UA126558C2 - Ліганд анти-msrv/herv-w env для профілактики і/або лікування прогресуючого розсіяного склерозу - Google Patents
Ліганд анти-msrv/herv-w env для профілактики і/або лікування прогресуючого розсіяного склерозу Download PDFInfo
- Publication number
- UA126558C2 UA126558C2 UAA201809345A UAA201809345A UA126558C2 UA 126558 C2 UA126558 C2 UA 126558C2 UA A201809345 A UAA201809345 A UA A201809345A UA A201809345 A UAA201809345 A UA A201809345A UA 126558 C2 UA126558 C2 UA 126558C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- epm
- ors
- still
- shk
- shi
- Prior art date
Links
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 206010053395 Progressive multiple sclerosis Diseases 0.000 title claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 94
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 55
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 44
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 39
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 39
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 11
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 7
- 208000007118 chronic progressive multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 206010063401 primary progressive multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000008628 secondary progressive multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 3
- 101100203591 Arabidopsis thaliana SOK5 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000011779 Nitric Oxide Synthase Type II Human genes 0.000 claims description 2
- 108010076864 Nitric Oxide Synthase Type II Proteins 0.000 claims description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims 3
- 244000111306 Torreya nucifera Species 0.000 claims 2
- 235000006732 Torreya nucifera Nutrition 0.000 claims 2
- PGOOBECODWQEAB-UHFFFAOYSA-N (E)-clothianidin Chemical compound [O-][N+](=O)\N=C(/NC)NCC1=CN=C(Cl)S1 PGOOBECODWQEAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-(6-hydrazinyl-6-oxohexyl)pentanamide Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCCCC(=O)NN)SC[C@@H]21 IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 0.000 claims 1
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 claims 1
- 244000208874 Althaea officinalis Species 0.000 claims 1
- 235000006576 Althaea officinalis Nutrition 0.000 claims 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 claims 1
- 244000218454 Bambusa tulda Species 0.000 claims 1
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 claims 1
- 241000566113 Branta sandvicensis Species 0.000 claims 1
- 101100134058 Caenorhabditis elegans nth-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 claims 1
- 241001137251 Corvidae Species 0.000 claims 1
- 244000301682 Heliotropium curassavicum Species 0.000 claims 1
- 235000015854 Heliotropium curassavicum Nutrition 0.000 claims 1
- 241000087799 Koma Species 0.000 claims 1
- 241001446467 Mama Species 0.000 claims 1
- 241000538132 Moya Species 0.000 claims 1
- 241000468053 Obodhiang virus Species 0.000 claims 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 claims 1
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 claims 1
- CYTYCFOTNPOANT-UHFFFAOYSA-N Perchloroethylene Chemical compound ClC(Cl)=C(Cl)Cl CYTYCFOTNPOANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000159610 Roya <green alga> Species 0.000 claims 1
- 206010041349 Somnolence Diseases 0.000 claims 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 claims 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 claims 1
- 235000001035 marshmallow Nutrition 0.000 claims 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims 1
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 abstract description 18
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 abstract description 5
- 101000820777 Homo sapiens Syncytin-1 Proteins 0.000 abstract 3
- 241000005822 Human endogenous retrovirus W Species 0.000 abstract 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 85
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 79
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 52
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 49
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 46
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 43
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 39
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 29
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 28
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 28
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 26
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 25
- 208000005923 otitis media with effusion Diseases 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 22
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 21
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 21
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 19
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 19
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 18
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 18
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 17
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 17
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 16
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 16
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 16
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 14
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 14
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 13
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 12
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 12
- 239000001744 Sodium fumarate Substances 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 229940005573 sodium fumarate Drugs 0.000 description 12
- 235000019294 sodium fumarate Nutrition 0.000 description 12
- MSJMDZAOKORVFC-SEPHDYHBSA-L disodium fumarate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O MSJMDZAOKORVFC-SEPHDYHBSA-L 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 9
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 9
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 9
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 9
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 9
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 9
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 9
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 6
- -1 as defined above Substances 0.000 description 6
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 6
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 6
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 5
- 241000181331 Saron Species 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 5
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 5
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000010149 post-hoc-test Methods 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 5
- 238000007473 univariate analysis Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100023006 Basic leucine zipper transcriptional factor ATF-like 2 Human genes 0.000 description 4
- 101000903615 Homo sapiens Basic leucine zipper transcriptional factor ATF-like 2 Proteins 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100027983 Molybdenum cofactor sulfurase Human genes 0.000 description 4
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 4
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 4
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000008599 nitrosative stress Effects 0.000 description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000874160 Homo sapiens Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit, mitochondrial Proteins 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 3
- LEBBDRXHHNYZIA-LDUWYPJVSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] n-[(z)-1,3-dihydroxyoctadec-4-en-2-yl]carbamate Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C/C(O)C(CO)NC(=O)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LEBBDRXHHNYZIA-LDUWYPJVSA-N 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 3
- 102000045360 human SDHB Human genes 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 3
- 108010037253 syncytin Proteins 0.000 description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- GIANIJCPTPUNBA-QMMMGPOBSA-N (2s)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-nitramidopropanoic acid Chemical compound [O-][N+](=O)N[C@H](C(=O)O)CC1=CC=C(O)C=C1 GIANIJCPTPUNBA-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 208000000187 Abnormal Reflex Diseases 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 241000776471 DPANN group Species 0.000 description 2
- 101710195101 Flagellar filament outer layer protein Proteins 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010061296 Motor dysfunction Diseases 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 2
- JYZIHLWOWKMNNX-UHFFFAOYSA-N benzimidazole Chemical compound C1=C[CH]C2=NC=NC2=C1 JYZIHLWOWKMNNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- LDCRTTXIJACKKU-ONEGZZNKSA-N dimethyl fumarate Chemical compound COC(=O)\C=C\C(=O)OC LDCRTTXIJACKKU-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 2
- 229960004419 dimethyl fumarate Drugs 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 2
- 208000033068 episodic angioedema with eosinophilia Diseases 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 206010020745 hyperreflexia Diseases 0.000 description 2
- 230000035859 hyperreflexia Effects 0.000 description 2
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001095 motoneuron effect Effects 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000003007 myelin sheath Anatomy 0.000 description 2
- 230000023105 myelination Effects 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 238000013105 post hoc analysis Methods 0.000 description 2
- 230000007112 pro inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 2
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 2
- FBTSQILOGYXGMD-LURJTMIESA-N 3-nitro-L-tyrosine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 FBTSQILOGYXGMD-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000212977 Andira Species 0.000 description 1
- 101100111953 Arabidopsis thaliana CYP734A1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150100308 BAS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000605059 Bacteroidetes Species 0.000 description 1
- 101100165166 Barbarea vulgaris LUP5 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000020925 Bipolar disease Diseases 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000507614 Chama Species 0.000 description 1
- 208000030939 Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 108091005960 Citrine Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004437 Endogenous Retroviruses Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014066 European mistletoe Nutrition 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150105763 FSHR gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100028496 Galactocerebrosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010042681 Galactosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000896769 Multiple sclerosis associated retrovirus Species 0.000 description 1
- KQJQICVXLJTWQD-UHFFFAOYSA-N N-Methylthiourea Chemical compound CNC(N)=S KQJQICVXLJTWQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 1
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 1
- 108091005998 Nonenzymatic posttranslational protein modifications Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005298 Oligodendrocyte-Myelin Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102100026746 Oligodendrocyte-myelin glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 239000008896 Opium Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033546 Pallor Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 101710158668 Placental protein Proteins 0.000 description 1
- 102000001393 Platelet-Derived Growth Factor alpha Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010068588 Platelet-Derived Growth Factor alpha Receptor Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000008217 Pregnancy Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 208000007400 Relapsing-Remitting Multiple Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 235000012300 Rhipsalis cassutha Nutrition 0.000 description 1
- 235000002492 Rungia klossii Nutrition 0.000 description 1
- 244000117054 Rungia klossii Species 0.000 description 1
- 241000711981 Sais Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 238000003639 Student–Newman–Keuls (SNK) method Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000008233 Toll-Like Receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010060804 Toll-Like Receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000221012 Viscum Species 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000339 bright-field microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 201000005795 chronic inflammatory demyelinating polyneuritis Diseases 0.000 description 1
- 239000011035 citrine Substances 0.000 description 1
- 208000029664 classic familial adenomatous polyposis Diseases 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 239000013066 combination product Substances 0.000 description 1
- 229940127555 combination product Drugs 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000003210 demyelinating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 101150107911 eae gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000002134 immunopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 102000002467 interleukin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010093036 interleukin receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000006662 intracellular pathway Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002314 neuroinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007971 neurological deficit Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037420 neurological improvement Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001151 non-parametric statistical test Methods 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960001027 opium Drugs 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000009038 pharmacological inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 108700005467 recombinant KCB-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Винахід стосується ліганду анти-MSRV/HERV-W Env для застосування у профілактиці і/або лікуванні прогресуючого розсіяного склерозу, де зазначений ліганд анти-MSRV/HERV-W Env містить кожну з ділянок, які визначають комплементарність (CDRs), та способу профілактики і/або лікування прогресуючого розсіяного склерозу, який включає введення суб'єкту ліганду анти-MSRV/HERV-W Env.
Description
Винахід стосується ліганду анти-М5АМ/НЕНМУ-М/ Епм для застосування у профілактиці і/або лікуванні прогресуючого розсіяного склерозу, де зазначений ліганд анти-М5ВМ/НЕВМУ-М/ Епу містить кожну з ділянок, які визначають комплементарність (СОН5), та способу профілактики іабо лікування прогресуючого розсіяного склерозу, який включає введення суб'єкту ліганду анти-МОАМ/НЕВМ-М/ Епу.
Аз сло ГОШЕрЕІ ВЕШНЇ 00н, а- щі ЩІ: т о. ПОН о б шо
ЩІ Зв ї НН доле р ї вої щ- ша ще
Водне ОО У о св НС шо св ВУ . - зневоннннею вн зх «0 ММ твердий
Б жк. МНН 5 ЩО К мот 7 КК о с, ма Ох : У : пт Пи джек З Вих «с ї шо МОЖЕ тн КК ВО:
Га; : МОН: НИ ОЗ ЕЙ шок - ВИНИ! х Й й о щ : " В а с шини с с НН во сечі ММ твердий с МУ тагрдий за, В 8. з п я рен в : ках те 7 І З : й дю З: Ж Фо ш ї 2 ж сі
Оу Ж ша Фо і 77 діжа Во:
Во гля. ді омела з - о
В рулон БУЛА 5 ків МУ твердий
В Мики НемМИ води ЕВ ст ЖЕО ЕММОЕММ
ЧУГ. З
МО -окевд азоту
НСКУ івдуцибельна синтзза оксиду азот І
ТМЕ «фактор некрозу пухлини 1 - етерленйків
ХВ я комтрапь
Область винаходу
Даний винахід належить до інноваційних сполук і композицій для профілактики і/або лікування нововиявленого ушкоджуючого механізму, що блокує здатність відновлення ендогенного мієліну в зрілій нервовій системі (НС) при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ, епмеіоре ргоївіп) НЕВМ-М/ (питап епдодепоив5 геїгоміги5, ендогенний ретровірус типу МУ людини), зокрема, його підтипу МОВУ (тийіріє зсієговів-аззосіаїєд геїгомігив, ретровірус, асоційований з розсіяним склерозом).
Даний новий терапевтичний підхід поєднує в собі інгібування верхніх, патогенних впливів
Епм на клітини попередники олігодендроцитів (ОРС»5, оїїдодепагосуїє ргесиг5ог сеїІв) разом з інгібуванням нижче розміщених ефекторів патогенності Епм на диференціацію ОРС (МО- радикали), які, як в даний час показано, блокують ремієлінізацію при НЕКМ-МУ/-асоційованих захворюваннях, що впливають на нервову систему.
Даний винахід належить до терапевтичних композицій, які містять (ї) принаймні один ліганд анти-НЕВМУ-М/ Епм, і/або (ії) принаймні один лікарський засіб, який інгібує вільні радикали окису азоту (МО, Мигіс Охуде), що застосовуються для профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ) НЕКМ-МУ, зокрема його підтипу МБ5КМ.
Композиція, при якій поєднані як ліганд, так і лікарський засіб, який інгібує МО, впливає на вище розміщений індуктор Епм, так само, як і на нижче розміщені МО-ефектори, в вищеописаному процесі, який викликає блокаду ремієлінізації при ураженнях НС.
Крім того, синергічна дія двох типів сполук (націлених на Епм і МО, відповідно) підвищує швидкість і ефективність терапії у пацієнтів з неремієлінізуючими ураженнями, які викликані активацією НЕКМ-МУ (зокрема, асоційованих з М5КМ-підтипом, який виділений як частинка віріонів з клітин М5') і експресією його Епу-білка в нервовій системі.
Докладний опис винаходу
У відповідності з першим аспектом, даний винахід належить до ліганду анти-НЕНКМУ-М/ Епуи, що застосовується для профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації при хворобах, які пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ) НЕКЕМ-МУ/, зокрема його підтипу МЕМ.
У даному винаході, терміни "блокада диференціювання" або "блокада ремієлінізації"
Зо застосовують для узагальнення нещодавно виявленого явища, що складається в (і) інгібуванні диференціації клітин попередників олігодендроцитів (ОРС5, оЇїдодепагосуїе ргесигзог сеїЇї5), яке викликано білююом оболонки НЕКМ-М/ (зокрема М5ОКМ підтипом), (ії) в кінцевій продукції МО з
ОРСЗ5, і (ії) кінцевому інгібуванні продукції мієліну ОРС»5, як описано в Прикладі 1.
Хвороби, пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ) НЕКМ-МУ, зокрема його підтипу М5КМ, визначають як НЕКМ-М/-асоційовані захворювання, що вражають нервову систему, які переважно є, але не обмежуються ними, розсіяним склерозом (М5, птийіріе в5сіегов5ів), переважно рецидивуючим ремітуючим розсіяним склерозом (ККМ5, гетічціпд-геІарзіпуд тийПіріе 5сІего5із), прогресуючим розсіяним склерозом, таким як вторинний прогресуючий розсіяний склероз (5РМ5, зесопаагу ргодгебвзіме тийКіріє зсіего5і5) або первинний прогресуючий розсіяний склероз (РРМ5, ргітагу ргодгеззіме тийіріє з5сіегозі5), хронічною запальною демієлінізуючою полінейропатією (СІОР?, сПпгопіс іпПйаттайогу етуеїїпайпуд роіупеигораїйу), психічними розладами, такими як шизофренія або біполярні розладит, для яких також описано пошкодження мієліну»,
Зазвичай, ураження при розсіяному склерозі (М5) пов'язані з імуно-опосередкованою втратою олігодендроцитів і мієлінових оболонок при пошкодженні аксонів. Так само описано вплив на імунні клітини, який опосередкований білком оболонки (ЕММ) ретровірусу, що асоційований з розсіяним склерозом (М5КМ, Миїріє Зсіегов5і5 аззосіагей геїгоміги5) з НЕКМ-МУ- сімейства ендогенних ретровірусів, в асоціації з запальними ураженнями нервової системи (НС). Однак, безпосередня патогенність М5ЕМ-Епм на гліальні клітини, що включає блокаду ремієлінізації бляшок Мо5-клітинами попередників олігодендроцитів (ОРС), раніше не була відома і ніколи не була показана.
Відповідно до одного аспекту даного винаходу, інгібування верхніх патогенних впливів Епм на клітини-попередники олігодендроцитів (ОРСз5) здійснюється за рахунок ліганду анти-НЕНМ-М/
Епу. Ліганд анти-НЕНУ-МУ Епм за даним винаходом визначається його здатністю зв'язуватися з білком Епу.
Термін "зв'язування" або "приєднання" ліганду означає щонайменше тимчасову взаємодію або об'єднання з антигеном-мішенню, наприклад ЕММ, що включає фрагменти, що містять епітоп.
Згідно з даним винаходом, НЕКМ-УМ ЕММ означає білок, який кодується геном епм будь-якого члена родини НЕКМ-МУ, в тому числі підтипу МКМ, як визначено з послідовностей, які визначені у РНК ретровірусних частинок з М5"» 27,
Ліганд за даним винаходом також може бути визначений, як такий, що міститься всередині рекомбінантного білка 5сЕм (зіпдіе-спаіп їтадтепі ої магіаріе гедіоп, одноланцюговий фрагмент варіабельної області), Гар-фрагменти (Гадтепі апіїдеп Біпаїпо, ділянка зв'язування антигену), антитіла, при цьому зазначене антитіло може бути поліклональним, моноклональним, олігоклональним, химеризованим, синтетичним або гуманізованим, або людським антитілом. У конкретному аспекті винаходу, антитіло, що містить ліганд, є гуманізованим або людським Ід (імуноглобулін) 0, і, більш переважно Ідс1 або Ідсаі.
Більш конкретно, ліганд за даним винаходом містить щонайменше один, і більш переважно кожну з ділянок, які визначають комплементарність (СОК5, сотріетепіагу-деїептіпіпу гедіопв), що мають амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІО МО: 3, 5ЕО І МО: 4, ЗЕОІЮО МО: 5і ЗЕО ІЮ МО: 6.
Вищезгаданий ліганд містить щонайменше один і, більш переважно, кожну з ділянок, які визначають комплементарність (СОК»5), які кодуються ЗЕО ІЮО МО: 25, 5ЕО ІЮО МО: 26, 5ЕО І
МО: 27, ЗЕО ІЮ МО: 28, 5ЕО ІЮ МО: 29, 5ЕО ІО МО: 30.
Як зазначено вище, блокада ремієлінізації також призводить до продукції МО клітинами
ОРС. Згідно з подальшим аспектом даний винахід також належить до лікарського засобу, який інгібує радикал окису азоту, що застосовується для профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ) НЕБМ-МУ, зокрема його підтипу МБ5КМ.
Хвороби, пов'язані з експресією НЕКМ-ММ ЕММ визначені вище.
У більш конкретному аспекті винаходу, лікарський засіб, який інгібує вільні радикали окису азоту, або лікарський засіб, який інгібує МО є будь-яким лікарським засобом, який може інгібувати біологічний вплив МО молекул, які також називають МО радикалами. Лікарський засіб, який інгібує МО вибирають з Ме-нітро-І -аргінінметилового ефіру (І-МАМЕ), 5-метил- ізотіосечовини (5МТ), фумарової кислоти і диметилфумарату (ОМЕ).
В іншому аспекті, даний винахід належить до фармацевтичної композиції, яка об'єднує щонайменше ліганд анти-МОНАМ/НЕНМ-УУ Епм, як визначено вище, і щонайменше один лікарський засіб, який інгібує радикал окису азоту, як визначено вище. Зазначену композицію застосовують для профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ) НЕКМ-МУ/, зокрема його підтипу М5КУ, захворювань визначених вище.
Фармацевтичний продукт, що містить ліганд анти-НЕНМ-М/ Епм, як визначено вище, і лікарський засіб, який інгібує окис азоту, як це визначено вище, розглядається як комбінований продукт для одночасного, роздільного або рознесеного в часі введення для профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ) НЕНМУ-МУ, зокрема його підтипу МОКУ.
Згідно з результатами, які описані нижче на мишачих моделях експериментального алергічного енцефаломієліту (ЕАЕ, ехрегітепіа!І ашойттипе епсерпаїпотуеїйі5), що індукований
Епу, був показаний синергетичний ефект комбінації ліганду анти-М5АМ/НЕВНМ-УМ Епм з щонайменше однією з МО-інгібуючих молекул, порівняно з будь-яким з цих терапевтичних агентів застосовуються окремо. Навіть при призначенні окремо, лікарські засоби, які інгібують радикали окису азоту, або ліганди анти-М5АМ/НЕВНМУ-УМ Епм демонструють терапевтичну ефективність при відновленні клінічного дефіциту, як відомо, що пов'язаний з ураженням мієліну в ЕАЕВ. Тим не менше, порівняння між (ії) лікарським засобом, який інгібує радикал окису азоту або лігандом анти-М5АМ/НЕВУ-МУ/ Епм і (ії) комбінацією щонайменше одного лікарського засобу, який інгібує радикали окису азоту, і щонайменше одного анти-М5ВМ/НЕНМУ-М/ Епу ліганду, демонструє велику перевагу у застосуванні даної комбінації в процесі лікування.
Таким чином, відсутність запальних інфільтратів і/иабо пошкоджень з запальною активністю (наприклад, неактивні бляшки М5) не виключає лікування блокади ремієлінізації, яку індуковано
Епм у хворих. Дане особливо актуально у пацієнтів з прогресуючим М5 (первинної або вторинної прогресуючої форми), яке, як відомо, призводить до численних пошкоджень без запальної активності, які довго не виявляються при магнітно-резонансній візуалізації сигналу з контрастуванням гадолінієм при більшості ушкоджень головного і спинного мозку.
Даний винахід належить до способу профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки (ЕММ) НЕКМ-МУ, зокрема його МКМ підтипу, що включає введення щонайменше одного ліганду анти-МОВМ/НЕНУ-МУ Епм людині.
У конкретному аспекті, спосіб додатково включає в себе введення щонайменше одного лікарського засобу, який інгібує радикали окису азоту.
В іншому аспекті, винахід належить до способу профілактики і/або лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією НЕКМ-М/ білка оболонки (ЕММ), зокрема його М5ЕМ підтипу, що включає введення щонайменше одного лікарського засобу, який інгібує радикал окису азоту, людині.
Короткий опис графічних матеріалів
Фігура 1. Виявлення білка Епм і експресія рецептора ТІ К4 у тканинах М5. (А, Б) Анти-Епу імуногістохімія показала наявність Епу-білка (стрілки) в МАМУМ, що близька до активних хронічних уражень (Б), але не в білій речовині здорового мозку (А). (В) ОїЇїд2-позитивні ОРС5 в безпосередній близькості від Епм-позитивних клітин мікроглії в області хронічного активного ураження. (Г-Г") Контрольна здорова мозкова тканина з РОСЕКа (рецептор до фактору росту тромбоцитів с) -позитивними ОРОС, що демонструють ко-експресію ТІ К4 (толл-подібний рецептор 4) (стрілки). (Д-Д")У ОРС5 в МАМУМ близькі до активного ураження М5 хворих, що експресують як ТІ К4, так і РОСЕКа (стрілки). Масштабна смужка: 50 мкм.
Фігура 2. Регуляція експресії ТІ К4 під час ОРС диференціювання. (А) Кількісна ЗТ-ПЛР, що показує прогресивну знижувальну регуляцію експресії ТІЇК4 у процесі спонтанного диференціювання ОРС щура в культурі протягом періоду дев'яти днів. Як ген для контролю експресії застосовували САРОН. Дані показані як середнє значення -/-стандартне відхилення, яке отримано з 3 незалежних експериментів, ї-тест ("7Р«0,001). (Б, Б) Анти-ТІ К4 імуно- фарбування показало, що при подавленні ТІ К4, що опосередкований малими шпильковими
РНК (зПЕМА, 5таїїІ-Наїігріп ЕМА), трансфековані ОРС»5 були позбавлені експресії ТІ КА (стрілка), що говорить про специфічність антитіл. Показані ОРС були зафіксовані через три дні після трансфекції, і трансфековані клітини виявляли експресію есЕР (зелений флуоресцентний білок). Цікаво, що сусідні нетрансфековані клітини були Т1К4 позитивним. (В-Г)
Репрезентативні приклади галактоцереброзидази (саІС)/Т1К4 -позитивних ОРС після трьох днів (В, В") і основний білок мієліну (МВР)/ТІК4 - позитивні ОРС5 після шести днів (Г, Г") спонтанного диференціювання в культурі Стрілки в (Г) вказують на більш високо диференційовані ОРС тільки зі зниженим рівнем експресії ТІ К4, таким чином, відображаючи
Зо дані про експресію генів, які показано в (А). Стрілками вказана сильна експресія менш зрілих клітин.
