UA126848C2 - Філовірусна вакцина на основі рекомбінантного модифікованого вірусу вісповакцини анкара (mva) - Google Patents

Філовірусна вакцина на основі рекомбінантного модифікованого вірусу вісповакцини анкара (mva) Download PDF

Info

Publication number
UA126848C2
UA126848C2 UAA201702987A UAA201702987A UA126848C2 UA 126848 C2 UA126848 C2 UA 126848C2 UA A201702987 A UAA201702987 A UA A201702987A UA A201702987 A UAA201702987 A UA A201702987A UA 126848 C2 UA126848 C2 UA 126848C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
mma
filovirus
recombinant
encodes
virus
Prior art date
Application number
UAA201702987A
Other languages
English (en)
Inventor
Аріане Фолькманн
Ариане Фолькманн
Робін Штайґервальд
Робин Штайгервальд
Губертус Гохрайн
Ульрике Дирмаєр
Ульрике Дирмаер
Геніннґ Лаутербах
Гениннг Лаутербах
Юрґен Гаусманн
Юрген Гаусманн
Original Assignee
Баваріан Нордік А/С
Бавариан Нордик А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Баваріан Нордік А/С, Бавариан Нордик А/С filed Critical Баваріан Нордік А/С
Publication of UA126848C2 publication Critical patent/UA126848C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14211—Marburgvirus, e.g. lake Victoria marburgvirus
    • C12N2760/14234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Винахід стосується застосування рекомбінантного вектора на основі модифікованого вірусу вісповакцини (МVA), що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує глікопротеїн оболонки (GP) вірусу Марбург (MARV), для отримання лікарського засобу для лікування і/або профілактики викликаного MARV захворювання, причому рекомбінантний вектор MVA містить нуклеїнові кислоти, яка кодують імуногенний білок глікопротеїну оболонки MARV, імуногенний білок глікопротеїну оболонки Zaire Ebola virus (ZEBOV), імуногенний білок глікопротеїну оболонки Sudan Ebola virus (SEBOV) та імуногенний білок нуклеопротеїну Cote d'Ivoire Ebola virus (EBOV-CdI).

Description

(54) ФІЛОВІРУСНА ВАКЦИНА НА ОСНОВІ РЕКОМБІНАНТНОГО МОДИФІКОВАНОГО ВІРУСУ
ВІСПОВАКЦИНИ АНКАРА (ММА) (57) Реферат:
Винахід стосується застосування рекомбінантного вектора на основі модифікованого вірусу вісповакцини (ММА), що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує глікопротеїн оболонки (ОР) вірусу Марбург (МАКМУ), для отримання лікарського засобу для лікування і/або профілактики викликаного МАКМ захворювання, причому рекомбінантний вектор ММА містить нуклеїнові кислоти, яка кодують імуногенний білок глікопротеїну оболонки МАКУ, імуногенний білок глікопротеїну оболонки 7аїге ЕБроЇїа міги5 (2ЕВОМ), імуногенний білок глікопротеїну оболонки Зидап ЕбБоїа міги5 (ЗЕВОМ) та імуногенний білок нуклеопротеїну Соїе а"моїге Ебоїа мігив (ЕВОМУ-Саі).
ОБЛАСТЬ ВИНАХОДУ
Цей винахід пов'язаний з удосконаленою філовірусною вакциною, яка містить вакцину на основі рекомбінантного модифікованого вірусу вісповакцини Анкара (ММА основі) проти філовірусної хвороби, і продуктами, способами та застосуваннями, які мають до неї відношення. Зокрема, цей винахід пов'язаний з генетично-спроектованими (рекомбінантними) векторами ММА, які містять гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного білка. Цей винахід також пов'язаний із способами вакцинації, зокрема, гомологічними і гетерологічними примуючими-бустуючими режимами вакцинації, із застосуванням двох вірусних векторних композицій. Більш детально, винахід пов'язаний з рекомбінантним ММА для використання в гомологічному примуючому-бустуючому режимі вакцинації, і/або рекомбінантним ММА і рекомбінантним вірусом віспи курей (ЕРМ), для використання в гетерологічному примуючому-бустуючому режимі вакцинації. Винахід також пов'язаний із продуктами, способами та їх застосуваннями, наприклад такими, що придатні для виклику захисної імунної відповіді у суб'єкта.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Філовіруси є вкритими оболонкою, несегментованими вірусами з мінус-ланцюгом РНК із сімейства вірусів Ріїомігідае. На сьогоднішній день були виявлені два члени цього сімейства вірусів: вірус Марбург (МАЄМ) і вірус Ебола (ЕВОМ). Філовіруси є надзвичайно вірулентними, легко передаються від людини до людини, надзвичайно смертоносні, викликають сильну геморагічну лихоманку у людей і нижчих приматів. Рівень смертності від філовірусних інфекцій серед людей варіює від 23 95 до 90 95. Незважаючи на їх заразність і летальність, втім, не існує офіційно схваленого лікування або профілактичної вакцини.
Під час спалахів хвороб, ізоляції хворих, застосування захисного одягу та дезінфікуючих процедур (які в сукупності називають ізоляційними запобіжними заходами або бар'єрними методами захисту персоналу від вірусної геморагічної лихоманки (ВГЛ)) було достатньо, щоб припинити подальшу передачу вірусу Марбург або вірусу Ебола, і таким чином проконтролювати і припинити спалах хвороби. Так як не існує жодного відомого ефективного лікування геморагічних лихоманок, які викликані філовірусами, запобігання передачі, застосовуючи ВГЛ ізоляційні запобіжні заходи, на даний час є єдиним доступним засобом для
Зо контролю епідемій філовірусів.
Перший філовірус був розпізнаний в 1967 році після того, як у деякого числа лабораторних працівників у Німеччині та Югославії, які працювали з тканинами африканських зелених мавп, розвинулася важка геморагічна лихоманка. В цілому з цими спалахами хвороб було пов'язано сім смертей та 31 випадок зараження. Вірус був названий вірусом Марбург (МАКМ) у відповідності з містом Марбург, Німеччина, місцем одного зі спалахів хвороби. Після перших спалахів хвороби, вірус зник і не з'являвся аж до 1975 року, коли мандрівник, швидше за все інфікований в Зімбабве, захворів в Йоганнесбурзі, Південна Африка; супутник мандрівника і медсестра також були заражені. З того часу були ідентифіковані декілька спорадичних випадків геморагічної лихоманки Марбург (ДЛМ), але хвороба залишається відносно рідкісною.
Другий філовірус, вірус Ебола (ЕВОМУ), був вперше виявлений в 1976 році, коли два спалахи геморагічної лихоманки Ебола (ГЛЗ) відбулися у Північному Заїрі (нині Демократична
Республіка Конго) та Південному Судані. В ці спалахи хвороб були залучені віруси, які в кінцевому підсумку виявилися двома різними видами вірусу Ебола, і які були названі в честь країн, в яких вони були виявлені. Було доведено, що обидва віруси є надзвичайно смертельними, так як 90 9о випадків в Заїрі і 50 о випадків у Судані призвели до смерті заражених. Починаючи з 1976, вірус Ебола спорадично виникав в Африці, разом з кількома дрібними і середніми спалахами хвороб, підтвердженими в 1976-1979 роках, і знову в Габоні в 1994-1996 роках. Великі епідемії ГЛ Еболи траплялися в Кіквіте, Заїр, в 1995 році, і в Гулу,
Уганда, в 2000 році.
Виявляється, що філовіруси передаються людині у процесі життєдіяльності однієї або більше тварин, які не відносяться до людини. Незважаючи на численні спроби виявити природне джерело або джерела вірусів Ебола і Марбург, їх походження залишається загадковим. Отже, залишається незрозумілим, як саме вірус передається з природного(их) джерела(ел) людям. Після того як людина була інфікована, подальше зараження відбувається шляхом передачі від людини до людини. Зокрема, передача передбачає тісний особистий контакт між інфікованою людиною або її біологічними рідинами та іншою людиною. Під час зафіксованих спалахів геморагічної лихоманки, які були викликані філовірусною інфекцією, люди, які дбали про інфікованих (тобто ті, які годували, мили, лікували) або дуже тісно працювали з інфікованими, піддавалися значному ризику зараження. Нозокоміальна (лікарняна) бо передача через контакт з інфікованими рідинами організму (тобто, через повторне використання нестерилізованих шприців, голок та іншого медичного устаткування, забрудненого такими рідинами) також є важливим чинником у поширенні хвороби. Мінімізація тісного контакту між неінфікованими та інфікованими пацієнтами, як правило, скорочує кількість нових заражень людей під час епідемії. Хоча філовіруси виявили деякі здатності до зараження через малі частинки аерозолів в лабораторії, повітряно-крапельне поширення серед людей не було чітко продемонстровано.
До теперішнього часу було виявлено п'ять штамів вірусу Ебола, і вони були названі на честь місць їх першої появи: Випдіридуо (ВЕВОМ), Соїє аїмоїте (ЕВОУ-Саї, також позначений як Таї
Еогеві міги5 або ТАЕМ), Кев5іоп (ЕВОМ-Кевіоп), Зидап (ЗЕВОМ,), і 7аіге (7ХЕВОМ); штами л7аїге, зидап і Випаіридуо, як правило, пов'язані з захворюваністю і смертністю людей. Ероїа-Кевіоп є єдиним відомим філовірусом, який не викликає важкого захворювання у людей, хоча він може бути смертельним для мавп. До теперішнього часу було ідентифіковано кілька штамів вірусу
Марбург, разом з штамом МизхокКе, який має найвищий показник смертності. Див. Фіг. 1.
У структурному плані, віріони філовірусів можуть зустрічатися в декількох формах, у тому числі довгих, іноді розгалужених волокон, а також коротких волокон, у формі цифри "6", у формі літери "О", або у формі кола. Вірусні волокна можуть досягати 14 мікрометрів (мкм) в довжину, мають рівномірний діаметр, який складає 80 нанометрів (нм), і упаковані в ліпідну мембрану.
Кожен віріон містить одну молекулу одноланцюгової антисмислової РНК, довжина якої становить близько 19 тисяч пар основ (кБ), і яка містить сім генів, які послідовно розташовані в такому порядку: ген нуклеопротеїну (МР), ген білка 35 віріона (УР35), ген білка 40 віріона (МР40), ген глікопротеїну оболонки (СР), ген білка 30 віріона (МРЗ0О), ген білка 24 віріона (УР24), і ген
РНК-залежної РНК-полімерази (1). При вході в цитоплазму клітини-господаря, РНК транскрибується для створення поліаденільованих, субгеномних видів мРНК, які кодують білки.
Транскрипція і трансляція призводять до синтезу семи структурних поліпептидів, з передбачуваними однаковими функціями для кожного з різних філовірусів. Чотири білки (МР,
МРЗО, МРЗ5 і Її) об'єднані з вірусною геномною РНК в нуклеокапсидний комплекс. Три структурних білки є мембран-зв'язаними; СР є трансмембранним білком І! типу, а МР24 і МР40, ймовірно, знаходяться на внутрішній стороні мембрани. Глікопротеїн оболонки (СР) входить до складу вірусної оболонки в якості гомотримера (також називається "пепломер), який
Зо складається з трьох копій гетеродимера. Гетеродимер містить два фрагменти повнорозмірного попередника СР (називається "ЗРО), відомих також як "ОРІ і С ОР2", які утворені шляхом розщеплення фурином. ОРІ і ОРІ зв'язані дисульфідним зв'язком. Неструктурний глікопротеїн (БОР), який секретується, експресується ЕВОМ, але не МАКМ (Н. Реійтапп 5 М.Р. Кіеу, Ситгтг.
Тор. Містобіої. Іттипої. 235:1-21 (1999)). Нові вірусні частинки утворюються шляхом відокремлення від поверхні клітин-господарів (див. нижче).
Життєвий цикл філовірусу починається з прикріплення віріона до специфічних клітинних поверхневих рецепторів, після чого відбувається злиття оболонки віріона з клітинною мембраною і вивільнення нуклеокапсиду вірусу в цитозоль. Вірусна РНК-залежна РНК- полімераза (ЕМАР, також відома як білок "7 частково розкриває нуклеокапсид і транскрибує гени в плюс-ланцюги мРНК, які потім транслюються в структурні та неструктурні білки. Див. Фіг. 2. ЕМАР зв'язується з єдиним промотором, який розташований на 3'-кінці генома. Транскрипція або припиняється після проходження гена, або переходить до наступного за порядком гена, і це означає, що гени які розташовані близько до 3'-кінця генома транскрибуються в надлишку, а ті, що розташовані близько 5'-кінця генома транскрибуються з меншою ймовірністю. Тому порядок розташування генів є простою, але ефективною формою регуляції транскрипції. Нуклеопротеїн (МР) є білком який виробляється в найбільшій кількості, і клітинна концентрація якого визначає, коли КМАР перемикається з транскрипції генів на реплікацію генома. Результатом реплікації є повнорозмірні, плюс-ланцюг анти-геноми, які в свою чергу транскрибуються в мінус-ланцюг вірусне потомство геномних копій. Нові синтезовані структурні білки і геноми самостійно збираються і акумулюються біля внутрішньої сторони клітинної мембрани. Вірусні частинки упаковуються під час того, як вони відбруньковуються від зараженої клітини-господаря, породжуючи зрілі інфекційні віріони.
Попередні розробки вакцини
Було оцінено безліч стратегій в ході спроб розробити безпечну, імуногенну вакцину, яка здатна індукувати захисний імунітет проти інфекції, яка викликана одним або більше видом філовірусів, з явно різнорідними результатами. Огляд коротко викладено в Марці й Фельдман (А. Магі апа Н. Реійтапп Ехрегі Кеум. Массіпе5 13(4):521-531 (2014)). Наприклад, не дивлячись на те, що трьохвалентна ДНК-вакцина, яка складається з трьох ДНК плазмід, одна з яких експресує глікопротеїн оболонки з ЕВОМ, друга експресує глікопротеїн оболонки з ЗЕВОМ, а бо третя експресує нуклеопротеїн з 2ЕВОМ, була безпечна, імуногенна, і здатна викликати антигенну відповідь проти щонайменше одного з трьох антигенів в організмі людини, відповіді
СО8аТ-клітин спостерігались менш ніж в 1/3 прищепленої популяції (У. Е. Мапіп еї аї., Сііп.
Массіпе Іттипої. 13(11):1267-1277 (2006)). Аналогічно, складна пятивалентна "пан-філовірусна" вакцина на основі аденовірусу, яка містить суміш з чотирьох різних рекомбінантних аденовірусів, які експресують глікопротеїни оболонки з ЛЕВОМ, 5БЕВОМ, Магригд-Сіб7 (штам
Ваїаусгак), Магбига-Мизоке, і Магригд-Камп, а також нуклеопротеїни з 2ЕВОМ і Магбригд-Мизоке, захищала нижчих приматів від ЛЕВОМ або МАКМУ зараження і індукувала продукцію антитіл до обох типів вірусу, проте залишається незрозумілим, чи індукувала вакцина будь-яку СОв'-- Т- клітинну відповідь (0. Г. Змепзоп еї аї., Сііп. Массіпе Іттипої. 15(3):460-467 (2008)).
Інтраназальне введення рекомбінантного параміксовірус - вірусу парагрипу людини, серотипу З (НРІМ3), який експресує або глікопротеїн оболонки, або як глікопротеїн оболонки, так і нуклеопротеїн з ЕВОМ, захищало морських свинок від подальшого зараження ЕВОМУ. Моделі з використанням гризунів надають результати, які погано екстраполюються на приматів, з рядом попередніх вакцин-кандидатів ЕВОМ, які були ефективні для гризунів, і зовсім неефективні для нижчих приматів (А. ВиКгеуєм еї аїЇ., 9. МігоЇ. 80(5):2267-2279 (2006).
Інтраназальне введення рекомбінантного НРІМ3З, який експресує або глікопротеїн оболонки, або як глікопротеїн оболонки так і нуклеопротеїн з ЕВОМ, макакам-резус показало, що будь-яка конструкція, яка експресує глікопротеїн оболонки була помірно імуногенною, і захищала більше 80 95 тварин від хвороби після пост-вакцинуючих заражень за допомогою 2ЕВОМ (А. ВикКгеуем еї аї., у. Мігої. 81(12):6379-6388 (2007)). Зрештою, рекомбінантний вірус везикулярного стоматиту (УСУ), в якому глікопротеїн МСУ був замінений на глікопротеїн оболонки 7ЕВОМ, захищав 50 95 морських свинок, 100 95 мишей, яких лікували так пізно як 24 години після зараження, в іншому ж випадку спостерігалась поголовна смертельна інфекція. Чотири з восьми макак-резус (50 95) були захищені, коли їх лікували від 20 до 30 хв. після впливу вірусом, надаючи можливість пост- контактної терапії при зараженні вірусом Ебола (Н. Реійтапп, РГо5 Раїйодеп5 3(1):54-61 (2007)).
Геісберт і співавт. оцінили ефекти стратегій вакцинацій, які захищали мишей або морських свинок від летальної інфекції ЕВОМ у нижчих приматів. Вони використовували частинки РНК реплікона, які були отримані з ослабленого штаму венесуельського вірусу коней (МЕЕМ), який
Зо експресує глікопротеїн і нуклеопротеїн ЕВОМ, рекомбінантний вірус вісповакцини (МАСУ), який експресує глікопротеїн ЕВОМ, ліпосоми, які містять ліпід А та інактивований ЕВОМУ, і концентровані, інактивовані препарати цілісних віріонів. Вони виявили, що жодна з цих стратегій не була здатною успішно захистити приматів від важкого зараження ЕВОМ (Т. Н Сеїзрегі еї аї.,
Етегіпа Іптесіїои5 Рівзеазев 8(3):503-507 (2002)).
Інші використовували Вірус-Подібні Частинки (ВПЧ), які були експресовані в клітинах ссавців, бактерій, рослин або клітинах комах, як субодиничні вакцини, що не здатні до реплікації (0. . бмепзоп вї а!., Массіпе 23:3033-3042 (2005); К. І. УМапйівйа єї а!., ЛО 196(2):430-437 (2007),
М. КизвнНпік еї аї., Массіпе 31(1):58-83 (2012), К. І. М/апівій ЕТ АГ., Р О5 ОМЕ 10(3):6е0118881 (2015), К. Г. Уапівід апа М.дУ. Атап ЛО 204:1053-1059 (2011), М.М. УУанпі-Уепзеп еї аї., У Мікої. 79(16):10442-10450 (2005), УМО 2003/039477, М/О 2006/046963, УМО 2006/073422, МО 2004/042001, 5 8900595, 05 7211378), щоб викликати продукцію антитіл. Проте філовірусні
ВПЧ вимагають дорогого і складного процесу виробництва, і їх тривале зберігання повинно забезпечуватися при кімнатній температурі протягом тривалого періоду.
Таким чином, після витрати великої кількості часу і зусиль, на доклінічних стадіях з'явилося лише кілька перспективних вакцин-кандидатів, але в даний час немає затвердженої профілактичної вакцини. З урахуванням заразності та летальності філовірусної інфекції, існує нагальна необхідність у створенні ефективної вакцини.
СУТЬ ВИНАХОДУ
У цьому винаході виявлено, що різні примуючі-бустуючі комбінації реплікативно-неповних і реплікативно-нездатних векторів створюють ефективний імунний захист проти філовірусної інфекції.
Відповідно, один загальний аспект цього винаходу має відношення до комбінованої вакцини, яка містить: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок щонайменше одного філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; і б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора на основі вірусу віспи курей, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; бо при цьому одна з композицій є композицією для примування, а друга композиція є композицією для бустування.
У додатковому аспекті, цей винахід пов'язаний з комбінованою вакциною, яка містить: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок щонайменше двох філовірусних субтипів, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому одна з композицій є композицією для примування, а друга композиція є композицією для бустування.
У додатковому аспекті, цей винахід пов'язаний з набором, який містить: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок щонайменше одного філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора на основі вірусу віспи курей, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому одна з композицій є композицією для примування, а друга композиція є композицією для бустування.
У додатковому аспекті, цей винахід пов'язаний з набором, який містить: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенні білюи щонайменше двох філовірусних субтипів, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; і б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому одна з композицій є композицією для примування, а друга композиція є композицією для бустування.
У додатковому аспекті, цей винахід пов'язаний з рекомбінантним вектором на основі
Зо модифікованого вірусу вісповакцини (ММА), який містить нуклеотидну послідовність, яка кодує дві або більше антигенні детермінанти філовірусного білка для застосування в лікуванні і/або профілактиці викликаного філовірусом захворювання. У ще одному аспекті, цей винахід пов'язаний з рекомбінантним вектором ММА, який містить нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенний білок філовірусного глікопротеїну і кодує філовірусний білок 40 віріона (МР40) для застосування в лікуванні і/або профілактиці викликаного філовірусом захворювання. В іншому варіанті реалізації винаходу, винахід пов'язаний з рекомбінантним вектором ММА, який містить нуклеотидну послідовність, яку вибирають із групи, що складається з: а) 5ЕО ІЮО МО:5, ЗЕО І
МО:19 ї БЕО ІЮ МО:30; б) 5ЕО ІЮ МО:5, 5ЕО ІЮ МО:19, БЕО ІЮ МО:28 і ЗЕО ІЮ МО:30; в) ЗЕО ІЮ
МО:19 ї БЕО ІЮ МО:33. В деяких аспектах, винахід пов'язаний з: фармацевтичною композицією, яка містить вектор ММА; вакциною, яка містить зазначений рекомбінантний вектор ММА; лікарським препаратом, який містить зазначений рекомбінантний вектор ММА і фармацевтичний носій, розчинник і/або добавку; і клітиною, яка містить зазначений рекомбінантний вектор ММА.
В деяких аспектах, винахід пов'язаний із зазначеним рекомбінантним вектором ММА для застосування як лікарського засобу або вакцини для лікування і/або запобігання філовірусному захворюванню у суб'єкта, і спосіб для впливу на імунну відповідь у суб'єкта, який включає стадію в якій суб'єкту вводять зазначений рекомбінантний вектор ММА. У додатковому аспекті, цей винахід пов'язаний з набором, який містять зазначений рекомбінантний вектор ММА в першій ампулі або контейнері для першого введення (примування) і в другій ампулі або контейнері для другого введення (бустування).
Справжній винахід також пов'язаний з рекомбінантним вектором ЕРМ, який містить нуклеотидну послідовність, яка кодує щонайменше одну антигенну детермінанту філовірусного білка (наприклад будь-якого з філовірусних білків як згадувалося вище або нижче, бажано філовірусного глікопротеїну оболонки) під контролем промотору ЕРМ-40ОК, який має 5ЕО ІО
МО:26. У додатковому аспекті, цей винахід пов'язаний з рекомбінантним вектором на основі модифікованого вірусу віспи курей (ЕРМ), який містить нуклеотидну послідовність, яка кодує одну, дві або більше антигенних детермінант філовірусного білка для застосування в лікуванні мМабо профілактиці викликаного філовірусом захворювання. В деяких аспектах, винахід пов'язаний з: фармацевтичною композицією, яка містить вектор ЕРМ; вакциною, яка містить зазначений рекомбінантний вектор ЕРМ; лікарським препаратом, який містить зазначений 60 рекомбінантний вектор ЕРМ і фармацевтичний носій, розчинник і/або добавку; і клітиною, яка містить зазначений рекомбінантний вектор ЕРМ. В деяких аспектах, винахід пов'язаний із зазначеним рекомбінантним вектором ЕРМ для застосування як лікарського засобу або вакцини для лікування і/або запобігання філовірусному захворюванню у суб'єкта, і спосіб для впливу на імунну відповідь у суб'єкта, який включає стадію в якій суб'єкту вводять зазначений рекомбінантний вектор ЕРУ.
У додатковому аспекті, цей винахід пов'язаний з комбінованою вакциною, яка містить: а) імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенні біли щонайменше двох філовірусних субтипів, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; б) імунологічно-ефективну кількість вектора вірусу віспи курей, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично- прийнятним носієм; при цьому один із векторів є вакциною для примування, а інший вектор є вакциною для бустування.
У додатковому аспекті, цей винахід пов'язаний з комбінованою вакциною, яка містить: а) імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенні біли щонайменше двох філовірусних субтипів, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; і б) імунологічно-ефективну кількість одного або більше додаткових векторів ММА, які містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому один із векторів ММА є вакциною для примування, а інші вектори ММА є вакциною для бустування.
У додатковому аспекті, цей винахід пов'язаний з комбінованою вакциною, яка містить: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує щонайменше одну антигенну детермінанту філовірусного білка; і б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує щонайменше одну антигенну детермінанту філовірусного білка;
АБО в) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує щонайменше одну антигенну детермінанту філовірусного білка; і г) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ЕРУ, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує щонайменше одну антигенну детермінанту філовірусного білка; при цьому одна з композицій є композицією для примування, а друга композиція є композицією для бустування.
У додатковому аспекті, цей винахід пов'язаний зі способом виклику імунної відповіді проти філовіруса у суб'єкта, що включає стадію, в якій суб'єкту вводять: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок щонайменше одного філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора на основі вірусу віспи курей, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому одна з композицій є композицією для примування, а друга композиція є композицією для бустування.
У додатковому аспекті, цей винахід пов'язаний зі способом виклику імунної відповіді проти філовірусу у суб'єкта, що включає стадію, в якій суб'єкту вводять: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок щонайменше двох філовірусних субтипів, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; і б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому одна з композицій є композицією для примування, а друга композиція є композицією для бустування.
Винахід також охоплює спосіб створення рекомбінантного вектора ММА для застосування в лікуванні і/або профілактиці викликаного філовірусом захворювання, що включає етапи, в яких: бо а) інфікують клітину-господаря вірусом ММА,
б) трансфікують інфіковану клітину рекомбінантним вектором, який містить щонайменше одну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту будь-якого з філовірусних білків за будь-яким з варіантів реалізації винаходу; зазначена нуклеотидна послідовність додатково містить геномну послідовність вірусу ММА, здатна направляти вбудовування щонайменше однієї нуклеотидної послідовності в геном вірусу ММА, і в) ідентифікують, ізолюють і при необхідності очищують створений рекомбінантний вірус
ММА.
В іншому варіанті реалізації винаходу, порядок етапів а) і б) способу створення рекомбінантного вектора ММА за будь-яким з вище зазначених варіантів реалізації винаходу може бути змінений таким чином, що етап б) є першим етапом, а а) - другим.
Винахід також охоплює спосіб створення рекомбінантного вектора ЕРМ для застосування в лікуванні і/або профілактиці викликаного філовірусом захворювання, що включає етапи, в яких: а) інфікують клітину-господаря вірусом ЕРМ б) трансфікують інфіковану клітину рекомбінантним вектором, який містить щонайменше одну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту будь-якого з філовірусних білків за будь-яким з варіантів реалізації винаходу; зазначена нуклеотидна послідовність додатково містить геномну послідовність вірусу ЕРМ, здатна направляти вбудовування щонайменше однієї нуклеотидної послідовності в геном вірусу ЕРМ, і в) ідентифікують, ізолюють і при необхідності очищують створений рекомбінантний вірус
ЕРУ.
В іншому варіанті реалізації винаходу, порядок етапів а) і б) способу створення рекомбінантного вектора ЕРМ за будь-яким з вище зазначених варіантів реалізації винаходу може бути змінений таким чином, що етап б) є першим етапом, а а) - другим.
У додатковому аспекті, цей винахід пов'язаний зі способом виклику імунної відповіді проти філовірусу у суб'єкта, що включає стадію, в якій суб'єкту вводять: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує щонайменше одну антигенну детермінанту філовірусного білка; і б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить
Зо нуклеїнову кислоту, яка кодує щонайменше одну антигенну детермінанту філовірусного білка;
АБО в) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує щонайменше одну антигенну детермінанту філовірусного білка; і г) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ЕРУ, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує щонайменше одну антигенну детермінанту філовірусного білка; при цьому одна з композицій є композицією для примування, а друга композиція є композицією для бустування.
У додатковому аспекті, цей винахід пов'язаний із способом забезпечення захисного імунітету або захисної імунної відповіді у суб'єкта, що включає стадію, в якій суб'єкту вводять: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок щонайменше одного філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора на основі вірусу віспи курей, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому одна з композицій є композицією для примування, а друга композиція є композицією для бустування.
У додатковому аспекті, цей винахід пов'язаний із способом забезпечення захисного імунітету або захисної імунної відповіді у суб'єкта, що включає стадію, в якій суб'єкту вводять: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенні білюи щонайменше двох філовірусних субтипів, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; і б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому одна з композицій є композицією для примування, а друга композиція є композицією для бустування.
У додатковому аспекті, цей винахід пов'язано із способом продукування філовірус-подібних бо частинок у суб'єкта, що включає стадію, в якій суб'єкту вводять:
а) імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок щонайменше одного філовірусного глікопротеїну і філовірусного білка 40 віріона (МР40), разом з фармацевтично прийнятним носієм; і б) імунологічно-ефективну кількість вектора на основі вірусу віспи курей або вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому один із векторів є вакциною для примування, а інший вектор є вакциною для бустування.
У додатковому аспекті, цей винахід пов'язаний зі способом виклику продукування філовірус- подібних частинок у суб'єкта, що включає стадію, в якій суб'єкту вводять: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенні білюии щонайменше одного філовірусного глікопротеїну і філовірусного білка 40 віріона (МР40), разом з фармацевтично прийнятним носієм; і б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора на основі вірусу віспи курей або вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому одна з композицій є композицією для примування, а друга композиція є композицією для бустування.
У додатковому аспекті, цей винахід пов'язаний зі способом виклику посиленої імунної відповіді проти філовірусу у суб'єкта, що включає стадію, в якій продукують філовірус-подібні частинки у суб'єкті шляхом введення суб'єкту: а) імунологічно-ефективної кількості вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок щонайменше одного філовірусного глікопротеїну і філовірусного білка 40 віріона (МР40), разом з фармацевтично прийнятним носієм; і б) імунологічно-ефективной кількості вектора на основі вірусу віспи курей або вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому один із векторів є вакциною для примування, а інший вектор є вакциною для
Зо бустування.
У додатковому аспекті, винахід пов'язаний зі способом виклику посиленої імунної відповіді проти філовіруса у суб'єкта, що включає стадію, в якій продукують філовірус-подібні частинки в суб'єкті шляхом введення суб'єкту: а) першої композиції, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенні білою щонайменше одного філовірусного глікопротеїну і філовірусного білка 40 віріона (МР40), разом з фармацевтично прийнятним носієм; і б) другої композиції, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора віспи курей або вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому одна з композицій є композицією для примування, а друга композиція є композицією для бустування.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
Супроводжуючі графічні матеріали, які включені в цю специфікацію і є її частиною, ілюструють кілька варіантів реалізації винаходу, і разом з описом слугують для пояснення принципів винаходу.
Фіг. 1 ілюструє філогенетичне дерево, яке відображає взаємозв'язки між різними виявленими штамами філовірусів. Дерево було побудоване з використанням кодуючих ділянок генів глікопротеїну оболонки (СР) і способу максимальної парсимонії. Обидва штами Камп і
Каїауслак вірусу Марбург мали летальність, яка дорівнює 23 95, в той час як штами Мизоке і
Апдоїа мали летальність в діапазоні від 50 95 до 88 95. Штам 5идап мав летальність 41-65 95, а штам 7аїге мав летальність 57-9095. Обидва штами Соїе аїмоїге і Кебіоп не викликають хвороби у людини, хоча штам Кевхіоп викликав захворювання у свиней.
Фіг. 2 ілюструє структуру і генетичну організацію філовірусного генома.
Фіг. ЗА ілюструє структуру і генетичну організацію ММА-тВМ2528. Фіг. ЗБ ілюструє структуру і генетичну організацію ММА-пВМ2268. Фіг. ЗВ ілюструє структуру і генетичну організацію ММА- твВМ254А, включно з селекційним маркером. Фіг. ЗГ ілюструє структуру і генетичну організацію
ММУА-тВвМЗ68А, включно з селекційним маркером.
Фіг. 4А ілюструє структуру і генетичну організацію плазміди РВМІХ186. Фланг 1 (Е1 ІК 88/89) бо та фланг 2 (2 ОК 88/89) є послідовностями ММА-ВМ, які оточують ІК 88/89. Е1 ІСК 88/89 і 2
ІК 88/89 застосовуються для вставки касети експресії і селекційної касети (МРТ І і есгЕР) в
ММА-ВМ у випадку гомологічної рекомбінації. Були з'єднані ген селекції Неоміцин
Фосфотрансфераза (МРТ Ії) ї ген посиленого Зеленого Флуоресцентного Білка (есЕР) Е. соїї через внутрішній рибосомальний сайт входження (ІКЕ5), і вставлені під контролем сильного синтетичного поксівірусного промотору (Рг5), щоб забезпечити відбір рекомбінантних вірусів.
Послідовності Е2 і Е2-повторів ІС 88/89 фланкують селекційну касету, і роблять можливим видалення селекційної касети за допомогою гомологічної рекомбінації за відсутності селективного тиску.
Фіг. 4Б ілюструє структуру і генетичну організацію плазміди рРВМХ197. Фланг 1 (Е1 ІСК 148/149) та фланг 2 (2 ОК 148/149) є послідовностями ММА-ВМ, які оточують ІК 148/149. Е1
ІСА 148/149 і Е2 ІСЕ 148/149 застосовуються для вставки касети експресії і селекційної касети (СОРТ і КЕР) в ММА-ВМ у випадку гомологічної рекомбінації. Ген селекції за чутливістю до лікарського препарату Гуанін-Ксантин-Фосфорибозил-Трансфераза (СОРТ) Е. соїї і ген Червоного
Флуоресцентного Білка (КЕР) були вставлені у вигляді злитого гена під контролем сильного синтетичного поксівірусного промотору (Рг5), щоб забезпечити відбір рекомбінантних вірусів.
ГохР послідовності фланкують селекційну касету, і роблять можливим СВЕ рекомбіназо- опосередковане видалення селекційної касети. Фіг. 4В ілюструє структуру і генетичну організацію плазміди рВМ274, яка експресує Сте рекомбіназу. Фіг. 4Г ілюструє структуру і генетичну організацію плазміди РВМХ221. Фланг 1 (21 ІК Ватні у) Роу/Рох) та фланг 2 (62 ІК
Ватніу Роу/Рох) є послідовностями ЕРУ, які оточують інсерційний сайт Ватні 9. Е1 ІБК Ватні
У ЕоміРох і Е2 ІК Ватні .) Еом/Рох застосовують для вставки касети експресії і селекційної касети (СОРТ і КЕР) в ЕРМ у випадку гомологічної рекомбінації. Ген селекції за чутливістю до лікарського препарату Гуанін-Ксантин-Фосфорибозил-Трансфераза (СОРТ) Е. соїї і ген Червоного
Флуоресцентного Білка (КЕР) були вставлені у вигляді злитого гена під контролем сильного синтетичного поксівірусного промотору (Рг5), щоб забезпечити відбір рекомбінантних вірусів.
ГохР послідовності фланкують селекційну касету, і роблять можливим СВЕ рекомбіназо- опосередковане видалення селекційної касети. Фіг. 4Д ілюструє структуру і генетичну організацію плазміди рВМХ214. Фланг 1 (БЕ1 ІК 148/149) та фланг 2 (2 ІК 148/149) є послідовностями ММА-ВМ, які оточують ІБК 148/149. Р1 ІС 148/149 і 2 ІК 148/149
Зо застосовують для вставки касети експресії і селекційної касети (СОРТ і КЕР) в ММА-ВМ у разі гомологічної рекомбінації. РВМХ214 вже містить РгББЕ промотор для експресії трансгенів. Ген селекції за чутливістю до лікарського препарату Гуанін-Ксантин-Фосфорибозил-Трансфераза (ОРТ) Е. сої і ген Червоного Флуоресцентного Білка (ЕЕР) були вставлені у вигляді злитого гена під контролем сильного синтетичного поксівірусного промотору (Рг5), щоб забезпечити відбір рекомбінантних вірусів. ГохР послідовності фланкують селекційну касету, і роблять можливим
СЕАЕ рекомбіназо-опосередковане видалення селекційної касети.
Фіг. 5А ілюструє структуру і генетичну організацію плазміди РВМ433. СР-МАНМУ-МизокКе був вставлений під контролем промотору Рг5 в В5рЕЇ/Мпе! сайт рВМХ197. Крім цього, плазміда також містить ДНК послідовності ММА-ВМ, які фланкують ІК 148/149 ММА-ВМ генома і ІохрР- фланковану селекційну касету. (охР сайти дозволяють пізнє усунення селекційної касети за допомогою САЕ рекомбіназо-опосередкованої рекомбінації. Фіг. 5Б ілюструє структуру і генетичну організацію плазміди рРВМ384. Гени глікопротеїнів вірусу Ебола 7аїге-Мауіїпда (СсР- 7ЕВОМУ-Мауїпда) і вірусу Марбург МизоКе (СР-МАНУ-МизоКе) були вставлені під контролем промоторів Рг7.5 і РгЗ5 в Міш/Мпе! сайти рВМХ197. Крім того, плазміда також містить ДНК послідовності ММА-ВМ, які фланкують ІБК 148/149 ММА-ВМ генома і ІохР-фланковану селекційну касету. ІохР сайти дозволяють пізнє усунення селекційної касети за допомогою СВЕ рекомбіназо-опосередкованої рекомбінації. Фіг. 5В ілюструє структуру і генетичну організацію плазміди рВМ385. Ген глікопротеїну вірусу Ебола 5Бидап (СР-5ЕВОМ) і нуклеопротеїну вірусу
Ебола могу Соазі (МР-ЕВОУ-СаЇї) були вставлені під контролем синтетичних промоторів Різ і
РІ Е1 в Міш/Мпеї! сайти рВМХ186. Крім того, плазміда містить послідовності ДНК ММА-ВМ, які фланкують ІСК 148/149 ММА-ВМ генома і селекційну касету, яка фланкована сайтами Е2 і Е2грі, які дозволяють пізнє усунення селекційної касети за допомогою гомологічної рекомбінації за відсутності селективного тиску. Фіг. 5Г ілюструє структуру і генетичну організацію плазміди рВМ436. Ген глікопротеїну вірусу Ебола 7аїіге-Мауіпда (йР-27ЕВОМУ-Мауїпда) був вставлений в
В5рЕМОЇЙ сайти рвВМхХ214 під контролем Рг55Е промотору. Крім цього, плазміда містить ДНК послідовності ММА-ВМ, які фланкують ЗК 148/149 ММА-ВМ генома і ІохР-фланковану селекційну касету. ІохР сайти дозволяють пізнє усунення селекційної касети за допомогою СВЕ рекомбіназо-опосередкованої рекомбінації. Фіг. 5Д ілюструє структуру і генетичну організацію плазміди рВМ555. Ген глікопротеїну вірусу Ебола 7аїге-Мауіпда (сР-7ЕВОМ-Мауіпда) під бо контролем промотору ЕРУ-40К був вставлений в Міш/Мої! сайти рРВМХ221. Крім цього, плазміда містить ДНК послідовності ЕРМ, які фланкують інсерційний сайт Ватні у генома ЕРМ і Іохр- фланковану селекційну касету. хР сайти дозволяють пізнє усунення селекційної касети за допомогою САЕ рекомбіназо-опосередкованої рекомбінації.
Фіг. 6 ілюструє рівні антитіл до СР в яванських макак, після вакцинації ММА-ВМ-Рйо (ММА- твВМ2268), як було виміряно за допомогою ІФА. Тварини були вакциновані двічі протягом чотирьох тижнів ММА-ВМ-РІЇо (в День -42 і День -14), і кров брали з інтервалами, для аналізу за допомогою ІФА: перед вакцинацією (День -42, червона крива (1)), після першої, але перед другою вакцинацією (День -14, зелена крива (2)), і після другої вакцинації (День -5, помаранчева крива (3)). Графік ліворуч демонструє специфічні антитіла до Магригу СР в сироватці, графік посередині демонструє специфічні антитіла до Ероїа 7аїіге ОР в сироватці, і графік праворуч демонструє специфічні антитіла до Ероїа Зидап СОР в сироватці. Гіперімунна сироватка з яванських макак, імунізованих або Магригд Апдоїа ОР (лівий графік), Ероїа 7аїіге СР (середній графік), або Ероїа Зидап ОР (правий графік) була використана в якості позитивного контролю в кожному ІФА.
Фіг. 7 ілюструє результати вакцинації за допомогою ММА-ВМ-Ніо (ММА-пВМ2268В), після якої проводили зараження за допомогою МАКМ-МизоКе. Фіг. 7А ілюструє, що вакцинація за допомогою ММА-ВМ-Ніо захищала 100 95 тварин від зараження МАКМУ-Михоке. Фіг. 7Б ілюструє клінічні показники після зараження; вакциновані тварини, заражені МАКМ-МизоКе, не продемонстрували жодних симптомів або гістологічних змін, пов'язаних з геморагічною лихоманкою, і не містили вірус в печінці, селезінці, наднирниках, лімфатичних вузлах або легенях.
Фіг. 8 ілюструє гуморальну і СО8 Т-клітинну відповідь після гетерологічної ММА/ЕРМ імунізації. Н-2КеВбСВА Е1 миші були імунізовані підшкірно за допомогою 5 х 107 ІДКТ5о ММА- 7ЕВОМУ-СР (ММА; ММА-тВМ354А, див. Фіг. ЗВ) або ЕРМ-27ЕВОМ-ОР (ЕРУ; ЕРМтВМЗ68А, див.
Фіг. ЗГ) в День 0 і День 21. А) У мишей брали кров у День 21 і 41 для аналізу антитіл. Показана середня концентрація ЛЕВОМ-СР специфічних антитіл ї/- СПС. Б) У День 41, миші були вбиті та їх селезінки були проаналізовані за допомогою проточної-цитометрії після повторної стимуляції пептидом СР»577-5в4. Показана абсолютна кількість СО107а", ІЕМ-у" та ТМЕ-а: СО8 Т клітин на селезінку х 107 3/- СПС. "ММА - рекомбінантний ММА-7ЕВОМ-ОР (ММА-тВМ254); ГЕРМ - рекомбінантний ЕРМ-2ЕВОМ-СР (ЕРУ-тВМ368).
Фіг. 9 ілюструє ЛЕВОМ-ОСР специфічну СО8 Т-клітинну відповідь після імунізації (підшкірно) мишей за допомогою ММА/ЕРУ. Показана абсолютна кількість СО107а», ІЕМ-ух та ТМЕ-с: СОВ8 Т- клітин на селезінку х 107-- -/- СПО. 1: ММА-тВвВМ254/ЕРУ-тВМ368; 2: ММА-твМ226/ЕРУ-тВМЗ368, 3: ММА-тВМ255/ЕРУ-тВМЗ68.
Фіг. 10 ілюструє специфічні антитіла яванських макак до 2ЕВОМ-ОР, які в День 0 ї 28 дослідження отримали примуюче-бустуюче щеплення за допомогою ММА-ВМ-2ЕВОМ/ОР (ММА- тВМ254) в дозі 5 х 108 ІДКТво (п-3), за допомогою ММА-ВМ-2ЕВОМ/аР-МУР40 (ММА-тпВМ255). в дозі 5 х 108 ІДКТ5о (п-3) згідно Прикладу 6. Результати представлені як середня геометрична концентрація (нг/мл) разом із стандартною помилкою середнього (СПО).
Фіг. 11 ілюструє нейтралізуючу гуморальну відповідь яванських макак, які були вакциновані тричі в День дослідження 0, 28 за допомогою ММА-ВМ-2ЕВОМ/СОР в дозі 5 х 108 ІДКТ»о (п-2), або за допомогою ММА-ВМ-2ЕВОМ/ЯР-МРАО (5 х 108 ИДКТ5о, п-2). Додаткові тварини (п-2) отримали ТОБ в якості негативного контролю в День дослідження 0 і 56. Сироватки були проаналізовані за допомогою 7ЕВОМ-(С2075т-специфічного псевдовіріонного нейтралізуючого аналізу. Результати представлені в якості окремого титру антитіл, що нейтралізують 80 95 7ЕВОМУ-ОР, які експресують УБМ.
Фіг. 12 А) і Б) ілюструють формування філовірус-подібних частинок в клітинах Нега, заражених ММА-ВМ-2ЕВОМ/С2Р-МР40 (ММА-тВМ255). А, Б) Трансмісійний електронний мікроскопічний (ТЕМ) аналіз ММА-ВМ-2ЕВОМ/2Р-МР4А0 (МІ Р) і ММА ул заражених клітин Неї а.
Клітини НегГа були інфіковані ММА-ВМ-2ЕВОМ/2Р-МР40 (А) або ВАС-отриманих ММА-м/ (Б) при
МОЇ, яке дорівнює 10, і були отримані і оброблені тонкі зрізи для ТЕМ. Стрілка: поперечний переріз ВПЧ, які продукуються ММА-ВМ-2ЕВОМ/2Р-МР40. В) показаний імуноблот-аналіз (ко- )експресії СР і МР40 в клітинах Неїа. Г) показаний імуноблот-аналіз імунопреципітатів з супернатантів клітин Нег а (аліквоти тих самих супернатантів продемонстровані В) інфіковані за допомогою ММА-ВМ-2ЕВОМ/2Р-МР40 при МОЇ яке дорівнює 10, протягом 2 днів. МР40 і СР можуть бути тільки спільно преципітовані, якщо вони присутні в інтактних ВПЧ, але не після руйнування ВПЧ за допомогою ТІйоп Х-100 (1 90). 166: ММА-тпВМ166, 254: ММА-тпВМ254, 255:
ММА-твМ255.
