандонана

НПананайанананананатанананананатананонаціаанаснадсіаададанцшссаасідйшнссааанаддааащіяй

Зо дааадсаіаднаацдіаійаіаааадсдіцйістсіаагассНнадснададсадаїааісасаааацшаїсадаїааіаадсадасааїй

ШшШесіаднсааасісаїдссасссісаїааааааціссасдідсндасіддсаюйнададоадасаісноддсаїаанааасаааїадааїй дісссшпсіаасадснаадсішадададосоддісаасаайсаасаашосашо пдаїаадаадаїанаааадаасснаааадаїт іїісадіадуаасааасісааддддіадасіаасіадаадісаашааайнсідсноістідішаснстдсасіаїадааайдсатесс адсанссдааадсідсноспідсаїаіадаснсасашссадсошсідаїаадсунсноснНайссідіссісіаснодідайсіссісіс аснаднсасіаїснсндсасдсашісааайуннаїісаансісндсністісаїсідассссасаааатассісссаааадсстсїдсн іссдадісідааанаісідснанасідсстсаавіансіаїдсойдасіднинссспдіадіааїдсадонсосідіссааїсістайну што даассастанстонуснсі Шедісаїссісадіїссссаїснсісаддашссісашааааадсдідідссссійнснадсі асссісіааааааїсадунаосідісаїсісдоаїсідісаїдаїсссадндадссасадщнтаднстассісіддасаасішаснссюда даассасдашсішссідаадааайсНнадааацйодонНаціаааддааанйсссадсааїсассашаодссісіассюдсндсінсаас

НассдасасдщціїсаїссссіЦаасададсідассанаіснсідснонаддосаїаснсНасссаїддіюнНаасссідаїсцедіаїса саншсаасіснНаансісасаїдіааадідссіаїстдссістадндаїсндадндадасінНааїссааансістдоастастааацчі адаїаадсддіадсШасіасадіассаїансіасайдсіасадасоаюдааанаюєсстдатйадстодаідасюдсаадідіадай асдссасададдассіданддадідданусаїадссаїдащдасіднаїсносісаїсаасдуанддсааіадіадасссааснсіддад аїсадссасшасаасдаддасаадассайу й дісдсодіаїддаааташанагатннснадаїанассдаїасаддастоддасаа їашдгдсанноаснсіаїадіасааасійсісдіаддаїааацйссістастдаадаодаснаасаддааааісоддааіааасаатої дашйсдаааншадіснНасаашоддаасаацдсоддіааадіаасіаддсдандасіаддюдааасодадааштссісіасіоНаїсаа їашасісадсісайдааадацсісідддісдісіадсадіасадсїіашаддсааснаассаааїсссснсоссаїіюнсасшесндасії ашааншнодасайшодсаадссдааааіааайціннссааюдасстшааааюндадддааддасіаддсддіасщаандасна ісадсаасаащдіацнадаїіасададсасаааснатддаюссіаанодіанндадаасдацддадіаааддаааадаайнадса аааїандаааіадіадаїсідаааааїдаадасідаашададдаддассінснстссндсідаадіданаіаададаанаююдаа даасадіаадсштадоддіадіднасассаїаасадісаї(снісссісаасіанаддіадсічадаадсшсадааацдідддсі(нні дсюсаїанайцдістсаїсаїсісаааашандіціНаасасідснодаадассіададісйіссдааааіадіадандадаааасат адіаадсаааціснсосідсіддсаанааісоНагададдоаадссасасаасіаасаддіснадасаїаааааїанайшнодасаї ададсадасадаааїснддаісіадносіасіссснеосіааіаадаїдсссісіаїссісандсіаіаісссаааасадайсасасіадаа ааїаааїсісіссндсадссасашаацааіаадіадіцдіаасассаааасашаодсіїсідсааацдчісідаадіддасданаадіа аїааандідющаднодасідаададааадіааіааайдддідадсісісасашнсаддаїаащцісаайсаєсідандаастнндаадад асаісісстнсіааааднноНсаснссідааааїудндешсссааашайнсіссідїїавссндідснннинассаддаїдасіста ссісссіпдсааагадідаснсанассіаасаааадассаааіадссндіаїдсндаааісдаадсадаашасддсісаашсісі аддадацідіадсадіаасаїаааасудіддоднааадсаасноіаадсасідссасідіссаашдасаїдасісіанасіашададідіса бо ааїадюцістідасіассааннсаашеннагасснтнстодасідідаснагадіагаітаюдіаднсадаагааанадвннаа адаандаїдісідааадіасадссаанададодцсасссісдіастаааіснНагаадундіснаданаааддааїаатадсаюайнас андшодданоагайсадаадаїсааадідссддасаааадсндсадаадацаїіаансідісаїтонашадаїааасіассстдісаа азассіаааасіаансаїастісаддаїссіснданддасіасісідаісісіїссайаандаїассіайситасійадоааасдо9да адаійайаіаассаіддадаснасдддаааадсідаадісєссассадшсдаасіддсадідасющдааднанодсасаїснодіаадіасії іїісадааіаїашадаїаасіаіїасадаснсісадшсідідсдсадааїдашсаааагассадасісаааннісаїсаааадсдааааа даюданагадіаддадаададацнюісаїаашснісна(цдіасндаасіссдсаасіассіаісдсадіадаадасіаюддадаа даснсонсасаціддаюдааднсісстоддснсідасасссдідаїаааадшсанодсідсісддда(дсаанодсанасассссі

Нагвюдддаюдаододаснодашдаашдіаанднссашсагаанноддіаганаціссінааіаааіадсссодідадсіаїаїдааднйсстонад шеспоншайодасідаціаюстонатодссіасіанаддддіцісаадойнсдоансддассоаднашагаааашоіассаїассааї

ІшадднансіанашдіаіаассаааанадасітндааассодісссааїсаїдісдадіНсіспсддіасаодіасдайсдоанааннсоддаї пШаааісаціаааайсассадіадаадіадаандсааіаасаїасацйсіШаіаддаснадсаааасісісіадатаннасідштшааа даддадаанаааааааааадаааадааададаодсіадааіаіадаїссаїсаасіанаіасаасадсудіаааадаааїсааасааад асааадааааіанааісасасдадндааадаїаіассааддіаддасісаадааіааадісіаїадааданаааіансааааадаїаа аїсіааацайащцдаааддааасацайсаансапаіадншосіасісаіааісддсіадааїастащісносіааіааадаїасндааа!їааї

Падшаадіадаадіадсаїааіада, Наюдаанадатцовдаднаанаснонддсндіааіаашісаіаанссаадодсісааадааа ашайндсананайшаааснасіаааіаааіатанісіасацдіаааашансодіадднесюаннсдуананйтшагааааіаааааа ссіасссіаанаіїсддідсдандіадашааааааассіасоддніснааааадааадсіаааааісоаднсддідсдаїасдонсдас дашадісдашсдааагссайдасассссіассіасіаіааі(дсіддісісасінонасааасааацдаютщіагаагадідсаїадіас адішснассдсідіадаїсаасаащдіассаадаасаісіціснадсіадіїсаассіааістсаднасіаїсанссаддааіаасасаї азададнаддссдасанНассіааддссаасіаїасаасандідаддідсдасіааддаасісідаасасідаїсдддадааааадсаа снассдаюшщшонідаацдіасіаїдаддаддсадсаассіпдсіддацагїсаснодасадіааацдісааддідаддаасаннааїдас сддаддадааасададаададаадаааїаанданаааааадсадааіадааааїтодідаадісдіаднаацшсааюдаачадд аїсаасаддідсааїайдаснддсассіадсадіадааашсідондоадандадсаддіаддсасюндсішасаасщісанада дісддааасаїандіансідаддаадсоа дсіаддаїаааааадодссіаїсіастасндаїатддосайнсадаасіаднадісіаддад даадааааддашааааюддідадіандіаддстістоссдіссаддаїссідддсіадйсссюдаандддагасіддіддаддашес сюааайдаїсаддсссюдаїацднададддаїаадаасандааддаїсдааддааддідссддсдсіаадіндсіадаааюдаасацді іссайаддсіндісааададодааадааайнодссссаасіїсіаддсаісіссаїссаїсдісаддідаасіааадіаадднасасідаці адааннсанацйсаїганаадіааддідаадссдісаасааіїсандсдідадааддаассаддаасаааасіадаадацісіасіаа адідсіааіадаїааісідсаааашадсасддіааддсіадіаїадаїсідднсаааааанддієсаааадсонНааїааацісдда

Зо ссісдннддісссссдааадоносіаааіїааадасідасааадааасадддааддадаадсссааасаціоаасааасіасассіа дссіааасааадідандосдаддаддааааадсдадсаддсодадададссісааасасааааааддссіадісноїаадацдісі адссааасаїдіаадсіссдаспсаадададаїсаасадаааасійсдісааіссддаіаааісаадаааанадайїааддааадда дасіддасайсіасідссдасдсаассссіддтніодадісадідадасаадіддаасіааадаадааіаіддаїсаааададшайсса дідасассідаіадасісасіасаїсадійнсаднсаадаасацшсаансносідаіааадагадідссдаїааадаіаддсааасідна ссіассааїісаааддада на псааноаднадададіаїсаааддаддадссацдіаіаіаіададсааднндаїааддчадноссісі ашдадассассаддіасісаадідсісссдіадііссіаддсашіаюдаїодаїацдагададааацдіснандасаадааагасіадд дсіасадддаїааіїаддданНаддаааддаідаддаснсндоносідісаддаасіддааасааадддадааадддаоанддаасааадд шшдашсандатшагааддаааіаадодаїадодадавадісдаддаїаддааададданассадндсассайноаааціаанад адасасіаіїссіспоНадоддаасасдасіаїсасаадсасудіааддададщцдааадсіссдасаюдасадащтансдадіашндас асдаадсснсащісіадатндаюнддонаадідсаасісснтаддааддсаааіааасндадасадацйоагаднцісаддаадндса саадаїдагашстаїссааасдсіасдааюдайосасаїаіадіаасіададанацшсісандадсіШагацдіаадааїсаааіаааа

Щщайдаюдааафдсаїдааадсісазададаааїаасіадноїдадааіїдсасаддадааааааіанатанданааадціюдіасаа сссіашадаїасадіаацасаїааіаагаддіаіїсіаснсссдадідддасасіадасаїдасіаасіаснаасааїсссссісаадссд дідсаїаіаааїсаіаціасдадснонасадащціаасіааїасдадаассадіаададаснадіодааааїагсідсіадсіааїсайсд асшШасааасццдіаасааіасісндададіашнсісіаасааадідасадісдаїсісаацідщшадіссцсаіадаасассддацу асдсааіадаададсадсідайаїсасасассаднссаїсндсідацсіссдааснсаасіссідадсаасідсндаїссааасіад ааїсасасуНдссасаассаїддсссодаїансодснсддсдсіадаїсдадсаасіасансіа шен осісносаададасіазанасс іссіасіадаасасааіаіїссадасдіадаасдісааісадсаддіааіссідсссааїсадсаїсідідїасссаасааїсідсісаіддссі сдаїссісаааісдіаассстодссіддадсідасцШаїйаіассдаадаадсодаасаасідсаїсссадіщдасіаїсасадддадааасс аїааасіаасндсаасасісассддаааадааатанадчдісіадісасічюддіаашаатодссаассаассіссісіаїсісдіадааї сісіаадаідсісссссідіссадсадаадснадсансоддаїссаїадаадідісаасіддісіасаасссаїсанссадісіссісаадаа ідісїааддсаїашссдедідаааіаасааіассдадсіадасдадсодассісааіассіадааааїаснсааїсідсссадаїсснад ісюдаадідсідааададаїдсідснсаданНадіаагассаїсідаїсандссааїааїааіааіаісаїсаасаіассасісаасщодс ашсіаїсісаашоддсіддааіаіссіддасааідсссааїаасасідсдісіснсісадіадсіддаасааюдаддддсааатанааас адаадаааі(діддааавчіадіссідснагаюсідадаоддісадюддааддаааадаадсададнндаадаїадоссіадсіснадс сіслассадаааанаадснаапк ШНІШОНашсактододідсааадададсіаїадддчаддаюітасанстасіадашосіадаада аашдіааіїсданадааіаддсааддсадносадаїсіттоддаістандідаснасасіасіссюааааннаасішагагаващтоай ассайсіааааааааасаїааассассадаїаааіаіасаданаддадсадаадісдаїааадсасададдаїссдснсасіасуа дісаїдссдаасіссідааіїаанадсюдааснНассааассаадсісдадддаасідінсааассаїаіадідассідсдсааїсддсаїа бо саадассасіадаснсссНаадсаасаааассаддідандсіссаїаіїааашснссісаадаїсассоаддаддааадсанснатюі сіаасідаїааададдісайдасдіасаасаассадаасаадаададасаассдаїдсіасшадссасдддаадададідісасіаїа аїсаадсссаааааїстадущіаїссіндсаасаадасдадсснаадасодаїсаасіддссаїссдддсдастдасідсаїааасс саасдаїаассаасааіїадаснасндааддаададдаасаадснссаадідссасісасаїдіааадсадаса! сіссісааїсаїадн ідісдссаїссіддаюдадагацдідссісассіціадастдддагадааасаанодасааадаїдаїаіаааадсаїіаадададаїдаса дасдаюдаїааснНаааісдасаіаададданааданаададіддаїсаїасассціссдаадіодсааісддіаїасіаддаададаса адіссдсадіаддадсададісаад діаддацідааїсаоноддссідадсідддідсоадасдасдада!ащдісаададчіддонс сддащдодсддаоадаасіаддаддадссасасіадасіссссаасддндодааддаїаадаснацдідасддааддаідааддааддадсіа їадіаадсісЩщааадцдісдаіагаддіаадассісадаїаіаісааддіодісадаададдіааадаааддШадасісааааааююда сдісададасаїааадіаанасдааааісаадідадіаасаасдаіаіссстдаасасдадааіаассааддаадасатасндада діасдаддадсіааснаїстссіаддддсіааайадаасдааасаададсіссссаааасасдаддаддаасададіаїаадда асідддааасааіасідсаіїасддааісідансіддадддададааддсансданаассаааіаасаадсіддадаасідіаїсодссі аааааасдсаасддаасаїдадансааададаадідідсдадсадцсаащдащіоссіайсцсісісідсаассссашіосщавчд даїаіааддасаададцісідадаааайссідадаадісаіаааддсіаааайдададдаїаасіансіааддсанаїсасідсдаа аадідсдааїадааасассааайданнаацшсаїсасааааансіддааіаіадаааасаасісадаасдаіїстсанаадааааїс саадіасаісідааїдаїсаїсааідааасіаїсааасіаасдаааїсссааддндаднодасісіасіаюдасссіааіаісадааюдаасі ааадаааааасадасіаюдсайдасісісааіасіасдаддаааддаддсісаддіадшнсссдадсідасаїдасісасасісіаайціа даїааасіаддсасіаїсісідаадснуддаїдіссіааасаісідюаанаддіссддаддаїсюдіаасіадасадссндддаддаайнда дідаднНааддіадіаааддсснсіаайнсаацдіссіднНссаасадісідіссдіасдсддіссідсаїааіаааадааісанааіааааата іассасааїіддаддоасасаадісааасдасіаасадаїдсааданааааддасаассадддасаїааадаасоддааїсіададщдас ададддіаддддайсодсндіссаасіссіносісадндадасссуїдосіааадіаасадіддааададасідідааіасдсаатац дасаааадщдащшайнассададаїадаїсадаадсдуноаадіссасаасссанціссаададіасіадасідддааасасаадсааа адаанассадсаасаааадсаїсадісдадсаасададдсіасноюдчдадчащісідснНасносісдаіасідааддааснанатасі ссссНнесдаїааадаааатасссуднассіаїацдісісддісідадсаасаїаадсантодддіддасдассацдіааадааїадсасас дісасдадідідіссаадшащцасааіаададсасіпддаісіадаісіссаааасдассіссіссісдісіайсіссаїадтндадагдссс данднсаснасідддаїасдадаасадаюдавдісаддісісіідададсісасіддаюаснддідсідсадсааддсдаадіааісда дадааіаансаїсаасціддддасадісддасіадссааааісіддісасоїасідааїсааддісанадддадіссаїсаадшщіаада асіадааасаіснсідісонасісноа паси цааасіадсадааасіддсаісаасдісісааансіссаюдайоссідіасідіссссіа діаадіадасаіаіссаайссідНсНсаадснодісансдсдатанасаїісаїадааасдадааіцісанадціаааанасдадсснії сссааасіаааіаасаідісіддааддасоддаасаадддсаїсааснддааісааіадаісдссасаддайасіасаіаасідадсас

Зо дассіснсаааадютадсстсаїсассісдсіадссіін юНаааюдаійсндаасіссідассщасаасасаасісдасадасда адсссаадсіаадіадштоддааснсісанааадданедадаоіааїсагіааіадсадааснссадаасісду ННадасссаааасаїсс асісссааадасайанддандаааададаїсіадсааацадсассаааіаааасааадааісаасідіддносссааааасідссод аааасіасіюіаондссддаааайнсааадідсісддааіїсааааааіааааатададдсаддсісддааддіададсдаїсадасіа ассіаааддадннсідаааааанйдасддаасдадсіссаїддсасіддосоаїддадіадаїсісдссодадаадасідісіссдаїсад сдсдіддсдадсададасдодснаюдасоададаюнсоасідадашадісассяодааондодаадасснпоідадаюндавантшодсас аасассдаддаанданндасдаааааіадсссіааааддісассддаайдаадсасадсдасадсіданнннесссддаїішес ісасідссдсісідаіассадідадаадсасдададааааааіанатанданааадуцуйнаїасаасссіашааіасадіаанасаїа агааіаддіаіїстаснсссдаюдідддасасіааасаїдасіаасіаснаасасіадіаассісаїдднсісаїссіаснсандассасіщда ссасаїсснддаїдссідсасідіадндіадсідіаадаадаіаааннтшснинсіддагасіснатаноїдасаанцйсісатодсюдйнааї даададоанНаїдідасісіссдаюддідадааюнаадаасаїсаадсісасадісашсаннсюайноаїсносіснсасістасодацді

Наадіднадіссносааднсідіссаїсіаїсшсіддідідснаасссаїдіаїанддассасасноансадсюдайнодсаасааадсс

ЩщасідаїссідаасіссісстадсснНаддіадааайдідідшадвіднасацінсдснсаааддааааадддадаааснааддіа дааіссідсіссідасстдаасснодсасайдаадіддасадасадтноастщосійдацдаднаннадіадісддісіааасаасідсі чаютансюсщтанодіаадіцісіаїаанцаюсцшессасаашндсшсадсістсідсадіададааааіаасадаадснсіацоаїсаї діааїандасідсдсаадісадінааасаастоддсіадсаіадсаадсаащдассідаааіїаааїананшаюдсаддадісюіавда

Ішснсадададааадсснааддаїдасідідаасдашопнадшсснсссддісасашансаадсаааааддіагдсссаїасда адсісайсдаасноїдснсацаюдідагадноаїсадншссіагїасдаїсадсдіасішосіашацйісадашастшаддасссідіс даааасадісйдааассснандадаідіаанонаїсісндаїсаассаааддадіаанасаціаананасааацосааїааааїаа сішаддаіаассадюдадснаатдааїсннаддаїіашодададсіададдашюіасннодаїаацдісддднаааааааїссстдасі щіасщдаюіасддсідадсаданнаіанасшсіадісссісідсаааїааааааандідадасюдсааіаіаасассаштшаадсат асаадцшааасіндацдіадсадідаадаасацісдасснааасададднсіашодіссіадаїаааддаасаїсадсдіаадаааса

Пасаддададаадсістайдаданнопгаасіададддадсссдіаааіадаасассаайнсагсіюнаіадаснсннсантоддаас дішШаааадшндасаасаніноаїсіссдіасасіааастнодаїіанааасіаасіашссасіастааатшснсснааасаасісаї оНадсаїснНааасідідідіюнсаагасссісаїаааааанааасдадіашішататоснаюдссснддачандадчаддадааднс асандадддаааддіазайсітодаддасааааадідаассісцістдддсаддадддасіашаааїсдісаїсанассааацді саїсстсааацдшасцісаадаасіансаюдсіашсісаадіаїанададдідсаддададдасісадаададдіасаасссассаїдої асісадааассанссісіасіссаіаюдаїсассндіснасддааадснндадаадаїсайсіаїйтодаїдісасноашсідадноїасаї ааїашаддідссасщонНаїанідааснсаїсаааадсстдддашндаддасасаїаіссссідасідасідддсасдаашессідаї діайдідснанндайнаїссіспетоїіааасісноссіаїаааіааассістаїсаааадаааатдаїааааднааіаасастоюаї бо азаішіндаададдацдіснддсаїаасіддіааадносідссадідассаддаддісасддансаадссудіддааасадссісндсада аашдіадддіааддсідсаїасааіїсдасссідддіссдасссіссссддассссдсдсаіаасддаадснНадідсассддаосідіссії

Ін дсагадастшасацдаїантатшсааєсцагсаанстшассісасаюдсааайнаасіассоїацдідаааіардсааганшсс сдсаацнсаїстсаюіассісісісіасіаїссндіанасіасташдуаюдсанадаюнааайсссаасстастаїдсадосідіа дісаадсдаснащдасодаюдіассатодадіддснсісісададдасіадансисаснойдсідсадіддссаассуоанатнддсюаїа сюаадсідсдсдасаадддодагсасадідсагассішосодіаддснааададдідадсісссттодіаааснодсісіданададааї тїдсіадсідіаісаїсссаансасаддааднсіадассайапдсіднсінссаіаіаіаддчаннсідааааіадіаааааддаааюад аашсісананааадаіассаааїдсстндддааадаснНасадідааісідааашсстдасандданаансідаадаатад іссаїссіддсШесНсісідандаіаданиншсіснносаанаагцссіндіацсаїасіснанадсіанайанагцсантнаюдаїа сіааіаіасдасіссінастниндадссдадататашйсіосіаїсасдіссіссдааааацдідсіасіаїсідіайсадсддаадні дааашосаадідіаіїдасщасаааащдайнсдаасідаїсасадіісапдсіааїааастаїааааадсадатапнодатагааці дасаснаааіааашааассіасаїсстісдаааїсісіааіадснсасіааїашесноадсіааайснссаасассіснаісдадссааа шодасадасснадідясаайдааадідщадиойстаїдсавіадачаюнандіссаааадасадаааіааадначаданонадаааа адссаспддідідандадсаднсддадаюдадвідашаїссаюсншагастадвцдтансінагандннсісітндсітнодісанодіа апаадданасєтанддастаддойнсіссіаїстааадсідссадададдіддсадасіасснддаасісдісассададнсастн асіддсаддіаастснсаїааадасассіаїдсідашісснагаддадіаіаасідснаадісааайодсіаїсіаснетсіандсіас аїсаддааддаайдаїдсасіадаїдаадісашасадндааасаїададтюассасіаїсададссадіасассааюдтсісаїдіс ісддаадаіааадісснддадідаааацднсіаєсіддіюдаадчсідаїдаааннддсдаащтаашссасааддсасссааса апшасасааааадасасааднаюсадааааааіадіссісааідісадддадассаддунсааасідадданааааааааасіа даюдаасісіїсіааїссашаадсснддіадаїададнаасіадіаіаїдадсіаднададсіадсадаїассюдіаданадюдсада сасасдадсідасісаааассассацанааааааіїаадааадннсаадіціїссассоаюаайсаїдаюдідссдастссідювщаїс ісюдаіададаадачідннодаїснданаансідтшадссссндадосідсаадсіашсіадасісаваасндсідсодаюсітаюцна даїсіададааіаісідссаааіаааасааддаадаіасасісаадіаїШаїсіссаіацйасаадісадювйачндаададаісідаїатаї дадасадааааддснсаїасссаїаассісайааааюнасідаїідсюаїсісаїсдіасаїсіадіаіааіссіаанасааацааю саїсістдсудддасіаїадіаїдсідаадаастісндааасайносадаїсадассюаїсісддаадааіадаааадчіддайнсіасдса адсиндасдаїдаїсадааїссцаісідссаааданоа ша ннсідіаїсаддіссааааїсааааїстоатайсацшосаїааасадад садіадасісссааїасандідіасаснНагдсасаааюіагцдадайдідіанагацідісасаіагааддааціссасадавотанодаї сіададааадсдіасдасаддонссіадддаддіссіаїддадаюдссіададданаааддадісссаддндасідсанадддіданааа дасащдіаюдаїдададсіаадасісдаайаддасадіаддаддсаасіссдассатшіссдоанонасдддадонодсаїсааддаісідсай саассспіссіашдссндадаїдцоадсіаїіаассдсаїсагайсаадддддаддідссаюддвідсаюнатшодсідаюдасаїадіссіаа

Зо Пдасдадасасдасдсоддсдісаасдададдсіададдшодадасаїдсссндадісіаааддашсаддсідадсаддасдаадас ддааіаїсісдаддсааппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппп пппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппаїсодіаїагддіаддаюдаїдаадчіддадоанадсаас99д адіснудідасаадааадідісассуНасіаапісісдадідясаастодддоссдадссдаддаадсададюдааддадодсісда сісасаадісаіїсссіаададдддаіадшсаадіасснподдісаднансаддддассддддадаісдасдаддайдісасасаїсаїата дадададоааідчвадаадддпппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппппп пппппппппппаіїаддддіаддадздадаадоддадонадсаасдддаадчіснаюд дасаадааадідісассунасіааааддіаа дішШасададсадідонадассідсіаюндсадддассдадіданддесдоНааааансасасаїсіадаададааадіадсадад ададдадсдадаюддаїдідсдадсаїасааддададдасаадацнаддаадааоднайсдададааддіпідадссдададісісс тддааасадссісісідссссісддддіаддддіааддісідсдіасагасіасссіссссадассссанддіддданагасідддчадноії опононопопо о їасагаіааддаїанаіаюіасасасіссісссасспісаснНаїаіансасдіаааасасаїдсаю діаааассіа їаїаюіщдіюдідаїагаагаааааадацдноаааадасанагдаїсаадіаонодаїснсаїісідстссншадсаїасіюдіагадад садааддаасадінсадідаюддаднддсіасаднподанаадоанодааддаїсасдсаадсадасідаюадсинтадндйсіснс ссіссіспссанйсШаїсссісстадошондаасасаїсісоїаташодіссадансідансіаднадсоаадсааднсущжасс сдсаіїадасасасссасдасаааддааддаїасіасіаїадаасіанндадсдатаніссссааддащдадіснНадаїтадіснсннсснай ансаюнсааншодатаннцісссааасаа(цінсннсссісідНаасааддісдсісіаїснсаїашондаїааадодіаасасаїй даїаасіанашодадсадаадсюсдадддааасаднссаддіддіссаадщіддсаїдсадсасідсаааадсадіадаашада сдсадснддіссаадааїсіадаїссаїсюдасдадсідсасісддідНсаїдсадсдснНададдаїдсаїсададднаааассаса дісдсаасадагассссісадааасндаадіндаїааадсідясадіадсю Нда

ЗЕО ІО МО: 10 - ШМАБМ3-5, передбачена амінокислотна послідовність

МСапАМЕРасІОМЗОАКАЗНА ЕІ ЗАВІ ВНС РОМ Заї НІОНООСХМІ АНОВІГАІМОРТЗароРІ УМ

ЕОКТІММАУММСа Є! ММНАОІ НЕК КЗНОРАТавЗОСЕМІАН МЕОМИЄЕОЄМНМІ СИ МЕЗЕМ ГОТАОКВЕ

ІААВОВАЇІСІТРІ УМОСУИТ! ОС УМ ЕЗЗЕМКАЇ 5ООСЕВЕМЗЕЇ РОНІУЗОЗКМИаСІ ВАМ ММРРУ/УЗЕТІ

РЗТРУОСНІ М АКАРГЕКАМУКАВІ МТОУМРЕСМ І СИ 0551 МААМАМА МІ АОТЕААНОМ,авОЇ НТЕСУ

СІ Ка5РОЇ КААВЕМАВМІ СТ АННЕЕРНЕТМОЕСІВАГ СЕМІМНУЕТМОМТТІВАЗТРМЕЇ МЗАКІКБІ СМ

КММІ БЕСЗОБІРаСМІ МЕНКАРМКЕЕЕНОЕТСВАКІКАЇ НІ МОСІ ВАМКОТЗАМСМЕАВУРЕЇ ОКЕБЕ

МУММАМММОРЕБЗКМІВРОГСИАІЕКУМ М АМАРОВБСВОМРМІ РКНІСМВОКЕОєЗОСМОУБУЛ ОСІ КОНА

ЗВІ У50О5МІ АМАЗЕУУРНМЯМТРТІТКЕВУУУВТІРЕВМЕРКМААВЕТУРИСРОМАСЗТАКАМЕМ ОДАМУ

ЗКМІ ОРБаВААЇ амНААДАМЕВАЗЕУКТТМАТОТРОКІ ЕМОКААМАМ

ЗЕО ІЮ МО: 11 - МА5БМЗ-Т, послідовність геномної ДНК адіддааїасіадсадіннсддносайноаїаайсісаддссаадсунсссдааїсаїсдаасшсіадааддіадааннйааа ааааа аайдсайссааннсіасадсайснайстадддідасааюдіаюсающі сшто9датодсіанйсоїддаснойсдсщшсісддчвіснсодатантаї їаашаїааісадіданнагайдапсниоаасісісаааіааюдасаї пдашссасдадаааашадсатнагонснагдагадсддаасссцс дссносаісосісадсдсшаааадасодаааідаюдодсіанадіааіасідсіада дідаНайдаанасанаааіаасаданодсіадіадаїсааайсадааюдасадід аааіафєсісіддааасідааїссссдісаайсдсіддіаааассіддсаааааааїа дсщШаїсісаааддададіаюдісасіядааанддіадіаї юноожшаадсій аадоасащдаїйацдсюдсіснаддадаюдісаддаїдаїааіассаїсстсасасіа дасісадспдаадсасшсаїсісаднааісддіддаддааааєсіаддносн дадсаїааіаіассаааціснесітноа шсіаді на цнсісаадаайнодааа аассаассіасааіаадідаїаіаанаасіаднадсісносідйннНесюдааааї

ПссааіїаандадаадсудШасаддісаанадіааадддадаасддаасацнії ссісіааадааснсістнссаїасадааюасцнсіаіасааддссіаацдісідс

Шаадщісідсданаадсаїснсідддааасісасасіїдааадаадіадаасіад дадддддсаддісіадсаадаїаанудсіїсадісацісїісаіааааааа9асандщшіє ансанащідсансаїаїадаондонаадсідсіаадсідадсіааіадіаюаї адсіадаасісдасааадіадоносіснададсетанстоддсіссдіааад аайстоддаададсісададддааддасіцйсідадаїаадсідіаасасс аасдааасаадссідіадсідіддаадіссвааддача дата даддааатдаці дачаднадчадідаддаддадададдадаадідаададаадшагаїнааадааїа ддосспдадаастцадіадідадсп9д99999999999999сададдодадоадтщчаа дадаацдіаіаіаїШааадааіадддссідадааснаіадіадіаадсаїдсацаї їабпапопонанананананананшананацдіаадашдіаанас

Падсіаададданнссаасіайссааанадааацдідндааадсаїаана адіаїаі(аааадсоаднстсіааіаіїстадснаададдадаїааїсасааааї

Наїснодаїааіаіадсадасаанйссіаднсаааїісісасдісасссіїсаїаа

Зо аааашссасдідснадсносаднаддддасдісндасаїаанааасаааїаї аайдісссісісіїіаасадснаадастадададдсодісаасаансаасаацща сашндашодаїаадааднаанаааадаасаснааааддащісадіадюдсасаа асісааддідіадасіаасіадаадісаайсааатісідснунсісісідіна снсійносасіаїадааайдсашссадсанйсссдааадсідспссшосаїа іадасаїсасашссадсдідісідаіаадсунсіпдснНанссідісссістїасії дайндашіссісісаспаднсасідіснспдсасдсанНаїсааанаюцісі саансісндсесістісаїсідассссасааааіассісссааааадсстадії ісідсінссдадісдааанаїсюснанНасідсстсаадіансідатасоді ассандцшссссадіадіааюсано і сісідіссаасістачнннйі тдідаассасіайстоноснсідшедісаїссісадііссссаїснсїсааї пдашссісашааааадсдідідссссінсндідсіасссісісаааааїса оНосідісаїсіса й даїсіцісадаасссадндаїдссасаюшаднесні ассісіддасаасіцасіссідадаассасаашсстсснНаадааайснад ааайдунаїіааасідіааадддаааанцісссадсааїсассашоддссістасд тдосндешсааснассдасасодіднсаїссссіШаасааадсідассана існесідснопододсадснснасссаддцйаасссідаїсцсдіаюсас ашнсаасіснаансісаїісНаіааадідсаіаіссідссістадноаїсі тдданоддосіднааїссааанссаддастдстдаавіащдаїаадсанадс

Шасіасадіадсаїіансіасунпдсіасадасаїдааайшссідацасшца адідацдісіддсаадіаїаданасдссасададдассідасіддадіяаданодсаїа дссаїдаюдасюйаїсносісаїсаасдаддсаагадіадасссаасіїсіддад аїсадссасшасааюдаддасаадассапонадісдсоадіададаааташацнаї аїсашснадаїадунаадіаніассадіасаддастодасааташотіоса

Ішнодаснсіаїадсасааастісісдіаддаїааашссістастдадодаа існаасаддааааісддааіааасаацоїдацйсдаааннаднснасаїаї

