UA129382C2 - Агент, націлений на erbb-2, і біспецифічне антитіло з сайтами зв'язування антигену, які зв'язують епітоп на позаклітинній частині erbb-2 і erbb-3, для лікування індивіда з позитивною за erbb-2, erbb-2/erbb-3 пухлиною - Google Patents

Агент, націлений на erbb-2, і біспецифічне антитіло з сайтами зв'язування антигену, які зв'язують епітоп на позаклітинній частині erbb-2 і erbb-3, для лікування індивіда з позитивною за erbb-2, erbb-2/erbb-3 пухлиною Download PDF

Info

Publication number
UA129382C2
UA129382C2 UAA201910171A UAA201910171A UA129382C2 UA 129382 C2 UA129382 C2 UA 129382C2 UA A201910171 A UAA201910171 A UA A201910171A UA A201910171 A UAA201910171 A UA A201910171A UA 129382 C2 UA129382 C2 UA 129382C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
erbb
antigen binding
binding site
shi
antibody
Prior art date
Application number
UAA201910171A
Other languages
English (en)
Inventor
Марк Тросбі
Марк Тросби
Сесілія Анна Вільгельміна Гьоін
Сесилия Анна Вильгельмина Гёин
Девід Андре Баптіст Моссан-Детай
Дэвид Андре Баптист Моссан-Детай
Тон ЛОГТЕНБЕРГ
Original Assignee
Мерус Н.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Мерус Н.В. filed Critical Мерус Н.В.
Publication of UA129382C2 publication Critical patent/UA129382C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4709—Non-condensed quinolines and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6879—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin having two or more different antigen-binding sites, e.g. bispecific or multispecific immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Винахід стосується антитіла, що містить перший сайт зв'язування антигену, який зв'язує ЕrbВ-2, і другий сайт зв'язування антигену, який зв'язує ЕrbВ-3. Вказані антитіла, як правило, можуть знижувати викликану лігандом функцію рецептора ЕrbВ-3 на позитивній за ЕrbВ-2 і ЕrbВ-3 клітині. Також запропоновані способи лікування та застосування антитіл для візуалізації та для лікування суб'єктів з позитивною за ЕrbВ-2, ЕrbВ-3 або ЕrbВ-2/3 пухлиною.

Description

(54). АГЕНТ, НАЦІЛЕНИЙ НА ЕВВВ-», І БІСПЕЦИФІЧНЕ АНТИТІЛО З САЙТАМИ ЗВ'ЯЗУВАННЯ
АНТИГЕНУ, ЯКІ ЗВ'ЯЗУЮТЬ ЕПІТОП НА ПОЗАКЛІТИННІЙ ЧАСТИНІ ЕВВВ-2 І ЕНВВ-3, ДЛЯ ЛІКУВАННЯ
ІНДИВІДА З ПОЗИТИВНОЮ ЗА ЕНВВ-2, ЕНВВ-2/ЕНВВ-3 ПУХЛИНОЮ (57) Реферат:
Винахід стосується антитіла, що містить перший сайт зв'язування антигену, який зв'язує ЕТОВ-2, і другий сайт зв'язування антигену, який зв'язує ЕТтОВ-3. Вказані антитіла, як правило, можуть знижувати викликану лігандом функцію рецептора ЕтВ-3 на позитивній за ЕїбВ-2 і ЕбВ-3 клітині. Також запропоновані способи лікування та застосування антитіл для візуалізації та для лікування суб'єктів з позитивною за ЕТЬВ-2, ЕТЬВ-3 або ЕтОВ-2/3 пухлиною.
Дана заявка претендує на пріоритет на підставі заявки на Європейський патент Мо 17164396.8, поданої 31 березня 2017 р., і 05 15/476260, поданої 31 березня 2017 р., зміст яких даним повністю включений у дану заявку за допомогою посилання.
Даний винахід відноситься до області антитіл. Особливо, він відноситься до області терапевтичних (людських) антитіл для лікування захворювань, пов'язаних з аберантними клітинами. Більше конкретно, він відноситься до антитіл, які зв'язують ЕгоВ-2 і ЕгбВ-3, й їх застосування для зв'язування позитивних за ЕгЬВ-2 і ЕгЬВ-3 клітин, особливо пухлинних клітин.
Сімейство рецепторів епідермального фактора росту людини (НЕК, які також у сукупності називають сигнальною мережею ЕгбВ) являє собою сімейство трансмембранних рецепторних тирозинкіназ (КТК). Вказане сімейство включає рецептор епідермального фактора росту (ЕСЕК), також відомий як ЕгрВ-1 (або НЕКТ), і гомологічні рецептори ЕгтЬВ-2 (НЕНг), ЕтВ-3 (НЕКЗ) ї ЕгтбВ-4 (НЕК4). Дані рецептори (огляд яких представлений в Магдеп і Ріпез 2012) широко експресовані на епітеліальних клітинах. Підвищена експресія рецепторів НЕК або їх лігандів, таких як херегулін (НКСО) або епідермальний фактор росту (ЕСЕ), є частою подією при раку в людини (М/їзоп, Егіаіуапа й ін. 2012). Надекспресія ЕгЬВ-1 і ЕгрВ-2, зокрема, відбувається в епітеліальних пухлинах і пов'язана з пухлинною інвазією, метастазуванням, стійкістю до хіміотерапії та несприятливим прогнозом (2Ппапд, Веге2ом й ін. 2007). Було показано, що в здоровій молочній залозі ЕгЬБ-3 відіграє важливу роль в зростанні та диференціюванні епітелію просвіту. Наприклад, втрата/нгібування ЕгбВ-3 призводить до виборчого розростання базального епітелію щодо епітелію просвіту (ВаїКо, МіПег й ін. 2012). Зв'язування ліганду з позаклітинним доменом рецепторів КТК викликає димеризацію рецепторів, як між однаковими підтипами (гомодимеризація), так і між різними підтипами (гетеродимеризація) рецепторів.
Димеризація може активувати внутрішньоклітинні тирозинкіназні домени, які зазнають аутофосфорилювання та, в свою чергу, можуть активувати множину наступних сприятливих проліферації шляхів передачі сигналів, включаючи такі, опосередковані мітоген-активуючими протеїнкіназами (МАРК), і шлях, що сприяє виживаності, АК (огляд яких представлений в
Магаеп ії Ріпе5, 2012). Для ЕгбВ-2 не виявили специфічного ендогенного ліганду, і, отже, припускають, що він зазвичай передає сигнал за допомогою гетеродимеризації (Зегдіпа, Каизсп й ін. 2007). ЕгбВ-3 може активуватися при зв'язуванні з його лігандами. Дані ліганди включають, але не обмежені нейрегуліном (МКС) і херегуліном (НКО).
Були виявлені різні способи активації сигнальних шляхів через рецептори сімейства ЕгбВ.
Серед них представлені залежна від ліганду та незалежна від ліганду активація сигнальних шляхів. Надекспресований ЕгоВ-2 здатний викликати онкогенну передачу сигналів через гетеродимер ЕгоВ-2:ЕгОВ-3 навіть під час відсутності ліганду ЕгЬВ-3 (ЧипіШа, АКйа й ін. 2009).
Активність ЕгЬбВ-2 можна інгібувати специфічними до ЕгЬВ-2 антитілами. Такі специфічні до
ЕїЬВ-2 антитіла, наприклад, застосовують для лікування позитивних за ЕгЬВ-2 (НЕК2») пухлин.
Проблема з такими способами лікування полягає в тому, що часто пухлини вислизають від спрямованого на ЕгЬВ-2 лікування та продовжують рости навіть у присутності інгібуючого антитіла. Спостерігали, що позитивні за ЕгбВ-2 пухлини, такі як пухлини молочної залози, яєчників, шийки матки і шлунку, можуть вислизати від лікування шляхом селективного розростання субпопуляції пухлинних клітин, у яких спостерігають підвищену експресію ЕгЬВ-3 (Осапа, Мега-Вадіййо й ін. 2013) й/або експресію ліганду ЕгЬВ-3 (М/йівоп, ЕгідіІуапа й ін. 2012).
Також були виявлені активуючі мутації в рецепторі ЕгрВ-3.
Моноклональне антитіло проти ЕгоВ-2 трастузумаб (герцептин) і специфічний до ЕгоВ-1 цетуксимаб (ербітукс) являють собою два з декількох моноклональних антитіл, схвалених для клінічного застосування. Трастузумаб дає доведену перевагу у виживаності при метастатичному раку молочної залози (Апеада, Зіїм/КомеКі й ін. 2011). Точний механізм дії трастузумабу однозначно не встановлений. Можливі механізми дії являють собою інгібування передачі сигналів через рецепторні тирозинкінази (КТК) і залучення антитілозалежної клітинної цитотоксичності (АЗКЦ). Інші описані механізми дії включають блокування протеолітичного розщеплення позаклітинного домену ЕгбВ-2, інгібування ангіогенних факторів і збільшення ендоцитозу рецептора. Інші агенти, які перешкоджають передачі сигналів ЕгОВ-2, були схвалені або перебувають в розробці для лікування раку молочної залози й інших раків зі надекспресією
ЕтЬВ-2. Наприклад, хімічна сполука лапатиніб інгібує тирозинкіназну активність обох ЕгГЬВ-1 і
ЕІБВ-2, і його застосовують в терапії першої лінії раку молочної залози з ампліфікованим ЕгрВ- 2.
У пацієнтів з НЕК2- метастатичним раком молочної залози стійкість до трастузумабу або в якості монотерапії, або в комбінації з хіміотерапією, зазвичай розгублюється протягом місяців від початку терапії. Лише частина пацієнтів з НЕК2- метастатичним раком молочної залози бо відповідають на трастузумаб в якості окремого агента, дозволяючи запропонувати наявність механізмів стійкості де помо у розповсюджених раків. Дані механізми включають, серед інших, передачу сигналів через інші рецептори сімейства НЕК і компенсаторну передачу сигналів через КТК, що не відносяться до сімейства НЕК (ТНегу й ін., Кезібтапсе 0 Ппитап ерідегтаїЇ! дгоулА Тасіог тесеріог їуре 2-іагдеїейд Іегарієз, Еиг ) Сапсег (2014), том 50, випуск 5, сторінки 892-901 (пир:/ах.аоі.огд/10.1016/.еіса.2014.01.003)). Наприклад, надекспресія НЕКЗ або його лігандів поряд з НЕК? призводить до утворення гетеродимерів НЕК-2/НЕВ-3 і придбаної стійкості до трастузумабу. Таким чином, вважають, що антитіло трастузумаб неефективне для блокування передачі сигналів, що запускається лігандами ЕгоВ-3 (М/епгтап, Кааб й ін. 2006,
УспіШа, Акіїа й ін. 2009, ТНегу й ін. 2014).
Недавно моноклональне антитіло пертузумаб було схвалено для застосування в комбінації з трастузумабом на підставі переваги в додаткових 5 місяцях виживаності без прогресування (ВазеЇда, Сопез й ін. 2012). Пертузумаб також зв'язує ЕгрВ-2, але в ділянці, відмінній від такої для трастузумабу.
Інші стратегії лікування позитивних за ЕгрВ-2 пухлин направлені на ЕгЬВ-3. Зв'язуючі ЕгрВ-3 моноклональні антитіла продемонстрували активність в доклінічних випробуваннях (Зспоербе!!,
Еабег й ін. 2010). Деякі зв'язуючі ЕгоВ-3 моноклональні антитіла можуть інгібувати проліферацію та ріст різних видів раку.
Інша стратегія включає зв'язування обох рецепторів ЕгЬВ-2 і ЕгбВ-3. Молекула ММ-111 являє собою штучну біологічну молекулу, що містить два одноланцюгових фрагмента Ем (зсЕм), які зв'язують ЕгЬВ-2 і ЕгЬВ-3. Два вказаних зсЕм пов'язані з мутованим білком сироваткового альбуміну людини (НБЗА) для збільшення часу напівжиття молекули. У доклінічному випробуванні показали, що дана молекула інгібує передачу сигналів ЕгЬВ-3 і проліферацію.
Даний ефект переважно був виміряний на позитивні за ЕгбВ-3 лініями клітин, які експресують відносно великі кількості ЕгОоВ-2.
КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Відповідно до даного винаходу запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигену, який зв'язує ЕгрВ-2, і другий сайт зв'язування антигену, який зв'язує
ЕпВ-3, і при цьому зазначене антитіло здатне знижувати викликану лігандом функцію рецептора ЕгрВ-3 на позитивній за ЕгЬВ-2 і ЕгбВ-3 клітині. Зазначений перший сайт зв'язування антигену переважно присутній у варіабельному домені, що містить ланцюг МН з послідовністю амінокислот ланцюга МН МЕ2926; МЕ2930; МЕ1849; МЕ2973; МЕ3004; МЕ3958 (являє собою гуманізовану МЕ2971); МЕ2971; МЕ3025; МЕ2916; МЕЗ3991 (являє собою гуманізовану МЕЗ3004);
МЕЗ3031; МЕ2889; МЕ2913; МЕ1847; МЕ3001; МЕ300О3 або МЕ1898, зображену на фігурі 16А або на фігурі 16Е. Зазначений другий сайт зв'язування антигену переважно присутній у варіабельному домені, що містить ланцюг УН з послідовністю амінокислот ланцюга МН МЕЗ3178;
МЕЗ3176; МЕЗ163; МЕЗ3099; МЕЗ3307; МЕб6О55; МЕб6О56; МЕб6О57; МЕ6058; МЕб6О59; МЕ6060;
МЕб6О61; МЕ6062; МЕ606З3; МЕ60О64; МЕ 6065; МЕ60О66; МЕ6067; МЕ6068; МЕ6069; МЕ6070;
МЕб6071; МЕ6072; МЕ6073 або МЕ6074, зображеної на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37. Легкий ланцюг імуноглобуліну у варіабельному домені переважно включає послідовність амінокислот, представлену на фігурі 16С.