Фіг. 13 ілюструє структуру деяких рекомбінантних ММА/ЕРМ конструкцій. 60 ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Автори цього винаходу виявили, що вакцина, яка містить рекомбінантний модифікований вірус вісповакцини Анкара (ММА), який містить гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту глікопротеїну (СР) вірусу Марбург (МАКМ), утворює філовірусну вакцину, яка здатна індукувати як клітинну, так і гуморальну відповіді, яких достатньо для набуття захисного імунітету до вірусу Марбург, так само як і до віспи. Вставка додаткових гетерологічних нуклеотидних послідовностей, які кодують антигенну детермінанту глікопротеїну (СР) Ероїа міги5 7аїте (7ЕВОМ), глікопротеїну (ОР) Ероїа мігиз Бцидап (ЗЕВОМ), і/або нуклеопротеіну (МР) ЕВОМ в рекомбінантний ММА, створює полівалентні вакцини, які здатні індукувати імунну відповідь як до МАКУ, так і ЕВОМ, і навіть багатьох штамів МАКМ і/або ЕВОМ, таких як, наприклад, Ероїа міги5 Зидап (ЗЕВОМ) і Ероїа міги5 2аїге (2ХЕВОМ), двома типами, які пов'язані зі смертельними формами лихоманки Ебола. Таким чином, рекомбінантний вектор
ММА, який містить нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту СОР ЕВОМ, демонструє дуже гарну імунну відповідь проти штамів вірусу Ебола. Крім цього, чудовий профіль безпеки ММА і його похідних (наприклад, ММА-ВМ), а також їх здатність вміщувати декілька гетерологічних нуклеотидних послідовностей, дозволяє виробляти безпечну одно- компонентну полівалентну пан-філовірусну вакцину, на відміну від ряду багатокомпонентних вакцин на ранніх стадіях розробок (див. ниже).
Враховуючи той факт, що спроби відомого рівня техніки створити імунну відповідь проти філовірусів, особливо в нижчих приматів проти МАКМ і ЕВОМУ, провалилися, цей винахід став несподіванкою. Виходячи з того, що викладається, і того що було досягнуто у відомому рівні техніки, неможливо було очікувати, що вакцина на основі ММА буде викликати імунну відповідь, яка надає нижчим приматам захист від філовірусної інфекції, зокрема від МАКУМ. Зрозуміло, що виходячи з даних, які були отримані авторами цього винаходу і за їх спостереженнями, це більш ніж розумно і правдоподібно сказати, що вакцина на основі ММА також буде викликати імунну відповідь у людини. Дійсно, ЕБА приймає моделі на основі нижчих приматів, як доказ того, що вакцина, яка забезпечує захист для нижчих приматів, також підходить для людей.
Автори цього винаходу також виявили, що режим вакцинації, який включає рекомбінантний модифікований вірус вісповакцини Анкара (ММА), що містить гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту ЕВОМ, наприклад, таку як Ероїа міги5 Зидап
Зо (ЗЕВОМ) і/або Ебоїа міги5 2аїге (7ХЕВОМ) в поєднанні з рекомбінантним модифікованим ЕРУ, який містить гетерологічную нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту
ЕВОМ, наприклад Ебоїа міги5 Зидап (ЗЕВОМ) і/або 2ЕВОМ, утворює філовірусну вакцину, яка здатна індукувати як клітинну так і гуморальну відповіді, яких достатньо для набуття захисного імунітету.
В ході дослідження, яке лежить в основі цього винаходу було також встановлено, що застосування вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок, щонайменше одного філовірусного субтипу, зокрема філовірусний глікопротеїн, і вектора на основі вірусу віспи курей, який містить щонайменше одну нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного глікопротеїну в якості гетерологічного примування- бустування, викликає захисну імунну відповідь проти філовірусного імуногена шляхом індукції високого рівня гуморальної відповіді, і аж до Б5-п'ятикратного підвищення відповіді цитотоксичних СОВ8 Т-клітин, зокрема, при цьому вектор ММА був використаний щонайменше як одна композиція для примування, і вірус віспи курей як композиція для бустування.
Рекомбінантний ММА і/або ЕРМ може бути моновалентним, тобто складатися тільки з однієї гетерологічної послідовності, яка кодує антигенну детермінанту ЕВОМ, або полівалентним, тобто містити щонайменше дві гетерологічні послідовності, які кодують антигенні детермінанти
ЕВОМУ.
Таким чином, у винаході пропонуються вакцини або комбінації вакцин, які застосовуються для виклику імунної відповіді, яка забезпечує подвійний захист або перехресний захист від зараження, принаймні двома субтипами філовірусів, зокрема, такими субтипами, як вірус
Марбург і/або вірус Ебола, і пропонуються вакцини або комбінації вакцин, які можуть бути використані для виготовлення вакцини проти щонайменше двох субтипів філовірусів, зокрема проти таких субтипів, як вірус Марбург і/або вірус Ебола. Таким чином, можуть бути запропоновані вакцини для перехресного захисту проти філовірусів, таких як Ероїа 2аїге-
Мауїпда і 7аїг-Кікм/й і/або Магригд-МизоКе і Магригд-Апдоїа. Також, зараз було виявлено вперше, що імунізація вектором ММА, який експресує певні антигени, такі як білок МР40 7ЕВОМ разом з іншими гетерологічними нуклеотидними послідовностями, які кодують щонайменше один поверхневий глікопротеїн філовірусу, зокрема 2ЕВОМ, може породжувати філовірус- подібні частинки, наприклад, такі як вірус Ебола-подібні частинки, що містять філовірусний бо глікопротеїн на їх поверхні. Це було несподівано, оскільки повідомлялося, що транспорт філовірусного ОР на поверхню клітини сильно пригнічується ММА (заподег еї аї. 9. Міко!. Меїй. 81, 29-35 (2001)). Проте, оскільки відділення філовірусних частинок відбувається на поверхні клітини (Мода еї аї., Рі о5 Раїйод. 2(9):е99 (2006)), потрібний ефективний СР поверхневий транспорт для формування ОР, які містять філовірусні ВПУ. У дослідженні, яке лежить в основі цього винаходу, рекомбінантний ММА, який експресує білок 40 філовірусного віріона (МР4А0) і глікопротеїн, наприклад, ЗР-7ЕВОМ-Мауіпда здатний продукувати ВПЧ, викликав посилену імунну реакцію з різними примуючими-бустуючими комбінаціями, і захищав нижчих приматів від філовірусної інфекції. Проведені дослідження також показали, що гомологічний примуючий- бустуючий режим, який базується виключно на рекомбінантному ММА, який експресує глікопротеїн і білок 40 (МР40) філовірусного віріона, захищав нижчих приматів від філовірусної інфекції.
Додатково було встановлено, що застосування вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний глікопротеїн щонайменше одного філовірусного субтипу, зокрема глікопротеїн вірусу Марбург і/або вірусу Ебола, і нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок білка 40 віріона (МР40) в якості гетерологічного примування-бустування разом з вектором на основі вірусу віспи курей, що містить щонайменше одну нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного глікопротеїну, створює посилену СО8 Т-клітинну відповідь. Додатково було встановлено, що застосування вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний глікопротеїн щонайменше одного філовірусного субтипу, зокрема глікопротеїн вірусу Ебола, і нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок білка 40 віріона (МР40), індукувало більш високу нейтралізуючу гуморальну відповідь у нижчих приматів, наприклад, вже після примування, яка була поліпшена після бустування, і таким чином створювалась імунна відповідь проти однієї або декількох філовірусних інфекцій, зокрема заражень 7аїге-Мауїпда і 2аїіге-Кікм/ї. Крім того, було показано, що імунізація вектором ММА, який експресує такі певні антигени, як білок 40 (МР40) філовірусного віріона разом з філовірусним глікопротеїном може створювати ВПУ, які експресують філовірусний глікопротеїн оболонки, який вистилає всю поверхню ВПЧ, які схожі на інтактні віріони філовірусів. Таким чином, було показано, що включення нуклеїнової кислоти, яка кодує філовірусний білок МР40 у вектор ММА, підсилює імунну відповідь на вірусний вектор, який експресує антигенний білок або
Зо білки, зокрема вектор ММА.
Тепер буде наведено детальній опис типових варіантів реалізації цього винаходу, приклади яких проілюстровані у доданих графічних матеріалах.
Рекомбінантний вірус ММА
В одному аспекті, в цьому винаході запропонований рекомбінантний модифікований вірус вісповакцини Анкара (ММА), який містить нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну (СР), зокрема глікопротеїн оболонки. В іншому аспекті, в цьому винаході пропонується рекомбінантний вектор ММА, який містить гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну, зокрема глікопротеїн оболонки, і гетерологічную нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту додаткового філовірусного білка. ММА був створений за допомогою більш ніж 570 послідовних пасажів штаму епідермальної коров'ячої віспи Анкара на курячих ембріональних фібробластах (КЕФ) (СпогіоаІМапіоі5 вірус коров'ячої віспи Анкара, СМА; для огляду див. Мауг еї а. (1975), Іптесійоп З: 6-14) який підтримувався в Інституті вакцинації, Анкара, Туреччина протягом багатьох років і застосовувався в якості основи для вакцинації людей. Проте, через часті важкі поствакцинальні ускладнення, які пов'язані з вірусом коров'ячої віспи, було кілька спроб створити більш ослаблені, безпечні вакцині проти віспи.
У період з 1960 по 1974, професору Антон Майєр вдалося послабити СМА більш ніж 570 безперервними пасажами в КЕФ клітинах (Мауг еї аї. (1975)). На різних моделях тварин було показано, що остаточний ММА був авірулентним (Мауг, А. «5 Баппег, К. (1978), Оеєм. Віої. апа. 41:225-234). В рамках ранньої розробки ММА в якості попередньої вакцини проти віспи були проведені клінічні випробування із застосуванням ММА-517 в поєднанні з Лістер Злстри (5сСКІ (1974), Ргєм. Мей. 3:97-101; 51СсКІ апа Носпвзівїп-Міпіге! (1971), Мипсй. Мей. У/оспепзвсенг. 113:1149-1153) для осіб схильних до ризику виникнення побічних реакцій від коров'ячої віспи. У 1976 році, ММА, отриманий з ММА-571 стокової культури (відповідає 571-шому пасажу), був зареєстрований у Німеччині як примуюча вакцина в двохетапній парентеральній програмі вакцинації проти віспи. Надалі, ММА-572 був використаний для вакцинації близько 120000 європейських індивідів, більшість з яких становили діти від 1 до З років, без будь-яких зареєстрованих серйозних побічних ефектів, хоча багато хто з суб'єктів були серед населення з високим ризиком розвитку ускладнень, пов'язаних з коров'ячою віспою ((Мауг еї аї. (1978), бо 7епіга!рІ. Васієтгіої. (В) 167:375-390). ММА-572 був депонований в Європейській колекції клітинних культур тварин як ЕСАСС М94012707.
В результаті пасажування, застосованого для ослаблення ММА, існує цілий ряд різних штамів або ізолятів, залежно від кількості пасажів, виконаних в КЕФ клітинах. Наприклад, ММА- 572 застосовували у невеликій дозі в якості попередньої вакцини в Німеччині під час програми ліквідації віспи, а ММА-575 широко застосовувався в якості ветеринарної вакцини. ММА, як і
ММА-ВМ, не має приблизно 13 95 (26.6 кБ з шести областей) генома у порівнянні з початковим
СМА вірусом. Делеції зачіпають ряд генів вірулентності і хазяйських генів, так само як і ген, який відповідає за утворення тілець включення типу А. ММА-575 був депонований 7 грудня 2000 року, в Європейській колекції клітинних культур тварин (ЕСАСС) під номером доступу
М00120707. Ослаблений СМА-вірус ММА (модифікований вірус коров'ячої віспи Анкара) був отриманий шляхом послідовного розмноження СМА (більш ніж 570 пасажів) на первинних фібробластах курячого ембріона.
Хоча Майєр і співавт. продемонстрували в 1970-х, що ММА сильно ослаблений і авірулентений для людини і ссавців, деякі дослідники повідомили, що ММА не є повністю ослабленим в клітинних лініях ссавців і людини, оскільки в цих клітинах може відбуватися залишкова реплікація (Віапснага еї аї. (1998), 9. Сеп. МігоїЇ. 79:1159-1167; Сатої! в Мов5 (1997),
Мігоїоду 238:198-211; 0.5. Раїепі Мо. 5185146; Атрбгозіпі єї аї. (1999), У. Мешйговзсі. Вез. 55: 569).
Передбачається, що результати які представлені у цих публікаціях, були отримані з використанням різних відомих штамів ММА, оскільки ті віруси, які застосовуються, суттєво відрізняються за своїми властивостями, зокрема, щодо їх ростової поведінки в різних клітинних лініях. Така залишкова реплікація є небажаною з різних причин, включаючи проблеми безпеки у зв'язку із застосуванням для вакцинації людей.
Штами ММА, які мають поліпшені профілі безпеки для розробки більш безпечних продуктів, таких як вакцини або лікарські препарати, були розроблені Вамагіап Могаїс: ММА далі було пасажовано в Вамагіап Могаїс і позначено як ММА-ВМ. Типовий і кращий зразок ММА-ВМ був депонований 30 серпня 2000 року, в Європейській колекції клітинних культур (ЕСАСС) під номером доступу МО0083008. ММА-ВМ додатково описаний в УМО 02/42480 (005 2003/0206926) і
МО 03/048184 (5 2006/0159699), обидва з яких включені в цей документ шляхом посилання.
ММУА-ВМ може прикріплятися до людських клітин і проникати всередину, де гени, які
Зо кодуються вірусом, експресуються дуже ефективно. ММА-ВМ дуже пристосований до первинних клітин фібробластів курячих ембріонів (КЕФ), і не реплікується в клітинах людини. У клітинах людини, вірусні гени експресуються, але інфекційний вірус не продукується. ММА-ВМ класифікується як організм першого рівня біобезпеки за даними Центрів з контролю і профілактики захворювань в США. Препарати ММА-ВМ і його похідні, були введені багатьом видам тварин, і більш ніж 2000 людям, в тому числі людям з імунодефіцитом. Було доведено, що всі щеплення в цілому, як правило, безпечні і добре переносяться. Незважаючи на значне послаблення та зниження вірулентності, у доклінічних дослідженнях було показано, що ММА-ВМ викликає як гуморальну, так і клітинну імунну відповіді на вірус вісповакцини і продукти гетерологічних генів, які кодуються генами, що клоновані в геном ММА (Е. Наїтег еї аї. (2005),
Апіїміг. Тег. 10(2):285-300; А. Совта еї а!. (2003), Массіпе 22(1):21-9; М. бі Місоїа еї аї. (2003),
Нит. Сепе ТНег. 14(14):1347-1360; М. бі Місоїа єї а)ї. (2004), Сііп. Сапсег Вез., 10(16):5381-5390). "Похідні" або "варіанти" ММА відносяться до вірусів, які проявляють, в основному, такі ж характеристики реплікації що і ММА, як описано в цьому документі, але демонструють відмінності в одній або декількох частинах їх геномів. ММА-ВМ, також як і похідні або варіанти
ММА-ВМ, не здатні репродуктивно реплікуватись іп мімо в організмі людини і миші, ї навіть в мишах, з сильно пригніченою імунною системою. Більш конкретно, ММА-ВМ або похідна або варіант ММА-ВМ має бажано також здатність до репродуктивної реплікації в фібробластах курячих ембріонів (КЕФ), але не має здатності до репродуктивної реплікації в клітинній лінії кератиноцитів людини НаСат (ВошКатр есеї а! (1988), У. Сеї! ВіоІ. 106:761-771), клітинній лінії остеосаркоми 1438 (ЕСАСС депозитарний Мо 91112502), в лінії клітин 293 нирки людського ембріона (ЕСАСС депозитарний Мо 85120602), і людській лінії клітин Не а аденокарциноми шийки матки (АТСС депозитарний Мо ССІ-2). Додатково, похідна або варіант ММА-ВМ має коефіцієнт ампліфікації вірусу, щонайменше, у два рази менший, і більш бажано в три рази менший, ніж ММА-575 в клітинах клітинних ліній Неїа і Насат. Тести їі аналіз цих властивостей варіантів ММА описані в УМО 02/42480 (05 2003/0206926) і УМО 03/048184 (5 2006/0159699).
Термін "нездатний до репродуктивної реплікації" або "немає можливості репродуктивної реплікації" - описані, наприклад, в УМО 02/42480, який також демонструє, як отримати ММА, яки й має потрібні властивості, як зазначено вище. Цей термін застосовується до вірусу, який має коефіцієнт ампліфікації вірусу менше 1 до 4-го дня після зараження, застосовуючи аналізи, які 60 описані в УМО 02/42480 або патенті США Мо 6761893.
Термін "нездатний репродуктивно відтворюватись" відноситься до вірусу, який має коефіцієнт ампліфікації вірусу менш 1 до 4-го дня після зараження. Аналізи які описані в УМО 02/42480 або в патенті США Мо 6761893 застосовуються для визначення коефіцієнта ампліфікації вірусу.
Ампліфікація і реплікація вірусу зазвичай виражається як відношення продукованого вірусу інфікованою клітиною (продукована кількість) до початкової кількості, яка застосована для того, щоб заразити клітини спочатку (кількість яка вводиться), і це співвідношення називають "коефіцієнтом ампліфікації". Коефіцієнт ампліфікації рівний "1" визначає статус ампліфікації, при якому кількість вірусу, який продукований зараженими клітинами є таким же, як і кількість, яку спочатку використовували для зараження клітин, і це означає, що інфіковані клітини толерантні до наявності вірусної інфекції і розмноження вірусу. На відміну від цього, коефіцієнт ампліфікації менше 1, тобто зниження кількості, яка була продукована, в порівнянні з кількістю, яка була введена, вказує на відсутність репродуктивної реплікації і, отже, ослаблення вірусу.
До переваг вакцин на основі ММА можна віднести їх безпеку, а також доступність для крупномасштабного виробництва вакцини. Доклінічні випробування показали, що ММА-ВМ демонструє чудовий рівень ослаблення і ефективності у порівнянні з іншими штамами ММА (МО 02/42480). Додатковою властивістю ММА-ВМ штамів є здатність викликати істотно такий же рівень імунітету в режимах: примування - вірус вісповакцини/бустування - вірус коров'ячої віспи, у порівнянні з режимами: примування - ДНК/бустування - вірус вісповакцини.
Рекомбінантні ММА-ВМ віруси, у варіанті реалізації цього винаходу, якому надають найбільшу перевагу, вважаються безпечними через їх різні репликативні недоліки в клітинах ссавців, і їх стабільну авірулентність. Крім цього, в додаток до його ефективності, може бути вигідною можливість виробництва в промислових масштабах. Додатково, вакцини на основі
ММА можуть доставляти декілька гетерологічних антигенів і забезпечувати одночасну індукцію гуморального і клітинного імунітету.
У варіанті реалізації винаходу, якому надається перевага, рекомбінантний вектор ММА будь- якого з варіантів реалізації винаходу, які використовуються для створення рекомбінантного вірусу, є ММА-ВМ вірусом або його похідним, що мають можливість репродуктивної реплікації іп міго в клітинах курячих ембріональних фібробластів (КЕФ), але не мають здатності до
Зо репродуктивної реплікації в клітинній лінії кератиноцитів людини Насаї, людській клітинній лінії остеосаркоми 143В, в лінії клітин нирки людського ембріона 293, і людській лінії клітин Неї а аденокарциноми шийки матки.
В іншому варіанті реалізації винаходу, рекомбінантний вектор ММА будь-якого з варіантів реалізація винаходу, який використовується для створення рекомбінантного вірусу, є ММА-ВМ, який депонований в Європейській колекції клітинних культур тварин (ЕСАСС) під номером доступу ХО0083008.
Вектори ММА, які підходять для цього винаходу, можуть бути створені зі застосуванням способів, які відомі в даній області техніки, таких які описані в УМО 02/042480 і МО 02/24224, обидва з яких включені в цей документ шляхом посилання.
В іншому аспекті, вірусний штам ММА, який підходить для створення рекомбінантного вірусу, може бути штамом ММА-572, ММА-575 або будь-яким аналогічним ослабленим штамом ММА.
Також підходящим може бути будь-який мутант ММА, такий як вірус СпогіоаПНапіої5 коров'ячої віспи Анкара (асмМА) з делеціями. ОСМА містить аеї І, аєї! ї, аеї ПІ, аеї їм, аеї М, ї аеєї! МІ сайти делеції ММА генома. Сайти особливо корисні для вставки декількох гетерологічних послідовностей. ОСМА можете репродуктивно реплікуватись (з коефіцієнтом реплікації більше 10) у людських клітинних лініях (наприклад, таких як людські 293, 143В, і МКС-5 клітинні ліній), які дозволяють оптимізацію за допомогою додаткових мутацій, корисних для стратегії вакцинації на основі вірусу (див. УМО 2011/092029).
Рекомбінантний ЕРМ
В одному аспекті, в цьому винаході запропоновано рекомбінантний ЕРМ, який містить нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну (СР), зокрема глікопротеїн оболонки. В іншому аспекті, у цьому винаході пропонується рекомбінантний вектор ЕРМ, який містить гетерологічную нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну, зокрема глікопротеїн оболонки, і гетерологічную нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту додаткового філовірусного білка.
ЕРМ, згідно цього винаходу, є прототипним видом в роді Амірохміги5. Описані і доступні численні ЕРМ штами, які можна отримати у таких компаній як: СЕМА Іарогаїйогіе5, Супатіа
Ммуерзіег, оп Родде, Іпіегсопіїіпепіа! І арогайюгієв, Іпіегувї (МОВІСІЗ МАВІОЇ Е), Мета! (ОІЕЄТОЗЕС 60 СТ вігаіп), Зспегіпд-Ріоидн, зеїесі І абогаютієв, боїмау, Зупіго-7еоп і Міпеіапа І арогафогіе5. ЕРІ є штамом Юимейе, який був модифікований для використання в якості вакцини для одноденних курчат. Штам є комерційним вакцинним штамом вірусу віспи курей, позначений як 0 ОСЕР 25/СЕРб7/2309 жовтня 1980 року, і випускається Іпбійше Мегіеих, Іпс. ЕР5 є комерційним вакцинним штамом вірусу віспи курей, джерелом якого були курячі ембріони, отриманий
Атегісап Зсієпіййс І арогайгіез (підрозділ Зспегіпд Согр.) Медісон, Вісконсін, Ветеринарна
Ліцензія Сполучених Штатів Мо 165, серійний Мо 30321. Різні ослаблені штами вірусу віспи курей відомі, наприклад, як ЕРМ М (м'який вакцинний штам) та ЕРМ 5 (стандартний вакцинний штам), отримуються у Суапатій У/ереїег5 РІХ Ца Австралія. Штам, який був підданий критичній оцінці
Департаментом сільського господарства США (ШВА), додатково був описаний С. І. Атпвзхо еї а!., У. Мігої. 74(8):3815-3831 (2000), 74(8):3815-3831 (2000). РРО є штамом вірусу віспи курей, який застосовується у вакцинних цілях, був отриманий в кінці 1980-х Томлей, Бінс, Борснелл і
Браун в ІАН Ноидйоп І арогайогіеє (Сент-Айвс, Великобританія). Він був отриманий при очищенні бляшок вірусу, який був пасажований 438 разів в культурі курячих ембріональних фібробластів (КЕФ) НРІ (А. Мауг 4. К. МаїїскКі (1966), 7епігаІрІ Меїегіпагтей (В) 13:1-13, 5Кіппег еї а!. (2005), Ехреп Вез. Массіпез 4(1):63-76). Інші ослаблені штами є РОХМАС-Т3З як такими, що описані в 5. УепКіп5 еї аї. (1991), Аїйб5 Кезеагсй апа Нитап Кеїгомігизе5 7(12):991:998.
Депоновані штами включають, наприклад, вірус віспи курей АТССФ ВР-229 (типові струпи вірусу віспи курей з гребенів курей в Нью-Джерсі до 1928) і вірус віспи курей АТССФ ВР-250 (курка,
Кентуккі, 1950).
В іншому аспекті, ЕРМ вірусний штам, який підходить для створення рекомбінантного вірусу, може бути будь-яким зі штамів, які згадані вище, або будь-яким подібним штамом ЕРМ. В іншому аспекті, ЕРМ обраний із групи, яка складається з: ЕР, ЕРБ, ЕРО, ЕРМ М, ЕРМ 5, АТССФ
УВ-229, АТОСФ МК-250, ОБОА штаму і РОХМАС-ТСО. В ще одному варіанті реалізації винаходу,
ЕРМ будь-якого з варіантів реалізації винаходу, є ослабленим ЕРУ.
Перевага ЕРМ в тому, що вірус викликає захворювання лише у птахів, а також здатний проникати і експресувати трансгени в клітинах ссавців, залишаючись імунологічно неперехресно-реагуючим з вірусом коров'ячої віспи, і тим самим уникає вже існуючого імунітету у людей, які пройшли вакцинацію проти віспи.
Рекомбінантні вектори ЕРМ, які підходять для створення рекомбінантних ЕРУ, можуть бути
Зо створені за допомогою усталених способів. Живі ослаблені віруси віспи курей можуть бути отримані шляхом багаторазового пересіву вірусу в пташиних клітинах. Підготовка векторів для
ЕРМ описана, наприклад, Міспаєї! 9. Р. Гаумлтап апа Раїгісіа 0. І аултап (еа5.) Сапсег Массіпев:
Меїїпоа апа Ргоюсої!в5, Меїнодз іп МоїІесшіаг Віоіоду, мої. 1139, Спарієгї 32 Раці М. Ном/еу, Кептіуп
А. Рієпег апа доп 0. Наубаї! р.407-427. Створення рекомбінантних ЕРУ, які підходять для стратегії вакцинації на основі вірусу, також були описані у ЕР 0 284 416 В1, МО 88/02022, МО 89/03429, МО 89/03879, МО 89/07644, МО 89/12684, УМО 90/02191, УМО 91/02072, УМО 89/03879 і
МО 94/019014. Послідовність генома і організація генома були описані в Аїпзо еї аї. апа
І аіїдіІам/ апа 5Кіппег (С.Г. Атопзо еї аї. (2000), 9. Мігої. 74(8):3815-3831, 5.М. І аідіаж апа М.А.
ЗКіппег (2004), доштаї! ої Сепега! Мігоіїоду 85:305-322). Приблизна послідовність генома ЕРМ може бути знайдена за номером доступу ГенБанку АЕ198100.1.
Антигенні Детермінанти
Термін "антигенна детермінанта" відноситься до будь-якої молекули, яка стимулює імунну систему хазяїна для створення антиген-специфічної імунної відповіді, незалежно від того чи це клітинна реакція або гуморальна відповідь. Антигенні детермінанти можуть включати: білки, поліпептиди, фрагменти антигенних білків, антигени, і епітопи, які ще викликають імунну відповідь у господаря і є частиною антигену, гомологи або варіанти білків, поліпептидів, і фрагменти антигенних білків, антигени і епітопи, в тому числі, наприклад, глікозильовані білки, поліпептиди, фрагменти антигенних білків, антигени і епітопи, і нуклеотидні послідовності, які кодують ці молекули. Таким чином, білки, поліпептиди, фрагменти антигенних білків, антигени і епітопи не обмежуються певними нативними нуклеотидними або амінокислотними послідовностями, а включають послідовності, які є ідентичними нативній послідовності, а також включають зміни в нативній послідовності, такі як делеції, додавання, вставки і заміни.
Термін "епітоп" відноситься до сайту на антигені, на який реагують В- і/або Т-клітини, або самостійно, або у поєднанні з іншим білком, таким як, наприклад, білок головного комплексу гістосумісності ("МНС") або Т-клітинними рецепторами. Епітопи можуть бути утворені як з суміжних амінокислот, так і окремих амінокислот, які зіставлені вторинним і/або третинним згортанням білка. Епітопи, які утворені з суміжних амінокислот, зазвичай зберігаються при впливі денатуруючих розчинників, в той час як епітопи, які утворені третинним згортанням, втрачаються при впливі денатуруючих розчинників. Епітоп зазвичай включає щонайменше 5, 6, 60 7, 8, 9, 10 або більше амінокислот - але, як правило, менше 20 амінокислот в унікальній просторовій конформації. Способи визначення просторової конформації епітопів включають, наприклад, рентгенівську кристалографію і 2-мірний ядерний магнітний резонанс. Див., наприклад, "Ерйоре Марріпд Ргоюсої!в5" іп Меїнодз іп МоїІесшаг Віоіоду, Мої. 66, Сієпп Е. Моттів,
Еа (1996).
Бажано, щоб гомолог або варіант мав щонайменше близько 50 95, щонайменше, близько 60 95 або 65 95, щонайменше, близько 70 95 або 75 95, принаймні, близько 80 95, 81 95, 82 95, 83 95, 84 95, 85 905, 86 95, 87 Уо, 88 95, або 89 95, що більш типово, щонайменше, близько 90 95, 91 95, 92 Ув, 93 95, або 94 9б5, і ще більш типово щонайменше близько 95 95, 96 95, 97 У, 98 95 або 9995, найбільш типово, щонайменше близько 99595 ідентичності з зазначеним білком, поліпептидом, фрагментом антигенного білка, і епітопом антигена на рівні нуклеотидної або амінокислотної послідовності.
Методи визначення ідентичності нуклеотидних та амінокислотних послідовностей, які відомі в даній галузі техніки. Дві або більше послідовності можна порівнювати шляхом визначення їх "відсотка ідентичності". Відсоток ідентичності двох послідовностей, незалежно від того чи це нуклеотидні, чи це амінокислотні послідовності, є числом точних відповідностей між двома вирівняними послідовностями, яке поділене на довжину більш коротких послідовностей і помножене на 100. "Відсоток (90) ідентичності амінокислотної послідовності" по відношенню до білків, поліпептидів, фрагментів антигенних білків, антигенів та епітопів, які описані у цьому документі, визначається як відсоток амінокислотних залишків у послідовності-кандидаті, які є ідентичними амінокислотним залишками еталонної послідовності (тобто, послідовності білка, поліпептиду, фрагмента антигенного білка, антигену або епітопа, з якої вона отримана), після вирівнювання послідовностей і введення пробілів, якщо це необхідно, для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовності, не розглядаючи будь-які консервативні заміни як частину ідентичності послідовності. Вирівнювання для визначення відсотка ідентичності послідовності амінокислот може бути досягнуто різними способами, які знаходяться в межах кваліфікації в даній області техніки, наприклад, за допомогою загальнодоступних комп'ютерних програм, таких як ВГ А5Т, АГІСМ, або Медаїїднп (ОМАЗТАК). Фахівці в даній області можуть визначити відповідні параметри для вимірювання вирівнювання, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання по всій довжині порівнюваних послідовностей.
Те ж саме стосується і "відсотка (95) ідентичності нуклеотидних послідовностей", з відповідними змінами.
Наприклад, належне вирівнювання амінокислотних послідовностей забезпечується за допомогою алгоритму локальної гомології Сміта і Вотермана, (1981), Адмапсе5 іп Арріїєй
Маїпетаїййсь 2:482-489. Цей алгоритм може бути застосований для вирівнювання амінокислотних послідовностей з використанням матриці нарахування балів, яка розроблена
Баупоїї, АйМаз ої Ргоїєїп Зедиепсев апа Зігисіште, М. О. баупоїї єд., 5 з,уррі. 3:353-358, Маїйопаї
Віотедіса! Кезеагсп ЕБоипаайоп, Умахпіпоїоп, О.С, ОА, і стандартизована сгірзКом (1986), Мисі.
Асід5 Нев. 14(6):6745-6763. Типова реалізація цього алгоритму для визначення відсотка ідентичності послідовності, запропонована Сепеїййсз Сотршег сгоир (Медісон, Ісв.) у "Вевігії" допоміжному додатку. Параметри за замовчуванням для цього методу описані в М/і5сопвіп зедцепсе Апаїузіз РасКаде Ргодгат Мапиаї, Мегв5іоп 8 (1995) (доступно від Сепеїїс5 Сотршег
Сгоир, Медісон, Ісв.). Спосіб визначення відсотка ідентичності в контексті цього винаходу, якому надається перевага, полягає у використанні МРОКСН пакету програм, під авторським правом
Единбурзького університету, розробленого Джоном Ф. Коллінз і С. Шейн Старрок, і який розповсюджується ІпіеїйСзепеїіс5, Іпс. (Маунтін-В'ю, Каліфорнія). З цього набору пакетів, алгоритм Сміта-Ватермана може використовуватися у випадках, коли у рахунковій таблиці застосовуються параметри за замовчуванням (наприклад, штраф за відкриття пробілу - 12, штраф за продовження пробілу - 1, і штраф за пропуск - 6). З даних, які були згенеровані, "Маїсп" значення відображає "ідентичність послідовності". Інші підходящі програми для розрахунку відсотка ідентичності або схожості між послідовностями, широко відомі в даній області техніки, наприклад, інша програма для вирівнювання є програмою ВІАБ5Т, яку застосовують з параметрами за замовчуванням. Наприклад, ВГА5БТМ і ВГАБТР можуть застосовуватися, використовуючи наступні стандартні параметри: депеїїс соде-5іапаага; тіпег-попе; зігапа-роїй; сшой-60; ехресі-10; МайіхХ-ВІ О5БОМб62; ЮОезстіріопе-50 зедпиепсев; 5огі
Бу-НІСН ЗСОВЕ; Раїаразез-поп-тедипдапі СепВапк-єМВІ -008.)-РОВ-СепВапк о СО5
ІгапоіайопоЗміз5 ргоїеіпязрирааїе-РІК. Деталі цих програм можна знайти в інтернеті за такою адресою: пір:/Лумм. порі. піт. дом/сді-бБіп/ВІ А5Т.
В деяких варіантах гетерологічна нуклеїнова кислота кодує антигенні домени або бо фрагменти антигенного білка, а не весь антигенний білок. Ці фрагменти можуть мати будь-яку довжину, достатню для того, щоб бути антигенними або імуногенними. Фрагменти можуть бути, щонайменше, 8 амінокислот в довжину, бажано 10-20 амінокислот, але можуть бути і більше, наприклад, щонайменше 50, 100, 200, 500, 600, 800, 1000, 1200, 1600, 2000 амінокислот, або будь-якої довжини між вказаними значеннями.
В деяких варіантах, щонайменше, один фрагмент нуклеїнової кислоти, який кодує фрагмент антигенного білка або імуногенний поліпептид, вбудовують у вірусний вектор згідно 3 цим винаходом. В іншому варіанті реалізації винаходу, близько 2-6 різних нуклеїнових кислот, що кодують різні антигенні білюи вставляють в один або більше вірусних векторів. В деяких варіантах реалізації винаходу, можуть бути використані декілька імуногенних фрагментів або субодиниць різних білків. Наприклад, з векторів можуть експресуватись декілька різних епітопів з різних сайтів одного білка або різних білків з того ж штаму, або з білкового ортолога з різних штамів.
Визначення
В контексті цього документа визначення в однині означають також і визначення в множині, якщо не зазначено інше. Таким чином, наприклад, посилання на "антигенна детермінанта" включає в себе одну або більше антигенних детермінант, а посилання на "спосіб" включає посилання на рівнозначні стадії і способи, відомі звичайним фахівцям в даній області техніки, які можуть бути змінені або замінені на способи, які описані в цьому документі.
Якщо не зазначено інше, термін "щонайменше" попередньої серії елементів, слід розуміти як такий, що посилається на кожний елемент в серії. Фахівцям в даній області техніки буде зрозуміло, чи вони будуть в змозі встановити з використанням не більш ніж рутинних експериментів, безліч аналогічних конкретних варіантів реалізації винаходу, які описані у цьому документі. Такі еквіваленти призначені для того, щоб бути охоплені даним винаходом.
В описі і формулі винаходу, які слідують нижче, якщо контекст не вимагає іншого, слово "мати" і його варіації, такі як "містить", "містити", слід розуміти як таке, що означає включення зазначеного цілого або стадії, або групи цілих або стадій, але не виключення будь-якого іншого цілого або стадії або групи цілих або стадії. При використанні в цьому документі, термін "містить" може бути замінений терміном "містить"? або "включає" або іноді, коли використовується в цьому винаході терміном "має". Будь-який із зазначених вище термінів (що
Зо включає, містить, що включає в себе, має), будь-який раз, коли використовується тут у контексті аспекту або варіанту реалізації цього винаходу, може бути замінений терміном "складається з", хоча це й менш бажано.
При використанні в цьому документі, "складається з" виключає будь-який елемент, крок, або компонент, незазначений в елементі формули. При використанні в цьому документі, термін "складається в основному з" не впливає істотним чином на основні та нові властивості формули.
Як використовується в цьому документі, термін сполучник "або" між кількома перерахованими елементами слід розуміти як такий, що включає як індивідуальні, так і комбіновані варіанти. Наприклад, якщо два елементи з'єднані за допомогою "і/або", перший варіант відноситься до застосування першого елемента без другого. Другий варіант відноситься до застосування другого елемента без першого. Третій варіант відноситься до застосування першого і другого елементів разом. Будь-який з цих варіантів слід розуміти як такий, що потрапляє в межі свого значення, і, отже, задовольняє вимогу терміна "і/або", як використано в цьому документі. Одночасне застосування більш ніж одного з варіантів, слід розуміти як таке, що потрапляє в межі свого значення, і тому задовольняє вимогу терміна "і/або".
У тексті цієї специфікації цитуються деякі документи. Кожен з документів, які зазначені у цьому винаході (включаючи всі патенти, патентні заявки, наукові публікації, технічні вимоги виробника, інструкції і т. д.), або вище, або нижче, включені в цей документ у повному обсязі за допомогою посилання. У тих випадках, коли матеріал, який включений в справжній документ шляхом посилання, суперечить або не узгоджується з цією специфікацією, специфікація замінює собою будь-такий матеріал. Ніщо в цьому документі не повинно бути витлумачено як визнання того, що винахід не має права датувати більш раннім числом таке розкриття на підставі попереднього винаходу.
Термін "по суті подібний" в контексті філовірусних антигенних білків згідно цього винаходу вказує на те, що поліпептид містить послідовність, щонайменше на 90 95, бажано щонайменше на 95 95 ідентичні еталонній послідовності при вікні порівняння в 10-20 амінокислот. Відсоток ідентичності послідовностей визначають шляхом порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей в межах вікна порівняння, при цьому частина полінуклеотидної послідовності у вікні порівняння може містити доповнення або делеції (тобто гепи) у порівнянні з еталонною 60 послідовністю (яка не містить доповнень або делецій) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоток обчислюється таким шляхом: визначається кількість позицій, в яких ідентичний нуклеотид або амінокислота представлені в обох послідовностях, для одержання кількості співпадаючих позицій; число співпадаючих позицій ділиться на загальне число позицій у вікні порівняння, і отриманий результат множиться на 100 для отримання відсотка ідентичності послідовностей.
Термін "субтип" тут можна замінити словом "вид". Він включає в себе штами, ізоляти, клади або варіанти будь-якого філовіруса, такого як Марбург або вірус Ебола. Терміни "штам" "клада" або "ізолят" є технічними термінами, які добре відомі практикуючому, і які відносяться до систематики мікроорганізмів. Таксономічна система класифікує всі на даний момент охарактеризовані мікроорганізми в ієрархічному порядку - сімейства, роди, види, штами (Мігоіоду, єй. Бу Рієїдз В. М., Пірріпсой-Камеп Рибріїзпег5, 4 едйоп 2001). У той час як критерієм для членів сім'ї, є їх філогенетичний зв'язок, рід містить всі члени, які мають спільні характеристики, а вид визначено як політилічний клас, який є сомовідтворюваною лінією потомства і займає особливу екологічну нішу. Термін "штам" або "клада" описує мікроорганізми, тобто віруси, які мають загальні властивості, такі, як морфологія або структура і організація генома, але варіюють в плані біологічних властивостей, таких як коло господарів, тканинний тропізм, географічне поширення, ослаблення або патогенність. Наприклад, існує п'ять субтипів вірусу Ебола, тобто Ероїа міги5 7аїге, Ероїа міги5 Зцидап, Ероїа мігиє ВНевіоп, Ероїа міги5
Випаіридуо и Ебоїа мігиє могу Соазі. Штамами Ебоїа міги5 7аїге, наприклад, є штами: 7аїге-
Мауїпда, 7аїге-Кікм/ї, 7аіге-бароп (1994), 7аіге-Сароп (лютий 1996), 7аіге-сароп (жовтень 1996).
Є тільки один субтип або вид вірусу Марбург, тобто відомий досі марбургвірус озера Вікторія, зі штамами, які включають Магбригд-МизокКе і Магбигд-АпдоЇїа. Додаткові штами або ізоляти також можна побачити на Фіг. 1.
Термін "ІДКТво" - це скорочення від "інфекційна доза культури тканин", та кількість патогенного агента, яка буде призводити до патологічних змін в 50 95 клітин інокульованої клітинної культури, виражена як ІДКТео/мл Метод визначення ІДКТ»о добре відомий фахівцям в даній галузі техніки. Він, наприклад, описаний, у Прикладі 2 МО 03/053463.
Термін "суб'єкт", який застосовується в цьому документі, означає живі багатоклітинні хребетні організми, в тому числі, наприклад, людей, ссавців (не людей) і нижчих приматів.
Зо Термін "суб'єкт" може бути застосований рівнозначно з терміном "тварина" у цьому винаході.
Термін "викликане філовірусом захворювання", який відноситься до будь-якого з варіантів реалізації винаходу, може позначати будь-яке захворювання, викликане інфекцією будь-яким філовірусним штамом, ізолятом або варіантом, як зазначено в цьому документі, або викликане будь-якою комбінацією будь-яких філовірусних штамів, ізолятів або їх варіантів (як вже згадувалося у будь-якому місці вище або нижче і/або в будь-якому з варіантів реалізації вище або нижче).
Як використовується в цьому винаході, термін "посилення", коли застосовується по відношенню до імунної відповіді проти філовірусів, такої як гуморальна відповідь (наприклад, специфічна антигенна нейтралізуюча гуморальна відповідь або 7ЕВОМ-СР-специфічна гуморальна відповідь), цитокінова відповідь або СО8 Т-клітинна відповідь (наприклад, імунодомінантна СО8 Т-клітинна відповідь), позначає збільшення імунної відповіді у тварини, яким ввели гомологічну примуючу-бустуючу комбіновану вакцину ММА, відносно відповідної імунної відповіді, яка спостерігається у тварини, якій ввели гомологічну примуючу-бустуючу комбіновану вакцину векторів ММА, при цьому вектори ММА не експресують жоден білок 40 філовірусного віріона, або позначає збільшення імунної відповіді у тварини, якій ввели гетерологічну примуючу-бустуючу комбіновану вакцину ММА і ЕРМ векторів згідно цього винаходу, відносно відповідної імунної відповіді, яка спостерігається у тварини, якій ввели гетерологічну примуючу-бустуючу комбіновану вакцину ММА і ЕРМ векторів, згідно цього винаходу, при цьому вектори ММА не експресують жоден білок 40 філовірусного віріона.
Бажано, "посилений", коли застосовується по відношенню до імунної відповіді, такої як гуморальна відповідь, наприклад, нейтралізуюча гуморальна відповідь, цитокінова відповідь або СО8 Т-клітинна відповідь, означає зростання імунної відповіді у тварини, якій ввели гетерологічну примуючу-бустуючу комбіновану вакцину з вектором ММА як примуючим вектором, і вектором ЕРМ як бустючим вектором, згідно цього винаходу, відносно відповідної імунної відповіді, яка спостерігається у тварини, якій ввели зворотню примуючу-бустуючу комбінацію, при цьому вектор ЕРМ пропонується як примуючий вектор, а вектор ММА пропонується як бустуючий вектор, застосовуючи той самий примуючий -бустуючий інтервал.
У контексті цього винаходу "імунодомінантна СО8 Т-клітинна відповідь" означає масштабну
СО8 Т-клітинну відповідь господаря проти рекомбінантного антигена, який закодований ММА бо Мабо ЕРМ вектором. Таким чином, може бути створена імунодомінантна СО8 Т-клітинна відповідь проти рекомбінантного антигена, який закодований за допомогою гомологічних примуючих-бустуючих рекомбінантних ММА або гетерологічних примуючих-бустуючих рекомбінантних ММА і ЕРУ, яка є більшою, ніж СО8 Т-клітинна відповідь проти рекомбінантних антигенів рекомбінантних ММА або ЕРМУ, при цьому вектор ММА не експресує жодного білка 40 філовірусного віріона.
Рівень СО8 Т-клітинної відповіді може бути визначений способами, які добре відомі в даній галузі техніки, таким як, але необмежені лише цими: ЕГІ5РОТ аналіз (наприклад, інтерферону- гамма (ІФН-у) ЕГІБРОТ. Наприклад протоколи описані в Ситепі Ргоїосої5 іп ІттипоЇоду (допп
УМіеу 5 оп, Іпс. (1994) (див. наприклад, Спаріег 6, зесіоп 19: ЕГІБРОРТ Аззау їо Оеїесі
СуїокКіпе-зестеїпа Мигіпе апа Нитап СеїІ5, Зирріетепі 10) або в 5сппеїдег, еї аї., Маї. Меа. 4:397-402 (1998)) і, наприклад, за методиками, які викладені в прикладах для конкретного вірусу цього винаходу. Інші підходящі аналізи включають в себе аналіз ІС5, який аналізує рівень внутрішньоклітинних цитокінів при діяльності СО8 Т-клітин. Наприклад, СО8 Т-клітинна відповідь може включати антиген-специфічну СО8 Т-клітинну відповідь, яка становить більш ніж 5095, наприклад, 51 95, 60 5, 70 95, 80 95, 9095 або 10095 від загального числа антиген- специфічних Т-клітинних відповідей у тваринному суб'єкті. Бажано, СО8 Т-клітинна відповідь також представляє 0,1 95 або більше, наприклад 0,1 95, 0,2 о, 0,3 Фо, 0,4 У, 0,5 9Уо, або більше від загального числа цитокінових відповідей у тваринному суб'єкті. В деяких варіантах, після другого або третього бустування, рекомбінантні вірусні вектори згідно цього винаходу викликають СО8 Т-клітинну відповідь господаря проти закодованого антигена, що становить щонайменше 0,5 95, 1 90, 5 90, 10 95, 15 95, 20 90, 25 95, або 30 95 від загального числа СО8 Т- клітинних компартментів.
Рівень гуморальної відповіді може бути визначений за допомогою способів, які відомі в даній галузі техніки. Для визначення, чи індукує поліпептид (або полінуклеотид, який експресує такий поліпептид) одне або кілька нейтралізуючих антитіл проти одного або декількох філовірусних антигенів з одного або більше філовірусних субтипів, може бути застосований будь-який відповідний аналіз за допомогою реакції нейтралізації бляшкоутворення (РНБО). Типовий аналіз за допомогою реакції нейтралізації бляшкоутвонення для філовірусів описаний в
Прикладах. Інші РНБО способи і формати добре відомі фахівця в даній галузі техніки.