ПдааасаюдідсддідаадіаасіаддсасНдасіаддідааіасддадааціссіс їасюйаїсдаїаннсісаднсатшодаааодагсісідадісдісіадсадіасаа сіашаддсааснааїсаааісссснсссаїдадшсасшсідаснаїша іїіашдасанносаадссдааааіааайнцішіссаїШаїдасстааааї бо оандаддідааддасіаддсддіастааїсдаснаїсддсаасаащдіанадаїас ададсасаааснушоаддідссіааайдатаннодаааадісдадчавацдіааад даааіадданНадсаааааіайдаааіадіадаїсіааасааюдаїдасідааша даддаддассінсиспісснтундаацідонаїаададаанайодаадаааа тіаадсшададдіадідносассаїаасадіса(дстесссісаайанадісїа дсюдаїдаацдсішодааааддіддсідатнтодсідсоіаащістсаїс аїсісаааашоноадійаасадіддсндддааддссіададісісідаааааацді аддсдадаааасацдадіаадсааашснссідсіддсаанааїстаїанатда дадаадссасаїааїсіаасаюдайнадасаїаіааатананнодасаададс адасадаааісноддчаісіадіусіаісісссНесіааіаадаїдсссісанусіаї аїсссаааасадайнсасссіадаасдааїааагісісіссндсадссасаїайаана агаадіадідіаасасіаааасашаідснсідсааадієдіїдаадіддодсдана адіааїааанадюідаднодасідаададааадіааїаааноююдадсіїсісаса

І саїдаїаацісаансаєт4данйдааснндааддасаїсісстсіааа адктшонсаснссідааааїоноснісссааашіансіссічтаннссі тідсШацдндассаддаїюдасісіддссноссннсааадсддаснсана ссепаасаааадаїсаааіадсстідіадсндаааісдаадсадаашадодсі саашсісіаддададюдіадсадіаасаїаасасдадднааадсаасішаадса сюссасідісааашнодаїадасдсіанасіашадацдідісаааіадіашсійї

Пдасіассааннісааіасницшатасстншснаасіщюаснаїацді аззішаюдіадшсадааааатадннааадаайдащцісдааацдіа садссаанададащшсассснодіаснсаааїснаїаадандатадонааачд ааіааіаі(ддсащданасандтодайноааайсадаадаїсааадодсаддсааа аадсндсоддаадаїаїаансідісаєтоношаданааснссссвісаааї адсіаааасіаайсаїасцсісаддаїссісндайодасіасісідаїсной ссаїайандайагагсаайссіндсішнадоанаасдддодадааагаассаї ададаанасдддаааадсідаадісссассаднісдаастдасадідасічвюдаавії андсасаїсноїаадіастсадаааайсаааіаааіаасаюаснсісавді псдідсдаадаащдайцнсааааіассаюдасісааацшсісаїсаааададааааа даюданаіадіаададаададаштодісаїаайшсніснаддіандаа

Зо сіссасдаїсіассіаїсдсадіаїдаадаснддадаадаснсонсасаїнодда тдааашцнсісстоідсісНнаасасссоідаїааааашсаносідсісддда тдсаайддсацасодссссШагадводададоісндаюдвднаціааннсса шсагаантдааандсссттаагаааіадссюдідаднадщтдааднсс шап9шеснтантшатоссідаїдсаєстандноссіасіаїааї дсюднсадсіцдйнонНасааасаааїдащшіагааіадудаасадіасацдітйс пассдсесдіадаїсаасаадіассаадаасагсідіснаадсіадіїсаассіааюєс псаднаїсіаїсанссадсдааіаасасацдіададнаассддасанассіаадчд ссадсіаїасаасандідаддаюасіааддаасісідаасасідщшодадааада ааадсаасаїаіїссдадщшоаннодаацдіасіаїааддаддсадсаассндсддай іаїсаспдасадсаааіцісааюдоуноааддаасацщшаїдосідададдадаааса дадаададааааааїзандайнаааааасададдадаааайшо даадчісаїа

НПаашсааддсіддаддідсааіашдаснддсаасіадсуюіадчааднсїд оподаоаідадсаддаадасасідндаесннасаасідісанададісддааасаї андіансндадддаадсоандсаадчнагїаааааацдіссіассіасіасндаїані дадсайсадаасідднадісіааадсідадааддаадаааааддаціааааїддщдацві андіаддсшснНсідіссаддассіддасіаднсссюааноддаїасідад тдаддашссідааайдаїсаддссааададаїадісаддеаагаадаасаїда аддаїсазаддааддідсідсдсіаадшніосіадаааїдаасаднссасіаїдчадсії

Паїсааададдааайоаайноддссссаасісіддосаїсіссаїссаїсдісадоі даасаааадіаадднасааддіадаашнсанашсааасаадіааддідааці сдісадсааісандссдадааддаассаддаасааааїсіадаадаїйдісідсіааад іїдсіааіадаїіааісідссааашадсасддіааддсіадіосадаісідднсаааїй

НааанддіссаааадсцЦаагааащдісддассісдійддісссссаааадсоїї дсіаїаїааадасндасааадааасаддідааддадаадсссааасаанудаасааасі асассіадссіааадааадчідднНдагадноддісддаддаддаададсдадссідсдд адададссісааасаіааааааїдассіадіснуіаадацдісіддссаааїісаадіаа дсісідаспісаадададаіїсаасадааааснсдісадісіадаіаааїсаадааааї іїаїдаїаадааааддаддсіддасансіасідссдассаасссіддіШодідісад адасаадіддаасіааадаадааіацддаісааааададшассддндасассда бо іІааасісасіасаїсадійсаднсааааасашсаайсндсдаїааадасада сааасідісассіассааіїсаааддаддана Нсааноаднададдіаїсаааддад дсддсадіаіаіаддадсааднідадаадддадноснсіанддадассассад діасісаадідсноссоіадіїссіаддсашаїаандайатдасададааа!(ціс

Нанкдасаадааіадасіаддасіасадоадаїааіадіандддаадаюдададасцйцсї падносіїсаддааснддааасааадддадаааддданодааїсааадданіда шсанндашаюададаааіаащдадіадіададоаадісдаддададааадад дшШассаанодсассанНдаагаюіаанададасасіаїссіснашподдаасас дасіаддддщдадоадаасдсіссдасадддадідашайсддагацюіддсасдаад сіндідісїадандЧаіндаснаадідсаасасспаддаадасааасааасії аддасадашоаїадндісддааайосасадідаїдатансИснесааасоі тддааадандсасаюіадіаасіададнацшсісашаадсішаїаюдіаад ааїсаааіїааааїадандаюдааардсаюдааадсаасідіснасдссідааїснії ааааддсадсшШасааадцнодіасаїсіаїсідасадасасасіаасайсас ісНнагадідіасаіацаасіаадіссаадссіаасіаісіаасіддадааїсааа одНснадсісшааадсністаастаддаадаїссюсадчінаннтнаї аассдуідаіаіїссаддсіадсндсасасаїсісдасіаанссассоаддадсносіаї сісссассаасасаданассіддіаасісаїдддаадаааїсассіайданодадіс тдсюдсашдаадішодасіасіаассісаідднсісаїсссасінсайдасса снддссасаїсснддаідссюдсасідіадсідіаасдаадазадшннссода даїасіснаїайдідаїааннтноіансдсюпнааюддаюдадонадтюас ісіссадддіюдададіднаадаасаїсаадсісаїіадісашсаннсідана асцпдсіснсасістасдадшаацдіюнадіссісссадіннтаадад сдадаадсдсаааааадсдасаадддсісдссісдсісаааадсдаадсдсааадсдаа дсдсасасшанааадідаадсдсаансінаааааасаіаацдіааассносааад асасааіаіаааанаіаааіааісааааадіїсааандісааааісааадсіасіааа

Насіадааісаассіснансіїстіасісіснойснсисааданоісааааї сндаайнссісіанаіснсаганосісдісаїсіїссіссісссссіссіснесі снсаїдаїсасцтшсаїсіїсаїсаанадддаіаддаасдаснаїадіадссасас пШшссснссіааіїсдадсндаасідаадіансссссНааассаїааддайсї

Зо ссссаасіссасіадсаассдсаасаїсассссаадідааанадааісдсснНсаааїа сненсаісіїсасаашісддоадасіссдунадссасісанадссісаїсааїаї ідіссаааадаанддаїсаанйаданпдсоадіданїадсдасоссісаадсісіаї щіаншаїдаасасіаданаддаддсосісаадонНадісданссісното іаїдааісідсааасаадаідідісаасіаанадіаддаднаддасаайоадаїаїа ашастшаїсісаааасасдаааіаансншацсісасдіднсааааасдсі ссадіссЦсасаїссддаїдадсіасааднаааснадаасісдаддсдааацді сюіааайсддацдісісіасассаїанддісссассасісаасіаїадаадідааааа аааааансаададнааїаадіаїааааааіасанаааднададсіаїіаааатагад аадсаснддісассіддсчдчанісдіснстоШаагадсаадісєддадснааа аадісссісадсідссідіаааіадсаадсідаісіасіаїстісндсадіснс асіддддісаасндаіаасаассісаїддааїссідіссасасіїсісїадссааюа анайсісадсідаїсаіаааададідасодддіісадааіаадіссадсідсаїдсаа аддісіаїдаадносісасіссаїсносаїсааідаіїсідааадасстодсаїатш сідсісаїсаддааюаїдснНдаагадссіссподсссіаїссаіадснсаїадад діадсссайдді(дондсіссссаїссассааасуддадіасщаассааадддссс ассаайаададсаїдааддасананссааааадааіаадааадааїіаадсадс аасаїсшессідсастпсстодсааащшасісносіссайссістааддаа саасшсісааанадданносаадоддаасіаюдіааадісаадааадсадідас даассідіснйдсссддашсассаааннйціссддідааіснсісаїсаїайн сааіїаасаадддссдсідадааааіаадаацдіасссіаасдсссіддссааааасіді ададчааддаіннссідаааацдіссссдааданааднодаїасааїдадссдсаса тддадіссааіадасансідіасдсіссіссассаїдссасссдешсасаїццс асісдсанНаїсадідассасідаасаасшоспноддссааїєсннсаац ції сюааасааддідаасайідашіддісадіяадащдацдісдсіадсаїсаадвдасіс аадааасаааснссснпдддадаансассаасасунНааїааїсаннсссаднсї іїдссдіссасНаїссаіїсаіаа(ддадсадссаїасцунссасдсаастаднс сіссасааїшанадісіссіссаснсснацшадаіааддассістацйсаїд аїааддддаддснсайссаддіссдіанйдассаасдассісааіааадісіссааа адідісадіаїадідасасаайдааддддадсссадсаїсаїадасссаїсддсааа бо адсісіаасідсасдаїісссісаааащісснадсаацннодіасаїстіссасс дсісшфесИссодсіспдодааагадсаасіаїаддасстацвдіссіасісді асссдісдаїссаїддсідаададайцосаїсісйссссоанноподаадщдасаа пснсааїагсаїсаїсассаїсаїсаїсааданддісассаадданодадасісаї паанншшодсіссненНсіїсісаасаааанстацісаїсссісассіссда тддасашсддасааснодідасоцшсіаїсдссассааіїаададоааашааадсд аїааанссасссуандіааїснонасааааснодсаїасааїашатанснеїс анаасісіаіїсдссаіаісдссаадссдддістаїстсдаїснодадасані даааісссіанаадаїаіаадааааіасаїааїсаааіааасідааааіасаіаїааїта їаїаіааіїаанааїШаїааассдаааіасасацаааааааісаааїааасіааааї аіаасагаіаааннсіааандаааіасаїаіаааанааісаааїааасдаааас аіаасаїаіайаіааіаанаацшааасдаааааїдсанаадааааїсаааїаа асідаааааїаіаасаїаіаіаааіааідайааншааасюдаааіаааааїсааа іІааасіааааіаіаасаіааіааіаааанаашісіаааадаааасаїаїааа анааісаааїааасдааааїіаіаасааіаіаааіааіаайцаатанагаіасідаа аіаіїасацааааааісаааіааасідаааааіаіаасаіаіаіаааїааіаанаані іїіаїадсідаааіаіасанаааааааісаааіааасіаааааїаіаасаіаїааааї ааіїаанааїЇЩагааасіааааіасаїіанаааацдіааіаааїаадаадааіааадда дадааааааасааааддонададаіааааддаадаадаадасдсідаадісідаасад їдсааасюддасідісададісісададаїааасдаадаадаадааддаадааадаадда аааадааадаааааааадсадааїстдасодддассаадаадаадааадааадаадааада ааааааададаадаадаааацассюдасіддісадсаадісааїдаадіндаасссї аддастодаїсдассісдаїсдаадаадададаадаадаааїдадссаннноісаайн їададіс(дНоїагааїаддааааасадасссааадацншааааааааааддас сюсудснаасаааадсдаїсдсісдісдсіссіссо даадсдісдснос сісддісдадісдссісаддсадсіадаадсдасасдадісдсдісдсдісдснсдса сшаадсдсдаадсдаїсдснсіааасасіддіссносааднсщіссаїсн сюдооіоснаасссащдіаанодассасастшоїансадсюдайосаасааа дссідасідаіссідаасіссісснідссподдіадаананнонтнтад тНасаїашсаашаааддааааадддадаадснааддіадаассідсісснад

Зо асстоддаїсснНасасайдаадіддасадасадасшостоснвдаюда онаншадіадісадісіаадсаасідсідаюіансідсшанодіаадцієсіа їіаайнаїстссасаашостсадсістсідсагаіаададааааїаасад аадснсіансдаїсаїдіааіандасідсасаадідсаїашааасаастодсі адсдіаїсаадсааіааіааатанасишаюдсадодаїсюаюдаоннсіса дададааадсснаадіюаїдасідідаасдашонадшесснсссдчадісаїайн іайсаадсааааадздіадсссаїасдаадсісайсідадсндсдснсатшаї даїсадсдіасійссіашанісадашжасшаддасссіддааасацдісєії

Іаассснайдащдаюіаананасісндаїсаассаааддадіаацнасацці аацанасааацшосаасааааєсішададагааісадіададснсаюдааїст їаддаїааподоааюдсіададюайцаснюдаїаацісдонаасаааайссіс щастоаїасідаюіасіддсідадсаданаанастсіааїсссісіасаа аїааааааайдідадасідсааіаіїадасассашіщааїдсашасаацдннаа асідашадсаасдіадаасацісдасснааасададднесташоіссіадаїа ааддаадаїсадсаіааї(дааасанасаддададдадсіссандааннюгваатс їададддадсссдіаааіадіасассаансаїсіснаїаїідаснснтсатад даасдіааааашдасіасанінноаїсіссдіасасіаааснтндаїйдіаї іІааасіаастафшссасіасштааіаннсноснааасаасіссіюйНадсаїсі іІааасісідідіунНсаагасссісаіаіаааанцаіасдачіанншагатодс

Накчісснддадвтдадададдаадсісаїсандаддсдаааддіааансії ааюддасааааадідаассісддістодсаддадддасіашаадісдссаїса

Нассааадісаїсстсаадицтодсінсаадаасіайсасіацдісісаацді азайаюдіцдідсаддаддасісадаадацдіасаасссассаїддіасісадааасса

Песнсіасіссагацдаісассндіснасддааадсійдадааддісансіаї шодаадчісдснуоапісюавнодіагагааташтададссастовнаїанії аааснсаїсаааадсстоддайстодаддасасаїаїссссідасідасюддад сюаацшессідащіагадіаснаноданодіссісісстоїіаагасіснус сіаїаааіааассіїссНаісаааадааааідаїаааацднаааааіастодюда!ва дчаюндасіаїадасщаааїдаїаітшагсісааїстаісаансцішасс

Псасаюсааанаіїасіасадіаюідаааіагсааадтассідсааншіса бо істсаюіассісісісіасіаїссощдіанасіасюатоаїдсанааасі ааїшансссаассшасШадсаддсщдіадісаадсудаснащдасддайщдіа ссашадіцдідснНсісісаддсддасіаданснсаспндсдсадіддссаас сдсіашоддсідаіасідаадсідсдсдасааддадаїсасадндсатассішщос діаддсідаадаюдаідадсісстидіааасндсістатоддааанодсіад сдіаїсаїсссаашасаюддаацдісіадассанапйдсішсннссаїаїа їададайісідааааіадіаааааддаааїддаацшсістанааадаїассдаа їдссинододааацдаїснасаднсідааїсдаааашесстдасацоюдаї їаансідаа(даатодцдіссаїссідстшеснсістдандіаданнссії сіснпоНасаанатагдссдіснтдіснасісісдадасаддсаающіаасі ссадідсааддшадіааїіандаснашатсіднаїсасаїссіссідаааа адідсіасіадсідіайсацсддааанідааайсаадшюціаіадсщнасааа адаїсадаасідаїсасадісайцосісіаааіаааайнсіааааадсаддчаїацої іїдідагаіаадідасаснаааїааашааассіасаїсстісдааасідіааіад сіссасіааїашснодідсіааасіайссаасассісНаісдаїдссааїнндас адасснадюдсаснаааадчідшаддйнстагдсадіаддіаднаноцісєса ааадасадаааіїаааонадачашо дааадссаснодідідандадсаансяд дадададщдашаїссатшаатасногадзчцінданнсітасітас андіаанаадуандаістатоаасанаддайсіссідаісідааадсідссад ададдіддсадасіасснддаасссдісассаїдадшсасшасадідсадодіаас

ШшШесасааадасаїссіассадідассаддаддісасддданодадсідіддааасаа сспідсадааадсадсдіаадундсдіасааіадасссідддіссдассснос ссдассссдсасаїадсдддадснадідсассдддсідсссаїссіаадсідатцісс

НагаддадіаіаассодсНаадісааанодсіаїстасносіанусіасаїса даааддаандаїдсасіададаадісашаїсацдідааасагаюдацдідассас іІаїсададссадіасассаадінНсісащдісісадаадаіааадістодаюдаа ааі(ддчнсіаісідаідаадднсдаїдааандодсаднашаашссасаа доадасссаасааададдадцсассаадааасіщіадаааддіддайсісаноцісаї пснсадісайсадчананддаадіаасюіантасіадаатаснснодаа сіашсіадсісюаддасустдаюнНааїссаданааадсасіїсаїстаї

Зо дандсндадддссаасааасіасісадснддаа ді даадсісдідіасстс подагааадаашаїсаадідсаадаасаноаїссададіддаааадчдіаасс їасадіосНнесдісісайшсіссассссссасссссссаааааааадаасадаааада андаааадададансіцнсносісааддаадааддаддіаасаааадааїадсід сааднаюдсадааааааіадісіїссащісадддадассаддоансааасідаца

Паааааааасасіаддюаасіснсіааіїсідшаадсснддідсдасагаднаас їадіазаїдадсіаднададсідасісдааассассанайсаааааайцаадаааці снсаадноінссассоїдаайнсаїдаюдідісдастсащіащтаїсісдда їададаачадннтодаїсіданаансі шддсссстодадайнсідсас дсіацісіадасісааасідсдсдассіаднадчцісіададааїасідссіааї аааасааїддааонасансаадіаїШассіссаїіацасаадісадіюнаднаа адодцвдісідайаацдоддаіадааааддснсаїасссаїаассісонаааадідс щаїдіосідаїсісаїсідіасаїсіадіаіааіссіаанасааацнаадсаїсісії пасдодщюдасіаїадіаюсідаадаассідісєдааасайодсадаїсадассідаює ісддаадааіадаааадіддоднсіасдсаадсіндасодаїдаїсадааїсснНаїс їдссааадда та ше Поїагсадціссааїааісаіааїстатшайса шШосаїааааддсадіадасісссааіасанпд діасдсНадсасаааціаюдад ашдіиїанагацдіцдісасаїагааддаїанаащцдіасасасіссісссассНноса сайаіайащііюшдііадіюагааюдааащдадтштодаааадасанаюда їсаадіаднНодаїссісаїсюстсідннадсааснаагаддсадааддаа саднсадідаїддадчнддсіасаднддандаддсідаадоаїсасдсаадсацді сюдюдадсістатісіснсссіссісйссанстаїсссіссни часно йодаасасаїсісаіаіаснодіссаддашстщдансіаїднадсдаа т1дсаадіндщшасссдсаіаасасасссасдасаааддааддаїасіанатадаас їашндадсдаїашссссаададдчвіснасагадіснсінеснонНанс адінсадшаюаїатшодісссааасааїдішеннснссисюна асаадаїсосіїсіаїснсдїашо даїаааонаагісасацйонаасіанайн тддадсадааїдсідсдадддааасаднссаддіддіссаадідіддсадсадсасід саааадсадіадаадддасдсадснддіссаадааісіадаіссаїсіддісдадсід сасісдддіїсадсадсідснададдаїсаїсададуднаааассасадісдсда бо садаїасідсісадааасндасуноагіааадсідсадіадсювнда

ЗЕО ІО МО: 12 - МА5БМЗ-Т, передбачена амінокислотна послідовність

ІААВОВАЇІСІТРІ УМОСУИа! ОС УМ ЕЗЗЕМКАЇІ 5ООСЕВЕМУЗЕЇ РОНІУЗЗКМИСІ ВАМ УМРРУ/УЗЕТІ

МУММАМММОРЕБЗКМІВАВРОГСАІЕКУМ МГ АМАРОВБСВОМРМІ РКНІ-СМАОКЕОБєЗОСМаУБУ ОСІ КОНА

ЗЕО ІО МО: 13 - послідовність ДНК праймера МАМІ, АБМ'-ї ісасаїйаіансссісаїаасасас

ЗЕО ІО МО: 14 - послідовність ДНК праймера МАМІ, АБМ1-г аадаадсаїсссасісіасадсії

ЗЕО ОО МО: 15 - послідовність ДНК праймера МАБМ5, АБМ5-Ї агаіснеоссісасаасасіссаасі

ЗЕО ОО МО: 16 - послідовність ДНК праймера МАБМ5, АБМ5-г

Стассддаааддаїсааданої

ЗЕО ІО МО: 17 - кодуюча послідовність ДНК з МІА5М1-5, що використана для сайленсингу обох копій МІАД5М1-5 і МІАБМ1-Т ісасаіїайансссісаіаасасасссанасаааддаадсаїасіасіаїаддаданісдадсдсішісссасадаансадсідда сіаассуНссіддаддадсаадіціддсдідіадсасадсіааадсщіадчадщдадаюдсіснодісааадаассідаїсснсаддса дадсідсіайддщіасаіаасісддснададааїсащіассідсіаддсіааддааацйідассаааааааїсападісадідсснсї адодіадаадунддідсідсісссдадсісасааіааададнад

ЗЕО ІО МО: 18 - кодуюча послідовність ДНК з МІА5М5-Т, що використана для сайленсингу обох копій МАА5М5-5 і МАБМ5-Т дассаданддадідадааіасаасададіщдатннаснНадсасаїсаасудащадсаанаісдаїссіаснсіддідаїсадссісіді

ПааісаадаіаадасіанопоНасадісааддаадааашасааїсададаааснсодіааїіснНаїдссіааісасааднсадаассода аадіданаїідаюнандсасаїстаюаадааіацдадаааайноіддасаютддааюддааднсіститанонодаїасдсдса

Зо аїаасадсшсцНусідсісддаїдсданпддаанасіссссістаїапдандадааснодада

ЗЕО ІО МО: 19 - послідовність ДНК стоп-мутанта АБМ1-5: АБМ1-5 МУ156" ашщіасддаасноддсіитшааЧнансіаїдайсісаддессааааддансоіднсісдадсісісісдсаддіадандаадсаїсд тддассадайддадідддсіціаїсаасаддоадасюнаснддсасаїсадсдісіадсіанднНдаїссідсносддідаїсаассісіаії іІадасдаадаїаадасчдандіднасддіаддіаааддададасіасааіїсасдадсаасіїсдіаадсаааідссіааісаїаадіссд дасіддсадідасідюдайдісайосасассіадіадіаїдаадаасаддадаадайна даоасадсідчвадодааєснсодснноїна подагасісдадаїаасадстсноносісдідадссанддаанаснссстаїанда ддадчасндагдааддаісіюіаюдааїаїс асідадснаададсндааїдаюдасідсдаасашідаадійсссассаддадсасцоасісіадсаадааїддсдастаддачад діасааїссісспдунсісідаддссайсснссасісоНаїдаїсссНаднсісаддсоідсстдаааащцдіадоасіднаїсааааазнд адасідаїдісєссстуддиайнсіссісіссдддоддасісдайсаїсспадноснсданасідсісдсіаснодсіддіасаааддсідсса адсадіддадоддадсасадсісайсснсі юнддссідаддіаддосісассодаїсісааддсідсаададаадндседасіаснода аассуісассасдаднісаснсассунсадаїаддаддаандаїдсаандаададнащшассаїандадасаїасдаїдіаасдас ааїсададсаадсасіссіаднсснащдісосдіааданаадісасіаддаддаададчдісаіаісіддоадааддаісічадаацдиоїй тдадаосіасндіастсасаададсісссаасааддаададііссасааддааасаїдісдсаадаіаданааадсдснсассааїа асідснаададсаааіаадісаасаісідсаїдадденадаадсіададісєсстссіадаїааддадіїсаїсаадідссаюдадіанда іїссададддаадндаданааассададсаааддаддайдаааадідддсісіїіааддадддсеснідаюдаїдаддадсаїсснаїсіс ссаааддіадсасаіїссюдіаіаддсааааадаасаайсадідаддсдіддосаіадноддаїададчдасісааадсасадсідааса асаюіададассааіаддадацшШааїдснсасаїаайсссісаїаасасасссанасаааддаадсаїасіасіаїадчащданин сдадсдснШсссасаддіадаайнсадсідддсіаассоанссіддаддадсаадідідасдідіадсасадсіааадсіяїадааюда адснснддісааадаассідаїссіїсаддсадддсідсіайддідіасаїаасісддснаідадааїсаціассідсіаддсіааїд9чад аашдассаааааааїсандаїсаїдкиосснсіаддіадааднддідсідсісссдадсісасааіааадацді

ЗЕО ІО МО: 20 - амінокислотна послідовність стоп-мутанта АБМ1-5: АБМ1-5 МУ156"

МеїСузауПеїЇ епАІаМа!ІІ енсіуСузбЗегАврАзврзегаїпАа!І узАгаМаіАгомМаї еистіші еизегАгдАгаЇї є и узНізАгдаіуРгоАврТгрзегацуЇ еиТугаїпНізспуАзрСузТут ейАІанізаїіпАго! ейАіаНема|іА5рРгодАіа зЗегаїуА5раїпРгоЇ еиРпеАзпаїАзрі уз ТипеМаїМаІТигМаіАзпаїустиПе ТугАзпНізансіпі ейАгад ув

СіпМеїРгоАзпнНівзі узРпеАго ГигспіузегАзрСузАзрмайПелАіаніві еиТу(« сти НізсіусінАврРпемаїАв5 рмеї енАзраїуПеРпелйІаРнемаї еш епАзрТнгАгдАзрАзвпзегРНеї еимаїіАіаАтгоАзрАїанестіуПе ТигоОе

П еиТупПестуТтрапу енАзраїузегмаізтТоР

ЗЕО ІО МО: 21 - послідовність ДНК стоп-мутанта АБМ1-Т: АБМ1-Т МуУ156" ашщіосддааєсноддситшааЧнансідадайнсісадддсааааддансдідйсісдадсісісісдсадаїаданодаадсаїса бо тддассадайддадідддсіціаїсаасаддадасюнаснддсасаїсадсдісіадсіануднНдаїссідснссодідаїсаассіс3юй іІадасдаадаїаадасданддНасддіаддаіаааддададайсіасааіїсасдадсаасісдсаадсаааідссідаїсаїааднссд дасіддаадщдасідідащдісандсасассіадіадціадаадаасаддадаадано ддасадсіддадоддасісодснноаіна сюдаїасісдадаїаасадастпсноНосісдідадссанодаанасіссстаандоанддоадасндадааддаісюаюаагас асідадснаададсіндааїдаюдасідсдаасашідаадійсссассаддасаснодіасісїадсаадааюдюдсддстаддада діасааіїссістдоансістаддсіансснессасіссНаюаїсссНаднсісаддсдсдсеснпдааааюдіаддаасюнаїсааааачнд адасідаїдісссійадіднсідсісіссядддддасісдайсаїссндоносісдацасідсссдсіасндасіддсасаааддсідсса адсадіддоддадсасадснсайссісідіанодссідаддіадддаісассддаїсісааддсідсаададааондсідасіаснода аассуісассасдаднісаснсассунсадаїаддаддаандаїдсаандаададнацассаїандадасаїасдацдіаасдас ааїсададсаадсасіссіадйнсснащдісосдіааданаадісасіаддаддаадащайнагасііддоадаадосісідаїаадчиан даюдсіасндіасшсасааддсісссаасааддаададіссасааддааасаідісдсааддіадайнааадсасісассааїаюа сюшаададсаааіаадісаасаісідсадддоснадаадсіададідссшссіадаїааддаднсаїсааціїдссадавіаноаї ссададіддаадндаїаданйааассададсаааддаддайдадаадідадсістааддаддассНдаїдададдадсаїсссіаюс ісссаааддіадсасаїссіаїасаддсадааадаасаайсадідаїддсдіаддсіаїаунддаіададдасісааадсасаїдсіда асаасашюіаддідассааїаддаюагснНааїдсіїсасаїатайнсссісаіаасасассданасаааддаадсаїасіайаіаддаюд ашсдадсдесннсссасаддіадаансадсідддсіаассунйссідаддадсдадщдідасдідіадсасадсіааадстщіададі дчададснсцноддісааадаассндаїссісаддааддасідсіанддщіасаїаасісадспададаагсаюдаассідсіаїдяосіаа тдааашодссасаааааісайддссдідсоссдісіаддіадааандаідсідсісададсісасааіааддацді

ЗЕО ІО МО: 22 - амінокислотна послідовність стоп-мутанта АБМ1-Т: АБМ1-Т МУ156"

МеїСузау Пе! епАІаМа!ІІ енсіуСузбегАвзрАзврзегаїпАа!І узАгамМаіАгоМаї ес еизегАгуАгаї е иГузНізАгдаіуРгоАврТгрзегасіу еиТугаїпНізспуАзрСузТупт ешйАІаніза|іпАга! еи

АІаіемаіАзрРгоАІазегстуАзраїпРгоЇ еиРпеАзпаїншАзрі уз ТппемаїМаІ Ти МаіАзпатустиПе ТугА5 пНізаїішсіпі ейАгаГузаспМеїРгоАзврнНізі ух РпеАго ГигспузегАзрсСузАзрМаїПеліанізі еитТугаїшстинНІі заусійАврРпемаіАзрмеїї енАзрацуПеРнеАіаРнемаї ей енАзртнгАгаАзрАзпо5етРнеї еимаїАІаАг дАзрАїанестуПетТйгзел еиТупіессту Гтра!у епАзраїузегмаії5ТОР

ЗЕО ІО МО: 23 - послідовність ДНК стоп-мутанта А5М5-5: АБМ5-5 066" адіоддааіїснаддсто нада нонсадаюдайнсісаддссааааддайсдаднсідадсісісісдсаддсаддаі даадсаїс діддассадайддадчідддаїагаісаасаддіданнаснадсасаїсаасошадсаанагсоаїссідснсіддідаїсадссісй іїІадапйаадаіаадасдакупнонНасадіаддаісааддададацасааісададааасісдіааснаюдссіааісасаадіїсадаас тддаадщданддаюднанодсасаїснодіадіаїаадааіаддадааааашоаюдасаюнодаюдааіднсісннотаноноддаїа

Зо сдсдсдаїаасадснпісносідсісдідадсаанддаанасіссссіаїаіанпдонаддодаснодаюдавіадодсісіідіддашсаїс адсіааааддайааашдаідасідідаасайндаадішсссісссддісасноїасісдадсаадааддсдддашаддадацаїаса аїссісаадднсісюадасіайссаїсаааісснасдасссснадндадасодідсснсдааааціадосійнаісааасчандаїд ассдагщдісссстШоддіойсідсісіссдадддасндансоаістаанодснсідісасідсісдсіасідудсіддаасаааадсідсіаадс ааддддадсасадсійсайсснсідіюнддісісдаддіадддсісассадаісісааддсідсаададааондсідасіатдддаас сунсассасдаднсассіїсасаднсаддіаддадааайноаюдсіайдаадацнацшассаїаісдадасаїасдаціаасаасодаї сададсаадсасіссїіаюнсснаїдісдсдіааданаааісасідддаонаадаюддісаіаісаддддаадасісададаасіащоа сддсіайндіасносасааддсіссдаасааддаадаанссаідіддадасаїдісасааддіадаїаааадсдснсассааїасдасі дшодададсаааіааддсаасаїсадсаддадснадаадсіададіассашсіддаїааададнсаїсаасундсіаюавдіаїсдаї ссідаа(ддаадацдаіаданааасасодаїсаюдіаддаїсдадаавіддонснаддааддстдадаюдадоадсаасссіаїсіс ссаааддіадсаїансідіассддсадааадаасаансадідаюддсдіадасіаїаднодаїсдадздасісааадсасадсідааса асаюіададасіюдаіїаддаїдадснНааїдсідсасаіаісісссісасаасасіссаасіасаааддаадсаїасіанасаддадат ісдададднсесісссасаддіадаанйсадсаадаоасіаасідссіддаддассдадіаїадсндсадсасадсіааадсіандачюаоа адснсдіддісдаасаассндаїсснссодіададсідсааісддідіасагаасісддсНадасоаїсаїсіссссдаюнодадіаащда даашддасасаасдаїсаїсдаіаадюссдаддадааддадддадсідсідсададсісасааіїааддадс

ЗЕО ІО МО: 24 - амінокислотна послідовність стоп-мутанта А5М5-5: А5М5-5 066"

МеїСузауПеї! ешАаІ ей енсіуСузбзегАзрАзрзегаїпАПа!І узАгоМаіАгамМаї еистпші еизегАгаАгої е и узНізАгдаіуРгоАврТтрзегспу Пе ТугсІпНізсіуАзрРпетут ешиАанізанпАга! ейАІаПеПеАвбрРгоАаз егсіуАзраїпРгтоЇ еиРпеАзпЗТОР

