UA129013C2 - Спосіб культивування клітин - Google Patents
Спосіб культивування клітин Download PDFInfo
- Publication number
- UA129013C2 UA129013C2 UAA202003692A UAA202003692A UA129013C2 UA 129013 C2 UA129013 C2 UA 129013C2 UA A202003692 A UAA202003692 A UA A202003692A UA A202003692 A UAA202003692 A UA A202003692A UA 129013 C2 UA129013 C2 UA 129013C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- inhibitor
- cells
- concentration
- neural crest
- medium
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 109
- 210000001982 neural crest cell Anatomy 0.000 claims abstract description 187
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 185
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 61
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 194
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 31
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 26
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims description 23
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 claims description 18
- HIJMSZGHKQPPJS-UHFFFAOYSA-N 3-(6-methylpyridin-2-yl)-n-phenyl-4-quinolin-4-ylpyrazole-1-carbothioamide Chemical compound CC1=CC=CC(C=2C(=CN(N=2)C(=S)NC=2C=CC=CC=2)C=2C3=CC=CC=C3N=CC=2)=N1 HIJMSZGHKQPPJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 9
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 9
- RAQQRQCODVNJCK-JLHYYAGUSA-N N-[(4-amino-2-methylpyrimidin-5-yl)methyl]-N-[(E)-5-hydroxy-3-(2-hydroxyethyldisulfanyl)pent-2-en-2-yl]formamide Chemical compound C\C(N(Cc1cnc(C)nc1N)C=O)=C(\CCO)SSCCO RAQQRQCODVNJCK-JLHYYAGUSA-N 0.000 claims description 7
- QQUXFYAWXPMDOE-UHFFFAOYSA-N kenpaullone Chemical compound C1C(=O)NC2=CC=CC=C2C2=C1C1=CC(Br)=CC=C1N2 QQUXFYAWXPMDOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 6
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims 2
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 claims 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 55
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 18
- 102000019058 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Human genes 0.000 abstract 2
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 abstract 2
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 129
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 51
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 28
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 230000008859 change Effects 0.000 description 20
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 15
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 13
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 12
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 11
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 11
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 11
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 7
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 7
- 208000017763 cutaneous neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 7
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 7
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 5
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 4
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 4
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 4
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 4
- 210000000276 neural tube Anatomy 0.000 description 4
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 4-(5-benzoyl1,3-dioxol-5-yl-4-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl)-benzamide Chemical compound 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 description 3
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 description 3
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 3
- 241000567769 Isurus oxyrinchus Species 0.000 description 3
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 3
- 102000000479 TCF Transcription Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010016283 TCF Transcription Factors Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000012583 B-27 Supplement Substances 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000007055 Endothelin-3 Human genes 0.000 description 2
- 108010072844 Endothelin-3 Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100028895 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M Human genes 0.000 description 2
- 101000839073 Homo sapiens Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FHYUGAJXYORMHI-UHFFFAOYSA-N SB 431542 Chemical compound C1=CC(C(=O)N)=CC=C1C1=NC(C=2C=C3OCOC3=CC=2)=C(C=2N=CC=CC=2)N1 FHYUGAJXYORMHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- ZGOVYTPSWMLYOF-QEADGSHQSA-N chembl1790180 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]2CSSC[C@@H](C(N[C@H](CC=3C=CC=CC=3)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](CCC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2)[C@H](C)O)=O)NC(=O)[C@@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](N)CSSC1)C1=CNC=N1 ZGOVYTPSWMLYOF-QEADGSHQSA-N 0.000 description 2
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 2
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 2
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001020 neural plate Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 2
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 2
- NTSBZVCEIVPKBJ-UHFFFAOYSA-N 1-azakenpaullone Chemical compound C1C(=O)NC2=CC=CN=C2C2=C1C1=CC(Br)=CC=C1N2 NTSBZVCEIVPKBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JCSGFHVFHSKIJH-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4-dichlorophenyl)-4-(1-methyl-3-indolyl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound C12=CC=CC=C2N(C)C=C1C(C(NC1=O)=O)=C1C1=CC=C(Cl)C=C1Cl JCSGFHVFHSKIJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGTAEYDIDMGJLX-UHFFFAOYSA-N 3-(3-aminophenyl)-4-(1-methylindol-3-yl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound C12=CC=CC=C2N(C)C=C1C(C(NC1=O)=O)=C1C1=CC=CC(N)=C1 RGTAEYDIDMGJLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-(6-hydrazinyl-6-oxohexyl)pentanamide Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCCCC(=O)NN)SC[C@@H]21 IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 235000015178 Asplenium bulbiferum subsp bulbiferum Nutrition 0.000 description 1
- 244000178908 Asplenium bulbiferum subsp bulbiferum Species 0.000 description 1
- 102100028845 Biogenesis of lysosome-related organelles complex 1 subunit 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000008137 Bone Morphogenetic Protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101100287724 Caenorhabditis elegans shk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010011469 Crying Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000632511 Daviesia arborea Species 0.000 description 1
- 102100030013 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 101710199605 Endoribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 102100022975 Glycogen synthase kinase-3 alpha Human genes 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100437724 Homo sapiens BLOC1S2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000903717 Homo sapiens Glycogen synthase kinase-3 alpha Proteins 0.000 description 1
- 206010065042 Immune reconstitution inflammatory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 101100509424 Mus musculus Itsn1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101100384965 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cya-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101150024689 OST3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 102000004590 Peripherins Human genes 0.000 description 1
- 108010003081 Peripherins Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710113029 Serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 101100226845 Strongylocentrotus purpuratus EGF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- JDSJDASOXWCHPN-UHFFFAOYSA-N TDZD-8 Chemical compound O=C1N(C)SC(=O)N1CC1=CC=CC=C1 JDSJDASOXWCHPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038313 Transcription factor E2-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- HUDSYNWJCPDHLL-CJLVFECKSA-N [(E)-[2-(6-bromo-2-hydroxy-1H-indol-3-yl)indol-3-ylidene]amino] acetate Chemical compound CC(=O)O\N=C1\C(=Nc2ccccc12)c1c(O)[nH]c2cc(Br)ccc12 HUDSYNWJCPDHLL-CJLVFECKSA-N 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009815 adipogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 108010054176 apotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000000399 corneal endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004029 cranial neural crest cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- ZSWFCLXCOIISFI-UHFFFAOYSA-N endo-cyclopentadiene Natural products C1C=CC=C1 ZSWFCLXCOIISFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 210000001061 forehead Anatomy 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000000933 neural crest Anatomy 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000002488 outer root sheath cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005047 peripherin Anatomy 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000007651 self-proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- YRWWOAFMPXPHEJ-OFBPEYICSA-K sodium L-ascorbic acid 2-phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP([O-])([O-])=O)=C1[O-] YRWWOAFMPXPHEJ-OFBPEYICSA-K 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004071 soot Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000023895 stem cell maintenance Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000013334 tissue model Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0623—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
- C12N5/0626—Melanocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/135—Platelet-derived growth factor [PDGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Винахід стосується способу отримання клітин нервового гребня, який включає стадії: (1) отримання клітини нервового гребня; та (2) суспензійного культивування клітин нервового гребня в середовищі, яке містить інгібітор GSK3β та основний фактор росту фібробластів (bFGF), при цьому середовище містить інгібітор GSK3β в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється CHIR99021 в концентрації вище ніж 1 мкM та менше ніж 5 мкM.
Description
Галузь техніки
Представлений винахід стосується способу отримання клітини нервового гребня, способу забезпечення можливості проліферації клітин нервового гребня, середовища, замороженого вихідного розчину, та способу отримання різних типів клітин із клітин нервового гребня. Більш конкретно, представлений винахід стосується способу отримання клітини нервового гребня, способу забезпечення можливості клітини нервового гребня проліферації, середовища для застосування в даних способах, замороженого вихідного розчину, який містить клітини нервового гребня, та способу отримання різних типів клітин, в яких може бути індукована диференціація клітин нервового гребня.
Передумови створення винаходу
Клітини нервового гребня (МСС) являють собою клітини, які розвиваються між нейроектодермою та епідермальною ектодермою, коли нервова трубка формується з нейронної пластини під час раннього розвитку. Дані клітини мають мультипотентність для диференціювання в багатьох типах клітин, таких як нервові клітини, гліальні клітини, мезенхімальні стромальні клітини, кісткові клітини, хондроцити, рогівкові клітини та пігментні клітини, та здатність до самопроліферації. Така мультипотентність та здатність до самопроліферації свідчать про корисність клітин нервового гребня як клітинного лікарського засобу для регенеративної медицини. Таким чином, існує попит на методику ефективного підтримування або проліферації клітин нервового гребня.
Непатентна література 1 зазначає, що клітини нервового гребня індукуються з людських індукованих плюрипотентних стовбурових клітини (РЗС5), та мезенхімальні стромальні клітини або подібні далі індукуються із клітин нервового гребня. В непатентній літературі 1, клітини нервового гребня збережено культивуються із застосуванням адгезивної культури, використовуючи середовища, доповнені інгібітором ТОЕВ, епідермальним фактором росту (ЕСЕ) та основним фактором росту фібробластів (БЕСЕ (також називається як ЕСЕ2)).
Непатентна література 2 зазначає, що клітини нервового гребня індукуються з нервової трубки курячого ембріона, та гліальні клітини або подібні, крім того, індукуються з клітин нервового гребня. В непатентній літературі 2, клітини нервового гребня збережено культивуються із застосуванням суспензійної культури, використовуючи середовища, доповнені курячими ембріональними екстрактами, інсуліноподібним фактором росту (ІСЕ), БЕСЕ та ретиноєвою кислотою (КА).
Непатентна література 3 зазначає, що клітини нервового гребня індукуються з людських ембріональних стовбурових клітин (Е5С5) або людських іІРЗС, та гладких м'язових клітин або подібні додатково індукуються з клітин нервового гребня. В непатентній літературі 3, клітини нервового гребня збережено культивуються із застосуванням адгезивної культури, використовуючи середовища, доповнені інгібітором С5КЗВ та інгібітором ТОД.
Непатентна література 4 зазначає, що клітини нервового гребня індукуються з людських іІР5С та підтримуються із застосуванням адгезивної культури або суспензійної культури, використовуючи середовища, доповнені інгібітором С5КЗВ, інгібітором ТОЕД, ЕСЕ та БЕСЕ. Непатентна література 4 розкриває, що кількість та співвідношення клітин нервового гребня в клітинній популяції, яка культивується в підтримуваній культурі із застосуванням адгезивної культури, зменшувались в залежності від концентрації в межах концентраційного діапазону БЕСЕ від 0 пг/мл до 10 нг/мл (дивіться фігури з 5А по 5С). В підтримуваній культурі із застосуванням суспензійної культури, присутність 5ох10-позитивних клітин було підтверджено за рахунок культивування протягом 7 днів, використовуючи 1 мкМ СНІКУ9021, як інгібітор С5КЗр. Однак, чи мала клітина мультипотентність, не визначали.
Жодне із непатентних літературних джерел 1-4 не розкриває, що клітини нервового гребня підтримуються та можуть розмножуватися із застосуванням суспензійної культури, використовуючи середовища, доповнені СНІКУ90О21 з концентрацією вищою, ніж 1 мкМ та БЕСЕ.
Перелік цитувань
Непатентна література
Непатентна література 1: Рикша М. еї аї!., "Оегпімайоп ої тезепспутаї 5іготаї сеї їтот ріпгпроїепі 5іет сеїЇ5 їпгоцдН а пешигаї сгевзі Іпеаде изіпуд зтаї! тоіесше сотрошпаз улій аєїпей теаїа.", Рі о5 Опе, 2014, 9(12)е112291.
Непатентна література 2: Кегов5цо Ї. еї аї!., "СтевтозрНегев: І опд-Гепт Маїпіепапсе ої Мийіроїепі,
Ргетідгаїюгту Мешга! Стевзі 5ієт СеїІв5.", ет Сеї! Верогів, 2015, 5(4):499-507.
Непатентна література 3: Мепепаде? І. еї аї., "МУпі зідпаїпд апа а Зтай раїйулау ріосКаде аїгесі (Ве айегепіайоп ої питап рішгіроїепі 5іет сеїЇв5 о тийПіроїепі пешгаї сгеві сеїІв.", Ргос. Маї). Асад. зсі., 2011, 108(48):19240-5.
Непатентна література 4: НотгіКкігі Т. еї аї,, "6ОХ10-Мапо-Іапієт Реропйег Нитап іІР5 СеїІв; А
Мегзаїйе Тоо! їог Мешгаї! Стезі Незеагсй.", РІ о5 Опе, 2017, 12(1):60170342.
Суть винаходу
Технічна проблема
Клітини нервового гребня спочатку мають мультипотентність для диференціювання в багатьох типах клітин, таких як нервові клітини, гліальні клітини, мезенхімальні стромальні клітини, кісткові клітини, хондроцити, рогівкові клітини та пігментні клітини. Однак, культура клітин нервового гребня, як є відомим, поступово знижує мультипотентність та зменшує типи клітин, на які клітини нервового гребня можуть диференціюватися.
Основним завданням представленого винаходу є створення технології культивування та проліферації клітин нервового гребня, які зберігають мультипотентність протягом тривалого періоду.
Вирішення проблеми
Для досягнення даної мети, представлений винахід передбачає наступне з || до (2161. 1 Спосіб отримання клітини нервового гребня, який включає стадії: (1) отримання клітин нервового гребня; та (2) суспензійного культивування клітин нервового гребня в середовищі, яке містить інгібітор СЗКЗВ та основний фактор росту фібробластів (БЕСЕ), при цьому середовище містить інгібітор 5З5КЗД з концентрацією, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКУ9021 з концентрацією вищою, ніж 1 мкМ.
Па| Спосіб отримання відповідно до |1|, в якому концентрація інгібітору З5КЗД представляє собою концентрацію, яка демонструє ефект, еквівалентний дії яка демонструється СНІК9УО9021 з концентрацією вищою, ніж 1 мкМ, та меншою, ніж 5 мкМ.
ІБ Спосіб отримання відповідно до (1), в якому ефект оцінюють на основі інгібіторної активності
ОК інгібітору С5КЗД, при цьому О5КЗВ інгібіторна активність інгібітору 55КЗД визначається за процедурами: () культивування клітин, чия експресія репортерного гена супресується під контролем 5КЗВД, в присутності та за відсутності інгібітору СЗКЗВД; (ї) вимірювання рівня експресії репортерного гена в присутності та за відсутності інгібітору СЗКЗВД; та (її) визначення інгібіторної активності З5КЗД інгібітору С5КЗВ на основі збільшення кількості в рівні експресії репортерного гена в присутності інгібітору С5КЗВ по відношенню до рівня експресії репортерного гена за відсутності інгібітору С5КЗВД. (2) Спосіб отримання відповідно до |1|, в якому середовище додатково містить інгібітор ТОЕ ВД.
ІЗІЇ Спосіб отримання відповідно до |1|, в якому середовище представляє собою середовище СОМ.
І4Ї Спосіб отримання відповідно до (1|, в якому середовище додатково містить епідермальний фактор росту (ЕСЕ).
ІТЇ Спосіб отримання відповідно до (1), в якому інгібітор СО5КЗВ представляє собою щонайменше один член, вибраний з групи, яка складається із СНІКУ99021, СР21К7, СНІКО8014, І У2090314, кенпауллона, АК-АО144-18, 1070-68, 58216763, ВІО, ТМ/5-119 та 58415286.
ІЄЇ Спосіб отримання відповідно до (5), в якому інгібітор О5КЗВД представляє собою СНІКУ90О21.
Іба| Спосіб отримання відповідно до |б|Ї, в якому СНІКУ99021 має концентрацію вищу, ніж 1 мкМ, та меншу, ніж 5 мкМ.
ІЄБІЇ Спосіб отримання відповідно до |ба)|, в якому СНІКУ9021 має концентрацію 2 або вище, та 4,5
МКМ або нижче.
Ібс| Спосіб отримання відповідно до |5), в якому інгібітор О5КЗВ представляє собою СР21К7.
ІбЯ| Спосіб отримання відповідно до |бс|, в якому СР21К7 має концентрацію 0,5 або вище та 1 мкМ або нижче.
І/ Спосіб отримання відповідно до |2|, в якому інгібітор ТОЕДВ представляє собою щонайменше один член, вибраний з групи, яка складається із 58431542, А83-01, І 0М193189, М/піЗа/ВІО, ВМРА, сму788388, 5М16, ІМ-1130, СУУбЄб6О04 та 58505124.
І7/а| Спосіб отримання відповідно до будь-якого з || до Г7), в якому БЕСОЕ має концентрацію від 20 до 40 нг/мл.
ІВІ Спосіб отримання відповідно до |1|, в якому на стадії (2), клітини нервового гребня пересівають кожні від 5 до 8 днів після інокулювання.
ІЗ|Ї Спосіб отримання відповідно до ||, в якому стадія (1) представляє собою стадію індукування диференціації стовбурових клітин в клітини нервового гребня.
І19)| Спосіб проліферації клітини нервового гребня, який включає стадію: (І) суспензійного культивування клітин нервового гребня в середовищі, яке містить інгібітор С5КЗД та основний фактор росту фібробластів (БЕСЕ), де середовище містить інгібітор О5КЗДВ в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКУ9О21 з концентрацією вищою, ніж 1 мкМ.
ПОа| Спосіб проліферації відповідно до (101), в якому концентрація інгібітору С5КЗД представляє собою концентрацію, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКУ9О21 з концентрацією вищою, ніж 1 мкМ, та меншою, ніж 5 мкМ.