Зо Філовірусні білки
Як використовуються рівнозначно у цьому винаході, терміни "ген глікопротеїну" або "ОР ген" позначає ген, або гомолог або варіант гена, який кодує глікопротеїн, зокрема трансмембранний глікопротеїн оболонки, в будь-якому філовірусному штамі або ізоляті, хоча точна послідовність і або геномне розташування гена глікопротеїну може відрізнятися у різних штамів або ізолятів.
Наприклад, в штамі Маіїео ЗЕВОМ (ЗЕВОМ-Маїйео), ген глікопротеїну (ген СР-БЕВОМУ-Маїеєо) містить нуклеотиди 1120-1004 ї 1004-2149 (кінцеві точки включені) як пронумеровано в номері доступу ГенбБанку 023069.1. Транскрипти ЕВОМ проходять редагування у ході транскрипції таким чином, що деякі нуклеотиди зчитуються двічі. Ген СР-5БЕВОМ-Маїео додатково містить відкриту білок-кодуючу рамку зчитування (ОКЕ), яка охоплює нукеотиди 120-1004 і 1004-2149 (кінцеві точки включені) як пронумеровано в номері доступу ГенБанку О23069.1. Нуклеотидна послідовність гена СР-5БЕВОМ-Маїео викладена в ЗЕО ІЮО МО:1 (під номер доступу ГенБанку
Ш23069.1).
Як використовується в цьому винаході, "гомолог" або "варіант" має бажано щонайменше близько 50 96, щонайменше, близько 60 95 або 65 956, щонайменше, близько 70 95 або 75 95, принаймні, близько 80 95, 81 Фо, 82 95, 83 Фо, 84 95, 85 У, 86 95, 87 95, 88 95, або 89 95, що більш типово, щонайменше, близько 90 95, 91 95, 92 95, 9395, або 9495 і навіть більш типово щонайменше близько 95 95, 96 95, 97 9», 98 9о або 99 95, найбільш типово, щонайменше близько 9995 ідентичності нуклеотидної послідовності з зазначеним геном, білком, поліпептидом, фрагментом антигенного білка, антигеном і епітопом. Термін "гомолог" або "варіант" також включає в себе видалені, усічені чи іншим чином мутовані версії генів і білків, відповідно. В якості прикладу, охоплюються, наприклад, розчинні форми СР-ЕВОМ або ОР-МАРМ білків, які позбавлені сигнального пептиду, а також трансмембранні та/або цитоплазматичні домени повнорозмірних СР-ЕВОМ або СР-МАКМ білків.
Як використовуються як рівнозначні у цьому винаході, терміни "глікопротеїн" або "ОР", відносяться до глікопротеїну, зокрема трансмембранного глікопротетну оболонки, або до гомолога або до варіанта глікопротеїну.
Амінокислотна послідовність ЗР-ЕВОМ-Маіео викладена в 5ЕО ІЮ МО:2 (амінокислотна послідовність під номером доступу ГенБанку 023069.1). СР-БЕВОМ-Маїео білок містить сигнальний пептид, позаклітинний домен, трансмембранний домен і цитоплазматичний домен 60 (див., наприклад, ОпіРгоїКкВ/Зм/і55-Ргої номер доступу 066798). Сигнальний пептид білка СрР-
ЗЕВОМ-Маїео складається з амінокислот 1-32 5ЕО ІО МО:2; позаклітинний домен білка орР-
ЗЕВОМ-Маїео складається з амінокислот 33-650 5ЕО ІО МО:2 або амінокислот 1-650 5ЕО ІЮ
МО:2; трансмембранний домен білка СОР-5ЕВОМ-Маїйео складається з амінокислот 651-671 5ЕО
ІО МО:2; і цитоплазматичний домен білка СР-5ЕВОМ-Маїео складається з амінокислот 672-676
ЗЕОЮ МО.
Нуклеїнова кислота, яка кодує амінокислотну послідовність ЗР-7ЕВОМ-Мауїіпда викладена в
ЗЕО І МО:19. аР-7ЕВОМ-Мауїпда містить білок викладений в 5ХЕО ІЮ МО:20 (номер доступу
ГенБанку АВХ75367.1).
Крім того, також терміни "ген нуклеопротеїну" або "МР ген", які використовуються рівнозначно у цьому винаході, позначають ген, або гомолог або варіант гена, який кодує нуклеопротеїн в будь-якому філовірусному штамі або ізоляті, хоча точна послідовність і/або геномні розташування гена нуклеопротеїну також можуть різнитися між штамами або ізолятами.
Наприклад, в штамі Вопітасе БЕВОМ (ЗЕВОМ-Вопіїтасе), ген нуклеопротеїну (ген МР-5ЕВОМУ-
Вопіїасе) містить нуклеотиди 383-2599 (кінцеві точки включені), як пронумеровано в номері доступу ГенБанку АР173836.1. Ген МР-5БЕВОМ-Вопіїасе додатково містить відкриту білок- кодуючу рамку зчитування (ОКР), яка охоплює нуклеотиди 383-2599 (кінцеві точки включені), як пронумеровано в номері доступу ГенБанку АЕ173836.1. Нуклеотидна послідовність гена МР-
ЗЕВОМ-Вопіїасе викладена в ЗЕО ІЮ МОЗ (номер доступу ГенБанку АЕ173836.1).
Амінокислотна послідовність МР-ЕВОМ-Вопітасе викладена в 5ЕО ІЮ МО:4 (номер доступу амінокислотної послідовності ГенБанку АЕ173836.1). МР-БЕВОМ-Вопітасе білок містить суперспіральний домен (див., наприклад, номер доступу ШОпіРгоїКкВ/бм/із5-Ргої 0О90Р77).
Суперспіральний домен білка МР-5ЕВОМ-Вопіїтасе складається з амінокислот 334-363 5ЕО І
МО.
В деяких варіантах реалізації винаходу, нуклеїнова кислота, яка кодує антигенну детермінанту, бажано антигенний білок, більш бажано будь-який з білків, які згадані вище або нижче, являє собою повнорозмірний білок.
Рекомбінантні ММА і ЕРМ
У цьому винаході запропоновані рекомбінантні поксвіруси (наприклад, ММА або ММА-ВМ або
ЕРМ), які містять гетерологічні або чужорідні послідовності нуклеїнових кислот, отримані з ЕВОМ
Зо або МАКУ, які вставлені в різні сайти вбудовування в поксівірусний геном (наприклад, ММА або ММА-ВМ або ЕРМ). Гетерологічні нуклеїнові кислоти можуть кодувати один або більше чужорідний білок і/або чужорідний антиген, у тому числі, наприклад, вірусні антигени.
Як правило, такий "рекомбінантний" ММА або ЕРУ, як описано в цьому документі, належить до ММА/ЕРМ, які створюються стандартними генно-інженерними методами, тобто ММА/ЕРМ цього винаходу, таким чином, являють собою генетично спроектовані або генетично модифіковані ММА/ЕРС. Термін "рекомбінантний ММА або ЕРУ", таким чином, включає в себе
ММА/ЕРМУ які мають стабільно інтегровану в їх геном рекомбінантну нуклеїнову кислоту, бажано у формі транскрипційної одиниці. Транскрипційна одиниця може містити промотор, енхансер, термінатор і/або сайленсер. Рекомбінантні ММА/РРМ цього винаходу можуть експресувати гетерологічні антигенні детермінанти, поліпептиди або білки (антигени) після впливу на регуляторні елементи. Термін "ММА/ЕРУ" в контексті будь-якого з варіантів реалізації винаходу включає як індивідуальні, так і комбіновані варіанти ММА, ЕРМ або ММА і ЕРУ.
Як використовується тут, "гетерологічний" ген, нуклеїнова кислота, антиген або білок вважається нуклеотидною або амінокислотною послідовністю, яка не представлена в поксівірусному геномі дикого типу (наприклад, ММА або ММА-ВМ або ЕРМ). Досвідчений фахівець розуміє, що "гетерологічний ген", який присутній в поксівірусі, такому як ММА або ММА-
ВМ або ЕРУ, повинен бути включений у поксівірусний геном таким чином, що, після введення рекомбінантного поксівіруса в клітину-господаря, він експресується як відповідний гетерологічний генний продукт, тобто як "гетерологічний антиген" і/або "гетерологічний білок."
Експресія зазвичай досягається шляхом оперативного зв'язування гетерологічного гена з регуляторними елементами, які допускають експресію в поксівірус-інфікованих клітинах.
Бажано, щоб регуляторні елементи містили природні або синтетичні поксівірусні промотори.
В одному аспекті, рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор, згідно цього винаходу, містить гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного білка, який вибраний з вірусу Ебола (ЕВОМ) і/або вірусу Марбург (МАКУ). В іншому варіанті реалізації, рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор, згідно цього винаходу, містить гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту однієї чи більше антигенних детермінант філовірусного білка (наприклад, білка ЕВОМ), який вибирається з одного або більше субтипів
ЕВОМ, вибраного з групи, що складається з ЕБоїа міги5 2аїге (7ЕВОМ), Ероїа мігиє Зцдап 60 (ЗЕВОМ), Ероїа мігиє Соїє алїмоіїє (ЕВОУ-Саї), який також називається Таї Рогев5і міги5 або
ТАРМ), Ероїа міги5 Кезіоп (КЕВОМ) і Ероїа міги5з Випаіридуо (ВЕВОМ).
Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу, рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор, згідно цього винаходу, містить одну або більше антигенну детермінанту філовірусного білка, бажано білок
ЕВОМ, білок МАКМ або повнорозмірний білок, вибраний з групи, яка складається з: 7аїге-
Мауїпда, 7аїге-Кікм/ї, 7аіге-Сароп, Ероїа міги5 Соїе а'моїге, Зидап-Вопітасе, Зидап-Маїєо, Зидап-
Си, Магбигод-НКамп, Магбиг9-О2оїїп, Магбигд-Ваїаусгак, Магбигд-МизокКе, Магбигд-Апдоїа.
Бажано, щоб антигенна детермінанта філовірусного білка (наприклад, вибраного з групи, яка складається з гаїге-Мауіпда, 2аїге-Кікм/ї, 7аіїге-Сароп, Ероїа міги5 Соїє а'моїгте, Бидап-
Вопітасе, Зидап-Маї!єо, Зидап-сши, Магбигд-Намп, Магбига-Огоїїп, Магбигд-Ваїаусгак, Магриго-
МизокКе, Магрига-Апдоїа) була обрана з групи, яка складається з: глікопротеїну оболонки (СР), нуклеопротеїну (МР), білка 35 віріона (МРЗ5), білка 40 віріона (МР40), білка 30 віріона (МРЗО), білка 24 віріона (МР24), і білка РНК-залежної РНК-полімерази (І).
В іншому варіанті реалізації цього винаходу, антигенна детермінанта філовірусного білка є глікопротеїном оболонки (СР), бажано, щонайменше, глікопротеїном оболонки (ОР) і білком 40 віріона (МР40).
В іншому варіанті реалізації цього винаходу, антигенна детермінанта філовірусного білка є глікопротетїном оболонки (СР), який обраний із групи 2ЕВОМ і БЕВОМ, бажано щонайменше глікопротеїном оболонки (СР) і білком 40 віріона (УР40), при цьому ОР і МР40 походять з одного і того ж штаму, бажано при цьому цей же штам обраний із групи 7ЕВОМ і БЕВОМ.
В іншому варіанті реалізації цього винаходу, антигенна детермінанта філовірусного білка є щонайменше глікопротеїном оболонки (СР) і білком 40 віріона (МР40), при цьому ОР і МР40 отримують з різних ізолятів або тих же ізолятів, бажано при цьому різні або ті ж ізоляти обрані з групи, яка складається з 7аіге-Мауіпада, 7аїге-Кікм/ї, 7аіге-Сароп, Ебоїа міги5 Соїє амоїге, Зидап-
Вопітасе, Зидап-Маї!єо, Зидап-сши, Магбигд-Намп, Магбига-Огоїїп, Магбигд-Ваїаусгак, Магриго-
МизоКе, Магбигд-Апдоїа, бажано, при цьому ізолят вибирають з групи 7аїге-Мауіпда, Зидап-
Си, Магрига-МизокКе і Магригд-Апдоїа, найбільш бажано, при цьому ізолят вибирають з групи 7аіге-Мауіпда, зЗидап-Ссии, Магбигд-Мизоке.
В іншому бажаному варіанті реалізації винаходу, рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор, згідно цього винаходу, містить нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенні детермінанти двох, трьох, чотирьох або більше субтипів Ебола і Марбург.
Інший бажаний варіант реалізації винаходу охоплює рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор по будь-якому з варіантів реалізації винаходу, який містить антигенні детермінанти двох, трьох, чотирьох або більше філовірусних білків, які вибрані з групи, яка складається з глікопротеїну оболонки (СР), нуклеопротеїну (МР), білка 35 віріона (МРЗ5), білка 40 віріона (МР40), білка 30 віріона (МРЗО), білка 24 віріона (УР24), і білка РНК-залежної РНК-полімерази (І).
У бажаному варіанті реалізації винаходу, рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор по будь-якому з варіантів реалізації винаходу містить антигенні детермінанти одного, двох, трьох, чотирьох або більше філовірусних білків, які вибрані з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮ МО:4,
ЗЕО ІЮ МО:6, ЗЕО ІЮ МО:20, ЗЕО ІЮ МО:29, БЕО ІЮО МО:31, 5ЕО ІЮ МО:34 і ЗЕО ІЮ МО:37.
У бажаному варіанті реалізації винаходу, рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор по будь-якому з варіантів реалізації винаходу містить антигенну детермінанту філовірусного білка, який вибраний з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮ МО:4, 5ЕО І МО:6, 5ЕО ІЮ МО:20,
ЗЕО ІЮ МО:29, ЗЕО ІЮ МО:31, ЗЕО ІО МО:34 і БЕО ІО МО:37.
В іншому варіанті реалізації винаходу, рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор по будь-якому з варіантів реалізації винаходу містить антигенну детермінанту філовірусного білка який складається з БЕО ІЮ МО: 20.
В іншому варіанті реалізації винаходу, рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор по будь-якому з варіантів реалізації винаходу містить антигенну детермінанту філовірусного білка, який вибраний з групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО: 20 і ЗЕО ІЮ МО: 34.
В іншому варіанті реалізації винаходу, рекомбінантний ММА/ЕРУ вектор по будь-якому з варіантів реалізації винаходу містить антигенну детермінанту філовірусного білка, який вибраний з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО:б, 5ЕО ІЮ МО:20, 5ЕО ІЮ МО:31 і БЕО ІЮ МО:34.
В іншому варіанті реалізації винаходу, рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор по будь-якому з варіантів реалізації винаходу містить антигенну детермінанту філовірусного білка, який вибраний з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО:б6, 5ЕО ІЮ МО: 20, 5ЕО ІЮ МО:29, 5ЕО ІЮ МО:31 і ЗЕО ІЮ МО:34.
В іншому варіанті реалізації винаходу, рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор по будь-якому з варіантів реалізації винаходу містить антигенну детермінанту філовірусного білка, який вибраний з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО:б, 5ЗЕО ІЮ МО:20, 5ЕО ІЮ МО:29, 5ЕО ІЮ МО:31, 60 ЗЕО ІЮ МО:34 і ЗЕО ІЮ МО:37.
В іншому варіанті реалізації винаходу, вектор ММА відповідно до будь-якого з варіантів реалізації винаходу містить гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного білка, який вибраний з групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО:29 і/або
ЗЕО ІО МО:6, 5ЕО ІЮ МО:20, 5ЕО ІЮ МО:91.
В іншому варіанті реалізації винаходу, вектор ММА відповідно до будь-якого з варіантів реалізації винаходу містить нуклеотидну послідовність, яка містить зЕО ІЮ МО:28 і/або 5ЕО ІЮ
МО:5, 5ЕО ІО МО:19, 5ЕО ІЮ МО:30.
В іншому варіанті реалізації винаходу, вектор ММА відповідно до будь-якого з варіантів реалізації винаходу містить нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенний філовірусний білок 40 віріона (МР40), що містить ЗЕО ІЮО МО:33 або нуклеотидну послідовність, яка кодує білкову послідовність, що містить ХЕО ІЮ МО:34.
В іншому бажаному варіанті реалізації винаходу, рекомбінантний вектор ММА, відповідно до будь-якого з варіантів реалізації винаходу, містить нуклеотидну послідовність, яка обрана з групи, що складається з: а) БЕО ІЮ МО:5, 5БЕО ІЮ МО:19 ії БЕО ІЮ МО:30; б) 5ЕО ІЮ МО:5, 5ЕО І
МО:19, 5ЕО ІЮ МО:28 і БЕО ІО МО:30; в) ЗЕО ІЮ МО:19 і ЗЕО ІЮ МО:33.
В іншому аспекті, цей винахід включає рекомбінантний вектор ММА або вектор ЕРУ, який містить гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну, зокрема філовірусного глікопротеїну оболонки.
Філовірусний глікопротеїн може кодуватися ОР-МАКМ або СР-ЕВОМ.
Для описаних тут варіантів реалізації винаходу, глікопротеїн з МАКМ може бути отриманий з
МАНВМУ-МизоКе, бажано повнорозмірний МАКМ-МизоКе, який, у свою чергу, може бути отриманий з штаму озера Вікторія або ізоляту МАКМ-МизоКе. СР-МАКМ також може бути отриманий з МАКМ-Намуп, МАНУ-О2оЇїп, МАНВМ-Каїауслак або з МАКМ-Апдоїа. Нуклеотидна послідовність, яка кодує ОР-МАНМУ-МизоКе наведена в ЗЕО ІО МО:5, яка кодує амінокислоти 1- 681 або 19-681 5ЕБО І МО:6. У бажаному варіанті реалізації винаходу, СР-МАВМ-МизоКе містить нуклеотидну послідовність зЗЕО ІЮ МО:5, яка бажано кодує білок ЗЕО ІЮО МО:6. В деяких варіантах реалізації винаходу, ЗОР-МАНМУ-МизоКе є усіченим, при цьому усічений СР-МАНУ-
МизоКе, може містити лише позаклітинний домен глікопротеїну оболонки, що містить амінокислоти 1-648 або амінокислоти 119-648 5ЕО ІЮ МО:б (номер доступу ГенБанку
Зо АВА87127.1). В інших варіантах реалізації винаходу, як описано в цьому винаході, глікопротеїн
МАМ може бути отриманий з МАКМ-Апдоїа, бажано повнорозмірний ОР-МАНМ-Апдоїа.. У бажаному варіанті реалізації винаходу, СР-МАНМ-АпдоЇїа містить нуклеотидну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:З6, яка кодує БЕО ІЮ МО:37.
Глікопротеїн ЕВОМ може являти собою СР-5ЕВОМУ, або може бути отриманий з СР-7ЕВОМ, зокрема, із штаму Мауіпда ОР-2ЕВОМ (СР-2ЕВОМ-Мауіпда). Повнорозмірний ОР-2ЕВОМ-
Мауїпда містить нуклеотидну послідовність ЕС 10 МО:19, яка кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:20. У бажаному варіанті СР-7ЕВОМ-Мауїпда містить нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО:19, яка бажано кодує білок ЗЕО ІЮ МО:20. СР-ЕВОМ можуть також являти собою СР-ВЕВОМУ, СР-ЕВОУ-Сдї або СР-ЕВОМ-Вевіоп. СР-7ЕВОМ може бути усіченим і може містити нуклеотидну послідовність 5ЕО І МО:19, яка була змінена для кодування амінокислот 1-636 5ЕО ІЮ МО:20, або змінена, щоб видалити домен муцину, що охоплює амінокислоти 314-464 5ЕО І МО 20.
СР-БЕВОМ може бути отриманий із штаму Сши ОР-5БЕВОМ (СР-БЕВОМ-СШІм). В деяких варіантах реалізації винаходу, ЗОР-БЕВОМ містить нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО:30, бажано, яка кодує амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО:31.
Рекомбінантний ММА/ЕРМ, згідно цього винаходу, також може додатково містити послідовність фрагмента С правцевого анатоксину. У бажаному варіанті реалізації винаходу,
СР-МАВМУ-МизокКе, зокрема, повнорозмірний СР МАКМ-МизоКе додатково містить фрагмент С правцевого анатоксину. Фрагмент С правцевого анатоксину може містити нуклеотидну
БО послідовність 5ЕО ІЮ МО:7, яка кодує амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:8. В деяких варіантах реалізації винаходу ЗР-МАНМУ-МизоКе додатково містить фрагмент С правцевого анатоксину (САС), який може містити нуклеотиди 2281-3642 нуклеотидної послідовності ЗЕО ІЮ
МО:7, які кодують амінокислоти 760-1213 амінокислотної послідовності зЕО ІЮ МО:8.
Рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор, згідно цього винаходу може додатково містити імуностимулюючі або костимулюючі молекули. У бажаному варіанті реалізації винаходу, гетерологічна нуклеотидна послідовність, яка кодує антигенну детермінанту ОР-МАНМУ-Мизоке, додатково містить одну або більше імуностимулюючих молекул. В деяких варіантах реалізації винаходу, одна чи більше імуностимулюючих молекул є людським СО40 лігандом, (пПСО401), який може містити ЗЕО ІЮО МО:9, яка кодує амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО:10. В деяких бо варіантах реалізації винаходу, одна або більше імуностимулюючих молекул є злитим білком,
що містить суші-домен рецептора людського інтерлейкіна-15 (ПІ/158-5изпї), який може містити
ЗЕО ІЮ МО:11, яка кодує амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:12.
Одна або більше імуностимулюючих молекул також можуть являти собою лімфоцитарний функціонально-зв'язаний антиген З (І ЕА-3, або СО58), молекулу внутрішньоклітинної адгезії 1 (ІСАМ-1, або СО54) та В7.1 (СО80), в сукупності відомі як тріади костимулючих молекул (тобто "ТРІКОМ"). "ТРІКОМ", як використовується в цьому винаході, являє собою абревіатуру від
Тріада Костимулючих Молекул, яка складається з В7-1 (також відома як СО80), внутрішньоклітинної молекули адгезії-ї (ІСАМ-1, також відома як СО54), і лімфоцитарного функціонально-зв'язаного антигену-З (І ЕА-3, також відома як СО58), що входять до складу рекомбінантних вірусних векторів (наприклад, поксівірусних векторів), які експресують специфічний антиген з метою підвищення антиген-специфічної імунної відповіді. Окремі компоненти ТРІКОМ можуть бути під контролем одного і того ж або різних промоторів, і можуть бути надані в тому ж векторі зі специфічним антигеном або в окремому векторі. Типові вектори описані, наприклад, в Нодде еї аї., "А Тіїад ої Созіїтшаюгу МоїІесшев бупегаіге юю Атрійу Т-Сеї!
Асіїмайоп, " Сапсег Нез. 59:5800-5807 (1999) і патенті США Мо 7211432 В2, обидва джерела включені в цей документ шляхом посилання. ГЕА-3 може містити нуклеотидну послідовність
ЗЕО ІЮО МО:13, яка кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:14, ІСАМ-1 може містити нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО:15, яка кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:16, і В7.1 може містити нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО:17, яка кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:18.
Рекомбінантний ММА/ЕРУ, згідно цього винаходу, може додатково містити послідовність мембранного якоря, таку як ген В5бт вірусу коров'ячої віспи, який містить нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО:21, яка кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:22. Зокрема, антигенна детермінанта, як описано в цьому документі, бажано, може бути функціонально зв'язаною з мембранним якорем, наприклад, таким як Вот. Таким чином, як застосовується в цьому документі, те, що рекомбінантний ММА/ЕРМ містить послідовність мембранного якоря, це означає, що антигенна детермінанта, яка міститься в рекомбінантному ММА/ЕРУ, є бажано функціонально зв'язаною з мембранним якорем. Мембранний якір позначає будь-який поліпептид, який здатний заякорювати гетерологічні поліпептиди на зовнішній поверхні
Зо клітинної мембрани. Бажано, мембранний якір містить трансмембранний і цитоплазматичний домени білка ВОК вірусу коров'ячої віспи, зазначеного в цьому документі як "В5Е якір" або "В5т". Згідно з визначенням, В5ОК якір позначає 42-амінокислотний С-кінцевий сегмент ВОК білка з будь-якого типу вірусу коров'ячої віспи, наприклад, МУК штаму (Каї еї аїЇ. У Мігої. 71(4):3178-87 (1997)) або більш бажано ММА. Крім цього, в цей винахід включені варіанти В5К якоря, які мають щонайменше 80 96, наприклад щонайменше 85 95, наприклад щонайменше 90 95, або щонайменше 9595, наприклад щонайменше 98 95 ідентичності послідовності по відношенню до еталонної ВОК якірної послідовності. Бажана послідовність якоря показана в
ЗЕО ІЮО МО: 21, її трансляційний продукт також показаний в 5ЕО ІЮ МО: 22.
У бажаному варіанті реалізації винаходу, повнорозмірний і/або усічений ОР-2ЕВОМ додатково містить ген Вот вірусу коров'ячої віспи.
В іншому аспекті, цей винахід включає рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор, який містить гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну, як описано вище, та додатково містить гетерологічну нуклеотидну послідовність, що кодує додаткові філовірусні білки, які необхідні для формування вірусоподібних часток (ВПЧ). В одному варіанті реалізації винаходу, додаткова гетерологічна нуклеотидна послідовність, яка кодує філовірусні білки, які необхідні для формування ВПЧ, може представляти собою УР40. В деяких варіантах реалізації винаходу, додаткові філовірусні білки, які необхідні для формування вірусоподібних частинок або посиленого утворення вірусоподібних частинок, являють собою МР-ЕВОМ і МР40-ЕВОМУ, при цьому білки можуть бути отримані з штамів, як зазначено вище. Бажано, філовірусний нуклеопротеїн (наприклад, МР-
ЕВОМ) і філовірусний білок 40 віріона (наприклад, МР40-ЕВОМ) отримують з того ж філовірусного штаму. Вакцинуючи нижчих приматів рекомбінантним ММА, який експресує ОР і
МРА0О (або в доповнення або без експресії МР), який здатний виробляти ОР-вмісні ЕВОМ- вірусподібні частинки з інфікованих клітин, винахідники змогли досягти захисту проти вірусу для нижчих приматів при перевірочному філовірусному зараженні. Виробництво вірусподібних частинок у тварин, які були вакциновані, створює додаткову модальність вакцини, близько імітуючи вірусні частинки, які присутні при цій філовірусній інфекції. Така рекомбінантна вакцинація ММА філо ВПЧ, стимулює ії гуморальну і клітинну імунні відповіді, ії таким чином захищає від філовірусної інфекції. Додатковою перевагою вакцинації ослабленим вірусом ММА, бо який виробляє філовірусні ВПЧ, є уникнення необхідності очищення вірус-подібних частинок перед інокуляцією і додаткова ММА-опосередкована імуностимуляція. Застосування філовірусного нуклеопротеїну (наприклад, МР-ЕВОМ) і філовірусного білка 40 віріона (наприклад, МР40-ЕВОМ), які були отримані від того ж штаму, є корисним для підвищення утворення вірус-подібних частинок, бажано для продукування однорідних СР шипиків, які декорують вірус-подібні частинки з однорідним діаметром, близько імітуючи вірусні частинки і покращуючи захист від філовірусної інфекції.
Справжній винахід також пов'язаний з рекомбінантним ММА/ ЕРМ вектором, який містить гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну, і гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту додаткового філовірусного білка. Гетерологічна нуклеотидна послідовність, яка кодує антигенну детермінанту додаткового філовірусного білка, може кодувати один або більше філовірусний білок, який вибраний з групи, що складається з: нуклеопротеїну (МР), білка 35 віріона (МР35), білка 40 віріона (МР40), білка 30 віріона (МРЗО), білка 24 віріона (МР24), і білка РНК-залежної
РНК-полімерази (І). Перераховані гени і білки, відповідно, можуть бути отримані з одного або більше описаних вище філовірусних штамів. МР-ЕВОУ-Саі деяких варіантів реалізації винаходу містить нуклеотидну послідовність зЗЕО ІЮ МО:28, яка кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО:29.
В деяких варіантах реалізації, МР40 вибирають з МАКМ або ЕВОМУ, бажано МР40 обраний з одного або більше субтипів ЕВОМ, який обраний із групи, що складається з: Ероїа міги5 2аїге (7ЕВОМ), Ероїа міпоє Бйцдап (ЗЕВОМ), Ероїа міг Соїє самої (ЕВОМУ-Саї, який також називається Таї Рогевзі мігиз або ТАРМ), Ероїа мігиє Невіоп (ЕВОМ-Кевіоп) і Ероїа міги5
Випаіридуо (ВЕВОМ). У бажаному варіанті реалізації винаходу, МР40О0 обраний з одного або більше 2ЕВОМ, 5ЕВОМ і МАКМУ. В деяких варіантах реалізації винаходу, філовірусний глікопротеїн і філовірусний МР40 вибирають з того ж філовірусного штаму. У додатковому варіанті реалізації винаходу, МР40 і/або філовірусний глікопротеїн вибрають з одного або більше: 7аіге-Мауїпда, 7аїге-Кікм/ї, 7аіге-Сароп, Ероїа мігив Соїе а моїге, Зидап-Вопіїтасе, Зидап-
Маїєо, зидап-Ссшии, Магтбигд-Намп, Магбиг9-Огоїїп, Матигд-Наїаусгак, Магбигд-МизокКе, Магригод-
Апдоїа; і більш бажано, вибирають з одного або більше 7аіге-Мауіпда (МР40-2ЕВОМУ-Махуїпода), зидап-сшиши (МР40-5БЕВОМ-Сійм), Магбигд-МизоКе (МР4А0О-МАНУ-Мизоке) і Магригд-Апдоїа (МР40-
Зо МАНВУ-Апдоїа). У додатковому варіанті реалізації винаходу, вектор ММА в будь-якому з варіантів реалізації винаходу додатково містить філовірусний нуклеопротеїн (МР), бажано, при цьому філовірусний нуклеопротеїн і філовірусний МР40 отримують з того ж філовірусного штаму. У додатковому варіанті реалізації винаходу, МР40 містить нуклеїнову послідовність, яка кодує
МР4А0О-2ЕВОМ-Мауіпда або МР4А0О-МАНМ-МизоКе. В інших варіантах реалізації винаходу, філовірусний МР40 містить нуклеотидну послідовність БЕО ІЮ МО:33. У додатковому варіанті реалізації винаходу, МР40 містить нуклеїнову кислоту, яка кодує білкову послідовність ЗЕО ІЮ
МО:34. У додатковому бажаному варіанті реалізації винаходу, МР40 містить нуклеотидну послідовність зЕО ІЮ МО:33, яка кодує амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО:34.
У додатковому бажаному варіанті реалізації винаходу, рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор містить гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну оболонки, і щонайменше одну гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту додаткового філовірусного білка. В деяких варіантах реалізації винаходу, перша гетерологічна нуклеотидна послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовирусного глікопротеїну оболонки кодує СР-МАКМ, а друга гетерологічна нуклеотидна послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного глікопротетну оболонки, кодує СР-ЕВОМ. Рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор містить, згідно додаткового бажаного варіанту реалізації цього винаходу, три гетерологічні нуклеотидні послідовності, які кодують антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну оболонки, і щонайменше одну гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту додаткового філовірусного білка. Бажано, перша гетерологічна нуклеотидна послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну оболонки, кодує СР-МАКУ, друга гетерологічна нуклеотидна послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну оболонки, кодує СОР-ЕВОМ, і третя гетерологічна нуклеотидна послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну оболонки, кодує ОР-ЕВОМ, отримана з ізоляту штаму або ЕВОМ, в якому СР-ЕВОМ відрізняється від такого, який закодований другою гетерологічною нуклеотидною послідовністю. Відповідно, одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну оболонки, може кодувати СР-5ЗЕВОМ-СШІИ, а інша - Р-7ЕВОМ-Мауїіпода.
В іншому варіанті реалізації винаходу, рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор містить дві бо гетерологічні нуклеотидні послідовності, які кодують антигенну детермінану ОР-ЕВОМ з ЕВОМ штаму або ізоляту, і дві гетерологічні нуклеотидні послідовності, які кодують антигенну детермінанту СОР-МАКМ з МАКМ штаму або ізоляту, і бажано МАКМ штам є МАКМ-Аподоїа і
МАРВ-МихзоКе, а ЕВОМ штам є 2ЕВОМ і/або БЕВОМУ, бажано 7ЕВОМ-Мауїпда і ЗЕВОМ-СШІИ.
Зрозуміло, що додаткова нуклеотидна послідовність, яка кодує антигенну детермінанту додаткового філовірусного білка, може кодувати також філовірусні білки, які вибрані з групи, що складається з: нуклеопротеїну (МР), білка 35 віріона (МРЗ5), білка 40 віріона (МР40), білка 30 вірна (МРЗО), білка 24 віріона (МР24), і білка РНК-залежної РНК-полімерази (Ї), як вже згадувалося вище, які можуть бути отримані з різних штамів, як вже зазначалося вище.
Рекомбінантний ММА/ЕРМУ вектора, згідно додаткового бажаного варіанту реалізації цього винаходу, містить дві гетерологічні нуклеотидні послідовності, які кодують антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну оболонки СР-МАКМ і СОР-ЕВОМ, і третю гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту МР40. Такий МР40 може являти собою будь-який МР40, як описано вище або нижче. Відповідно, одна гетерологічна нуклеотидна послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну оболонки, може кодувати СР-5ЕВОМ-СшИи, інша - СР-2ЕВОМ-Мауїіпда, а третя гетерологічна нуклеотидна послідовність, може кодувати антигенну детермінанту філовірусного білка МР40- 7ЕВОМ, МР40-5ЕВОМ або МР40-МАРУ, бажано МР40-2ЕВОМ-Мауїпда або МРА4А0О-МАВМУ-Мизоке.
У додатковому варіанті реалізації цього винаходу, рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор містить дві гетерологічні нуклеотидні послідовності, які кодують антигенну детермінанту філовірусного глікопротетну оболонки ОР-ЕВОМ, бажано ОР-2ЕВОМ і/або СР-БЕВОМ, більш бажано ОрР- 7ЕВОУ-Мауїпда і СР-БЕВОМ-Сшіи, один філовірусний глікопротеїн оболонки СР-МАКУ, бажано
СР-МАВМ-МизоКе, або СР-МАНМУ-Апдоїа, і щонайменше один філовірусний нуклеопротеїн, бажано обраний із групи, яка складається з МР-ЕВОМ-Саї, МР-2ЕВОМ, і МР-МАРМУ, бажано МР-
МАВМУ-МизоКе або МР-МАНУ-Апдоїа.
Інтеграційні сайти в ММА/ЕРМ
Гетерологічні нуклеотидні послідовності, які кодують антигенні детермінанти філовірусного глікопротеїну, в якості варіанту, які додатково містять щонайменше одну гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує додатковий філовірусний білок, можуть бути вставлені в одну або кілька міжгенних ділянок (ІЗ) ММА. В деяких варіантах реалізації винаходу, міжгенна
Зо область вибирається з: ІК 07/08, ІСЕ 44/45, ІСК 64/65, ІК 88/89, ОК 136/137, і ІК 148/149.
В деяких варіантах реалізації винаходу, менш ніж 5, 4, З або 2 міжгенні ділянки рекомбінантного
ММА містять гетерологічні нуклеотидні послідовності, які кодують антигенні детермінанти філовірусного глікопротеїну оболонки і/або додаткового філовірусного білка. Гетерологічні нуклеотидні послідовності можуть, додатково або альтернативно, бути вставлені в одному або декількох делеційних сайтах дикого типу, зокрема в основних делеційних сайтах І, ЇЇ, ПІ, ІМ, М або МІ в геномі ММА. В деяких варіантах реалізації винаходу, менш ніж 5, 4, З або 2 з делеційних сайтів дикого типу рекомбінантного ММА містять гетерологічні нуклеотидні послідовності, які кодують антигенні детермінанти філовірусного глікопротеїну оболонки і/або додаткового філовірусного білка.
Кількість інсерційних сайтів ММА, які містять гетерологічні нуклеотидні послідовності, які кодують антигенні детермінанти з філовірусного білка, може становити 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, або більше. В деяких варіантах реалізації винаходу, гетерологічні нуклеотидні послідовності вставляються в 4, 3, 2, або меншу кількість інсерційних сайтів. Бажано, використовують два інсерційних сайти. В деяких варіантах реалізації винаходу, використовують три інсерційних сайти. Бажано, рекомбінантні ММА містять щонайменше 2, 3, 4, 5, 6, або 7 генів, які вставлені у 2 або З інсерційні сайти.
Гетерологічні нуклеотидні послідовності, які кодують антигенні детермінанти філовірусного глікопротеїну, в якості варіанту, які додатково містять щонайменше одну гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує додатковий філовірусний білок, можуть бути вставлені в одну або кілька міжгенних ділянок (СЕ) ЕРУ. У бажаному варіанті реалізації винаходу, міжгенна ділянка знаходиться між ОКЕ 7 і 9 1,3-кБ Ніпап фрагмента генома (див. ОгіШеп еї аїЇ, Мігоїоду 160:203-209 (1987) (05 5180675) і 5реппег еї аї, 9. Міго!Ї. 64:527-533 (1990)). В деяких варіантах реалізації винаходу, гетерологічна нуклеотидна послідовність може бути вставлена в інсерційні сайти вірусу віспи курей, як описано в ЕР 0 538 496 А1 і М/О 05/048957, які включені в цей документ шляхом посилання. Також бажані інсерційні сайти вірусу віспи курей цього винаходу являють собою ГШ5 інсерційний сайт, ЕР14 інсерційний сайт, і 43К інсерційний сайт. Ці сайти також згадуються іноді як ЕРМООб/РРМО07 (ОБ інсерційний сайт), ЕРМ254/ЕРМ255 ((Ц05 інсерційний сайт), ЕРМОб6О/ЕРУОБЄ1 (ЕР14 інсерційний сайт), і ЕРМ107/ЕРУ108 (43К інсерційний сайт). бо В одному бажаному варіанті реалізації винаходу, інсерційний сайт в вірусі віспи курей є інсерційним сайтом ГО5. Існує дві довгих унікальних послідовності (05) на кожному кінці вірусного генома вірусу віспи курей (номер доступу ГенБанку: АФ 198100.1), і, таким чином, два
ГО5 інсерційні сайти в кожному геномі. ГО5 інсерційний сайт на лівому кінці генома лежить 3'
ЕРМО06 ії 5' ЕРМО07 1251, бажано між позиціями 7470 і 7475 в геномній послідовності вірусу віспи курей, як анотовано в номері доступу ГенБанку АЕ198100.1. ГО5 інсерційний сайт на правому кінці генома лежить 3' ЕРМ254 їі 5' ЕРМ255, бажано між позиціями 281065 і 281070 в геномній послідовності вірусу віспи курей, наприклад, номера доступу ГенБанку АЕ198100.1. В одному варіанті реалізації винаходу, гетерологічна нуклеотидна послідовність може бути вставлена в будь-яку позицію між нуклеотидними позиціями 281065 і 281070.
В іншому варіанті реалізації винаходу, інсерційний сайт вірусу віспи курей є ЕРІ14 інсерційним сайтом. Цей сайт знаходиться в 3 ЕРМОбО і 5 ЕРМО61 в геномній послідовності вірусу віспи курей, бажано між позиціями 67080 і 67097 генома вірусу віспи курей, наприклад, номера доступу ГенБанку АЕ198100.1. В одному варіанті реалізації винаходу, нуклеотиди між позиціями 67080 і 67097 ДНК послідовності видаляються в рекомбінантному вірусі, і замінюються певними вставками, які є послідовністю інтересу. В одному варіанті реалізації винаходу, ЕР14 інсерційний сайт знаходитися між ортологом гена ЕРУОБбО і ортологом ЕРМОБ61, наприклад, АР198100.1. Термін "ЕРМОб6О, ЕРМО61, ЕРМ254" ії т. д. позначає положення відповідної кодуючої послідовності (наприклад, СО5) відповідного гена, пронумерованої від 5' до З' кінця, як анотовано в номері доступу ГенБанку АЕ198100.1. У бажаному варіанті реалізації винаходу, ЕРІ14 інсерційний сайт знаходитися між позиціями 67091 і 67092 в геномній послідовності вірусу віспи курей (який також називають ІСНбО/61 інсерціний сайт, як анотовано в номері доступу ГенБанку АЕ198100.1).
У ще одному варіанті реалізації винаходу, інсерційний сайт вірус віспи курей позначає 43К інсерційнний сайт. Цей сайт знаходиться в 3 ЕРМ107 і 5 ЕРМ108, бажано в позиції 128178 геномної послідовності вірусу віспи курей, як анотовано в номері доступу ГенБанку АЕ198100.1.
У бажаному варіанті реалізації винаходу, інтеграційний сайт є ЕР14 (ІСВАбО/61) і/або Ватні у ділянка. Ватні у ділянка додатково описується в 5. УепкКіп5 еї аї. (1991), Аід5 Кезеагсп апа
Нитап Кеїгомігизез 7(12):991:998, який включений в цей документ шляхом посилання.
В певному варіанті реалізації винаходу, ІСК є Ватні у ЕРУ.
Кількість інсерційних сайтів ЕРМ, які містить гетерологічні нуклеотидні послідовності, які кодують антигенні детермінанти філовірусного білка, може складати один або два. Бажано, використовують два інсерційних сайти. В іншому варіанті реалізації винаходу, рекомбінантний
ЕРМ містить щонайменше 1, 2, 3, 4 або 5 генів, які вставлені в один або два інсерційні сайти.
Рекомбінантні МУА/ЕРМ віруси, які представлені у цьому документі, можуть бути створені за допомогою звичайних способів, які відомі в даній галузі техніки. Способи отримання рекомбінантних поксівірусів, або вставки екзогенних кодуючих послідовностей в поксівірусний геном, добре відомі фахівцю в даній галузі техніки. Наприклад, способи стандартних методик молекулярної біології, такі як клонування ДНК, РНК і ДНК виділення, Вестерн-блот аналіз, ЗТ-
ПЛР та ПЛР методи ампліфікації описані в МоїЇесшіаг Сіопіпд, А Іабогаюгу Мапиаї (2па Еа.) (9. затьгоок еї аї., Соїй брііпу Нагбог І арогафогу Рге55 (1989)), і методи поводження з вірусами і маніпуляції вірусами, описані в Мігоюду Меїпод5 Мапиаї! (В. МУ. У. Маву еї аї. (еаз.), Асадетіс
Рге55 (1996)). Аналогічним чином, методи та вміння для поводження з, маніпуляцій та генетичної інженерії ММА описані в МоїІесшаг Мігоїоду: А Ргасіїса! Арргоасі (А. -. Оамізоп 8 К.М.
Еіой (Едв5.), Те Ргасіїса! Арргоасі Зегієв, ІВІ. Ргезз аї Охіога Опімегвйу Ргев55, Охтога, ОК (1993) (див, наприклад, СПпаріег 9: Ехргеззіоп ої депе5 Бу Массіпіа міги5 месіог5)) і Сштепі Ргоїосої5 іп
МоїІесшіаг Віоїюду (допйп УмМпеу 5 Зоп, Іпс. (1998) (див., наприклад, Спаріег 16, Зесіоп ІМ:
Ехргезввіоп ої ргоївіп5 іп таттаїіап сеїЇ5 ивіпу массіпіа міка! месіюг)).
Для створення різних рекомбінантних ММА/ЕРМ векторів, які описані у цьому документі, можуть бути застосовані різні способи. Послідовність ДНК, яку потрібно вставити у вірус, може бути розміщена в плазмідній конструкції Е. соїї, в яку було вставлено ДНК, яка гомологічне ділянкці ДНК ММА/ЕРМ. Окремо, послідовність ДНК для вставки може бути лігована з промотором. З'єднання промотор-ген може бути розташоване в плазмідній конструкції таким чином, щоб з'єднання промотор-ген фланкувалось на обох кінцях ДНК, яка гомологічна послідовності ДНК, яка фланкує ДНК ділянку ММУА/ЕРУ, яка містить несуттєвий локус. Кількість копій отриманої плазмідної конструкції може бути збільшено шляхом розмноження в бактерії Е. соїї, ії надалі ця плазмідна конструкція може бути виділена з бактерії. Виділена плазміда, яка містить ДНК послідовність гена, який повинен бути вставлений, може бути трансфікована в культуру клітин, наприклад, культуру ембріональних курячих фібробластів, в той же час культура інфікується ММА. Рекомбінація між гомологічним ДНК ММА в плазміді та вірусним 60 геномом, відповідно, може створювати ММА, який модифікований наявністю чужорідної послідовності ДНК.
Згідно бажаного варіанту реалізації винаходу, клітини підходящої клітинної культури, такі, як наприклад КЕФ клітини, можуть бути заражені поксівірусом. Заражена клітина може бути, як наслідок, трансфікована першим плазмідним вектором, який містить чужорідний або гетерологічний ген або гени, бажано під транскрипційним контролем поксівірусного елементу, який контролює експресію. Як пояснено вище, плазмідний вектор також містить послідовності, які здатні направляти включення екзогенної послідовності в обрану частину поксівірусного генома. В якості варіанту, плазмідний вектор також містить касету, яка містить маркер і/або ген відбору, який функціонально зв'язаний з поксівірусним промотором. Підходящий маркер або гени відбору є, наприклад, генами, які кодують зелений флуоресцентний білок, В-галактозидазу, неоміцин-фосфорибозилтрансферазу або інші маркери. Застосування відбору або касети маркерів спрощує ідентифікацію і виділення виробленого рекомбінантного поксівірусу. Проте, рекомбінантний поксівірус також може бути визначений за допомогою методу ПЛР. Надалі, додаткові клітини можуть бути інфіковані рекомбінантним поксівирусом, який отриманий як описано вище, і трансфіковані другим вектором, який містить другий чужорідний або гетерологічний ген або гени. У разі, якщо цей ген вводиться в різні інсерційні сайти поксівірусного генома, другий вектор також відрізняється в поксівірус-гомологічних послідовностях, які направляють вбудовування другого чужорідного гена або генів у геном поксівірусу. Після того як відбулась гомологічна рекомбінація, може бути виділений рекомбінантний вірус, який містить два або більше чужорідних або гетерологічних гена. Для введення додаткових чужорідних генів у рекомбінантний вірус, етапи зараження і трансфекції можуть бути повторені за допомогою рекомбінантного вірусу, який був виділений на попередніх етапах, для зараження, і за допомогою додаткового вектора, що містить додатковий чужорідний ген або гени, для трансфекції.