ПЕВЖИЛЕ ЛОСЛІДОВНОЮТЕЙ

«АД оБінов мовах МродаКтТе бий, каш ЗНИЖЕННЯ ВМС БОПАКАСЕНУ ВО ОБОСЛИНАХ «са БУЛ кате УБУВЕУЄК. КЕ шля 0 перен «чвжк ж «ЧЕНІ Бе ВЕБ В ло «шик дае «ВЕ ДЕК дм масо ми МАВ саше А зічезичааВ кокс усе шекає сеча сов заз сух Бу зишсксвии псвоксвса чеазавкзок Косенко Бе сщЕаЕВ пев кА Уво проф коое хз аАМЕ Засоюквшку звсзувувазах еще меца посох Кк кскасзатаа дор ика аасосемзача гауакснеах ЗБЕбесашакх пев Бе скит ками Мебель Фалвтакх бобюоорсса впасти свое Зо завакздатаи пакахоаваж схо х палтазеназ азбвакттат силах що ладити БЛОК ІЙ шив КЛЕМИ МВА ЗЛВВЛОИВ ЖНт Кон пилюси юка Міша акловамиох сви закони сг акеа яшл кеша севозеМекх стзЗаксасає чес атома щи воТеа є ки щура свлозашее зксчшеви вав:вицма вики викик пса ОО сажтсвахакх заточку хзасахеае бзЗсазакооа совно ша заевомоеио КИ сусФЕсвомоа усе йв ВОК тМвВКИКа котам «ква сива тий зЕШВсКОУК ЗсЕЗКаККУЄ Зевс. сОВОкУавоВ вв оЮ Вл 7 зІснажянЄско аж Уєт коми ві Кк заз киш пев ваша ца

Езулизтаех соми пущатиавит ТосУекееавс се аза совка е м

Каттчкщоае чека БсасвЕеКтає ксхсажжтсх саше освОивкх встоватоанва Бек плас Торт шо Кзбуаливо Купали у. ІННА ТУСИЦВ СЖНД ЕЛ КК ХІПІ мірки тавсосивути КетаМіІсвае Мвакеоза повзає саї зисананаке їова

Комрлш ка совозоаеяе всваксасо завис алфавіту скеля ва ж пиЕжоснихе осо вех фон све пеммихасноюа зум висул сихащо ЖК сжацзоазасв позу вія Коовищатка колесі взувкбасака севекашикму ї8КО какйлазазос везавнавив Кетле є впоелкешатус зате ско и кА що коцавевтвс залаєавсва ЗБЕ сосочка сек оак паском МБО катаксвукі срака а содтанавше спатасаи Бесссаеко зако Мак зкоазаств «касова кохокеквез саскавеких косважеко Соловках УБНУ здо чав ахмамс Бочка зако вакуум окр херів Тука

ЗЕ сад євоме поеасискеєв запавлооет омпемовошам чкоанавк ійке екшен КсесЕчаас сао зсемесокжакя висо сКОВще сокоаЯе ів8Е застава ЗОН зем с ФОБеоаеако апа кеша МТ аштскакжка кеша зоаскоклямо вва овес киа шпик МИ зекспсноох соцчоерза сексом шефи «зашаоєюм кеша МВА зиму золою ва сплата сви все Ка ївшй часа ає вм слаца сива Касадсвкйа Вдесоисєвв воли аЗКкоє лю видає платне попав шлаи моціон аВМи пен Уи Бош ІН

МОЖУ САЖККМ МОХУ. ХУМ ХМ АУЮМ СУМКУ КОМ с МИМО МИМО Кука ТК ЯКУ

Чешееовим,у парки коанк спюертавсватвя ср сюовс папка соус аІпО савситксве Коба заз зак давати КМИНУ кашах ВІБИ ка коки кі ; ко соді гот : зав попелу коссосекус шКивасновах зсвзавелвс Зк КОкораятх м чека света ува сеенекщвоя сек асо КЕшА дляшевіасв спека соком свроеяоакоз добавил у виговзачату Я чиста сова поласоаве ке зсешакЕ боса За спипсвасавс виска споазаса зоиплусайаа масажна сосеЕкенех тако чими васала зсачековоа азебомкцио ВОК слобе КоочавК ках КМ пет кксво зазсвксовех зи Ффвакажяєта асо ою ух ШАБО «апа соків ач збаслоашех свгсавлаЕ зепвкозака Беорахенанов МЕЗкеН

Фочкезазека зЗкавзевиецу свсшєеєсваи соках Вже ше втсхх вна: азвавскакче чЧЕвЕасесах КесСазатаа зссасесназ зп азвавекоцх шт кпсізалави ост зчака аучазоавлеє бойпттасикс ссвавУчкиЄ абкзадленує ТО секс МОДУ жетон жнтихь али ат перитнаєся лих заклав ливо свсвовеови вкблшекии щоки ч вапассюківо зошити селища ВЕНУ зда ЗК нивоЗ бодай полова паса зищишкиває Ме ка нн В в р кн в о и в м в з а и в В о р а р о п в ах цассвазийа сви оа зиск бас сексота жоцскжУЕмє дошка БІ конусу здстаткмоє МХлслекезват водив сва спаде ема Ме їй

: : : ше ; : ших зак си ую люМ. Е М Кі пвх ок Іжт мих с ЕК ди І т1 ко талатапате сосок щУмасстніаиа сла анко стос юх СЛУ ХЛ лАЩО дууже мія с ков цМвм уювствк моху ілі мМ даху ших тозчазиикх пкшосивсу иа Емех ша ака ева хорами тла У

ІК МІ Мих у ам иа ит УМ В охо що селу фол «АВ сити туиф єму пу рама асевакеквно Фобос фев ковов тА сю Бан ЩИТ Дема КИ

Кіхот цю Ко Му мА УЮ схрещувати ЕВ Кох КЕ пючуаникиМ тпуцтвстаеавк закаеунх ува постання ла частка же лугами тиуУ. чом іхуУк уУіюух имув а Ка тмчи уки М Сб ем же кх Моди КК кит КО

КУ ЮдвЗТиМАЄ су МОХУ САС КУКСМУЄ меш МОНУ осики лашЕ с НН зак

МИХ Аж КИа МЕМ роми КВК МКК ИН УТИ ТИХІ КТУ хх ПУ ЛАТ шоці ціуича є фу ую списів єм Фе тхитй ін дю ЖИЛЮВ поем ши КАК у куму зх вий вина у. умо пана сарани ВВ шАТЛНУВИИ ПВХ йо фр т фони уро, уки Кур КК сет МКК ем ук вх зей

ХЖНЕТЛІЄТВАТИІУ ЩОКИ ДАТОЮ фрак тас й щ Мем УЧИ КК важко ори ми ТМ уж дк. мам ми віт, М ЛюЮМлЬт мМ Б ощ Ка туш ЧМТ ФДМ оИХ мае о Драшнд УКР УЛОІЯ «ЯК

ХА МУХ. т ях. Я

ТКА Я МО -

Кене тб хай У

ДОЛ 0 Ме рочв рар Во дулехим

ХУ к Масу сема суки С

Ба ху

Меню отим вки Жах факт око Ум Хом їх їн шу Мам діє щу пом Кі

М Мушу Те без ЛІВО А АЮ ММ МУ ХМ БО КУ С ДІВККУ КМО ЗМІ 1 В її 15

ХЕ У що МТ

Ж дане 3 тити а вух их там Шаує Леву Ли Тохує Жохуут Ес Мом Тк муш о жи мед ст жу Ви Ам оО щА ДБА УБТ ЖЖ ТИ АЖ? см ВЛ ОЖУХЛЯ ММ - я Км жи -л и пає дока би диких М фата урн Крах в Лю пред у лиху о Ти ха ціх

ЖК ФУ ЖДЕ жи МАС ДИ Ж Х їх МЕЮ Тех їх ую уж Кут анна МАО ду зв 5 мох жу ів йів гло щі лу; Уві і бу зе Аж Я бум боді Др ух ха іх з гне Яд Х; УК їлю ку лі Да От ем ху ох ТЕБЕ: ший Дт Адже ліз їз Му й цроБжш дід мех шу ЖЕ СТЬ Ку ме МДЕ м 5 її

Мам фі: йшер таюки би тлі щу МАЛ юю Зх бе шу кі с удо Кому

МИМО УЖИЛ охуть ЖЖ Ша ши ВА Ух ща ФУТ СУ с КМ уж а

Фк, у: з ту

Я ТЕ І Ви

Мах по ни аа КА ТК Фи МИ їм Хе ун "Ух Зк У. Ху Ка за мая ск бот зтм МЕЖ ль МЕЖ Му фот Біла Суд ге Бор Кт оу

ЗВ а 5 дам пом ож ух а уш да мм тм пк ту сії пе й сі де

ОХ О зихІю МУ МЕ УВА шо їм МІ ОМ ЖУК САМ ОШАМ МАМ ху МОСК дом хтк я

М ТК МІС тиша ХА Аж Мун Хтухіт й шу Й рі и Ми: ло фе. сії Той» бомд одахю Сх Ух

КТ и УЖ Ме оман пшвоихом де му ід жає Уді смМ Е - іа» я че у

ТА їх ЦЕ регу лу ли Фк ах Зоатройнл жі іму й Вів іш шли Ті кл Ем лЗкща Аз оди шеЕж Ба Еш ой хв дЕчЯ АЮ Зав МАВ ШУ АЖ ОСКІКУ МЕ ям «5 «дії

МІ МА КИ т осика ру КЛ ху щоешує Єїу сви лить ПВ аку лих и: ес сук Дао схкЖ жит їхмжо Мом о валро сів ВеБЖЕ хх жу дм Зах сМаЖК їх ап Кк Я АЙ

ВОЛЕЮ вже хм м : - з є : м х - -4 п УЗ кт ния мих М їз отит 13 хк бомлі му дю Юідрх ла тіла М Юа у 32 МКМ Мах пе

Шев Бжшж сам лий) ий ем НЕ ож шА МЕЖ ЖЕМЕ ЗА жим УКВ Ж ЄЕОУ

НУ Ко ЕН: пт я що біжи. Му сю Моя ме Мосужиі Жрхяї т а ЖУК Моусуих Мод ТЕ тю Суд їх КМУ п щем ШКО ІМК ОКО муш юВИ їхву Яку ск мл УЖЕ ХУ УМХ СВМАтЬ лолих зп їпл век АХ ЕОМ

Бе о Ку ку ШВОМ Шу з А тла Ше шШащуУ ЗМ лезу бе ще Шоу» фиа

Кс вхо КБ о жа шех мм ФВ Ям ЖЖ мех фах опт ЕЕ АЮ ЮЖле ма яви не пух

ДЕ пУгу ау

МУ Не ші ур р дуг вт діл ви те йде Мій Зв ті дм фу фозту фу сбву

УА фам МВт жо Бі БНО ОлЛИ йаг одій УМ Ха Бут МІФ Бай мож о жВЕ туту ск т туту

ОКХ я «ХХ гусак Ту шішю ЛИ ж ЖЕ т томі Мом. М ЯК пла тожю М шлю Мохоюю Ту вв ом тс ЖТнх ФУ Уже хжма пЕМА ХО ОХ бхАм ЕН АБО ОЛЖЕХ Ж о МЕИХ точ зулку три, ту

В кВ ЕЕ ях

Ух Луї в Зі ду бю юю кю юки Й хе 3 риє Ту ві 1; тиж

У іще к іс тм Бій Кор тех ем й ім ЖБК Б УМ мим мА ОУх од зкр покла «ТІ кА ВА ех п хі мс тА мату щи - с шк Уж лю о не НН щоби ще ло Ууви цу Моз Щщоаг ле б ат їв Тема СМ ХО

ШАКОЖЕ зу ХА ОК хм хв оБек пе ув ад ж СУ ща собу ех

У хх ШО те жі Жма Таз А я жі а тії Ах Ж бак да ІД рхю бу А

Кхт ем мети Муш маш мА дів лі У ла вер тую ДЕЛА МУ Ж УФ

ХЕ, щи зе «іх и кОЖО пс БК я УК Жбши Щ х Тих ЛЬ они» рути Ж пу що МНК очне

Ніж Мілош Бе Б Баш Жак Ма бат шрохмиМ ож ЖУР емжю АЛЯК УМОЮ бли СДМ пе

ХОО КОЖ пе помити ХЕ СК ду У Ма ту. ку хм фея дев ЗЕ О бою маю 3 о дух УТ я

ТУШ ХА Ав Ху Кл ха юшОЗТУк хуж авВе М КБ Жи»Ж хашОодхЗ лава

Б пл ук пух мМ, Со ж ким

Соус дватих ЖЖ ЖЕКи Хоми ййиУМ о Машу дюжмех Сб Стік бик юю у КА пав о тву вже Ма ве бха Жах ех вх лук ал УЖ Бах ми ую У

Іва 330 ЗХ жди дню хв ОМ жує У Мі ЖК хі шиє люімкі Ії леї ве що Вл лак» бю їущ мит ща та Бах А пам ошіш Зах ши оам жа КБ іїхКу хм ю СКУ сродсич зах Уч

КО За пк сон см ІВ ю Ло тд Що Шхже би т Ка мих 2 г тож 2 ЛУК ід ЖЖ в ца МЕЖ паю Мвт Мо жі ОХ КА МЛ мул МЛ скх

Зах хи ЖИМ хіх фр Тл ох Бах Ар Бе Мі У м ою ат мм лом ква Аа дме

Ще КЛАДУ Хв КК ЖК ЛВ зим Я Кт вх па Су ви ви ная мл пер кц лад

ОНЕУ вен мМ жо вух ую ру м у ЗІ школах й ль беж диво Ж Ма сб Жов ікущ ша СХ шЕ Ма КК ху ММ КМ од ЗЕД ЖК Б'Є КК МИХ: ВЕЖІ вх сргут жде дих

ТКУ 4 к ВІ С т "х У У. ло Уже КА КУ ОА сли Зх Тс Жккхк их, ПУ З Тихо Геропу, був Філ вве їла ев чні 5РдоБет спех Ті ВЕН Кл ЗА Щ СЕЖ МеВ УМХ дух ІЙ 5

ОТ ІВ ОК

Хорше Хол Мати. БЕЛЬ, й Жака. Ж ЕХ ожехм бує Й ху о о ї х

ПА лЛУЖІ ЖЖ ОИДЬ Ам Од МКК Масло сбкАМ Й СКК Гии и ах Ах

ЯК й С ук в Я

ІУкі ик воску с джодує ЖІ Ж у м ку: бек їжу Ж хо Ко ри Того СМугує З

Ім: дю АВ лю МД ва Же Ух мМ ЖЕО муж мВ жає в ух ми и МК їх Не Я т ЕК ря бер тд тла Му пика Ки Довуу Ло лядуз 11 бом миках ЗУкум Сб ую пк, тал ше уж їхіх дм Кар лм ЯК шу Вл мае ЖЕ ВК КВ с ВЕ зу щи ах, ЯКО лю аО КИ чо їй іх й о йа в сі: Ммім ца а СТЕ бі фрюр Ко Мат би о йашй їх бут Зав НІЖ пав сій пол нан 0 Тай ви мор Ме КО Бе вий іцд Іл; СЯ аку

Бк ал 515 щК з су. І Зк їх У яке ГО Мои. р пед жи М Ж ких ПЕ сх ОТ Ті іш Беж пі о лтЕ о ББеЖ КЗ НішЖ ба тТвк о Ббес жі ТВО бум ай Фа Ух

КЕ зал доскк,

У зп ря «ис мм обо Мн Сб. Фах б боках фо Мох Же Ля; шим о бмую й про

ХУЖК КЖЖ Еш НМУ Б Ох ії бан йх що Ох їв БЛЗО (МАВ Дб ек дум МЕ тм це пліх

М зма хм

Тиша ОМптує М мі Хр стік і мом ІЩЕ ло ге пор би Во тигу АЛ жищі КОХ КМ МЛ і Су ЖАЛЬ ХМОММ ЖЕК УМ ХУ СУШКА КК бкниА зу КА ее тугу кити у

ОК М МЕЖ за хро кр оВар АТ бат Тр дек Му бе Мо бвмо Бо дек ЗДУ од

Ки З М тв Вів тіж піз Чаї ній Ащу йсх дій Тухк сліз йди ЦІВ ОМА Без ів

Аїда Бі іме біу АХ НІЖ Бак шОХ Лів жухХ ба дви Як МОошЕО В же МУЗ не чо мет дів вла ші Вал оїдн: ТВІ Був Буж їз ре шу Кк Уа ВХ дех

Ух ВІВ ТЕ

Ме: хі лі ха їж Ма із Буо сі Пец ТОК дів пулобеє

БиЖУ ІК ща пік хи КЯ

Ви» ВЖК ха щАсеонаьаня ЕОМ ИВ ве «ЕМ мов мої шепхахе

ЕЕ. 13Х3У.. А МУХХ «ЕМВ о оншнда ИММУЮ п. ме (ЮК ДОМУ Ж хаейих З пішов пибБлеутуух Зло увОи Кстуасамх сова вазах то агдконим: соми сориво збзаеотеа шля УтТиТл блю аКоя Кава иах МУ звука клі чего рим рек сво мих БМ сулуєти КК Кожен Ми. "пакету часова БЕХ МКОво Зааассза сопла кое исх МО пигасейві зпсбасаус базахсдаши посазцаВоу абсаїаквче Хвала та хаасооазо спішеакоттх запосньо: кеЕопослає сазекявих Фошакасех Зб чапля песо час азохвахаце Ера ко абсо Хот гЕ БЖ

МТУ ЛУ ЛУ тити ее ку ую Тушку М ТМ КМУ СУХИХ А МАМ см закис спвкстакае Кектассво зи свиня пташки ви айс перами наяв Метали газетою калія т мТл, ря чекав чи Ес датксй бал ищтякУу ФК ЕИТО бантик пилу МІ сту МА вати СЕИ ДУТИ ОТИТ ТОД КЛИН БУХ ТИША ОО котлах «хоседтото ЩО оМО поаКосеаело мата камх комет Е Ба пмовНео КВ зсавиєтсм офагвторуава зфксвкатх зхаопвеютто палав ТК бив какі вла та какао за птлеЕКЕксх хаВКоусанаа совка тво засвоїв сб спами павссоевзає «оедфуекилас сзкеко спожи о чека всавовиа бБскаккасї сЗусвих ЗсзсеаеМ: зе ВВ сзкапткссеой сЗахсвамсх ската возів аксона х вени зва сек жажкиу сера ше «ев Фиблеиха ссзаказата сеувавсенижх МАХИ дасищксойау сецссватов досєасцскктя аобосвкала фото сапевезкоє ійни тісабкакаи сехексюкоє вбоссцлево лиж ссгеахін авасжеьктх боаетаа вик МіО сапоссвсвя зІхІінпазака вазу сао иси сшаисчНасеЕ ее циатна їапИ кахсканевої Маса сскозавцу зскомедех сешкоєалає стареча їх зЕствИВиха сржИИ: Зщемупасває сваха то темних как Кксвие Зо зЕсіковВсаК асаюкантсв застава сасуооаоая ВЕК ЗОаВ селах хЛВО

Чацалеко поета виток ахк совувивася веною шоста х. їа4о сс тодая спаштвокюх КЕапастоне сор асеия здана кусаееви Апцо пеки дура абсссвеавко ватджекьки село ЗшВи зок їшжо ккахавока ЗЕ сокоо зач бою ави страв ява руках і5ІО

Феїдаєтрвир ваствиекхора вве кжлонх соус муасесиу паза 15 х кому. 5 2. ІМ ниж ж Уч до и Ан чи с дик хи мч пики ук Оу засос спосте спало спол слеакТУИ СПК АТМ цехи клсан слемоюєкир скоса х ехо акдаюкшита Ки ааах іо завишизаса еп Укьсшх вазоаскУдах він єпютевх але ютає ша іно позаєстзака попсуко пато сота едикт МЕС та течі сопосовлек зУспеосайе еачикоссв вуса воасасачнкх Ваши свкукм: дес пап слачеа Казкакецає зеспбетогою вивсаааке Чай закавасувос аочоотувихМ сводвазчссьа Мазапевеас Катасцвашо Кововоссае БАЧ

Би тесцскЕ боавасцвзює «зазаковос засо саво доептпоаечао аеро «і пиву щисеубЕсос дип кма спос садки бошеиаасх кодЕ шпаклотошно шЕфабстлв аксони бепсютевом села аво попав авоми ши вкриє кеш нуцаи аа ах маку ших по шпесастатх варта мово шевцосв скшоевоЗкх шток ецуссю свати я зипкоастаоя вуса зкевевисьа щипає Шестовазт БК. вки зсохдивиикх ксясвежусиу спав есе овосяе сешонувазся зичної що стаслазаваз ВОК ссевах шсокЕЗикиВ вадосскавКЕ ЗаанзЗоааАх воававовае ВВ дасть Зошееаеа звспсвска коки ктв Фата фувакоча каз апсошквисис сасботофая задав ска техе ФраБастоувє Коли меєои мНЮ свававист дії казаєсео зосзасдфиае Кзаланашоа как Ком осатох шщО шфисху жиму городи ат витає кхласКі пило Молоко Іл ша КА КУТУВТМК. СМУЗІ ТОАТЮ СДС У МАК АХ ХЕ МАИМТЛКТУМАЄ ТУМЖВИЮ ХЕ КОХ им скассдзоаніо возапсовав зкашскькою Єва фелошиє ЧепюсВвив хиВО пиво вазон косе пух ваша Фома ве вллмимихауко пемсеванен. кишках МАО ефе дисинаВ Чпазашаи ЗО влшнмрамнам сети тним) залою х сабо лоза вшсасестма сеанс КО здо сасива зксабиокие Зшзшавотає спхзоазасив ес ВЗА Я засанасева свей пута зош аказ вашому х века х вебсавячя Ну чи лсаво дешосазазч песасазоа пасбакокоми зе саса заочно зб пасток о Белая апа зоба шахи аа Ва тділанісси шежалои є сич папок фезаасаКишю пес и аск а ки ди их питав и «ВВ ех су даю нн ан и нки ку и Ж ТТ пк З Медшиатиня УЛ Тл с щВ ІН. ХУ УЗА я ШИХ ІК КОМАХИ ІК КИ КЛІК ЕХ о Ян кидав ат «ери зчав заз ВЕКЕпсІМху «Есковане запа лаАщО «пшЕсСтктал ЕДЕМ КЕ сажа зсвавй Свазкоавие сом ока ас твазаищиих сапу зовв зцазакксвх сеакоуктониї аковакакла рол ЕНН «зво викла мілвІю Єсспаввиє Жчаакснаня дасте хро нУАея ЗО вис В село баз маває салат еще вашим УТЕВ казизаззшс сексвасУаи зазазусеею зекаєссосх зааоакоцея сбваанесие УТо спек свавс халоктдсва зЗозаєкепо зба зЗБеавсспе совасаднике жвЯО вагова едюе ВЕЛО саспаесАМаАМ сс зЗавалавике емалі Й

Маси Хе ЕВ права сан во еп ая ДВО шА а всханстаяс зво тква БЕ секжкк апа Макух Бека ши звис ик ЕцеЕ сопе хВанУ За ссваха зак еЗаколе вача а що свлвтатЕяс сксвтвайес ассоаскаса авоспазсавЕ аставкеахао запах о свое хоста ласве азбест Коулатезоча Зпалеовхира бажвлеаае але авишклялашх звука сіла омиракхї совок спаде що сксажноеа віракеканех Спасе оселя вки слсоковакмах й азпсковоасм сошки зелизасаамх бесепзоа азпсесвоска вас жІВО спксовляу ФУ запасна ства тами жшетв зло скорх хорами ша спалесазих касопзоацей змиаасесеє Сер вах спанакютиц осів ЖИМ свохщцкух сщеистеюка Коуказанак софеоиклм сасчаєсикой смакам ап їх апае хіх 4 хх ї шк Ма

Ук ЕтМх, туши ви ЧУ поту М жит при ву

ХУ ДОК УМА ОС ДК МН

Оп о хо УКи з жаху г тк. Жук що ау току ен бух Мих лугу оЖлую Жду хх У: ТЗ

Ме БОМ ЖМ УЖ А ів с-м Мід Удо ія а МО Ку ЕМ ДИМ МиКуИ их; лим сип г 1 ЕХ за -щ5 4 їх Ба ЕЕ: тк г Той Ж Пкокта СУК, ис У у. Пере Те. Ки нх су Н. х с ТЕ їх г. ШИ

Ку КК СЮ і ОК Мвт пил ТУ т Її х у хх щМІХ слЕщМ цх ВЗ як ШАХ

ВЕЖ АЙ жа ЖУК яр вена а БА МЖК МЕ ЖД ож м ВІВ МЕ КМ «м ге гр,

Ії А м «й Ті ТО

Ж пр Ж їх ще г Хе х АК Шрек сх т хх Мод ста уки Ле окт Уж ШИ

Ж) жу Бу дико сІ ж жим ЩеЖ ост БАЖ ОАУ МАЕ ЗОМ ФМ жд дО ВЛАЖ

У Мо МОЯ й Б ах мил Фе Жодіу АС мо Жов ШКТ ж ІМ хо ик ШЛ см они ША де ду соту

КІЛ ех щу А м Ло же ХК совуя дуже Ва щук АЛ шо бах ЛУ дхкиИ Чо шин Мох,

УМО БЕМа мА Ба УВА ем Ж А МУК Ж ТУ БАХ ЖЕК К ВЖК ве

Бе ту ВО жу Шліосфюдмо Хол Міуає С Ж ік тф3ДАЛ Дж смрюю Кл Хіаті Ли и Ж шо хм ду

Мам спа ар цу їлх їі Зв У ТЕ УЮ Валу Фош що ТуК АВИ ке, зу т рух що їх У шо п о як з « ше ще - пу її - у доти п Нещі

Мала іі ж им Лу бдаш 1 МЕ ТКУ фу Ті туш Бр щбжех сБРую сх

МЕЖ КАЛ медхю МшШщ ЛЬКОЮ муж ЦО ОЖЦЄ КЕ Мо п лу вл КЕ ХМАХх оку

М З ТУ

Яеж рюю. Еткемо дю Дж Ж ке БО ко ст дя бін Ти Як Як жк я дух «МИЛО лі Ком Жах мар Улах АЖ маю БЖ ВИМ Мо сх Уха ЕХ зх м М УЮ

КАК. ех, яру

ТО МУ ЯКУ

Шів Заї бю Мей ї-ап йо біс лів» Бе Віз Бе ві фам: їй: вм Бе ше УК УНК мех. Бак меж А ЕП Ма Бі жах Бе вищі АВ КЕ лк пог люк

ЩхЗ Ка фтя

Ж іх була ск М оч ж Ж я о Б с ши хи мом У

Мет ма бодчі бр Ов од ЗРО Кл могу вх й стих штЬьхх СК жд рум будую хіІроЖиш сит ЖЕ Кк На о йеУх Май Мід йшов бід ле Ох У Бі ж ех от Кя яд а В НИ мч о АЖ т ЧК шк палю су. тю. х х са сх с хх І Га я «Ух. що -ї їду сим Сгловх Жах сфе М гу сто дує ХА ру що ле Тк. об аю я еу ЖЖ МО КМ СКХЕ Ж Жим вл аж меж ож БЕ Да шеЕ ле КИ я ях че я дих но. КЕ Ве КІ

НН АН Я шою Ач хіти Ех ТЕ ше мух СИЛ У у хи. пу

ХИЖУК ХІД сх МИЛО ЖЖЖНМ ЕжЮ УЖЕ сут ша А М ЄП Ам ува ЕЖПте КК ЮО

Ук доечих чує

КУ АТО пу

Я - я уко х х А ж З у Ж ху бю дум ку: тод З шт СУБ луку умах Її пе бути єв, Сам фтх ду сл вже ХК ех му Ук ЗУ му Ух о УКУ виз жЮ гуЖ ма : ах «тк з Іду Де

КУ ШК лм у х 5 м т я щу -4 бужчих им ЛЕК; че: Вісти Тк жж сво ж 0 У оіх їхніх Зах бежж фе» Мк кум Ж ба фут их Кр ут сг вк Кит Тим

ЖЖ мим ам Кв зе АВМ Ма МК КК Мих СА КЕ Ух ЕЕ ОюТИ А їх гр са МОЖ

КК ХКГ хе : пу щ зу Удзих Мого Козу Мами чи ха ему дуа доз дід Ба біз й Віз Май ті зд до бе Ба та

У ЕМ ВХ І А КЛ май ваи ав ша дош фу о ми ке УДпХ ї Кен тюк г лу и ле рвНя ТК «ую и и е . Сх я т л т т уку С боитах ші мкм ж одіх вай МжЖі фра Біде Ша ба бом; ізн ет ШУ 5 бдць ВЕ Лю ЩЕ їв

Ви жа Бе Кі Кк шо. ММ АТО КАК КОЮ АЖ КЕ ЖК МАК ЖЖ МОЗ х Е пул сх сут за и АК еп КО : є шо - х Ко ех кед « у щк - хи КЛ ку УМ МИ В во ух скат Тк КА ТІ во тод ві Ж тих та щі ек ее ВЕ віє дх ЩПОУЖЕК ше Ма АТ У БУ АЖ ВАВ у КА ах «У таж ау ца кНя

ЕХ ке «ХАТУ с ті т г: Б У т: 2. и Не жо Ж йти Мая пік ЕЕ о щі п лямі Піх Ше Мф шжшо ва ро ба бак і о Мих куп АТ ККУ Жук ЗМ джму мм з КМ М ЖМмО ЖЕК МКУ СБК мо их Ж ОХНИХ пршех Я ща ку Я МКК суті ЖЕК щі г АБ ЩІ, покора Уже Да о Сх изд ФЕМ ТЕ За

ЖЕ ою меч Уж лав о жма чо жи дк АЮ АшЖ мав му СКК Е К лу д лику ру «А І не м ; : : поря - мелх шо хх зок унт їх ок аа чі кер З см ких Іі тів щу ЛА бле ж Був сив Б пПхб епЕе ЖАХ щі АБ лав сут ав Мав бі дв с дріт сплУт скрути

А З шт

У Кожне) мМ 2 шо : це «33 ; з ка пи - -х Хоми КЗ пове Мило Бір сбдже 4 а сл ах гу но Мік дове; ЗМ сію сбічи Сл 3 шо Хжлж х

ВІ: ож Кк жи МІФ ме (ушу УХ МН УА жи х ЖЕ лов АХ соя спри че гак хок

М КУ ОА УНІ певен А АХ ж кю рі ВЦУБ СЖБаю Жар оМиеюк ух бот фло СБУ Жана іа бі ст жи ЗКщо беж Теж ко Как бе ба Мек бек Вже фев Ж ух ак сей о сіУ ві хвЕ че «кл:

ЗЕ МЕ ЗХ сах ; ще сх ск тії гі Я ш ит. кВА КА рн ке

Межа Ма Ж Жов дра 13. 22» шохе о бук 2 б ух діл» хе Ах ше МНК Ж КО ЖК сла ЖОМУ ЩО АЖ да Уа гра АХ Ж Ух спи пр кОЖ ох

Кен ее ІК ; и пед : : й я кечИш -ї У са якщо.

