UA129366C2

UA129366C2 - Спосіб одержання низькомолекулярних гепаринів і низькомолекулярні гепарини, одержані таким способом

Info

Publication number: UA129366C2
Application number: UAA202203500A
Authority: UA
Inventors: Родрігез Гільєрмо Франко; Родригез Гильермо Франко; Адуріз Ібон Гутьєро; Адуриз Ибон Гутьеро
Original assignee: Лабораторіос Фармасеутікос Рові, С.А.; Лабораториос Фармасеутикос Рови, С.А.
Priority date: 2020-04-27
Filing date: 2020-11-10
Publication date: 2025-03-26
Also published as: ZA202211958B; PE20230257A1; BR112022021243A2; ES2792298R2; ES2792298A2; CN114072430A; EP4144766A4; EP4144766A1; US20230139786A1; CN115485308B; CN114072430B; ES2792298B2; CA3175180A1; WO2021219907A1; AU2020444652A1; CN115485308A; CL2022002730A1; CO2022016188A2; WO2021219902A1

Abstract

Винахід стосується способу одержання низькомолекулярних гепаринів, які мають високу стабільність, при цьому спосіб включає обробку деполімеризованого гепарину H2O2 в співвідношенні від 0,04 до 1,0 л H2O2 33 % мас./об./кг деполімеризованого гепарину.

Description

ОБЛАСТЬ ЗАСТОСУВАННЯ ВИНАХОДУ

Даний винахід відноситься до способу отримання низькомолекулярних гепаринів (НМГ) ії до низькомолекулярних гепаринів, отриманих таким самим способом.

ПЕРЕДІСТОРІЯ ВИНАХОДУ

Гепарин - це полісахарид сімейства глікозаміногліканів, що складається з уронової кислоти (І - ідуронової кислоти або О-глюкуронової кислоти) і О-глюкозаміну, поперемінно пов'язаних між собою.

І-їдуронова кислота може бути 2-О-сульфатованою, А О-Глюкозамін може бути М-сульфатованим та/або 6-О-сульфатованим, і меншою мірою М-ацетильованим або 3-О-сульфатованим. Гепарин переважно використовується у вигляді натрієвої солі, але може також використовуватися у вигляді солі інших лужних або лужноземельних металів і в основному застосовується в якості антитромботичного і антикоагулянтного препарату.

Гепарини можна класифікувати на основі їх молекулярної маси як нефракціонований гепарин (НФГ), НМГ і гепарин з дуже низькою молекулярною масою (ДНМГ). НМГ і ДНМГ отримані в результаті деполімеризації вихідної молекули НФГ.

В даний час технічно описані різні способи отримання НМГ. Один з них відповідає лужній деполімеризації за механізмом р-елімінації.

ЕРОО40144 описує процес отримання НМГ за допомогою способу, що включає стадії трансалкілування солі гепарину до гепаринату бензетонію, етерифікації гепаринату бензетонію бензилхлоридом, очищення і отримання натрієвої солі бензилового ефіру гепарину, деполімеризації гідроксидом натрію з омиленням складного ефіру і очищення продукту.

ЕР1070503 описує процес отримання НМГ за допомогою способу, що включає стадії трансалкілування солі гепарину в гепаринат бензалконію, деполімеризації в неводному середовищі з

Тип В і очищення продукту.

ЕР2881404 описує процес отримання НМГ, що включає перший етап трансалкілування, деполімеризацію з фосфазеновою основою або основою, отриманою з гуанідину, та заключний етап трансалкілування.

Існує потреба в більш відтворюваних та стабільних процесах, які дозволяють отримувати НМГ, особливо НМГ з більш високою стабільністю.

ОПИС ВИНАХОДУ

Автори цього винаходу знайшли спосіб приготування низькомолекулярних гепаринів (НМГ), які демонструють чудову стабільність при збереженні хорошої анти-ЕХа та анти-РНа активності. Цей метод отримання НМГ включає обробку сирого деполімеризованого гепарину НгО»г при витраті від 0,04 до 1,0 літра НгОг 33 95 мас/об./кг деполімеризованого гепарину.

Таким чином, в першому аспекті винахід відноситься до способу отримання низькомолекулярних гепаринів із середньою молекулярною масою від З до 3,8 кДа, що включає наступні стадії: а) приготування водного розчину гепарину натрію; р) додавання хлориду бензалконію до розчину етапу (а), щоб отримати гепаринат бензалконію; с) розчинення гепаринату бензалконію, отриманого на етапі (б), в Сі"СНе, додавання Тійоп В та витримка при 20-40 "С протягом 24-48 годин; та а) виконання щонайменше двох обробок НгОг деполімеризованого гепарину, отриманого на етапі (с), з розрахунку від 0,04 до 1,0 л Нг2О»2 33 95 мас./об./кг деполімеризованого гепарину, для кожної обробки.

Другий аспект винаходу відноситься до низькомолекулярного гепарину, одержуваного способом по винаходу.

Було встановлено, що вміст 1,6-ангідрозалишків в отриманих НМГ становить від 1 до 15 95. Таким чином, третій аспект винаходу відноситься до низькомолекулярного гепарину з середньою молекулярною масою від З до 3,8 кДа, що має вміст 1,6б-ангідрозалишків від 1 до 1595 на відновлювальному кінці його олігосахаридних ланцюгів.

Визначення та варіанти здійснення, описані для одного аспекту, в рівній мірі застосовні до всіх інших аспектів винаходу.

У цьому винаході "низькомолекулярний гепарин" або "НМГ" визначається в монографії "Гепарини, низькомолекулярна маса" |"Нерагіпв, І ом-МоїІесшаг/-Маз5"|, 0828, Європейська фармакопея 9-е вид., як суміш полісахаридів, отримана з гепарину та має середню молекулярну масу менше 8000 дальтон, в якому принаймні 60 95 від загальної маси має молекулярну масу менше 8000 Да. Середня молекулярна маса НМГ по винаходу була визначена за способом Європейської фармакопеї (Європейська фармакопея 9-е видання).

У цьому винаході під "1,6-ангідро залишками" розуміються різні хімічні групи, які утворюються в термінальних положеннях НМГ в процесі деполімеризації. Необмежуючими прикладами цих груп є 2- сульфо-аміно-1,6-ангідро-2-дезоксі-Я-Ю-глюкопираноза (1,6б-ангідроглюкозамін) і 2-сульфо-аміно-1,6- ангідро-2-дезоксі-Д-Ю-маннопираноза (1,6б-ангідроманозамін). Кількість цих залишків в НМгГ виражається як відсоток олігосахаридних ланцюгів з цими типами залишків на їх відновлювальному кінці.