В альтернативному варіанті, етапи зараження і трансфекції як описано вище, є рівнозначними, тобто, відповідна клітинна лінія може спочатку бути трансфікована плазмідним вектором, який містить чужорідний ген і, потім, заражена поксівірусом. У додатковому альтернативному варіанті, також можливо ввести кожний чужорідний ген у різні віруси, заразити клітину спільно усіма отриманими рекомбінантними вірусами, провести пошук рекомбінантних
Зо варіантів, які містять всі чужорідні гени. Третій альтернативний варіант являє собою лігування
ДНК генома і чужорідної послідовності іп міго, і реконструювання рекомбінованого вірусного
ДНК генома вірусу коров'ячої віспи, застосовуючи допоміжний вірус. Четвертий альтернативний варіант являє собою гомологічну рекомбінацію в Е. соїї або іншому виді бактерій, між геномом вірусу коров'ячої віспи, який був клонований як бактеріальна штучна хромосома (ВАС), і лінійною чужорідною послідовністю, яка фланкована послідовностями ДНК, що гомологічні послідовностями, які фланкують бажані сайти вбудовування в геномі вірусу коров'ячої віспи.
Експресія гетерологічних філовірусних генів
Гетерологічна нуклеотидна послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного білка може експресуватись як єдина транскрипційна одиниця. Наприклад, гетерологічна нуклеотидна послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного білка, може бути функціонально зв'язана з поксівірусом, наприклад, з промотором вірусу коров'ячої віспи і/або пов'язана з поксівірусом, наприклад, термінатором транскрипції вірусу коров'ячої віспи.
В деяких варіантах реалізації винаходу, ""транскрипційна одиниця" вставляється самостійно в інсерційний сайт ММА/ЕРМ генома. В деяких варіантах реалізації винаходу, "транскрипційна одиниця" вставляється разом з іншою одиницею транскрипцією в інсерційний сайт ММА/ЕРМ генома. "Транскрипційна одиниця" не зустрічається в природі (тобто є гетерологічною, екзогенною або чужорідною) в ММА/ЕРУ геномі, і здатна до транскрипції в заражених клітинах.
Бажано, рекомбінантний ММА/ЕРУ містить 1, 2, 3, 4, 5, або більше транскрипційних одиниць, які вставлені у ММА/РРМ геном. В деяких варіантах реалізації винаходу, рекомбінантний
ММА/ЕРМ стабільно екрпресує гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенні детермінанти філовірусного білка, який кодується 1, 2, 3, 4, 5, або більше транскрипційними одиницями. В деяких варіантах реалізації винаходу, рекомбінантний ММА/ЕРМ містить 2, 3, 4, 5 або більше транскрипційних одиниці, які вставлені у ММА/ЕРМ геном в 1, 2, З або більше інсерційних сайтів в ММА/ЕРМ геномі.
В деяких варіантах реалізації винаходу, експресія одного, кількох або всіх гетерологічних нуклеотидних послідовностей, які кодують антигенні детермінанти філовірусного білка, знаходиться під контролем одного або більше поксівірусного промотору. В деяких варіантах реалізації винаходу, поксівірусний промотор є Рі7.5 промотором, гібридом раннього/пізнього промотору, Рі5 промотор, Рг55Е промотором, синтетичним або природнім раннім або пізнім бо промотором, або АТІ промотором з вірусу коров'ячої віспи. Підходящі промотори додатково описані в УМО 2010/060632, УМО 2010/102822, УМО 2013/189611 і УМО 2014/063832, які включені в цей документ шляхом посилання. В деяких варіантах реалізації винаходу, поксівірусний промотор обраний із групи, яка складається з: Рг5 промотору (ЗЕО ІЮ МО:23), РгББЕ промотору (ЗЕО ІЮ МО:24), Рг7.5 (5ЕБЕО ІЮО МО:25), РІ'ЕЇ промотору (ЗЕО ІЮ МО:27), Рі13.5 довгого промотору (ЗЕО ІЮ МО:35) і ЕРУ-40К промотору (ЗЕО ІО МО:26); більш бажано, вибраний з групи, яка складається з: Різ промотору (ЗЕО ІЮ МО:23), РІББЕ промотору (5ЕО ІЮО МО:24),
Рг7.5 (ЗЕО ІЮО МО:25) і РІЇ Е1 промотору (ЗЕО ІЮ МО:27).
В деяких варіантах реалізації винаходу, нуклеотидна послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного білка, бажано ЕВОМ, БЕВОМ, ЕВОУ-Саї, МАКМ їі МР-2ЕВОМ білка, більш бажано СР-7ЕВОМ-Мауіпда, СР-БЕВОМ-Сши, СР-МАЕМ їі МР-2ЕВОМ, більш бажано срР-
МАНВМУ-МизоКе або сР-МАНУ-Аподоїа, знаходиться під контролем промотору, який вибраний з групи, що складається з Рі5, РІЇЕ1 і Рі7.5. У бажаному варіанті реалізації винаходу, нуклеотидна послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного білка СР-5БЕВОМ і
СР-МАВУ-Мизхоке, експресується під контролем Рг5 промотора (наприклад, 5ЕО ІО МО:23), МР-
ЕВОМ-Саії експресується під контролем РІіЕї або модифікованого РгЕї промотора (наприклад, ЗЕО ІЮ МО:27 і ЗЕО ІО МО:32), і СР-2ЕВОМ-Мауїіпда експресується під контролем
Ріг7.5 промотора (наприклад, 5ЕО ІЮ МО:25).
В іншому бажаному варіанті реалізації винаходу, нуклеотидна послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного білка ЕРМ будь-якого з варіантів реалізації винаходу, знаходиться під контролем промотору, бажано містить або має 5ЕО ІО МО:26.
Філовірусні вакцини і фармацевтичні композиції
Оскільки рекомбінантні віруси ММА, які описані в цьому документі, є дуже обмеженими в реплікації, і таким чином, сильно ослаблені, вони є ідеальними кандидатами для лікування широкого кола ссавців, включаючи людей, і навіть людей з ослабленим імунітетом. Отже, в цьому документі запропоновано фармацевтичні композиції та вакцини для індукції імунної відповіді в живому організмі тварини, включаючи людину. Додатково запропоновано рекомбінантний вектор ММА, який містить нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну для застосування в лікуванні і/або профілактиці викликаного філовірусом захворювання.
Зо Вакцина бажано містить будь-який рекомбінантний вірус ММА, який описаний у цьому документі, і приготовлена у вигляді розчину в діапазоні концентрацій від 107 до 109 ІДКТ5о/мл, від 105 до 5 х 108 ІДКТ5о/мл, від 105 до 108 ІДКТ5во/мл, або від 107 до 108 ІДКТео/мл. Бажана доза для вакцинації для людини становить від 1094 до 109 ІДКТ»5о, в тому числі доза 105 ІДКТ»о, 107
ІДКТ»о, або 108 ІДКТ о.
Фармацевтичні композиції, які запропоновані в цьому документі, можуть, як правило, включати один або більше фармацевтично-прийнятних і/або схвалених носіїв, добавок, антибіотиків, консервантів, ад'ювантів, розріджувачів і/або стабілізаторів. Такими допоміжними речовинами можуть бути: вода, фізіологічний розчин, гліцерин, етанол, зволожуючі або емульгуючі агенти, рН буферні речовини, або тому подібне. Підходящі носії зазвичай є великими молекулами які повільно метаболізуються, такими як білки, полісахариди, полімолочні кислоти, полігліколеві кислоти, полімерні амінокислоти, сополімери амінокислот, ліпідні агрегати, або тому подібне.
Для приготування вакцин, рекомбінантні віруси ММА, які запропоновані в цьому документі, можуть бути перетворені в фізіологічно прийнятну форму. Це може бути зроблено на основі досвіду у підготовці поксівірусних вакцин, які застосовуються для вакцинації проти віспи, як описано Н. 5ІсКІ еї аІ., Оі5сп. тей. УуУзсепг. 99:2386-2392 (1974).
Наприклад, очищені віруси можуть зберігатися при температурі -80 "С з титром 5 х 108
ІДКТоо/мл, приготовані близько в 10 мМ Трис, 140 мМ Масі ії рН 7,4. Для приготування доз вакцини, наприклад, 102-109 або 102-107 частинок вірусу можуть бути ліофілізовані в 100 мл фосфатно-сольового буферного розчину (ФСБР) в присутності 2 95 пептону і 1 95 альбуміну людини, в ампулі, бажано у скляній ампулі. В якості варіанту, дози вакцини можуть бути приготовані за допомогою поетапної ліофілізації вірусу в лікарський препарат. Цей лікарський препарат може містити додаткові добавки, такі як маніт, декстрин, цукор, гліцин, лактозу або полівінілпіролідон, або інші засоби, такі як антиоксиданти або інертний газ, стабілізатори або рекомбінантні білки (наприклад, сироватковий альбумін людини), які підходять для іп мімо введення. Потім скляна ампула герметизується і може зберігатися при температурі від 4" С до кімнатної температурі протягом декількох місяців. Проте, поки немає необхідності, ампулу зберігають бажано при температурах нижче -2096.
Для вакцинації або терапії, ліофілізат може бути розчинений у водному розчині, бажано 60 фізіологічному розчині або Трис-буфері, і введений або системно, або локально, тобто парентерально, підшкірно, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, інтраназально, або будь-яким іншим відомим шляхом введення, який є відомим досвідченому практикуючому лікарю. Режим введення, доза і кількість введень можуть бути оптимізовані фахівцями в даній області техніки відомим способом. Проте, найчастіше пацієнт вакцинується другою дозою вакцини близько впродовж від одного місяця до шести тижнів після першої вакцинації.
Комбіновані вакцини застосовуючи гомологічні/гетерологічні примуючі-бустуючі режими
Комбіновані вакцини і способи, які описані в цьому документі, можуть також використовуватися як частина гомологічного примуючого-бустуючого режиму. У гомологічному примуючому-бустуючому режимі, проводиться перша примуюча вакцинація за якою проводиться одна чи більше наступних бустуючих вакцинацій. Бустуючі вакцинації конфігурують для того, щоб підсилити імунну відповідь, яка створена при першій вакцинації, шляхом введення того ж рекомбінантного поксівірусу, який був використаний в першій вакцинації.
В одному типовому варіанті реалізації винаходу, може бути використаний гомологічний примуючий-бустуючий режим, при цьому вірусний вектор ММА, як визначено в цьому документі, вводитися в першій дозі. Може бути виконано одне або більше наступних введення вірусного
ММА вектора, як визначено в цьому документі, щоб підсилити імунну відповідь, викликану при першому введенні. Бажано, одна або більше антигенних детермінант є такими ж або схожими на ті, що і при першому введенні.
ММА і ЕРМ рекомбінантні вірусні вектори, відповідно до цього винаходу, також можуть бути застосовані в гетерологічних примуючих-бустуючих режимах, в яких одна або більше початкових вакцинацій примування виконуються за допомогою вектора ММА або ЕРМ, як визначено в цьому документі, і одна або більше наступних вакцинацій бустування виконується поксівірусним вектором, який не був застосований в вакцинаціях примування, наприклад, якщо вектор ММА, як визначено у цьому документі, надається в примуючому-бустуючому режимі, то наступні вакцинації бустування будуть проводиться векторами ЕРМУ і навпаки.
У бажаному варіанті реалізації винаходу, примуюча вакцинація виконується вектором ММА, а повторна вакцинація вектором ЕРМ. Як варіант, один з аспектів винаходу пов'язаний з комбінованою вакциною, яка містить: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який
Зо містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок щонайменше одного філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора на основі вірусу віспи курей, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому перші композиції є композицією для примування, а інша композиція є композицією для бустування, бажано, при цьому композиція для бустування містить дві або більше доз вектора композиції для бустування.
Вакцини та набори, які містять рекомбінантні ММА і ЕРМ віруси
Також в цьому документі запропоновані вакцини і набори, які містять будь-який один чи більше рекомбінантних ЕРУ і/або ММА, які описані у цьому документі. Набір може містити один або безліч контейнерів або флаконів рекомбінантного ММА або ЕРУ, разом з інструкціями для введення рекомбінантного ММА і ЕРМ суб'єкту, який підлягає ризику зараження філовірусом. В деяких варіантах реалізації винаходу, суб'єкт є людиною. В деяких варіантах реалізації винаходу, в інструкції вказують, що рекомбінантний ММА вводять суб'єкту у вигляді однієї дози або декількох (наприклад, 2, 3, 4 і т. д.) доз. В деяких варіантах реалізації винаходу, в інструкції вказується, що рекомбінантний вірус ММА або ЕРМ вводять при першому (примування) і другому (бустування) введенні зараженим або незараженим суб'єктам. Бажано, набір містить щонайменше дві ампули для примуючої-бустуючої імунізації, що містять рекомбінантні ММА, як описано в цьому документі, для першої інокуляції ("примуюча інокуляція") в першій ампулі/контейнері, і для щонайменше другої і/або третьої і/або додаткової інокуляції ("бустуюча інокуляція") в другій і/або додатковій ампулі/контейнері.
У бажаному варіанті реалізації винаходу, вакцини та набори, які запропоновані в цьому документі, містять першу композицію, яка містить вектор ММА, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок другого філовірусного субтипу, третього філовірусного субтипу, або щонайменше чотирьох підвидів філовірусів.
У бажаному варіанті реалізації винаходу, вакцини та набори, які запропоновані в цьому документі, містять вектор ММА у першій композиції, яка містить нуклеїнову кислоту, що кодує антигенний білок, який вибраний з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮ МО:4, 5ЕО І
МО:6, ЗЕО І МО: 20, БЕО ІЮ МО:29, 5ЕО ІЮО МО:31, ЗЕО ІО МО:34 і ЗЕО ІЮ МО:37. бо У додатковому варіанті реалізації винаходу, вакцини та набори, які запропоновані в цьому документі, містять вектор ММА у першій композиції, яка містить нуклеїнову кислоту, що кодує антигенний білок, який вибраний з групи, яка має: 5ЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮО МО:4, 5ЕО ІЮО МО:6,
ЗЕО І МО:20, 5ЕО І МО:29 і 5ЕО ІЮ МО:31, бажано, містить нуклеїнову кислоту, що кодує антигенний білок, який вибраний з групи, яка має: ЗЕО ІЮ МО:б6, 5ЕО ІОЮО МО:20, 5ЕО ІЮО МО:29 і
ЗБОЮ МО:З1.
У додатковому варіанті реалізації винаходу, вакцини та набори, які запропоновані в цьому документі, містять першу композицію, яка містить вектор ММА, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок щонайменше чотирьох філовірусних підвидів, бажано, при цьому чотири різні філовірусні субтипи вибираються з групи, що має: 5ЕО ІЮ МО:2, 5ЗЕО ІЮ МО:4, 5ЗЕО
ІО МО:6б, 5ЕО ІЮ МО: 20, БЕО ІЮ МО:29, 5ЕО ІО МО:31, 5ЕО ІО МО:34 і БЕО ІЮО МО:37.
У додатковому варіанті реалізації винаходу, вакцини та набори, які запропоновані в цьому документі, призначені для застосування у створенні захисної імунної відповіді проти щонайменше одного філовірусного субтипу, при цьому перша композиція застосовується для примування згаданої імунної відповіді, а друга композиція застосовується для бустування згаданої імунної відповіді, або для застосування у створенні захисної імунної відповіді проти щонайменше одного філовірусного субтипу, при цьому друга композиція застосовується для примування згаданої імунної відповіді, а перша композиція застосовується для бустування згаданої імунної відповіді. У будь-якій вакцині, і будь-якому наборі, які запропоновані в цьому документі, бустуюча композиція може містити дві або більше дози вектора бустуючої композиції.
Як обговорювалося раніше вище, цей винахід також пов'язаний з гетерологічними режимами вакцинації із застосуванням двох різних вірусних векторів, які не реплікуються.
Для гетерологічних режимів вакцинації, у цьому винаході запропонована комбінована вакцина і/або набір для вакцинації, яка(ий) містить: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенні білюи щонайменше двох філовірусних субтипів, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора на основі вірусу віспи курей, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм;
Зо при цьому одна з композицій є композицію для примування, а друга композиція є композицією для бустування.
У цьому винаході також запропонована комбінована вакцина і/або набір для вакцинації, яка(ий) містить: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок щонайменше двох філовірусних субтипів, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; і б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому одна з композицій є композицію для примування, а друга композиція є композицією для бустування.
В цьому варіанті реалізації винаходу, суміщені вакцини і/або набори містять щонайменше дві ампули для примуючої-бустуючої імунізації, що містять рекомбінантні ММА/ЕРУ, як описано в цьому документі, для першої інокуляції ("примуюча інокуляція") в першій ампулі/контейнері, і для щонайменше другої і/або третьої і/або додаткової інокуляції ("бустуюча інокуляція") в другій і/або додатковій ампулі/контейнері.
Комбінована вакцина і/або набір може містити кілька контейнерів або флаконів рекомбінантного ММА/ЕРМ, разом з інструкціями для введення рекомбінантного ММА/ЕРМ суб'єкту, який підлягає ризику зараження філовірусом. В деяких варіантах реалізації винаходу, суб'єкт є людиною. В деяких варіантах реалізації винаходу, в інструкції вказується, що рекомбінантний ММА/ЕРУ вводять суб'єкту у вигляді однієї дози або декількох (наприклад, 2, 3, 4 і т. д.) доз. В деяких варіантах реалізації винаходу, в інструкції вказується, що рекомбінантний вірус ММА/ЕРМ вводять при першому (примування) і другому (бустування) введенні зараженим або незараженим суб'єктам.
Перша і/або друга композиція або ММА і/або ЕРМ будь-якої поєднаної вакцини, набору для вакцинації і/або гетерологічних програм вакцинації за винаходом, може містити будь-який з ММА іабо ЕРМ векторів, які описані в цьому документі, або, як більш докладно описано в розділі "Рекомбінантні ММА і ЕРУ", і будь-яку їх комбінацію.
У бажаному варіанті реалізації винаходу, поєднані вакцини, які запропоновані в цьому бо документі, містять першу композицію, яка містить вектор ММА, що містить нуклеїнову кислоту,
яка кодує антигенний білок другого філовірусного субтипу, антигенну детермінанту третього філовірусного субтипу, антигенну детермінанту чотирьох філовірусних субтипів або антигенну детермінанту щонайменше чотирьох філовірусних субтипів.
В іншому варіанті реалізації винаходу, поєднані вакцини, які запропоновані в цьому документі, містять філовірусний субтип з вірусу Ебола (ЕВОМ) або вірус Марбург (МАЕМ).
В іншому варіанті реалізації винаходу, поєднані вакцини, які запропоновані в цьому документі, містять антигенну детермінанту з одного або більше ЕВОМ субтипу, який вибраний з групи, що складається з: Ероїа міги5 7аїге (2ХЕВОМ), Ебоїа мігиз Зидап (ЗЕВОМ), Ероїа міги5 Соїє аїмоїге (ЕВОУ-Сайї), Ебоїа міги5 Кевіоп (КЕВОМ) і Ебоїа мігиз Випаіридуо (ВЕВОМ).
В іншому варіанті реалізації винаходу, поєднані вакцини, які запропоновані в цьому документі, містять антигенну детермінанту філовірусного білка, який вибраний з групи, що складається з глікопротеїну оболонки (СР), нуклеопротеїну (МР), білка 35 віріона (МР35), білка 40 віріона (МР40), білка 30 віріона (МРЗО), білка 24 віріона (МР24), і білка РНК-залежної РНК- полімерази (|).
У додатковому варіанті реалізації винаходу, поєднані вакцини, які запропоновані в цьому документі, містять вектор ММА у першій композиції, яка містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок, який вибраний з групи, що складається з: БЗЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮ МО:4, 5ЕО ІЮ
МО:6б, 5ЕО 1Ю МО: 20, 5ЕО ІЮ МО:29, 5ЕО ІЮО МО:31, 5ЕО ІЮ МО:34 і 5ЕО ІЮ МО:37.
У додатковому варіанті реалізації винаходу, поєднані вакцини, які запропоновані в цьому документі, містять першу композицію, яка містить вектор ММА, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок щонайменше чотирьох філовірусних субтипів, бажано, при цьому чотири різних філовірусних субтипи вибираються з групи, що має: 5ЕО ІЮ МО:2, 5ЗЕО ІЮ МО:4,
ЗЕО ІЮ МО:6, ЗЕО ІЮ МО: 20, ЗЕО ІЮ МО:29, 5БЕО ІЮО МО:31, ЗЕО ІЮ МО:34 і ЗЕО ІЮ МО:37.
У бажаному варіанті реалізації винаходу, поєднані вакцини, які запропоновані в цьому документі, містять першу композицію, яка містить вектор ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенні білки з чотирьох різних філовірусних субтипів, які вибрані з групи, що має:
ЗЕО ІЮ МО:6, ЗЕО ІЮ МО:20, ЗЕО ІЮ МО:29 і ЗЕО ІЮ МО:31.
В іншому варіанті реалізації винаходу, поєднані вакцини, які запропоновані в цьому документі, застосовуються для створення захисної імунної відповіді проти щонайменше одного
Зо філовірусного субтипу, бажано щонайменше двох, більш бажано, щонайменше, чотирьох філовірусних субтипів.
В іншому варіанті реалізації цього винаходу, цей винахід пов'язаний з поєднаною вакциною або рекомбінантним ММА будь-якого з варіантів реалізації винаходу, для застосування в якості лікарського засобу або вакцини для створення захисної імунної відповіді, або для виклику 35 посиленої імунної відповіді проти щонайменше одного філовірусного субтипу, щонайменше двох філовірусних субтипів, щонайменше трьох або щонайменше чотирьох філовірусних субтипів, при цьому ММА здатний виробляти філовірус-подібні частинки в суб'єкті, який лікують, бажано, при цьому ММА виробляє філовірус-подібні частинки в суб'єкті, який лікують.
Способи і застосування рекомбінантних ММА/ЕРМ вірусів 40 Також, в цьому документі запропоновано способи і/або будь-які рекомбінантні ММА/ЕРМ, як описано в цьому документі, для застосування в способі імунізації тваринного суб'єкта або способах які впливають на імунну відповідь у суб'єкті. Крім того, розглядаються наступні види застосування рекомбінантних ММА/ ЕРУ, як описано в цьому документі, для приготування ліків або лікарського засобу, що застосовуються для імунізації тваринного суб'єкта, зокрема для 45 приготування лікарського засобу або вакцини для лікування і/або для запобігання викликаного філовірусом захворювання суб'єкта. Також запропоновано рекомбінантний ММА/ЕРМ у відповідності з будь-яким варіантом реалізації цього винаходу, для застосування в примуванні або бустуванні імунної відповіді проти філовірусу, бажано, при цьому рекомбінантний ММА і/або рекомбінантний ЕРМ вводять один раз, два рази, три рази або чотири рази. 50 Додатково у цьому документі розглядаються наступні види застосування комбінацій вакцин або рекомбінантного ММА по будь-якому з варіантів реалізації винаходу, для застосування в якості лікарського засобу або вакцини для індукції посиленої імунної відповіді проти філовірусной інфекції, при цьому ММА здатний виробляти філовірус-подібні частинки в суб'єкті, який лікують, бажано, при цьому, ММА виробляє філовірус-подібні частинки в суб'єкті, який 55 лікують. Також, у цьому документі розглядаються наступні види застосування комбінацій вакцин або рекомбінантного ММА по будь-якому з варіантів реалізації винаходу, застосування для лікування або профілактики філовірусної інфекції, при цьому ММА здатний виробляти філовірус- подібні частинки в суб'єкті, який лікують, бажано, при цьому, ММА виробляє філовірус-подібні частинки в суб'єкті, який лікують. бо Відповідно, в одному варіанті реалізації цього винаходу, в цьому винаході запропоновано спосіб виклику імунної відповіді проти філовірусу у суб'єкта, що включає стадію, в якій суб'єкту вводять: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенні білюи щонайменше двох філовірусних субтипів, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора на основі вірусу віспи курей, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому одна з композицій є композицію для примування, а друга композиція є композицією для бустування.
В іншому варіанті реалізації винаходу, у винаході запропоновано спосіб виклику імунної відповіді проти філовірусу у суб'єкта, що включає стадію, в якій суб'єкту вводять: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенні білюи щонайменше двох філовірусних субтипів, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; і б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому одна з композицій є композицію для примування, а друга композиція є композицією для бустування.
В іншому варіанті реалізації винаходу, в цьому документі описані: спосіб виклику імунної відповіді проти філовірусу, застосування рекомбінантних ММА/ЕРМ для приготування лікарського засобу та імунізації тваринного суб'єкта, зокрема, для приготування лікарського засобу або вакцини для лікування і/або профілактики викликаного філовірусом захворювання у суб'єкта, або поєднана вакцина за будь-яким із варіантів реалізації винаходу, для застосування у забезпеченні захисної імунної відповіді проти філовірусної інфекції, як запропоновано в цьому документі, яка містить першу композицію, яка містить вектор ММА, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок другого філовірусного субтипу, третього філовірусного субтипу або щонайменше чотирьох філовірусних субтипів.
Зо В іншому варіанті реалізації винаходу, в цьому документі описані: спосіб виклику імунної відповіді проти філовірусу, застосування рекомбінантних ММА/ЕРМ для приготування лікарського засобу та імунізації тваринного суб'єкта, зокрема, для приготування лікарського засобу або вакцини для лікування і/або профілактики викликаного філовірусом захворювання у суб'єкта, або поєднана вакцина за будь-яким з варіантів реалізації винаходу, для застосування у забезпеченні захисної імунної відповіді проти філовірусної інфекції, як запропоновано в цьому документі, яка містить першу композицію, яка містить вектор ММА у першій композиції, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок обраний із групи, що складається з: БЕО
ІО МО2, 5ЕО І МОС4, 5ЕО 10 МО:б, 5ЕО ІЮ МО: 20, 5ЕО ІЮ МО:29, 5ЕО ІЮО МО:З31, 5ЕО І
МО:34 і 5ЕО ІО МО:37.
В додатковому варіанті реалізації винаходу, в цьому документі описані: спосіб виклику імунної відповіді проти філовірусу, застосування рекомбінантних ММА/ЕРМ для приготування лікарського засобу та імунізації тваринного суб'єкта, зокрема, для приготування лікарського засобу або вакцини для лікування і/або профілактики викликаного філовірусом захворювання у суб'єкта, або поєднана вакцина за будь-яким з варіантів реалізації винаходу, для застосування у забезпеченні захисної імунної відповіді проти філовірусної інфекції, як запропоновано в цьому документі, яка містить першу композицію, яка містить вектор ММА, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок щоайменше чотирьох філовірусних субтипів, при цьому чотири різні філовірусні субтипи вибрані з групи, що складається з: БЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІЮ МО:4,
ЗЕО ІЮ МО:б, БЕО ІЮ МО: 20, БЕО ІЮО МО:29, 5ЕО ІЮО МО:31, 5ЕО ІЮО МО:34 і БЕО ІЮО МО:37.
В іншому варіанті реалізації в цьому винаході запропоновано спосіб забезпечення захисного імунітету і/або захисної імунної відповіді проти філовірусної інфекції в суб'єкті. В іншому варіанті реалізації, у винаході запропоновано спосіб забезпечення захисного імунітету і/або захисної імунної відповіді проти філовірусної інфекції у суб'єкта, що включає стадію в якій суб'єкту вводять: а) першу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ММА, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенні білюи щонайменше двох філовірусних субтипів, бажано, щонайменше трьох, або щонайменше чотирьох різних філовірусних субтипів, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; б) другу композицію, яка містить імунологічно-ефективну кількість вектора ЕРМ, який містить бо нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок першого філовірусного субтипу, разом з фармацевтично-прийнятним носієм; при цьому перша з композицій є композицією для примування, а друга композиція є композицією для бустування, бажано, при цьому друга композиція є композицією для бустування, бажано для введення один раз, два рази, три рази або чотири рази.
В іншому варіанті реалізації винаходу, спосіб, який забезпечує захисний імунітет і/або захисну імунну відповідь проти філовірусної інфекції за будь-яким з варіантів реалізації винаходу, включає вектор ММА у першій композиції, яка містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок, який вибраний з групи, що складається з: БЗЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮ МО:4, 5ЕО ІЮ
МО:6б, 5ЕО 1Ю МО: 20, 5ЕО ІЮ МО:29, 5ЕО ІЮО МО:31, 5ЕО ІЮ МО:34 і 5ЕО ІЮ МО:37.
В іншому варіанті реалізації винаходу, спосіб, який забезпечує захисний імунітет і/або захисну імунну відповідь проти філовірусної інфекції по будь-якому з варіантів реалізації винаходу, включає вектор ММА у першій композиції, яка містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антигенний білок з чотирьох різних філовірусних субтипів, який має: 5ЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮ МО:4,
ЗЕО ІЮ МО:6, ЗЕО ІЮ МО: 20, ЗЕО ІЮ МО:29, 5БЕО ІЮО МО:31, ЗЕО ІЮ МО:34 і ЗЕО ІЮ МО:37.
В іншому варіанті реалізації в цьому винаході запропоновано спосіб продукування філовірус-подібних частинок або спосіб виклику посиленої імунної відповіді проти філовірусу у суб'єкта, спосіб, що включає вироблення філовірус-подібних частинок у суб'єкта по кожному з варіантів реалізації винаходу, при цьому філовірусний МР40 обраний із групи, що складається з:
Еброїа мігив 7аїге (7ХЕВОМ), Ебоїа міги Зидап (ЗЕВОМ), Ебоїа мігив Соїе амоїге (ЕВОМ-Саї), Ероїа міги5 Кебіоп (КЕВОМ) і Ероїа мігиз Випаіїридуо (ВЕВОМ), бажано, при цьому філовірусний МР40 вибирають з групи з одного або більше ЕВОМ, БЕВОМ, МАКМ.
В іншому варіанті реалізації в цьому винаході запропоновано спосіб продукування філовірус-подібних частинок або спосіб виклику посиленої імунної відповіді проти філовірусу у суб'єкта, спосіб, що включає вироблення філовірус-подібних частинок у суб'єкта за будь-яким із варіантів реалізації винаходу, при цьому філовірусний глікопротеїн і філовірусний МР40 вибрані з того ж філовірусного штаму.
В іншому варіанті реалізації в цьому винаході запропоновано спосіб продукування філовірус-подібних частинок або спосіб виклику посиленої імунної відповіді проти філовірусу у суб'єкта, спосіб, що включає продукування філовірус-подібних частинок у суб'єкта за будь-яким
Зо із варіантів реалізації винаходу, при цьому вектор ММА додатково містить нуклеїнову кислоту, яка кодує філовірусний нуклеопротеїн (МР), бажано при цьому філовірусний нуклеопротеїн і філовірусний МР40 отримані з того ж самого філовірусного штаму.
В іншому бажаному варіанті реалізації винаходу, філовірусний штам за будь-яким з вище перерахованих способів вибирають з групи 7аіге-Мауїіпда, 7аїге-Кікм/ї, 7аіге-Ссароп, Ебоїа міги5
Соїве а'моїге, Зидап-Вопітасе, Зидап-Маїєо, Зидап-Сим, Магригуд-Намп, Магбигуд-Огоїїп, Магбиго-
Ваїаусгак, Магбиг9-МизоКе, Магбиг9д-Апдоїа, вірусів 7аіге-Мауіпда і Ероїа міги5 Соїє а моїге, бажано при цьому філовірусний МР40 обраний із групи 7аіге-Мауіпда або Магригд-Мизоке, більш бажано філовірусний УР40 містить нуклеїнову кислоту, яка кодує білкову послідовність
ЗЕО ІЮ МО:34, або при цьому нуклеїнова кислота, яка кодує антигенний білок філовірусного
МРАО містить БЕО ІО МО:33.
Як використовується тут, термін "захисний імунітет" або "захисна імунна відповідь" означає, що вакцинований суб'єкт здатний контролювати інфекцію збудника, проти якого було зроблено щеплення. Як правило, суб'єкт який має вироблену "захисну імунну відповідь" демонструє лише від легких до помірних клінічних симптомів, або взагалі жодних симптомів. Як правило, суб'єкт який має "захисну імунну відповідь" або "захисний імунітет" проти якогось збудника не вмирає в результаті інфікування зазначеним збудником. В деяких варіантах реалізації винаходу, тваринний суб'єкт є ссавцем. Ссавець може бути дорослою коровою, телям, зокрема ювенільним телям, пацюком, кроликом, свинею, мишею, але бажано людиною, і спосіб включає введення суб'єкту дози будь-якого одного або більше рекомбінантних ММА/ЕРУ, які запропоновані у цьому документі.
В деяких варіантах реалізації винаходу, суб'єкт є людиною. В деяких варіантах реалізації винаходу, суб'єкт є дорослою людиною. В деяких варіантах реалізації винаходу, доросла людина є дорослою людиною з ослабленим імунітетом. В деяких варіантах реалізації винаходу, доросла людина має вік 10, 15, 20, 25, 30, 25, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, або 85 років. В деяких варіантах реалізації винаходу, вік суб'єкта становить менш ніж 5 років, менш ніж З роки, менш ніж 2 роки, менш ніж 15 місяців, менше ніж 12 місяців, менше ніж 9 місяців, менш ніж б місяців, або менш ніж З місяці. В деяких варіантах реалізації винаходу, вік суб'єкта становить від
О до З місяців, від З до 6 місяців, від 6 до 9 місяців, від 9 до 12 місяців, до 1 до 2 років, або від 2 до 5 років. бо Будь-який з рекомбінантних ММА/ЕРУ, які запропоновані у цьому документі, можуть бути введені суб'єкту в дозі від 109 до 1079 ІДКТ5о, бажано від 105 до 109 ІДКТ»о як, наприклад, у дозі вді 105 до 109 ІДКТ»о, від 1096 до 5х108 ІДКТ»о, від 107 до 108 ІДКТ»:о, від 5 х 107 ІДКТео в 5 х 108
ІДКТво, 107 ІДКТео або 108 ІДКТео. В деяких варіантах реалізації винаходу, рекомбінантний
ММА/ЕРМ вектор вводять у кількості 1 х 108 ІДКТ5о або 1 х 1019 ІДКТео. В іншому варіанті реалізації винаходу, рекомбінантний ММА/ЕРУ вводять у кількості від 1 х 108 ІДКТ»о до 5 х 109, бажано в кількості від 5 х 108 ІДКТ»о до 6 х 103. В деяких варіантах реалізації винаходу, будь- який з рекомбінантних ММА, які запропоновані у цьому документі, вводять людському суб'єкту в дозі 107 ІДКТоо або 108 ІДКТ»о або 5 х 109 ІДКТ»о. В деяких варіантах реалізації винаходу, будь- який з рекомбінантних ЕРУ, які запропоновані у цьому документі, вводять людському суб'єкту в дозі 5 х 108, 6,3 х 108 або 1 х 109 ІДКТ»о.
В іншому варіанті реалізації винаходу, рекомбінантні ММА, які запропоновані в цьому документі, вводять людському суб'єкту в дозі нижче, ніж рекомбінантні ЕРМ. У деяких варіантах реалізації винаходу, будь-який з рекомбінантних МУА/ЕРУ, які запропоновані у цьому документі, вводять суб'єкту в дозах, які передбачені у цьому документі, перед зараженням філовірусом, як, наприклад, 1, 2, 3, або 4 тижні або 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, або 12 місяців перед зараженням філовірусом. В деяких варіантах реалізації винаходу, будь-який з рекомбінантних
ММА/ЕРУ, які запропоновані у цьому документі, вводять суб'єкту в дозах, які запропоновані у цьому документі, після зараженням філовірусом, як, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, або 24 години або 1, 2, 3, 4, 5, 6, або 7 днів після зараження філовірусом.
В деяких варіантах реалізації винаходу, рекомбінантні ММА/ЕРУ, які запропоновані в цьому документі, вводять суб'єкту у вигляді однієї дози або у вигляді декількох (наприклад, 2, 3, 4 і т. д.) доз. В деяких варіантах реалізації винаходу, рекомбінантні ММА/ЕРУ, які запропоновані в цьому документі, вводять при першому (примування) і другому (бустування) введеннях. Перша доза може становити від 107 до 108 ІДКТео рекомбінантного ММА/ЕРМ вірусу, а друга доза може становити від 107 до 108 ІДКТ«ео рекомбінантного ММА/ЕРМ вірусу.
Композицію для бустування, як правило, вводять один або кілька разів, тижні або місяці після введення композиції для примування, наприклад, через 1 або 2 тижні, або З тижні, або 4 тижні, або 6 тижнів, або 8 тижнів, або 16 тижнів, або 20 тижнів, або 24 тижні, або 28 тижнів, або
Зо 32 тижні, один або два роки.
Бажано, початкову бустуюче щеплення роблять впродовж 1-12 тижнів, 2-12 тижнів після примуючого введення, більш бажано 1, 2, 4 або 8 тижнів після примуючого введення. У бажаному варіанті реалізації винаходу, первісну бустуючу інокуляцію роблять 4 або 8 тижнів після примуючого введення. У додаткових бажаних варіантах реалізації винаходу, початкове бустування проводять щонайменше 2 тижнів або, щонайменше 4 тижні після примуючого введення. У ще одному варіанті реалізації винаходу, початкове бустування проводять впродовж 4-12 тижнів або впродовж 4-8 тижнів після примуючого введення.
Рекомбінантні МУА/ЕРУ, які запропоновані в цьому документі, можна вводити системно або місцево. В деяких варіантах реалізації винаходу, рекомбінантні ММА/ЕРМ вводять парентерально, підшкірно, внутрішньовенно, внутрішньом'язово або інтраназально, зокрема підшкірно. Бажано, рекомбінантні ММА/ЕРМ вводять інтраназально. В інших варіантах реалізації винаходу, рекомбінантні ММА/ЕРМ вводяться будь-яким іншим шляхом введення, який є відомим досвідченому лікарю. У додатковому варіанті реалізації винаходу, рекомбінантний
ММА/РРМ вводять внутрішньом'язово, бажано рекомбінантний ММА/ЕРМ вводять внутрішньом'язово в об'ємі, що перебуває в діапазоні від близько 100 мкл до 10 мл, бажано який містить концентрації, наприклад, близько від 107 до 10192 вірусних частинок/мл. Бажано, рекомбінантний ММА/ЕРУ вектор вводять в об'ємі, який знаходяться в діапазоні від 0,25 до 1,0 мл. Більш бажано, рекомбінантний ММА/ЕРМ вектор вводять в об'ємі близько 0,5 мл.
Спосіб отримання рекомбінантного ММА/ЕРМ вектора
Додаткові варіанти реалізації винаходу включають спосіб отримання рекомбінантного вектора ММА за будь-яким з варіантів реалізації винаходу чи антигенної детермінанти, яка експресована з генома зазначеного рекомбінантного вектора ММА, що включає в себе етапи, в яких: а) інфікують клітину-господаря рекомбінантним вірусом ММА за будь-яким з варіантів реалізації винаходу або трансфікують клітину рекомбінантною ДНК рекомбінантного вірусу ММА за будь-яким з варіантів реалізації винаходу, бажано з додаванням допоміжного вірусу для виробництва вірусних частинок ММА, б) культивують інфіковану або трансфіковану клітину, і в) ізолюють вірус ММА і/або антигенну детермінанту з вказаної клітини. бо В іншому варіанті реалізації винаходу, винахід пов'язаний з рекомбінантним вірусом ММА і/або антигенною детермінантою, які отримані за способом створення рекомбінантного вектора.
Додаткові варіанти реалізації винаходу включають спосіб отримання рекомбінантного вектора ЕРМ за будь-яким з варіантів реалізації винаходу, або антигенної детермінанти, яка експресована з генома зазначеного рекомбінантного вектора ЕРУ, що включає етапи, в яких: а) інфікують клітину-господаря рекомбінантним вірусом ЕРМ за будь-яким з варіантів реалізації винаходу або трансфікують клітину рекомбінантною ДНК рекомбінантного вірусу ЕРМ за будь-яким з варіантів реалізації винаходу, бажано з додаванням допоміжного вірусу для виробництва вірусних частинок ЕРМ, б) культивують інфіковану або трансфіковану клітину, і в) ізолюють ЕРМУ вірус і/або антигенну детермінанту з вказаної клітини.
В іншому варіанті реалізації винаходу, винахід пов'язаний з рекомбінантним ЕРМ вірусом і/або антигенною детермінантою, які отримані за способом створення рекомбінантного вектора.
В іншому варіанті реалізації винаходу, винахід пов'язаний із способом отримання рекомбінантного вектора ММА, що включає етапи, в яких: а) інфікують клітину-господаря вірусом ММА, б) трансфікують інфіковану клітину рекомбінантним вектором, який містить щонайменше одну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту будь-якого з філовірусних білків; зазначена нуклеотидна послідовність додатково містить геномну послідовність вірусу
ММА, здатна направляти вбудовування щонайменше однієї нуклеотидної послідовності в геном вірусу ММА, і в) ідентифікують, ізолюють і при необхідності очищують створений рекомбінантний вірус
ММА.
В іншому варіанті реалізації винаходу, винахід пов'язаний зі способом отримання рекомбінантного вектора ЕРУ, що включає етапи, в яких: а) інфікують клітину-господаря вірусом ЕРМ, б) трансфікують інфіковану клітину рекомбінантним вектором, який містить щонайменше одну нуклеотидну послідовність, яка кодує антигенну детермінанту будь-якого з філовірусних білків; зазначена нуклеотидна послідовність додатково містить геномну послідовність вірусу
ЕРМ, здатна направляти вбудовування щонайменше однієї нуклеотидної послідовності в геном
Зо вірусу ЕРМ, і в) ідентифікують, ізолюють і при необхідності очищують створений рекомбінантний вірус
ЕРУ.
Інші варіанти реалізації винаходу будуть очевидні для фахівців в даній області при розгляді специфікації та практичній реалізації винаходу, як описано у цьому документі. Передбачається, що специфікація та приклади будуть розглядатися тільки як ілюстративні, при цьому справжній обсяг і суть винаходу вказуються у Формулі винаходу.
ПРИКЛАДИ
Детальні приклади, які слідують далі, призначені для сприяння кращому розумінню цього винаходу. Проте винахід не обмежується прикладами. Інші варіанти реалізації винаходу будуть очевидні для фахівців в цій області при розгляді специфікації та практичній реалізації винаходу, які описані у цьому документі.
Приклад 1: Конструювання рекомбінантного ММА
У наступних розділах описані конструкції рекомбінантних ММА, які містять одну або більше гетерологічних нуклеїнових кислот, що експресують антигенну детермінанту філовірусного глікопротеїну оболонки і/або додаткового філовірусного білка. Всі інші конструкції, які описані в цьому документі, створені з використанням аналогічних способів.
Конструювання ММА-тВМ2528В (Рг5-Я4Р-МАНУ-Мизоке)
Повнорозмірна ДНК послідовність гена СР-МАНУ-МизоКе природного походження (ізолят
І аКке Місюгіа) слугувала еталонною послідовністю для конструювання вакцини-кандидата МАМ
ММА-тпвМ252В. Нуклеотидна послідовність, яка кодує повнорозмірний СР-МАНУ-МизоКе була синтезована в Сепеагй АС (Регенсбург, Німеччина) з використанням кодонів, які були оптимізовані для експресії в організмі людини, і для того, щоб звести до мінімуму або запобігти внутрішнім подіям гомологічної рекомбінації. Хоча кодонова оптимізація змінила послідовність
ДНК дикого типу, кодон-оптимізована послідовність кодує амінокислотну послідовність, яка ідентична послідовності дикого типу ЗР-МАВМ-МизоКе (ЗЕО ІЮ МО:6; номер доступу МСВІ-
АВАВ87127.1). Експресія ЗР-МАНМ-МизоКе керується за допомогою опромотору Рг5, синтетичного промотору, розробленого на основі ранніх і пізніх елементів промоторів вірусу вісповакцини (ЗЕО ІО МО:23; див. також 5. Спакгабагнії еї аї.,, "Сотрасі, зупіпеїйїс Массіпіа Міги5
ЕапуЛаїє Рготоїєї їог Ргоївїп Ехргевзвіоп", ВіоТесппідиез 23(6):1094-1097 (1997)). Кодон- 60 оптимізований ген СР-МАНМ-МизоКе був вбудований в геном ММА-ВМ за допомогою стандартних способів (див. нижче), застосовуючи одну з декількох адаптованих рекомбінантних плазмід, які націлені на різні певні області генома ММА-ВМ, в тому числі і на сайти делецій або міжгенні (некодуючі) області (ІК).
Для того щоб вбудувати кодон-оптимізований ген ЗР-МАНМ-МизоКе в геном ММА-ВМ, клітини курячих ембріональних фібробластів (клітини КЕФ) були інфіковані ММА-ВМ і згодом трансфіковані рекомбінаційною плазмідою рвмМ433 (Фігм. 5А). рВМ433 містив кодон- оптимізований ген СР-МАНМ-МизоКе (5ЕБО 10 МО:5 (ДНК) що кодує 5ЕБО ІЮ МО:6 (амінокислотна)) під контролем синтетичного Різ промотору, вбудованого за допомогою
В5рЕЇ/МНеї рестрикції в плазміду РВМХ 197 (Фіг. 4Б). РВМ433 плазміда містить послідовності ДНК
ММА-ВМ, які фланкують ЗК 148/149 в геномі ММА-ВМ, і селекційну касету, яка фланкована сайтами ІохР, які дозволяють наступне видалення касети за допомогою СВЕ рекомбіназо- опосередкованої рекомбінації. Після гомологічної рекомбінації між фланкуючими послідовностями в плазміді та гомологічними послідовностями в потрібному інсерційному сайті в геномі ММА-ВМ (тобто ІК 148/149), кодуюча частина плазміди була вбудована в потрібний сайт в геномі ММА-ВМ.
Після ампліфікації та клонування за допомогою методу бляшкоутворення (дев'ять пасажів; три з них включали клонування за допомогою методу бляшкоутворення) за селективних умов (мікофенолова кислота/ксантин і гіпоксантин), був отриманий рекомбінантний ММА-ВМ продукт, позначений як ММА-пВМ252А (РгеМаєхіег А), що містить ген СОР-МАВНМ-МизокКе. Рекомбінантний
ММА-тпвМ252А РгеМасєхіег вихідний вірус був перевірений на викидання ММА-ВМ (батьківський вірус; дані не показані), на правильність послідовності вбудованого гена разом з інсерційними фланкуючими областями (за допомогою ген-специфічної ПЛР, застосовуючи праймери, специфічні для геномної ММА-ВМ послідовності, в яку був введений чужорідний ген; дані не показані), на відсутність мікроорганізмів (тест на стерильність; дані не показані), та на наявність і правильний розмір вставки (за допомогою секвенування; дані не показані). Також був визначений титр вихідного вірусу ММА-тВМ252А РгеМазвівг.