Тв СМ и МІК тих мне Гая Хе Ток Ті ФЛ шт Може Зк т тре

Ма ХХ ХНН МАВ сув ха яко ма Беж їн мл Кеш па У МАВ ОКЦЯ

ЕК КЕ Я

Ко ЛК «ЕТ ем М То Ті бод Ар бихіи Мао і Чем Дер би Темі ще й мет

ПеУж Вже пуВ жа шо МА иа ВМ ХА МК КН СУ Дим КЕ лов АВ ар дих се

ШІ М КІ ШК

Хлор СТЬОкКо Ше кю сич ак Жомах 1333 Ву вот М джу Шерех Лх Мщух

МЖК МАМО ХИЖО зашю КИ сп у и п лю лКХ щфю САЖІ ІМ шо БЕ шо ЕМ ї5У уко ім сутки УЖи

Бе З УА жмю ул гі; Р тд Божу Ми Ух нм Му Кл Мт ар ум Мк боже Тема

Кв ма Спа іс зво ві Бе щах діє ХВО Бра а ЖЕО БУХ БО ям дл дк щГх З ЗА

Кі Ж фани 3 Ва ще рми СКЬрам ЕХ ОХ хіх Су ВО Км йомет о бує Ах ї гу ах фе х І Ту ТЛгю 2 Мом Од Ще Сто Аг ХУ Уж іде Тир Док и М

ТІїв и а я ко мА о Мо НК М А ЕВ а В КК М КК о М З ЕН ВК алу гу а ОЛЕГ хай Ся а

Узкету Щму фрекек а ЖЖ ж Ел хо Жкжних Мт Доки їн; блуєу ЩІ ше ЛЕМ Жокіюі Ма Док оце а Зк ка м ЗК З МК Я КК а п МИ ВЛ В С З В В В С В В а В В НЕ КЕ З ЕВ ОКХ КЕ

Ох, С й Ж,

БО чу КЕ

ЖЖ ту Жожх (їх Му фМіхих спі: Люгух ШЕ ху Т.к екв па ке ЗО гк бкуюю К пат Беж в ба ЕН Зах Щаамошаму же маку КУЛЮ КК М ху ци я ща

З ХУ Вас

Жоден жк ля ЩА шо мк ЕВ Шї шо КА х МК о Бдшую о То Мо тідерх хш До їш о Жід м хе ЗХ У пк їх смт МАК ОО МЕУ Токхтж Мох

АМАТА схшль АЛ ФСК І хкКМО бдДАЛЬ ЖеМл УА СКЛО ДИЗТ ЯМ БО МЖК НА У

МК Ко стуки али че У ЗЕ а

Мом. Мам ЩО мо їжу Уха. ду щомМує Сов о її. Ха Ця Тк У су іму що ош маш а жМмЕОоОБж Мл ше мА АТ ї Жив А УК ши ХА МО Ах У ж «ке хх «І

І БУ о баку сх жех Мк Храм Жичах «А йо Юна а Вр ослів дав оЖек ів пі

ПУЖОХУЖ АЖ ОЯ Че Гр те СМ жи пе Бе Ето сій дит МеВ КЗ кій тт Е кг

ЗАМ ТЕМ А ім) Ше Мві Бк Фі 3» дій дет Уві Бі бою йщу бик діє пув ді шИМУ сххРжЖ жа Бас А су Мао жах ж АКА БУМ ХК ТЕМ ЯК КІ як ту ща три ге ПК КО) тр тля юку М до и тує ди ек ох томі шах Бу. Мою ТЛ ду дит,

ІК ХМ ЕХО ЛУ Аз о бе тку» Бжюх Був Ва іш Бар БКО Беж іУ Ло ї І Ї Ж З МОЖЕ Х ПА ОК хосух шоу подо же в дай що ет чо он З І АН НЯ ок п о жхМх - хх пкт дж пл та іш ех о Ві Мі дай Щи Міщ о слюю міш щшт Ніщо пі Бут ід

АЙВА За мебу жа М Ба ше да ЖУК пт ВН ВМ ХхеМм о юхш ща щлауд вок, чн

ПМ УЮ. «ХМ ТАК те щі Ми жа де би. АК що ЛИ тм СМ У ем и ую Ме ПТ у Ши лико

Мет Мйій Аж У Ам ба ді В СВ фо рі тла сі У Вл Ві Бут башт поже шеж м полу: па Коен що

УК шу вежу ен НН у ха дл 4 -Я - я ех х п

Бо хе на ти Он на Я З НОЯ хх Фа СТА кр Жожиже Юм СК рих рути пк ю

А Я а М З М В В НЯ щі ОБУ МмАЛЬ ДЕН ГМО ХА ЖУЮТЬ роса ке Оу

ТМ пит п хшле У

НН За7Е -«- х т. Ше цк

ЕД Мінвогідтча тЗбБаоки «Тех

Зіседтова есте жено о свои схсовозсова вок й пики кториє Коста саден пит юто пока е отак що псаватьакі ЗБКокВИВ смак жшЕви лемеша Коза Е век КЯ ХВО пек ксвь КЕ коса юс Казсцоках вра нкаака дачах 245

Свахжолокоа азоетх Меффаоеанє супваачею хекссумаютв кує НЯ тощо а аначлацека спаде ико саловоаеа век уютими софаавомх ЗЕ акжшкдхавта ЯК еКЕросВоВ зваблакорду хасазЕзев се євукох н їккзасссвав ввасаковов повара тох ковбасою ачеоцейння запив Се аашксккоааз пасошлЕаех оавпекова шкексеєтох МСБО заВшВсВое чо семан ссскосомсв вазестатох заамасаай сасосвасеих фс в искали пожевецоее пока салют еще ско Щ воазізавишс зЗаактовея зеовашвак кКОвавВекУв кожи еє сао танох ТО

Шо і шо о ЛФК а и НН В ЗИ ки кН сту зОзактсахт совка амх пев акта века КУСОК ї5О камеспкаєе говорах тиша ла зсзанавтс оавсеавмо яви а срака ета пово автя пілрижокаохм зале ае пава щ заекЕзкзачи Здав СОКУ собака саше аа зго кзахтвасосва сзсвевашти сбазвсемоов «слюЕаакосю аква свкеназкЕк 108 сш жлянсоє даси Ччбавелечох себе аква ховав вк спижшоакхак щен еаашт ско иля Макух Ве пасе пЕцах Іо зкКеФелаом зазакєтесаа пасток ссопессив схе Зако алі ах ТЕО штслпвкчадовео зазавеаненає КИ ЕКиасии КОВИХ визнана кІ ОЗ КВУ їй ееппатодею Вал ном ксеЗсакава сівовакнок кала івах зпалемодав 1385

Зевавсваа гово кекс ов сасівавевас пивесавово злавайзбоув І зшиавеачи асбешиекшеах час сивс зво па ЕКОКах холхалкУай що МА «лис свасх спанохсвоко азс ее Месавссасс хсооувчеасх зЗсвасаКосоя УБИО високе еса фестусавох КЕаотевсса зЗооосассоо вааосхвутає вавквквееє ММ позавазаєс пехвааеУВ сзасваесая Хачакхотаве псзставких казавсеаса зх есе стковавави штсошужеи видео «сама пен ї885

Зиепущиая силовим дташнтих и пазом аже сват ап ущ ща аштаиктавЕ сФозкацикї Фдехусахомух фуассвца Зак ах охо їІщав тик ав ливтинає подат ука повну аши віце ий смурозатсвх ЗВО

ЛК ШК чисвазчатах пасалулодтх Чесатацеая застава ем овен я ІНВ чкшхЕлЕскЕ ЕЕ МЕкХ Вс х ХЕ Еазахо щестаківЕ звавакикуєх Узша

ДЛЛЕПУТ ВК ЛКК ЦАЮЮ Хратнкшикмил Брате шеЖВО ЗА под снкти я ачЧалаплутог саштоклву ста ксовса ачокозазат папа щах опо шекА шо кіосромсанаМ бобра зЕкао сушки посада зов щиюих кан КУ кох семи але закіжавиеєма шал аасеив пющитавткй РО) тавслихикЕ котел еасаю она вхковзівзаза шпажках апокалосах ЕКО пжешлнеассма саке астсккодаа вас свомо сзамазевЕЕ Возна 234

СИНА ВИН. ово НУМО Кн НУК ло мих пим идурурют ат яало хоста блока ваза мрав Фавимуаеал орати каста яко маму тяні Мал елеи відвмозанех ХО жепдих зізОещьая дока ик ВХ ше амт Ко ещацю ска лясеашн су ЖлНуЕ вохсокавец сени Зла

Камсосесоств кахакоиє франко за запа ант сис а КЕКСИ ший виразка ства ниема їлскеахиое сиза за всМосаивс ВЕЗЧСКВЕКО ках чих кали фронт слу юоюаак тер пев я паж скол кита кох хопокиспоза ксаскеоеас ссощачснаиа шо

Зіна яром Аж Тена ває ОВУ силемовнаа цу аа ситасавсхо затоку Зоо ни хоставзаво заоцскеаих азсзанемлоа ВЕ зкатасвате сода о Яковом одас бив кса додисовивеа зак ксках За фригнювоаа т поле ваА Фрелцемде ливі пт ел М спот ЗО зхрмимиео шик усе сосна минав киска еко етошх ЗО

ПИ фс: срасуєраєв ав стоамя ворожа веасазскЕ ВУ

КОЛЕ БЕ ТОЮТЕ селом тсцва стем товста сек зва злих соти косвай шовк ил Екоаак сзаслссвиае асасаеакоє ами засос зе печасюиютчй сатин десабксв скавчєсви База севаа зав

Каша ки писк бодесдастує аканта «опа камо сплатили Му ЗІКО тепле хЕтлштаих дзвслувит є зов нажалесх азам 3550 марки не сранассЗх о петнаололе ємне стих ТММ т сукаенатку ай пек ттМх закиди сила шко сосссадаза зосавосех щи жо и М У утухоелхтв й ющ м фіІх печиво Жив дими муки, КОЗИ птпдУшихеМ пса зокре пане СУТ НАк Деу «БОЯХ

Ми нн В Но Не ст косими В ЯеЗНИ

ДОКТ ВИШИТОМУ раса ВИМ самцем фашиа Тих «ТМ пуд чи Комі ем МІиї мфмколумумх смію им КіацеМіІУ комі Кох, ТЕ, сансошаае сало зкзрсачоо авдислеІвае Кано х сим. «ВІТ хау МА ЛНУ МС св НИЖ ЩО КТК Ю ФК ХУК. СПАТИ ВКМ Хі ККУ пи НН НН НН КН и Но Ім

УВК: МУК УХИМУт дику ФУТ МИ КТ М паОУкОупк сх ЕХ ЖКЕ ЛИ ЛУКИ нин и НН и НН Но НК ЧА чазатланике ста Во Це лхуу КИКОКсИаИш ШВУ ис сом чик схоче кін ВКМ ува хіІчЄМО Ва ММ щих см г им дл чававсеь сасоавеахз всех нАс ЗпизаавНа Зп Сех лк полждииц піж сиуи уии В ВО Кк Моди у им фу пдв ху. ПЕ ах ок их дж ре ми уки ТЯМ

ПОВ урлСЦ ро ооют хх Мер поаковю саткАИ У МаМ: ЗМУ МЕМ КИТ кеКее подати а ОКУ ЖЕК. АН ММАТОБІЮМ НМА УЛЯНА МТК ФМ ПЗ че

Кюрі вими ие и ре А ЧИ За о ее М и в КК ДИ ДО МИ СІК А о МЕ М о и КК и СК о Зо закапоиниму кжлестлаай спи Кист лому кплоа зважає паста жи пулретххдхв среі, ММк мита КО, пяти садили ваних Меп ах али

С аа о ЕМ НИ во Ци чия ЗІ НКН у со и а МА З ТАН КУ о ОЗ Зно ов ДО А НО в кн нн НН в НН НН ЖАННИ

ХДМА атм МІД М. ТИКИ ЛУ КІН ОЖЛНДСлЮЕТ У АОС КЕДУАТЬКУ МКК АВІА ТУУАМ

ЕТ вІ ква Кп Ел МКМ ІУЄНИЮ ДІ КІВ В іних муч ар думу им де

ПТУ шлЛидУ ту: КФК ЛИСТИ КН ИМАМ ФО ДтУ Дара ВОЛЬ МАУ. ами ср тишею о сети мтую м; ев ов ту. уз лугі кими Ми ярих ХХ МУ ММ сини шахт палю спам малаполоаш сблтасацомо вбосооаса шлаком е хат ем сющо сте тм тісющити дела ок шлю ставт ем КК іч маю КОМУ Бан жу атат пешлараш посимакен Фах КК КотовУХ Сол о те т АЩЮ серуг ік сив В Кві плутають я тує о р ужи и акт

ПЩМТХЛЕАТОХ М сраютеааитим УСИК дат ет Жов ина ду КТК лу ХНИ су Юкка ро де у гукрмиих прнии В МВ орі рик р цл

СТАТКИ Інф и щомаа азс савима сзазЗзчцаасо касет сотих тис дреди ет Я ск Коток пи м пед внчи я сек о ккд ху іо

ПДК М КОКИКУ ВМ С МОВ СЕТ у МІК АТІКА, ЖЖ ожех Дою ИНА М и пут а ки ри и мо СКик мини Коти пт се урну Ка пу щік их ат си тод БАКА п КТК УМ КК ЛА КЕТІ МУКУ ДУ КА ХУ ЗМО и нн и НК НН и и х ді

ВУД рН пз осссунме Зоб отаик о у руно ПМК ТОЮ ПОДЯКУ ВІЗКИ довлуєкв міх мах Кіа куме пеки пиво лі і СМОМ І К о УК загасання алко лено сова о вовазавави спсозикІйЕа хи

ОН ля шах ВІ щолкмулис ммоль ММ Ми ин НН НН в НН НК ах ваойполсаасв Збевесдстанс вояки Овес еоМ Зв кцю смеаиеках ОК пудів КК елудлютчх сек фі сх давати Мих м КИ или кт захазиапсаа КЕ азащ влив зе Коц ППЗ ЩаЯЮМ СКМ по «оди фс у Ки КЕ вудки пк сві КВ ОК М Кор ДК 51315

УЕИХАКЛЮЮТМ ХОДИ УС УПМ ВИКУ ЗЛЕ ЗЕ За п

АН и ОА ЧА САУ КД доми ий худа и мА и ІМ ВІКА ко Ду ик им чи шт; сити приво ХИЯ о ул лет Саме Ки ВЕС дехто ТМ й

ОМБеЦЕ Іо Мекки сти іт ої ці білим віщі поши сита Такси. с ТОРТИ ХЛ ті. ОБОМА. ха камКакх шш химери ма що узи стели Кущ. ехо в Кк ую. ик пл

Кс Ка чими лева списана Во пе стю д

ЖЕ й «Ту цтнї

КД ших ги шт дк ОМ ил при тя дачу шк 0 БМ УМа ІиМ аю вики ХУ хядіий обтхєем о Тік Же Ж Млодо Жах Тихе філ фо Мою Млу Мою ла їй АЛ

ЕОМ у В Оощу ку ТО АЛЕ Кі МИВЕ ХИЖИ АМВУ Ж ОКА К жар ну хи о а. о х « зв СЯ я - я. ж тка кю ХЕ дю Юр Ту Ж жіж Мих ут фею у Жех Жошхл Тихе ДЖ ох ужеу їх

МЖК ЖИВ ЖК лІ аа лижах сх ща ХМ АЕТЮ АЖ дви Деу ЗБК М ху тег; ря их ші КЕ КН м «5 - гоже т. с. Ку реж й А І. жи. Кан їх з коми оту УА ох кУшх М їжі Мам тек суши Мк 01 паж Ім Дом МЛ ху ої пі тк та ВОМ ох як НЕ ДЖЕ ж Му АК АШЖАО МІ ЛЬ Ж Ку МмшЕОЕУМИ ух дих вам От

Пр пт ср пох Би Кг

Фах ним тими З и Хо иву дак І Мн ТЛ Мн С Ж Товжує МЛК ока их і й за зі ВВЕ ОКО Ма ше ПАК У ЗУБК А КК ХМ КІН

Вау У її дошок п ють Боби МЕ Же одитуї дкщої ри. їмщи Ж су і ДМ аш, Сеат Ку

В ХАІ Ж І; ев СК жк жа вл СКК Ущ Міша см Ти ДО ПОВЕ

Гая ух хх, пот пе її 5 й

У т ник ши

Ч3 є бах б їкмі Дж Ба їм Меж бе й Вів їв Ббеа ду ЖЕ щі»

ТЛО ХКИІА дж ЯМ МК Те БМК БМУМХО У Мат ма оУВ ж ш ЛАК СБК о ша ре с п

Хо У З ве «сне Тих зх їх п м КУН 15 Жохжао пху. ЛО, ТУ. Вуд я, Ух. дк с

Миш щує хх зх дах І А хіх хижої гу 3 яко УТ з ЖЕ ще Дер оМуВ дев ші бли Був мів Бе жук сів слав тТУуК СЕ Сів ма зх яти як пи ТТ ТЗ ме АХ ух о ши и о А а о АН о А и НН ЧАН ЖЖ ох Міо: вав УК бр Ме: ін; ВЕше щіш У Ба ех Се ві їм ев мав Тих духу пожкті тв

ОХ ККУ ЗИМ шочох . м У х кл Я Фолекі К о у шо «ц яю ж яко Же Вк п ФМ баші Ал що йо й аю скл І хх СЕ дх ух Тк

ХХ Оу ке с БІБ Бе схов студ СУПІ ЖК тека м хи ОКОМ СА ОКУ лож сх з ат тот род З жо АХ А тот Мозем о ли й є бух (і зум да «іх: лани ЕМО Чим, Сп х мою ши у

МшиОЖЖК АЖ АЮ ЖК ЩА У БЖ МК бю У КЕ же ШК ж Ж УК М Х хх КВ й ж фло ж Ех ях мМ вже АВ хз вм Хо їз Ух ух т ях пуд ги: Ух М шо дви тА ХО Жид Жуан ду вшм зум ж ме М баАшж Ма ОК им ДЖ КІ ЗАМ ж Біне жшЖКЖУ ях вч с пл

МЕМ їли В т «75 мо т я їх ж я мит Ж Уч х х - п дію Щі лахую Міка шо Жук ді шу ЖЖЛетю Ті х у окт им ую о Млт

АЖ МУ межа юшх УА ХМУХ муш иа їхеУ Су Спб хо ж КЖЖ КУМ МІК 1ц зав зда ів М Кл

Дю ФІЛ Мих: Узіж у. хх ТУ: МЛК сх ТУ ах ми. о дк КАН кни УТ зх хх Та. и Те я

ЖЖ хг ХтЖ жа щбшх ша Ома Аж гум мах дат КК жу вав о КхФо мих

КЕ В: х ут сричих сб їх ж ТЕ

ТАЖ жі йон дану КО ЖАмш Ко гла игу Оу ЖИ Ж тем ак їм Мою вк

УА ша дар ою іх им тА і сіє ХО А гОЗНИ ЖК У а ЖНА УЖ К ХК У

Скот ре рами хи ее шу дод хи би ШКИМ їТ1 хе Міг сб їжа мак ЗИ ах «пас бахаї Км Жук що їм

АЖ УРА КОТ ЖТКВ САУ мА ЗМ мам Юм бу ММ лУВтВ ЗХ жу МО хх стату лю уд хе ху жи ЖюЖКМ чена ни но чн а ан и о НН в нн НН о НН НО Я

Св мів ех жі ЛІС Бі АЛ ТШХ фей Ал ХОЛ Ж БУК пуд ОмЖш

Зх: тк гркх, хдЕ хг ЕК,

ХОМ «ЛИ ЛуМх я я я тт ш : - ха у я кі г лях жу тх Му СА м ТАТУ Зк. ання о а З НН ен У У НК ід тТше пи ж Ук) ПІ Бей Нв оЗеах Бе СУ ж пору м БІД ОЖьУ МВ клю «ді ки Жх

Що МИ КУ

Фриз Лют. Пошхує оз ДК пе шля А Ж х оажу хеах Боаих ТАТ М у жил ОКУ пух ЗУБ о ЖкА Ма БХЩ ТІ Ж КмАщ ММ ЖУК хЖИХ МОУ СХ жа як Зал з хшОЄТ ЖИМ. ХМ чім щім ЗРК й блю Шк. риє зв 05 Дац ім бл що ще ді тла цлів о Бум ші Ем СКК Та р мах (аю й ім їі о мМши Аа та ік яв шу що а ьо ан о нн не НН а НН ШК В в НЕО ЧАН дв мал ба жфже ля фе сда ЖЖ Жук ою же тТвж ШАХ БМВ ла ля

З тк ах ж

ХХ 7 Зі ЗшИ пе Лю фієу как Мід Жар КО хх Ток Лбоіфх о тТатхи ує отТоаддт си ЧЕщо пак ЛИВОЮ фот пи пали Учх бло Ліс Бк мує б слткю

Зак о жню БЕ МБ Кие Ме Ме ше вх Му бАФ Суш аж Беніожху Ух сук зх яв йМмх МОЯ УК яжзимо кл ле пн А п А А и ЧИ о АНА НЯ хм о Жук УЛрдх сук лою їй ж рлк Жди юки лю бах Да Хм ух

Буш жмат мах пФ М МЮУ Не МР ЇМ МЕМ КОФ їх ус су СКУ

УА а Ел

Ас хх КУ логії ху мч Кіл бах урану іш дух ШУ, Ж ніх рух Ден. СЕ: у сам жк Ми тА шЖшО ЕЕ Кл УНІ мух і їхали шив рух у хх їх

Зак се, пог ваш Яви и ее и нн З НН кН фодяазчи МЕ дж му их пе Ач х ом зх ту Кіш фр блю бони Ді: їх шоОТЬмостех Ат; лу їні Ес 2 УЖ

У Між му Мб СУ ма їжа МІ Опов ТЕ й МОМЕЩ о ану Ха

То БЖ щи дих Міс Чем Хі Ада лк я прі АК жах ЦИ аянту ХК Ухі дош муж мАФ ТИ «КОХА ТЕО КАУ см бек са АХ ЩА ЖЕ ЖІКЛ ММ ОО

Бач т Кк ди

ЛКДІЙ ЗО ПУ ІМ дю літе ха гу дам я Лю А ДЮ Ша Хо іх дю; ЛуУдуя пШУрат бли учи Ман

МЕЖ о жшАШ СІ Ма АВТ УФХ від Мек ех лів МУ ЖІ сі СКИЕх іже МЖК дит як іх

ЖІМХ ЖАХ алу

Хосюкамо Хоютик. ЖК є дух ща ші у Ж Ілля Зх С Км ЗІ тліє бач тТлумо

ОАЕ ДМШ БЕ ЛЯ М ТМКж сш КуУ Вр ХО АХЖ ОЛЛА БУЖХ МАМ ЖК ШИМКО му жк

ТА Яся: ДОК

Ма чо ЛЕ пихх щожіх Маре (Лаз Іа балах. ку ін Ж ох Пан Та р: То ах стоаия С Док

ШТ БАК: УБІР ЖхІЛА ху ЛЬ КІТ ФУКО ЕМ МУЛ ТАКЖЕ БИ сема УМ ЖК ах аг ак хо ЗУ Пух ок сжтююк Ж ТМ кін ХХ ухує СА ши ШУ тм ж юю Тра дм СМУєюу Со Мах и ха

ЩЕ уєш чив им Кг ще зма ам Зщж ої М ше ЖЕ А ж лаку ці дл т хе хм ЛУ

Же тлі дю іх дулі оду М хх у шу у ти о Кашу Ж. М тіше Сток їх що ме 55 1ощо 0 дл. ЖИ р М у З у бЗку. ху Ту М Міг у Мк ваш ж аа ля маш скоса пав ще ПЕ дао ха Ме емо ешодеИ в п ких ак ж

БЕ. ЕВ 15 В я щи Вл Її тк ЕМ биту М дю Се їх яких ких Чхж Же у дю пк

ТКА ОДУ ОК Ме ве Б Нів дае Же Бо Же ТВ б ш ом ах ух хх 5 ак зм кю ох Как Струм ВОК ік орех кцх КМух ба: ХА хе Фх жі жи

Мо пк у МК тк Жах 1 теж Шк ЮБух БШкт: га лх ож МІК Е ік кт їчЕ ук и Ме бе жна шій ех Мне бе Бк бів бар) шек ЛІ ах я ОТ тт жо ХЕХКТІ ТАМ

Фо век жу бюкуу Кут лю іх фу са Та 0; жу дю Со ул до фо ло

ММ ЇВ жа ЖК КК хАЛИ Ж КО ЛАК р ЗУ хи СКК НВ МУ г зх п поко дл що щи НЯ

АХ КЗ ХпЖУ ак сь пПшхх В УНК Ким. ля ся. Хе ше - г. Ко . ч Я У я ок хх а ч с

Та УЖ пу В дух що сек сп жру Маю б «ах ода шк ану суки тах Кв

КАЖЕ СИЛ КЕЖКЕ ВО АК хи Юм хе АЛЬ МРТ ме А жо меж хи АХ ва ще вав

ЗУ ЩО уд у ЦЮ Мах Машу Ми ЗК у ЛИ ку бах Мох ст Ай Ту ож хх ма АК ДУ Ж БА БМ Ж МАЗОК ММВІМ МК. ТЕЩА КАМ КУ РОКІВ

КК, шу НЯ щи

НЯ ен ННЯ Кт

Кене» шк ши УЖЕ с ле фату ЖЖ ху фо Ж Мак ме Ме єю ех Ж лу ораю усі ДЖ Жумолює Мед шва ж ЯМИ б У КНУ З: ЗУ ХХ ОСАЮ схе: АХА ОАЩЕ ЛВ МщЩ МЮХОВХУ дош діт пек зи М Я шрх во лі ЕМ тех ж хо зло ж о 5 ск: щі х - йо ші і уві щіхе іш йод Ма що лю бр Чу Я що Мав сля

ВМО А їж , и ен о вн п в о В М І З а МЕ КН З З МОУ

Я пог пе

СН КО щи еще ШИШКУ

ХУ :

Ех цщид мкг ух «ОТИХ п

КУ ІМТ УХ ге ту - що з «ЛЕ у ня т ТИ Міссотааава Єдекш

«аа т тп бидерлвтхи сценах зезпасае» ппаяпанщктю зак еукинех їй тЕхвукісаке Євсвоватсо сасзавсозео штам КаУх хашещкКюма шик клаю їх чик списа ваи соска УКоввстаїих КЛ МИХ КИ ї85 ком ях БК м КК дю ВДВ Кок го ЦИ ЕК МТ І

КАМИ ЮМК КЕКВ ЗУШАИКККаКК ДЕК АУЄМУ ЕН ЦУВ ММ ВК ХУТОКНА КЛ КУ хчолаксаває вкбоахче чеше ствекоако касове Вацааворая У заазазактв садоштсках зскавЗсасе авааооукавеа ваасвавава зона ВО пишні зла вок папселадаши поеми се Ба шт вати м Фу уг мошки ВИБаКОМПЕаЄ Ки 2Во овБсхакаека Кесаассека Фати КОКО ВК сзаскавеає ее БЯс скоаеекертх сакттжн Кекедово сиссваякі хокававака асжолеката ши зквахастнох зазна вас еша чем МаКиКЕКаоВ шашка Бо сфмасояих система фати фот ззааскузвак ази но ТЕ сткчтпелутоє паче а Мповачама бесзазоете асжеккавих ваовасазеє ве задравтитат семахацеза авусавоваєс баавдскжа дела шинок БЕУ цім жі шаг тек іже «погли. по КК. дует цих 4

ХРМЛІ ДН ЕКНАЮ щу А ПОМ Ка І ЖИ тя ЗІ ИМИ КН ТКИИ ВКМ ТИХІ КИ УДК ТД завакаканя ера шов ліве Уа ОК ВКМ Ед зкавтавкхих сисхсувою еФфиовенсиВ повік М кесосоува пасе пло хсикаканоче Факс осев ствола зчакосомав оавивис космос а Ов звук Енстст тазик зайваєастяє каска єкам сЗвекозахах палававкКЕк МО пасната Ко Факт стаєш смисл аанн ВЕК осами ФК їжпай

КЕсВилОИ Сичов ворс асас Звсвболентсов зас шави МЕС ТИчУВА ІЛ

Ззаду сага я еле сх стати ПОГОНИ Клея вих Іво

Чишеситкмя акшшекаке кдяюетев см то фас оює спеиааКЕ ТАБ аавактусозая как НОМ х ВЗ Емова Купе иа кими 0 «нимовахех чкЕвкслях захавоюва засл вела коа аква МУ скиди тмва сезсккзаве спекла сза щевлеавииє побоеалоа сваха Не стопах пазсвІМиних паеалаациє Машисбласеика мошок Вип НЕ вості заптевавшко хво нлесв века шко асМ ВОНО ТБ ч«коазксгьЕ савани кх спбздслазава пепесадлайа сити зкашлвиває МТА свсакткакас всвЕУккаха чаті мава аштажІеей шевлиталою шлоКеаи МН бокове озскооцев поазйЗксза пвевамейза атшеновиову свавекокех. ї8во даслазавай засосахиче пасив пев ака шоссе переве х івжо шодо дир змов Віт мів мохом вве пір мкддите зно пил маз зобу тьася сти айата силах ТКУ УКУМ сидВюувих маша полем тб прп Ж м что ВИ Ммаціі де рамку тлу ДВ дІТЛал ЛВ БІЛА нд т масам хм КОМУ ТМХ шк русских міх мом томі м тт м меми КІкщій серії ВІК поло

ККД х Ка чеше кс е весхсЄковюй што такоМ вує х. АХ прик мч му. ми дужок Кф сим АК ді от Ую КФК дреди ди

ИН КК МИХ БЖ уже Лема ОК ТИМ ТЛ КЛІК МАКУХУ АОМ хакі мі фу о муч пишемо но седазйк оса т спи Би люлютухі

Ваши ККУ УХА КЛИЧЕ ЛЬУЛОКИЯ. КАК КМИНАТИЙ СКАЖУТЬ «уку гадащент васала ва позахсадла сказав мх загс гайда и ПК

Кал тнАмі. щас сип асх Ул АМС ТО Хату ких удвічі ит о узи од ЖИВ В Кути КУМ Тк скелі Км мли В щоиод Я ВОМ лам ра У шили сядь и асан рум вахту сама мех ОК МК КИ к. «и ачикекалтк тела каста вк казевойа Клас саешалоихи спр цемї пед ашишуткаУкх потщшЧчееаска сксозєов БАС сто спалити ЯМИ пн НН Нв НК А ОНА КН зав "зУзавгатам азс иа ВОМ иКУ форластаимиа суку Буша усих хо

ІЩУК К ОД І и ХИТ КУ ях КД цях. МТУ ТАКТУ КАХ ди кий щоки Бу р Но в о НА КУ петлю ви ОО міхуром п

Сет уМкВ «МАТИ ТИ сли коле миня ХЕ Аа я жл. зале зЕзакх ММК пуд кіс ща скл кіики Борова Кепхдовавитю морачавих МН палату ТОК ти м ВИМ парою топом кер ВАХ кН ядтнд світове я ур мив. Кри ков хр піт сю Ку сту о, ЗИ татлазтїлакт деагнамо пс слозакивавоа сипсаштеовсш аомепвиават соц ювке йо докт оо біфідо Кору и прик ди До ти УА

ХЕ ЯКЕ КЕ чиасмеакик пси совок хЕХИВ ВК Вк ія АК акво сан фу ин що рити и и пф БІД М их сковувати фати ДОЮ си пу ТИЕ СЕ сира тою роса ВАМИ тла диву щаМ Малих орла лах хо «витягти піл десант «сил шлиаи вивих стта шатавакаи ше сивою и и узами ую ги Укр М и ших стиму вони ді тре. ОБ оману сЕбран их ОЕМ соми Фа Кк хи джу ціІКІКтг КВ меми св таз ром вемтеуе дав мозок Кім вокдюд у, Заг зІкславакаав ККУ пас псехих Земле ва иа Мер х зо ві ківш сл скид, сш хви ВЕЖ атичу діти дю Ер аюж а мват мо ау хижа ФЕМ ВОМ с ЖКУ УЛ МИ спра в м кажи пер омюю ів кеВ мутмо ВФноюцжімиьо фодо нити трутнів тут злод зацікав спи аксони плані мио вацилавиша папа Ва: судоми іо дує шою дух РИ уявив Мову охо; МД ЮК Дю пр и и УКХ зх раадживжнАтол азс пе омАя ТС ФАО шШЛТОВТИМНХ ЗЛА ТЛУМИАХ. ЗМО пресхуми ки межові х етері БтцжмІхмот МЛК Ку ие при аксмалато ВЕЖ ПКМУ У АНОМИ То ХОМА АК Ж БАКИ КК пек УА чужім мук ка Міг емиу слш МдІ Ме ОМ М КМ КИМ МИ ЕК кни. ил мих пеки уую карав асою сорта кл юшка ва «ен К машеваьа вежами. мамам вуж сценами тр сих міжн фикод ве спри дл застав асоксопслУукех овоч зас емах Зевса мое ЗИМУ ее в НН НК НИ НН я спалугу

МКМ рас КЕ ДІДЕНКО КМ М ще СЕ лЛу тика ТИХ ДЕМКІВ, Лю. ен нн ни НА и НН лок апхчшикат равспсвозу шостою Мем осух чисашци иа по ще кісти ВОК Кл ує ие БМ тв стрку ки КиЮМ іх скучив ОМВК прах зим шештеаєт сс при менеа слмущслля лопух дУумКе

Ек ХМ іумиую и дУудрк при п гу суєт туту ю ризи Ж КИ ук я Коти ЧАТ кла асрАатО Фо лаают ФВ Стат ТОК І ЕІ УК пн и НН НН З.