Вміст в 1,6-безводних кінцях НМГ може бути отримано за допомогою аналітичного методу, описаного в монографії "Еноксапарин натрію" ("Епохарагіп бодішт"), 1097, Європейська фармакопея, 9-е вид., описаної в розділі Ідентифікація В. У цьому методі молекула інтенсивно деполімеризується сумішшю гепариназ І, ІІ і І, а утворені залишки розділяються та кількісно визначаються за допомогою хроматографії сильного аніонного обміну (ЗАХ-НРІ С). Вміст 1 ,б-ангідро, наприклад, визначається за такою формулою:

Чо 1,6-ангідро- Ми" (Ат Аг Аз)"100/Х Мих Ах в якому: - Мму, середньовагова молекулярна маса - Мухх, молекулярна маса похідного х |див. таблицю 1097-1 в монографії "Еноксапарин натрію" ("Епохарагіп 5одіит"), 1097, Європейська фармакопея, 9-е вид. - Ах, площа піку похідної х - Аї, площа піку 1 ,б-ангідропохідного ЛІ5 - Аг, площа піку похідного 1,6-ангідропохідного ЛІ5 - Аз, площа піку 1,б-ангідропохідного ЛІ5-І5

Частка залишків 1,6-ангідроглюкозаміну і 1,6-ангідроманозаміну в НМГ може бути визначена за допомогою ядерно-магнітного резонансу (ЯМР), наприклад, шляхом "Н ЗС Н5БОС. Співвідношення між двома залишками може бути визначено шляхом інтегрування сигналів, відповідних кожному з цих залишків у спектрі "Н 3С НБОС.

Анти-ЕХа та анти-НРІіа активність НМГ по винаходу була визначена за допомогою хромогенного способу Європейської фармакопеї |Європейська фармакопея 9-е вид., Монографія 0828) та була виражена в міжнародних одиницях по мг.

Ступінь забарвленості НМГ може бути визначена відповідно до методу І Європейської фармакопеї, глава 2.2.2.

Термін "температура навколишнього середовища" відноситься до температури від 20 до 25 760.

Як використовується в цьому документі, термін "приблизно" означає «10 95 від заданого значення.

НМГ по даному винаходу має середню молекулярну масу (Мм) від З до 3,8 кДа, переважно від З до 3,6 кДа.

В одному варіанті здійснення винаходу НМГ має вміст 1,6-ангідро залишків від 1 до 15 95 на відновлювальному кінці своїх олігосахаридних ланцюгів; переважно від 2 до 13 95, більш переважно від 4 до 11 95.

Переважно молярна частка залишків 1,6-ангідроглюкозаміна в НМГ за цим винаходом більше або дорівнює молярній частці залишків 1,6-ангідроманозаміна. У конкретному варіанті здійснення молярне співвідношення залишків 1 ,б-ангідроглюкозаміну і залишків 1,6-ангідроманозаміну в НМГ становить від 171 до 3:1, переважно від 1:1 до 2,5:1 або від 1,05:1 до 2,5:1.

У конкретному варіанті здійснення винаходу НМГ мають середню молекулярну масу від З до 3,8 кДа, вміст 1,6-ангідро-залишків від 1 до 15 95 на відновлювальному кінці їх олігосахаридних ланцюгів та співвідношення 1,6б-ангідроглюкозамінових залишків більше або дорівнює співвідношенню 1,6- ангідроманозамінових залишків, переважно від 1:1 до 3:1.

Переважно, НМГ за цим винаходом проявляє анти-ЕХа активність в діапазоні 80-120 МО/мг та анти-РНПа активність в діапазоні 5-20 МоО/мг. В одному конкретному варіанті здійснення вони проявляють анти-ЕХа активність в діапазоні 95-120 МоО/мг та анти-РІІа активність в діапазоні 10-20

МО/мг.

У конкретному варіанті здійснення винаходу НМГ мають середню молекулярну масу від З до 3,8 кДа, вміст 1,6-ангідро-залишків від 1 до 15 95 на відновлювальному кінці їх олігосахаридних ланцюгів і співвідношення 1,6-ангідроглюкозамінових залишків більше або дорівнює співвідношенню 1,6- ангідроманозамінових залишків, переважно від 1: 1 і 31, анти-ЕХа активність в межах 80-120 МоО/мг і анти-ЕПа активність в межах 5-20 МоО/мг.

Переважно, щоб НМГ даного винаходу мала ступінь фарбування, більшу або рівну Є, в діапазоні еталонних колірних розчинів, встановлених в Європейській фармакопеї, глава 2.2.2. (метод І) протягом не менше 24 місяців, переважно не менше 36 місяців, при кімнатній температурі і відносній вологості 60 95. Це визначення може бути виконано відповідно до методу, описаного в Європейській фармакопеї (глава 2.2.2; метод ІЇ), або автоматично за допомогою колориметра.

Було відзначено, що НМГ за цим винаходом мають високу стабільність. Зокрема, було виявлено, що вони стабільні не менше 24 місяців або навіть не менше 36 місяців при кімнатній температурі та відносній вологості 60 95.

В одному аспекті винахід відноситься до способу отримання низькомолекулярних гепаринів із середньою молекулярною масою від З до 3,8 кДа, що включає наступні етапи: а) приготування водного розчину гепарину натрію; р) додавання хлориду бензалконію до розчину етапу (а), щоб отримати гепаринат бензалконію;

с) розчинення гепаринат бензалконію, отриманого на стадії (Б), в СНоСі», Додавання Тійоп В та підтримка температури від 20 до 40 "С протягом 24-48 годин; і а) виконання щонайменше двох обробок НгОг деполімеризованого гепарину, отриманого після етапу с), з розрахунку від 0,04 до 1,0 л НгОг 33 95 мас./об./кг деполімеризованого гепарину, для кожної обробки.

Конкретні та кращі варіанти реалізації низькомолекулярного гепарину описані вище в цій статті.

У конкретному варіанті здійснення водний розчин гепарину натрію на етапі а) готують з гепарину, отриманого з слизової оболонки кишечника свині.

Додавання Т/йоп В на етапі с) може бути здійснено шляхом одного або декількох послідовних додавань, наприклад, шляхом 1, 2, З або 4 послідовних додавань Топ В.

У конкретному варіанті здійснення додавання Топ В на етапі с) здійснюється максимум трьома послідовними додаваннями, тобто, 1, 2 або 3, кожне з додаванням Тііюп В у ваговому співвідношенні від 0,2:1 до 0,3:1 Тийоп В: гепаринат бензалконію. Переважно додавання ТІйоп В на стадії с) проводять трьома послідовними добавками Топ В, і переважно кожне з них з додаванням Топ В у ваговому співвідношенні від 0,2:1 до 0,3:1 Топ В: бензалконію гепаринату.