МОБ) Спосіб проліферації відповідно до (10Ї, в якому середовище додатково містить інгібітор
Тов.
Осі Спосіб проліферації відповідно до (10), в якому середовище представляє собою середовище
СОМ.
М1Оа4| Спосіб проліферації відповідно до (|(10Ї, в якому середовище додатково містить епідермальний фактор росту (ЕСЕ).
П1Оє)| Спосіб проліферації відповідно до |10|, в якому інгібітором 55КЗД є щонайменше один член, вибраний з групи, яка складається із СНІК99021, СР21К7, СНІКУ8О014, І 72090314, кенпауллона, АК-
АО144-18, 1020-68, 58216763, ВІО, ТМ/5-119 та 58415286.
МОЯ Спосіб проліферації відповідно до (1ОєЇ, в якому інгібітор 55КЗВ представляє собою
СНІН9УЗО21. 109) Спосіб проліферації відповідно до (101, в якому СНІК99021 має концентрацію вищу, ніж 1
МКМ, та меншу, ніж 5 мкМ.
ПОНІ Спосіб проліферації відповідно до (109), в якому СНІК99021 має концентрацію 2 мкМ або вище та 4,5 мкМ або нижче.
П10ї| Спосіб проліферації відповідно до |10є), в якому інгібітор О5КЗВ представляє собою СР21К7.
ПОЇ Спосіб проліферації відповідно до |10їЇ, в якому СР21К7 має концентрацію 0,5 мкМ або вище та 1 мкМ або нижче.
МОКІ Спосіб проліферації відповідно до |1ОБІ, в якому інгібітором ТОЕД є щонайменше один член вибраний з групи, яка складається із 58431542, А83-01, І 0М193189, М/піЗа/ВІО, ВМРА, сУу788388,
ЗМ16, ІМ-1130, СУУббО4 та 58505124.
МО Спосіб проліферації відповідно до |10Ї, в якому на стадії (І), клітини нервового гребня пересівають кожні від 5 до 8 днів після інокулювання. 1 Середовище, яке містить інгібітор 55КЗВ, основний фактор росту фібробластів (БЕСЕ) та клітини нервового гребня, при цьому середовище містить інгібітор С5КЗВ в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКУ9021 з концентрацією вищою, ніж 1
МКМ. та) Середовище відповідно до (11), в якому концентрація інгібітору 55КЗД представляє собою концентрацію, яка демонструє ефект, еквівалентний дії яка демонструється СНІК9УО9021 з концентрацією вищою, ніж 1 мкМ та меншою, ніж 5 мкМ. 121) Середовище відповідно до (11), яке додатково містить інгібітор ТОЕВД. (13) Середовище відповідно до (11), в якому середовище представляє собою СОМ середовище.
І14| Середовище відповідно до |11), яке додатково містить епідермальний фактор росту (ЕСЕ).
І15) Середовище відповідно до |111, в якому інгібітор ЗЗКЗВД представляє собою щонайменше один член, вибраний з групи, яка складається із СНІК99021, СР21К7, СНІКУ8014, І 2090314, кенпауллона,
АВ-АО144-18, 070-868, 58216763, ВІО, ТМ/5-119 та 58415286.
І16Ї Середовище відповідно до (151, в якому інгібітор СОЗКЗД представляє собою СНІКУ9021.
Іба| Середовище відповідно до |(16)Ї, в якому СНІК99021 має концентрацію вищу, ніж 1 мкМ та меншу, ніж 5 мкМ. (165) Середовище відповідно до (1ба)|, в якому СНІКУО9021 має концентрацію 2 мкМ або вище, та 4,5 мкМ або нижче. (16с| Середовище відповідно до (15), в якому інгібітор О5КЗВД представляє собою СР21К7.
І164| Середовище відповідно до (1бсі, в якому СР21К7 має концентрацію 0,5 мкМ або вище, та 1
МКМ або нижче.
І17| Середовище відповідно до (121, в якому інгібітор ТОЕД представляє собою щонайменше один член, вибраний з групи, яка складається із 58431542, А83-01, І 0М193189, М/піЗа/ВІО, ВМРА, сму788388, 5М16, ІМ-1130, СУУбЄб6О04 та 58505124.
І18)| Заморожений вихідний розчин, який містить клітини нервового гребня, отримані за способом отримання відповідно до |11.
І18а| Заморожений вихідний розчин відповідно до (18), при цьому заморожений вихідний розчин отримують за стадіями: відокремлення клітин нервового гребня, отриманих за стадіями способу отримання відповідно до
М; та суспендування відокремлених клітин нервового гребня в розчині для зберігання клітин, з подальшим заморожуванням.
І19| Спосіб отримання нервових клітини, гліальних клітин, мезенхімальних стромальних клітин, кісткових клітин, хондроцитів, рогівкових клітин або пігментних клітин, який включає стадії: () суспензійного культивування клітин нервового гребня в середовищі, яке містить інгібітор СЗКЗД та основний фактор росту фібробластів (БЕСЕ), при цьому середовище містить інгібітор С5КЗВД в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії яка демонструється СНІК9У9021 з концентрацією вищою, ніж 1 мкМ; та (ї) диференціювання клітин нервового гребня, отриманих на стадії (ї) в клітини щонайменше однієї лінії вибраної з групи, яка складається із нервових клітин, гліальних клітин, мезенхімальних стромальних клітин, кісткових клітин, хондроцитів, рогівкових клітин та пігментних клітин.
П19а| Спосіб отримання відповідно до (19), в якому концентрація інгібітору 55КЗДВ представляє собою концентрацію, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКУО9021 в концентрації вищій, ніж 1 скМ та меншій, ніж 5 мкМ.
І19БІ Спосіб отримання відповідно до (191, в якому середовище додатково містить інгібітор ТОЕВД. (19с| Спосіб отримання відповідно до (19), в якому середовище представляє собою середовище
СОМ. (194) Спосіб отримання відповідно до (19), в якому середовище додатково містить епідермальний фактор росту (ЕСЕ).
М19є|Ї Спосіб отримання відповідно до (19), в якому інгібітор 55КЗВ представляє собою щонайменше один член, вибраний з групи, яка складається із СНІК99021, СР21К7, СНІКОВ8014,
І у2090314, кенпауллона, АК-АО144-18, 1070-68, 58216763, ВІО, ТМ/5-119 та 58415286.
М19Я Спосіб отримання відповідно до (19єЇ, в якому інгібітор 5ЗКЗВ представляє собою
СНІН9УЗО21. (199) Спосіб отримання відповідно до |191Ї, в якому СНІКУО9021 має концентрацію вищу, ніж 1 мкМ, та меншу, ніж 5 мкМ.
І19п| Середовище відповідно до (1994), в якому СНІКУО9021 має концентрацію 2 мкМ або вище та 4,5 мкМ або нижче. 19і|Ї Середовище відповідно до |19єї|, в якому С5КЗВ інгібітор представляє собою СР21К7. 191| Спосіб отримання відповідно до |19іЇ, в якому СР21К7 має концентрацію 0,5 мкМ або вище та 1 мкМ або нижче.
МОК| Спосіб отримання відповідно до (195), в якому інгібітор ТОЕВ представляє собою щонайменше один член, вибраний з групи, яка складається із 58431542, А83-01, І 0М193189,
МупіЗа/ВІО, ВМРА, СУ/788388, 5М16, ІМ-1130, СУУбЄбО4 та 58505124.
І19Ц Спосіб отримання відповідно до |19), в якому на стадії (І), клітини нервового гребня пересівають кожні від 5 до 8 днів після інокулювання.
І20| Спосіб культивування клітин нервового гребня, які мають мультипотентність протягом тривалого періоду, який включає стадії: (1) отримання клітини нервового гребня; та (2) суспензійне культивування клітин нервового гребня в середовищі, яке містить інгібітор СО5КЗД та основний фактор росту фібробластів, при цьому середовище містить інгібітор С5КЗ3В в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКУ9О21 з концентрацією вищою, ніж 1 мкМ. (20а| Спосіб культивування відповідно до (20), в якому концентрація інгібітору СЗКЗВ представляє собою концентрацію, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКУ9О21 з концентрацією вищою, ніж 1 мкМ та меншою, ніж 5 мкМ.
І2ОБ| Спосіб культивування відповідно до |(20Ї, в якому середовище додатково містить інгібітор
Тов. (2ос| Спосіб культивування відповідно до |20Ї, в якому середовище представляє собою середовище СОМ. (204| Спосіб культивування відповідно до (|20Ї, в якому середовище додатково містить епідермальний фактор росту (ЕСЕ). (20є| Спосіб культивування відповідно до (20Ї, в якому інгібітор 55КЗ3В представляє собою щонайменше один член, вибраний з групи, яка складається із СНІКО9021, СР21К7, СНІКУ8014,
І у2090314, кенпауллона, АК-АО144-18, 1070-68, 58216763, ВІО, ТМ/5-119 та 58415286.
І2О1| Спосіб культивування відповідно до (20єЇ, в якому інгібітор 5КЗВ представляє собою
СНІН9УЗО21. (209| Спосіб культивування відповідно до (201, в якому СНІКУО9021 має концентрацію вищу, ніж 1
МКМ, та меншу, ніж 5 мкМ. (20п| Спосіб культивування відповідно до (20949|, в якому СНІК99021 має концентрацію 2 мкМ або вище та 4,5 мкМ або нижче.
І20ї| Спосіб культивування відповідно до |(20е|, в якому інгібітор 55КЗВ представляє собою
СР21Н7.
І20ОЇЇ Спосіб культивування відповідно до |20ЇЇ, в якому СР21К7 має концентрацію 0,5 мкМ або вище та 1 мкМ або нижче.
І2ОК| Спосіб культивування відповідно до |І2ОБ|), в якому інгібітор ТОВ представляє собою щонайменше один член, вибраний з групи, яка складається із 58431542, А83-01, І 0М193189,
МупіЗа/ВІО, ВМРА, СУ/788388, 5М16, ІМ-1130, СУУбЄбО4 та 58505124.
І20ОІ| Спосіб культивування відповідно до |20)Ї), в якому на стадії (І), клітини нервового гребня пересівають кожні від 5 до 8 днів після інокулювання. (21| Застосування середовища, яке містить основний фактор росту фібробластів та інгібітор
СКЗ в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКУ9О21 з концентрацією вищою, ніж 1 мкМ, для культивування клітин нервового гребня, які мають мультипотентність протягом тривалого періоду. (21а| Застосування основного фактору росту фібробластів та інгібітору СЗКЗВД в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКУ9021 в концентрації вищою, ніж 1
МКМ, для культивування клітин нервового гребня. (215) Застосування основного фактору росту фібробластів та інгібітору С5КЗВД з концентрацією, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКУ9021 в концентрації вищій, ніж 1
МКМ, для отримання середовища для клітин нервового гребня.
Як використовується в даному документі, "плюрипотентність" означає здатність до можливого диференціювання в тканини та клітини, які мають варіативні різні форми та функції, та є здатними щодо диференціювання в клітини будь-якої лінії З зародкових шарів. "Плюрипотентність" відрізняється від "тотипотентності", яка полягає в можливості бути здатними щодо диференціювання в будь-яку тканину живого організму, включаючи плаценту, тоді як плюрипотентні клітини не можуть диференціюватися в плаценту, та, таким чином, не мають здатності утворювати індивідум. "Мультипотентність" означає можливість бути здатними до диференціювання в багато та обмежену кількість ліній клітин. Наприклад, мезенхімальні стовбурові клітини, гематопоетичні стовбурові клітини, нервові стовбурові клітини є мультипотентними, але не плюрипотентними. Клітини нервового гребня мають мультипотентність для диференціювання в клітини, такі як нервові клітини, гліальні клітини, мезенхімальні стромальні клітини, кісткові клітини, хондроцити, рогівкові клітини та пігментні клітини.
Як використовується в даному документі, "культивування" відноситься до підтримування, проліферації (росту), талабо диференціації клітин в середовищі іп міо. "Культивування" означає підтримування клітини та/або можливість клітини до проліферації (росту) та/"або диференціювання з тканини або організму, наприклад, в чашці або колбі для культивування клітин. "Адгезивна культура" означає культуру в стані, коли клітини є прикріпленими до контейнера, наприклад, в стані, коли клітини є прикріпленими до чашки або колби для культивування клітин, виготовленої із стерилізованого пластику (або пластику з покриттям) в присутності відповідного середовища. "Суспензійна культура" означає культуру в стані, коли клітини є диспергованими як одиничні клітини або як клітинні сфери, кожна з яких складається з двох або більше клітин у відповідному середовищі без прикріплення до контейнера. "Культивування з експансією" означає культивування з метою дозволити проліферацію бажаним клітинам. "Інгібітор С5КЗВД" представляє собою речовину, яка має інгібіторну активність по відношенню до
О5КЗВ (глікоген-синтазна кіназа 3рВ). СЗКЗ |(глікоген-синтазна кіназа 3) представляє собою серин/треонін-протеїнкіназу та бере участь у багатьох сигнальних шляхах, пов'язаних з продукуванням глікогену, апоптозом, підтримуванням стовбурових клітин, тощо. С5КЗ має 2 ізоформи са та В. "Інгібітор 55К3Д", який використовується в представленому винаході, не є особливо обмеженим за умови, що інгібітор 55К3ВД має інгібіторну активність 55К3ЗВД. Інгібітор О5КЗДВ може представляти собою речовину, яка має як інгібіторну активність по відношенню до С5КЗРр, так і інгібіторну активність по відношенню до С5КЗа. "Інгібітор ТОД" представляє собою речовину, яка має інгібіторну активність по відношенню до
ТОВ (трансформуючий фактор росту В). ТОЕВ представляє собою цитокін, який зв'язується з двома типами рецепторів серин/греонін-протеїнкіназу та контролює клітинну проліферацію, клітинну диференціацію, загибель клітин тощо за допомогою сигнальної трансдукції, головним чином, для активування тай (К-Зтадй). Приклади речовини, яка має інгібіторну активність, включають речовини, які інгібують зв'язування ТОД зі своїм рецептором, та речовини, які інгібують сигнали в прямому напрямку після зв'язування ТОЕДВ зі своїм рецептором. Приклади сигналів в прямому напрямку включають фосфорилювання рецептора ТОЕДВІ рецептором ТОЕВІЇ, та фосфорилювання тай фосфорильованим рецептором ТОДІ. "Інгібітор ТОД", який використовується в представленому винаході, не є особливо обмеженим за умови, що інгібітор ТОЕВ має інгібіторну активність ТОЕВД.
Як використовується в даному документі, "маркер" представляє собою "маркерний протеїн" або "маркерний ген" та означає протеїн, який специфічно експресується на клітинній поверхні, в цитозолі, та/або в ядрі заздалегідь визначеного клітинного типу або його гена. Маркер може представляти собою маркер позитивного відбору або маркер негативного відбору. Переважно, маркер представляє собою клітинний поверхневий маркер. Зокрема, клітинний поверхневий маркер позитивного відбору дозволяє концентрувати, виділяти, та/або виявляти живі клітини.
Маркерний протеїн може бути виявлений з використанням імунологічного аналізу, наприклад,
ЕПЗА, імунофарбування, або проточної цитометрії, використовуючи антитіло, специфічне для маркерного протеїну. Антитіло, яке зв'язується з конкретною амінокислотною послідовністю маркерного протеїну або конкретним цукровим ланцюгом, зв'язаним із маркерним протеїном, тощо, може використовуватись як антитіло, специфічне для маркерного протеїну. У випадку внутрішньоклітинно експресованого маркерного протеїну, який не з'являється на поверхні клітин (наприклад, транскрипційний фактор або його субодиниця), маркерний протеїн, що викликає зацікавленість, може бути виявлений за рахунок експресії маркерного протеїну з репортерним протеїном та детектування репортерного протеїну (наприклад, Непатентна література 4). Даний спосіб переважно може використовуватися, коли відповідний клітинний поверхневий маркер не є знайденим.
Маркерний ген може бути виявлений з використанням способу ампліфікування та/або детектування нуклеїнової кислоти, відомої в даній галузі, наприклад, ПЛР зі зворотною транскрипцією, мікроматричний аналіз, біочіп, або секвенування РНК.
Як використовується в даному документі, "експресія" визначається як транскрипція та/або трансляція певної нуклеотидної послідовності, керованої внутрішньоклітинним промотором.
Як використовується в даному документі, термін "містять/містить" або "який містить" стосується включення елемента(ів), який слідує за словом без його обмежень. Таким чином, це передбачає включення елементайів), який слідує за словом, але не передбачає виключення будь-якого іншого елемента.
Як використовується в даному документі, термін "приблизно" або "близько" стосується значення, яке може змінюватися до плюс або мінус 30 95, 25 У, 20 95, 15 95, 10 90, 8 У, 6 У, 5 90, 4 У, З У, 2 о, або 1 95 від еталонного значення. Переважно, термін "приблизно" або "близько" стосується діапазону від плюс або мінус 15 95, 10 У, 5 Уо, або 1 95 від еталонного значення.
Переважні ефекти винаходу
Представлений винахід передбачає методику культивування та проліферації клітин нервового гребня, які підтримують мультипотентність, протягом тривалого періоду.
Короткий опис креслень
ІФігура 1) Фігура 1 представляє собою графік, який показує зміну загальної кількості клітин після початку культивування з експансією клітин нервового гребня (Приклад 1). Ордината показує загальну кількість клітин, та "1.Е-" представляє собою множник 10. Наприклад, "1.Е-04" означає 10000 клітин.