МОХУ КМ ЙКЕУиИИ УЛ ЯМА Хорта МД УКІЦ ЛУКОМ ОКІ М ДУ ера в Мр іххрвих КоеК дщцц ев р ожр сущим сук ери прЕсвоєиттья пЕтеЕтуту вс ще Кхсопавухит зазазекеле пиЗсаласал запас вуих ще ух М спеки дащек Бізе и мою ВК Е ха ск тар смеих сумо дьухиту Боже М сютіуту чеки кавтт щсотпслодзео кизеоазасло зо зрасовии лавою сет У «прут ізистугію сісти ам пи вину може рія пат кт чт де куми ен зе Уни тХтуч шими арт л ий ЛлІх ут ПД те рим сихле ек шило тм ЛКК и нн НН НН НН в Ку СНИ стаз зипавосавт зола сшптлактщ тлимау хх цу сЕДЛІ У ІКТуУ

СО ЗУ ящика пасинки пу Еидш слав Если а кляр дети сий бабака Мосазавеле кМевачатяє вас каекая 40хо сакевесчка Викл онума Єву комуть «арвіллцфам се МЕХ ЗМК Е Ко о сивини квах взаважкощя вас ивновс сша мокко ааа скали за

КІВ КАФ, ВИРОК ФРІ аНитх ОЗОН: пюЗКУМЕМу ОЗ тінню бедеулаиа мова тена серавоандих флазменамк сет ТАКО ик скихех Косквзокаав асолповесв Бетон сором зажимами хи как гмаим Мекки ки тою бурю ціеї ие оре шк Ию Я Дт кут СКАН пузкууавали ЗВО ша МУКУ умисне т мете КМ пЕИМІАВОВВ СК Тоа бсовавсжека вассаешкох ВУСА шисНОВКеННу о порах: завітав ОКей зак Мк кове АйевНМ сила ЩІ зазшайцох слушна КОуБслведесо Казвтзаваесв сацеФбуєсвай тич юкех шяу секс ЕКО Зла зи иве кКДАТяКАК пунк ре попа авбсецене кра и авооаювіаа засо та стано ФЕНО шополмимнуУ севазтеаснн азот оюта сови паси шок КВК ЕЕ чази:вавсовцаї шовусваєах р ах вкмломьотоко савани супах ВН скоцвоаскосв зКесосаном аочасовоавал сисваскшна СВІД шик НХ зак кекс век певен оюв скваасаеяв Бона втсцацяе меш ре здадіоекев дав лонню; зпсмиЗеюя сороссиаваа дисонанс шпака екх. ке псекжекак Коса какао застава КЕН КО Мем к ВЕУ зсзахакатх сеЕсовсюо сплав пиво отах ока ВВЕ ОО соні васала сопе яате пусчному сгппавлааних совка УКВ

Зоя ков им МЕ тожоскаося севаквЕмни пове пенах ЗАЙ асзшкЕцеко соасочевсває джек азам само аза ВЕК шило сиасазазаз сасасхтовзає стспеачкжкт сесеаотеко актавкусвка здат аюх 40

Фезавоаии сеанс вас вузли селовекка саке о завесловци птоз Чем свавочау сов ания ЕСЕ сПОСЮ мона що «авствидеии воЗссмващеа шоловивцшх се УЄЮ ЗашВИПсоФфІ МСА ВагО вооаттстат Каса ог сзасоу дтесскостка каша аких Камо ва «кзавассста казав кісок зас кавао зКасаешиих бавочаковав аж заштавсвлос зсгрбосско пасками БеЕщоєеаЕ БОБИ шал встя УЮ кам ша каєи попа пава сеи паза сен ТВО павсваєвлло чаветеситу зозтодомоас какенуусоа паханстосва пгожшкуаее АВІО позіхає чвизовоака асрашаевох завовзсля зоба тслата во ошажц ВЗ

НА а НК ази

ТЕХ Ю Я ОиЦ ЗКУ КМТ СК ВІМКЕ ИИ А ниж «Ж ц

ЕН я

Ой п:

МУЖИК ХК еле жх НЯ «шхИЖО ОЖКУ

Кен Я чин п че «є«пале смавуканма кафмася сто ї

КАМ їх вади Ср кажан ану и ки Ук даму тим Жов тат СБ іх шу. Піх

ЖМЖХ АТАТ Ам зу ви МАМУ М УАМТ МАКОМ АТАЮ ТЕ З ЖАЛЬ пхд 4 « та хх й В Не хх йобах Доц ки ке Тим В д. ща пп хмх лює жахи М фл ТІМ дозу. ЛЮ Піх щеож пев па ЖЖХ БецпроАзлю На ув вка МН ла А Де БО Мр КО Те

Зк ту, Я ке хуй У

Сука на кв В НН АННА ек я ВК дж Ж Ар оба Жео їв Бе Ба СУ баз БУ Живх ЖЕО МІ ай Жех ту ах г

Ко Тулх Ки стю. дюмУє шия її З тах свахи 115 251. том Хе Лдодиму ЛК ЕМ МУ тег

У ВАЛ УЮ МАХ ДВО КшО В МАВ ОАц КВ дУЖИ ке пий їдУф Ма о БЕх дк «х ще

ЩІ : г ле ЮЛ ех бод Ім фо фе ому СГіх мо ї3 р жмут й бук Мі ТУ глум

Вт НА я Мошо г ке шх З от фу БиЖХ Бо сбуй вам ха Ве ліш Но тим

Ух Тло тк Ко то р НЕ МИХ того Хрін спе й ТЕХ джек пвх Ал ще ЖЕО те Ме ду тт У

ЖХ лі Ол УЖЕ ЖЖ ПІВ Ажо Бе Узі Вр Ме пе АЖ СЮ» МаХ ОБІНа

Св ЗИ У ших ЗУКІх ЗМ ТО тм Фк ми Ве даху Мати; ин Ум: ух дО у дл ак отлФ ах МИ Меу АБЕ ОХАХ ЛЕ ОЗ ШТ (МУ лаМт БИИ Ліс Ай УК як хе са : І 45

Ах МІ Ал ее ин нн в НН В АН В В А ЧН

У Ну НЕ Ук зобож тлі іо Мені УР Ти кт їх

ТУДИ ФЛАЛВО МАШО ША М шу Ж ЖИ М СХ ха КУ ЖЖ емо мА УМО ОАУ

У зт лих дл уко А

Фідія і уу т шах пф фИт тихам сту Ух, т шу Ж, хо тих ТИ пек Жах ска Ха ек меж с ій фо Фу бо ДЕ БУХ дек УЖ шА

ЗУ хв ПАЛІ під т ди їх т -4 «а : Ж т - г - - піхов слі: І р. фу лм: дл Ма соди суки Жуки тохущо уки Пе

Ж ща чан УА ЕДУ ЕУЖО кс Фу СМ ди) ХУ лам ж муть МІ ую п тля зх вч

ДТ ІТИ МИСУ КУ

МИТІ в. ТІ Шксж у Тс Зник Ту Жити Туя ух, 25 «аа ТЛ ЩО хіх му ру іш ШОК ух. у Тит Хеджу тичия Уіух томи КЗ поши и ЛГ хіх (р Мт мож ММ ЛУК ФУКО АК БЦ ІК ЖАТЬ ХЕ КІТЮИ ж сп Аль МК мк КО ща Зх Зв

Мщшл Мо КМ г х - - Я - с ст х хх хх ях сх щк «А

Мсзм Ж ут паж безе Дж т щі та Деу бук Ві що Лех (14; ЛИ їз

ШИ АВ ОКХ САМ ЇХ КОЖ їш а ше АЮ ОО КУЖОМ Ж КОТИ ОК МОЛЬ ХЮ Лу сх х цк, джу хх цк Ох жо «ЛІ ХХ ХХ жд сту стояу Мак Куй Мішек о ббб:о ема ЛА Зк. МЕ Фу МІ. тек Жду, ЖК

ОА ЗАМ ЗМО КК ДАХ, Беж ТК хх ром Ева ЖК Б Ж же м да МУ з сл тЕгЕК,

М ЖУХх ше Х

Ж. Я У у пт - сх. Її. зи ЖАХ М ІХ. си шк Ух вУш Пси Жук хх ї їх

Фо пух шо бурж Жехат ЩІ їн А АТЗ Бех ил тк Мі вода Ту ск пд ММ ЖИ ХУМЕ УЛ И ОА О ешдо Жева ой щеаж сет К ж Вас У Ян як «ча ве я ФА хи ва ті у Маю ти Мах А тлу Їх пику Лтх А м ІТ о лову і риє ТІК

ММ ХК Х ме АВК ЯМИ ІхАЛЬ ку ШО ХМ СУ В щх ХУ ЖУЛЯ ХММУХ АЖАХЬ МИХ КИ МОЖЕ сек, ТИ люк т Ух

КК хм ПЕ АХ их с, «сх. с ЖЕ У ч пУТ ст г ТЕ. м. сх о т У т. о. ун Бон с я тк У тт ЖЕО ЕХ ху ит УТ їла рю ее Жду тлу У Ах ла щих т Ка

Ж УТА ХМ ежМК А ж и ЖЕ МОЮ ІнВМ МУ МА ОК ЯМКХК іїхАМ УТА км УМ. рено в ш- щих полою Вам ум у тут КЕ де як Мох шах Мт ут ДЖ Мі ДМ, їх ЩхяЮ ям

Же В ши ДИМ Хе Уу ДЛ жа МЛЛХ Ж їх ща: ТО РК БЖ СССТЮМ Ок їх схожа сюди утри

Я вх ТЕ ше хх ку х ок а БУ ха зво Кт х скАСМО ВУ ж «їх ве я п хо ТК зе Дату 1 дз ЖІ дк жа Жах ую Мао жу У я дх Жеуу

МКК ЗК ва УЮ ВАМ аю Е ке УМ НК в я В ІА ЗМК о В ЯК В ВК Я укОЖ УК уки «п ткгх ве

Зх т. ак ко пом КВУ божа а Жах вро рію ох хан их Ку му: Мих ТО ок шу ЄМ те щшав і КУ Тв: У УНН іа дю Ку вом: Кгх уж Оу ХУ ЇМ У шк шк шо КВ жВЕ КА МДЕ ДЕ БЖ ЖАХ ЕФ Ме Жля кед Ме ях же сту тую аж

Те ЯКО ж нео о З а ен СНО Ки Мр Жодам Сх ен я маже о Ек я т х

Ууш Тл ти дам би У ех Тон ж Мо Зв жлею Мал ФУ МТФ ї гоже ашш ав му ох зе Ах ча вуж о МеК уУва ж схе ша ша СКУ ЗЕ хутуву БК щі й поли ту М З а «АЙХХ Ви ЯИл пі ан ин ин АН НН жиє пихи сш м чі ж шузеди. Ж ших

З Тл бах Крем Ел Ж хи бо Жорвіх бра Тл; ЗІЗ хі їн В рт Жде Ж р

МЕ ХМК М жі ау су ЖЕК НКУ Х БК ТА Бу лк КИ МАЕ лУМХ че вк сук

ЗЕ БаБУМ зах

Ух овжк ямі секр. пк п я шт ж ак 5 х У з у

Та. л ія 1 ож Стр ф34 3 кує Ін ля до ги Ів ом ід пев. Мк: А у жав шам Же Ніж Те осів За Сея ів буз 5 Бек із їм Ві сп ж ду зу

ХК їх о у У а хї ху ої «тк 2 що те я т их

Зо гу с пах я 3, Ат То у ко бю таку: ФЛ шт гу тре йве Сбюв би ет ів вав ста Але ТВЖ дех лів жЕЮ ОБ бмх ух би лоту р

ЛУ КУ п

ТТ дн. ХІІ жи Мао СХ яю жу о Лю мам КК Фе ОТ км М аю Ммаь о ух

Гоа кН Я Бо Кт їд. ее м ХМ ЕТМит а КАТ да ФК ЖАКА. МОЛІ

З в: ВЕН п Три жу оз жд пи, У. Ж. жах ге йо ЄХложе Лях оумх. бух Їх шою кшЖер о ОаАЮ ВЖУу ую Бех ААУ Пів де мом оку Беж БИ КА зв З Зх зщ х ще Який А Ж Тож т, т І М. Хе тини М НА БУ Де учих РОК пошу хх ее їні МК їдкі що М пе Млин жу ща бю о би муз тТжм о УФА фер жа БУ МЬа ств БЕ АОВ о їзкМм хх о М Ух а пт ло ик

ТЕ, НИ за пек Жук Бета йти Сфашує уж ує су ФП тик ач и логу Ж Мі жу є ун ж Кеш Ба ло Мем о хуХ ко пам Був ЛЮ с ге НО МО СКУ УВА за Как Щ

М ХО У ЛИ мкл бів смрюю Первржу Кок ще ГУК Тахо бо дл в вм з т п г хх СК О ЖНАДО ЖЕ ЖАХ Ж АЛ МЖК де АК УКХ ОМУДОВЬ їв а МА Ж ки к, ОК аа

ТУ ЛЕХУ м Ул жк о Жоїк: алею фу Дек том ха дія лихе Ма сплю фе ки щі ди ьо

ХХ ую Мих Мех Мб ем дат й ак Бім од Бе БЕ Був Ва ТЬх й же як

ЗБЕ 3 ЕЕ ях бури СП жо ду Ж мо паю Мі Пеую й Можу Ха ФфФКам тах фер Ко

Ж УК КАМ УЖш АХ БВ УЖ ух ЖК КО МА маш ю Ве па дко Єх гук Мч вх їх

ХХ чи І я тУчах бром ба» й бе Мі вою Жваю фр хв Жідету їд34х (3, бе Мак

МАЛОЖЕ їхМгО я БЖ Ми АМКУ МаНА КлАКБо же жи МАУ Ам ЖЕ КО док дич хр з

КЗ Ту аг а дз 5

ПОобох у ию Пх ПТя Жожшях. 21-х Ко ТЯ бачу м ло ек ММ Пи й у щушонх Км ока 1уУх Мі: Ті СЛ ОтЕ може міф ЕЛ Ж МУК АВГ чай суд ща вояк ЛК ВУ

Ти Зтистут Мох Зх ре (А му ач М що ря ду тож сфихах Хід

ЯЖНЬ дим Аж ух ЕЕ їхУуУ чу Ма Мід ІЯшО СБУ А МЕЖ КЕЖИа шк ОМ пах мох моде

Ті у гу в

ПА ех Ве

Ук Тсзх. В Я шко дк Тиск ВАН о не «Є. Ти жо пед о НН дих ху М шо там ТЕО Му Тл ям о йшм па бюд Тай дкх я пору

КУ БЮ БО лож о шм ШО ТЮ хщд хи НИ Саш ММ ж ОМ БЕЖ кл х км кожух шк

ГУ Ол шо

Як ле ПІ

Таж лах Щщмтх ще щих сйомаж МК іх стру дж ПЛ Малу дух До МИХ ак ОК УЖ ЯМІ ХМ ЖХ їКл М жах су Ж М ЕК ХМ ФАО А пот ше тях пе прах п туї Зал

Ко ака МУ ва ти ВЕ Хр Ди ді їди ЖЕ Лів дхш Б

БЖ сша В хяхих піл «ВАшШе ЦИХ «І Крсосаяти КЕДИ

ПК

ЖК чих дає деакоке аВЖШа ЗАШОТЕр. КІНО

ХО Ж ОЯЖлю: Хо у с, ОВО В

ХИТ

СІ ші бювшная єИйЕ» ТБаЗУБК; ВАХ «ЕЯВМ поднлиє ОМ ду пу рода х

КИ

ЯМАХ вище Кеш

Файов ів. ВА «ШО Же ол джлиф сек ж, сх ово В «ЛИ и фрахт, ЖеВТлХх «ЕЕ трата. ІВ К) «ЖИВУ ложу спефбою б, т, фо их ка мах Каавцяє «ЕДЕМ фшЦОЇВРЕ,, ЗО «ТИХ й деивш соб шу шу щрОВШО ї «вп ассесоуа шастиасене Его акоуйвеавой сблаувюже зов Б дотясномає тт т ДЕК ХВ фЕКЯКксиКо Корали кидав У 12й певен риВ фусакововх солевкосає ЗеоанЕЬіо біоваквх Зкоашнеб т що хотехвЕста соус ПИСКяЕВУТХ цураевтлюх? вассоезои ства те авхїститих хфавсскство зазКаєчкста сашисзакее сопе отут у зп стае Бокова фот селеспова зош птоккваааа АБО нд туцувчях пр Ком Бору оцту сили чи в Ву під Мф суши я

ТАКУ ТЕ пРІІМИН МЛН Ух т МАУ КАМ ТМ ТИХ КН ХМК ТЖлУЮМУ ДМ її їм поемі стат тихими сен вежу пожиеИиІМ ЯдІї

АК рамою сажа тлі друцачняутю т лу лрак мумей угии та и Но А па

Ке З УЛІКМЕИ КЛ сросяшиаиу паном мух ПИ КУ. ЕМО ря ЩІ ЕК М КАЖУ я кукі вх суки Ки ім ожкю стеми рр Ме В важит ж ВВ см Ера таклааеема зоре мекв Сай ОН МОНУ ВУ какає сере аих ре цатк щире ті ту жи ВИМ ер Код Ех

ЕК мВ Мут ЩИХ ККУ орних ТА УЖ кум коки дае ія мк стру д им уми пута укр их жи кіфивужин я ме ик уки дур и в и сглумч о юитА , дех т

ПДЕККТН ДТ ВАСІ МЕТКИ ККУ юни МВ Т. ТЕЖ. СИВА: КУ МИ пскдик у «рахує ііі щі один ск В ВІКажн їх Міо дн пед. мл ХХ ке НИ ПЕ СНАХ АЕС ВЯ іх ЕЕ ШАФКИ ХВЄ ХАШКХУВ ся щ ЛІК. МИТА ШІ ВК ТИ в ни НН НН и НК Фту яп х СИМ сіхравияиия; петлях вок скул МД

Биду:В пі сумці утІЮК. ЗК ри ФУ политі ЕЕ ИДЕ ВВ Щи ме муєщ Ні

БІДТЕК, ЗЛУ ТАКТУ ЩА Зло; КЛ ТВ ПИ ХАТКИ ПЛАТУ ТАМИ, мА віці ВЕ Кі Ялти ств им пі опіку Кит ФК дир. УА Бер З пиалАтМ ТМ Ос Толі ПИТАЮ туту ПИ УТМ шл ТОЇ Я х тю ХТО. щих ЗО СТАЖ КІ у ТУ ан НН В В НА ларзи лекси зага сани пра но тая лети МО пливи Ммодлмаии Комі тити пк люгюину гак ву отух ща ковим а пЗазанатик комткюваумои «лапа таса тисках лк дало

Я : вн я ля ккд сумо ми Руси сер тую ик рити КК т тай скповазцстх завчлевакац паста позалоелео апвсавазевиш МІЧНИХ КН ; . Я птучух нн НН А у тр семи КЕ СЕУ сис сива вам котру стоком ашоа М ТЕ ЖЕТЬ їі

Й гук дикими т ср вемуМоМ м поеми мм М Мо діви ти ех ІЕМ зала ксахта ЗбазоскмВ зузссавсля пасазашек Зола пас илсц ХЖТУМ : ; ; ; гаки пружин міч смуюичЕ осимі ето Комір св ещичиих сКЕК ск тази

Зк ие скл поко фрлцумаов Аа ому їй мимо в АРВККМ ВИМ щит СК срдуст дм Мр вими сх Кор НЕК зищизажиити ака еквам оре кофасьаитк бевшгашка шелак ЩхІаде кі виУє кава века ЖК М мМ ніІ МІ БЕК ИКК ОВ тд «тах иЕаекоах каМЕеКВКи зЗзЕСВЕХаІВ ЩО ВЕКаккаК свистка и ХМК, АВ

ЗМ Мох лк, Ки Мод им МО а котики КІМ ум Ки и КК изд ВИН зехвивжке КЕ КАМОКВ ВЕ ОсЛУВоМ АВК КЕлесааит шКБИСКОЕВ Али зими Кфемимче Кк вима пики Вк к ам спа звис Земан У вок вешках «овазазЗецк КАК ЛОТА ЗУ

КЕ Ер ух пиві ване ву хм УКаВЕВМ дупи ВК Кк Ал стики: зве: сас зано кеви козака а ШОН ЖЕКи ївхе о м Му их Мухи еум у. жд М В, Кури МУК УМ ри яму кети уиМ КОН мишам Дис уКх ФУ ЛОСЯ АЖ М п М. т Ох. те Х Сея мВ пу Ким ит німи Меч мів Мом см КВ кВ Іа лиеелус пасками засне ХхсосокОтоа всазосекаа спиш А ЖО ше мтимаз сеанс жктпеноивЕ зга ави авпВКВеквш сна НН

ЕЙКХІЦЕМУМІМ СИМ хе еВАю МдКмМ о ЕУ ОтОМкЕ ках МДУ КЕ ОДНЕ КУМ У АХ седан гищ пЕсувитии декхя смхЕ а соків хи Кок В зви лиж ИИ и ПЕК ЛЯЮТНХ авемлюлеса зе аливи пшона ща аКх ї1нпЕО кажкн кати КУБ Вивести ска миддщим КК Мен сих зал пЛЕЖСІІ МТД УЩИщКМІ ТЛ шив плеса аа АмхУ перу са Краси уд Мих ц Сливи М мех щ ща М КВК, і1хщим тимусу лає рати мли пос Мисик а МТУ

Умов КВК ютми Тими дифе еще Же мор МЕДІ

ЛЕМ МНИ МОТО М ТИХ ТЕЖ КА УО ДИ БИ КО ОКО ОО ХО хів СИ Кв хр ів В ех тв в руно жимі пе моде ву

ЗОВ иХ СХ ТИ ПЕТ ша КИТ КК а МІК МИИЧИТАдЕ ЛІ КНУ, ЕН ав он о На НН КН НН пет чссаанукс шахи косошасистя возом ОМВО тил еще ав щі дКожи ФК им М жом сх Мов пот порив и фею и г свлу

ВЕК сКщдахль: ща КОВИХ Зк ваво віки ТОКМАК ІМ паю юатти ває жор яиту тях КИМ МО ж жор и Р Кф и Деу дж, сУтУМОКу

МИ КАМИ М УКЛ КИХ КОЛА КЛОЗМ ОКХ ФК И У КТК ТУДИ УА ХМ ин нн НВ В НИ НЯ ох хо тату вммта Тл М селах ав «вази секс дове ки ОЗ сша сема само ожкь папці приво сеВаМ аю лаУ ок чешузашииь БЕвзссвомау всавувсока спека аа юшУШИКОК В яко порежвт ши аоразамециУ касова спра титкихмт слюмаиджмюихи ПЛОДИ о яви шетаниюо БЕКОН встав ороблаиатна МЕМ щемацию Бюро воие ян са итлеках ЗЕЗЕКч Зевса спов'левшє Кави смаувт песо Мвлих ПИ «шалЕКІКОВ ВО СТКаВЕк сптбсвсавоса авфклишкшйе сети беавовкя яд кота сізЕсзассо зазкисескх сщсекиоске воза ча Кале КаЯ ТИ тшхассовив зтаслакаке сішевкозех всвовссктва ока ВЕКЕУУКХ ШВИ сіна ех сут аи бод ио подтма ато са Мекки ЕВ засожковкл випаМевє бокс всовв спек свях Вапкалас ВЕУ дай сила с міпалаекина лк лавиаих спати широ анх и ЛОВ КЗ

ЕдЕЖКІщИх саодеавтви подо вспеЕцоае Фест во МКК. МБО котатанкає завсоксиєс сокнвосахай вк лвохеа скледааш ВМІВ дНИЮА 318 здазчиити вквазсвакт бзаєкусм вадтЕтЕкає посстния МКК Іво дозах сива скволх засо звокаМ шФодаакао КЕ МООЮ КАСКО ЗЕ шеавкдєхитс Соазексяех сопе «смаком касах ета о часова сст аваклссиви сюибасшичие ЖоЗасиеиеМ спанмЕлакЕке ВОВКИ ао ко акткжостдя посуававтх дапучеииих слацексвоз всиеквана СБК 4 аа о МАМА ТИВ ВЕК парна. ЗИ КМИН КАК я хао атокапоков зсщсставкх сови божулногах світанки пава кас іхадпсндаакх аспзазаєа сеча споозЗа апа ени СБК оса Бод

КО ЕККО ДИПЛОМ КМ само Коран ие хво пачках всвтсатвню зола сосок саакое ин кокаа пон о ЛИЙ

ПТК й КН ВибоБтикою ЗЕЗШКОКШОЮ ВККС ИЖТоВ петойаАКЕ ва

ХА КЧУМу севсвитисо Зосзазлосх зовскско давання пасив лава ІА вовча спав тмУ Комикс застали ПЕВ у оса Ме зсзакскзас вбив асаханазас яжтжктиох поета лов пев УВІ кн соас ЕкастайсвИи собксстває зазакщосих сиФснак Бас аиВТх ОК завадив биасвиеада зЕпазоваає чеською помсвдавх влазить СТВ

ОХ трон лен иаВшта У. Меч пос схе се КВ 31:80 зказасквио попаде совеа спасе славаш сіФвшАшАТХ. БІБ шви ДЕМО мом дона спра ос коала Тім дупи их ик КК худа шими Ум МФ СУЖЛОУТЯННЧ ІНАТСУТОКЛО МУХА Х Ук Х же киюхо:І пЕссМеаая жо ЕскЕ после ШЕсКОМеОЯя ІМЕНА КИСВ зд зкЕкЕжЕкЕх ткассасоо сЗсеосаЧе еко еВ бсавшеенуюи пес совю 18 текс щаивоа ссраєсяат мис ЕВ сааАю сова ШКО се пахла здала зале єя кава сбвавасьаст Сова є БОМ

Кесаскемс сваєтаие Бувексотаїк вопасктяав попів ЗЕМ Око хладпвоссиа КЕЖЕКодаМО фопекеквК апослЕки КО яса ЗЕ катихжесах осика бвапАимЕт «опо кевава пев са зеричо жен десни ш пи сим айк Шана шацелексюи застава ТЕ хаовасашши шин ема Б а Ісак ВИЛКИ ла І БИК ЗВО

І му ом СМАК ху их ме СУ и ХЕК ТУ М. УЖЕ М ТИМ ХИИХА У МЕМ ПЛИТИ КУ тк Котх соовек авчликоусзад задехешаЕ шссзеакху зи єКеа вужча Форма ТВО десукласамю вакжевиаек Сбор сао заслали ю час ЕОВко жо сейм пекти БУК ЬК каф таномі овен Мя еще 48

Зачкевсуво ааеваиктц стос ШК Вико хорах що евсвтотсо пжвекастхх сазан Ева збзовеавех сексу е ЗАКИХ какао Федак кОиЗе еамасовие попазаеких повтсаноюь сова е ВА са уєат «ожива чав папавктяеє птотеавчви аспек Ви жЗ сема ва шків фФкоравекя Бепрасравои Мілрвеная Кер мен ЗИМІ законо из кс шкщвсвосое боса меси ешекц попу кабан зако такуУ асан васасозико засл Ее Чака фаски жо сззіватлІво засееВекае соКЕкиснвих збою у Зеаовалаа адепти За зежчскмх кашею и спавссо СбвссеЕаме акти завела ахК шокова сх сао поле ках вкввавтика кассакасов всеж оавЕ. ЗО «вЕМстаксоВ счеаКавсосв завксаснсю ВЕК аною пес Сус БЕ тиледцета" судово соптвайниик козам ховання БИВаДе ех Ж пивом нанАь Кжоаавмову. піваеакхнів МТК нс Віх завоював А паса ов шив щем бага вааеаа иа аво сом во ЗИ

Канон тса КеаавИиака Кесаиссоо ке ав саке маки раах БащИ ее века ВОК: ЧИМ о ще Ежен ОМА ЩІ 5Вя

ЕК ниа руля ЗАМ ВЛН фотки порвати тет М ра ВІ хто акХ солена швах вкатоаавио пасом сВеюи вико не зро тлирниово бопплавеє ЄзцисожаУх Кеш тю бипкайк страх о астма вбачав зпвопвев си саювах вуса Ка Вуха ве сила кшаги СЗсвзжичвих сисоузакИл сезааоскоав ФзававкЕка шко аКае ІВ аУшикканас фишссвазез ване схпсакоказ зе ща оте вки чашки «акне КЕ сасиазааоав дадасотавос спав Фо Ух вм понят кт йавайолюво срівикстлва авачаеннх дивані кою хнІх БІБ всцевтлецю очам павееесидна шафи єнусєюєємстт Квбвуаусу ати специ мея згЕЯекакК паваглавато віспа аних дозосвивува сухих, зЗави мирт авА деаксавосває Зовзсосавийе свеовнису вот вацта ветегаисих ЕН

СЕДАН темами траїлюатан хв ютих срок слава й пс існова меЄКоугмонат Меоцрииаво расовою тенх аж пратуВмеВ ах ЗЕ

Вал вину БОКИ сват стра наююма ме жевл М. пре г Клима УТШО пеновИаеий ефе кити жил ВИКО шва Ве затазашвав земних вавазаєенео замаснедеї БОГ сша и ве кає тепсвзатойа дар а на о тошнвиия ли лоптєва сша св ипаапе я суші Модволатош песни паска дико АВт І пеллонлеяа Няня сек ру що З отр кукі фут х Ку ехо «яри и и шу ек "бмума

МЕЖ ВО ММК ЖАКА ЗНУ МАУКОТИЙ М КЕКСУ ДАТИ МКУ МЕМ ЛУКИ ТВ М пет пижоносак свое тосохжа чав авіа шою ОВ

УК А ю Меду та ша УДК УХ Здуття су Аж им и і й

МІВ Таун КИ коти рота Жора моруюня Ка ка Я чазикмєскоа зааксшаюссяю бом еколо акад ам козам су ТяпО залу тоалеееваа КК ее скла скако ета Ти запаксталнва бесбаваммац ссонастет Форест акемаАвст уми хо ап зичканвччих псасхоЧчеоу васкЕккоВ заповів зада за еокиг та аизахикит сен виссаооал зазаквсттьа алакакокає базах та зкацатавто сесвавашие осо аз сосбазчкока дасте вано ща БК скацессава зспосстаах щзаБакео спосо етто зош оса Вошесютя ПО «киавлатми засавазаих свочезаво зазаресва аспассецаю мати ТО

СаАщОсианлУ жави СЕ Уа; щем фокуса ВОК ТИ азпасананае гоцссталис тоБуавеал статева Кий вис тео Та зайасислихо ваосаиааас шксзчесавсо сезавазаєо азузаваєтя шчакал ее То иа тя ср Ки евро засо Келащнснса бомизанах Іво ачнсукааз запазовіну зксвавазчая сткакссаа сиупогосопа Шедаскавие Там асеахсахих зпсещиокзва авсвестеВ все омоа базальних корма Тащо стдух диму щім Кук Мети де смс сус Кит що еж ума іІєщіІ ками и пл оз о о а и В В в и а В ЕТ В МА в м в ПК В он со п М ВК ВО МИ закис «вивих ооо лавет кофе нвому пастух: ЗМОВ Ц ЩІЧО песто аст кощазкоих песакауетї сивлоташтк как ема ЩІК засаксново сощотаеснах зЗбоаскацоих Коса злак сао ники вет секіха косе саз зазсеслова асазазчазаз валова зако ас ВЕНО шУшкщеактх ЕХ тОжил. ХМатавомива висо опо их сова ал дати вола ою азам сем Ка уп пли см ап

КТ о М и С ІА ОН а о З М СН З Я В я о о Ко В з В ов м о У А о а В ВО В тп сила Віза «ска вела спав сову ем ВаКо ходи какох корсо пе ако Зв яе зо юютих ще Ва хзоууаасас завозавсккх зрізозавк спахазеках сушею вес е ВЖК такое их Коса азс ЄводаатовЕ спснсвеата зправа как ЕКаов Вей шпаки кесауікава азбрсазаса внозанезах зазаксеасв вався Вл соазасаказ схвоахклкаа оззасссасоУ Фаоунававкв Секкаевива зба тк сзеваваною кастмазаха свати ас вові аєая списках похо ВХ йоснствоає збоасееаок ашкещиих спос суток казав виво зижксзаск казково до осака соазавссад нат аноє зУусоваваке о сехаекаасх засоби сшпЕсьКанх ШКО ХЕ ПОЬ КК х БАН бостєтнимаз зусозоеето детстсевно ЩОКИ кт КЕКВ али ОО

Фазова ак осразозо наст пет Еетя сеча совет акме УК азвсиссавсю спскізаева позоасецахе спазскоаав ово оса сваовх Зо доуссезаАкак Бити соска почалтосв плакала келетеюиме Ва вот МВФ ЕД ВУЛ ПТК ЗАТОК зле таакстлво савтадомиюх спец шоукесенх звела сонет пава Зо бсоаказснних колл шопасоМиях каное завиВ зішедште сіло заго чан нсм папа спиаиеанехА всех орещиля сБосассоже впав катх Заво ациксуачес векасмное «веопвешьЕ посазютчаавс суошбешеаво БолеВе За

Бобвасакаю солити уткс павука стжвиакактс зве осакщо вас ове ЗЕ

ТЕКА пет «нку сКемо веФеаякавсех везла ь кеспесиеа ЗЕМ аабвасавЕя слюди сани зб насх вда сшетМ Месалоемцих ВИ паща пшехелуувамае сазана вас кко зас кзя Камо ща аклакиописв зевжкавсва біса юизахм засос всех М кесБасоих Зав вЧЕкХвитую зако подамо вежа ЗО лИьют фо ЗК акачзколяйно осв «засазавоз застати Фахове ие авсх зва пижма ма свв сп ватсаи мли земна послом ТИ

ДИКИМ си в пов аттюх вшеУкокутав паска ша стМу ММ пики освоюх дпавлеавлох павуки Е собом жують па ІК тла пушинки МоОкдстсе спасе снаи ВАВ Факти зп цосеФчисео умосжватоУх зірцезУсе завеахесх касове кахох сскокавава као

ЗЕСпПжкнаешхУ слежкакани ВЕПОвассе Бокзавава Васшеваио Зо мкВ бах савахх зааслоачаа бобпавтсна пизсвонако зКосявис пу рев А пуссзанеко сваха асошстсраят фстваяоса щас засічки х ОІВ аОЗФИаМВКВК уро зако свасаосаєст ашасовосих безвсавшая тПпляд звисати а поосслака савакотоМу поксававви весела азковвко Нч тази Мве скдесвзаза збе ас засалаає папоадива ЗОВ ц ЕНН

СОМ КИУМ КОНІ пава баствкажко вас збо іпгиа

ВИшОюКМЮ асп ашо сита феї ашкихко прово иу совок кох ХАКАХУ

ПЕВНО Меса авжеж зовЕахекиВ Боожазчатвив апа ВО аавоптчоссою свои ивва сововонсюи сотка сат вОсопувеве сабоптах НН чазВівахчє суслсссцеа саше са садамасах козсвавувх дасаканяа ТО тиском фа евави или іш Медові мани пд дос иитва Іа пазли васщесмев сома коаи опері озеро. соц 10 жацтоит змова оса сук О пеЗЕТоУ Ла ТЕСЯЙ за акакух паче Фкшстсро соми орла Вовка ЕН пит шалитии Бек. хоКе КУКА ТЛА ИМИАМ ТЛШ ДЕ КЕТИ ХК шКАшЕ пихи Каси пров сапжащасск хазабяеаєо фо ррюсче падках ВЕШЖО аа аМ т. МІМАС ДІА АУБ. СВОИ КИ сирами лах ВІшВВ пепзаоавсй все стих БОС огвиви даедамвеааІ жест аа шастец ХЕ тато саалитатсак птссеваа ставки шавстзавини ВЖК ке хеку даловссазо вача саа ал ващя поботааащ Фаласюєах оду І езшвлітаа Фора зику сеассзаватем сбавцоЗтвх завалами хІВиє росу атасаст свати се КИ садово сем Еовакох МОУ сни кашко Емо сс коросту сша зак РІО зксзалзахе сокола ссвсхвацчия соалзавккояє зазсоакавех шилокващє ВЕН:

ЗштлиютивОк списувати плода поса УП ВНКЕ шапках ВЕ віха пог дасшиса албоаизала деко х дефаантмт дае тх, чінхЕ гоже суд Мях ФСітложекенотох ЗМооруветитіт вок иВуМ. Боуа в УВК зкзувшизмак асаесщааеи пава зЗазацитилає саше остова вих УЖ, всю вщт села пет иМі Зоамуцаове офробосвеви хкасвоиаша хи КО ява Ма КУМ уІу ше ею Мпмтхшнниях шлИХри мих Кан ВДПКО паавскчкза «асвевсах спосо кезасепове казка заоюехкик 1вішИ

