UA126392C2 - Спосіб одержання алюлози - Google Patents

Description

(54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ АЛЮЛОЗИ (57) Реферат:

Винахід стосується способу одержання алюлози, який включає перетворення фруктозо-6- фосфату (Е6Р) на алюлозо-6-фосфат (АбР), каталізоване за допомогою алюлозо-6-фосфат-3- епімерази (АбРЕ); і перетворення одержуваного АбР на алюлозу, каталізоване за допомогою алюлозо-б-фосфат-фосфатази (АбРР).

І ФРУКТОЗО-6-ФОСФАТ (РЕБЕР) / АПЛЮЛОЗО-8-ФОСФАТ(АР)0ОАЛЮЛОЗА 000 (АЛЮЛОЗА) С

ФІГ. З

ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА ПОВ'ЯЗАНІ ЗАЯВКИ

ПІ За даною заявкою запитують пріоритет заявки США із серійним Мо 62/434,033, поданої 14 грудня 2016 року, яка включена в даний опис за допомогою посилання.

ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ

І2Ї Винахід належить до одержання цукру О-алюлози. Більш конкретно, винахід належить до способів одержання О-алюлози за допомогою ферментативного перетворення сахаридів (наприклад, полісахаридів, олігосахаридів, дисахаридів, сахарози, О-глюкози і О-фруктози) в О- алюлозу.

ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ

ІЗЇ О-алюлоза (також відома як ЮО-псикоза) (далі алюлоза) являє собою низькокалорійний, природний підсолоджувач, який має 70 95 солодкості сахарози, але тільки 10 95 калорій. Вона представляє моносахарид гексозу, що зустрічається в природі, присутній тільки в малих кількостях у пшениці і інших рослинах. Алюлоза схвалена як харчова добавка в Роса апа Огид

Ай тіпівігайоп (ЕОА)в 2012 році, яка віднесена до загальновизнаних як безпечна (СКАЗ). Однак, через високі продажні ціни алюлози, її використання як підсолоджувача обмежене. Алюлоза відома множиною аспектів користі для здоров'я: вона низькокалорійна (10 95 від сахарози); вона має дуже низький глікемічний індекс 1; вона повністю абсорбується в тонкій кишці, але не метаболізується, і замість цього секретується в сечу і фекалії; вона допомагає регулювати цукор крові за допомогою інгібування са-амілази, сукрази і мальтази; і в продуктах харчування і напоях вона має функціональність, схожу із сахарозою. По суті, алюлоза явно має різні застосування в індустрії продуктів харчування і напоїв.

ЇЇ У даний час алюлозу одержують в основному через ферментативну ізомеризацію фруктози (МО 2014049373). Загалом, спосіб відрізняється підвищеними витратами на вихідну сировину, дорогим відділянням алюлози від фруктози і відносно низьким виходом продукту.

ІБЇ Існує необхідність розробити економічно ефективний шлях синтезу для одержання алюлози з високим виходом, де щонайменше одна стадія способу включає енергетично сприятливу хімічну реакцію. Крім того, існує потреба в способі одержання, у якому стадії способу можна проводити в одному резервуарі або біореакторі. Також існує потреба в способі одержання алюлози, який можна проводити при відносно низькій концентрації фосфату, де

Зо фосфат можна використовувати повторно, і/або в способі, який не вимагає використання аденозинтрифосфату (АТФ) як джерела фосфату. Також існує потреба в шляху одержання алюлози, для якого не потрібно використовувати дорогий кофермент нікотинамідаденозиндинуклеотид (МАСХН)) на будь-якій зі стадій реакції.

СУТЬ ВИНАХОДУ

І6Ї Винаходи, описані в даному описі, належать до способу одержання алюлози. У різних аспектах способи включають перетворення фруктозо-6-фосфату (Еб6Р) в алюлозо-6-фосфат (АбР), каталізоване за допомогою алюлозо-6-фосфат-3-епімерази (АбРЕ); і перетворення АбР в алюлозу, каталізоване за допомогою алюлозо-6-фосфатфосфатази (АбЄРР). Винаходи також належать до алюлози, одержуваної за допомогою будь-якого зі способів, описаних у даному описі.

Ї/|Ї У деяких аспектах винаходу, спосіб одержання алюлози також включає стадію перетворення глюкозо-6-фосфату (О6Р) в ЕбР, де стадію каталізують за допомогою фосфоглюкоізомерази (РОЇ). В інших аспектах способу синтез алюлози також включає стадію перетворення глюкозо-1-фосфату (С1Р) в ОбР, і цю стадію перетворення каталізують за допомогою фосфоглюкомутази (РОМ).

ВІЇ У різних аспектах спосіб одержання алюлози може включати перетворення сахариду в

СР, каталізоване за допомогою щонайменше одного ферменту; перетворення С1Р в обр, каталізоване за допомогою фосфоглюкомутази (РОМ); перетворення О6Р в ЕбР, каталізоване за допомогою фосфоглюкоіїзомерази (РОЇ); перетворення ЕбР в алюлозо-б-фосфат (АбР), каталізоване за допомогою АБбРЕ; і перетворення одержуваного АбР в алюлозу, каталізоване за допомогою АбРР.

ІЗЇ Сахариди, використовувані в будь-якому зі способів, можна вибирати із групи, що складається із крохмалю або його похідного, целюлози або її похідного і сахарози. Крохмаль або його похідне може являти собою амілозу, амілопектин, розчинний крохмаль, амілодекстрин, мальтодекстрин, мальтозу або глюкозу. У деяких аспектах винаходу спосіб одержання алюлози включає перетворення крохмалю в похідне крохмалю за допомогою ферментативного гідролізу або за допомогою кислотного гідролізу крохмалю. В інших аспектах, похідне крохмалю можна одержувати за допомогою ферментативного гідролізу крохмалю, каталізованого за допомогою ізоамілази, пулуланази, а-амілази або комбінації із двох або більше із цих ферментів. Спосіб 60 одержання оалюлози, у визначених аспектах, також може включати додавання 4-

глюкантрансферази (41). 191 У різних аспектах спосіб одержання алюлози може включати перетворення фруктози в

Еб6Р, каталізоване за допомогою щонайменше одного ферменту; перетворення ЕбР в алюлозо- б-фосфат (АбР), каталізоване за допомогою АбРЕ; і перетворення одержуваного АбР в алюлозу, каталізоване за допомогою АбЄРР. В інших варіантах здійснення спосіб одержання алюлози включає перетворення сахарози у фруктозу, каталізоване за допомогою щонайменше одного ферменту; перетворення фруктози в ЕбР, каталізоване за допомогою щонайменше одного ферменту; перетворення ЕбР в алюлозо-6-фосфат (АбР), каталізоване за допомогою

АбБРЕ; і перетворення одержуваного АбР в алюлозу, каталізоване за допомогою АбРР.

М1) В інших аспектах винаходу, О6Р, що підлягає використанню в способі одержання алюлози, можна утворювати за допомогою перетворення глюкози в ОбР, каталізованого за допомогою щонайменше одного ферменту. Глюкозу можна, у свою чергу, одержувати за допомогою перетворення сахарози в глюкозу, каталізованого за допомогою щонайменше одного ферменту. 121 В інших аспектах винаходу, стадії способу одержання алюлози проводять без АТФ, без

МАБВ(Н), при концентрації фосфату приблизно від 0 мМ приблизно до 150 мМ, фосфат використовують повторно і/або щонайменше одна стадія способу включає енергетично сприятливу хімічну реакцію.

КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ

(13) Ці креслення ілюструють визначені аспекти деяких з варіантів здійснення винаходу, і їх не слід використовувати як обмеження або визначення винаходу. 141 На фіг. 1 представлене схематичне зображення, що ілюструє ферментативний шлях перетворення фруктозо-6б-фосфату в алюлозо-6-фосфеат і потім в алюлозу. 51 На фіг. 2 представлене схематичне зображення, що ілюструє ферментативний шлях перетворення крохмалю або його похідних продуктів в алюлозу. Використовують наступні скорочення: ав, а-глюканфосфорилаза або крохмальфосфорилаза; РОМ, фосфоглюкомутаза;

РОЇ, фосфоглюкоізомераза; ІА, ізоамілаза; РА, пулуланаза; МР, мальтозофосфорилаза; РРОК, поліфосфатглюкокіназа.

П16Ї На фіг. З представлений ферментативний шлях перетворення целюлози або її похідних

Зо продуктів в алюлозу. СОР, целодекстринфосфорилаза; СВР, целобіозофосфорилаза; РРОК, поліфосфатглюкокіназа; РОМ, фосфоглюкомутаза; РОЇ, фосфоглюкоізомераза. 171 На фіг. 4 представлене схематичне зображення, що ілюструє ферментативний шлях перетворення фруктози в алюлозу. РРЕК, поліфосфатфруктокіназа. 81 На фіг. 5 представлене схематичне зображення, що ілюструє ферментативний шлях перетворення глюкози в алюлозу. РРОК, поліфосфатглюкокіназа; РОЇ, фосфоглюкоізомераза. 1191 На фіг. 6 представлений ферментативний шлях перетворення сахарози або її похідних продуктів в алюлозу. ЗР, сахарозофосфорилаза; РРЕК, поліфосфатфруктокіназа; РОМ, фосфоглюкомутаза; РОЇ, фосфоглюкоізомераза. (20) На фіг. 7 представлена енергія Гіббса для реакції між проміжними продуктами на основі енергії Гіббса для утворення при перетворенні глюкозо-1-фосфату в алюлозу.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

(21| Винахід належить до ферментативних шляхів або способів для синтезу алюлози з високим виходом продукту при значному зниженні витрат на виділення продукту і вартості одержання алюлози. (22) Винахід належить до способу одержання алюлози, де спосіб включає перетворення фруктозо-6-фосфату (ЕбР) в алюлозо-6-фосфат (АбР), каталізоване за допомогою епімерази, і перетворення одержуваного АбР в алюлозу, каталізоване за допомогою фосфатази (наприклад, алюлозо-б6-фосфатфосфатази, АЄРР). Цей спосіб у цілому показаний на фіг. 1. У визначених варіантах здійснення епімераза, яка каталізує перетворення ЕбР в АбР, являє собою алюлозо-6-фосфат-3-епімеразу (АбРЕ).