Фігура 3. Запальні ефекти рекомбінантного Епм на культурі ОРС щура. (А, Б, В)
Стимулювання ОРС рекомбінантним Епм в розчині (А, розчинний Епу), рекомбінантним Епм, що зв'язаний з поверхнею (Б; Епм твердий) і Епм, що зв'язаний з мембраною, (В) експресованих в рМУІ4Епм трансфекованих 0343 клітинах гліобластоми, (Г-Г") призводить до сильної індукції експресії МОЗ після восьми годин стимуляції в порівнянні з відповідними буферними контролями або ОРС, які вирощені в присутності рміІ4сії трансфекованих 343 клітин гліобластоми (Д-Д"). У пробі рекомбінантного Епм рівень ендотоксину складав «5 ЕШ/мл (Епдоїохіп Опії5 в мл) як виміряно за допомогою тесту Г АГ... (Г-Д") анти-Епм імуно-фарбування трансфекованих рмі4Епм і рмід4сігі 0343 клітин, що демонструють поверхневу експресію Епм. (Е-
Ж") Олігодендрогліаальна морфологія, як було оцінено шляхом 04 імуно-фарбування залишається незмінною при стимуляції зв'язаним з поверхнею рекомбінантним Епм, як було показано після одного дня (Е, Е"), також як після п'яти днів (Ж, Ж") в культурі. (3) Непрямий спектрометричний аналіз супернатантів клітинної культури для вимірювання продукту розпаду
МО-нітриту показав значне збільшення дозозалежних рівнів МО в пробах ОРС, які стимульовані розчинним рекомбінантним Епм протягом 24 год. (І-Л) Прозапальні цитокіни, такі як ТМЕ(фактор некрозу пухлин-а, ІІ (інтерлейкін)-18 і І1/-6 піддаються регуляції при стимуляції поверхнево- зв'язаним рекомбінантним Епу. ЗАРОН застосовували як контрольний ген. Дані показані як середні значення ч/- стандартне відхилення, і є 1 із 6 (А), 8 (Б), З (В), З (3) і 8 (І-К) незалежних експериментів, відповідно, і-тест (""Р«0,001). Масштабна смужка: 50 мкм.
Фігура 4. Порівняння чутливості до НЕКМ-МУ Епм у незрілих (у віці одного дня -ОРС) і зрілих
ОРСз» щура (у віці семи днів; "зрілі ОРС5" або олігодендроцити - ОЇ).
Обидва типи клітин стимулювали 100 нг/мл розчинного рекомбінантного Епу. Незважаючи на значну, порівняно з буферними контролями, активацію іМО5 і цитокінів у відповідь на Епм стимуляцію в ОЇ 5 є менш вираженою порівняно з ОРС. Для контролю експресії застосовували ген САРОН. Дані представлені у вигляді середнього значення ж/- стандартне відхилення, отриманого з одного із трьох незалежних експериментів, І-тест (Р«0,001, иР«к0,01, Р«О,05).
Фігура 5. Епм залежні реакції ОРС людини. (А) Стимулювання культивованих людських ОРС, зв'язаним з поверхнею (твердим) і розчинним рекомбінантним (розчинним) Епм, призводить до бо сильної індукції експресії ІМО5 через 24 год. стимуляції порівняно з клітинами, які оброблені буфером. Для контролю експресії застосовували ген СЗАРОН. Дані представлені у вигляді середніх значень ж/- стандартне відхилення, отриманого з одного із трьох незалежних експериментів, Ї-тест ("Р«0,001). (Б, Б") Імунофлуоресцентне фарбування культивованих СаїЇсС позитивних ОРС людини виявило сильний сигнал для ТІ К4 (показано після трьох днів в культурі). Масштабна смужка: 50 мкм.
Фігура 6. Експерименти по нейтралізації Епм шляху. (А) Теплова інактивація рекомбінантного Епм призводить до усунення індукції гену ЇМО5 порівняно з нативним рекомбінантним Епму після 8 год. стимуляції ОРС. Два зразки, нативний Епм і денатурований Епм (Епи, оброблений температурою), наносили в концентрації 1000 нг/мл. (Б, В) Зниження експресії
ЇМО5З в ОРС при фармакологічному інгібуванні ІКАК1/4 і ТКІР, відповідно. Після етапу 2 год. попередньої інкубації з 3200 нМ інгібітора ПКАКТ/4 (кіназа, асоційована з рецептором 1-1) або 50 мкм ТКІР інгібуючого пептиду ОРС стимулювали зв'язаним з поверхнею (твердим) рекомбінантним Епм протягом 8 год. і згодом лізували. (Г) Зниження експресії ІМОЗ в ОРС після опосередкованої антитілом блокади рецепторів ТІ К4. Після етапу 2 год. преінкубації з антитілом до ТІ КА у концентрації 15 мг/мл при 37 "С, ОРС стимулювали твердим Епм протягом 8 год. і потім лізували. Для контролю експресії застосовували ген САРОН. Дані представлені у вигляді середніх значень ч/- стандартне відхилення, і отримані з одного із трьох незалежних експериментів кожен, Ї-тест ("Р«0,001, "Р«0,01). (Д) Збільшення ядерної локалізації МЕКВ після стимуляції ОРС зв'язаним з поверхнею (твердим) рекомбінантним Епм протягом 8 годин.
Дані представлені у вигляді середніх значень х/- стандартне відхилення, і отримані з одного із трьох незалежних експериментів кожен, ї--ест ("Р«0,001). (Е-Ж") Репрезентативне МЕКВ імунофарбування буфера (контроль) і стимульовані Епм ОРС5. Масштабна смужка: 50 мкм.
Фігура 7. Генерація З-нітротирозин (3-МТ) позитивних ОРС5. (А) Імунофлуоресцентне фарбування показало, що після 24 год. Епм стимуляції (зв'язаний з поверхнею рекомбінантний
Епу) значно більше ОРС експресували МО-залежний маркер нітрозильного стресу 3-МТ порівняно з обробленими буфером клітинами. Як позитивний контроль був використаний 5- нітрозо-М-ацетилпеніциламін (ЗМАР), сильний МО донор. Однак, коли ОРС інкубували з 1-
МАМЕ, їЇМО5 інгібуючими молекулами, у концентрації 100 мкМ протягом 30 хв при 37 "С до Епм стимуляції, 3-МТ позитивність була знижена до контрольного рівня. Неактивний енантіомер О-
Зо МАМЕ не може усунути Епм залежну індукцію 3-МТ. Дані представлені у вигляді середніх значень «х/- стандартне відхилення, і випливають з одного з трьох незалежних експериментів. 1- тест (Р«0,001). (Б-Е") Репрезентативне анти-3-МТ імунофарбування контрольних клітин (Б,
Б"), Епм стимульовані ОРС» (В, В"), ОРС»5 пре-інкубовані з І! -МАМЕ (Г, Г), О-МАМЕ (Д, Д" і
ОРС5, які піддаються ЗМАР (ЕЕ, ЕМ. Масштабна смужка: 50 мкм. (Ж-Ж).
Імуногістофлуоресцентне фарбування зрізів тканини МАМУМ МзЗ-пацієнтів показало, що резидентні ОРС (відмічені експресією їх маркера попередника РОСЕКа, стрілки) можуть піддаватися нітрозивному стресу, як показала їх 3-МТ позитивність.
Фігура 8. Епм залежне інгібування ОРС диференціювання. (А, Б) Імунофлюоресцентний аналіз, який демонструє, що після одного - трьох днів стимуляції зв'язаним з поверхнею рекомбінантним Епм, значно знижене число ОРС експресувало ранній мієліновий маркер
СМРавзе, також як пізній мієліновий маркер МВРах порівняно з контрольними клітинами. Дані показані у вигляді середніх значень ч/- стандартне відхилення, і отримані з одного з чотирьох незалежних експериментів, ї-тест ("Р«0,001). (8-В") ії (Г-ГУ демонструють репрезентативне анти-СМРавхе і анти-МВР імунофарбування контролю і Епм стимульованих ОРС»5. (Д) Інкубація
ОРС» з 100 мкМ І-МАМЕ у поєднанні зі зв'язаним з поверхнею рекомбінантним Епм протягом трьох днів, призводить до припинення існування Епу-опосередкованої блокади ОРС диференціювання, як показано анти-МВР імунофарбуванням. Застосування О-МАМЕ виявилося не в змозі врятувати експресію мієліну. Дані представлені у вигляді середніх значень ж/- стандартне відхилення, і отримані з одного з чотирьох незалежних експериментів, ї-тест (РО, 001, п.5. не суттєво). (Е-3") Репрезентативне МВР імунофарбування ОРС, які стимульовані тільки Епм, поєднанням Епм і Г-МАМЕ та поєднанням Епм і О-МАМЕ, відповідно.
Масштабна смужка: 50 мкм.
Фігура 9. Експресія ОРС маркерів дозрівання через 24 і 72 годин стимуляції в камерах (Іабіекз) попередньо покритих М5КМ-Епи. Нанесений МО5КМУ-Епм (-Епу-Т), індукував зниження частки СМРазе позитивних ОРС після 24 год. стимуляції (А), а також зниження у відсотках МВР позитивних ОРС після 72 год. стимуляції (Б), порівняно з його розбавленим буфером (буфер).
Дані представлені у вигляді середнього значення -/-стандартна похибка одного експерименту оцінена в 10 повторах (від 410 до 563 порахованих клітин в групі; "р«0,05 І-тест (А) і з 364 по 491 порахованих клітин в групі; "р«0,001 ранговий критерій Манна-Уітні (Б)).
Фігура 10. Експресія СМРазе в ОРС людини після 24 годин стимуляції МБКМ-Епм і ЗМБАС1 (гуманізоване моноклональне антитіло у порівнянні з МКМ). (А) Нанесений М5ЕКМ-Епи викликає зниження відсотка СМРазе позитивних ОРС після 24 год. стимуляції. (ЗМБАСІ1 при 50
НМ або 200 нМ повністю пригнічує ефект М5КМ-Епу, при обох тестованих протоколах ЗМБАСІ1 обробки (ЗМБАС1-А або СМрАС1-В). Дані представлені у вигляді середнього значення ж/- стандартна похибка від 2 до 8 незалежних експериментів (від 705 до 3878 порахованих клітин в групі). (Б) ЗМБАСІ (50 пМ або 200 пМ), які нанесені поодинці або разом з В5А (бичачий сироватковий альбумін) (1 мкг/мл), при обох тестованих протоколах обробки ЗМБАС1 (СМБАС1-
А або СМБАС1-В) не має ніякого впливу на відсоток СМРазе позитивних ОРОС. Дані представлені у вигляді середнього значення ж/- стандартна похибка одного експерименту оцінена в 10 повторностях (399 до 512 порахованих клітин в групі; р»0,05; однофакторний дисперсійний аналіз (АМОМА)).
Фігура 11. Експресія СМРавзе в культурі ОРС людини після 24 годин стимуляції МОКМ-Епм і
СМБАСТ, які додані в культуральне середовище.
М5АМ-Епум (3 нМ), які розведені в клітинному культуральному середовищі, значно знижує
СМРахе експресію після 24 год. обробки. СМБАСІ1 (200 нМ) повністю інгібує даний ефект, в той час як він не показує ніякого ефекту самостійно. Дані представлені у вигляді середнього значення ж/- стандартна похибка від 2 до 4 незалежних експериментів (від 927 до 1913 порахованих клітин у групі); "р«0,001 у порівнянні з буфером; однофакторний дисперсійний аналіз (АМОМА) з подальшим апостеріорним методом І 50 (Іе55 зідпіісапсе дібїапсе, найменш значна різниця) Фішера.
Фігура 12. Експресія МВР в культурах ОРС людини після 72 годин стимуляція М5КМ-Епм і
СМЬАСІ. (А) Нанесений МЗКМ-Епм (Епу-Т) індукує зниження у відсотках МВР позитивних ОРС після 72 год. стимуляції. ЗМБАСІ1 при 50 нМ частково інгібує дію МОКМ-Епм, і дане інгібування є повним при 200 нМ, в обох тестованих протоколах обробки СМБАСІ (ЗМБАС1-А або СМЬАСІ1-
В). (БУ М5КМУ-Епм (3 нМ), доданий в середовище клітинної культури, значно знижує експресію
МВР після 72 год. обробки. ЗМБАСТ1 (200 нМ) повністю інгібує даний ефект (Б).
Дані представлені у вигляді середнього значення -/- стандартна похибка (А) від 2 до 8 незалежних експериментів (від 924 до 4156 порахованих клітин у групі) "р«0,05; ""р«е0,001
Зо порівняно з буфером; фр«0001 порівняно з Епу-Т; однофакторний дисперсійний аналіз (АМОМА) з подальшим апостеріорним методом І 5О Фішера, і (Б) від 2 до 4 незалежних експериментів (1013 до 1834 порахованих клітин в групі; "р«0,001 у порівнянні з буфером; фр«0,001 у порівнянні з Епу-Т; однофакторний дисперсійний аналіз (АМОМА) з подальшим апостеріорним методом І 50 Фішера).
Фігура 13. Експресія маркерів дозрівання ОРС через 24 і 72 години стимуляції за допомогою нанесення М5КМ-Епм і СМБАС1. Нанесений М5КМ-Епм індукує (А) зменшення відсотка СМРавзе позитивних ОРС людини після 24 год. стимуляції, а також (Б) зменшення у відсотках МВР позитивних ОРС людини після 72 год. стимуляції. (А) ОМБАС1 (200 нМ) повністю інгібує дію
М5АМ-Епу, при обох тестованих протоколах обробки СМБАС1Т (ЗМБАС1-А або СМБАС1-В). Дані представлені у вигляді середнього значення ж-/- стандартна похибка б незалежних експериментів (від 2805 до 3039 порахованих клітин в групі; "р«0,05 у порівнянні з буфером; фр«0,05 у порівнянні з М5КМ-Епум; ранговий критерій Краскела-Уолліса АМОМА-1 з подальшим апостеріорним аналізом Стьюдент-Ньюман-Кейля і (Б) від 5 до б незалежних експериментів (1671 до 2066 порахованих клітин на групу; "р«0,05 у порівнянні з буфером; фр«0,05 у порівнянні з М5КМ-Епм; ранговий критерій Краскела-Уолліса АМОМА-1 з подальшим апостеріорним аналізом критерію Данна).
Фігура 14. Інгібування дозрівання ОРС людини, яке викликане М5КМ-Епм, повністю усувається ЗМБАСІ. Нанесений М5АКМ-Епм (ЕММ) індукує (А) зниження відсотка СМРазе позитивних ОРС людини після 24 год. стимуляції, а також (Б) зменшення у відсотках МВР позитивних ОРС людини після 72 год. стимуляції. зМБАСІ1 (200 нМ) повністю інгібує МБЕМ-Епми ефект, в обох тестованих протоколах обробок СМБАСІ (-ЗМБАСІ А або я«СМрАСІ1 В).
Результати виражені як відсоток СМРазе (А) або МВР (Б) позитивних клітин, і є середнім значенням -7- стандартна похибка 8-14 незалежних експериментів (3600 до 6800 порахованих клітин у групі (А) ї 2700 до 5800 порахованих клітин в групі (Б)) "р«е0,05 у порівнянні з СТЕК; тр-«0,05 у порівнянні з МБЕКМ-Епм; ранговий критерій Краскела-Уолліса АМОМА-1 з подальшим апостеріорним аналізом критерію Данна.
Фігура 15. Інгібування дозрівання ОРС людини, яке викликане М5КМ-Епм, повністю усувається СОМБАСІ1 (нормалізовані дані). М5АМ-Епм наносили на скло культуральних камер перед посівом ОРС. СМБАСІ1 (200 нМ), змішували з МОКМ-Епм перед нанесенням (СМБАС1-А) 60 або інкубували на культуральних камерах, які покриті М5ЕМ-Епм (С.СМБАС1-В). Дані розраховуються як відсоток (АХ) СМРазе або (Б) МВР-позитивних клітин і виражені у вигляді відсотка зміни умовам СТКІ (М5КМ-Епм буфер). Результати є середнім значенням /- стандартна похибка 8-14 незалежних експериментів (від 3600 до 6800 порахованих клітин у групі (А) і від 2700 до 5800 порахованих клітин в групі (Б)). "р«0,05 у порівнянні з СТКІ, "р«0,05 у порівнянні з М5КМ-ЕММ; ранговий критерій Краскела-Уолліса АМОМА-1 з подальшим апостеріорним аналізом критерію Данна.
Фігура 16. Кінетика клінічного показника ЕАЕ Груп А, Б, В і Е (А - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, Б - ЕАЕ, оброблений ОМБАс1 200 мкг, В - ЕАЕ, оброблений І/-МАМЕ, Г-ЕАЕ, оброблений СМБАс 200 мкг ж І -МАМЕ).
Фігура 17. Кінетика клінічного показника ЕАЕ Груп А, Б, Г їі Ж (А - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, Б - ЕАЕ, оброблені ЗМрБАс1 200 мкг, Г - ЕАЕ, оброблені 5МТ, Ж - ЕАЕ, оброблені
СМрАс 200 мг я ЗМТ).
Фігура 18. Кінетика клінічного показника ЕАЕ Груп А, Б, Д і З (А - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, Б - ЕАЕ, оброблений СМБАсІ1 200 мкг, Д - ЕАЕ, оброблений ЮОМЕ, З - ЕАЕ, оброблений 200 мкг ЗМБАсСьОМЕ).
Фігура 19. Кінетика часу на Роїагоай при 23 об/хв
Вісь Х: Дні виміряних значень, у відповідності з протоколом. Вісь У: Збільшення або зменшення часу на Коїагод, щодо 7 дня. А: Групи А, Б, "1 ін'єкція" і "2 ін'єкції" Епм; Б: Групи А, Б,
ВІЕ; В: Групи А,Б, ГІЖ; Г. Групи А, Б, Ді 3.
Фігура 20. Кінетика часу на Коїагой 26 об/хв
Вісь Х: Дні виміряних значень, у відповідності з протоколом. Вісь У: Збільшення або зменшення часу на Коїагод, щодо 7 дня. А: Групи А, Б, "1 ін'єкція" і "2 ін'єкції" Епм; Б: Групи А, Б,
ВІЕ; В: Групи А,Б, ГІЖ; Г. Групи А, Б, Ді 3.
Фігура 21. Кінетика часу на Коїагой при 29 об/хв
Вісь Х: Дні виміряних значень, у відповідності з протоколом. Вісь У: Збільшення або зменшення часу на Коїагод, щодо 7 дня. А: Групи А, Б, "1 ін'єкція" і "2 ін'єкції" Епм; Б: Групи А, Б,
ВІЕ; В: Групи А, Б, Гі Ж; Р: Групи А, Б, Ді 3.
Фігура 22. Кінетика клінічного показника ЕАЕ ГрупА, Б, ВІГ (А - ЕАЄ хибно-негативні контролі, Б - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, Г - ЕАЕ,
Зо оброблений СМБАс 200 мкг, Г - ЕАЕ, оброблений СМБАс 500 мкг).
Фігура 23. Кінетика клінічного показника ЕАЕ ГрупА, Б, Ді Е (А - хибно-негативні контролі ЕАЕ, Б - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, Г - ЕАЕ, оброблений ЗМТ, Ж - ЕАЕ, оброблений СМБАс 200 мкг-ЗМТ)
Фігура 24. Кінетика клінічного показника ЕАЕ Груп А, Б, Ж і З (А - хибно-негативні контролі
ЕАЕ, Б - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, Д - ЕАЕ, оброблений ОМЕ, З - ЕАЕ, оброблений
СМрАс 200 мкгОМЕ).
Фігура 25. Кінетика збільшення маси за період дослідження (Відносне збільшення маси порівняно з днем до першої ін'єкції імуногенів): Групи А, Б, Ві Г (А - хибно-негативні контролі ЕАЕ, Б - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, В - ЕАЕ, оброблений СМБАс 200 мкг, Г - ЕАЕ, оброблений СМБАс 500 мкг).
Фігура 26. Кінетика збільшення маси за період дослідження (Відносне збільшення маси порівняно з днем до першої ін'єкції імуногенів): Групи А, Б, Ді Е (А - хибно-негативні контролі ЕАЕ, Б - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, Г - ЕАЕ, оброблені
ЗМТ, Ж - ЕАЕ, оброблені ОМБАс 200 мкг я 5МТ).
Фігура 27. Кінетика збільшення маси за період дослідження (Відносне збільшення маси порівняно з днем до першої ін'єкції імуногенів): А, Б, Ж і З (А - хибно-негативні контролі ЕАЕ, Б - необроблені ЕАЕ позитивні контролі, Д - ЕАЕ, оброблені ОМЕ,
З - ЕАЕ, оброблені СМБАс 200 мкг ї- ОМЕ).
Фігура 28. Кінетика часу на Коїагой при 16 об/хв
Вісь Х: Дні виміряних значень, у відповідності з протоколом. Вісь У: Збільшення або зменшення часу на Коїагод, щодо Дня 7. А: Групи А, Б, Ві Г; Б: Групи А, Б, Ді Е; В: Групи А, Б,
ЖіЗ.
Фігура 29. Кінетика часу на Коїагоа 26 об/хв
Вісь Х: Дні виміряних значень, у відповідності з протоколом. Вісь У: Збільшення або зменшення часу на Коїагод, щодо Дня 7. А: Групи А, Б, В і Г; В: Групи А,Б, Ді Е; С: Групи А, Б,
ЖіЗ.
Фігура 30. Кінетика часу на Коїагой при 29 об/хв
Вісь Х: Дні виміряних значень, у відповідності з протоколом. Вісь У: Збільшення або зменшення часу на Коїагод, щодо Дня 7. А: Групи А, Б, В і Г; В: Групи А,Б, Ді Е; С: Групи А, Б, 60 / ЖіЗ. б
Фігура 31. Кінетика клінічного показника ЕАЕ всіх груп протягом періоду дослідження (А - хобно-негативні контролі ЕАЕ, Б-позитивні контролі хибно-оброблені ізотипом антитіла, В - ЕАЕ оброблений ОМБАс 500 мкг, Г - ЕАЕ, оброблений фумаратом натрію і Д - ЕАЕ, оброблені ОМБАс 500 мкг - фумарат натрію).
Список використаних скорочень
Абреватура | 777
Наступні приклади є ілюстративними і не обмежують винахід.
Приклад 1: Блокада ремієлінізації, індукована білюоом оболонки НЕКМУ-М/ сімейства (інгібує диференціювання олігодендрогліальних клітин попередників при демієлінізованих ураженнях нервової системи). 111 Матеріали і методи 1.1.1. Культура клітин-попередників олігодендроцитів
Клітини-попередники олігодендроцитів щура (ОРС5) очищали, як описано раніше??7. ОРС зберігали в середовищі для проліферації (середовище За, яке доповнено 10 нг/мл рекомбінантного основного фактору росту фібробластів людини і 10 нг/мл рекомбінантного тромбоцитарного фактору росту людини -АА; КО Зузіетв5, УМезбрадеп-Могаепвзіайії, Німеччина), в той час як диференціацію ініціювали середовищем за, яке доповнено 0,5 95 фетальної телячої сироватки. Фетальні клітини попередники олігодендроцитів людини (ПОРС) і відповідне середовище були отримані від ЗН ВіотеаїйїсаЇ, Оррзаїа, Швеція. Рекомбінантний Епм був отриманий і очищений за допомогою РХ РХ-Тпегарешісв (Сгепобріє, Франція) відповідно до вимог ОС бСеМеиго (Сепема, Швейцарія) поставляли білкові партії. Рівні ендотоксину становили «5 ОБ/мл, як виміряно за допомогою тесту лізату амебоцитів ІГітиїш5 (СА). Епм стимуляцію проводили за допомогою трьох різних підходів із застосуванням і) рекомбінантного повнорозмірного Епу-білка, що розведений в середовищі для диференціації при 10 нг/мл, 100 нг/мл і 1000 нг/мл, ії) рекомбінантного білка Епу, що нанесений на культуральні чашки для клітин при поверхневій концентрації 17,53 нг/см: і ії) шляхом посіву ОРС на трансфековані 0343 клітини гліобластоми з гіперекспресією Епм відповідно. Контрольні експерименти по стимуляції проводили за допомогою отримання буфера рекомбінантного Епм (20 мМ гістидин, 5 мас/об. 9) сахароза, 0,01 мас/об. 96 полісорбат 20, рН 6,0) при рівних розведеннях. Вимірювання МО концентрації в супернатанті ОРС проводили із застосуванням колориметричного набору для аналізу окису азоту (Мегок-мМіПроге/СаІріоспет, баптвїайії, Німеччина), а поглинання визначали при 540 нм з використанням планшетного рідера Апіпо5 2001 (Апіпо5 Іарієс іпзігитепів, заіІ27бигу, Австрія). Оцінку морфології ОРС проводили за допомогою анти-0О4 Мегеск-
МіПіроге/Спетісоп, Оагтвіавдії, Німеччини) з урахуванням діаметра клітин і ступеня розгалуження
Зо процесу. ІКАК-1/4 інгібітор І (1-(-2-(4-морфолініл)етил)-2-(З-нітробензоіламідо)бензимідазол, М- (2-морфолінілетил)-2-(З-нітробензоіламідо) бензимідазол; ЗідталЛ|Іагісй, Натбиго, Німеччина), експерименти проводилися при концентрації 2400 нМ, ТРЇІЕ інгібуючого пептиду (Іпмімодеп, Сан-
Дієго, США) експерименти проводили при концентрації 50 мкМ відповідно до протоколів виробників. Епм інактивацію проводили за допомогою впливу на рекомбінантний Епм при температурі 123 "С протягом 1 години. Експерименти з блокування рецептора ТІ Р4-антитілом проводили при концентрації антитіла 15 мкг/мл. Експерименти з блокування І-МАМЕ/0О-МАМЕ проводили при концентрації 100 мкМ кожного; 5-нітрозо-М-ацетил-ОІ - пеніциламін (ЗМАР) застосовували в концентрації 100 нг/мл. 1.1.2 Попередники олігодендроцитів і трансфекція 0343 клітин гліобластоми
ОРС вирощували протягом 24 год. в середовищі для проліферації, а трансфекцію проводили за допомогою реагенту Мапоуицісе (Мегск-Міййроге, Дармштадт, Німеччина) із застосуванням кодуючого 5ПЕМА ТІ К4 супресуючого вектора на основі Ни5Н 29 рогР-У-5 вектора (Огісепе, Роквілл, штат Меріленд, США) для доказу специфічності анти-ТІ КА антитіл.