ВАК Ттльшят спам шНАМ ЗКБПТКМУ Басбегтои сума вежах се ХЕ авклалнека факси зазору сревисть ашоошовузи фоалодиква Тихий аавсовсанвс зумов а аенасуна сквмеаешо вірадоювом: позує ки зксохалмтою поса та пре оазозаех спека шссав десь у пеавацеонох хи чизавнамас сакамоково азазававих ребмапевих пеатешоаному пев ха ко на сИХаа КеЯХЛДіАИВ ВА леВме у МКК КІ БКОК ЄВ ПЕК КК, КО левова Фещук ско Зсавсвовов сах соєюв вам мекУмх Ковш Коцеце Мая папасетзазо двзась вав асо сювх зеозаїазаслта задвбвессов Кене освву Ва кишки ар асаса закуску зов асо звана касах уаеко садив она созазвЕих совожасою спзасвеао спадає охала ІТИ ото ОБО утсих Ве у Бентлі Кри МОНО ВЕТО саспсееса зипшее сопсуруо мезсеоюююс лм их пазом ІВ

М мкА У КУ ие ах Еанан кА зчвасивегто зрапавовах тсабоанесо коза асаУ созасевоми вад о Іи5БИЮ

ФшАМИЛІКтКАНМ ЛК КАК ВАНЯ тя У ЕВ В ВН КИ У ТЕ ТВО злаками хи сеоееє кави патраєеоо сала сижааиКЕ КО хсбасчавикще скшквоеках ссоскакза зе шеввиссеки шККОМОсВая ІНВ точна кко дезпахаєтає зесамезава солод света ще кана ІІ чик вас ааась опо азам зсоаволев задарма ЗИВО їсвееваВс сФоселаоця. скловвавс оасаеатомих нка Мо аефкююькх ке

ЗЕ ах паси ЗИСК зеплаавто сови Спаса АЗИ

ПОД щІя по ва сили ве виш иве ваше савеоееиЕ їжа зем паза «мишпсваав шксозешо БеоБсоивая ше Ке МАО писав пак шк орали шва мис спав ХО

ЛКК КМ СЕТИ Ж ЕМ хуликі хи У МУХА М СТИ МЛМ ЖАЛУКУЄ: ККУ ПЕВМ КАК КК ТИ м анксеасенеу час осоаає фзвзссоосооуа вано є умо вещкекеох хм зчечснсоса зима свзававаЕем иа а засос мав еаоаих тах засставиооя запітікста азазазеках соонашоаі зесацоцох зако тх вза

ФОТКУ МУКА СТКІУМ ТУЮ ХЕ ШІ Вашем МАТ

Холл песен ЗКмецт спот спот сама МАВ

ЗМЕлЕМОЮВО плас пек Косова сеаоссеває яса ЗБЕКО

Вал имени ОБЖ клена п КК 1355 зало пвомахоовиа човин анох сасвгсамат стпАСшВаааЦЕ попою ехни УМО сиди квпасоаве щлеущатяах см Мати шле Трах: їжа;

ДІПАБОЬСЛТНХ су Міли ХДУ ТУ У серці кеша. вк оку ЯК тост сокацесює флевсвчюква сіра ско века аєв чек ТаУКх

УМІЛАУМОрК ЛКК ОВО Скала х хпЕпескнх ховає пове. Зах зи аасео сон заков заньаттвак зазеововави стодсвкаюи диско кх ілкна каша кв ків сів с ик БІДИ сах та ших ДЦ ле ше сумі ож екикХк. ДЕЕЛИр ММК єю» ХК М довів шати кеВ зе нятке смчиааесоа се ща зак свасза ас зашоюшани сем ха лихе аа ра тезах помасвкак сопе свав сонавсавору зЗовасаесва зоба васмо ВЗ ваше екза сумках зБоовиВе» пазцилоася слшвелока се іо зидадкеаеи КтаВказеса здпскавасав стала мех слона актова іа лева вакЕк века осю пане ютешк Хтось х кокелавчка за ааеах КЕ ЕОи сазвачуккос вабтікеавоя усваватт висо ел еЕк авсвасквия ва чпеваїлонка Балан двельчанши нважиаксвив еКтвечвО фопопакакя тай

Щити сао КО тні УВА сю иКий ФЕМ Кх хаб сзпсивсви Касове дено риса вл елини и КО «ках хии зЗепщенячЕ шва ИВК свскамнєтав салом шив Ека ДУ сежкеачанеи век порей вої комь запах дим еах ММ

Кичуважхуют паху: «дача Скала тав утазЕасаня пек кози «втаалокУю вИплеанавсе сбощеасосв акававехкк папи вижх соакаска МУ чат цетдиає Ток аня. спе маах акдааВеошхУ стат коМ слов ех Га то еею Зак вн баосктокаю бсессптщов забава ЗичОчацаєх ДУ щепи евас вадами них «вкзижкока садив ккйа ис пачка Іа запсцчеоши спасе Ол фест падає кома Її звик опо онах повеказЗаиЕ вп иаамо доти педа АМВо засассчаве сабо ває за болем ко осла заз Іо палактмио ЗЕ О свапсвавеме КеоватчиеЕ таваспанскх Флоту а уз пЕтеаакакк коп коя запазеєсвг дови сеиУ серадотах зт сзаха ІБЕКО постхаказа азаєквався закаккеких сахаксох ес у заактса жо щЕкрмецио с«вссахскоз закоавзаззи свашмаокеке озаочаняь заз и МУК О песо сво свсбовавт сус такт оса осока КЕ кое алеке свадазвсонак всовбесеаки обста акшвезачко пазу МО сосок овЕ блохи твко пакодеени чне саке соншнскаки сфе кх ЗБЕ секс а слу Е Кота свита Еке бота Барка 1БшчИ чисспеасаса абаскевоав зссасиекоа кашах аобесвВесав задово МАСИ вишка всбзсввохо Ос пвсхонь со во дане видав ЛО ша Мд Міст м ЕК Клум аб ваюя Заекващо БМК НК

Завслгвнюя взсбвавашек забави Ємоуаоакеє пов век ума ВЕЖ пресу ве ВЗ Ою ЗБобошоєс засчеюсасоа щмхеманороі подав АЖ тт дрошнає «мак атва асеМадех виш кленвсо пп ши даси Іво пох фасон апп зер ах сет еКЕ косах іо хітин хчама Митна абсо ола Екс всопбксзоВи сзавеоеа КЕНЕ сипле овес азс ї лопозлавьи повесюиКим сеиаспниоо же уевевсхашУє шКщаштвию Ве ел ІВ ЕшНИ ЧУМАК Кока НЕ. ткасостака садоскоукац биазосових овоогасощне часова часом БО песни сваию алго спец сою осо сенех пал оео Я канавок спесвахо зпашсовоииУх самку ою штам а ІБН занос сек аваш щоках запаска сезсевиао зЗбшцсвавКе ІБ сеї ващи пемасраєсви сао «ск ссах ВКМ боса МУНТУ

Клер зала мох плата авфажахитс ваз ме анчаАе шах «кс уносвих сожнікьмк чик Епт часам ож МЕЗаКЕОвоя УНК МОЖ чикати пики КИ косих чаКУе жав ОККО свасивиея їз сФЄєсвЕмевки бовкдксектВ ЕеоМакоска пхаскЕсВО акОраонемо ваефукатона Не сет сошки ЕЕ зей х дивак села Іти пеціасваве піша скак сушею ро Усе совно Вед ітТ58 шоскасвазе стевексщаво каві саснах ксвисцекав сеаваскеков сазаваеку Та

ЧІВ палакая засастоваа панаслога сис Ви запа стевакацихо пвотедвамь Зсесозколтия замінив «св ме Козаков зав ес стінах «ксрЗаванка Кока МЕасеуюеах вацЕнечеа УУБЩО бещкссщА судова знака ВЕКЕЗОМона авоосни зсчеонеоа ВТУщИ чаги соч зачати Бищкспавох БЕФеабяхе Фран ме фл х МІК акакжлоцик сну оюо криз свиоа феваковазнНЕ соток ю Ех ЕК чем Водою поси зорсаик восстзоваю Ху ВТО зацшиЕкстов стозсЕаЕосе зоасавсоков Ебсасблавоа саван ВОК ОВКих АТБ такое падоковуа помсвшнмМ ска ок пИпКеХиК пекти і7Зщиї зазор зісокосхаом Звали каси зазещкано сота оч вксФсессся дозавссоавх ЧИМ стоге УЧ шавасллих полоновая іно зкеадутсотах сти місту атлет чів Овка плов їн псовссвасох злресастов завакилово Зате чаша жлдсевеу сосках іккше пекла спаяасоникивса веселдтох зЗазелевето ізо чави вссмоавео ТЕ стук боком Молю мож о ий моих ом меди б ІК рози опіуму є ВК дих ЗА

Ес КОМ папул аситео уже КаЩКови сне їли и «кт нфчіжит тив іі и их ЕК чик гема наВ ЕК шле дУх НЕУчНУ скдчсазамі зп паса осла СЯ диво АІшІОО мае Ему ша кажи Ім мету чч ах сера теє мом Мом. Ж сум ЕК ЗЕ

Ви ш о в У ую тиран М У. лшМ Ку ЛАН МИ Ки СЕУЕ Мо М КГ ДМ МУ оте си рідини и ую Кози сх пк ою І ФУ СВ рути Ми ТК аж ЮК ОК Удаишг липа ФАТИ ХІМ ПЕКИ МУ ТацусЄимУ МІ тис мпурмучилує Мп нн и НН НН СН НО и БОЧКИ тесазосве поем о далекі пошита звочессавоа зас кх іо ні туди вд рик В ЕВ пишна СІК а ОН тий ЗУ ЦИ КИ ЕОМ МАУ Я КОНЮ ТКУ Є Куют ЖІНКИ пррномпкзики МоукімімКІіУю челуєцідІви со пу ри пені шах ккд зи тост Ми ажкахак сизим аецрл муии шви КЕ ІКОНО сток ою ки оду см тв щі нг іо хі ипщоуює теми спо В Кулі чий

Есе ОМ ю Алл КНИНХ МЕМ слухала атака МК фу маєм іт жні Ук т ду кейс У чим кв видиме РЕ

КЕР шир Ор ОСАТОСВО УХА дать кстУкУ аа ВАМИ А ЖИО такса попа ава фор ви возсвасамо КеецвОаи вт соааесні или ення Кто о в о в в ем в І м в в в м в п Я КЕ тексту папок Е Ка ЕВККсІКТт квочки ававеинана МОХ КН

ЄКМТ ИМИИИ УЧИ ТИД УМХ М ЛОВУ СУЖУЧУ МАМ ДИКУ КЕКВ мк КС ЩІ ен и В НК НН Я тай кота киІй Сея змазати вати прегсатлеюат сонна ша ; ; хх зим ких рив ІК КК кі що ЕК ЮЮК Ми су Мира о ви, ил атшааолон Маса чеЕсесасаса ше Еаххтс сасакиацюм ев юза ах МО птпатмомажеті Бошемувімат Сич к моих нт Квт ур тп ою. ДИ вм хар завали мав битву шт ктО Дурататите важке ІМ спі муки спасе ко судити м піни в р густу Іуда, теги

УК Ер хол ро мя ж жаху У туту вдих ЛО фепвуущомает т семи Жи іх чи и еВ Фичачит й ем паче К о хом прик тах

ТОДІ т орав ашнох их Нии М гени ВИК Чем Фари КАЛУ ті хв тьия гм жи мирним оку ж тік дрилі ким Утльх кзаслЕВсавс мошок Х Ем иККт силами сажа х маша ува М сонати сабо миука акти птпдстабоех споскхастово ЗвавовоЗЗе ее

ЗАМ САТ ЕМ АМЮ МВ КОМА КУКА Уоку ОУРШ У ЮКуми ММЗ МУЛ гігсттууе су су уст уит ІЖКІЗКК В ЖИТИ усе Кіш во дм ЗКУ их СІМ ВУ у МНЕ МАВ ДНО МКМ КОДИ ВУ ЩЕ МОХУ АЛЛдИ тівтютивутИьих оч ем живу ср КМУ МЕД МИХ залим

Корж пщрлтмт Запас М Костел «ФфівалИЗиих пази паля НХ АХКАХИХ фут: ит МІФІВ спите СУА ТІВ ТК м, штук гук У УУ Ж ТУТ КК УтТУДоДІя

ОПІКИ МОБ ИИ БаМУЛтНАКЧІМ: ста МЕ ДІМ ЕНУНИХ ДИМ МЛМ МІБКАЄ в Я щих мумії мУУ УК М Кот смс р МОУ. мух НИ пла йцеми паповпавІа в міак ост хоеломаох седана тю траират ту юа ж скиту мину ит и вк іх шу ит ур си дині Кв ий ЕМ УМ те

ФІ ОКХ ск зам аав павука суші пло пазшлекоу ІЗ стилі тч Бозі дарма гурамі. стара пиши ТА чере міфраломан лишити рулон мелшнаФреиют мит ТИЙ ми вн Нв НН В зе такими дес алла сецуаиу соуси сю хзЗаче пути оку суку уми сиф учи туту Филкучилиу тих тут Фу иу тку тала

ТНК МІю повтор аттт ТРУД СЯдняХЕ жиру ДІМ ПДНДНОТИТНА ПАЮ ИІКИ НН ке а о км ак о п А В М КЕ ПОВ їм поцлдилийомх ТМ иИММ зицииМмннмиц: йппйодтнвииА рима авихац чат МТК по о У и НН НО НИ НИ худ щу

ТРАДИ СВТ. СМ ЗЛИХ т. ТЕКА ть хжимА БЕ и о Мама при м хуи р КМ о с ду вч жи а НААН А НН ОН а. атак кто Беслхїаи шосе запемрашислм мух мих поки алвиат хишмсссии впала плов шили лм ве ІЗсапОо

ПЕМТУ ЕН УМ КАМ МАМ МІК. Ор кетьош помісних хомут сти у ТМ кае ох

СОМ зичимо сим пуер ел ЕВ мих б ри екю ге Во Зима

Очна шт НАМ О ложе самЗе азУораєиим Фулолючаеаном: шорт ЕН а А А НА А НН А НА КН мли

ТОНКИХ. ФМ Фуко ІМТ АТМ АК КЦМШАХ ЗМКДрУТЛУВІва ше Цруюитя «АГА коксу схе оюитутию УФ Можемо си вач кв іже аж пе замеалстици поисащалосми збірне ктлаташож ач ЗЕ ВИ тт КІ У одує лук дУї МІЗСМмХУТ дю мс спимо мая труди дО т Іти мА

МОУ КІ ММ КУ У яка ами а и в но вн п а в ав Я КИ ХУ : Нш : ко : . дети жиму коти ик е их. сен Ввід пі пк цомх пла пишно с попку зи така зпшЗ слу еасасцее акащеаавх хиакКО сс нац суді ціа схдфиєуціІт ох Ви Визв им ку ж р воеро тупа

Чамапимаси ававсвлтах Фзвілавихен СОВИ НА слів Фета шу

Комо ие цю пуитЕжихуи ть міт щоці хі ведіть охочих я путі У ую фе Мі ач мих

ХНЕЖЖОТЄ КАХ втрати а вада шрам х УК ал х щи У. піаху хизЗшо по фсршдіих сдт емо са КК Кн к дви пк КЕ ТД на с и о в мо в о зовн в ик и ми и Ми о нки в а ап и м но и КД УС го : пед п кош ; ; теги схуд жо ом фею ак Бар китів Костюми к кед фета, І КОЕх сил шМХУютаМ КЕ МАКИМК БОКИ Ех ВНИМ СК ЮВХ корицю «КО флак кік фрі ОВ семи ю М Мо имеет гайку вушних ее вд лаг шпшкоапоостю зба лом о ій лишок сеКуюсц сала МКМ «МОм о вн НН КН нн на а НЯ піч лоллкратями Барта ее. пса паху стопа ов песо еска МИ ик рю ую уч ЕК ЩЕ пев каже ую Мф ит Ме ие щук Кия ІА

ФЛ а села пила МЕТ ж МС лЮМЛеющях са ДМК й БА шомлюнматі кат Беет моди догми фе мс вже пу ак УТ жан и ки п ми и М Ом о и ни и и В В І В ЕВ Пс МО ЕВЦКу хим ої п метою сс Кіт песто Кен Ию І ТИ, Фрі сна лігу вивозу ва Мена щас КИМ МКК тая КАМ меті рову сне т пек ЕІ сг клоун ТД ТІК

УТ ОЮ пає Морой луна пато с оси мецеих ваги кими М пен НН НН НН НК НН тах птаетотхуиву йсспишетоа шести Верона лабо йатом Фран ссатратих АНЯ М

Фо. доки гію сут луі ум ЖИ сита мія сапу о АЙ и си Мі В М ож ати и ик тт

Буда АК ву охоти МНК пива мІНнУ ОО КАШУ ФУ ат ОКА грог рн ит Вдкеная ри а рдух пе

ТК ТК я АК КККУ кепі ух тек и нта пд тА МА. люк, «лу «йи Ж

Кееье МЕ сили пою о пек

ВМ дрон КаюасмВ ших погу хОІУ о

Мак сс ім ЖІ фл М Хі жим ді бо Ху хат; Дт маш гу у мах шу жу АФ ОБМИМ ОМ УА БА ОсХу КУМ ОМА евроОУжО яву пав ОомАд - д с Ук

КУ й НУ ТУ бо Домує ан Мч. р В яд фам Шамо Мах. кто Тим до і я хх

МІ Мп ях Аа аа Кіш ОСІ Ка тжЖх джКа Акт пам БЕЗ БВ АОС х п талу ЗІ кл Ко и ге йшла мет ра жах. Той Мого бі Мясо Мт ла гр Мед од Хі 03 што вс тТжр мех Аа і Ба Ошх Ко АБИ ід Муш ЕМ Ом МА ЛАД яке ще ча ій оба тїищ хі т М Дах ши Км Мушу її лу ГІЯ Ше Ру пюх джкполвЕм ци мА Ваш ду што жТмпХ хмХ сСАафж млрос яко МяМмоКук й ТУ що

Мар є дао зх сг доз Ха о Вл да ду шт і Жде докт м о сам Ер о зЕш хх ха ма Уа маш УВА МТ см б Ав КК Мт че -к у ск

СИ НЕ 1 пс

Ки с Х ї - Км БАНЬ щу р Шия БА км У ТМ р а НШНЯМНЯ паж бе Бардо ідо ВХ шо Бу ла мущ Мекка ж Ма їна йуло ву пе

КУ БАН ох пашж додУу гм кт дощу дош бомир оту о яа дАДує ури блсх ТЕ. Под беж фюжЕ Петж біти тай ліф КМЗ нам ле Ух ям ВВЕ ОтТев оси жі КВ

У ЗТ чт ро МмО хи

Фит дО ва що бите т Шо сл жи ЗВих Шо бат 1 їм леді Доу бу поло МлЕфомшк бач арок КИ шум шеЕ ЄМ У Ба дм ФМ ЯЮ чий зл жу АЖ ех біо фо їли Фидох Кох о: і лом Мі дом іще Ла Кт тр ж птщш мам муж лю Обоє ща с хе а о КА М а ВМ НН тче уче - вх

А АВТ АК жо хе фл т сан ЕЕ бі щук пити Міхже хЕнуї Чу, БИХеЮ ср под РЕ зшим рМЕ ЖЕ ТМ Ж іш шЕ вюЮ ож МЕ ши ОККуМ ЕЛЕК У МЖК ІК їх хо зх УА

Кл Ка Ал і не не в і о в ВН НН Же

Мет Муз Бі іа дак овии бр о сжвобім Аве КДЖ УФ ехо Бе Зм Би тих їі МІВ пік дію се Му ин іш Мою Маю Мод и Ми же До Ту Сууто Мих Док іш паж ха ІМК жо лВЖХ Буш о УМЕт УКМУу сбМЖ Мем ТУ щ ВАС ДуЩ СКУХ ЕЖИ ий з их чт ех МВт Мо а Шо Бон нон нн и В о о Но НО НН

БЕшО Бу Зі феж ех оби ТНро хів же дж тТВх о КХо ТУ дар ОКУ Бех 155 їпш ши

М жом уж тк що зах а їди А т ги жо ших Ми же

Мам ее А Зушо нм КІМ ем МУ 2 же ях муж ТК мим см МОХ вч зх сх не іх с

ВХ й ди

Ажро Св ус Кф ХЕ ж Я. км бек їж ші 3 їшо ВЕ Од ше ШО со сх хх НИ

ТАКУ Ах яИту си бах ой жі кує вт ца нн НН НН Шостий ку; дохо СА ху дю

ТАМ оАХМВ ВІВ УВУ Важ Бе Акч ут сш Вів ле Хто Ко ав Аза Вк ша ШІ дя м Му хі ту ВУЄ М п АН ех хи М он НН

МІ Кут Мій йо щолилу Кі тож зе Ма ЕМ Хм Мед Ше піл отже ШЕУ пс у ЧУ еп КЕ ТБ Бл Сетш УЗА Шу Хом БУ бІш МжХх пи) ши ши даних щоку пненн е ь и н а к Н Н Н о а

БАХ о сдюкую дик муж км В ХЕ шли ХА ОКОШю ВУЖУуХ БУХ О МАМО КМ АТ УМО АТО ух сип: тету й яш вх ою дя хо щем йти ріж Бі тбоке ЗАЗ Хм (ах стлх тм Вих. Щі та А шк ша пл ов ве Чу кмле ШЕ о маА СД де С у МА ЩщО КМЮ ях МмжМм о сУмю

ШО ЗЕ НН ріку ха рек шия Зі ДЖ 23 Мою ста Дх уд ж КЕ умо ех иа же Мийт ЧОМ ФІ УА А ОСКАХ ЖЖ ВІ да лТЕЄ ЯКУ ЗО АК ВК піц сх ей пр

ВЕБ БУ ОА ИЙ шШежах УМ де Шуускю шо бу Тойхх МИ м Ат ори о Ж беж. ДЖ С юю ау ме ТК Буш Мах о пме диТМмОосТАВУ ЮК АКТ ОдУу ТІ Душ ж дим ху ха зх зт зу їх ЗаМ во я яким у - хх вх Я т х хх ей ддооух шу Мі

Тлдхгі Мк Ха Ле Зк Щи сі Ж фея ШЛЯХ бал хе БЖ хо Піх

ВЖК ОТО жах ж ОК Зою снах жа ше я ум дм Кл ошАаш му Му х

ЕН зах й

ЗИ 345 хИ

Туя беж пхує рем їж ла жу Ж оте її 1 ті Ін щи 1 ТА МРІЮ сб

МИ Ж шЖЖК ЖеЖКОМО АХУ Ж ММА ОАЄ КТ сВбр ХЗАЛХ м МКК ОО ЖЖ сМІдАХ ММА ЛУК ве АБУ ЗХ їж Дозу ти ГЛах зок Мі тм Да фо чем кат ох тм Жит Аа ух

Миш ФУ дже АВ ую МАЮ ве лашо МжЩа ХУМО МЕ ЗА УА ЛК УК лих хе дк «вх

САН СЯ з ля ек АО ілоще коки рю Зло ум тях а жах ЗУ що дал лі дк МЕ Хв их му мах жо сФЕ ла ЖЕ ОУМКУ СУМ МА МЕ Аж УВІ БУ оттІнНЕ З ДЕК тю зд спе ух що я ЦЕ ДІ

МУ ЗО ЖЕ ЖКО

З ск й яю Шкає МЕ ду АХ щодо му о щока. фідию Мах би Фе тує МщЕ

М хм ЖІН ді ди ша Ал МЕТ ОХ Мелло дж Бут са В ож МеХх мч хе «кк

ЗАМ Ся ж -ї дет ХХ щ . мч їК ща сх - - шому сх Я з. іде йуктж. Мр дже су ло же лок во сао сижЕх дО гожур дея Жде АХ жаКА ЛУК ЖЕО МИ Бема Ж КЕ ма МУШ КЕ А ММ Ж ММ ЗИ аа іх ка

ЖАХ ше ЗУИУУх

Про» дух Маих Довхі ст мо ща ди схе тям: фу їси Па ТЛоах хоажи Уміхих вух кт МАТ ЗУБИ дар ошаім дб КЕ Кмх фінзмо Еко У ми Е Да лу тут ЗУЖОСЙ док БЖ ка.

КК мяз ра

Ул тами худу ПК шику ех дреучо ВИЛО Як бурю Мих ку ех ни но АН М м МУуш аа ща Бле леж ВЕ БУ Зі КУ Жук ех жЕрОБІЄ вав оту

З лу Хщтх ве ж жо їду ло Ло її Ж 16 Мою А вує тм 4 с Жерує Мою Ж АЙ ую ух я

Мем омЕЖ зЖю піт Уа суб АК Фоми Ус ОК МВТ ще СТУ ДИВО ФУКО ЛУ хорт хг ях Се

Би о Ху рено

Щі шим Жах ЗК Ммихаж Шах ТЗ ку щу. Ка даео Шче хе МОЖ. фоюих ть До юю. Мтюуу ем бяЖх Кл УВА дж КО БЖ АТ ЧІ КМ КВК ОлТеК Буд о са ТУХ

АХ ЯМ ЯКО тую уж о вВжОа Так Кіа БА біз жо тую Бе бтєе Бу Авт олія Аза ка р БО -к

Вт. тп тні Руз щіуУ лу Вт Шех Узі віз пу Ме ТИС ОАІВ Буж лів

М ЗЕЙ Вл увРощів Тер о Бав Азія дах Тто Бех Бу Аве іа вв; БКо Заг біу Вед

Зо 535 м ліз віщо мем (лу Хв нів вій Але лів Жук ММ Ба дах ББЖ Ж МВ а Оу сих їй

Пув ТВ тн Мі Мів чих йо ТЕ ЖЕО ОВ ув Пно Ме ве Бах БЖ що пла пт діа Аз хі Ада ді ви «а м яю рН еБій» ДНК «Дю Масивна усю «их «УМ жави бити Ф «ШОйк брННю о 1УЗЯН)

ЛИШ отрошБажЬ СКУОЮ до с бу Фщоайм Ох ал ї3 зЕакчидада каст ссоник што вохчакваме ств цчних Зешеісуа кв акоакосавс колота зчавт збазчеакие соспвдазаз пайткдювик ссаатеквох 1

Квсвасжеко Мово б і соучвсваМ сах своа соки БллТКаУюОВ Ш

Монети х шани разу ссух пп став КОщьмМ золу я пкавиако КЗ ЕЕКЕЕжс вагових осах судно русі вс асопацчшавах щ шхоуасактми Мис акоаквоетоВ сккаасщоко сумок сосен ЗЕ мутна ля ал сонати циущ тили ябаюівиова запеУдквтако замка мати ал и нн НН и НА С НН на НЯ види Алешиаа ЗМК ВЗІуМюаи стае тт ще кмиух ре иАТААТУ ПОДИВ КУ шт сич сн ик а чих уи и пучку тусуться юю дев в и «ліве ЕЕ шо

ЛМЖХИЄНИЮМУ ТЛ: МНТУ КЛ СТУ Му ТЯ ДАЮ ДИ М КК САУ ТУЮА У ЛАТИ дос уми. Мужик гу ож су Вс щІяуЕ Мох мІхувум Ем Сорти и жим ІТ зи намлує хопаашлте пекакиеек Фет аверлих Меса ЗАШИТИ КОХ фровоже кю ем кт моб МЕ Кри хів міх Жди дл

Ето Метод ає малою МКК Зоо и КАНА ше нн нн НА НН НН зутхгх

КИСЛЕ КМ МИ ДЕН ВУ МАК МЕТУ М У УДО ру ЛОНК ЕТ КА нн в НН НН НН Зап

ТЕКА Дж ХУ МІМОВІКУ. МУ тими газах МОЯ ЖИВ КИЛе КЛ. МИЛО АХ У ее

Кн В НН НН Ах папа соти мим Мета Свт пори У вежах слі К Мам сюди Мхх папа ЕМ БУМ КІ КоДдшМЯ ЛК КЕ БОНН тпиедиазло милу пиву васЯи валакшехкЕ Холла ям зму емо книжок діІЄМ У ФУ Ом МІХ ізо У рим и куму мух дощ ре стека кала чавакадсх пово сиксовесЕи хоКккащез св ава ЕХ р о і В и сут, шапки орали КМТ дод СВІ ЕН ХО ЕДДІ ЗДОрКдТО КИ ли нен В Нв зору,

ОК Я МТ ЯВ ання ТЕМИ тпташльМ мА сю сауна ТМ. ХСН ух У. АЛОЕ НКТ МИ пн а а а и п ЧК о І а В З КИ НН А КО МЕ ОК НЕ пока и и К Блек чІвстащУктм: ува ох випус автнвцивиВ Маю Есий шлами хи МІЗО рути Е Минко міхури екю ви в чих ие ту м ум КК пу МУ ли чатах к хсксесоою кашку фе кзав азс турне АМІЩІ успіхи Каплиця кім миюам МмИКикавихю пам р Ки В члищі семи Сан Мх сходи сомжа скло виасає савсиаваша рем ДЖ сук да Мч МІЖ Кии тд жКмнуКи тиха пав І пл

ДКР М я СКОТТ КОДОМ. КРОКІВ Сорт кат кря ЗО але И рати ал АТМ МІ ВМ. МЕМ ТИНУ. СВІТО Ту КАТ, ВЛ ЩЕ шо З й ах

Та О ХРУХМКННаУ пет ААти салати ВАННУ дк, сех Кун ІАЕ сумку Же щ пилюка оці леми дФкоувід кою Кок ж м дю ха сних Сас Код лема пиво ка их ви МО ТАКЕ СЛОВ Є НА пет ккау втома покора сю сх тіж тюв ох бік щи урок ких пу щикекккиа шк плитах захи тавка сота уд ХХ пен щі жи ат Мох кім доба ке смціІУи ин ме игшельм мому ких ЗЛУ шашки сважокшаВ заходжу х аесповіжеок азЗсаечмав вазах шк

Фоми В ду Му сих ою дома тех побогстдуєхоюо тує КМУ прі хв отих чат

ПОВІТ ММ ЗШ Сех ДК ТІ. вну Млоися о БОМ Калла Ах а в ЗО ИН ОН КО о о ЧИ ПО КВ пи ЗМК и а НИ о ЗНА В ЗОНИ ака щфисалолиКк єкти виз ле р аа ТВ схфндВ ТИІ В аа ри Ті А

ОМ Же В МИ делі ТОМІ СК Бл ВК ии Вол иУВ м и КУ сих Во ЩА ЖЕО ТКУ во самку ШТ ЛК АЛ т др и НМ ЕК ері дур мим КІ удо В дис Ж рух ско ме К 1Е шиЕхжЖвищмеМЕ шрами спасе псвавсовакхЕ сс оман І паж житокайл пенал тиж вмерти лецштклизох ваассежаан че асиа КЗ не НН и В НН НН тло, тем бла ул УПА КАВИ ТИХ ПА ШО ЖІН Оу шапках ШТИЩ акемоцексх СВОИ Чад бета аг св парк крстдуня пори

ВИШКИ ШОСТА ол лЛИЖтвИІх Уа тштовиа Фуємра там пустул ху ен нн а и о и М В ЗО А С а ки ВХ у скажи ві ти злоби чЗитиссоаеа афект ша ктес шосте трупі ах КЕ опихп в ле, «АХА «Фо шР В тори петунію кими В омлему ким ф ем Мічдулф вне ОО Ми ж М кох пВауМтлиатет КОМУ суляУх смакота «КИМ ХсавкксхУує колосу ША домі ові их а хто ее М НЕЮ фейки юн В годжі воитхр

ПОТОМ ВА СХОЖА ДЕНО: ЖД КЛЕМ ША ТИИОМВ КЕ порука пл дою ни Фавор ек ізооерйту Мф ар люючю еф рик ви КК ут и люлі ру заштшвхтко слушну соски МошЖсмсМ таз ко еБЕУЦиаи МИМО зо вд ен Ка ви Кук дав умами бок В Ка 35

ХНИ НАЛ МИ МТМ КЛІК пла и КАХ У М КОЛУ КЛІ Укл ЕВ ККТУ КО кат кю Ки уві Кох тіки ВАВ Ми му митр и им ую воу щи пед

Ха мИит КЕсЦушано пе мшсих Тут шунка ОІКЛЮІМК КУ пшЖлИКМК ках ва уст и Мк жи тек ки сиди сизим пр Бех кажи що ехо о да

Ваш ТАКИХ ДЕНАТОМЙКА ЕОМ ТЮТЕМИУВ Стат МЕМ О КІ ЕМО М «УЮ п НН В НН стюотьку зе ові п ваорссацеа акшсосвси Мій еои сасосфсоа свабкеике ДЕЙ пн и в в НН НН НН НИ ТІНІ

Кісозааза де созаннмєс секс лкХтьа сваха зазАКка ПМ. вумсуклаассуюау МИ

Кпваомлиим УК гозіматн акаде щих Брук т і пути Бегкеваиккх здат маса ЛУКА БА КІ ВКМ. ХЛЕМАМІ КК РЕНТА КВ «аю пхати вдихи Ж окохре М тен кт хі КК сти Ух

ПОМОЖМІ ОКО МАМУ ТЕТ Х БЕК лМБОВт ЗИ пами сну я ТІ фіАК вух свт вЯ друк МЕ жуки см вух и мож ще пат АХ и а на: вщклоттеки мусу се МКК СУКИ О ХОМ кіт соль у рівисуюуМ Кк мекв Кун вим Ко мою ТЕХ пиши каха са ПІПАААМ ДІ Х УМ КЕ їх пак коша ПЕ СІЛ Ме КО нн в и НН с

ІК ШЛОЛІМА МУ СЕК УМ ЛУКА ХОМ ХК Е ХУ КК ЗАМКА М МЛУ кову сАКовуч с воду пак КИиюкМм цк кеав кт спі куй В В ти "ка ппасчмечих восадаслчсза асо вип еоикх З ТУ їх МОЖ ПЕЖИМЕІ Я ОА ре В и В КН и В Я Зло