Абсциса показує дні культивування.
ІФігура 2) Фігура 2 представляє собою графік, який показує зміну відсотка 5ОХ10 експресійно- позитивних клітин після початку культивування з експансією клітин нервового гребня (Приклад 1).
Ордината показує відсоток 5ОХ10 експресійно-позитивних клітини (95). Абсциса показує дні культивування.
ІФігура З3| Фігура З представляє собою графік, який показує результати зміни вимірювання загальної кількості клітин від клітин нервового гребня, експансійно-культивованих шляхом встановлення концентрацій БЕСЕ та ЕСЕ до 20 нг/мл (А) або 40 нг/мл (В) та встановлення концентрацій СНІКУ99021 до 1, 2, З або 5 мкМ (зазначено 1х, 2х, Зх, та 5х, відповідно) (Приклад 2).
Ордината показує загальну кількість клітин, та "1.Е-" представляє собою множник 10. Наприклад, "1.Е04" означає 10000 клітин. Абсциса показує дні культивування.
ІФігура 4| Фігура 4 представляє собою графік, який показує результати зміни вимірювання загальної кількості клітин від клітин нервового гребня, експансійно-культивованих шляхом встановлення концентрацій БЕСЕ та ЕСЕ до 40 нг/мл та встановлення концентрацій СНІКУ9О21 до 3, 3,5, 4, 4,5 або 5 мкМ (Приклад 2). Ордината показує загальну кількість клітин, та "1.Е-" представляє собою множник 10.
ІФігура 5) Фігура 5 представляє собою графік, який показує результати вимірювання зміни відсотка 5ОХ10 експресія-позитивних клітин від клітин нервового гребня, експансійно-культивованих шляхом встановлення концентрацій БЕСЕ та ЕСЕ до 20 нг/мл (А) або 40 нг/мл (В), та встановлення концентрацій СНІКУО9021 до 1, 2, З або 5 рМ (зазначено їх, 2х, Зх, та Ох, відповідно) (Приклад 2).
Ордината показує відсоток 5ОХ10 експресійно-позитивних клітин (90). Абсциса показує дні культивування.
ІФігура 6Ї Фігура Є представляє собою графік, який показує результати вимірювання зміни відсотка 5ОХ10 експресія-позитивних клітин від клітин нервового гребня, експансійно-культивованих шляхом встановлення концентрацій БЕСЕ та ЕСЕ до 40 нг/мл та встановлення концентрацій СНІКУ9О21 до 3, 3,5, 4, 4,5 або 5 мкМ (Приклад 2). Ордината показує відсоток 5ОХ10 експресійно-позитивних клітин (95). Абсциса показує дні культивування.
ІФігура 7| Фігура 7 представляє собою графік, який показує зміну відсотка 5ОХ10 експресійно- позитивних клітин після початку культивування з експансією клітин нервового гребня, використовуючи
СР2І1К?7 як інгібітор 55К3В (Приклад 3). Ордината показує відсоток ЗОХ10 експресійно-позитивних клітин (95). Абсциса показує дні культивування.
ІФігура 8| Фігура 8 представляє собою графік, який показує результати вимірювання зміни загальної кількості клітин від клітин нервового гребня, експансійно-культивованих шляхом встановлення концентрації БЕСЕ до 10, 12,5, 15,0, або 17,5 нг/мл (Приклад 8). Ордината показує загальну кількість клітин, та "1.Е-" представляє собою множник 10.
ІФігура 9| Фігура 9 представляє собою графік, який показує результати вимірювання зміни відсотка 5ОХ10 експресійно-позитивних клітин від загальної кількості клітин, клітин нервового гребня експансійно-культивованих шляхом встановлення концентрації БЕСЕ до 10, 12,5, 15,0, або 17,5 нг/мл (Приклад 8). Ордината показує відсоток ЗОХ10 експресійно-позитивних клітин (95). Абсциса показує дні культивування.
Опис варіантів здійснення
Далі в даному документі, будуть описані відповідні режими здійснення представленого винаходу.
Варіанти здійснення, описані нижче, надаються тільки для ілюстрації типових варіантів здійснення представленого винаходу. Обсяг представленого винаходу не слід тлумачити як такі, що обмежують дані варіанти здійснення.
ІСпосіб отримання клітини нервового гребня та спосіб проліферації клітин нервового гребня|)
Спосіб отримання клітин нервового гребня відповідно до представленого винаходу включає стадії, наведені нижче. З даних стадій, стадія (2) представляє собою, зокрема, стадію проліферації клітин нервового гребня відповідно до представленого винаходу. (1) Отримання клітин нервового гребня; та (2) суспензійне культивування клітин нервового гребня в середовищі, яке містить інгібітор СЗКЗД та основний фактор росту фібробластів (БЕСЕ), при цьому середовище містить інгібітор 55КЗД з концентрацією, який демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІК9УО9021 з концентрацією вищою, ніж 1 мкМ.
ІСтадія (1) отримання клітин нервового гребня)
Стадія (1) отримання клітин нервового гребня представляє собою стадію отримання клітин нервового гребня, які піддають стадії (2). Приклади способу отримання клітин нервового гребня на стадії (1) включають, але конкретно не обмежуються ними, спосіб індукування диференціації стовбурових клітин в клітини нервового гребня, спосіб придбання комерційно доступних клітин нервового гребня, та спосіб збирання клітин нервового гребня, які зустрічаються в природі.
В одному варіанті здійснення представленого винаходу, для того, щоб отримати клітини нервового гребня, які піддають стадії (2), може бути індукована диференціація стовбурових клітин в клітини нервового гребня.
Приклади "стовбурових клітин", які можуть використовуватися в представленому винаході включають плюрипотентні стовбурові клітини. "Плюрипотентні стовбурові клітини", які можуть використовуватися в представленому винаході відносяться до стовбурових клітин, які можуть диференціюватися в тканини та клітини, які мають варіативні різні форми та функції, та мають здатність диференціюватися в клітини будь-якої лінії З зародкових шарів (ендодерма, мезодерма та ектодерма). Приклади таких включають, але конкретно не обмежуються ними, ембріональні стовбурові клітини (ЕбС5), ембріональні стовбурові клітини, отримані з клонованих ембріонів, отриманих шляхом ядерної трансплантації, сперматогоніальні стовбурові клітини, ембріональні зародкові клітини, та індуковані плюрипотентні стовбурові клітини (в даному документі також називається як "ІРЗС5"). "Мультипотентні стовбурові клітини", які можуть використовуватися в представленому винаході, відносяться до стовбурових клітин, які мають можливість бути здатними щодо диференціювання в множину та обмежену кількість ліній клітин. Приклади "мультипотентних стовбурових клітин", які можуть використовуватися в представленому винаході включають стовбурові клітини зубної пульпи, стовбурові клітини, похідні оральної слизової оболонки, стовбурові клітини волосяного фолікула, та соматичні стовбурові клітини, отримані з культивованих фібробластів або стовбурових клітин кісткового мозку. Плюрипотентні стовбурові клітини переважно представляють собою ЕЗС та іРЗС.
Доступні "ЕБС" включають мишачі Е5С, такі як різні мишачі Е5С лінії, створені в Сепіои5 Тагдеїпд
І арогасогу, Кікеп (Іпзійше ої РПпузіса! апа Спетіса! Кезеагсі)), та подібні, та людські Е5С, такі як різні людські Е5С лінії, створені Опімегейу ої М/ізсопвіп, МІН, КіКеп, Куоїо Опімегейу, Майопаї! Сепіег Тог Спа
Неапййп апа ОемеІортепі, СеїПапів, та подібні. Наприклад, лінії СНВ-1-СНВ-12, лінія КОЕ51, лінія
КОЕЗ2, та лінії НОЕЄ51-НОЕ528, які поширюються Еб5БІ Віо, лінія НІ та лінія НО, які поширюються
УміСеї! Кезеагсі, та лінія КПЕ5-1, лінія КПЕ5-2, лінія КПЕ5-3, лінія КПЕ5-4, лінія КПЕ5-5, лінія 55Е51, лінія х5ЕЗ2, та лінія 55Е53, які поширюються КіКеп можуть використовуватись, як людські лінії ЕС. "Індуковані плюрипотентні стовбурові клітини" відносяться до клітин, які отримують шляхом перепрограмування соматичних клітин ссавців або недиференційованих стовбурових клітин шляхом введення конкретних чинників (чинників ядерного перепрограмування). В даний час існують різні "індуковані плюрипотентні стовбурові клітини" та ІР5С, створені Хатапака, єї а. шляхом введення 4 факторів ОсіЗ3/4, 5ох2, КІ4, с-Мус в мишачі фібробласти. (ТаКапавзпі К, МХатапака 5., СеїїІ, (2006) 126: 663-676); ІР5С, отримані з людських клітин, створених шляхом введення аналогічних 4 факторів в людські фібробласти (ТаКайназні К, Хатапака 5., еї а!. СеїІ, (2007) 131: 861-872.); Мапод-іР5сС, створені шляхом сортування клітин з використанням експресії Мапод як індикатор після введення 4 факторів (Окна, К., ІспізакКа, Т., та Матапака, 5. (2007). Майшге 448, 313-317); ІР5С, отримані за способом, який не використовує с-Мус (МаКадама М, МатапакКа 5., еї аіІ. Маїште Віоїесппоіоду, (2008) 26, 101-106);
ІРЗС, створений шляхом введення 6 факторів за способом, який не використовує віруси (ОкКійа К еї аї.
Маї. Мешоа5 2011 Мау; 8(5): 409-12, ОКйа К еї аІ. Стовбурових клітин. 31 (3) 458-66); та подібні, можуть також використовуватися. Крім того, індуковані плюрипотентні стовбурові клітини, створені шляхом введення 4 факторів ОСТ3/4, 5ОХ2, МАМО, та І ІМ28 за Тпотзвзоп еї аї. (Ми 9., Тпотвоп ОА. еї а!І., Зсіеєпсе (2007) 318: 1917-1920.); індуковані плюрипотентні стовбурові клітини, отримані Оаїеу еї аї. (Рак ІН, ОаіІєу СО.еї аї., Майте (2007) 451: 141-146); індуковані плюрипотентні стовбурові клітини, отримані ЗаКигада еї аЇ. (дарапезе Опехатіпей Раїепі Арріїсайоп Рибіїсайоп Мо. 2008-307007) та подібні, можуть використовуватися.
Крім того, будь-який з відомих індукованих плюрипотентних стовбурових клітин, відомих в даній галузі, описані в усіх опублікованих статтях (наприклад, Пі У., Оіпод 5., еї аіІ.,, Сеії Єїет Сеїї, (2008) Мо!
З, Іввце 5, 568-574; Кіт УВ., 5споїег НЕ., еї аї., Маїиге, (2008) 454, 646-650; Ниапоги 0., Мепоп, БА., єї аІ., Маште Віотеснпоіоду, (2008) 26, Мо. 7, 795-797) або патенти (наприклад, публікація нерозглянутої
Японської патентної заявки Мо. 2008-307007, публікація нерозглянутої Японської патентної заявки Мо. 2008-283972, О52008-2336610, 0О52009-047263, МО2007-069666, М/О2008-118220, МО2008-124133,
МО2008-151058, УМО2009-006930, УМО2009-006997, ММО2009-007852).
Доступні індуковані плюрипотентні клітинні лінії включають різні ІРЗС лінії, створеної МІН, Кікеп,
Куоїо Опімегейу та подібні. Приклади таких людських іІР5С ліній включають лінію НІР5-ВІКЕМ-1 А, лінію
НіІРБ-ВІКЕМ-2А, лінію НІР5-ВІКЕМ-12А, та лінію Міре5-В2 від КіКеп, та лінію 253С1, лінію 253054, лінію 1201С1, лінію 120501, лінію 121082, лінію 138302, лінію 138306, лінію 20187, лінію 40982, лінію 454Е2, лінію 60бА1, лінію 61081, лінію 648А1, лінію 1231А3З, та лінію ЕТ-01504 від Куоїо Опімегейу.
Лінія 1231АЗ є переважною.
Індукування диференціації стовбурових клітин в клітини нервового гребня може здійснюватися відповідно до відомого способу, описаного в літературі (наприклад, Непатентна література 1). У випадку використання, наприклад, людських ІР5С, ІРЗС інокулюються в чашках або подібному, адгезивно культивуються, та потім адгезивно культивуються в середовищі, яке містить інгібітор ТОЕВ та інгібітор С5КЗДВ, та може, таким чином, бути дозволено диференціювання в клітини нервового гребня.
В даному відношенні, середовище, яке використовується, не є конкретно обмеженим, та, наприклад, відповідно використовується середовище Тек та хімічно визначене середовище (СОМ).
Крім того, може використовуватись середовище ВМЕ, середовище ВО, середовище СМ. 1066, середовище Сіаздом МЕМ, оптимізоване середовище МЕМ (ІМЕМ), оптимізоване середовище МОМ (МОМ), середовище 199, середовище Ігла МЕМ, середовище ОМЕМ, середовище ОМЕМ (з високим вмістом глюкози або з низьким вмістом глюкози), середовище ОМЕМ/Е12, середовище Хема, середовище КРМІ 1640, середовище Фішера, та їх змішане середовище, тощо.
Середовище СОМ не є конкретно обмеженим, та, наприклад, може використовуватись середовище, отримане із середовища Дульбекко в модифікації Іскова (виробництва СЕ НеайПпсаге
Уарап Согр.). Як більш конкретний приклад, використовується середовище СОМ, описане в непатентній літературі 1. Середовище СОМ може містити апотрансферин, монотіогліцерин, альбумін сироватки великої рогатої худоби (В5А), інсулін та/або антибіотик.
Період культивування до додавання інгібітору ТОЕРр та інгібітору О5КЗВ може представляти собою період, за який отримують зацікавлену кількість клітин. Даний період культивування не є конкретно обмеженим, та становить, наприклад, від 2 до 6 днів.
Приклади інгібітору ТОЕДВ включають 58431542 (4-(5-бензолі1,З|діоксол-5-іл-4-піридин-2-іл-1 Н- імідазол-2-іл)-бензамід, /4-(4-(1,3-бензодіоксол-5-іл)-5-(2-піридиніл)-1 Н-імідазол-2-іл|-бензамід, 4-|4- (3,4-метилендіоксифеніл)-5-(2-піридил)-1Н-імідазол-2-іл|-бензамід), А83-01 (3-(б-метилпіридин-2-іл)-1- фенілтіокарбамоїл-4-хінолін-4-ілпіразол), ГОоМм193189 (4-І(6-(4-(1-піперазиніл)феніл|піразоло|1,5- а|піримідин-З-іл|-хінолін), МУпіЗа/ВІО (член родини УУпі ЗАД2"7, З'Є)-6-броміндирубін-3'-оксим), ВМРА (кістковий морфогенетичний протеїн 4), 5Уу788388 (4-(4-І(ІЗ-«(піридин-2-іл)-1 Н-піразол-4-іл|-піридин-2- іл|-М-(«тетрагідро-2Н-піран-4-іл)бензамід), ЗМ16 (4-І4-(1,3-бензодіоксол-5-іл)-5-(6б-метил-2-піридиніл)- 1Н-імідазол-2-іл|-біцикло|2.2.2|октан-1-карбоксамід), ІМ-1130 (3-((5-(6б-метил-2-піридиніл)-4-(6- хіноксалініл)-1 Н-імідазол-2-іл|метил|-бензамід), (СУУбб6О4 /(2-феніл-4-ІЗ-(піридин-2-іл)-1Н-піразол-4- іл|Іпіридин) та 58505124 (2-(5-бензо|1,3|діоксол-5-іл-2-трет-бутил-ЗН-імідазол-4-іл)-6-метилпіридин).
Дві або більше з даних речовини можуть використовуватися в поєднанні.
Концентрація інгібітору ТОЕРД, яку слід додавати на даній стадії відповідним чином регулюється в залежності від типу інгібітору ТОЕВД, який слід додавати, та становить, наприклад, від 1 до 40 мкМ, переважно від 5 до 20 мкМ.
У випадку використання 58431542 (4-І4-(1,3-бензодіоксол-5-іл)-5-(2-піридиніл)-1Н-імідазол-2-іл|- бензаміду), концентрація інгібітору ТОЕВ, який слід додавати, зокрема, може становити до 10 мкМ.
Приклади інгібітору о5КЗВ включають СНІКУ8014 (2-Ф2-К5-нітро-б-амінопіридин-2- іл)аміно|етил|аміно|-4-(2,4-дихлорфеніл)-5-(1 Н-імідазол-1-іл)упіримідин), СНІКУ90О21 (6-Ц2-ЦА-(2,4- дихлорфеніл)-5-(4-метил-1Н-імідазол-2-іл)-2-піримідину|аміно|етил|аміно|нікотино-нітрил), СР21К7 (3- (З-аміно-феніл)-4-(1-метил-1 Н-індол-З3-іл)-пірол-2,5-діон), ГУ2090314 (3-(УЗ-фтор-1,2,3,4-тетрагідро-2-(1-
піперидинілкарбоніл)піроло!|3,2,1-ЇК)1 4|бензодіазепін- 7-іл|-4-імідазо|1,2-а|піридин-З-іл-1Н-пірол-2,5- діон), Т020-8 (4-бензил-2-метил-1,2,4-тіадіазолідин-3,5-діон), 58216763 (3-(2,4-дихлорфеніл)-4-(1- метил-1Н-індол-3-іл)-1Н-пірол-2,5-діон), ТМу5-119 (3-(І6-(З-амінофеніл)-7Н-піроло|2,3-4|піримідин-4- ілокси|фенол), кенпауллон, 1-азакенпауллон, 58415286 (3-(З-хлор-4-гідроксифеніл)аміно)|-4-(2- нітрофеніл)-1 Н-пірол-2,5-діон), АК-АО144-18 (1-К4-метоксифеніл)метил|-3-(5-нітро-1,3-тіазол-2- іл)усечовина), СТ99021, СтТ20026, ВІО (27, З'Е)-6-броміндирубін-3'-оксим), ВіО-ацетоксим, піридокарбазол-рутеній циклопентадіеніловий комплекс, ОТ02Т, альфа-4-дибромоацетофенон та літій. Дві або більше з даних речовин можуть використовуватися в поєднанні.