У варіанті здійснення винаходу додавання ТІйоп В на стадії с) здійснюється шляхом трьох послідовних додавань Тгйоп В, таким чином, що після першого додавання реакція підтримується протягом 6-10 годин до другого додавання, після другого додавання реакція підтримується протягом 12-20 годин до третього додавання, та після третього додавання реакція підтримується протягом 6-10 годин. В іншому варіанті здійснення після першого додавання реакція підтримується протягом 7-9 годин до другого додавання, після другого додавання реакція підтримується протягом 14-18 годин до третього додавання, а після третього додавання реакція підтримується протягом 7-9 годин. В іншому додатковому варіанті здійснення час реакції після першого, другого і третього додавання становить приблизно 8, приблизно 16 та приблизно 8 годин відповідно.

В одному варіанті здійснення температура на стадії с) становить від 25 до 35" з, переважно від 27 до 32 76.

У переважному варіанті здійснення обробку НгОг на етапі 4) проводять на водному розчині деполімеризованого гепарину.

Переважно, кожна обробка НгОг на етапі а) проводиться при витраті від 0,04 до 0,5 літрів НгОг 33 6 мас/об./кг деполімеризованого гепарину, більш переважно від 0,04 до 0,3 літрів НгОг 33 95 мас./об./кг деполімеризованого гепарину. У конкретному варіанті здійснення кожну обробку НгОг на стадії 4) проводять з розрахунку від 0,04 до 0,2 л НгОз» 33 95 мас./об./кг деполімеризованого гепарину.

У переважному варіанті здійснення стадія 4) включає першу обробку деполімеризованим гепарином

НгО», отриманим після стадії с), у співвідношенні від 0,05 до 0,25 л Нг2Ог 33595 мас./об./кг деполімеризованого гепарину, і друга обробка з використанням НгОг в співвідношенні від 0,04 до 0,25 л Нг2О5» 33 95 мас./об./кг деполімеризованого гепарину.

В іншому варіанті здійснення стадія а) включає в себе три процедури з НгО».

Переважно етап 4) проводять при температурі від 20 до 50 "С, переважно від 25 до 45 76.

Переважно кожну обробку НгОг проводять протягом не менше 3 годин. Наприклад, від З до 20 годин. У конкретному варіанті перша обробка НгОг проводиться протягом 12-20 год., переважно 14-18 год. Переважно другу та наступні обробки НгОг проводять протягом 3-7 год., переважно 4-6 год.

У кращому варіанті здійснення стадію с) проводять при рН від 10,5 до 11,5. Крім того, спосіб по винаходу може включати додаткову стадію осадження деполімеризованого гепарину в метанолі після кожної обробки НгО» на стадії 4). У конкретному варіанті здійснення проводять дві обробки НгОг і проводять стадію осадження деполімеризованого гепарину в метанолі між двома обробками НгО». В іншому варіанті здійснення проводять три обробки НО? і проводять стадію осадження деполімеризованого гепарину в метанолі між першою та другою обробками НгОг і між другою та третьою обробками НгО».

Переважно, після першої обробки Нг2Ог на етапі 4) деполімеризований гепарин осаджують в розчині ацетату натрію в метанолі.

У кращому варіанті здійснення НМГ, отримано в способі по винаходу, очищається осадженням метанолом.

Отриманий НМГ можна піддати сублімаційній сушці.

КОРОТКИЙ ОПИС МАЛЮНКІВ

Малюнок 1. Спектр "Н ЯМЕР НМГ, отриманого за способом винаходу, з розширенням аномерної зони.

Малюнок 2. Спектр "Н ЗС НБОС НМГ, отриманий способом по винаходу з розширенням аномерної зони.

ПРИКЛАДИ

Наведені нижче конкретні приклади служать для ілюстрації сутності цього винаходу. Ці приклади наведені тільки в ілюстративних цілях і не повинні інтерпретуватися як обмеження заявленого тут винаходу.

Приклад 1 г гепарину натрію розчиняють в очищеній воді і при перемішуванні додають розчин 50 95 (мас/об.) хлориду бензалконію з утворенням гепаринату бензалконію. Сформований продукт кілька разів промивають водою для видалення надлишку хлоридів і, в результаті, висушують сублімаційної сушкою.

Бензалконію гепаринат розчиняють у метиленхлориді і регулюють температуру до 30-55 "6.

Бензилтриметиламмоній гідроксиду (Тійоп В) додають при 40 95 мас/об. у метанолі при масовому співвідношенні 0,25:1 до Т/йоп р: бензалконію гепаринату та залишають для реакції при зазначеній вище температурі. Додавання повторюють ще два рази, залишаючи перше додавання Тийоп В на 8 годин, друге - на 16 годин, а третє - ще на 8 годин.

При розчиненні деполімеризованого продукту та при рН від 10,5 до 11,5 додається НгОг 33 95 мас/об., зокрема, додається 0,110 95 літрів НгОг 33 95 мас./об./кг бензалконію гепаринату, і дають прореагувати при 30 95 мас/об. 55 "С протягом більше З годин (від 14 до 18 годин). Після закінчення часу реакції його осаджують при розчиненні ацетату натрію в метанолі, виділяючи неочищений низькомолекулярний гепарин центрифугуванням.

Цей неочищений низькомолекулярний гепарин розчиняють у воді та знову осаджують метанолом.

Осад розчиняють в очищеній воді та обробляють НгО2 33 95 за вагою, а саме додають 0,08:10 95 літрів НгО» 33 95 за вагою на кг бензалконію гепаринату при температурі 4012 "С протягом більше З годин (близько 5 годин). Після закінчення реакції розчин нейтралізують і осаджують метанолом.

Осад повторно розчиняють в очищеній воді і знову обробляють 0,05:10 95 літра НгОг 33 95 мас./об./кг бензалконію гепаринату при температурі 40 "Сх22 "С з протягом більше З годин (близько 5 годин). Після закінчення реакції розчин нейтралізують і осаджують метанолом.

Концентрація гепаринату бензалконію в розчині, в якому проводиться як деполімеризація, так і перша обробка перекисом водню, становить 20 95 по мас/об. 2 95 в цьому та у всіх інших прикладах, якщо не вказано інше. Кількість перекису водню, що додається на різних стадіях, еквівалентно кількості як бензалконію гепаринату, так і деполімеризованого гепарину, оскільки при різних додаваннях Тийоп В присутній в реакції бензалконію гепаринат деполімеризується, утворюючи деполімеризований гепарин.