Для експресії зв'язаного з мембраною Епм в ШЗ343 клітинах гліобластоми вектор", який експресує цитрин для візуалізації трансфекованих клітин комбінували з підвищеною експресією Епм (рм14 вектор з 1 по 1629 п.н. НЕКЕУ-М/ М5ЕКМ типу кодує послідовності епм гена-сепВапк АЕЗ331500.1- поставлених Сепеийго ЗА, Швейцарія) у співвідношенні 1:5. Відповідний порожній вектор застосовували як контроль. Трансфекцію 0343 клітин гліобластоми проводили за допомогою
Проїтесіатіпе (І бе Тесппоіодієх, Дармштадт, Німеччина). 1.1.3 Фарбування тканин розсіяного склерозу
Для Оїїд2/Епм подвійного фарбування фіксовані формаліном оброблені парафіном М5 тканини людини нарізали і 5 мкм зрізи депарафінірували ксилолом і регідратували проводкою через різні концентрації спирту і дистильованої води. Ендогенну пероксидазну активність пригнічували за допомогою інкубування предметного скла в 0,3 95-ий розчин перекису водню в метанолі. Потім скло промивали дистильованою водою і переносили в 10 мМ Тріс, розчин 1 мМ
ЕДТА (рн 9) для досягнення індукованої теплом демаскування антигену. Далі, зрізи охолоджували до кімнатної температури, промивали в фосфатно-сольовому розчині (РВ5) і інкубували з анти- Оїїд2 (1:300; Мегск-Мійїроге) і анти-Епм антитілами ЗВ2НА (1:500, СеМеиго,
Женева, Швейцарія) протягом ночі при 4 "С. Потім зрізи інкубували з АЇеха 488-міченими антитілами осла проти кролика (1:400; Іїе Тесппоіодіез/МоЇІесшаг Ргоре5, Дармштадт,
Німеччина) з метою виявлення Оїїд2 і АІеха 555-міченого антитіла осла проти миші для візуалізації Епм. Для ТІ К4/РОКЕКа подвійного фарбування готували зрізи із замороженої тканини, і 5 мкм зрізів інкубували з анти-ТІ НА (1:100; Мегск-Мійїроге) і анти-?РОсСЕса антитілом (1:50; еВіозсіепсе5, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) протягом ночі при 4 "С. ТІ К4 детектували за допомогою АїЇеха 488-міченого антитіла осла проти миші (1:400; І їе ТесппоІодіез/МоїІесшаг
Ргобрех) і РОСЕКа біотинільованим антитілом кролика проти щура (1:500; Месіог І арогайогіє5,
Вигіпдате, СА, США) ї АІеха 647-міченим стрептавідином (1:400; І їе Тесппоіодіез/МоїІесшаг
Ргоревз), відповідно. Для фарбування ядер зрізи інкубували з розчином барвника Ноеспві (1:100;
Зідта-АїІдгісй, Гамбург, Німеччина) протягом 1 хвилини і покриваючи Месіазпівїй (мМесіог
І арогафогіез). Мікроскопічний аналіз проводили на Геєіса ТСб5 5Р 2 АОВ5 конфокальному лазерному скануючому мікроскопі (І еіса Місгозузіе тв, НеїдеїІрегд, Німеччина). 1.1.4 Фарбування культивованих клітин
Фарбування фіксованих у формальдегіді культивованих клітин проводили, як описано ранішег22. Первинні антитіла були розбавлені наступним чином: анти-ТІ К4 антитіла (1/1000;
Метгек-Міййроге, Дармштадт, Німеччина), антитіло до Епм ЗВ2Н4А4 (1/500; СеМеиго, Женева,
Швейцарія), антитіло до 2", 3З'-циклічний нуклеотид 3-фосфодіестерази (СМРазе) (1/1000;
Сомапсе, Прінстон, Нью-Джерсі, США), моноклональні антитіла проти основного мієлінового білка (МВР; 1/1000; Сопмапсе, Прінстон, Нью-Джерсі, США), поліклональні антитіла проти основного мієлінового білка (1:1000; Мійроге, Швальбаха, Німеччина), антитіла проти
Зо галактоцереброзіда (СаІе), анти-04 антитіла (обидва 1/1000; Мегок-МійПроге, Дармштадт,
Німеччина); анти-3-МТ антитіла (11000; Ареат, Кембридж, Массачусетс, США) їі анти-МЕКВ антитіла (111000; Ареат, Кембридж, Массачусетс, США). АІеха Рісог 488- і АІеха Рійог 594- кон'юговані антитіла (обидва 1:500,) застосовували для візуалізації сигналу. Ядра фарбували 4, б-діаміно-2-феніліндолом (САРІ; Коспе, Базель, Швейцарія). 1.1.5 Отримання РНК, синтез кДНК і кількісна полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією
Очищення РНК з культивованих клітин проводили за допомогою методу КМеазу (Оіадеп,
Ніїдеп, Німеччина). Виділену РНК піддавали зворотній транскрипції за допомогою високоефективного набору для зворотної транскрипції кДНК (Іїе ТесппоіІодіез/Арріїєа
Віозузіет5). Кількісне визначення рівня експресії генів виконували на системі 7900 НТ виявлення послідовності (І їе Тесппоіодіез/Арріїей Віозуєіет5) за допомогою Рожег Зубгогееп ипімегзаї! тавхіег тіх (Гїе ТесппоіІодіез/Арріїей Віозузіетв5). Послідовності праймерів визначали за допомогою програмного забезпечення РгітегЕхргез5 2.0 (Пе ТесПпоіодієз/Арріїєд
Віозузіетв) і перевіряли специфічність ампліконів: пт вм то СОТ ОТ ОЗ АСА КОНЯ
ТЕКЯ гу: ДОЮ Т ТАСААСССТССТОСТСС ЗБОЮ Ме: ВІ
ЧО вва СТ КАССАСАВАССС САААСВІВКО ЦО МО
ЧО теє ТСАСССАЛАСАССААВС ЗО З Ме ОО
ВИКО Ве: ПОАОВСАОСАСОТООАСНАСТ ВЕС МОСТИ вАМОб гу ПЗАТАВОВСТТСОТЕНСТОТТО БК НО Ме 1)
НООАРОН в ТО АССТОАССТОСССТСТА СЗЕКИЮ Ме
ВОСАРОН. теє АОСАСТСОВСОТОТСОВСТОЯТТО СЗЕКНЮО Ме: 14)
ТМБа в АБОЮССТООСТАТОАОВОСССАТОТА ВЕС ММ ТВ
Та гам СОС ОАСТССОТОАТОТСТААС ЕС С МО У
ЦІВ ВУ ОАЛАСАОСААТОСТОВОВАС ЕС О Мо ТИ
Шо У: ААСАСАСОООЮТ ТОСАТОВ ТО ГЕ НО МО ТІ
ПО ВЕК СТТОТОСААТОЗОСААТТСТОАЧКО НО МК 19
В пе ТОТОАСАСТОСАТСАТСОСТО ВККС ОО Ме: ДО
САРОН Ме: БААСОВОЛАОСТСАСТОВОС(ЗЕСНО Ме: ХО)
СЗАРОН теє СОСАТОТОСАВАТССАСААСОО ВЕС Ю Ме: 28)
ОО ЛК ОТ ОСАСВАВОССАААСАТОС БО Ме: Я
ОО тем ЗТТОССАСА ТТ ОАЄ АС ЗКО Ю МОо
САРОН ії О0С були використані як референсні гени, а відносні рівні експресії генів були визначені відповідно до ЛАСІ (І їе Тесппоіодієз/Арріїєд Віозубзіетв5). Кожен зразок вимірювали в чотирьох повторностях; дані представлені у вигляді середніх значень ж/-стандартне відхилення, і ї-тест застосовували для визначення статистичної значущості. 1.2 Результати 1. 2. 1 Локалізація Епм білка близька до хронічних активних М5 пошкоджень і в околицях резидентних ОРС
Застосовуючи імуногістологічний аналіз ми вивчали локалізацію білка Епм у зразку тканин людського мозку. Дане показало досить численну наявність Епм-білюка в МАМММ близько до хронічних активних МО пошкоджень (САЇ., Фіг. 1Б), а також в околицях САЇ в безпосередній близькості від ОЇїд2-позитивних ОРС (Фіг. 1Г). МАМУМ на більш далекій відстані до уражень не показує помітним Епм імунореактивності (Фіг.1А.). З метою подальшого доведення, потенційного впливу білка Епм на резидентні ОРС і, таким чином, на відповідне лагодження мієліну, ми, крім того, шукали ТІК4 і тромбоцитарний альфа фактор росту рецепторів (РОСЕКа) - двічі позитивних ОРС5. Ми могли виявити їх у здоровому мозку (Фіг. 1Г-Г") і в МАУУМ М:5 (Фіг. 1Д-Д").
Наочно було продемонстровано, що в М5 мозку, ТІ К4-позитивні ОРС5 можуть бути виявлені в безпосередній близькості від НЕКМ-М/ Епм експресуючих клітин або відповідного секретованого білка, що робить їх прийнятними мішенями даних ТІ К-4 патогенних агоністів, як було описано 10. Тим не менше, дане є несподіваним висновком і відкриває ще небачені перспективи для застосування, тому що раніше було невідомо, що ТІ К4 експресується при таких умовах в ОРС і, більше того, як продемонстрували пізніше, тому що НЕКМ-М/ білок оболонки, такий як М3КМ-
Епм, не може, отже, . розглядатися для безпосередньої взаємодії з ОРС на даному конкретному етапі диференціювання з остаточними драматичним впливом на їх потенціал мієлінізації. 1.2.2 ТІ Кк. експресія культивованими ОРС щура і людини
Попередні дослідження, по суті, свідчили про ТІ Р4-залежну прозапальну дію на моноцити і
Зо клітини дендритів!?. Апіі-ТЇК4 імуномічення підтвердило експресію даного рецептора на поверхні олігодендрогліальних клітин попередників щура і людини (Фіг. 28, В'ї 5Б). Крім того, специфічний 5ПЕМА-опосередкований нокдаун ТІ К4 в ОРС щурів обгрунтував специфічність попереднього імуномічення (Фіг. 2Б, Б"). Для того щоб оцінити кінетику експресії рецептора
ТІК4, від молодих до зрілих ОРС, ми провели ко-фарбування з використанням антитіл до галактоцереброзиду (Сас), а також антитіл до основного білка мієліну (МВР), маркера для більш зрілих ОРС, після трьох і шести днів диференціювання в культурі (Фіг. 28-Г").
Несподівано було виявлено, що експресія гену рецептора ТІК4 через деякий час пригнічувалася в процесі клітинного диференціювання (Фіг. 2А), у той час як специфічна детекція білка ТІ К4 дала тільки слабкий сигнал на пізніх тимчасових точках в морфологічно зрілих ОРС щура (Фіг. 2Г), в порівнянні з більш молодими клітинами. 1.2.3 Стимуляція ОРС Епм індукованою експресією прозапальних цитокінів та індукованої
МО-синтази Стимуляція ОРС щура рекомбінантним Епм білком, що розчинений у середовищі (розчинний Епу; 100 нг/мл; Фіг. ЗА), що нанесений на культуральні чашки для клітин (твердий
Епм;. Фіг. ЗБ) або надекспресуючим на поверхні трансфекованих клітин гліобластоми 0343 (РМ14Епу; Фіг. З В-Д") призвела до сильного збільшення транскрипції індуцибельної синтази оксиду азоту (МОБ), також як до індукції прозапальних цитокінів, таких як ТМЕа; 1-18 і 11 -6 (Фіг.
З І-Л) порівняно з контрольними (буфер або порожній вектор для обробки) умовами. У свою чергу, підвищена експресія ІМО5 призводить до залежного від концентрації Епм підвищення Її нітрозивного стресу, утворюючи продукт оксиду азоту (МО) в клітинних супернатантах (Фіг. З 3).
Цікаво, що морфологія ОРС щура залишалася незмінною протягом Епм стимуляції, як було показано 04 фарбуванням олігодендроглії, що здійснювалася через один і п'ять днів впливу Епм
(Фіг. З Е-Ж"). СаІС-позитивні ОРС людини також були знайдені, експресуючими ТК 4 (Фіг 5Б, Б) і стимуляція рекомбінантним Епм (як у розчині, так і як нанесеним на поверхню тарілки) аналогічно індукувала ІМО5 транскрипцію (Фіг. 5А). Крім того, ми виявили, що Епм стимуляція не впливає ні на виживання ОРС (як показано за допомогою ТИМЕЇГ і кількісної оцінки загального числа клітин; дані не представлені), ні на індуковане старіння фенотипу ОРС (досліджуваного шляхом фарбування на р-галактозидазу; дані не показані). Епм стимуляція дозрілих ОРС щурів (таюорРс»; зберігали в середовищі для диференціювання протягом шести днів) призводять до істотно більш слабкої, прозапальної реакції, яку було визначено рівнем транскрипції ЇМО5,
ТМЕа, 1-16 та І/-6, у порівнянні з впливом на незрілі ОРС (Фіг. А). Це спостереження у відповідності з даними про більш низький рівень експресії ТІ К4, що виявлений в зрілих ОРС (Фіг. 2), і підтверджує відмінну чутливість незрілих клітин у відношенні Епм, що відповідає Ті К-4 рівнем експресії. 1.2.4 Епм, що опосередковує свій вплив через ТІ КА і прозапальна відповідь включає в себе
ІРАК 1/4, ТАЄ ії МЕКВ
Для того, щоб довести специфічність Епм до ТІК4 і пролити додаткове світло на нижчерозташований сигналінг ми провели ряд контрольних дослідів (Фіг. 6). Термоінактивація рекомбінантного Епм перед ОРС стимуляцією призводить до дуже значного зниження індукції
ЇМО в порівнянні з контрольною групою (Фіг. бА). Аналогічне значне скорочення іМО5 транскрипції може спостерігатися при використанні опосередкованої антитілом блокади ТІ К4 тим самим підтверджуючи специфічність Епм до даного рецептора і його актуальність щодо спостережуваних нижчерозташованих прозапальних ефектів (Фіг. 6Г). Для того, щоб пролити світло на внутрішньоклітинні шляхи ТІ К4 активації за допомогою Епм, ми досліджували роль двох відомих нижчерозташованих шляхів, що слідують за ТІ К4 активацією, Мур88-залежний шлях за участю ІКАК-1/4 (інтерлейкіновий рецептор 1-асоційованої кінази-1/4) ії мМурв8- незалежний шлях за участю ТКІЕ (ТІК-доменовмісний адаптер, індукуючий інтерферон-В).
Застосування ІКАК-1/4 інгібітора І або ТКІР інгібіторного пептиду призвело до значного зниження рівня експресії ІМО5 у присутності Епм (Фіг. 6Б, В) демонструючи, що Епу- опосередкована активація ТІ К4 призводить до активації обох Мур88-залежного, так само як мМурвв-незалежного шляху передачі сигналу. Обидва шляхи можуть сходиться на МЕКВ
Зо (ядерний фактор енхансер легкого ланцюга типу К активованих В-клітин) ядерної транслокації.
За допомогою анти-МЕкКВ антитіла, ми підтвердили, що Епм стимуляція призводить до сильного збільшення ОРС з ядерною локалізацією МЕКВ (Фіг. 6Д-Ж"), надаючи пояснення активації транскрипції, яка спостерігається прозапальних цитокінів. 1.2.5 Епу-опосередкована індукція маркера нітрозивного стресу нітротирозину
МО, рівень якого був підвищений після Епм стимуляції (див. Фіг З 3), є активною формою азоту (ЕМ5). МО може реагувати з безліччю внутрішньоклітинних молекул, включаючи білки, нуклеїнові кислоти і ліпіди, що призводить до формування З-нітротирозинових залишків (3-МТ).
Ми виявили, що дія рекомбінантних білків Епм на ОРС щура призводить до сильного збільшення 3-МТ-позитивних клітин в порівнянні з буферними контролями (Фіг. 7Б, Б" і В, В"), яка вказує на
МО-опосередковану індукцію нітрозивного стресу. Однак, після попередньої інкубації з інгібуючими ЇІМО5 молекулами Г-МАМЕ (метиловий ефір І-Ме-нітроаргініну) продукція МО, як було встановлено, була значно знижена (дані не показані), як і формування 3-МТ позитивних
ОРС (Фіг. 7 Г, ГУ. При застосуванні О-МАМЕ, неактивного енантіомера І -МАМЕ, як негативний контроль, ЕММ-опосередковане 3-МТ формування не було порушено (Фіг. 7 Д, ДУ. З іншої сторони, застосування ЗМАР (5-нітрозо-М-ацетилпеніциламін), сильного МО донора, служило як позитивний контроль, і призвело до нітротирозинілюванню майже всіх ОРС (Фіг. 7Е, Е").
Важливо відзначити, що З-нітротирозин позитивні ОРС, що виявлені за рахунок експресії їх маркера попередника РОСЕКа, також можуть бути виявлені в МАМУМ мозку хворих (Фіг. 7 Ж-
Ж"), що вказує на патологічно схожий стресорний механізм в М5. 1.2.6 Епм впливає на експресію мієліну в ОРС
Після вказаних знахідок ми досліджували, чи може Епм білок впливати на процеси олігодендрогліального диференціювання, які, як показано, є необхідними для можливості відновлення мієліну. Для даної мети, Епм стимульовані ОРС щурів оцінювали відносно рівня експресії мієлінових білків СМРавзе (2", 3'- циклічний нуклеотид З-фосфодіестерази) після трьох днів Епм стимуляції і МВР (основний білок мієліну) після шести днів стимуляції, відповідно.
Результати показали, що Епм сильно скорочував кількість СМРазе і МВР-позитивних клітин (Фіг. 8А-Г") на відміну від незмінної експресії маркера попередника 04 (Фіг. З Е-Ж"). Дане свідчить про значно порушену реакцію клітинного диференціювання при наявності білка Епу. Проте, додавання ІЇ-МАМЕ, але не О-МАМЕ паралельно з Епм стимуляцією може відновити експресію
МВР (Фіг. 8 Д-3), що свідчить про прямий зв'язок між утворенням 3-МТ через нітрозивний стрес і зменшену здатність до диференціації ОРС. 1.3 Аналіз результатів
Неефективна ремієлінізація НС в нейрозапальних демієлінізуючих захворюваннях, таких як
М5, як вважають, в першу чергу викликається зниженням здатності резидентних ОРС до правильного диференціювання і ремієлінізації демієлінізувальних аксонів!""З, але не було відомо ні однієї основної і вищерозміщеної патогенної молекули, що викликає блокаду такої ремієлінізації. Попередні дослідження вже показали, що білок оболонки Епм з НЕКМ-МУ, також названий "Асоційованим з розсіяним склерозом ретровірусним елементом" (МЕМ), при отриманні з відповідних ретровірусних частинок", надає прозапальний вплив на одноядерні клітини, активують вроджену імунну систему, які, в свою чергу, виробляють основні прозапальні цитокіни!"!о. Однак, прямий зв'язок між Епм і зниженням здатності до диференціювання ОРС досі не була показана, і не могла бути припущена. Тут ми показали, що даний білок Епм може бути виявлений в М5-ураженої тканини НС, і що Епм може заважати диференціювання ОРС через раніше невідому наявність Епм рецептора, ТІ К4, на ОРС на певній стадії диференціювання.
Даний шкідливий ефект обумовлений іЇМО5. Дана стресорна відповідь призводить до формування нітротирозину і безпосередньо впливає на експресію мієлінового білка. Цікаво, що
Епм стимуляція не впливає на ступінь виживання ОРС клітин, а клітинна морфологія залишалася незмінною на основі чого можна припустити, що Епм-опосередковані сигнали націлені на елементи цитоскелету. Слід відзначити і підтвердити новизну несподіваних результатів, попередні дослідження стверджують відсутність ТІ К4 в олігодендрогліальних клітинах в людському мозку"». Однак, на відміну від даної думки ми могли б чітко показати, що
ТІК. експресується не тільки на культивованих первинних ОРС (як щурячого, так і людського походження), але також на РОСЕКа-позитивних резидентних ОРС в М5 тканині людини. Такі відмінності можуть відбуватися з того, що Ленхардт і його колеги використовували більш загальний маркер 04 для детекції олігодендрогліальних клітин, а ми спиралися натомість на нещодавно прийнятий маркер попередника РОСЕК-й. Тим не менше, ми вперше показали даний своєрідний патерн експресії ТІ К4 в ОРС, в той час як в його існування не вірили. Крім того, ми виявили, сильне пригнічення ТІ К4 при дозріванні ОРС, що дозволяє припустити, що експресія рецептора і, отже, схильність до Епми, обмежені незрілими клітинами. Тим не менше, дане відкриття є патологічно значущим, оскільки-робить дані клітини здатними взаємодіяти безпосередньо з білком Епм, який, як показано, експресується і вивільняється при М5 ураженнях. У світлі даних висновків ми зробили висновок, що, МОКМ/НЕКМ-УМ Епм є не тільки імунопатологічним компонентом М5, але також може чинити істотний негативний вплив на ендогенну здатність відновлення мієліну. Тому було зроблено висновок, що втрата здатності лагодження, як це спостерігається у багатьох пацієнтів 3 М5 під час хвороби, пов'язана з активацією МБ5КМ/НЕКМ-ММ елементів2. Слід зазначити, що попереднє дослідження, яке описує експериментальний вплив біль»а НЕКМ-М/ Епм кодованого дефектною копією (яка не проявляє
ВТ-активності, не утворює частинки, через відсутність послідовностей кодування в генах дад і рої) зі стабільною вставкою на хромосомі 75. Даний білок Епм може бути експресований єдиним кодованим геном НЕКМ-УМ 74 елементу (епм, або ЕКММ/-Е1 локус), має чотириамінокислотну делецію в С-кінцевій частині свого поверхневого домену, очевидно, викликаючи властиву клітинну маршрутизацію і, як відомо, володіє іп мімо експресією на рівні білка, що обмежений плацентою!" "8, Даний білок дійсно є прикладом "одомашненого" НЕКМ білка", який тепер грає фізіологічну роль у формуванні синцитіотрофобластичної тканини і тому названий "Синцитій""»,
Відповідний домен злиття в НЕКМ-М/ Епум, а також як і ТІ Р4-зв'язуючий домен, можуть бути більш-менш консервативними між НЕКМ-М/ підтипами (наприклад, МОКМ-Епм або Сінтіцин). їх доступність як поверхневий білок або позаклітинний білок з конформаційною експозицією активного домену строго регулюється, і фізіологічна роль синцитіну залишається в межах синцитіотрофобласту і обмежується присутністю в плаценті Таким чином, пов'язана патогенність, очевидно, є відмітною ознакою не фізіологічної активації, наприклад, за рахунок певних інфекційних агентів навколишнього середовища???" у людей, або в експериментальних трансгенних умовах іп мімо або іп міо. Як повідомляється, синцитій знаходиться в астроглії НС у пацієнтів з розсіяним склерозом (М5), але використання антитіл в іншому сполученні дозволило виявити НЕКМ-М/ М5АМ-Епм підтип, а не синцитій22. Послідовність синцитіну може, тим не менше, бути експресованою шляхом трансгенезу в астроцитах миші, викликаючи вивільнення цитокінів, шкідливих для олігодендроцитів'є, але трансгенні миші показали нежиттєздатність (особисте спілкування С Роугег до Н. Реїтоп, Мешигомігоїоду зутрозішт, Сан-Дієго, 2007). Тим не менше, в той час як Апіопу і колеги виявили, що паличка аденоматозного поліпозу (АРС)- бо позитивні мієлінізуючі олігодендроцити є уразливими до синцитін-опосередкованої цитотоксичності в таких мізках трансгенних мишей, ми змогли продемонструвати, що тільки незрілі ОРС5 значно схильні Епу-опосередкованим прозапальним сигналам, тоді як у зрілих клітин такого немає. Таким чином, результати даного дослідження, по всій видимості, є результатами артефактних експериментальних умов, які пов'язані з їх умовами експресії, яку викликано трансгенезом плацентарного білка в клітинах головного мозку. На відміну від даних результатів, які виведені з штучних умов, авторами показаний ушкоджуючий механізм, який спрямований на здатність ендогенного ремонту нервової системи (НС) дорослого, а не патологію М5, таку, яка помітно показує імуноопосередковану втрату олігодендроцитів і мієлінової оболонки при пошкодженні аксонів. Дійсно, ЕММ-опосередковані ефекти на клітини імунної системи в асоціації із запальними ураженнями М5 є тепер добре документованими""0.2325 але ніякі попередні дослідження не свідчать про таку пряму патогенність НЕКМ-М/ Епу на гліальних клітинах з участю в блокаді ремеїлінізації МО бляшок за рахунок ОРС»5. Дані результати, що зв'язують імуногістологію мозку при М5, показують сильну експресію білка Епм в активних МО бляшках або на краю менш активних уражень, тепер підтримують таку роль у відомому дефекті ремієлінізації за рахунок ОРС при М5 ураженнях.