Інгібітор О5КЗВД не обмежується даними речовинами, та антисенсові олігонуклеотиди та кіРНК по відношенню до мРНК о5КЗр, антитіла, які зв'язуються з З5КЗВД, домінантні негативні мутанти С5КЗВД, та подібні можуть також використовуватися як інгібітори С5КЗВД. Дані інгібітори С5КЗД є комерційно доступних або можуть бути синтезовані відповідно до відомого способу.
Концентрація інгібітору О5КЗВД, який слід додавати на даній стадії, відповідним чином регулюється в залежності від типу інгібітору СО5КЗВД, який слід додавати, та становить, наприклад, від 0,01 до 20
МКМ, переважно від 0,1 до 10 мкм.
У випадку використання СНІКУ9021, концентрація інгібі тору С5КЗДВ, який слід додавати, не є конкретно обмеженою та може становити, наприклад, від 0,1 до 1 мкМ, переважно від 0,5 до 1 мкМ, зокрема, 1 мкм.
Період культивування після додавання інгібітору ТОЕРД та інгібітору 5КЗД може представляти собою період за який отримують кількість клітин, що викликає зацікавленість. Даний період культивування не є конкретно обмеженим та становить, наприклад, від 6 до 14 днів, від 8 до 12 днів, від 9 до 11 днів або 10 днів.
Для адгезивної культури, використовується контейнер для культивування, наприклад, чашка, колба, мікропланшет, або пластина для культивування клітин, наприклад, ОріїСеїЇ (назва продукту) (Мипс). Контейнер для культивування є переважно поверхнево-обробленим для того, щоб покращити адгезивність до клітин (гідрофільність), або покритим субстратом для клітинної адгезії, таким як колаген, желатин, полі-І-лізин, полі-О-лізин, ламінін, фібронектин, Матрігель (наприклад, ВО
Матрігель (Мірроп Весіоп біскіпвоп Сотрапу, Ца.)), або вітронектин. "Матрігель" представляє собою розчинний препарат базальної мембрани, екстрагованої із мишачої саркоми Енгельбрета-Холма-Рояма (ЕН5), збагачений протеїном позаклітинного матриксу.
Контейнер для культивування, покритий Матрігелем, є комерційно доступним. Матрігель складається в основному із ламініну, колагену ІМ, протеоглікангепаран сульфату, та ентактин/нідогену-1,2.
Матрігель містить, на додаток до даних основних компонентів, ТОВ, фактор росту епітеліальних клітин, інсуліноподібний фактор росту, фактор росту фібробластів, тканинні активатори плазміногену 3,4, та інші фактори росту, які природньо продукуються в пухлині ЕН5З.
Температура культивування не є конкретно обмеженою та становить від 30 до 402С (наприклад, 372С). Концентрація вуглекислого газу в контейнері для культивування становить приблизно, наприклад, 5 95.
В одному варіанті здійснення представленого винаходу, для того, щоб отримати клітини нервового гребня, які піддають стадії (2), можуть бути придбані комерційно доступні клітини нервового гребня.
Приклади комерційно доступних клітин нервового гребня включають клітини зовнішніх кореневих оболонок людського волосяного фолікула (виробництва Созто Віо Со., Ма.) та 09-1 лінію мишачих краніальних клітин нервового гребня (виробництва Мегск МійПіроге).
В одному варіанті здійснення представленого винаходу, для того, щоб отримати клітини нервового гребня, які піддають стадії (2), можуть бути зібрані клітини нервового гребня, які зустрічаються в природі. Клітини нервового гребня, за повідомленнями, існують в живих організмах ссавців, наприклад, людській ембріональній нервовій трубці приблизно через 30 днів після запліднення, мишачій ембріональній нервовій трубці приблизно на 9-ий день плоду, та в шкірі дорослої людини, свиней та гризунів (ВеЦег5 еї аїЇ., ЮОемеІортепіа! Біоіоду, 2010, 344 (2): 578-592; діапд еї аї.,
Оемеіортепі, 2000, 127 (8): 1607-1616; Оиріп еї аїІ., ОемеІортепаї! Біоіоду, 2012, 366 (1): 83-95; та
Мадозні єї а!., Се! тет Сеї!| 2, Аріїї 2008, 392-403). Такі клітини нервового гребня можуть бути зібрані з використанням відомого способу (наприклад, наприклад Моїопйабзні еї аї., Віоїоду ореп, 2016, 5: 311- 322; та Ріанйгогаїй еї аї., доигпаї ої Мізцаїї7ейд Ехрегітепів, 2012, 64: 4134) та піддають стадії (2).
ІСтадія (2) експансійного культивування клітин нервового гребня)
Стадія (2) експансійного культивування клітин нервового гребня представляє собою стадію суспензійного культивування клітин нервового гребня в середовищі, яке містить інгібітор С5КЗВД та основний фактор росту фібробластів (БЕСБЕ).
В даному відношенні, середовище, яке використовується, не є конкретно обмеженим, та, наприклад, середовище СОМ належним чином використовується. Крім того, може використовуватися середовище ТеЗК1!, середовище ВМЕ, середовище ВОЮ, середовище СМКІ 1066, середовище
Сіаздом МЕМ, оптимізоване середовище МЕМ (ІМЕМ), оптимізоване середовище МОМ (ІМОМ),
середовище 199, середовище Ігла МЕМ, середовище «МЕМ, середовище ОМЕМ (з високим вмістом глюкози або з низьким вмістом глюкози), середовище ОМЕМ/Е12, середовище Хема, середовище
ЕРМІ 1640, середовище Фішера, та їх змішане середовище, тощо.
Інгібітор ОБКЗВД, зазначений вище, може використовуватись без особливих обмежень.
Інгібітор С5КЗВ представляє собою переважно щонайменше один член, вибраний з групи, яка складається із СНІКУ99021, СР21К7, СНІКУ8О014, І 2090314, кенпауллона, АК-АО144-18, Т020-8,
ЗВ216763, ВІО, ТМУ5-119 та 58415286. Інгібітор 55КЗДВ особливо переважно представляє собою
СНІКУ9021 або СР21К?7.
Концентрація інгібітору СЗКЗВ, який слід додавати на даній стадії, представляє собою концентрацію, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКУ99021 в концентрації вищій, ніж 1 мкМ (або концентрації вищій, ніж 1 мкМ, та меншій, ніж 5 мкМ). СНІКУ9021 сам по собі може використовуватися як інгібітор С5КЗВ. У випадку використання СНІКУО9021 самого по собі, як інгібітору 55КЗД, як зазначається пізніше, прийнятна концентрація інгібітору С5КЗДВ, який слід додавати, представляє собою концентрацію вищу, ніж 1 мкМ, переважно 2 мкМ або вищу, та меншу, ніж 5 мкМ, більш переважно вище, ніж 2 мкМ та 4,5 мкМ або нижче, особливо переважно З мкМ або вище, та 4,5 мкМ або нижче. Таким чином, у випадку використання інгібітору С5КЗВД іншого, ніж
СНІКУО9021 на даній стадії, концентрація інгібітору З5КЗВД, який слід додавати, представляє собою концентрацію, яка демонструє ефект, еквівалентний дії яка демонструється СНІКУ9У0О21 з концентрацією вищою, ніж 1 мкМ, переважно концентрацією, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється 2 мкМ або вище, та меншою, ніж 5 мкМ СНІКУ9021, більш переважно з концентрацією, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКУЗ9О21 в концентрації вищій, ніж 2 мкМ та 4,5 мкМ або нижче, особливо переважно концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКУО9021 в концентрації З мкМ або вище, та 4,5 мкМ або нижче.
Клітини нервового гребня, які зберігають мультипотентність, можуть культивуватися та можуть проліферувати протягом періоду культивування який становить більше, ніж 9 тижнів (63 дні) шляхом суспензійного культивування клітин нервового гребня в присутності інгібітору С5КЗД, який має концентрацію та БЕСЕ.
В одному варіанті здійснення представленого винаходу, "клітини нервового гребня, які зберігають мультипотентність" мають здатність до диференціації в нервові клітини, гліальні клітини та мезенхімальні стромальні клітини, або здатність до диференціації в дані клітини, а також кісткові клітини, хондроцити, рогівкові клітини та пігментні клітини. "Клітини нервового гребня, які зберігають мультипотентність" можуть бути оцінені з використанням багатьох способів. Приклади способів включають, але конкретно не обмежуються ними, спосіб індукування диференціації клітин нервового гребня, які підлягають оцінюванню в кожну лінію, таку як нервові клітини, гліальні клітини та мезенхімальні стромальні клітини. За умови, що клітини нервового гребня, які підлягають оцінюванню, насправді можуть диференціюватися на нервові клітини, гліальні клітини та мезенхімальні стромальні клітини, тощо, клітини нервового гребня, які підлягають оцінюванню, можуть бути визначені як "клітини нервового гребня, які зберігають мультипотентність".
Інший приклад способу включає спосіб вимірювання експресії маркерного протеїну або гена. За умови, що транскрипційний фактор 5ОХ10 експресується в клітинах нервового гребня, які підлягають оцінюванню, клітини нервового гребня, які підлягають оцінюванню, можуть бути визначені як "клітини нервового гребня, які зберігають мультипотентність". хХОХ10 може бути виявлений з використанням імунологічного аналізу, наприклад, ЕЇІ5А, імунофарбування, або проточної цитометрії, використовуючи антитіло, специфічне для маркерного протеїну. Маркерний ген може бути виявлений з використанням способу ампліфікування та/або детектування нуклеїнової кислоти, відомої в даній галузі, наприклад, ПЛР зі зворотною транскрипцією, мікроматричного аналізу, або біочіпу. Коли клітини мають вставку нуклеотидної послідовності, яка кодує репортерний протеїн (наприклад, Мапо-
І апіет (Зайюо К. еї аї., " итіпез5сепі ргоївїп5 ог пПідп-хреєй 5іпаіе-сеїЇ апа м/поіе-боду ітадіпд." Маї.
Соттип., 2012; 3: 1262)) по ходу транскрипції гена 5ОХ10, маркерного гена МСС, та експресують злитий протеїн 5ОХ10 та може використовуватися репортерний протеїн під контролем промотору 5ОХ10, спосіб детектування репортерного протеїну (наприклад, вимірювання інтенсивності флуоресценції).
Ефект, еквівалентний тому, який демонструється СНІКУ9021 з "концентрацією вищою, ніж 1 мкМ" (або "концентрацією вищою, ніж 1 мкМ та меншою, ніж 5 мкМ") щодо інгібітору С5КЗВД, можуть бути оцінені на основі інгібіторної активності З5КЗВ. Інгібіторна активність З5КЗВД інгібітору С5КЗВ може вимірюватися за способом, відомим по суті, та може вимірюватися, наприклад, за способом, описаним в Раївсі єї а!., Маїиге сеїЇ Біоіоду, 2015, 17 (8): 994-1003 або по еї аї., Вгаіп Кез., 2009, 1296: 148-163.
Зокрема, інгібіторна активність 55КЗ3В може вимірюватися з використанням функції регулювання експресії генів (особливо, р-катенін функції фосфорилювання) з З55КЗВД в М/п/р-катеніновому шляху як індексу. Більш конкретно, такий підхід включає в себе: () культивування клітин, чия експресія репортерного гена супресується під контролем С5КЗ3ДВ, в присутності та за відсутності інгібітору окр; (ії) вимірювання рівня експресії репортерного гена в присутності та за відсутності інгібітору о5КЗрД; та (ії) визначення інгібіторної активності С5КЗВ інгібітору 55КЗДВ на основі збільшення кількості в рівні експресії репортерного гена в присутності інгібітору СО5КЗВ по відношенню до рівня експресії репортерного гена за відсутності інгібітору С5КЗВД (дивіться Приклад 9).
Коли інгібітор С5КЗД демонструє інгібіторну активність 5З5КЗДВ (95 інгібування), еквівалентну до тієї що демонструється СНІКУ9021 з концентрацією вищою, ніж ї мкМ в результатах вимірювань, інгібітор, С5КЗВ визначається як такий, що демонструє "ефект еквівалентний до того, що демонструється СНІКУ9021 (інгібіторна активність С5КЗВД, еквівалентна ефекту, який демонструється
СНІК9У9О21) з концентрацією вищою, ніж 1 мкМ". В даному контексті, "еквівалентне" значення (90 інгібування) стосується значення, яке може змінюватися до плюс або мінус 30 9», 25 У, 20 У, 15 95, 95, 8 95, 6 У, 5 У, 4 У, З Уо, 2 У, або 1 95 від еталонного значення. Переважно, значення стосується діапазону від плюс або мінус 15 95, 10 Ув, 5 У, або 1 95 від еталонного значення. "Ефект еквівалентний до того, який демонструється СНІКУ9021 з "концентрацією вищою, ніж 1
МКМ" (або "концентрацією вищою, ніж 1 мкМ та меншою, ніж 5 мкМ") щодо інгібітору 55КЗД може бути більш прийнятно оцінений на основі періоду, протягом якого "клітини нервового гребня, які зберігають мультипотентність"?, є здатними культивуватися, коли клітини нервового гребня культивуються аналогічним чином до способу, описаного в Прикладах в даному документі. Коли "клітини нервового гребня, які зберігають мультипотентність"?, є здатними культивуватися, при цьому кількість їх збільшується від тієї, що на початку культивування, за рахунок культивування клітин нервового гребня в середовищі, яке містить інгібітор С5КЗВД протягом періоду, еквівалентного до культивування клітин нервового гребня в середовищі, яке містить СНІКУ99021 з концентрацією вищою, ніж 1 мкМ, інгібітор
ОКО, як визначається, демонструє "ефект еквівалентний до того, який демонструється СНІКУ9021 (проліферативна активність клітин нервового гребня еквівалентна до ефекту, який демонструється
СНІКЗ9021) з концентрацією вищою, ніж 1 мкМ". В даному контексті, "еквівалентне" значення (період) стосується значення, яке може змінюватися аж до плюс або мінус 30 95, 25 У, 20 У, 15 95, 10 95, 8 9, б Ув, 5 90, 4 У, З У, 2 У, або 1 95 від еталонного значення. Переважно, значення стосується діапазону плюс або мінус 15 9», 10 95, 5 У, або 1 95 від еталонного значення.
У випадку використання СНІКУ9021 самого по собі як інгібітору 55КЗВД, концентрація інгібітору о5КЗВ, який слід додавати, представляє собою концентрацію вищу, ніж 1 мкМ, переважно 2 мкМ або вище, та меншою, ніж 5 мкМ, більш переважно вищу, ніж 2 мкМ та 4,5 мкМ або нижче, особливо переважно З мкМ або вище та 4,5 мкМ або нижче. Ефект, що дозволяє клітинам нервового гребня проліферувати, при цьому зберігається здатність до диференціації протягом тривалого періоду, як було визначено, є високим для СНІКУО9021-2 мкМ або вище та меншим, ніж 5 мкМ та є найвищим, зокрема, для СНІКУ9021-3 мкМ або вище, та 4,5 мкМ або нижче. Зокрема, СНІКУ9021 з концентрацією від З до 4,5 МКМ дозволяв культивування та проліферацію клітин нервового гребня, які зберігають мультипотентність протягом 112 дні (16 тижнів) або довше. Крім того, СНІК99021 з концентрацією 2
МКМ підтримував мультипотентність протягом 9 тижнів (63 днів) або довше. З іншого боку, СНІ 299021 в концентрації 17 мкМ або 5 мкМ зменшував кількість клітин, які зберігають мультипотентність при культивування на З тижні (21 день) та 6 тижнів (42 дні), відповідно.
У випадку використання СР21К?7 як інгібітору С5КЗВД, концентрація інгібітору 55КЗД, який слід додавати, представляє собою концентрацію вищу, ніж 0,1 мкМ, переважно 0,5 мкМ або вище, більш переважно 1 мкМ або вище. Ефект, що дозволяє клітинам нервового гребня проліферувати при цьому зберігаючи здатність до диференціації протягом тривалого періоду, як було виявлено, є високою для
СР2187-0,5 мкМ або вище та 1 мкМ або нижче. Зокрема, СР21К7 з концентрацією від 0,5 до 1 мкМ дозволяв культивування та проліферацію клітин нервового гребня, які зберігають мультипотентність протягом 84 днів (12 тижнів) або довше. З іншого боку, 0,1 мкМ СР21К7 зменшував кількість клітин, які зберігають мультипотентність при культивуванні протягом З тижнів (21 днів).
Концентрація БЕСЕ, який слід додавати, не є конкретно обмеженою та становить, наприклад, від 10 до 200 нг/мл, переважно від 20 до 40 нг/мл.