Очищений продукт розчиняють у воді і проводять ліофілізацію, отримуючи 6,00 г низькомолекулярного гепарину з середньою молекулярною масою 3241 так, анти-ЕХа-активністю 118

Мо/мг ї анти-РПНа-активністю 13,7 МоО/мг, і присутній на відновлювальному кінці його олігосахаридних ланцюгів вміст 1,6-безводних залишків від 1 до 15 95, в якому частка залишків 1,6-ангідроглюкозаміну більше або дорівнює частці залишків 1,6-ангідроманозаміну, на відміну від інших низькомолекулярних гепаринів.

Цей низькомолекулярний гепарин також має перевагу в тому, що він стабільний при кімнатній температурі протягом 24-36 місяців, демонструючи ступінь забарвленості 26, виміряну за допомогою колориметра марки ГІСОФ, співвідносить колір відповідно до еталонного діапазону кольорів, встановленого у фармакопеї |Європейська фармакопея (2.2.2, Метод ІІ.

Ступінь забарвленості, параметр, безпосередньо пов'язаний зі стабільністю продукту, дозволив визначити, що кінцевий упакований продукт стабільний при кімнатній температурі протягом 24-36 місяців.

Приклад 2

Починаючи з 10 г гепарину натрію і повторюючи кроки, зазначені в прикладі 1, отримують 6,01 г низькомолекулярного гепарину з середньою молекулярною масою 3259 Да, анти-ЕХа активністю 103

МоО/мг і анти-РІа активністю 15,2 МО/мг. Цей низькомолекулярний гепарин відрізняється тим, що на відновлювальному кінці його олігосахаридних ланцюгів вміст 1,6-безводних залишків становить від 1 до 15595, в якому частка залишків 1,б-ангідроглюкозаміну вище, ніж частка залишків 1,6- ангідроманозаміну. На відміну від інших низькомолекулярних гепаринів.

Приклад З 10 г гепарину натрію розчиняють в очищеній воді і при перемішуванні додають розчин 50 95 (мас./об.) хлориду бензалконію з утворенням гепаринату бензалконію. Сформований продукт кілька разів промивають водою для видалення надлишку хлоридів і, в результаті, висушують сублімаційної сушкою.

Бензалконію гепаринат розчиняють у метиленхлориді і регулюють температуру до 30 С ж 5 76.

Бензилтриметиламмоній гідроксиду (Тійоп В) додають при 40 95 мас/об. у метанолі при масовому співвідношенні 0,25:1 до Тийоп р: бензалконію гепарин ату та залишають для реакції при зазначеній вище температурі. Додавання повторюють ще два рази, залишаючи перше додавання Тийоп В на 8 годин, друге - на 16 годин, а третє - ще на 8 годин.

При розчиненні деполімеризованого продукту та при рН від 10,5 до 11,5 додається НгОг 33 95 мас/об., зокрема, додається 0,110 95 літрів НгОг 33 95 мас./об./кг бензалконію гепаринату, і дають прореагувати при 30 95 мас/об. 55 "С протягом 16 годин. Після закінчення часу реакції його осаджують при розчиненні ацетату натрію в метанолі, виділяючи неочищений низькомолекулярний гепарин центрифугуванням.

Осад розчиняють в очищеній воді та обробляють НгО2 33 95 за вагою, а саме додають 0,08:10 95 літрів Нг2О2 33 95 за вагою на кг бензалконію гепаринату при температурі 40:52 "б. Через 5 годин реакції розчин нейтралізують і осаджують метанолом.

Очищений продукт розчиняють у воді і проводять ліофілізацію, отримуючи 5,21 г низькомолекулярного гепарину з середньою молекулярною масою 3269 так, анти-ЕХа-активністю 119

Мо/мг і анти-РІМа-активністю 13,70 МоО/мг, і присутній на відновлювальному кінці його олігосахаридних ланцюгів вміст 1,6-безводних залишків від 1 до 15 95, в якому частка залишків 1,6-ангідроглюкозаміну більше або дорівнює частці залишків 1,6-ангідроманозаміну, на відміну від інших низькомолекулярних гепаринів.

Приклад 4

Починаючи з 10 г гепарину натрію і повторюючи кроки, зазначені в прикладі 1, отримують 6,25 г низькомолекулярного гепарину з середньою молекулярною масою 3172 Да, анти-ЕХа активністю 108

МоО/мг і анти-РіІІа активністю 13,1 МоО/мг і більш високий профіль активності. 1,6-безводних залишків на відновлювальному кінці його олігосахаридних ланцюгів від 1 до 15 95, в якому частка залишків 1,6- ангідроглюкозаміну більше або еквівалентна частці залишків 1,6-ангідроманозаміну, на відміну від інших низькомолекулярних гепаринів, таких як еноксапарін.

Приклад 5

Починаючи з 10 г гепарину натрію і повторюючи кроки, зазначені в прикладі 1, отримують 6,34 г низькомолекулярного гепарину з середньою молекулярною масою 3347 Да, анти-ЕХа активністю 110

МоО/мг і анти-РіІІа активністю 14,7 МоО/мг і більш високий профіль активності. 1,6-безводних залишків на відновлювальному кінці його олігосахаридних ланцюгів від 1 до 15 95, в якому частка залишків 1,6- ангідроглюкозаміну більше або еквівалентна частці залишків 1,6-ангідроманозаміну, на відміну від інших низькомолекулярних гепаринів, таких як еноксапарін.

Цей низькомолекулярний гепарин також має перевагу в тому, що він стабільний при кімнатній температурі протягом 24-36 місяців, демонструючи ступінь забарвленості 26, виміряну за допомогою колориметра марки ГІСОФ, співвідносить колір відповідно до еталонного діапазону кольорів, встановленого у фармакопеї |Європейська фармакопея (2.2.2, Метод І)). Ступінь забарвленості, параметр, безпосередньо пов'язаний зі стабільністю продукту, дозволив визначити, що кінцевий упакований продукт стабільний при кімнатній температурі протягом 24-36 місяців.

Приклад 6

Починаючи з 10 г гепарину натрію і повторюючи кроки, зазначені в прикладі 1, отримують 7,11 г низькомолекулярного гепарину з середньою молекулярною масою 3400 Да, анти-ЕХа активністю 119

МоО/мг і анти-РіІІа активністю 15,0 МоО/мг і більш високий профіль активності. 1,6-безводних залишків на відновлювальному кінці його олігосахаридних ланцюгів від 1 до 15 95, в якому частка залишків 1,6- ангідроглюкозаміну більше або еквівалентна частці залишків 1,6-ангідроманозаміну, на відміну від інших низькомолекулярних гепаринів, таких як еноксапарін.