Приклад 2: Блокада ремеліенізації, яка індукована білюоюм оболонки НЕКМ-УМ сімейства ефективно лікуватися антитілом специфічним до Епм
Білок оболонки НЕКМ-М/ сімейства оболонки (Епуи, зокрема, із асоційованого з розсіяним склерозом ретровірусного підтипу, МОКМ-Епу) є потужним інгібітором здатності не мієлінізуючих
ОРС диференціюватися в мієлін виробляють зрілі олігодендроцити, які є важливим етапом у процесі ремеліенізації. Ми досліджували вплив МОКМ-Епм білка на експресію двох різних маркерів диференціювання олігодендроцитів:
СМРахе (2", 3'-циклічний нуклеотид-3'--фосфогідролазу) є 4 95 загального білка мієліну і присутній у цитоплазмі не компактизованої олігодендрогліальної оболонки аксонів. СМРавзе є найбільш раннім відомим мієлін-специфічним білком, який синтезується шляхом розвитку олігодендроцитів.
МВР (основний білок мієліну) є цілих 30 95 білків мієліну і відіграє важливу роль при ущільненні мієліну в центральній і периферичній нервовій системі. Він з'являється послідовно після СМРаве як іп міо, так і іп мімо, і є специфічним маркером зрілих олігодендроцитів. Метою даного дослідження було визначення того, чи можуть специфічні антитіла до Епу, такі як
СМБАСІ, рекомбінантне гуманізоване Ідс54 моноклональне антитіло до Епум, блокувати інгібування дозрівання ОРС, що індуковане М5КМ-Епу. Справді, такий ефект СМБАСІ1 буде свідчити про те, що антитіла здійснюють "анти-блокаду реміелінізуючих клітин". Для того, щоб перевірити дану гіпотезу, первинну культуру ОРС5 людини інкубували з М5ЕМ-Епу, з або без
СМрБАСІ, або шляхом нанесення рекомбінантного білка на поверхню культури або шляхом додавання білка в культуральне середовище. Експресію СМРаве (як ранній маркер дозрівання) і
МВР (як пізній маркер дозрівання) оцінювали шляхом імуноцитохімії після одного або трьох днів стимуляції, відповідно.
У даному прикладі, М5ЕЕМ-ЕММ належить до повнорозмірного рекомбінантного М5КМ-Епу білка, який містить внутрішньоклітинні, трансмембранні і позаклітинні домени білка оболонки
НЕВУ-МУ.
Представлені тут результати показують, що ОРС людини специфічно експресують ТІ КА на своїй плазматичній мембрані, і демонструють, що рекомбінантний білок М3ЕМ-Епм специфічно і суттєво зменшує кількість СМРазе і МВР-позитивних клітин. Дані спостереження знаходяться у відповідності з наведеними Прикладом 1 на ОРС людини і щура. Крім того, наші експерименти показують, для початкового часу, що гальмування (блокада) дозрівання ОРС людини, яке індуковано за рахунок М5КМ-Епм, який повністю усувається шляхом обробки СОМБАСІ1, демонструючи дані нові і раніше несподівані лікувальні якості. Дане в свою чергу забезпечує додаткову ознаку в лікуванні прогресуючих форм розсіяного склерозу. 2.1 Матеріали і методи 2.1.1.Матеріали
Матеріали, які використовуються для первинної культури ОРС людини
11111111 фПостачальник (Посилання |Серійнийномер./:.:/7/ГЗГ9О
Клітинний інкубатор ТпептоОсієпіййс /|НерРА Сіав5 100 і
Стерильна витяжка Рівпег. . Віоріоск еп МУВН Сотрасі
Зсієпійіс
ЗН Віотеаісаї 1600 10805
Повні ОРС ЗНО Вотедіса! воу 10887
ЗсієпСеї!
Середовище 1652(ОРСО5 10576 редовищ 0503 (Р/5 9846 10010 954270
Тт75 флакон 21488 03412012
І абієекК 8-лункові 154534 081711-8-0 081611-8-0 ром у увте (Полі Відта-Аітіст РА7О7 ВМС 607180 11032401 606180 11051101
Матеріали, які використовуються для оцінки експресії маркерів дозрівання в ОРС людини 11111111 (Постачальник |Посилання |Серійнийномер.:.:СЖ/:/Й 10010 954270
Параформальдегід Зідта-Аїагісн 15,812-7 ЗІввВ5309
Тих 100 ВРІ151-100 104484
Фетальна 0 бичачота лют РЕ17В-БООМІ 00 овоменоя сироватка . . Еигодепіес
Апіі-СЮРавзе антитіла ЗМІ91-8 Е11вЕ00277
Апіі-МВР антитіла ЗМ99 Е12Ог00468
Сомапсе
Апіїі-ТІ К4 антитіла АРМОМА нОоОо07099-МОЗ 11293-1Н7 п антитіла осла проти) уіірое АРІ2АЕ І м1688510
Сетага Мепге! | 87257М 0290880
Середовище для заливки Месіог .
Месіазпівід- САРІ НІзоо Х1118
Ахіозсоре мікроскоп |йвівв///////|Ї- 77777711 1-11
Ахобат 777 ф|йвівв//// |Ї- 77777771 1-11 (Ахіомівют 0 фйвівв///// |Ї- 77777771 1-11
Матеріали, які використовуються для стимуляції ОРС М5КМ-Епм, ОМБАСІ і МЗКМ-Епм буфером 11111111 |Постачальник Посилання |Серійнийномер..:/(/"СО рекомбінантний М8КМІРХТпегарешісв | ЕМУ-Т 110719-1 (22А)
М5ВУ-Епу-Т буфер РХТпегарешісвї 1-2.ЮБ5Б иши |- 8
СМБАСІ1 СМБАСІ1 Т96/рАСІ1/81 2.1.2 Протоколи
Інкубація ОРС людини з МОКМ-Епим, МОНМУ-Епм буфером і СМЬАС1
Повнорозмірний рекомбінантний МЗКМ-Епм був отриманий і очищений за допомогою РХ "Тпегарешісв (548 ак., 61, 44 кДа) (серія 110719-1). Початкова концентрація становила 0,6 мг/мл (9,76 мкм). МЗКЕМ-ЕММ буфер (20 мМ Ттідта-НСЇІ, рН 7,5, 150 мМ Масі, 1,5 95 505, 10 мМ ОТ) був наданий РХТПегарешіс5. Даний розчин використовували як негативний контроль. ЗМБАСІ1 (Ваїсп Т96/БАС1/81, виробництво ЗМР) був отриманий і очищений за допомогою РоіІутип зсіепійіс, Відень, Австрія. Початкова концентрація становила 10 мг/мл (68,03 мкМ).
ОРС людини стимулювали різними способами, або шляхом нанесення розчинів на поверхню тарілки для культивування клітин до висіву клітин, або шляхом додавання їх в клітинне культуральне середовище після посіву клітин. У будь-якому випадку 8-лункову слайд- камеру Іабіек (Мипс) попередньо покривали полі-І -лізином (Зідта-Аїййгіст"й) протягом ночі при 376.
Покриття скла 8-лункової камери І абіек
Різні речовини розводили в РВЗ в стерильному ламінарному боксі (Різспег Віобіоск,
Франція), 8 лункові слайд-камери Гаріек (Мипс; 250 мкл на лунку) покривали наступним чином:
М5АМ-Епм (1 мкг/мл) з покриттям протягом 2 год. при 37 "С.
М5АМ-Епу буфер (таке ж розведення, ніж М5ЕМ-Епу) з покриттям протягом 2 год. при 37 "С.
МОАМ-Епу-аМБАСІ Ат: МЗ5АМ-Епм (1 мкг/мл) і ЄМБАСІ (7,35 мкг/мл - 50 нМ) суміш з покриттям протягом 2 год. при 37 "С.
МЗАМ-Епу-аМБАСІ Аг: МО5АМ-Епм (1 мкг/мл) і ЗМБАСІ1 (29,4 мкг/мл - 200 нм) суміш з покриттям протягом 2 год. при 37 "76.
М5АМ-Епу-аМБАСІ1 ВІ: МОАВУ-Епм (1 мкг/мл) з покриттям протягом 2 год. при 37 "С, промиті
РВ5 і потім покриті ЗМБАСТІ (7,35 мкг/мл - 50 нМ) протягом 1 год. при 37 "С.
М5АМ-Епу-аМБАСІ1 В2: МОАУ-Епм (1 мкг/мл) з покриттям протягом 2 год. при 37 "С, промиті
РВЗ5 і потім покриті ЗМБАСТ1 (29,4 мкг/мл - 200 нМ) протягом 1 години при 37 "С.
СМБАСІ А! тільки: ОМБАСТІ (7,35 мкг/мл - 50 нМ) з покриттям протягом 2 год. при 37 "С
СМБАСІ А?2 тільки: ОМБАСТІ (29,4 мкг/мл - 200 нМ), з покриттям протягом 2 год. при 37 "С.
СМБАСІ1 ВІ1 тільки: РВ5 протягом 2 год. при 37 "С, потім покриті ЗМБАСТ1 (7,35 мкг/мл - 50
НМ) протягом 1 год. при 37 "С.
СМБАСТІ В2 тільки: РВ5 протягом 2 год. при 37 "С, потім покриті ОМБАСІ (29,4 мкг/мл - 200
НМ) протягом 1 год. при 37 "С.
ВЗА (1 мкг/мл) з покриттям протягом 2 год. при 37 "С.
ВБЗАЖОМрАСІ Ат: суміш ВБА (1 мкг/мл) і ЗМБАСІ (7,35 мкг/мл - 50 нМ) з покриттям протягом 2 годин при 37 "С.
ВБЗАОМрАСІ А2: ВЗА (1 мкг/мл) і ЗМБАС1 (29,4 мкг/мл - 200 нм) суміш з покриттям протягом 2 год. при 37 "С.
ВБЗАЖОМрАСІ В1: ВЗА (1 мкг/мл) з покриттям протягом 2 год. при 37 "С, промиті РВ5, а потім покриті ЗМБАСТ1 (7,35 мкг/мл - 50 нМ) протягом 1 год. при 37 "С.
Зо ВБ5АЖОМБАСІ1 82: ВЗА (1 мкг/мл) з покриттям протягом 2 год. при 37 "С, промиті РВ5, а потім покриті ЗМБАСІ1 (29,4 мкг/мл - 200 нМ) протягом 1 год. при 37 "С.
Клітини-попередники культури олігодендроцитів людини
ОРС, виділені з головного мозку людини, були придбані у 5сіепСеї! Кезеагсі І арогайогіє5 (через З Н Віотеаїса!Ї, Швеція). Кожен флакон містить » 1 х 106 клітин в 1 мл. Повне ОРС культуральне середовище (ОРСМ) було відновлено шляхом додавання розчину для зростання
ОРС (ОРСОЗ) і пеніциліну/стрептоміцину (Р/5) в ОРСМ, відповідно до рекомендації виробника (ЗсіепсеїЇ).
Флакон, що містить ОРС людини, поміщали на водяну баню при 37 "С і обережно перемішували шляхом обертання до повного розморожування вмісту. Клітини обережно ресуспендували за допомогою піпетки (сіїбоп 1 мл. Потім вони розбавляли повною ОРСМ і засівали у в-лунковий посудини для культивування Іаріек (7000 клітин/см"-10000 клітин на лунку) попередньо покриті полі-і--лізином (0,01 95, бідта) і з (або без) обробок, описаних вище (див 3.2.1.1) в стерильному ламінарному боксі (Ріхпег ВіобіосК, Франція). Культури інкубували при 37 "С; 5956 СО: до подальших імуноцитохімічних експериментів. Живильне середовище міняли на наступний день для видалення залишкового ЮОМ5БО і неприкріплених клітин в культурах, які обробляються протягом 72 год.
Інкубація в культуральному середовищі з МБЕМ-Епму
Після З годин попереднього культивування (див 3.2.1.2) ОРС людини в 8-лункових камерах для культивування ІабіекК, клітини інкубували при. 37 "С протягом 24 год. або 72 год. у 8- лункових камерах Іаріекз (250 мкл/лунка) з додаванням наступних розчинів:
М5АМ-Епм буфер, який застосовується як негативний контроль, додавали в повне середовище для культивування клітин.
М5АМ-Епу, що доданий при З нМ (0184 мкг/мл) в повне середовище для культивування клітин.
М5АМ-Епу (3 нМ) 4 СМБАСІ1 (200 нм; 29,4 мкг/мл) суміш, яка додана в повне середовище для культивування клітин.
СМрБАСІ (200 нМ), що доданий поодинці в повне середовище для культивування клітин.
Експресія ТІ КА і маркери мієлінізації в ОРС іп міо
Після 24 або 72 год. інкубації, середовище для культивування клітин видаляли і ОРС бо людини, що стимульовані шляхом обробок, які описані вище (див 3.2.1) фіксували в розчині параформальдегіду (4 95 РЕА в РВ5, 250 мкл на камеру) при кімнатній температурі протягом 1 години. Потім їх промивали три рази РВ5 (3 х 250 мкл на камеру), неспецифічні сайти зв'язування насичували шляхом інкубації з 1095 фетальною бичачою сироваткою (ЕВ5) в розчині РВ5, що містить 0,1 95 Тритон Х100 (250 мкл на камеру) протягом 1 год. при 37 "С. У разі ТІ К4 фарбування, клітини інкубували з 10 95 ЕВ5 в РВ5 тільки (250 мкл на камеру). Після насичення, культури ОРС інкубували з розчином первинного антитіла протягом ночі при 4 "С, що розведений в 10 95 ЕВ5З в розчині РВЗ (200 мкл на камеру), наступним чином:
Мишачі антитіла до ТІ КА 1/1000 (після 24 і 72 год. культивування)
Мишачі антитіла до СМРавзе 1/200 (після 24 год. стимуляції)
Мишачі антитіла до МВР 1/100 (після 72 год. стимуляції)
Клітини промивали З рази в РВ5 (3 х 250 мкл на камеру), і інкубували з розчином вторинного антитіла протягом 1 год. при 37 "С (250 мкл на камеру), наступним чином:
ЕІТО-кон'юговані антитіла осла проти миші 1/200.
Після З промивок в РВ5 (3 х 300 мкл на камеру) при кімнатній температурі, пластикові камери відокремлювали від предметного скла. Потім предметне скло поміщали в середовище для заливки Месіавзіаійп?ф, що містить БАРІ (Месіазпівеі4). Фарбування візуалізували методом флуоресцентної мікроскопії з використанням Ахіозсоре мікроскопа (2 еїі55).
Аналіз даних
Після 24 годин стимуляції МОКМ-Епу-Т (або контролем), СМРавхе імунореактивність клітини підраховували в 10 кадрах випадково вибраних в камері. Відсоток СМРазе-позитивних клітин розрЕібОвуваоМміряке -- п САРІ п СКМРаве я - кількість імунореактивних ОРС для СМРазе
Після 72 годин стимуляції М5КМ-Епу-Т (або контролем), МВР імунореактивність клітини підраховували в 10 випадково вибраних кадрах в камері. Відсоток МВР-позитивних клітин був розребованмівяк: п САРІ п МВР я - кількість імунореактивних ОРС для МВР
Дані представлені як середнє значення -/- стандартна похибка відсотка СМРазе або МВР позитивних клітин. Графіки отримували за допомогою СгарпРай Зойуаге, 5.00 версії для
УМіпдому5 (Сан-Дієго Каліфорнія, США). Непараметричні статистичні тести проводили за допомогою 5ідта гаї (Чикаго, Іллінойс, США).
Наступні результати були отримані протягом трьох незалежних серій експериментів, кожен з яких виконаний з новою ампулою заморожених комерційних ОРС: ОРС ІСС 01, ОРСІСС 02 і
ОРС ІСС 03. 2.2 Результати 2.2.1 Експресія ТІ КА рецепторів у ОРС людини іп міго
Експресію ТІ К4 оцінювали за допомогою імунофлуоресцентної мікроскопії. Етап насичення, що зроблений без будь-яких детергентів, дозволяв виявити ТІ К4 тільки на поверхні клітин.
Даний експеримент підтвердив присутність рецептора мішені М5КМ-Епм на клітинній поверхні
ОРС людини через 24 і 72 год. первинної культури (не показано). 2.2.2 Експресія СМРавзе і МВР в ОРС людини іп міїто
Морфологію ОРС людини іп міо візуалізували за допомогою мікроскопії в світлому полі.
ОРС представляло тіло клітини і в цілому два клітинних розширення. СМРазе і МВР експресії були підтверджені за допомогою імунофлуоресцентної мікроскопії після 24 год. і 72 год. в культурі, відповідно (не показані). 2.2.3 Вплив М5КМ-Епм з або без СМБАСІ на диференціювання ОРС людини Вплив нанесеного М5КМ-Епм на експресію маркерів дозрівання ОРС людини в первинній культурі (ОРС ІСС 01)
Метою даної першої серії експериментів (ОРС ІСС 01) було встановлення умов для первинної культури ОРС людини, а також протоколів імунофарбування слайд-камер Іабіекв, які попередньо покриті М5КМ-Епм і СМРавзе і МВР.
Гаріек посудини для культивування покривали 1 мкг/мл М5КМ-Епм перед посівом ОРС людини. Як негативний контролю (буфера), культуральні посудини інкубували при тих же умовах, тільки з буфером МЗКМ-Епу.
Відсоток СМРазе позитивних клітин був значно знижений з 85:24 95 в контрольних умовах (буфер) до 69526 95 в ОРС людини, які стимульовані протягом 24 год. в Іабтек5 попередньо покритих МОКМ-Епм ("р«е0,05; І-тест) (Фіг. 9А).
Після 72 год. культивування, відсоток МВР-позитивних клітин значно знизився з 74:27 95 при контрольних умовах (буфер) до 25:23 95 в ІіІабек5 попередньо покритих М5ЕМ-Епм (4Епу-Т)
Ср«0001 ранговий критерій Манна-Уїтні) (Фіг. 9Б). Дані результати показують, що МЗКМ-Епм інгібує дозрівання ОРС людини в мієлінізуючих клітинах іп міїго.
Вплив СМБАСТ на інгібування дозрівання ОРС, що індукований М5КМ-Епм (ОРС ІСС 02)
Метою даної другої серії експериментів (ОРС ІСС 02) було підтвердження ефекту МБ5КМ-
ЕММ на диференціювання ОРС людини і визначення того, чи можуть МО5КМ-Епм інгібувати диференціювання ОРС людини при додаванні білка безпосередньо в середовище для культивування клітин. Крім того, ми також протестували, чи може СМБАСІ1 інгібувати вплив
М5ВУ-Епм в даній моделі.
У разі стимуляції ОРС людини в Іарбіек5 попередньо покритих МОКМ-Епм, СМЬАСІ1 обробки оцінювали при двох різних протоколах. По-перше, Іарїек культуральне предметне скло попередньо інкубували з сумішшю М5КМ-Епм (1 мкг/мл) і ЗМБАСТІ (50 нМ або 200 нМ) до посіву
ОРС (умова СМЬБАСІ1-А).
Другий протокол включав в себе послідовне покриття з МОКМ-Епм (1 мкг/мл) з подальшим покриттям ОМБАСТІ (50 нМ або 200 нМ) перед посівом ОРС (умова ЗМБАСІ1-В).
Вплив М5КМ-ЕММ і ОМБАСІ1 на експресію СМРазе ОРС людини
Після 24 год. стимуляції, значне зниження відсотка СМРазте позитивних клітин з 75:22 95 в контрольних умовах (буфер) до 5522 95 спостерігали в Іабіек5, попередньо покритих 1 мкг/мл
М5АМ-Епм Ср«е0,001 у порівнянні з буфером; однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера). Крім того, стимуляція в Іабіекв5, які попередньо покриті 1 мкг/мл ВЗА, не робить впливу на СМРабзе експресію (7152 95), демонструючи, що ефект, який спостерігається з МБКМ-Епм є специфічним, оскільки він не був помічений з контрольним білком (Фіг.10А).
СМБАСІ значно інгібує зниження СМРазе позитивних клітин, що індуковані в Іабіекв, попередньо покритих М5КМ-Епм (Фіг. 10А). Ефект СМБАСІ1 видно при 50 нМ і 200 нМ, а в двох тестованих протоколах обробки: (І) умова СМБАС1-А, 50 нМ (6954 95), 200 нМ (80:52 9); (І) умова СМБАСІ1-В 5О0нмМ (96:53 95) і 200 нМ (76:54 95) (шр«0,001, однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера). Крім того, ефект
Зо СМБАСІ, очевидно, залежить від концентрації (Фіг. 10 А).
Додаткові контрольні експерименти показали, що ОРС людини, що стимульовані протягом 24 год. в Іабїек5, попередньо покритих одним СМБАСІ (50 нМ або 200 нм), або сумішшю
СМБАСТІ (50 нМ або 200 нМ) -- В5А (1 мкг/мл), не робить ніякого впливу на експресію СМРазе в порівнянні з контрольною умовою (буфер) (р»0,05; Опе-жау АМОМА) (Фіг. 10Б). Дані спостереження були зроблені по двох протоколах обробки СМБАСІ, які описані раніше (СМБАС1-А 50 нм, СМБАСТ1 200 нМ і ОМБАС1-В 50 Нм).
Даний експеримент також показує, що навіть низькі концентрації М5КМ-Епм в розчині викликають значне зниження відсотка СМРахе позитивних клітин після 24 год., з 7852 95 в контрольних умовах (буфер) до 5752 95 у групі МОКМ-Епм (р«0,001 у порівнянні з буфером; однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера) (Фіг. 11). Крім того, обробка СМБАСІ1 (200 нм) повністю протидіє зниженню експресії СМРазе, що викликана МБАКМ-ЕММ (76бж2 95; фр«0001 у порівнянні з ЕММ-Т; однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера). Цікаво відзначити, що 200 нМ СМБАСІ1 поодинці (7422 95) не робить ніякого впливу на експресію СМРаве в порівнянні з контрольною умовою (буфер) (Фіг. 11).
Вплив МЗКМ-Епм і ОМБАСІ на експресію МВР в ОРС людини
Після 72 годин стимуляції, значне зниження відсотка МВР позитивних клітин з 76:22 95 в контролях (буфер) до 571 95 спостерігається в Іаріеквх, які попередньо покриті 1 мкг/мл М5ЕМ-
Епм ("р«0,001 у порівнянні з буфером; однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера) (Фіг. 12А). У даному експерименті було показано, що відсоток МВР-позитивних клітин в ОРС-культурі в Іартекх, попередньо покритих
В5А (1 мкг/мл), дещо відрізнявся від контролю (буфер) (692 95). Однак, ВЗА також показував істотно інший вплив у порівнянні з М5КМ-Епм (р«е0,001 у порівнянні з Епх-Т; однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера), і, таким чином, показував, що повинні бути ізольовані і не впливати тільки в даній серії експериментів, оскільки не спостерігаються в інших експериментах або з СМРазе в даній же серії.