Середовище може бути доповнене інгібітором ТОЕВ та/або епідермальним фактором росту (ЕСЕ), на додаток до інгібітору С5КЗВД та БЕСЕ. Інгібітор ТОЕД, зазначений вище, може використовуватись без особливих обмежень.
Інгібітор ТОВ переважно представляє собою щонайменше один член, вибраний з групи, яка складається із 58431542, А83-01, І 0М193189, М/піІЗА/ВІО, ВМРА, сУу/788388, 5М16, ІМ-1130, СУУЄбО4 та 58505124. Інгібітор ТОЕВД особливо переважно представляє собою 58431542.
Концентрація інгібітору ТОЕРВ, який слід додавати, відповідним чином регулюється в залежності від типу інгібітору ТОЕЗРД, який слід додавати, та становить, наприклад, від 1 до 50 мкМ, переважно від 5 до 20 мкм.
У випадку використання 58431542, концентрація інгібітору ТОЕД, який слід додавати, не є конкретно обмеженою та може становити, наприклад, від 1 до 40 мкМ, переважно від 5 до 20 мкМ, особливо, 10 мкМ.
Концентрація ЕСЕ, який слід додавати, не є конкретно обмеженою та становить, наприклад, від 5 до 100 нг/мл, переважно від 20 до 40 нг/мл.
При суспензійному культивуванні, клітини нервового гребня, отримані на стадії (1) відокремлюються від контейнера для культивування та потім диспергуються в середовищі, та утворюється агрегована клітинна маса, при цьому компоненти середовища та внутрішня концентрація кисню середовище уніфікується за рахунок перемішування або струшування. Прийнятна швидкість перемішування відповідним чином встановлюється відповідно до щільності клітин та розміру контейнера для культивування. Надмірне перемішування або струшування спричиняє фізичне навантаження на клітини та гальмує утворення агрегованої клітинної маси. Таким чином, швидкість перемішування або струшування регулюється таким чином, щоб можливим було уніфікувати компоненти середовища та внутрішню концентрацію кисню середовище так, щоб не гальмувати утворення агрегованої клітинної маси. Суспензійне культивування може бути проведене шляхом нерухомого стояння без перемішування або струшування.
Температура культивування не є конкретно обмеженою та становить від 30 до 40 "С (наприклад, 37 С). Концентрація діоксиду вуглецю в контейнері для культивування становить приблизно, наприклад, 5 95.
Період культивування на даній стадії може представляти собою період, за який отримують кількість клітин, що викликає зацікавленість. Даний стадія дозволяє культивування та проліферацію клітин нервового гребня, які зберігають мультипотентність протягом тривалого періоду.
Співвідношення клітин нервового гребня, які зберігають мультипотентність до клітинної популяції, яка культивуються, становить щонайменше 20 95 або більше, 30 95 або більше, або 40 95 або більше, та може зберігатися переважно на 50 95 або більше, 60 95 або більше, або 70 95 або більше, більш переважно 80 95 або більше, 90 95 або більше, або 95 95 або більше.
Під час даного культивування, клітини належним чином пересівають. Пасирування, наприклад, проводиться кожні від 5 до 8 днів після інокулювання. Переважно, проміжок між пасажами є достатнім періодом для розмноження агрегованої клітинної маси, та даний період є коротшим, ніж той, коли занадто велика агрегована клітинна маса перешкоджає досяганню кисню або поживних речовин клітинами в межах агрегованої клітинної маси.
Період, протягом якого дана стадія дозволяє культивування та проліферацію клітин нервового гребня, які зберігають мультипотентність, не є конкретно обмеженим та може становити, наприклад, 7 днів, 14 днів, 21 день, 28 днів, 35 днів, 42 дні, 49 днів, 56 дні, 63 дні, 70 днів, 77 днів, 84 дні, 91 день, 98 днів, 105 днів, або 112 днів або довше. Даний період переважно становить 35 днів або довше, більше переважно - 42 дні або довше, особливо переважно 63 дні або довше, дуже особливо переважно 84 днів або довше, найбільш переважно 112 днів або довше.
ІСередовище
Представлений винахід також передбачає середовище для застосування в способі отримання клітин нервового гребня та способі проліферації клітин нервового гребня, зазначеного вище, яке містить клітини нервового гребня. Переважний склад середовища є таким, як зазначено вище.
ІБанк клітині
Представлений винахід також передбачає заморожений вихідний розчин, який містить клітини нервового гребня, отримані за способом отримання клітини нервового гребня, та спосіб проліферації клітин нервового гребня, зазначений вище. Клітини нервового гребня є позитивними до експресії
ЗОХ10 та позитивними до експресії р75, маркера поверхневого клітинного антигену МОСС.
Заморожений вихідний розчин може бути отриманий шляхом відокремлення клітин нервового гребня, отриманих за способом отримання клітин нервового гребня, та спосіб проліферації клітини нервового гребня із середовища, та суспендування клітин нервового гребня в кріоконсерваційному розчині для заморожування. Відокремлення клітин нервового гребня від середовища може здійснюватися, використовуючи клітинне ситечко або центрифугування. Клітини, таким чином, відокремлені можуть бути промитими, за необхідності. Заморожений вихідний розчин може містити додаткову клітинну популяцію на додаток до клітин нервового гребня, та переважно містить очищені клітини нервового гребня. Очищення клітин нервового гребня може здійснюватися, наприклад, шляхом відокремлення клітин нервового гребня від інших клітинних популяцій шляхом сортування клітин, використовуючи маркерну експресію, описані вище, як індекс. Звичайний реагент для застосування в кріоконсервації клітин може використовуватись як розчин для консервування клітин.
Наприклад, середовище Сгуозіет Егееліпд та СЕГІ ВАМКЕК(К) є комерційно доступними.
Заморожений вихідний розчин може використовуватися як вихідний матеріал для індукування диференціації клітин нервового гребня для того, щоб отримати нервові клітини, гліальні клітини, мезенхімальні стромальні клітини, кісткові клітини, хондроцити, рогівкові клітини та пігментні клітини.
Крім того, заморожений вихідний розчин може використовуватися для отримання тканинних моделей, які мають в складі клітини нервового гребня.
ІСпосіб отримання різних клітин із клітин нервового гребня
Спосіб отримання нервових клітин, гліальних клітин, мезенхімальних стромальних клітин, кісткових клітин, хондроцитів, рогівкових клітин або пігментних клітин відповідно до представленого винаходу включає стадії, наведені нижче. З даних стадій, стадія () є такими самими як стадія (2) способу отримання клітин нервового гребня відповідно до представленого винаходу або як спосіб проліферації клітин нервового гребня відповідно до представленого винаходу. () Суспензійне культивування клітин нервового гребня в середовищі, яке містить інгібітор СО5КЗД та основний фактор росту фібробластів (БЕСЕ), при цьому середовище містить інгібітор 55КЗ3Д з концентрацією, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІК9У9021 з концентрацією вищою, ніж 1 мкМ; та (ї) надання можливості клітинам нервового гребня, отриманим на стадії (ї) диференціюватися в клітини щонайменше однієї лінії, вибраної з групи, яка складається із нервових клітин, гліальних клітин, мезенхімальних стромальних клітин, кісткових клітин, хондроцитів, рогівкових клітин та пігментних клітин.
ІСтадія індукування в різні клітини)
Відповідно до способу отримання клітин нервового гребня та способу проліферації клітин нервового гребня відповідно до представленого винаходу, отриманими можуть бути клітини нервового гребня, які зберігають мультипотентність для диференціювання в нервові клітини, гліальні клітини та мезенхімальні стромальні клітини, або мультипотентність для диференціювання в дані клітини, а також кісткові клітини, хондроцити, рогівкові клітини та пігментні клітини.
Індукування диференціації клітин нервового гребня в клітини кожної лінії, вибрані з нервових клітин, гліальних клітин, мезенхімальних стромальних клітин, кісткових клітин, хондроцитів, рогівкових клітин та пігментних клітин може здійснюватися відповідно до відомого способу, описаного в літературі (наприклад, Непатентні літературні джерела 1-4).
Зокрема, індукування диференціації в нервові клітини може здійснюватися на основі способу, описаного в непатентній літературі 1 або 4.
Наприклад, клітини нервового гребня інокулюють на пластині, покритій фібронектином, та середовище замінюють на ОМЕМ/Е12, доповнене добавкою М-2 (17502-048, Сірсо), ВОМЕ (028-16451,
Мако Риге Спетісаї! Іпаивігевз, ал), СОМЕ (074-06264, Мако Ригте Спетісаї! Іпаивзійез, Ца.), МТ-3 (141- 06643, Умако Риге Спетісаї! Іпдивігіеєв, Ца.), та МОЕ (141-07601, Мако Риге Спетісаї Іпдивігієвз, Ц.), з наступним культивуванням при 372С протягом 14 днів в 5 95 СО».
Альтернативно, клітини нервового гребня інокулюють на пластині та культивують протягом 1 дня в середовищі СОМ, яке містить 10 мкм 58431542 та 1 мкм СНІКУ9021, та потім середовище замінюють на нейробазальне середовище (21103-049, бібсо) доповнене добавкою В-27 (17504-044, (Ффірсо), добавкою М-2, Ї-глутаміном (073-05391, Уако Риге Спетісаї Іпаивігієв, ла.),
Пеніциліном/стрептоміцином (15140-122, Сірсо) ВОМЕ, СОМЕ, МТ-3, та МОБ, з наступним культивуванням при 37 "С протягом 35 днів в 5 95 СО».
Клітини, які таким чином культивуються, фіксуються в 4 95 параформальдегіді, та емерджентність диференціації в нервові клітини, які експресують ТИВВЗ-протеїн, підтверджується способом імунофарбування.
Індукування диференціації в гліальні клітини може здійснюватися з використанням підходу, подібного до індукування диференціації в нервові клітини за способом, описаним в непатентній літературі 1 або 4. Після завершення періоду індукування диференціації, емерджентність диференціації в гліальні клітини підтверджується експресією СЕАР-протетну.
Індукування диференціації в мезенхімальні стромальні клітини може здійснюватися на основі способу, описаного в непатентній літературі 1. Зокрема, наприклад, клітини нервового гребня інокулюють зі щільністю 6,5 х 107 клітин/см? на чашку та культивують протягом 1 дня в середовищі
СОМ, яке містить 10 мкм 58431542 та 1 мкМ СНІКУ9021. Через один день, середовище замінюють на
ОМЕМ (Масаїаї Тездие, Іпс.), яке містить 10 95 фетальної сироватки великої рогатої худоби (ЕВ5,
Міспігеї Согр.). Приблизно через 4 дні, спостерігається морфологічна зміна в клітині. Клітини пересівають шляхом відокремлення клітин з 0,25 95 трипсину-ЕДТО (бірсо) та інокулювання зі щільністю 1,0 х 107 клітин/см-. Через 14 днів після початку індукування диференціації, експресія СО73, ср44, 0045 та СО105, поверхневих антигенних маркерів людських мезенхімальних стромальних клітин, аналізується, використовуючи ЕБАС5 для підтвердження диференціації в мезенхімальні стромальні клітини.
Індукування диференціації в кісткові клітини може здійснюватися на основі способу, описаного в непатентній літературі 1. Зокрема, наприклад, мезенхімальні стромальні клітини, описані вище інокулюють в кількості 2,5 х 105 клітин на пластину, покриту фібронектином, та культивують протягом 2 тижнів в «МЕМ, яке містить 10 95 ЕВ5, 0,1 мкМ дексаметазону, 50 мкг/мл аскорбінової кислоти та 10
ММ В-гліцерофосфату. Середовище замінюють один раз на два дні тільки протягом першого 1 тижня.
Кальцифікований вузлик виявляється шляхом фарбування алізариновим червоним для підтвердження диференціювання в кісткові клітини.
Індукування диференціації в хондроцити може здійснюватися на основі способу, описаного в непатентній літературі 1. Зокрема, наприклад, мезенхімальні стромальні клітини описані вище, суспендуються в концентрації 1,5 х 105 клітини/5 мкл в ОМЕМ:Е12 (Іпийгодеп Согр.), яке містить 1 95 (об./06.) ІТб- премікс (ВО), 0,17 мМ АА2Р, 0,35 мМ пролін (бідта-АїІадгіспй Со. 1 С), 01 мМ дексаметазону (Зідта-Аагсн бо. 11 С), 0,15 95 (об./06.) глюкози (Зідта-АїЇагісй Со. 11 С), 1 мМ Ма- пірувату (Іпийгодеп Согр.), 2 мМ СішаМах, 0,05 мМ МТС, 40 нг/мл РОСЕ-ВВ та 1 95 (об./06.) ЕВ5 (Міспігеї Согр.). 5 мкл клітинної суспензії наносять плямою на пластину, покриту фібронектином, та культивують протягом 1 години. Через один годину, туди ж додають 1 мл середовища для індукування диференціації, описаної вище. Через 3-5 днів після початку індукування диференціації, туди ж додають 10 нг/мл ТОЕрВЗ (КО Зузіетв, Іпс.). Через 10 днів після початку індукування диференціації, туди ж додають 50 нг/мл ВМРА4. Клітини культивуються протягом 16 днів, та емерджентність диференціації в хондроцити підтверджується фарбуванням альціановим блакитним.
Індукування диференціації в рогівкові клітини може здійснюватися на основі способу, описаного в непатентній літературі 1. Зокрема, наприклад, клітини нервового гребня інокулюють на пластині, покритій фібронектином, та культивують протягом 1 дня в середовищі СОМ, яке містить 10 мкм 58431542 та 1 мкм СНІКУ9021. Через один день, середовище замінюють на кондиціоноване середовище, приготовлене культурою людських рогівкових ендотеліальних клітин в середовищі СОМ.
Середовище замінюють один раз на два дні. Через 12 днів після початку індукування диференціації експресія 20-1, маркерної молекули рогівкових клітин, підтверджується із застосуванням способу імунофарбування, та експресія СОЇ 4А1 та СОЇ 8А1 підтверджується із застосуванням кПЛР.
Індукування диференціації в пігментні клітини може здійснюватися на основі способу, описаного в непатентній літературі 1. Зокрема, наприклад, клітини нервового гребня інокулюють на пластині, покритій фібронектином, та культивують протягом 1 дня в середовищі СОМ, яке містить 10 мкМ ЗВ та 1 мкм СНІК. Через один день, середовище замінюють на середовище СОМ, яке містить 1 мкм СНІК, нг/мл ВМРА та 100 нМ ендотеліну-3 (Атегісап Реріїде Сотрапу). Середовище замінюють один раз на два дні. Через 7 днів після початку індукування диференціації, диференціація в пігментні клітини підтверджується за експресією МІТЕ та с-КІТ генів.
Кожна з отриманих нервових клітин, гліальних клітин, мезенхімальних стромальних клітин, кісткових клітин, хондроцитів, рогівкових клітин та пігментних клітин може використовуватися як клітинний препарат для регенеративної медицини.
Клітини нервового гребня представляють собою клітини, які мають мультипотентність для диференціювання в багато типів клітин, таких як нервові клітини, гліальні клітини, мезенхімальні стромальні клітини, кісткові клітини, хондроцити, рогівкові клітини та пігментні клітини, та здатність до самопроліферації. Застосування клітин нервового гребня в клітинних лікарських засобах для регенеративної медицини, тощо, очікується на основі такої здатності, яка знайдена в клітинах нервового гребня. Якщо клітини нервового гребня, які зберігають мультипотентність, можуть ефективно підтримуватися або дозволяють проліферуватися, можливим є їх виробництво в великих масштабах. Якщо отриманими можуть бути вихідні клітини нервового гребня, в яких підтримується мультипотентність, вихідні клітини є корисними як сировинний матеріал для клітинних лікарських препаратів. Наприклад, застосування клітин (наприклад, клітини нервового гребня), розташованих посередині диференціювання стовбурових клітин в клітинах, що викликають зацікавленість, (наприклад, нервових клітинах) як вихідного матеріалу, вивчався з метою, наприклад, спрощення способів виробництва, скорочення періодів виробництва, або зменшення вартості виробництва у виробництві клітинних лікарських засобів. Представлений винахід, як розглядається, надає можливість отримувати корисну методику для даної мети. Даний винахід може бути справедливим не тільки для виробництва клітинних лікарських засобів, але і для конструювання систем скринінгу, які використовують різні клітини, тощо.
Приклади
ІПриклад 1: Культивування з експансією клітин нервового гребня
Індукування диференціації ІРЗС»5 в МОСС)
Людські ІРЗС могли диференціюватися в клітини нервового гребня (МСС) відповідно до способу, описаного в непатентній літературі 1. ІРЗС, які використовуються представляли собою ЗОХ10-Мапо-
Іапсегп репортерні людські іІРЗС (лінія 20187), описані в непатентній літературі 4. Дана клітинна лінія має вставку нуклеотидної послідовності, яка кодує флуоресцентний протеїн Мапо-Ї апієт (Зайо К. єї а!., "СГитіпезсепі ргоївіп5 ог пПіднп-зреєй взіпаіе-сеїї апа мпоїіе-боду ітадіпд." Маї. Соттип., 2012; З: 1262) по ходу транскрипції гена 50ОХ10, маркерний ген МСС, та експресує злитий протеїн 5ОХ10 та
Мапо-ГІГапегт під контролем промотору ЗОХ10.
ІРЗС були інокульовані на чашці з покриттям Матрігелем, адгезивно культивувалися протягом 4 днів в середовищі Тек, та потім адгезивно культивувалися протягом 10 днів в середовищі СОМ, яке містить 10 мкм 58431542 (інгібітору ТОЕВД) та 1 мкм СНІКУ99021 (інгібітору С5КЗВД), та, таким чином, дозволили диференціюватися в МСС.