Цей низькомолекулярний гепарин також має перевагу в тому, що він стабільний при кімнатній температурі протягом 24-36 місяців, демонструючи ступінь забарвленості 26, виміряну за допомогою колориметра марки ГІСОФ, співвідносить колір відповідно до еталонного діапазону кольорів,

встановленого у фармакопеї |ХЄвропейська фармакопея (2.2.2, Метод І)). Ступінь забарвленості, параметр, безпосередньо пов'язаний зі стабільністю продукту, дозволив визначити, що кінцевий упакований продукт стабільний при кімнатній температурі протягом 24-36 місяців.

Приклад 7

Починаючи з 10 г гепарину натрію і повторюючи кроки, зазначені в прикладі 1, отримують 6,92 г низькомолекулярного гепарину з середньою молекулярною масою 3328 Да, анти-ЕХа активністю 117

МоО/мг і анти-РіІІа активністю 14,9 Мо/мг і більш високий профіль активності. 1,6-безводних залишків на відновлювальному кінці його олігосахаридних ланцюгів від 1 до 15 95, в якому частка залишків 1,6- ангідроглюкозаміну більше або еквівалентна частці залишків 1,6-ангідроманозаміну, на відміну від інших низькомолекулярних гепаринів, таких як еноксапарін.

Цей низькомолекулярний гепарин також має перевагу в тому, що він стабільний при кімнатній температурі протягом 24-36 місяців, демонструючи ступінь забарвленості 26, виміряну за допомогою колориметра марки ГІСОФ, співвідносить колір відповідно до еталонного діапазону кольорів, встановленого у фармакопеї |ХЄвропейська фармакопея (2.2.2, Метод І)). Ступінь забарвленості, параметр, безпосередньо пов'язаний зі стабільністю продукту, дозволив визначити, що кінцевий упакований продукт стабільний протягом 24-36 місяців.

Приклад 8

Починаючи з 10 г гепарину натрію і повторюючи кроки, зазначені в прикладі З, отримують 7,04 г низькомолекулярного гепарину з середньою молекулярною масою 3331 Да, анти-ЕХа активністю 113

МоО/мг і анти-РіІіа активністю 15,3 МоО/мг і більш високий профіль активності. 1,6-безводних залишків на відновлювальному кінці його олігосахаридних ланцюгів від 1 до 15 95, в якому частка залишків 1,6- ангідроглюкозаміну більше або еквівалентна частці залишків 1,6-ангідроманозаміну, на відміну від інших низькомолекулярних гепаринів, таких як еноксапарін.

Приклад 9

Починаючи з 10 г гепарину натрію і повторюючи кроки, зазначені в прикладі З, отримують 7,09 г низькомолекулярного гепарину з середньою молекулярною масою 3366 Да, анти-ЕХа активністю 115

МоО/мг і анти-РІа активністю 16,0 МоО/мг, і більш високий профіль активності. 1,6-безводних залишків на відновлювальному кінці його олігосахаридних ланцюгів від 1 до 15 95, в якому частка залишків 1,6- ангідроглюкозаміну більше або еквівалентна частці залишків 1,6-ангідроманозаміну, на відміну від інших низькомолекулярних гепаринів, таких як еноксапарін.

Цей низькомолекулярний гепарин також має перевагу в тому, що він стабільний при кімнатній температурі протягом 24-36 місяців, демонструючи ступінь забарвленості 26, виміряну за допомогою колориметра марки ГІСОФ, співвідносить колір відповідно до еталонного діапазону кольорів, встановленого у фармакопеї |ХЄвропейська фармакопея (2.2.2, Метод І)). Ступінь забарвленості, параметр, безпосередньо пов'язаний зі стабільністю продукту, дозволив визначити, що кінцевий упакований продукт стабільний при кімнатній температурі протягом 24-36 місяців.

Порівняльний приклад 10 (без обробки з НгОг) г гепарину натрію розчиняють в очищеній воді і при перемішуванні додають розчин 50 95 (мас./об.) хлориду бензалконію з утворенням гепаринату бензалконію. Сформований продукт кілька разів промивають водою для видалення надлишку хлоридів і, в результаті, висушують сублімаційної сушкою.

Бензалконію гепаринат розчиняють у метиленхлориді і регулюють температуру до 30-55 76.

Розчин деполімеризованого продукту осаджують при розчиненні ацетату натрію в метанолі, при цьому неочищений низькомолекулярний гепарин виділяють центрифугуванням.

Осад розчиняється в очищеній воді при температурі 40-42 "С при рН 11. Через 5 годин розчин нейтралізують і осаджують метанолом.

Очищений продукт розчиняють у воді і проводять ліофілізацію, отримуючи 5,28 г низькомолекулярного гепарину з середньою молекулярною масою 3280 Да, анти- ЕХа активністю 112

МоО/мг і анти-РІйа активністю 13,70 Мо/мг, і присутній на відновлювальному кінці його олігосахаридних ланцюгів вміст 1,6-безводних відходів становить 18,5 95.

Крім того, аналізується співвідношення залишків 1,б-ангідроглюкозаміну та залишків 1,6-

ангідроманозаміну, на відміну від попередніх прикладів, залишки 1,6-ангідроманозаміну більші, ніж залишки 1,6-ангідроглюкозаміну.

Далі аналізується ступінь стабільності, що корелює з кольором зразка, відзначаючи, що починаючи з десятого місяця при кімнатній температурі він має колірну ступінь 4, виміряну за допомогою колориметра марки І ІСОФ, який співвідносить колір відповідно до еталонного діапазону хроматичних кольорів, встановленого Фармакопеєю (Європейська фармакопея (2.2.2, Метод 1)). Ступінь забарвлення, параметр, безпосередньо пов'язаний зі стабільністю продукту, дозволив визначити, що кінцевий упакований продукт не був стабільним протягом більше 9 місяців при кімнатній температурі, тому добавки НгО», мабуть, відповідальні за цю поведінку.

Порівняльний приклад 11 (деполімеризація при 60 "С) г гепарину натрію розчиняють в очищеній воді і при перемішуванні додають розчин 50 95 (мас/об.) хлориду бензалконію з утворенням гепаринату бензалконію. Сформований продукт кілька разів промивають водою для видалення надлишку хлоридів і, в результаті, висушують сублімаційної сушкою.

Бензалконію гепаринат розчиняють у метиленхлориді і регулюють температуру до 60-55 6.

Бензилтриметиламмоній гідроксиду (Тійоп В) додають при 40 95 мас/об, у метанолі при масовому співвідношенні 0,25:1 до Т/йоп р: бензалконію гепаринату та залишають для реакції при зазначеній вище температурі. Додавання повторюють ще два рази, залишаючи перше додавання Тийоп В на 8 годин, друге - на 16 годин, а третє - ще на 8 годин.