Наявність селекційної касети у вбудованій послідовності дозволяє виконувати позитивний відбір рекомбінантних вірусів ММА-ВМ в культурі. Щоб створити рекомбінантний ММА-тВМ2528В, селекційна касета була видалена з вихідного вірусу ММА-пВМ252А Ргемаєвієг, застосовуючи
Зо систему СтеЛохР. Щоб видалити селекційну касету, КЕФ клітини, інфіковані рекомбінантним
ММУА-ВМ, що містить вставку плазміди рВМ433 (наприклад, ЗОР-МАНУ-Мизоке під контролем Рго промотору, а також селекційна касета, яка фланкована ІохР сайтами) були додатково трансфіковані за допомогою рвВМ274, плазмідою експресії, яка кодує СКЕ рекомбіназу (фіг. 4В).
Сайт-специфічна Сте-рекомбіназа каталізує точне вирізання послідовностей ДНК селекційної касети, яка фланкована цільовою послідовністю ІохР, повністю видаляючи селекційну касету.
Одержаний вірус був клонований за допомогою методу бляшкоутворення, при не селективних умовах (двадцять сім пасажів, дев'ять з них включали клонування за допомогою методу бляшкоутворення), та був виділений рекомбінантний вірус ММА-тпВМ252В, позбавлений селекційної касети. Повне видалення селекційної касети було підтверджено за допомогою "вкладеної" ПЛР (дані не показані). В результаті, експресія СОР-МАНМУМ-МизоКе за допомогою рекомбінантного ММА-7ВМ2528 була підтверджена за допомогою ПЛР із зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР; дані не показані).
Конструювання ММА-пвВМ2268 (Мульти-антиген ММА-РІЇО)
Для всіх трансгенів, які були експресовані ММА-тВМ2268В, повнорозмірні ДНК послідовності генів природного походження служили еталонними послідовностями. Ці були синтезовані в
Сепеай АС (Регенсбург, Німеччина) з використанням кодонів, які були оптимізовані для експресії в організмі людини, і для того, щоб звести до мінімуму або запобігти внутрішнім подіям гомологічної рекомбінації. Оптимізація кодонів змінила послідовність ДНК дикого типу без зміни амінокислотної послідовності. ММА-пВМ2268 містить такі філовірусні гени: ОР-5БЕВОМ (5ЕО ІО
МО:30); МР-ЕВОМ-Саї (ЗЕО І МО:28); аР-2ЕВОМ, штам Мауїпда (СР-2ЕВОМУ-Мауїіпда, ЗЕО Ір
МО:19) і ОР-МАВМ-МизоКе (5ЕО ІЮ МО:5). аР-ЗЕВОМ і СР-МАНУ-МизоКе експресуються під контролем РгЗ промотору (ЗЕО ІЮ МО:23), МР-ЕВОУ-Саї експресується під контролем Рг Е1 або модифікованого РІЕЇ1 промотору (ЗЕО ІЮ МО:27 і 5ЕО ІЮО МО:32), і ОР-7ЕВОМУ-Мауїіпда експресується під контролем Рг7.5 промотору (ЗЕО ІЮО МО:25).
Промотор Рг5 є синтетичним промотором, який був розроблений на основі ранніх і пізніх елементів Массіпіа міги5 промоторів, який забезпечує експресію трансгену під час ранньої та пізньої фаз експресії генів. Аналогічним чином, Рг7.5 промотор з 7,5 кДа гена вірусу коров'ячої віспи є сильним раннім і пізнім промотором, і це означає, що трансгени під його контролем також будуть експресуватись під час ранньої та пізньої фаз експресії генів (ЗЕО ІЮ МО:25; див. 60 також М. А. Соспгап еї аї., "п міго тшадепезів ої те рготоїег гедіоп їог а массіпіа міги5 депе:
емідепсе ог їапдет єапу апа Іаїе гедшіайогу 5ідпаї!5", у). Мігої. 54(1):30-37 (1985)). Промотор Рг Е1 є штучним промотором, що складається з промотору вірусного включення А-типу вірусу коров'ячої віспи (АТІ), злитого з п'ятьма оптимізованими ранніми елементами, які отримані з
Рг7.5 (ЗЕО ІО МО:27; див. також К. Вашиг еї аї., "Іттеаїіафе-Еапу Ехргезвзіоп ої а Несотрбіпапі
Апіідеп ру Модіїїєдй Массіпіа Мігив АпКага ВгєаКв Ше Іттиподотіпапсе ої 5ігопуд Месіог-Зресіїіс
ВВА Апіїдеп іп Асше апа Метогу СО8 Т-Сеї! Везропзев", У. Міго!. 84(17):8743-8752 (2010)). Отже,
МР-ЕВОМУ-Саї буде експресуватись під час ранньої та пізньої фаз експресії. Крім того, було показано, що Рг Еї викликає особливо сильну, клітинно-опосередковану імунну відповідь. При пассажуванні ММА-тВМ2268, був втрачений один з п'яти ранніх елементів, які були отримані з
Рг7.5, ймовірно, в результаті гомологічної рекомбінації; аналіз показав достатній рівень експресії МР-ЕВОУ-Саї, проте (не показано), змінена конструкція була використана без заміни модифікованого промотору РІ Е1.
Для вставки чужорідних генів у геном ММА-ВМ, було створено кілька рекомбінаційних плазмід, які націлені на різні області видалення і міжгенні області (ІК) генома ММА-ВМ. Для створення рекомбінантних ММА-ВМ продуктів, чужорідні послідовності інтересу можуть бути вбудовані в будь-який з цих базових векторів, наприклад, РВМХ186 націлений на ІС. 88/89 (див.
Фіг. 4А) або рВМХ197 націлений на ІСК 148/149 (див. Фіг. 4Б), застосовуючи широко доступні ферменти рестрикції і звичайні методи молекулярної біології. Щоб отримати рекомбінантні ізоляти ММА-ВМ, які експресують потрібні трансгени, КЕФ клітини потім інфікували за допомогою ММА-ВМ, ії потім трансфікували однією або кількома рекомбінаційними плазмідами, які експресують потрібний трансген або трансгени, і в тому числі селекційну касету, яка дозволяє проводити позитивний відбір рекомбінантних вірусів. В ході гомологічної рекомбінації, плазмідні фланкуючі послідовності рекомбінують з гомологічними послідовностями інсерційного сайту у вірусному геномі ММА-ВМ. Це введе до вбудовування плазмідних послідовностей в сайт, на який націлений базовий вектор, що застосований в якості вихідного матеріалу (наприклад,
ІС 148/149, ІС. 88/89 і т. д-) в геном ММА-ВМ. рВМХ197 націлена на ІСЕ 148/149 (Фіг. 4Б) і була застосована як початкова плазміда для конструювання остаточної рекомбінаційної плазміди рРВМЗ384 (Фіг. 5Б). Плазміда рВМ384 експресує ОР-7ЕВОМ-Мауїпда і СР-МАВУ-Мизоке. рВМХ 186 націлена на ІК 88/89 (фіг. 4А) і була застосована як початкова плазміда для
Зо конструювання остаточної рекомбінаційної плазміди рВМ385 (ФігМ. 58). Плазміда рвМ385 експресує ОР-БЕВОМ і МР-ЕВОУ-СаЇ.
Щоб вбудувати трансгени СР-БЕВОМ, МР-ЕВОМУ-СаЇ, сР-7ЕВОМ-Мауіпда, і сР-МАВУ-
МизоКе в ММА-ВМ, КЕФ клітини були інфіковані ММА-ВМ і згодом трансфіковані рекомбінаційними плазмідами рвМ384 і рВМ385. Після ампліфікації та клонування за допомогою методу бляшкоутворення (десять пасажів; три з них включали клонування за допомогою методу бляшкоутворення) при подвійних селективних умовах (мікофенолова кислота/ксантин і гіпоксантин також як і Сепеїісіп), був отриманий рекомбінантний ММА-ВМ продукт, позначений як ММАтВМ226А (Іпіегіт Ргетазвіег), що містить гени трьох глікопротеїнів, один нуклеопротеїн і дві селекційні касети. Рекомбінантний ММА-тВМ226А Ргемазвіег вихідний вірус був перевірений на викидання ММА-ВМ (батьківський вірус; дані не показані), на правильність послідовності вбудованого гена разом з інсерційними фланкуючими областями (за допомогою ген- специфічної ПЛР, застосовуючи праймери, які є специфічними для геномної ММА-ВМ послідовності, в яку був введений чужорідний ген; дані не показані), на відсутність мікроорганізмів (тест на стерильність; дані не показані), та на наявність і правильний розмір вставок (за допомогою секвенування; дані не показані). Також був визначений титр вихідного вірусу ММА-тВМ252А РгеМавіег.
Після додаткової ампліфікації, видалення селекційної касети та клонування за допомогою методу бляшкоутворення при неселективних умовах (двадцять пасажів, шість з них включали клонування за допомогою методу бляшкоутворення), був виділений рекомбінантний вірус ММА - твВМ2268, позбавлений селекційних касет. Повне усунення селекційних касет було підтверджено за допомогою "вкладеної" ПЛР (дані не показані). В результаті, експресія трансгену за допомогою рекомбінантного ММА-тВМ2268В була підтверджена за допомогою ПЛР із зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР; дані не показані).
Конструювання ММА-пВМ254А (ММА-СР-2ЕВОМ)
Для ОР-2ЕВОМ трансгена, який був експресований з ММА-пВМ254А, повнорозмірна ДНК послідовність гена природного походження слугувала в якості еталонної послідовності. срР- 2ЕВОМ були синтезовані в Сепеагі АС (Регенсбург, Німеччина) з використанням кодонів, які були оптимізовані для експресії в організмі людини, і для того, щоб звести до мінімуму або запобігти внутрішнім подіям гомологічної рекомбінації, як описано вище у "Конструювання ММА- 60 твМ2268". Оптимізація кодонів змінила послідовність ДНК дикого типу без зміни амінокислотної послідовності. ЗР-27ЕВОМ-Мауіпда експресувався під контролем РгіЗ5Е промотору (ЗЕО ІЮ
МО:24).
РгЗ5Е (5ЕО ІЮ МО:24) є штучним сильним раннім і пізнім промотором, який був розроблений на основі штучного раннього і пізнього промотору (Спакгабагії еї аї!., 1997) після якого йдуть 5 ранніх елементів Рі7.5 промотору з 7,5 кДа гена вірусу вісповакцини (ЗЕО ІО МО:25; див. також
М.А. Соспгап евї аї., "п міго тиїадепевів ої Ше рготоїег гедіоп гог а массіпіа міги5 депе: емідепсе ог тапдет єапу апа Іаїє геашаїйогу в5ідпа!вє", У. МігоІЇ. 54(1):30-37 (1985)). РіІББЕ промотор описаний більш детально в патентній заявці М/О 2013/189611А1.
Для вбудовування чужорідних генів у геном ММА-ВМ, було створено кілька рекомбінаційних плазмід, які націлені на різні області видалення і міжгенні області (ІК) генома ММА-ВМ. Для створення рекомбінантних ММА-ВМ продуктів, чужорідні послідовності інтересу можуть бути вбудовані в будь-який з цих базових векторів, наприклад, РВМХ197 націлений на ІК 148/149 (див. Фіг. 4Б), застосовуючи широко доступні ферменти рестрикції і звичайні методи молекулярної біології. Щоб отримати рекомбінантні ізоляти ММА-ВМ, які експресують потрібні трансгени, КЕФ клітини потім інфікували за допомогою ММА-ВМ, і потім трансфікували однією або кількома рекомбінаційними плазмідами, які експресують потрібний трансген або трансгени, і в тому числі селекційну касету, яка дозволяє проводити позитивний відбір рекомбінантних вірусів. В ході гомологічної рекомбінації, плазмідні фланкуючі послідовності рекомбінують з гомологічними послідовностями інсерційного сайту у вірусному геномі ММА-ВМ. Це введе до вбудовування цільових послідовностей в сайт, на який націлений базовий вектор, що був застосований в якості вихідного матеріалу (наприклад, ІК 148/149), в геном ММА-ВМ. рвМхХ197 націлена на ІС 148/149 (фіг. 4Б) і була застосована як початкова плазміда для конструювання остаточної рекомбінаційної плазміди рВМ436 (Фіг. 5Г). Плазміда рВМ436 містить СР-2ЕВОМ-
Мауїіпда.
Щоб вбудувати трансген СР-7ЕВОМ-Мауїіпда в ММА-ВМ, КЕФ клітини були інфіковані ММА-
ВМ, і згодом трансфіковані рекомбінаційною плазмідою рвВМ436 (Фіг. 5Г). Після ампліфікації та клонування за допомогою методу бляшкоутворення (дев'ять пасажів; включаючи три з клонуванням за допомогою методу бляшкоутворення) при селективних умовах (мікофенолова кислота/ксантин і гіпоксантин), був отриманий рекомбінантний ММА-ВМ продукт, позначений як
Зо ММА-тпвВМ254А (Ргетавіег), що містить ген СОР-ЛЕВОМУ-Мауїпда і злитий ген ОРТ-ЕЕР, в якості маркера селекції (Фіг. ЗВ). Рекомбінантний. ММА-птВМ254А РгемМабхіег вихідний вірус був перевірений на видалення ММА-ВМ (батьківський вірус; дані не показані), на правильність послідовності вставленого гена разом з інсерційними фланкуючими областями (за допомогою ген-специфічної ПЛР, застосовуючи праймери, специфічні для геномної послідовності ММА-ВМ, в яку був введений чужорідний ген; дані не показані), на відсутність мікроорганізмів (тест на стерильність; дані не показані), та на наявність і правильний розмір вставок (за допомогою секвенування; дані не показані). Також був визначений титр вихідного вірусу ММА-тВМ254А
Ргемазвіег. В результаті, експресія трансгену рекомбінантним ММА-пВМ254А була підтверджена за допомогою ПЛР із зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР; дані не показані).
Інші конструкції були створені відповідним способом. Зокрема, ММА-тВМ255 експресував
МР-ЕВОМ-СЇ (ЗЕО ІЮ МО:28) під контролем Рг5 промотору, що був вбудований в ІК 88/99,
МРА0О 7ЕВОМ (5ЕО І МО:33) під контролем Рг5 промотору в ОК 136/137 і СР-2ЕВОМ (5ЕО І
МО:19) під контролем Рг55Е промотору в ІК 148/149 (Фіг. 13).
Конструювання ЕРУ-тВМЗ68А (ЕРМ-СР-2ЕВОМ) і ЕРМ-тВМ391 (ЕРМ-тиі-Но)
Для ОР-2ЕВОМ трансгену, який був експресований з ЕРУ-птВМЗ368А, повнорозмірна ДНК послідовність гена природного походження слугувала в якості еталонної послідовності. Ген срР- 2ЕВОМ були синтезовано в Сепеагі АС (Регенсбург, Німеччина) з використанням кодонів, які були оптимізовані для експресії в організмі людини, як описано вище у "Конструювання ММА- твМ2268". Оптимізація кодонів змінила послідовність ДНК дикого типу без зміни амінокислотної послідовності. ЗР-27ЕВОМ-Мауіпда експресувався під контролем промотору ЕРМ-4ОК (5ЕО І
МО:26). ЕРУ-40К промотор є послідовністю промотору ЕРМ-кодуючої послідовності 40К білка в
ЕРУ.
Для вбудовування чужорідних генів у геном ЕРМ, було створено кілька рекомбінаційних плазмід, які націлені на різні сайти вбудовування генома ЕРМ. Для створення рекомбінантних
ЕРМ продуктів, чужорідні послідовності інтересу можуть бути вбудовані в будь-який з цих базових векторів, наприклад, РВМХ221 націлений на інсерційний сайт Ватні . (див. Фіг. 4Г), застосовуючи широко доступні ферменти рестрикції і звичайні методи молекулярної біології.
Щоб отримати рекомбінантні ЕРМ ізоляти, які експресують потрібні трансгени, КЕФ клітини потім інфікували ЕРМ, і потім трансфікували однією або кількома рекомбінаційними плазмідами, які бо експресують потрібний трансген або трансгени, і в тому числі селекційні касети, що дозволяють проводити позитивний відбір рекомбінантних вірусів. В ході гомологічної рекомбінації, плазмідні фланкуючі послідовності рекомбінують з гомологічними послідовностями інсерційного сайту в
ЕРМ вірусному геномі. Це введе до вбудовування цільових послідовностей в сайт, на який націлений базовий вектор, який був застосований в якості вихідного матеріалу (наприклад, інсерційний сайт Ватні у), в геномі ЕРУ. рВМхХ221 націлена на інсерціний сайт Ватні . (Фіг. 4Г) і була застосована як початкова плазміда для конструювання остаточної рекомбінаційної плазміди рВМ555 (Фіг. 5Д). Плазміда рВМ555 містить СР-27ЕВОМ-Мауїпда під контролем ЕРУ- 40К промотору.
Щоб вбудувати трансген ЗР-2ЕВОМ-Мауіпда в ЕРМ, КЕФ клітини були інфіковані ЕРМУ, і згодом трансфіковані рекомбінаційною плазмідою рВМ555 (Фіг. 5Д). Після ампліфікації та клонування за допомогою методу бляшкоутворення (тринадцять пасажів; включаючи чотири з клонуванням за допомогою методу бляшкоутворення) при селективних умовах (мікофенолова кислота/ксантин і гіпоксантин), був отриманий рекомбінантний ММА-ВМ продукт, позначений як
ЕРУ-"ВМЗ68А (Ргетавіег), що містить ген СОР-7ЕВОМ-Мауїпда і злитий ген СРТ-КЕР, в якості маркера селекції (Фіг. ЗГ). Рекомбінантний ЕРМ-тптВМЗ3б8А РгемМавхіег вихідний вірус був перевірений на видалення ЕРМ (батьківський вірус; дані не показані), на правильність послідовності вбудованого гена разом з інсерційними фланкуючими областями (за допомогою ген-специфічної ПЛР, застосовуючи праймери, які є специфічними для геномної ЕРМ послідовності, в яку був введений чужорідний ген; дані не показані), на відсутність мікроорганізмів (тест на стерильність; дані не показані), та на наявність і правильний розмір вставок ЕРМ (за допомогою секвенування; дані не показані). Також був визначений титр вихідного вірусу ЕРМ-ТВМЗ368А РгеМаєвхіег. В результаті, експресія трансгену рекомбінантним
ЕРМУ-"тТВМЗ368А була підтверджена за допомогою ПЛР із зворотною транскрипцією (ВІД-ПЛР; дані не показані).
Додатково віспи курей конструкції були створені застосовуючи ЕР14 (ІС 60/61) і Ватні У області для вбудовування згідно способу, як описано вище. ЕРМ-тптВМ391 експресувала Ор- 2ЕВОМ (ЗЕО ІО МО:19 ії 20) під контролем ЕРУ-40К промотору (ЗЕО ІЮ МО:26), СР-МАВУ-
МизоКе (5ЕО ІЮ МО:5 і 6) під контролем Рг5 промотору (ЗЕО ІЮО МО:23), обидва в ЕР'114 сайті, і
СР-МАВМУ-Апдоїа (ЗЕО ІЮ МО:36 і 37) під контролем Рг13.5 довгого промотору (5ЕО ІЮ МО':35),
СР-ЗЕВОМ (5ЕО ІЮ МО:30 ї 31) під контролем ЕРУ-40К промотору та МР-ЕВОУ-Са! (ЗЕО І
МО:28 і 29) під контролем Рі Е1 промотору (ЗЕО ІЮО МО:27), всі три були вбудовані в Ватні У область у порядку згадування.
Приклад 2: ММА-ВМ-РйЙо (ММА-тВМ2268) у нижчих приматів
Імуногенність і захисна ефективність ММА-ВМ-БРЙо (ММА-птВМ226В) була проаналізована в моделі зараження яванських макак вірусами Ебола і Марбург. Мавп розмістили і годували згідно з відповідними інституційними рекомендаціями з догляду і годівлі лабораторних тварин.
Дизайн експерименту наведено в Таблиці 1 нижче.
Таблиця 1:
Протокол вакцинації для ММА-ВМ-РІіЇо в яванських макак.
Вірус для зараження 010000 тестуваннялунсипротокюлувводення РО одя
Розмір . Доза на Шлях Розклад . Розклад
Група Групи Вакцинація кожне введення (Дні) Вірус (День) введення 1 БО фе ово 1 БО фе оно
Внутрішньом'язове введення (1,000 ри) або штаму 7аіге ЕВОМ або штаму МизоКе МАКУ; всі тварини які вижили підлягали евтаназії в День 63.
ОС'єм дози становив 0,5 мл для групи контролю і групи вакцинації, всі щеплення були виконані шляхом підшкірних ін'єкцій. Перший день вакцинації позначений як День 0. Всі тварини отримали дозу збудника від 1,000 ріш 2ЕВОМ (Групи 1 і 3) або МАКМ-Мизхоке (Групи 2 і 4) за допомогою внутрішньом'язової ін'єкції в День 42. Всі тварини які вижили підлягали евтаназії в
День 63. сіР-специфічні антитіла були виміряні методом імуноферментного аналізу. Як і очікувалося, невакциновані контрольні тварини, що були заражені МАКМ-МизоКе, не мали СР-МАВУ- специфічних антитіл при перевірці в будь-який час до зараження (тобто, в День 0, День 28 та 36 (дані не показані) і захворіли. В той же час, дві з трьох тварин, які були вакциновані ММА-ВМ-Р Йо (номери тварин 30766 і 30768) мали низький ОР-МАКМУ титр антитіл через 28 днів після першого щеплення (після першого щеплення; див. також Фіг. б), і кожна з трьох вакцинованих тварин продемонструвала явну посилену імунну відповідь через вісім днів після другого щеплення (після бустерної вакцинації; див. Фіг. 6). Всі три тварини пережили в іншому випадку летальне внутрішньом'язове зараження МАКМ-Мизоке.
Аналогічним чином, невакциновані контрольні тварини, які були заражені 7ЕВОМ, були негативними за СР-7ЕВОМ-специфічним антитілам, в усіх часових точках тестування (дані не показані). Контрольна тварина, також як і вакциновані тварини, захворіла, після зараження 2ЕВОМ за допомогою внутрішньом'язової ін'єкції. Дивно, але всі три вакциновані тварини, продукували СР-2ЕВОМ-специфічні антитіла перед зараженням, на рівнях, більших за величиною, ніж ті, які були виміряні в гіперімунній сироватці, які були продуковані в нижчих приматів при вакцинації ЛЕВОМ-ОР. Були виконані повні розтини, тканину розміщували в 10 95 нейтральному забуференому формаліні в момент смерті. Зрізи тканин були оброблені за допомогою стандартних методів, зрізи були виконані товщиною 5 мкм, і пофарбовані гематоксиліном та еозином для гістологічного дослідження. Результати узагальнені у Таблиці 2 нижче.
Таблиця 2
Гістологічна оцінка вакцинованих і контрольних тварин.
Експериментальна
Печнкїд////// ЇЇ 717 Г171117Г111171С11111711111171С1111171їс11 множинні закнятчни! 1111111 некроз Ї я | - Її - | - | Ж | - | - 1 - сваскулї//////// ЇЇ ж | - 1 - | -н ЇЇ - 111-11-11
Леєгегні////// ЇЇ Г171117Г111171111117111111711111171сг11 внутрішньо- ше 1111 набряк осептальнийнабрякї ж | - | - | - | ж | я | є | - крововилив | ж | - | - | - | жж | я | - | - інтерстиціальний ве | 71111
Селезінка: ЇЇ ЇЇ 77111111 сіперплазя./ | - | яю | -- | я- | - 1 - | - 1 - шенні 12 1 оо : . . ж ж ж я ж лімфоїдної тканини відкладення в ни . я ж ж ни ж червоній пульпі селезінки ше ШО 2 1 1 О | 1 тр . ж ж ж ни ж васкуліт ше ПО вузли:
шек І-І 151 1313111 макрофагів питні 1 2 1 3 1 ор : . . ж ж я ж лімфоїдної тканини ше 1111 вузли: шеж | 12:31:31: 11151 макрофагів дише 5 1 2 1 2 1 о 1111 : . . я ж ж ж ни лімфоїдної тканини
Шини! 12310310 1 3111 - лімфатичні вузли: шк | 12:31:31: 11151 макрофагів ння я 1 2 1 1 : . . ж ж ж ж ни лімфоїдної тканини
Наднисниїу/////Ї1Ї771117Г11111Ї1111Ї11111111Г некроз. | - ЇЇ - | - 1 - | ян | - | - | - " васкуліт у тварин 30766 і 30768, мабуть, вже був в наявності. У - піддані евтаназії; СС - спонтанна смерть
Аналіз підтвердив типові симптоми геморагічної лихоманки в МАКМ-МизокКе-інфікованих, невакцинованих контрольних тварин, а також у всіх ЛЕВОМ-заражених тварин, у той час як вакциновані тварини, які були заражені МАКМУ-МизоКе, продемонстрували кілька гістологічних змін, за винятком селезінкової гіперплазії яка узгоджується з імунною відповіддю після зараження і В-клітинною гіперплазією.
Результати експерименту представлені на Фіг. 7. Фіг. 7А ілюструє, що вакцинація за допомогою ММА-ВМ-Нію захищала 100 95 тварин від зараження МАКМ-Мизоке. Фіг. 7Б ілюструє клінічні показники після зараження; вакциновані тварини, заражені МАКМ-МизоКе, не продемонстрували жодних симптомів або гістологічних змін, які пов'язані з геморагічною лихоманкою, і не містили вірус в печінці, селезінці, наднирниках, лімфатичних вузлах або легенях.
Приклад 3: ММА-ВМ-НРІЇю в нижчих приматах
У цьому експерименті тестували ММА-ВМ-Біо на нижчих приматах за аналогічним протоколом дослідження, як описано в Прикладі 2, але зараження проводили іншим штамом вірусу Марбург, тобто Магригд-Апдоїа замість Магригд-Мизоке в Прикладі 2.
Таблиця З
Дизайн дослідження та результати для ММА-ВМ-РІіо в нижчих приматах.
Група М - Зараження Виживання
ІДКТ»5о
І.1551й5пі ІДКТ о Магбигд
СО40І. ІДКТ о 56
ММА-ВМе МАВУ- 1 х 108
Внутрішньом'язове зараження (1,000 рій) штамом МАКМ Апдоїа; тварини які вижили були піддані евтаназії у День 70 Таблиця 3 показує, що ММА-ВМ-РйЙОо повністю захищає нижчих приматів від штаму Апдоїа вірусу Марбург. На відміну від цього, невакциновані тварини в групі 5 захворіли. Це також показує, що захисна ефективність залежить від дози, оскільки доза в 5 разів менша, застосовуючи ММА-ВМ-МАКУ, який також кодує ОР вірусу Марбург, лише частково є захисною, до тих пір, поки він експресує СЮО40Ї як ко-стимулюючу молекулу. Всі щеплені кандидати продукують специфічні антитіла для вектора ММА (Массіпіа специфічні антитіла), а також антитіла, специфічні для МАКМ ОР вставки, як показано в Таблиці 4.
Таблиця 4:
Антитіла, індуковані ММА-ВМ-НРІО в нижчих приматів. . ММА-МАВУ ММА-МАВУ
Приклад 4: Гетерологічне примування/бустування
У цьому експерименті протестували комбінацію рекомбінантного ММА і рекомбінантного ЕРМ в примуючих/бустуючих імунізаціях.
Н-2КеВбСвВА Е1 миші (дапміег арх, Франція) були імунізовані підшкірно (підшкірно) за допомогою 5 х 107 ИДКТ5о ММА-27ЕВОМ-СР (ММА; ММА-тВвМ254А, фіг. ЗВ) або ЕРУ-27ЕВОМУ-аР (ЕРМ; ЕРМтТВМЗб8А, Фіг. ЗГ). Доза вірусу була введена в обидві бічні поверхні живота в загальному об'ємі 100 мкл/сторона.
Для виявлення 2ЕВОМ-СР-специфічних Ідс, 9б-лункові планшети (Корнінг, штат
Массачусетс, США) були покриті ЕВОМ ОР антигеном (ІВТ Віозегмісе5, Меріленд, США) при 4 "С протягом ночі. Дублікати двукратних розведень сироватки були додані у вимиті і блоковані планшети, було застосовано ІдДО-ПХ анти-миша-вівця антитіло (АБО 5егоїес, Великобританія) в якості антитіла виявлення. Субстрат ТМВ був доданий на 30 хвилин при кімнатній температурі, і реакцію зупиняли додаванням 1М розчину Нае5О». Абсорбцію вимірювали при 450 нм. Мишачі моноклональні антитіла 13Еб були використаний в якості стандарту для розрахунку концентрації ЛЕВОМ-ОР |до в сироватці крові.
Лімфоцити миші були свіжо виділені з селезінки за допомогою обережного подрібнення і продавлювання тканини через 70 мкм клітинне сито (ВО Віозсіеєпсе, Каліфорнія, США). Після лізису еритроцитів, клітини інкубували з 5 мкг/мл 2ЕВОМ-(С1Р577-5в4 пептиду (ТЕ! КТЕ5І) (Сепзогірі, Нью-Джерсі, США) протягом б годин при 37 "С у повному КРМІ в присутності 10 мкг/мл брефелдину А і СО107а-РІТС. Для розпізнавання живого/неживого, клітини фарбували за допомогою 2отріе Адиа"М Ріхаріє Міарійу Кі (ВіоЇєдепа, Каліфорнія, США).
Внутрішньоклітинне фарбування ІФН-у і ФНІ-а проводили після поверхневого фарбування бра-вум605, СОва-ВМ421 (Віої едепа, Каліфорнія, США) і СО44-АРС-еРіног780 (еВізосієпсе,
Каліфорнія, США) і фіксацію/пермеабілізацію згідно інструкцій виробника (ВО Суюойх/Суюрегт,
ВО Віозсіепсев5). Всі клітини були отримані за допомогою цифрової проточної цитометрії (І.А ІЇ,
ВО Віозсіеєпсе5, Каліфорнія, США) і дані були проаналізовані за допомогою програмного
Зо забезпечення Ріомло (Ріомл)о, Орегон, США).
Чотири можливі комбінації рекомбінантних ММА і ЕРМ примуючих/бустуючих імунізацій були протестовані в Н-2КУСВАВб ЕЕ мишах, тому що сильний СО8 Т-клітинний епітоп із штаму глікопротеїну (СР) 7аїге вірусу Ебола (7ЕВОМ) був описаний для цього гапплотипу МНС класу І, а саме ОРБ77-58в4 (ТЕ ВТЕ5І) (Вао єї аї., Массіпе 17(23-24):2991-8 (1999)). Концентрацію в сироватці 2ЕВОМ-С.6Р-специфічних дО аналізували у День 21 і День 41 після підшкірної імунізації в День 0 і 21. У той час як в День 21 всі ММА-імунізовані миші мали надійні титри Ідс, лише 20 95 від ЕРУ-імунізованих мишей мали сероконверсію. Після другої імунізації, всі тварини були серопозитивними за 7ЕВОМ-СР-специфічнийими до. Найбільш низькі титри спостерігалися після гомологічної імунізації за допомогою ЕРМ. Між тваринами, які були імунізовані двічі за допомогою ММА, і тими, які були примовані за допомогою ЕРМ, та які були бустовані за допомогою ММА, не було виявлено жодної різниці в концентрації зР-специфічних Ідс в День 41.
Миші, які були примовані за допомогою ММА, та які були бустовані ЕРМ, проте, мали трохи більш високі титри, ніж всі інші групи в День 41 (Фіг. 8А).
Цікаво, що така ж комбінація, яка призводила до сильної імунної відповіді, також викликала сильну СО8 Т-клітинну відповідь. Знову ж таки, гомологічна імунізація за допомогою ЕРМ призводила до слабкої СТІ відповіді, за якою слідували ММА-ММА і ЕРУ-ММА імунізації.
Примування за допомогою ММА, після якого слідувало бустування за допомогою ЕРМ, індукували « в 5 разів більше цитотоксичних СО8 Т-клітин, ніж при гомологічній комбінації 2 х
ММА (Фіг. 8Б).
Взяті разом, ці дані дають змогу припустити, що гетерологічна імунізація за допомогою першого ММА і другого ЕРМ, викликає найсильнішу 7ЕВОМ-СР-специфічну гуморальну відповідь, а також найсильнішу СТІ відповідь, що продемонстровано присутністю високофункціональних СОВ8 Т-клітин.
Приклад 5: Посилена 2ЕВОМ-ОР специфічна СОВ8 Т-клітинна відповідь
Н-2ККА-СВА миші були імунізовані підшкірно за допомогою 5 х 107 ІДКТ5о ММА або ЕРМ в
День 0 і 21 День. Миші (5 у кожній групі) були принесені в жертву в День 42 для Т-клітинного аналізу шляхом внутрішньоклітинного фарбування цитокінів спленоцитів. Були застосовані такі примуючі/бустуючі режими: 1: ММА-2ЕВОМ-СР. (тВМ25АУЕРУ-2ЕВОМ-СР (тВМ368), 2: ММА- тийі-йо (ММА-пвВМ226уУєРМ-2ЕВОМ-ОР (тВМ368), 3: ММА-2ЕВОМ-СР-МУР4А0 (тВМ255УЕРУ- 7ЕВОМУ-ОР (тВМ368). Дані представлені на Фіг. 9.
Реакції СО8 Т-клітин селезінки були проаналізовані в День 42 після стандартних 6 годин іп міго повторної стимуляції за допомогою 5 мкг/мл 2ЕВОМ-С1Р577-5ва пептиду (ТЕ КЕТЕ5І). у присутності 10 мкг/мл берефелдину А і анти-СО107а-РІТС. Клітини були поверхово пофарбовані за допомогою анти-СО4-8М605, анти-СО8-8М421, СОр44-АРС-еРіІцог780 і внутрішньоклітинно пофарбовані за допомогою анти-ІЕМ-уУ-РЕСу/ і анти-ТМЕ-о-РегСр- еБішог/10. Розпізнавання живий/мертвий було виконано за допомогою ГПІМЕ/ЮЕАЮОФ Ріїхабріє
Ада Оеай Сеї! Зіаїіп Кії згідно інструкції виробника (Гіїте Тесппоіодіе5). Гістограми показують загальну кількість СО107ак, ІНФ-уї та ФНІП-а- СО8 Т клітин. Показано середнє х стандартна помилка середнього по 5 мишей/група. СЮО8 Т-клітинна відповідь проти ХЕВОМ-СР-поХіднОоГгОо пептиду ТЕГЕКТ5ЗІ була посилена приблизно у два рази, коли ММА-ВМ-2ЕВОМ/2Р-МР4А0О був застосований як примуюча конструкція в ММА-ЕРМ гетерологічному примуючому-бустуючому режимі у порівнянні з ММА-27ЕВОМ-СР (тВМ254) або ММА-тийі-йо (ММА-пВМ226) в якості конструкцій для примування (Фіг. 9).
Приклад 6: Посилений захист нижчих приматів проти 2ЕВОМ після вакцинації за допомогою
ММА-СР-МУРАО
Яванські макаки (Масаса їазсісціагі5) були вакциновані двічі (в День 0 і 28) підшкірно дозою 5 х 108 ІДКТєо або ММА-ВМ-2ЕВОМ/ОР (п-3), ММА-ВМ-2ЕВОМ/аР-МР40 (п-3), або отримували
Трис-сольовий буферний розчин (ТОБ) в якості негативного контролю (плацебо група, п-2). До вакцинації і за тиждень до контрольного зараження (Дні 7, 14, 21, 28, 35 ії 40) була зібрана сироватка крові для аналізу за допомогою імуноферментного аналізу, специфічного для
Зо глікопротеїну (СР) Еброїа міги5 гаїге і специфічного для спинно-мозкового ММА. Через чотири тижні після повторної вакцинації, тварини були заражені Ероїа міги5 7аїге (штам КікКм/), за допомогою внутрішньом'язового введення близько 1000 ри.
Таблиця 5:
Дизайн дослідження: о Вакцина | Доза |Розклад(Курс)| Вірус | Розклаяд.йї
ММУА-ВМ- 5 х108 |День 0428 девоу
Кік .
МУдСВМ Бх108 |ДеньоОк28 0 |Близько 7 ТИЖНЯ після 2 7ЕВОМ/АОР- ІДКТео | (підшкірно) 1000 рій останньої 2/3
УР4А0 . вакцинації 0128 внутріш-ньо- (підшкірно) 7аїге Ебоїа міги5 (7ХЕВОМ)-специфічний імуноферментий аналіз
Був виконаний імуноферментий аналіз для визначення ЛЕВОМ/ЗР-специфічних антитіл, які були імобілізовані за допомогою рекомбінантного 2ЕВОМ/ЗР, і детекція виконувалася за допомогою пероксидази хрону (ПХ), кон'югованої з антитілами проти МНР /до. Кількість зв'язаних ПХ-мічених антитіл була порахована після субстратної реакції, в якості значення оптичної густини (ОГ) при 450 нм. Концентрація антитіл була розрахована згідно регресійного аналізу з чотирма параметрами, і на основі стандартної кривої з застосуванням моноклональних антитіл миші.
Результати ІФА представлені на Фіг. 10. Всі тварини які були вакциновані ММА-ВМ- 2ЕВОМ/БР або ММА-ВМ-2ЕВОМ/2Р-МР40 конструктами мали спинномозкові- і 2ЕВОМ- специфічні антитіла, які можна було виявити, вже після примуючої вакцинації, і гуморальні відповіді були підвищені другою вакцинацією.
У другому дослідженні яванські макаки (Масаса їазсісціагіє) були вакциновані тричі (День 0,
28 і 56) підшкірно дозою 5 х 108 ІДКТєо або ММА-ВМ-тийі-Шо (ММА-пвМ226, п-2), ММА-ВМ- 7ЕВОМ/аР-МРА0О (ММА-тпВМ255, п-2), або отримували Трис-сольовий буферний розчин (ТОБ) в якості негативного контролю (плацебо група, п-2). До вакцинації і за тиждень до контрольного зараження (Дні 0, 27, 41, 55, 35, 67) була зібрана сироватка крові для аналізу за допомогою
Ероїа міги5 2аїге глікопротеїн (СР)-специфічного нейтралізуючого аналізу (Фіг. 11). Через чотири тижні після останньої вакцинації, тварини були заражені вірусом Ебоїа міги5 2аїге (штам Кікм/ію, за допомогою внутрішньом'язового введення близько 100 ріи.
Таблиця 6:
Дизайн дослідження:
Зараження контроль Кік 4 тижні
ММА-ВМ-тий-| 5 х108 |День 2 но ІДКТео 0428456 | ОЛИЗЬКО після 0/2 100 ріш останньої
З ВОМС. 5х 107 День внутріш» вакцинації 2/2
МРАО ІДКТво /|0-28-56 ньом'язово
Вакцинація за допомогою /ММА-ВМ-2ЕВОМ/2Р-МР40 привела до продукування нейтралізуючих антитіл, що виявляються відразу ж після вакцинації примування, в той час як
ММА-ВМ-тийі-Яйо не викликав продукування нейтралізуючих антитіл на рівні, який можна виявити, після примування в День 27 (Фіг. 11). Тварини, які були вакциновані ММА-ВМ- 7ЕВОМ/БР-МР40, мали більш високі титри нейтралізуючих антитіл, ніж ММА-ВМ-пийі-Но вакциновані тварини, у всіх часових точках аналізу. Після ЛФЕВОМ зараження ММА-ВІМ-птиі-йНоО захворіли до 7 дня після контрольного зараження, тоді як ММА-ВМ-2ЕВОМ/2Р-МР40 вакциновані тварини вижили без симптомів або тимчасових епізодів лихоманки.
Приклад 7: формування ВПЧ і експресія білків МР40 і СР
Клітини лінії НеГа були інфіковані зазначеними вірусами при МОЇ, який дорівнює 10. Після двох днів інфекції, супернатанти збирали, і потім ВПЧ в очищених супернатантах (СН) були осаджені через 20 96 шар сахарози шляхом ультрацентрифугування (УЦ-СН). Клітинні лізати були приготовлені шляхом прямого лізису клітин в буфері їх Іаетютії. Клітинні лізати розбавляли 1:5 до розділення за допомогою 505-РАСЕ для імуноблотингу. УЦ-СН не розбавляли перед 505-РАСЕ. 72ЕВОМ-СОР було виявлено за допомогою моноклонального антитіла миші (клон 608) з ОБАМНМАИО, і 2ЕВОМ-МР40 було виявлено за допомогою очищеного поліклонального антитіла кролика від ІВТ Віозегмісе5.
Експресія СР і МР40 була підтверджена у свіжих препаратах за допомогою імуноблотингу.
Обидва білки були присутні в клітинних лізатах, а також були збагачені при УЦ-СН (Фіг. 128).
Відомо, що експресії матриксного білка МР40 достатньо для формування ВПУ, і не надходило
Зо інформації про пряму взаємодію білка УР40 і білка СР. Щоб показати, що СР дійсно включений у ВПЧ разом з МР40, ОР був імунопреципітаціяований з СН інфікованих клітин. Для цього, клітини лінії Не а були заражені ММА-7ЕВОМ/аР-МР40, контрольні клітини - ММА-ХЕВОМ/ОР і
ВАС-отримані ММА ум. ВАС-отримані ММА Ул були описані раніше в Меїізіпдег-Непзенеї єї аї (Меїізіпдеї/-Непзснеї еї аї. (2010), У Мікої. 84(19):9907-9919). СН із заражених клітин піддавали імунопреципітації (ІП) за допомогою анти-СР-специфічного антитіла. СН аліквоти були оброблені 1 95 ТиИйоп Х-100 (ТХ-100) впродовж 30 хвилин до імунопреципітації, яка, як було показано раніше, руйнує більшість зрілих упакованих ВПЧ вірусу лейкозу мишей (Оамідої еї аї. (2012), Мігтоіоду 433(2):401-409).
Потім ІП-комплекси були проаналізовані за допомогою імуноблотингу на наявність ОР і ко- осадженого УР40. Для імунопреципітації (ІП), очищені СН інкубували з анти-7ЕВОМ-СР (клон 608, ОБАМКІІЮ) антитілами разом з Ргоївіп С-Адагозе (10 мкл) при 4 "С протягом ночі.
Імуноблоти імунопреципітатів потім інкубували з антитілами до 7ЕВОМ-СР (моноклональне антитіло 608) і 2ЕВОМ-МР40 (ІВТ). ОР білок був ефективно імунопреципітований з супернатанту клітин, що експресують лише ОР (Фіг. 12Г, верхня панель), і експресія не залежить від наявності
МР40. Важливо, УР40 імунопреципітувалось разом з ОР з супернатантів ММА-7ЕВОМ/аР-МР4А0О заражених клітин лише у відсутності ТХ-100 (Фіг. 12Г, нижня панель, лінія 2), вказуючи на те, що
СР дійсно були включені в вірусоподібні частинки. Оскільки передбачається, що ТХ-100 руйнує
ВПУ, і оскільки не існує прямої СР-МР40 взаємодії, МР40 не може бути ко-преципітовано в ТХ- 100-оброблених зразках (Фіг. 12Г, нижня панель, лінія 4). Таким чином, було показано, що дійсно, ВПЧ які представляють ОР, були продуковані після зараження рекомбінантними ММА.
Приклад 8: формування ВПЧ в 293Т/17
Є можливим отримати більш високі концентрації ВПЧ після зараження клітин, 2937/17 клітини для приготування свіжих ВПЧ. Білковий вміст препаратів було проаналізовано на наявність ОР і МР40 за допомогою Вестерн-Блотингу. 293Т/17 клітини в Т175 культуральних чашках були заражені зазначеними вірусами при МОЇ, який дорівнював 10. Супернатанти збирали 24 години після зараження, і, або безпосередньо змішували з трьеохкратним буфером для нанесення (сирий СН), або концентрували через 20 95 шар сахарози (УЦ-пригот.). Клітинні лізати (КЛ) були підготовлені в одноразовому буфері для нанесення. Білки були розділені за розміром за допомогою денатуруючого 505-РАСЕ.
Імуноблоти інкубували з анти-сР антитілом (клон 608, 1:2500, ОЗАМКІІЮ) або анти-МР40 антитілом (поліклональне, 1:1000, ІВТ) і були оброблені застосовуючи хемілюмінісцентний субстрат.
Експресію глікопротевїну ЕВОМ (СР) було легко виявити після зараження клітин ММА- 2ЕВОМ/ОР і ММА-27ЕВОМ/аР-МР40 (ММА-О-МІ Р), МР40 після зараження ММА-По-МІ Р, обидва в клітинному лізаті (КЛ) і супернатанті (СН) із заражених клітин. Несподівано виявилося, що ММА- 7ЕВОМ/аР-заражені клітини експресують більше ОР у порівнянні з клітинами, які були заражені
ММА-йо-МІ Р, в той час як при зараженні ММА-йо-МІ Р було знайдено більше ОР в СН. Це, можливо, відображає той факт, що з ММА-йо-МІ Р, ко-експресія СР і МР40 посилює вивільнення
СР (у формі ВПУ) із заражених клітин. Обидва, СР та МР40 білки були представлені в УЦ- прегот., вказуючи на те, що ОР ії МР40 були зібрані УЦ. Деякі СОР і також МР40 раніше були присутні в СН після УЦ, хоча й у меншій кількості в порівнянні з неочищеним СН, що особливо актуально для УР40. Таким чином, УР40 - головним чином присутній у формі ВПУ, разом з ОР - значною мірою вичерпаний з СН, у той час як частини ОР пулу (можливо, у вигляді плеоморфних часток) залишаються в СН після УЦ.
Трансмісійна електронна мікроскопія (ТЕМ) та імуно-електронно-мікроскопічний аналіз ВІПЧ з 293Т/17 клітин показали, що ММА-йо-ВПЧ продуковані відповідним ММА рекомбінантом, були
Зо щільно декоровані СР, СР шипами, які вистилають всю поверхню По-ВПЧ. Крім того, препарати з клітин, інфікованих ММА-м або ММА-2ЕВОМ/ОР, були проаналізовані за допомогою імуно-ЕМ; вірусоподібні частинки були виявлені в цих пробах.