ЇКультивування з експансією МСС)
МОСС відокремлювалися від чашки та суспензійно культивувалися в середовищі СОМ, яке містить мкм 58431542, З мкМ СНІК9З9021, 40 нг/мл БЕСЕ та 40 нг/мл ЕСЕ. Клітини пересівали кожні 7 днів.
Зміна загальної кількості клітин після початку культивування з експансією є показаною на фігурі 1, та зміна відсотка 5ОХ10 експресійно-позитивних клітини є показаною на фігурі 2. Для вимірювання відсотка 5ОХ10 експресійно позитивних клітини, агрегована клітинна маса була дисоційована, використовуючи реагент для клітинної дисоціації ЗЇетРго Ассшазе (Іпийгодеп Согр.) для приготування одноклітинних суспензій. Одноклітинні суспензії в буфері ЕАС5 (2 95 ВБА НВ5З5), доповнені 1 мкг/мл РІ (пропідію йодид, Умако Риге Спетісаї! Іпаизігіез, а.) фільтрували через пробірку з 35 мкм нейлоновою сіткою (ВО Раїсоп), та потім аналізували, використовуючи проточний цитометр (БАС5 Агіа, ВО
Віозсіепсе5) для того, щоб вимірювати співвідношення СЕР-позитивних клітин в живих клітинах (Рі- негативні клітини). Загальна кількість клітин збільшувалася протягом усього періоду, та високий відсоток 5ХОХ10 експресійно-позитивних клітин був підтверджений навіть на 121 день культивування.
Експресований 5ОХ10 служить маркером МСС, які мають мультипотентність. Дані результати свідчать про те, що МСС проліферують, при цьому зберігаючи здатність до диференціації протягом тривалого періоду культивування.
ІПриклад 2: Дослідження концентрації добавки середовища) інгібітор С5КЗВД, БЕСЕ та ЕСЕ досліджувалися стосовно впливу їх концентрацій на здатність МСС до самостійної проліферації та їх здатності до диференціації в культивуванні з експансією МОСС. Далі в даному документі, культивування з експансією здійснювалося в таких самих умовах, як і в прикладі 1, якщо не зазначене інше.
Фігура З показує зміну загальної кількості клітин, коли концентрації БЕСЕ та ЕСЕ встановлювали на 20 нг/мл (А) або 40 нг/мл (В), та концентрацію СНІКУ99021 встановлювали на 1, 2, 3, або 5 мкМ.
Швидкість клітинної проліферації протягом 1 тижня СНІКУО9021 в концентрації 1 мкМ або 2 мкМ була від 8- до З0-кратною (також дивіться Приклад 8, який наводиться пізніше). Фігура 4 показує зміну загальної кількості клітин, коли концентрації БЕОЕ та ЕСЕ встановлювали на 40 нг/мл, та концентрацію СНІКУ99021 встановлювали на 3, 3,5, 4, 4,5, або 5 мкМ. Концентрації БЕСЕ, ЕСЕ та
СНІК9З9021 не мали ніякого впливу на зміну загальної кількості клітин.
Фігура 5 показує зміну відсотка 50ОХ10 експресійно-позитивних клітини, коли концентрації БЕОЕ та
ЕСЕ встановлювали на 20 нг/мл (А) або 40 нг/мл (В), та концентрацію СНІКУ9021 встановлювали на 1, 2, 3, або 5 мкМ. Фігура б показує зміну відсотка 5ОХ10 експресійно-позитивних клітин, коли концентрацію БЕСЕ та ЕСЕ встановлювали на 40 нг/мл, та концентрацію СНІК99021 встановлювали на 3, 3,5, 4, 4,5, або 5 мкМ. Коли концентрація СНІКУО9021 становила від З до 4,5 мкМ, 90 95 або більше 5ОХ10 експресійно-позитивних клітин були підтверджені при тривалому періоді культивування (при 121 дню культивування). Навіть коли концентрація СНІКУО9021 становила 2 мкМ, приблизно 55 95 або більше 5ОХ10 експресійно-позитивних клітин були підтверджені при відносно тривалому періоді культивування (при 63 днях культивування). З іншого боку, коли концентрація СНІКУ99021 становила 5
МКМ, приблизно 55 95 або більше відсотків 5ХОХ10 експресійно-позитивних клітин підтримувалися аж до 42 днів культивування, тоді як відсоток 5ОХ10 експресійно-позитивних клітин зменшувався до приблизно 5 95 або менше за 63 дні культивування. Коли концентрація СНІКО9021 становила 1 мкм, зменшення відсотка 5ОХ10 експресійно-позитивних клітин спостерігалося протягом короткого періоду культивування (на 21 день культивування), та відсоток 5ОХ10 експресійно-позитивних клітин становив приблизно 25 95 або менше на 63 день культивування. Концентрації БЕСЕ та ЕСЕ1 не мали ніякого впливу на зміну відсотка 5ОХ10 експресійно-позитивних клітин.
ІПриклад 3: Дослідження інгібітору СЗКЗРІ
МСС експансійно-культивували аналогічним чином як і в прикладі 1, за винятком того, що інгібітор с5КЗВ, який використовується в культивуванні з експансією МСС, був замінений з СНІКУ99021 на
СР2І1К7. Концентрація СР21К7 встановлювали на 0,1, 0,5 або 1 мкм.
Зміна відсотка 50ОХ10 експресійно-позитивних клітин є показаною на фігурі 7. При концентрації
СР21К7 0,5 або 1 мкм, високий відсоток ЗОХ10 експресійно-позитивних клітин був підтверджений навіть на 84 день культивування. З іншого боку, при концентрації СР21К7 0,1 мкм, відсоток 5ОХ10 експресійно- позитивних клітин почав зменшуватися за короткий період культивування (на 21 день культивування).
ІПриклад 4: Індукування диференціації клітин нервового гребня в нервові клітини)
Підтвердженою була здатність щодо диференціації МСС, експансійно-культивованих в Прикладі 1 в нервові клітини.
Індукування диференціації в нервові клітини здійснювалося на основі способу, описаного в непатентній літературі 4.
МОСС, експансійно-культивовані за рахунок підтримування культури протягом 30 днів були інокульовані в кількості 5 х 107 клітин на пластині та культивувалися протягом 1 дня в середовищі
СОМ, яке містить 10 мкм 58431542 та 1 мкМ СНІКУ9021. Через один день, середовище замінюють на нейробазальне середовище (21103-049, (бібсо) доповнене добавкою В-27 (17504-044, аірсо), добавкою М-2 (17502-048, Сірсо), І-глутаміном (073-05391, ММако Ригте СНетіса! Іпаивійев, Ц.), пеніциліном/стрептоміцином (15140-122, Сірсо), ВОМЕ (028-16451, Мако Риге СНетіса! Іпавілев, ца), аОМЕ (074-06264, Мако Риге СНетісаї! Іпаивтіе5, а.) МТ-3 (141-06643, М/аКо Риге СНетісаї
Іпдивігіе5, ЦЯ.), та МОЕ (141-07601, УлаКо Риге Спетісаї! Іпдивіпев, Ца.), з наступним культивуванням при 37 "С протягом 35 днів в 5595 СО». Протягом даного періоду культивування, середовище замінювали кожні 3-4 дні.
Клітини фіксували додаванням 4 95 параформальдегіду (М/лако Риге Спетісаї! Іпдивігіез, а.) та інкубуванням при 4 "С протягом 1 години. Клітини взаємодіяли з анти-ТОВВЗ3 антитілом (845502,
Віо едепа, Іпс.) та анти-СЕАР антитілом (ар7260, Арсат РІС), як первинним антитілом, далі послідовно взаємодіяли з АІеха 488-міченим вторинним антитілом (Іпийгодеп Согр.) та АІеха 568- міченим вторинним антитілом як вторинними антитілами, співставимими з імунізованими видами тварин первинного антитіла, та потім їх спостерігали під флуоресцентним мікроскопом.
Емерджентність диференціації в нервові клітини, які експресують ТОВВ протеїн та гліальні клітини, які експресують СЕАР протеїн, була підтвердженою в МСС, збережено культивуються протягом 30 днів.
Здатність до диференціації в нервові клітини була додатково підтверджена аналогічним чином, як зазначено вище, використовуючи експансійно-культивовані МСС, за рахунок підтримування культури протягом 84 днів. В результаті підтвердженою була диференціація в нервові клітини (периферинопозитивні клітини) та гліальні клітини (СЕАР-позитивні клітини).
ІПриклад 5: Індукування диференціації клітин нервового гребня в пігментні клітини)
Підтвердженою була здатність до диференціації МСС, експансійно-культивованих в Прикладі 1, в нервові клітини.
Індукування диференціації в меланоцити здійснювалося на основі способу, описаного в непатентній літературі 1.
МОСС, експансійно-культивовані, за рахунок підтримування культури протягом 84 днів були інокульовані в б-лунковому планшеті, покритому фібронектином, та культивувалися протягом 1 дня в середовищі СОМ, яке містить 10 мкм 58431542 та 1 мкМ СНІКУ9021. Через один день, середовище замінювали на середовище СОМ, доповнене ВМРА та ендотеліном-3 (Улако Риге Спетісаї! Іпаивігієв, дао), з наступним культивуванням при 37 "С протягом 7 днів в 595 СО». Протягом даного періоду культивування, середовище замінювали кожні 2 дні.
Клітини фіксували додаванням 4 95 параформальдегіду (М/лако Риге Спетісаї! Іпдивігіез, а.) та інкубуванням при 4 "С протягом 1 години. Клітини взаємодіяли з анти-МІТЕ антитілом (5бідта-Аїагісн
Со. Г/С) як первинним антитілом, далі послідовно взаємодіяли з Аіеха 568-міченим вторинним антитілом (Іпийгодеп Согр.) як вторинним антитілом, сумісним з імунізованими первинним антитілом видами тварин, та спостерігали під флуоресцентним мікроскопом. Емерджентність диференціації в меланоцити, які експресують МІТЕ протеїн було підтверджено в МСС, яка збережено культивуються протягом 84 днів.
ІПриклад 6: Індукування диференціації клітин нервового гребня в мезенхімальні стромальні клітини)
Підтвердженою була здатність до диференціації МСС, експансійно-культивованих в Прикладі 1, в мезенхімальні стромальні клітини.
Індукування диференціації в мезенхімальні стромальні клітини здійснювалося на основі способу, описаного в непатентній літературі 1.
МСС, експансійно-культивовані шляхом підтримування культури протягом 84 дні були інокульовані в чашці б см діаметром для клітинного культивування, покритій фібронектином, та культивувалися протягом 1 дня в середовищі СОМ, яке містить 10 мкм 58431542 та 1 мкМ СНІКУ99021. Через один день, середовище замінювали СТ5 5іетРго М5С ЗЕМ (Сібсо, А1033201). Клітини пересівали шляхом дисоціації клітин з реагентом для дисоціації клітин 5ЇетРго Ассціазе (Іпу/йгодеп Согр.) та інокулювання зі щільністю від 1,0 до 2,0 х 109 клітини/чашка (для 10-см чашки).
Через 14 днів після початку індукування диференціації в мезенхімальні стромальні клітини, МСС були імунофарбовані антитілом СО73 (ВО), антитілом СО44 (ВО), антитілом СО45 (ВО) та антитілом
СО0105 (еВіозсіепсе, Іпс.), антитілами проти поверхневих антигенних маркерів людських мезенхімальних стромальних клітин, з подальшим аналізом ЕАС5. Емерджентність диференціації в мезенхімальні стромальні клітини, які експресують кожен з протеїнів СО44, СОО7З та СОО105, та які не експресують ніякого протеїну СО45 була підтвердженою в МСС, які збережено культивуються протягом 84 днів.
ІПриклад 7: Індукування диференціації клітин нервового гребня в кісткові клітини, хондроцити або адипоцити)
Підтвердженою була здатність до диференціації МСС, експансійно-культивованих в Прикладі 1 в кісткові клітини, хондроцити або адипоцити.
Індукування диференціації в кісткові клітини, хондроцити або адипоцити здійснювалося на основі способу, описаного в непатентній літературі 1.
МОСС, експансійно-кгультивовані за рахунок підтримування культури протягом 84 днів, могли диференціюватися в мезенхімальні стромальні клітини за способом, описаним в Прикладі 6.
Мезенхімальні стромальні клітини були інокульовані в кількості 4,0 х 107 клітин/лунку в 12-лунковому планшеті, покритому фібронектином, та культивувалися протягом 4 тижнів в «МЕМ, яке містить 10 95
ЕВ5, 0,1 мкМ дексаметазону, 50 мкг/мл аскорбінової кислоти та 10 мМ В-гліцерофосфату для того, щоб індукувати диференціацію в кісткові клітини. Середовище замінювали один раз в два - три дні.
Кальцифікований вузлик виявляли шляхом фарбування алізариновим червоним для підтвердження диференціювання в кісткові клітини.
Індукування диференціації в хондроцити здійснювалося наступним чином: мезенхімальні стромальні клітини, в яких індукувалася диференціація МСС, експансійно-культивованих за рахунок підтримування культури протягом 84 днів, суспендували в концентрації 1,5 х 105 клітини/5 мкл в
ОМЕМ:Е12 (Іпийгодеп Согр.), яке містить 1 95 (об./06.) ІТ5-- премікс (ВО), 0,17 мМ ААД2Р, 0,35 мМ проліну (Зідта-АІдгісн Со. 11 С), 0,1 мМ дексаметазону (Зідта-Аїагіснй Со. 1/ С), 0,15 95 (об./об.) глюкози (б5ідта-Аїагіспй Со. ГІ С), 1 мМ Ма-пірувату (Іпу/йгодеп Согр.), 2 мМ Сішамах, 0,05 мм Мт, 40 нг/мл РОСЕ-ВВ та 1 95 (об./06.) ЕВ5З (Міспігеї Согр.). Клітинну суспензію наносили плямою 5 мкл/лунку на 12-лунковий планшет, покритий фібронектином, та культивувалися протягом 1 години. Через одну годину, середовище, додатково доповнене 10 нг/мл ТОЕВЗ (КО 5бузіетв, Іпс.) та 100 нг/мл ВМР 7 (Улако Риге СНептісаї Іпдивігіез, Ца.), додавали туди ж в кількості 1 мл /лунку. Клітини культивувалися протягом 10 днів, та емерджентність диференціації в хондроцити була підтвердженою фарбуванням альціановим блакитним.
Індукування диференціації в адипоцити здійснювалося наступним чином: мезенхімальні стромальні клітини, в яких індукувалася диференціація МСС, експансійно-культивованих за рахунок підтримування культури протягом 84 днів, були інокульовані в кількості 4,0 х 107 клітин/лунку в 24- лунковому планшеті, покритому фібронектином, та культивувалися протягом 4 тижнів в середовищі, приєднаному до булет-набору для адипогенної диференціації АИМеС - людських мезенхімальні стовбурових клітин (їоп2а дарап ЦЯ4.). Середовище замінювали один раз в два-три дні. Олійні вкраплення в межах клітин, забарвлених олійним фарбуванням червоним О, були виявлені для підтвердження диференціювання в адипоцити.
Фарбування алізариновим червоним 5 кісткових клітин здійснювалося наступним чином: клітини фіксували додаванням 100 95 етанолу та інкубуванням при кімнатній температурі. Клітини взаємодіяли з розчином для фарбування алізариновим червоним (МегскК Мійроге), промивали водою, сушили, та потім досліджували під мікроскопом.
Фарбування альціановим блакитним хондроцитів здійснювалося наступним чином: клітини фіксували додаванням 4 95 параформальдегіду (Мако Риге Спетісаї! Іпаизігпев, а.) та інкубуванням при кімнатній температурі протягом 30 хвилин, піддавали взаємодії з 1 95 розчином для фарбування альціанового блакитного (Мшо Риге Спетісаї!5 Со., Ча.), промивали водою, та сушили.
Фарбування олійним червоним О адипоцитів здійснювалося наступним чином: клітини фіксували в 96 формаліні при кімнатній температурі протягом 1 години, піддавали взаємодії із сумішшю 3:2 0,5 95 розбавленого ізопропанолом та водою розчину олійного червоного О при кімнатній температурі протягом 1 години, та промивали водою. Олійні вкраплення досліджувалися під мікроскопом.
ІПриклад 8: Дослідження концентрації добавки середовища - 2)
БЕОЕ досліджували щодо впливу його концентрації на здатність МСС самопроліферувати та їх здатність до диференціації в культивуванні з експансією МСС. Далі в даному документі, культивування з експансією здійснювалося в таких самих умовах як і в прикладі 1, якщо не зазначене інше.
Фігура 8 показує зміну загальної кількості клітин, коли концентрація СНІКУО9021 встановлювали на 1,5 мкМ та концентрація БЕСЕ встановлювали на 10, 12,5, 15,0, або 17,5 нг/мл. Фігура 9 показує зміну відсотка ЗОХ10 експресійно-позитивних клітин. Концентрація БЕСЕ не мала ніякого впливу на відсоток позитивності експресії БЗОХ10.