ПД КОТИК М ЛУКА КТК КУ АТАКИ М. ВІ ЦІКАВІ У КА АНІ о но и о и п а М пи В НН о м п п В о п а М п М о о ЧИ и пом ЧЕ ОХ СОННИХ ФЕМ КК сраремацених шли ша ие сет сиву ПИ КІУ юки Муки цію сук код дру вв се т паче х раль пода КК фанів вишневих Мате садах яко митцю іожі см щи вет щі Км сук КК ех им и Ки фах оририєтуих діди аква секс КУ пЕосиКа ВІЛ КЕ ТИСМКет КМТ тАХ НИ дики их: сгмееіт іш сх ей В офикуи їв и тущтжв іо пу духи сих уп ги аг зав ксМ смути шиком соміоаеаітя ВЕсплешН аа Ж замі мовом о Мф го жим ме мі Ким ковток дує си их п петуу зевансвахми пекан вах бомбою айате коала о пора МН пп у НИ ЕХ ММ ЩІ шрам лиса ДМ КМ хв аа МеВ АХ пив мамо три КА куту уче ух боможеиюттк їв сур М долю пам ЕК гу щих УА

ММА ДОМІ ОАЕ ХЕ Кох васала З СМАКУ Мо КК зум ученими у хуя добуто ик ук Бан тивів прут Кіхгух Я оту Аг

Вами пис Прах Клас УМ рам Лу кл ехлидаш шим елауУВ а приххдсеадвав вашим шоп вища лис Оса МІУ прлтщеашяюв чакшощешиик шочфкеау шокова КО ЗОМ ла уже м М Кс піку терти вив ПЕ жилий ту тут пе Й КД: ик суху пошта а тла аМ сивим БАзсяшУу щи АлЬьихАа: странах ла БО

КУ З з Х ї КАТ їх ух. ХА «Ж скинув жа ак створи темчй Бенц аццт спиці ке ща тлеви ви их чидисиавиахМ лаками санвавсимВ одеса записи Ома ЗЕ пе в в и НН НН НА хр актова ах сосен лот стома х хворе нон ж ВЛІВО ТО стосіпасея валка вала віїа пів лавй ЗИ ановкЕ спо чкВ пуце ие а а в и по в а и в м др В і м С А о м в З ою и М ВВ Я КВК ух ереемітуть й міч щи ум Між ОКОМ рити их Ко колу их пихи у тут Ду юри кує гу

ХК В ВЕК ХНАХМ ЖУК МУМАЦМУ ЛСОУ ТИКВ КЕТЯЕх Кливию шОНІ По В прутки фа ве гуру КК КУ своєю Квт зцтунх пава аск сс ма же лай свита Ем рез я ак ВЕН пода сек осерді Боді мил щу гущі зу тина лк сет емММ сеча аншна сет Бах зво до хви сих и М ріже хв Іо удоВівИиМ сурхо і ох т Ян

Мч ШАТНА ММ ЗУБ ЛОДМАІКУВ лек птаха вич оваис аахеАЛИкИ ТУТ пис аскх пдв кав ВЕЩЕСВКЕКЕ Козоцб ва слав Кт ува о

ДМЕ КУА тю ЖЕХВТУМОТВЛУМЬТЬХІВ ОМУМу МАЮТЬ М ТИУ. ПУТ ЕК ТІ МИЮТЬ ек ХКГ І КЛИХ КІ МО) вия В в НН КН НН НИ а аух

ЗМУ ТАМИ ТИЛ ОВО мХ тост МИ І І щи

У х З 3 Ї СІЮ ЛЕМ ян п и нн в и НА НК НН КА

ТІНИ АТИДЮИ ЛОВ КК ИЛІХЯІ УХА пиві Зкшкх ака аи се слс Ах Ах пудів І КК село у их гоже я сх Дт КК Види и гу щоці ад етики сем шиае омлет рому вахта ша ша паці кіл село ОВ спе Кіма ує щі имя КК грі фотка кА ши и. чен ша шя пмМеаатвоУ влвлсесуєтУЄт зиму птлх ВКІсосатох свасземав ЯКІ

Укр сш МКК свічу І В Є Кок м В КМ фрі фону вх та

ПЕН Ох пак о весно шожеккеташ ЗИ Х шпат ек аа паніки смс ева ВаКарлотос Кекактєтаю Козакова кит то чЧатоанскскя Фісексоссоки Кекс Бзаєкісви есежпЕканос зватися КОЮ зІшческука вікова аесозавсосво аз тавос Мовакекеюю Каша 5 пожекадусв шебваслеасч зуккавиоа вп ксавц елботсас Копиеєа 152 самими Єижотахока зва а Каши мкх КИТА але ВеНИХ ще тав ЕКЕ зиаоскККЕ бобхезаза Бозсьичича шетВЕКІвЕ ЗКУ аУ42 «аква спасе васакоее зиспяанає всазееааех дока з виппскоє: пташник зба Є Хассе зем сепаския 4-55 карі пев везе ах поіповодив жест пек аках ЩЕ шкекакзаєи КОКО УСкКВ чЧахеваскоє ссовоковае пафскавнат пазсбоака рн

ЕЕЕсссаоюв оС ша Сб вВсЕВох поза ЕКк псеаваєвих есе до шле шоп с Я зло аля сота кавова каезазавеся сему КЕ пава сопе исе зскодсве епос овас Макс Во бокову ЕКО тЕкЕсвоуєви «ЕЕ ксза з«ваекакаиа паскою бокс здо нехи совазакшос фена рювовсвісю шввадпоана пора катка шеВуУ чЕЗаоик: вкзжсакачх ЗЕ ха зас кЕЗа меси ФюдшсеВКОЯ що падках хорах Зо ККУ семи шуми АИИХ ЕКО ЗА

Ес хазса спосо авоахЕввВМЕ зоре воосавкичо св асцоюе зако шпескацжакоа заз аки мчуамалевоя тет впсловене ших ЕЙ пктаоснекк забеанівою задачі Сусувециюю соби БОБИ зач скзкукоаосх засчевеовк КУЄ Укехта спеокашеякаФ саше ваше тух ко свсСтотсвоа пувКоватя казково сасаїзекк сечо садасеавсв ик збо виссву васакишсакос коізазикаок козеня Соки имВ пезЕсеекоє пЯБО вира ецнно земна Бфлаєтштнямо Бити спи хю са шт ур ВИК зпастевесь азам фаски Коочаоавако спвавуснася ВаКОСИ КЕ ЗВО ах ховаво каса овову зом себарот Кеносанису вспоючва ку а копакоціла аоаааавемі Кебвеазеко ззесадаас аасавовоа ззавзаса ие ча чакекотвав ази ававликово запо пса шеки м асо плону мн зічовакак? соуасессаса аствосее ув тоге доме песо ма відо сна аке сила сао болото маза Чубач КВлесееКт Скоуворруас БІВ епос впалададих сенс те впала Ми фол даму що коскавацину «пайсодевух звасвикиа авашонну Бахрах МСЕК Бика оухлшеиьмя кисла м стих шпон ия щомоазаке боскоававкЕ Б пексаводос азоасасасах чека везе жвавий доасавцх пято есе соц лвовах банк папбвиек Ко етави оф то аККуМИМИ ШЕ ДК ВТК кажан КУН ХМК 4 зіпаежанях БЕК ВОКат Хо исо бує Кома юю ваш запаси вузол вв кована ажеаї Зо снавна ЧСС взасос Кенио БЕВО звасктІкоса сосна щост зспкосадете сездктоваею лова ота я спаси к порно чек аксос досавеачас состава зону ие што зу маю ему Х щи У аю о мохи З тхедая чІ сУК тк У ша ллХ

МОБХІАЖИКИ В СТ ЕКІНМ ЩУКИ Ію ХИЖАКА ДИМУ Мои МЕ хек васат МЕЧ а о спеки орех шашлика ща дешева ФЕсвКатяе ЗзУссецеює авайсявая зосоокоувив скевазаа БЖКИ зтназсвсва заз сдков кистей Все аава ово пива ЗІДЕХ стосовно каста оаассеза бач ие заз аоави пеавскаая ТП зазазамасаь аксващазче зЗбкмапосех Екозсвоска візавасо Киоассаих тм кн НН НН НК и НН НН пу

МОДИ ХО ФАК. ЛИХ ЛУКИ ПДІТХАЮ лЛелюдмМАтетН ДАМ УКХ А УК ТММ. Ам с«зазчсаао сао свак Чазеказаду хассвиханов зо санка арапнаоє ТИ аазЕШЕЕтлаВ сумом ФителеВето соуси оче авова СКК Та завис севоя забивав ламає попав стпжшивтиВ раз ВИх ав возашкивока даю що сек ЕК цех. аяЯо казавасаве заоазевевия засів зе аккесаекЕк кока В ТЕО пазазивеатя спе спекою вкомолааво сорувлаєюсвя пули ШЕ зваїсаасна Кеалауваве Какшсжкеква кеВ сувою зош ЗБЕ теле неу асани епопея мопоюннаав песик сечо Тео их юри ту си и рик У пом У уки милу ІМ оду мури шуй ев ма тА

МОМ М ВЕ КАВИ КО ВАКЕДЖНТА В ВИНЕН МЕМ МЕ. МАЕ ен седан сесечсовех таке не ско вато БЕЗОКравкчя КК ах та вокивсенав пехасЕвомо кс Мх бешЕекува Чпазксаветя зав'ва кеВ тва кодами сазан ТУ МТ Ве бла Мт бдшдцивло села са иа ла

ЛКК ОМ пташкам САТ КОВКИ ДЛ Ва КОХ. ЛАВ НДІ ПІЙАЮ чик ка соска сала св свистка сис вишша лама пз

ТММ УМСУМ ММ Вимк мин КУМ ММС МУ.

Мале «сват Мама ранах ее осика дао

ЕвоМіяеЄ тою сомоматтю доби кокеа Хевоссту: висота ЗМК тус аск ма бета пу поибтмоюасив ехо нру та ВЕ «ост авив свои авксасстак КекЕклеах сосках Синє ЗЕ

ЗаасквисаА спосаєсенме соовтассву Кдесакевасо зсекацеває вісожеое ВО «или шарі лова петанк типо са вда шу

КК ка оф ожива МУК ІМ ущ. міна жі дірн чани ази Еккту сала х павука лид лу цицею судину що щнас и ух, Б ра кіжнщитю счттраУЮ ЧК ІЮ Богу ВК гц Керрі В праві В рве ик К а

ПАН ВАТ СМІТ ми у МАК ХНУ МК Мт Кая ХвАТАИ Му БТ КМ х км мисі і Кто дерти и жиди КО ОБ ОМ хи слі лис М схуд ня МИ

За о мо У и о и ак ну М Ва Ж о в я З Ж С и о в КИ а КД ЗИДІ АЛІ ДІМ КУ дриль К хх цим ку и ел І Х ІД КІ ВУЛ БМК ща Зап

ДІА ИТЙ СУКМАКС ТИМИ ХАТАХ ММК АЧЕМАМИМ ОКОДОТуУ Му КВУ Є У дасте м мВ вихов мо пев о пами ему до еме ВКО м К лох дах зач аМ со ладан пшецваюи ЗУМТУЛИИВаВ срКуВсвВаМАМ пвх ЗЕЛОИКТВ Іо ззагславв зикеспайик спІсвЗааила даси месник КАТ шт ефе ун во КО Мо в п З о о в В а Кожну о ДЗ ВО м о чо ль нм оди зако Ви хм прожи ін цю Качан о и віх ек фути ве Мети в «Ж КК дих посту веж мтлІвеУ ВЖКЕЛуІТ соски Мб смдава спукчавЕс писав ВАХ п а Кн а і а а пп и о М п М п п ВИ ЕК С и МЕНЯ щит кепаинеЕкщу пора кАтКХ ККУ БУХ петусм БАБУ сад вхо

Блесюклще о пра сти редис КК ви сив д пий тиж аву ОКА МАЛУ КМИНУ К МУКУ МиМЕМКУМИ ша пи мір щік супу Ю их мму оміціхиє поді ин ДО МД прив Ум сих ами Су КЛИМАТМИ У ЦИУВЦАУ УСТИМ НУ М Кут ВАУТ АХ ПОТУ я Н Я : : в Н кот сх щоки пуитис окис по увК кивсмои поК у ВИ июМ адже. реУанани поета ссосзаони захсаславко еп оеалих й ЕХ «тк ІМаа ККУ о і А Ор НК НН НЯ пилу пелікани: сватів вишлаткщи стутассньи Ва сашяаю зако ее ше ода кім гео у ІК ето ми. си мітки кі ВОК Вк фуда кт пло заскзсавини соазезаких асани паза вищим др Ко ЖИю плов жмішеит сок став сво маех кет скотЕсЕ зп еоакох плавав СЯ соло уу ОСТ Елая шт ссилку ДУЕТ Ю щих А ве елек ва атмка Винні х Вес лака Ва виЕ весла иде ту пщтощшксшас што КИ ЄМ еках ВМС КХУ худу КУ плині мМ о У Ж КО М юМм их уи кВ зви дім пуер ту мих пух доссдазанаах кОопекотваО побосои а база клоаки Та сеоУ КО трати: ВОЗІ лину. пряжа ЗИМ и КИТІВ ЗИ дтп о сужасетмати секта м мита до нову гудлую т сю Коко, ЗА вспшслиишех орршсстицту ше х а рисам махи МК У ак дтп щоки су ОК шує дожитИ о пр длюдоу ую щи щитю є и чив иа іМ па

ШУМУ МАВ пЛАЛОЖИВУМАн КУ Крат ЩИЖУ. САЛОВЩОМТ КО Фр ОО У АМУТЯ ХХ ач дм емайутув БУК ваМвовлавіх сумок мо мак МиК МІОМІ ПА ще мхлиаж м КАХ Х висох сплеск ваше Вс ХК нн о в ва в ем Кн Ноя лаг пада ломви ЩО тел масою Мораль вла сили вашою в в НН НИ в Фа

ЛАТІІЖЕИМАМІ М ЕД ЕАТИ МІД ФА ТЕТУ. МЛКОАФМ СХ МД ЗАМ ВЕЖУ КИХ ЖИ ВИТОКИ час кодом чуже В хх СУК МІ км пух ил Ком (Ул КІ пли ВМ це палац все паж Фффосшсамциа дошках Зоо ВТши ен НН НН НН и З

ЗчХЛІМА КУМ КАХ УМА МЕТУ: УНК МУЛИДУМИЄВХ УДТИИ ЧЕМ ЦК х пає мит ит ому гом Ми стру мит Мо мм жим мим ММ иуиеУдюМ ОО Жуки чи зиск плеса соовисака пло олахмою запасах Муха чке ЗИ зримо состав разу алекет алое сла салі дере Заг

МЛДУМДХ МКУ ЛУКИ САУНІ ММ ЛИ А ЦК УМ ИКА ЮХУКУ МИАИ КУ МО нн нн НН НН НН НА НИ туп щех

ПІДКОВУ ЛІАЮТ ХЛАЛЕІЮМЕВ ІА слі пул ихийхл ФСІМаМЯ але мл ФЛ Х, ПТО. фомтув кое ВЕЖ Кат В сумка им Вокер вико мМ цим ЕІ чи замок зсав вЕКЕасисЕВ зпеосламеиша косо посади кКВИх Свзазккоа МОЖ квести мо би кут ломки мит ит чим ВИК ІК іх учрЕ УМУйТь сшшотлхзаци лезом паажуксва аладевслчеа совасенеаМ стела еух ВАМИ «руді цлуї ШО ВАТИ сук іц ув таж им МІМШОЄ В ТК уже ори тя хх аг

Стала лют СМ КОТИК ОНКО МЛЕІКТИ ть ДЕЛІ КИАТИ ТИВ ж КА суху Конт поту мачете сждехгимихУю єп пита пох тімпом БЕ Ки ко БТКІН лелека піти «шив Мам слоивааанско салати єоа пек сш молю мими (МД и лущо срок фета Же с и пт и СН авалушхимс сізпачахтав зекстасахалч бич ау Куиа тав уи ЧЕМ дувоифт піти вих горили сурми и ЩО дини пт ока ьи ау У

ХИТ СТИЛЕМ ОМЛЕТИ. ММА ВИВИХ ЕМ МУКАХ ша УГгМ затЕсавсяв путасу ато ииухх пава У бпсцоваляай зупавоаху 2535 казахів сатттраамай збою тв кохетуату бАаудавися забесисеу іп44о плвзавутий славовооМуи азуйвзтлавфх косе о бушосокоса сттекссяшх Мамо зкгазтцдлпво посозуатит збіссвспса зскстасаа спосо е хека НІ

Костхсаслук соиктацуєво втазоцрюттх судеитксаї пава; азопЕтяк хИвло : : : : чиксй псодуцисос зоб узоснас жопу соха «ас оова ват клаць вкзуМиолов НГУ птюзктдемао долото ТУТ «спаїл усві спекли пмосзодвосм їот4х сксваваМУї бсксалазу МОБТКдуйи поси тсово пак бкссикх ТВОЄ глузду зачу асплоезезсов аздалзоткта аческастко Бассмоїда смаках НУБ чезахззахг сатскосгксот ситевкЕЗ заазахоаса віп ховях атака їоп25 спафдпваулай свадалисх спестжатоу Мтабзайтоив Муїозілотл бкшсбоски 1пвиИ тжстїсриая свя МихМ сект тщтл птаство Мудра Мих саванах тп жувати бапосдадаси забава затотсзадо зчатоеватуто сосочка МІкОо вплубчстас заазстоосЗ звсезбахїх зпатьстсоах саткаавикок збосисахе рі БО пепітжатост оф срат ВЕссЗаїхук сдедасайхї сопваахостї зла хо заавзжацс жеаясваве пласка Ззсзуаувеу вущкитовив акушвІЛ Ка ЗХ удз»засліавн івсзосФгуІдо задезгсвзвас бавалуаома тагдасихит два 1:34

ЖМІЮЛЮСІТУЄЕМ ОМ ОБИУВКІТН М УТ) ХВІРТКИ АНА КІ ХІТ ІТ УК МК и Х Км зватіЗазат апліпувдааа гбзатодазо лзавстзаайаи саптвачтзівх повтзаквах Іо о тахихуїата гаподазваза апаєтзаця ззатоважеа вастісзвзазаз паузах. Ммізе жіанвамлаата аствзокута сегатисяваа бБедазазтужа вінаасеава вовзуалоивух 152 вві атщтав вшацтавткут сбпаазолах згас втдех пАТИВА МОВ ауВаЗИМуЙа їфпво атпущтзиозї взуатапвзійз Кватгсазогйу пзгтагалоіца авуакасвиМ пахжайлзіляа 113540 зтагЩввстсав азззсазса сасліваасо ваказтизаку ссатахаоо азвуакасах То зазаззанес ванідззпулт ваазвакасав Звтасасайаи плакала ОХКБІКщли 1175 тазватвивзЕ вівайваМмо ахазвтавла дпаакайвоу Фрай а хоста НЯ зтазаузуав палопзттувиу азс пт лраатя зб атники срюп ут лав ЩІ зЗкстлвосуа удадосзаз пчавсавзойз адалзапза аодазааийх давалатлайое 135340 зчазтутхссаєт фупассазул вауазаїзазоа заузахааза Зайва а дав жаатуая че зум уза бом оатвла сало лвачя соусом поч ллїтой бор мода їипБ5О

Ходазвсавой сачагчвача заледютаху Мука х було розу акаа т1512о їаузаавауа Звсуєсщавах Ес заа зазаазаза соуси сЕтвасзаая іщУ8о

ЧИХ спр страМмии Хссцьулви сло спумлтксл ситету сорх пусписмуУмий Мило пладтсацва сс зом суспижлтілух Уувттайх поумацедасх НЕ зиск встсва асасосзлане бкствазеко сзошоеахскх упора ул тАТУ ЗИ хо пцатапощшево сапвокії ахісахосі апізчсвлива зсув локон атх ка списки ко рало копаа узаєтвикекх пакета зола саєа тиБМваєккя їлх4вИ «піцасназа ЗощозациМу вазууаааах сипле зАЗОВИТУВа КОПЕКлшас ій кіззазозчаа сзавсава заток осв зЗата алу чьхока повакооо ГЕ пазли страту судесковух здолав відеотека тептбтолата їлвБО акткщситкс заоесукесх Зсатекавая пвазакавнов звазскохв врахову ївтЕо

Мдахакслво буспоєвахоЯ сеакатемаав сазстбуома уакщєаали павголаакая ІТ савакаксущи МЕС асзов са скааА Фокс с зузувізайя зак кажака еко аксасттля зхирамМул ях Фо тюлитс: тилруттиаМай. пакувати ведедт лю Мп мутсвуася ваплтсаоке сояазоебоІ ЗсзеосвЕсов Кавесвмхх аск спиа їх

Кока жУссви амфбклаиутмх оозслимМу здався о іпааєсиМм «тла з1жпяп кавхквктак тестова восвзатю базбтасато базекактсас хавїктотах Мова пичавичоМу птазааушазтм пагпжузщих. шитлиазтит Мудущвауате о атлия Та звзахзасчіа стЕбссабавз Сакс ав сакзавкюсх сеуашкокекх аск щих Ач

Кочсатуачиє позу аї Кастуботам гос осмалаА васваанавав Міс І30Е0 зпвацамват аспек Квахзолоатої асзабчевка засіб Е зусавсцах 13 авсоткціснра сс лпдасаз воацпитМогат Матка азаццаллві стцощтнак т2380 застсактсма супом спкахттзааи Кп Мкває создалозая послав а іч чезсеасттвак теассттстуй буси ут ях КЛулЛеактМх запватаМуМу вазу це НЗКНО сим ухю пев соа вещосвзато Босак ра сувахмасавс КАКАО 1455а мпктавкас Брока Заасгвикум: МебМощушет бущааспео! бу птлайх, халви ашпеміпакаї зазввоаМалх зазеявикЕвх посаг сеозечсск вла хво щапсцнац сплозссялкх офенаоюіваноа заавтКиМу Ктлравкавіит паодачемаа 1574 шптснрутиМе соолекоатяо пзасташкса гзбодисакс аккассваоа севкостеке 13505 азчхчкУслс тел залааст тактусяталь потопу стсвас Мов КкАЛУТ фуда ізвей зомосгзазца бшквсвато сасосвойчив сесзушавсм ВЕхшшКВоїа пепоакакаа Ада тсомсооскоаи ктапоадаєва спгошнвава заусяМкоМма гутузаваи самки 135

Мачуха зЗівакжМуїа поаМонласт Бак Вазаобесаї сазазвуєсмт ко сажа ок дапоавсзса ВУессакхта страте снмодазшку сх ат НЕ захи квик стаз болісна уТо жау«анйстлху сиву алдлою затЗлХ па 14180 агипазавцавав звапаасжааз зОкказавань аск скаві апахцбклнс хаказасекЕ 148 чзахдевахї спавКсоїсвах зекоативах кОоБутиКущт сулеатяос пеУМЕаатт, Мав всвзхахака вавзвізлва їзаиеиУукис Масвектьуло алєстклако сессполко ТАКО баліабосці Зала заптковіу спаМозвазусє тсавлимовк сс ок 14509 ваитлопазога зцетотащис вавцазесовв косо вссабссаМк зок Вау седлозоаті азатосікся сткоМозсока зазбаоосва суфоВЕККО покавквоа кажи о звоасізсзез аселіоаяа козсадуко вас ссср ьму зазакац у їаУщо

Кеапстнуї пааевсока стсвзаууий зчпазероцоа зобу втюах блилсавткйасИ А4550 зудрайяцуто Матраиоаойя сломиест ог рисзаках зтазчзавке хосЗзаваха 140 зізазансчав загоуаазекї Фпопетакта ааЗвквспав вбочесецехе Ффілтаваєов, 14155 сушасаченс сова одава асшинеоя спатактокоА слати вішаки 14нКО

Фикипакініца фрої пт лати МиМтсрАМОУ видвтпж цим обо оМо садка ка захо сстзсїМЕкх хабоведобо сів асля зиваєовавс босачкоса заз Еоцья хавао зевасмзласеї ЗиміавКеУс зксассвсвї сеїпемовае Фаїна зоб ух, їЗ00о лаки цівая Ккинвавкх сода. «круки вемав звкеусвнх втекла ї15лей дісвьсзима гавакававї бпілірзазаа чоессахт Кблісраката лока ї15ІХа їазаїазачо їазасотаса поскексазаи зіпкВкавіта зфскосаліва БАКУ 15 сртжавалкм боссвгмаєх пЕмБоесвАМ свати ттьк шааЗалаєсоа Мапи плаав їжи лайк тацчь ис оївтя сазтзачиву заг отим: азазгасаоя запали Мр зоае«чиїЕЗЕ пуазедиесас спо гзаздсадико платлаєзаУх засгігакса АБЗЕО сЕкЕвтакас зад ии Ва КЕкЕсце бкоапЕиКеах свкжпешнмо вазон Іва шли смус віха ш шк зЗавота заазеклсзь запачааа мороки, І5ана орати цуми фемлехяику босаттсівов збере сфТкттивсва спосте ів птатотксатло зазфреолас золі око занаса зсстекоата завіт аоє ї5аепо жизни Е піаславсвив пезекЗКаче лози кс осо єсямр состав 15БАЦ десь уальо свому пеосаксоусавз злочяьиіс скбасво ви Баба кути капотогнват КОМА МА ВЕСТИ ТИКУВ биЗптайехо плов КОВфоах КБляо чакра кЕтаксясас бцадалвхак зв'збаассв стасбозузос садбзовссоа вай відді соса сах ссстава забБазвазиск бус оЯиле завела вотум 15800 сах алі Мхуле стих пахеросяив вода тива сеазог а лаз

Мовсаюсвззо ззвассстоаз зазозсдах сксатсзсева Есе псачх сзехсаааах ВОшо хапттрамнмцту вату ех сівстяифразу воску цда сла утеья сддлудак хай вуст ктах чехавослеза атавачиво ЕХсвОсохтв куаблапися вс аса Ап о поезїшусильсс посіви чктавдовт пезіазтох сісхдзаханя демо кВкох НА «кОкторссвт пватавісаї сихасловов вазтсруматш тасьму бешелкиах зви БО втоклсоасиє спсоалапопс сізазавзазо вассдаалзау авбЕцпзавазя вовааскї їіс3Ко

Макао вазчозацасмі дзслугазосва ваозатачих зсавзаМа сезазавагх ЕКО апрески Фдисакт асо еватУхлрАхУ мем аваеда лу ЯУ зва авшупиксся «тпузМквао Зостлоцтйу зівсвУхІаа стветатако азсотажехки ій атокавскоЗ азасозссак патесвазаз акіазочвзач шспиксазеяе шко щост 18180 каавакісвіЗз зезЕЗсааз сі свЕ шпакОаМоОоМОє ахасваховат Муки тевио сапичтзаМо вайптотоьМо долали азам цов пешайтлиох созсксваєе ККеВИ схо мраих схтакохеалу псів двах абсЕцескав Хадансозвхто озУкКвовВЕ т157Л4Й пса бвссесовка Меаслоевоусв спека я жест хуо вага 188 тадзазжмьр сотка стшлимУвди пазазтземя стиакцсцлі пвглепамох Ів8ап чеасабттср папвасиоста векабєсалйииї васасасскс скепозалаа скаказеівет 15502 ссаздавис сх спжсвиав сабкокнхчаї саедасостїое суспденауаа бара жаьо СаО золота ваущиВосг вові «рамках суовміватзом Уста Та сксктзсакс атома аксвсбещть БІщЕБІабсх зІМозоасав зацзалацену мн асо тсхзата сеокакаквс зоба аваксосакав здо запа КЕТІ спюхвтварр; Маїс ваианшМ власними сслімаскто двовьатакив БОС РТИХО такачоамата казссаавт збулася зазсовЕкиака алое тає Заассєт ла ЕВ зиск ска секс Катсах ЗКсбтасака доасазазвоша асалексатх заклав упо зсхасачька зві закстс ссшеарахс асалааву остео какЕкВаЕК У М'Яоє

Оу уть луску ПВА УЛОЮХ сим Жет Ве хата ссозавовсвх Іза тисноівахас баомсосаас бесктзчатлох абупвзалав з сеаАники ФЕМ алолО ХТО пАбаатаєт сплесевсвао падазвезахел капеекастя сиве ела жиле какке ВТОКо писав ЗбскМалабя чека МоМо сшутькаке сетослосао бака веаЕк тай

Кгзбосозай зазЕочекао СТЕК ЕсМеос ФЕВ ЕсОУкт азоеФфіакстя солсувляєЕ Мао спсизовгаг засавачека кбдесасвця хаасеаймаї тофу аав вочобаовх МЕТО зуадаливиут спивоватощуює погроми «иа спрлажемрмюи пазвзктуця ЕТ ио папа секоа боса аахи Запвіловот Така У сбромупоета їтпабасат ізвжо сапштатуай забрала заз вазіво сла есдио впзажсвахЯ стсподаасї ща таза зазостзоло сип З УТ тюрми чи вовна ях тихі БІ еВ их ЩО ую міхи СКіфевІМ ТВ хо УК ММ УМОВУ т й ту Но ами Ек ме о т хи ї щ 1 Я Шіне гріхи хи ік До ДО УеНАНЯ у ік

Меї СУ БАХУу Ті цей ків Уа БвзЗз опім СУ Їле АБ обива ву Ав Ада ї 5 То МО тес щем кт дай ті Зх (У у його й му бу Щит ці дач мл ів о втш дв вит о і4южш А Іо б бак ОдКОЯ Мхт лиж ул БАаЖ ол

МН тої, лих ками код Бе

Зм й У т жу Мир 21 т су Шім суку М мо дич шт мм М; Тухи іх Зм

ТЕО АЮ ОТЕ попшжх слу мец пав о пеІ НіЗ о дврБо»же Су Ух лУМЬ Ах Бл пк КК 25

М Б по пі йхх га Ам зі і рю ри ву Сук іс Мік сум мжт фу лою пАгОлЕсд орки Аів тів Уві Ах Божко хх хе му мЗЮ ос ОКО ЕМ ОУУЕ

Б ВЕ шо щен і МК тих тиж жтіщ ля іі ла зіші шим СУТ ія то є дом аж осами о ЮЖЖ ХХ Ті мші УВІ: АТА СА пи АЖ ОА АБО ЕК я в з те що внут МА У їх: Ми ху Жах Хі ТА ун ІІ шу и Фу доих фран фу

Нід Ах Чо вно Вл ОдлЬ Буд осям КОЖ їх маш сл пе жа ТК ду ж о 25 ше Дошки 11: М лю Ар г мо гомо Пи 2314 Дошух спін пра сл дв зи АВК Су Сн ол Мав оАкА ВЛМ хни ЖУК лм ОБЖ реж їКУу ЮЛ ОАЩЕ г та чату

Ку а АХ Ач на ші іш Мо їм еф і Маї рве дає й ущі паї бар лк є пе Уві Муш (ех їй Азвошіу Мец ЕБе бек ЕЗЕшж Уа дим їй ЛІСИ

Б - т15х яко 1 же КУ

Тоннчю ост Тех 7 ш гон а КК т йокох чаю то. щік ла Ся ті ти: ч Тк. кт Для З. Жах бітиї З 12 х мож ха лі п. їх . я вхо Оу пех о бБшЖ діа Ало Кіш вил АЮ вав АУФ КіУ їі Тлх Бус

М БО ша

Ух є МЕ гля пнях ТЛ тим Міші ті хну МИ бек о ау зе осрУх нм пу КХЮ о шАУ НМ Аве о блЛу хе ща ТкОо Біне Пет о хех ОО чаї чик Зх ди за М НА ії:

МВ оф До ах им уд ди гм ЛА й из їКА лише МЧату фору Ухут

У дує жк ау сш Х ОК блшашюр СУБ сх АХОо БКпе да си клема Ба тих Уч Бен їж ае У

Пл пе що тю тик о укр охо г ем жу тяг: Даю Мати еру бух оту мау паж А Бук За ШК АЖ АТ пшАшЖ ОзаУу мипи ЗХ АХ жбКе Кук дЕД ї59 і ї5В чн пух баг тм ІТ роки ти не но НН така уч Мііза о Тзу

ЖЕО ОКХ ЖК ут шХ ЗА Кат Між Хо шу ВХ гл МУК АЮ пив ци лек, ту тп їз шо «Ол хі Тим М жит дак У мо шумних ул ххх Мія У РАХ З Мун мух Мщк мух хе дн АК ух мав о хп о ма муз маш жало уді ву о Ахс мем сах ЦЕ тюч Ії Кк, лесУгІ аю СА М

УКО 31-11 Же наш сашн а Ж: Ж суху Є исти СИ; Тех мак, дим г - що

Хоми їц Те ІТРчиМ т де Її бич я Тк Тк чу ие Аме «ух шо УА жо глж оса УА дна цВМ лев їму ху лищИ млшЕ УМХ ЗК їжа вжи БАКИ т Б й хи А КМ ху т МІ А ху т мч А х г. мо КИ Мозк ху - я оч рАЧЬШИ Тож

Щі діа ді їі Аза Вп АТЗ ток їдли3 дід пі тр щіщш ів дій ДЕ: "вах щі зав УВА фл ЖИ ХО ЖЖ АНА Аа МІ 4 Му пів ваз дід де п чаї шк чи за по ту «1 шо «У

Зк сб сл; Маю гуру тема Мі щ и ну й ЯМщ туту Ху Тусх 1 Мих

МлвБОоЯщЕ о хМууУ дит схАЛй іа маш айлогАле Ся ше їхмУу шо Буд о шау пшЖХ тд нЗшк січем кору КУ ау

Кт» Аж іч бує Мід Ав о дисгр і Ма ха дик гу биЗМи (мо сСМкру ДтІ шкКш лжЖш ми мух Баш маш АКОЯ ЗАВ УВІ Іа ВСЮ ЖК СН лу їду гі ха бу тиащ я ти І и кий «ії шу іх т А КАК КУ УК дю кож чалЬШКе пл кое Ки РчЯ МУ Ж Що ух нЕж Вів о сац Жпе Вів го ТЬж о Уді біт опал ву Зв Аве Ааа їбвох Аву піти заще ех хо «Сх БІ

СУТ. ие ши Не НА У НН Мем о без Воші м юю нн т Ху УТ хащах АФ Ох маш От їз ОЖМХ зУД вАБЕЮ Ох п К ІП де ми Ма