Антитіло згідно з даним винаходом переважно являє собою, якщо конкретно не зазначено інше, біспецифічне антитіло.
Згідно з даним винаходом додатково запропонована фармацевтична композиція, яка містить антитіло згідно з даним винаходом.
Додатково запропоноване антитіло згідно з даним винаходом, яке додатково містить мітку, переважно мітку для візуалізації іп мімо.
Відповідно до даного винаходу також запропонований спосіб лікування суб'єкта, який містить позитивну за ЕгЬВ-2, ЕтЬВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 клітину, включаючи шкідливу клітину, або пухлину, або суб'єкта, в якого є ризик розвитку зазначеної пухлини, який включає введення зазначеному суб'єкту біспецифічного антитіла згідно з даним винаходом. Також запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом для застосування для лікування суб'єкта, в якого присутня позитивна за ЕгГЬВ-2, ЕТЬВ-3 або ЕтрВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина або є ризик її розвитку.
Згідно з даним винаходом додатково запропонований спосіб лікування індивіда, в якого присутня позитивна за ЕгЬВ-2 пухлина або є ризик розвитку позитивної за ЕгЬВ-2, ЕтВ-3 або
ЕпЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлини, вказаний спосіб включає введення індивіду, що потребує цього, націленого на ЕгбВ-2 агента, включаючи інгібітор ЕгВ-2 або зв'язуючий ЕгЬВ-2 агент, наприклад, бівалентне моноспецифічне антитіло, яке містить сайт зв'язування антигена, що може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгоВ-2, і біспецифічне антитіло, яке містить сайт зв'язування антигена, що може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині 60 ЕІБВ-2, і сайт зв'язування антигена, що може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині
ЕтбВв-3.
Також запропонована комбінація націленого на ЕгоВ-2 агента, яка включає інгібітор ЕгЬВ-2 або зв'язуючий ЕгЬВ-2 агент, наприклад, бівалентне моноспецифічне антитіло, яке містить сайти зв'язування антигена, що можуть зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгЬВ-2, і біспецифічне антитіло, яке містить сайт зв'язування антигена, що може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгоВ-2, і сайт зв'язування антигена, що може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгбоВ-3, для застосування в способі лікування індивіда, в якого є позитивна за ЕгГЬВ-2, ЕТтЬВ-3 або ЕтрВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина або ризик розвитку вказаної пухлини.
Додатково запропонована фармацевтична композиція, яка містить націлений на ЕгбВ-2 агент, включаючи інгібітор ЕгоВ-2 або зв'язуючий ЕгбОВ-2 агент, наприклад, бівалентне моноспецифічне антитіло, яке містить сайти зв'язування антигена, що можуть зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгОВ-2, і біспецифічне антитіло, яке містить сайт зв'язування антигена, що може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгЬВ-2, і сайт зв'язування антигена, що може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгЬВ-3.
Також запропонований набір із частин, який включає націлений на ЕгЬВ-2 агент, включаючи інгібітор ЕгЬВ-2 або зв'язуючий ЕгЬВ-2 агент, наприклад, бівалентне моноспецифічне антитіло, яке містить сайти зв'язування антигена, що можуть зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгоВ-2, і біспецифічне антитіло, яке містить сайт зв'язування антигена, що може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгбВ-2, і сайт зв'язування антигена, що може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгрВ-3.
Також запропонований спосіб лікування індивіда, в якого є позитивна за ЕгЬВ-2 і позитивна за ЕгЬВ-3 пухлина в головному мозку або є ризик розвитку позитивної за ЕгтоВ-2 і позитивної за
ЕтВ-3 пухлини в головному мозку, вказаний спосіб включає введення індивіду, що потребує цього, біспецифічного антитіла, яке містить сайт зв'язування антигена, що може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгоВ-2, і сайт зв'язування антигена, що може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгЬВ-3.
Також запропоноване біспецифічне антитіло, яке містить сайт зв'язування антигена, що може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгтрВ-2, і сайт зв'язування антигена, що може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгЬВ-3, для застосування для лікування індивіда, в якого є позитивна за ЕгоВ-2 і позитивна за ЕгЬВ-3 пухлина в головному мозку або є ризик розвитку позитивною за ЕгрВ-2 і позитивною за ЕгбВ-3 пухлини в головному мозку.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Відповідно до даного винаходу запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгрВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує
ЕтВ-3, при цьому зазначене біспецифічне антитіло знижує або може знижувати викликану лігандом функцію рецептора ЕгтЬВ-3 на позитивній за ЕгЬВ-2 і ЕгрВ-3 клітині.
У даній заявці термін "сайт зв'язування антигена" відноситься до сайту, переважно присутньому на біспецифічному антитілі, яке здатне зв'язуватися з антигеном, й отриманому з нього. Немодифікований сайт зв'язування антигена зазвичай утворений варіабельним доменом антитіла та присутній в ньому. Варіабельний домен містить вказаний сайт зв'язування антигена.
Варіабельний домен, який зв'язує антиген, являє собою варіабельний домен, що містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує вказаний антиген.
В одному варіанті реалізації варіабельний домен антитіла згідно з даним винаходом включає варіабельну область важкого ланцюга (УН) та варіабельну область легкого ланцюга (МІ). Сайт зв'язування антигена може бути присутнім в об'єднаному варіабельному домені
МНЛ/. або тільки в області МН, або тільки в області МІ. Якщо сайт зв'язування антигена присутній тільки в одній з двох областей варіабельного домену, то друга варіабельна область може сприяти укладанню та/або стабільності зв'язуючої варіабельної області, але не вносить значний вклад у саме зв'язування антигена.
У даній заявці зв'язування антигена відноситься до звичайної здатності антитіла зв'язуватися з його антигеном. Антитіло, що містить сайт зв'язування антигена, який зв'язується з ЕгЬВ-2, зв'язується з ЕгЬВ-2 і, за інших рівних умов, щонайменше в 100 разів гірше зв'язується з гомологічними рецепторами ЕгбВ-1 і ЕгрВ-4 того ж виду. Антитіло, що містить сайт зв'язування антигена, який зв'язується з ЕгбоВ-3, зв'язується з ЕгЬВ-3 і, за інших рівних умов, не зв'язується з гомологічними рецепторами ЕгЬВ-1 і ЕгрЬВ-4 того ж виду. Враховуючи, що сімейство ЕгЬВ являє собою сімейство рецепторів на поверхні клітини, зв'язування зазвичай оцінюють на клітинах, які експресують вказаний(-ї) рецептор(и). Зв'язування антитіла з антигеном можна оцінити різними способами. Один спосіб полягає в інкубації антитіла з антигеном (переважно з клітинами, експресуючими антиген), видаленні антитіла, що не зв'язалося (переважно за допомогою етапу 60 промивання) та виявленні зв'язаного антитіла за допомогою міченого антитіла, яке зв'язується зі зв'язаним антитілом.
Зв'язування антигена антитілом зазвичай опосередковується комплементарними ділянками антитіла та специфічною тривимірною структурою як антигена, так і варіабельного домену, що дозволяє даним двом структурам точно зв'язатися один з одним (взаємодія, аналогічна взаємодії замка та ключа), на противагу довільному неспецифічному прикріпленню антитіл.
Тому що антитіло зазвичай розпізнає епітоп антигена, і так як такий епітоп може також бути присутнім в інших сполуках, антитіла згідно з даним винаходом, які зв'язуються з ЕгЬВ-2 та/або
ЕГтЬВ-3, можуть також розпізнавати інші білки, якщо такі інші сполуки містять той самий епітоп.
Отже, термін "зв'язуючий" не виключає зв'язування вказаних антитіл з іншим білком або білками, які містять той самий епітоп. Такий(-ї) інший(-і) білок(і-ки) переважно не є білком людини. Сайт зв'язування антигена ЕгрВ-2 і сайт зв'язування антигена ЕгбЬВ-3, відповідно до визначення у даному винаході, зазвичай не зв'язуються з іншими білками на мембрані клітин людини після його народження, переважно дорослої людини. Біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом зазвичай здатне зв'язувати ЕгоВ-2 і ЕтрВ-3 з афінністю зв'язування, рівною щонайменше 1х10Ое-6 М, як вказано більше докладно нижче.
Термін "перешкоджає зв'язуванню" у даній заявці означає, що антитіло спрямоване на епітоп на ЕгЬВ-3, і зазначене антитіло конкурує з лігандом за зв'язування з ЕгоВ-3. Антитіло може послабляти зв'язування ліганду, витісняти ліганд, коли він вже зв'язаний з ЕгЬВ-3, або воно може, наприклад, шляхом стеричного перешкоджання, щонайменше частково запобігати зв'язуванню даного ліганду з ЕгЬВ-3.
Термін "антитіло" у даній заявці означає білкову молекулу, яка переважно відноситься до класу білків імуноглобулінів, що містить один або більше варіабельних доменів, які зв'язуються з епітопом на антигені, при цьому такі домени отримані з варіабельного домену антитіла або гомологічні йому за послідовністю. Антитіла для застосування в терапії переважно настільки близькі до природних антитіл суб'єкта, якого лікують, наскільки це можливо (наприклад, людські антитіла для людей). Зв'язування антитіла можна виразити у поняттях специфічності й афінності. Специфічність визначає, з яким антигеном або його епітопом специфічно зв'язується сполучний домен. Афінність являє собою захід сили зв'язування з конкретним антигеном або епітопом. Специфічне зв'язування визначають як зв'язування з афінностями (КО), рівними щонайменше 1 х10е-6 М, більше переважно 1 х10е-7 М, більше переважно більшими, ніж 1 х10е- 9 М. Зазвичай, в антитіл для застосування в терапії афінності складають до 1х10е-10 М або більше. Антитіла, такі як біспецифічні антитіла згідно з даним винаходом, містять константні домени (частина Ес) з природного антитіла. Антитіло згідно з даним винаходом зазвичай являє собою біспецифічне повнорозмірне антитіло, переважно з підкласу (ДС людини. Переважно антитіло згідно з даним винаходом відноситься до підкласу ЇдДС1 людини. Такі антитіла згідно з даним винаходом мають гарні властивості у відношенні АЗКЦ, у них спостерігається підходящий час напівжиття після введення іп мімо людям, й існує методика конструювання СНЗ, яка може дозволити одержати модифіковані важкі ланцюги, які переважно утворюють гетеродимери, а не гомодимери при спільній експресії в клональних клітинах.
Антитіло згідно з даним винаходом переважно являє собою "повнорозмірне" антитіло.
Термін "повнорозмірний" згідно з даним винаходом визначений як такий, що включає по суті повне антитіло, яке, проте, не обов'язково має всі функції інтактного антитіла. Щоб уникнути сумнівів, повнорозмірне антитіло містить два важкі та два легкі ланцюги. Кожний ланцюг містить константні (С) та варіабельні (М) області, які можна розділити на домени, позначені СНІ, СНІ,
СНЗ, МН ї С, Му. Антитіло зв'язується з антигеном за допомогою варіабельних доменів, що містяться в частині Раб, і після зв'язування може взаємодіяти з молекулами та клітинами імунної системи за допомогою константних доменів, більшою частиною через Ес-область.
Терміни "варіабельний домен", "пара МН/Л/І", "МНЛ//" у даній заявці використовують взаємозамінно. Повнорозмірні антитіла згідно з даним винаходом включають антитіла, в яких можуть бути присутні мутації, що надають бажані властивості. Такі мутації не повинні являти собою делеції істотних частин кожної з областей. Проте, антитіла, з яких вилучено один або декілька амінокислотних залишків, по суті без зміни властивостей зв'язування отриманого в результаті цього антитіла, входять в обсяг терміна "повнорозмірне антитіло". Наприклад, в антитілі (дО можуть бути присутнім вставки, делеції, або їх комбінація, 1-20 амінокислотних залишків у константній області. Наприклад, активність АЗКЦ антитіла можна поліпшити, якщо саме антитіло проявляє низьку активність АЗКЦ, шляхом незначної модифікації константної області антитіла (ипа, Т. Т., К. Раггоп5 й ін. (2010). "БЗирегіог Іп мімо Ейісасу ої АГисозуїЇаїед
Тгазіигитаб іп їШте Тгеаїтепі ої НЕН2-Атріїйієа Вгеазі Сапсег." Сапсег Везеагсп 70(11): 4481- 4489) 60 Повнорозмірні антитіла ІдсС переважні завдяки їх сприятливому часу напівжиття та необхідності, щоб вони були близькі до повністю аутологічним (людським) молекулам через імуногенності. Антитіло згідно з даним винаходом переважно являє собою біспецифічне антитіло дсС, переважно біспецифічне повнорозмірне антитіло Ідс1. ІдсС1 є переважним завдяки його тривалому часу напівжиття в кровотоці людини. Для того, щоб запобігти будь-якій імуногенності в людей, переважно, щоб біспецифічне антитіло Їдс згідно з даним винаходом являло собою ІдС1 людини.