СМБАСІ значно інгібує зменшення МВР-позитивних клітин, які індуковані в Іабіекв, попередньо покритих МЗ2КМ-Епм (Фіг. 12А). Частковий ефект СОМБАСТІ з'являється при 50 нМ, а 60 повне інгібування досягається при 200 нм, і в обох тестованих протоколах обробки: (ї) ЗМЬАС1-
А 50 нМ (69:2 95) і 200 нМ (73:2 95) і (ії) ЧМЬАС1-В 50 нМ (68:52 95) і 200 нМ (7452 95) (шр«0001 у порівнянні з Епх-Т; однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера). Крім того, ефект СОМБАС1 очевидно, залежить від концентрації (ФІГ.12А).
Даний експеримент також демонструє значне зменшення відсотка МВР-позитивних клітин від 76:22 95 в контрольних умовах (буфер) до 55:22 95 в клітинах, які стимульовані додаванням
М5АМ-Епм в культуральне середовище (3 нМ) протягом 72 год. ("р«0,001 у порівнянні з буфером; однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера) (Фіг. 12Б). Крім того, обробка СМБАСІ (ЗМБАСІ 200 нм) повністю інгібує зменшення МВР експресії індукованої МЗЕМ-Епм (76:22 95; фшр«0001 у порівнянні з Епхм-Т; однофакторний дисперсійний аналіз з подальшим аналізом за допомогою апостеріорного критерію Фішера) (Фіг. 12Б).
Підтвердження СМБАСІ1 ефектів на інгібування диференціювання ОРС індукованого МБЕМ-
Епм (ОРС ІСС 03)
Хоча описані вище результати були отримані із значної кількості зібраних даних, метою даної третьої серії експериментів (ОРС ІСС 03) була повне відтворення ефекту ОМБАСІ1 при абсолютно самостійній серії експериментів.
Вплив М5КМ-ЕММ і ОМБАСІ1 на СМРавзе і МВР експресію в культурі ОРС людини
Після 24 год. стимуляції, значне зниження відсотка СМРахзте позитивних клітин з 9051 95 в контрольних умовах (буфер) до 71:51 95 спостерігається в Іабіек5, попередньо покритих МБКМ-
Епм (1 мкг/мл) (р«к0,05; ранговий дисперсійний аналіз Крускала-Уолліса з подальшим апостеріорним аналізом Стьюдента-Ньюмана-Кейлса) (Фіг. 13А). Як описано вище, ЗМрБАС1 (200 нм) повністю звертає інгібування експресії СМРазе, що викликане МЗКМ-Епм при двох
СМрРАСІ тестованих протоколах обробок (ЗМрБАС1-9022 95, ЯМБАС1-В: 914 95) (фр«0,05 у порівнянні з Епу-Т; ранговий дисперсійний аналіз Крускала-Уолліса з подальшим апостеріорним аналізом Данна) (Фіг. 13А).
Після 72 год. стимуляції, значне зниження відсотка МВР позитивних клітин з 78:22 95 при контрольних умовах (буфер) до 55:53 95 спостерігається в Іабіек5, попередньо покритих МБКМ-
ЕММ (1 мкг/мл) протягом 72 год. ("р«0,05 у порівнянні з буфером; ранговий дисперсійний аналіз
Зо Крускала-Уолліса з подальшим апостеріорним аналізом Данна) (Фіг. 13Б). Як описано вище,
СМБАСІ1 (200 нМ) повністю змінює інгібування МВР експресії, що викликане М5КМ-ЕММ у двох
СМрБАСІ1 тестованих протоколах обробок (ЗМБАС1-А: 80ж2 95, СМЬАС1-В: 75:22 95) (МИР«0,05 у порівнянні з Епх-Т; ранговий дисперсійний аналіз Крускала-Уолліса з подальшим апостеріорним аналізом Данна) (Фіг. 13Б).
Об'єднання даних експериментів ОРС ІСС 02 і ОРС ІСС 03
Результати, що отримані в двох різних серіях експериментів (ОРСІССО2 і ОРСІССОЗ), представлені вище, були об'єднані в одному аналізі. Таким чином, дані нанесені на Фіг. 14 є від 8 до 14 незалежних експериментів для СМРазве (Фіг. 14А) і МВР (Фіг. 14Б). Даний аналіз показує, що М5КМ-Епм ії ЗМЬБАС1І вплив на диференціювання ОРС людини є високо відтворюваними і послідовними.
Для того, щоб нормалізувати експресію даних, контрольна умова (буфер) була використана як референс, і вважається 100 95. Таким чином, дані результати показують, що концентрації
М5АМ-Епу, які використовуються в даній серії, інгібують 24 95 кількості СМРабзе позитивних клітин (СТК: 10051 90; ЕММ: 7651 905) і 27 906 кількості МВР- позитивних клітин (Сі: 10052 95;
ЕММ: 732 90). ОМБАСІ (200 нМ) повністю змінює ефект М5КМ-ЕММ на експресію СМРазе (СМБАС1-А: 10251 95; ЯМБАС1-В 10151 95) (ФІГ.15А), але також і ефект на експресію МВР (СМБАС1-А: 10152 95; ЯМЬАС1-В 97: ж 2 905) (Фіг. 155). 2.3 Аналіз результатів
Отже, дані з цього прикладу показують, що М5КМ Епм індукує міцне і високо відтворюване зниження експресії двох різних специфічних маркерів дозрівання олігодендроцитів. Таким чином, МЕМ Епм інгібує диференціювання попередників олігодендроцитів людини в мієлінізуючі клітини. Крім того, ми наочно продемонстрували тут, що СМБАСІ1 повністю усуває даний шкідливий вплив М5КМ Епм і відновлює нормальний рівень СМРавзе і МВР в даній моделі.
Вказані результати показують, що СМБАСІ1 лікує блокаду диференціювання ОРС, індукованої
НЕВМУ-МУ/М5АМ-Епу. Таким чином, дані результати підкріплюють інноваційне показання
СМрАСІ1 для лікування демієлінізованих уражень, які викликані НЕКМ-М/-Епу. Вони, зокрема належать до прогресивних форм розсіяного склерозу, для яких ремієлінізація є критичною, але не походить від оточуючих ОРС М5 уражень, у зв'язку зі зберігаючими Епу-позитивними клітинами і секрецією, як показано в Прикладі 1.
Приклад 3: Дослідження терапевтичних ефектів ЗМБАСІ1 антитіла, І-МАМЕ, 5МТ, ОМЕ або фумарату натрію при Експериментальному Алергічному Енцефаломієліті (ЕАЕ) на мишачій моделі індукованого глікопротеїном олігодендроцитів мієліну (МОСС, Муєїїп оїІїдодепагосуїе дЧіусоргоїгіпе) і МБЕМ/НЕКМ-МУ білком оболонки (Епм).
З. А Порівняння між окремими молекулами (мрнотерапія) і асоціації антитіла анти-Епм з малими молекулами, що інгібують Епу-індуковані ефектори при ОРС блокаді (комбінована терапія).
З.А.1. Матеріали
С57ВІ/6 миші з Спапез Вімег.
МОа 35-55 ЕзріКет, 5гі (Роїуреріїде сотрапу); посилання: 501272.
СМЬАсі1; партія Т950111-8 (Анти МОВМ/НЕВУ-М/ гуманізовані Ідс4 антитіла, що включають кожну з ділянок, що визначають комплементарність (СОВ), які наведені у БЕО ІО Мо: 1, 5ЕО ІЮ
Мо: 2, БЕО ІО Мо.З 5ЕО ІО Мо: 4, 5ЕО ІЮ Мо 5 і БЕО ІО Мо 6.
І-МАМЕ (Ма-нітро-І -аргінін метиловий ефір) бідта; посилання: М5751-525 партія вСвЕ4375У
ЗМТ (5) Метилізотіо сечовина (5ідта); посилання: М84445-1002 партія ЗТВСТ10ОЗМ
Диметилфумарат (ОМЕ) Зідта; посилання: 242926-1002 партія 2507УвСВН
Метоцел МС 5ідта; посилання: 64605-1002 партія ВСВО9989У
ІРА (Зідта) бідта; посилання: Е5506-10МІ. партія: 061М8728
РТХ (Коклюшний токсин; СаІріоспет); посилання: 516561 партія 00128881
РВЗ (фосфатно-сольовий буфер; І опа); посилання 516561; партія; 000128881
Епм (Р'Х Тпегарешіс5); виробничі партії очищеного білка, перевірені на відсутність ендотоксину (тест І ОЇ «5|ЦІ /мт) і біоактивні (зепейго внутрішні тести ОС). Прилад Коїагой (І Е8200; Віозеб Франція)
З3.А.2. Методи
Вільні від патогенів миші жіночої статі С57ВІ /6 (6-8 тижнів) були придбані у Спагпе5 Кімег
І арогайфогієз і підтримувалися на апаратурі для тварин протягом одного тижня до імунізації. За один день до імунізації, всі миші були зважені, а потім оцінювалися на тесті обертового барабана.
Зо Обертовий барабан
Дні тестування: 9 і 8 днів до імунізації. Мишей транспортували в їхніх домашніх клітках, з кімнати, в якій тварини утримувалися, в експериментальну кімнату. Миші звикали до експериментальної кімнаті протягом 15 хв. В період навчання, кожну мишу поміщали на барабан, що обертається з постійною швидкістю (4 оберти за хвилину), якщо одна миша падала, то її повертали на обертовий барабан, до тих пір, поки миші не ставало комфортно на обертовому барабані, миші бігали протягом 120 с Всіх мишей повертали в їх клітки, швидкість збільшували до 13 об/хв, і мишей знову поміщали на обертовий барабан на 120 с Всіх мишей повертали в їх клітки, швидкість збільшували до 19 об/хв, і мишей знову поміщали на обертовий барабан на 120 с Середовище приміщення для дослідів залишалося постійним між тестовими сесіями щодо температури, і інтенсивності світла.
Тестові дні: 1 день до кожної імунізації мишей транспортували в їх клітках з кімнати, в яких їх тримали, в експериментальну кімнату. Мишей привчали до експериментальної кімнати протягом 15 хв.
Потім мишей піддавали двом випробуванням при 10 збільшуючих рівнях швидкості, починаючи з 7 до 40 об/хв. Окремі затримки перед падінням з обертового барабана (для двох випробувань на кожному рівні швидкості) реєстрували до 60 с Таким чином, для кожної тварини визначали підготовку і продуктивність в системі обертового барабана.
Результати випробувань на обертовому барабані виражаються у вигляді кінетики середньої індивідуальної оцінки для кожної групи зі стандартною похибкою, зазначені в барах, для кожного дня випробування і для кожної тестованої швидкості в необхідному діапазоні для нейромоторного погіршення в даних умовах (від 16 до 29 об/хв).
Вони розраховуються для кожної окремої миші, для кожного дня тестування і для кожного значення швидкості, як відносне збільшення або зменшення часу на обертовому барабані (до падіння), у порівнянні з першим тестовим днем при одній і тій же швидкості (Д-7, перед початком індукції хвороби у відповідних групах). Значення розраховується як "Час на обертовому барабані на день Х" - "Час на 7 день для тієї ж миші з тією ж швидкістю". Цифри показують кінетику для різних груп на весь період навчання, для характерних дискримінаційних значень швидкості, при достовірній диференціації хворих від здорових тварин в наших умовах (наприклад, занадто високі або занадто низькі значеннях швидкості, або здорові падають бо негайно або хворі здатні підтримувати повільний рух).
Дані про початкову вагу і продуктивність своїм власним контролем, перш ніж середнє значення і стандартне відхилення були розраховані в групі. Різні групи тварин були розміщені однорідно в кожній клітині, відповідно до відповідної інформації, яку надано, перед кожною експериментальною серією.
Клінічна оцінка
Тварин зважували і клінічно оцінювали 5 днів на тиждень у відповідності з наступними критеріями: 0 - без ознак; 1 - параліч хвоста або гіпер-рефлексія задньої кінцівки(ок) або одностороння слабкість задніх кінцівок; 2 - двостороння слабкість задніх або передніх кінцівок;
З - плюс односторонній параліч або великий дефіцит; 4 - повний параліч задніх кінцівок або передніх; 5 - плюс частковий параліч або великий дефіцит протилежних кінцівок; 6 - агонія або смерть. Вони були взяті зі стандартних критеріїв з тим, щоб відобразити більш швидку індукцію пошкоджень головного мозку і шийного мозку даною моделлю.
Мишей зважували З рази на тиждень по понеділках, середах і п'ятницях протягом всіх експериментів.
Для серії експериментів Прикладу 3.А, групи визначали наступним чином.
Всім групам 6 (шість) мишей вперше робили щеплення підшкірно в області шиї на день 0, потім збоку спини на 7 і 14 день; 200 мкг МОоС/мишу ж 60 мкг М3ЗЕМ-ЕММ-1ЕА.
Група А була позитивною контрольною групою МЗКМ-Епу, що індукує ЕАЕ без будь-якого лікування.
Для груп Ж-3, обробку СОМБАсС1, І -МАМЕ, ЗМТ і ОМЕ окремо або разом з СМБАСсІ1 при дозах, які зазначені нижче, проводили на 12 день після імунізації, коли вже спостерігалося прогресування клінічних симптомів ЕАЕ. СМБАСсІ1 гуманізоване антитіло вводили один раз, а І -
МАМЕ або 5МТ вводили кожні 4 дні до припинення дослідження на 29 день. Що стосується груп
Д і 3, які належать до лікування ОМЕ, ми визначили обсяг щоденних витрат води для кожної миші, і встановили, що (в наших умовах), кожна миша споживає близько 3,5 мл питної води в день. Таким чином, на основі даних вимірювань, доза в 1 мг ОМЕ--0,08 95 МейшШосеї! була додана в 3,5 мл питної води на мишу щодня. 350 нг коклюшного токсину (РТХ) на тварину, вводили (і.р.) у всіх групах на той же день після кожної ін'єкції імуногену, і відтворювали через 2 дні, як звичайно в протоколах ЕАЕ, щоб
Зо полегшити міграцію лімфоцитів через кров - гематоенцефалічний бар'єр.
Узагальнена презентація експериментальних груп в Прикладі 3.А 1 А1 ЇЇ 200 |! ї1771111171Г11171С111111171111111171ї1 1716
НеобробленийгАЕ /|//:/ | я | ІА | їх | - | - | - /! - / сюди 020 | А || 11 мм 29 | 9 | тА | (б с | св г 1мг в а 1 1мг ж д 0,08 96 3,5 мл питної води. г сммерінамі | 20 0 | А | я бе
Ж. 1мг в як 1-1
ЗМ ІР
1 мг жк 0,08 96 з: Мефтос еї в питної води.
Щодня
З.А.З Результати Клінічні спостереження
Оцінку клінічних ознак і маси регулярно проводили, як описано вище. Рахунок кінетики ЕАЕ за досліджуваний період представлений на Фіг. 16, 17 і 18.
Регулярний і постійний розвиток ЕАЕ клінічних показників, таких як гіпер-рефлексія, параліч хвоста, слабкість задніх кінцівок, передніх кінцівок і частковий параліч, міг бути зафіксований у всіх мишей до кінця дослідів в групі А (ЕАЕ позитивний контроль) і до 12 дня в інших групах, які були оброблені на 12-й день СМБАс1 гуманізованими антитілами (група Б) або анти-вільних радикалів (група В, Г, Д) окремо або групами, які були оброблені одночасно СМБАСІ ії анти- вільними радикалами (групи Е, Ж, 3).
Спостереження після обробки: клінічні ознаки у групі Б, яку оброблено тільки 1 раз з
СМБАсСІ, злегка зменшувалися до дня 29. У групах, які оброблені тільки Г-МАМЕ, 5МТ, нерегулярне відновлення можна було спостерігати, але зі зменшенням прогресування ЕАЕ.
Слід зазначити, що на «16 день, введення 5МТ було перервано.
Що стосується груп Д, Ж і 3, які оброблені одночасно ЗМБАсі і І-МАМЕ, 5МТ і ОМЕ відповідно, відновлення було набагато більш значним і, зокрема, в групах Ж і 3. Дані результати показують, що синергічні ефекти значно прискорюють і збільшують симптоми ЕАЕ. Варто також відзначити, що лікування даними речовинами не викликає яких-небудь відхилень в будь-якій групі мишей (у тому числі контрольних мишей, які досліджувались окремо).
По результатам, які представлені на Фіг. 16, 17 і 18, можна резюмувати, що: найбільш підвищений клінічний показник (при найгіршому розвитку захворювання) засвідчений у необроблених тварин (група А). Тваринам, які оброблені тільки ОМБАСТ (група Б), стає краще після його введення (починаючи з 12-го дня). групи, що оброблені І -МАМЕ або 5МТ тільки, мали більш низькі показники відновлення і кінетику, ніж група Б. група Д, що оброблена ОМЕ, і група Е, оброблена СМБАст (200 мкг разова доза) в поєднанні з Ї-МАМЕ мали еквівалентне відновлення до кінця дослідження. група Ж, що оброблена антитілами СМБАСІ1 в поєднанні з ЗМТ, і група Н, що оброблена
СМБАСІ антитілами в поєднанні з ОМЕ, мала значно краще відновлення в кінці дослідження і більш ранню кінетику клінічного поліпшення, ніж всі інші групи. Дане демонструє синергічне посилення об'єднання ОМБАСІ1 і З5МТ або СМБАСІ і ОМЕ, для значного поліпшення терапевтичного результату.
Випробування на обертовому барабані
Зо Насамперед, має бути чітко зазначено, що групи з надписом "1 ін'єк." і "2 ін'єк." на Фіг. 19 відповідають контрольним тваринам, яким вводили тільки один раз (1) або два рази (2) Епм білок і МОС антиген, у порівнянні з трьома ін'єкціями Епм білка і МОС антигену, які необхідні, щоб викликати клінічний прояв ЕАЕ, як у всіх інших групах. Вони є контрольними мишами, що піддаються Епм нижче патогенного порогу і без індукції клінічної картини захворювання. Вони підтверджують, що для того, щоб всі тварини були протестовані при різних обробках, що індуковані у розвитку гострої і серйозної ЕАЕ симптоматики і поступової зміни, потрібна подібна картина трьох ін'єкцій. Таким чином, терапевтичні ефекти, які спостерігаються у оброблених тварин, актуальні для ефективності лікування в поточних і прогресуючих захворюваннях.
Відповідно до результатів, які представлені на Фіг. 19, з показниками випробування на обертовому барабані при 23 об/хв, ми можемо побачити, що:
Фізичні зусилля при 23 об/хв досягають достатнього порогу для того, щоб розкрити основні сенсорні і моторні дисфункції у тварин: не оброблена група А має найгірший результат і кінетику, в той час як тварини з одноразовою або дворазовою ін'єкцією ("1 ін'єк. або 2 ін'єк"), мають значно більш слабкі симптоми і більш помітні зміни. Зневажливий і прогресивний клінічний дефіцит в контрольній групі Б підтверджує, що хвороби і відповідні ушкодження М5 були дуже активними при З ін'єкції Епу. Тому всі інші групи з різними обробками піддавалися подібній сильній індукції захворювання Епу.
Група Б з ЕАЕ, оброблена однією ін'єкцією 200 мкг ЗМБАСІ, має відновлені показники, що подібні до контрольних мишей без індукції хвороби з низьким впливом на Епу, наприкінці періоду дослідження.
Найбільш примітний ефект, в даних умовах, виявлений для групи Ж, обробленої СМЬАС1 антитілом в поєднанні з 5МТ, яка, здається, має яскраву криву кінетики відновлення, яка закінчується при кращих показниках всіх груп в кінці дослідження. Це демонструє синергічне посилення об'єднання СМБАСІ і 5МТ для значного поліпшення терапевтичного результату.
Група Г, оброблена 5МТ, також має тільки поліпшені кінетику і результати (остання точка періоду дослідження), хоча і в меншій мірі.
За результатами, які представлені на Фіг. 20, отримані за допомогою обертового барабана з 26 об/хв, ми бачимо, що:
Фізичне зусилля при 26 об/хв підтверджує, що дані умови є вищими за поріг, що необхідний бо в даному експерименті для виявлення важливої чутливої і моторної дисфункції у тварин:
контрольна група А має гірші результати і кінетику, в той час як тварини, яким вводили тільки один раз або двічі ("-1 ін'єкція або 2 ін'єкції"), мають значно більш слабкі симптоми і більш помітні зміни (дуже хороші параметри на кінець досліджуваного періоду для групи "1 ін'єкція").
Група Б з ЕАЕ, що оброблена однією ін'єкцією 200 мкг СМБАСІ, має відновлені параметри, схожі на Г, Ж, В, Д і З груп і "72 ін'єкції" контроль, наприкінці періоду дослідження.
Найбільш примітний ефект, в даних умовах, свідчив про те, що група Е, що оброблена
СМБАСІ1 антитілами в поєднанні з Г-МАМЕ, очевидно має хорошу криву кінетики відновлення, що закінчується кращим результатом всіх груп в кінці дослідження. Група В, оброблена тільки І -
МАМЕ також має поліпшену кінетику і результат, хоча і в меншій мірі. Дане демонструє синергічне посилення об'єднання ОМБАСІ1 і Ї-МАМЕ для значно поліпшеного терапевтичного результату.
По результатам, які представлені на Фіг. 21 при випробуванні на обертовому барабані з 29 об/хв ми бачимо, що:
Фізичні зусилля при 29 об/хв досі підтверджують, що дані умови вищі за поріг, що необхідний для ініціації головних сенсорних і моторних порушень у тварин: контрольна група А має найгірший результат і кінетику, в той час як тварини, що ін'єктовані тільки один або два рази
С" ін'єк. або 2 ін'єк."), мають значно більш слабкі симптоми і більш помітні зміни з аналогічними хорошими результатами в кінці дослідження.
Група Б з ЕАЕ, обробленою за рахунок однієї ін'єкції 200 мкг ОМБАСІ1, має відновлені показники, які схожі на контрольних мишей без індукції хвороби з низьким впливом на Епм, наприкінці періоду дослідження.
Найбільш примітний ефект, в даних умовах, свідчить, що група Е, що оброблена СМБАСІ1 антитілами в поєднанні з Ї-МАМЕ, що досі, здається, має хорошу криву кінетики відновлення, яка закінчується кращим результатом всіх груп (кінець дослідження). Група В оброблена І -
МАМЕ мала поліпшену кінетику і результати, хоча і в меншій мірі.
Ще одним загальним примітним результатом є систематичне поліпшення мишей з групи Б, які оброблені тільки ЗМБАСІ, який завжди показує в значній мірі стабілізовані і/або поліпшені показники в порівнянні з необробленими тваринами (група А) у всіх умовах (від 16 до 29 об/хв тестів).
Зо Тим не менше, дана очевидна ефективність виявляється значно посиленою, шляхом поєднання СМБАсІ1 з Г-МАМЕ або 5МТ. Вона була також поліпшена шляхом поєднання з ЮОМЕ, але з більш повільною кінетикою. В будь-якому випадку, це не виключає поліпшення з оптимізованими дозами і на більш тривалий термін лікування.
Таким чином, у всіх умовах тестування (у тому числі клінічні показники) поєднання ЗМТ, І -
МАМЕ або ОМЕ з СМБАс1 забезпечило значну перевагу для клініко-функціонального відновлення в порівнянні з використанням будь-якої терапевтичної молекули, яку випробувано поодинці. Самі по собі малі молекули, очевидно, мають більш низькі і досить перехідні ефекти, в той час як ОМБАс1 має довгострокові наслідки, що забезпечують краще відновлення в кінці дослідження у порівнянні з даними невеликими лікарськими засобами, таким чином, показуючи тривалу ефективність.
Кінетика і амплітуда остаточного відновлення, будучи значно покращеною за рахунок комбінацій, тепер показано перевагу використання комбінації даних терапевтичних засобів для їх синергічних і цільових ефектів на функціональне відновлення в умовах іп міїго. Дане демонструє зазначення на ранню і більш потужну клінічну ефективність при захворюванні людини. 3.Б. Порівняння терапевтичної ефективності двох доз анти-Епм антитіла, які дано окремо як монотерапія або в комбінації з анти-МО лікарськими засобами. 3.Б.1 Матеріали і методи:
Якщо не вказано конкретно, всі матеріали і методи, є такими, як описано в Прикладі ЗА.
Експериментальні групи
Узагальнена презентація експериментальних груп Прикладу 3.Б мкл мкл НГ ей | || Ах рияюю соми | | | тА) з раю вм | || А раю вм | 311 я я ГО 13 1 Гн
Всі миші отримували три ін'єкції підшкірно на шиї в ОО, на дорсальній стороні з Д7 і Д14. Тут, мишам з групи А вводили тільки МОЄ 200 мкг/мишу і ІРА без Епми, що є групою негативного контролю без ЕАЕ в даній серії (сіп-). Група позитивного контролю з нелікованим ЕАЕ в даній серії представлена групою Б (сіпк). Іншій групі вводили 200 мкг МОоС/мишу - М5АМ-ЕММ (60 мкг) ж- ІРА, з процедурами, як зазначено в вищевикладеній презентації. Лікування було розпочато на 12-й день після імунізації у своїх відповідних групах.
Групи В, Д, Ж отримали 200 мкг СпБАСсІ1 при Л 2; Групи Г, Е, З отримали 500 мкг спрАс1 при
Л2; Група Б отримала тільки СОМБАс1 розчин буфера.
Групи Д і Е отримали ІР ін'єкцію 5МТ (200 мг/мишу) два рази на тиждень при 12, 914, 919, 321, 926 і 928.
Для груп Ж і 3, які отримують ЮОМЕ, ми попередньо визначили обсяг щоденного споживання води кожною мишею, і визначили, що (в наших умовах), кожна миша споживає близько 3,5 мл питної води в день. Таким чином, на основі даних вимірювань, дозу в 2 мг ОМЕж0,08 95 метоцел на мишу додавали до 3,5 мл питної води щодня.
Для кожної тестової швидкості обертового барабана, результати були підтверджені при кривих відповідних необроблених мишей з ЕММ-індукованої ЕАЕ (група Б, що є контролем з необробленою ЕАЕ) показали значний дефіцит в порівнянні з хибними контролями (група А, які імунізовані МОС розведеним у ІРА без Епум білка). Результати вважалися "неінтерпретуючими" всякий раз, коли такі критерії не були підібрані, як відповідні технічні і експериментальні умови, отже, як такі, що не проходять контроль якості на основі даної значної розбіжності кривих "Позитивних у порівнянні з негативними ЕАЕ" групами.
Після 20-ого дня, була зроблена внутрішньовенна (ІМ) ін'єкція 20 мкг МеКМ-Епм у фізіологічному розчині, для створення системної гострої проблеми за допомогою М5ЕМ-Епиу білка у всіх мишей, коли значне клінічне поліпшення (ремісія-подібне) було отримано при більшості обробок у мишей ЕАЕ. Це було зроблено на день Д21 для мишей групБ, Г, Е і 3, або на день Д22, для мишей груп А, В, Д і Ж, це було виконано з метою вивчення реакції різних груп з гострою Епм антигенемією, і оцінки можливих відмінностей у захисній ефективності різних методів лікування. 3.Б.2 Результати Клінічні спостереження
Показники клінічних показників і вага регулярно оцінювалися, як описано вище. Кінетика клінічних показників ЕАЕ протягом періоду дослідження представлені в Фіг. 22, 23 і 24. Криві маси, що вказують на відносну масу в порівнянні з днем до першої ін'єкції імуногенів, представлені на Фіг. 25, 26 і 27.
Випробування на обертовому барабані
Результати досліджень на обертовому барабані представлені при різних швидкостях (16; 26; 29 об/хв) на фіг. 28, 29 і 30.
Дана серія експериментів стосується впливу середовища (200 мкг) в порівнянні з високою концентрацією (500 мкг) терапевтичного СМБАСІ антитіла як монотерапія, також були проведені аналогічні порівняння при поєднанні з 5МТ і ОМЕ.
Глобальне порівняння кривих клінічного показника за період дослідження було обгрунтовано, оскільки (І) необроблена Епу-індукований ЕАЄЕ (група Б) має найбільш несприятливі зміни і (ІІ) хибні імунізовані контролі без ЕАЕ (група А) не мають клінічних ознак, що виявляються понад період, який передує внутрішньовенній ін'єкції (ІМ) Епм на 20-й день.
До внутрішньовенної ін'єкції на 20-й день, всі оброблені групи значно відрізнялися від необробленого Епу-індукованого ЕАЕ. На 20-й день оброблені групи з різною кінетикою захворювання за період дослідження мали порівняльні показники з середнім значенням нижче 0,5, що вказує на період ремісії у всіх оброблених групах. Дане підтверджує ефективність усіх доз антитіл і всіх протестованих комбінацій як з ОМЕ так і 5МТ.
В подальшому задача з внутрішньовенною (ІМ) ін'єкцією Епм білка на 20 день, мімікрувала пік експресії Епм і його вивільнення в кров, як очікувалося, під час ініціації нового і важкого рецидиву, захворювання, яке природно виникає. На Фіг. 22, 23 і 24, пояснені значні відмінності в терапевтичній активності різних продуктів і доз: 1) СОМБАСІ1 показав високу ефективність в доданні стійкості даного піку Епм антигенемії при дозуванні 500 мкг (група Г), але тимчасові клінічні порушення були виявлені при дозі 200 мкг (група В). 2) У разі комбінації з 5МТ, не було помічено суттєвих варіацій клінічних параметрів при двох дозах СМБАСІ (групи Д і Е). Таким чином, 5МТ присвоєна підвищена стійкість до ІМ М5КМ-Епу, для мишей, які отримали низьку дозу СОМБАСТІ (200 мкг) в порівнянні з мишами, яких лікували тільки антитілом при даній більш низькій дозі (група В). 3) Миші, що оброблені ОМЕ, показали клінічну резистентність до даного піку антигенемії, коли також оброблені більш високим дозуванням СМБАСІ1 (група 3), але не змогли запобігти клінічним порушенням при низькому дозуванні (група Ж). ОМЕ, таким чином, не забезпечує підвищену стійкість до ІМ М5КМ-Епм у мишей, які оброблені найменшим дозуванням ЗМБАС1 (200 мкг). Миші, що оброблені ОМЕ їі більш високими дозами ЗМБАС1 (500 мкг, в групі 3) демонстрували порівняльну стійкість, порівняно з мишами, які оброблені тільки СМБАСІ в тій же дозі (група Г). 4) Криві, що показують збільшення маси протягом періоду дослідження у всіх групах несподівано показали, що група Г, що оброблена ЗМБАСІ1 при 500 мкг, мала кращу кінцеву
Зо точку. 5) ОМБАСІ при 200 мкг (група В) або ОМЕ з СМБАСІ але при більш високій дозі (Група 3), дали кінцеві точки, що еквівалентні хибним контролям.
Дане вказує на те, що, крім відносної ефективності різних способів лікування, що показані з показником клінічної кінетики:
СМрРАСІ антитіла самі по собі у високих дозах (500 мкг) демонструють кращу клінічну ефективність. Вони також чинили позитивний вплив на загальне здоров'я тварин, як показано за допомогою динаміки зростання маси.
У поєднанні з ЗМБАСІ при більш низькій дозі (200 мкг), 5МТ показав значно більшу ефективність для лікування, з повною стійкістю до залишкової проблеми МОКМ-Епм ІМ.
Дане вказує на те, що СМБАСІ демонструє найсильніше лікування, оскільки забезпечує кращі результати при більш високій дозі (500 мкг), але, і при своїй низькій дозі (200 мкг), воно значно посилено в поєднанні з ЗМТ, яке ефективно запобігає клінічним загостренням після піку
Епм антигенемії створеної ІМ ін'єкцією в кінці дослідження.
Крім того, дані результати також показують, що більш високі дози ЗМБАСІ, самі по собі або в комбінації із даними дозами ОМЕ, забезпечують істотне посилення в терапевтичній ефективності у відношенні загального стану здоров'я (відповідно до кривих зростання маси).
Тим не менше, можлива синергія 5МТ або ОМЕ з СМБАСІ при більш високих дозах, якщо є, неможлива, оскільки антитіло саме по собі вже забезпечує максимальну терапевтичну ефективність при даних умовах індукції захворювання і активності в ЕАЕ у мишей.
Паралельно випробування на обертовому барабані об'єктивно підтверджує, при всіх відповідних швидкостях (Фіг. 28А, 29А і З0А), що більш високе дозування ЗМБАСІ (500 мкг/мишу) є найбільш ефективним продуктом (що призначається окремо) у поліпшенні неврологічного дефіциту оброблених Епму, які індуковані ЕАЕ, мишей.
Випробування на обертовому барабані також підтверджує синергетичні ефекти ЗМТ з
СМрБАСТІ, в той же час, що показує неврологічне поліпшення тварин, що оброблені низькими дозами СМБАСІ в поєднанні з МТ, що демонструють значне нейромоторне поліпшення при 26 і 29 об/хв (фіг 29Б і ЗОБ). При 16 об/хв (Фіг. 28Б), низька швидкість, здавалося, не забезпечує досить дискримінаційної здатності для підтвердження даного клінічного поліпшення за досліджуваний період.
Нарешті, результати на обертовому барабані показують поліпшення Епу-індукованих ЕАЕ у мишей з ОМЕ при обох дозах ОМБАСІ, але дане стає ясно значущим тільки при 29 об/хв (Фіг. 30
В).
Отже, беручи до уваги результати даної мети і автоматизовані тести, що оцінюють неврологічну продуктивність тварин, ЗМБАСІ1 є очевидно, надійним лікуванням, коли дається як монотерапія, що показано в Прикладі 3.Б. Синергетичні ефекти з молекулами анти-МО, як видно з СМБАСІ при більш низькій дозі з МТ, також чітко свідчать і вказують на потужне терапевтичне посилення. Дане має бути при різних дозуваннях СМЬБАСІ, але не може бути виявлено в нинішніх умовах з уже максимальними ефектами 500 мкг з ОМБАСТ1. 3.8. Порівняння між анти-Епм антитілом або фумаратом натрію поодинці (монотерапія) і анти-Епм антитіла з фумаратом натрію (комбінована терапія). 3. В 1 Матеріали і методи
Матеріал 1111 МрАсТ | о (бепвию)// | 77777771 17111 тоБОТ8Ю сСімАпегівоуреСст | (77777771 7777717171717171717171111119110280
Експериментальні групи
ІзОТИП (мкг) ник . натрію них антитіл
Ас! 200 | - | ІРА / я |РіасевроЇ.//- | - | 5 500 мкг 200 я ІГА т | ріасебо/ 7
СН ІР
Ма? | 200 | з ІА | я | Ріасеро ВЗомл о) 4 |Ма2 Фумаж
Фум питної води до кінця щодня дослідження питної води до кінця щодня дослідження 3. В.2 Результати Клінічні спостереження
Оцінку клінічних ознак і маси регулярно проводили, як описано вище. Показник кінетики ЕАЕ за досліджуваний період представлений на Фіг. 31 31.
Група А, яка представляє негативні контролі, що ін'єктовані ІРА, МОС без Епм білка і ін'єкції плацебо антитіл, що містять його буфер розчинник, не демонструвала значні клінічні симптоми протягом періоду дослідження.
Поступова зміна ЕАЕ клінічних показників може бути зафіксована до 12-ого дня в групах, які були оброблені на 12-й день з СОМБАс1 гуманізованими антитілами (група В) або з фумаратом натрію, ОМЕ-зв'язаними анти вільних радикалів окису азоту (анти-МО), поодинці в групі Г або одночасно з СМБАСІ в групі Е.
Цікаво тут тільки групи, що отримали високі дози СМБАСІ антитіла (В і Д) показали значне повернення своїх показників клінічних кривих і значно поліпшену кінцеву точку в кінці дослідження. Група Г, що оброблена тільки фумаратом натрію не показала будь-якого значного клінічного поліпшення в порівнянні з групою Б, яку оброблено неефективним ізотипом контрольного антитіла (Перекриваючі величини похибок на кривих). Регулярний і постійний розвиток ЕАЕ клінічних показників можуть бути записані у всіх мишах аж до кінця досліду в групі
Б (Епу-індукованої ЕАЕ), яку оброблено ізотипом контрольного антитіла без специфічності до білка Епу. Дане вказує на те, що терапевтичні ефекти, які спостерігаються з СМБАСІ1, є специфічними для цього, зокрема, антитіла і не мають відношення до ін'єкції будь-якого гуманізованого антитіла з тим же ізотипом який, наприклад, не буде націлений на той же епітоп.
Таким чином, даний останній приклад показує, що:
Контрольна група А без введення Епм білка поводиться як здорові контролі без клінічних ознак, незважаючи на ін'єкції всіх інших компонентів, які необхідні, щоб зводити нанівець Епм- індукцію ЕАЕ (ІРА ії МОСС), а також зводити нанівець ін'єкції антитіла (Розчинник антитіла); хибної доставки водорозчинного фумарату натрію, що є неявно наданою за рахунок нормальної питної води.
Найбільш підвищений клінічний показник (при найгіршому розвитку захворювання) зареєстрований у тварин, які оброблені нерелевантним ізотипом контрольного антитіла (Група
Б). Дана ін'єкція хибного ізотипу антитіл у присутності Епм-білка, таким чином, демонструє позитивний контроль ЕАЕ з типовою поступовою зміною ЕАЕ.
Група Г, що оброблена тільки фумаратом натрію, мала несприятливий результат в кінці дослідження, який подібний з групою Б, яка оброблена неефективними контрольними антитілами.
Групи В і Д, що оброблені високими дозами ЗМБАС1 антитіл окремо або в поєднанні з фумаратом натрію, мали еквівалентне і значно краще відновлення в кінці дослідження. Клінічне поліпшення з'явилося на 15-й день, після початку лікування.
Тут, оскільки фумарат натрію самостійно не чинив ніякого ефекту і, оскільки криві динаміки груп В і Д еквівалентні, терапевтичний ефект, що спостерігається в даних двох групах повинен бути повністю і виключно викликаний СМБАСІ, в той час як фумарат натрію показав неефективність. 3.Г Аналіз загальних результатів Прикладу З
На закінчення, окремо або в комбінації, лікування за допомогою анти-Епим специфічних антитіл, таких як СМБАсСІ і антитіл у порівнянні з вільними радикалами окису азоту (анти-МО) сполук, таких як ОМЕ, ЗМТ або І-МАМЕ, є переважними, завдяки лікуванню і запобіганню блокади потенційної активності ремієлінізації, яку викликано НЕКМ-МУ білком оболонки, зокрема,
М5ВМ-Епм, іп міо і іп мімо.
СМБАСІ при високому дозуванні (500 мкг/мишу близько 20-25 г) також показав ефективність у порівнянні з низькою дозою (200 мкг), яку дано як монотерапія в даних прикладах.
Посилання: 1. Реітоп Н, Сагбоп ДА, Веадіп ЕК, єї аЇ. МоїІесшціаг ідепійісайоп ої а помеї! геїгоміги5 гереаїеаіІу івоїаїейд їот раїепів м/йп тийіріє зсієговів. Тпе СоППарогаїме Везеагсп Стоир оп Мийгіріє Зсіеговів.
Ргос Маї! Асай 5сі О5 А. 1997; 94: 7583-8. 2. Ретоп Н, Септі В, Вегпага С, еї а Нитап епдодепои5 геїгоміги5 їуре М/ епмеіІоре ехргезвіоп іп Біоса апа бБгаїп сеї ргоміде5 пему/ іпвіднів іпіо тийіріє зсієгозіз дізеазе. Маї! Зсіег. 201218: 1721-36. 3. Вгипо 5, Сегсідпапі М апа Воп МА. М/нйе тацег арпоптаїйіез іп Біроїаг дізогаєг: а мохеі!- разес аійивіоп їепзог ітадіпд зішау. Віроїаг Оізога. 2008; 10: 460-8. 4. Сбоднагі ММ, Вепйт К, Сапйег С5 апа МасОропаїй АМ/. Зийіса! (піскпе55 аз а миїпегарійу іпадісайог тог 5спігорнгепіа. Вг У Рзуспіатгу. 2007; 191: 229-33. 5. Біємеп5 УВ. Мепйгораїпоіоду ої зспі2орНнгепіа. Агсй Сеп Рзусніаїгу. 1982; 39:11 131-9. б. Реітоп Н, Натаапі М, Райсага РН, єї аЇ. МоіІесшаг сНагасієгівіс5 ої Нитап Епдодепоий5
Веїгомігив туре-МУу іп 5спігорнгепіа апа бБіроїаг аізогаег. Т гапві Рзуспіату. 2012; 2: е201. 7. Реїтоп Н, дойміп-Магспе Е, Міспе! М, еї аї. Мийіріє зсіего5і5 геїгоміги5 рапйісіев апа гесотбіпапі епмеІоре їіддег ап арпогтаї іттипе гезропвзе іп міїго, Бу іпдисіпа роїусіопа! Моеїа16
Т-ІутрпПосуїе асіїмайоп. Мігоіоду. 2001; 287: 321-32. 8. Оеєіагаєзе С, тій Р, ВаКег О апа Атог 5. Моме! раїйподепіс еріоре5 ої туеїїп оЇїдодепагосуїє діусоргоїєїп іпдисе ехрегітепіа! ашоїттипе епсернаіотуєеійів іп С57ВІ/6 тісе.
Іттипо!іоду. 2013. 9. Неїіпеп А, Ктетег О, СоШе Р, єї аї. Те сусіїп-дерепдепі Кіпазе іпрірйог р5 7Кір2 із а педаїїме гедшіаюг ої 5спулапп сеї! аїйегепііаноп апа іп мйго туеєїїпайоп. Ргос Маї! Асай 5сі О5А. 2008; 105: 8748-53. 10. ВоПапа А, дойміп-Матсне Е, Мігеї С, Раше М, Ретоп Н апа Магсйе РМ. Те епмеІоре ргоївіп ої а пПитап епдодепошв геїгоміги5-МУ Татіїу асіїматез5 іппаїе іттипйу (год СО14/ТІ 4 60 апа ргоотоїев5 ТП1-ІїКе гезропзев. У Іттипої. 2006; 176:7636-44.
11. Снпапа А, Тошпейойе М/УМУ, Видіск А апа Ттарр ВО. Ргетувєїіпаїйіпуд оїїдодепагосуїев іп спгопіс Іевіоп5 ої тийПіріє зсієговів5. М Епді У Мед. 2002; 346:165-73. 12. Кипітапп Т, Мігоп М, Сиії О, Медпег С, Апієї У апа Вгиск МУ. Оійегепііайомп ріоскК ої оїїдодепагодіїа! ргодепіог сеїї5 ах а сайбзе ог гетуеїїпайоп Таїйге іп спгопіс тийПіріє 5сіегов5ів.
Вгаіп. 2008; 131: 1749-58. 13. Ктетег ОО, АКіах О, Найипу НР апа Кигу Р. Те сотрієх жопа ої оїіїдодепагоаїа! дінегепіайоп іппірпог5. Апп Мешгої. 2011; 69: 602-18. 14. Котигіап-Ргадєе! Б, Рагаппо5-Вассаїа (С, Ведіп Р, еї аїЇ. Моїіесшаг сіопіпд апа сНагасієгігайоп ої М5АУ-геЇаіїєд зедиепсез аззосіаївй м/йп геїгомігив-ЇКе рапісіє5. Мігоїоду. 1999; 260: 1-9. 15. І енпагаї 5, Маззійоп І, ЕоїПеїй Р, еї аї. Асіїмайоп ої іппаїе іттипйу іп Ше СМ5 іддете пеигодедепегаїйоп Іпгоцай а Тої-ІКе гесеріюг 4-дерепаепі раїпугау. Ргос Маї! Асад бсі ОБА. 2003; 100:8514-9. 16. Апюопу УМ, мап Магіє С, Орії МУ, єї аї. Нитап епдодепоиз геїгоміги5 діусоргоїєіїп-тедіаїтей іпдистіоп ої гедох геасіапі5 сайзез оЇїдодепагосуїе аеайй апа детуеїіпайоп. Маї Мешговсі. 2004; 7: 1088-95. 17. Воїк Р, Вгомлп МР, Недуї Н апа 5сп!йй» 9. Те ргоївіп рпозрНаїазе 20 (РР2С) зирепатіїу: деїесіп ої Басівїа! потоіодиев. Ргоїєїп сі. 1996; 5: 1421-5. 18. Віопа ЛІ, Везете ЕЕ, Юигеї І, єї аЇ. МоІесшціаг сНагасієгігайоп апа ріасепіа! ехргезвіоп ої
НЕНУ-МУ, а пем/ питап епдодепоиз геїгомігив Татійу. У М/гої. 1999; 73: 1 175-85. 19. Мі 5, Г ее Х, Її Х, еї а). 5упсуйнп із а саріїме геїгоміга! епмеІоре ргоївїп іпмоїмей іп питап ріасепіа! тогрподепезвів. Майте. 2000; 403: 785-9. 20. Виргесні К, Оброї|ез К, УУепаєї! У, єї аІ. Веашаїйоп ої пПитап епдодепоив геїгомігив М ргоївїп ехргеввіоп Бу Пегре5 5ітріех міги5 їуре 1: ітріїсайопе Тог тийПіріє 5сіегов5і5. У Мешгомігої. 2006; 12:65-71. 21. Аиргестї К апа Реїтоп Н. Ехрозиге юю іпіапі в5ібіїпд5 дигіпд еапу Ше апа тгізК ої типПіріє 5сієгові5. ЧАМА. 2005; 293: 2089; ашпог геріу-90. 22. ВоеркКе С, ані 5, І ашег С, єї аі. Ап М-ІеттпіпаїІу іпопсаїед епуиєіІоре ргоївїп епсодейд Бу а
Ппитап епдодепоиз геїйоміги5 М Іоси5 оп спготозоте Хадг2.3. НеїгомігоІоду. 2010; 7: 69. 23. Ретоп Н, Септі В, Вегпага С, Сіагсіа-Мопісїо М, Оеєішеп С апа Рагіпейї С. Нитап
Епдодепоив Неїгомігивз їТуре МУ ЕпмеІоре ехргезвіоп іп ріоса апа бгаїп сеїІ5 ргоміде5 пем/ іпвіднів іпто Мийіріє Зсієговів дізеазе. Мийіріе бсіеговів (оигпа!. 2012; БО: 10.1177/1352458512441381. 24. Реітоп Н апа Г апа А. Пе питап епдодепоизх геїгоміги5 ПпК Беїм'єєп депез апа епмігоптепі іп тийіріє зсієговів апа іп тийіасіогіа! дівєазев5 аззосіайпуд пешгоіпПаттаїйіоп. Сіїп Вем АЇПШегау
Іттипої!. 2010; 39: 51-61. 25. Нігои?гі В, НоїЇапа А, Міснеї! М, єї аІ. Мийіріє 5сієгов5і5-аззосіаїеай геїгомігив5 рапісіе5 саивзе Т
Іутрпосуїе-дерепаепі деайй м/йп Бгаїп петоітпаде іп питапігей ЗСІЮО тісе тодеї. У Меийгомігої. 2003; 9: 79-93. «110» Женеро «1205 СПОЛУКИ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ БЛОКАДИ РЕМІЄЛІНІЗАЦІЇ ПРИ ЗАХВОРЮВАННЯХ, ЯКІ
ПОВ'ЯЗАНІ З ЕКСПРЕСІЄЮ БІЛКА ОБОЛОНКИ НЕНУ-ЖМУ -130» ВНОВОО6б/МОО/СС -1505 05 61/708779 -1515 2012-10-02 -1505 05 61/746792 -1515 2012-12-28 -160» 30 «170» Версія, що патентується 3.5 -2105 1 «211510 «212» ПРТ «213» Миша хатня «4005 1
Бе" Аза бе бЗег бек Уа) баб Тук Ме ТУб з К за
БВ ї 5 МЕ -21052 «21157 «212» ПРТ «213» Миша хатня
«4005» 2
АгЕ ОТ зве дяп о іеи бів ЗВг з В «2105 З «21159 «212» ПРТ 213» Миша хатня «400» З іп бів Туг бій Заб без го фе о ТВе ї з «2105» 4 «2115 5 «212» ПРТ 213» Миша хатня «400» 4 дев Тук біо Меї нів 1 5 «2105 5 «211517 «212» ПРТ 213» Миша хатня «400» 5
Аїв ді Аіз го біз Те о біу зі ТВг Аз Ту Ап бій фу РВЕ губ ї 5 за 15 іу «2105» 6 «2115 7 «212» ПРТ 213» Миша хатня «400» 6
Тве УЗ Уві Бро Рв Аї1В Тує ї 5 «2105 7 «2115» 20 «212» ДНК -213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер для ампліфікації «400» 7 сЕВЕВКЕККЄ ВстВЕдЕасВ а «210» 8 «2115 21 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер для ампліфікації «400» 8 «210» 9 «2115 21 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер для ампліфікації «400» 9 кісавсвсав зввесісада в і «2105 10 «211519
«212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер для ампліфікації «4005 10 твсвсссваз сасевавнЕ - ї5 «2105 11 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер для ампліфікації «400» 11 «210512 «2115 21 «212» ДНК -213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер для ампліфікації «400» 12
ТЕзсавсвсї тстявскс В А «210513 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер для ампліфікації «4005» 13 зо ТЕвассткає сте сЕсЕВ ке «2105» 14 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер для ампліфікації «400» 14 зеЕкавтвнии ВІСЕСТРуКВ К «210515 «2115 22 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер для ампліфікації «4005» 15 звесеївесв їеавсссВсЕ ТВ а «210516 «2115 21 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер для ампліфікації «400» 16 ссввистссе сВасесТаа є зії «210517 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220»
«223» Праймер для ампліфікації «4005 17 казасавсва сввссереаЄ кВ «-2105 18 «2115 20 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Праймер для ампліфікації «400» 18 завасасвве КтссаТКВЕ ко «-2105 19 «2115 21 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Праймер для ампліфікації «4005» 19 «-210» 20 «2115 21 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Праймер для ампліфікації «400» 20
Сстввезвсв свісасовс в зії «-2105» 21 -211519
Зо «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Праймер для ампліфікації «400» 21
ЗБ ваасевевав стсасєтвис . 19 «-2105» 22 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Праймер для ампліфікації «4005» 22 всасвіїсвив сссвезасвЕ че «-2105» 23 «2115 20 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Праймер для ампліфікації «4005» 23 «втїссвеви вссааавевВЕс КК «-210» 24 «2115 20 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Праймер для ампліфікації «400» 24
ВСТвссиЕ твассвсває За
Зо
«-2105 25 «-2115 30 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Кодуюча послідовність для СОК «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (3)...(3) «223» пєа,с, 9, або ї «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (6)...(6) «223» п єа,с, 9, або ї «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (9)...(9) «223»пєа,Ффао.,абої «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (12)...012) «223» п єа,с, 9, абої «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (15)...(15) «223» п єа,с, 9, абої «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (18)...(18)
Зо «223» пєа,с, 9, або ї «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (21)...(21) «223» пєа,с, 9, або ї «400» 25 чЕпЕспеВим япю5песлю»х псвузкесву за «-2105» 26 «2115 21 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Кодуюча послідовність для СОК «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (3)...(3) «223» пва,с, 9, абої «2020» «221» тівс Тєаште «222» (6)...(6)
БО «223» пєа,с, 9, або ї «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (9)...(9) «223» пєа,с, 94, або ї «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (15)...(15) «223» п єа,с, 9, абої «2020» бо «221» тівс Теайшге
«222» (18)...(18) «223» п єа,с, 9, або ї «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (21)...(21) «223» п єа,с, 9, абої «400» 26
Мевзасве на вус В ах «-2105 27 «2115 27 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Кодуюча послідовність для СОК «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (15)...(15) «223» пєа,с, 9, або ї «2020» «221» Іпізс Тєайште «222» (18)...(18) «223» п єа,с, 9, абої «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (21)...(21) «223» п єа,с, 9, абої «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (24)...(24)
Зо «223» п єа,с, 9, абої «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (21)...(27) «223» пєа,с, 9, або ї «4005» 27 ака гРІВУуЄ Зоя пуєтс пуси ас Я «219» 28 -211515 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Кодуюча послідовність для СОК «400» 28 «вусаувана Євсяу 15 «2105» 29 «2115 51 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Кодуюча послідовність для СОК «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (3)...(3) «223» п єа,с, 9, або ї «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (6)...(6) «223» пєа,с, 9, або ї «2020»
«221» тівзс Тєаште «222» (9)...(9) «223» п єа,с, 9, абої «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (12)...012) «223» пєа.,с, 9, або ї «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (18)...(18) «223» п єа,с, 9, абої «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (21)...(21) «223» пєа,с, 9, або ї «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (24)...(24) «223» пєа,с, 9, або ї «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (21)...(27) «г2З3»пєа,с, 9, або ї «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (30)...(30) «223» п єа,с, 9, абої «2020» «221» тізс Твашпе
Зо «222» (51)...(51) «223» п єа,с, 9, абої «400» 29 вспЕтпасне страгаспни пЕдпаЗСпВет Хазузауєзеа агоКуВн ви в В «210» 30 «2115 21 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Кодуюча послідовність для СОК «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (3)...(3) «г2З3»пєа,с, 9, або ї «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (6)...(6) «223» п єа,с, 9, абої «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (9)...(9) «223» пєа,с, 9, або ї «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (12)...012) «223» пєа,с, 9, або ї «2020» «221» тівзс Тєаште «222» (18)...(18) «223» п єа,с, 9, абої
«4005» 30 вспЕСПеТАЄ сПЕСУВСВЯ У 81
Claims (5)
1. Ліганд анти-М5ВМ/НЕНМУ-М/ Епм для застосування у профілактиці і/або лікуванні прогресуючого розсіяного склерозу, де зазначений ліганд анти-М5АВМ/НЕНУ-М/ Епм містить кожну з ділянок, які визначають комплементарність (СОМК5), зазначених у 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО І МО: 2, ЗЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮО МО: 4, БЕО МО: 5 і ЗЕО ІЮ МО: 6.
2. Ліганд анти-МОАМ/НЕНМ-ММ Епм для застосування за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений ліганд анти-НЕНМ-УМ Епм є 5сЕм, Раб-фрагментом або антитілом, переважно химерним антитілом, синтетичним або гуманізованим антитілом і більш переважно Ідс, таким як ЇДО1 або досі.
3. Ліганд анти-МОАМ/НЕВМ-М/ Епм для застосування за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що прогресуючий розсіяний склероз є вторинним прогресуючим розсіяним склерозом (ЗРМ5) або первинним прогресуючим розсіяним склерозом (РРМ5).
4. Спосіб профілактики і/або лікування прогресуючого розсіяного склерозу, який включає введення суб'єкту ліганду анти-МОНАМ/НЕНМ-ММ Епм, який містить кожну з ділянок, які визначають комплементарність (СОК5), зазначених у ЗЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІО МО: 2, 5ЕО ІО МО: З, зЕО ІЮО МО: 4, БЕО ІЮ МО: 5 і ЗЕО ІЮ МО: 6.
5. Спосіб профілактики і/або лікування прогресуючого розсіяного склерозу за п. 4, який відрізняється тим, що зазначений ліганд анти-МОАМ/НЕВМ-М/ є зсЕм, Бар-фрагментом або антитілом, переважно химерним антитілом, синтетичним або гуманізованим антитілом і більш переважно Ідс, таким як Ідс1 або Ідсаі.
6. Спосіб профілактики і/або лікування прогресуючого розсіяного склерозу за п. 4 або 5, який відрізняється тим, що прогресуючий розсіяний склероз є вторинним прогресуючим розсіяним склерозом (ЗРМ5) або первинним прогресуючим розсіяним склерозом (РРМ5).
я кое онко ко во З о ОБ В: па . ; да КМ о щ Суши Б КАК, КО х с А п ОО СЕ МОМ ЕК сх МОЖ М ооо НИ Ки Ка ра п ті й В АХ МКК ОК Ж о КМ З а Х ПО ОН о с с ОЗ ще 5 ЕК ПО и в пон КК п ЗОН ТЕ ВК г: Во тя не ово по Ех ЖЖ ПК Ки СО С ОО У о и. о о о Ж Є ОК ПЕТТНИВ КК КК НВК оо о М ПК НК он ВН ПОВ Де о В АК ех ВОМ В нн о В ОО ОМ ПММ ОО о УК ВН о Ко ЕК КК М ПОВЕ ТК НН В нн ОО о Ко в КН Ж НВ НН я я Пан У ЕЕ Ки ЕОККК КК КМ я ВВВВВЯ ОКО я ка ДЕННЯ ко У В Зно я Ох п АК КК ни и ОК о М ПЕВ Ва в о п І І пов Б Он ВОМ ОВ Кн в В с я 5 МКУ с "ПНО Коко З АК ВК КК ВК НН ков НН ОО А и ЕК ши М з п показу ОККО ее ПО ХОБІ КЕ о в В Ом в ПЕК ВК КН В я . 3. В ом Кох ОХ ПК хх З ОО Я ек МСМНННИЧЯНиНи ОХ ВЕ В ПА ЕХ КА: Нр ВН ох КК КМ КК НО ОН З В В М КА и В ОН я Ве МК АК ООН і КВ Кон пе нн ПЕН КЕ Я КК КС ВВ ЕК вс п. п в кВ В в В ск п о о де ще и Й з Вони, ;: М СХ В он ння ПК и КК КВ У ІНН Вин наве ДЕ вен ПК В о Е ДК НВ НО 6 ши нн нн ІІІ я УВО ОВ : В Аня ПИ КЕН Здорова нсннанвнввн, ВИН По КК ВЕ Зо НН "НН нш шк УиеННевниня ООН ноя Й КО оте НИ ; ре фени нн нн о не В вени ен НОЯ ки 5 Ж и Денне ННЯ о ШОН ВЕ З нове о ти і пн В Й шо ОВ ЕВ С я. ц , с я в СЯ Пи о ни НН й ва М в о о ОМ ОО й еШ сини Он І ОО о Я ПЕД на Б ОО шо пе КН 5. тот шин оо кл В з і Ен У НН ее нн ВЕ в Ки в й й о В Ве: У м у я ПНЯ ев тя . ЕЕ Б. Жов о дя Вон Ве що шу не сок ННЯ они ек ВИНЕН Вк хи як я ше БІ В НЕ Я а шин ДК Ки с В ен и й З Ой Кене вен КЗ Я "она Я фев А Я Бех САН В ми Пи ЇЇ НН ЗЕ вена сік сов А о о я я си а а в панк у нн и В ЕН В жи Я о НЕ в роді у ЗИ МН КЕ ЕН о Пн чи Ще : Мона Ко З МОЯ У В ще ВНУ не ЯК Я ВК ване я о со м я "М шо Б: ЯК ЯКЕ вн ВЗ в н я. а оо он Й ОО ЗИ В шк ВЕН Вени: В і ЗКУ о В и З ! в ей По ВН Ве я ЕЕ "о Вин В и М М В о КО НА оо НЯ я ен В НИ ЖЕ: шк ЦИ и ай Ен и Бе Он ОВК в ни Я о Я Мей В З й ТОНЕ НИ ЗМЕН У а Но я ОО ЗІБ і у с, т. Ши ВОК ШИ ОО Кн В КО о в ВИНИ ее У ШУ пеня ИНА он в ВО Бе З ИВННЯ З С на ще Я нн й М я вин в НН : я мк ка ОБ ЖК КО Є : УНвНН Козаки ї. і й Е ж он о овен вне ее У рання НК ВО ння син КК пк Ме: яву в ши Ши з и ни ни М що виш пон квн ання ПЕН ППО ЛИ Ми В ПЕК ЖЖ ж: Й НН я ОН они ВИ ее Е ши НН я йно ЗИ ПІНКИ ПИШИ КОКС С ВІК ие с Еї : (о р І і ж 1 ЕМУ ВІ ТУ я білок оболонки РОСЕКа - рецептор до фактора рос З зцей ла фактора росту тромбоциті щі з юосту тОомМмОоцитв а ик. хх ТЬНЯ - топл-подібний ре плепйодібний вецептов 4 й ЖК сш А 14 ШЕ З во ж же: ВЕНИ ення ; х 08 Й о, - іа - В ; У о ев як ши. нн 55 ее Од її ЗД ед 9д ше і: С й й | прин о І КЕ Ба ше Що | я й Ін и ши її Ми с 3 М і С ММ сві -гапактоцереброзидаза ОКР «зепений флуоресцентций біле і Шон з во Ані 0 Фо ше ШЕ ше ЇЇ й у песен они МОВ ен ее с Я і маш ше Бен ек ехо
В. я Щи 5 ше ! ДО шт сах КОНЯ Бони ОС ї ! ; : ч ва Ж лу и ЖИ ож З що ї С а що Жовте ок В Кк м В Я дення ше ИН ВК НН. 5 щі ВУ вні ння з 0 ЄМУ сердий Б зе сзчинчяий : НШШИКНЕ ЩШЩе К шо0оте . же МОМ сне ее Ше з Й лит Ше ВК З МЕ 000 Ж : й пови вони нн в я НЕ - ВЕК НН оо Ше В БЕ Я с: Зк : і УНН ШО : я зб ВИ пн Б ши С 5 я жук ж... Я ше ща Я ЗИ Св гу рожевою Нм ї яті БМ'У твердий | і «ЧА ЕМ теврдий вок. Зону Лю; ГоОриттння ях В: ; яко
НЕ. зоровн: 5 Оу френч Ко ОВ Ж в Фо ше ев: о й в 5 фе хни лннонаь НА. пол се ду як ї ен НВК, я ЕЕ з ; ; ху обо во сн га ; В руУутасн вилаєну і 7 ! 5 с ЄМУ твердий в | меми нем нявло нема «Я ет ЕМУ МУ МО «оксид азоту ІС індуцибельна синтаза оксиду азота " ТМЕ -хбактор некрозу пухлини
1. «іберлейкін С -контроль
ЩЕ. я : що с А її о (Ж Ж ОВ ща -: ЩЕ Ф Я: ще В ю ВВ в їй за : ве - Ж: Й . В: як У давен ЖЖ. фу, Ж «к. як Му ж ос С хо Жооожо мо Жосж ж ко Мою Ж де Є б ОК ше С щ-ів ТР ще
ФІГ. 4 ОО» клітини попередники опігодендрацитів Сі, - опігодендроцяти Й жа що. Вт во. ла» ча щі ЕЕ я рт Фо Я о. : о та: шо КОХ пана на Жов с п в с НН, я ща ОО о . ше ак ви кН А і ДАВ КУ о нина: ЗШ повен У ав: я о п ШІ С А . ВО ще ОО о а НО Є ВО ня м За: я о в ав ба Б . Ес вв В ав Б 5 В нмннюенв не ко тв. п о шиненнАоя Мн се НН ще ще о Б т ї. ї ї сні ЕМУ Ст ЕМУ твердий твердий розчинний розчинний
Фіг. 5
А 7 : ре ЖК Б їх | тя В БЕ : дня сек еле ве ТО ши що ве я вщ ВЕ оо ДЯ а. ВШ ук: кг оси 1 З З ка ШЕ 5 к. ЩЕ 5 ка ВЕ с я: В БНО НН 8 ба ШЕ з ЖЕ С. во ШИ да Й оооосххнях у ЖНУ 0 ЕМУ нагріне ЕМУ 0 ВнБЮр ЩО вибов ле хи шк: її АКНЕ ; ШИ Г Б : ! А Ох ВВ рн шк А здвшне ШИ 7 ше. х я і ще : жан шо С
АЖ. У В Не 4 Я : ен с ХМ. Ї ті І | шле я В ек ОО ШИ шк шк! ше п ще ї вах : : родення Бе ; ен Ж з Бе Я Ж ще кн нн ДЕ донееюеюююндм ох ее р те Е я ше НУ вив ТВ - ЕМУ ши и ІБАК 1/4 - кіназа; що асоційована з рецептором інтерлейкіняї 14 ПА в дізміно 2 феніліндоп МЕКВ «ядерний фактор енхансер легкого ланцюга типу Кк активованих В-клітин
І реа нестніннині окон : ТБ. состав г вит Кент, пк знанні зе : у м: КУ вк зна ШЕ З о о. яко п зам ке я ЩО 5 о
1 . ня КОД ОО «в щу МАМУ МАМУ ЗНАК з кеш нин коп я В с нок Б г ЧТ нн сита ШЕ ЕМ не НИ ни и шен нен шо ци ге ши Ов як а п ОВ а А ТЕН 0000 и и й МИ М І МК и ОК НН :
Б. и: В ! ШИНИ їн пишне Я Манн МИННННЯЯ САМАМЕ «МУ вітроартініну метиловий ефів О-ЧАМЕ - БМ нітровутініну метиловий ефір ЗМАР - Б-нітрозомеацетиле і «вен ідилавня ЗАМ - Зеітротірозин "
А с. онов М: слона ма аакова Д рон нпденонячнні нт ннвння чн, ЯЖ ох веж ее у ЧИН З ЗИ 7 і " у о а Не і ДЕРУНИ у в роя А АН Няня вк ї ще -- В. кА и НЕ жк е - че ення ВИНИ і !
з С. р ие ща чия зах 4 : о с т в се В Ши - й іх : ОЗ : В Боян ВОНО ж і ще : пе і ВВ. ИН я ЩЕ | і. ! БОЖОМУ тАеня . Вр що а СО ВН ння Б нт ВН ЕМУ СКАМЕЖОУ Оман но ся и Іще шк: БОБ у я : кон НН я Шу 7 і МН ше МБО - КБ с 0 СОМОВІ о Ж рн ща Ай ко Кк: ВН Еф М вн « жк ШЕ ЩІ ж чі - НО НН ОМИНв ВИМ ЕНН МР» основний білок мівліну ОМРавех З -фосфодівстераза цикпічних нухлеотидів ді
8 сг Кі тт сет З КЗ п. 5 УМ песее о
Б в. г с
Се. ї с с
Її. щ | о. о. « ! В ? буфер
Я в. тн Ес Ва с хв с От ож З пчничи ння інн я щі ж 1 чех КО ЗК В з Я: ВМ КЕ МО ! ші що ШЕ Б до шо. . щі щ щ о. м ; о . 55 КЕ С ЕК у То РОЯОО . ! о Б Ї З ї Б о. ш ш шщ ш щ о Буфер Етпул 50 Ж ві оо ва "СМБАСІ А ОМ с А ОМВАС1-В --о ВУ та «ей КЕ а | о. о СЯ ОО КО ШОК ЖЕ МО В ; ВМ ОК ЕК Ж СК ДО о п
З о. о. о. о. о. о. о Я МОЖ ЖЖ ШИК ВОМС ОК ПІН Ж Я З
Ж я. о. і. І. о. о пох и" и й. ЕЕ и. о Ох ж КК СХ КЗ КО Я ЕЕ В ук ЕХ ВК ОНИ В ОО о о яти Ук г. . ОК УОООО ОВО З п. Х й СНО БОИ ОЙ ЗЕ М у Буфер БО ОО 0 й и й. туферо ех зо в ж Ковнинх р й свов. З ев аБ5О о дОВО наб
У. КАХ 5 Ей ВОАВОМВАС
Фіг. 10 ге ра о В ПК МАКАВВННИХ ще шо о . з ш в с Ох Її. ОВ ДЯ о ос ше в. ! о : Ж КУ | КО о о. о Ес о . ХХ В ОКО С в їі о. . о о ж ТК ; ОО ЕЕ. З ОБ о. а | с . З МОХ В х яко їх шщ о. в о. Е о : Х ВВ ВО бе зв о шщщ
ШЕ. КО МБ с З БО МВ х і Як ОО Б о. : З ОВ КК В В х ЕК п. ; - . КО й я ОМ У ЕН , Ко о В а. ШИ М ОО зн одн М од й що (яничний
ІГ.
У ВО; жо ж ож й Х В : ка щ й я ! з 9 , е КОХ о МК заокікнюю БО я Кк ЕЯ Дону В Й рез о. о : ІОВ чок ДО З я З З І і Я: «Ех Ши і. | с. | | і. і. зак ВО ВИ БОКВ КВ ВВ Б: г. м з ШІ ЕК ЖК КВ я В . ща сек о х і. КО 5 о в | . о Х Ж У М КОП ДЯ В С з |. . НТ . чи я й шо т пет ща ЗБ: Буфер ; " І Ж Не ЧОМВАСІА ОМА цу г | " о
: 1. ЩЕ З у т) во : с о . 0. Е ін оо о. о Ез і МЕ і. З о. і : ВХ ох 5555 ШИ Еп-ї буфер - зни ООН
Фіг. 12
МЕ У А хх лих окт ще БО о І ; ше кекс І У х г ОО ше І У ОО 3 ЗО ; ді МОЯ ОХ МОЯ у бою ж Б : ВО КК З а ПО 5 З ПЕКИ НВ СО З ОКХ Ін х о . . а ЕВ п . З ООВЯ НН Буфев Епу-т КЗМВАС1 А ОМНВАСТАВ у Ж КН мой З и Жов, а шин що ЕК н ШЕ З о . У Я ю щі Б . о. о Є ЕВ З КК ПИМЯ ЗЕ а . . с щ я с ш я Буфер о Єпуєт ЗСИЧБАСТ А ЧЗМВАСТВ
Фіг. 13 це ЗВ я МОХ о : Я ОО З Б і ; зооровнихх х 0 5 Не : з з Х о З З с. Х ШЕ М ще й : о: а М с ! хх : В КО МВ З з З Оу ї Б МК ОХ Є БО З ОО . . КО 5 : З В Бо о. п о і и о. Ж о. Е о 5 п. Х В г КО М З М Я у о. й Е ЇВ В 5 З х Я я г Ф 2 5 гі п КАХ КО ї 1. і в Що -аМБАСІ о. ; о. ; о Х 55 Х В КОС с о З о - х са о 5 о Ж . . ; ї о 5 КВ В ПИВ о. Ж - х 8: В За : о т оц в. кеш І |. Я Яос Й Ох КК Я о. ВОК М х "З п. З ів | . о З Ж В ОО Ж й ХУ ОХ ОК х с у Ж о ; Є си 5 о х : о зов Ян ОО: ях ї В ОО з Во. о. що ї» п З с о ге і о. п З о З : о З о 1 о. с о. й 5 ЗОЗ ЕЕ. о ; о й - к- о о. шо ех с о о й 7 7 | пл тв. Ще аМБВАС фіг. 14
58 Сг ПА 1265 з ; но «овен З
. В ВХ З Я тов і, ш Ж х о. оф: в о. ; хх ш З УОКОКККВ Е: І З МО ОВ Б ік Іі В ш . . о. о х й с. ОО КО Х В З а З п о г с. З ох ОВ . о. З п. с, о ТЕ о і о ох нс : : о. У мВ | о Ко В в Е с я зо З : ! М М З З о Ф о о. Що о. . о о - с . о. о У 7 я ОВ 5 ХХ З 55 ОО о. Ж ! с о о. о. Ек в. . . о. о. ЕВ В о о. шщ- о. о КО ОБ Ь КК БІ ОО Ко . ш х за» о. о о і. Жх ВОЗ КВ В ДУМАВ
Б о. й А с «ТВ, В сте «анвБАсі -
Фіг. 15
Дкк КК ККК КО ККККЖКХКХККАю КККККККККККК ККККС КК КК К Кк уК КК кккКккккккхкюкюкнка ; ї ї ее 3 і ж Ї ; ї роз 5
ОБ. ! ї Ж нч о о 5 їв і : ; і м : ж : ще з Мк ї В | Як сн й х сюжжжюию демо ее ми ин шк ї о 2,5 ння хх хат оо су Я. : і ох ! добх. НК ска КУН й ї З за В ! Й че у бик ди Кох З Н ї -ш ОО рент ВК и Й о о: же фр і Н їх : ее ака ее сте р БО Ок ! в ! с ах шо йо їз ; 3 «Ех о : з У. и ОЖК й: Ж кю з А щ ; З ДЕ ії, Делкеке 5 М я Мчикккннкнинннн ех хкююютєюю Вс х сКжжжя жиє юю юю зе фе 4 Е : 3 5 ї Я Я Ь і З а ц х ох У». те 5 З ї Денне З. "ДК ххх вх уууум ту у у у у я У УКХ у УК МУКУ мчч новой В ї З « і З і З і е і Же і гу : за г , 3 М , З с 1 в Кк Ук ллчттттлтлллт ти пд АЛАНА ЖАЛА Х Алли тт АлАТ л ТЯ ЖЖ А АТ л тт ня х х і Те їж і У х х З г С знан нн нн нн і щи І 3 Кома т т Мт МО : щ а а в а й в й юю й а а в дю : ж Ж ж Ж Ж Ж Ж Ж Ж Ж ж хх хх фо шо фа б фо оф Бо З «її авчичи'ЧчкаииуХУ2о2Сткк« вшчсцщццк і ен нн а НН НН
Фіг. 16 КК У КК у У У п о о ооо Куток ото хх ююдттсннс ї ЖОВ. о сддоюкюкюкуккхюк ххх КК ух кк Кк ккккккКкКккккккккк Кк ккккккки х ! Я ; хх х х м ! : і ї : р ФО франко А КК ХХХ АНА К КК Кк ск ДК ун ччнчккккк кс кккюююсяхняя ї ї я 7 1 СУЯ щх 5 ї ї її зе 1 ; в пт, ОА по ких С Б ї і ре З 5 о в ВК В о у хе окон Все Кк ВВ ї ї т зи і ще СУ Я нан КВК Ме ше 3 ї сх і СК КЕ МКК осо ї Бо ен яд І хх птах ОК Я КК лай ше ї ; й Щх Якшо Кі ОО похнеенкуккок кекс конк Ак ВВ фр квовннкх я я Б ї їх у ве З у. Я "Ж Ж С ка 3 х ром І ях зх. ак ЗХ Ж т х я ТОЖ ки ще ПОТ С ч о : : Бе 4 о ВК хх Кк ДК ки зааннх В ї х ск КН 7 -к Й . х ОО ха як ; ї Бк ВХ . ї т як з і ЗХ х т ї ї що с я х т ї вх х : в | ща ї їх ЗА БК: : : З ТУ ХЕ о в в і ї З Х в і х х їх С» Ж Ї дексу з - СЯ Я ШИ Бе а ож Кот А ї : і МО ЩО ЩО ФК яко же ях же ФЕОСЯ ЄМ СМС ї
Я с. З с. Ех с. с. З х і й а в ж а а а й й в ша а да : ї Ох се хе гом же. : 5 БІБ Е М щі ї У НЕ ДН Х ї ї ко КМ Б КК Б КОКО С М КО ї нн и я фіг. 17 пончо кн кокон чинне нн кн нно нні ЗИ ря ї к і : та і і я 2, р дви сф М ст Вкрай ; в | пак ПЕ оо : т Га - тре и к ях зако В іх : ! як ФО ренти па КО що аг а и кри я ай рю ок Д. ї ШЕ | си Бек ту . ОО ов ВК ння вон оон вро жд м ї рен з ге З ЮК лоннннннунаннняялькнн наданню склаляяядядяннняннн іа - вен бле зинюфоння ЇЗ ; щ вм і « | ще : Н ЕЗ З ; 1 ь 0 БД, тот чут зекннадфонннх г
! Й. МСС онннттоттттстттттттоонтсстттстстосюттонтітсссевтетскочкдтнюся В і і Н - (4 ря хе жен ФЙ а : Комар Вин І а в й ва й в в й в а й ва а в Ї : ЖЖ Ж Ж Ж Ж Ж ж Ж ж Ох ж Ж ох і що що шк ї : чеичЧачбчниА чт мм : М одною наннкнкнккнкнакан ання чні палнканнккананан нак паннаячя кана ан нн ккактнктя няння кчнак а кая анна анна плнкаячяньнннн
Фіг. 18 й г яти т юю юю юю юю я юю м ТУ УКХ і і і ; сафбрня : і 5 г і ЇЇ 7 їх : ще і і : « ; як І Ф ї я я" : їх і 7 т Я удчякноюв ють : Кок і хх ХМ . за туї зві ів КЕ ; ку. ТО ціни . --я-- Чінжекція : Її хіх ох к І ї ж Бо нку ХЕ де ее КО о : ж ту і НИ Н 3 се Же Бір ГОТУ фріфрооронннннннннннннчнннноннннконн поунннніаннннннчннтттнтнктх Я І еКце Мал АХАА ААУ М ААААААХАХАМА МАЛА АЛЛА КАХ А ДМА ААААААААААА КАЛ УААН АХА ААУ А ААА УА АЛЛА АЛАНА МА ли Ки МА День, дей де ДВ Дб що О7У ! т Ї Б з .. : 1 Кай Ї КК. з » ху пахафняя Б і Тож ! ж тку І їж ! ж . дж о дню і і Ж зв фени Бек : їх : Дн, уж яке т 7 : Ї ро ! ее меч с я : : 5 : тк Ж ж в , і ДОД пре у фу ти для флчннннннх і ! Ф КО г З Ку щі ! їх : . 7 т ол, х і а ! З ув ча ! їде ки п нн ! ОТ : ' ! - й А дна : на дев де дя дн
Фіг. 19
КУ У нн Н І і 1 і : Е і їх і : і і і і 3 ; ! : ї і ї І : ї : І! ї : дод М їжу щи : я й і! НІ ВЕК ЕІ дрон нт у А АКА А АНА фінали нтх 1 : Ж КЕ ї т : В ' | ! іх і . їх : т я -ев 15 і ! т Х і : Ж ї б земних : п КОД фев оеетуєтт фут ду у в ря : ри я с но йк а жи ВЕ т В! і т ї Кн жу ї-е ння ду : : А Ук уми Ї Ї : ї "Ех, 7 ек жу хм ї к - -Же ж г : ен В и да дути ння " і їв Ку ї ЗУ ДУ ук леєвкн Х ох ща : В | х я в п : а : Яд і ї Ї а фунт ненні : ; : зефір З і : : - Ж : і юаг- 3 х Зх 3 я 4 з дл де дез 0 див дев рекет ут У т т тт тк ттют ткттітеккеве те тететктє кі тететктк тт тетієтк єю ткттетек тк тре орден тттететюсн і ї і і і і і ї і і ! і і І і : і і : Н ! сн нн і ! МИ су хі Ї ее : і 1 2 х - ї Її і в і І р і й меж і і 3ав оултетнтстттуттттетостоттттттнтятютттетиюнчтякототтнттттттттт сет отттттттототтт няття 7 і Б ме Т Ж І ! і : ,ї : дк З. їх : їх : о . . А пане ко д і Н « ща пи ах дя Ку кю Ек ее і 1 ї тк тож о шк У ох І Шк : хе во ши я і іш і ; хх ТЕ « : і За хх . : Ж да с ДЯ кох ях Її : і Її -їща ПЕ МК и дж З Пт «Ж З і і я і ж т св ск жд . АХ і з ! у У | і : І " і х ї ї і і і і й ! ! Зк А о м ї ї еВ не пад - «опале накаже тятежтюю» ї ї Я що тк с лу до дея дян дев дев
Фіг. Та іпродовж.