І23| Епімерази, які перетворюють ЕбР в АбР, можна використовувати в способі за винаходом. Епімерази також здатні перетворювати АбЄР в ЕбР. У деяких аспектах винаходу епімерази, придатні для використання в способах для того, щоб перетворювати ЕбР в АбР, містять амінокислотну послідовність, яка має ступінь ідентичності з амінокислотною послідовністю з ЗЕО ІО МО: З або 6 щонайменше 45 95, більш переважно щонайменше 50 95, більш переважно щонайменше 55 95, більш переважно щонайменше 60 95, більш переважно щонайменше 65 95, більш переважно щонайменше 70 95, більш переважно щонайменше 75 95, більш переважно щонайменше 80 95, більш переважно щонайменше 85 95, найбільш переважно щонайменше 90 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 96, щонайменше 93 або щонайменше бо 94 95, найбільш переважно щонайменше 95 95 і навіть найбільш переважно щонайменше 96, 97,

98, 99 або 10095. Придатні епімерази кодує полінуклеотид, що містить нуклеотидну послідовність, яка має ступінь ідентичності з нуклеотидною послідовністю з 5ЕО ІЮО МО: 1,2, 4 ї щонайменше 30 95, переважно щонайменше 35 95, більш переважно щонайменше 40 95, більш переважно щонайменше 45595, більш переважно щонайменше 5095, більш переважно 5 щонайменше 55 95, більш переважно щонайменше 60 95, більш переважно щонайменше 65 95, більш переважно щонайменше 70 95, більш переважно щонайменше 75 95, більш переважно щонайменше 80 95, більш переважно щонайменше 85 95, найбільш переважно щонайменше 90 95, найбільш переважно щонайменше 95 95 і ще більш переважно щонайменше 96, 97, 98, 99 або 100 95. (24) Приклади АЄРЕ включають, але не обмежуючись цим, наступні білки, ідентифіковані номерами ОМІРКОТ ІС: 097094, АОАОЗОЇХ28 і РЗ2719. Серед них, Ю9ТО04 і АОАОЗОІЇХ2в одержують із термофільних організмів. РЗ32719 одержують із мезофільного організму. РЗ2719 на 5396 ідентичний АОАОЗО0ОЇХ28 і на 5595 ідентичний 091094, і кожний білок каталізує епімеризацію ЕбР в АбР. Крім того, АОАОЗОЇХ2АВ8 на 45 95 ідентичний 09004. Навпаки, інші епімеразні білки, ідентифіковані за номерами ОМІРКОТ І: АОА1010823, АТАХОб, АОА1Т50І ВИВ,

АОАО23СО09 і НІХМУМУ2, які мають визначений ступінь ідентичності з 091094 в 45 95 або менше, не каталізують епімеризацію ЕбР в АбР. (25) У деяких аспектах винаходу епімерази, придатні для використання в способах для того, щоб перетворювати ЕбР в АбР, використовують кофактор двовалентний метал: переважно, але не обмежуючись цим, кобальт. У додаткових аспектах за винаходом епімераза містить, але не обмежуючись цим, домен (а/В)--бочонка для каталізу; додатково, але не обмежуючись цим, містить фосфатзв'язуючий домен, що містить Зег на кінці 7-го Д-тяжа бочонка, 5ег на кінці 8-го

В-тяжа бочонка і СіІу у петлі активного центра; додатково, але не обмежуючись цим, містить металзв'язуючий домен, що містить Ніє в 2-му і З-му Д-тяжах бочонка; додатково, але не обмежуючись цим, містить Ар в 2-му їі 7-му Д-тяжі бочонка, щоб діяти як кислотний/основний каталізатор для переносу 1,1 протона, і додатково, але не обмежуючись цим, містить сигнатуру

Ніз-гідрофобний залишок-А5р в 2-му ВД-тяжі бочонка, де Ні бере участь у зв'язуванні металу і

Авзр для кислотного/основного каталізу. Ці ознаки відомі в даній галузі і згадані, наприклад, в

Спап еї аї., Бігисіига! Вавів Тог Зирвігаїе Зресіїйспу іп РпозрНаїе Віпаїпд (Беїа/аІрна)8-Ваїтеєїв: О-

Зо Ашозе 6-Рпоз5рпаїеє 3-Ерітегазе їот ЕзвсПегісніа соїї К-12. Віоспетівігу, 2008; 47 (36); 9608- 9617. Переважно, епімераза для використання в способах за винаходом містить домен (а/р)в- бочонка для каталізу, бег на кінці 7-го Д-тяжа бочонка, 5ег на кінці 8-го ВД-тяжа бочонка, Спіу у петлі активного центра, Нів в 2-му і З-му Д-тяжах бочонка, Авр в 2-му і 7-му Д-тяжах бочонка і сигнатуру Ніз-гідрофобний залишок-Авр в 2-му р-тяжі бочонка. (26| Способи за винаходом використовують фосфатази, які перетворюють АбР в алюлозу (О-алюлозу). У деяких аспектах винаходу, фосфатази, що придатні для способу для того, щоб перетворювати АбР в алюлозу, містять амінокислотну послідовність, яка має ступінь ідентичності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 9 щонайменше 4595, більш переважно щонайменше 5095, більш переважно щонайменше 5595, більш переважно щонайменше 60 95, більш переважно щонайменше 65 95, більш переважно щонайменше 70 95, більш переважно щонайменше 75 95, більш переважно щонайменше 80 95, більш переважно щонайменше 8595, навіть більш переважно щонайменше 9095, найбільш переважно щонайменше 95 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 95 або щонайменше 94 95 і навіть найбільш переважно щонайменше 96, 97, 98, 99 або 100 95. Придатні епімерази кодує полінуклеотид, що містить нуклеотидну послідовність, яка має ступінь ідентичності з нуклеотидною послідовністю з 5ЕСО ІО МО: 7 і 8 щонайменше 30 95, переважно щонайменше 3595, більш переважно щонайменше 4095, більш переважно щонайменше 4595, більш переважно щонайменше 5095, більш переважно щонайменше 5595, більш переважно щонайменше 60 95, більш переважно щонайменше 65 95, більш переважно щонайменше 70 95, більш переважно щонайменше 7595, білош переважно щонайменше 80 95, більш переважно щонайменше 85 95, найбільш переважно щонайменше 90 95, найбільш переважно щонайменше 95 9б5 і навіть найбільш переважно щонайменше 96, 97, 98, 99 або 100 9. (27| Приклади АбЄРР включають, але не обмежуючись цим, наступні білки, ідентифіковані за номерами ОМІРКОТ ІБ: АЗОС21, О5І О4 і 08921. АЗОС21 на 46 95 ідентичний О5І ОКА і на 4595 ідентичний 20892К1, і кожний білок каталізує специфічне дефосфорилування АбР до алюлози. Навпаки, інші фосфатази із суперсімейства дегідрогеназ галогенокислот, білки, ідентифіковані за номерами ШМІРКОТ ІС: НОШО29, 067104, АОдДОКбІРМЗ, С8УУБОЮ,

АОА1Т51УХ61 і інші, які менше ніж на 45 95 ідентичні АЗОС21, не каталізують специфічне дефосфорилування АбР до алюлози. бо (28) Фосфатази для перетворення АЄР в алюлозу, придатні для використання в способах за винаходом, мають специфічність до алюлозо-6-фосфату. Як використовують у даному описі, специфічність алюлозо-б6-фосфату належить до наявності вищої специфічної активності відносно алюлозо-6-фосфату в порівнянні із глюкозо-1-фосфатом, глюкозо-6-фосфатом або фруктозо-6-фосфатом.

І29| Фосфатази для перетворення АбР в алюлозу використовують кофактор двовалентний метал: переважно магній. У додаткових аспектах за винаходом фосфатаза містить, але не обмежуючись цим, домен з Россман-подібним укладанням для каталізу; додатково, але не обмежуючись цим, містить домен кепірування С1 для субстратної специфічності; додатково, але не обмежуючись цим, містить сигнатуру ОхО в 1-му Д-тяжі Россман-подібного укладання для координації магнію, де другий Аб5р є основним кислотним/основним каталізатором; додатково, але не обмежуючись цим, містить Тпг або 5ег на кінці 2-го ВД-тяжа Россман-подібного укладання, що сприяє стабільності проміжних продуктів реакції; додатково, але не обмежуючись цим, містить І уз на М-кінці а-спіралі ближче до С-кінця відносно 3-го ВД-тяжа Россман-подібного укладання, що сприяє стабільності проміжних продуктів реакції; і додатково, але не обмежуючись цим, містить сигнатуру СЮХХхХО на кінці 4-го ВД-тяжа Россман-подібного укладання для координації магнію. Ці ознаки відомі в даній галузі і згадані, наприклад, в Витоцоднв5 еї аї.,

Емоїшіопагу Сепотісв ої Ше НАЮ БЗирепатіу: Опаегеіапаійпа Ше Бігисішга! Адаріайоп5 апа

Сазауїіс Оімегвйу іп а зЗирепатіїу ої Рпозрпоеєзіегазез апа Аїєда Епгутезв. У. Мої. Віо!. 2006; 361; 1003-1034. Переважно, фосфатаза для перетворення АбР в алюлозу, використовувана в способах за винаходом, містить домен з Россман-подібним укладанням для каталізу, домен кепірування С1, сигнатуру ЮхО в 1-му Д-тяжі Россман-подібного укладання, ТНг або 5ег на кінці 2-го ВД-тяжа Россман-подібного укладання, І уз на М-кінці с-спіралі ближче до С-кінця відносно 3- го Д-тяжа Россман-подібного укладання і сигнатуру СОхХхХхО на кінці 4-го Д-тяжа Россман- подібного укладання.

ЇЗО) У деяких варіантах здійснення спосіб одержання алюлози відповідно до винаходу також включає стадію ферментативного перетворення глюкозо-6-фосфату (С6Р) в ЕбР, ї цю стадію каталізують за допомогою фосфоглюкоіїзомерази (РО). В інших варіантах здійснення спосіб одержання алюлози додатково включає стадію перетворення глюкозо-1-фосфату (СР) в С6бР, де стадію каталізують за допомогою фосфоглюкомутази (РОМ). В інших варіантах здійснення

Зо спосіб одержання алюлози також включає стадію перетворення сахариду в С/Р, яку каталізує щонайменше один фермент.