Термін "біспецифічне" (бс) означає, що одна частина антитіла (згідно з визначенням вище) зв'язується з одним епітопом на антигені, тоді як друга частина зв'язується з відмінним епітопом. Вказаний відмінний епітоп зазвичай присутній на відмінному антигені. Згідно з даним винаходом вказані перший та другий антигени фактично являють собою два різні білки.
Переважне біспецифічне антитіло являє собою антитіло, яке містить частини двох різних моноклональних антитіл і, отже, зв'язується з двома різними типами антигенів. Одне плече біспецифічного антитіла зазвичай містить варіабельний домен одного антитіла й інше плече містить варіабельний домен другого антитіла. Варіабельні області важкого ланцюга біспецифічного антитіла згідно з даним винаходом зазвичай відрізняються один від одного, тоді як варіабельні області легкого ланцюга переважно однакові у біспецифічних антитілах згідно з даним винаходом. Біспецифічне антитіло, в якому різні варіабельні області важкого ланцюга пов'язані з одним і тим самим, або загальним, легким ланцюгом, також називають біспецифічним антитілом із загальним легким ланцюгом. Отже, додатково запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, в якому обидва плеча містять загальний легкий ланцюг.
Переважні біспецифічні антитіла можна отримати шляхом спільної експресії двох різних важких ланцюгів і загального легкого ланцюга в одній клітині. Якщо використовують домени СНЗ дикого типу, то спільна експресія двох різних важких ланцюгів і загального легкого ланцюга призведе до отримання трьох різних видів: АА, АВ і ВВ. Для збільшення відсотка бажаного біспецифічного продукту (АВ) можна застосовувати конструювання СНЗ або, інакше кажучи, можна застосовувати важкі ланцюги із сумісними доменами гетеродимеризації, як описано нижче.
Термін "сумісні домени гетеродимеризації" у даній заявці відноситься до доменів білка, які сконструйовані таким чином, що сконструйований домен А" буде переважно утворювати гетеродимери з сконструйованим доменом В" і навпаки, при цьому знижена гомодимеризація між А"-А" і В'-В".
Термін "загальний легкий ланцюг" згідно з даним винаходом відноситься до легких ланцюгів, які можуть бути ідентичні або можуть містити деякі відмінності у послідовності амінокислот, при цьому специфічність зв'язування повнорозмірного антитіла не порушена. Наприклад, можливо, в рамках обсягу визначення загальних легких ланцюгів у даній заявці, отримати або знайти легкі ланцюги, які неіїдентичні, але все ж таки функціонально еквівалентні, наприклад, шляхом введення та тестування консервативних замін амінокислот, замін амінокислот у ділянках, які не вносять або вносять лише частковий внесок у специфічність зв'язування при утворенні пари з важким ланцюгом, і таке інше. Всі терміни "загальний легкий ланцюг", "загальний МІ", "один легкий ланцюг", "один МІ!", з додаванням або без терміна "перебудована", використовують взаємозамінно у даній заявці. В деякому аспекті даного винаходу застосовують в якості загального легкого ланцюга людський легкий ланцюг, який можна комбінувати з різними важкими ланцюгами з одержанням антитіл з функціональними сполучними антиген доменами (М/О2004/009618,. УМО2009/157771, Мегспапі й ін. 1998 і Мібб5іт й ін. 1994). Переважно, загальний легкий ланцюг має послідовність зародкової лінії. Переважна послідовність зародкової лінії являє собою варіабельну область легкого ланцюга, який часто використовують в людському репертуарі й яка має гарну термодинамічну стабільність, вихід і розчинність.
Переважний легкий ланцюг зародкової лінії являє собою 012, переважно перебудований легкий ланцюг каппа зародкової лінії людини Ідмк1-39"01/(5.)Кк1701 або її фрагмент або функціональний еквівалент (тобто, той самий фрагмент гена ІдмМк1-39, але відмінний фрагмент гена ІСук) (номенклатура згідно з базою даних ІМСТ, сайт у всесвітній мережі ітаої.ого). Отже, додатково запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, в якому зазначений загальний легкий ланцюг являє собою легкий ланцюг зародкової лінії, переважно перебудований легкий ланцюг каппа зародкової лінії людини, що містить фрагмент гена ІЧ9МКІ- 39, найбільше переважно перебудований легкий ланцюг каппа зародкової лінії людини ІдДМКІ- 39"01/Л9КІ01. Терміни перебудований легкий ланцюг зародкової лінії каппа людини Ідмк1- зЗ9701/Л0)Кк1701, ІБКМ1-39/ЛОКУІ1, легкий ланцюг пиМк1-39 або коротко пиМк1-39 використовують взаємозамінно у всьому тексті даної заявки. Очевидно, що фахівці в даній області зрозуміють, 60 що термін "загальна" також відноситься до функціональних еквівалентів легкого ланцюга,
послідовність амінокислот яких не ідентична. Існує множина варіантів зазначеного легкого ланцюга, в яких присутні мутації (делеції, заміни, вставки), які суттєво не впливають на утворення функціональних сполучних областей. Легкий ланцюг згідно з даним винаходом також може являти собою легкий ланцюг згідно з визначенням, наведеним вище у даній заявці, що містить вставки, делеції, заміни 1-5 амінокислот, або їх комбінацію.
Також запропоновані антитіла, в яких МН здатний специфічно розпізнавати перший антиген і
МІ, що утворює пару з МН у варіабельному домені імуноглобуліну, здатна специфічно розпізнавати другий антиген. Отриманий в результаті цієї пари МН/Л/. буде зв'язуватися або з антигеном 1, або з антигеном 2. Такі так звані "антитіла два в одному", описані, наприклад, у
МО 2008/027236, УМО 2010/108127 ії 5спаеєтег й ін. (Сапсег Сеї! 20, 472-486, жовтень 2011 р.), відрізняються від біспецифічних антитіл згідно з даним винаходом, і далі їх називають антитілами "два в одному". Такі антитіла "два в одному" містять ідентичні плечі та не є антитілами згідно з даним винаходом.
Термін "ЕгтЬВ-2" у даній заявці відноситься до білка, який в людей кодується геном ЕКВВ-2.
Альтернативні назви даного гена або білка включають СО340; НЕК-2; НЕВ-2/пеи; МІ-М 19; МЕ;
МО ТКА. Ген ЕКВВ-2 часто називають НЕКЗ (від рецептора епідермального фактора росту 2 людини). Якщо у даній заявці згадують ЕгЬВ-2, то таке згадування відноситься до ЕгбВ-2 людини. Антитіло, що містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-2, зв'язується з ЕгоВ- 2 людини. Сайт зв'язування антигена ЕгбВ-2, внаслідок подоби послідовностей та третинних структур між ортологами з людини й інших ссавців, може також зв'язувати такий ортолог, але не обов'язково. Номера доступу в базі даних для білка ЕгОВ-2 людини і кодуючого його гена наступні: МР 001005862.1, МР 004439.2 МС 000017.10 МТ 010783.15 МС 018928.2. Номера доступу насамперед дані, щоб забезпечити додатковий спосіб ідентифікації ЕгЬВ-2 як мішені, фактична послідовність білка ЕгЬВ-2, пов'язаного з антитілом, може змінюватися, наприклад, внаслідок мутації в кодуючому гені, такому що зустрічається при деяких видах раку або тому подібного. Сайт зв'язування антигена ЕгоВ-2 зв'язує ЕгЬВ-2 і різні його варіанти, такі як варіанти, які експресуються деякими позитивними за ЕгЬВ-2 пухлинними клітинами.
Термін "зв'язуючий ЕгоВ-2 агент" у даній заявці відноситься до будь-якої молекули або сполуки, здатної зв'язуватися з ЕгоВ-2. "Інгібітор ЕгЬВ-2" у даній заявці відноситься до будь-якої
Зо молекули або сполуки, здатної знижувати або послабляти, або безпосередньо, або опосередковано, активність ЕгЬВ-2. Такий інгібітор може являти собою низькомолекулярну сполуку або може являти собою біологічний агент, наприклад, антитіло.
Термін "ЕтЬВ-3" у даній заявці відноситься до білка, який в людей кодується геном ЕКВВ-3.
Альтернативні назви даного гена або білка включають НЕКЗ; 0052; МОА-ВЕ-1; с-ЕгПЬВ-3; с- егрр-3; епор-3-5; р180-ЕгрЬ-3; р45-5ЕтЬр-3; і р8а5-5Егрр-3. Якщо у даній заявці згадують ЕгГЬВ-3, то таке згадування відноситься до ЕгтбВ-3 людини. Антитіло, що містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-3, зв'язує ЕгбВ-3 людини. Сайт зв'язування антигена ЕгЬВ-3, внаслідок подоби послідовностей та третинних структур між ортологами з людини й інших ссавців, може також зв'язувати такий ортолог, але не обов'язково. Номера доступу в базі даних для білка ЕгбВ-3 людини і кодуючого його гена наступні: МР 001005915.1 МР 001973.2,
МС 000012.11 МС 018923.2, МТ 029419.12. Номера доступу насамперед дані, щоб забезпечити додатковий спосіб ідентифікації ЕгЬВ-3 як мішені, фактична послідовність білка ЕгрВ-3, пов'язаного з антитілом, може змінюватися, наприклад, внаслідок мутації в кодуючому гені, такому що зустрічається при деяких видах раку або тому подібного. Сайт зв'язування антигена
ЕгтВ-3 зв'язує ЕгрВ-3 і різні його варіанти, такі як варіанти, які експресують деякі позитивні за
ЕїбВ-2 пухлинні клітини.
Термін "зв'язуючий ЕгоВ-3 агент" у даній заявці відноситься до будь-якої молекули або сполуки, здатної зв'язуватися з ЕгОВ-3. "Інгібітор ЕгЬВ-3" у даній заявці відноситься до будь-якої молекули або сполуки, здатної знижувати або послабляти, або безпосередньо, або опосередковано, активність ЕгЬВ-3. Такий інгібітор може являти собою антитіло, наприклад, патритумаб, ММ-121 (серибантумаб), лумретузумаб.
Біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, яке містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгтоВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгоВ-3, може знижувати або знижує викликану лігандом функцію рецептора ЕгоВ-3 на позитивній за ЕгЬВ-2 і
ЕїбВ-3 клітині. У присутності надлишку ЕтЬВ-2 гетеродимери ЕгоВ-2/ЕтЬВ-3 можуть дати сигнал до росту експресуючій клітині у відсутності детектуємого ліганду для ЕгоВ-3 ланцюга в гетеродимері. Дану функцію рецептора ЕгЬВ-3 у даній заявці називають незалежною від ліганду функцією рецептора ЕгЬВ-3. Гетеродимер ЕгЬВ-2/Е(т0В-3 також дає сигнал до росту експресуючій клітині у присутності ліганду ЕгбВ-3. Дану функцію рецептора ЕгбЬВ-3 у даній 60 заявці називають викликаною лігандом функцією рецептора ЕгрВ-3.
Термін "ліганд ЕгЬВ-3" у даній заявці відноситься до поліпептидів, які зв'язують й активують
ЕтЬВ-3. Приклади лігандів ЕГгбОВ-3 включають, але не обмежені перерахованими: нейрегулін 1 (МКО) і нейрегулін 2, бетацелюлін, зв'язуючий гепарин епідермальний фактор росту й епірегулін. Даний термін включає біологічно активні фрагменти та/або варіанти зустрічаємого у природі поліпептиду.
У переважному варіанті реалізації даного винаходу викликана лігандом функція рецептора
ЕгЬВ-3 являє собою викликаний лігандом ЕгЬВ-3 ріст позитивної за ЕгЬВ-2 і ЕгоЬВ-3 клітини. У переважному варіанті реалізації вказана клітина являє собою клітину МСЕ-7 (АТОСФ НТВ-22 М); клітину БКВАКЗ (АТССФ НТВ-30 мМ); клітину МСІ-87 (АТОСЯО СТІ -5822"7М); клітину ВхРС-3-ІШс2 (Регкіп ЕІтег 125058), клітину ВТ-474 (АТССЯ НТВ-20 М) або клітину УМТ-1 (05М2 Мо: АСС 589).