При розчиненні деполімеризованого продукту і при рН від 10,5 до 11,5 додається перекис водню з концентрацією 33 95 за вагою, зокрема, 0,1-10 95 літра НгОг додають з концентрацією 33 95 за вагою/кг бензалконію гепаринату і залишають для реакції при 3025 "С на 16 годин. Після закінчення часу реакції його осаджують при розчиненні ацетату натрію в метанолі, виділяючи неочищений низькомолекулярний гепарин центрифугуванням.

Осад розчиняють в очищеній воді і обробляють перекисом водню 33 95 за вагою, а саме додають 0,08:-10 95 літра НгО» 33 95 за вагою на кг бензалконію гепаринату при температурі 40:52 "С. Через 5 годин реакції розчин нейтралізують і осаджують метанолом.

Осад повторно розчиняють в очищеній воді і знову обробляють 0,05:10 95 літра НгОг 33 95 мас./об./кг бензалконію гепаринату НгОг 3395 за вагою при температурі 40 С ж 27С протягом приблизно 5 годин. Після закінчення реакції розчин нейтралізують і осаджують метанолом. Очищений продукт розчиняють у воді і проводять ліофілізацію, отримуючи 5,10 г низькомолекулярного гепарину з середньою молекулярною масою 2341 так, анти-ЕХа активністю 109 МоО/мг і анти-РІа активністю 2,8

МоО/мг і присутній на відновлювальному кінці його олігосахаридних ланцюгів вміст 1,6-безводних залишків становить 21 95, в якому частка 1,6-ангідроглюкозамінових залишків набагато нижче, ніж у 1,6-ангідроманозамінових залишків.

Далі аналізується ступінь стабільності, що корелює з кольором зразка, відзначаючи, що починаючи з десятого місяця при кімнатній температурі він має колірну ступінь 4, виміряну за допомогою колориметра марки І ІСОФ, який співвідносить колір відповідно до еталонного діапазону хроматичних кольорів, встановленого Фармакопеєю (Європейська фармакопея (2.2.2, Метод 1|)). Ступінь забарвлення, параметр, безпосередньо пов'язаний зі стабільністю продукту, дозволив визначити, що кінцевий упакований продукт не був стабільним протягом більше 10-11 місяців при кімнатній температурі, що вимагало холодного ланцюга для забезпечення стабільності продукту більше 12 місяців.

Приклад 12

Продукти, отримані в прикладах з 1 по 11, аналізують на процентний вміст 1,6-безводних залишків конкретним способом відповідно до методу, описаного в монографії "Еноксапарин натрію" ("Епохарагіп бодіит"), 1097, Європейська фармакопея 9-е вид., описаний в розділі ідентифікація В, отримані наступні результати. вв а111111111111119259111Ї1111111111111181 22411131 11111118 618аю11111Ї11111111111111577С7СсСсС2 88331111 11111114 8111111111111836611 11111114

Приклад 13

Продукт, отриманий у прикладі 1, аналізується методом ядерного магнітного резонансу, зокрема, за допомогою експериментів "Н-ЯМР і тН-ЗС НО.

Спектроскопія "Н-ЯМР була найбільш широко використовуваним методом для вивчення цих сполук через їх багаті ядра і високе гіромагнітне відношення. Область між 1,8-2,1 проміле містить сигнали, відповідні М-ацетильним або метильним групам відновних закінчень, які можуть бути включені синтетично. Область між 2,8-4,6 проміле містить більшість сигналів сахаридного кільця та має високий ступінь перекриття між ними, що ускладнює витяг структурної інформації безпосередньо з цієї області. Між 4,6-6,0 проміле знаходяться сигнали, відповідні аномерним протонам. Оскільки це набагато менш насичена сигналами область, з неї можна витягти багато корисної інформації. Крім того, у випадку НМГ, отриманих за допомогою механізму р-елімінації, вони також містять сигнали, відповідні Н4, з невідновлювальних кінців молекули.

Зокрема, сигнали, що відповідають залишкам 1,6б-ангідро, з'являються при 5,57 і 5,62 проміле, що відповідає аномерному протону структур 1,6-ангідроманозаміну і 1,6-ангідроглюкозаміну, відповідно, та як описано в літературі. Іншим двовимірним експериментом, що має особливе значення для структурної характеристики сполук цього типу, є "Н-З3С НБОС (гетероядерна одноквантова кореляція), який корелює хімічні зрушення протонів з хімічними зрушеннями вуглецю-13 і дозволяє зіставити первинні структури олігосахаридів, отриманих з САсСв5, і моносахаридний склад.

Збільшення спектральної дисперсії, що досягається за допомогою цього двовимірного методу, дозволяє кількісно визначати інтеграли сигналів, які перекриваються у відповідних одновимірних спектрах.

Сигнали, що відповідають 1,6-безводним залишкам, з'являються при 5,57-103,9 ї 5,61-104,3 проміле, що відповідає аномерному протону 1,6-ангідроманозаміновой і 1,б-ангідроглюкозаміновой структур, відповідно, і як описано в літературі і як показано на малюнках 1 і 2 для зразка продукту отримано в прикладі 1.

Приклад 14

Продукти, отримані в прикладах з 1 по 11, аналізували на вміст залишків 2-сульфоаміно-1,6- безводної-2-дезоксі-В-Ю-глюкопіранози (1,б-ангідроглюкозаміну або 1,6-ан.А) і 2-сульфоаміно-1,6- ангідро-2-дезоксі-Я-Ю-манопіранозу (1,6-ангідроманозамін або 1,6-М) відповідно до способу, відомого в сучасному світі для експериментів з "Н-3С з НБОС, отримані наступні результати. л- | ШЕУ | ШОУХ ГТМ

Приклад , . відносна частка відносна частка ан.А /1,6-ан.М 17171774 Ї771111111066 7 177771711116б501111117 11111111 11712617 Ї17711111110267777771|777171717111023111 1111113 22287117 7771111110и6в61111171771117111100877777 17771711 2001 22917110 17111111 0ив111117 11111116

Приклад 15: відтворення прикладу 1 з ЕРТ070503 і того ж прикладу з додаванням обробки перекисом водню

Приклад 1, описаний в ЕР1070503, був відтворений в тому вигляді, в якому він описаний, і з одним варіантом: додавання після деполімеризації Тийоп В двох стадій обробки перекисом водню при рН від 10,5 до 11,5, в якому на першій стадії додавали 0,08 літра Нг2гО2 33 95 мас./об./кг бензалконію гепаринату при температурі 40:22 "С (5 годин реакції) і на другій стадії 0,05 л НгО5» 33 95 за вагою на кг бензалконію гепаринату при температурі 40:22 "С протягом приблизно 5 годин.