Приклад 9: Імуногенність гетерологічної примуючої-бустуючої імунізації в нижчих приматів
Чотири яванських макака були щеплені (підшкірно) в День 0 і 28. Дві тварини отримали в якості примуючої дози 5 х 108 ІДКТео ММА-тВМ226 в День 0 і в якості бустуючої дози 1 х 109
ІДКТсо ЕРУ-тВМ368 в День 28. Одна тварина отримала в якості примуючої дози 1 х 109 ІДКТ5о
ЕРУ-"тВМ368 в День 0 і в якості бустуючої дози 5 х 108 ІДКТео ММА-тВМ226. Одна контрольна тварина отримала лише ТОБ. У День 0, 7, 28, 35 і 49 були ізольовані мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК). Кров була зібрана в День 0, 28 і 49 для гематології, клінічної хімії, параметрів коагуляції, ізоляції МКК або сироватки для аналізу Т-клітин та гуморальної відповіді, відповідно, і аналізу вірусного навантаження. Зразки сироватки були проаналізовані на Ебола-специфічні гуморальні реакцій за допомогою ІФА та ЕКМТ. ОР - і Массіпіа - специфічні
Т-клітини були проаналізовані за допомогою іп міго повторної стимуляції МКПК за допомогою 2ЕВОМ/ОР бібліотеки пептидів з Массіпіа УМуе(й, після чого проводили виявлення ІФН-у секретуючих клітин за допомогою ЕГІЗРОТ. Всі тварини були заражені внутрішньом'язово (в/м) (100 рій) ЕВОМ КікКкулі-9510621 в День 56. Всі три тварини, які отримали гетерологічну примуючу бустуючу ін'єкцію ММА і ЕРМ, вижили. Повна сероконверсія вже була отримана після примування імунної системи, яка була додатково вдосконалена шляхом бустування.
ОПИС ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
ЗЕО ІЮО МО:1 |послідовність ДНК, що кодує СОР-БЕВОМ-Маїео (номер доступу ГенБанку
Ш23069.1))
ЗЕБЕО ІЮО МО:2 (амінокислотна послідовність СР-5ЗЕВОМ-Маіео (номер доступу ГенБанку
Ш23069.1))
ЗЕО ІЮ МО:З |послідовність ДНК, що кодує МР-БЕВОМ-Вопітасе (номер доступу ГенБанку
АР173836.1)
ЗЕО І МО:4 (амінокислотна послідовність МР-5ЕВОМ-Вопітасе (номер доступу ГенБанку
Аг173836))
ЗБЕО ІЮ МО:5 |кодон-оптимізована послідовність ДНК, що кодує СР-МАНМ-МизокКке (номер доступу ГенБанку АВА87127.1 для білкової послідовності) бо ЗБО ІЮ МО:6 (амінокислотна послідовність зР-МАНМ-МизоКе (номер доступу ГенБанку
АВАВ7127.1))
ЗЕО ІЮ МО:7 (послідовність ДНК, що кодує ТТС
ЗЕО ІЮ МО:8 (амінокислотна послідовність ТТС
ЗЕО ІЮ МО:9 (послідовність ДНК, що кодує ПСО401
ЗЕО ІЮ МО:10 (амінокислотна послідовність ПСО40І
ЗЕО ІЮ МО:11 (послідовність ДНК, що кодує ПІ15К-5иФв5нпі)
ЗЕО ІЮ МО:12 (амінокислотна послідовність ПІЇ154К-5и5пі)
ЗЕО ІЮ МО:13 |послідовність ДНК, що кодує людський ГРА-3/С058 (номер доступу ЕМВІ -
СО5 САА75083.1))
ЗБО ІЮ МО:14 (|амінокислотна послідовність людського ГЕА-3/2058 (номер доступу
ОпіРтгоїкВ/бугізвРгої Р19256))
ЗБО ІЮ МО:15 |послідовність ДНК, що кодує людський ІСАМ-1/2054 (номер доступу
ГенБанку ВТО06854)
ЗБО ІЮ МО:16 Іамінокислотна послідовність людського ІСАМ-1/2054 (номер доступу 15. ОпіРтоїКкВ/5м/іб55Ргої РОБ5З62)Ї
ЗЕО ІЮ МО:17 Іпослідовність ДНК, що кодує людський В7.1/С2080 (номер доступу ЕМВІ -СО5
АААЬВІЗ90.1))
ЗБО ІО МО:18 Ц(амінокислотна послідовність людського В7.1/2080 (номер доступу
ОпіРтоїкВ/буізв Ргої РЗЗ681))
ЗЕО ІЮ МО:19 |кодон-оптимізована ДНК, що кодує СР-27ЕВОМ-Мауїпда (номер доступу
ГенБанку АВХ75367.1))
ЗЕО ІЮ МО:20 (амінокислотна послідовність ОР-7ЕВОМУ-Мауїпда (номер доступу ГенБанку
АВХ75367.1))
ЗЕО ІЮ МО:21 послідовність ДНК, що кодує якір УМ В5КІ
ЗЕО ІЮ МО:22 |(амінокислотна послідовність якоря УМ В5КІ
ЗЕО ІЮ МО:23 |послідовність ДНК промотору Рго)
ЗЕО ІЮ МО:24 |послідовність ДНК промотору Рг55Е: 1х (Рг) кт 5х (Рг7.56е))
ЗЕО ІЮ МО:25 |послідовність ДНК промотору Рг7.5
ЗЕО ІЮ МО:26 послідовність ДНК ЕРУ-40К промотору ЕРМІ
Зо ЗЕО ІЮ МО:27 |послідовність ДНК промотору Рг Е1 - 1х (АТІ) -- 5х (Рг7.56)
ЗЕБЕО І МО:28 |кодон-оптимізована послідовність ДНК, що кодує МР-ЕВОМ-Саї (номер доступу ГенБанку АСІ28629.1))
ЗБЕО ІБ МО:29 ГІамінокислотна послідовність МР-ЕВОМ-Сді (номер доступу ГенБанку
АСІ2г8629.1))
ЗЕО ІЮ МО:30 |кодон-оптимізована послідовність ДНК, що кодує СОР-БЕВОМ-Сши (номер доступу ГенБбанку ААО43887.1))
ЗЕБЕО ІЮО МО:31 ГІамінокислотна послідовність ЗР-5ЗЕВОМ-Сшци (номер доступу ГенБанку
ААИ4З887.1)
ЗЕО ІЮ МО:32 |послідовність ДНК промотору Рг Е1 - 1х (АТІ) -- 4х (Рг7.56)
ЗБЕО ОО МО:33 Цкодон-оптимізована послідовність ДНК, послідовність ДНК кодує послідовність МР4А0-7ЕВОМ-Мауїпода
ЗЕО ІО МО:34 (амінокислотна послідовність МРА0-7ЕВОМ-Мауїіпада
ЗЕО ІЮ МО:35 |послідовність промотору Рі 3.5)
ЗЕО ІЮ МО:36 Ікодон-оптимізована послідовність ДНК, послідовність ДНК кодує ОР-МАВУ-
Ападоїа
ЗЕО ІЮ МО:37 (амінокислотна послідовність ОР-МАНУ-Апдоїа
Перелік паслідовностей «МУ ваУувгіЗа Бач дух «ЗО» вВІВОоВІрУЄНАа ВАКЦИНА НА ЗЄНОВХ РеКОМБІНАНТНОГО МОЛ МОВаНОГО ВІРУСУ вІсповАакцини анкАРа СМАЗ «5305 БМБОРСТ «І» ЩО пеки «Майк МВВ «КО» Ше Бема «Їж Манан В «БИ її «ТУ» орРаАЖептІй вені 5.5 «ж їж Ви хай» штучна пестідеантсть ! ке . ; . . хойУ» ДЕ поспідваність, вка кодує пеекЕщО яаїво БОНН У я нене ет уюу пенваняю «ад ї с. астЕовеува застає зексввооеє саке СЕККЕСНсся савЕестеТсе 5 сісватасся сесвакауоа збатасстс сааавоссє ссассівиаа ззкесееєва а тпозоооєст карсстєястє свассоєсса заоаєзавст ссдазааює ССС ще
Іст ах сВтЄкКаСт свазадаскє сибссасєє боро е зсовскавсв й здевстттлоз васвасаово аставссаоє та щена сша пеаксваєа КІ «ссвоствзаз аесозестозе сесавесстов зобом поса зак я стдодаєяна особ вни сЕсСаоВЕсю ФО сеєс севаоеєочеє зестасоває Я санок постозянає тостасвяис собавакваа базассооВс обов оеовях «ко чпоствсосссс вососсочих дого аа остова песо сеає зекевесвава а сесвасофаас содесстоє ссодопеозаст атеєстесса сазана ЗсСЄсЕстЕсе В скщоасав зссочснюєя астосааєє асвоаводаєє кайссеєчнх зазор аа Б тсВенККсЖЕ ОККО зазесєчано заасоакскст сеакеоккс сосаскє тей жнежосвня ствезеЄва заєжхевесаа Ффесастаєес сасзжеесає сова ТО зазвссвниа сс єт сазевсіссв совессеиьх савяаїтаас аатавкасох ща тим сктсе цезсасеєс свсвесдєстс щує сс товне датассвесе С авастісаска зслостовас засзеваств зозаасєвах ссосвсзста паста ча яоамвююм СЕКС код зоба са сЕсх сс це зсевкодана сеостОмске тсоваасєтех ассостсває сафсзаає везе КО зесатостєсо аааастясяя вона стссувеос ссхаєсвнь вас юв. що кеш тсося зада стеєс ссзозасає сссзсвсас втассзоває ззожаасаає АВ йекссцтеєє схозаєесвях свовачеєсв заозотаове оеозатасєс водпаже ва їн часно аствсавсва ссатлоЗкає свазсовІвасє звеакесвоа сстссВссВЕ ї352о созпасзова стзестєка сссаватесс за еесвез ссозссзтаа сзссвадесе Тяо овес ВОо Всстссакай сстасвсасє звааетасса позбав св ссовоаааеє о асавсвкка сссвОва сісссас аасяясаоаа ссоасссВсК своє З азипеасаса зсвасвасоо стзазастоє сеопосасВа смриссасаз певаховесх ЗБ аасявсетсоЗ зсасптавсво ом етсвтої Зазеєткодя сттечаннає осзвсаовау 16-о яєвааєтнає зссзоозосся содасввихо саатсссзає ставте єт са асв ЗО зоависнасаЕ васостосто бодхтоссто сагоссвтвс ство Вссво осв пааоі і сахатасасх фаски сеасааессв заавосстта состава садах ХВО тосязакоая зсзасесне сєтстлеацек секс пссзсвзакє воску їі ататасєсвта стсзаказца йооссаєаоя фест сзасозічеу зсооЗасата КО син жкееке заассаих чес зокасаєзає това век ЗО зваавеснас сажа сатсс візаж сає соасаяесєт стасссватс апаозеЗаков ОНИ чзвізаїечо «ЗоасоЗосї зозозсаоти баїсостоса дозасвцюса скассвавЕ за тає носа вус ВЕае Іс ий сеасавоєта сим еастая сте Васе а щі вас сан сса сесзкссств са сна став два аа шк
Зковазатаа сзстзасвес ааатсссто сова за азБсаовтеї зсозававие жа се васєне зас ва сестежексх савівстата базаттссеж сссвааакав я татІсатозга заткааозая за я
Я
«віз БУВ чаїв ВВЕ «а В
Ме СІВ бі; іжу вк осв; ів; Їй ву бо ку йо вуз ві го був ї 5 15 У
Шев бен вба вва Узі Тгв заї ті і івуц оББе Єїяй Гуз від реа дек а В За
МеК Бго сви сту УВІ УЯІ ТВг овеи ща ТАК сем бів Узі тТВР осів їв 35 Я ях аа віп іч УВІ Суб зу а ні ви ія Бк ТвК дв бів ву Буг 5 ще
Зате маі бі вве ав ви їв бі беб сте Ма бек твк дв ЕВ го
В то 75 що
Бек діЗ їБР т Ага ТтВ Бі вне аг хов біх Уа! вка ве; їв чаї і ше | рен
ВЕ щає туЕ пів Ата оту тв їто віз сто АЗК Су тує Яви Бе шт що М що мів Ку Се Рг Аа Чіу аг БІВ КУх СБ ОБГ КО ККЗ РРБ АБ ЧТ
ЗО 135 хе Кк ех ча У ва ву яге щу Ага тує ті міх ех То оту те 3 Е ою Хм
А Ка ЩІ щі га оКух вто цім ев тек аа РЕ нія сує а БУ яїа вне вва 145 155 55 ЗО
Ж Тук ЯВИ агш їв АТа Зек ТК Уа ХТЕ ЖУе ага Бі В абв вна її | жк У ків іч бі» жВі їте аїш бие ва зів в; вія був ке уз То ТНе
ВО Ів Ї НЕ вве зе ів ЗК рт; во ЗіБ ве і та Мій каб тує Ме ВН ака 155 | 20 205 тик Щек Бек тук Тже аїа тТЕРОЗеК ТУК се бів тує бів Те о дев
ІВ зї5 У
МАХ Ж КК вне сім Р іа Ні щее тйР тк їж Бе р ЖІ дев вкл ода ТВе
ТЯ Ж -5 БЕЗ важ МА! веб вес вхо б вга Між те Бко Біж вве Бавовна с ев я я я
Ей ва те Кі ів Бех нів Бів собів бе бБеє ба ВЕ ЖВе іч рух
ЗЕМ ее ВЕ яю АЖ КК БЕ жхжук се РК жу БК я БИ заго Кух
І 5 Ж заз ЗЕ же вк іви ха Ів яв тів ва із ше гі пі вів оту
МЕщ ОКУ М ТЕ ОТГ Б ВВЕ ІВ ши ДІЙ ЕТ оМмІіВ А БІ АЖ МІ КК
ЗК Пх АТ й Я
У «ВВ й вій жМе тера Зі: дев бу Ух дал ід ев Біш бій без Ав осів Вів цію КЕШ ек Ріє бів Тк Бе БЕК Бен ай бів Те вів Вр я ев
Бу АК ЗХ» Ж іа їн Бек Зак во Ве тТнкоБух «1жЖ Ага ЖТе бек дев ака ія ве
Ме БЕЖ туго бве Я сечу УВІ БкВ ська жар Бегогиш ТУ Зб жі же я 45 ж ке: нів щі втв ів Оу ів Не ВК о Сву Бе) ев зів ашя дак їй
ЗЕ Ї ЗХ І ще ТУ Ба Аа У дви Уві яв Тве пів дів Бе ї16 ТЕ Ел жк
За 375 БО
Твг ові ТНК обр ків 5Бію ЖКК же Бі яви вай мес ів її дет ТНК
Хе ші тне ту кВ Як Хвк дек МІВ Тіз фен бе ее бек бе тВе
Я Я мих атдовУ си вх З Те ія ЗБ ОЗек тВБе те отже УНг БР Су іви Без Уві мех ТУНе їв» бів ів ве) тк тт РО БКО АР дав ще бе Бі ЕР ТВ Та 53; Аза БР НЕ БеботВтг Ве вра бів я т» че сука в вч ск. ча як й и ак шо ЖЖ фжкю о м г Ж ве те вів Уж ву ТНК жі тгрояЗа бій отр ЗБе ЗВкоЗее як ж
ВХ Я 3 «БО ів жів тег ошек тва ев! твоя ЗТ во ек ее бер Біж Бен ока
Зи5 ще па із АГО щеє Ага ве ЗІЗ Чаї вв їБе кр КВ КВ У вує Сук аа
ХЕ ща УЩЕ
Тех аа Кр НВ Тут тер) отВе ді ОВ бо зів нев ака ЗІЗ АТ ШІ
ЗА я ЗЕ5 м ау - КФК. дошок ЗОМ с. : ох од сук. КТ я ках М
ОЕМ Б МЕЖ на аж мій йжв ж Б УВІ СУ ші ТЕ Об АН зів БУ вв Мах Ні ака ів без із Бев У Сух бів цею Вр їв» Вів аза бі ту бе бій іа веб бі ве Бе зе ве аа ТВ
Ба У УТ5
ТК БІВ Бо ат Те ТК ЖВК жів ан аби Ме БУВ Аля Хв жов ВВ рен ку а ага Зв ВУ ші Тв осСух яка Хе фев БЕК Рей ха СУх
СУуж Хі іа вра нів яв Тгвоїйе Бує аАБй Її ТВ» ажв су Жів Яви
Б ВЕ ЗУ
БІВ ОТ жів ні ажровне Те вхр ау Бр бе у вен я Азш В ше их НК вих в УК Оя й дев лей авя ТК оте ОТВе щіу Ттв ага сів тк жів Бе зів 3 ТЕ о В У
Оу іє те бі» х1в 16 215 аї5 тів Се а3За ви феб суз чаї сує
У ех Би
Муз Кам Бе Кук
ОБ
«Ех З си ВЕ «Кк БуУВНяа послідавні сть «вкіх ДНЕ ВОсліДеВНістТв, Ва кодує МИеЗЕВОУ Ві Таке САКЕ ЯВЗВ. з нове
ВЕЕТЕНЕ . гемнеаНняв)
ІК. Бе
КУКСИ НОСІВКА фосЗтТцнвОВ БОС сСав сажки Кебодаака М куквасии теахокскеоа ВТО кі тазає кед СЕН КІВ света пес ас УВОКки же аснак ставок копа КВ сук саз ананас сварці стат ск Та ЗЕВС ОВ. о кактвіска аВісієваца оаочооваз сесоосскс сацоеасєю СЕС еВ З важакстаус сватежкаос тезитос соатеаесюте зеснювсцеж есте тяви З сект з реккаса зсасооаєна сп оеоЯ саке сесія о аеватютваа зако зскаєєясвя ака Заса сс нен ака аа сна НО еВ везе ки ксвеВ Зако НВ 54 «савсакатс ще авосв вкозавовою собак своваєнаєв став ОО шЕКЕІаСЕК ВЕК Вес ТЯ са ЗаВк СВО СТеЄ ВСЕ І тес аЗкХ сзатятккви бойове сесаваеє бас цво зважав КО среаєзскох скочив фе ОККО ща НИваКе ев ЕВ
ЗВ жор сюова НН ЗОН Е Зевс сЕсжаЕеКжЕ ко
ООН а тКТстеска ЗасесесСв мона ее вана БВ, зиннианех сабуксса; сазана сессакесая сакссяекх ссммеааке ЕВ зЕтоцясвс ВЕЧа Оса ЕСКЕЕОКеЄ скол Вас ЕКта ВІК ТКЄ хо
ЗекаеваКВх сраку ВК ФОКС фев саке Ва Ве ЗУ таке посспоцєва даКегістНв Тех Безававета свв ЕЕ сатїсктвеВа данасацятє ск іН ВСЕ В сесія Савран ОО пава саао есе сова Метт ЕсВ спа МВ и В ї2Б5О хасісеОгЕт шодешкеко КООІЄВЕКХ Зреокєнає заеЕкоуЗаає зго се а 3 тсівсвастх тео о стер иХ тосазсеоє садова грека 130 хасвакука финасах весассявих осзваове зстаско сяде що зкжсевниая кеетвова сао сажа аеассно засо КЕ
ЗЕАВВКЕСК ЗВО СК ТНК ра ЗЕД КЕС ВВ ВОВК КЕ за «автвзсваєсс ствасозиане засззетоє тавакеасє озаесаа саке ЗБ пеацатеаза цікаво Фото воа ЕВасвасОак ТЕКС Є ссбапесоЕ ТЕО пЕйтаяЕЧаЄ ВКТСЯЄОССЯ ЗКОКЕСЖОХ Тозсжасскт саецаксяє еф сВеає зу
ВЕС ЕКЕХ ЯНБЕМКЕКЕ акксоакиВ са КацецЕ яка Є ЕК ТНе ХК ХЕ позах зажнкеакса свв овжекх касет зако веде здо
ТИН ЄЮ кеВ ВОВИХ ер жаси сно сесооех ЧІВ щацсесткеве забсевасєт суб тевиє оз ска сессОє ХОЩО сив овасєа зрсавекжеє зсзісасва чек весассавеє зассвевац МІН саВтВЕНКЕВ КстстКеєє вок ає сескат асо пеаоанвсвю зе суаеця а кових законо сю зе Вес вЕЗас КОКЕе ефек ЗК кажи Бета ВеВсресаВе ТОВ Кекх ска ес МИ сасівижата песвствакс фововакою ява воБназаси збе КО хованки зе Кска сват ав анонс ака вас ЕХ теабетекУа вежа песо зфосваесвес Река ксВсю КК ЄНВ сао тОааеКоятх СК таце ста сзЗОаВеВЕ аБЕКтТКЕсвВи ЗеТЕЕК ОВ КА армистає СеВссвтоак ен КН Фоноцеєтює сени а ВЕсОФЕВЕСЯ 3
Ісака дуєсвосивиЕ ТескстВоєє осв аОє скасоцеаса Заст «КЕ костеєукай кехшВстсоВвО часом суха стек ЗаесеВХ а звезаттотес дата за ешщеКа сссвосссЗе зататавасє саке УВО хжханаа кхавакнаах звескасн ге ающ кое есе и ува
ВЕТтНТОВТВ пес сдкаскоснх дане КтзотаВк тат МВ сват созаівавой аск вакао сзееаааюи азс ТЕКИ жое ТиЩО
ЖХтзровода: важкатесква таза кає авт снаю века Ме «В ю ЩеЖК с хиМЯе Ен У Во Не
НМ В мех зов ін ага жі ЗУ ші ек тр оаїа ів Зі ім ів Зак Вів
УЗі Ав МвБ ав ТУК НІ Б ЖЕ ве ТВР АТ РУ См Бак жа Щі ' І КЕЗ хо іп бір 15 щі ас зів вко щі Ї16 Бгто Уві Уже ба! Уві дей вв ец діш ФУ ЖІ Су зів НЕ Хе жів щі іа вм З аа тк жа о З В й аа Квас я Ар аа ага ще ее ВИВоОЮев Сер Бер рев суюш сей НЕ т Та що
Нік зн ту ооів Бі ар ніх аг вм вне ів; ух Бек зав аа УВІ
Пі ТК баз Зв ЄТю ні Єїу ЯКЕ аАре вне бів жі ака ЄТЬ вже ТВ щих ЗЕрЕ 3 дай жтаі міх др Це) дер Ой ев зво вка ха УЖ ВС ТУ 5іж вх хі КІ 85 п фе: шт и ї а їх ї « із ми Бех «со «кві с ки щі ж КК лк КЗ тик Бе важ жа ки БВ І МІ ЕМ ТВе ОТ ке Ії їз віє ази вій Фі бій Ре яв хе Ва АТ щЕР Сер ЕЕ в Ве їж М 155 що
М хі У ік ів кув Та С КБ Зі КУБ МК А зр іа
І Їй КУ
НЕ УАІ ніх іа ші сті сТж я жів бів тує веБстве дев тк я
ЖЕ ІЩУ З заго осі Ні: веж меж Уа? ів РВЕ Ага фев мет й Вт вза еНЕ
Ем ШТ їх ВМа їж Свв жів ні бів і МЕЖ ні меж ма Від ту я ЩА ТЕ нії АБИ Аів аз АБИ ВК жа! ЖІ ЕК яв хар УК АТ НЕ Вій Ва
ЖЖ ЩО зі я ме Ек БІ Баш жо Зв ЖЕ Еш ТВе УЖ! зе; ява вів жів зв їй
МУЗ Те яр ев ік жа! ще Бе НІ РІ іяю ів вгВ те 538 жа
ЩО НЕ ай
Ві Бк ве БИК УВІ Зак заг Не їж Аїа МІВ ве шу бе ке вх
МУ НіЗ Бі Бін ТУ віз ВР Бе Аїй арО Сем не яв їжа Бек БУ
Уві Ачи ат фею ін ні їж Кер тб Все бів вез о беє ів їв дів щі КН 5 Зк ву ші» жі аа ТБ ав Мі Щ3У ЗВЕР ОТВЕ бен дів БІіУ Уаї дек
Зх і о пи вк іт ін ів тек ді ів бе ака із із ат ЗР оБін вів ЗИ БК ів се жи ій Тек Аза БІц ВК ага вів без вав аз їв щі Бе з За яке
Б ЗО ЗБ
Ве щі ів біз вує БУ тів їв МЕЖ Бак ве Мі5 бій вух пух а5а
За ЖЕ жа
Беж МОЖ ПЕ ст КЕ бек бно о3й Бій Тако ака АТ меж УЖ Ти фе аку ж 5 зга іш абз ту фей тне БМ; АТ БІВ ВЕ УВК кі Ве ж Тв Ух ях СЕЗ ях ні бі А чо Ту бро ай ав ав ев Же бро бе бБеооБі Ве
Хі Тугб ажр вав Те нів ве ав БОВ ЖеР АХ ВВ й ге доця ав
Зак яна АхВ ТЕ ТНе бів бога бік бім УЗ Ук) зе кЄ ТУК ав кеВ ж р Я
Сів ще АНІ жа Три ве ВЕБ тую і Бк хек ів ЩЕ ту КВОТ іу ар жи во мес сне жи жо а55Б ав А АВВ аз абю ЗБ ОВК
Бкасщіф вм ко ов ага ОТ Щі й гу СІ ВУ Я ів вка ТВе тує ау ім ік в кре Твк ве: ар ВІК ЯКЕ фу мух аж ве» Ти ва М Бе Біт ЗР Ні віп бе; ще дей еВ Мах 1 ТР ж БК хи ЗУ ве пі жає аа тв мекв щі Бк щі г о ваг МУК На аю фр ран о ее ші БЕ АБИ ТНК дя ЗІ РРО ЕВ ру АБ о МеК ег ек Упе вецоНх бат Ве Те реа ів бів с з а ее БІБ га вер ар Бій вує язе
ЗЕ хо Б до де яти Мк дк жоугу С ус ом кеух кока ин дано У мя спр Уж ха С ю зви жар хр він БЕК БО) ТЯгоБаР ЕВ ар щег 1 ТУ ар тя Во еіЖ шТЕ Ек ХВ жає Сі 1; аа Ве ве Тв ур аа Бех вує Аїд шо тя га о кає их їх зх Ж мах м ку Кк. ех Ка
Вдома ТК ОБЖ ЗО ВК бу Ма АжО ТТ вав щі й ази БЕК те ще віх пе жк яшк тн М! йде зак дів сте бек Об све бів віж вва» вка бів
БІВ 5 і ЇВ ще дай ек вуз бух дек дек кій цен обів ої ЖК жк жуК нів вар вже ах вх І і тво бік ве вв щі дів хів я Тк ту он фо Ве Зк
ЕВ вів без ків 51 вве зак тик ошів ее у фр СТВ те 16 ва
ВО Бех що З хх гу, и З сжЖ о страх се межи її щоосідк си зд КК га его ахо Бек іви Біб ЗНраїа ТУ БЕ віх тро рец ЗБК Вів Бу Бі ще а т дів сени ів Бу Бін ав Ко ТУ лев жа! їз кв У БІВ вій Бе
ЗК І ва 7 І 5 Ї Уа
КМ КА Ех ЖЖ іже ТМ вт Уді веж зве ів АВ ай Ку ВНе свв аа Уві ев Я
КЕ т й 5 тий УЗ КЕ мів яв
Ех ах МЕ «В ВЖК: хіх ВРжЖчУма ВИК ООЖИНИТЬ
У І
«Я нОкОВоОпінізОванІ ДМК песлллОовістЬ. Ва оду ОБоМАну нак е
ВНАУ КК. є номер Сй і достули свнЕаНКУ дея акне лесі ден «ВЕ З азжозаансна «сек савсзоссто аск аеБмесяа Заст й места моксаОсва свассаоке: саемасатоцй вон сво одеса ЗО
ЕВЦКИЩНя СедауВЕе ВеоМЕОНЯ песо вазвочкеВ зи їщО чажзвцессск тозааоскау сао доска сао зескавовас ЗВ
ЗезозотяоВ сао сао есЗаа земне ее ох зак ЗХ
ВИНОМ СКСКЕ КС ВИЗ носизЗоВикае звикає ване сяае ЩО аспжксєвес вевтссасо ссзсвасех свсостсао пса Зевса ЕВ
ПОС ВтКСХ тСсвакахуа сао с Вес гос сви х. ЯК везла «ен сао засависсо свсзсаон аск Ееае. що вва «засо ее смаки ссевасзаа стос аВ. ЖК засваковев спозаассва ср соце ес ово сок тосазав аа що вссназиа сік ме косе аск еще сслнвоє ТІЙ сала саке ксесасор песессааВс тазасассяк саке секе 750 зоасазсоаео овен застаасове зесовеавсв заозозоцноа зсссзе В дссссЗаке ссосозсая есаоонесте засво сОЄсєоєтаЄ ссср Бон; хоскствоса сассссоука чесна засво єс фскескоа хек В
ЦВК ЄВ ведасвакає саскоскєве собвосатоє сесеюсвеве сасеуеає ВО дЕсСтесВиюя Сас сс о Все КфаБКОКеКє ство ЩЕ
Ввсрассваса асевкаєсса пер асснс асан ааса зосацасеВе ох 13-03 воскрес осскосссас сапки тееє вссовоснсов Вова коса що ос стасецесвк фас За ащеасю кеВ оса ЗО скТВоєКЄся сВворекеОса сссутас еессоє ЗОбошЕссях еетотОВева 13щИ двоє снжесоссте ства свОє сус аац сскосяквя СЕКеВВЄСОЄ їО
Черссааоа кома ска «ке свІ ЗОВ сиК соуси засемацав аа
ВЕСНА Сен ксвНй секс ВсрсО окон ЄВ Ве тесосюю Какао ЩО засяссцеєют всаусвасця базсоаоавє засос сеоваєєово заксооває во
Фешсвоаа зас стце сс со аа коовеае свя соссех ЗБ
ПВС ТОЄ Вес ВСкО хека ВС Виа Вес св коса ЛО
Вот вес смакова фс є сова ає сассЗаао та возассекек соссцаксви сесзсововек Все КОоЄТеКюю кове сх ЗО вкатаснацу тео воастоєках чеспокаєсю вооаестев ва Мо
Осваасвок стовссвоає саоокеоюмє деусаожан зедосвс стоовосєта 1950 еко ЧОМУ сени Зоо яке єс 195 зает ща «Вк В «Кк ВІ «МЖК МАУ КВН Ка ка В
ВаЕ УЮ ЯК Те су Нео кан ків Бак іо СТ Сав КІ тя су Ве
ХЕ х 35 ї5
Ка АВ ВХ в жі рев от мів аа ще ях вай БІВ вге Ів вза ха кА З
ЧУ вже Бак жа Св бак ців Тврофав БІВ бух тТВе ств вав шк іх
Б я ях їжи Ме ТУ ББе ТК ваз ще біЖ Б бух чаї жі яха бог ве Бе
ЩО у | і щк
Сів віш Зек вує ака Те ія БК ат Жак Бі УВІ мгО то ух вх
ВЕ ТВ т я та! ів тут те із оіу ат Бі дів Бу жне ств ту» ка Зв о Вег
ЩЕ ЕЕ Ще
Ві ТК аа Бе ак бію в зак с і ке щх Ве вка тв ОВЖВ
З 35 І М
ЖІ ага ЗО Тук Вже фа Куз ух Те їі ні ніж ків сія щі ія 355 го 55 дало вкш НіЗ АТ ші щі ї16 Ра Си 5 Бев Те пів кі ню КВЕ що ша За вен тус ази аг а Вів хів Бе же Те меж тет а БІК бек Ж Не
Так дів де ана ків 5із із кет її дк? хв бух Не У Ніж ж меж КІВ Бе як бе іл ту 1 бі же аг ВЯх меж ази сви Те
ЩЕ ІЕ5 КО ас ТВ аа СУ ук ТО їж ев бек Ка щі Ве Бій ТБ дев же
Как 5 ївВк обі Куб вв ЄВУ зів аз ІВ М ТУ айв Жек ТВЕ фік вза Вів
Я . ж Ха й
ІЛ Ух КУ
ТНК бу аїв КРУ зе фев фі вга Бе веб косо БУз Ве Б1д ко вх ій ів вує Б ЖК сек оОтТВе Бе тнРБоахю КІВ Те їж сви дв Ве " аж ЗЕ 7 жиЖ шЖ МО ших
ТБгожр Бк сБС Бе яща ах бів ее ве АТА те век вію хек ТУ
Б ях У хек ее бір ве Зі его Ні КВЕ Тв ек ва аа Уа фе рує щі жа ага й; Я )
Я 25 5 зу ев жаг фаК ТаЄ ВЕК Беа БгО ТЕ РРО БЕК Бех дів вка бак Ах
В ха5 КА дикою соя кдд ері жу хі СЮжуо аліво вишашо Камо вже жар Зо стю о га ій цій кір мір дев аа Тв зн нів как Сів вер ків за) НЕ
Фін Меи ази Ух вай аа Тйг ївВг ока ан реа бе ех Вео ва Ні дки ТВе ТВЕ тне уЯе хек ТКК дев яви ТВК Бак бух МТ дев оВНе БЕК яких. ее 7 КАХ ке ах 50
ТВг сер озек дів рез Бен БіЯ да ТНК Те ав аж ав ТК ще ее
ЖТвг жі твгобів аза бів біз їаг ек КТ го шеє їі Тео ївК зе ва ва Те ік ах вко ЗМР ОїЇНК аж же ак Ти ве как реє їж щіж сто вів тег о тТве аїв ге аби ВК отьК ява 13 БЗш ее Же ще ях о І вто рф вт Те ве ше Ват тв аїВ ів ні іно жа! ту вне аку агЩ оБує ага бок ТБ зм тер ак яв БІЖ ар овех Нв вро РЕ у чо 45 аа БІ ів ів аха АВ Бе Я3Зе АБО РНе вою В Уві вро ви ТАК цу ви жі ее а їн же же ее Зв обі вій Зек і і к ях Й Я З дев Оівз Ні зі баг вт ав жів Зегокшу КВК о бжшр о Жак отже Ве о вКо і яБ5 че ча вхв їі аз» бів аха їМе 8із їжк Заг б1у б ван бів дей дже Кух акр.АТа Чт ев ага жіе тб ее уві ія бі вхо вав ев вія Ай
Яве хів Ук? сем Ї15 уз ав ій аби ява раб УВК Су ве кеш ага ага сее АТ Ве стін Тв аа руш ес убив во ев вен аа Заї
Твготве З біц аку вк о БОе бек сво 316 ака АБ Вів вата жів а5о
КО ЗА ХО вне Кам же тн ода ТР СТУ і ТВгОСжЕ бує УВІ Бу БТ РК І уз Єрки їЗе у Кі ої ар ьо ЗМК же йжи 36 Бек зів бів їв
ЖЕК щі я вхо ій Ків бух бе5 ака ів ів ж БІВ ТУ ве лу тв сію
ВЖЕ во їх ач
ФІ УТ. ЩЕ ТкО Те Ве бек йхо ТБ СЕК ЖИ яв тн аа фенобіх
Її се ів Бу іо 5ег ЗЗя АТїа Ущі Сев ЗТ їж венобек Ск Ще во їх БА
Су аг жів вне тес іуя ту КВ ту «Щі «ВА» ВТУЧНИ ПОсКІДОВН ть «ЖЕУк. ДНК восвідовністе, йка кодує ТТ «Ще У венмеессо всассстоюх оскогювюєс скрктостоє ювокрєксве свревскввє та сНЗКОНО ОХ зеводеавня ксфаетта авеню аеносоак хе вескю що сеОєкасє ВеККСВОЄ Се КиС СВОЄ кесюВ Фо рОе свцсваее зо весвосоас товки тссс сЗВвсва СТВ аався ЗеКБоВВсВх вазсеаВЕе не)
ЕКС НКО СсОВККТВа соостковкю ачацтоице аексслаюх есе кКе яов петвкстосо сповсваєсв стокове косеєеювє ексаооле сасоввевае ке уесацеася фсазеваюае состава засне сосзскаави ск есева яхо сани аск ас соаозаваце ска ков яско Ен аск а сювхасаи зацзазаоає сеанс вс пастою Босссвао овен зо тесвОєчаєю сссосеювя осо вососсоюеє ссасооеоке сасерю о
ВЕК ВННЯ КЕКВ Се пес кессснесяє чину 3 соацаесттєс таасесєто цассвосавс ВтссасоаВа авановоє дасснаока що зааапсаВес собоаанки порезесвеє ЗО ео зеВВеВаєтє сазоаааокВ ї5
ВКОКЕВАСЕКНЕ ЖКЕКНОВОЄН СУК керує ВСУ кс еКкає яка пссвїсотос «срака вовавекатс абсскоаоюх аваасюеньа ссвосоєвех ке сзаВаснсєв астессВНаЄ ссБозєкакс зОсаховаєа єоНКєеваяЯ ЄВавасееа зо пса о косеєєта соссоааєю ювобоєююю зкхееаквє кода ще
ВЕОККСВСЕО КК сССВОєвя скаче ВОК сВеОю сеже са сашссєає но
КОДЕК ВСЖКОКОЄВ сухе. верес кеовеє вес есе що асо ОЖККостУою снацевссяе зссссеєса севеєвеех скаже що карета скс ЯуКессЕює сессвненає Бастасоєсов ссавовнесх орсосетате я пксктанасо сссаоапесов СЕБоТОІсЕ БСрслаесВ ссВиОВНСта сВаКеУК ї38о керракеце кВА ее стен весевацєе песен їжа щосасстася зсктсоова «ооо то сосзецдасе сспосвоєча скора Б
Есе Є хпжхссВОю забав СОЦ КАеЕ севчсвуєви УСЕ в стр сенс сОСсЧЕННЯЄ себе СВЯЄс сота сесесавекеє КЕ пасаекносе тонаяавооє ска с ско т пезасомсє сазсоас ЗО «озон воза евкеаосиі скодясеса Вес цВСя Це ща паднаєвкса засне оОссоувОевО зЗаєденасюа асвтетаєяє аакастовах, АщОВ ааеавекаавс са есв писуааенес сенс ас веех ссастне ї8а седнасавВеа сосні ю соссоасоеоа засос еа вада юх ссозавен що актах склекцацею зсоесасеО засареаєя зозсВесс сазцаКеКу За поБиуЦеКВИНк БККЕКЦЄМаК кеснанкх ФОНІФЕЄЄВИ зжефенаютях ефе ХО тхзецдаснес масова свое О сааовсноєВ ацасевеевк сеЗсекеаь А зага ена ема ЄЕК Вага сек атака аск кає ЖОВ
ПЕНІ КОЕНОК МеВ МКК СЕ КВОКТ ВК ЗнХнак а КВ ке засни яаВ зозісстове стаз) зафошстВсв Вон еВН ех ВкскОевох ЗУ вадаасккау зе ЧевсВасове Занее ака ех как се я
Вест В Мети Е гевсВанас Весвкеме ее тсвовВ ст свасаає ВА асссрасєв сстасєссва спессВеєів) дсосєноєв хеВакодка оосеавсевяе та ктаоковася суаекну «зако: зт ааоу ска цОоВ везе ТВО пок ВИН Скісс СЕС ТЕЕ тОУКТас Муссснаоє пткодоєа ЗАВ коселовас вохасвюєвс свекЗВоєє ЗвеВесаеВ певна зааасВсаВЕ НУ сенс пев сс кек кер осВ певаеетаае зе ЗК заизастсто ссоБсваОх осесииНеє ссеІеВеВ ВеСЕЦЕКК ОВ св Ває МІ сестасссау спа: е соте веснерасевВ воза ек ссср ВЕ аасстакзЕа ссозещосОх зеовасовоах закоассивва зозсадасех факс ТК сеанс екавесеєв своє кЗ ЗассозгЧся асазеваєа сезон Ва їесвткоасв ВВС Е СОСКИ ВесККЦаек овавсвоа сова БІВ ти сицск вості ска сВСсКІКежО совок сусваскк ЩеВНЗЦВЕХ ОБО
Оасасеа еКжасетцяк сессоконсє мае нуососока чекає КН ассВЄкцасЄ всеКокасєєт оасказсвеє ес тася єсаалесв зствавкаєе БАН тастясе вх посадкова сеЗсек стос ки оС кгккавоВах ЗО окис псктсок я ЗК ає стек кока е стасвВсВає З забава Зсосовоєюв сессавоває зубаасокеї ссваканисх звасеоцаке ІЗ седаааосу ства сесспУєвек сесстокаса зач жассеканав ЗО стшКоасє кОнеааеєска СКК ВО ставав човна цеВевеК «5
«коксу базова ека засос ЕКО кавеа зскссзаскЗ чиасвіссеЯ ща
Зк а аскооенект сазесвсю ваду свяВме КеСтНааевИ сани ЗО чесвксеса ссонеоавов скавасєває ЗВсВисе ах аваХ «їі З кафе ПР , «еле наше «Виза а В меж жі МЕ ав Те Бер гени фев тер УЖ! во фам озфев тре ж ве сіу Щек тве віу «а ці жі бух ЗІ щіз ази вка фе їв Ве ан Фіз бак ак шок ОН Об Бец о веО бію Тер тТук Бе «ак дж ем
Аза твер вів во мех УВІ жі ще хек ее ТвР ТВ КУ ву шк
Як їТе вгО Бак Хек С іа сію а З ВР дес бів вай Бій Тук
БвЕ Бій лег яїя ті ТЕрозег ів Ре ів БУб аї КУБ уз Бек АЖИ сів ТУуК ТК ОбКе із ТР ожЖек іа А Ба вів Ві Тве мак Тер Майї
ЩЕ ЗВ ще «ер аз вій ів Уа ї15 аж бух ВІВ Заг джй ЗВГ вай вує ЖІ Зг
Ба тв мук віх вкЗ і ТУк бів Жія в ЖТВ бів тк ів еф у 136 ї35 ї40 жа ВУ ТЕ ОФІЮ Куб аіж ве охо БЕ БЖ БЕ ТУ ТЕ ОТНе дер Вже їй То Ук 150 бій ази бує вух бі жі Хе бек бег азр ван вза йія Бе: вра ФВ
ЗЕ її ЖК се; вуж ів ВУ Зак БВ АВ Заг КО ух ух ака ЯР ТВК бер а 1щй І8Х з
ЗЕу Бр тег оУзі РО а) РЕ ав вл аз Оу хі вето аа ще УуБи
Зв ові бів іх Тук збе уз! би заї вух яв іх дей зве оба іБи ха РЕш тт Кі бве аа БІВ Ні БІБ Бух су БТ вв о їВк уж тує уж ЕК дек рив БІВ ув КВ ЗВ ТМ ке Жак ве ве Тут Чак Вжр
Бе вії жа УВІ їн і ка їв ав Бу вв мі щег вра сти 818
БВ і Зх а
Ра нів йхо ів бві Аа іл тує РкЗ ЕЕ АЇ Ні ба вав мех у 7 5 Зк І Ше 7 І І ях МЕ КУ и ІТ ріє се беб руя аха бі аеро Бек тнк бій аяй ун Яще ее осів так о веа Не ків бер був АЙ ТНгОЖЕ Те хаб ага ТНК Ні
ТВ як ін У нів СТУ вав А ої) Узі ніх МІВ ек вва вве дер; : студе 7 Зх їх Я ї пупе я ех З 355 хів біжу его УВІ дек АїЖ 01 Бе бек вн бек ан бер озви тВе
Заї він за ях нів Звг вав баг їн а15 ББУ БТУ ага ТК ОТГ лів ів тк мет іж кер дат не дів ахр Те іх вКО меи жев 55 вяк пи т є т Кн т ее я ЗО хів аг тує Мі два тат уж тег віз Ве жів жує дян чаї мер вах
Тв оте ек рен жі зе і вує ве БІЙ Те ЕВ а те Ків вує «у СА І
МІВ КУБ ж ФВ «Ж КЖК БЕР ОСІ Ті Бе Аж БЕ Же же Тк Ту
КУ З же ї ж йо те
В Як 435 кни саке те вк Ск. дво та що дж жов о зок до щк