У переважному варіанті реалізації позитивна за ЕгЬВ-2 і ЕгЬВ-3 клітина містить щонайменше 50000 рецепторів ЕгЬВ-2 на своїй поверхні. У переважному варіанті реалізації щонайменше 100000 рецепторів ЕгбВ-2. В одному переважному варіанті реалізації позитивна за ЕгрВ-2 і
ЕїбВ-3 клітина містить щонайменше 1000000 рецепторів ЕгЬВ-2 на своїй поверхні. В іншому переважному варіанті реалізації позитивна за ЕгЬВ-2 і ЕгЬВ-3 клітина містить не більше 1000000 рецепторів ЕгбВ-2 на своїй поверхні. Використовувані в даний час методи лікування, такі як трастузумаб (герцептин) і пертузумаб, назначають тільки пацієнтам зі злоякісними позитивними за ЕгбЬВ-2 клітинами, які містять більше 1000000 рецепторів ЕгобВ-2 на своїй поверхні, щоб отримати клінічну відповідь. Пацієнтів з позитивними за ЕгЬВ-2 пухлинними клітинами з більше ніж 1000000 рецепторами ЕгЬ8В-2 на їх поверхні зазвичай класифікують як ЕгЬВ-2 (--).
Пацієнтів класифікують, наприклад, застосовуючи імуногістохімію або флуоресцентну гібридизацію іп 5йи. НегсерТеві М і/або НЕК2 РІЗН (рпагт Ох М) обидва реалізуються на ринку компанією ЮБако ЮОептагк А/5, і/або можна застосовувати тест НЕКтагкФ), реалізований на ринку компанією Моподгат Віозсіепсе5. Трастузумаб і пертузумаб назначають тільки ЕгЬВ-2 (---ї пацієнтам, тому що у пацієнтів з більше низькими концентраціями ЕгЬВ-2 зазвичай не виявляють достатньої клінічної відповіді при лікуванні трастузумабом і пертузумабом. У даному винаході, проте, запропоновані біспецифічні антитіла, які також проявляють поліпшену афінність зв'язування з клітинами з більше низькою концентрацією рецептора ЕгрВ-2 у порівнянні з трастузумабом. У прикладах показано, що проліферації таких клітин з більше низькою експресією ЕгЬВ2 ефективно протидіють за допомогою антитіла згідно з даним винаходом. Така більше низька концентрація рецептора ЕгбВ-2 присутня на злоякісних клітинах пацієнтів, яких класифікують як ЕгОВ-2 (ї-4Ї або ЕгЬВ-2 І. Також у рецидивуючих позитивних за
ЕтВ-2 пухлинах часто концентрація рецептора ЕгбВ-2 виявляється більше низькою, ніж 1000000 рецепторів на клітину. Таких ЕгрВ-2 (44 або ЕгЬВ-2 Г-4| пацієнтів, а також пацієнтів з рецидивуючою позитивною за ЕгЬВ-2 пухлиною, отже, переважно лікують біспецифічним антитілом згідно з даним винаходом. Отже, додатково запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгрВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгОВ-3, при цьому зазначене антитіло може знижувати викликаний лігандом ріст позитивної за ЕгЬВ-2 і ЕтЬВ-3 клітини, яка містить менше 1000000 рецепторів
ЕГтЬВ-2 на своїй поверхні. Також запропонований спосіб лікування суб'єкта, в якого є позитивна за ЕгЬВ-2, ЕТЬВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина або в якого є ризик розвитку пухлини, при цьому вказана пухлина містить на поверхні клітини менше 1000000 рецепторів ЕгЬВ-2 на клітину, вказаний спосіб включає введення вказаному суб'єкту біспецифічного антитіла або фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом. Також у даній заявці запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом для застосування для лікування суб'єкта, в якого присутня позитивна за ЕгрВ-2, ЕТЬВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина або є ризик її развитку, при цьому вказана пухлина містить на поверхні клітини менше 1000000 рецепторів ЕгоВ-2 на клітину. Зазначене антитіло згідно з даним винаходом зазвичай здатне знижувати викликану лігандом функцію рецептора ЕгрВ-3, переважно викликаний лігандом ріст, на позитивній за
ЕпПЬВ-2 ї ЕгЬВ-3 клітині. Зазначене антитіло згідно з даним винаходом переважно містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен | ЕгтбВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен І ЕгтбВ-3. В одному переважному варіанті реалізації афінність вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгтбВ-3 клітини дорівнює або більше, ніж афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгоВ-2 клітини, що більше докладно пояснено нижче у даній заявці. Афінність вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за
ЕгЬВ-3 клітини переважно нижче або дорівнює 2,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,39 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,99 нМ. Афінність вказаного першого сайту 60 зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгбВ-2 клітини переважно нижче або дорівнює 5,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 4,5 нМ, переважно нижче або дорівнює 4,0 нМ.
В одному переважному варіанті реалізації зазначене антитіло згідно з даним винаходом містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше одну амінокислоту домену І ЕгрВ- 2, вибрану з групи, що складається з 144, Т164, К166, Р172, 5179, 5180 і К181, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах приблизно 5 положень амінокислот від Т144, Т164, К166, Р172, 5179, 5180 або К181.
В одному переважному варіанті реалізації зазначене антитіло згідно з даним винаходом переважно містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше одну амінокислоту домену Ш ЕгЬВ-3, вибрану з групи, що складається з К426б, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах 11,2 А від 426 у нативному білку ЕгОВ-3.
Для того, щоб встановити, чи є пухлина позитивною за ЕгбЬВ-3, кваліфікований фахівець може, наприклад, визначити ампліфікацію ЕгоВ-3 і/або забарвлення ЕгбрВ-3 при імуногістохімії.
Щонайменше 10 95 пухлинних клітин у біоптаті повинні бути позитивними. Біоптат також може містити 20 95, ЗО 95 40 965 50 965 60 965 70 96 або більше позитивних клітин.
У даній заявці викликана лігандом функція рецептора знижується щонайменше на 20 95, переважно щонайменше на 30, 40, 50 60 або щонайменше на 70 95, в особливо переважному варіанті реалізації викликана лігандом функція рецептора знижується на 80, більше переважно на 90 95. Зазначене зниження переважно визначають шляхом визначення викликаної лігандом функції рецептора у присутності біспецифічного антитіла згідно з даним винаходом й її порівняння з такою самою функцією у відсутності антитіла за інших рівних умов. Вказані умови включають щонайменше присутність ліганду ЕтоВ-3. Кількість присутнього ліганду переважно являє собою кількість, яка викликає половину максимального росту позитивної за ЕгЬВ-2 і ЕгЬВ-
З лінії клітин. Позитивна за ЕгоВ-2 і ЕгГЬВ-3 лінія клітин для даного теста переважно являє собою лінію клітин МСЕ-7 (АТОСФ НТВ-22 М), лінію клітин 5КВЕЗ лінію клітин (АТССФ НТВ-30 М), лінію клітин УМТ-1 (0547 АСС 589) або лінію клітин МСІ-87 (АТССФ СК -5822 М). Тест і/або ліганд для визначення викликаної лігандом ЕгоВ-3 функції рецептора переважно являє собою тест на викликане лігандом ЕгрВ-3 зниження росту, як описано в розділі Приклади.
Білок ЕгЬВ-2 містить декілька доменів (для довідки див. фігуру 1 в І апддгаї, ЕЕ Вгєавзі Сапсег
Ве5. 2007; 9(1): 202-). Позаклітинні домени називають доменами І-ЇМ. Місце зв'язування з відповідними доменами сайтів зв'язування антигена на антитілах, описаних у даній заявці, було картовано (див. приклади). Біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом з сайтом зв'язування антигена (першим сайтом зв'язування антигена), який зв'язує домен І або домен ЇМ
ЕтЬВ-2 (перший сайт зв'язування антигена), містить варіабельну область важкого ланцюга, яка зберігає значну специфічність зв'язування й афінність до ЕгЬВ-2 в комбінації з різними легкими ланцюгами. Було виявлено, що біспецифічні антитіла з сайтом зв'язування антигена (першим сайтом зв'язування антигена), який зв'язує домен І або домен ІМ ЕгЬВ-2 (перший сайт зв'язування антигена), і з сайтом зв'язування антигена ЕгбВ-3 (другим сайтом зв'язування антигена) більш ефективно знижують викликану лігандом функцію рецептора ЕгбВ-3 у порівнянні з біспецифічним антитілом, який містить сайт зв'язування антигена (перший сайт зв'язування антигена), який зв'язується з другим позаклітинним доменом ЕгрВ-2. Біспецифічне антитіло, що містить сайт зв'язування антигена (перший сайт зв'язування антигена), який зв'язує
ЕТЬВ-2, при цьому вказаний сайт зв'язування антигена зв'язується з доменом І або доменом ІМ
ЕїЬбВ-2 є переважним. Переважно вказаний сайт зв'язування антигена зв'язується з доменом ЇМ
ЕтВ-2. Виявили, що біспецифічне антитіло з сайтом зв'язування антигена (першим сайтом зв'язування антигена), який зв'язує ЕгтбВ-2, й який додатково викликає АЗКЦ, більш ефективно, ніж інші зв'язуючі ЕгоВ-2 антитіла, які не проявляють значну активність АЗКЦ, зокрема, іп мімо.
Біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, яке проявляє АЗКЦ, отже, переважне.
Виявили, що антитіла, в яких вказаний перший сайт зв'язування антигена зв'язується з доменом
ІМ Еї08-2, мають власну активність АЗКЦ. Домен І, зв'язуючий пов'язуюче ЕгЬВ-2 антитіло, яке має низьку власну активність АЗКЦ, можна сконструювати, щоб підвищити активність АЗКЦ. Ес- області опосередковують функцію антитіла шляхом зв'язування з різними рецепторами на імунних ефекторних клітинах, таких як макрофаги, клітини-природні кілери, В-клітини і нейтрофіли. Деякі з даних рецепторів, такі як СО1б6А (ЕсуУКПА) ї СОЗ2А (ЕсукІІА), активують клітини, щоб вони сформували відповідь на антигени. Інші рецептори, такі як СОЗ2В, інгібують активацію імунних клітин. Шляхом конструювання Ес-областей (за допомогою введення замін амінокислот), які зв'язуються з активуючими рецепторами з більшою селективністю, можна створити антитіла, які мають більшу здатність опосередковувати види цитотоксичної активності, необхідні для протиракового МАТ.
Однієї методикою збільшення АЗКЦ антитіла є дефукозилювання (див. наприклад, «ипйа, 60 Т. Т., К. Рагбоп5 й ін. (2010). "Бирегіог Іп мімо Ейсасу ої АГисозуїаїва Тгазіигитар іп Ше
Тгеайтепі ої НЕН2-Атрійіей Вгеазі Сапсег" Сапсег Незеатгсй 70(11): 4481-4489). Отже, додатково запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, яке дефукозильовано. В якості альтернативи або доповнення, можна використовувати множину інших стратегій, щоб добитися підвищення АЗКЦ, наприклад, включаючи глікоіїнженерію (Куожма
Накко/Віоуга, СІусАгпі (Коспе) й Еигека ТПегареціїс5) і мутагенез (Хепсог і Масгодепісв), в усіх з яких намагаються збільшити зв'язування Ес з низькоафінним активуючим ЕсукКІШа і/або зменшити зв'язування з низькоафінним інгібіторним Есукір.
Існує декілька способів іп міго для визначення ефективності антитіл або ефекторних клітин відносно індукції АЗКЦ. Серед даних способів є аналізи вивільнення хрому-51 |Сго1), аналізи вивільнення європія (Еч| й аналізи вивільнення сірки-35 (535). Зазвичай мічену лінію клітин- мішеней, яка екпресує деякий виставлений на поверхню антиген, інкубують з антитілом, специфічним до даного антигена. Після промивання ефекторні клітини, які експресують Ес- рецептор СО16, зазвичай спільно інкубують з міченими антитілом клітинами-мішенями. Згодом зазвичай вимірюють лізис клітини-мішені з вивільнення внутрішньоклітинної мітки, наприклад, за допомогою сцинтиляційного лічильника або спектрофотометрії. Переважний аналіз докладно описаний у Прикладах.
Однією перевагою даного винаходу є той факт, що зв'язування антитіл згідно з даним винаходом, таких як, наприклад, РВ4188, з позитивними за ЕгОВ-2 і ЕгЬВ-3 клітинами призводить до того самого рівня інтерналізації як і застосування трастузумабу. Якщо використовують комбінацію трастузумабу та пертузумабу, то інтерналізація даних антитіл збільшується. Така підвищена інтерналізація, проте, призводить до зниженої АЗКЦ. Антитіло згідно з даним винаходом, що призводить до інтерналізації по суті на тому самому рівні, що і трастузумаб, отже, є більше переважним, ніж комбінація трастузумабу та пертузумабу, оскільки з таким антитілом активність АЗКЦ краще підтримується.
Антитіло згідно з даним винаходом, що містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгоВ- 3, перешкоджає зв'язуванню ліганду ЕгоВ-3 з ЕгОВ-3. Такі антитіла більш ефективно знижують викликану лігандом функцію рецептора ЕгЬВ-3 на лінії позитивних за ЕгЬВ-2 і ЕгрВ-3 клітин, особливо в контексті біспецифічного антитіла, яке також містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-2.