При відтворенні прикладу 1 ЕР1070503 був отриманий низькомолекулярний гепарин, який мав на відновлювальному кінці своїх олігосахаридних ланцюгів вміст 1,6-ангідро залишків 0,3 95, в той час як при додаванні двох стадій обробки перекисом водню, описаних вище, цей вміст становив 6 95. Крім того, залишки 1,б-ангідроманозаміну більше, ніж залишки 1,б-ангідроглюкозаміну, при відтворенні прикладу 1 ЕР1070503, тоді як при обробці перекисом водню, описаної вище, молярна частка залишків 1,6-ангідроманозаміну була більше або дорівнює молярній частці залишків 1,6- ангідроманозаміну.

Відтворюють Приклад 1 з ЕР1070503 і аналізуючи ступінь стабільності, корелює з кольором зразка, було відмічено, що починаючи з десятого місяця при кімнатній температурі він має колірну ступінь 4, виміряну за допомогою колориметра марки І ІСОФ), який співвідносить колір відповідно до еталонного діапазону хроматичних кольорів, встановленого Фармакопеєю (Європейська фармакопея (2.2.2, Метод І). Однак при обробці пероксидом, описаної вище, було виявлено, що отриманий продукт стабільний при кімнатній температурі протягом 24-36 місяців, демонструючи ступінь фарбування 2б, виміряну за допомогою колориметра марки ГІСОФ, який співвідносить колір відповідно до еталонного діапазону хроматичних кольорів, встановленого Фармакопеєю (Європейська фармакопея (2.2.2, Метод І1Ї)).

Приклад 16:

Приклади 1 і З повторювали, варіюючи додані кількості перекису водню, які завжди варіювалися при кожній обробці від 0,04 до 1,0 л НегО» 33595 мас/об./кг гепаринату бензалконію (або деполімеризованого гепарину) і в проміжках від З до 20 годин. о бпротягомЗгодин, | бідпротягомЗгодин///|/77777777-сС1С 0 б,ЗпротягомЗгодин | 0 О,ЗпротягомЗгодин//|/7777777771-сС1 б,5протягомЗгодин, | О,бпротягомЗгодин///|/77777777711-сС1С о б,бпротягомЗгодин, | 0 ОбпротягомЗгодин////|/777777777-сС1С 0 б,впротягомЗгодин | 0 О,бпротягомЗгодин//|7777777711-111сС1С (о б4протягомівгодин | б.О5протягом/7годин.//| - " літри НгОг 33 95 мас./об./кг бензалконію гепаринату

У всіх випадках отримані гепарини показали середню молекулярну масу від З до 3,8 кДа та анти-

ЕХа активність від 80 до 120 МоО/мг і анти-РІМа активність від 5 до 20 МоО/мг.

Аналогічним чином, у всіх випадках отримані гепарини представляли на відновлювальному кінці своїх олігосахаридних ланцюгів вміст 1,б-ангідро залишків від 1 до 15595, а частка 1,6- ангідроглюкозамінових залишків була більше або дорівнює частці 1,6-ангідроманозамінових залишків.

о емо р Ух. ря

Фоми М М хг ж г кит сит і КК і «| а т зай ; І ь ЩЕ ї : ; і З : ї ЕН: | : 1 п Ку х : 1 Є п п х ЧІ: ї

І

ШЕ І ОЖБЕ .: її "КЕ шх н

БО |; Ко ; ИН ИН ЖК : 3 ОК: ВЕ х мії й: ї іх 1 15 :К У й ОО ВІ1 Я:

ШІ з І ІН І: :

А з І І її ї ї п з их ї іх, ї ї

Не ії кі 1 ; г

Щі че

ОК 34 "ТЕ Я

ОБ Е и Ж!

І у НЕ !

І БК Кі В и кі й : зпрнгзраагіі о заздрісні азалії ілааьмьмтнй Й ЧК рззззіітаззлізлалнн Мразааггзгіза ЇХ дання лагірівнкиміі ниві а хл Ж ХЕ жд 8 КЕ Ек плх ка и їх ох хо ша їв кох пох МЕ

ТІМ х х й Ку Ж СЯ й є я р т їх че хх

Ї : і і 1 1 Е : Й і і

А З

: і г ЦЕ гі НЕ 1 Ї :ї і ; Кк її 3 1: Її: ії т! і г Її ;

ШЕ З Те її ЕН г

І! І о ; її і: у 1 їі : й 1 і їз Ії а Її:

Й Е ії р т Ї Ї В 1 І І її | її 1

І її і х її

Ї : г ! 1 і ії і рі |і ії І: і ї І

Її і ї у гі і І зевх здав: | ж х 1 ї і вві і о кі х ї ІТ ї тк : х т х - 1 ї я ї Б

Кі 5 ж 1: і : ; ї 1 7 Х ї їх 5 і А кі, , х її МИ її: м у і Кк ; к ГА Є З к їх ЦЗ бич 2 і А ХК х і ч- й с і х. р нок ще -

ПАЛИТИ АТІКА ДАК УК УК ДИ КДКА УК УК ВАК у ку у лики

ІК ХЕ бах пл хе ке МОМ щах їх и Зх у М.І що ПОЖЕ Ж Ж 5. БАЛ ВА

Хіт

Фіг. 1 (продовження!)

пк й і вх :

Б й, ЛЯ Ж і кпк нчтячинттіЙ Ж бе дини й дя С ПОН 4 З ннннлчччччннннн й ПОН : п цех : і з З : фах : : Я : пимлю пк дик аУ : : зх я ; Це В : Як . : х : ях 5 : о : ее Чо : зо одне» : : з з хо чхк т : « . х КИ т

І шк о : 7 : ЯК : ан е : : а ни ї : БІ Слне ПЕК з мих : : скл ВВ, ще ІВ Мет ВЕ фр : же ік; з 7 Ж. ї

Ро яАл о ІЕдЖИВ ТКУ дМКеХ Ч ох : Код 1 пав и М НН дах її КУ ХЕ я ха їх й сія хе х ї1е тпоощемі і: і ї ї х 11 кА А ля в т. хі ях і Ко ї ХХ, г Аж Й ох х че ся х. шдлчтнни Котли птттводлнялллчи ветлятхеятєнццік чної муж 0 хукит они кетони ями ддвнитя : пк ї : Бо пе : Б п : ОСККУЖКТТ п

І дКх Щ : Б Бе З ві : ЗУ З й : я й : ікла ех гелів тд : сьхрз ад : Хе УИтЯ ї Щ" : Б кв з «Ж п : ШО ОКУ с щ : ВВ льох феод

Соя сь ЕОї : ЕКО копа зво ву х : Бе тк тва с ч З ща М : Кох хх тах ве» : сов ак Дт ІВ пиши х : панни м й Я 7 й Тох : ех Кк - аж ягу. Се це : се о 5 щх м : шк я ІВ пава ОМ : вана ваих пе : фер х ВИХ І у : З тю : «ктів Ти

І " пе : 5 г: : из за я хе хз хе зх хе що ха ха за з яв ях ак чя

Біде . сш їй

Фіг. 2 (продовження!

Claims

1. Спосіб одержання низькомолекулярних гепаринів із середньою молекулярною масою від 3 до 3,8 кДа, що включає наступні етапи: а) готують водний розчин гепарину натрію; Ь) додають хлорид бензалконію до розчину етапу а), щоб одержати гепаринат бензалконію; с) розчиняють гепаринат бензалконію, одержаний на етапі б), в СЬСН», додають Топ В та витримують при 20-40 "С протягом 24-48 годин; та 4) виконують щонайменше дві обробки з Н»2О» деполімеризованого гепарину, одержаного після етапу с), з розрахунку від 0,04 до 1,0 л НоО» при 33 90 мас./0б. на кожен кг деполімеризованого гепарину, для кожної обробки, в якому стадію 4) проводять при рН від 10,5 до 11,5 1 протягом не менше 3 годин при кожній обробці з Н?2О», при цьому низькомолекулярні гепарини мають на відновлювальних кінцях своїх олігосахаридних ланцюгів вміст І,б-ангідро залишків від І до 15 90, 1 при цьому молярна частка залишків 1,6-ангідроглюкозаміну більша або дорівнює молярній частці залишків 1,6б-ангідроманозаміну.

2. Спосіб за п. І, в якому додавання Тгйоп В на етапі с) здійснюють максимум трьома послідовними додаваннями, а кожне додавання Тгцоп В у ваговому співвідношенні від 0,2:1 до 0,31 Топ В:гепаринат бензалконію.

3. Спосіб за п. 1 або 2, в якому температура етапу с) становить від 25 до 35 2С.

4. Спосіб за п. 3, в якому температура етапу с) становить від 27 до 32 С.

5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, в якому стадія с) включає три послідовних додавання Топ В, так що після першого додавання реакція підтримується протягом 6-10 годин до другого додавання, після другого додавання реакція підтримується протягом 12-20 годин до третього додавання, а після третього додавання реакція зберігається протягом 6-10 годин.

6. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, в якому кожну обробку з Н»2О» на стадії 4) проводять зі співвідношенням від 0,04 до 0,5 л Н»2О» при 33 905 мас./0об. на кг деполімеризованого гепарину.

7. Спосіб за п. 6, в якому кожну обробку з НоО» на стадії 4) проводять зі співвідношенням 0,04 до 0,3 л НО» при 33 95 мас./об. на кг деполімеризованого гепарину.

8. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, в якому стадію й) проводять при температурі від 20 до 50 2С.

9. Спосіб за п. 8, в якому стадію й) проводять при температурі від 25 до 45 С.

10. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, в якому стадія 4) включає першу обробку деполімеризованого гепарину Н?2О», одержаного після стадії с), в співвідношенні від 0,05 до 0,25 л Н?2О» при 33 95 мас./0б. на кг деполімеризованого гепарину, 1 другу обробку з Н?2Оз у співвідношенні від 0,04 до 0,25 л Н?2О» при 33 95 мас./0б. на кг деполімеризованого гепарину.

11. Спосіб за будь-яким з пп. 1-10, в якому деполімеризований гепарин осаджують в метанолі між кожною стадією обробки з Н?2О».

12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-11, в якому одержаний низькомолекулярний гепарин очищають осадженням метанолом.

13. Спосіб за будь-яким з пп. 1-12, в якому одержаний низькомолекулярний гепарин піддають сублімаційному сушінню.

14. Низькомолекулярний гепарин із середньою молекулярною масою від 3 до 3,8 кДа, одержаний способом за будь-яким 3 пп. 1-13, який відрізняється тим, що низькомолекулярний гепарин має на відновлювальному кінці своїх олігосахаридних ланцюгів вміст 1,6-ангідро залишків від І до 15 90, 1 в якому молярна частка залишків 1,6- ангідроглюкозаміну більша або дорівнює молярній частці залишків 1,б-ангідроманозаміну.

15. Низькомолекулярний гепарин за п. 14, який відрізняється тим, що він має на відновлювальному кінці свого олігосахаридного ланцюга вміст 1,6-ангідро залишків від 4 до 11 95.

16. Низькомолекулярний гепарин за будь-яким з пп. 14-15, який відрізняється тим, що має анти-ЕХа-активність в діапазоні 80-120 МоО/мг та анти-ЕПа-активність в діапазоні 5-20 Мо/мг.

17. Низькомолекулярний гепарин за будь-яким з пп. 14-16, в якому вказаний гепарин має ступінь фарбування, що перевищує або дорівнює б, в діапазоні еталонних розчинів для фарбування, встановлених в Європейській фармакопеї 2.2.2. Метод ІЇ, протягом не менше 24 місяців при кімнатній температурі.

18. Низькомолекулярний гепарин за п. 17, в якому вказаний гепарин має ступінь фарбування, що перевищує або дорівнює 6, в діапазоні еталонних розчинів для фарбування, встановлених в Європейській фармакопеї 2.2.2. Метод П, протягом не менше 36 місяців при кімнатній температурі.

19. Низькомолекулярний гепарин із середньою молекулярною масою від 3 до 3,8 кДа, який відрізняється тим, що на відновлювальному кінці своїх олігосахаридних ланцюгів він має вміст 1,6-ангідро залишків від І до 15 9065, 1 в якому молярна частка залишків 1,6- ангідроглюкозаміну більша або дорівнює молярній частці залишків 1,б-ангідроманозаміну.

20. Низькомолекулярний гепарин за п. 19, який відрізняється тим, що на відновлювальних кінцях своїх олігосахаридних ланцюгів він має вміст 1,6-ангідро залишків від 4 до 11 95.

21. Низькомолекулярний гепарин за п. 19 або 20, який відрізняється тим, що має анти-ЕХа- активність в діапазоні 580-120 МО/мг та анти-ЕЦа-активність в діапазоні 5-20 МО/мг.

22. Низькомолекулярний гепарин за будь-яким з пп. 19-21, в якому вказаний гепарин має ступінь фарбування, що перевищує або дорівнює б, в діапазоні еталонних розчинів для фарбування, встановлених в Європейській фармакопеї 2.2.2. Метод ІЇ, протягом не менше 24 місяців при кімнатній температурі.

23. Низькомолекулярний гепарин за п. 22, в якому вказаний гепарин має ступінь фарбування, що перевищує або дорівнює 6, в діапазоні еталонних розчинів для фарбування, встановлених в Європейській фармакопеї 2.2.2. Метод П, протягом не менше 36 місяців при кімнатній температурі.