Поведінка зміни загальної кількості клітин була практично такою самою в межах діапазону концентрацій БЕСЕ, описаному вище, та швидкість клітинної проліферації знаходилась в межах діапазону від 6- до 13-кратного протягом 1 тижня. Швидкість клітинної проліферації протягом 1 тижня в Прикладі 2 знаходилась в межах більш високого діапазону від 8- до 3З0-кратного при концентрації
СНІКУО9021 1 мкМ або 2 мкМ та концентрації БЕСЕ 20 нг/мл або 40 нг/мл (дивіться Фігуру 3), припускаючи, що БЕСЕ сприяє здатності МСС до самопроліферації та має прийнятний діапазон концентрацій від 20 до 40 нг/мл.
ІПриклад 9: Вимірювання інгібіторної активності СО5КЗВДІ
Встановленою була експериментальна система для оцінки інгібіторної активності 55КЗВ інгібітору озКЗВ.
В шляху УМУп/В-катенін, 55КЗ3В функціонує, щоб фосфорилювати р-катенін за відсутності МУпі- ліганда. Фосфорильований р-катенін є убіквитинованим та розкладається в протеасомі. Таким чином, експресія гена по ходу транскрипції шляху УУпі-ВД-катеніну супресується. Якщо С5К3ВД в даному шляху інгібується, В-катенін транслокується в ядро, без розкладання, для того, щоб індукувати генну експресію по ходу транскрипції шляху М/пі-В-катеніну разом з іншими транскрипційними факторами, такими як Т-клітинний фактор (ТСЕ)/ лімфоїдний підсилюючий фактор (ГЕРБ). Клітинний сенсор
ГЕР/ТСЕ-ріа НСТ-116 клітинна лінія (ТПепто Різпег бсієпіййс Іпс., К1І676) стабільно вводить в неї
ІГЕР/ПСЕ та вводить репортерний ген (бета-лактамазний репортерний ген) таким чином, щоб експресувати репортерний ген під контролем ГЕРЕ/ТСЕ. Експресія репортерного гена в даній клітинній лінії за відсутності М/пі-ліганда служить показником для інгібування функції (функції фосфорилювання
В-катеніну) -5КЗД. Інгібіторна активність ЗЗКЗВ інгібі тору 55КЗВ вимірювали шляхом аналізу, використовуючи даний клітинна лінія.
Аналіз проводили у відповідності з протоколом Іпийгодеп Согр. (СеПЗепзог(К) ГЕР/ТСЕ-ріа НСТ 116 СеїІ-Ббазей Аззау Ргоїосої).
Зокрема, клітини ГЕРЕ/ТСЕ-ріа НСТ-116 суспендували в середовищі для аналізу (ОРТІ-МЕМ, 0,5 95 діалізований ЕВ5, 0,1 мМ МЕАА, 1 мМ натрію пірувату, 100 Од./мл/100 мкг/мл Реп/5ігер) (312 500 клітини/мл). Клітинну суспензію інокулювали у кожну лунку досліджуваного планшету (10 000 клітини/лунку), та культивували протягом від 16 до 24 годин.
Інгібітор 55К3В (СНІКО9021 використовувався в даному документі) додавали до кожної лунки (концентрація: 0,316, 1,00, 3,16, 10,0, 31,6, 100, 316, 1000, 3160, та 10000 нм), та клітини культивувалися протягом 5 годин.
Розчин субстрату бета-лактамази (субстратну суміш І імеВІі Агег-ЕВЕТ В/а (ССЕ4-АМ)) додавали до кожної лунки (8 мкл/лунку) та інкубували протягом 2 годин. Значення флуоресценції вимірювали в рідері флуоресценції для планшету. Вимірювання здійснювалося у двох лунках на кожну умову концентрації.
Результати є наведеними в "Таблиці 1". Інгібіторна активність СО5КЗВД, яка демонструвалась 1 мкМ
СНІКОУ90О21, становила 113,5 (середнє значення з двох лунок) у перерахунку на значення флуоресценції.
Концентрація, яка демонструє інгібіторну активність (5КЗВ еквівалентну до тієї, яка демонструється 1 мкм СНІКУО9021 (значення флуоресценції: 113,5) також може бути визначене як щодо інгібіторів З35КЗДВ, за виключенням СНІКУО9021 шляхом вимірювання значень флуоресценції в кожному режимі концентрації, використовуючи дану експериментальну систему та отримуючи криві калібрування відповідно до стандартного способу.
Таблиця 1 сполуки флуоресценції 31607777 171199 | 196 316 77777777 177101 1962 лоб 77777111 11175 | 60 2 ( 84167777 11710174 ло 110 10 0316 | 6 |0 2 т ка с що с сч с - жк жи Кепки Мета : ФДГЕЛЬНЯ КІЕЛЬКЕУР: ЮТИЄ
Тож Бах
Тож ут . тож от ух ШЕ
ДеХОТЖСЯ йо ж ваду я ж Гала пийте пан .
ЗОЗ ЖЕ т У ха ще
В ЕВІЯ дО жк Шо : ОТ ВІ де ж ах я
СБК ТАЮ ЩО а ошущИ шо
БІЛУ ЖЮ ж кет : г ке де а жу : В М ЕК ж 21
МНЕ вупьтю
Фіг. 1 : ті . НАЧИИ сажу злі Дух : Суличучттучм кутюр ім Сл зр ку ніх іяш я хі
І кидок УСП - поет НниХ КПУНА Кі іже : пек : вх ї Ки : - : я : КУ Ж ї У у й ше в : Ж ї С : хх Ж
І с. п х. Е їв ТАК жан : с ОК не Є
СО З ьо : 3 й ї 3 кх : Х : З : х : 2 8
ОА І
: 5 : Х : Ж ї ї : за 5. : я У о жМм
В
: с ск щит що о : З М їі ВІ 15
Кв купетурнх
А
Сагач Кісь Ки
ЯЖНЯВ ооо тт жен ря 7
Я У 14 27 26 З 5 я8 58 83 шишку нжне ЗХ. нку, Днів кулери (в)
Загальна килькість клин
ТЕН ех 0 7 44 21 28 35 43 49 55 83 ско ЇХ ех МЖК знейнне Ух змен Ку йкв купетури
Фіг. З
Загальна китькістів клітинам века ти с ще ше й 7 зн пиння . . шо сф . їжа о зе 3жН5 я 7 ча й 25 365 45 45 55 55 ла Тї 85 о БВ 05 5 нів купетури зе: ДІДА сечеоок ВИКЛ зе В ВАВ ее ВАК нен В вай тн В мкВ фіг. 4
(А)
Відсоток експресійно-позитивних клітин ЗОХЯО
ВО дня со й я в ко з 0 КІ Бо Б 21 шле ЯК тех Ж нан ФК нйнх БЖ днів культури (8)
Відсоток експресінно-позитивних єлітих 5ОХТО 100. о й Кк БО я ТИ со Ж хУЖКах ж ядхнм їх зн ВУЖ Днів культури
Фіг. 5
З. Я - вав, Р - г а ів » ОЗЕР Каїтин в культурі ин ши дев ща Бе Куна дихеояи й
Ну КОЗДИДЕтЯ нка
Ж че СЕ оо
КЕ сн ж, сов 7 щи З, се: З ше 7
ІНВ купьтели зесене ДІЯ ееее В вже себе З ЗО БЖКДЙ ей МКМ сняне З ВДВ Осн Я МКМ
Фіг. 6 х. ЖЖ: паж; то Ящук клітин
СМ
З Е Сех нки і оди я с т
ХХ ся с ос є а
ЕВ о. ТРК есккін ку ку о
В 5 8 ОВО
Двох Кузь вувня т КЕ. с. ОХ і -. «з Я сан З КА ен ВЕД яні МЕ
Фіг. 7
: дагальна вльксть клітин ї рт; и :
АЖ М :
ЕСЕ й ЖЕ : пи ом. ІйЕ : : ніс : : мит г І : в : хо, кі КА ї
Ж ом м М І іст я їх . й . й о пн : : КО І : МИЙКИ : : ШЕУ : и ЩО І перожх кит шк : пе М : : У : : «Ж ї : й : : ОО у ів ж во кОжя :
КИ шах пенею пити - : : я : : Ой І : вс ї пеж то; оюрИх де : по КО: я 1 : щ - я що апа : : Не ї з і «от : : я 1, А я Коавошш У Дак : : пен ЗА БО ве в НЕО ФК КО еВ й 33 :
Фіг.
За ЗК клітин в ЕжлЬьгуУєІ г
ЩІ о
ПО,
ЕТ пн о код - шо Коко
Я т М я ве - а я ек 1 шк 1 Ж зве іх З пк ее НК ОН ЩЕ ее НЕ ние ех НЕ
Фіг. З
Claims (25)
1. Спосіб проліферації клітин нервового гребня, який включає стадію (І) суспензійного культивування клітин нервового гребня протягом 35 днів або довше в середовищі, яке містить інгібітор С5КЗД та основний фактор росту фібробластів, при цьому середовище містить: (а) інгібітор С5КЗРр в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКО9021 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ, при цьому ефект оцінюють на основі інгібіторної активності О5К3РД; або (5) СНІКО99021 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ як інгібітор ОБКЗД; або (с) СР21К7 в концентрації 0,5 мкМ або вище та 1 мкМ або нижче як інгібітор С5КЗРД.
2. Спосіб за п. 1, в якому середовище додатково містить інгібітор ТОЕД.
3. Спосіб за п. 1, в якому середовище являє собою середовище СОМ.
4. Спосіб за п. 1, в якому середовище додатково містить епідермальний фактор росту.
5. Спосіб за п. І, в якому в середовищі, що містить (а), інгібітор С5КЗД являє собою щонайменше один член, вибраний з групи, яка складається із СНІКО9021, СРОІК7, СНІВК98014, .У2090314, кенпауллону, АК-АО144-18, ТО2О-8, 58216763, ВІО, ТУ5-119 та 58415286.
6. Спосіб за п. 5, в якому інгібітор О5КЗР являє собою СНІКОУ99021.
7. Спосіб за п. 2, в якому інгібітор ТОЕД являє собою щонайменше один член, вибраний з групи, яка складається із 58431542, А83-01, ГОМ193189, УМУпіза/вІО, ВМРА, СХ/788388, ЗМІб, ІМ-1130, СМ/6604 та 58505124.
8. Спосіб за п. 1, в якому на стадії (І) клітини нервового гребня пересівають кожні від 5 до 8 днів після інокулювання.
9. Середовище для отримання або проліферації клітин нервового гребня протягом 35 днів або довше, яке містить інгібітор С5К3рР, основний фактор росту фібробластів та клітини нервового гребня, при цьому середовище містить: (а) інгібітор С5КЗРр в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКО9021 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ, при цьому ефект оцінюють на основі інгібіторної активності О5К3РД; або (5) СНІКО99021 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ як інгібітор ОБКЗД; або (с) СР21К7 в концентрації 0,5 мкМ або вище та 1 мкМ або нижче як інгібітор С5КЗРД.
10. Середовище за п. 9, яке додатково містить інгібітор ТОЕД.
11. Середовище за п. 9, в якому середовище являє собою середовище СОМ.
12. Середовище за п. 9, яке додатково містить епідермальний фактор росту.
13. Середовище за п. 9, в якому в середовищі, що містить (а), інгібітор С5КЗрД являє собою щонайменше один член, вибраний з групи, яка складається із СНІКО9021, СР2І1К7, СНІВК98014, .У2090314, кенпауллону, АК-АО144-18, ТО2О-8, 58216763, ВІО, ТУ5-119 та 58415286.
14. Середовище за п. 13, в якому інгібітор ОБКЗ| являє собою СНІК99021.
15. Середовище за п. 10, в якому інгібітор ТОЕРД являє собою щонайменше один член, вибраний з групи, яка складається із 58431542, А83-01, ГОМ193189, МпіЗа/ВІО, ВМРА, Осу788388, 5М 16, ІМ-1130, ОСМ/6604 та 58505124.
16. Заморожений вихідний розчин, який містить клітини нервового гребня, отримані за способом за п. 1.
17. Спосіб отримання нервових клітин, який включає стадії: (1) суспензійного культивування клітин нервового гребня протягом 35 днів або довше в середовищі, яке містить інгібітор С5КЗІД та основний фактор росту фібробластів, в якому середовище містить: (а) інгібітор С5КЗ3ДрД в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКО9021 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ, при цьому ефект оцінюють на основі інгібіторної активності СКЗ; або
(5) СНІК9902 1 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ як інгібітор С5КЗРД; або (с) СР21К7 в концентрації 0,5 мкМ або вище та 1 мкМ або нижче як інгібітор С5КЗД; та (11) диференціювання клітин нервового гребня, отриманих на стадії (1), в нервові клітини.
18. Спосіб культивування клітин нервового гребня, які мають мультипотентність протягом днів або довше, який включає стадії: (1) отримання клітин нервового гребня; та (2) суспензійного культивування клітин нервового гребня в середовищі, яке містить інгібітор О5КЗр та основний фактор росту фібробластів, при цьому середовище містить: (а) інгібітор С5КЗРр в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКО9021 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ, при цьому ефект оцінюють на основі інгібіторної активності О5К3РД; або (5) СНІК9902 1 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ як інгібітор С5КЗД; або (с) СР21К7 в концентрації 0,5 мкМ або вище та 1 мкМ або нижче як інгібітор С5КЗРД.
19. Застосування середовища для культивування клітин нервового гребня, які мають мультипотентність протягом 35 днів або довше, при цьому середовище містить основний фактор росту фібробластів та (а) інгібітор С5КЗРр в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКО9021 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ, при цьому ефект оцінюють на основі інгібіторної активності О5К3РД; або (5) СНІК9902 1 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ як інгібітор С5КЗРД; або (с) СР21К7 в концентрації 0,5 мкМ або вище та 1 мкМ або нижче як інгібітор С5КЗРД.
20. Спосіб отримання гліальних клітин, який включає стадії: (1) суспензійного культивування клітин нервового гребня протягом 35 днів або довше в середовищі, яке містить інгібітор С5КЗІД та основний фактор росту фібробластів, в якому середовище містить: (а) інгібітор С5КЗРр в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКО9021 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ, при цьому ефект оцінюють на основі інгібіторної активності О5К3РД; або (5) СНІК9902 1 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ як інгібітор С5КЗРД; або (с) СР21К7 в концентрації 0,5 мкМ або вище та 1 мкМ або нижче як інгібітор С5КЗД; та (11) диференціювання клітин нервового гребня, отриманих на стадії (1), в гліальні клітини.
21. Спосіб отримання мезенхімальних стромальних клітин, який включає стадії: (1) суспензійного культивування клітин нервового гребня протягом 35 днів або довше в середовищі, яке містить інгібітор С5КЗІД та основний фактор росту фібробластів, в якому середовище містить: (а) інгібітор С5КЗРр в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКО9021 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ, при цьому ефект оцінюють на основі інгібіторної активності О5К3РД; або (5) СНІК9902 1 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ як інгібітор С5КЗРД; або (с) СР21К7 в концентрації 0,5 мкМ або вище та 1 мкМ або нижче як інгібітор С5КЗД; та (11) диференціювання клітин нервового гребня, отриманих на стадії (1), в мезенхімальні стромальні клітини.
22. Спосіб отримання кісткових клітин, який включає стадії: (1) суспензійного культивування клітин нервового гребня протягом 35 днів або довше в середовищі, яке містить інгібітор С5КЗІД та основний фактор росту фібробластів, в якому середовище містить: (а) інгібітор С5КЗРр в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКО9021 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ, при цьому ефект оцінюють на основі інгібіторної активності О5К3РД; або (5) СНІК9902 1 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ як інгібітор С5КЗД; або
(с) СР21К7 в концентрації 0,5 мкМ або вище та 1 мкМ або нижче як інгібітор С5КЗД; та (11) диференціювання клітин нервового гребня, отриманих на стадії (1), в кісткові клітини.
23. Спосіб отримання хондроцитів, який включає стадії: (1) суспензійного культивування клітин нервового гребня протягом 35 днів або довше в середовищі, яке містить інгібітор С5КЗІД та основний фактор росту фібробластів, в якому середовище містить: (а) інгібітор С5КЗРр в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКО9021 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ, при цьому ефект оцінюють на основі інгібіторної активності О5К3РД; або (5) СНІК9902 1 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ як інгібітор С5КЗРД; або (с) СР21К7 в концентрації 0,5 мкМ або вище та 1 мкМ або нижче як інгібітор С5КЗД; та (11) диференціювання клітин нервового гребня, отриманих на стадії (1), в хондроцити.
2А. Спосіб отримання рогівкових клітин, який включає стадії: (1) суспензійного культивування клітин нервового гребня протягом 35 днів або довше в середовищі, яке містить інгібітор С5КЗІД та основний фактор росту фібробластів, в якому середовище містить: (а) інгібітор С5КЗРр в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКО9021 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ, при цьому ефект оцінюють на основі інгібіторної активності О5К3РД; або (5) СНІК9902 1 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ як інгібітор С5КЗРД; або (с) СР21К7 в концентрації 0,5 мкМ або вище та 1 мкМ або нижче як інгібітор С5КЗД; та (11) диференціювання клітин нервового гребня, отриманих на стадії (1), в рогівкові клітини.
25. Спосіб отримання пігментних клітин, який включає стадії: (1) суспензійного культивування клітин нервового гребня протягом 35 днів або довше в середовищі, яке містить інгібітор С5КЗІД та основний фактор росту фібробластів, в якому середовище містить: (а) інгібітор С5КЗРр в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКО9021 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ, при цьому ефект оцінюють на основі інгібіторної активності О5К3РД; або (5) СНІК9902 1 в концентрації 2 мкМ або вище та нижче ніж 5 мкМ як інгібітор С5КЗРД; або (с) СР21К7 в концентрації 0,5 мкМ або вище та 1 мкМ або нижче як інгібітор С5КЗД; та (11) диференціювання клітин нервового гребня, отриманих на стадії (1), в пігментні клітини.
Винахід стосується способу отримання клітин нервового гребня, який включає стадії: (1) отримання клітини нервового гребня; та (2) суспензійного культивування клітин нервового гребня в середовищі, яке містить інгібітор С5КЗД та основний фактор росту фібробластів (БЕСЕ), при цьому середовище містить інгібітор С5КЗРД в концентрації, яка демонструє ефект, еквівалентний дії, яка демонструється СНІКО9021 в концентрації вище ніж І мкМ та менше ніж 5 мкМ.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017230074 | 2017-11-30 | ||
| PCT/JP2018/043949 WO2019107485A1 (ja) | 2017-11-30 | 2018-11-29 | 細胞の培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA129013C2 true UA129013C2 (uk) | 2024-12-25 |
Family
ID=66665610
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA202003692A UA129013C2 (uk) | 2017-11-30 | 2018-11-29 | Спосіб культивування клітин |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11959100B2 (uk) |
| EP (1) | EP3719120A4 (uk) |
| JP (2) | JP7330466B2 (uk) |
| KR (1) | KR20200091885A (uk) |
| CN (1) | CN111492052A (uk) |
| AU (1) | AU2018376391B2 (uk) |
| BR (1) | BR112020010539A2 (uk) |
| CA (1) | CA3083253A1 (uk) |
| CO (1) | CO2020007772A2 (uk) |
| EA (1) | EA202091354A1 (uk) |
| IL (1) | IL274746A (uk) |
| MX (1) | MX2020005668A (uk) |
| SG (1) | SG11202004964WA (uk) |
| TW (1) | TW201940693A (uk) |
| UA (1) | UA129013C2 (uk) |
| WO (1) | WO2019107485A1 (uk) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020040166A1 (ja) | 2018-08-22 | 2020-02-27 | 国立大学法人京都大学 | 腸管神経前駆細胞の製造方法 |
| JP7799153B2 (ja) * | 2021-06-10 | 2026-01-15 | 国立大学法人京都大学 | 間葉系幹細胞の製造方法 |
| EP4353243A4 (en) * | 2021-06-10 | 2025-06-25 | Ajinomoto Co., Inc. | METHOD FOR PRODUCING MESENCHYMAL STEM CELLS |
| JPWO2023106122A1 (uk) * | 2021-12-06 | 2023-06-15 | ||
| JPWO2023127824A1 (uk) | 2021-12-27 | 2023-07-06 | ||
| CN117736990B (zh) * | 2022-09-13 | 2025-10-24 | 中国科学院动物研究所 | 一种实现细胞分化的体外培养法以及由此得到的细胞群及其用途 |
| JPWO2024242069A1 (uk) | 2023-05-19 | 2024-11-28 |
Family Cites Families (67)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ226750A (en) | 1987-10-29 | 1990-09-26 | Amrad Corp Ltd | Immortalisation of neural precursor cells by introducing a retrovirus vector containing a myc-oncogene |
| AU1284999A (en) | 1997-10-28 | 1999-05-17 | Jain, Mukesh | (in vitro) differentiation of vascular smooth muscle cells, methods and reagentsrelated thereto |
| US20030003572A1 (en) | 1999-03-05 | 2003-01-02 | David J. Anderson | Isolation and enrichment of neural stem cells from uncultured tissue based on cell-surface marker expression |
| US6548059B1 (en) | 1999-07-22 | 2003-04-15 | The Schepens Eye Research Institute, Inc. | Promotion of proliferation of adult corneal endothelial cells |
| US20030134413A1 (en) | 2000-01-14 | 2003-07-17 | Rathjen Peter David | Cell production |
| AUPR349501A0 (en) | 2001-03-02 | 2001-03-29 | Bresagen Limited | Cellular production control |
| EP1610642B1 (de) | 2004-04-10 | 2006-08-02 | Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien | Lockenwickler |
| US20060236415A1 (en) | 2005-03-09 | 2006-10-19 | Silversides David W | Neural crest cells specific promoters; isolated neural crest cells; and methods of isolating and of using same |
| US8030072B2 (en) | 2005-03-15 | 2011-10-04 | Newcastle University | Method of isolating epidermal neural crest stem cells |
| US20070258957A1 (en) | 2006-05-04 | 2007-11-08 | Russell Bowermaster | Method for obtaining and storing multipotent stem cells |
| US8048999B2 (en) | 2005-12-13 | 2011-11-01 | Kyoto University | Nuclear reprogramming factor |
| US8278104B2 (en) | 2005-12-13 | 2012-10-02 | Kyoto University | Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2 |
| JP5680850B2 (ja) | 2006-03-30 | 2015-03-04 | ザ・ユニバーシティ・コート・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・エディンバラＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｕｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ | キナーゼインヒビターを含む培養培地およびその使用 |
| WO2008018190A1 (en) | 2006-08-09 | 2008-02-14 | Biomaster, Inc. | Fat-derived neural crest cells |
| JP2008099662A (ja) | 2006-09-22 | 2008-05-01 | Institute Of Physical & Chemical Research | 幹細胞の培養方法 |
| WO2008058216A2 (en) | 2006-11-07 | 2008-05-15 | Keck Graduate Institute | Enriched stem cell and progenitor cell populations, and methods of producing and using such populations |
| US7661738B2 (en) | 2006-11-28 | 2010-02-16 | Veritainer Corporation | Radiation detection unit for mounting a radiation sensor to a container crane |
| CN105861443A (zh) | 2007-04-07 | 2016-08-17 | 怀特黑德生物医学研究所 | 体细胞重编程 |
| EP2164951A2 (en) | 2007-05-30 | 2010-03-24 | The General Hospital Corporation | Methods of generating pluripotent cells from somatic cells |
| JP2008307007A (ja) | 2007-06-15 | 2008-12-25 | Bayer Schering Pharma Ag | 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞 |
| WO2009155301A2 (en) | 2008-06-17 | 2009-12-23 | The Mclean Hospital Corporation | Multipotent neural cells |
| WO2010077955A1 (en) | 2008-12-17 | 2010-07-08 | The Scripps Research Institute | Generation and maintenance of stem cells |
| GB201111244D0 (en) | 2011-06-30 | 2011-08-17 | Konink Nl Akademie Van Wetenschappen Knaw | Culture media for stem cells |
| EP2393917B1 (en) | 2009-02-03 | 2016-04-06 | Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen | Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising said stem cells. |
| WO2010108008A2 (en) | 2009-03-18 | 2010-09-23 | University Of Georgia Research Foundation | Bsc cell differentiation and use in therapy |
| JP5700301B2 (ja) | 2009-06-03 | 2015-04-15 | 国立大学法人大阪大学 | 多能性幹細胞からの神経堤細胞群の分化誘導方法 |
| US20120219535A1 (en) | 2009-10-02 | 2012-08-30 | University Of Southern California | Cranial neural crest stem cells and culture condition that supports their growth |
| WO2011144901A1 (en) | 2010-05-20 | 2011-11-24 | The University Of Newcastle Upon Tyne | Expansion and directed differentiation of epidermal neural crest stem cells |
| WO2012091978A2 (en) | 2010-12-31 | 2012-07-05 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Differentiation of human pluripotent stem cells to multipotent neural crest cells |
| CN103562379A (zh) | 2011-05-19 | 2014-02-05 | 国立大学法人德岛大学 | 细胞分化诱导剂以及分化诱导方法 |
| WO2012164137A1 (es) | 2011-05-30 | 2012-12-06 | Fundación Investigación En Regeneración Del Sistema Nervioso | Células madre y células de la estirpe neural derivadas de la glía envolvente olfatoria, y sus aplicaciones |
| EP2765188B1 (en) | 2011-10-06 | 2017-12-06 | Keio University | Method for producing corneal endothelial cell |
| US10472607B2 (en) | 2011-12-14 | 2019-11-12 | National Chung Hsing University | Culture medium and method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neuroepithelial cells |
| EP2614829A1 (en) | 2012-01-11 | 2013-07-17 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Mammalian neural plate border stem cells capable of forming neural tube and neural crest cell lineages including central and peripheral neurons |
| CN102604894B (zh) | 2012-02-29 | 2014-07-30 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 用于制备神经干细胞的培养基及其用途 |
| US10106773B2 (en) | 2012-03-01 | 2018-10-23 | University Of Miami | Isolation and use of pluripotent stem cell population from adult neural crest-derived tissues |
| KR101389851B1 (ko) | 2012-05-04 | 2014-04-29 | 이화여자대학교 산학협력단 | 신경능선줄기세포의 배양방법 및 그 용도 |
| ES2666503T3 (es) | 2012-05-16 | 2018-05-04 | Becton, Dickinson And Company | Características distintivas de superficie celular para aislar neuronas de cultivos celulares derivados de células madre pluripotentes |
| CN102952777B (zh) | 2012-11-29 | 2015-01-21 | 山东大学 | 人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法 |
| US20140248696A1 (en) | 2013-03-01 | 2014-09-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods of maintaining, expanding, and diffrentiating neuronal subtype specific progenitors |
| KR101445026B1 (ko) | 2013-03-14 | 2014-09-26 | 건국대학교 산학협력단 | 낭배외피줄기세포의 신경세포로의 분화 유도 방법 |
| CN105531365A (zh) | 2013-04-23 | 2016-04-27 | 耶达研究及发展有限公司 | 分离的幼稚多能干细胞和产生所述细胞的方法 |
| KR20160033703A (ko) | 2013-07-23 | 2016-03-28 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 체세포로부터 신경 능선 세포로의 소분자 기반 전환 |
| WO2015035506A1 (en) | 2013-09-13 | 2015-03-19 | University Health Network | Methods and compositions for generating epicardium cells |
| WO2015042356A1 (en) | 2013-09-19 | 2015-03-26 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Chemically defined culture medium for stem cell maintenance and differentiation |
| EP3063267A4 (en) | 2013-10-29 | 2017-10-18 | Vestion Inc. | Cardiac neural crest cells and methods of use thereof |
| KR101743799B1 (ko) | 2013-11-25 | 2017-06-07 | 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 | 아스코르브산을 이용하여 인간 역분화 줄기세포를 신경능선 세포로 분화시키는 방법 및 상기 방법에 의해 형성된 신경능선 세포 |
| SG10201806695QA (en) | 2014-02-05 | 2018-09-27 | Agency Science Tech & Res | Manufacture Of Vascular Smooth Muscle Cells And The Use |
| JP6304818B2 (ja) | 2014-04-21 | 2018-04-04 | 花王株式会社 | 皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法 |
| CN105154386B (zh) | 2014-05-30 | 2018-04-24 | 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 | 人肝细胞长期维持和增殖传代培养的专用培养基和培养方法 |
| CN108064274A (zh) | 2014-07-30 | 2018-05-22 | 耶达研究及发展有限公司 | 用于培养多能干细胞的培养基 |
| CN105441384B (zh) | 2014-09-26 | 2021-01-05 | 北京大学 | 一种制备动物和人类原始多潜能干细胞的方法，试剂盒及用途 |
| WO2016099602A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | University Of Utah Research Foundation | Induced pluripotent stem cell and method for producing the same |
| WO2016103269A1 (en) | 2014-12-23 | 2016-06-30 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Populations of neural progenitor cells and methods of producing and using same |
| WO2016104574A1 (ja) * | 2014-12-24 | 2016-06-30 | 国立大学法人京都大学 | 異所性骨化の予防・治療剤及びそのスクリーニング方法 |
| EP3246394B1 (en) | 2015-01-15 | 2022-11-23 | Osaka University | Method for inducing differentiation of corneal epithelial cells from pluripotent stem cells |
| US20180142206A1 (en) | 2015-05-05 | 2018-05-24 | The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glads | Reversion of primed pluripotent stem cells to naive pluripotent stem cells |
| US10443043B2 (en) | 2015-05-07 | 2019-10-15 | New York University | Methods for making induced pluripotent stem cells |
| US11186821B2 (en) | 2015-06-02 | 2021-11-30 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Method for inducing differentiation of neural crest cells into neurons of the autonomic nervous system |
| US10563171B2 (en) | 2015-06-29 | 2020-02-18 | Kyoto University | Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into germ cells |
| LU92771B1 (en) | 2015-07-10 | 2017-01-30 | Univ Luxembourg | Long-term self-renewing neural stem cells |
| CN105255826B (zh) | 2015-11-27 | 2019-01-08 | 中山大学 | 人iPS细胞向睾丸间质细胞的诱导分化方法及其用途 |
| WO2017099766A1 (en) | 2015-12-09 | 2017-06-15 | Intel IP Corporation | Aggregated signaling for machine type communication (mtc) devices |
| CN105483080A (zh) | 2015-12-15 | 2016-04-13 | 同济大学 | 一种大鼠胚胎干细胞高效培养基 |
| CN106244522A (zh) | 2016-08-12 | 2016-12-21 | 浙江译美生物科技有限公司 | 一种干细胞培养体系及其培养方法 |
| CN106867962B (zh) | 2017-03-28 | 2020-09-04 | 周婧 | 一种诱导神经嵴干细胞向色素细胞分化的方法 |
| WO2020040166A1 (ja) | 2018-08-22 | 2020-02-27 | 国立大学法人京都大学 | 腸管神経前駆細胞の製造方法 |
-
2018
- 2018-11-29 MX MX2020005668A patent/MX2020005668A/es unknown
- 2018-11-29 US US16/767,753 patent/US11959100B2/en active Active
- 2018-11-29 EA EA202091354A patent/EA202091354A1/ru unknown
- 2018-11-29 EP EP18883499.8A patent/EP3719120A4/en active Pending
- 2018-11-29 CN CN201880077420.6A patent/CN111492052A/zh active Pending
- 2018-11-29 BR BR112020010539-2A patent/BR112020010539A2/pt unknown
- 2018-11-29 SG SG11202004964WA patent/SG11202004964WA/en unknown
- 2018-11-29 JP JP2019557317A patent/JP7330466B2/ja active Active
- 2018-11-29 WO PCT/JP2018/043949 patent/WO2019107485A1/ja not_active Ceased
- 2018-11-29 AU AU2018376391A patent/AU2018376391B2/en active Active
- 2018-11-29 UA UAA202003692A patent/UA129013C2/uk unknown
- 2018-11-29 TW TW107142689A patent/TW201940693A/zh unknown
- 2018-11-29 KR KR1020207017714A patent/KR20200091885A/ko active Pending
- 2018-11-29 CA CA3083253A patent/CA3083253A1/en active Pending
-
2020
- 2020-05-18 IL IL274746A patent/IL274746A/en unknown
- 2020-06-25 CO CONC2020/0007772A patent/CO2020007772A2/es unknown
-
2023
- 2023-04-26 JP JP2023071996A patent/JP2023093693A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MX2020005668A (es) | 2020-11-24 |
| EP3719120A1 (en) | 2020-10-07 |
| JP7330466B2 (ja) | 2023-08-22 |
| IL274746A (en) | 2020-07-30 |
| SG11202004964WA (en) | 2020-06-29 |
| JPWO2019107485A1 (ja) | 2020-11-26 |
| KR20200091885A (ko) | 2020-07-31 |
| WO2019107485A1 (ja) | 2019-06-06 |
| US20210002608A1 (en) | 2021-01-07 |
| CO2020007772A2 (es) | 2020-08-31 |
| TW201940693A (zh) | 2019-10-16 |
| CA3083253A1 (en) | 2019-06-06 |
| EA202091354A1 (ru) | 2020-08-20 |
| AU2018376391A1 (en) | 2020-06-04 |
| BR112020010539A2 (pt) | 2020-11-17 |
| JP2023093693A (ja) | 2023-07-04 |
| US11959100B2 (en) | 2024-04-16 |
| CN111492052A (zh) | 2020-08-04 |
| AU2018376391B2 (en) | 2024-09-12 |
| EP3719120A4 (en) | 2021-08-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6602288B2 (ja) | 浮遊液中で内胚葉前駆細胞を培養するための方法および組成物 | |
| UA129013C2 (uk) | Спосіб культивування клітин | |
| JP6678107B2 (ja) | 膵前駆細胞の増殖方法 | |
| US11814652B2 (en) | Pluripotent stem cell differentiation-promoting agent | |
| KR102316007B1 (ko) | 피부 유래 전구 세포의 제작 방법 | |
| US20240166994A1 (en) | Oligodendrocyte progenitor cell compositions | |
| JP7541700B2 (ja) | 腎間質細胞の製造方法 | |
| Xiong et al. | Recapitulation of endochondral ossification by hPSC-derived SOX9+ sclerotomal progenitors | |
| JP7274683B2 (ja) | 多能性幹細胞から樹状分岐した集合管を伴う腎臓構造を作製する方法 | |
| WO2023106122A1 (ja) | 間葉系譜への分化に特化した神経堤細胞の製造方法 | |
| JP7437766B2 (ja) | 中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法 | |
| WO2020203538A1 (ja) | 多能性幹細胞を含む細胞集団及びその製造方法 | |
| CN120359301A (zh) | 用于评价肾毒性的方法 | |
| JP2024531682A (ja) | コミットされた心臓始原細胞の製造方法 | |
| KR102218549B1 (ko) | 인간 타액선 세포의 배양 방법 | |
| US20240052318A1 (en) | Methods for Differentiating AT2 Cells | |
| EA044339B1 (ru) | Способ культивирования клеток | |
| HK40029689A (en) | Method for culture of cells |