У переважних варіантах реалізації даного винаходу запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгтрВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕГЬВ-3, при цьому вказаний перший сайт зв'язування антигена зв'язує домен І ЕгоВ-2. У прикладах показано, що біспецифічні антитіла, що мають дані властивості, в достатній мірі здатні зв'язувати позитивні за ЕгЬВ-2 і ЕгЬВ-3 клітини та протидіяти їх активності (такій як викликана лігандом функція рецептора ЕгрВ-3 і викликаний лігандом ріст позитивної за
ЕтВ-2 і ЕгВЗ3 клітини). Більше того, біспецифічні антитіла згідно з даним винаходом, що містять перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен І ЕгоВ-2, особливо підходять для застосування в комбінації з існуючими спрямованими проти ЕгЬВ-2 методами лікування, такими як трастузумаб і пертузумаб, тому що трастузумаб і пертузумаб зв'язують різні домени ЕгЬВ-2.
Трастузумаб зв'язує домен ІМ ЕгЬВ-2, і пертузумаб зв'язує домен ІІ ЕгЬВ-2. Отже, біспецифічні антитіла згідно з даним винаходом, які зв'язуються з доменом І ЕгЬВ-2, переважні, тому що вони не конкурують з трастузумабом і пертузумабом за той самий епітоп.
В іншому переважному варіанті реалізації запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгГЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕтЬВ-3, при цьому вказаний другий сайт зв'язування антигена зв'язує домен ЇЇ ЕгЬВ-3.
Таке антитіло згідно з даним винаходом особливо підходить для комбінованої терапії із застосовуваними в даний час спрямованими проти ЕгЬВ-3 зв'язуючими молекулами, які не зв'язують домен Ії ЕгбВ-3, такими як ММ-121 (МегітаскК РНагтасеціїсаіє; також називають
МоАБб) і КО7116 (Коспе), які зв'язуються з доменом | ЕгбВ-3, тому що тоді різні зв'язуючі молекули не конкурують один з одним за той самий епітоп.
Переважно запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгтЬВ-3, при цьому вказаний перший сайт зв'язування антигена зв'язує домен | ЕгбВ-2 і вказаний другий сайт зв'язування антигена зв'язує домен І ЕгбОВ-3. Таке антитіло особливо підходить для комбінованої терапії зі спрямованими проти ЕгЬВ-2 зв'язуючими молекулами, які не зв'язують домен | ЕгЬВ-2, такими як трастузумаб і пертузумаб, і зі спрямованими проти ЕгрВ-3 зв'язуючими молекулами, які не зв'язують домен ІІЇ ЕгЬВ-3, такими як ММ-121 (МодБЬб) і КО7116.
В одному переважному варіанті реалізації запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгГЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який 60 зв'язує ЕГЬВ-3, при цьому вказаний перший сайт зв'язування антигена зв'язує домен І ЕгрВ-2 і вказаний другий сайт зв'язування антигена зв'язує домен І ЕгЬВ-3, і при цьому зазначене антитіло здатне знижувати викликану лігандом функцію рецептора ЕгтЬВ-3 на позитивній за
ЕїбВ-2 і ЕгГЬВ-3 клітині. Зазначене антитіло переважно може зменшувати викликаний лігандом ріст позитивної за ЕгоВ-2 і ЕгЬВ-3 клітини.
У додаткових варіантах реалізації даного винаходу запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгтрВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгОВ-3, при цьому афінність (КО) вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгЬВ-3 клітини дорівнює або більше, ніж афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕтрВ-2 клітини.
На противагу біспецифічним сполукам відомого рівня техніки, таким як, наприклад, ММ-111 від
Ме!тітаск РПагтасецшіїсаі5, які мають більше високу афінність до ЕгбЬВ-2, ніж до ЕгбВ-3, відповідно до даного винаходу запропоновані біспецифічні антитіла, які містять специфічне до
ЕпВ-3 плече з афінністю до ЕгбВ-3 на клітинах, яка більше, ніж афінність специфічного до
ЕтЬВ-2 плеча до ЕгЬВ-2 на клітинах. Такі біспецифічні антитіла здатні краще зв'язувати ЕгЬВ-3, незважаючи на на низьку концентрацію ЕгрВ-3 на поверхні клітини. Це забезпечує перевагу, яка полягає в тому, що функціональна активність проти ЕгЬВ-3 підвищена у порівнянні із сполуками відомого рівня техніки, це означає, що дані біспецифічні антитіла згідно з даним винаходом краще здатні протидіяти активності ЕгЬВ-3 (такий як викликаний лігандом ріст).
У даній заявці термін "афінність" відноситься до значення КО.
Афінність (КО) вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгрВ-3 клітини переважно нижче або дорівнює 2,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,5 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,39 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,99 НМ. В одному переважному варіанті реалізації афінність вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до ЕгоВ-3 на клітинах 5К-ВВ8-3 нижче або дорівнює 2,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,5 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,39 нМ, переважно нижче або дорівнює 0,99 нМ. В одному варіанті реалізації вказана афінність перебуває в діапазоні 1,39-0,59 нМ. В одному переважному варіанті реалізації афінність вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до ЕгЬВ-3 на клітинах ВТ-474 нижче або дорівнює 2,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,5 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,0 нМ, більше переважно нижче, ніж 0,5 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,31 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,23 нМ. В одному варіанті реалізації вказана афінність перебуває в діапазоні 0,31-0,15 нМ. Наведені вище афінності переважно виміряні шляхом вимірювання афінності клітини в стаціонарному стані, при цьому клітини інкубують при 42С, застосовуючи мічене радіоактивною міткою антитіло, після чого вимірюють пов'язану з клітиною радіоактивність, як описано в розділі Приклади.
Афінність (КО) вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгрВ-2 клітини переважно нижче або дорівнює 5,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 4,5 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,9 НМ. В одному переважному варіанті реалізації афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до ЕгбВ-2 на клітинах 5К-ВВ-3 нижче або дорівнює 5,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 4,5 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 4,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,5 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 2,3 нМ. В одному варіанті реалізації вказана афінність перебуває в діапазоні 3,0-1,6 нМ. В одному переважному варіанті реалізації афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до
ЕгтЬВ-2 на клітинах ВТ-474 нижче або дорівнює 5,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 4,5 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,9 нМ. В одному варіанті реалізації вказана афінність перебуває в діапазоні 4,5-3,3 НМ. Наведені вище афінності переважно виміряні шляхом вимірювання афінності клітини в стаціонарному стані, при цьому клітини інкубують при 49С, застосовуючи мічене радіоактивною міткою антитіло, після чого вимірюють пов'язану з клітиною радіоактивність, як описано в розділі Приклади.
В одному переважному варіанті реалізації запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, при цьому афінність (КО) вказаного біспецифічного антитіла по відношенню до клітин ВТ-474 нижче або дорівнює 5,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 4,5 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 4,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,5 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,7 НМ, переважно нижче або дорівнює 3,2 нМ. В одному варіанті реалізації вказана афінність перебуває в діапазоні 3,7-2,7 нМ. В одному переважному варіанті реалізації запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, при цьому афінність вказаного біспецифічного антитіла по відношенню до клітин ЗК-ВНА-3 нижче або дорівнює 5,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 4,5 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 60 4,0 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,5 НМ, більше переважно нижче або дорівнює
3,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 2,5 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 2,0 нМ. В одному варіанті реалізації вказана афінність перебуває в діапазоні від 2,4-1,6 нМ. Знову, наведені вище афінності переважно виміряні шляхом вимірювання афінності клітини в стаціонарному стані, при цьому клітини інкубують при 42С, застосовуючи мічене радіоактивною міткою антитіло, після чого вимірюють пов'язану з клітиною радіоактивність, як описано в розділі
Приклади.
У додаткових переважних варіантах реалізації даного винаходу запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгГОВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгоВ-3, при цьому афінність (КО) вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгоВ-3 клітини дорівнює або більше, ніж афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгЬВ-2 клітини, і при цьому зазначене антитіло здатне знижувати викликану лігандом функцію рецептора ЕгЬВ-3 на позитивній за ЕгГЬВ-2 і ЕгЬВ-3 клітині. Зазначене антитіло переважно може зменшувати викликаний лігандом ріст позитивної за ЕгЬВ-2 і ЕгЬВ-3 клітини.
Наведені вище антитіла згідно з даним винаходом з високою афінністю до ЕгбВ-3 переважно зв'язують домен | ЕгЬВ2 і/або домен І ЕгбВ-3. Отже, додатково запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен І ЕгЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-3, при цьому афінність (КО) вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за
ЕтВ-3 клітини дорівнює або більше, ніж афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгтбВ-2 клітини. Також запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує
ЕІЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен І ЕгрВ-3, при цьому афінність вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгтбВ-3 клітини дорівнює або більше, ніж афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгоВ-2 клітини. В особливо переважному варіанті реалізації запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен | ЕтрВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен ІЇЇ ЕгЬВ-3, при цьому афінність вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгОВ-3 клітини дорівнює або більше, ніж афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгЬВ-2 клітини.
Вказаний другий сайт зв'язування антигена переважно зв'язує домен ІП ЕгЬВ-3 і має афінність (КО) по відношенню до позитивної за ЕгЬВ-3 клітини, яка нижче або дорівнює 2,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,5 нМ, переважно нижче або дорівнює 1,39 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,99 нМ. В одному переважному варіанті реалізації вказаний другий сайт зв'язування антигена зв'язує домен І ЕгЬВ-3 і має афінність до ЕгЬВ-3 на клітинах
ЗК-ВА-3, яка нижче або дорівнює 2,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,5 НМ, переважно нижче або дорівнює 1,39 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,99 нМ. В одному варіанті реалізації вказана афінність перебуває в діапазоні 1,39-0,59 нМ. В одному переважному варіанті реалізації вказаний другий сайт зв'язування антигена зв'язує домен ЇЇ
ЕГЬВ-3 і має афінність до ЕгоВ-3 на клітинах ВТ-474, яка нижче або дорівнює 2,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,5 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,5 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,31 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,23 нМ. В одному варіанті реалізації вказана афінність перебуває в діапазоні 0,31-0,15 нМ.
Вказаний перший сайт зв'язування антигена переважно зв'язує домен | ЕгбОВ-2 і має афінність (КО) по відношенню до позитивної за ЕгЬВ-2 клітини, яка нижче або дорівнює 5,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 4,5 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,9 нМ. В одному переважному варіанті реалізації вказаний перший сайт зв'язування антигена зв'язує домен І ЕгоВ-2 і має афінність до ЕгоВ-2 на клітинах 5К-ВВ-3, яка нижче або дорівнює 5,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 4,5 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 4,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,5 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 2,5 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 2,3 нМ. В одному варіанті реалізації вказана афінність перебуває в діапазоні 3,0-1,6 нМ. Афінність вказаного біспецифічного антитіла по відношенню до клітин 5К-ВА-3 переважно нижче або дорівнює 5,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 4,5 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 4,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,5 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 2,5 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 2,4 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 2,0 нМ. В одному варіанті реалізації 60 вказана афінність перебуває в діапазоні від 2,4-1,6 НМ.
В одному переважному варіанті реалізації вказаний перший сайт зв'язування антигена зв'язує домен | ЕгоВ-2 і має афінність (КО) до ЕгоВ-2 на клітинах ВТ-474, яка нижче або дорівнює 5,0 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 4,5 нМ, переважно нижче або дорівнює 3,9 НМ. В одному варіанті реалізації вказана афінність перебуває в діапазоні 4,5-3,3 НМ.
Афінність вказаного біспецифічного антитіла по відношенню до клітин ВТ-474 переважно нижче або дорівнює 5,0 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 4,5 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 4,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,7 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,2 нМ. В одному варіанті реалізації вказана афінність перебуває в діапазоні 3,7- 2,7 НМ.
Знову, наведені вище афінності переважно виміряні шляхом вимірювання афінності клітини в стаціонарному стані, при цьому клітини інкубують при 49С, застосовуючи мічене радіоактивною міткою антитіло, після чого вимірюють пов'язану з клітиною радіоактивність, як описано в розділі Приклади.
В іншому переважному варіанті реалізації запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕГоВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕтоВ-3, при цьому зазначене антитіло може знижувати викликану лігандом функцію рецептора ЕгбВ-3 на позитивній за ЕгтбВ-2 і ЕгбВ-3 клітині, при цьому зазначене біспецифічне антитіло значно не впливає на виживаність кардіоміоцитів.
