UA128204C2 - Імуногенна композиція з покращеною стабільністю, підвищеною імуногенністю та зниженою реактогенністю і спосіб її виготовлення - Google Patents

Abstract

Винахід належить до імуногенної композиції, що включає антиген дифтерійного анатоксину (D), антиген правцевого анатоксину (T), поверхневий антиген гепатиту В (HBsAg), інактивований цільноклітинний кашлюковий антиген (wP), капсулярний сахарид Haemophilus influenzae типу B (Hib), кон'югований з білком-носієм, інактивований антиген вірусу поліомієліту (IPV), додатково з одним або кількома антигенами та спосіб її виготовлення. Повністю рідка комбінована вакцина з підвищеною імуногенністю, зниженою реактогенністю та покращеною стабільністю. Покращені методи інактивації формальдегіду, покращений профіль адсорбції антигену дифтерійного анатоксину (D), антигену правцевого анатоксину (Т) та поверхневого антигену гепатиту В (HepB), адсорбованого окремо на ад'юванті фосфату алюмінію, мінімальний загальний вміст алюмінію (Al3+) та оптимізована концентрація 2-феноксіетанолу (2-PE) як консерванту.

Description

(54) ІМУНОГЕННА КОМПОЗИЦІЯ З ПОКРАЩЕНОЮ СТАБІЛЬНІСТЮ, ПІДВИЩЕНОЮ ІМУНОГЕННІСТЮ

ТА ЗНИЖЕНОЮ РЕАКТОГЕННІСТЮ І СПОСІБ ІЇ ВИГОТОВЛЕННЯ

(57) Реферат:

Винахід належить до імуногенної композиції, що включає антиген дифтерійного анатоксину (0), антиген правцевого анатоксину (Т), поверхневий антиген гепатиту В (НВ5АЗ), інактивований цільноклітинний кашлюковий антиген (Р), капсулярний сахарид Наеторпйив5 іпПпепгає типу В (НІіБ), кон'югований з білком-носієм, інактивований антиген вірусу поліомієліту (ІРУ), додатково з одним або кількома антигенами та спосіб її виготовлення. Повністю рідка комбінована вакцина з підвищеною імуногенністю, зниженою реактогенністю та покращеною стабільністю. Покращені методи інактивації формальдегіду, покращений профіль адсорбції антигену дифтерійного анатоксину (0), антигену правцевого анатоксину (Т) та поверхневого антигену гепатиту В (Нерв), адсорбованого окремо на ад'юванті фосфату алюмінію, мінімальний загальний вміст алюмінію (А) та оптимізована концентрація 2-феноксіетанолу (2-РЕ) як консерванту.

Галузь техніки

Винаходу відноситься до галузі біотехнологій, і більш конкретно, комбінованої композиції вакцини, яка складається з групи антигенів/імуногенів, та способу її виготовлення. Крім того, винахід стосується вдосконаленої методології у галузі виробництва комбінованої вакцини.

Рівень техніки

Комбінована вакцина, яка може забезпечити імуногенність проти великої кількості захворювань, є більш ефективною порівняно з одновалентною вакциною, оскільки при її використанні зменшується кількість ін'єкцій, зменшується кількість ускладнень, пов'язаних з багаторазовими внутрішньом'язовими ін'єкціями, зменшуються витрати на введення та виробництво, зменшуються витрати на зберігання, зменшується ризик затримки або пропуску вакцинації та забезпечується краще дотримання рекомендацій пацієнтом за рахунок зменшення кількості окремих вакцинацій. Більше того, повністю рідкі препарати комбінованої вакцини мають явні переваги порівняно з вакцинами, які потребують розведення. Встановлено, що середній час приготування повністю рідкої вакцини на половину коротший за час приготування не повністю рідкої вакцини. В ході цього ж дослідження майже весь медичний персонал (97,6 95) повідомив, що віддав би перевагу використанню повністю рідкої вакцини у своїй щоденній практиці. (Див.: Зоибеугапа В, еї аї; Оцінка часу підготовки повністю рідкої вакцини порівняно з часом підготовки не повністю рідкої педіатричної шестивалентної вакцини. Вивчення трудового процесу в часі; Массіпе 2015; 33:3976-82).

Наразі відомі та доступні комбіновані вакцини можуть не містити відповідний склад відповідних антигенів у відповідних імуногенних формах для досягнення завдяки одній ін'єкції бажаних рівнів безпечності, ефективності та імуногенності серед уразливої людської популяції щодо ряду захворювань. Існує значна кількість різних комбінацій вакцин, які можна створити за допомогою лише декількох додаткових антигенів. Додаючи від 1 до 4 інших компонентів антигену (наприклад, НІВ (ліофілізований або рідкий), НВМ, ІРМ, НАМ) або ОТ, чи ОтТарг, можна отримати 44 можливі різні комбінації вакцин. Кількість збільшилася б до тисяч, якби враховувались окремі компоненти різних виробників. Оскільки кожна нова комбінована вакцина (з урахуванням відмінностей компонентів у залежності від джерела) повинна розроблятися окремо, щоб продемонструвати безпечність, стабільність, сумісність та ефективність, розробка

Зо всіх цих вакцин стає складним завданням.

Антигени комбінованої вакцини:

Антигени дифтерії та правця

Дифтерія та правець є гострими інфекціями, спричиненими відповідно Согпуерасіегійт

ОБірпіпегіає та Сіовігідіпт їейапі В обох випадках причиною клінічних захворювань є високоактивний екзотоксин цих бактерій. Вакцини, що забезпечують захист від цих бактерій, містять токсини, які хімічно модифіковані, отже, більше не є токсичними, але все ще залишаються антигенними. Дифтерійний токсин і токсин правця виробляються вирощуванням

Согуперасіегішт Оірпійпегіає і Сіовігідішт їеїапі, в середовищі, що містить бичачий екстракт.

Токсини інактивуються за допомогою обробки, яка включає тепло, УФ, формалін/формальдегід, глутаральдегід, ацетилетиленімін та ін., для виготовлення анатоксинів |дифтерійний анатоксин (Юр) та анатоксин правця (Т)). Занепокоєння з приводу губчастої енцефалопатії великої рогатої худоби (ВЗЕ), трансмісивної губчастої енцефалопатії (ТСЕ), хвороби Кройцфельда-Якоба (С920 та різновиди хвороби СОЮ) може виникнути через тваринні компоненти, використовувані в поживному середовищі з вмістом бичачого екстракту, що поширюється через вакцину. (Див.:

Керівні принципи ВООЗ щодо трансмісивних губчастих енцефалопатій стосовно біологічних та фармацевтичних препаратів; 2003 5 ЕМЕА/СРМР/ВМУУР/819/01; 24 квітня 2001 р.).

Кашлюкові антигени

Введення цільноклітинних вакцин, що складаються з хімічно- та теплоіїнактивованих організмів Вогаєїтеї Ма репиз5і5 в 40-х роках, стало причиною різкого зменшення захворюваності на кашлюк, спричинений В. регпиз5і5.

Цільноклітинні вакцини ДКП зазвичай асоціюються з декількома місцевими небажаними явищами (наприклад, еритемою, набряком та болем у місці ін'єкції), лихоманкою та іншими легкими системними явищами (наприклад, сонливістю, дратівливістю та анорексією) (Див.: Соду

СІ, Вагай ГУ, Спеггу У0, Магсу ЗМ, Мапсіагск СЕ; Характер та частота виникнення небажаних реакцій, пов'язаних із вакцинацією ДКП та ДК у немовлят та дітей. Раєдіайсв 1981; 68:650-60) 5 (Див: Гопд 55, ОеБогезі А, Реппгідде Реаіайіс Авзосіаіїез, еї аі. Динамічне дослідження небажаних реакцій після введення вакцини проти дифтерії-правця-кашлюку в грудному віці.

Раєдіанісх 1990; 85:294-302). Більш важкі системні явища (наприклад, судоми (з лихоманкою або без) та гіпотонічні гіпореактивні епізоди) трапляються рідше (співвідношення: один випадок бо на 1750 введених доз) серед дітей, які отримують цільноклітинні вакцини ДКП (Див.: Соду СІ,

Вагай ГО, Спегу УО0, Магсу ЗМ, Мапсіагек СК; Характер та частота виникнення небажаних реакцій, пов'язаних з вакцинацією ДКП та ДК у немовлят та дітей. Раєдіайгіс5 1981; 68:650-60).

Гостра енцефалопатія зустрічається ще рідше (співвідношення 0-10,5 випадків на мільйон введених доз). Експерти погоджуються з тим, що цільноклітинна вакцина проти кашлюку спричиняє тривале ураження мозку в деяких рідкісних випадках. (Див.: Інститут медицини;

Вакцина ДКП та хронічна дисфункція нервової системи, новий аналіз; УМазпіпдіоп О.С., Майіопаї!

Асадету Ргез5, 1994).

Ряд повідомлень про взаємозв'язок між вакцинацією від кашлюку, реактогенністю та серйозними побічними ефектами, призвели до зниження прийняття вакцини і, як наслідок, нових спалахів епідемій (МіПег, О.Г., Коз55, Е.М., АІдегвіІаде, К., ВеПптап, М.Н. та Вгамжзоп, М.5.В. (1981).

Вакцинація проти кашлюку та серйозні гострі неврологічні захворювання у дітей: Вгї Меа. 9. 282: 1595-1599).

Небажані реакції, пов'язані з цільноклітинною вакциною проти кашлюку (М/Р), є перешкодою для подальшого застосування вакцин у всьому світі, і тому комбіновані вакцини на основі м/Р поступово замінюються ов індустріальному світі комбінованими вакцинами на основі ацелюлярного кашлюку.

Зовсім недавно були розроблені визначені компонентні кашлюкові вакцини. Раніше повідомлялося про повністю рідкі шестивалентні ацелюлярні кашлюкові вакцини (ОТаР ІРМ

РАР-Т-НВ5АЯ) (ЕРІТО28750).

Іптапгіх» Неха (З5К) на сьогоднішній день є єдиною на ринку шестивалентною дитячою комбінованою вакциною, що містить зЗаїкК ІРМ. Цей препарат (ОТаРЗ-ІРУ-НВМУ/НІВ) продається у вигляді шприца, попередньо заповненого п'ятивалентним препаратом, упакованого разом із ліофілізованим кон'югатом Нір-антигену РЕР-Т в окремому флаконі, який перед використанням необхідно розвести рештою вакцини.

Друга шестивалентна вакцина, НехуопФб (також її називають Нехасітаф і НехахітФб)) - це повністю рідка шестивалентна вакцина від Запоїї Равбівеиг; однак також з вмістом аР. Ця вакцина, ймовірно, буде націлена на приватні ринки Європи та у всьому світі. Інша шестивалентна вакцина, також із вмістом аР, що є спільною розробкою компаній МегскК та Запоїї

Разіеиг, на даний час вивчається у клінічних дослідженнях фази ПП.

Зо Внагаї Віоїесії Іпіегпайопа! розробляє семивалентну комбіновану вакцину, яка включає ОТ, ацелюлярний кашлюк, Заріп ІРМ (тип 1: 40 Би, тип 2: 8 БИ, тип 3: 320))), одноштамовий інактивований ротавірус (штам С9, тобто штам 116Е), кон'югат РЕР Наеторпійиз5 іпїчепла тип Б

З ТТ та вакциною на основі реомбінантного гепатиту В.

Однак виникають занепокоєння щодо довгострокової ефективності вакцин ацелюлярного кашлюку (аР), особливо в країнах, що розвиваються. Останні повідомлення свідчать про те, що імунітет до кашлюку знижується в підлітковому віці і є причиною збільшення випадків захворюваності у немовлят до шести місяців, перш ніж вони будуть повністю вакциновані.

Оцінка ефективності вакцини становила 24 відсотки у дітей віком 8-12 років, вакцинованих в грудному віці проти аР. Неекспериментальне дослідження в Австралії також підтвердило більш високий показник випадків захворюваності серед підлітків, які отримали кашлюкову вакцину в грудному віці, порівняно з тими, хто отримував цільноклітинну кашлюкову вакцину (відносний ризик 3,3, 95-відсотковий довірчий інтервал 24-45).

З точки зору витрат, аР-антигени історично перевищували витрати на антигени м/Р в 10-30 разів через виробничі відмінності та витрати на авторську винагороду, а отже, становили економічне навантаження для країн, що розвиваються. В результаті вартість шестивалентних вакцин на основі м/Р була б більш привабливою для використання в державному секторі країн з низьким рівнем ресурсів.

Отже, використання цільноклітинного кашлюкового компоненту (Р) у шестивалентних вакцинах, призначених для країн, що розвиваються, набуло важливого значення як через вартість, так і через занепокоєння щодо довгострокової ефективності вакцин аР, особливо в країнах, що розвиваються.

У порівнянні з найкращими цільноклітинними вакцинами проти кашлюку (МР), вакцини аР не настільки ефективні в програмах масової імунізації (Міскег:5 еї аІ. 2006; Спегту 2012).

В нещодавніх дослідженнях спалахів серед високоіїмунізованих груп населення визначено, що тривалість захисту вакцин проти аР занадто коротка (Ківїп еї аІ. 2012; Мізедадез еї а!. 2012), що призводить до зниження імунітету у дітей старшого віку та підлітків і відповідного збільшення випадків захворюваності у цій віковій групі (ЗКомгопекі еї аї. 2002; Кієїп єї аї. 2012). Навпаки, вакцини Р забезпечують кращий захист у підлітковому віці (Кіеїп єї а). 2012). Внаслідок цих недоліків у країнах, які перейшли на застосування вакцини аР у 90-х роках, зараз у нас є 60 покоління дітей не лише менш захищених від кашлюку, але й тих, хто може бути менш чутливим до ревакцинації, оскільки первісна вакцина може визначити їх імунну відповідь на подальші ревакцинації (Родаа еї аї. 1995; Мазсан евї а. 2007; ЗНетідап єї аї. 2012; Ко, Вобізоп апа СіевіаК 2013; Зтіїв єї а). 2013).

Одним з найважливіших факторів, що сприяють реактогенності м/Р, є наявність ліпо- олігосахариду (ГО5) - ендотоксину з зовнішньої мембрани бактерій.

Інактивацію токсинів у вакцинах м/Р можна здійснити різними методами, але жоден активний токсин, стійкий до тепла, не повинен виявлятись у кінцевому продукті. В процесі масового виробництва цільноклітинного кашлюкового компоненту (м/Р) для інактивації токсинів м/Р, який застосовують багато виробників, використовується термічна обробка/формалін. Деякі джерела повідомляють про використання тімеросалу для інактивації м/Р. Однак використання тімеросалу призводить до втрати антигенності ІРМ (Вакцина 1994, том 12 Мо 9 851-856. Згубний вплив тімеросалу на специфічну активність інактивованої вакцини проти поліовірусу), а тому у разі застосування комбінованої вакцини, що містить ІРМ, можливо, знадобиться окремий флакон для тімеросалу, що містить м/Р, щоб зберегти його специфічну активність з часом, або змінити спосіб інактивації вихідної маси кашлюкового компоненту. Деякі антигени, тобто активні РТ, також можуть слугувати модифікаторами імунної відповіді. Спостерігалися помітні відмінності в імунній відповіді на різні антигени в різних вакцинах (ВООЗ, 1993).

Хімічна екстракція ГО5 призвела до значного зниження вмісту ендотоксину (на 20 95) та вражаючого зниження токсичності, пов'язаної з ендотоксином (до 97 95), залежно від використовуваного тесту іп міїго або іп мімо. Екстракція І О5 не впливала на цілісність продукту і, що ще важливіше, не впливала на специфічну активність та/або стабільність ОТР. Крім того, майже не спостерігалося відмінностей у відповідях антитіл та Т-клітин. (Див.: Умаідеїу Оїімеїга

Оіа5 еї. аїЇ; Вдосконалена цільноклітинна вакцина проти кашлюку зі зниженим вмістом ендотоксину; Вакцини та імунотерапевтичні засоби 9:2, 339-348; Лютий 2012 р.)

Антигени гепатиту В

Існують різні штами вірусу гепатиту. Гепатит В - це захворювання, спричинене вірусом гепатиту В (НерВ), який інфікує печінку людини і викликає запалення, яке називається гепатитом. Вакцина проти захворювання містить один з білків вірусної оболонки, поверхневий антиген гепатиту В (НВ5ЗАд). Тепер доступні вакцини, що застосовувалися для масової

Зо імунізації, наприклад, препарати Кесотрімах НВФ та СотмахФ від МегсК, Епдегіх-« ВО та

Редіагіхе від Сіахо ЗтійпКіїпе Віоіодісаіє5. Комбінована вакцина, що містить компонент проти гепатиту В, асоціювалась з кращими результатами виконання та дотримання порівняно з одноразовою вакциною проти гепатиту. (Див.: Киго5Ку. еї. ам; Вплив комбінованих вакцин на дотримання схеми імунізації вакциною проти гепатиту В у дітей в США; Те Реайїаїгіс Іптесіив5 різєазе дошгпаї. 36(7):е189-е196, У0І. 2017). В кількох джерелах повідомляється про адсорбцію поверхневого антигену гепатиту В на фосфаті алюмінію в поєднанні з іншими антигенами.

Компонент гепатиту В практично не повинен містити тіомерсалу (спосіб приготування НВзАд без тіомерсалу раніше був опублікований в ЕР1307473). Нехамасф - комбінована вакцина, яка була виведена з ринку через низьку імуногенність компоненту гепатиту В. Тому існує потреба у комбінованій композиції вакцини, що містить антиген гепатиту В з належною або посиленою імуногенністю.

Антигени Наеторпіїсиз іпїнеп7ає (НІіБ)

Наєторнійсз іпПшепає - це грамнегативна коккобактерія, що є звичайною частиною флори верхніх дихальних шляхів. Наепторпйи5 іпйцеплає типу Б (Ніб р) є головною причиною інвазивних інфекцій менінгіту, що передаються через кров, у дітей раннього віку, і головною причиною менінгіту в перші 2 роки життя. Імунізація проти Наеторпіїи5 іпїчеп7ає розпочалася в

Канаді в 1987 році із застосуванням полісахаридної вакцини (полірибозилрибітолфосфату (РЕР)). Капсула полірібозилрибітол фосфату (РЕР) НІ є головним фактором вірулентності для організму. Антитіло проти РКР є основним фактором бактерицидної активності в сироватці крові, а підвищення рівня антитіл пов'язане зі зниженням ризику інвазивного захворювання.

РКР є незалежним Т-клітинним антигеном і, отже, характеризується а) індукцією поганої відповіді на антитіла у немовлят та дітей, які не досягли 18-місячного віку, б) мінливою і кількісно меншою відповіддю на антитіла порівняно з Т-клітинно-залежними антигенами, в) виробленням більш високої частки імуноглобуліну М (І9М) і г) неможливістю індукувати бустерну реакцію.

Початкові вакцини на основі лише компоненту РЕКР виявилися неефективними для немовлят. Подальші зусилля були спрямовані на розробку вакцини на основі кон'югату РЕР, де

РЕР кон'югується з білками, званими білками-носіями, такими як білок зовнішньої мембрани

Меїззегіа тепіпуйідеб5, антитоксин дифтерії, антитоксин правця та СКМ 197. Включення бо компонентів-кон'югатів Ні у комбіновані вакцини пов'язане зі зниженою імуногенністю Ніб. Крім того, кон'югати НІ нестійкі у водних середовищах і не можуть пережити тривале зберігання у цій формі. Отже, полісахарид РЕР Наеторпійи5 іпїсеп7ає Б (Ні) часто має форму висушеної твердої речовини, яка розводиться під час введення рідким складом інших антигенів.

Наприклад, у Іптапгіхю пеха (М/О99/48525).

Антиген поліомієліту

Доступні різні види вакцини: - Жива ослаблена оральна поліомієлітна вакцина (ОПВ) була розроблена доктором

Альбертом Сабіном у 1961 році. ОПВ, що включає штами Сабін, вводять перорально. - Інактивована (вбита) вакцина проти поліомієліту (ПВ) була розроблена в 1955 році доктором Йонасом Солком. ІПВ, що включає штами Солк, вводять у вигляді ін'єкцій. - Нещодавно був розроблений інактивований поліовірус Сабін для ін'єкцій, який був приготований шляхом інактивації вірусу поліомієліту штамами Сабіна, доступний також у комерційних продуктах.

Живі послаблені (ОПВ) та інактивовані (ІПВ) поліовакцини були ефективними у боротьбі із захворюванням на поліомієліт у всьому світі. Вакцина проти поліомієліту може містити штами

Солк або Сабін.

У 1955 році доктору Йонасу Солку вдалося інактивувати вірус поліомієліту дикого типу, таким чином включивши його у склад ін'єкційного типу, і назвавши його штамом Солк, який включає Мапопеу типу 1, МЕБЕ типу 2 та Зашикеїй типу 3, які мають використовувались у вакцині проти поліомієліту. До штамів Сабін належать штами Сабін 1 і Сабін 2.

На даний момент прийнятна стандартна доза поліовакцини містить 40 О антигенних одиниць інактивованого поліовірусу типу 1 (Мапопеу), 8 О антигенних одиниць інактивованого поліовірусу типу 2 (МЕБР-І) та 32 О антигенних одиниць інактивованого поліовірусу типу З (ЗаиКей), наприклад Іпгапгіх-пехає (М/О99/48525).

На даний час ІПВ доступна або як безад'ювантний окремий препарат, або у різних комбінаціях, включаючи ОТ-ІРМ (з дифтерійним та правцевим анатоксинами) та шестивалентні

ІПВ вакцини (додатково проти кашлюку, гепатиту В та Наеторпйи5 іпїшеплає Б), наприклад

Іптапгіхо пеха (М/О99/48525).

Однак, порівняно з ОПВ, загальна собівартість виробництва ІПВ значно вища. В основному

Зо це пов'язано з такими вимогами: (ї) більше вірусу на дозу; (ії) додаткова подальша обробка (тобто концентрація, очищення та інактивація) та відповідне тестування контролю якості (її) втрата антигену або неналежне подальше відновлення і ім) стримування. Досі фінансовий аспект був головним недоліком новаторської розробки та впровадження ІПВ у країнах з низьким та середнім рівнем доходу.

Майбутній світовий попит на ІПВ після ліквідації поліовірусів може зрости з нинішнього рівня 80 мільйонів доз до 450 мільйонів доз на рік Отже, ймовірно, знадобляться підходи до "періодичних" поставок ІПВ.

Ефективні вакцинні препарати зі зменшеною дозою, які забезпечують захист від інфекції із застосуванням меншої дози антигену ІПВ, є оптимальними в ситуаціях, коли постачання звичайної вакцини недостатнє для задоволення глобальних потреб або, коли витрати на виготовлення звичайної вакцини не дозволяють продавати вакцину за ціною, доступною для країн, що розвиваються. Також вплив меншої дози ІПВ порівняно з існуючими на ринку препаратами може бути більш безпечним. Таким чином, необхідно оцінити різні стратегії забезпечення ІПВ за більш доступними цінами. Отже, комбінована вакцина зі зменшеною дозою

ІПВ може бути доступнішою по ціні та зручнішою для введення.

У разі вакцини проти пандемічного грипу використання ад'ювантів дозволило зменшити дозу, збільшити доступність та знизити вартість вакцини. Тому було припущено, що форма вакцини ІПВ на основі ад'юванта дозволить знизитти витрати, а також збільшити кількість доступних доз ІПВ у всьому світі.

Крім того, солі алюмінію вважаються безпечними й недорогими, вони вже використовуються в комбінованих вакцинах, що містять ІПВ, їх використання завдає менше перешкод при розробці. Однак не відомо чи можна значно зменшити дозу при застосуванні алюмінієвих ад'ювантів.

Інші антигени

Іншими антигенами, які можуть бути включені до комбінованої вакцини, є Наеторпіїи5 іпЯсепає (серотипи а, с, 4, е, ї та неінкапсульовані штами), гепатит (штами А, С, 0, Е, Є їі 5), менінгіт А, В або С, грип, пневмококи, стрептококи, сибірська виразка, денге, малярія, кір, свинка, краснуха, БЦЖ, японський енцефаліт, ротавірус, віспа, жовта лихоманка, тиф, вірус оперізуючого лишаю, повітряної віспи та ін.

Діапазон та тип антигенів, що застосовуються у комбінованій вакцині, залежать від віку цільових груп популяції, наприклад, немовлята, діти дошкільного віку, діти шкільного віку, підлітки та дорослі. Відомі перші комбіновані вакцини, які могли б запобігти інфікуванню

Вогаєїєйа репиввзів, Сіовігдійт іеїапі, Согуперасієгішт Оірійпегає та необов'язково інактивованого полівірусу (ІПВ) та/або вірусу гепатиту В та/або Наеторпійи5 іпЯсеплаеє типу В (див., наприклад, УМО 93/24148, ММО97/00697, ММО2000/030678, УМО2008/028956, 05 6013264 8.

МО2005089794).

Тим часом для багаторазової ін'єкції вакцини необхідно використовувати консервант, щоб уникнути зараження мікроорганізмами. Серед комбінованих вакцинних препаратів, що експортуються ООН в країни, що розвиваються, переважають вакцини, які містять консервант, враховуючи середовище країн, де слід використовувати вакцини, методи розподілу, витрати тощо. Приклади консерванту, що застосовується у вакцинних продуктах, можуть містити тімеросал, 2-ПЕ, фенол, формальдегід та звичайні дози консервантів, відомі в даній галузі техніки.

Винахідники встановили, що імуногенність, реактогенність, стабільність та підтримання правильної форми антигенів у комбінованій вакцинній композиції залежать від способу утворення композиції, що включає процес виготовлення індивідуальних антигенів, послідовність додавання антигенів, використання специфічних ад'ювантів у конкретній кількості для певних антигенів, індивідуальна адсорбція або комбінована адсорбція антигенів на ад'ювантах, ступінь адсорбції антигену на ад'ювантах, загальний вміст алюмінію, концентрація та тип використовуваного консерванту, використання різних параметрів, у тому числі змішування, температура і рн.

Стислий виклад суті винаходу

Розкрито рідку, стабільну комбіновану вакцинну композицію, що демонструє підвищену імуногенність та знижену реактогенність та процес її виготовлення.

Дане розкриття стосується комбінованої вакцинної композиції, що включає: а) високоочищений дифтерійний анатоксин (0) та анатоксин правця (Т), отриманий з використанням напівсинтетичного середовища та згодом детоксифікований.

Б) інактивований цільноклітинний кашлюковий компонент (м/Р), приготований із

Зо застосуванням комбінації теплової та хімічної інактивації, специфічних штамів ВогаеїейПа репіи55і5 у певному співвідношенні, що призводить до зниження реактогенності та підвищення специфічної активності. с) капсулярний полісахаридний антиген (РКР) Наеторпіи5 іпПиеплає типу В (НІБ), кон'югований з білком-носієм (СР) 4) ІПВ (інактивований поліовірус) зі стандартною або зниженою дозою штаму Солк або штаму Сабін, отриманий за допомогою вдосконалених методів інактивації формальдегіду та може бути додатково адсорбований на гідроксиді алюмінію. е) оптимальний профіль адсорбції антигену(-ів), такий, що поверхневий антиген гепатиту В (Нерв) адсорбується індивідуально на фосфатно-ад'ювантний фосфат алюмінію, антигениб і Т індивідуально адсорбуються на ад'ювант фосфату алюмінію, завдяки чому підвищується імуногенність

І) мінімальний вміст алюмінію, забезпечуючи тим самим знижену реактогенність 9) оптимальна концентрація 2-феноксіетанолу (2-РЕ) в якості консерванту.

Завдання

Деякі завдання розкриття, які відповідають, щонайменше, одному варіанту винаходу, наведено нижче.

Завданням цього розкриття є поліпшення однієї або декількох проблем рівня техніки або принаймні надання корисної альтернативи.

Іншим завданням цього розкриття є створення рідкої, стабільної, менш реактогенної та більш імуногенної комбінованої вакцинної композиції/рецептури, придатної для профілактики та лікування більш ніж одного хвороботворного стану, що відповідає критерію серопротекції відносно кожного із зазначених імуногенних компонентів.

Ще одним завданням цього розкриття є представлення способу виготовлення такої композиції/рецептури комбінованої вакцини.

Інші завдання та переваги цього розкриття будуть більш зрозумілі з наступного опису, який не призначений для обмеження сфери застосування цього розкриття.

Детальний опис

Згідно з першим варіантом цього розкриття, комбінована вакцинна композиція складається з групи антигенів/муногенів, вибраних, серед іншого, з таких: дифтерійний анатоксин (0), бо правцевий анатоксин (Т), цільноклітинний В. реги55і5 (м'Р), Наеторпйиз іпїсепгає типу В(НІБ),

кон'югований з РЕР-СР, гепатит В (НерВ), інактивований поліовірус (ІПВ) ї додатково містить ад'ювант та консерванти на основі алюмінію.

Згідно з другим варіантом цього розкриття, комбінована вакцинна композиція може додатково містити один або більше антигенів, вибраних із групи, що складається, серед іншого, з таких компонентів: Наеторпйиз5 іпїсеп7ає(серотипи а, с, 4, е, ї та неінкапсульованих штамів), гепатит (штами А, С, 0, Е, Е і С), менінгіт А, В, С, М, М/-135, або Х, грип, іарпуіососсив5 ацгеив, антиген(-и) ЗаІтопеїІа їтурпі, адмелюлярний кашлюковий антиген, модифікована аденілатциклаза, антиген малярії (РТС, 5), пневмококи, стрептококи, сибірська виразка, денге, малярія, кір, свинка, краснуха, БЦЖ, вірус папіломи людини, японський енцефаліт, денге, Зіка, Ебола, чикунгунья, ротавірус, жовта віспа, флавівіруси, оперізуючий лишай, антигени вірусу МагісеПа, відповідно.

Згідно третього варіанту цього розкриття, штами ІПВ, що використовуються у складі комбінованої вакцини, містять інактивовані штами Сабін, обрані з групи типу 1, типу 2 та типу 3, або інактивовані штами Солк, обрані з групи Мапопеу типу 1, МЕБЕ типу 2 і Заикей типу 3.

В одному з аспектів третього варіанту поліовірус може бути культивований таким способом: - Клітинна лінія ССІ 81-МЕКО (нирка мавпи) використовувалася в якості клітини господаря для культивації поліовірусів, тобто штамів сабін та солк. - Після інфікування клітин-господарів бажаним штамом поліовірусу та інкубації протягом 72 годин середовище, що містить вірус та клітинний дебріс об'єднували та збирали в один контейнер. - Фільтрат піддавали тангенціальній потоковій фільтрації за допомогою касети 100КбОа; діафільтрували з використанням фосфатного буфера і очищували за допомогою аніонообмінної хроматографії. - До введення пацієнтам віруси повинні бути інактивовані за допомогою відповідних методів інактивації.

Однак винахідники напрочуд виявили, що високий відсоток втрат пост-формальдегідної інактивації О-антигену може бути зумовлений наявністю фосфатного буфера, який несподівано викликає небажану агрегацію частинок поліовірусу.

Отже, важливий аспект цього розкриття включає вдосконалений процес інактивації

Зо формаліну, що складається з таких етапів: а) очищений пул вірусів піддавали буферному обміну від фосфатного буфера до трис- буфера в діапазоні (від 30 до 50 мМ) з рН від 7 до 7,5, р) до вищевказаної суміші додавали середовище М-199, що містить гліцин (5 г/л) с) додавали 0,025 95 формальдегіду і потім змішували,

Я) потім суміш інкубували при температурі 37 "С протягом 5-13 днів при постійному перемішуванні маси вірусу на магнітній мішалці, е) пост-інкубаційну суміш обробляли на проміжній системі ТЕР (100 КдДа, 0,1 м") на 7-й день та остаточній фільтрації після інактивації 7) згодом відфільтровану частину зберігали при температурі 2-8 С, 49) ІФА О0-Ад для визначення одиниці О-Аа

Згідно четвертого варіанту цього розкриття, штами ІПВ, що використовуються у складі комбінованої вакцини, містять зменшені дози інактивованих штамів Сабін, обрані з групи типу 1, типу 2 та типу 3, або інактивовані штами Солк, обрані з групи Мапопеу типу 1, МЕЕ типу 2 і заикеїй типу 3.

Згідно п'ятого варіанту цього розкриття, ІПВ (штами Сабін та Солк) не адсорбуються на будь-якому ад'юванті (наприклад, перед змішуванням з іншими компонентами, якщо є).

Відповідно до шостого варіанту цього розкриття, компонент(и) ІПВ (Сабін та Солк) можуть бути адсорбовані на ад'юванті, вибраному з групи солі алюмінію (АЇІЗж), наприклад, гідроксид алюмінію (АКОН)з) або фосфат алюмінію (АІРОз4), квасці, фосфат кальцію, МРІ А, 30О-МРІ, 0521, олігодезоксинуклеотидний ад'ювант, що містить Сро, ліпосома або водно-масляна емульсія чи їх комбінація. (наприклад, до або після змішування з іншими компонентами, якщо є). Якщо адсорбовані, один або кілька компонентів ІПВ можуть адсорбуватися окремо або разом у вигляді суміші на гідроксиді алюмінію.

Компонент(и) ІПВ (штами Сабін та Солк) можуть бути адсорбовані на солі алюмінію за допомогою такої процедури: - Беруть потрібний об'єм обробленого в автоклаві АКОН)з для отримання кінцевої концентрації алюмінію (Аїч---) від 0,1 до 0,8 мг/доза в контейнері об'ємом 50 мл - Додають масу ІПВ з доведеною одиницею О-Ад та доводять об'єм до мітки розріджувачем (1Ох М-199--0,5 905 гліцину), 60 - Доводять рН кінцевого складу та отримують готовий склад з рН від 6 до 6,8.

В одному з аспектів шостого варіанту адсорбція ІПВ, інактивованого формаліном, може бути здійснена на алюмінії (АІЗх) з концентрацією, вибраною з 0,1 мг/доза, 0,2 мг/доза, 0,3 мг/доза, 0,4 мг/доза, 0,5 мг/доза, 0,6 мг/доза, 0,7 мг/доза та 0,8 мг/доза, переважно з 0,1 мг/доза до 1,25 мг/доза на серотип та при рН, вибраному з діапазону 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7 і 6,8, переважно - 6.5.

У ще одному аспекті шостого варіанту відсоткове відновлення О-Антигену після інактивації формаліном в присутності Тгі5 може бути або 50 95, 60 Фо, 70 95 або 80 95, а відсоток адсорбції після адсорбції гідроксидом алюмінію може бути між 70 95 до 80 95, 80 9о до 90 95 або 90 95 до 99 95 або 95 95 до 99 95.

Згідно з сьомим варіантом цього розкриття, дифтерійний токсин (екзотоксин) та токсин правця (екзотоксин) отримували відповідно з Согупебасіегішт Оірпіпегіа та Сіозігідішт Теїапі та згодом детоксифікували за допомогою відповідного способу інактивації. Отриманий таким чином дифтерійний анатоксин (0) та анатоксин правця (Т) був додатково очищений за допомогою гель-фільтрувальної хроматографії. Отриманий таким чином очищений ОТ далі використовувався для створення комбінованої вакцини.

В одному з аспектів сьомого варіанту дифтерійний токсин продукується культивацією

Согуперасіегішт Оірпїегіає у напівсинтетичному середовищі, що складається з наведених далі інгредієнтів в оптимальних концентраціях у будь-якій з таких комбінацій:

Комбінація 1:

Казеїновий гідролізат, моногідрат мальтози, льодовикова оцтова кислота, лактат натрію, сульфат магнію, В-аланін, пімелова кислота, нікотинова кислота, купорос сульфат, сульфат цинку, хлорид марганцю, І-цистин, дигідрат хлориду кальцію, ортофосфат дигідрогену калію, фосфат гідрогену калію, сульфат заліза і ВДІ.

Комбінація 2:

Казеїн гідролізат, моногідрат мальтози, оцтова кислота льодовикова, натрію лактат, сульфат магнію, В-аланін, пімелова кислота, нікотинова кислота, хлорид марганцю, І -цистин, дигідрат хлориду кальцію, ортофосфат дигідрогену калію, дікалійфосфат, сульфат заліза і ВДІ.

Комбінація 3:

Казеїновий гідролізат, моногідрат мальтози, льодовикова оцтова кислота, лактат натрію, ІДВ-

Зо аланін, пімелова кислота, нікотинова кислота, купорос сульфат, сульфат цинку, хлорид марганцю, іІ-цистин, дигідрат хлориду кальцію, ортофосфат дигідрогену калію, фосфат гідрогену калію і МУР.

Комбінація 4:

Дріжджовий екстракт, моногідрат мальтози, льодовикова оцтова кислота, лактат натрію, сульфат магнію, В-аланін, пімелова кислота, нікотинова кислота, купорос сульфат, сульфат цинку, хлорид марганцю, І-цистин, дигідрат хлориду кальцію, ортофосфат дигідрогену калію, фосфат гідрогену калію, сульфат заліза і ВДІ.

Згідно другого аспекту сьомого варіанту дифтерійний токсин продукується культивацією

Согуперасіегішт Оірпїегіає у напівсинтетичному середовищі, що складається з наведених далі інгредієнтів в оптимальних концентраціях у будь-якій з таких комбінацій:

Комбінація 1:

Казеїнове середовище, хлорид кальцію, дікалійфосфат, декстроза безводна, натрію хлорид, сульфат магнію, рибофлавін, тіаміну гідрохлорид, піридоксину гідрохлорид, пантотенат кальцію, нікотинова кислота, І-цистин, хлорид заліза, розчин вітаміну В12 розчин, біотин, конц. НСІ,

Маон, абсолютний етанол та ВДІ

Комбінація 2:

Казеїнове середовище, хлорид кальцію, Г-аланін дікалійфосфат, декстроза безводна, натрію хлорид, сульфат магнію, сульфат заліза, рибофлавін, тіаміну гідрохлорид, піридоксину гідрохлорид, пантотенат кальцію, нікотинова кислота, І -цистин, хлорид заліза, розчин вітаміну

БО В12 розчин, біотин, конц. НСІ, Маон, абсолютний етанол та ВДІ

Комбінація 3:

Казеїнове середовище, хлорид кальцію, дікалійфосфат, декстроза безводна, натрію хлорид, сульфат цинку, рибофлавін, тіаміну гідрохлорид, піридоксину гідрохлорид, пантотенат кальцію, нікотинова кислота, І-цистин, хлорид заліза, розчин вітаміну В12 розчин, біотин, конц. НСІ,

Маон, абсолютний етанол та ВДІ

Комбінація 4:

Казеїновий гідролізат, хлорид кальцію, дікалійфосфат, декстроза безводна, натрію хлорид, сульфат магнію, діхлорид марганцю, рибофлавін, тіаміну гідрохлорид, піридоксину гідрохлорид, пантотенат кальцію, нікотинова кислота, І -цистин, хлорид заліза, розчин вітаміну В12 розчин, 60 біотин, конц. НСІ, Маон, абсолютний етанол та ВДІ

У ще одному аспекті сьомого варіанту дифтерійний токсин та токсин правця детоксифікували за допомогою одного або комбінації наступних методів інактивації, які включають тепло, УФ, формалін/формальдегід, ацетилетиленімін та ін.

Згідно з восьмим варіантом цього розкриття антиген гепатиту (Нер), який використовується в комбінованій вакцинній композиції, містить Нер-антигени, отримані з поверхні штаму гепатиту

В (НВзАО).

В одному з аспектів дев'ятого варіанту НВ5Ад може бути отриманий одним із таких способів. - Очищення антигену у вигляді частинок з плазми хронічних носіїв гепатиту В, великі кількості НВ5Ад синтезуються в печінці та вивільняються в кров під час зараження НВУ. - Експресія білка методами рекомбінантної ДНК.

Згідно дев'ятого варіанту цього розкриття, дифтерійний анатоксин (0), анатоксин правця (Т) та поверхневий антиген гепатиту В (НВ5Ад) індивідуально адсорбуються на ад'юванті, вибраного з групи солі алюмінію (АЇІЗ-), наприклад: гідроксид алюмінію (АМКОН)з) або фосфат алюмінію (АІРО»х), алюміній, фосфат кальцію, МРІ А, 30О-МР'І.,, 9521, олігодезоксинуклеотидний ад'ювант, що містить Сро, ліпосома або водно-масляна емульсія чи їх комбінація.

Однак переважно дифтерійний анатоксин (0), анатоксин правця (Т) та поверхневий антиген гепатиту В (НВ5Ад) індивідуально адсорбуються фосфатом алюмінію.

В одному з аспектів дев'ятого варіанту дифтерійний анатоксин (0) адсорбується на фосфаті алюмінію з відсотковою адсорбцією принаймні 50 95.

В іншому аспекті дев'ятого варіанту анатоксин правця (Т) адсорбується на фосфаті алюмінію з відсотковою адсорбцією принаймні 40 95.

У ще одному аспекті дев'ятого варіанту поверхневий антиген гепатиту В (НВзЗАд) адсорбується на фосфаті алюмінію з відсотковою адсорбцією принаймні 70 95.

Відповідно до десятого варіанту цього розкриття, Ніб-антиген, який використовується в комбінованій вакцині цього розкриття, походить від капсульного полісахариду штаму НІіБ Б 760705.

Згідно з одним аспектом десятого варіанту, РКР антигену НіР р кон'югується з білком- носієм, обраним із групи білка-носія, що складається, серед іншого, з таких компонентів:

САфМ197, дифтерійний анатоксин, комплекс зовнішньої мембрани Меї5зегіа тепіпойіаів,

Зо фрагмент С анатоксину правця, кашлюковий анатоксин, білок О Н. іпЯшсеплає, Е. сої І Т, Е. соїї

ЗІ та екзотоксин А з Рзепдотопа5 аегидіпоза, комплекс зовнішньої мембрани с (ОМРО), порини, білки, що зв'язують трансферин, пневмолізин, поверхневий білок пневмокока А (Р5рА), поверхневий пневмококовий адгезин А (РзаА), пневмококовий РП, пневмококові поверхневі білки ВМН-3 та ВМН-11, захисний антиген (РА) Васіїйи5 апійгасі5, детоксифікований набряковий фактор (ЕЕ) та летальний фактор (І Е) Васійи5 апіпгасі5, овальбумін, гемоціанін лімфи равлика (КІН), альбумін сироватки людини, альбумін бичачої сироватки (ВБА) та сухий туберкулін, очищений від білків середовища (РРО), синтетичні пептиди, білки теплового шоку, білки кашлюку, цитокіни, лімфокіни, гормони, фактори росту, штучні білки, що містять багато епітопів

Сра4Т-клітин людини від різних антигенів, похідних від патогенів, таких як М 19, протеїни, що поглинають залізо, токсин А або В з білків С. аїйісйе та 5.адаіасіає.

Тим не менш, оптимально, щоб Нір р РЕР кон'югувався з правцевим анатоксином (ТТ) за допомогою хімії СМВГг, хімії відновного амінування, хімії ціанілування або будь-якої іншої хімії, вже розкритої КпіхКегп еї аї., "Кон'югація: дизайн, хімія та аналіз" та ЕїЇї5 еї аЇ. "Розробка та клінічне застосування вакцин Наеторпійиз Б на основі кон'югату". Мем ХогК: Магсеї! Оеккег, 1994: 37-69

Згідно другого аспекту десятого варіанту, білок-носій присутній як у вільній, так і у кон'югованій формі в композиції цього розкриття, некон'югована форма переважно становить не більше 20 95 від загальної кількості білка-носія в композиції як в цілому і, більш переважно, принаймні менше 5 95 по мавбі.

Згідно третього аспекту десятого варіанту Нібо-антиген не адсорбується по суті на будь- якому ад'юванті.

Згідно четвертого аспекту десятого варіанту Ніб-антиген не може піддаватися навмисній або примусовій адсорбції на будь-якому ад'юванті.

Відповідно до одинадцятого варіанту цього розкриття, антиген цільноклітинного кашлюкового компоненту (м'Р), використовуваний у складі комбінованої вакцинної композиції цього розкриття, переважно виготовляють із штамів ВогаєтеїПа репи55і5 134, 509, 25525 та 6229, змішаних у визначеному співвідношенні та згодом інактивованих за допомогою використання вдосконалених методів інактивації без застосування тімеросалу, що призводить до зниження реактогенності та збільшення специфічної активності і може або не може бути адсорбований на 60 ад'ювантах на основі алюмінію.

Згідно першого аспекту одинадцятого варіанту, антиген цільноклітинного кашлюкового компоненту (м'Р), використовуваний у складі комбінованої вакцинної композиції цього розкриття, переважно, виготовлений із штамів ВогаєїтеМйа репивз5і5 134, 509, 25525 та 6229, змішаних у співвідношенні 1:1:0,25:0,25.

Згідно другого аспекту одинадцятого варіанту, антиген цільноклітинного кашлюкового компоненту (мР), використовуваний в комбінованій вакцинній композиції, був інактивований з використанням одного або декількох наступних методів інактивації, які включають тепло, УФ, формалін/формальдегід, ацетилетиленімін та ін.

Однак переважно антиген цільноклітинного кашлюкового компоненту /- (мР), використовуваний в комбінованій вакцинній композиції, був інактивований комбінацією термічної та хімічної обробки. Однак переважно інактивована теплом при температурі 56:22 "С протягом 10-15 хв у присутності формальдегіду маса м/Р залишається негрудкуватою і легко гомогенізованою, тим самим призводячи до зниження реактогенності та покращення активності

МР протягом більш тривалого часу.

Згідно третього аспекту одинадцятого варіанту, антиген цільноклітинного кашлюкового компоненту (м'Р), використовуваний в комбінованій вакцинній композиції, може або не може бути адсорбований на ад'юванті на основі алюмінію, такому як гідроксид алюмінію, фосфат алюмінію або їх комбінації (наприклад, до або після змішування з іншими компонентами, якщо є). При адсорбуванні один або кілька штамів м/Р (тобто 134, 509, 25525 і 6229) можуть бути адсорбовані окремо або разом у вигляді суміші.

Згідно дванадцятого варіанту цього розкриття, кількість дифтерійного анатоксину (0) становить 1-40 І 7; анатоксину правця (Т) - 4-25 1 мР - 4-30 МОО на 0,5 мл; кількість кон'югату

РАР-ТТ Н. ІпПшеплає В становить 1 - 20 мкг вмісту РЕР на 0,5 мл; кількість антигену НВ5ЗАд становить від 1 до 20 мкг на 0,5 мл; ІПВ Сабін, що включає тип 1, тип 2 і тип 3, де тип 1 міститься в кількості 1 - 50 БШО/,5 мл, тип 2 в кількості 1 - 20 БО/,5 мл і тип З в кількості 1 - 50

БИ / 0,5 мл і додатково містить ад'ювант на основі алюмінію і консерванти в готовій комбінованій вакцинній композиції/рецептурі.

При цьому оптимальна кількість дифтерійного анатоксину (0) становить близько 25 І у готовій комбінованій вакцинній композиції.

Зо При цьому оптимальна кількість дифтерійного анатоксину (0) становить близько 20 І у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість дифтерійного анатоксину (0) становить близько 10 Ії у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість анатоксину правця (Т) становить близько 10 І у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість анатоксину правця (Т) становить близько 4 Ії у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість анатоксину правця (Т) становить близько 2 Ії у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість м/Р становить близько 16 МОО на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість Р становить близько 14 МОО на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість Р становить близько 12 МОО на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість кон'югату Н. Іпйцеплає В РЕР-ТТ становить близько 13 мкг вмісту РЕР на 0,5 мл.

При цьому оптимальна кількість кон'югату Н. Іпйцеплає В РЕР-ТТ становить близько 10 мкг вмісту РЕР на 0,5 мл.

При цьому оптимальна кількість кон'югату Н. ІпЯйшеплає В РЕР-ТТ становить близько 8 мкг вмісту РЕР на 0,5 мл.

При цьому оптимальна кількість антигену НВ5Ад становить близько 15 мкг на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість антигену НВбАд становить близько 10 мкг на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість антигену НВ5Ад становить близько 8 мкг на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість поліовакцини інактивованої штамом Сабін (5ІРМ), яка включає штами типу 1, типу 2 та типу 3, становить близько 40 БІО, 8 БИ та 32 БІ відповідно на бо 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

Згідно тринадцятого варіанту цього розкриття, кількість дифтерійного анатоксину (0) становить 1-40 І 7; анатоксину правця (Т) - 4-25 1 мР - 4-30 МОО на 0,5 мл; кількість кон'югату

РАР-ТТ Н. ІпПшеплає В становить 1 - 20 мкг вмісту РЕР на 0,5 мл; кількість антигену НВ5ЗАд становить від 1 до 20 мкг на 0,5 мл; поліовірус, інактивований штамом Солк (ІРМ), що включає штами Мапйопеу типу 1, МЕБЕ типу 2 та Зашикеїй типу 3, при цьому штам Майопеу типу 1 міститься в кількості 1-50 00/0,5 мл, МЕР типу 2 міститься в кількості 1-20 0О/0,5тіІ ії ЗаиКей типу З міститься в кількості 1-50 0Ш/0,5 мл з додатковим вмістом ад'юванту і консервантів на основі алюмінію у готовій комбінованій вакцинній композиції/складі.

При цьому оптимальна кількість дифтерійного анатоксину (0) становить близько 25 І у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість дифтерійного анатоксину (0) становить близько 20 Ії у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість дифтерійного анатоксину (0) становить близько 10 Ії у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість анатоксину правця (Т) становить близько 10 І у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість анатоксину правця (Т) становить близько 4 Ії у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість анатоксину правця (Т) становить близько 2 Ії у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість Р становить близько 16 МОО на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість Р становить близько 14 МОО на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість м/Р становить близько 12 МОО на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість кон'югату Н. Іпйцеплає В РЕР-ТТ становить близько 13 мкг вмісту РЕР на 0,5 мл.

При цьому оптимальна кількість кон'югату Н. ІпЯйпеплає В РКР-ТТ становить близько 10 мкг вмісту РЕР на 0,5 мл.

При цьому оптимальна кількість кон'югату Н. Іпйцеплає В РКР-ТТ становить близько 8 мкг вмісту РЕР на 0,5 мл.

При цьому оптимальна кількість антигену НВбАд становить близько 15 мкг на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість антигену НВ5Ад становить близько 10 мкг на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість антигену НВ5Ад становить близько 8 мкг на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість поліовакцини, інактивованої штамом Солк, яка включає штами Майопеу типу 1, МЕЕ типу 2 та ЗашкКей типу З становить близько 40 БИ, 8 БО та 32 БО відповідно на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

Згідно чотирнадцятому варіанту цього розкриття, кількість дифтерійного анатоксину становить 1-40 І Є анатоксину правця - 4-25 1 МР - 4-30 МОО на 0,5 мл; кількість кон'югату

РАР-ТТ Н. ІпПйшеплає В становить 1 - 20 мкг вмісту РЕР на 0,5 мл; кількість Нер-антигену становить від 1 до 20 мкг на 0,5 мл; поліовакцина, інактивована зменшеною дозою штаму Сабін (СІПВ), що використовується у складі комбінованої вакцини і включає тип 1, тип 2 та тип 3, де тип 1 міститься в кількості 2,5-10 БО/О,5 мл, тип 2 міститься в кількості 5-20 БО/,5 мл, а тип З міститься в кількості 1-20 БО/0,5 мл з додатковим вмістом ад'юванту і консервантів на основі алюмінію у готовій комбінованій вакцинній композиції/рецептурі.

При цьому оптимальна кількість дифтерійного анатоксину (0) становить близько 25 Ії у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість дифтерійного анатоксину (0) становить близько 20 Ії у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість дифтерійного анатоксину (0) становить близько 10 І у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість анатоксину правця (Т) становить близько 10 Ії у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість анатоксину правця (Т) становить близько 4 Ії у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість анатоксину правця (Т) становить близько 2 Ії у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість Р становить близько 16 МОО на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість м/Р становить близько 14 МОО на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість Р становить близько 12 МОО на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість кон'югату Н. Іпйцеплає В РЕР-ТТ становить близько 13 мкг вмісту РЕР на 0,5 мл.

При цьому оптимальна кількість кон'югату Н. Іпйцеплає В РЕР-ТТ становить близько 10 мкг вмісту РЕР на 0,5 мл.

При цьому оптимальна кількість кон'югату Н. Іпйцеплає В РКР-ТТ становить близько 8 мкг вмісту РЕР на 0,5 мл.

При цьому оптимальна кількість антигену НВ5Ад становить близько 15 мкг на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість антигену НВ5Ад становить близько 10 мкг на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість антигену НВ5Ад становить близько 8 мкг на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість поліовакцини, інактивованої зменшеною дозою штаму Сабін (СІПВ), яка включає штами типу 1, типу 2 та типу 3, становить близько 5 БИ, 16 БО та 10 Б відповідно на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

Згідно п'ятнадцятого варіанту цього розкриття, кількість дифтерійного анатоксину становить 1-40 І Є анатоксину правця - 4-25 1 м/Р - 4-30 МОО на 0,5 мл; кількість кон'югату РКЕР-ТТ Н.

ІпЯсеп7ає В становить 1 - 20 мкг вмісту РЕР на 0,5 мл; кількість Нер-антигену становить від 1 до 20 мкг на 0,5 мл; поліовакцина, інактивована зменшеною дозою штаму Солк, що включає штами

Мапопеу типу 1, МЕЕ типу 2 та Ззаишкей типу З, при цьому штам Майопеу типу 1 міститься в кількості 5-15 0ШО/0,5 мл, МЕРЕ типу 2 міститься в кількості 1-18 БО/О,5Іті і заийкей типу З міститься в кількості 5-15 БШО/О,5 мл з додатковим вмістом ад'юванту і консервантів на основі алюмінію у готовій комбінованій вакцинній композиції/складі.

При цьому оптимальна кількість дифтерійного анатоксину (0) становить близько 25 І у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість дифтерійного анатоксину (0) становить близько 20 Ії у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість дифтерійного анатоксину (0) становить близько 10 Ії у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість анатоксину правця (Т) становить близько 10 Ії у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість анатоксину правця (Т) становить близько 4 17 у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість анатоксину правця (Т) становить близько 2 Ії у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість Р становить близько 16 МОО на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість м'Р становить близько 14 МОО на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість Р становить близько 12 МОО на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість кон'югату Н. Іпйшеплає В РЕР-ТТ становить близько 13 мкг вмісту РЕР на 0,5 мл.

При цьому оптимальна кількість кон'югату Н. Іпйцеплає В РЕР-ТТ становить близько 10 мкг вмісту РЕР на 0,5 мл.

При цьому оптимальна кількість кон'югату Н. Іпйцеплає В РКР-ТТ становить близько 8 мкг вмісту РЕР на 0,5 мл.

При цьому оптимальна кількість антигену НВ5Ад становить близько 15 мкг на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість антигену НВбАд становить близько 10 мкг на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість антигену НВ5Ад становить близько 8 мкг на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

При цьому оптимальна кількість поліовакцини, інактивованої зменшеною дозою штаму Солк, яка включає штами Майопеу типу 1, МЕБЕ типу 2 та ЗашКей типу З становить близько 10 БИ, 2 и та 10 БІ відповідно на 0,5 мл у готовій комбінованій вакцинній композиції.

Згідно шістнадцятого варіанту цього розкриття, один або більше антигенів готової комбінованої вакцинної композиції не можуть бути по суті адсорбованими на будь-якому ад'юванті.

Згідно сімнадцятого варіанту цього розкриття, композиція містить один або більше ад'ювантів, вибраних із групи солі алюмінію (АІЗж), наприклад, гідроксид алюмінію (АКОН) з) або фосфат алюмінію (АІРО»), алюміній, фосфат кальцію, МРІА, З30-МРІ, 0521, олігодезоксинуклеотидний ад'ювант, що містить Сро, ліпосому або водно-масляну емульсію.

При цьому оптимальна композиція містить в якості ад'юванту фосфат алюмінію (АІРОх).

В одному з аспектів сімнадцятого варіанту антигени готової композиції можуть бути адсорбовані іп 5йи на гелі ортофосфату алюмінію або на готовому гелі ортгофосфату алюмінію чи їх комбінації.

В одному з оптимальних аспектів сімнадцятого варіанту композиція цього розкриття може містити ад'ювант у кількості 2,5 мг/0,5 мл або менше, а конкретно, у кількості від 1,5 мг/0,5 мл до 0,1 мг/0,5 мл

При цьому в іншому оптимальному аспекті сімнадцятого варіанту вміст алюмінію (АїІнЗ3) у готовій комбінованій вакцинній композиції/рецептурі може бути не більше 1,25 мг на 0,5 мл, переважно 1 мг на 0,5 мл і найбільш переважно у кількості 0,1 мг на 0,5 мл до 0,63 мг на 0,5 мл.

Згідно вісімнадцятого варіанту цього розкриття, комбінована вакцинна композиція/рецептура може містити консервант, обраний із групи, що включає: 2-феноксіетанол, бензетонію хлорид (фемерол), фенол, тіомерсал, формальдегід, метилові та пропільні парабени або бензиловий спирт чи їх комбінація.

При цьому оптимальна комбінована композиція/рецептура може містити 2- феноксіетанол (2-РОЕ) в якості консерванту.

Згідно ще одного аспекту винаходу кількість 2 - феноксіетанолу в комбінованій вакцині згідно винаходу не може бути більше, ніж оптимально 3,5 мг/0,5 мл; більш оптимально 3,0 мг/0,5 мл; і найбільш оптимально 2,5 мг/0,5 мл.

Згідно дев'ятнадцятого варіанту цього розкриття, комбінована вакцинна композиція/рецептура цього розкриття може містити фармацевтично прийнятні допоміжні речовини, вибрані з групи, що включає цукри і поліоли, ПАР, полімери, солі, амінокислоти, модифікатори рН (регулювання рН вакцинної композиції) тощо. Приклади цукрів та поліолів, які слід використовувати, можуть включати сахарозу, трегалозу, лактозу, мальтозу, галактозу, маніт, сорбіт, гліцерин тощо. Приклади ПАР можуть включати неїонні поверхнево-активні речовини, такі як полісорбат 20, полісорбат 80 тощо. Приклади полімерів можуть включати декстран, карбоксиметилцелюлозу, гіалуронову кислоту, циклодекстрин тощо. Приклади солей можуть включати Масі, МоС12, КСІ, СаС12 тощо. Приклади амінокислот можуть включати аргінін, гліцин, Приклади модифікаторів рН можуть включати гідроксид натрію, соляну кислоту тощо.

Згідно двадцятого варіанту цього розкриття, зазначена комбінована вакцина може бути ліофілізованою або рідкою композицією, переважно рідкою.

Згідно двадцять першого варіанту цього розкриття, зазначена комбінована вакцина може бути стабільною при температурі 2-8 "С протягом періоду від 12 до 36 місяців; при температурі 25 "С протягом від 2 до 6 місяців; при температурі 37 "С - від 1 тижня до 4 тижнів, з кінцевим рН у діапазоні від 6,0 до 7,0; більш оптимально в діапазоні рнН від 6,2 до 6,8; і найбільш оптимально в діапазоні рН від 6,3 до 6,7.

Згідно двадцять другого варіанту цього розкриття, заявник виявив, що стабільну багатовалентну вакцину з покращеною імуногенністю та зниженою реактогенністю можна отримати, коли вакцина виготовляється способом, представленим нижче, з урахуванням ії) процесу виготовлення окремих антигенів ії) послідовності додавання антигенів ії) використання специфічних ад'ювантів у певній кількості для певних антигенів; ім) індивідуальної адсорбції або комбінованої адсорбції антигенів на ад'ювантах у) ступеня адсорбції антигену на ад'юванті; оптимальної концентрації та типу консерванту та мії) використання різних параметрів, включаючи перемішування, температуру та рн.

Біологічне джерело штамів, що використовуються в комбінованій вакцині ПРІ.

Дифтерійний анатоксин:

Штам Согупебасіегішт дірпіпегіає РУУВ СМ2000 був отриманий з дослідницької лабораторії "УуеПсоте", Лондон, Великобританія, Центральним науково-дослідним інститутом національного органу контролю (С.К.І.) Казапії, Нітаснпа!І Ргадезп, Індія в ліофілізованому вигляді в 1973 р. Штам був відновлений і додатково ліофілізований як серія виробничого штаму б. аірпінегіає СМ2О000 АТ аї С.В... Казації.

Правцевий анатоксин

Штам Сіозіпаійт іеїапі Нагулага бігаїй Мо.49205 був отриманий Національним органом контролю С.В.І. з Інституту Те ВіЇк5 Іпзійше Моог де МоІКздегопанеїа (Нідерланди). Казашції, у ліофілізованій формі.

Кашлюк

Виробництво маси кашлюкової вакцини в 5ІІРІ. передбачає використання чотирьох штамів

Вогаєїейа репиввів міг. Штами 134, 509, 6229 та 25525. Виробничі штами 134 та 509 отримані з

Інституту НіЇк5, Нідерланди, через Національний орган контролю, Центральний науково- дослідний інститут, Казашції, Нітасгнаї! Ргадези, Індія. Виробничі штами 6229 та 25525 отримані з

Інституту Лістера, Англія.

Гепатит В:

В Кпеїп Віоїесп (Німеччина) розроблено рекомбінантний штам Напзепшароїутогрпа, що містить ген поверхневого антигену НВ5Ад. В КПеїп Віоїтесії також створено Головний банк клітин (МСВ Напзепшароіутогтрна КЗ3З/8-1 штам АЮОМУ, 12/94) і проведено усі випробування з визначення характеристик цього банку.

Наеторпіїйсиз іпїсеп7ає типу В:

Вихідним організмом для генерації клітинного субстрату є Наеторпйи5 іпЯйпеплає типу В, штам 760705. Спочатку штам був виділений у хлопчика віком 2 роки 2 місяці (народився 14.08.1974 р.) у листопаді 1976 року. Було проведено три пересіви штаму до його зберігання при температурі -70 "С в Академічному медичному центрі (АМС) університету Амстердаму. Цей штам було передано 5ІІРІ. у рамках співпраці між 5ІІРІ. та Нідерландським інститутом вакцин (ММІ, Нідерланди).

ІПВ:

Штам та джерело поліовірусу представлені нижче.

Зо Поліовірус типу 1:

Штам: Мапопеу

Джерело: Ог. уУ.заІК (компанія Рітап 5 Мооге)

Поліовірус типу 2:

Штам: МЕЕ1

Джерело: Загепо5 Зегит Іпзійше, Копенгаген

Поліовірус типу З:

Штам: заикей

Джерело: Загепо5 Зегит Іпзійше, Копенгаген

В цьому документі специфікації слово "містить" або варіації, такі як "складається з" або "включає", означають, що вони включають вказаний елемент, ціле число або крок, або групу елементів, цілих чисел або кроків, але не виключення будь-якого іншого елемента, цілого чи кроку, або групи елементів, цілих чисел або кроків.

Використання виразу "цонайменше" або "щонайменше один" передбачає використання одного або декількох елементів або інгредієнтів або кількостей, оскільки використання може бути у втіленні винаходу для досягнення однієї або кількох бажаних цілей або результатів. Хоча окремі варіанти винаходів були описані, ці варіанти були представлені лише в якості прикладу і не призначені для обмеження сфери застосування винаходів. Варіанти або модифікації складу цього винаходу в межах винаходу можливі з боку фахівців в даній області техніки при розгляді розкриття в даному документі. Такі варіації або модифікації належним чином відповідають суті цього винаходу.

Числові значення, наведені для різних фізичних параметрів, розмірів і величин, є лише приблизними значеннями, і передбачається, що значення, які перевищують числове значення, присвоєні фізичним параметрам, розмірам і величинам, підпадають у сферу застосування винаходу, якщо немає іншого твердження в специфікації.

Незважаючи на те, що було зроблено значний акцент на конкретних особливостях кращого варіанту, слід розуміти, що багато додаткових функцій можна додати та внести зміни до оптимального варіанту, не відхиляючись від принципів розкриття. Ці та інші зміни в оптимальному варіанті розкриття є очевидними для фахівців у цій галузі техніки на основі даного розкриття; тому слід чітко розуміти, що вищевказаний описовий матеріал повинен 60 тлумачитися лише як ілюстративне розкриття, а не як обмеження.

Переваги

Дане розкриття, описане в цьому документі, має ряд технічних досягнень та переваг, включаючи, серед іншого, реалізацію комбінованої вакцинної композиції, що включає 0, Т, м/Р,

НВ5ЗАд, кон'югат НіБ РЕР-ТТ та ІПВ та спосіб її виготовлення. У порівнянні з іншою комбінованою вакцинною композицією, дане розкриття забезпечує наступні переваги: 1. повністю рідка комбінована вакцина 2. підвищена імуногенність 3. знижена реактогенність 4. підвищена стабільність при температурі 2-87С та при кімнатній температурі, випробовувана протягом 12 місяців. 5. Високоочищені дифтерійні анатоксини (0) та анатоксини правця (Т), отримані з використанням напівсинтетичного середовища без вмісту трансмісивної губчастої енцефалопатії (Т5Е) або губчастої енцефалопатії великої рогатої худоби (ВЕ). 6. Антиген цільноклітинного В. регіизв5із (мР) включає штами ВогаеєїеПНа репиввів 134, 509, 25525 та 6229 у співвідношенні 1:1:0,25:0,25, тим самим покращуючи специфічну активність та імуногенність проти В. репіи55і5. 7. Удосконалений метод інактивації цілоклітинного компонента В. регіиб55і5 (МР) з використанням комбінованої інактивації теплом та формальдегідом. В процесі не використовують тімеросал, а інактивований цільноклітинний кашлюковий антиген залишається негрудкуватим та гомогенним, що призводить до зниження реактогенності та покращення специфічної активності протягом більш тривалого часу. 8. Низький вміст вільного РЕР (менше 7 905) у загальній масі кон'югату РКР-ТТ Наеторпйшв5 іпЯїнеп/ає типу б 9. Покращений профіль адсорбції антигену дифтерійного анатоксину (0), антигену анатоксину правця (Т) та поверхневого антигену гепатиту В (НерВ), адсорбованого окремо на ад'юванті на основі фосфату алюмінію, покращуючи тим самим специфічну активність та імуногенність. 10. Мінімальний вміст алюмінію (АІЗ»), що забезпечує знижену реактогенність. 11. Оптимальна концентрація 2-феноксіетанолу (2-РЕ) в якості консерванту.

Приклади

Наступні приклади включені для демонстрації оптимальних варіантів винаходу. Фахівцям у цій галузі техніки слід визнати, що композиції та методи, розкриті в поданих нижче прикладах, являють собою методи, відкриті винахідником, які функціонуватимуть належним чином в практиці винаходу, і, таким чином, можна вважати такими, що представляють собою оптимальні способи практичного застосування. Однак, фахівці в даній області техніки повинні, зважаючи на це розкриття, врахувати можливість внесення багатьох змін в конкретні варіанти, які розкриваються і все ще отримують подібні або аналогічні результати, не відступаючи від суті та сфери застосування винаходу.

Приклад 1:

Таблиця 1: У цій таблиці наведено короткий опис відсоткової адсорбції окремих антигенів, профілю специфічної активності та стабільності окремих антигенів у комбінованій вакцині 5ІІРІ. при температурі 2-8 "С протягом 12 місяців.

Таблиця 1 випробування/Специфікація

Гепатит В

Специфічна активність Іп-Мімо Н.Р. МТ 1,0 Відповідає нЗ Відповідає 95 9о СІ.

Специфічна активність Мов 95 8463 дифтерійного компонент МІ.Т 30 МО/доза. во ОББО нЗ МО) (МО/доза) (69,9650- доза 137,247 138,030

Специфічна активність правцевого МоО/доза 382,079 компоненту (МО/доза) МІ-Т 40 МО/доза (88,2850- Н/з Мо/доза 208,688)

Специфічна активність 4,6749 кашлюкового компонент МІ.Т 4 МО/доза Мо/доза то таВ В вОВІ 5,131 (МО/доза) 2,5492-8,2763 ' '

Адсорбція гепатиту В (95) 89,44 82,65 75,52

Адсорбція: о, Дифтерійний Фактичне значення 79,0 72,0 ні компонент (95)

Тип 1-40 БО/0,5 мл, тип 2-8

О-антиген (0Ш/0,5 мл) п в від номінального. мл Відповідає Відповідає Відповідає значення прийнятне)

Н/З - не застосовано : Короткий опис відсоткової адсорбції окремих антигенів, профілю специфічної активності та стабільності окремих антигенів у комбінованій вакцині при температурі 25:42 "С протягом 12 місяців.

Таблиця 2 випробування/Специфікація

Гепатит В

Специфічна активність Іп-Мімо МТ 1,0 Відповідає нІЗ Відповідає

А.Р (95 б» СІ)

Специфічна активність с. 98,5120 МО/доза 96,5482 МО/доза (Мод ен МІ-Т 30 МО/доза. (69,9650-137,247) (65,9292-137,687)

Специфічна активність правцевого компонент МІ.Т 40 МО/доза ово Мов нІЗ нІЗ (МО/доза) (88, -208,688)

Специфічна активність 4,6749 МО/доза /|4,5170 МоО/доза| 3,4899 МО/доза (Мода компонент МІ-Т 4 МО/доза (2,6492-8,2763) | (2,4894-8,2672) |. (1,86997-6,4750)

Адсорбція гепатиту В (95) 89,44 83,92 83,00

Адсорбція: Правцевий 40,0 компонент (95) Фактичне значення 59,0 31,0

Адсорбція: о, Дифтерійний Фактичне значення 79,0 72,0 компонент (95)

Тип 1-40 БО/0,5 мл, тип 2-8

О-антиген (0Ш/0,5 мл) пово від номінального мл Відповідає Відповідає Відповідає значення прийнятне)

Н/З - не застосовано

Приклад 2:

Цей приклад дає короткий опис різних комбінованих вакцинних композицій:

Таблиця 3:

Комбінована вакцинна композиція 1

Дифтерійний анатоксин (0) 111111 Типуй(одиниціб-антивєну)д7//|Ї7777777777777171811111717СсС21 778 17111111 2-феноксієтанол..7/://// | 77777777 25мгСС 79871171 Хлориднатрю.їд///// | 77777777 45мгСсС

Таблиця 4:

Комбінована вакцинна композиція 2 1111111 ТипуПсодиниціб-антиєну)д7////Ї77777777777178111СсС21С 78111171 Хлориднатрію.д/////// | 77777 45мг

Таблиця 5:

Комбінована вакцинна композиція З

Дифтерійний анатоксин (0) 1111111 Типуйсодиниціб-антитенууд7/О/ОЇ 77777778 7СССсС21С 10811111 2-феноксетанол..7/ | 77777777 25міСС 77911111 Хлориднатрю.їд//:/:/ОО/ | 7 45мг С

Таблиця 6:

Комбінована вакцинна композиція 4

Дифтерійний анатоксин (0) 1111111 ТипуП(одиниціб-антитену)д7///Ї7777777777777117811111С1СсС2СС 77786111 Хлориднатрю.їд//:/.О|Ї 77777 45мгСС

Таблиця 7:

Комбінована вакцинна композиція 5 1111111 ТипуП(одиниціб-антиєну)д07/////Ї77777777777717117181111С1СсСс2СС 72781711 е2-феноксівєтанол..7/:////С/ | 7777777 25мгіССсС 77989 | 11111111 Хлориднатрію.їд///-/-:// | 45мг

Таблиця 8:

Комбінована вакцинна композиція 6

Дифтерійний анатоксин (0) 1111111 ТипуП(одиниціб-антитену)д7///Ї7777777777777117811111С1СсС2СС 77786117 Хлориднатрію.їд//:/// | 77 45мгС1С

Таблиця 9:

Комбінована вакцинна композиція 7

Дифтерійний анатоксин (0) 1111111 ТипуП(одиниціб-антитену)д7///Ї7777777777777117811111С1СсС2СС

Адсорбується на фосфаті алюмінію (Аг: 77786117 Хлориднатрію.їд//:/// | 77 45мгС1С

Вакцина може містити незначну кількість глютаральдегіду, формальдегіду, неоміцину, стрептоміцину та поліміксину В, які використовуються в процесі виготовлення

Приклад 3:

Процес виробництва кон'югованої маси Наєторнпіїси5 іпПшнепгає типу р

Розгорнутий огляд етапів процесу виробництва кон'югованої маси Наеторпійи5 іпїсепгає типу Юр представлений шляхом опису 53 кроків процесу, коротко описаних нижче:

Крок 1: Колба для культивування інокуляту на етапі І (51):

Флакон з робочим посівним матеріалом використовується для посіву інокуляту в колбі для культивування, яка містить 0,22 мкм відфільтрованого посівного середовища. Використовується одноразова колба ПЕТГ 125 мл з робочим об'ємом 25 мл. Цей етап виконується в шейкері- інкубаторі із контрольованим перемішуванням (2002-50 об/хв) при температурі (3622 "С). Після досягнення відповідного росту бактерій (ОЮОвоо 2 1,0) культуру переносять на наступний етап інокуляції (етап 52), описаний у кроці 2. Виконують забарвлення методом Грама в якості внутрішньовиробничого контролю для забезпечення чистоти культури (грамнегативні кокобацили).

Крок 2: Колба для культивування інокуляту на етапі ІІ (52):

Етап інокуляції 52 передбачає використання колб Фернбаха на 2 л (52А і 528) з робочим об'ємом 800 мл. Колба 52А використовується для вимірювання ОЮ»схоо, доки ОЮсхоо не досягне критеріїв прийнятності, а колбу 52В використовують для інокуляції на етапі 53. В обидві колби завантажують стерилізоване шляхом фільтрації середовище, ідентичне етапу інокуляції 51.

Колбу для етапу 51 використовують для інокуляції обох колб для етапу ІІ. Цей етап виконується в шейкер-інкубаторі з контрольованим перемішуванням (2005-50 об/хв) при температурі (36:12 "С). Після досягнення відповідного росту бактерій (ОЮ5оо 2 1,0) культуру переносять на наступний етап інокуляції (етап 53), описаний в кроці 3. Виконують забарвлення методом Грама в якості внутрішньовиробничого контролю для забезпечення чистоти культури (грамнегативні кокобацили).

Крок 3: Ферментер для інокуляту етапу ЇЇ:

Зо На етапі інокуляції 53 використовують ферментер на 120 л з робочим об'ємом 35 л. У ферментер завантажують середовище, ідентичне попереднім етапам інокуляції.

Використовують колбу для етапу 52 для посіву інокуляту в ферментері. Культивування здійснюють при температурі 2 "С), РО (10 95 від заданої точки), перемішуванні (300-600 об/хв), аераціїї (1-5 ГРМ) і зворотному тиску (0,2 бар) у ферментері інокулята. Після досягнення відповідного росту бактерій (ОЮ»воо 2 1,0) культуру переносять на наступний виробничий етап (етап 54), описаний в кроці 4. Виконують забарвлення методом Грама в якості внутрішньовиробничого контролю для забезпечення чистоти культури (грамнегативні кокобацили).

Крок 4: Ферментативне розщеплення у виробничому масштабі 1200 л:

Виробничий ферментер на 1200 л має робочий об'єм 800 л, в який завантажено компоненти основного середовища та стерилізований парою іп 5йш. Згодом додають різні добавки для носія після проходження фільтра з розміром пор 0,22 мкм. Ферментер інокулюють культурою на етапі

З3, отриманою під час виконання кроку 3. Ферментацію проводять при контрольованому розчиненому кисні (2095 - задана температура), температурі (3бж2 С), рн ш(7,1-7,4), перемішуванні (40-400 об/хв), аерації (50-300 І РМ) і тиску (0,2 бар). Під час ферментації додають дві дискретні біогенні речовини. Зростання контролюється за допомогою вимірювання

ОбОзоо (ОЮвоо 2 3,5), а ферментація вважається завершеною після досягнення стійкого рівня. Під час росту та фази стійкого рівня полісахаридний продукт секретується та накопичується у бульйонній культурі. Виконують забарвлення методом Грама в якості внутрішньовиробничого контролю для забезпечення чистоти культури (грамнегативні кокобацили).

Крок 5: Обробка формаліном:

Зниження біонавантаження на цьому етапі досягають за допомогою хімічного агента (формаліну). Додають 0,1 95 формаліну і інкубують ферментований бульйон протягом НМН 2 годин при температурі 37 "С. Після обробки формаліном посудину швидко охолоджують до «15"С. Валідовано, що додавання формаліну дозволяє досягти зменшення біологічного навантаження. Це підтверджується за допомогою культуральних планшетів після періоду інкубації. Бульйон зі зменшеним біонавантаженням готовий до збирання, як описано в кроці 6.

Крок 6: Збирання при постійному центрифугуванні:

Безперервне центрифугування застосовують як основний етап збирання. Цей етап виконується для відділення полісахариду, що містить сирий бульйон, від інактивованої біомаси.

Безперервну центрифугу використовують з метою вилучення» 9095 біомаси на основі вимірювань відповідно до показників зменшення ОЮ»зоою. Центрифуга працює приблизно при 15000 г та при швидкості потоку рідини 200-500 л/год. Центрифугований супернатант додатково обробляють, як описано в кроці 7.

Крок 7: Глибина фільтрація 501 Р:

Центрифугований супернатант пропускають через фільтр глибиною 50ІЇ Р для видалення грубого матеріалу, такого як клітинний дебріс. Під час виконання цього кроку продукт пропускають через фільтрат відповідно до застосування додаткового глибинного фільтра, як описано в кроці 8.

Крок 8: Глибина фільтрація 90І Р:

Фільтрат, отриманий з глибинного фільтра 50І Р далі пропускають через глибинний фільтр 90І Р. (номінальний показник 0,22 мкм) для подальшого видалення будь-якого нерозчинного матеріалу, який, можливо, не був відфільтрований попереднім глибинним фільтром. Цей крок гарантує, що фільтрат, по суті, не містить клітинного дебрісу і його можна пропустити через фільтр з розміром пор 0,22 мкм. Наступний крок фільтрації описаний в кроці 9.

Зо Кроки 9 та 10: Фільтрація при розмірі пор фільтра 0,22 мкм:

Фільтрат після проходження глибинного фільтра 90ЇР далі пропускають через фільтр з розміром пор 0,22 мкм, фільтрат збирають у накопичувальний резервуар.

Кроки 11 та 12: Концентрація та діафільтрація 100 кД:

Цей крок проводиться для видалення компонентів середовища та домішок з невеликою молекулярною масою. Крім того, проводиться концентрація для зменшення робочого об'єму.

Обирають граничне значення молекулярної маси 100 кД, оскільки молекулярна маса полісахариду Ніб (РКР) становить 2 500 кД. Бульйон концентрують приблизно в 10 разів і згодом діафільтрують для отримання обсягів НМН 5, використовуючи 0,01 М фосфатно- сольового буферного розчину (рН 7,2). Отриманий у концентраті продукт називається "сирим

РЕР" ї далі обробляється, як описано в кроці 13. Концентрований бульйон переносять в зону

О5Р через порт для перенесення через 0,22 мкм-фільтр, щоб гарантувати, що жодна бактерія не потрапить в зону О5Р.

Крок 13: Осадження ЦТАБ:

ЦТАБ (цетилтриметиламоній броміду) - це катіонний миючий засіб, який використовується для осадження полісахариду. ЦТАБ складається з гідрофільної області, а також гідрофобної частини і осаджує білок, нуклеїнову кислоту та полісахарид. Неочищений РЕР, отриманий під час виконання кроку 12, осаджують при концентрації 1 95 ЦТАБ й інкубують протягом» 2 годин.

Збір гранул ЦТАБ описаний в кроці 14.

Кроки 14, 15 і 16: Центрифугування, збирання та зберігання гранул ЦТАБ:

У ЗЕ2-3, ЕЕ, гранули ЦТАБ центрифугують з використанням центрифуги безперервної дії при 15000 об/хв. Гранули ЦТАБ збирають, зважують, аліквотують і зберігають при х -20 "С для подальшої обробки. Це перший внутрішньовиробничий крок утримування.

Кроки 17 та 18: Розморожування та розчинення пасти ЦТАБ:

Заморожену пасту ЦТАБ розморожують до кімнатної температури. Розморожені гранули розчиняють у 5,85 95 розчині МасСі. Розчинення здійснюють у змішувачі, а полісахаридний продукт розчиняють у водній фазі. У резервуарі міститься певна кількість нерозчинного матеріалу, який надходить з осаджених білків та нуклеїнової кислоти. Цю суспензію додатково обробляють, як описано в кроці 19.

Крок 19: Центрифугування:

Матеріал, отриманий під час виконання кроку 18, центрифугують при температурі 2-8 76С, 5000-6500 об/хв протягом 20-30 хвилин для видалення нерозчиненого матеріалу.

Центрифугований супернатант збирають і далі обробляють, як описано в кроці 20.

Крок 20: Осадження 72 95 етанолу: 7290 етанол використовують для осадження РЕР. 96905 етанол використовують для отримання готової концентрації 72 956 етанолу з урахуванням супернатанту, отриманого при виконанні кроку 19. Осадження здійснюють при температурі 2-8 "С протягом ночі. Отриманий осад збирають, як описано в кроці 21.

Кроки 21 та 22: Центрифугування та розчинення гранул:

Осад 72 95 -ного етанолу збирають центрифугуванням при температурі 2-8 "С, 5000-6500 об/хв протягом 20-30 хвилин. Отримані гранули розчиняють у ВДІ до отримання видимої прозорості. Подальша обробка солюбілізованих гранул описана в кроці 23.

Крок 23: Осадження СОС та 32 95 етанолу:

До матеріалу, отриманого під час виконання кроку 22 додають 6 95 ацетат натрію та 1 95 дезоксихолат натрію (00). 96 96 етанол використовують для отримання готової концентрації 3295 етанолу. БОС і 3295 спирт призводять до осадження білкових домішок, дозволяючи полісахариду перебувати в рідкій фазі. Цей осад витримують при температурі 2-8 "С протягом ночі (НМН 8 год.).

Крок 24: Центрифугування:

Матеріал, отриманий під час виконання кроку 23, центрифугують при температурі 2-8 76С, 5000-6500 об/хв протягом 20-30 хвилин для видалення осаду. Центрифугований супернатант збирають і далі обробляють як описано в кроці 25.

Крок 25: Глибина та вуглецева фільтрація:

Супернатантний розчин, отриманий при виконанні кроку 24, містить розчинний РЕР і піддається глибинній фільтрації з подальшою вуглецевою фільтрацією для видалення нуклеїнових кислот і барвника. Видалення нуклеїнових кислот контролюється шляхом періодичного вимірювання поглинання при 260 нм (Агво). Після досягнення необхідного значення Агво розчин фільтрують через фільтр з розміром пор 0,22 мкм ї цей відфільтрований розчин додатково обробляють, як описано в кроці 26.

Зо Крок 26: Осадження 64 95 етанолу:

Відфільтрований матеріал, отриманий при виконанні кроку 25, додатково осаджують 96 9о етанолом при готовій концентрації 64 90 етанолу. Осадження здійснюють при температурі 2-8 70 протягом ночі. Отриманий осад збирають шляхом центрифугування і далі обробляють як описано в кроці 27.

Крок 27: Збір та розчинення гранул:

Супернатант декантирують і відкидають для збору гранул. Гранули розчиняють у ВДІ при кімнатній температурі.

Крок 28: Концентрація та діафільтрація 300 кД:

Розчин розчинених гранул концентрують за допомогою мембрани ММУУСО 300 кД. Потім додатково діафільтрують не менше ніж (НМН) 8 разів за допомогою ВДІ. Отриманий концентрат обробляють далі, як описано в кроці 29.

Кроки 29 та 30: 0,22 мкм фільтрація та зберігання очищеного РЕР:

Концентрат ОРЕ 300 кД пропускають через фільтр з розміром пор 0,22 мкм в якості кроку очистки для мінімізації біологічного навантаження. Отриманий очищений РЕР аліквотують і зберігають при температурі х -20 "С до подальшого використання, як описано в кроці 31. Зразок очищеного РЕР відправляють на аналіз контролю якості.

Крок 31: Розморожування та об'єднання:

Виходячи з обсягу серії кон'югату, розморожують відповідну кількість нативного полісахариду, отриманого при виконанні кроку 30. Об'єднаний матеріал аналізують на вміст

БО РЕР, який необхідний для подальшої обробки, як описано в кроці 32.

Крок 32: Концентрація 100 кД:

Для подальшої обробки мінімальна концентрація об'єднаного очищеного полісахариду повинна становити 8-12 мг/мл. Якщо концентрація полісахариду в пулі нижче необхідної, об'єднаний розчин полісахариду концентрують за допомогою мембрани 100 кД ШЕ ММУУСО.

Пробу відбирають після концентрації, щоб забезпечити досягнення мінімальної концентрації для наступних кроків (крок 33).

Крок 33: Лужна деполімеризація:

Концентрований полісахарид (еквівалентний 74 г/110 г), отриманий при виконанні кроку 32, деполімеризують в легких лужних розчинах, використовуючи карбонат-бікарбонатний буфер.

Після досягнення необхідного об'єму полісахариду деполімеризований полісахарид активують, як описано в кроці 34.

Крок 34: Активація полісахариду:

Деполімеризований полісахарид, отриманий при виконанні кроку 33, активують за допомогою броміду ціаногену. Активація проводиться в азотному середовищі. Ціаноген бромід є високотоксичною хімічною речовиною, тому слід дотримуватися необхідних заходів з техніки безпеки під час поводження з цим хімікатом.

Крок 35: Додавання лінкера:

Свіжоприготовлений розчин дигідразиду адипінової кислоти (АОН) додають протягом 6-10 хвилин до реакційної суміші, отриманої при виконанні кроку 34. Реакцію проводять протягом

НМН 16 годин при температурі 2-10"С. Роль лінкера АЮН полягає у забезпеченні в полісахариді аміногруп, необхідних для реакції кон'югації.

Крок 36: Концентрація та діафільтрація:

Реакційну суміш, отриману при виконанні кроку 35, концентрують і діафільтрують за об'ємом за допомогою фосфатно-сольового буферного розчину (РВ5), використовуючи мембрану 10 кД

ОБГ-ММУУСО для видалення вільної АСОН. Видалення АОСН контролюють за допомогою ВЕРХ та продовжують діафільтрацію доки рівень вільної АОН не буде нижче 5 95. Отриманий концентрат додатково діафільтрують буфером МТ 5Х МЕ5-Масі. Далі концентрують для отримання концентрації НМН 20 мг/мл. Цей концентрований оброблений РЕР витримують при температурі 2-8 7С до подальшого використання, як описано в кроці 37.

Кроки 37 та 38: фільтрація через фільтр з розміром пор 0,22 мкм та зберігання обробленого

РАР:

Концентрат, отриманий при виконанні кроку 36, пропускають через фільтр з розміром пор 0,22 мкм, що слугує етапом очищення. Це також забезпечує контроль рівня біологічного навантаження під час процесу, який виконується в зоні класу С. Відфільтрований активований полісахарид збирають, відбирають пробу, аліквотують і зберігають при температурі 2-8 С до подальшої обробки. З обробленого полісахаридного пулу беруть зразок для аналізу, який включає молекулярний розмір РЕР (кД), вміст РЕР та ступінь активації РЕР. Подальша обробка

РЕР описана в кроці 40.

Зо Крок 39: Концентрація та діафільтрація 10 кд:

Реакція кон'югації потребує двох компонентів, а саме. обробленого полісахариду і білка- носія (ТТ). Білок-носій концентрують і діафільтрують буфером МЕ5-Масі з використанням мембрани 10 кД ШЕ ММУУСО. Потім цей діафільтрований білок-носій далі концентрують до НМН 20 мг/мл, використовуючи ту ж мембрану.

Крок 40: Кон'югація:

Реакція кон'югації потребує двох компонентів, а саме. обробленого полісахариду і білка- носія (ТТ). Активований полісахаридний компонент отримують при виконанні кроку 38. Білок- носій отримують при виконанні кроку 39. Два компоненти змішують у відповідних кількостях у співвідношенні РКР: ТТ-1:1 (мас./мас.) у присутності ЕОС при перемішуванні. Реакцію кон'югації контролюють за допомогою ВЕРХ і продовжують доки конверсія білка не буде становити 2 85 95 (на основі конверсії вільного білка в кон'югат).

Крок 41: Гасіння:

Після того як досягнуто критерії прийнятності реакції кон'югації відносно конверсії (крок 40), реакцію припиняють гасінням. Реакцію кон'югації гасять за допомогою фосфатного буфера

ЕДТА. Реакція кон'югації згодом обробляється, як описано в кроці 42.

Крок 42: Фільтрація через фільтр 30 5Р із розміром пор 0,22 мкм:

Кон'югат, отриманий при виконанні кроку 41, фільтрують через фільтр 30 5Р з подальшою фільтрацією 0,22 мкм. Це забезпечує видалення будь-яких великих часточок. Відфільтрований кон'югат обробляють, як описано в кроці 43.

Крок 43: Ультрафільтрація та діафільтрація 300 кД:

Суміш, отриману після реакції кон'югації при виконанні кроку 42, діафільтрують 0,05 95 -ним фізіологічним розчином з використанням мембрани 300 кД ОР ММУУСО. Діафільтрація проводиться для видалення кон'югаційних реагентів і ТТ, що не вступили у реакцію. Отриманий концентрат додатково обробляють, як описано в кроці 44.

Кроки 44 та 45: фільтрація через фільтр із розміром пор 0,22 мкм та зберігання попереднього РЕР:

Концентрат, отриманий при виконанні кроку 43, пропускають через фільтр з розміром пор 0,22 мкм, що слугує етапом очищення. Це також забезпечує контроль рівня біологічного навантаження під час процесу, який виконується в зоні класу С. Відфільтрований попередній кон'югат збирають, відбирають пробу та зберігають при температурі 2 2-87С до подальшої обробки. Подальша обробка попереднього кон'югату описана в кроці 46.

Крок 46: Розведення попереднього кон'югату:

Попередній кон'югат, отриманий при виконанні кроку 45, розводять ВДІ до цільової концентрації 441 мг/мл, якщо потрібно, та додатково обробляються під час кроків осадження, як описано в кроці 47.

Крок 47: Осадження сульфату амонію:

Розведену суміш реакції кон'югації додатково обробляють для видалення вільного РЕР з використанням сульфату амонію (матковий розчин 50 95 мас./об.). Крок осадження виконують при температурі менше 15"С та перемішуванні. При виконанні кроку осадження кон'югат осаджується і в супернатанті залишається вільний РКР. Після додавання сульфату амонію отриману суспензію зберігають при температурі менше 15 "С без перемішування протягом НМН 12 годин.

Крок 48: Збір та розчинення гранул:

Суспензію, отриману при виконанні кроку 47, центрифугують при -«- 7000 г при температурі 2- 8"С протягом 40-10 хвилин. Супернатант відкидається декантацією, а отримана гранула розчиняється в трис-фізіологічному розчині.

Крок 49: Діафільтрація 300 кД:

Розчин, отриманий при виконанні кроку 48, фільтрують через глибинний фільтр 30 5Р і діафільтрують 20 мМ трис-фізіологічним розчином з використанням мембрани ММУУСО 300 кД.

Крок 50: Очищення за допомогою гель-фільтраційної хроматографії:

Розчин, отриманий при виконанні кроку 49, завантажують на колонку гель-фільтраційного хроматографа приблизно 70 Ї, що містить гідроксильований метакриловий гель з гранулами полімеру Тоуореаг! НУУ-б5Е для виконання ексклюзійної хроматографії за розміром.

Використання гель-фільтраційної хроматографіїздля обробленого кон'югату (після обробки сульфатом амонію) знижує рівні вільного РКЕР в отриманому матеріалі. Колонку еюлюють із використанням розчину 20 мМ Тті5 0,9 956 Масі, і збирають фракції на основі Агво. Відповідні фракції, на основі критеріїв прийнятності щодо вільного РЕР, співвідношення та молекулярного розміру, об'єднують. Потім пул додатково обробляють, як описано в кроці 51.

Зо Крок 51: Діафільтрація 300 кд:

Об'єднаний елюат кон'югату, отриманий при виконанні кроку 50, діафільтрують розчином 20 тМ Ттгі5 з використанням мембрани 300 кД ШЕ ММУМСО. Потрібний об'єм концентрату має бути таким, щоб вміст РЕР в ньому становив приблизно 1 мг/мл.

Кроки 52 та 53: Фільтрація 0,22 мкм:

Масу кон'югату, отриману при виконанні кроку 51, фільтрують через фільтр з розміром пор 0,22 мкм в середовищі класу А для забезпечення стерильності. Фільтр з розміром пор 0,22 мкм випробовують на цілісність. Зразок відфільтрованої маси кон'югату надсилають для повного аналізу контролю якості. Відфільтрований кон'югат маркують як "Стерильна маса кон'югату НІБ" і зберігають при температурі 2-8 "С. Маса кон'югату зберігатиметься при температурі 2-87 протягом максимум З місяців, після чого, якщо він не використовується, його можна зберігати при температурі -70 "С протягом до 1 року.

Якісні характеристики отриманого антигену кон'югату Нір РКР-ТТ:

Вміст РЕР (мкг/0,5 мл): 8,1

Співвідношення (РКР:ТТ): 0,5

Вільний РЕР (95): 4,8 Фо

РМУУ (КО): 983

Сер. МВ (КО): 752

Приклад 4:

Метод інактивації цільноклітинного кашлюкового (м'Р) антигену:

Оптимізація методу інактивації виконується після проведення різних експериментів, які включають інактивацію при температурі 56 "С протягом 10 хв у присутності формальдегіду, 56 "С протягом 15хв у присутності формальдегіду, 56 "С протягом 10хв у присутності гиміну, 56 "С протягом 15хв у присутності гиміну і лише нагрівання при 56 "С протягом 30 хв. Значної різниці в специфічній активності за цими методами не спостерігалося. З цих методів вибирають 56 "С протягом 10 хв у присутності формальдегіду, оскільки маса клітин кашлюку, отримана за допомогою цього методу, є більш однорідною порівняно з іншими способами, зазначеними вище.

Процес виробництва інактивованого м/Р-антигену включає наступні етапи: а). Інактивація при температурі 56 "С протягом 10 - 15 хвилин у присутності формальдегіду 60 штамів Вогаєїеїа репиввів 134

БЮ). Інактивація при температурі 56 "С протягом 10 - 15 хвилин у присутності формальдегіду штамів ВогаєїейПа репиз5і5 509 с). Інактивація при температурі 56 "С протягом 10 - 15 хвилин у присутності формальдегіду штамів ВогаєїейПа репиз55і5 25525 та 6229 4). Інактивація при температурі 56 "С протягом 10 - 15 хвилин у присутності формальдегіду штамів ВогаєїейПа репизв5і5 6229 е). Згодом змішують інактивовані штами Вогдебена репиз5з5і5134, 509, 25525 та 6229 у співвідношенні 1:1:0,25:0,25.

І). Необов'язково адсорбують на ад'юванті на основі алюмінію.

В процесі не використовують тімеросал, а інактивований цільноклітинний кашлюковий антиген залишається негрудкуватим та гомогенним, що призводить до зниження реактогенності та покращення специфічної активності протягом більш тривалого часу.

Приклад 5:Процес виробництва інактивованого поліовірусу (ІПВ)

Поліовірус можна культивувати за допомогою таких методів: - Клітинна лінія ССІ 81-МЕКО (нирка мавпи) використовувалася в якості клітини господаря для культивації поліовірусів, тобто штамів сабін та солк. - Після інфікування клітин-господарів бажаним штамом поліовірусу та інкубації протягом 72 годин середовище, що містить вірус та клітинний дебріс об'єднували та збирали в один контейнер. - Фільтрат піддавали тангенціальній потоковій фільтрації за допомогою касети 100Кба; діафільтрували з використанням фосфатного буфера і очищували за допомогою аніонообмінної хроматографії. - До введення пацієнтам віруси повинні бути інактивовані за допомогою відповідних методів інактивації.

Етапи інактивації формаліном: а) очищений пул вірусів піддавали буферному обміну від фосфатного буфера до трис- буфера в діапазоні (від 30 до 50 мМ) з рН від 7 до 7,5, р) до вищевказаної суміші додавали середовище М-199, що містить гліцин (5 г/л) с) додавали 0,025 95 формальдегіду і потім змішували,

Зо Я) потім суміш інкубували при температурі 37 "С протягом 5-13 днів при постійному перемішуванні маси вірусу на магнітній мішалці, е) пост-інкубаційну суміш обробляли на проміжній системі ТЕЕ (100 КДа, 0,1 м") на 7-й день та остаточній фільтрації після інактивації 7) згодом відфільтровану частину зберігали при температурі 2-8 С, 49) ІФА О0-Ад для визначення одиниці О-Аа

Приклад 6:

В цьому прикладі стисло викладено процес виробництва комбінованої вакцинної композиції, що включає 0, Т, Р, НВзЗАЯ, НІВ РЕР-ТТ кон'югат і ІПВ: 1. Процедура формування компоненту І: а). Перенесення фосфату алюмінію в контейнер/посудину

Юр). Додавання дифтерійного анатоксину с). Регулювання рН до 4,5-5,5 за допомогою оцтової кислоти/гідроксиду натрію 4). Вичікування для стабілізації е) Регулювання рН до 5,5-6,5 за допомогою гідроксиду натрію/карбонату натрію

І) Вичікування для стабілізації 2. Процедура формування компоненту ЇЇ: а). Перенесення фосфату алюмінію в контейнер/посудину р). Додавання правцевого анатоксину с). Регулювання рН до 4,5-5,5 за допомогою оцтової кислоти/гідроксиду натрію 4). Вичікування для стабілізації е) Регулювання рН до 5,5-6,5 за допомогою гідроксиду натрію/карбонату натрію

І) Вичікування для стабілізації 3. Процедура формування компоненту ПІ: а). Перенесення фосфату алюмінію в контейнер/посудину р). Додавання поверхневого антигену гепатиту В с). Регулювання рН до 4,5-5,5 за допомогою оцтової кислоти/гідроксиду натрію 4). Вичікування для стабілізації е) Регулювання рН до 5,5-6,5 за допомогою гідроксиду натрію/карбонату натрію

І) Вичікування для стабілізації бо 4. Змішування компоненту І у компоненті ІІ і перемішування при КТ.

5. До вищевказаної суміші додавали інактивований м/Р-антиген з подальшим перемішуванням при КТ. 6. Компонент ІІ додавали до суміші, отриманої при виконанні кроку 5 при КТ 7. Кон'югат НіІБ РЕР додавали до суміші, отриманої при виконанні кроку 6, при температурі 6-16 76. 8. Антиген ІПВ додавали до суміші, отриманої при виконанні кроку 6, при температурі 6- 1676. 9. 2-феноксіетанол додавали до суміші, отриманої при виконанні кроку 7, при температурі 6- 1676. 10. Перевіряють рН, якщо потрібно, доводять рН 6,0 до 7,0 за допомогою гідроксиду натрію/карбонату натрію 11. До суміші, отриманої при виконанні кроку 10, додавали МасСі з подальшим перемішуванням протягом З годин.

Приклад 7:

Дослідження токсичності шестивалентної вакцини

Наступні дослідження токсичності проводили із застосуванням вакцини ЮОТмР-Нерв-ІРМ-НІБ згідно плану дослідження відповідно до Таблиці "у" та рекомендацій ВООЗ щодо доклінічної оцінки вакцин та у відповідності до Принципів ОЕСР щодо належної лабораторної практики. 1. Дослідження токсичності разової дози, яку вводили підшкірно щурам лінії Спрег-Доулі

Всього 20 щурів-самців та 20 самиць у віці 5-6 тижнів на початку обробки були випадковим чином розділені на чотири групи. Кожна група складалася з 5 самців та 5 самиць. Готові плацебо, ад'ювант, однодозову вакцину ОТМУР-НерВ-ІРУ-НІЬ та багатодозову вакцину вводили підшкірно. За щурами спостерігали протягом 14 днів після введення дози. 2. Дослідження токсичності кількох доз, які вводили внутрішньом'язово щурам лінії Спрег-

Доулі

Загалом 100 щурів-самців та 100 самиць були випадковим чином розділені в основну групу та групу відновлення. Готові до використання контроль плацебо, контроль ад'юванту, однодозову вакцину ОТМР-НерВ-ІРУ-НІВ та багатодозову вакцину вводили повільно глибокою внутрішньом'язовою ін'єкцією в дні 1, 29, 57 та 85. Тваринам у групах відновлення нічого не вводили та спостерігали за ними протягом 28 днів.

З. Дослідження токсичності разової дози, яку вводили підшкірно новозеландським білим кроликам

Всього 16 самців та 16 самиць кроликів були випадковим чином розділені на чотири групи.

Готові до використання плацебо, ад'ювант, одноразову вакцину ЮТмР-НерВ-ІРУ-Нір та багатодозову вакцину вводили підшкірно кожній тварині відповідної групи. Кроликам вводили разову підшкірну дозу і спостерігали протягом 15 днів. 4. Дослідження токсичності повторних доз, які вводили внутрішньом'язово новозеландським білим кроликам

Всього 40 самців та 40 самиць кроликів були випадковим чином розділені в основну групу та групу відновлення. Готові до використання контроль плацебо, контроль ад'юванту, та різні дози однодозової та багатодозової вакцини ЮТмР-НерВ-ІРМ-Ніб вводили повільно глибокою внутрішньом'язовою ін'єкцією в дні 1, 29, 57 та 85. Тваринам у групах відновлення нічого не вводили та спостерігали за ними протягом 28 днів.

На підставі результатів було зроблено висновок, що однодозова та багатодозова шестивалентна вакцина Ідифтерія, правець, кашлюк (цільноклітинний), гепатит-В, поліомієліт (інактивований) та кон'югат Наеторпййи5 іпЯсеплає типу Б (адсорбована)| не призводили до будь-яких системних небажаних явищ у щурів лінії Спрег-Доулі та новозеландських білих кроликів, коли їм вводили разову дозу для людини (0,5 мл) підшкірно або внутрішньом'язово в передбачених умовах випробування. Запальні реакції в місці ін'єкції та результати імунологічної відповіді, що спостерігалися у групах, які отримували вакцину, зазвичай є очікуваними та спостерігаються в дослідженнях токсичності при введенні адювантних вакцин на основі алюмінію. Отже, досліджуваний препарат "Вакцина ОТм/Р-НерВв-ІРУ-НІірБ" у найвищій дозі 0,5 мл/тварина (1 людська доза) вважається таким, що "Не викликає спостережуваних небажаних ефектів" (МОАЕЇГ), в умовах випробувань та при застосовуваних дозах.

Приклад 8:

Таблиця 10: У цій таблиці наведено порівняння відсоткової адсорбції окремих антигенів, специфічної активності, вмісту вільного РКР комбінованої вакцини ЗІР та и Еазу 5іх (Рапасеа):

Таблиця 10 пола Комбінована вакцина ЗПРІ. Комбінована вакцина Рапасеа

Еазу-5іх

Адсорбція "0". (95)

Адсорбція "7". (95)

Адсорбція НВзЗАаЯ (95) 95,44 Більше ніж 95,0

Специфічна активність "0" . .

Специфічна активність "ТТ" . . "НВзЗАд

Специфічна активність Іп- 35,490 (34, 210-36,818) 23,167

Міїго (мкг/мл "НВзЗАд

Специфічна активність Іп- 1,07 (0,74-1,57) 0,71 (042-113)

В/Р

Специфічна активність м/Р' . . (МО/Доза) 4,6749 (2,6492-8,2763) 3,2221 (1,8032-5,7706)

НІВ (вільний РЕР) (95) 18,45

Вільний формальдегід (95 мас./об.) 0,0013 0,0011

Вміст 2-феноксіетанолу 271 3,3 (мг/0,5 мл

Загальний вміст алюмінію 02863 0,6034 (мг/0,5 мл) агро Тип-І-39,046 Тип-І-43,504

Ом Тип-п-7,280 Тип-П-8,056 ' Тип Ш-33,058 Тип ПІ-39,840 р - антиген дифтерійного анатоксину

Т - антиген правцевого анатоксину

МР - антиген цільноклітинного кашлюку

НВзАЯ - поверхневий антиген гепатиту В

ІПВ - антиген інактивованого поліовірусу

Адсорбція (95) - відсоткова адсорбція антигену на солі алюмінію (Аз)

Claims (15)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Імуногенна композиція, що включає на 0,5 мл: () дифтерійний анатоксин (0) в діапазоні від 10 до 25 Ії, адсорбований на солі алюмінію, що має відсоткову адсорбцію щонайменше 50 905; (і) анатоксин правця (Т) в діапазоні від 2 до 10 Ії, адсорбований на солі алюмінію, що має відсоткову адсорбцію щонайменше 40 95; (ії) інактивований цільноклітинний кашлюковий антиген (мР), що належить до штамів Вогаеїе/а репиввів 134, 509, 25525 та 6229, у співвідношенні 1:1:0,25:0,25, в діапазоні від 12 до 16 МОО; (ім) поверхневий антиген вірусу гепатиту В (НВзАО) в діапазоні від 7 до 12 мкг, адсорбований на солі алюмінію, що має відсоткову адсорбцію щонайменше 70 905; (м) капсулярний сахарид Наеторнийи5 іпПшеплає типу Б (НІіБ), кон'югований з правцевим анатоксином як білком-носієм з використанням броміду ціаногену як реагенту ціанілування, в діапазоні від 7 до 12 мкг; (м) інактивований антиген вірусу поліомієліту (ІРМ), що включає ІРУ-антиген типу 1 у кількості 1- 50 РІ (д-антигенних одиниць), типу 2 у кількості 1-20 БО або типу З у кількості 1-50 ВИ, відповідно;

(мі) фосфат алюмінію як ад'ювант з вмістом фосфату алюмінію (АїЗ») в діапазоні від 0,1 до 0,5 МГ; (мії) 2-феноксієтанол як консервант в діапазоні від 1 до З мг; і (їх) хлорид натрію (Масі) як середовище для розведення або буферний розчин у кількості від 0,5 до 1,5 95, при цьому імуногенна композиція - це повністю рідка комбінована вакцина.

2. Імуногенна композиція за п. 1, в якій антигенами ІРМ є штами заїК, вибрані з групи Мапопеу типу 1, МЕЕ типу 2, ЗашиКей типу З або штами 5абіп, вибрані із групи, що містить тип 1, тип 2 та тип 3.

З. Імуногенна композиція за оп. 1, в якій антиген Ніб являє собою полісахарид полірибозилрибітол фосфату (РКР), кон'югований з білком-носієм, використовуючи хімію кон'югації ціанілування або хімію кон'югації відновного амінування, де реагент ціанілування вибраний із броміду ціаногену, 1-ціано-4--диметиламінопіридину тетрафтороборату (СОАР), 1- ціано-4-піролідинопиридину тетрафторборату (СРРТ), 1-ціаноїмідазолу, а саме (1-СЇ), 1- ціанобензотриазолу (1-СВТ) або 2-ціанопіридазин-3(2Н)ону (2-СРО); а білок-носій вибраний із групи, що включає СЕМ197, анатоксин дифтерії, зовнішній мембранний комплекс Меїі5зегіа тепіпойіаї5, фрагмент С анатоксину правця.

4. Імуногенна композиція за п. 1, в якій інактивований цільноклітинний кашлюковий антиген, антиген НІ та інактивований антиген вірусу поліомієліту не адсорбовані на жодному ад'юванті.

5. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1-4, яка містить дифтерійний анатоксин (0)-антиген у кількості від 10 до 25 І Гна 0,5 мл; анатоксин правця (Т)-антиген у кількості від 2 до 10 Гна 0,5 мл; мР-антиген у кількості від 12 до 16 МОО на 0,5 мл; НВзЗАд у кількості від 7 до 15 мкг на 0,5 мл; Ніб-антиген у кількості від 7 до 13 мкг на 0,5 мл; ІРМ-антиген заїК типу 1 у кількості 1-50 БИ, заїК типу 2 у кількості 1-20 БІ або заїК типу З у кількості 1-50 БИ, відповідно, на 0,5 мл; фосфат алюмінію у кількості від 0,1 до 2,5 мг на 0,5 мл; 2-феноксіеєетанол у кількості від 1 до 6 мг на 0,5 мл; хлорид натрію у кількості від 0,5 до 1,5 95.

6. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1-5, яка містить дифтерійний анатоксин (0)-антиген у кількості від 10 до 25 І Гна 0,5 мл; анатоксин правця (Т)-антиген у кількості від 2 до 10 Гна 0,5 мл; мР-антиген у кількості від 12 до 16 МОО на 0,5 мл; НВзЗАд у кількості від 7 до 15 мкг на 0,5 мл; Нір-антиген у кількості від 7 до 13 мкг на 0,5 мл; ІРМ-антиген Забіп типу 1 у кількості 1-50 ри, Забіп типу 2 у кількості 1-20 ВШ або Забіп типу З у кількості 1-50 БИ, відповідно, на 0,5 мл; фосфат алюмінію у кількості від до 2,5 мг на 0,5 мл; 2-феноксіетанол у кількості від 1 до 6 мг на 0,5 мл; хлорид натрію у кількості від 0,5 до 1,5 905.

7. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1-6, яка містить дифтерійний анатоксин (0)-антиген у кількості 10 І ГГ на 0,5 мл; анатоксин правця (Т)-антиген у кількості від 2 І Гна 0,5 мл; мР-антиген в кількості 12 МОО на 0,5 мл; НВ5АОЯ у кількості 8 мкг на 0,5 мл; Ніб-антиген у кількості 8 мкг на 0,5 мл; ІРУ-антиген заїК типу 1 у кількості 40 БИ, 5аїК типу 2 у кількості 8 БІ або заїК типу З у кількості 32 БИ, відповідно, на 0,5 мл; фосфат алюмінію у кількості 1,25 мг на 0,5 мл; 2- феноксієтанол у кількості 2,5 мг на 0,5 мл; хлорид натрію у кількості 0,9 905.

8. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1-7, яка містить дифтерійний анатоксин (0)-антиген у кількості 20 Ії на 0,5 мл; анатоксин правця (Т)-антиген у кількості 4 Ії на 0,5 мл; мР-антиген у кількості 14 МОО на 0,5 мл; НВзЗАд у кількості 15 мкг на 0,5 мл; Нір-антиген у кількості 10 мкг на 0,5 мл; ІРУ-антиген заїК типу 1 у кількості 40 БИ, 5аїК типу 2 у кількості 8 Б або заїК типу З у кількості 32 БИ, відповідно, на 0,5 мл; фосфат алюмінію у кількості 1,25 мг на 0,5 мл; 2- феноксієтанол у кількості 2,5 мг на 0,5 мл; хлорид натрію у кількості 0,9 905.

9. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1-8, яка містить дифтерійний анатоксин (0)-антиген у кількості 25 І ГГ на 0,5 мл; анатоксин правця (Т)-антиген у кількості 10 І Є на 0,5 мл; мР-антиген у кількості 16 МОО на 0,5 мл; НВзЗАд у кількості 15 мкг на 0,5 мл; Нір-антиген у кількості 13 мкг на 0,5 мл; ІРМ-антиген заїК типу 1 у кількості 40 Бу, заїК типу 2 у кількості 8 ШО або заїК типу З у кількості 32 БО відповідно на 0,5 мл; фосфат алюмінію у кількості 1,25 мг на 0,5 мл; 2- феноксієтанол у кількості 2,5 мг на 0,5 мл; хлорид натрію у кількості 0,9 905.

10. Спосіб виготовлення повністю рідкої імуногенної комбінованої композиції вакцини, яка включає на 0,5 мл: () дифтерійний анатоксин (0) в діапазоні від 10 до 25 Ії, адсорбований на солі алюмінію, що має відсоткову адсорбцію щонайменше 50 905; (ї) анатоксин правця (Т) в діапазоні від 2 до 10 Ії, адсорбований на солі алюмінію, що має відсоткову адсорбцію щонайменше 40 905; (ії) інактивований цільноклітинний кашлюковий антиген (мР), що належить до штамів Вогаеїе/а репиввів 134, 509, 25525 та 6229, у співвідношенні 1:1:0,25:0,25, в діапазоні від 12 до 16 МОО; (ім) поверхневий антиген вірусу гепатиту В (НВзЗАОЗ), в діапазоні від 7 до 12 мкг, адсорбований на бо солі алюмінію, що має відсоткову адсорбцію щонайменше 70 95;

(м) капсулярний сахарид Наеторнийи5 іпПшеплає типу Б (НІіБ), кон'югований з правцевим анатоксином як білком-носієм з використанням броміду ціаногену як реагентом ціанілування, в діапазоні від 7 до 12 мкг; (м) інактивований антиген вірусу поліомієліту (ІРМ), що включає ІРУ-антиген типу 1 у кількості 1- 50 РІ (д-антигенних одиниць), типу 2 у кількості 1-20 БО або типу З у кількості 1-50 ВИ, відповідно; (мі) фосфат алюмінію як ад'ювант з вмістом фосфату алюмінію (А1І»») в діапазоні від 0,1 до 0,5 МГ; (мії) 2-феноксієтанол як консервант в діапазоні від 1 до З мг; і (їх) хлорид натрію (МасіЇ) як середовище для розведення або буферного розчину, у кількості від 0,5 до 1,595, що включає етапи: а) додавання в посудину або контейнер для змішування звичайного фізіологічного розчину; р) додавання в посудину або контейнер для змішування компонента І, що містить дифтерійний анатоксин; с) додавання компонента ІЇ, що містить анатоксин правця, до компонента І з етапу (Б), при перемішуванні при кімнатній температурі; а) додавання інактивованого цільноклітинного антигену кашлюку до суміші, отриманої на етапі (с), при перемішуванні при кімнатній температурі; е) додавання компонента І, що містить поверхневий антиген гепатиту В, до суміші, отриманої на етапі (4), при кімнатній температурі; І) додавання Нібр-антигену до суміші, отриманої на етапі (є), при 6-16 С; 9) додавання ІРУ-антигену до суміші, отриманої на етапі (Її), при 6-16 "С; І) додавання 2-феноксіетанолу до суміші, отриманої на етапі (9), при 6-167С; ї) регулювання рН від 6,0 до 7,0 за допомогою гідроксиду натрію/карбонату натрію, і ) додавання при перемішуванні звичайного фізіологічного розчину для доведення об'єму до мітки.

11. Спосіб за п. 10, в якому підготовка компонента І включає такі етапи: а) перенесення фосфату алюмінію в посудину або контейнер для змішування; Юр) додавання дифтерійного анатоксину; с) регулювання рН до 4,5-5,5 за допомогою оцтової кислоти або гідроксиду натрію; а) стабілізація; е) регулювання рн до 5,5-6,5 за допомогою гідроксиду натрію або карбонату натрію, і 7) стабілізація.

12. Спосіб за п. 10, в якому підготовка компонента ЇЇ включає такі етапи: а) перенесення фосфату алюмінію в посудину або контейнер для змішування; Юр) додавання правцевого анатоксину; с) регулювання рН до 4,5-5,5 за допомогою оцтової кислоти або гідроксиду натрію; а) стабілізація; е) регулювання рН до 5,5-6,5 за допомогою гідроксиду натрію або карбонату натрію і 7) стабілізація.

13. Спосіб за п. 10, в якому підготовка компонента ІЇЇ включає такі етапи: а) перенесення фосфату алюмінію в посудину або контейнер для змішування; Юр) додавання поверхневого антигену гепатиту В; с) регулювання рН до 4,5-5,5 за допомогою оцтової кислоти або гідроксиду натрію; а) стабілізація; е) регулювання рН від 5,8 до 6,8 за допомогою гідроксиду натрію або карбонату натрію, і 7) стабілізація.

14. Спосіб за п. 10, в якому підготовка інактивованого цільноклітинного антигену кашлюку включає такі етапи: а) інактивація при температурі 56 "С протягом 10-15 хвилин у присутності формальдегіду штамів Вогаєїе/а репиввів 134; БЮ) інактивація при температурі 56 "С протягом 10-15 хвилин у присутності формальдегіду штамів Вогаєїе/а репиввів 509; с) інактивація при температурі 56 "С протягом 10-15 хвилин у присутності формальдегіду штамів Вогаеєїе/а репиввів 25525 та 6229; Я) інактивація при температурі 56 "С протягом 10-15 хвилин у присутності формальдегіду штамів Вогаеїе/а репиввів 6229; е) наступне змішування інактивованих штамів ВогаеїелЛа репиввзів 134, 509, 25525 та 6229, 60 отриманих на етапах (а), (Б), (с) і (4), у співвідношенні 1:1:0,25:0,25, відповідно;

У адсорбування на ад'юванті на основі алюмінію, при цьому в процесі не використовують тимеросал, а інактивований цільноклітинний кашлюковий антиген залишається негрудкуватим та гомогенним, що приводить до зниження реактогенності та покращення специфічної активності протягом більш тривалого часу.

15. Спосіб за п. 10, в якому підготовка Ніб-антигену включає такі етапи: а) ферментація Наеторпйиз іпіцепгає типу Б; р) інактивація Наеторпйих іпПшепгає типу Б, отриманого на етапі (а), при температурі 37 "С протягом 2 годин у присутності 0,1 96 формальдегіду; с) очищення полісахариду полірибозилрибітолфосфату (РЕР) НІ, отриманого на етапі (Б); а) кон'югація очищеного продукту етапу (с) до анатоксину правця (ТТ) з використанням хімії кон'югації ціанілування бромистого ціаногену в присутності лінкера дигідразиду адипінової кислоти (АОН); е) очищення кон'югату з етапу (4); І) фільтрація очищеного кон'югату з етапу (є) переважно через фільтр з розміром пор 0,22 мкм, причому процентний вміст вільного РЕР становить не більше 5 95 у загальній кількості очищеного кон'югату НІіб.