Ве Щек вк ев вів го Кі дів Беца вів бів ав ак вве й ех
Бевтоаве їМт Беп жі тк меж жа тує дяк обі вбах ем фін вн Ві
МУ ТМ КВ ІЙ Бе Ару: Кем А Ве Аве СТ МВ те пів вай Щ15 діа ве тує аа Бке біз аз Зі аб Маї жев Уаі аа же вію пає аа ТРЕоЯаг ФВ Ма іже бе бів їі5 бів бів так їВе вія ака В
КН те я
ЖІ ВЕ яви Чу се Яр Боб Язи веб Уві біх Аг аРО ЖЕ АБ КАТА їх ЗВ У
УВІ ал ке щег аа во яв бін ТВ тт вух БгО зер ме Те о веи
ЗВ ЕІ в
БУ Ів 8165 ее цех ІВ КАТЯ Не РУ ВБе ков ОТ Без аж РУ ака
Мч БІВ ТУЄ ів щіж рух а Кі о тТвВе щі вве а ве дя шНе ДВ : я я С
ЗЕ х В ВА пів щів тВе бек дів ви жів мує ази сів вве із ЯЗ) іже АВ чВЇ твго вжи іє те УВК У БВ яв Був КІР Гуз сви дей За же ве дув Те Бе КТ Бк А» же Аг Не мі теє аз АК жа ан ХВ с ух шк ко де ва вк поки г За ек с их ж жк дів ні дію АтТа еВ вії Заг ожаі ві су (ів Атв нія ага бів чаї
Хі яви шег ше ЖБК ФІН бі. Бек бе бен жав ХВ ау вже аа кт
ЗЕ В Їх ага ув Ті рез оБек БУ Тжг ХМК Ві «Ти ті от аа ве ВВ ях щоб Я ВВ
Сем вух бів УВІ фів ази АБ АР Тук зв Ме сло Аа ЖЕВ бек ЗК а Кз до цей ЗЕ 85 зай вт пів вав іх ув Ме Ба хів ве ВН за ж тре вай дев
ЩІ дО вже вжм ВУ а) ЖУК Кі Зак Ази КУ аа тег вже УВІ яз Ж тус
З15 Ві Твері аа ЗБЕ І1е хів зв Веа БЕК у ев О3уУ ев
Тв б ожекК ТВ ази ЗУ Щі же ми жів веб хіє віб Бе вих вия БЕХ
КЗ: 45 М
ТУР МІВ жі ТУ МІЖ вра пі» рее Беж вже ве ве ух Тв жа а» ув Ота Фта вав жі ав ока! тів ев Бу Су Щек Не 3 рей вух я З й ПОВ г М у ях ве ар ків ан зи вяр ІЗ Хе бек ар іє Ве ОТУ вНж ява зве «5 КО Ух 5 зе чі КІВ ТНе Тег го ВЕБ АТ бів бе Ма Бе БТ жТя вай Бі дах Кжее ща вуж АТ ЖІ МІЖ ехо жа) во жи Бі бегб бек сто зі Те маї з ух їв еж ав їі із ТУг ойза ах ща ВН ах аа Не те жа
Зх ща ях
ЗБ овЛе тео у АР УЗ БЕ КО Уа Хер дій зве ніх ев БО У
Б ях яка тек ІУ ЖЕ де дію Ту ек Хі ЗЕ его бог МК рух дз НІ бак іви сек Кіш біж бек о Біх ке обве ба Зее ав бух щі» де ака ан;
ТБ ЖЕ ЖК во ку БЮ БЕК Вів щіж Божі ве ок віє ТВ Ве
КЕ БО ща аг А іБИ ВкО Ащ Кух БМе ачй іа ту фев ат ака і ТБ оУдЇ
Ра зута ТвР ЇЇ ТБт вев й5Оо вк Беи Чак ожекК вів аж зав тує ЇВ ж 35 з ака піж млі ваз Мас Бі Бек вів ів лів те іх їем сію кі ле
АД ЩІ Б АЖ ДОВ КТЯ Же Бер Беж фе Я АР КУ Я ле вимі ява сій Тк Ущі Беб ків ав су чи аа ТБ БНа Су КБ БІВ ве ява ри ЖЕ У КО Ів вих ЦЕЮ отТжРОТВг ОЗБе ХЖК зе ек Тв оте
Ж М М на їн ага а5в БК ТКО Біб де Вей зіва вка тує еВ ТВ Лу
ВО М ва '
ТУР ТЖжЕ АБ ХВ РКО бі АТ бек бак Зак фу аб ві бій мед
Мох хз що рух авт 36 ВР АВО Тук Мак Тук іви ТВК вв Ді го За тук шХ ще та
ЖТКгоаа Ж БуБ і аяв ке ук Туг аго вка їв ТУ дан у зх МО МЕ зем іже Бе Жів жів був аг бує ТБ бра вжи ай БЦ Хе дев
УВО щу ОБО его вве УК ух хе вію яз че (Ре бу ев ту жа ВК тує
ЗО5 ВО ще ах вай щей шій ніж їі ві Бі Ту Бк вух Во шу аа дій вче хи яз Бе) збе ве їі ее ага УВІ Бі тує аз Я еко
ІК ЗБ Ки
ЗУ Ів б веб ТУР вух бує ек Сів Ж Уа? Бе сем Ата В
ТО. ще їмо іши ве СТЕ тую хек УВІ ФІ ве оБуЖ жо Тек ав Ах УЖ жк
МУ М ЩЕ
Зі аг Бебвобіу ви УВІ Ще ОТвтоМіЗ емо офіж о ОКТЄ Фів Аа еВ ре а5й АЖа ва їв їв) ЗТ ЗЕ ог ХВ тки ТУ БМ ак
МІХ хАВО ААУ
Ніж вен Бух Ащо бух іє ве МУ Су ащо Тк отує Бе жі ве в ТІ їв
Тео б Бі Тео тк о йха АБ БУ ям «Я «КІ. ТИВ «Бо ДНК і
КАМ ШУУЧНЯ ПОСЕЕДОВН СЮ ке КЕИ» «АЖ ДНК песезновніють. ВЕ кОДдУЄ ВОЛЯ «Не зач сдява свсвоавесВ ВІСК ЕККиЄс сопігтвеоу Кевстаєх есе есаЗе ща аепаннаяскї усві ВСЕТАСЕНЕС КІЕКЕХНКК сек ВМ 1-0
СЕК ЕНСВО КобажКктсВ сера оВНєка садове зецатеане аа 15о ес соо сакеевевая знезвкасво зр осаася сао аксегеавє чо ксЗеовяет Фк кзахацсово кекс екз закваска ЗК засзаавчао) возсдевв сном тека авакнс аявеає зе ЗО саазекасеу сасасцесах ваефкевовсє есе знии сс зЕсасВВКВ С соааво засвикасви спасає «вс кОоса сек кова «КО «КОКС В вазозсвзаза Зсжежажвих аіскакоссє ваевесте єкокеовае ха сн рВОєє сф кеванх тсеЗжееВКА ВОК жеК дкстазаєє Тесс ЕК
ВЕК ВЕК МЕН КЕ НВК МКК МЕС ВИ кецЕцОацкав. ЕЙ савассса в вста нас ови ха ЗЕ соВ тка КИМ доз оавКс саажосинає задесамни засос кеса сосок стбасвсвах т етЕкНа ЗВБ «І Ла «каш ДЕК хМІЖ» ноз заріяна ка щу
Ма ЇВ ів Те тує дая ій йб бок бе аа бек віз й тв Ту ї Х її 5 іжн Бра КІВ бер век ру КЗ БВ БЕ їж БВ бе ЖНе жа ве веб
Її їВг БІВ мех тів бі» заг Аза іду вне Ав Зі ТУР Бе нія ЗК о ! 55 ! в ви вер кує 36 ців ак бів Аго вет ев між віч аеробне У о Б Бе
НЕ МЕЖ Ку Те ЖІ фія ака же ай те БІК Бі дк ее Сем же вч іжи ва Суб Тв Бів Кв уз Хвгощій ВВа їв ЩІК кВ жа Був
З ше ЗЕ «вро жів меж Бомжоаже бух те Фіз тт рив из зів ом баг овне сте
Ж В КЕ
Ва ій же ЗіУ ар сів вв я) бів їфе дів 18 міх З Хі яв тб їз ще віз АТа Баг хек їжа тик так ак тд із ти те аб бів рух щу ше 35 їща тег тТЖк ТВ мех щяк або оажше Кен жаї ТР Бе бів яв ту век цій у и ; ев ТУ КУЖ БІЙ тк ще УУ У сечу тве св! КУБ ес ОІВ ОР ев тує УК ДІВ Ту ат Зів Уві тВе ня сих ЕЕ да АК Бір ав жаб ек сів їз Бе вне 31 Вів ще ше Сеж сем ви жає Бе щі ВК Ре біб вка Зеров ев г КІЗ як сне яю а кі жи ви ага Кі
ЖЖ жо Ж ів аа кг оМміх екобев ВР уз Ву Сех ОТжЖ БІК щій бе св ніх
«і іх я ве щі пі «8 вве бів зви віз вто Біж аїа ЦеЄ Уві! Вб ма! А3В
ЗЕ 7 ЗІ зх я кю ОАЕ ря. ке
У тНг обер бе Бер дій чаї Баг ная Фі ТВ обі Бе ТвкК Бак ВН» «ча а ах ду поч соки жом ві ВЕН Бу БУВ КИ я «Ще В. «Іі» Тяб «Ой КНЕ «А» шУжчна Послідовні Кт» «Ж «ВИЯ» ДИМ песлідовніств. яка Бод ВІЗКИ екю Я . вче пом ска азс ча ВсКеОНаЄ хек КОС а - г соди п й сеї куки еру их мах Ях скж вами КВ я зх пЕССІВЕІца ОСІ сВКсКоиНє ЯК ВНКс ССС «Та В: їх сову евути уч я Жим ж ох жу жеюри в ваує ту и - ех. сет во жу ЕХ веассваса охо саа Заст сукаевася сеча счоса какає ТЯ заст сосозааиає судкаксвоє ЗОсстшвесИ Зако ох севсаошех кеВ зссевасотай сесастацеє каексежеає стома сне спрею З ев ор я межа лук суху уча и и на ек А стає стос с защКоеєЗо тео фреш соц З песо Зсзхста паском весековее фею ца Яяха щциксічеккс щас тасв сет касє вешсханк седана Син еКиЄ Я жастстежн тес ееаК ЗажатасжеЕ сецитоцвас тост «аск а З жносако совдсжксеа спакяксокоу паща хсВтес свакаасяОє ЩО стоассвося «св ваєоє дес анає сВстаєваа всосовова асо вао БІ заувассєх зак х донос оц с Оса сакеВааее ТЯ есе хв «ке «вій Пет Ї «Ж» нене зврієпе «НМ мет іа вга ага аа віз аж ТУ Кжж дго тТВе зем біжЖ веб ве ЯЗ
Х х 12 ж зез ів ви сей івв іжв се ага ого Бе іа ре ве дію КТ ОТВЕ
ДЕ І Її суб вто БгО га меж заг чі бів Ні дів Ащр Ле те УВІ вух бат їх Бо З тек хг ів тує лаг ага і де ОТУуЄ Ті Су ав Беє щі КВе ге ака су Ві Біу ТгоБек бек зов тв ЄБк бух Уві вен Аки Гук ма 7 й їв що тТнг вав Уві аіа ніх Тер Тв отв БР Бак ів ву КУх Її Ага ажв «В ве пт Аз ів Ма! віє сів «го Реб аіа Бо го бек ші бів Бак У й що МО
ФУ Тк 1У чер біт 1У ТУ его іж вію Тр їх Бе? кву дів ав щі ех ж їтв Улі Ази Уві Ж Зак йо НЕ суб бух Ті Бі Ах Бе жів бій що 5 | що зар омає ні сів а5р АВМ тТвЄ сви ТуУг ТВгобів заг ав жаї ні его
Бек був муж маї ТВг АТя мек мух Сух ББе вен мен єї ес СТВ ма
ІБ Зег їжи біб ве шу дер АТа ог же нів аяро оте УВї ото дев
ЩО ї55. МЕ ів жі6 її2е фу Аїа й: дян дег іви бве дет вав ШТУ ях Уді ТНК ща В а сів лег у сує ух ії суб бін «Зв ем бін ств Гм Абе Хе гув я : «ув се бі РНе без (Тв ек зва за! вії жів узі 016 Жеж вне я ай ЯВК «дій її «В» 3 «бе ДНК «БК» нео зарісве весюостО паосовсоє озоосоосє стровонсє ож отовї стоєстея . састаєтемо сосксоассяє стоїекк сс свасваатяє зво тох отаке 1 паст кксс Зсусассав савееаскк фензаєеа сстаєна зазасвазая в пасзаанітО сазаасстов заз оах хеснОаоскт стае тазааякаОо о шектасети) асастеєє зоЗєансссс астасстаєт зстсваєвт: абсзвасова за паціесис) захтдозаєс зссвазсаск астодтвеся соц есе секта щи
«Екс К Місіс савасваєх Зезкасох сбетовао сага еВ скаваїсатов Євсслряцка фтасвасаює сзесвадцає кбабаакцва сеомчющаає я кристисєна зосзабосва зезасека зок акає акуктавак собаки що «тіста свай зайтзснуєв каст ар аскВЕ сеавЕВслає ака БИК
Зкетконнаа ебакасеє зачсвосі сакусанцає зсвовВнеє век В аБассаїтає саціваїтає закавтвсаст осока сао кає сссванЕ ТЯ песабповзяє сазасаоває савсісевах Кк «ЕН Я. «я а «а ВВЕ «Я» ноОше ващкейя «ВО» а
Ма: УВК АТ ТУ ес вв віз б53у ага аіз ев ців Уві се бек уд ї 5 їй ї5 ча су ев ід нів Се Не БУ Ще бів же Се бе ЕК іп щі
В Щі й ко мів тек шіу Ух щі Тек біт ахй жа тВе Ве вів З ва Яак дей 7 ЗЕ і СЕЗ а я жа
УЩТ Веа ем ву біб УВІ веб тер вує ре Фі іже ав дує У ка щи | 55 | 5 щі ев бів Ах ЗБЕ біз ке аку діз вве бек хає Ве рух Як агу
БУ ж | т що
УЖі Тує ММ хо» ТВ Уа Бегт бік беєс бев ТК ЕЕ СТУК ван веротне 5 вес. ще
Заг Заг ав зів Я біз Тек Біб мех Ті ес бте ази ур тУНе яхо їв ЗБ М
ТЕ ВВЕ БУ РВЕ ВВ фе ТУ Уа ра бін заг дм БР бе все тв їх а ах ща ке 8 івв тве сСув дів сви ТВК дя біж ЗЕ жів бів Уві бів бух меж жів
Ті Мї5 їхо
Рте Бім нів Тук да чес із Аг БіУ Кен ів БЕ Те Зеб ТРр лав
Суз РеОо Ве ів дія бух бух ага А зве ТВ За ХВ тек оба іже іх 170 175 мет Фів Яба ов Се) БгО Бій гуж жів бів Суб те іо дев дей. Вр їй ще і ББа яви тн тйК ек вет хів Її бою Те отнК Суб ХІТ РО Бе
З За ек сію ніх Бак АтТа ні ака Тек оаів Бе; жів бо жів Бей осв АЖ си лу зум 24й Ах Б
УВІ Ж тТвР тек Се жів Ущі Бен оте Меб ай сіж ті Бей сб Се
ЗЕ Яд : чи ' «5 ХО їх о дя Ага БжЯ БК дя вує ТР ОА БЕК АВ 5 БЕ «вою 35 «кає» ДЕК ; «АЖ» нене зар'тянех вЕшестссєв свасссско псссВсеКЯ СЕсЦЧеВетеЄ Забсестаєх сени ета БИ зтсссвошяК ЄФОВеВаКВЄ ссацувВеаеК іст саааВОасеВе се сци ІД озашЗсв еко вік Вес сто вааєє апеесааНєх свв ї15о
Чапасєсскох косетааяааа дао стаєтс скусевммю всозасеоова чеебеасаа о стозпсаВеВ сосзаЗЗааа свое зі акт сазастсє совок З зжеавсаВст вас сЕ света ааастєсв зач сова вссацсасеє з
СсЕсСЕСТеКт усне Є оослациас єкта ска сао ЗЕ цевесссзоВ спасе со а сексом зозааовеєх озвасоцево що ксвостоє сс комою жсеаеочє серсовнае ее евесвЕ 585 щпевоскаваи секс Кешссе сесхпяеско засос ссср ас БОС цаоаакасий «осв а соевЗОсксвВоа сте соссаценає ес вва ща стат скани ее здана вся сс скова коесстоцає ТО песто смс ОососВеКе сао ає ознака засиковає ВО сесведдксв ссбакодсва сонет «соска сстозоєева сохвассцєВ З пецовсовю ссакесвУуєи Зстоасееах асвоєватає орних ее вну зсвствсвах сек сесВЦЄК: сс аква есе. За пасЧєсксво Ва асюти оцжолен аеро сесечееста васканово ЩО авшсточнта сої кссВв «ксашекаст восссдаво сеснтсее зссоааоосе ЩІ асессаоцем саке се БЕеВЕс БОЄТЄКЦКВа ССКТНЬНІНХ «оссадєкВа. жі ксижвтнсася «сзасксвеас сере е сере зоессссв астоадЗасова ТУ вщишщетЕве сровавсіо пеасотолеса цазазексес восзааетес заеохоссва ща ета ЗессВіжсс єрвостсаау сесстаао ЗМО сс 1358 асоснаозає сасевастех свстсовоЗх сееозОозка сссассееа єсооєсевоо На шин ксяа: жо тее ссосаанно зскосовито тост сового ЕЕ ажтасєвеся ссВстовове Звсабесосз зеоавНе Зсастоваца сстсВОсВО МН тассеєтата вссссвОуєє баевозссвео авасасаає свв еює ссвааааною о всесссжив азссоаасяс дова ссескетав 1 «ММ С. «ам ОМЛЕ «вда МЕТ «ії незв завтене ев ЩЕ мет аїва Бгто Бек о Зер Бе аго вро вій ву ВРО Аїд Бен овен У ее
Х 5 кт її мез єї ат фею вве его сіж веб бік ай а бій ТВК о бег уві зве ва 45. З го Бек ух УНІ їі сви вке аг ТУ шір зае УВі веб ма тек оС» зх ща 45 хег ТВ Щек сук а Тв го гу ве ме Бі Зі вію ТНК вт ве хо У і ще вив су їУЄ ЗР їез ев зов ре діє аха Ай ака вуж Уа ТУЄ Я іі Заг ам: У Бій Зі: ЗБ ЗК бій ККЗ МВС СУ УК ЗВГ дав Сух
ВХ що з вго авробіж Бій хе ТВБ оаїв куб те Не Бе тТвК Уві ТУ те ТЕ вро бе ага Уа) вію ем дія вро Бе ого ЗЕ Те обія бе жав вію суб ахй БЦ ТНК зі ага Суб Бій Узі біз біт віє ід бро Ага дів 33 5 ЩО зей Бей тТВР оба тВК кеб сев ака Оу 13 БУ сто веб фує темі
Ях ща їУ що
Бгто АЇВ УВІ РУ ів бе Аів бін за тве Бе жвР оба сеюж таі аг їх що 5 вка аа нія ніс ші аїа де кНе бек су» Ага ТВг пі ве дав вв га БР ія СІК Бош є вве бно 51 аа ТБ бер іа РЕ тУК щія
КЕ ща Ох Й іа Бій тТвР БЕ і їжа ге віз Твгобке Рго сів ке Уві дев рго я іх кВ
Кк ох ЕК;
де чаї ау 610 Уа! або Те бів фу тйе Узі Узі сСуз 5Єг іже вор вих ве ка М
ЗК ец вне кг жа! ек іо аа їй та! із Бен вів мем вію ар яко 555
Бій ко ка аб вга ТНК ож! Те ТУгобіу йей АБО Бек РНЄ Бек АТЯ. я КО Ж іже Від ак ма Чек Уа тик ів бі бер БІ ТУ ТВ СТВ А Ву кВ Х КК о» те сув а) Ві 16 бе б1іу аа Бій 5еб бів бів таке іва бів ТВ 2ю вх ОО чуаі тве їв тує заг Ка верб АЇа еко аяв ВІ хів Беб тБе вує ке
МЕ ІВ 5 ЗО
ЗіБ жа! хеб ось сію тве бін маї їве ка? вуз бу Сію тв ні вко
З Зо 335 да ати ж УВІ ТВР се дай Оу Уві все кіз бій ве Бе щіЄ ВЕе
ЩІ А | Зо мг ах ів ев ве) вно бує Аїх тТве обов Фів яв аз біх ага ЗР 5 ЗО ЗБЕ вве заг Суб пет АТ ТР ев біш Уа? АТА У БІЙ ів КТК віз вух о 5 35 вза ін твг АРЕ біб венв'аво Ві їжу тує пі ВБРе ар Бен ав ТВ
Зх | БІ: С ОО яю
Ага авр о Сух Вбх бі а Тр ТКг ТР оОвсвБ Я вжи бек бтй бів а ях о Я ве нах бух сій а! Тк шіб аши бро се Бо бів ев оз су фу
ІВ 25 СБ ер ах пі ТНК ов Без бен орг Її БТ» Біб бе узі яв Уві ТК
С Я а жто ар о сец Кін біУ Те ТУк ві Сує дку аб або бек о жве сів ві жу 455 я іш УВІ ТИР о акш гу Ух! ТВе ув) яБа Уа зіву Вег вро деж Тек СЮ я Ро и нив тів Уві Ті хіє те УЮІ Уаї ах аіз аа жа! Хв меж їх ТЕ дія
Зи5 Я ак «Ж ви ак Тпе Тек їсю ТУР ази аку бін або су же б Кув ту що 5 і БУ ака вен бів пів Аїа ів Був біб Те Бре меж ух ве а ТНРеОбія ве Бай ка дій тк ов кро
З
«ж У ях пу «гай» ДНК : хе» ММ баці вих «НМ ши | що зстозаскиєв каса нока попнасякеа севтсевадх зсссвщНе свассевее БИ сВшеТЕСІОО ТОстпОстов ВеСКЕсТКае ЕКеТОКтоЯО ЧсОЕЕВтсВ «ВХ ще чавназ зацсвсязес зсссіцЕ согсвсвас ІЕЕ ЗЗаБСтоВеВ 150 савани соїзенана заазазоааа ааанеаасОє теастаЕвяє паста ає жа авкеонасаЗах секс саван есе атак саєтах СБК Є ЗО асссвавКк ост ссср паска зо тес БІ квтденаязо асОсСтхтсаа ссооавяє соостааає тож тасс вк сазацох а зпвкжескств сзссхвосат ЗісеВастеє пазастесяя сстстзатаї сан ЯКО весеостсаа сс є СУС тЄсвуа сстсасстех ссфества заасвовова ха зва анкЗ ссвеЕсвниас засво стсс «зара сскВ вазетовост статостаг БУ жін ех хоча си сан савсс аассвсВЗх ссзставес своє В созсаттаа чаепсзаагсв звссстевє коза єасва сбазасаява св ТІ патааестк тсесаїсетО овес ккааЕСКСВО СВЯТО ЕВ КаТаВЕВ КК аосжцестоВ сс Бокєссзавя боса соя сова ча завис а ссокакески ока що «аю В хи» ВВ «А» ВЕНИ жарких
Мет вію Ніб твг о АгО Ага ія Бі їНк дек Бе же ух Суб Вре Тее ї 5 їй їй мем ази бе вл біл с ве) УВІ рей аАТа У во Зак Ні Не су
Й 5 За
Зак бік Ук! Жіє Ні маї УВгобуз бів жі УББ жа Аа тв сб хек су фі Ні деп уд Хек ща ів тю Бу АТВ ій тВе вва Хе ку хе | БО
ТУ го ів тя бій Був кя Меб Уві фен Тк Меж МаУ Зек б1у Вер то 75 ВО мега їі Те ве ів Тут рУє ваза ака ТР Ії вав вав ТЕ ТНеЕ дев ав ве. сег Кіє УБІ гів фер АЇВ во Ага бто яек о ахр РН ТУ
ТВЕ отже бі; був Ві м вам Кух ТУК ів бух й Ай БВ Бжж АК пос КОСІ 7 в 7 7
ЖЖ Ж Я сів ніх ви ат сій У Те ей Бак УЗ вже 13 аж РВЕ вра тек я аск - п 7
ХО 5 о вго яег 16 бек ав вяЕ Фо ів его пр очек аа 316 Аг Ага ТВ їжа Ка 5 М їі Су дек Тк Зак іУ зів ВНЖ вто Біб вва Бій ар бек жк еф
Я ща 125 сії ха У БІВ 5 рев аа АТЯ тів вер ве Ве Уа ак Кі жУв 7 ОК, з ККУ. су т
МВ їК5 М вт бів ТВ ів це) Тув Аза та хеР бек рух ве аЗВ ВНе ах ех
ТВ ТВР о йув ТЯ Бек вмБ МЕЖ СУ ївч тів іх туг БіуУ нія ем ятв
АЖ Ах як чі ага бій же Ра ахй ТР ав Не ТВ вух Би їі: нів риж вк
ТЕ я ї ЗЕ зай
АХ Аа вен ін Бо вк теройія Тв Твт бен ові Заг тд ам ік
Б то 55 її вно узі їі сСух Суб ве ТВкЕ Тук Суб ВВ Аля вга де су аКЕ
ЗВ ах ай зів аг заго аг ака бів аг Бан Ага ага іш як чув! ага вко чаї ож т ПОлхгх т т Боже т и ши КО «іх 5 «ем ВК шо НА свати «Же штучна сослідовнІсть «ЕД «віз Коден-сонтннізовина ДНК. яка кодує ЧЕ-ЗВНОо МахівВоа сАВХТ3Б7.3 - вовев дасте ну Ї ! гтевванкуї «и З жено ча саше КЕ Зсестеоєє Вей х Кезечнє стЄтКЕх ща пткжоцеска сСажостоВе теабуооакс ФЕСтесВКєє соска соє датесасавєе чай восарсктсх афутотсова сотодасаню стоуеоюосє дровах фесстоєвсю мо тссркєйса зесостинІ стопа є Фосцеєкс сбаватєсю окаскасово жо пезвоцрахак сзоссаах кеша сткововВтеЗ зас (осв зай тсстоесто ссостєєсвов сооєзесою дОСсЕКисєв Фамоссаста сиосиєава с шпкдзасвата «аОцесежее сОскпесо сееуссюк зеваваачиа оку чів сідсасваса зосісаксво свозатовка сасслаЗока стассттеОе со «ай зе ес свастетосє скзомесває зецевогієк комою «сесекув ЖІ пасом зсзссясвох оовссссвас веспостаєт всаасвссває аежсвоакає ев пацдоссасво век све сжакоаоа сеокаєс шов квасстдвес зв касою буаааеся дітІвессх смижесієс кое ва спасає зе жене стєсо псазоєо свасвевася деєвадєтех сссууааає овасоєсюя ща зккцакасся ссвуааюн віжки бебзаааска анеаовассх сеопевонає кю атсвоаастско дет стос осессевесю псоссавова секта зво свзцсксся сезонно саасоакссє БосвесаВсВ скясвасеоа засос у ММ
БОКУ оСТрНяКк ВСКНеЯІ евсаєтис вевУсевоу каоаноее дово пфскусованс зсскевосвс всеодеєвес Зееацкасса песксваааа кс енее зі ваше сезвєвзаєвао каса зсссскОтк ясавнсюви сао зо сосевссеаЕ СпаВенюєв Єкесвоувеою ассзаєжсу асавосаєєоує сааеВакаєе уза сЕЖЕКЕОсси сеасВЦючє св еексх звочссоваа абз ає саше о
ВссОнсЕвЕЄ їозтксає саскассвкс ви свсаца ассакаВсо адссоєєває і3к засавсазта сссассасса спасассозе даоваася ссавстєта свв зав «ЕВаЕжИикох ЗевоВаЕсоОс СОСОК осока СОМ Зк есвуВ як сецоводска тедкавасоє тсвосссная кбсааЕсски автскскаск капа еВе ща сароасочю ссостюєсВк сФфозстооса содаетеКеЕ ассесоюасє аоскоєтювя БО
ФООзБсЕВт: ссоБООНОсІ сабцсвснає своракоюєх КВН іШКОЮ ссбосрюсво БО стооставеу засяє доєтсткєюу стаєте сдмнеаває кс ковоа ідо
ВссСЕЄВОЮХ ЄтсїснексЯ саворєтаєт озекесосоє кесваєувтю сооеюровою 00 ЛЮ спсевсВеко КОЦОЗЄЄТОВ ЕКОКтОєє Оавесесесе естосасная дев зва
ЗасцатеЖх Френе федоаовсво кедасосво сс твоя созесерає ї58о пксактаксо сезсЗав ство ан: ее а ме «КО ТО. «іх ЗВУК «Вфй» ВЕК «З» жеВОх-науУ аа ех о
Ме пі УВІ ТВР ОіЮ хів во сів ву РКО дгО ВВ Аг Ва ух КО
З З 19 її
ТБт Бек Вк віє фею тт Уа ія їі їз бе біз де тТвг о бВе дер т 5 зв ях ЖЕ БО їі го без бу УТ 15 нія ахй бек ТР Без бі" та! бек ав ув! ох т КК КОД щі ТІ авро цу їси УВІ Сув ага зр цу жо щеб БЕК ТВ Аза БІВ Бе дев ет узі Є1у їв аа іо бів сік ахп о сіж Уві аа Тв? оахВ уд во ти 5 КО чек АіБ їв вуз заго ТТ сі ов ага бек Бі. Уа вка Бго губ уд пове пов 5
Гек ХХХ хо
УЩі дже тук бів АТЗ сі 1 тт аа бін аж Сук туг дев ве бів
Ю що КЕ
І1в суб уз во АВ бі БЕР ОСТ бух фев вго АТМ ТБ РРО АФ ВЕ
Ме ще 125 тів лаку сту РБе сте Аг Суб вко тує Узі нії суб ма жЖек БТю те
Її їі 140 пі вка сСух вів пі ад РН дів Бе міз рух Вів бі 18 він еБа зу ; У АВ з і кає їж що Ка ще їжи ТУР АЗр акш ев діа Бек так Уві хіє ту два біж ТВ твк ее 155 і-ї Мих
ЩЕ с ке «їх сі кущ чаї х Ж ВЕ і р: хї йо кож ККУ - ть й й їУВБ Ук Би
МКК Ба Ку щщї а в МЕ В ж КЕ а БЕ ше А Му Мих ав
Цю КВУ ї5а
Те Ре бек хег нів вга Бе аго б) БР У! доп АТО ТНе дів ав їх З а вКО деР Бек йіж тТуКк ТжК Бек ТК ТВ» жів го ту біз вів ТВг обу за ши "7 5 7 аа 7
КЗ, А Кая ке ож те аяй 1 ТВРОЄТЬ Тег си ВВЕ біб УЖ й» вай во тТНе
ТУуК жа отв Беу біб ще Ак ее ТК вго біб ВБе реф овен Ов р
Я ЗБ КО
ВЕ бів ТНРе ОЇ туге тТвгощВР СТУ ух ага заг а5я Те тВг дію рук ен ЗЕ І су й 7
КЕ МА ЖЕ
Мен І їБо вуз Уві Аяя ВМО отв їі ахо Тве ТвР ОЇ БІУ Біб ТКе ях ВЕ їх
ІЗ вне крої Тк вже же ав ев ТБг аг фу5 ї1е гу баг Оу ха я Ж щі ден шаг вве ТНК та! Уа! Заг ай О1у ві Буб вай БІВ Звк от» зах за що За «іч Бек Бго іа ага Те 5ег бег ав веб ік те аБа твР ОЇ ВЕ щу 53 ї35
ТЕ хо вх Жофежх с ож. бМажо жижкк Ж ж дура жов ВОК кю зх С р іш я5в ніх ух Ті Меб дій зЗег біз й зве бак вів меж УВі вія о БО 5 за) нія ве бів бі ага біз вата із Узі ве нія дви ве Те В)
М т ж ва 55 з 565 кіз те (ів беє Те заг Бра ба жаб ев те тр о БУж фре с сіж вра
ЗО ЗУ ЗО яв ази ев ТНК нія Ав ТаР ов Уві теє вух вав аа жТв Зав дв жах З З ЕІ аа тне 5івз Уві сів шій ні ніх ак ага тв асо аз во оба ТЕ я ЗО 5 діз баг йб5а те го Зегоазя Тег отве аїв віз Бі вро бБгО був 15 оів ан Як аБи ТВг обер їж Бак Тг оа5О Во ів» вар б) авіа Ве 35 ще БО. тТнг зве Зав овге Фів ач вії баг ів їйг оаіз біу дев вх дов о тве щі 5 я ні» ні бів ах Тк обію іє іш хек аа Баг деу Чі вух сан обі ке І У «ЩО
Кер жі тве ахи Таб їі Та піу уві Аїа бі ву 36 ТЕР ОБЖ Ту ях о Зх
Ва Аго тВг оваго ага ой АТ ЩІ Жаї йхи із бій БРО руб Сух до
БІО кій
Ргб ачн і8ц Ніє Туб те таг тТвг обі Ах в ТУ із аз ЕТ ТУ іх ЗеО щеа кан аїв тер тів РРО ТУР вве СТУ еко аї35 АТЕ бів Бі ків ТУ КІВ що не що
ЗіБ оту МБ Мет ні яки БІЙ АВ ТУ во ків Суб Біб во» ака їв ща У 555 о їи вів ай пів тТне те оБій ал кем сій ве) ве рве кре дій Те зах ато ЗІ
Те БТЮ Севовка те ОРНЕ ЗБК ОЖТЄ Беновей АР Був ка ія ву вне 55 Зах М цем ме вій аеро тке Ту У Тег осув ніх ХЗЖ ЯМ Ф1У го Ар оСУХ сує та бів его нія дев Те оТНЕ БуУуБ АяиИ Те ТВе хр БУЄ Її. дв
БВ віх 5 пів хі бів нів дер се щі ар ж ТВеоБеб го а» ої бі» вче
Во Ва 5 що. ак зв ве Те) ТО Так оБіє їв аа віп те гів пвУ ав ої ге ах ОО ІЗ
Зі Уа тве і шві Те їв іх м їв аа вв НЕ сих І КВ шщіжЖ жа: Те ціЖж Ущ ЗІв ЖІ АТ М їв іа Бе вне си Же же
ОО ЗКУ ве ух Бе Уві вне «и ж се 59 «еЛж тТучиа пОосплавВН ть ек й «еїЗ ДЯК ше нідавність. ща вадуУєЄ У НВ яю «Не КЕ кетавоссех стзсассксс кооссаос зсезостасє яса сао оте ЩО лезвттатау чспсаакежк сти саве збо ас ссокоагоєаа сс аа 2 заєзасшаєє зу асвацек ссавмикеа стоссскай ща «а «кеіЕк Я «и БЖ
СЕ» УВеєтвіз жігив «В хі жів тк тує ні бів іє С ща? йів ре таб сте мех вію м в
ХЕ й 3 ї5 ва іс тів хв уз Хі УВІ їі Уа! сСув ЗБК Се а ув дев ай
АВ ОВТ Тук фу РВЕ ОН зух фев ге реа.
ЗВ:
«Ж Ж «ем «ВХ» еру ЕС КОВН В ЮЬ
У
«ке ОслІдДоВНІСтТЬ пиву я ЩО Що с заааатоня акт ЕсЖЕ ЕТРІКЕТОИ аасасвавЕВ я «Не З «шк «ле ДН . І «Тійх Штучна ПпОСАіТДОВНі ять «я» веслідовність проматеву «Я я ШИ шк звахаєтаах: аск таксКе жеіктткда закжесваака зважав а зааотах щі
Зате ВОК сОВЕ ззааеоюнва незевакееї засстаєтває ясопіскоде їх назазссяах ажастакісє застає аецоККсоує зако заастатео за вистав ас ант ссац зазна азс ааКжЕажкОє чеВО КВ «НВ «ЕК БЕ «ке ДНК і «КІЗ» шщтунна послідов те «без еслідеовиїетв пренетовВу осла сси сЕсЦККЕКе ЗЕВОаТаВОКК сте зав ааа гасватащх ща зате жсвЕ ВН НОВ виїзЕЯКЖЄК ВБІК ає ЗОВ МЕ «ові» ЛІ «вів ДВК. . «ЖЖ КОжіршх ги «ще 85 . ааїосаїа паста зсазевавса сазсаавсає заокааєєкє птзасавося В хазетвааає фазизааава зевссаках завасвтаза созасвазаа застав З «Ох «ії Й? «ЖІЇЖе штучна песнеВаВн ть який і каой» песлідшавість проматеову «НН 2
Екс тзанав СЕКС КЕТава зсазажнІсє посваааеЄ зазавастаж сстаатетах ща мвсасуцісс співає саваансва сесаасета песо є засавааакх ї20 паза кова жтя са є сесазнаакї дез васкає ствах 150 ковку кана даевеветщи фекваєвеаж овес й «КВ В «Ав Ук «Я ДНК «23» щУчна поса ДОВ са53» хХюидонеоптимізована ДНК послідовність. йка кодує НЕК СНХ САСХІВВОКХ є нове дастуву о танканюю зкозвивоса зн есвсая зіскооако всесвовВесу сосок сиї совно щі кавскзсазца тестове сеЗсстНтеє що восяоО Феасснся пев ща зкгсаІаенс яссядасовс сиасекуоа За стосе Вахта сВ сова секе їі заіассвсо тоцастесся безазосвес засаосєтеє встав єє опвкостосає ад сасдссеаес воза сявЗсавккс стбюцязаасе Зоо ива песо. о подсасоцєк тевовексв зекоусдовай зазна созаосіаєх обавоваєта зо сЕОсстО В ссоускоков своє зОвссеакек това оерсоаокних я зараснассо аассЯсює КщОсКаеЕЄ стОЗВстесо скооєскацєх СО аа ЗО ско) Зсозоеннеє кмаєсвовяа завоссавє посвваєеся Фасновсє що
Віри звВЕссвВава сеєкасеого Єбосвовоєа соассвсах еВ ВОВК ОВ хЕсВОЧстше тосовасева СЕгескоВЕс ВАК ЄТОЄ зевкскаююю зав кеве БО десВешостю досвецасоє сзакансроє шкі соєся абавеотоде ссзавесвоа ТЯ хек соток пинвасвово стека тесоваЗаа засяє ТО
Засикавцас рас сст фосесвовос десааадєав зозасвавоє свасаєтє ще задасицчксс ск и бекоссас фак сосстеквє СОНЕТ ЗО влсстюачея зима сколи пока сесвокаа сука В сиве ссзсвщмесвз соостетвсй бер совКа сгозасеню соаосванає о вабсанскав звозцесиє свсзпяйесє звааацсвмоєс Звсвеваека соска ЗО соусу МКС сссрасває кажваяачв зоаксккожа офсет ща кионациниЯ ями све сткосаево ассвесека тозспассст зе ояа з паску вні ассЗа чосоЕсвс тссвеНКе тосСтойавяє свасиВоєна іще вени чЕМо воаажєцасак сесежтксех фссссвкея зедасаасов вас ЗК сачсачачко аспаскссве суден час свВ мсек сновх саке о сстичечасе ассоцтна саеастакедє пчекассєса дсоаовеє евакосерее ЗА деодасекУВ кЗссусюєох сек сосок веовссасва воссаокаоє КЕ
СЕСВИОМОЬХ асаасвакав осасвуєсто всКоцовесв всесрожваєтва орех. їз зок свуа всхсечкея сатосссвао засовсася сесвоваєва соасвасесе МАО шеесВоВоВО сесадруваюх сассєювевя авсзессвчо всасессхає сесксвевох ЩБАЦ
Фк стцаске ссвесаеюта доааассоо кссавеуєє сао чця сувкасецає 35 адезжесскеЕ ксескцоааеє спа азсваєсаєту вазекакевх сассяксак Ї5 зацавсжеса севскествє свсесстам сажсвокес асан ааацевеекв зва «кктсазинаж зоеоскаона асавсссває сазакексо ссаоєовови вес ХОЕИ зацссссаса зсцедсвчна сусоЗадона акшкассоок вовсессвка Засссааоце ОО сесія совет секс) ЗквасамН Вага гелеве О зскопасоцеа азам часа скла Чеки косКОвН а Я зоспаажо вчссскова созасаас соцетеакса ссводдасо поса ще ескоаскса хожгеоаасоса сесцаасва) кто зестВевОса сслеаао са ще сказ « Же х -о МЕТ ххій» ЕВОУе СХ «ВН Я
Маж сія бек ага ія нів бе Ді тер омає МК Ні тве о аїв Бак Це 1 х КК ї5
Же ТО ТМе дев тик Ніж щеЖ Хі іо о тве Та ту ву бе тВ щІВ 2 КУ з сів іх сі Уа! яка ої кто Уві хів вія Уві нія бів жаї Яївг ака ї5 БІ Я їжи він і ЖІ СУБ 55 фе 35 Ж бів 13 вве щів Аа 51» май ща 7 В Я вв пе сію Фі яег лів даю ее ба ібн фви МУК ін сю рев Ні
ВЕ т х5 ВО
Ме Аа Ту Зія Бі БО ТУК БУ Бій Бе іа іа БК дя 513
Б З я Жук їн ів БіУ ніх йіж БНо де ейв бів ві аб уз Бех щі їй ї ї тах божу
ДУХ ХВ КМ
БІ Мі вух ака ев он БІ Боем о Бем Ро ді Вів бек ваг БІЖ вух ще ЗО Ма ек КІВ дго Ак тс о кжу вів яіз век вже бів бів бів Яр отвК зів 335 135 о іч жи Аїж боіу ТЕ Бе Без Зає вве Аїв Зег бец Кфе фе бує жк вав Мяі УВІ 1 бій БУ Ві Суб бен сфе вує маї бів зга от діє
У І5В жу біп а! нів зе бій бів бі зм зів БІ тже ве тв аїа ТР ія
ЗО 185 щі баг жа бі нія щеЄ меж УяІ ЇЇ вне вагу і меж ве те НЕ вне
Ж ОО 235
Ма. же їж ВВЕ ву Бе хів Ні бій ОТ меб ні мес ба! вів оту еще «їх а в Фев сх р КИ дж жд Лу вх Фожю в вт Кк дь х ку:
Ні ач йіз аззлп аз вів Уа КІ йїя 5 Заг баз аїа ів я дга
РНе ВК ціу фев бе) Ті жа бух Тбе У 15 дер мі ів ів щі
Мо Щх І ЖК і . ах
ВК я ки же їВк щі нія стю УЖ вт іно нії без ве аіа вга тн іа у
Уві ух аза от УВІ АЗИ бек РЕ уз її ій ев Зак ЗР фен вів ши ее ех чіп нік біУ біб Тк Аа бро Бе Аза ага Бей рам жа кеВ Бек сту а : ХВ МЕ
Ма! ахй ах фею вів Мі5 біу цем Рбе его бів себе бег віх Хе дів
МЕ що 5 м вік жі ща у тва у м шо Ку Мехах В ве АВ ші Уві да а
МеВ Біж Уві вла ТВг ОАІВ НІ БІТУ 5 аг и Аа Сію УдІ Кам УЖ
КІ що що
ПІУ ів бій тує БІЛ БІВ сво аг сів ата аа нг оєт; ай о КУх
Я пак Зх щі
Ка ї45 ЗМ бій Б) біз кУух ТЕР аїв Фіз зе ага Бі свв ав нів в БІ су ар АВ ІЗ Оз в КУ Зі бе рух 5 ВВЕ Бі пів вх Був Ва
Шу 7 Зх 7 зай "
МАМ Зх ее
Пій жів 5евб рне бів бій твготне абд Ме маї ТеК вес лев Ух сте
ЗВ що їЗ5 ща ва івиу ад губ ев ве Біб АТ її те Зак о їВе Бак ву реп вує
АГ ЯМ йРЖ БУБ БМ НЄ бі жа ТТБ СТАР Бек не Бек бе Без СУ «Ех я БІ
Тв і бує Біб тТУК аж Ав дв вкн Ар ТЕ ро Ва бра бір Бте хів Аа або АЖВ СІМ АБУ БАК шію бін Фів вжр ев жов вро ТВ же;
ДЕК к ч Є 5.