ЧЕ яв тах туту 0 31 ТА МАМ

Хікс Ми Мк їх тощ и НИ тзіщоти се У мі ск

І ТЕО І, ТІ 1 АК ех до до НИ У -вх ІМК Я хх

Зах тах Еко Меб Бе Сец Мек бет дк бул їі Му о фах їм) 3 у Ж «КІТ; и А

У каш щу се п я вк « - -- т: що о кі Ф зувомнх та Фе Хвх п у Сарсхлу сбшХ АОЩМО ЖшАМм лА гло сМІш мшАУ УЖ пд зах пит а І аа

Тим б7ечх бю Мі б ех дід Бко джмп Був сині, Бех Пік щі піз) шву

ММ о АхУХ Ком ла ух АФ ЖЖ Б зу АМКУ ртТ МмаЇЖ стадо УК

Б дих ча ло ЗИ КІ

Тов ем ум їі їх Аїд балу Мід їду де мм їй км А щи еуш жим мух дАШ МУЛ мал ем тк МАТ ут ФАШИМ от зво МАЕ АМ ОХ

З З Не

Ту Маю Чу їз Доц лк хі лі 45 1 й зл бах им Її из ку мущш пах кпк о шеК екв Кр ща хі Са омАай ОВО УДдл КХш ЕЛ ФО БжмА Ах

УТ лм зах Ром зи я ЯКЕ зо:

т « хі : є Хламідії ку, Та Тих М

Жах М. 05 х 121 нує 52 бщоМис тур МОБ о бщхі Ше Та Хек о їв Ме

ЗУ зар ЖК о жаХ лх жЗА АСБИЮ НВК ДУМ МИМО МЕ Ка АБО ОФЖ ху ж г 43 43 х

КУ же МО ч До їни Доу Тому 021 дж т її Тлхдосрам лів тка; уч йди Дім іїв Ако Буо АБробев Зі Ат біе біз Був Тжв отв) Би Ах Ав Хів ага 45 аз ли а я я,

Фошікн Зх пу с Ми БУ облек тим) й беж Міг Жіп їм) Ше дк кпе о мжке ФІ лож аАФТ МЛ ЕХ КУЄ зим вже сум маш ах їм) КУЖ ЛК су зах диц 135 445 45 - « - й г се Кк жое 2

ФМ я ТЛ 5 Кл Ск моє йбщух їх 353 0Х рю бю сих З шу ФМ

АЛЬ Му снАМОУХУйО БІБ бзхІ вро МуУ УА о сСсму Ух еш ХО КЕ Мр за виг я би це а ще кі

ІК ЗХ ще ії ба вв о Ніз Аза бе; дк їі Уві бах дво де Меп їм із Ави мМ мух ВЕ опа ба ше БК нац о УЯМ маш адм ож МЕ ОМ МАО МИ че хх, зм ак Я а ап а Я 25 З ; : не п й -- схилу міх міх бу Же тн їх пл дам М на шви РОЮ тах Фі 8314 у

Алі шк Бл о Уві бе РКО Ні дв оБбвК Еко те тн ПУБ осла ща УуУХ лих па жах

ЗИ У МОЖОІХ

4 в К їв у 4 ЩЕ я дшио

Чек бив ще Тв е о та бик і ду спе Шрам їй Тора йду Дів Аз дя

КкшУ зу вка Ого ніж ЕЖпеж бли АХ Я ТУХ Х па ого Му вай мам ач АК дог лек шли кл їди 12 ши Ко АН чех Я ех два кі У КІ пак ко У хе

ЩЦла о Я ЧН Яаєуї ЇХ с 501 Із се и НЕО Мо до їжу Свую На: « дід Тс д 1 х ші тс Уві бро сі Ж аю Ах ее ВА дув Сум ОК БпХх ВАВ дух ваз гу я, цап ик я и. ий

ЗУ ву у ук Хо їх г ЩО Ки жжує Мішее То шо А шт Таж Маму ЇУУх Шик чи Му

Я Я М ТЕ 3 - ІЗ ід На м ге т У ї оту С у ЖУК чвх ов кр Аае мів ва їх оБ-шх мив ож ка вшр ву Беж щі Ока мкг» озу що худ вав пам ще : - учи - сх ка ее т шо кни Уж хх- хіх лах фа рах хащі їв бів ів йід оп Лі Аді йїдп о бок ліз Ма

АВ Мі БКЦ У ча пу їа із дід ЖЕ о їхАМ вав ода БеЕХ А ді хм що ких ви м пил щі о ад М А ВЕ

Жахи МЕ у ою ха Мі бю щу бою те ся Хм іх пл фодмі Ти

Ту ж фМЖ ХмХх ча лаву ро ТАКО МУ Оу й хм жим ВА АВ МУ

ЧИЯ що ших цде МИ Ку пла МН 2 іш іа А АТ ум Ак ща А шО Уа ше -вИ еп гух, ях пек я У ех З тА ЩА хи

«піде Вк «ІЗ шжучНнО ПОСЛІДОВНІ ТВ «Ж свїе праймею

ОО 13

Ккевсеатлеає пелеМсаХщ лю Ж «тихше КУ хх еш ДИХ «а Беумна спзсмллдоаасюь

СОМ хи рема «ан У джтлпшннаушивта «єюКоКи Мав Ям их «кій 1 вчнни БУ «ВІЙ» ДИЕ

АТО ОВ учня поси денма ць ня «жи праймер

ХЕ

«асп І

ОВТ ИЦИНИ ОВ МИХ ПАХ

«кп ТЕ «ак хе «ті ДАК «Ух 0 щрештю Тел ДАНИМ ДАХ

СО Ег жах 0 Брама «ап БЕ сталому зі свеи З їй

«ІПМ ух мн

ОО17 «Ер ЗО «але ДНК тА» МІусетіана сарасінй под гух чан

УКХ М

Мосапсачаїба Збосесава сасавсосакі возаєрвив: сасастьвовая казок р хМтлаасии МуЖиптлеа закутки. аппуласта тупо уати апреежокцмо хе зЗсзоУоащим сухому бувала заст и паосавзлва соках їв

Колона бли Моска Молот віся запам аиеМ есе ахя тай зига«сзаза апекдасоза зазазесахо сзксозеепс соусах аях возах до пиїзаипитуир адесснляант авта 335 «км 18 тя ОЯбЯ «їз ШНЕК «813» Місотіала Кобесим «ях ОВ пзлсазакез зааксталага бассзвасако спзпавокиа стхазпасах павсчске Бен тиазх те боці амт М сртрамуєнут стсокоамутьяа бовазехуави вусатий НК е схвавуксаз будвзузавох таовзаєсьо азазаловош бзатсокеваую сптбалтовиа Мо ачекисоавс слодаваудеї слудвепОа хезсаоехсу ЗЕівЗкЗвазаз Кврзпвава 240 ахкхЕЕзІслта сестехауаї За У стик ста АКЯ порадив ми зпУжксМуст Мастсзоах сла кава схастессем скамакува сЗзозахеки Зо ака ЗА «Віп» ІЗ дк 1518

Ох цик

Аж МКК «МЛ МіхуотаА тних Хата ех 15 здо нощу паса пока Мобчасоауй пусимаюєтьй азам. Б

Щитохлнуатил Тл устлла зламав завітала сова зе тка дп коавсвто сасуевнах ЗфивовВтса подфескаии вокавусюво стос 187

Хорщіхлетомух суди ужниЗ вачаказози ЗаКИЗМуееМ ес весла ПАЙ тсїтвсвансов спчазеовасех соугавзлпаза беспстаатсв савокуссв апа Бе асозснатох спахідфеасао севоаказеяМ соФфазсвяво задав бзелаасекя те педчацув псохепцискХ Есе бвета звізскосчаз віозасавсих пт кЩлЕчак а пакзахоусвсов пблчавикас шо кзУ авозак З зчасекласзо свопи 48О втравеаклию костєлаєсуй возоктая Козітрауто дежежеокко кої ух аг

Зшити КбоеМаписка зиаздвасау серии мата см зує дупло пс дешскскоамнр зпоаикених стивстопита сазблилека змспелящею пусвмлологув ВМО пазлів спла огна ачоиктлакой ставок лиа спекомУєт стос ЛЕ члпазвиксаа шссвІлскоЗ шоІхасехсзпа стапсаобоо спассєорї запасазацо тп стпссозваса писався сапекЕсвке ссікоекакак Блпасскозаз зво са ато «кооуакипсосо абоссзоваз взвачесасє дествоскаф пвасосзексв ссастааке зп свиауХстаптия Ботсзмта смт веалеагіза бзсзакічйва звкзковМх всзасатеза зва првовівсозах чопаАсааосса гіпммави амнаситя тт битою. сире, МОВ чазчфсастиз ззаоваза хоалсоахахс бзобовачав тсоазсзазо Зоя МОщо паску ай коссвсоаазо скспсавова соазвовОасви саспазеази сзілрхизтнає 115 пагазасая вого савасвакавох псбказухао зазтяаачьса пакетом Не азам всссовсанаус «ЧоМуостаа зкаволеьх сахсвакоке срмсаоацік шо ттоакасеця збодзасько ауауЄаввас воадовеоу) вказана ее рисх І325 зазуза ст зтсато апа Мік тсгя дечоеаємиюми еп 15 шжчусазазаче сгиазЕксво звису овал паса ба овов 1448 типа зсза свзсалисЇ псасзасацаз савКогза бас осдидх сбаглегнуко 1550 аптанксУсьсх свлкдсанах давосзвих зствкатаз засо хсзаз поле лЕле І5-Ей плпастзадшісеав пахло ухжв: зЗаквазсєчУЕ состава свазечяес зозеаоаа НЕ цитвзавфлір Мт цатна пори боавазвахо Зозвішсео воза 1аБО чоквкІЗца палакаастос сусла здза апа пілрлоют ав севіуах 145 поувославав заводу фосзав бловілвахац спаси ср леноениу ко

Потагасхая ях НЯ «ЕМ З ким 155 «ил МЕ шою Шежиі ко у ух их Базі

ТАК лим ва печати мих Ех

МАМАМИ я

Ми гі Так Ха Хі В За тим 4 хи. б ага см Му Мак І у Ву

Ме Мосмуш у СО ХК ЖЮ ОЖИЖ і иЯ жа ою і МД ХУ ОХУеКО ЖУКИ УЖЕ ММ СХ ГО

КУ т З обу КУ 7. а КО че я с хх У ї. хх хх. ту Ки ВШ Жов сни оку ие Же ххх ОО Уж пок я тику кі МА МХокіх 3ії то Я Тит ХУ Фа бух Локуух лох хх ето Іл хе ЇМ жа ОК ФО Ж М ЗА БЕ ТК УК МАХ М мує ВК ТУЮ І У лу Тх ях

М ОЇ вх й з хи с». у ННЯ сеї ме я ж ет ЩЕ - що св пінг ббеджх Мія Жду Пе Же лікує їжі Засуха току гм Ах

ЖЖ В ЖК Не му МЕ Ж ЖХ ШО ЗОЮ саку МмЕЕОУЮМ Ку Х МЕМ ОКУ еВ ра ЗЖН її

ДХ в ря

Зх. Тут У Бе ок лю, ож Ж но пох ке нн ак ТТ. ре Жожккч ТЕ

Тіт дув їду А тю тк хе ку. Воду поко ші ве шк Ем Кия і ММЕхЕ

УА КК ХІ АЛІ АЛЯ ЗВО жав. АЮ МОХ ЯМ УЮ МЕфБОю МЕ МБТ БОКУ. ЖНА ОК ща ге ЯК

ПО Бак: тих т шхх Ух Уже Топ ТЗ. « ан те ха То хи -Нї гію ка и я сечо 7

Щкх ТАТ хІмУ ЕІ СКК. Моя ЗК б тк ли ХюхиМ шлю Кл СТ ши жу жо Ме жа шу УЖЕ вуж М дж УВК ж КБУ Ух МЕТУ ХУЖ Ло СА КД ХО ФММ ек «вк за ще

ТЗ ТИ ЗВ ЗИ

Мізв їз (ЗІЗ Та Щччх Тих тм Кіш їйичч би ЩІ Її «кс УМ; коуч Мох КА ж х Б ТУ я ЗХ ХК АТ ТЕЗ США 2 Кк їі за г (с ШК ЗУ х СЯ заАш омаІВ Оп зов вжи МУ о сАп БеК вро дв бух БУБ Бл ах ЕД Ах

Ки ко що г За Я

Ма що МО пуд духи и ж оч З З і - тре с шежди тру пк і шк з

Ен хау хх Доза Мих тк АВМ Мао їні бах ік ІІ гм тлі 1 ЛЕ

ХНА АЮ хе КІ МІЖ схо МИХ ТУ шиА МЖК Мам леАМ КОМ АТ ОМА ВВЕ 1 ТІК гу

КАХ БКЦ АК вин АЮ ад кий що кон о А А НН ве м ке

Тік ЗЕ як КЕ й Тед у їж їх Вот ЗБ Б їх гом пу ку,

БЖХНИ ОМА ЛУК КНУ о дм ТІ см А ЕТ КАШ Кп мем ВМО БИ БСК

В 55 пк

МАСУ ЖАХ і У фони Ж фо дю я соди р Не в А НН АКА АН ги м пух є

Фокін Мох «я Тк. аю Км ще пл кииж бо ух ти Сб шу їх ТЕ Ух фею

ІК си у и КваФ МЕМ Жак г жо вве мі ДЖ шу АЖ СКМ СЕ олугх рак ЗАТ

ОА ря к Мах

ЖожщуУтЄ Мед Кинь З ОАЯНЯЯ Ж х г А я «у. ХУ з у щу Гах А ЛЕ ж ТИМ Тавуи у МО сМжи Ах

МАК ОТ У шО Ж КЖЕ АХ сей ЗБЕ ХеМу Ж ЗХ ча З дх жк

КАХ КМ КТК ект зх вики я

МОЖ ло ТЕ шт хів

Ку ку Мви МАО шо тр, трох

Он щих кутя ЗНАНИЙ ОА

ДУХ и о и я хАДОМ ІМТ ОМЯКМА МК СИ опи тух

ІТК ЛХ нтил.

ПОКРА ак зечееа екс кц посох ях бспзевемк сових зак НУ серия еротьки Кар ихУє мини КК суч М Бо Ємешомамерк сю мови Кей ФУТ БЕ У

Сас и ии а ва во в В Ох В В в ВО в и и З М и м в ВК А щовисіао сс касх коло лава сш кааою ашкоуктааких сл кту Щи

Мотиви ЛЕ Ша ВшДЕНИ ЩТ, Хр дик позикуи паста щи

Енн як и а м ко кв ва и сл м В в ов в ХМ ЦІВ М а В М В ЕВ В КУ БУ 353 ЩИХ ЕВ. дм

Коли тихи тоесени ширма Сіон кави Фома зо

Зк саке ших леоавсквя човни хорах хе скла кчоов си:офии Уа чвлалтсваат щиДеИОИ КЕ ЕКМЄ ОК покчвксюси скаже яс «Епстарекав вктаче засни плов ях Я втцачкнтю Кирик ост практ ово савшжккктоа ав бикее по всисшо ас с КО сиза сорт ад квВ писку ща

Еш омтая практи шеВпЕиома тато шА Зк ониІ пощишчеха ВК зносі Кетанов «аа спа всщем КІМ КАК Та щфнруаимоза Коса чек совеа пове се дес ня певен «пу ацє печемо «Змія ах сома шик що пецоазесхсв воза позах фс кка сосок сосни ЩО шашкпсаох соти ваЗ атолаакооя хо Фа камкх злами БІ

Засчввоч Зк Коалаиани сала вишка ско ааВ. пий

Мавки узами лавах Сртрузавцц схо КК мо писпжшоМяо Есовстамру сссспожвовоа завис састевчанай сао ива ха зосзоавиова «дом сль: зедтатзайт зеЕклзавос авеваациа вИпвксчсв І

ЗУ дека еко псикал Ех СВК ИЧЮЄ соска хе и пт скеув подав пев сип сома кох са у хо пиво пекан руна ока шт: СПЛИВОМ вже БО тупик Куюа я САТ КІ Е З Сх ОЦК Ме х423 пев садсапцова Зслдассовазя зФозачавщкх пане са сакакакисих КО стсакавоах зсозаксноя зводеаевкх зскнтавве саке ЗБК Їж мистасєсеощ повасконих фрез аєи чБишсопомса зви орати ІБ зсвоскавад соусах орали безос яоспкен ккеаовиав хо зскосхакко фак ва сісвомлосах Звавзьсаму Вес совЕ засеваст ВІ аву шщсв павашассао качелоеслк подаю Мерзаек Болена УВУ

Фе мошсюя пах і п гух т ху АЖ М ши ліз

ВИХ АТО

«ТАТУ. ІУНе

МЖК У

Ко а НИ яКЦЕОм. ОЗЛАХТИ ЛЮ БІТ ЛЕНИ моде тат

ЗАОЖК ХО БК

Мах ел їла ж. Хом Лог Мо блву; тю бо ха духу іш До Бр у слов шоу мА ОКЦЕЖ ШиЩ АМІАК ЖЕК ОСІМЖМ да Її жо ж ЖЖ суду ФМ ших ол» ЕХ 3 т тв тк

Кя Не ке Кн

То Для чаї й Ма Сама СМ самі Пдх дика Да Ттм; Ту ЩІ кі Б

МУ ММ жа АК ХХ ЕМ б еЖМ мя КМ АЖ ОМЯМИ се ТК Ж АЖ ЇХ тал Ж Зх

ХЕ ме НЄ

Іхжх: Щоеджх Маси шує Їх У хі іже м лу Узі Ме сою Мих І

ЖАХ ОМА ГУ вихо ма МО ФЯШЛЬ ЖЖ ШАХ ХХ МОЖ ББЖ МОЖ. СХ ЖК СМАЖКХ ЖУю МЛА ще за ах -х в хх пл ю Же им лом Жах 3 дужх Хе іх шуху Ах Де Ж жу ее по ОК

ПпАМОдис бами бю» АЖ Жах Важ Мо А шнек СУ баром Кт мех КН п ме ше у СН т

БАН в що ро ан нн ач о НН о НК НО ах НК НА бух МЖюшжи ж

Аж Мамо лик му ТИХ ЗаАєш ШВА МВА їЄРХ ба здо їжу ша Важ иНКя ЖЖ ОТ ек сугу - ка с т І цап о ке їх М. фею жі ЩУР їм. ук Же ШТ УМ ух дше ца Ж Жеуєх дове ПТК ле ших МАК Му Ди Ба Ай МЕЖ БЕХ А НАЖ Луущ БжО ВОМ М пе ЗО Ух

Фприза щої схе дк Ша їв щі щЩіх лому сф ул гу р іх 3 Ку

СЕ ЗЕМ дж БЮ ех їв ЗАВ МІВ ги ї Ук ово На СХ жом ОВО т; Ух чл,

АК НЕ МІ ік М ща Ма стагії сюда 4» жи в Зі ах Зб ші хх М вх у тТпжшО Ух вжр вк Ам ЗЕ ММ док те ут ПЕ Ко Бе п еКЩЕ УЖ лХ 115 зай Іще

ХХХ ке АТ м С К Тусж лю Ж ге живо о и ЯН м сил, яки кі меч жу ую ау Ше. ми биЩщ ни Бім ух де ХА пк І Ті ТК хе дер ой бек окде Мей ті віз Дт вер ойіа Хі шу Те стр Ба

Я УВО ха фФомте сСбхву. Лот Ті; сббуже гук ству суєту 7 щу І

ТАх Ше Се АХ у МЖК АЖ ска мгю бХУ ЗК ах пут, ЗІ У

Кая МО Ах

Ве З

УК лох сь ж КЕ

Б еКн МУК штуту ме

ММ МИХ

Ле ЦеУучзиа поплідУвнать «Пи тяжі Послідовність ДНЕ стопомутеанежя АВМ ЗІ: ЗОМ ЦЕ чайМх калі мутація «Ох гл папа вдих Т1п3р.. 50 «ал Од аск еповат бат чека МЕ Хладаехл птлацосспа валом во зо скховас помагбоссповсл бФопзацтіна злабсочозає сова поха диска 152

Кона тяИах захв ате бБоацівовкса зозссезсв заказ акху соло 135 мережив асу стзулваї азцзізалзас чагізчса восвчовзиссу або 4 штлапдессих слава вихї сезачиств» Мапсказсзая савухлласа «лтоцвалти ї0по зккохсовочЕ саскосвове ск вакак зазоззавакз ЗаавасанлоМ Котов Зо сукзазінкн зол ИшхоЕк Маска засазриєа аказсеовет поетесу яко сиру дов Бпрталлуат пси ас вес аМісему спас ато кох що зга заксоп птслазитаз ваза рана їраумоєномаМ дпвасетьЕто дату 542 хепозаеах ксчастсоуа дезатазко) сс ковоа зазозакана абасосва соя ЩО кер сзаз зЗасакоссаї сазаєсокхкса савлоссека збі сазавса зианокЕида во зЗінкж ун теру втоавза спракковьое соб авипо сша сиди тс щдавсхіча степу мІмтя пуб иКевИ моалудитту пізаптцх фазшдсвапфяа з зз скаскавоса ахозлаисй сао свКе спкбссзае бла кспоа чола ща пивовослисва азам озсват здавЗекахе заствекла Звасзсазксв сспсачеа ЗО лежу сив лора: їзда акхтов Мзогаксозвза лвезоовхх вссахакса ЗО азИпзбзоЦах зоплнтваєцв хозащдмавиц света митом осо їз ззазісастз ЗузокЕеачле сЗцбсатаїх азарт ссецезкяаай теме ТОКО свічу зово сооевсвати скссзажсва Ззазоазасво засос село ова 1145 ласацатжай мин псвст сзатбвтаасхМ кава с зазізацаса астма їЗпо зач таза сзспааака сеамтбутуоу вто х пауталйструл. ДАНИМ зо сУодахпивая атхавцасоа зоаздвоквав сасзвсако чсазазеооа чапокоих 145и пктлмурато єшулутоаутя сомиучачива МУ АВОВОС пам ввела УЗБО пюре сорапонм рос зЗблакозиУ азапозизаМ Вочзвусзаоа застала васх хо зизкстав севсвочовУ зхаастдаха зако савтстоса сасатлети Мп стиводатях: Тмівяпуьоя дво Фолс щлат свахи паса иосї ї1550 хеспталстачат сзазохсвас азпзоказох зстспстзАщ заессплазтах засоколазе їБхК закис ааат каса поакоекос пос сюмаиаия сс шоаим Же БЖ зЗИихщидаху чЧтуеалатих стул сах Зесчаттацуи тло влИші За меча май щвахбсофнюю сива єстнх спзкзатзка соло зьа слони ща бусом Ущю

Чвсикивува жватлаци її «ШТ БЕЖ «ЕВ штУЧМа ПпОсЛіМОоВМЕсСтІЬ

ЕКО Аманскнопохна плопідавність сволемутанив Зимує: ВЕМлех БЕХ

Ми Су пф їіюж Туга дій ша фе п Суз Веє АвроАвр Шелл й Азов був Ат Хі йхт Уві Сеча щі бе пек йКкЧ Акс оце був кав о БхВ с ІУ 2 а

Жхо балу отТкводех шву 16 Жук бі Ніж ФАу Аж Кнз жук ію 848 Нв з 45 15 із ака іні Лія ів іа АвроБко дів баб БіУ Вар опід Бо їм) Бе

Во А Що ав в

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Трансгенна рослина тютюну або її частина, яка характеризується зниженою експресією або активністю аспарагінсинтетази, причому зазначена аспарагінсинтетаза включає зазначене нижче або складається з зазначеного нижче: () полінуклеотидна послідовність, що включає послідовність або складається з послідовності, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 90 95 з 5ЕБЕО ІЮ МО: 1 або ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з ЗЕО ІЮ МО: З або 5ЕО ІЮО МО: 5, або 5ЕО ІО МО: 7, або (ії) поліпептид, який кодований полінуклеотидом, що викладений в (ї), або (ії) поліпептид, який характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 78 95 з БЕО ІЮ МО: 2 або ЗЕО ІЮ МО: 4, або 5ЕО ІО МО: 6, або 5ЕО ІЮО МО: 8, причому експресія або активність аспарагінсинтетази, як вона визначена вище відповідно до (Її), (ії) або (ії), знижена у порівнянні з контрольною рослиною, при цьому зазначена знижена експресія або активність аспарагінсинтетази забезпечує зниження рівня аспарагіну в обробленому або висушеному листі, що одержане із даної трансгенної рослини або частини рослини, щонайменше на 17 95 у порівнянні з рівнем аспарагіну в обробленому або висушеному листі, що одержане з контрольної рослини, і зазначена знижена експресія або активність аспарагінсинтетази забезпечує зниження рівня акриламіду в аерозолі, який утворюється після нагрівання або згорання обробленого або висушеного листя, що одержане із даної трансгенної рослини або частини рослини, щонайменше на 20 956 у порівнянні з обробленим або висушеним листям, що одержане з контрольної рослини, і рівень нікотину в обробленому або висушеному листі із даної трансгенної рослини або частини рослини знаходиться в межах /-20 95 відносно рівня нікотину в обробленому або висушеному листі контрольної рослини.

2. Трансгенна рослина або її частина за п. 1, причому рівень аспарагіну в обробленому або висушеному листі, що одержане із зазначеної трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, є щонайменше на 22 95 меншим і кількість акриламіду в аерозолі, який утворюється після нагрівання або згорання обробленого або висушеного листя, що одержане із зазначеної трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, є щонайменше на 24 95 нижче у порівнянні з обробленим або висушеним листям й аерозолем з контрольної рослини, при цьому відповідно до варіантів, яким надають більшу перевагу, рівень аспарагіну в обробленому або висушеному листі, яке одержане із зазначеної трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, є щонайменше на 44 95 меншим і кількість акриламіду в аерозолі, який утворюється після нагрівання або згорання обробленого або висушеного листя, що одержане із зазначеної трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, є щонайменше на 66 956 нижче у порівнянні з обробленим або висушеним листям й аерозолем з контрольної рослини, при цьому відповідно до варіантів, яким надають більшу перевагу, рівень аспарагіну в обробленому або висушеному листі, що одержане із зазначеної трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, є щонайменше на 70 95 меншим і кількість акриламіду в аерозолі, який утворюється після нагрівання або згорання обробленого або висушеного листя, що одержане із зазначеної трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, є щонайменше на 88 956 нижче у порівнянні з обробленим або висушеним листям й аерозолем з контрольної рослини.

3. Трансгенна рослина або її частина за будь-яким із попередніх пунктів, причому утворення глутаміну, аспарагінової кислоти та глутамінової кислоти підвищене в обробленому або висушеному листі, що одержане із зазначеної трансгенної рослини або частини зазначеної рослини, щонайменше на 10 95 у порівнянні з обробленим або висушеним листям контрольної рослини, і/або Зо зазначена рослина тютюну являє собою рослину тютюну Л/сомапа Іабасит, відповідно до варіантів, яким надають більшу перевагу, рослину тютюну Лісоїапа Іарасит типу Берлі.

4. Трансгенна рослина або її частина за будь-яким із попередніх пунктів, причому зазначена рослина містить щонайменше одну мутацію у кожній копії полінуклеотидної послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка зазначена вище в підпунктах (ії), (ії) або (ії), відповідно до варіантів, яким надають перевагу, стоп-мутацію або стоп-мутації та/(або фрагмент або фрагменти гена, які перешкоджають трансляції РНК-транскрипта, що кодує аспарагінсинтетазу.

5. Трансгенна рослина або її частина за будь-яким із попередніх пунктів, причому зазначена нуклеотидна послідовність аспарагінсинтетази містить нуклеотидну послідовність, що кодує стоп-мутацію у положенні, яке еквівалентне розташуванню нуклеотидної послідовності, що кодує стоп-мутацію, у ЗЕО ІЮ МО: 19, 21 ї 23, або зазначена аспарагінсинтетаза містить нуклеотидну послідовність, що кодує стоп-кодон у положенні, яке еквівалентне розташуванню стоп-кодона у ЗЕО ІЮО МО: 20, 22 і 24.

6. Трансгенна рослина або її частина за будь-яким із попередніх пунктів, причому зазначена аспарагінсинтетаза містить нуклеотидну послідовність, яка вибрана з групи, що складається з ЗЕО ІО МО: 19, 21 і 23, або кодується нуклеотидною послідовністю, яка вибрана з групи, що складається з 5ЕО ІЮО МО: 19, 21 і 23, або містить поліпептидну послідовність, представлену у ЗЕО ІО МО: 20, 22 і 24, або складається з поліпептидної послідовності, що представлена у ЗЕО ІО МО: 20, 22 і 24, і/або кількість біомаси листя із зазначеної трансгенної рослини або частини зазначеної рослини становить щонайменше 10 95 від кількості біомаси листя з контрольної рослини.

7. Трансгенна рослина або її частина за будь-яким із пп. 2-6, причому зазначене листя являє собою листя, що оброблене повітряною обробкою, відповідно до варіантів, яким надають перевагу, листя, що оброблене повітряною обробкою, є обробленим на сонці або обробленим вогневою обробкою, або зазначене листя висушене повітряним сушінням, при цьому відповідно до варіантів, яким надають перевагу, листя, що висушене повітряним сушінням, є висушеним на сонці або висушеним вогневим сушінням.

8. Рослинний матеріал або оброблений або висушений рослинний матеріал з рослини за будь- яким із пп. 1-7.

9. Рослинний продукт для утворення аерозолю, що містить щонайменше частину рослини за 60 будь-яким із пп. 1-7 або рослинний матеріал за п. 8.

10. Спосіб одержання рослинного матеріалу зі зниженими рівнями аспарагіну та зниженими рівнями акриламіду в аерозолі, що одержаний із зазначеного рослинного матеріалу, у порівнянні з рослинним матеріалом з контрольної рослини, причому рослиною є рослина тютюну, зазначений спосіб включає наступні стадії: (а) забезпечення рослини або частини рослини, що містить полінуклеотид, що містить або складається з послідовності, що кодує аспарагінсинтетазу, яка характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 90 95 з ЗЕО ІЮ МО: 1 або ідентичністю послідовності щонайменше 72 95 з ЗЕО ІЮО МО: З або 5ЕО ІО МО: 5, або 5ЕО ІО МО: 7; (Б) зниження експресії полінуклеотиду або активності білка, що кодується зазначеним полінуклеотидом, у рослині або її частині; (с) збирання рослинного матеріалу з рослини або її частини; (а) сушіння або обробку рослинного матеріалу; (є) необов'язково, вимірювання рівнів аспарагіну у рослині або її частині і/або вимірювання рівнів акриламіду в аерозолі, що одержаний з рослини або її частини, й (0 одержання обробленого або висушеного рослинного матеріалу з рівнем аспарагіну в обробленому або висушеному листі, що одержане із відповідної рослини або частини рослини, зниженим щонайменше на 17 95 у порівнянні з рівнем аспарагіну в обробленому або висушеному листі, що одержане з контрольної рослини, та рівнем акриламіду в аерозолі, який утворюється після нагрівання або згорання обробленого або висушеного листя, що одержане із відповідної рослини або частини рослини, зниженим щонайменше на 20 95 у порівнянні з обробленим або висушеним листям, що одержане з контрольної рослини, причому рівень нікотину в обробленому або висушеному листі із відповідної рослини або частини рослини знаходиться в межах /-20 95 відносно рівня нікотину в обробленому або висушеному листі контрольної рослини, причому відповідно до варіантів, яким надають перевагу, утворення глутаміну, аспарагінової кислоти та глутамінової кислоти в обробленому або висушеному листі, що одержане із відповідної рослини або частини рослини, підвищене щонайменше на 10 95 у порівнянні з обробленим або висушеним листям контрольної рослини.

11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що зазначений рослинний матеріал обробляють або висушують протягом щонайменше 3 днів після збирання; й/або тим, що зазначений рослинний матеріал обробляють повітряною обробкою, при цьому відповідно до варіантів, яким надають перевагу, листя, що оброблене повітряною обробкою, є обробленим на сонці або обробленим вогневою обробкою, або зазначений рослинний матеріал висушений повітряним сушінням або сушінням на сонці, або вогневим сушінням.

12. Рослинний матеріал, який одержаний або одержується за допомогою способу за п. 10 або

11.

13. Спосіб одержання рослинного матеріалу зі зниженим рівнем аспарагіну та зниженим рівнем акриламіду в аерозолі, що одержаний з обробленого або висушеного рослинного матеріалу, у порівнянні з контрольною рослиною, причому зазначений спосіб включає наступні стадії: (а) забезпечення рослини або її частини за будь-яким із пп. 1-7 або рослинного матеріалу за п. 8; (б) збирання рослинного матеріалу з рослини; (с) обробку або сушіння рослинного матеріалу протягом певного періоду часу; й (4) одержання обробленого або висушеного рослинного матеріалу, який характеризується рівнем аспарагіну в обробленому або висушеному листі, що одержане із відповідної рослини або частини рослини, або рослинного матеріалу, зниженим щонайменше на 17 95 у порівнянні з рівнем аспарагіну в обробленому або висушеному листі, що одержане з контрольної рослини, та рівнем акриламіду в аерозолі, який утворюється після нагрівання або згорання обробленого або висушеного листя, що одержане із відповідної рослини або частини рослини, або рослинного матеріалу, зниженим щонайменше на 20 95 у порівнянні з обробленим або висушеним листям, що одержане з контрольної рослини, причому рівень нікотину в обробленому або висушеному листі із відповідної рослини або частини рослини, або рослинного матеріалу знаходиться в межах /-20 95 відносно рівня нікотину в обробленому або висушеному листі контрольної рослини, причому відповідно до варіантів, яким надають перевагу, утворення глутаміну, аспарагінової кислоти та глутамінової кислоти підвищене в обробленому або висушеному листі, що одержане із відповідної рослини або частини рослини, або рослинного матеріалу, щонайменше на 10 95 у порівнянні з обробленим або висушеним листям контрольної рослини.

14. Тютюновий продукт або курильний виріб, який містить рослинний матеріал за п. 8 або 12.