ІЗ1| Отже, спосіб одержання алюлози, відповідно до винаходу, може включати, наприклад, наступні стадії: (ї) перетворення сахариду в глюкозо-1-фосфат (С1Р) з використанням одного або декількох ферментів; (її) перетворення ЖІР в С2бР з використанням фосфоглюкомутази (РОМ, ЕС 5.4.2.2); (ії) перетворення С6Р в ЕбР з використанням фосфоглюкоізомерази (Раї,

ЕС 5.3.1.9); (м) перетворення ЕбР в АбР через АБбБРЕ; і (м) перетворення АбР в алюлозу через

АбРР. Приклад способу, де сахаридом є крохмаль, показаний на фіг. 2.

ІЗ2Ї Звичайно, співвідношення одиниць ферменту, використовуваного в розкритому способі, становлять 1:1:1:1:1 ((Р:РОМ:РОІ:АЄРЕ:АЄРР). Для того, щоб оптимізувати вихід продукту, ці співвідношення можна коректувати в будь-якій кількості комбінацій. Наприклад, співвідношення 3:1:1:111 можна використовувати для того, щоб максимізувати концентрацію фосфорилованих проміжних продуктів, що приведе до збільшеної активності наступних реакцій. Навпаки, співвідношення 1:1:1:1:3 можна використовувати для того, щоб підтримувати стійке постачання фосфатом для сОР, що приведе до ефективнішого фосфоролітичного розщеплення а-1,4- глікозидних зв'язків. Співвідношення ферментів, наприклад, 3:1:1:1:3 можна використовувати для того, щоб додатково збільшувати швидкість реакції. Отже, співвідношення ферментів, включаючи інші необов'язкові ферменти, розглянуті далі, можна варіювати для збільшення ефективності одержання алюлози. Наприклад, конкретний фермент може бути присутнім у кількості приблизно 2х, Зх, 4х, Бх і т. ін. відносно кількості інших ферментів.

ІЗЗЇ Однією з важливих переваг способів є те, що стадії способу можна проводити в одному біореакторі або реакційній посудині. Альтернативно, стадії також можна проводити в множині біореакторів або реакційних посудин, які розташовані послідовно.

ІЗ4Ї Потім іони фосфату, утворені при дефосфорилуванні АбР, можна використовувати повторно в способі на стадії перетворення сахариду в сС1Р, зокрема, коли всі стадії способу проводять в одному біореакторі або реакційній посудині. Здатність повторно використовувати фосфат у розкритих способах робить можливими нестехіометричні кількості фосфату, що підлягає використанню, що зберігає низькі концентрації фосфату в реакції. Це порушує загальний шлях і загальну швидкість способів, але не обмежує активність індивідуальних ферментів і допускає загальну ефективність способів одержання алюлози. бо ІЗ5Ї Наприклад, концентрації фосфату в реакції можуть знаходитись в діапазоні приблизно від 0 мМ приблизно до 300 мМ, приблизно від 0 мМ приблизно до 150 мМ, приблизно від 1 мМ приблизно до 50 мМ, переважно приблизно від 5 мМ приблизно до 50 мМ або більш переважно приблизно від 10 мМ приблизно до 50 мМ. Наприклад, концентрація фосфату в реакції може становити приблизно 0,1 мМ, приблизно 0,5 мМ, приблизно 1 мМ, приблизно 1,5 мМ, приблизно 2 ММ, приблизно 2,5 мМ, приблизно 5 мМ, приблизно 6 мМ, приблизно 7 мМ, приблизно 8 мМ, приблизно 9 мМ, приблизно 10 мМ, приблизно 15 мМ, приблизно 20 мМ, приблизно 25 мМ, приблизно 30 мМ, приблизно 35 мМ, приблизно 40 мМ, приблизно 45 мМ, приблизно 50 мМ або приблизно 55 мМ.

ЇЗЇ Отже, низька концентрація фосфату веде до зниженої вартості виробництва через низький загальний фосфат і, таким чином, зниженої вартості видалення фосфату. Також це перешкоджає інгібуванню АбРР високими концентраціями вільного фосфату і знижує потенціал забруднення фосфатами.

ІЇЗ7|Ї Крім того, способи, розкриті в даному описі, можна проводити без додавання АТФ як джерела фосфату, тобто без АТФ. Способи також можна проводити без необхідності додавати

МАЮД(Н), тобто без МАЮС(Н). Інші переваги також включають той факт, що щонайменше одна стадія розкритих способів одержання алюлози включає енергетично сприятливу хімічну реакцію (фіг. 7).

ІЗ8Ї Приклади ферментів, використовуваних для того, щоб перетворювати сахарид в СР, включають а-глюканфосфорилазу (ас, ЕС 2.4.141, яка також включає мальтодекстринфосфорилазу, крохмальфосфорилазу, глікогсенфосфорилазу і інші фосфорилази, що руйнують а-1,4-глікозидні зв'язки), мальтозофосфорилазу (МР, ЕС 2.4.1.8), целодекстринфосфорилазу (СОР, ЕС 2.4.1.49у3, целобіозофосфорилазу (СВР, ЕС 2.4.1.20), целюлозофосфорилазу, сахарозофосфорилазу (5Р, ЕС 2.4.1.7) і їх комбінації. Вибір ферменту або комбінації ферментів залежить від сахариду, використовуваного в способі.

ІЗ9Ї Сахариди, використовувані для одержання С1Р, можуть являти собою полісахариди, олігосахариди і/або дисахариди. Наприклад, сахаридом може бути крохмаль, одна або декілька похідних крохмалю, целюлоза, одна або декілька похідних целюлози, сахароза, одна або декілька похідних сахарози або їх комбінації.

Ї4О Крохмаль є найбільш широко використовуваною сполукою накопичення енергії в

Зо природі і головним чином зберігається в насінні рослин. Природний крохмаль містить лінійну амілозу і розгалужений амілопектин. Приклади похідних крохмалю включають амілозу, амілопектин, розчинний крохмаль, амілодекстрин, мальтодекстрин, мальтозу, фруктозу і глюкозу. Приклади похідних целюлози включають попередньо оброблену біомасу, регенеровану аморфну целюлозу, целодекстрин, целобіозу, фруктозу і глюкозу. Похідні сахарози включають фруктозу і глюкозу.

ІЇ41! Похідні крохмалю можна одержувати за допомогою ферментативного гідролізу крохмалю або за допомогою кислотного гідролізу крохмалю. Зокрема, ферментативний гідроліз крохмалю можна каталізувати або підсилювати за допомогою ізоамілази (ІА, ЕС. 3.2.1.68), яка гідролізує а-1,-6-глюкозидні зв'язки; пулуланази (РА, ЕС. 3.2.1.41), яка гідролізує а-1,6- глюкозидні зв'язки; 4-й-глюканотрансферази (40Т, ЕС 2.4.1.253), яка каталізує трансглікозилування коротких мальтоолігосахаридів, даючи більш довгі мальтоолігосахариди; або а-амілази (ЕС 3.2.1.1), яка розщеплює а-1,4-глюкозидні зв'язки.

І42| Крім того, похідні целюлози можна одержувати за допомогою ферментативного гідролізу целюлози, каталізованого за допомогою сумішей целюлаз, за допомогою кислот або за допомогою попередньої обробки біомаси.

ЇЇ3| У визначених варіантах здійснення ферменти, використовувані для того, щоб перетворювати сахарид в С1Р, містять сор. На цій стадії, коли сахариди включають крохмаль,

С1ТР утворюють із крохмалю за допомогою ФОР; коли сахариди містять розчинний крохмаль, амілодекстрин або мальтодекстрин, С1Р одержують із розчинного крохмалю, амілодекстрину або мальтодекстрину за допомогою ар.

І44Ї Коли сахариди включають мальтозу і ферменти містять мальтозофосфорилазу, С1Р утворюють із мальтози за допомогою мальтозофосфорилази. Якщо сахариди включають сахарозу і ферменти містять сахарозофосфорилазу, С1Р утворюють із сахарози за допомогою сахарозофосфорилази. 45) У ще одному іншому варіанті здійснення, коли сахариди містять целобіозу і ферменти містять целобіозофосфорилазу, С1Р утворюють із целобіози за допомогою целобіозофосфорилази.

І46Ї У додатковому варіанті здійснення, коли сахариди містять целодекстрини і ферменти містять целодекстринфосфорилазу, (С1Р утворюють із целодекстринів за допомогою бо целодекстринфосфорилази.

І47| В альтернативному варіанті здійснення перетворення сахариду в С1Р, коли сахариди містять целюлозу і ферменти містять целюлозофосфорилазу, С1Р утворюють із целюлози за допомогою целюлозофосфорилази.

І48| Відповідно до винаходу, алюлозу також можна одержувати із фруктози. Приклад способу показаний на фіг. 4. Наприклад, спосіб включає утворення ЕбР із фруктози і поліфосфату, каталізоване за допомогою поліфосфатфруктокінази (РРЕК); перетворення ЕбР в

АбР, каталізоване за допомогою АбРЕ; і перетворення АбР в алюлозу, каталізоване за допомогою АбРР. Фруктозу можна одержувати, наприклад, за допомогою ферментативного перетворення сахарози.

І49| В інших варіантах здійснення алюлозу можна одержувати із сахарози. Приклад такого способу показаний на фіг. 6. Спосіб передбачає шлях синтезу іп міго, який включає наступні ферментативні стадії: утворення С1Р із сахарози і вільного фосфату, каталізоване за допомогою сахарозофосфорилази (5Р); перетворення С1Р в ОбР, каталізоване за допомогою

РОМ; перетворення ОбР в ЕбР, каталізоване за допомогою РО; перетворення ЕбР в АбР, каталізоване за допомогою АбРЕ; і перетворення АбР в алюлозу, каталізоване за допомогою

АбРР.

ІБОЇ Іони фосфату, утворені при перетворенні АбР в алюлозу, потім можна використовувати повторно на стадії перетворення сахарози в С1Р. Додатково, як показано на фіг. 6, РРЕК і поліфосфат можна використовувати для збільшення виходу алюлози за допомогою одержання

ЕбР із фруктози, утвореної за допомогою фосфоролітичного розщеплення сахарози за допомогою 5Р.

І51| У деяких варіантах здійснення спосіб одержання алюлози включає наступні стадії: утворення глюкози з полісахаридів і олігосахаридів за допомогою ферментативного гідролізу або кислотного гідролізу, перетворення глюкози в (з6бР, каталізоване за допомогою щонайменше одного ферменту, утворення фруктози з полісахаридів і олігосахаридів за допомогою ферментативного гідролізу або кислотного гідролізу, і перетворення фруктози в

ОбР, каталізоване за допомогою щонайменше одного ферменту. Приклади полісахаридів і олігосахаридів перераховані вище.