: ре за фен фрі і ! 7 і З Кк ! І те зай св посттоттететестечттеєтетоттттттттттоттттсстете тт тт дня 7 і Т- ЗБ х Мей : ож : « и І ОО ФО. бен руду оф ння оренду рн у с нннннну с. о. ОБОВ тет тд, ш.- ін'єкція о ! рн дв цех з і !
5 Б. . і; з ін'єкції Ро 4 Хо ; і я з з і КОЖ ЖК пря но урнвкакненн КК зим т я 5 А : і І ! ' ! Н д-я де дев де Дав ' Е ; : х і і НУ ПЕ Аа нене ти А АН я Ки У у ня Й Ї Ї - Ї зер А і СЯ З ке нн а КК Е ї зва ї я зе ! ет м З хіх Її ї пе З в Кк в тя яке пдв й й ї х Б сей НЕ і їх в оентенюнн в -- ШЕ. ві ї Є ка КИ: Кука ткач тп пет т п п тут пгт т пупси А т я ЖАВ я КА нти ння й і В -аа п т щ ї 1 - х ії 7 і , і Ї м «ее щУ і - х В З ж і ' і ДУ де дея дет де «Фіг. 20
Е І і і і ї і ї і і ? Її хх - пня чих зах я х м Н їй нн п и м а і : і я і 1 я Ї і і Н Н і ! 1 Н | зу їх і ЇХ де ще г і і г КК ря вне у деку Мне : їх х хо ж - т око ї 3 ух. хе щ м х Жде г і 1 а у п» м рок КЕ 5. і х м є з Я т ож. мм Кх У уче АЖ ОЕ. френч ря чт дм жжжнжжюьью Киян ек м ння кю лляних дення 3 РОБ я НЕ ІВ ех рої 3 Ж МО джжннння ж і 1 Ж х УЖ Ж ля лксии дю І ї ї т хх. ко Ех і : я «Ева фено Хм В чу чтяюю я я я яка яю юю ї ї 8 і х . " і сх - і ЕО зв ЧК : я Ї і їх ЗК» кед ек фета нсуси ксненен ники кух скх кн нннкекен ! ОХ : ї ! і: і Я і ї й Н Ко : ГО ря : ев Одно і ії і х ЖЕ как кжкнКХх вх т З 1 Е і 1 і Ка а І
1 . і жо Ж хх і : Н 1 : : ; Її свв ! ! : - Я пон нн і ї ї тро ї- В гар т гу аз а ї : ще дя ДдяеТя ДВ дев : Н ! т 7 і У лада анна А А А АК А УА А КАМ У УААН КА АКА КА КЕ УК юн ння кокетки юю і у ї ї : : : і : мк ; : : « гесеффретнняя ї ї З. пу ут а тку юку унюююннюкнню М й : : кед ї і : ї КЕ як і і : «ї ї і ї Я х 1 ї і Ф ШО ке чна а а ан а а а а аа а а а а а а а і ОО 1 1 Ко ї ж посесбунсстя Ж : Бош | і як : Ж 2 х ї ! Ж ї ке ї їх 5 Мой ї сх і 4 7 Її, е : і К ДЮ хв дерен сетер ренні ниж мн : і МД о ямах оо кю й З і : їв 1 хе З. ДА жо ХЕ ук «ЩЕ -к і ЕХ : ОВ ник ож хх : і : КК ; ! чу Сам ще т : шк : Сх Ї ї : й і : З і Н Ї з і 5. і і с к і і к зай МЕ ха Кф фан» С п «ж - « : : : б я : х 1 х Ї : Н : ж під 4 я ах і і Де дея Дее Де Де :
Фіг. 20 іпродовж.)
. ; ча. у не ; ! ДВ. ре тетттттопоуттотототтттосоееоотетотессодужетотооя ї : З їх і ї !
Я. і ж 88 пе з Б І 8 ї і ї подяки ТК 0. іш фол уя еко В дет КУ пня, о : ОД ДКжтноя ях ОО -5о че Ді ія ШК ін'єкція 14 зх : КБ - ! З -з18а я У Дня . аа фено кекттеннно У ння і і щі я шой шу рабу і -ЖХ0 В пре в нн, Ж Ку Ін ЕКкцЕ : ук і і - У У . НУ У М У ях ; : До де де дв Дн ; ! ен и : : : Ж сним : Б ща | ши З шт з : Е | Км ї : їх є ї їжі п -к ї І з Кк їв . З рення ення ект і «френч рн фени фоонннннннн кокони фенннння в : "а сх ! йо ую - З . т Б 7 і : я і ; д-ї де днк? о дяе Днв ; мо а о и а в фіг. 2 і Її і : І! Н І: Кс - і іу ядрі і ! Ох КЗ ранніх чю т Куна А НААН ЧК УА на Кухня Кн ААААКУ уник хумхнуньн ї сф ! сен Й БА ; уеоетстттттонніях і 1 яка 0 і Ж ож. з : їж ДЖ, фе ут тт тт : і е В. В я пня сорт кукі медик кнкчнннях «Жов «АК і ї - : х УЖ тКо екон кю й ше : ї я ї х Ж 5 се я же ж у. : КО до сонну ВВ ВВ КК з і В Б | о -х ТУТ УТИКИ орки КАК фея ще - Ї і ; нм - х В а Кф ня ран А АК А А А у А А Ач нка нянь і : п ік і щи че пе осеттютття росте ет феетееня дж их З і
: . х їх ях т : ' 7 дД па ; ! ; -ї З М 1 Я : У онччнлядлнтуєчнннння й | с У Де 1 ща З ! І сан ; Ї і і ' Кз нини нн нн нн нн нена ї : Ї і х я : ' не ії а ї пкт ти си тн т ок ння Мт і В ак де А : ! реє де ! Я -х Кжя я - т 1 ії ЩОДО ср КУКА есюютниеекккннккттто сен рукжкннккютю с скннхкню зкнкюдрях | : Ж | я ак ' : Ж ор ооо ян ЕЕ і ш ва и тре ВВ нор сойки долин, ї і щ Е х. є Ух нн " х і : я дю щ 7 Ж «х З : е УЩД пря екон докум фонах но КК тота онннн ке: : рю і зе " КЕ ся і х З хна реттякніткнннх : Ж сова і Ж : ж : а ї х Ї Її ; як хі 18 : ; х ХК уднккнккимкх зефТу зе Же хо. : в зва 0 рн : їх ; : х 1 ї ї КЕ сх Е : і - З 5 З «кккнлхк юки кААХК ККАЛ КК АХААААКХ КК КА ААХААТЕ КК АКА КК АКА НАУК КА ААХУ МАХИ ААААААУ КАМИ т : і : : -к де г й ! : й ї 4: Ку о У Кіш ВЯ ДВ дея де Дав
Фіг. а (продовж)
пн НН НН в в ї Е і : х МУКУ УА УМХ ХК УМ МАМА МА АКА МКК КАХ КУ ККУ КК КК КАМ ММК МКК ВК КК КК КАК КК КАК КК КК КК х : х . : : ї х ї у Е ї х ле х о я ї а ї З х їх - з й ї КО ї з з : їх ї . ї х з ; : я ж Ж! я . х де ку кое о КОЮ о юю ук з Її зх з і Ж Е ї -е і о ї ї м. ож ї : ; : їх Ж ще Ко Дек КК КК стю ффроюєюиккикмхкюх» ї : , " ск. МКК, о з х --кх. Е ї з зви. В Веонинео ОО озороввеох х х я ї Я дух З ї ї мех Ж ах : М бах Х х КО з ї пом Кк еВ З їх Ж т нн КК М ще ОА В ї й ї т А. І я Де х А ї зай Я. ще с й ї : ж с ее Я фс м х те зе що : ЖАХ Ве Б х ї ї Я М з йо Зк дяки ЕХ хаме ЖЕ ак я Ї Я З, з їх : ок ЗХ ї с І укхекккок х хек В сюкекккнх, ЗНОСУ ВК ВОВНУ: ї ак ж: фен УМ УМ ММ МУК КК КАК КК МАК кекс. У х 3 ; Я Я ; В ; ОУВЕ я Коля їх х Хр ЗУ ОО я : Ка ї х Ж -е ї Ве 3 ШИ «й ; : Х Ж Ду чик КК КК а ХХХк КК КК КК ких шшши щ . х ву г я х ЖЖ ох З КЗ . Хнниюк з З х ї : х У з ек х Е Б с Я як як я 3 х у ї в х: ; КО 5 х т СК Ох з х 3 жо г : ох МУУХ Я р: не х х ож Ох а КК х о в ех х 3 хе ВК х ЗЕ Я М, с М ВО, їх х К х нн Осо ООН ВК НО х х ї КИ Ми в Я ОЙ ча, х х с Га х пн А І сонет» ОХ я я х 5 З Ве ООН КЕ х -- НК З ЗО ЗОНИ ЗК ї 3 і п НН В ВК. З ї З З Ж тк Ж тк й ох де ЧИ х ї І х х ЕЗ Х х ЕЗ я - , х 5 х . Фо мч юю ї . й з ще х вою о ке м . З З ї їх З 8 Х 5 : х : «В «В «В «В «і «В : 3 ї х х вах з зо х х р хволе ; Х 5 ме Я х ї зе жк жк «к жк зх їх : х 5 яку і 5 у ТЗ їх ї ще ща і р ща 3 ї х х З і ї х З ї КУ » кох з жк ха Яни ї х ї 5 х х їх х х ї : ї НН НН НН НН НН НН НН ННЯ х ї х х ЕЗ с х ї х х їх Я кА а М А КН А А А НК А АН НН ї і х ї х х ї їх їх ї х ккд ї : їх хе Ж х ї х З в нн о їх х ї х є Ох : ї х З чн ка ооо та кі КК АМКУ КК Кк вм х х же ї Її ї чай ї ї ї ме ї З Х БУ з . ї х КУ же хх о в и х їх дж ОХ З Ї т ї х УМХ Б жк ї Ж Во НН х їх ох ї КЕ: ем як У їх Ж - М: ШКТ ее ї х хх 1 . Я її ї джек 33 М фреон фея я ї . Я дк х сних зх, з х я ї х з т їх ЗВ ях ї їх є о їх зе а Те ж х КО Ж. г і ке За Мод КВ ї х жк ї ххх ко Хдхй З и нннннния їх х зе Б ; я доня ї їх ій зай се де ї МК ї х с с ї Ж ї с ї Я х ї їх ї Депо кн ДВК дідо ке о ос хід с х х ех се МКК ЗЕ ВХ ЗХ: З х ї я х ОМ щу З а, Як ї х ї ЖК ї ЯК сова СИ х х їй ї ке ож жу жо х Ка ту де Її ЯК ОХ ща ї їх лей Ж є уккккюєкюєккю Й В дукютю рю уа Ксороко ню х х г: т Й ее т М х їх ой ї ВВ ох З. Зак М ЗХ ї х х ЩО А В ВОК ЗК най чо . ; Зх зак х їх « сек БОНН х я З М ооо МК. КИ хх М М : х г 5 КО на і В а ххккжухіжнКх ох че ї М ко У ї Ж ЗК Се З и Я ї : ї х ї х х х їх їх я сов і ї х т Ж Ж х Ж З. ЖЕ ї ї Ка «В «В «В «М «М ; ї х г 5 і зе де жк Як че м ї ї щі В 5 ща щі щу ї ї х с х їх Ії : х їх ї ЕЗ 8 з я з їв х х З ї х 5 Х Ху ОККО КК ХК КК ХК КК ХХ КК КК КК КК ОК КК КК КУ МУК КК кккккккоХ деко ЮК КККк НК теееЕ соте Т ТЕТ Рот етіТТе ЕС ККК ЧК осстееее Сто тегороетеееоооотоеео т отое Кк чн кн кекчккк ї Ж ї : ; ї ї ї і і : ї 3 ї ї ї ї З ЗЕ З ї ї зу, х ен а а 4 ї хя сих 3 ї Ї 2 і . ї 3 : ї 3 З 3 ї ї ї М ї с ї Ї ї х їх . З фу асо оо ю ю ою ооню» ї ї ме їх ЕІ і З ї у ії ї 1 - М з ж че Є ; ї і З й Духу У КУ УК УК УКК МУКУ К УК УК КУМ Ух ї З 3 їх дих і : хм т яко :
мм. с З КЕ. сша х: х 4 : ж М дуех зання хі З А ще Б З й . З ї ї їт- хе є фе в я Ко ЯК хек сок : с Я с ХУЙ УНОЛИА Я шк з Ж ; ой хх ех Ко, Я Б щі ї ще ; т пах З КИ ї : ок й Я І Кн ноосанннняой ї 3 ож ях р, .. ЗАТЕ Те ї : р т У З кох їй ї ко з с й СОКОМ Б донні кн ек они . ї ; з х і З З ї ее З» х Я Зах я ї Ко Й : Я 2 3 . і їі є ї- з в жк Ж ? як як; Як Ех ї І З З ЖЕ ; ; ! 5 їх ще 5 х е х " х х . У. зни ЗНУ нин нен М кн нин ї Ї Рея са Й є - х СХ х Я ЗО х Т ; х з Зх , ;. . їх ї Зх ї Ж шк Е й ;, ї ї Ф ї ВХ і як: яд З о чи ' ши У ч ї ЖЕК з х ї Б нн ню м фея 3 ї де їх Я Й 7 М ї ї х ї ож ТВ, ЗУВ сів; У х ї Ей З. ДК з Не й» 3 х 5 їй Ж де Шо ож МОН Ве х х 3 . сюови ВХ : о Ох - ОН КО, ох х ї 5. у жах ох х. м ВНКК. оо, ВК, Я ЧК дав ЕЗ х : з Афон ях З х т ОХ х й е З З З ав "З З ! х їх ї : 4 5, с . х х х зе ; фе х х ; ч юю ас с і т : х я х ск с з з - з у їх З З М, й щих МИ м м с ве З ї х : : ; в Ї : з о Ко і ї : З м В «ой я - ій і х г з . Е З я я с мес. х і о оже щем 000 охо 00 о М. і х ї е ; 4 ; з х ї з з З їх ! М шо : : Кі Езе ї ї Я «о ож чо х хо яд з х о и я ДУ ТУМУХУМУУУУУУ МУКУ ККУ ККУ КИ ХК КУКИ 7 " ї З Її 3 х Ех яке ї 3 Ко ЩО Ре ет КТК ТИ АКТ КК КК ЖК ТК КАТ КК ІНК АК ІК ке КеЙ Пекти ето екееяяя ї ї мух ї : 3 ї ї 1 їх ї 3 ї 3 х Її І їх : 3 ї ї ї ї ї 1 ї І К дих ї ї Її Же ї ї КК ї о -к сх її --к - ск х з З хі о сфжковм х ї - В КУ г Я ї їх Же. ХЕ З ї Ес : жо : З -х ї Ж ї
5. Е шк я З Хе х З 5. : Ко ї : ко : І я «а ав ї бо я й Її ШК еф у кА КК КК Кф ок дк Кон жк ее хІЖ З На я у Ва х ща я Е ее 5 я я і ї Б і Я й х 5 ї ММК. Кая с з х і : і Ж обу ІК со: Ж я ШК хв знейсях ЖК гХ «ДМК им и т Км и нн ке Х х я не ос КЗ бек 1 ДК рими кни 7 7 ПТКС Ма КК в ж ке й ї ї Я: ЗКУ ЗЕ Зк ех Е Ж а М, ї ї "За ЯК, З їж : і ОК ща 3 Є х Х ее ". КУ М т ак "Я вся Я. З а вх їх ЖЕ сій я й ЗК ж ї ЗЕ. щі ТЕ о и в НН в В ї м МО МУ ї зу З Х ск ее я ВХ з у Же й Б яко ВО з» де» х х їх З Ко З їх Ї МОЖ є я У 3 ї АС жа Кк. З че х в в З. я з щи х свіже Й й я і . ех ща ККУ. «Кфкхкуккккюк ик оо я 7 ЖЖ ю т ЖЕ ях 3 Геї т -ї: ЗЕ: ї т йо. МУ. Зк ї же ї Я ХХ КОХ . 3 ща ї я ах ща 3 х «ик сг ЦО « і рої ВУ КЕ г ТВ ЗКУ В ик ик КК КК ХК ХК КК ХХ КК КК КК ЮК КК али КН КК КК ЮК ЮК КК ЮКккик» : т ТИМУКТУуеКХ МО ок юю Кв ї ї ча ШО в ї ї А їх КУ ї ї ї : їх 5 їх ї 1 ї ї ї Кк їх ї ї ї ї Ме кий кв : її з СЯ З СИМ ді КК КК КК КК КК КК КАК КК КК КК КК КК КК КК КК КК ЮК КК КТК АЮ КК КК АК ЖК кю ї 1 ЖЕ х щ- ЗЕ У Ж у. Я Се ВК их ах ї ї се . ЗУ КЯ ЗК го МЕ МЕ у Ка Я Б І х х ОХ, ЖК юн М МК МВ КВК ВО ггниннитииииититттиииититинни
Фіг. 25
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAA201809345A UA126558C2 (uk) | 2013-10-01 | 2013-10-01 | Ліганд анти-msrv/herv-w env для профілактики і/або лікування прогресуючого розсіяного склерозу |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAA201809345A UA126558C2 (uk) | 2013-10-01 | 2013-10-01 | Ліганд анти-msrv/herv-w env для профілактики і/або лікування прогресуючого розсіяного склерозу |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA126558C2 true UA126558C2 (uk) | 2022-11-02 |
Family
ID=89835741
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201809345A UA126558C2 (uk) | 2013-10-01 | 2013-10-01 | Ліганд анти-msrv/herv-w env для профілактики і/або лікування прогресуючого розсіяного склерозу |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA126558C2 (uk) |
-
2013
- 2013-10-01 UA UAA201809345A patent/UA126558C2/uk unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10752675B2 (en) | Compounds for treating the remyelination blockade in diseases associated with the expression of HERV-W envelope protein | |
| KR20070085232A (ko) | 혈관신생 치료방법 | |
| JP2011063612A (ja) | 開腹手術後の癒着の予防剤 | |
| US10640768B2 (en) | Method of treating pain with an antibody against netrin-4, UNC5B or neogenin | |
| UA126558C2 (uk) | Ліганд анти-msrv/herv-w env для профілактики і/або лікування прогресуючого розсіяного склерозу | |
| US20200155638A1 (en) | Enhancing Oxytocin Receptor Expression Using an Oxytocin Receptor Agonist and an Alk5 Antagonist | |
| KR20190040585A (ko) | Human Stm1 (hStm1) 유전자의 발현 또는 hSTM1 단백질의 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
| WO2016172082A1 (en) | A therapeutic gene cocktail for heart regeneration | |
| KR20240124222A (ko) | 조절 t 세포에 특이적으로 존재하는 dkk1 단백질 및 그 용도 | |
| TW201840332A (zh) | 用於對抗具抗藥性癌症之組合物及方法 | |
| HK1221399B (zh) | 用於治疗与herv-w包膜蛋白表达相关的疾病中的髓鞘再生阻断的化合物 |