Зх ЯН ах
Жег ців аеро ти» Тве тіе РРО Абе ЕТ Т15 У! дя» бе азр ав ВХ к ВК 455 ОО
Зако тук аби ази тТУг сту ав о Тук Без Бег бін Тр оАіВ али АТ во ах Я ЗІ5 ЯщО ів вв сеча Уві ев бе дов» ж В ав у Ве ІВ АВ ов Ні що ч9а 455 «га го бек цев еб Зк біб жа дей Аза Буг Ні Зек ер ТВе Ту
З З
Те ахр бег Аа мух ТР бек ак їв; АБВа агРЕ ака М ТР ода Ме
І КО ех
Рг зуз же ар бек ТМ сів ев ази ахи ов ро ліз Бій Аг АВ «о За 540
Фів бін ту дів аб Ар ви хів Бій АЖЮ ТВгОРКО Твг оБеО нів Ага
Зх 53 5 ОО віз меш те Рго віє ЗБК ТЕ ші Те б1е бек аа бу НЯ Аж Те ас ар тів зр обо Х16 ве РРО БвобБів Бак а5В їв бін доза дев ївВР Бі те тВе (ів Те тве тв се АБА ТВ Те АТа Ро КО АТ ах БМ 5
Ра Ві ТжР АБУ Баг АЕН Ба БІВ бух БЦ БР цеб Бра БІВ Бій Сух що БІ що
ЗВ Обі ге бів вбО ака ій зі ее бік бек бів аха Те ар ав ща КО Вже ва
КУБ ВО ні Яве «тн зів бе" ма! 51 ін мес ту ага ів ків (оц
АХ 55 КІ ців ТЕ бів є1ту веб ве аб аіа жів Бу Ту тУК Тув має век стве
КЕН, Ох БУВ пів ій вро ті УДі РН Заг тве бер вв ст бує бін ТР Ма тує
БІ чо ши века хв бе їви ів їж Сів НІВ РЕ ж ТВ Бер оба бій Суб 515 5 ВХ ТО
Вів ам лев ів зр ай ВР оБне Жіє Те мес аю зер Ів С вив
Зх ХА ТЕ Тео
Туб Ттр вт маі меб ап із дго ай из БИБ Меж 15 Іі вно обій тах Я т ніх нія ву «ЩО. «аж ОХ кЕех НЕ й ха» тучна ПОсвідовнКх «БЕ» хесй» кадон-соптимізозана ДМК леснідовнієсть, вкщ нодує звеБЕЩОУєіВ СКАЗУ З о ВЕН ВЕС ТУМУ, г жнеаниКХ «Ой» З
ЗКУЦОсОВес везе тоєт зеаоєтисеє сродасавок сесодааиє сарстеевеє ща зевтоЗоса театсосоцох созпааацеє коса ає ссссавє охоче 12 засяє сскох вашеовссох зассезеєво стзосавоєв вабасевесх обов ща
Ччаксадетаа звесепса єскожаск Час воєу ссосвє соасжкскеє я засне свека заз сек цажоє косе кованих сао КЕ
Зегоеєвак судсювема сеуєквсває стола авеє зу суВ сег ЗВО
КОЖ ЕОККВКсСЬ ТСН аца ЦК ВОТОсВОВих секр як
Ффасивсоса сопе кЯєа ссслдвенає ССО КЕСЄ веде сс ЯКО сіцівсцакс ФК оцеєтє саке сен ка совок я
ЗІКоестїКк Єдатскеує своє жеасасесс свсаовОссе соссзтесоу пов пащосузтуа ас сва зааозссаоє мес ссасстекта сети ає БО снМоекксцица аскекоеє созосвк весвесетОє совет сеасановВКе за кро ваВає ВадасВоВок кое КВК КаЕ Хосе: що сае Б катета засн ас сао зас ева сову есасоссае ке зсаасцеке вас оВ земне сви оваесв звана вех засне я схема са зазазсоа стек «кекс аеопауаєвов соасоакове Й шиєте Нє сао; зесаосцекс оживе ваза кВое МО песо ссааовасва сссспосяко ВІСК Всасисисох зап спацака Я зсжскскста зісвозатай сассвавоє зожсопаа особ овасвс ссаповавех ща зкювесовом сзфскрєє свтсаскак зссзасовса зссасатеся закевоєвис ЕВСеЕВ зЕковсвісс сфсссаеао седесвовко ссзавкавен Ессе зосеоєкВе їх «тиви зоасжкстас сасасвсяеє Вес сств деко своя 1 скжаксВскс стсстосво садсстааех сеааствеко вапевессаВє сстпаееВие іо секти аея ссасснесес «коза чисто вва св ове Но сиважсвске ФсаскосВас содсатосто часто зесізсваа асвазсаоз ЇМ вен Унека ясжосиає сасспеєааа ссаасекся вес овски ска асеее ще кадоваєви зсзасосєує сфе спевеесеек зехееацеос ско еає 363 пднакатвтяй «сов: уекосяєває садаєоскє соц Оєо сстунозсво вва сженслаєі заассасссв шрастаснеа саке теах зассвесає сема То асктвкасся фест анеВО поза ссє окт жевис кобуааові зозсчеее ОО щасвоватеє сус ссс о Ст євВЕС Звассккиса асСтозассва пак сВею ЛЕО цасзазаєкиа аксвовееа сеаковевє Зіка КОБЕОвесВЯ сгсжоюаеве Во пасоасваст зопсЗ4асоо ікс сова ссто сс асно сассвсене М
Вксексакі ссамтак кісок мОє піревеаває ост Осу я КО сан Зі каві БУВ «аж ПВЕК «МАЯ ЗЕВОУеСеВ «В Ж «ОО»
Ме щі бБіЖ Ве ща ев зви бій ви КгОо МБО ав ку» вна Ага вух я - Ж ЗЕ Вей ї
Х х АВ Ж. бак Жак вна вне Уві Тв оУуі жів хів іон й ів уз 18 вва заг я 5 за
МЕК кре Зв Фіж УВІ ві ТЕ айв бек о твк беб ів з пе зо тів ко ів сви Ві сує БЖ Ар ніх мен віз ас тв вав Фів Бей щує ща і Ух що
Зак жа ТУ цез йяв ен аій сту Ба ім Ущі бек Те аа ів ово
Ко: я я 5
Хег ів так беУх йга тб о БіЖ Ве заго Заг оБіЖ Уа бета вгБа тех Уа
Я за ах
Ма бер тує дів дів біжЖ їв тТев Ал Сів аяв сСже тук вав ве
За КЕ Що
Тіз ух вух Ро Аз БІ» БЕК Сів Сув іем вРО Бго Вго Бко ав ох ха І 1-5
УВІ Ага біЖ вЯЕ вРе АКЯ Суе АКо туК Уві віх сх аа б вію тв
М 355 о
ІК Ре бух вгО сБУ во тує азів ке ніх ж а5р БіЖж дів ВВЕ вне зу и їх ТО ви тує два аго 18 із бвг отнР ОМ же тек ага Бі З55ї айв вне
АТ ТВ Р ма! 316 АВ Ве ке (15 ів аа Б ВО Бу бі ОТГ
З ї85 Тв
РЕ еВ бі бек го РУ їв ака сім Аїз ба аа Жук Те бів зда
І85 БО У
ТвВг бак Бак ту ту вія тк жа Тк дав Бін стек бін те їв а 4 ЕХ жо те іх АТа ІЙ нія Зк тк Тек бес вВж Бех ТЕ АБО Ах АБВ ТК -І5 230 ах за ве узі ага івц аб аг вка Ні ТВК реа СТВ Бе Без Ве бік зе
ЖЖ «і за дій й ТВБ ів нії зе ну ів біз сем ее аа Тв тТве Бу АВ я 5 27О ви Же ТР ТНе Бе: аж Аїш ах Хе за аАта Ажв КІВ Фу бів тКо 255 я т
Аїй вве ТРИ бів ажа СУБ вух АЗИ БОМ ЗВе Б'з ів бен ага бу За
КВ ЗВ ЗО бів цев бек вне бін а18 свв зеР бо Ах біш тн ст Ар абр АЮ 305 16 3ї5 ХО аія аа Заг чає ага ЗіБ Те уз Щ1Ж га 318 ЗР ав Ага від ТЕ 325 ше ние:
Ага су ТуУг о Зве Абе ви Уа! РО Ку дхи Зеб вто БІ Ме о его
ЕВ Зх що цем нія хів вгРо бів біУ Біб їнк ТВ свв вра ек дів аж зав отне
Зо 5
Тв діє й аву Уві іє Уві ахя ТВ осів біб о тне Хі ТнНе ЗБ ТВ
Б 75 ЗО ід дія таб хів жів сію тТве дан стр дев віз век осів жів бае оте
Зк З Зх ЩО ів те хів ду БО его ЗЕк яви Бій ї36 Бо ще Зекобакб ве тТве
ТВР йід бе бек Ба бів Аїв бів Те Бе» ТВе оте нів тн Зак опію за я СН га бек Ма еф аія ТР оЄїЬ бів Бе ТвВР оТВе бго рез бі бер ще за Як 45 те дію ве ЖТВе о ТвК осів ів Ро ТР оіев ТВе о ТВе вро Єв аа Хе
Як а ав
Тве оте Атїа Уві БУЄ ТНК УВІ рем вка ЇВ біз бер жве о бег Аа Ох зев ЖЖ ТЕ Заг тн Уді тик ді жів рев ту чек рве аїУ ев ато
ЯК 395 іт вата Заг ака ага бій тнгойва таб су віз Так БУ ру сук ви 5 І З щі
Бра ай Би Мі зе КО г оаіз ів ів БІВ НЯ дав іх ва у її аз їгрокіє Ро тує вію біу Ре) сіб вія сів Оіу хів тує тве 5 У В піц су векомеж ні ве бін ах АТХ Ве Уві Суб ТУ Бо АР Бій ка 55 ка їеи Мій аж ші Тнк отТве бів АТа Бей ств кев ве рек ага азів т ще 5 БТ їве бів ть аг Те тує ТВРОХТВ фен ахв аке Був аа Хе дв Не вав вер; ато ага їка БіЖ бі» їне Су ага ї1івБ ів щіу бро дво ух тах і ож з до я
ЗУ г щи су жі сти бге іє вав тТкр Тв бує Аа ТР тТве ав рує Зі ав що ІБ Бий
Ота ве ІБ нії вх вве 16 а5р ав КО Бен вро дай БІВ аз дав ах» и аж ТО їКо ТР ОБію тр АТ ТВ ТЕЖ КЕ вро ія бік щ5 | ка Ві сіу ЖЗе те ші Же жів ті ав Бі їі їв іже ем Суб УВО ех і БОМ ВЕ | та цух МЕ Бен о сСуХ 5-5 ке я «ей» йтучня посвідоВНЯстЬ «Войх и
ЗА У пееліден ть БОМ ОКУ «й ще» З стан КЕБІЖЯсЯТа ЗкаВакасє ФотазаЗа заява вЕ саке тах що комою фокасаек фев есе кове зсанаваек ще
Фанати т єства кає осасоВКсс босахааамх пажаааетає ВеКаЗ ЕК: ЇВ хо ї55
«КАШ З «а» ЩЕ ка» ДЕ «е1Я» штучна веслідовність хе» водаонсоптенівана МР послідовність «В» 13 . засос саатКствес свесасеетЕ сенцаскаєв Єр кнЕ СЕС В спозасвасв деасваскос саовузсоює засавсваса ссоБеттоск засосссваа ЗАВ жшрчноався шсбакасеси седснасске скВашєста седссвраков сао ває їі «вес всасссеом сиза ксс аисясскіся ссскоовавє саке ває Ж пецатевака песеєвацчх стоку свое хетщасасе сежцоцО З щен сназ застосо сетовває вссвссюкО кеВ ЕНеЕ дОссвасее З жесвієвесся всжесачеии весвссаве ссесеннчає осесовасва зон 530 скосу чес забесиВко сопе св ассаоосеех секс ай нс сеескотеся Ясен сссво свое свесЕ сем суссстоває 538 смМмесаксс вес ЕсгщУс цес своє снеєцасо Зевс екає зас цеВаЄ ОО
Черсксмма шщсссосеЕ свої скаЄ сосна дес сВКссЕ оскцесеаає «ВО звааосочеа аздеасвоусяя саослесоає саке с ссавця сек ТО ахгазссвмє сусевовете сазозсЯка сесаасуаес ссесизадаа свесаще УВО зЕсовок с асяест зЗзеосвеваа са сса зако саВсаЗоЗае ВІЙ песвосксю тевтссетак та стосст затв Зсестаонеос сне 0 осот аа сек сасвевцає сосні дес сосок ЗИ «скоса ставав тя га 55 хе З хи ЖІ хи ЕЕВОК- Мат йо «Ні» За меж ага аг Уі СТВ ів о Беа тб ав Бга кто Бі тує век 53: а
Х 5 1 їУ
ЇТа Туг РгО Ма) Аг Зег ад» Заг ТНК ї3ів аа ага біб пі вай ЗеР
ТИ 5 за аж ТК біУ Бе вед тБг РРО бі) беб ВІ аБа СТ» ах тве реа дек
За З ях за го сом аку БгОо КІ6 йЇв де дер ЇВ СТЕ дев вія ія зве онія що
ТВГОБгО бу хор оУді Бек бег афа РБе Хі рев бін ка мат маї дя вх ти 5 ЗО чі хів заг ді бро вух Уві Би Меж су» щі (ТЕ РРо тів тТеробею
Щ5 що З вт ін обік Уві ів ар Ів вух тТйє Тут жее рве Ажр Бек твЕ ТВе
М і МЕ ма кт хі яву: зах З щі: КЗ шив р км Кі СКвхах хіх мії іще ка ат вів Хе меж ев оата Ег ТУ ЯР ж КК НІЖ Оу КУ Ж що 3 135
Те ака БРА Бу УВІ АРш Ві дай АК вве БіЖ вРО БІМ хТв РРО й5В
КЕН 15 З ніх ре веб ага їі сви ака їі біу ви Бій а вне ев ія бів їж З 5 Іо
Ве маї їз вго Вго уві бів сво без їй Теє ВВЕ ТВе Бне йо жу ї65 УВ В
ТвВге дів яви бує Мен її ТБЕ і бко Бе бе аб віз Те Тее отв їх 5 ї9о вер ар тт вто ТАЖ бі Бе вет 1 Аза ев Ага о бгОо ТУ Хе зве і1935 ще ях вве ні вго вух ев дго вко її Бо БЕ БгО ям БУ Бек іх сжх о віх як ів Бі ан бер ій ЗО вва ТНе звг РРО Єр Бу КБ бів іа її зи5 а їх тай меж Те Бек баб бій ар вне гу Хіт ві бе Яі азр вРО Так гу ах 5 МВ аа жів мак Бі жі шій УБі ето 53 НЕ ев Уві Міб вуз фев отне жу ще МЕТИ ОКХ
Фіу УЖ БУ ЩЯЇ ТВгодеє вує дей біЖ Біб еко ЗіБ ків Рго Уві ов
У Ж й хе 5 їецовгО вже ть ТТ ТУ во ар ве Уа! Аа вка іт вав кад ТНК 2 аа ще меж УВІ Кі те оБІй або сСує ав Те ЄМя Ні бек вра «та щек їв
З МО ях ЗО рге ій чаї ТІВ ОВ их
Же т дя «а» Я «її. ЩУчНИ посли нН У
«ве» ще ідОовВнЯсть преноееру таавзіасзо) аастакааке зах аацЕ чЕЗОащках ЗОВ бтокаае ву й застає хаос кааважемю заскнкааєє зак аакаає педоцекоах и ака в «ів ЦЕ «Я» Штучна ВеСЛІДОВНІЄТЬ хваї» кодон-сптувнізована днк послідовність Бема апа звозацесаа соток сатесескО астстОаЄ засаді ааиссеосе в зЕтетсва цес сяВ татссвосва свеваеско зсазЕцка сеисуцваСє В стссвзаав сеовооатої ксвсстеата беаткевстс татстодвсв дзазатецкя 18 засеетесЕс сов есссчо сазан есте есшоа сан осе есквазанає о пІсчниІзка стоззоЗсяя зопзачевиу чес Ктаіа ЗеЗЕЕКЕКОЄ сабо зай
ВОНИ ЕСЕЕЄСТЕЕК аж ссВОжя став сота с ааатасаза ЗБ засазстсаїс всвеесзнай всоичессх сажосссано оси ссакеткув же поса кекКоасиа касове гетвеасая екасвояОо саке зв земне застав сасваЇщх азс товсЗаВає зак ацЕ 5 созсазоацс зобов севкаевяах Етоасстсоа стазсваасв Стас ЩО кепаасоц ссевашеае свище Коста сасЕссаоаи Зевса ОО зсзавовасе закон сс мес цЄ жЕСКЕСССЯК сСуКссВеССХ 253 заз сени тсасаксови сеча аНе сссаеЕчаНє тек ЗОВеСеаЕе ща ксжовв аа ктсас сасвісенОє КесжННМи Зеозасааця вес каєВею 850 аасстваеЗ свдссововая пса єссжкзев оса фест аюєюя я савсссвта гасстсавса сеовоцевас затв аежстсвОа сао ЗО зпаозсссооя возссвасяс евстосткао ссттєкатоє стеесксасав хассасВЯса мимо зестсоавасоз зідасве не сзавсасавт стазасвове ссаосаосс сага що шсасаакс зсизовсвсв сссаснК ссзовоаас заєзаася сус Вос 13 зидассас стос тас сразааесса зсаассосєта затсовосяа тзосассиво аю кстсссвисв ссвссотоеє тлаєвссВКа лесжмраєа Зсасскеес сацссстася. 1555 «ета вксв сопосссВеВ Стах ксксвесЗка зааЗанакак ссестЗоаВоВ 5
За ацика кекс есе сс аО соссовесва есе ЗО песця саван стеком сбадскска осоозосс засвоадцаа М прак КК ЕВТЕТсСстЄ Зссетатесх зІжхЕссетаа вотозаковя 1 заІвсецехЄ зстстацааи Завсолазає сестосоаео студе зак І «своп со стКос «садове кестоцатеє осєсежЕхВа звсснекре Ба зажфаскцт абасваєтою асбсвтєвав затевозася ассесакотО есапсте 188о сосен ев ассвансеоє савааесссю Чавес сосоцоево сао ха азажеаЕкко сбстуасваа сце сВеМеЕ згас сессоєксу Зечудекецча З зсскасваво сссесЗвасє фсраФоЗсесВе аксоазаке зацежсснеє зсозакаКе Іо чекщаокаяа КкЗВЕсВщв гвачазаЗах серсазавоє вешєасвза пика ЗВО чан аає собача стє свайссеиає чеків ассксцроах сере еса ЗО сессссятго «сожсстоВЕ сс ижа сет ема ззатетЕсак заказканнх щи ах МОМ Е. «ап» МРТ
З йе МаАКуланц а
Мк 3; как ух ТВ ТНК сСує ви ве Жів хек їез хів вв хів Зі сіж У «г ок ЖЕ х те ХО З
МЖЖ УКе кям вт Кі ве сф 8 АБ хаб оача Хі бій Бе бів ав
Ві КЕ ЕК ЖІ Су» Щек Ту Твгоїви ІВ бух ЖБК шт а Уві нів і веж Ту Ббпе те ко чек іх ОЇ бух Уві вій 85 бек бро ев о І ТО Ї а що чів тує тив зів пі Біб 616 іа Бук Зк Сех тує дав іа щак
Ма! Укге ар Бко жк йіу Буш бек іон оре би 5 Ре БРВ ТВг ав
ЩО їх ке
Тв го дер тує Рг цу суб іх ТР (16 Ніж нія тів бів б1у щі 135 КН 25 дя вре мів Аїя Бі біу гію АЇв еф оніз ее тер обі» Ві Бе вве їЗО 135 Бе: і5и ТУ а5В- АГ ІВ АТ БЕ ВР ОТВе мех Бук агв сф фу Ма вве зах о 5 щО
ТВ біо ну аа Ж АЛЕ АТ КАЖЕ ІТ Ві АВ ВУЄ Те УВІ ВР Був
155 Б ї75 мек хі Ре зве ага бів 15 Бій сту ТЕР АР ніх МС дез Бею те
ЗО і5 ща щег те ах бу Тек ТР оТве ЗЕ Зак аа біуУ ТР Осі тб Аж АяВ
Ж РІ БУ г Біб сСув Ве бі» ат ква бів бід бук аа бек ТТ мух Абе ців
Звгосу; Аія рРгОо баг ую Буш РРО еВ РК Бец РгО ТВг АРЕНІ бгб тах В ЗЕ 4 ін Уві ух ев їме ек жаг обее ТнЕ ав ій зве БУХ рез вал оте а М 5 г Аз) вРО ВВ же зер аа Зі Зв в Ве Твг о Бет бі дек У
З тщо я
Зег а1іу бі о бів Бге туг їВБг оТВг ее Або вів аа ТР бух Ов 275 яко «5
ЕК іву ее Бек тТвВе бе БР БРо тн вро ЗР Вк Б БО ее сте 395 о
Веб ощів га ще Б : вставши ївк вки ВІ бере ом пі Ж ща ВЕ
БІ ОБІВ ІЙ РУ ту ЗБК АБ ТНК АЖ Мт Ве БІЙ ОБЖ МЩЕ ЖАР КОХ що що 5 ЗО бів вка ТУ іує ТЕ ася ТМ отв одіз бів БРБ хек БЖ вВгОо Бо Ві 355 35 Зх
Аква оте тег ТНК Х15 бек тво дяй ха ІНК бе гу Ні дев ря Заг що Її ЕІ
Твг о вБгРо пак Оу Бо їфе бів аа жі Ме аБв туго аай ТВе бів дер ї55 ЗИ 35
ТНК ат Ро бів ай бів Бі Тек оз? аїк Без б5ег ої ТВК ТВ вве зт ЕХ Ї ! ЖЕО виш а Ей КО ай вРО ТВК ОБів аа Во Так ТвВе о аів бує бве ТНе аз бе Не бух их Іо 355 Бе ваг БР тв тТве Те о Уді вео ав ТК Отак дв ух ЖЖ Бек ТВЕ ВЕК
ЯВ що 15
Бгб бек око Тек оБго я ее ТВгодіз бів зі зе у! теє Ба ака дго Св аг аа сі хе стев вв Зів біж ар Мет вне вра ее ке 155 як вда лев опік іжм тів ач аЇВ бро 16 Ар вве вер Рго маї Бе вав ТНК
ЯМ Я Ба
МУ ТВРгоХів вне зв пів баг хек Зв кер обі віз бек АїВ БІ Ті ж ато 5 «Що ден Зі нії щіЗ бЗве око аа тів 5вт бе Тве бе бек отже ба РКО
Б Я З вуз чаї й 5іц да таб ові нів зак бів ів аз ін вай зав се
З М ща
Аза аАїв ов Кер аг хі Тео оЗев У! зія Біб азо аяокев яів Аа що кто що
Бій ес ще ТР тів реж єв бе діт вра ці та бів Зі» Бе тує тнг вій вію рази ків їж аб Зі в5а АНА еВ Се гу Бе АК.
БА 55 5 5 га яви лів ай БЕ ТР Овід Буя ет ки І ей ів ве виє ма
Твгожїне біб біб ага те Бе зас рей 18 Бей АТО Мі вія сте Ах вне ес еп аз ака а Ту сту ве сух суб ж Боб бю еко ав. та що Бах кує сСух ХТе біу Хі біб йзр і) беб ага яса Ті Яак бів ія Хе
ВЕ їх еАе лев бів іє мух уж ав сів сів рух 2 біж Те бі тур Ф)ію Бе ща що 535 5
Пі бу рух тео тТРв оте дав ер тк ік жа! во ТНе ВА ве щі 45 5 Бк
Хі ів веб цен зву Збк тів Аїа УВІ сей ЇВ вія бу заг бух є сне Аг фі ве ТВгоБує тк жів «у

Claims (12)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Застосування рекомбінантного вектора на основі модифікованого вірусу вісповакцини (ММА), що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує глікопротеїн оболонки (СР) вірусу Марбург (МАКУ), для отримання лікарського засобу для лікування і/або профілактики викликаного МАКМ захворювання, причому рекомбінантний вектор ММА містить: першу нуклеїнову кислоту, яка кодує щонайменше один імуногенний білок глікопротеїну оболонки МАВМ; другу нуклеїнову кислоту, яка кодує імуногенний білок глікопротеїну оболонки 7аїге ЕБроїа міги5 (7ЕВОМ); третю нуклеїнову кислоту, яка кодує імуногенний білок глікопротеїну оболонки Зидап Ебоїа міги5 (ЗЕВОМ) і четверту нуклеїнову кислоту, яка кодує імуногенний білок нуклеопротеїну Соїє а'моїтє Ебоїа мігиз (ЕВОМ-СаіІ).
2. Застосування за п. 1, в якому глікопротеїн оболонки МАКМ являє собою повнорозмірний глікопротеїн оболонки МАЕУМизоке.
3. Застосування за п. 2, в якому перша нуклеїнова кислота кодує імуногенний білок, що містить послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 6.
4. Застосування за п. 3, в якому перша нуклеїнова кислота містить послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 5.
5. Застосування за п. 1, в якому рекомбінантний вектор ММА містить нуклеїнову кислоту, яка кодує імуногенний білок, що має послідовність, вибрану з групи, яка складається із: ХЕО ІЮ МО: 2, ЗЕО ІЮ МО: 4, ЗЕО ІЮ МО: 6, ЗЕО ІЮО МО: 20, 5БЕО ІО МО: 29, ЗЕО ІЮ МО: 31 ії БЕО ІО МО: 37.
6. Застосування за п. 1, в якому рекомбінантний вектор ММА містить нуклеїнову кислоту, яка кодує імуногенний білок, що містить послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 20, ЗЕО ІЮО МО: 29 або 5ЕО ІЮ МО: 31.
7. Застосування за п. б, в якому вказана нуклеїнова кислота містить послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО; 5, ЗЕО ІЮ МО: 19, БЕО ІЮ МО: 28 або 5ЕО ІЮО МО: 30.
8. Застосування за будь-яким із пп. 1-7, в якому введення забезпечує захисний імунітет або захисну імунну відповідь у суб'єкта.
9. Застосування за п. 1, в якому рекомбінантний вектор ММА містить щонайменше одну нуклеїнову кислоту, яка кодує послідовності, вказані в «ЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 20, 5ЕО ІЮ МО: 291 5ЕОЮ МО: 31.
10. Застосування за будь-яким із пп. 1-9, в якому рекомбінантний ММА додатково містить нуклеїнову кислоту, яка кодує СО40Ї..
11. Застосування за п. 10, в якому СО40Ї. містить амінокислотну послідовність, вказану в ЗЕО ІО МО: 10.
12. Застосування за п. 11, в якому нуклеїнова кислота, яка кодує СО40Ї, містить послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 9. Ффиуса Моагоигоіков . і Й І /. ухвкосометютомомоо нт ка в кеВ УХ : і Таке ШВОгоВ поведе се зненню ІН дк Во Іон . Щ се ем ВекруєтаВ ІІІ ! ! пря еко Ве : ; ЕВеіветня по й й ке ВВ Му ВУХ і ее Во зе Ева КЕ ЦОВІ ! ЗА ї : «ее і зар повіки МИ ! ! шо ОВК зад кобон см Е і и М о Янтах Кар жан З що я два пе КІ ; і пн Яни бори ПІВНІ ' ! - Кн ання й -4 нан намет і і Я фо Ів ква Карла К их одними ій Мінво звогакоках Її що па М : коду кУ комин ВИ пи пед ВЕ щ КехаВ ТКА Ї рення у Внизе Мках КМ тї Ж ве с.
Ж З ово ві о ОД оо дв в кр Ек В іо вв « ОА о ї око ооо З 7 я ж х (оно З скКмміниа Жбрнмю пеквмокавонх 1 со одебейееекя жан ее х фееке ЗК КО КОКО ЖЕО БОКОВКОСВК Б З ОВО; ! я. ! С» іже Я З нн кв ї ОП МО США МОЙ ЗМ М " т й ШМХ ї у АКВА нн ом ооо ооо ооо сосок оосоосоооог ооо осо осоососососоос З ї 3 і МЕ Ж же Ко зве ЗВУ й ; дя ГЕО о КК нь ух Веа ХК ш : ну У ЩО Еш. пен і ; . : Ж Ж вх садах З ве ие шк щЕ как переви Хр і жах пе кн. ї г. сх сумкою еко ВО че з БНО й оонока УДО ЧЕ КЕДКТУВАНКХ ке. ев и в ні но вн вн нн нн и в и оо нь сне нн ж 5 3 5 5 3 5 Зх в» ж в ВВ в в в Коадун област генів: Її х КОЖ доска ях Кк : ик ; Муклевноотания КОВІ МЕНЯ з зни внио Бон оМаНя . | я І я БО : салют сд о охуную ная З а Гадання М. сою гону і нуклескатсвку . . Нелінеразний ГО Назрезувннвов Е ! ВЕНА ОМ 7 7 7 дк ЦО ННЯ шу.
КЕ СВОЄ Її МекОодую а ори І я Шо ке би м ее ЕЯще пеззевнани ВО Запознчвно З КЕ С ЗНО НУ Фігура ЗА знало е й й ша Ммудапнковов Ї і БЕН ней Ї та серии ЖЕ ФІ МЕНЕ НО я ад ве В ОБ М вставка щ С ши яВлщО шк За ЯВК) 89 зЯВи 145 Цфреевеванвввввв вв нн в вв явні вень нінн в внввехввннеян КЕ Є - ВОВКИ ЕХ дек 5 я ка Що МмУАТВООВ ке у Ве Янко т У я о їх х ШЕ дк . Ка Рг5 РеЦЕя Рг7.8 ре
ІБН 138/149 а У ВА п пн У А, ну Ммуд-пьмаАд девекнен тора Я х МІК уко кох їх РРБЕ ШИМИ То кр шк Ватні еру ВЕ ї мя, Я дві и я птн ЕпучаВМЗвВА ДС | ри М ТЕКТИ ;; РІРКУу- ОК : г Ше ! Же | шк Фігура А Ате ї сх п ф-онввіве ві : М : мож хи ЩО овМхІВЕ їх вв і | є А-МЯНВОМО Кого нев ка, дев У о 7 А ОХ ЗО ЗПП МК Б т жу ХО ШИХ : т Бони ОО М ех ! : БЕРН . х ЕВ фура Б дюрвК ре МЕС) Нв В ес бо : у ех хх ще т захо о дкамо чаю вче : Е ї / от вк чавляЯЗ : п во по осжет мине ЕХ хх ща М ІС й Е. Е ЯН ТЯМ зо совте ГГ) і СК НВ Б НОЯ ЕЕ ШЕ КА вет у теми ка зала шо х " по ее й г Мне і ЕТОВ; докт З лужи х сти т» х х х З хе ї х зве ї х ок ї х Еге . ет КР Фіпдоз Я Аве стійкість т ВВ Ж кт вс с і зупинка їх ввМ274 п ому у і. и За ТЕ ОЗ ї щ їх ББУ 00 Семрекоменаза МЕМ ЕК Б хе івеР фури я Аа р ок зВМихеї й кт ! -в ІБ Ваивні З : БУВ пн. 00700 Божірох . я 7 сс ск, МВА НО я Кк НДО т В Б У ж І шк, і. бот пил «В «й іохе її НИ х ко я натни ОО вв де. : ; чну дими : К Есейрох шхб : Зет ВЕР сВігува і в Аютр ваше ЯК. . рвМх214 ШИ ї і ЕІ 448-148 В ще ч й ох ї - Е а: ЕЛЮВ зла, кг ві лека, я «нн ще хх з нн Ж пат «ЕХ Ж х : ди НУК пит х хх ; вк З у хх ВЕР х вів БР фура 5А Атр ; Троя зе 148-148 г не і овмАЗЗ ше как тала і ОЗ пон; . ї т Ще - 5 вх . й и Щк І вин НН ЗВМАНУМИ зупинка транскрипції Атр Яр в 148-143 ЗИ за З я ва ютіяаляа К ,вМЗ84 . і ЗВ. і. ВЕ і. І авоевоу ов ть її хр НН зупіннка ї фани сх зувзинка зисконпий ; х транскрипції транскрипції ср-мавмме Рг внУува 5 Аве х гоВДЕ я тп дж і в: --. МаВаВІВа а Р
ВВ. їх ть свв рам385 совки ОРЕ . (Р.В Ть її ШИШИЄ М о термінація МЕТО ро сн, 0 транскрипції ВО т УК К. ШЕ ічі Я юн во гори х сна хівімии МРАСЕВСМ Тева транскрипції . . тр пь БУ БА 148-149 «х х бу Я ех ще рамазо СК рРіввЕ ка ія 148-149 що тв, ТЕ ШУ с м і - Тареввом ЗТ КЕ кова івхв шнура 5 х я АТО ч НН ов х Кен Ваня і Ботрох п мед де де рю ПЕК, еру док пов вики будні і ща " НЕ БЕЗЕ ватні шенні квт пн с Рожмірох с й. Що г ще ЩЕ Ж Ж: 5 еВ пкт М Ко ь НШ кт У си й тд - По фе ОЩ сто» ах -Е. У КЕ в ее З ілини хе в РАСБКВОУ и ай -ат у ЗЕ КОМУ г; хе Фігура 8 ОО Об е ке г ше ур сш влагау ті Авіа й, апи-МмАКуае Я. бе і ! ; К, їв З і і дж Ум ВХ ї я ї з є ї у, Зх й х - і я х пр, х Ех : т 3 і що я ; Я х х ї щ АК т б я х, 45 У Її дж са х ія ух тон уро Мтишм ко ж ж М У доході морю ок нон ннння, ша Н МОМ Не ОН нео Меляр Нове ЗО щи 30 Ме читр Ов Деві бийато т-
ІК. А Пре«-вакуинація «щя МІ хви ни ПОН Я КЗ тю БлЛеля перше вакцинації я шк сх що де Яну Х В Після бустев вакцинації повів ж с. Ї Проеріяяунна позитивна комтроалена ща Ом сироватка нижчих приматів ДилАх прсесоокюю й у отодеекх УМ екю " БОМ це они Не мех пер
Ффиума А - В . зак ТЕ ікони ех З заака ВЕУ МУК ї ї х Ес і 5 х і ; ! ОК : в ї З я . її них Ж КО о З зо 15 Ко чзезщеви зараження Ману щень Фігура ТК Пт : : ! - В З зав ТОВ КОНІ ! в З завеек РУ ДАВНО их. ї зх з БУХ : х З ; З 1 З Б : З Ку ї З
Я . ! З : ; ге 5 30 15 О час ціелия звмаження МАКУ ень
ОЕМУА х МУ ВМО ВА ОТЕРУ ех БРОВКО ; : ша як : ли : щу ше Я Ж т 00. пай -к їж | пня «жк й : ГІ ден т ГБ: -жщ ж : сек Гі З Як за Я Гі їі т АН Рі і | Н йо бе 1 і їі ря ів є : Бі рі ЕН КК : р їі Кі ро : : Ї Ї ! ! ї : шо 000 щ ща ва. | їі в т-ч : | і В : її сне й роси шо НС ; снення Оу ким ї пуд гЛУух ТРУ ТРК дик "ЯЧА ТУ ТА ТЕКУ НМУй з МУлЛЯМЕМИОАА ТЕРУ с ГРУЧВОМЗЕКА в ЗК Зо.
З З : 1 ДЕ : : ї : ї Б -- о ш па 1 І В як ї а а 5 я дае В щ : і Жде : Зх 5 : о Я дк а ЕМО с.
ЕЕ.
За . г Що З ЕК З Ка о шо г ОО о: ЕЕ ох в я Я в» вся 0-5 Щ з х «ж і в З и В В з 5 ве В В що З за» В В й і ї як БЕ.
Ж : Вк 5 ! Я- 8 і ЩЕ Ще ї Б : дна щннх в : дних жк ів ММА (Ру КРУ наша жку ву З ПАЧА УК ЄВУ ТЕКУ зн МУК РУ МА РУ ММА ТЕРИ УА КРУ МЯМА ВРУ ТВАЖА РУ
Яга З «т Гура я 5 і о я З жа її СЯ шщ Бе Я ви о ши ше що т и ше ще а -Я но Бк. ня п сін ВВ пости я ше я нн ї з З 1 4 З З и щі що і й 4 Фігура з «ек МАКСА Р Е 10000 5 «же НегатиВнНиИМ контроль ПС) КЕ ; Де й Ї т а Де оятк І Ей ЖК : ї Ж зай ї ше / в Ї що 10 Ї Зк ; Ї в ' ! в | Її о 7 Я 21 я 5 яо «ень дослрвення Євідзнн ване ієчїь пслідження (відносно вакцини
Фігура її
- . х бе й ь е як : - ж г. в ЩЕ х МУАВМЦО ВВІВ Е й І х ВИУА-ВА ЕВ ВСНОУЄ х | е МУАОНЕВОМАОР М? ВСБІАЕ 4 000жо000300д. А МУА-ВМ-ОЕВОУЯРойР ВАТБВІ День День? День День 55 День й? Час відносно вакувнації вн. т ОККО ВВЕ ЗБК в ж НУ З сов «ЩИЩО сб хви ії о. о. а-УРао те. 0 ув севом
UAA201702987A 2014-09-03 2015-09-03 Філовірусна вакцина на основі рекомбінантного модифікованого вірусу вісповакцини анкара (mva) UA126848C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462045538P 2014-09-03 2014-09-03
US201462055154P 2014-09-25 2014-09-25
PCT/EP2015/070161 WO2016034678A2 (en) 2014-09-03 2015-09-03 Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) filovirus vaccine

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA126848C2 true UA126848C2 (uk) 2023-02-15

Family

ID=54145734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201702987A UA126848C2 (uk) 2014-09-03 2015-09-03 Філовірусна вакцина на основі рекомбінантного модифікованого вірусу вісповакцини анкара (mva)

Country Status (14)

Country Link
US (2) US10576141B2 (uk)
EP (1) EP3188752A2 (uk)
JP (2) JP6823586B2 (uk)
KR (2) KR102736868B1 (uk)
CN (2) CN112972668A (uk)
AU (2) AU2015310909B2 (uk)
CA (1) CA2959105C (uk)
IL (2) IL250552B (uk)
MX (1) MX2017002791A (uk)
MY (1) MY193417A (uk)
SG (2) SG10201901735XA (uk)
UA (1) UA126848C2 (uk)
WO (1) WO2016034678A2 (uk)
ZA (1) ZA201701077B (uk)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10130697B2 (en) 2010-03-23 2018-11-20 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses
JP2014527799A (ja) 2011-08-26 2014-10-23 ダブリュエーアールエフ−ウィスコンシン アラムナイ リサーチ ファウンデーション 変異型ｐｂ２遺伝子セグメントを有する弱毒化生ワクチンとしてのインフルエンザウイルス
US10053671B2 (en) 2014-06-20 2018-08-21 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
RS58080B1 (sr) 2014-11-04 2019-02-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Terapeutske vakcine protiv hpv16
HK1247066A1 (zh) * 2014-11-26 2018-09-21 Neuravi Limited 从血管除去阻塞性血栓的取血栓装置
US11701418B2 (en) * 2015-01-12 2023-07-18 Geovax, Inc. Replication-deficient modified vaccinia Ankara (MVA) expressing Ebola virus glycoprotein (GP) and matrix protein (VP40)
CN115300622A (zh) * 2015-02-25 2022-11-08 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 使用灭活的修饰的痘苗病毒安卡拉作为实体肿瘤的单一免疫疗法或与免疫检查点阻断剂组合
CN121159719A (zh) 2015-04-17 2025-12-19 高山免疫科学股份有限公司 具有可调的亲和力的免疫调节蛋白
WO2017120577A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Geovax Inc. Compositions and methods for generating an immune response to a tumor associated antigen
WO2017136419A1 (en) 2016-02-03 2017-08-10 Geovax Inc. Compositions and methods for generating an immune response to a flavivirus
US11197925B2 (en) 2016-02-19 2021-12-14 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza B virus replication for vaccine development
WO2017181152A2 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
MX2018012472A (es) 2016-04-15 2019-08-12 Alpine Immune Sciences Inc Proteinas inmunomoduladoras variantes de ligando icos y sus usos.
JP7053491B2 (ja) * 2016-05-02 2022-04-12 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー 治療用ｈｐｖワクチン組み合わせ
EP3484507A1 (en) 2016-07-15 2019-05-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection
WO2018022945A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2018075978A1 (en) * 2016-10-20 2018-04-26 Alpine Immune Sciences, Inc. Secretable variant immunomodulatory proteins and engineered cell therapy
KR20190141146A (ko) 2017-03-16 2019-12-23 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Pd-l2 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
SG11201907769XA (en) 2017-03-16 2019-09-27 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3606553A1 (en) 2017-04-06 2020-02-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Mva-bn and ad26.zebov or ad26.filo prime-boost regimen
CA3062549A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
EP3624851A1 (en) 2017-05-15 2020-03-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
WO2019018501A1 (en) * 2017-07-18 2019-01-24 Geovax Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR GENERATING LASV IMMUNE RESPONSE
US11311612B2 (en) 2017-09-19 2022-04-26 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria
GB201716181D0 (en) * 2017-10-04 2017-11-15 Univ Cape Town Recombinant mva with modified hiv-1 env
JP7749319B2 (ja) 2017-10-10 2025-10-06 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ｃｔｌａ－４変異型免疫調節タンパク質およびそれらの使用
BR112020007542A2 (pt) 2017-10-18 2020-12-01 Alpine Immune Sciences, Inc. proteínas imunomoduladoras ligantes de icos variantes e composições e métodos relacionados
WO2019084310A1 (en) 2017-10-25 2019-05-02 Yoshihiro Kawaoka HAS RECOMBINANT INFLUENZA VIRUSES STABILIZED FOR EGG REPLICATION
AU2019205273B2 (en) 2018-01-03 2024-04-04 Alpine Immune Sciences, Inc. Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
US12343390B2 (en) 2018-08-07 2025-07-01 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant biologically contained filovirus vaccine
JP7655849B2 (ja) 2018-08-20 2025-04-02 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション ヘマグルチニン（ｈａ）タンパク質内の非ドミナントエピトープに対する免疫応答を誘起するためのベクター
AU2019336940B2 (en) 2018-09-06 2025-09-11 Bavarian Nordic A/S Storage improved poxvirus compositions
US20220040284A1 (en) * 2018-09-28 2022-02-10 The Chancellor, Masters And Scholars Of The University Cambridge Vaccines and methods
CA3120868A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3921413A1 (en) 2019-02-08 2021-12-15 Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) Humanized cell line
CN114929269A (zh) 2019-05-01 2022-08-19 威斯康星校友研究基金会(Warf) 用于疫苗开发的改进的流感病毒复制
US11807872B2 (en) 2019-08-27 2023-11-07 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs
JP2023511444A (ja) 2020-01-24 2023-03-17 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション 安定化されたｎａを有する組換えインフルエンザウイルス
EP4103231A4 (en) 2020-02-14 2024-03-27 Geovax, Inc. VACCINES AND THEIR USES TO INDUCE AN IMMUNE RESPONSE AGAINST SARS-COV2
JP7712284B2 (ja) 2020-03-12 2025-07-23 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ ポックスウイルスの安定性を改善する組成物
WO2021195410A1 (en) 2020-03-25 2021-09-30 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant multivalent influenza viruses
EP4146684A2 (en) 2020-05-08 2023-03-15 Alpine Immune Sciences, Inc. April and baff inhibitory immunomodulatory proteins with and without a t cell inhibitory protein and methods of use thereof
CN115819616B (zh) * 2021-07-28 2025-04-11 江苏瑞科生物技术股份有限公司 一种基因重组vzv融合蛋白及其制备方法和应用
IL322961A (en) 2023-03-10 2025-10-01 Bavarian Nordic As Production of smallpox viruses from cell cultures
AU2024236322A1 (en) 2023-03-10 2025-08-21 Bavarian Nordic A/S Methods of isolating poxviruses from avian cell cultures
WO2024188801A1 (en) 2023-03-10 2024-09-19 Bavarian Nordic A/S Use of quail cell lines for poxvirus production
WO2026006679A1 (en) * 2024-06-28 2026-01-02 The Regents Of The University Of California Retroviral vectors
CN120843742A (zh) * 2025-09-09 2025-10-28 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 一种泛哺乳动物丝状病毒检测用引物组及其检测试剂盒和应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2776391C (en) * 2001-10-01 2015-03-31 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Development of a preventive vaccine for filovirus infection in primates
EP1586331B1 (en) * 2001-10-01 2008-05-28 The Government of the U.S.A., as repr. by the Secretary, Dept. of Health & Human Services, the Nat. Inst. of Health Development of a preventive vaccine for filovirus infection in primates
WO2004042001A2 (en) * 2002-05-17 2004-05-21 Emory University Virus-like particles, methods of preparation, and immonogenic compositions
EP1797113B1 (en) * 2004-09-27 2014-11-26 GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Optimized vaccines to provide protection against ebola and other viruses
GB0706912D0 (en) * 2007-04-10 2007-05-16 Isis Innovation Novel viral vaccines
EP3351628B1 (en) * 2008-10-24 2023-07-26 The Government of The United States of America as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Human ebola virus species and compositions and methods thereof
DK2352834T3 (en) * 2008-11-21 2017-03-13 Bavarian Nordic As VECTOR INCLUDING MULTIPLE HOMOLOGICAL NUCLEOTIDE SEQUENCES
US9097713B2 (en) * 2009-09-02 2015-08-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army On Behalf Of Usamrmc Monoclonal antibodies against glycoprotein of Ebola sudan boniface virus
US9526777B2 (en) * 2010-04-16 2016-12-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods for the induction of ebola virus-specific immune responses comprising administering a replication-defective chimpanzee adenovirus vector expressing the ebola virus glycoprotein
CA3194125A1 (en) 2012-04-12 2013-10-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Filovirus consensus antigens, nucleic acid constructs and vaccines made therefrom, and methods of using same
WO2014037124A1 (en) * 2012-09-04 2014-03-13 Bavarian Nordic A/S Methods and compositions for enhancing vaccine immune responses
GB201303406D0 (en) 2013-02-26 2013-04-10 Health Prot Agency Crimean-Congo Haemorrhagic Fever Virus Antigenic Composition

Also Published As

Publication number Publication date
BR112017003908A2 (pt) 2018-02-27
US11338030B2 (en) 2022-05-24
KR102736868B1 (ko) 2024-12-02
JP6823586B2 (ja) 2021-02-03
KR102812180B1 (ko) 2025-05-23
JP2017527557A (ja) 2017-09-21
WO2016034678A3 (en) 2016-06-02
AU2021209228A1 (en) 2021-08-19
KR20230134155A (ko) 2023-09-20
EP3188752A2 (en) 2017-07-12
SG10201901735XA (en) 2019-03-28
US20170304427A1 (en) 2017-10-26
SG11201701506PA (en) 2017-03-30
JP2021063112A (ja) 2021-04-22
NZ729012A (en) 2023-12-22
JP7113924B2 (ja) 2022-08-05
CA2959105C (en) 2023-10-17
MX2017002791A (es) 2017-05-30
IL250552A0 (en) 2017-03-30
CA2959105A1 (en) 2016-03-10
AU2015310909A1 (en) 2017-03-02
CN112972668A (zh) 2021-06-18
CN106999565B (zh) 2021-03-05
US10576141B2 (en) 2020-03-03
IL290052A (en) 2022-03-01
IL250552B (en) 2022-02-01
KR20170048396A (ko) 2017-05-08
AU2015310909B2 (en) 2021-05-27
CN106999565A (zh) 2017-08-01
ZA201701077B (en) 2022-07-27
WO2016034678A2 (en) 2016-03-10
MY193417A (en) 2022-10-12
US20200268872A1 (en) 2020-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA126848C2 (uk) Філовірусна вакцина на основі рекомбінантного модифікованого вірусу вісповакцини анкара (mva)
Zhao et al. Newcastle disease virus (NDV) recombinants expressing infectious laryngotracheitis virus (ILTV) glycoproteins gB and gD protect chickens against ILTV and NDV challenges
Qin et al. Identification of novel T-cell epitopes on infectious bronchitis virus N protein and development of a multi-epitope vaccine
US20240374710A1 (en) Vaccine Compositions For Preventing Coronavirus Disease
ES2629860T3 (es) Vectores virales recombinantes
ES2535310T3 (es) Atenuación sinérgica del virus de la estomatitis vesicular, vectores del mismo y composiciones inmunogénicas del mismo
JP6523955B2 (ja) 組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）ｒｓウイルス（ｒｓｖ）ワクチン
Kerstetter et al. Adenoviral vectors as vaccines for emerging avian influenza viruses
Hu et al. Generation and evaluation of a recombinant Newcastle disease virus expressing the glycoprotein (G) of avian metapneumovirus subgroup C as a bivalent vaccine in turkeys
CN113453710A (zh) 疫苗和方法
UA126860C2 (uk) Цитомегаловірусні вектори, що вибирають t-клітини, обмежені по молекулах головного комплексу гістосумісності e
EA002390B1 (ru) Полиоболочечная вирусная вакцина против вируса иммунного дефицита человека (вич), способ генерации гуморального и/или клеточного иммунного ответа у млекопитающих на вич и бифункциональная плазмида
CN104962581B (zh) 一种表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组病毒疫苗株
UA123385C2 (uk) Рекомбінантний модифікований вірус вісповакцини анкара (mva) та спосіб лікування або попередження інфекцій вірусу rsv
Boudewijns et al. MVA-CoV2-S vaccine candidate neutralizes distinct variants of concern and protects against SARS-CoV-2 infection in hamsters
US20190117758A1 (en) Compositions and Methods for Generating an Immune Response to a Hemorrhagic Fever Virus
US20140377295A1 (en) Influenza vaccines containing modified adenovirus vectors
Johnson et al. Non-propagating, recombinant vesicular stomatitis virus vectors encoding respiratory syncytial virus proteins generate potent humoral and cellular immunity against RSV and are protective in mice
JP5884100B2 (ja) 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するＤＩｓ株由来組換えワクシニアウイルス
Gao et al. A multi-antigen vaccinia vaccine broadly protected mice against SARS-CoV-2 and influenza A virus while also targeting SARS-CoV-1 and MERS-CoV
CN107841513B (zh) 基于M2e表位的广谱型流感疫苗
Wiegand et al. Evaluation of a novel immunogenic vaccine platform based on a genome replication-deficient Sendai vector
RU2802058C1 (ru) Рекомбинантный вирус гриппа, предназначенный для профилактики covid-19 и гриппа, способ его получения и применения
EP4108257A1 (en) Mva-based vaccine against covid-19 expressing a prefusion-stabilized sars-cov-2 s protein
Khumalo Development and Characterization of a Modified Vaccinia Ankara Vaccine Candidate Expressing the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein