UA128952C2 - Фармацевтична композиція, яка включає поверхневі і нуклеокапсидні антигени вірусу гепатиту в - Google Patents

Abstract

Винахід стосується фармацевтичної композиції, яка містить ядерний антиген вірусу гепатиту В (HBcAg) і поверхневий антиген вірусу гепатиту В (HBsAg), причому ядерний антиген вірусу гепатиту В (HBcAg) включає матричну рибонуклеїнову кислоту (мРНК) у відсотковій частці 45,0-67,1 % від загальної кількості рибонуклеїнової кислоти (РНК) цього антигену, і поверхневий антиген вірусу гепатиту В (HBsAg) включає фосфатидилсерин у відсотковій частці 5,0-8,2 % від загальної кількості фосфоліпідів цього антигену. Винахід також стосується застосування цієї фармацевтичної композиції в одержанні лікарського засобу для імунопрофілактики або імунотерапії проти інфекції, викликаної вірусом гепатиту В.

Description

Винахід стосується фармацевтичної композиції, яка містить ядерний антиген вірусу гепатиту В (НВсАЗд) і поверхневий антиген вірусу гепатиту В (НВзАЯ), причому ядерний антиген вірусу гепатиту В (НВсАд) включає матричну рибонуклеїнову кислоту (МРНК) у відсотковій частці 45,0- 67,1 95 від загальної кількості рибонуклеїнової кислоти (РНК) цього антигену, і поверхневий антиген вірусу гепатиту В (НВ5Ад) включає фосфатидилсерин у відсотковій частці 5,0-8,2 9о від загальної кількості фосфоліпідів цього антигену. Винахід також стосується застосування цієї фармацевтичної композиції в одержанні лікарського засобу для імунопрофілактики або імунотерапії проти інфекції, викликаної вірусом гепатиту В. ке

М г їх. ка : маг й» Як оч ур, - а я '

В. ж я МЕ був сю КО " мех ще г М зач сли хухчжиии ікхкося ек» а їх

ЇВ ссср сосок фор нн кн 3 я З Я 5 5 7

Супи

Фіг.

Даний винахід належить до галузі медицини, зокрема, до галузі вакцинології, зокрема, до розробки вакцинних композицій з підвищеною ефективністю. Ці композиції включають антигени вірусу гепатиту В (ВГВ), які мають модифікації у своєму хімічному складі, що неочікувано підвищило їх імуногенність. Антигенами ВГВ, які модифікували за їх хімічним складом, були поверхневий антиген (НВзАО) і ядерний антиген (НВсАа).

Рівень техніки

Згідно із даними Всесвітньої організації охорони здоров'я (ВООЗ), близько третини населення світу інфіковано вірусом гепатиту В, що основується на присутності серологічних маркерів інфекції. За оцінками приблизно в 5-10 95 дорослих і до 90 95 немовлят, інфікованих

ВГВ, розвивається хронічний гепатит В (НВС). На даний час 350 мільйонів людей мають персистентну або хронічну інфекцію. Стійка реплікація вірусу протягом тривалого часу призводить до запального процесу в печінці, що призводить до загибелі 25 95 інфікованої популяції внаслідок цирозу, гепатоцелюлярної карциноми або інших ускладнень, таких як асцит, кровотечі зі стравоходу і спленомегалія. Незважаючи на загальну вакцинацію немовлят і дітей в останні роки і на наступне зниження числа нових випадків зараження НВС, НВС, як і раніше, є серйозною проблемою охорони здоров'я в усьому світі (НІШетап, М. В. Вакцина (2001), 19, 1837-

АВІ.

Лікування інтерфероном-альфа (ІЕМ-с), його пегільованим варіантом (ПЕГ-ІЕМ), а також нуклеотидними і нуклеозидними аналогами, такими як тенофовір, ентекавір, ламівудин, адефовір дипівоксил і тельбівудин, являє собою сучасний стандарт лікування ХГВ. У цілому ці лікарські засоби мають низьку ефективність щодо стійкої елімінації ВГВ після лікування, при цьому їх застосування пов'язане із серйозними несприятливими явищами (АЮ), що широко відомо (Мазі К. Адм ТНег (2009), 26: 155-169; Мапа М, Нерайо! Іпі. 2015 бер 12. (електронна публікація до виходу до друку| РибМеа РМІЮ: 26363922.

Використання вакцинних композицій як імунотерапевтичної стратегії при лікуванні ХГВ являє собою цікавий підхід. Вірусну персистенцію пов'язували з порушенням розвитку клітинного імунітету проти ВГВ. З початку 1980-х років стратегії вакцинації були спрямовані на збільшення і посилення слабкої відповіді Т-клітин у хворих ХГВ. У таких імунотерапевтичних стратегіях спочатку застосовували комерційні вакцини проти ВГВ із метою індукції специфічних СО4ч і

СОр8 відповідей проти ВГВ, а також прозапальних цитокінів для контролю реплікації вірусу.

Таким чином, майже всі комерційні профілактичні вакцини досліджували окремо або в комбінації із традиційними противірусними терапіями. У попередніх дослідженнях терапевтичної вакцинації вакцини застосовували з іншими противірусними терапіями або без них. Крім того, імунотерапія із застосуванням комерційних вакцин також надала схеми з великими кількостями щеплень, при цьому досліджували альтернативні парентеральні шляхи. Основні дослідження коротко описані нижче.

Експериментальне дослідження вакцинації у хворих ХГВ із застосуванням Сеппемас ВУ (Амепіїз Рабвієциї, Егтапсе, отримана в клітинах ссавців -СНО) продемонструвало зниження реплікації ВГВ у приблизно 50 95 хронічних носіїв |Рої! 5, єї аІ. С В Асай 5сі ПШ (1993), 316: 688- 91). В іншому багато центровому плацебоконтрольованому дослідженні також проводили оцінку вакцини Сеппемас ВУ, вакцини НКесотбімах? (Мегок Зпагр бопте-Спібгеї, Егапсе, отриманої в дріжджах). При цьому значиму відмінність спостерігали в шостий місяць (З 95, 20 о і 22 905) між групами, що одержували Сеппемас? і Весотрбімах?", відповідно. Однак до 12 місяця відмінність зникла ІРої 5, / Нерай! (2001); 34: 917-211). У результаті дійшли висновку, що явна позитивна дія була відсутня, і антиген рге-52, присутній у вакцині Сеппемас?, очевидно, не виявляв якого- небудь додаткового ефекту.

Інші дослідження, у яких оцінювали терапевтичну вакцину Сеппемас?, ГМАЇ СІМ К, еї а).

Іптесійоп (2003), 31: 221-225; Рікісі В, еї а. У Сазоепіегої! Нераїйо! (2003), 18 (2): 218-221) показав лише невелику ефективність, пов'язану з лікуванням.

Нерадепе? (Медема Ца., ОК), отримана в СНО вакцина, включає три варіанти НВзАЯ (І, 5 і

М), ї їх результати на здорових добровольцях і нереспондерах продемонстрували високий рівень імуногенності |Раде М, еї аї. Іпітегмігоїоду (2001), 44: 88-97; Мар І, еї ам. Апп Асаа Мей зЗіпаароге (1996), 25: 120-122; 7исКептап УМ, єї аі. ВМУ (1997), 314: 329; допез СО, еї а). Массіпе (1999), 17(20-21): 2528-37|Ї. Беручи це до уваги, проводили дослідження для оцінки його терапевтичного потенціалу. Вісім доз по 20 мкг вакцини вводили у двох курсах з 4 щеплень, з 5- місячним інтервалом між ними |Саптап МУЕ, еї а). У Нератю! (2001); 34: 917-921). Наприкінці схеми, 8 з 22 пацієнтів, які пройшли схему, мали тривалу відсутність вірусу гепатиту В, а в 7 пацієнтів був усунутий НВеАд. Це неконтрольоване обмежене дослідження супроводжувалося контрольованим дослідженням з більшою кількістю пацієнтів. У цьому другому клінічному 60 дослідженні, що включало 103 хронічних хворих, які були НВеАд позитивними, чотири дози вакцини або плацебо вводили з інтервалами в один і 8 місяців, а потім усі пацієнти одержували 8 додаткових доз із одномісячними інтервалами. Наприкінці лікування не було отримано ніяких значимих позитивних клінічних результатів ІМедема РІС пЕрулимли. іпмезівдаїте.со.иК/апісіє. азрх"іа-2000011715321690930 (консультації 20 жовтня 2015 року)).

Щоб сприяти розвитку противірусної імунної відповіді, використовували методи лікування, що поєднують у собі терапевтичну вакцинацію зі стандартними противірусними терапіями. Така стратегія враховує результат, пов'язаний з дією ламівудину, який збільшує вміст специфічних

ВГВ Т-клітин у периферичній крові в результаті інгібування реплікації вірусу |Вепоїені А еї аї.

Ехреп Рем Сазігоепієгої! Нераїйо! (2009), З (5): 561-9)

Комбінована стратегія противірусної вакцинації повинна сприяти більшій реактивності Т- клітинної відповіді проти ВГВ, але повинна вважатися більш безпечною, оскільки вона повинна виключати ураження печінки внаслідок активації імунної системи. Однак немає ніяких підтверджень того, що активація специфічної імунної відповіді вакциною у хворих ХГВ може викликати фульмінантний гепатит.

У дослідженні, опублікованому в 2002 році, оцінювали внутрішньошкірне введення (в/ш) вакцини Енджерікс ВУ (СпіахобтійнКіпе) з ламівудином (Оаптеп А, єї аї. У Меа Мігої 2002; 66: 452-60| у хворих ХГВ. Шість доз Енджерікс ВУ вводили один раз на місяць у комбінації із щоденним введенням ламівудину. Додаткова група одержувала таке ж лікування в комбінації із щоденним підшкірним (п/ш) введенням інтерлейкіна-2 (ІІ -2). Після завершення терапії, в 7 з 9 пацієнтів у першій групі та в 2 з 5 пацієнтів у другій групі вірусне навантаження зменшилося до рівнів, що не піддаються визначенню. У чотирьох респондерів вірус був усунутий, і нормалізувалися рівні трансаміназ. В іншому клінічному дослідженні комбінацію терапевтичної вакцинації в/ш шляхом оцінювали при використанні вакцини, що містить НВ5ЗАд в алюмокалієвих галунах, із щоденним введенням ламівудину протягом одного року |Ногіїке М, еї а. У Сіїп Мігої! (2005), 32: 156-161). Ці дослідження показали, що комбінована терапія ефективна і має мало ускладнень у хворих ХГВ. Однак в обох випадках використовували в/ш шлях, який може сприяти імуногенності вакцини.

Той же поверхневий антиген, включений в активний ад'ювант, неефективний при комбінованій терапії ламівудином, що вказує на те, що вплив шляху імунізації не слід ігнорувати, і що це, можливо, вирішальний фактор, що визначає майбутнє вакцинації.

Дослідження, яке завершило тривалий період клінічної оцінки кандидатних вакцин для придушення вірусного навантаження, презентовано у звіті Мапаерареїїєте із співавт.

ІМапаерареїеге Р, еї аІ. Массіпе (2007) Оес 12; 25(51): 8585-97). У цьому дослідженні проводили клінічну оцінку кандидатної вакцини на основі композиції адсорбованого НВ5ЗАд, що вводиться внутрішнм'язовим (в/м) шляхом у дозі 100 г НВ5зАд, у комбінації з олійним ад'ювантом і потужними імуномодуляторами, такими як монофосфорилліпід А і сапонін 0521. Десять введень в умовах зниженого вірусного навантаження не продемонстрували ніяких переваг щодо вірусологічної відповіді, у порівнянні з контрольною групою, яка одержувала тільки противірусний препарат.

Накопичені знання про характеристики імунної відповіді хазяїна і про терапевтичне застосування звичайних вакцин показують, що стратегії, спрямовані на індукцію сильної і довгочасної реактивності Т-клітин проти антигенів ВГВ, можливі і дають надію на успішне лікування хворих ХГВ.

Відсутність імунної стимуляції проти нуклеокапсидних антигенів, імовірно, є основним імунологічним маркером неефективності терапевтичної вакцинації на основі НВ5Ад. Фактично, мета терапевтичної вакцинації при ХГВ полягає в активації тих же природних імунних механізмів, які переважають під час гострого гепатиту В і які є самоконтрольованими, або при

ХГВ, який піддається сероконверсії. Якщо імунотерапія не стимулює такі імунні відповіді, вона, імовірно, не зможе викликати сероконверсію.

Поліпшення композицій з погляду стратегії антигенної селекції і вакцинації може стати способом подолання таких труднощів. Характеристики білків оболонки виправдовують їх включення в терапевтичну вакцину. Фактично, білки оболонки містять численні епітопи В і Т- клітин (Реппа А, еї аї. У Мігої! (1992), 66(2): 1193-6; Мауегзіпа Н, еї аї. У Іттипої! (1993), 150: 4659- 711, і передбачається, що антитіла проти білків оболонки відіграють важливу роль у придушенні вірусу, усуваючи вільні вірусні частинки із кровотоку і запобігаючи повторному інфікуванню сприйнятливих клітин. З іншого боку, високі рівні НВ5зАд циркулюють у сироватці хворих ХГВ, цей факт може відігравати головну роль у підтримці імунної толерантності, у результаті виснаження Т-клітин і придушення продукування антитіл проти НВз |Мадага)и К, еї аї. У Міка! 60 Нераї (1997), 4: 221-30).

У цьому напрямку НВсАд був запропонований як основний кандидатний антиген для включення в терапевтичну вакцину для ХГВ. Під час гострого самозавершуваного гепатиту епітопна відповідь Т-клітин переважна і переважує в ході сероконверсії при спонтанному або викликаному лікуванням ХГВ (Реїтаїгі С, еї аї. У Сіїп Іпмезі (1991), 88: 214-22; Магіпоз С, еї аї.

Нераїйоіоаду (1995), 22: 1040-9; Тваї 51, еї аї. Сіїп Іпмеві (1992), 89: 87-96).

Дотепер жодна з комерційних вакцин проти гепатиту В не продемонструвала достатні клінічні результати, які дозволять їм конкурувати з існуючими методами лікування або просто викличуть схвалення їх впровадження в медичну практику. Проте, ці вакцини дали великі надії у галузі лікування, не тільки щодо імунотерапії проти гепатиту В, але також і для інших патологій, таких як інфекція, викликана вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ), і рак, серед інших хронічних захворювань, що передаються або не передаються. Таким чином, ця стратегія вимагає клінічної оцінки нових концепцій вакцин і оптимізації всіх пов'язаних факторів. У зв'язку із цим кандидатна терапевтична вакцина, що включає НВсАд, крім НВзАд, є результатом розробки таких стратегій імунотерапії.

Центр генної інженерії і біотехнології Куби (СІВ) робить НВзАад у вигляді рекомбінантного білка, одержуваного в дріжджах Рісніа разіог із як хазяїна. Цей антиген був включений у профілактичну вакцину Нерегбріомас НВУ з початку 1990-х років |Милгіо М, еї а!. Віоїеспоїодіа

Аріісада (2001) 18; 103-104; цІ-Над М, єї аІ. Массіпе (2003) 21: 3179-85).

Крім того, в СІВ розробили композицію, яка забезпечує тривалу імунну відповідь проти гепатиту В, зазначена композиція включає як основні компоненти НВ5ЗАд і НВсАд, антигени вводять через слизову оболонку з розвитком системної і мукозальної відповіді |вропейський патент ЕР 1136077Ї. В іншому патентному документі центру СіСВ описана генерація агрегованих антигенних структур, що утворюють частинки. У цьому документі показано, що агрегація, деліпідизація або окиснення, а також відбір частинок 30-500 нм і включення таких агрегатів у підходящий аювант, сприяє імуногенності отриманого антигенного препарату

ІЄвропейський патент ЕР 1346727|. Об'єднавши стратегії, запропоновані в обох патентних документах, в СІВ розробили кандидатну терапевтичну вакцину за назвою МАБМАС (І обаіна

У, еї аІ. Мої Іттипої (2015), 63: 320-327)Ї, яку вводять із застосуванням комбінації шляхів імунізації. Клінічні результати вакцинації вкрай перспективні, однак ефективність продукту необхідно підвищити із застосуванням більш сильних імуногенів.

Стратегії вакцинації, які включають основні антигени ВГВ, такі як НВ5ЗАаЯ їі НВсАЗд, призвели до появи композицій, що володіють деякою противірусною ефективністю. Однак їх поліпшення необхідне для збільшення числа пацієнтів із тривалою противірусною відповіддю, а також числа пацієнтів, у яких спостерігається сероконверсія НВ5ЗАд в анти - НВ5АаЯ.

Опис винаходу

Винахід допомагає розв'язати вищевказану проблему шляхом розробки фармацевтичної композиції, яка характеризується: 1) антигеном НВсАд, який включає матричну рибонуклеїнову кислоту (МРНК) у процентній частці більше 45 95 від загальної кількості рибонуклеїнової кислоти (РНК) зазначеного антигену, і 2) антигеном НВ5ЗАд НВУ. У варіанті здійснення винаходу фармацевтична композиція містить НВ5зАд, що містить фосфатидилсерин у процентній частці більше 5 95 від загальної кількості фосфоліпідів, що формують зазначений антиген.

Включення антигенів НВзАа і НВсАд, які були модифіковані за своїм хімічним складом таким визначеним способом, сприяє імунологічним і противірусним властивостям цієї композиції для імунотерапії. Однак вищевказані модифікації не впливають на білковий склад антигенів НВзАд і

НВсАд винаходу, тому що їх первинна, вторинна і третинна структури залишаються ідентичними в порівнянні з їх не модифікованими варіантами. Проте, такі модифікації призводять до несподіваних властивостей цих антигенів, що дає більш сильні імуногени. Крім того, комбінація таких модифікованих антигенів призводить до одержання композиції з більш високою терапевтичною противірусною ефективністю для лікування ХГВ.

У винаході НВсАд був отриманий із мРНК на рівні більше 45 95. У конкретному випадку цей модифікований антиген був отриманий завдяки комбінації змін параметрів його процесу ферментації. У цьому випадку застосування хімічно визначеного середовища і низької питомої швидкості росту забезпечує одержання варіанта НВсАд, де частка мРНК збільшена в порівнянні з іншою РНК, що є присутньою у ньому.

Хоча була описана висока імуногенність НВсАд, отриманого в ЕзсНегісніа сої, як і участь компонента нуклеїнових кислот в імуногенності повнорозмірних антигенів (183 амінокислот) у формі частинок, до даного винаходу відносний ефект кожного варіанта РНК був невідомий щодо їх певного внеску в кінцеву імуногенність НВсАд. Неочікувано було виявлено, що НВсАд з рівнем мРНК вище 45 95 був більш імуногенним і викликав розвиток більш сильної відповіді ТН1 60 у порівнянні з не модифікованим НВсдАд.

Зміни процентної частки виявленої МРНК не впливали на вміст сумарної РНК, що є присутньою у частинці, щодо вмісту білка. Неочікувано було виявлено, що НВсАд, що містить більше 45 95 мРНК у сумарній РНК, мав більш високу імуногенність в порівнянні з НВсАд, отриманим без якої-небудь зміни вмісту МРНК. Таке збільшення імуногенності включало значне збільшення цитокінів Тй71 і підвищену здатність до усунення циркулюючого НВ5ЗАд після імунізації трансгенних мишей і пацієнтів із ХГВ.

З іншого боку, у даному винаході оцінювали НВ5ЗАЗд, який містить фосфатидилсерин на рівні більше 5 95 від загальної кількості фосфоліпідів, що є присутніми у цьому ліпопротеїновому антигені. Зокрема, збільшення процентної частки фосфатидилсерину більш ніж до 5 95 від загальної кількості фосфоліпідів було продемонстровано щодо зміни таких параметрів, як збільшення концентрацій кальцію і магнію в середовищі ферментації, низькою питомою швидкості росту і низького рН. Однак винахід не був обмежений НВ5ЗАд, отриманим за таких умов. Збільшення процентної частки фосфатидилсерину більш ніж до 595 зв'язували зі збільшенням імуногенності отриманого в результаті антигену при порівнянні його з НВзАЯ з більш низьким вмістом цього фосфоліпіду. Спостерігали значне підвищення цитокінів ТА, а також більш високу здатність усунення циркулюючого НВ5ЗАЗ після імунізації НВ5зАд трансгенних мишей і хворих ХГВ при використанні НВ5ЗАд, що містить більше 5 95 фосфатидилсерину щодо загального 95 фосфоліпідів.

У даному винаході особливим чином модифіковані антигени НВзАа і НВсАд були вибрані на основі більш високої інтенсивності імунної і противірусної відповіді в порівнянні з композиціями, у яких використовувалися не модифіковані антигени. Крім того, композиція, що містить обидва антигени, могла викликати сероконверсію НВ5зАд в анти - НВ5ЗАд у більшого числа пацієнтів у порівнянні з антигенами, які вводили окремо, що демонструє важливість і функціональність модифікацій, виявлених в антигенах, що є частиною композиції даного винаходу, а також перевагу комбінованих композицій у порівнянні з окремими антигенами.

У даному винаході запропоноване нове рішення проблеми, що існує в рівні техніки, пов'язаної з необхідністю нових композицій, які дозволяють підсилити імунну відповідь проти

НВзАд і проти НВсАд, для створення більш ефективних способів лікування для контролю хронічної інфекції, викликаної ВГВ. Об'єкт даного винаходу не може вважатися очевидним або отриманим з рівня техніки фахівцями, оскільки він є результатом ідентифікації нових характеристик описаних антигенів. Хоча такі модифіковані антигени зберігають свій білковий склад, вони різняться за хімічним складом молекул, пов'язаних з ними.

Таким чином, у рамках винаходу модифікований НВсАд є препаратом з НВсАЯд, який включає мРНК у процентній частці більше 45 95 від сумарної РНК даного антигену. У той же час, модифікований НВ5Ад є препаратом НВ5ЗАд, який містить фосфатидилсерин у процентній частці більше 5 95 від загальної кількості фосфоліпідів даного антигену.

В одному варіанті здійснення винаходу композиція, що містить антиген НВсАд із мРНК у процентній частці більше 4595 від сумарної РНК даного антигену і антиген НВзАаЯ ВГВ, відрізняється тим, що вона виготовлена для введення парентеральним і мукозальним шляхами.

Для введення композиції згідно з винаходом мукозальним шляхом, і зокрема, назальним шляхом можуть застосовуватися пристрої, які були розроблені і/або випущені в продаж для введення фармацевтичних композицій таким шляхом.

У конкретному варіанті здійснення зазначена композиція додатково відрізняється тим, що вона містить вакцинний ад'ювант. Серед вакцинних ад'ювантів, які можуть бути присутніми у композиції згідно із винаходом, були виявлені, наприклад, такі, які добре відомі фахівцям у цій галузі, такі як солі алюмінію, емульсії "вода в олії", розроблені для медичного застосування, стимулятори імунної системи тощо.

Крім того, винахід належить до застосування антигену НВсАЯ, який включає мРНК у процентній частці більше 4595 від сумарної РНК даного антигену, і антигену НВ5зАд для виробництва лікарського засобу для імунопрофілактики або імунотерапії проти інфекції, викликаної ВГВ. В одному варіанті здійснення винаходу НВ5ЗАд, що входить до складу зазначеного лікарського засобу, містить фосфатидилсерин у процентній частці більше 5 95 від загальної кількості фосфоліпідів даного антигену. У конкретному варіанті здійснення зазначений лікарський засіб виготовлений для введення парентеральним і мукозальним шляхом. У переважному варіанті здійснення лікарський засіб, з НВсАд, що містить мРНК у процентній частці більше 45 95 від сумарної РНК даного антигену, і антигеном НВ5ЗАЗд, застосовують для лікування хворих ХГВ або хворих з коінфекціями, де одним з вірусів, що інфікують, є ВГВ. Крім того, при лікуванні хворих ХГВ зазначеним лікарським засобом застосування спрямоване на запобігання гепатоцелюлярного раку, що виник у результаті інфекції, викликаної ВГВ.

У випадку, коли лікарський засіб, що містить НВсАд із процентною часткою мРНК більше 45 95 від сумарної РНК даного антигену і антиген НВ5ЗАд, застосовується для лікування хворих

ХГВ шляхом імунотерапії, її можна проводити активним способом (шляхом імунізації пацієнтів цим лікарським засобом) або в пасивній формі, шляхом клітинної стимуляції. Завдяки своїм компонентам фармацевтична композиція за винаходом може застосовуватися для стимуляції аутологічних або гетерологічних клітин. Таким чином, у винаході запропонований спосіб клітинної стимуляції із застосуванням зазначеної композиції і наступної пасивної імунізації хворих ХГВ на основі максимальної стимуляції, іп мімо або іп міто, аутологічних або гетерологічних клітин, які включають дендритні клітини, В-клітини і макрофаги.

Крім того, у даному винаході розкритий спосіб імунопрофілактики або імунотерапії проти

ВГВ - інфекції, який відрізняється введенням пацієнтові, що потребує цього, ефективної кількості фармацевтичної композиції що включає антиген НВсАд, який містить мРНК у процентній частці більше 4595 від сумарної РНК даного антигену, і НВ5зАд антиген ВГВ. В одному варіанті здійснення винаходу НВ5Ад включає фосфатидилсерин у процентній частці більше 5 95 від загальної кількості фосфоліпідів даного антигену. У варіанті здійснення винаходу зазначену фармацевтичну композицію вводять парентеральним і мукозальним шляхами. У переважному варіанті здійснення пацієнт, що одержує імунотерапію, є хворим ХГВ. У цьому випадку застосування способу згідно з винаходом для імунотерапії у хворих ХГВ забезпечує запобігання гепатоцелюлярного раку, що виник у результаті інфекції, викликаної ВГВ.

Мета даного винаходу також полягає в застосуванні НВсАд антигену, який містить мРНК у процентній частці більше 4595 від сумарної РНК даного антигену, і антигену НВ5зАд для посилення імунної відповіді проти додаткового антигену, який спільно вводять із сумішшю цих антигенів. У варіанті здійснення винаходу НВ5зАд, що входить до складу суміші антигенів, містить фосфатидилсерин у процентній частці більше 5 95 від загальної кількості фосфоліпідів даного антигену.

Суміш антигенів, зазначених вище, може застосовуватися в потенціюванні імунної відповіді проти ХГВ (у терапевтичній схемі) або відповідно до стратегій профілактичної вакцинації, де вакцина є полівалентною. Це обумовлене тим, що на додаток до підвищення імуногенності антигенів НВзАд і НВсАд, змінених визначеним способом, можна було перевірити, що вони здатні викликати ефект потенціювання імуногенності гетерологічних антигенів. Результати експериментальних оцінок демонструють, що ці антигени, що є присутніми в полівалентних композиціях, можуть використовуватися в профілактичному або терапевтичному застосуванні.

Хоча відносно композицій у даному винаході можна виключити застосування ад'ювантів, стабілізаторів, консервантів або інших добавок, це не обмежує введення добавок, допоміжних речовин, розріджувачів, які не знижують імуногенність композиції або одержуваного кінцевого продукту, або противірусну ефективність композиції, що вводиться.

З використанням фармацевтичної композиції і способу імунопрофілактики або імунотерапії згідно із винаходом, досягається тривала противірусна відповідь, при цьому число пацієнтів із сероконверсією НВзАа в анти - НВ5Ад збільшується в порівнянні із застосуванням композицій і способів, відомих у даній галузі техніки.

Короткий опис фігур

Фігура 1. Продукування антитіл ІДС проти НВсАд після введення двох доз.

Фігура 2. Антитіла ІДС проти САЗ.

Фігура 3. Проліферативна відповідь СО8-САЗ (ВІЛ-1) - специфічних Т-клітин.

Докладний опис варіантів здійснення/прикладів здійснення

Приклад 1. Одержання білка НВсАд з різними процентними частками варіантів РНК

НВсАЯд одержували зі штаму Е. соїї, який генетично трансформували плазмідою, яка несла ген, що кодує цей антиген (Адиїйаг УС, еї а). Іттипої Сеї! Вісо! (2004) 82: 539-461.

При дослідженні частинок НВсАЯ, отриманих у результаті ферментативного процесу, проведеного в різні періоди часу, спостерігали збільшення частки мРНК, що включається в препарати НВсАд, отримані при більш тривалих періодах ферментації. Після 20 годин ферментації рівні мРНК в антигені зросли більш ніж на 20 95 у порівнянні з НВсАд, отриманим у процесах тривалістю до 14 годин, як показано в Таблиці 1. Ніяких істотних змін у вмісті сумарної

РНК у частинці не виявили, оскільки не було виявлено значимих відмінностей у рівнях сумарної

РНК або відносно вмісту РНК/вмісту білка. Однак спостерігали значне збільшення рівня мРНК у порівнянні з іншими варіантами, зокрема рибосомною РНК (рРНК), яка показала зниження свого вмісту з підвищенням мРНК. Ніяких інших значимих змін не було виявлено щодо пов'язаних з

НВсАд мінорних компонентів або характерних контамінуючих домішок при дослідженні за допомогою мас-спектрометрії або інших хімічних і фізичних аналізів. 60

Таблиця 1

Зміна процентного вмісту щодо основних типів РНК в НВсАд залежно від тривалості процесу ферментації 7 2(2тюод) | 77777017 77717171 600 7 | ...77р399 2 щ 1 З(4год) | 7777/7009. | юю 49 | 77177450 щЮ.::« 1 4(бгод) | 7777/7009 | ...юЮюж40024юЮюЮюЮюЮ.|.ЮюЮюрюс5МО1шщС

Результати являють собою середні значення з п'яти вимірів. У стовпці з назвою "Варіант" тривалість ферментації зазначена в круглих скобках. тРНК: транспортна РНК, рРНК: рибосомна РНК і мРНК: матрична РНК. (7): Значима відмінність (р«е0,05).

Оцінка на мишах Ва!р/с імуногенності варіантів НВсАд з різним процентним вмістом мРНК

Після одержання різних варіантів НВсАд з різним процентним вмістом мРНК у частинці (Таблиця 1), імунологічні оцінки цих препаратів виконували на мишах Ваїр/с. Для цього дослідження використовували самок мишей віком 8-12 тижнів, зробивши дві імунізації в дні 0 і 15, п/ш шляхом, з дозою 1 мкг НВсАд у фосфатно-сольовому буфері (РВ5), що вводиться в кінцевому об'ємі 100 мкл. Докладний опис схеми показано в Таблиці 2.

Таблиця 2

Схема імунізації для оцінки впливу процентного вмісту МРНК у частинці НВсАд на імуногенність цього антигену 71117176 17111111 1мконВсдо(б7жмРНЮ | 77777771

Забір крові для оцінки продукування специфічних антитіл у результаті імунізації проводили через 10 днів після введення другої дози. Вимір продукування антитіл проти НВсАд проводили за допомогою методики ІФА.

Як показано на фігурі 1, на якій представлені титри антитіл (ДС проти НВсАд, отримані в кожній досліджуваній групі, продукування їдс проти НВсАд була значно вище в групах, що одержували НВсАд із вмістом мРНК вище 45 95 (групи 3-6 у Таблиці 2). Між групами 3,4,51 6 не було виявлено значимих відмінностей, хоча спостерігали деяку тенденцію до збільшення відповіді ІДС, пов'язаному зі збільшенням відсотка вмісту мРНК. Результати показують, що збільшення процентної частки мРНК, що міститься в частинці НВсАд на рівнях вище 45 95 щодо сумарного вмісту РНК, надає цьому білку більш високу гуморальну імуногенність. Попередні аналізи структури субкласів (ДС вказують на аналогічну активність на рівні імунної відповіді клітинного типу.

Приклад 2. Одержання вірусоподібних частинок (МІР) НВзАд з різними процентними частками фосфатидилсерину

Рекомбінантний НВ5ЗАд одержували зі штаму генетично трансформованих Р. равіогів при використанні гена, який кодує цей антиген |(єЄвропейський патент ЕР 480525). Як відомо, НВ5АЯ, що експресується у дріжджах цього виду, містить фосфатидилсерин у своїх структурних ліпідах

ІГобаїпа У, еї аї. Віоїеспоіодіа Аріїсада (2008), 25: 325-331). Однак, до даного винаходу вплив присутності даного ліпіду на імуногенність цього антигену не було вивчено.

З метою дослідження того, як процентна частка фосфатидилсерину впливає на імуногенність НВ5Ад, одержували препарати зазначених МІ Р при різних умовах ферментації.

Під час культивування у ферментерах для рекомбінантних дріжджів підвищували концентрацію

Маг» у середовищі культивування до процентного вмісту 1,0-2,095, що призводило до збільшення зазначеного фосфоліпіду, пов'язаного з МІР НВ5ЗАд. Це було виявлено за допомогою тонкошарової хроматографії в ході дослідження НВ5БАд, отриманого при різних умовах росту.

Фосфатидилсерин пов'язаний з МІ Р НВ5АаЯ, що характерно для ліпіду. Результати, показані в Таблиці 3, являють собою середні значення з п'яти різних повторюваностей. Очищення було аналогічним для всіх препаратів НВ5Ад, отриманих при різних експериментальних умовах. Як можна бачити з таблиці, фосфатидилсерин не був виявлений у зразках, отриманих при ферментації з культуральним середовищем, що містить концентрацію Мде» нижче 1,2 905. Рівні фосфатидилсерину, виявлені в препараті, отриманому з культуральним середовищем, що містить 2,095 Маг», були значно вище рівнів, виявлених у препараті, отриманому з культуральним середовищем, що містить 1,4 95 Мде (Варіант С).

Таблиця З

Одержання варіантів НВздАа з кількістю, що підвищується, фосфатидилсерину в 77111112 00711111 в11Г111111111161111111111111111171111111111115:050403..ЙЙМ:ц:СсСО

МО: Не виявлений. Мас» (95): концентрація іона Мо (у відсотках), виявлена в сольових добавках середовища культивування. ФС (95): відсоток фосфатидилсерину від загального вмісту фосфоліпідів, визначений після виділення очищеного НВ5Аа. (): Значимі відмінності (р-0,05), (7) Високозначимі відмінності (р«0,01).

Препарати НВзАЯ, представлені в Таблиці З, були ідентичні за білковим складом згідно з дослідженням, проведеним з метою вивчення їх первинної, вторинної і третинної структури, порівнюваної з вихідним варіантом. Важливо відзначити, що відношення концентрації ліпідів/хонцентрації білків не змінилося ні для одного з досліджуваних варіантів. Той же результат був отриманий із процентною часткою загального вмісту фосфоліпідів щодо загального вмісту білка. Ніякі інші істотні зміни не були зареєстровані в ході аналізу домішок

НВзЗАд або інших мінорних сполук у результаті аналізу їх складу за допомогою мас- спектрометрії.

Приклад 3. Імунологічна оцінка препаратів НВ5зАд, що містять різні процентні частки фосфатидилсерину

З метою оцінки, чи впливає присутність фосфатидилсерину на імунну відповідь проти

НВ5ЗАЯ, проводили дослідження імуногенності на трансгенних мишах, які експресували НВзАЗд у сироватці (Сазіго ГО, еї аї. Іпіейегоп у ВіоїеспоЇодіа (1989) 6: 251-257; Реге А, еї а)Ї. Асіа

Віотеспнпої (1993) 13: 373-383). Використовували сім груп по шість мишей у кожній. Самок мишей віком 8-12 тижнів імунізували інтраназальним шляхом (і/н). Перші шість досліджуваних груп одержували по 5 мкг різних варіантів НВ5ЗАЯ, описаних у Таблиці 3, з ад'ювантом Фрейнда.

Сьома група використовувалася як контрольна група і одержувала РВ5 1х. Усі групи лікування одержували 10 доз імуногену, який вводили раз на 14 днів. Забір крові проводили перед первинною імунізацією і через 10 днів після кожної дози, починаючи із третьої дози. У Таблиці 4 показані рівні НВ5ЗАд у крові трансгенних мишей, а також рівні цитокінів (ЕМ гама (ІЕМ-у), фактора некрозу пухлини (ФНП-са) і І -2, індукованих у супернатантах культур спленоцитів, виділених після введення 10 доз. Аналіз проводили при використанні методики ІФА.

Після введення 5 мкг НВзАд і/н шляхом в 10 послідовних імунізаціях, концентрація НВ5ЗАа у крові трансгенних мишей за НВзАд була значно знижена, коли рівень фосфатидилсерину в зазначеному НВзАд становив 595 або більше (варіанти О, Е і Е у Таблиці 3, Приклад 2).

Аналогічним чином, варіанти НВзАа, що містять 5 95 або більше фосфатидилсерину, індукували значно більш високі рівні ІЕМ-у, ТМЕ-са і ІЇ-2 у порівнянні з варіантами з низькими (варіант ІЗ)

або такими, що не піддаються виявленню, рівнями фосфатидилсерину, що вказує на дозозалежний ефект. Це можна бачити в Таблиці 4.

При порівнянні з НВ5Ад, який не містить фосфатидилсерин, спостерігали значиме збільшення цитокінів ТАТ, при цьому більш висока здатність до елімінації циркулюючого НВзАд була виявлена після імунізації трансгенних мишей НВ5зАд варіантами НВзАа, що містять рівні фосфатидилсерину більше 5 95 (Таблиця 4, варіанти О-Р). Рівні цитокінів, які були виявлені для варіантів О-Е, були значно вище, ніж при умовах А-С. Варіанти 0-Е індукували найбільше зниження концентрації НВ5Ад, а також найбільш активну секрецію цитокінів після іп мйго стимуляції клітин селезінки в імунізованих трансгенних тварин.

Таблиця 4

Оцінка циркулюючого НВзАОЯ і рівнів цитокінів після імунізації трансгенних мишей варіантами НВ5ЗАаЯ з різним процентним вмістом фосфатидилсерину. . до зниження . . 5Ад НВ (пг/мл) (пг/мл) зАа

В 7777771771111123344 | 652 | 7 45518.4.Й|.ЮЙ.Ь. 224 07777111 66:55233.ЮЙМ| 2 юф250:200) | 57053003 | 505523 ДЖ РФ

А-Е: Варіанти НВ5зАЯд, отримані з рівнями, що підвищуються, фосфатидилсерину у своєму складі, показані в Таблиці 3. (): Значимі відмінності (р«0,05), 7" Високозначимі відмінності (р«е0,01).

Спостерігали значиме збільшення цитокінів Ти! і більш високу здатність до елімінації циркулюючого НВзАа при імунізації мишей, які були трансгенними за НВ5зАд, варіантами НВзАа, що мають більш високий вміст фосфатидилсерину, що продемонструє збільшення імуногенності антигену при збільшенні процентної частки даного ліпідного компонента в ліпідах, зв'язаних з МІ Р, формованих цим антигеном.

Про введення фосфатидилсерину в частинки НВ5Ад раніше повідомлялося в рівні техніки.

Однак не було досліджено, яким чином процентна частка цього компонента впливає на імуногенність зазначених частинок. Хоча в 2008 році Лобаїна із співавт. обговорювали роль фосфатидилсерину в більш високій імуногенності НВ5Ад, що продукується в Р. равзіогів (І обаіпа

М, еї аї. Аррієй Віоїесппоісду (2008), 25: 325-331), у тому ж повідомленні було продемонстровано, що дві вакцини на основі НВ5ЗА)д, отримані в тому ж хазяїні, відрізнялися за імуногенністю, хоча рівні фосфатидилсерину приблизно були однаковими, через вид дріжджів, у яких вони були отримані.

Приклад 4. Демонстрація підвищення імуногенності у хворих ХГВ варіантів НВсАЯ, що містять більш високу процентну частку інкапсульованої мРНК

У Прикладі 1 було показано на мишах, що було присутнє збільшення імуногенності НВсАд при збільшенні процентної частки мРНК у загальній кількості інкапсульованої РНК. З врахуванням таких результатів, досліджували імунологічні властивості і противірусну відповідь ій мімо композицій, що включають НВсАд і НВ5Ад, з модифікаціями щодо їх мРНК і фосфатидилсерину, відповідно.

Із цією метою проводили рандомізоване подвійне сліпе клінічне дослідження фази ЇЇ в хронічних хворих на гепатит В. На початку дослідження відбирали пацієнтів з вірусним навантаженням вище 10000 копій/мл і позитивним НВсАа. Пацієнтів розподіляли в 6 груп по 15 пацієнтів, яким призначали лікування, описане в Таблиці 5. У цілому вводили 10 доз, які були розділені на два курси по 5 доз кожний, з інтервалом один місяць між ними. Перші 5 доз вводили тільки і/н шляхом, а інші 5 доз вводили одночасно і/н і п/ш. В обох курсах введення дози вводили з інтервалом 14 днів.

Таблиця 5

Групи лікування в клінічному дослідженні фази ЇЇ, у якому проводили оцінку антигенів НВсАа і

НВзАЯ з модифікаціями за вмістом мРНК і фосфатидилсерину, відповідно 77717761 лобомконНВвАонбОМмконВсСАяЇГ7Г7/7/:///:(///:И тНВсАд: НВсАд, що містить мРНК із процентною часткою 50 9о від сумарної РНК цього антигену; тНВзАд: НВзАаЯ, що містить 7 96 фосфатидилсерину від ліпідних компонентів Мі Р.

Неочікувано, значно більш високі рівні сероконверсії в НВсАд і НВзАЯ були виявлені в групі пацієнтів, що одержували препарат, що містить обидва модифікованих антигени (тобто препарат, який містив НВ5Ад з рівнями фосфатидилсерину більше 5 95 і НВсАд із мРНК більше 45 95), у порівнянні із групами пацієнтів, що одержували препарати без цих характеристик (див.

Таблицю 6). Це демонструє значимість таких змін для поліпшення якості противірусної відповіді, яка була викликана у пацієнтів.

У людей антигени оцінювали в діапазоні концентрацій від 50 мкг кожного антигену на дозу до 1000 мкг кожного антигену на дозу, з підтвердженням противірусної відповіді, щодо сероконверсії в НВзАд і НВеда, вірусологічного контролю і довгочасної вірусологічної відповіді до 10000 копій ДНК ВГВ у мл протягом більше 1 року після завершення лікування.

Таблиця 6

Частка пацієнтів із сероконверсією в НВеда і НВ5ЗАад через рік після завершення лікування в клінічному дослідженні фази ІІ з НВсАд і НВ5Ад, що мають модифікації за вмістом мРНК і фосфатидилсерину, відповідно. 611 Г4611111111171111111111111ом6сСс21

Подібні результати також були отримані в моделі на мишах, які були трансгенними за

НВзАаЯ, де дослідження проводили для оцінки таких же груп лікування, як описані в Таблиці 5, при цьому було отримано більше зменшення циркулюючого НВзАа, а також більш високі титри антитіл проти НВзАа і з більш ранньою появою, для груп, що одержують композиції, які містили антигени з модифікаціями, описаними вище.

Примітно, що композиції, які містять варіанти модифікованих НВсАЯд і НВ5Ад, розвивали більш високу ТИ! імуногенність у мишей, трансгенних за ВГВ, і в пацієнтів у порівнянні з реакцією, отриманою з композиціями, що містять не модифіковані антигени, або композиціями, які містили тільки один із цих модифікованих антигенів.

Приклад 5. Ад'ювантний ефект антигенів НВсАд і НВ5Ад, що мають модифікації за вмістом

МРНК і фосфатидилсерину, відповідно, у полівалентних композиціях

У цьому дослідженні порівнювали ад'ювантну здатність, тобто посилення імунної відповіді проти антигенів, які вводили спільно, у суміші рекомбінантних білків НВсАд і НВсАд з модифікаціями за вмістом мРНК і фосфатидилсерину, відповідно, із сумішшю немодифікованих

НВсАд і НВзАЯ, парентеральним і мукозальним шляхами. Для цієї мети був вибраний

Зо рекомбінантний химерний білок СВАЗ, який є мультиепітопним антигеном ВІЛ-1 ГІдієвіав Е еї аї..

Віоспет Мої Віої! 4 Віорпуз (2001) 1: 109-122). У восьми групах по вісім самок мишей ВаїбБ/с (Н- га) віком 6-8 тижнів вводили: 1) РВ5 (плацебо) шляхом п/ш імунізації (далі іменований Плацебо

(п/ш)); 2) натрій-ацетатний буфер (МаАс), рН :- 5,2, шляхом і/н імунізації (плацебо (і/н)); 3) суміш

НВсАа (С) і НВзАа (5) п/ш (С--5 (п/ш)); 4) суміш НВсАяЯ, що містить мРНК у процентній частці 50 95 від сумарної РНК даного антигену (тс), і НВзАЯ, що містить 7 96 фосфатидилсерину від ліпідних компонентів (те) п/ш (тбС-нте (п/ш)); 5) С--5 і/н (С--5 (і/н)); 6) тбС-нт5 і/н (тб-нт5 і/н)); 7) суміш САЗ з НВсАз (С) і НВзАЗ (5) п/ш (СВЗ-а-С--5 (п/ш)); 8) СВЗ-то-нт5 (п/ш); 99 САЗ3-б--5 (і/н) ї 193 САЗ-нто-ня 5 (і/н). Використовувана доза становила 5 мкг кожного антигену на кожний шлях введення, при цьому імуногени вводили в дні 0, 7 і 21 схеми імунізації. Для п/ш імунізації білки розчиняли в РВ5 і адсорбували в 1,4 мг/мл гідроксиду алюмінію (Зирепоз5 Віозесіог А/5,

Уедьаєек, Юептаїгк). Для і/н шляху білки розчиняли в МаАс, рН - 5,2. Тваринам, поміщеним у положення лежачи на спині, робили анестезію шляхом внутрішньоочеревинного (в/ч) введення 30 мкг кетаміну (10 мг/мл) і повільно вводили імуногени в 50 мкл (25 мкл/у ніздрю) через наконечник піпетки. Через десять днів після імунізації сироватку всіх тварин збирали і п'ять тварин умертвляли (випадковим чином) наприкінці дослідження для одержання їх селезінки для досліджень клітинної імунної відповіді.

Продукування ІдСї у сироватці оцінювали за допомогою непрямого ІФА, у якому планшети були покриті білком САЗ.

Методика кількісного аналізу секреції ІРМ-у у супернатантах культур, стимульованих з САЗ, була описана раніше (Сагсіа Оіа? О еї аї. Іттипої! Гей (2013) 149: 77-84).

Розподіл Гаусса оцінювали для статистичного аналізу даних з використанням критерію

Колмогорова-Смирнова і рівності дисперсій із критерієм Бартлетта. Зразки з нормальним розподілом (або такі, у яких визначали розподіл Гаусса) і з однаковою дисперсією порівнювали з параметричними критеріями; в іншому випадку використовували альтернативний непараметричний критерій. Усі титри ІДС були перетворені в І0у 10 для одержання нормального розподілу значень. Сироваткам тварин, які не досягали сероконверсії, присвоювали довільний титр 1:10 для статистичної обробки. Значення р«0,05 вважали статистично значимим.

Результати визначення Ід антитіла проти САЗ (ВІЛ-1), спостережуваного на фігурі 2, показали більш високу відповідь (р«е0,05) після введення п/ш і і/н шляхами в групах тварин, імунізованих сумішшю СЕЗ-тО-то5 (групи 8 і 10) у порівнянні з САЗ-Ся5 (групи 7 і 9), відповідно. Відповідно до попередніх результатів більш високу секрецію ІЕМ-у також спостерігали в супернатантах культур мишей у тих же групах, які представлені в Таблиці 7. Для цього аналізу через десять днів після останньої імунізації (день 31) культивували спленоцити п'яти мишей з кожної групи. Суспензії спленоцитів окремих тварин підготовляли для групи плацебо. Їх стимулювали ех мімо 2,5 мкг/мл білка СВЗ протягом п'яти днів. У супернатантних рідинах СКЗ-специфічний ІЄМ-у визначали кількісно за допомогою ІФА сандвіч -типу. Границя виявлення становила 0,8 0 нг/мл.

Таблиця 7

Секреція ІЕМ-у, виміряна в супернатантних рідинах культур. 1 -0,80 2 -0,80

З Сб--5 (п/ш) З -0,80 4 -0,80 5 -0,80 1 -0,80 2 -0,80 4 тб-нт5 (п/ш) З -0,80 4 -0,80 5 -0,80 1 -0,80 2 -0,80 5 б-5 (і/н) З -0,80 4 -0,80 5 -0,80 . 1 -0,80 вофюєтвою 1 |181юю

З -0,80 4 -0,80 -0,80 1 6,35 2 7,86 7 САЗАСз5(п/ш) З 3,32 4 445 5 3,54 1 10,35 2 9,86

САЗннтС-то5 (п/ш) З 8,62 4 9,05 5 11,24 1 -0,80 2 2,03

САЗАСі(/н) З 1,68 4 0,97 5 2,25 1 4,55 2 5,36

САЗатб-нт5 (і/н) З 3,87 4 2,54 5 3,98

Нарешті, відсоток СО8 - клітин, які є специфічними до СЕЗ (ВІЛ-1), порівнювали після ех мімо стимуляції в групах, імунізованих п/ш шляхом. Більш високий відсоток СОб- клітин був отриманий у групі, стимульованій САЗ--тО-нто5 (п/ш) у порівнянні з САЗ--С--5 (п/ш) (р«е0,05), що можна спостерігати на Фігурі 3.

Ці результати в цілому показують, що суміш НВсАд, що містить мРНК вище 45 95 (т), і

НВзАаЯ з рівнями фосфатидилсерину вище 5 95 (т5) проявляє більш сильний ТН1 ад'ювантний ефект при введенні парентеральним і мукозальним шляхами. Зокрема, у випадку вакцинації 5 проти ВІЛ, цей результат вкрай важливий, оскільки противірусну ТИ1 відповідь пов'язували із захистом від інфекції і прогресування в СНІД.

Хоча метою цього експерименту не був вимір гуморальної відповіді проти антигенів НВзЗАд і

НВсАаЯ (скорочено позначених у даному прикладі як С і 5), спостерігали відповіді ІДС проти

НВсАд і проти НВзАа, які були більш високими і статистично значимими, у групах мишей, 10 імунізованих сумішшю модифікованих антигенів НВзАЯ і НВсАд (тС--нт5), у порівнянні із сумішшю немодифікованих НВзАд і НВсАа (С--5, дані не показані). Це підтверджувало наведені вище результати.

Приклад 6. Пасивна імунізація за допомогою адоптивного переносу клітин від мишей ВаїбБ/с, імунізованих композиціями НВсАд і НВ5Ад з модифікаціями за вмістом мРНК і фосфатидилсерину, відповідно, трансгенним мишам Ваїр/с, що експресують НВзАд.

У цьому винаході автори постаралися підсилити імунну відповідь проти НВ5Ад і проти

НВсАд у донорів за допомогою активної імунізації пацієнтів композицією, що містить антигени

НВзАЯ і НВсАд, які включають модифікації за вмістом фосфатидилсерину і мРНК, відповідно, і, крім того, клітини, що підлягають переносу, будуть активувати іп мйго до переносу, тому відповідь на ці антигени буде максимальною, коли клітини будуть інокулювати в організм реципієнта. Таким чином, тип відповіді, яка не існує в пацієнтів, одержують штучно, що дозволяє розширити групу донорів до осіб з подібними гаплотипами, незалежно від того, чи були вони інфіковані ВГ В, чи ні.

У поточному прикладі за допомогою адоптивного переносу клітин оцінювали вплив імунної відповіді, викликаної в результаті вакцинації з використанням композиції, що складається з антигенів НВ5ЗАЯ і НВсАд з модифікаціями за вмістом фосфатидилсерину і мРНК, відповідно, яку застосовували і/н/парентеральним шляхами, щодо трансгенної миші, яка експресує НВзАЯ, моделі персистентної інфекції ВГВ. Однією із цілей дослідження була оцінка впливу перенесеної імунної відповіді на концентрацію НВ5ЗАд (антигенемія) у сироватці трансгенної миші. Крім того, порівнювали вплив відповіді, викликаної комбінацією і/н/парентерального шляхів при введенні композиції антигенів НВ5ЗАд і НВсАд у порівнянні із впливом, викликаним переносом клітин, що стимулюються тільки НВ5ЗАд іп мімо і іп міїго. Крім того, вивчали кінетику перенесеного продукування антитіл проти НВзАд щодо трансгенної миші для цього антигену.

Використовували мишей Ваїр/с і мишей, які були НВзАд (т) трансгенними (з генетичним фоном

Ваїр/с, отриманих в СІСВ).

Одержання мишей Ваїр/с з імунітетом проти НВзАд Курс імунізації проводили на самках мишей ВаІр/с віком 8-12 тижнів. Мишей імунізували препаратом вакцини, що містить модифіковані антигени НВ5ЗАд (з вмістом фосфатидилсерину більше 5 95) і НВсАд (з вмістом

МРНК більше 45 95), одночасно і/н і парентеральним шляхами. У випадку парентерального введення тестували в/м, п/ш і в/ш шляхи. Дозу (в об'ємі 100 мкл) вводили в дні 0 і 14 і повторну імунізацію робили в день 100 перед переносом. Забір крові робили з ретроорбітального сплетіння в дні 2, 10 ї 25. У Таблиці 8 показана схема імунізації, що включає лікування, отримане кожною групою.

Таблиця 8

Схема імунізації у нетрансгенних мишей Ваїр/с . Кількість 6 стнВеАоетНВсАд/тНВвАднтНВсА4Ю 000000 |в//лн | 7713711 07 0галушм/РВ85ЇГ////7777777771717171717171717171111111111111фв/мин//////// | 7/9 тНВсАд: НВсАд, що містить мРНК у процентній частці 50 95 від сумарної РНК даного антигену; тНВ5Ад: НВзЗАЗ, що містить 7 96 фосфатидилсерину від загального вмісту ліпідних компонентів МІ Р.

Оцінку імунної гуморальної відповіді, отриманої в результаті лікування, проводили шляхом виміру продукування Ідас і субкласів Ід проти НВзАаЯ, після кожного щеплення, за допомогою методики ІФА. Для оцінки клітинної імунної відповіді, через 10 днів після першого введення, проводили дослідження за типом ЕІ І5РОТ, для виміру секреції специфічного ІЕМ-у проти НВзАд

Сбр8я- лімфоцитами селезінки. Результати цих оцінок вказують, що Група 5 робить найбільш сильну клітинну відповідь і гуморальну відповідь, яка не відрізняється від іншої частини досліджуваних груп. На основі цього відібрали двох тварин із цієї групи як донорів спленоцитів для адоптивного переносу. Вибір імуногену проводили при співвідношенні 1:1 (НВзАа:НВслАа)

Одержання імунних спленоцитів

Через п'ятнадцять днів після одержання бустерної імунізації, двох мишей із Групи 5 і трьох мишей із Групи 7 (плацебо) умертвляли і забирали їх селезінку. Селезінки із Групи 5 і із Групи 7, відповідно, групували. Селезінки обробляли для одержання спленоцитів. Їх ділили на аліквоти по 30 х 1092 клітин в 100 мкл РВ5 1х для переносу реципієнтним мишам.

Адоптивний перенос імунітету

Трансгенні миші, що експресують НВзАд, яких використовували як реципієнти, мали вік 16- 20 тижнів і були представлені обома статями. Їх розподіляли в різні групи лікування, як показано в Таблиці 9. Перед переносом спленоцитів проводили частковий забір крові для перевірки рівнів НВзАад у сироватці. Потім вводили (в/ч шляхом) 30 х 1092 спленоцитів в об'ємі 100 мкл РВ5 їх. Забір крові для оцінки ефекту адоптивного переносу імунітету робили з ретроорбітального сплетіння раз на тиждень протягом 5 тижнів. У тиждень 8 після переносу, у тварин забирали кров і умертвляли.

Таблиця 9

Схема експерименту із адоптивного переносу імунітету проти НВзАЯ і НВсАа плацебо

Кількісний аналіз НВ5зАд у сироватці мишей, трансгенних за НВзАд

Рівні НВ5ЗАЯ у сироватці визначали за допомогою ІФА.

Планшети покривали моноклональним антитілом проти НВ5Ад, названим Нер4 (виробництва СІСВ). Усі миші, що одержували клітини з попереднім імунітетом до НВзАа, показали при оцінці через тиждень після переносу помітне зменшення НВзАд у сироватці, зі значимими відмінностями між нульовим моментом і 2-м і 3-м тижнями (р«е0,05). На четвертий тиждень (день 35) помітили, що концентрації НВ5Ад у сироватці почали збільшуватися, що вказувало на те, що контроль антигенемії за допомогою перенесеного імунітету знижується. Із цього моменту і до тижня 8 (день 63) не спостерігали ніяких відмінностей в антигенемії, спостережуваній в нульовий момент дослідження.

У випадку мишей, підданих переносу спленоцитів зі специфічним імунітетом проти НВ5АЯ, виявили помітні зниження НВзАЯ у сироватці, які були найбільш помітними в дні 7-28. Однак миші, які одержували плацебо перенос спленоцитів або РВ5, хоча і мали зміни концентрації

НВЗАЯ у сироватці, але вони не досягали значимої відмінності з нульовим моментом, і значення нижче 5 мкг/мл ніколи не реєстрували.

Ці результати вказують, що за допомогою адоптивного переносу імунітету, опосередкованого клітинами, можна ефективно знизити рівні НВ5Ад, що циркулює в сироватці цих тварин, трансгенних за цим білком. Контроль, встановлений щодо антигенемії імунною відповіддю, перенесеним у цьому випадку, був ефективним і тривав протягом приблизно З тижнів після однократного переносу клітин.

Продукування ІдС проти НВ5ЗАЗ у сироватці

Специфічна гуморальна імунна відповідь ДС; проти НВ5ЗАд була виявлена у всіх мишей, підданих переносу спленоцитів з попереднім імунітетом до цього антигену. Це узгоджується з отриманими результатами за антигенемією. У тварин з відповіддю проти НВ5Ад виявлені титри були високими (титр»107) і починали знижуватися в третій тиждень, що може бути пов'язане з підвищенням антигенемії, яке спостерігали в цих тварин приблизно в 4-й тиждень (день 35).

Групи, піддані переносу плацебо клітин або РВ5, не показали наявності специфічних антитіл.

Зо

Claims (9)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Фармацевтична композиція, яка містить ядерний антиген вірусу гепатиту В (НВсА)д) і поверхневий антиген вірусу гепатиту В (НВзАд), яка відрізняється тим, що ядерний антиген вірусу гепатиту В (НВсАд) включає матричну рибонуклеїнову кислоту (МРНК) у відсотковій частці 45,0-67,1 95 від загальної кількості рибонуклеїнової кислоти (РНК) цього антигену, і поверхневий антиген вірусу гепатиту В (НВ5зАд) включає фосфатидилсерин у відсотковій частці 5,0-8,2 95 від загальної кількості фосфоліпідів цього антигену.

2. Фармацевтична композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що вона містить співвідношення антигенів 1:1 концентрації білка.

3. Фармацевтична композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що вона складена для введення парентеральним і мукозальним шляхами.

4. Фармацевтична композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що вона додатково включає ад'ювант вакцини.

5. Застосування фармацевтичної композиції, яка містить ядерний антиген вірусу гепатиту В (НВсАд), який включає матричну рибонуклеїнову кислоту (МРНК) у відсотковій частці, яка становить 45,0-67,1 95 від загальної кількості рибонуклеїнової кислоти (РНК) цього антигену, і поверхневий антиген вірусу гепатиту В (НВ5Ад), який включає фосфатидилсерин у відсотковій частці 5,0-8,2 9У5 від загальної кількості фосфоліпідів цього антигену, в одержанні лікарського засобу, призначеного для застосування в імунній профілактиці або імунотерапії проти інфекції, викликаної вірусом гепатиту В (ВГВ).

б. Застосування за п. 5, де лікарський засіб призначений для введення парентеральним і мукозальним шляхами.

7. Застосування за п. 5, де лікарський засіб використовують у лікуванні пацієнтів із хронічним гепатитом В (ХГВ) або пацієнтів з коінфекціями, де одним з вірусів, що інфікує, є вірус гепатиту

В.

8. Застосування за п. 7, де лікування пацієнтів із ХГВ використовують у запобіганні гепатоцелюлярному раку, що виник у результаті інфекції, викликаної ВГВ.

9. Застосування за п. 5, де імунотерапію проводять в активній або пасивній формі шляхом клітинної стимуляції. Є ме ваз | » ща я Хв пт ше КО ще ЕКО - В са шншшнши ЖЖ так ми: ух ххх ВВ Ка се Я ї й З в 5 5 7 Гоупи Фіг С чех | ' де Ох 7 Що ско. скдее ще ск її з них ЗМО КНИШ АВ чем .. і зе Ж : и ОО З х ЗрКОВИХ ЗКУМИВИХ МОВИ ЗУБОВОХ хе КЕ х ОКХ ОХ ЗБ ЗХ. Ко й и 5 Б її я оо я о ту Ж ня їх и я «М «шк до Я я а Ше Кей -й Ка АК щЗ й ФУ ОКУ Од ЕР и я т ФО Гоупи мишей Бал:

сік. а