І52І В інших варіантах здійснення ЗбР одержують із глюкози і поліфосфату натрію за

Зо допомогою поліфосфатглюкокінази.

ІЗ) Дане розкриття передбачає способи перетворення сахаридів, таких як полісахариди і олігосахариди в крохмалі, целюлозі, сахарозі і їх похідних продуктах, в алюлозу. У визначених варіантах здійснення штучні (неприродні) ферментативні шляхи без АТФ передбачені для того, щоб перетворювати крохмаль, целюлозу, сахарозу і їх похідні продукти в алюлозу, використовуючи безклітинні ферментативні коктейлі.

ЇХ4| Як показано вище, декілька ферментів можна використовувати для того, щоб гідролізувати крохмаль для збільшення виходу З1Р. Такі ферменти включають ізоамілазу, пулуланазу і а-амілазу. Кукурудзяний крохмаль містить множину гілок, які перешкоджають дії асР. Ізоамілазу можна використовувати для дегільюкування крохмалю, що дає лінійний амілодекстрин. Попередньо оброблений ізоамілазою крохмаль може привести до вищої концентрації Еб6Р у кінцевому продукті. Ізоамілаза і пулуланаза розщеплюють а-1,6-глікозидні зв'язки, що робить можливим повніше руйнування крохмалю за допомогою /-а- глюканфосфорилази. с-амілаза розщеплює (а-1,4-глікозидні зв'язки, отже а-амілазу використовують для того, щоб руйнувати крохмаль на фрагменти для швидшого перетворення в алюлозу.

І55| Як показано на фіг. 2, мальтозофосфорилазу (МР) можна використовувати для збільшення виходу алюлози за допомогою фосфоролітичного розщеплення продукту розкладання мальтози на С1Р і глюкозу. Альтернативно, 4-глюкантрансферазу (457) можна використовувати для збільшення виходу алюлози за допомогою повторного використання продуктів розкладання глюкози, мальтози і мальтотріози на більш довгі мальтоолігосахариди; які можна фосфоролітично розщеплювати за допомогою сОР з одержанням С1Р.

ІБб6|Ї Додатково, целюлоза є найпоширенішим біоресурсом і являє собою основний компонент клітинної стінки рослин. Нехарчова лігноцелюлозна біомаса містить целюлозу, геміцелюлозу і лігнін, а також інші мінорні компоненти. Чисту целюлозу, включаючи Амісеї (мікрокристалічна целюлоза), регенеровану аморфну целюлозу, бактеріальну целюлозу, фільтрувальний папір і т. ін., можна одержувати через ряд обробок. Частково гідролізовані целюлозні субстрати включають водонерозчинні целодекстрини, ступінь полімеризації яких більше 7, водорозчинні целодекстрини зі ступенем полімеризації 3-6, целобіозу, глюкозу і фруктозу. бо І57| У визначених варіантах здійснення целюлозу і її похідні продукти можна перетворювати в алюлозу через серію стадій. Приклад такого способу представлений на фіг. 3. Спосіб передбачає шлях синтезу іп міго, який включає наступні стадії: утворення С1Р із целодекстрину і целобіози і без фосфату, каталізоване за допомогою целодекстринфосфорилази (СОР) і целобіозофосфорилази (СВР), відповідно; перетворення (С1Р в (6бР, каталізоване за допомогою РОМ; перетворення О6Р в ЕбР, каталізоване за допомогою РОЇ; перетворення ЕбР в АбР, каталізоване за допомогою АбРЕ; і перетворення АбР в алюлозу, каталізоване за допомогою АбРР. У цьому способі, ідсни фосфату можна використовувати повторно на стадії перетворення целодекстрину і целобіози в с1Р.

І58| Декілька ферментів можна використовувати для того, щоб гідролізувати тверду целюлозу до водорозчинних целодекстринів і целобіози. Такі ферменти включають ендоглюканазу і целобіогідролазу, але не включають рВ-глюкозидазу (целобіазу).

І59Ї Перед гідролізом целюлози і одержанням СР, целюлозу і біомасу можна попередньо обробляти для збільшення їх реакційної здатності і зниження ступеня полімеризації ланцюгів целюлози. Способи попередньої обробки целюлози і біомаси включають попередню обробку розведеною кислотою, фракціонування лігноцелюлози на основі розчинників целюлози, аміачне розширення волокон, просочування аміачною водою, обробку іонною рідиною і частковий гідроліз із використанням концентрованих кислот, включаючи соляну кислоту, сірчану кислоту, фосфорну кислоту і їх комбінації.

ІБОЇ У деяких варіантах здійснення поліфосфат і поліфосфатглюкокіназу (РРОК) можна додавати в спосіб, таким чином збільшуючи вихід алюлози за допомогою фосфорилування продукту розкладання глюкози до СбР, як показано на фіг. 3.

ІЄ1| В інших варіантах здійснення алюлозу можна утворювати із глюкози. Приклад такого способу представлений на фіг. 5. Спосіб включає стадії утворення ОбР із глюкози і поліфосфату, каталізованого за допомогою поліфосфатглюкокінази (РРОК); перетворення ОбР в ЕбР, каталізованого за допомогою Ро; перетворення ЕбР в АбР, каталізованого за допомогою ферменту; і перетворення АбР в алюлозу, каталізованого за допомогою АбРР.

І62| Будь-який придатний біологічний буфер, відомий у даній галузі, можна використовувати в способі за винаходом, такому як НЕРЕ5, РВ5, ВІЗ-ТВІ5, МОРБ, ОІРБО, Тіій2та і т. ін.

Реакційний буфер для всіх варіантів здійснення може мати рН у діапазоні 5,0-8,0. Більш

Зо переважно рН реакційного буфера може знаходитись в діапазоні приблизно від 6,0 приблизно до 7,3. Наприклад, рН реакційного буфера може становити 6,0, 6,2,6,4,6,6,6,8, 7,0, 7,2 або 7,3.

І63Ї Реакційний буфер також може містити ключові катіони металу. Приклади іонів металів включають Маг», Сог» і 7п2,

І64| Температура реакції, при якій проводять стадії способу, може знаходитись в діапазоні 37-85 "С. Більш переважно, стадії можна проводити при температурі в діапазоні від приблизно "С до приблизно 70 "С. Температура може становити, наприклад, приблизно 40 20, приблизно 45 С, приблизно 50 С, приблизно 55 "С або приблизно 60 ес. Переважно, температура реакції становить приблизно 50 20.

ІБ65| Час реакції в розкритих способах можна коректувати в міру необхідності, і він може 40 знаходитись в діапазоні приблизно від 8 годин до приблизно 48 годин. Наприклад, час реакції може становити приблизно 16 годин, приблизно 18 годин, приблизно 20 годин, приблизно 22 години, приблизно 24 години, приблизно 26 годин, приблизно 28 годин, приблизно 30 годин, приблизно 32 години, приблизно 34 години, приблизно 36 годин, приблизно 38 годин, приблизно 40 годин, приблизно 42 години, приблизно 44 години, приблизно 46 годин або приблизно 48 годин. Більш переважно, час реакції становить приблизно 24 години.

І66Ї Способи відповідно до винаходу можуть досягати високого виходу внаслідок дуже сприятливої константи рівноваги для загальної реакції. Теоретично, можна досягти виходу аж до 99 95, якщо вихідний матеріал повністю перетворюють у проміжний продукт.

ІБ7| У способах за винаходом використовують недорогі вихідні матеріали і знижена вартість виробництва за рахунок зниження витрат, асоційованих з вихідною сировиною і виділенням продукту. Крохмаль, целюлоза, сахароза і деякі їх похідні є менш дорогою вихідною сировиною, ніж, наприклад, фруктоза. Коли алюлозу одержують із фруктози, виходи нижче, ніж у даному винаході, і алюлозу потрібно відокремлювати від фруктози через хроматографію, що призводить до вищої вартості виробництва.

Іб8| Також стадія перетворення АбР в алюлозу відповідно до винаходу являє собою необоротну фосфатазну реакцію, незалежно від вихідної сировини. Отже, алюлозу одержують із дуже високим виходом, при цьому ефективно мінімізуючи наступні витрати на виділення продукту.

ІБ9| На відміну від клітинних способів виробництва, винахід включає безклітинне одержання бо алюлози, має відносно високу швидкість реакції через усунення клітинної мембрани, яка часто сповільнює транспорт субстрату/продукту в клітину і з неї. Також він має кінцевий продукт, вільний від ферментаційних середовищ, багатих живильними речовинами/клітинних метаболітів.

ПРИКЛАДИ

Матеріали і способи

І701| Хімічні сполуки (71)! Усі хімічні сполуки, включаючи кукурудзяний крохмаль, розчинний крохмаль, мальтодекстрини, мальтозу, глюкозу, фільтрувальний папір, мали марку реактивів або вище і були придбані в бідта-Аїагісп (5. Гоці5, МО, ОА) або Рібпег Зсіепійіс (РІН5ригуй, РА, БА), якщо не зазначене інше. Рестрикційні ферменти, 14 лігазу і ДНК-полімеразу Рвизіоп придбавали в Мем/ Епдіапа Віоїаре5 (Ірзм/ісп, МА, ОСОБА). Олігонуклеотиди синтезували або за допомогою Іпіедгаїейа ОМА Тесппоїодіез (Согаїмійе, ІА, ОБА), або Еигоїйп5 МУУС Орегоп (Нипівмійє, АГ, ОБА). Нуклеотидна послідовність 5ЕСО ІЮ МО:1 кодує термофільну АбРЕ з

Тпеппоапаєгобасіегічт (пегтозасспагоїуйсит (ЮОМІРКОТ ІО 09704). БЕО ІЮО МО:2 являє собою версію цієї нуклеотидної послідовності з оптгимізованими кодонами. ЗЕО ІЮ МО:З являє собою амінокислотну послідовність для ферменту. Нуклеотидна послідовність ЗЕО ІЮ МО:4 кодує термофільну Аб6РЕ з Васійн5 Тептоатуїомогап5 (ШМІРКОТ ІЮО АОАОЗОЇХ28). 5БЕО ІЮО МО:5 являє собою версію з оптимізованими кодонами цієї нуклеотидної послідовності. ЗЕО ІЮ МО:6б являє собою амінокислотну послідовність для ферменту. Нуклеотидна послідовність ЗЕО ІЮ МО:7 кодує термофільну АбРР з Сіозігідічт (ШТегпгтосеїйшт (ЮМІРКОТ ІЮ АЗОС21). 5ЕО ІЮ МО:8 являє собою версію нуклеотидної послідовності з оптимізованими кодонами. 5ЕО ІЮ МО:9 являє собою амінокислотну послідовність, відповідну ферменту. Регенеровану аморфну целюлозу, використовувану при ферментативному очищенні, одержували з АмісеІ РНІ1О5 (ЕМС ВіоРоїутег,

РІійадеїрпіа, РА, ОА), через її розчинення і регенерацію, як описано в Уе еї аїЇ., Ризіоп ої а

Татіїу 9 сеПміозе-ріпаіїпа тодиіе ітргомез саїа|міс роїепійа| ої Сіозітаіт НептосеПшт сеїоадехігіп рпозрпогуїазе оп іпзоЇшбіє сеїїшіоз5е. Аррі. Містобіої!. Віотесппої. 2011; 92:551-560. ЕвсПегіспіа соїї зіа10 (бідта-Аїагіси, 5. Гоці5, МО, О5А) використовували як клітину-хазяїна для маніпуляцій із

ДНК, а Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) (Зідта-Аїагіси, 51. Гоці5, МО, ОА) використовували як клітину-хазяїна для експресії рекомбінантного білка. Середовища 7УМ-5052, що містять 100 мг/л" ампіциліну

Зо або 50 мг/л! канаміцину, використовували для клітинного росту ЕЕ. соїї і експресії рекомбінантного білка. Целюлазу з Тгісподепта геезеї (номер за каталогом: С2730) і пулуланазу (номер за каталогом: Р1067) придбали в Зідта-Аїагісн (51. І оціх, МО, ОА) і одержували за допомогою Момо7утевз (ЕгапКіїпіоп, МС, ОБА). Мальтозофосфорилазу (номер за каталогом:

М8284) придбали в бідпта-Аїагісн. (72) Одержання і очищення рекомбінантних ферментів

Ї/3)Ї Штам Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ), що несе експресуючу білок плазміду, інкубували в 1 л колбі

Ерленмейера з 100 мл середовищ 2УМ-5052, що містять 100 мг/л" ампіциліну або 50 мг/л" канаміцину. Клітини вирощували при 30 "С при обертальному струшуванні на 220 об./хв. протягом 16-24 годин. Клітини збирали за допомогою центрифугування при 12 С і промивали один раз із використанням 20 мМ НЕРЕЗ (рН 7,5), що містить 50 мМ Масі ії 5 мМ Масі»г (термопреципітація і целюлозазв'язуючий модуль), або 20 мМ НЕРЕЗ (рН 7,5), що містить 300

ММ Масі ї 5 мМ імідазолу (Мі очищення). Клітинні пелети ресуспендували в тому ж буфері і лізували за допомогою обробки ультразвуком (Ріхпег Зсіепіййс Зопіс ЮОізтетрбгатг Моаеї! 500; ввімк. імпульс 5 с і вимк. 10 с, усього 21 хв. при 50 95 амплітуді). Після центрифугування очищали цільові білки в супернатантах.

ІЇ74| Три підходи використовували для того, щоб очищати різні рекомбінантні білки. Білки з гістидиновими мітками очищали за допомогою Ргойпйу ІМАС Мі-Снагдей ВРевзіп (Віо-РНай,

Негсціе5, СА, ОБА). Злиті білки, що містять целюлозазв'язуючий модуль (СВМ) і самовирізний інтеїн, очищали через високоафінну адсорбцію на поверхні регенерованої аморфної целюлози великої площі. Термопреципітацію при 70-95 "С протягом 5-30 хв. використовували для того, щоб очищати гіпертермостабільні ферменти. Чистоту рекомбінантних білків досліджували за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (5З0О5-РАСЕ).

АбРЕ очищали з використанням 80 мкМ Сосіг2, присутнього в середовищах для вирощування, елююючих буферах, діалізному буфері і буфері для зберігання білка. 7/5) Використовувані ферменти і аналіз їх активності

І/6Ї Використовували а-глюканфосфорилазу (аОР) з ТПпегтоїода тагййта (ОМІРКОТ ІОЮ

С4РЕНВ). Активність аналізували в 50 мМ натрійфосфатному буфері (рН 7,2), що містить 1 мМ

Масіг, 5 мМ ОТ і 30 мм мальтодекстрину при 50 "С. Реакцію зупиняли через фільтрування ферменту з використанням концентратора Мімазріп 2 (10000 МУУСО) (мімаргодисів, Іпс., І їшШейюп, бо МА, БА). Глюкозо-1-фосфат (51Р) вимірювали з використанням набору для аналізу із глюкозогексокіназою/ЗбРОН (Зідта Аїдгіспй, Мо за каталогом САНК20-1КТ) з додаванням 25

Од/мл фосфоглюкомутази. Одиниця (Од) описана як мкмоль/хв.

І/7| Використовували фосфоглюкомутазу (РОМ) Тпегтососси5 КодаКагаєпзі5 (ОМІРКОТ ІОЮ

О6886). Активність вимірювали в 50 мМ буфері НЕРЕЗ (рН 7,2), що містить 5 мМ Маосіг» і 5 мМ

С1Р, при 50 С. Реакцію зупиняли через фільтрування ферменту з використанням концентратора Мімазріп 2 (10000 МУУСО). Продукт, глюкозо-б-фосфат (О6Р), визначали з використанням набору для аналізу з гексокіназою/ЗбРОН (Зідта АЇагісй, Мо за каталогом свАНК2О-1КТ).

І/8|Ї Використовували два різні джерела фосфоглюкоїзомерази (РОЇ) з Сіовігідінт

Шептосеїйшт (ЮОМІРКОТ ІО АЗОВХО) і Тпегти5 Іпептпорпййн5 (ОМІРКОТ ІЮО 05511 6). Активність вимірювали в 50 мМ буфера НЕРЕЗ (рН 7,2), що містить 5 мМ Масі» ії 10 мМ ОбР, при 50 20.

Реакцію зупиняли через фільтрування ферменту з використанням концентратора Мімазвріп 2 (10000 МУУСО). Продукт, фруктозо-6-фосфат (ЕбР), визначали з використанням сполученого ферментативного аналізу із фруктозо-6-фосфаткіназою (ЕбРК)/піруватдегідрогеназою (РК)/лактатдегідрогеназою (І 0), де зниження поглинання на 340 нм указує на одержання ЕбрР.

Ця 200 мкл реакція містила 50 мМ НЕРЕЗ (рН 7.2), 5 мМ Масі», 10 мм СбР, 1,5 мМ АТФ, 1,5 мМ фосфоенолпірувату, 200 мкм МАБН, 0,1 Од РОЇ 5ОДРКІ5ЗОДдІ1ІЮ.

Ї/9| Використовували алюлозо-б-фосфат-3З-епімерази (АбРЕ) з Тпеппоапаегобасіегійт

Шептозасспагоїуйсит (ОМІРКОТ ІЮ 097004), 5ЕО ІЮ МО:3. Активність вимірювали в 50 мМ буфері НЕРЕЗ (рН 7,2), що містить 5 мМ Масі»г, 80 мкМ Сосі», 1 Од/мл АбРР і 10 мм ЕбР, при 50 "Сб. Реакцію зупиняли через фільтрування ферменту з використанням концентратора

Мімазріп 2 (10000 МУУСО). Продукт, алюлозо-б6-фосфат (АбР), визначали з використанням алюлозо-6-фосфатфосфатази і виявляючи вивільнення вільного фосфату. Для того, щоб виявляти вивільнення вільного фосфату, 500 мкл розчину, що містить 0,1 М ацетату цинку і 2

ММ молібдату амонію (рН 5), додавали до 50 мкл реакції. Їх змішували, після чого йшло 125 мкл 5 95 аскорбінової кислоти (рН 5). Цей розчин змішували, потім інкубували при 30 "С протягом 20 хв. Поглинання на 850 нм зчитували для того, щоб визначати вивільнення вільного фосфату.

ІЗО|Ї Використовували алюлозо-6-фосфатфосфатазу (АбРР) з Сіовігідішт ШептосейПйЧт (ОМІРВОТ ІО АЗОС21), 5ЕО ІЮ МО:9. Активність вимірювали в 50 мМ буфері НЕРЕЗ (рН 72),

Зо що містить 5 мМ Масі», 80 мкМ Сосі», 1 Од/мл АБбРЕ і 10 мМ ЕбР, при 50 С. Реакцію зупиняли через фільтрування ферменту з використанням концентратора Мімазріп 2 (10000 МУУСО).

Продукт, алюлозу, визначали через виявлення вивільнення вільного фосфату, як описано для

АбРЕ.

ІЗ1| Рекомбінантна целодекстринфосфорилаза і целобіозофосфорилаза з С. ШТептосейПЙйт описані в Уе еїг а). Зропіапеоизв підп-уївід ргодисійоп ої Нудгодеп їтот сеїІшіовіс таїегіа!5 апа улаїег саїаіулед ру епгуте соскКіаїв. СпетбивСпет 2009; 2:149-152. Їх активності аналізували, як описано.

ІВ2| Рекомбінантна поліфосфатглюкокіназа з Тпепторбіїіда тибєса УХ описана в І іао еї аї.,

Опе-вієр ригіїсайоп апа іттобіїйгайоп ої ІШепторпййс роїурпозрпаїє діосоКіпазе | їот

Тпептобіїда їизса УХ: діисозе-6-рпозрпаїе депегайоп мйпоцшії АТР. Аррі. Містобіо!. Віоїеснпої. 2012; 93:1109-1117. Її активності аналізували, як описано.

ІВЗ| Рекомбінантна ізоамілаза з 5ипоІобив їоКодаїї описана в Спепад еї аї!., Оошбіїпд ромег ошїриї ої зіагсй ріорацегу ігєаїєд Бу Ше тові ІШептовіаріє ізоатуїазе їтот ап агспавоп З!ИПОоЇоби5 юкодаї. Зсіепійіс Берогів 2015; 5:13184. Її активності аналізували, як описано. 84) Рекомбінантна 4-с-глюканолтрансфераза з Тпегтососсиз Ійогаїї5 описана в Уеоп еї аї. 4- а-СуПисапоїгапоіегазе тот Ше Нуреппетпторнпіїїс Агспавоп ТНептососсиз І йогаїїв5. Єшг. у. Віоснет. 1997; 248:171-178. Її активність вимірювали, як описано.

ЇВ5| Використовували сахарозофосфорилазу з Саїдйнгіх абуззі (ШМІРВОТ НІХТО). Її активність вимірювали в 50 мМ буфері НЕРЕЗ (рН 7,5), що містить 10 мМ сахарози і 12 мМ органічного фосфату. Глюкозо-1-фосфат (С1Р) вимірювали з використанням набору для аналізу із глюкозогексокіназою/ЗбРОН з додаванням 25 Од/мл фосфоглюкомутази, як і у випадку а-глюканфосфорилази.

ІЗ6Ї Одиниці ферменту, використовуваного в кожному прикладі далі, можна збільшувати або зменшувати, щоб коректувати час реакції за бажанням. Наприклад, якщо бажають здійснювати приклад 9 за 8 год. замість 24 год., одиниці ферменту слід збільшувати приблизно в З рази.

Навпаки, якщо бажають виконувати приклад 9 за 48 год. замість 24 год., одиниці ферменту слід зменшувати приблизно в 2 рази. Ці приклади ілюструють, як кількість одиниць ферменту можна використовувати для збільшення або зменшення часу реакції при збереженні постійної продуктивності. бо ІЗ7| Приклад 1

ІЗ8Ї Для того, щоб валідувати технічну здійсненність ферментативного біосинтезу фруктозо- б-фосфату із крохмалю, рекомбінантно експресували три ферменти: а-глюканфосфорилазу з Т. тагйта (ЮОМІРКОТ ІОЮО С4ЕЕНВ), фосфоглюкомутазу з Тпептососси5 КодаКагаєпзіз (ОМІРКОТ ІЮ

О6882б) і фосфоглюкоїзомеразу з Сіозігідішт (Шегптосейшт (ОМІРКОТ СО АЗОВХУ).

Рекомбінантні білки надекспресували в Е. соїї ВІ 21 (ОЕЗ) і очищали, як описано вище.

ІЗ9Ї 0,20 мл реакційної суміші, що містить 10 г/л розчинного крохмалю, 50 мМ фосфатно- сольового буфера, рН 7,2, 5 мМ Масі», 0,5 мМ 2псі2, 0,01 Од аСР, 0,01 Од РОМ і 0,01 Од РОЇ, інкубували при 50 С протягом 24 годин. Реакцію зупиняли через фільтрування ферменту з використанням концентратора Мімазріп 2 (10000 МУУСО). Продукт, фруктозо-6-фосфат (ЕбР), визначали з використанням сполученого ферментативного аналізу із фруктозо-6- фосфаткіназою (ЕЄРК)/піруватдегідрогеназою (РК)/лактатдегідрогеназою (10), де зниження поглинання на 340 нм указує на одержання ЕбЄР, як описано вище. Кінцева концентрація ЕбР після 24 годин становила 3,6 г/л.

І2ОЇ Приклад 2

І91| Ті ж тести, як у прикладі 1 (крім температури реакції), здійснювали при 40-80 20.

Виявлено, що 10 г/л розчинного крохмалю давали 0,9 г/л ЕбР при 40 2С і 3,6 г/л Е6Р при 80 С після 40-годинних реакцій. Ці результати підказують, що збільшення температури реакції для цього набору ферментів збільшувало вихід ЕбР, але занадто висока температура може знижувати активність деяких ферментів.

ІЗ92| Приклад З

І93Ї Виявлено, при 80 С співвідношення одиниць ферментів «ЗР:РОМ:РОЇ приблизно 1:1:1 приводило до швидкого утворення ЕбР. Відзначали, що співвідношення ферментів не впливає на кінцеву концентрацію ЕбР значно, якщо час реакції достатньо великий. Однак співвідношення ферментів впливає на швидкості реакцій і загальну вартість ферментів, використовуваних у системі. 94) Приклад 4

І95)| 0,20 мл реакційну суміш, що містить 10 г/л мальтодекстрину, 50 мМ фосфатно- сольового буфера, рН 7,2, 5 мМ Масі», 0,5 мМ 2псі2, 0,01 Од аСР, 0,01 Од РОМ і 0,01 Од РОЇ, інкубували при 50 С протягом 24 годин. Реакцію зупиняли через фільтрування ферменту з

Зо використанням концентратора Мімазріп 2 (10000 МУУСО). Продукт, фруктозо-6-фосфат (ЕбР), визначали з використанням сполученого ферментативного аналізу із фруктозо-6- фосфаткіназою (ЕЄРК)/піруватдегідрогеназою (РК)/лактатдегідрогеназою (10), де зниження поглинання на 340 нм указує на одержання ЕбЄР, як описано вище. Кінцева концентрація ЕбР після 24 годин становила 3,6 г/л.

І96| Приклад 5

І97| Для того, щоб тестувати одержання ЕбР з АмісеїЇ, Зідта, використовували целюлазу, щоб гідролізувати целюлозу при 50 "С. Для того, щоб видаляти р-глюкозидазу з комерційної целюлази, 10 одиниць фільтрувального паперу/мл целюлази змішували з 10 г/л Амісе! на водно- льодяній бані протягом 10 хв. Після центрифугування при 4 "С, декантували супернатант, що містить В-глюкозидазу. Наявний АмісеІ! зв'язували із целюлазовмісною ендоглюканазою і целобіогідролазою, ресуспендували в цитратному буфері (рН 4,8) для гідролізу при 50 б протягом З діб. Гідролізат целюлози змішували з 5 Од/мл целодекстринфосфорилази, 5 Од/л целобіозофосфорилази, 5 Од/мл асР, 5 Од/мл РОМ і 5 Од/мл РОЇ в 100 мМ буфері НЕРЕЗ (рн 7,2), що містить 10 мМ фосфату, 5 мМ Масі» ї 0,5 мМ 2псСі». Реакцію проводили при 60 протягом 72 годин і виявляли високі концентрації ЕбР (невеликі кількості глюкози і без целобіози). ЕЄР виявляли з використанням сполученого ферментативного аналізу, описаного вище. Глюкозу виявляли з використанням набору для аналізу з гексокіназою/З6бРОН, як описано вище. 98) Приклад 6

І99| Для збільшення виходу ЕбРа з Амісе!, Амісе! попередньо обробляли концентрованою фосфорною кислотою для одержання аморфної целюлози (КАС), як описано в 2Ппапод еї аї. А їШапейоп їйот сейЙшіоб5е 5уейпуд о сейшобе аібззоїшіоп Бу о-рпозрпогіс асій: емідепсе їот епгутаїйс Ппуагоїувів апа зиргатоїесшціаг вігисішге. ВіотастотоїЇесціев 2006; 7:644-648. Для того, щоб видаляти ВД-глюкозидазу з комерційної целюлази, 10 одиниць фільтрувального паперу/мл целюлази змішували з 10 г/л ВАС на водно-льодяній бані протягом 5 хв. Після центрифугування при 4 оС, декантували супернатант, що містить ДВ-глюкозидазу. ВАС, яку зв'язували із целюлазовмісною ендоглюканазою і целобіогідролазою, ресуспендували в цитратному буфері (рН 4,8) для гідролізу при 50 б протягом 12 годин. Гідролізат НАС змішували з 5 Од/мл целодекстринфосфорилази, 5 Од/л целобіозофосфорилази, 5 Од/мл аСсР, 5 Од/мл РОМ і 5 60 Од/мл РИаї в 100 мМ буфері НЕРЕЗ (рН 7.2), що містить 10 мМ фосфату, 5 мМ Маосіг і 0,5 мМ

7пбі». Реакцію проводили при 60 "С протягом 72 годин. Одержували високі концентрації ЕбР і глюкози, оскільки не додавали ферменти для того, щоб перетворювати глюкозу в ЕбР. ЕбР виявляли з використанням сполученого ферментативного аналізу, описаного вище. Глюкозу виявляли з використанням набору для аналізу з гексокіназою/ЗбРОН, як описано вище. 100) Приклад 7

МО1|Ї Для того, щоб додатково збільшувати вихід БЕбР з КАС, додавали поліфосфатглюкокіназу і поліфосфат. Для того, щоб видаляти р-глюкозидазу з комерційної целюлази, 10 одиниць фільтрувального паперу/мл целюлази змішували з 10 г/л КАС на водно- льодяній бані протягом 5 хв. Після центрифугування при 4 "С, декантували супернатант, що містить В-глюкозидазу. КАС, яку зв'язували із целюлазовмісною ендоглюканазою (і целобіогідролазою, ресуспендували в цитратному буфері (рН 4,8) для гідролізу при 50 20, інкубували в цитратному буфері (рН 4,8) для гідролізу при 50 "С протягом 12 годин. Гідролізат

КАС змішували з 5 Од/мл поліфосфатглюкокінази, 5 Од/мл целодекстринфосфорилази, 5

Од/мл целобіозофосфорилази, 5 Од/мл асР, 5 Од/мл РОМ і 5 Од/мл РОЇ в 100 мМ буфері

НЕРЕЗ (рН 7,2), що містить 50 мМ поліфосфату, 10 мМ фосфату, 5 мМ Масі?» і 0,5 мМ 7псі».

Реакцію проводили при 50 "С протягом 72 годин. Е6Р виявляли у високих концентраціях при лише невеликих кількостях глюкози, що були присутні тепер. Е6Р виявляли з використанням сполученого ферментативного аналізу, описаного вище. Глюкозу виявляли з використанням набору для аналізу з гексокіназою/ЗбРОН, як описано вище. 1102) Приклад 8 103) Для того, щоб валідувати одержання алюлози з ЕбР, 2 г/л Е6Р змішували з 1 Од/мл

АБбБРЕ і 1 Од/мл АБ6бРР в 50 мМ буфері НЕРЕЗ (рН 7,2), що містить 5 мМ Масі» і 80 мкМ Сосі».

Реакцію інкубували протягом 6 годин при 50 20. 99 95 перетворення ЕбР в алюлозу спостерігали через НРІ С (Адіепі серії 1100) з використанням колонки Адійепі Ні-Ріех Н і детектора показника заломлення. Зразок проганяли в 5 мМ Н250О» при 0,6 мл/хв. 104) Приклад 9 105) Для того, щоб валідувати одержання алюлози з мальтодекстрину, 0,20 мл реакційну суміш, що містить 20 г/л мальтодекстрину, 50 мМ фосфатно-сольового буфера, рН 7,2, 5 мМ

Масіг, 80 мкМ Сосі», 0,05 Од аСР, 0,05 Од РОМ, 0,05 Од РОЇ, 0,05 Од АбРЕ і 0,05 Од АбРР,

Зо інкубують при 50 С протягом 24 годин. Реакцію зупиняють через фільтрування ферменту з використанням концентратора Мімазріп 2 (10000 МУУСО). Алюлозу виявляють і кількісно визначають із використанням НРІ С Адіїєепі серії 1100 з детектором показника заломлення і колонкою Адіїепі Ні-Ріех Н. Рухома фаза являє собою 5 мМ Не5О»5, яка йде 0,6 мл/хв. Стандарти різних концентрацій алюлози використовують для того, щоб кількісно визначати вихід за винаходом. 106) Приклад 10

Реакційну суміш, що містить 200 г/л мальтодекстрину, 10 мМ ацетатного буфера (рн 5,5), 5

ММ Масі», 80 мкМ Сосі» ії 0,1 г/л ізоамілази, інкубують при 80 С протягом 24 годин. Це використовують для того, щоб утворювати іншу реакційну суміш, що містить 20 г/л обробленого ізоамілазою мальтодекстрину, 50 мМ фосфатно-сольового буфера, рН 7,2, 5 мМ Масі», 0,05 Од саОР, 0,05 Од РОМ, 0,05 Од РОЇ, 0,05 Од АбРЕ і 0,05 Од АБбЄРР, інкубують при 50 "С протягом 24 годин. Одержання алюлози кількісно визначають, як у прикладі 9. 1071) Приклад 11

Реакційну суміш, що містить 200 г/л мальтодекстрину, 10 мМ ацетатного буфера (рн 4,5), 5

ММ Масі» і розведення пулуланази Момолутезх Об 1:200 інкубують при 50 С протягом 4 годин.

Це використовують для того, щоб утворювати іншу реакційну суміш, що містить 20 г/л обробленого пулуланазою мальтодекстрину, 50 мМ фосфатно-сольового буфера, рН 7,2, 5 мМ

Масіг, 80 мкМ Сосі», 0,05 Од аСР, 0,05 Од РОМ, 0,05 Од РОЇ, 0,05 Од АбРЕ і 0,05 Од АбРР, інкубують при 50 С протягом 24 годин. Одержання алюлози кількісно визначають, як у прикладі 9. 108) Приклад 12 109) Для того, щоб додатково збільшувати вихід алюлози з мальтодекстрину, 0,05 Од 4- глюкантрансферази (4СТ) додають у реакцію, описану в прикладі 9. 10) 0,2 мл реакційної суміші, що містить 20 г/л обробленого ізоамілазою мальтодекстрину (див. приклад 9), 50 мМ фосфатно-сольового буфера, рН 7,2, 5 мМ Мосі» 80 мкМ Сосі», 0,05 Од аг, 0,05 Од РОМ, 0,05 Од РОЇ, 0,05 Од АЄРЕ, 0,05 Од АЄРР і 0,05 Од 4СТ, інкубують при 50 20 протягом 24 годин. Одержання алюлози кількісно визначають, як у прикладі 9. 111) Приклад 13 (1121 Для того, щоб визначати діапазон концентрацій фосфатно-сольового буфера (РВ5), 60 0,20 мл реакційної суміші, що містить 50 г/л мальтодекстрину; 6,25, 12,5, 25, 37,5 або 50 мМ фосфатно-сольового буфера, рН 7,2; 5 мМ МосСІ2; 01 Од асР; 01 Од РОМ і 01 Од РО, інкубують при 50 "С протягом 6 годин. Мала тривалість гарантує, що завершення не досягають, і, отже, можна ясно бачити відмінності в ефективності. Одержання ЕбР кількісно визначають із використанням сполученого ферментативного аналізу із фруктозо-6-фосфаткіназою (ЕЄРК)/піруватдегідрогеназою (РК)/лактатдегідрогеназою (І 0), де зниження поглинання на 340 нм указує на одержання ЕбР. Відповідно, вихід 4,5, 5,1, 5,6, 4,8 або 4,9 г/л ЕЄР одержують для реакцій, що містять 6,25, 12,5, 25, 37,5 або 50 мМ фосфатно-сольового буфера, рН 7,2 (таблиця 1). Ці результати показують, що концентрація 25 мМ РВ5, рн 7,2, ідеальна для цих конкретних умов реакції. Важливо відзначити, що навіть використання 6,25 мМ РВЗ при рН 7,2 приводить до значного обороту через повторне використання фосфату. Це показує, що розкриті способи повторного використання фосфату дозволяють зберігати низькі рівні фосфату навіть при промислових рівнях продуктивності за об'ємом (наприклад, 200-300 г/л мальтодекстрину).

Таблиця 1 113) Приклад 14 114) Для того, щоб визначати діапазон рнН каскадної реакції, 0,20 мл реакційної суміші, що містить 50 г/л мальтодекстрину; 50 мМ фосфатно-сольового буфера, рН 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0 7,2 або 7,3; 5 мМ Маосіг2; 0,02 Од асСР; 0,02 Од РОМ і 0,02 Од РО, інкубують при 50 С протягом 16 годин. Одиниці знижують, щоб гарантувати, що завершення не досягають, і, отже, можна ясно бачити відмінності в ефективності. Одержання ЕбР кількісно визначають, як у прикладі 12. Відповідно, вихід 4,0, 4,1, 4,2, 4,1, 4,4, 4,1, 3,8 або 4,0 г/л Е6Р одержували для реакцій, що містять 520 мМ фосфатно-сольового буферапри рНб,0,6,2,6,4,6,6, 6,8, 7,0, 7,2 або 7,3 (таблиця 2). Ці результати показують, що рн 6,8 ідеальний для цих конкретних умов реакції, незважаючи на те, що система працює в широкому діапазоні рн.

Таблиця 2 777.60 юю. юЮющ40 г Ф 111166 Їм 77и7И7/7505ье87 11117144 115) Приклад 15 116) Щоб дослідити масштабування, 20 мл реакційної суміші, що містить 50 г/л обробленого ізоамілазою мальтодекстрину (див. приклад 10), 50 мМ фосфатно-сольового буфера, рН 7,2, 5

Коо) ММ Масіг, 80 мкМ Сосіг, 10 Од асР, 10 Од РОМ, 10 Од РОЇ, 10 Од АбРЕ і 10 Од АбРР, інкубують при 50 "С протягом 24 годин. Одержання алюлози кількісно визначали, як у прикладі 9. 117) Приклад 16

М18) Для того, щоб додатково збільшувати вихід алюлози з мальтодекстрину, 0,05 Од мальтозофосфорилази додають у реакцію, описану в прикладі 9. 119) Приклад 17 120) Для того, щоб додатково збільшувати вихід алюлози з мальтодекстрину, 0,05 Од поліфосфатглюкокінази і 75 мМ поліфосфату додають у реакцію, описану в прикладі 9. 121) Приклад 18 1122) Для одержання алюлози із фруктози, реакційну суміш, що містить 10 г/л фруктози, 50

ММ буфера Ттгі5, рН 7,0, 75 мМ поліфосфату, 5 мМ МасСі», 80 мкМ Сосі», 0,05 Од фруктозополіфосфаткінази, 0,05 Од АбРЕ і 0,05 Од АБбРР, інкубують при 50 С протягом 24 годин. Одержання алюлози кількісно визначають, як у прикладі 9. 123) Приклад 19 1124) Для одержання алюлози із глюкози, реакційну суміш, що містить 10 г/л глюкози, 50 ММ буфера Тгі5, рН 7,0, 75 мМ ополіфосфату, 5 мМ МосСі», 80 мкМ сСосі», 0,05 Од глюкозополіфосфаткінази, 0,05 Од РОЇ, 0,05 Од АбРЕ і 0,05 Од АбРР, інкубують при 50 С протягом 24 годин. Одержання алюлози кількісно визначають, як у прикладі 9. 125) Приклад 20 1126) Для одержання алюлози із сахарози, реакційну суміш, що містить 10 г/л сахарози, 50

ММ фосфатно-сольового буфера, рН 7,0, 5 мМ МосСіІ», 80 мкм сСосі», 0,05 Од сахарозофосфорилази, 0,05 Од РОМ, 0,05 Од РОЇ, 0,05 Од АЄРЕ і 0,05 Од АбРР, інкубують при 50 "С протягом 24 годин. Одержання алюлози кількісно визначають, як у прикладі 9. 127) Приклад 21 128) Для того, щоб додатково збільшувати вихід алюлози із сахарози, 75 мМ поліфосфату і 0,05 Од поліфосфатфруктокінази додають у реакційну суміш у прикладі 20. Одержання алюлози кількісно визначають, як у прикладі 9.

Claims (20)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб одержання алюлози, який включає: перетворення фруктозо-6-фосфату (ЕбР) на алюлозо-6-фосфат (АбР), каталізоване за допомогою алюлозо-6-фосфат-3-епімерази (АбРЕ); і перетворення одержуваного АбР на алюлозу, каталізоване за допомогою алюлозо-б-фосфат- фосфатази (АбРР).

2. Спосіб за п. 1, який додатково включає стадію перетворення глюкозо-6-фосфату (О6Р) на ЕбР, де стадію каталізують за допомогою фосфоглюкоізомерази (РОЇ).

3. Спосіб за п. 2, який додатково включає стадію перетворення глюкозо-1-фосфату (С1Р) на СбР, де стадію каталізують за допомогою фосфоглюкомутази (РОМ).

4. Спосіб за п. 3, який додатково включає стадію перетворення сахариду на СР, де стадію каталізують за допомогою щонайменше одного ферменту, де сахарид вибирають із групи, що складається із крохмалю або його похідної, целюлози або її похідної і сахарози.

5. Спосіб за п. 4, у якому щонайменше один фермент вибирають із групи, що складається з - глюканфосфорилази (СР), мальтозофосфорилази, сахарозофосфорилази, целодекстринфосфорилази, целобіозофосфорилази і целюлозофосфорилази.

6. Спосіб за п. 4, у якому сахарид являє собою крохмаль або його похідну, вибрані із групи, що складається з амілози, амілопектину, розчинного крохмалю, амілодекстрину, мальтодекстрину, мальтози і глюкози.

7. Спосіб за п. 6, який додатково включає стадію перетворення крохмалю на похідну крохмалю, де похідну крохмалю одержують за допомогою ферментативного гідролізу крохмалю або за допомогою кислотного гідролізу крохмалю.

8. Спосіб за п. б, який включає додавання 4-глюкантрансферази (4СТ).

9. Спосіб за п. 7, у якому похідну крохмалю одержують за допомогою ферментативного гідролізу крохмалю, каталізованого за допомогою ізоамілази, пулуланази, амілази або їхньої комбінації.

10. Спосіб за п. 1, який додатково включає стадію перетворення фруктози на ЕбР, де стадію каталізують за допомогою щонайменше одного ферменту.

11. Спосіб за п. 10, який додатково включає стадію перетворення сахарози на фруктозу, де стадію каталізують за допомогою щонайменше одного ферменту.

12. Спосіб за п. 2, який додатково включає стадію перетворення глюкози на СбР, де стадію каталізують за допомогою щонайменше одного ферменту.

13. Спосіб за п. 12, який додатково включає стадію перетворення сахарози на глюкозу, де стадію каталізують за допомогою щонайменше одного ферменту.

14. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, у якому алюлозо-6-фосфат-З-епімераза містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 45 95, щонайменше 50 9о, щонайменше 55 до, щонайменше 60 95, щонайменше 65 95, щонайменше 70 95, щонайменше 75 956, щонайменше 80 9565, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 95 956 або щонайменше 100 95 ідентичність послідовностей з 5ЕБО ІЮ МО:3З або б, де зазначена епімераза каталізує перетворення ЕбР на АбР.

15. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, у якому алюлозо-6-фосфат-3-епімераза містить домен 8- бочонка для каталізу, 5ег на кінці 7-го -тяжа бочонка, 5ег на кінці 8-го -тяжа бочонка, Су у петлі активного центра, Ні в 2-му і 3-му -тяжах бочонка, Ар в 2-му і 7-му -тяжах бочонка і сигнатуру Нівз-гідрофобний залишок-Азр в 2-му -тяжі бочонка.

16. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, у якому алюлозо-6-фосфатфосфатаза містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 45 95, щонайменше 50 965, щонайменше 55 95, щонайменше 60 95, щонайменше 65 95, щонайменше 70 95, щонайменше 75 956, щонайменше 80 9б, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 95 95 або щонайменше 100 95 ідентичність послідовностей з 5ЕО ІЮ МО:9, де зазначені фосфати каталізують перетворення АбР на алюлозу.

17. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, у якому алюлозо-6-фосфатфосфатаза містить домен з Россман-подібним укладанням для каталізу, домен кепірування С1, сигнатуру ОхО в 1-му -тяжі Россман-подібного укладання, Тпг або 5ег на кінці 2-го -сяжа Россман-подібного укладання, І уб на М-кінці -спіралі ближче до С-кінця відносно 3-го -т-яжа Россман-подібного укладання і сигнатуру СОХХхО на кінці 4-го -сяжа Россман-подібного укладання.

18. Спосіб за будь-яким одним із пп. 1-13, у якому стадії способу проводять при температурі в діапазоні від приблизно 40 С до приблизно 70 С, при рН у діапазоні від приблизно 5,0 до приблизно 8,0 і/або протягом від приблизно 8 годин до приблизно 48 годин.

19. Спосіб за будь-яким одним із пп. 1-13, у якому стадії способу проводять в одному біореакторі або в множині біореакторів, розташованих послідовно.

20. Спосіб за будь-яким одним із пп. 1-13, у якому стадії способу проводять без АТФ, без МАВД(Н), при концентрації фосфату до і включно 150 мМ, фосфат використовують повторно або щонайменше одна стадія способу включає енергетично сприятливу хімічну реакцію.

ФРУКТОЗО-6-ФОСФАТ (ЕбР) ( АбРЕ 3 АЛЮЛОЗО-6-ФОСФАТ (АР) ОО ФАЛЮЛОВА 000 (АЛЮЛОЗА)

нин вия й Кано Вин КРОХМАЛЬ | А чех у у АМООЙ овщо Я на роя Ох пух с М Кл п лу МЕ кое КВК Га РОК КУ І; АК ве Р хх як у, на "лаву ї. МА ол и Кн що Пулини коту ст ЩЕ 7 рей те в он НОДАБОРА У ШЕ м ши ож БУВ ОВК Год ВММНПОДЕКСТИН Кк в шу ТИ пох МО ще КА це Бен дн рові Мов Оки Же ва Мне вк з ті под шок. ові ма Дня Ви воьво хх ШОЗАК й йо сей ж п. Ви АК В МАЛЬТОЗА хо шен ц ЩЕ Бе М шк: керу у ух ! Не, БК Ї а Ж К Ж 7 ТПЮЖОЗОФОВАТ ; ще денно є і дове В г хх Б. кс кам. х я ; Пре нн ля. : КОВО ши 0 ГЛЮКОЗА і дв СЕ щи шо ВЕ ом ТМ кн А У де скл ро ОК Мово хе гпюкозовеоосют У БА ше ОМ они зн ВК 1 ї щиро шея Нк, щи шк і В у р ик, шк х ій Та -Я ше ак я і й Фруктове пофАТ 0, СК З ОО КО нний р в БЖ ткож дження ектим РОЮ Кк я З ни кдд і піхв й Мей, ПУЖ апюпозовесвАт ОК роКеека ; ЩО т, кі миня ре АР ринку ння Шо в (ВО Тих А ти Кк АЛЮПОЗА Не ШЕ

ФІГ. 2 рентна ноток Н й т Е Н х с Я ре І Т ск 5 Ак х т. ПЕВЮЛОЗА і сини й ща ле вх 4 І ОК а й пон аа НН Н ! Б 7 й ї : і МО к : Н і и Н Н їх ми «МЕ ее є ЦЕЛЮЛОЗА З п пайові ПЕЛОПЕКСТРИНИ ковиния гав р ії СЕ б Н ша й їх ТЕ У шо і АК Ходжсююнн "ж Ех не ШОН, ГЛЮКОВОЗФОСТАТ ен ПО Я я ж я Бо : совно що М и - вих і ОО У Кв З ГЛЮКОЗА РОМ я МК ни, Її й шин па й що кос 1Дх ж я ї СОМИ С ую Ко Е нем йо Он жи . й Гей У зовн, ВОК т ГЛюКОзоеосеат я КЕ нн їн Її Н СУ , ко но М тки ї они цеми зас у В х ЩО пк К до ОТ дітях с Но м Е ги; як руд яти куба Ор, МН ФУ КОВО ФОЮФА й У В, й Ех кл м С Й ОЇ род ну ме І Х й нлчнюннн АПЮПОЗОВФЮОЮВАТ охо виб ММК ї КЕ п 5 В ій рат о НН АПЮЛОЗА Як, В 4 їх р

ЖЕ. З пи АН КИСНІ ФРУКТОЗА М Н нн ДИ щі ФОН ще і Ст Ме х х ЩО Р-ОВ і о Й Кк ФРУКТОЗОЧВФОСТАТ би ВАН А СИ й г ян Со ОЗ т еоджтетнтнсннння ТМ пий І: їм СНЕОК АПЮЛОЗОЧЬФОСВАТ ки ня і ЩІ Когда їх я Ши КВ 4 схе, ення и у пет дну но тій дк кт ло кіл плоть що Ве М, ді Й АЙЮВОЗА С ж Н сій ее вощо

Фіг. а и одно М ГпюКОоА Би щ М те Е й ГСК піший св ши. ГЛюЮКОВО ОС Ши ОКО ФОСеАТ - ї- Н Ве а: М и Я в І Я т. М я й М В жо - Я Вес снаконньки Й Я мо й дохо скит ух Ї ФРУКТОЗО-В ФОСФАТ гре КАВА Ов. Ву ри, КАЖН Уч В їх я 1 7 ГЕ й УМ : цей Ва ) ддкжкюкюююю БВ дення АПЮЛОВО-В Св жи ПІДОСВ ЕК М док ОО ри ЯК я я ПК М ОО й, , й і АПЮЛОЗА Ко а щ ач ко кі ше ну М пр й Не що М

ФІр. 5

Я и ще СУКРОЗА У кт КУ Ж А ОЙ й М Жде но вхо

ПИ. Уран щі ние СИД ф нт ТЕ зе а що днини Р Х М Щ В. А ши

Ко. ня ОВ от. ГЛЮКОЗОЯ-ФфОСОАЇ ши Б ОНя ї. У х Ж і Я ; роя мин і т Р о ; й жде кжкююттАн ; 5 Ду ГЛЮКОЗО-В-ФОСФАТ Еш щі ? Як ві | А ШЕ а ЕЕ СА М ок М ОВО і ; щ сови шу ко : о сх , Р Ши ро ФРУКТОЗА хх дев А и НН щ ФБУКТОВОВВОСВАТ ше шу ж й ОН ев й М ВЖК пес МК і нні й ли ме НИ РО род я о. ше ше чи Я ух й їх Її Ше наван м й В КО их шо ше ої | СМ РК ж я . хатх апр АПЮПОЗОРОСФАТ бори Я ї з КВ Я яке ї вес дит, - о дв 1 и Дей по Ге хх ТО х ве ит сни й АПЮВОЗА ще т СХ ад ОО

ПЛюКОх МІ Мжаах печу «лю УВАТ ДРАВКУЮТОХ ЛКК ВВА уеесогссооювеооово вового во , й 1 тот меш ВУСА й поз Гелжхт і ; 7 У й їх я дим М КІМН. Абе З Я КДЖМЮТЬ оВОоКОве» , м бр ХК ДЖНЮТЬ, з їх д Я кое г сок ТЕН ке. А БОС КЕ кн і : А 2 ана кОм Трдойкне реа і ; У еооселелоселпданевелялюннняк ЗА МИМО ї Кяе ЕОМ пече ! КОД ї й т БОМ УЯ бе х том КДЖЛМТЬ ІЗ Ме ВІ і в КВТ ї ц З ї Н ? і З і й ПААНЕТОЮВА І ПОМ Н А ннн, Ч

ФК. З