Кардіотоксичність являє собою відомий фактор ризику при націлених ЕгоВ-2 методах лікування, і частота ускладнень підвищується, коли трастузумаб застосовують в комбінації з антрациклінами, тим самим викликаючи серцевий стрес. Наприклад, комбінація доксицикліну (БОХ) з трастузумабом виявляє важкі побічні дії на серце. В клінічних дослідженнях оцінили, що у від 5 95 до 10 95 пацієнтів, які одержують трастузумаб у комбінації з ад'ювантом для лікування раку молочної залози, розвивається дисфункція серця (Спцагпегі й ін., У Сііп Опсої!., 1985, 3:818- 26; Емжег М5 й ін., Маї Кем Сагаїо! 2010;7:564-75). Проте в ретроспективному дослідженні продемонстрували, що ризик розвитку асимптоматичної дисфункції серця фактично доходить до приблизно 25 95, коли трастузумаб застосовують в ад'ювантній схемі з ОХ (Умаапумла й ін.,
Вгєазі Сапсег Нез Тгєаї 2009:117:357-64). У прикладах показано, що відповідно до даного винаходу запропоновані антитіла, які націлені на ЕгбВ-2 й які не впливають або в значно меншому ступені впливають на виживаність кардіоміоцитів у порівнянні з трастузумабом і пертузумабом. Вони дають істотну перевагу, оскільки кардіотоксичність знижується. Це вже є перевагою для людей, які не страждають від серцевої недостатності, й є ще більшою перевагою для людей, які вже страждають від серцевої недостатності або в яких є ризик її розвитку, таких як, наприклад, суб'єкти, що страждають від застійної серцевої недостатності (ЗСН), дисфункції лівого шлуночка (ДЛІШ) та/або зниженої на г 10 95 фракції викиду лівого шлуночка (ФВЛШ), і/або суб'єкти, в яких був інфаркт міокарда. Антитіла згідно з даним винаходом, які значно не впливають на виживаність кардіоміоцитів, отже, переважні. п мйго функцію кардіоміоцитів, наприклад, вимірюють шляхом визначення життєздатності кардіоміоцитів, шляхом визначення
ВМР (натрійуретичного пептиду типу В, який являє собою кардіальний біомаркер), шляхом визначення подовження ОТ і/або шляхом визначення потенціалу мітохондріальної мембрани.
Зазначене антитіло згідно з даним винаходом переважно містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен І ЕгЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен ЇЇ
ЕпЬВ-3. В одному варіанті реалізації запропоноване антитіло згідно з даним винаходом, яке значно не впливає на виживаність кардіоміоцитів, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгрВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгтОВ-3, при цьому афінність вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгрВ-3 клітини дорівнює або більше, ніж афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгтЬВ-2 клітини. Афінність вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгтбВ-3 клітини переважно нижче або дорівнює 2,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,39 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,99 нМ.
Афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгЬВ- 2 клітини переважно нижче або дорівнює 5,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 4,5 НМ, переважно нижче або дорівнює 4,0 НМ.
В одному переважному варіанті реалізації зазначене антитіло, яке значно не впливає на виживаність кардіоміоцитів, містить: - щонайменше послідовність СОКЗ, переважно щонайменше послідовності СОКІ, СОКЗ2 і
СОКЗ, або щонайменше послідовність варіабельної області важкого ланцюга зі специфічною до
ЕтВ-2 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ2926,
МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973, МЕЗ3004, МЕ3958, МЕ2971, МЕЗ3025, МЕ2916, МЕЗ3991, МЕЗО031, 60 МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847, МЕ3001, МЕЗ3003 ії МЕ1898, зображених на фігурі 16А або на фігурі
16Е, або послідовність варіабельної області важкого ланцюга, яка відрізняється не більше ніж 15 амінокислотами, переважно не більше ніж 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 амінокислотами, більше переважно не більше ніж 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотами від перерахованих послідовностей варіабельної області важкого ланцюга; та/або - щонайменше послідовність СОКЗ, переважно щонайменше послідовності СОКІ, СОКЗ2 і
СОКЗ, або щонайменше послідовність варіабельної області важкого ланцюга зі специфічною до
ЕтВ-3 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕЗ3178;
МЕЗ3176; МЕЗ163; МЕЗ3099; МЕЗ3307; МЕб6О55; МЕб6О56; МЕб6О57; МЕ6058; МЕб6О59; МЕ6060;
МЕб6О61; МЕ6062; МЕ606З3; МЕ60О64; МЕ 6065; МЕ60О66; МЕ6067; МЕ6068; МЕ6069; МЕ6070;
МЕб6071; МЕ6072; МЕ6073 і МЕ6074, зображених на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, або послідовність варіабельної області важкого ланцюга, яка відрізняється не більше ніж 15 амінокислотами, переважно не більше ніж 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 амінокислотами, більше переважно не більше ніж 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотами від перерахованих послідовностей варіабельної області важкого ланцюга. В одному переважному варіанті реалізації зазначене антитіло являє собою РВ4188.
В іншому аспекті даного винаходу запропоноване антитіло згідно з даним винаходом, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгтЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-3, при цьому зазначене антитіло містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше один амінокислотний залишок домену І ЕгтоВ-2, вибраний з групи, що складається з 1144, 7164, К166, Р172, 0179, 5180 і К181, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах приблизно 5 положень амінокислот від Т144,
Т164, К166, Р172, 5179, 5180 або К181. Нумерація амінокислотних залишків відповідає такій для ідентифікаційного номера 1578 у базі даних Ргоїєїп Оага Вапк (РОВ). У прикладах показано, що антитіла, які зв'язують дану область домену | ЕгбВ-2, проявляють особливо гарні властивості зв'язування, і вони здатні протидіяти активності позитивних за ЕгтрВ-2 клітин (такої як викликана лігандом функція рецептора ЕгоВ-3 на позитивній за ЕгЬВ-2 і ЕгЬВ-3 клітині, та/або викликаний лігандом ріст такої клітини). Більше того, такі антитіла особливо підходять для комбінованої терапії з відомими на сьогоднішній день моноклональними антитілами проти ЕгоВ- 2, такими як трастузумаб (який зв'язує домен ІМ ЕгЬВ-2) і пертузумаб (який зв'язує домен ЇЇ
ЕпВ-2), тому що вони зв'язуються з різними доменами ЕгЬВ-2. Отже, дані антитіла можна застосовувати одночасно без конкурування за той самий епітоп. Термін "виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах приблизно 5 положень амінокислот від 71144, 1164, К166, Р172, 5179, 5180 або К181" відноситься до залишків, які у первинній послідовності амінокислот розташовані в межах приблизно перших п'яти амінокислотних залишків, розташованих поруч із перерахованими залишками, й які щонайменше частково виставлені назовні білку, так що з ними можуть зв'язатися антитіла (див., наприклад, фігуру 218). Переважно, вказаний амінокислотний залишок, розташований в межах приблизно 5 положень амінокислот від 144, Т164, К166, Р172, 5179, 5180 або К181, вибраний з групи, що складається з І 139, С140, 141, 9142, 0143, 1145, 1146, М/147, К148, 0149,1159, 1160,1161, 162, 0163, М165, 5167, 8168, А169, С170, НІ171, 0173, 5174, Р175, М176, С177, К178, С182,
ММ183, 5184, Е185 і 5186. Переважно, зазначене антитіло містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше 2 або щонайменше 3 амінокислотних залишки домену | ЕгЬВ-2, вибраних із групи, що складається з Т144, Т164, К166, Р172, 5179, 5180 і К181, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах 5 положень амінокислот від Т144,
Т164, К166, Р172, 6179, 5180 або К181.
В одному переважному варіанті реалізації запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, при цьому зазначене антитіло містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше Т144, К166 і К181 домену І ЕгтрВ-2. В іншому варіанті реалізації запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, при цьому зазначене антитіло містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше Т144, К166, Р172, 5179 і К181 домену І ЕгЬВ-2.
В іншому варіанті реалізації запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, при цьому зазначене антитіло містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше
Т144, Т164, К166, Р172, 5179, 5180 і К181 домену І ЕгрВ-2.
В іншому аспекті даного винаходу запропоноване антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгоВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ- 3, при цьому зазначене антитіло містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше одну амінокислоту домену НП ЕгЬВ-3, вибрану з групи, що складається з К426, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах 11,2 А від Б426 у нативному білку
ЕїбВ-3. Нумерація амінокислотних залишків відповідає такій для ідентифікаційного номера 4Р59 60 у Ргоївіп Юаїа Вапк (РОВ). У прикладах показано, що антитіла, які зв'язують дану область домену ІЇЇ ЕгЬВ-3, проявляють особливо гарні властивості зв'язування, і вони здатні протидіяти активності позитивних за ЕгЬВ-3 клітин (такій як викликана лігандом функція рецептора ЕгрВ-3 на позитивній за ЕгоВ-2 і ЕгЬВ-3 клітині та/або викликаний лігандом ріст такої клітини). Термін "виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах 11,2 А від Б426 у нативному білку ЕгрВ-3" відноситься до амінокислотних залишків, які в третичній структурі білка
ЕГТЬВ-3 просторово розташовані в межах 11,2 А від Б426 й які щонайменше частково виставлені назовні білку, так що з ними можуть зв'язатися антитіла. Переважно вказані амінокислотні залишки, які розташовані в межах 11,2 А від Р426 у нативному білку ЕгЬВ-3, вибрані з групи, що складається з І 423, 7424, М425, 5427, 5452, К453, 455, Е480, К481, І 482, 0483 і К485 (див., наприклад, фігуру 21С і таблицю 15). В одному переважному варіанті реалізації запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, при цьому зазначене антитіло містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше К426 домену Ії ЕгЬВ-3. Переважно, зазначене антитіло містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше К426 домену ІІ ЕгрВ-3.
Біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом переважно дефукозильовано, щоб підвищити активність АЗКЦ. Біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом переважно демонструє знижений ступінь фукозилювання М-зв'язаної вуглеводної структури в Ес-області у порівнянні з тим самим антитілом, отриманим у нормальної клітини СНО.
Біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом переважно застосовують в людей. Для цієї мети біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом переважно являє собою людське або гуманізоване антитіло.
Переносимість людиною поліпептиду обумовлюється багатьма різними аспектами. Імунітет, будь то опосередкований Т-клітинами, опосередкований В-клітинами або інший імунітет, є одним із параметрів, які визначають переносимість людиною поліпептиду. Константна область біспецифічного антитіла згідно з даним винаходом переважно являє собою людську константну область. Константна область може містити одну або більше, переважно не більше 10, переважно не більше 5 відмінностей в амінокислотах від константної області антитіла, що зустрічається у природі, людини. Переважно, щоб константна частина була повністю отримана з антитіла, що зустрічається у природі, людини. Різні антитіла, отримані у даній заявці, отримані з бібліотеки варіабельних доменів антитіл людини. Відповідно, дані варіабельні домени -- людські. Унікальні ділянки СОК можуть бути отримані з людей, бути синтетичними або можуть бути отримані з іншого організму. Варіабельну область вважають людською варіабельною областю, якщо вона має послідовність амінокислот, яка ідентична послідовності амінокислот варіабельної області антитіла, що зустрічається у природі, людини, за винятком ділянки СОК.
Варіабельна область зв'язуючої ЕгоВ-2 МН, зв'язуючої ЕгЬВ-3 УН або легкого ланцюга антитіла згідно з даним винаходом може містити одну або більше, переважно не більше 10, переважно не більше 5 відмінностей в амінокислотах від варіабельної області зустрічаємого у природі антитіла людини, не рахуючи можливих відмінностей у послідовності амінокислот ділянок СОК.
Такі мутації також зустрічаються у природі в контексті соматичної гіпермутації.
Антитіла можна отримати з різніх видів тварин, щонайменше відносно варіабельної області важкого ланцюга. Розповсюдженою практикою є гуманізування таких, наприклад, варіабельних областей важкого ланцюга миші. Існують різні способи, за допомогою яких можна цього добитися, серед яких: щеплення СОК на людську варіабельну область важкого ланцюга 30- структурою, яка відповідає ЗО-структурі варіабельної області важкого ланцюга миші; деімунізація варіабельної області важкого ланцюга миші, переважно здійснювана шляхом видалення відомих або передбачуваних Т- або В-клітинних епітопів з варіабельної області важкого ланцюга миші. Видалення зазвичай відбувається шляхом заміни однієї або більше амінокислот в епітопі на іншу (зазвичай консервативну) амінокислоту, так що послідовність епітопу виявляється модифікованою таким чином, що вона більше не є Т- або В-клітинним епітопом.
Такі деімунізовані варіабельні області важкого ланцюга миші менше імуногенні в людей, ніж вихідна варіабельна область важкого ланцюга миші. Переважно варіабельна область або домен згідно з даним винаходом додатково гуманізований, наприклад, венірований. Шляхом застосування методик венірингу зовнішні залишки, які легко виявляються імунною системою, вибірково заміняють на людські залишки з одержанням гібридної молекули, яка містить або слабко імуногенну, або по суті неїімуногенну веніровану поверхню. Тварина, яку використовують у даному винаході, переважно являє собою ссавця, більше переважно примата, найбільше переважно людину.
Біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом переважно містить константну область з антитіла людини. Відповідно до відмінностей в їх константних доменах важкого ланцюга, 60 антитіла групують за п'ятьма класами або ізотипами: Ідс, ІдА, І9М, ІдО і ЧЕ. Дані класи або ізотипи містять щонайменше один із вказаних важких ланцюгів, який називають відповідною грецькою буквою. У переважному варіанті реалізації відповідно до даного винаходу запропоноване антитіло згідно з даним винаходом, в якому зазначена константна область вибрана з групи, що складається з константних областей Ідс, ІдА, І9М, дО і ІЗ9Е, більше переважно вказана константна область включає константну область Ідс, більше переважно константну область ЇдДб1, переважно мутовану константну область Ідс1. Деякий варіант константної області ЇДС1 зустрічається у природі, такий як, наприклад, алотипи С1ті!, 17 і
С1т3, і/або допускається без зміни імунологічних властивостей отриманого в результаті цього антитіла. Зазвичай в константній області допускається приблизно 1-10 вставок, делецій, замін амінокислот або їх комбінація.
В одному варіанті реалізації даного винаходу запропоноване антитіло, що містить варіабельний домен, який зв'язує ЕтОВ-2, при цьому зазначене антитіло містить щонайменше послідовність СОМКЗ зі специфічною до ЕгтбВ-2 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ2926, МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973, МЕ3004, МЕ3958,
МЕ2971, МЕ3025, МЕ2916, МЕ3991, МЕЗ3031, МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847, МЕЗ001, МЕЗ003 і
МЕ1898, зображених на фігурі 16А або на фігурі 16Е, або при цьому зазначене антитіло містить послідовність СОКЗ важкого ланцюга, яка відрізняється не більше ніж трьома, переважно не більше ніж двома, переважно не більше ніж однією амінокислотою від послідовності СОКЗ МН, вибраної з групи, що складається з МЕ2926, МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973, МЕ3004, МЕ3958,
МЕ2971, МЕ3025, МЕ2916, МЕ3991, МЕЗ3031, МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847, МЕЗ001, МЕЗ003 і
МЕ1898, зображених на фігурі 16А або на фігурі 16Е. Зазначене антитіло переважно містить щонайменше послідовність СОКЗ із МЕ1849, МЕ2971, МЕ3958, МЕ3004 або МЕЗ3991, найбільше переважно щонайменше послідовність СОКЗ із МЕ3958.
Зазначене антитіло переважно містить щонайменше послідовності СОКІ, СОК2 і СОКЗ зі специфічною до ЕгбВ-2 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ2926, МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973, МЕ3004, МЕ3958, МЕ2971, МЕ3025, МЕ2916,
МЕЗ3991, МЕ3031, МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847, МЕЗ3001, МЕЗ3003 і МЕ1898, зображених на фігурі 16А або на фігурі 16Е, або послідовності СОМКІ, СОК2 і СОМКЗ важкого ланцюга, які відрізняються не більше ніж трьома, переважно не більше ніж двома, переважно не більше ніж однією амінокислотою від послідовностей СОКІ, СОК2 і СОКЗ із МЕ2926, МЕ2930, МЕ1849;
МЕ2973, МЕЗ3004, МЕ3958, МЕ2971, МЕЗ025, МЕ2916, МЕЗ3991, МЕЗ3031, МЕ2889, МЕ2913,
МЕ1847, МЕ3001, МЕ300О3 або МЕ1898. Зазначене антитіло переважно містить щонайменше послідовності СОК1, СОК2 і СОКЗ із МЕ1849, МЕ2971, МЕ3958, МЕ3004 або МЕ3991, найбільше переважно щонайменше послідовності СОК1Т, СОК2 і СОКЗ із МЕ3958.
Відповідно до даного винаходу також запропоноване антитіло, що містить варіабельний домен, який зв'язує ЕГгОЬВ-3, при цьому зазначене антитіло містить щонайменше послідовність
СОКЗ зі специфічною до ЕгтоВ-3 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ3178; МЕ3176; МЕ3163; МЕ3099; МЕ3307; МЕ6О55; МЕ6О56; МЕ6О57; МЕб6О58;
МЕ6059; МЕ60О60О; МЕ60О61; МЕ6О62; МЕ6063; МЕ6О6б4; МЕ 6065; МЕ60О66; МЕ6067; МЕб6068;
МЕб6069; МЕ6070; МЕ6071; МЕ6072; МЕ6073 і МЕ6074, зображених на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, або при цьому зазначене антитіло містить послідовність СОКЗ важкого ланцюга, яка відрізняється не більше ніж трьома, переважно не більше ніж двома, переважно не більше ніж однією амінокислотою від послідовності СОКЗ МН, вибраної з групи, що складається з МЕ3178; МЕ3176; МЕ3163; МЕ3099; МЕ3307; МЕ6О55; МЕ6О56; МЕ6О57; МЕб6О58;
МЕ6059; МЕ60О60О; МЕ60О61; МЕ6О62; МЕ6063; МЕ6О6б4; МЕ 6065; МЕ60О66; МЕ6067; МЕб6068;
МЕб6069; МЕ6070; МЕ6071; МЕ6072; МЕ6073 і МЕ6074, зображених на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37. Зазначене антитіло переважно містить щонайменше послідовність СОКЗ із МЕ3178, МЕ3176, МЕ3163, МЕ6058, МЕ6061 або МЕ6065, найбільше переважно щонайменше послідовність СОКЗ із МЕ3178.
Зазначене антитіло переважно містить щонайменше послідовності СОКІ, СОК2 ії СОКЗ зі специфічною до ЕгбВ-3 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ3178; МЕ3176; МЕ3163; МЕ3099; МЕ3307; МЕ6О55; МЕ6О56; МЕ6О57; МЕб6О58;
МЕ6059; МЕ60О60О; МЕ60О61; МЕ6О62; МЕ6063; МЕб6Об4; МЕ 6065; МЕ60О66; МЕ6О067; МЕ6068;
МЕб6069; МЕ6070; МЕ6071; МЕ6072; МЕ6073 і МЕ6074, зображених на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, або послідовності СОКІ, СОК2 ії СОКЗ важкого ланцюга, які відрізняються не більше ніж трьома, переважно не більше ніж двома, переважно не більше ніж однією амінокислотою від послідовностей СОКІ, СОК2 ії СОКЗ з МЕ3178; МЕ3176; МЕЗ3163; МЕ3099;
МЕЗЗ307; МЕ6О55; МЕ6056; МЕ6057; МЕ60О58; МЕ6059; МЕб6О6О; МЕб6О61; МЕ6062; МЕб6063;
МЕб6064; МЕ 6065; МЕ6066; МЕ60О67; МЕ6068; МЕ6069; МЕб6070; МЕ6071; МЕ6072; МЕ6073 або 60 МЕ6074. Зазначене антитіло переважно містить щонайменше послідовності СОКІ, СОКЗ2 і
СОКЗ із МЕ3178, МЕ3176, МЕ3163, МЕ6О58, МЕ6О61 або МЕб6О065, найбільше переважно щонайменше послідовності СОКІ, СОК2 і СОКЗ із МЕЗ3178.
В одному варіанті реалізації даного винаходу запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгтЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгрВ-3, при цьому вказаний перший сайт зв'язування антигена включає щонайменше послідовність СОКЗ зі специфічною до ЕгбВ-2 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ2926, МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973, МЕЗ3004,
МЕЗ3958, МЕ2971, МЕЗ025, МЕ2916, МЕЗ3991, МЕЗ30О31, МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847, МЕЗО001,
МЕЗ003 і МЕ1898, зображених на фігурі 16А або на фігурі 16Е, або послідовність СОКЗ важкого ланцюга, яка відрізняється не більше ніж трьома, переважно не більше ніж двома, переважно не більше ніж однією амінокислотою від послідовності СОКЗ МН, вибраної з групи, що складається з МЕ2926, МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973, МЕ3004, МЕ3958, МЕ2971, МЕ3025, МЕ2916,
МЕЗ3991, МЕ3031, МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847, МЕЗ3001, МЕЗ3003 і МЕ1898, зображених на фігурі 16А або на фігурі 16Е, і при цьому вказаний другий сайт зв'язування антигена містить щонайменше послідовність СОКЗ зі специфічною до ЕгЬВ-3 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ3178; МЕ3176; МЕ3163; МЕ3099; МЕ3307;
МЕ6055; МЕ6056; МЕ60О57; МЕ6О58; МЕ6О59; МЕ6О6О; МЕ6О61; МЕеЕ60О62; МЕ6063; МЕ6064; МЕ 6065; МЕб6Об6б6; МЕ6067; МЕ6068; МЕбО69; МЕбО0О70; МЕб6О71; МЕб60О72; МЕ6073 і МЕб6074, зображених на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, або послідовність СОКЗ важкого ланцюга, яка відрізняється не більше ніж трьома, переважно не більше ніж двома, переважно не більше ніж однією амінокислотою від послідовності СОКЗ МН, вибраної з групи, що складається з МЕ3178; МЕ3176; МЕ3163; МЕ3099; МЕ3307; МЕ6055; МЕ6О56; МЕ60О57; МЕб6058;
МЕб6059; МЕ6О60О; МЕб6О61; МЕ6О6б2; МЕ6063; МЕ6064; МЕ 6065; МЕ6066; МЕ6067; МЕ6068;
МЕб6069; МЕ6070; МЕ6071; МЕ6072; МЕ6073 і МЕ6074, зображених на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37. Вказаний перший сайт зв'язування антигена переважно містить щонайменше послідовність СОКЗ із МЕ1849, МЕ2971, МЕ3958, МЕ3004 або МЕЗ3991, найбільше переважно щонайменше послідовність СОКЗ із МЕ3958, і вказаний другий сайт зв'язування антигена переважно містить щонайменше послідовність СОКЗ із МЕ3178, МЕЗ3176, МЕЗ163,
МЕб6058, МЕ6О61Ї або МЕб6065, найбільше переважно щонайменше послідовність СОКЗ із
МЕЗ178.
Вказаний перший сайт зв'язування антигена переважно містить щонайменше послідовності
СОКІ, СркК2 і СОКЗ зі специфічною до ЕгоВ-2 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ2926, МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973, МЕ3004, МЕ3958,
МЕ2971, МЕ3025, МЕ2916, МЕ3991, МЕ3031, МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847, МЕЗ3001, МЕЗ003 і
МЕ1898, зображених на фігурі 16А або на фігурі 16Е, або послідовності СОКІ, СОК2 і СОКЗ важкого ланцюга, які відрізняються не більше ніж трьома, переважно не більше ніж двома, переважно не більше ніж однією амінокислотою від послідовностей СОКІ, СОК2 і СОКЗ із
МЕ2926, МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973, МЕЗ3004, МЕ3958, МЕ2971, МЕЗ3025, МЕ2916, МЕЗ3991,
МЕЗ3031, МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847, МЕЗ3001, МЕ3003 або МЕ1898, і вказаний другий сайт зв'язування антигена переважно містить щонайменше послідовності СОКІ, СОМК2 ії СОКЗ зі специфічною до ЕгбВ-3 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ3178; МЕ3176; МЕ3163; МЕ3099; МЕ3307; МЕ6055; МЕ6О56; МЕ60О57; МЕб6058;
МЕб6059; МЕ6О60О; МЕ6О61; МЕ6О62; МЕ6063; МЕ6064; МЕ 6065; МЕ6066; МЕ6067; МЕ6068;
МЕб6069; МЕ6070; МЕ6071; МЕ6072; МЕ6073 і МЕ6074, зображених на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, або послідовності СОКІ, СОК2 ії СОКЗ важкого ланцюга, які відрізняються не більше ніж трьома, переважно не більше ніж двома, переважно не більше ніж однією амінокислотою від послідовностей СОКІ, СОК2 ії СОКЗ із МЕ3178; МЕ3176; МЕ3163; МЕ3099;
МЕЗ307; МЕ6055; МЕб6О56; МЕб6О57; МЕб6О58; МЕб6О59; МЕб6О60; МЕ6061; МЕб6062; МЕ6063;
МЕ6064; МЕ 6065; МЕ6066; МЕ6067; МЕб6О68; МЕ6069; МЕ6070; МЕб6071; МЕ6072; МЕ6073 або
МЕб6074, зображеної на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37. Вказаний перший сайт зв'язування антигена переважно містить щонайменше послідовності СОКІ, СОК2 і СОКЗ із
МЕ1849, МЕ2971, МЕ3958, МЕ3004 або МЕЗ3991, найбільше переважно щонайменше послідовності СОКІ, СОК2 ії СОКЗ із МЕ3958, і вказаний другий сайт зв'язування антигена переважно містить щонайменше послідовності СОКІ, СОК2 ії СОКЗ із МЕЗ3178, МЕЗ3176,
МЕЗ3163, МЕ60О58, МЕ6О6Є1Ї або МЕб6065, найбільше переважно щонайменше послідовності
СОМ, СОК2 і СОКЗ із МЕ3178.
В одному переважному варіанті реалізації запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕГЬВ-3, при цьому вказаний перший сайт зв'язування антигена містить щонайменше 60 послідовність СОКЗ із МЕ3958, або послідовність СОКЗ, яка відрізняється не більше ніж трьома,
переважно не більше ніж двома, переважно не більше ніж однією амінокислотою від послідовності СОКЗ із МЕЗ3958, і при цьому вказаний другий сайт зв'язування антигена містить щонайменше послідовність СОКЗ із МЕ3178 або послідовність СОКЗ, яка відрізняється не більше ніж трьома, переважно не більше ніж двома, переважно не більше ніж однією амінокислотою від послідовності СОКЗ із МЕ3178.
В одному варіанті реалізації даного винаходу запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгтЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-3, при цьому вказаний перший сайт зв'язування антигена містить щонайменше послідовності СОКІ, СОК2 ії СОКЗ із МЕ3958, або послідовності СОКІ, СОК2 і
СОКЗ, які відрізняються не більше ніж трьома, переважно не більше ніж двома, переважно не більше ніж однією амінокислотою від послідовностей СОКІ, СОК2 ії СОКЗ із МЕЗ3958, і при цьому вказаний другий сайт зв'язування антигена містить щонайменше послідовність СОК1,
СОК2 ії СОКЗ із МЕЗ3178, або послідовності СОМКІ, СОК2 і СОКУ, які відрізняються не більше ніж трьома, переважно не більше ніж двома, переважно не більше ніж однією амінокислотою від послідовностей СОКІ, СОК2 і СОКЗ із МЕ3178.
В одному варіанті реалізації даного винаходу запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгОВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-3, при цьому вказаний перший сайт зв'язування антигена містить щонайменше послідовність СОКЗ із МЕ3958 і при цьому вказаний другий сайт зв'язування антигена містить щонайменше послідовність СОКЗ із МЕ3178.
В одному варіанті реалізації даного винаходу запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгтЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-3, при цьому вказаний перший сайт зв'язування антигена містить щонайменше послідовності СОКІ, СОК2 і СОБЕЗ із МЕ3958, і при цьому вказаний другий сайт зв'язування антигена містить щонайменше послідовності СОК1Т, СОК2 і СОКЗ із МЕЗ3178.
Послідовності СОК, наприклад, змінюють з метою оптимизації, переважно, щоб поліпшити ефективність зв'язування або стабільність антитіла. Оптимізацію, наприклад, здійснюють за допомогою процедур мутагенезу, після чого переважно досліджують стабільність й/або афінність зв'язування отриманого в результаті цього антитіла та переважно вибирають поліпшену специфічну до ЕгбВ-2 або ЕгЬВ-3 послідовність СОК. Кваліфікований фахівець цілком здатний створити варіанти антитіла, що містять щонайменше одну змінену послідовність
СОК згідно з даним винаходом. Наприклад, застосовується консервативна заміна амінокислоти.
Приклади консервативної заміни амінокислоти включають заміну одного гідрофобного залишку, такого як ізолейцин, валін, лейцин або метіонін, на інший гідрофобний залишок і заміну одного полярного залишку на інший полярний залишок, наприклад, заміну аргініну на лізин, глутамінової кислоти на аспарагінову кислоту або глутаміну на аспарагін.
В одному варіанті реалізації даного винаходу запропоноване антитіло, що містить варіабельний домен, який зв'язує ЕгВ-2, при цьому ланцюг МН вказаного варіабельного домену включає послідовність амінокислот ланцюга МН МЕ2926; МЕ2930; МЕ1849; МЕ2973;
МЕЗ3004; МЕ3958 (являє собою гуманізовану МЕ2971); МЕ2971; МЕ3025; МЕ2916; МЕ3991 (являє собою гуманізовану МЕ3004); МЕ3031; МЕ2889; МЕ2913; МЕ1847; МЕЗ3001, МЕ300О3 або
МЕ1898, зображену на фігурі 16А або на фігурі 1Є6Е; або включає послідовність амінокислот ланцюга МН МЕ2926; МЕ2930; МЕ1849; МЕ2973; МЕ3004; МЕ3958 (являє собою гуманізовану
МЕ2971); МЕ2971; МЕЗ3025; МЕ2916; МЕ3991 (являє собою гуманізовану МЕ3004); МЕЗ3031;
МЕ2889; МЕ2913; МЕ1847; МЕ3001, МЕ300О3 або МЕ1898, зображену на фігурі 16А або на фігурі 16Е, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно згаданої вище послідовності ланцюга МН, зображеної на фігурі 16А або фігурі 16Е. Ланцюг МН варіабельного домену, який зв'язує ЕгрВ-2, переважно включає послідовність амінокислот:
БО - МЕ1849; або - МЕ2971 або її гуманізований варіант, при цьому вказаний гуманізований варіант переважно включає послідовність амінокислот МЕ3958; або - МЕ3004 або її гуманізований варіант, при цьому вказаний гуманізований варіант переважно включає послідовність амінокислот МЕЗ3991; зображену на фігурі 16А. В одному варіанті реалізації ланцюг МН варіабельного домену, який зв'язує ЕгЬВ-2, включає послідовність амінокислот ланцюга УН-МЕ1849; або МЕ2971 або її гуманізований варіант, при цьому вказаний гуманізований варіант переважно включає послідовність амінокислот МЕ3958; або МЕ3004 або її гуманізований варіант, при цьому вказаний гуманізований варіант переважно включає послідовність амінокислот МЕЗ3991, при 60 цьому перераховані послідовності УН містять не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або
10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно відповідної послідовності, зображеної на фігурі 16А. У переважному варіанті реалізації ланцюг УН варіабельного домену, який зв'язує ЕгОВ-2, включає послідовність амінокислот МЕ3958; або включає послідовність амінокислот МЕ3958, зображену на фігурі 16А, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно послідовності ланцюга УН. Антитіло, що містить варіабельний домен, який зв'язує ЕгоВ-2, переважно являє собою біспецифічне антитіло, що переважно додатково містить варіабельний домен, який зв'язує ЕПОВ-3. Ланцюг МН варіабельного домену, який зв'язує Ег-В3, переважно включає послідовність амінокислот ланцюга МН: МЕЗ3178; МЕЗ3176; МЕЗ3163; МЕ3099; МЕЗ3307; МЕб6О055;
МЕ6056; МЕ6057; МЕ6058; МЕ6О59; МЕ60О60; МЕб6Об61; МЕ6062; МЕ6О6З; МЕ6064; МЕ 6065;
МЕб6066; МЕ60О67; МЕ6068; МЕ60О69; МЕ6070; МЕ6071; МЕ6072; МЕ6073 або МЕ6074, зображену на фігурі 16В, або на фігурі 1Є6Е, або на фігурі 37; або включає послідовність амінокислот ланцюга МН: МЕ3178; МЕ3176; МЕ3163; МЕ3099; МЕ3307; МЕ6055; МЕ60О56; МЕ6О57; МЕб6О58;
МЕ6059; МЕ60О60О; МЕ60О61; МЕ6О62; МЕ6063; МЕ6О6б4; МЕ 6065; МЕ6066; МЕ6067; МЕб6068;
МЕ6069; МЕ6070; МЕ6071; МЕ6072; МЕ6073 або МЕ6074, зображену на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно послідовності ланцюга УН, зображеної на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37. Ланцюг УН варіабельного домену, який зв'язує Егр-В3, переважно включає послідовність амінокислот МЕ3178, МЕ3176, МЕ3163, МЕб6О58, МЕб6Об1Ї або МЕб60О65; або включає послідовність амінокислот МЕ3178, МЕ3176, МЕ3163, МЕ6058, МЕ60О6Є1 або МЕб6065, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно відповідної послідовності ланцюга УН, зображеної на фігурі 168 або фігурі 37. У переважному варіанті реалізації ланцюг
МН варіабельного домену, який зв'язує ЕгбВ-3, включає послідовність амінокислот МЕ3178; або включає послідовність амінокислот МЕ3178, зображену на фігурі 168, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно послідовності ланцюга УН. Переважно, наведені вище вставки, делеції та заміни амінокислот не перебувають в ділянці СОКЗ. Наведені вище вставки, делеції та заміни амінокислот також переважно не перебувають в ділянках СОК1 і СОК2. Наведені вище вставки, делеції та заміни амінокислот також переважно не перебувають в області ЕБ4.
Згідно з даним винаходом додатково запропоноване антитіло, що містить варіабельний домен, який зв'язує ЕгЬВ-3, при цьому ланцюг МН вказаної варіабельної області включає послідовність амінокислот ланцюга МН: МЕЗ3178; МЕЗ3176; МЕЗ3163; МЕ3099; МЕЗ3307; МЕб6О055;
МЕ6056; МЕ6057; МЕ6058; МЕ6О59; МЕ60О60; МЕб6Об61; МЕ6062; МЕ6О6З; МЕ6064; МЕ 6065;
МЕ6066; МЕ6067; МЕ6068; МЕ6069; МЕ6070; МЕ6071; МЕ6072; МЕ6073 або МЕб6074, зображену на фігурі 16В, або на фігурі 1Є6Е, або на фігурі 37, або включає послідовність амінокислот ланцюга МН: МЕ3178; МЕ3176; МЕ3163; МЕ3099; МЕ3307; МЕ6055; МЕ60О56; МЕ6О57; МЕб6О58;
МЕ6059; МЕ60О60О; МЕ60О61; МЕ6О62; МЕ6063; МЕб6О6б4; МЕ 6065; МЕ60О66; МЕ6067; МЕ6068;
МЕ6069; МЕ6070; МЕ6071; МЕ6072; МЕ6073 або МЕ6074, зображену на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно вказаної послідовності ланцюга МН. Ланцюг УН варіабельного домену, який зв'язує
ЕпЬВ-3, переважно включає послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕЗ178, МЕЗ3176, МЕЗ163,
МЕб6058, МЕ6О61Ї або МЕб6065; або включає послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕЗ178,
МЕЗ3176, МЕ3163, МЕ6058, МЕ6061 або МЕб6065, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно вказаної послідовності ланцюга МН. У переважному варіанті реалізації ланцюг УН варіабельного домену, який зв'язує ЕгЬВ-3, включає послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕ3178, зображену на фігурі 16В; або включає послідовність амінокислот ланцюга УН-МЕЗ3178, зображену на фігурі 168, що містить не більше 15, переважно 1,2,3,4,5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно послідовності ланцюга МН. Антитіло, що містить варіабельний домен, який зв'язує ЕгоВ-3, переважно являє собою біспецифічне антитіло, яке переважно додатково містить варіабельний домен, який зв'язує ЕгбВ-2. Ланцюг МУН варіабельного домену, який зв'язує ЕгоВ-2, переважно включає послідовність амінокислот ланцюга УН, зображену на фігурі 16А або фігурі 16Е. Ланцюг МН варіабельного домену, який 60 зв'язує ЕтВ-2, переважно включає послідовність амінокислот МЕ1849; або МЕ2971 або її гуманізований варіант, при цьому вказаний гуманізований варіант переважно включає послідовність амінокислот МЕ3958; або МЕ3004 або її гуманізований варіант, при цьому вказаний гуманізований варіант переважно включає послідовність амінокислот МЕЗ3991, зображену на фігурі 16А. В одному варіанті реалізації перераховані зв'язуючі ЕгЬВ-2 послідовності МН містять не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно відповідної послідовності, зображеної на фігурі 16А. В одному переважному варіанті реалізації вказана зв'язуюча ЕгЬВ-2 ланцюг УН, зображена на фігурі 16А, включає послідовність амінокислот МЕ3958; або включає послідовність амінокислот МЕ3958, що містить не більше 15, переважно 1,2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно послідовності ланцюга УН. Переважно, наведені вище вставки, делеції та заміни амінокислот не перебувають в ділянці СОКЗ. Наведені вище вставки, делеції та заміни амінокислот також переважно не перебувають в ділянках СОК1 і СОК2. Наведені вище вставки, делеції та заміни амінокислот також переважно не перебувають в області ЕК4.
Додатково запропоноване антитіло згідно з даним винаходом, при цьому зазначене антитіло містить специфічну до ЕгЬВ-2 послідовність варіабельної області важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з послідовностей варіабельної області важкого ланцюга: МЕ2926,
МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973, МЕЗ3004, МЕ3958, МЕ2971, МЕЗ025, МЕ2916, МЕЗ3991, МЕЗ031,
МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847, МЕ3001, МЕЗ3003 ії МЕ1898, зображених на фігурі 16А або на фігурі 16Е, або при цьому зазначене антитіло містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, яка відрізняється не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно найбільше 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотами від послідовностей варіабельної області важкого ланцюга МЕ2926, МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973, МЕ3004, МЕ3958, МЕ2971, МЕЗ3025,
МЕ2916, МЕ3991, МЕ3031, МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847, МЕЗ001, МЕ300О3 або МЕ1898.
Додатково запропоноване антитіло згідно з даним винаходом, при цьому зазначене антитіло містить специфічну до ЕгбВ-3 послідовність варіабельної області важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з послідовностей варіабельної області важкого ланцюга: МЕЗ3178;
МЕЗ3176; МЕЗ163; МЕЗ3099; МЕЗ3307; МЕб6О55; МЕб6О56; МЕб6О57; МЕ6058; МЕб6О59; МЕ6060;
МЕб6О61; МЕ6062; МЕ606З3; МЕ60О64; МЕ 6065; МЕ60О66; МЕ6067; МЕ6068; МЕ6069; МЕ6070;
МЕб6071; МЕ6072; МЕб6073 і МЕ6074, зображеної на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, або при цьому зазначене антитіло містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, яка відрізняється не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно найбільше 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотами від послідовностей варіабельної області важкого ланцюга МЕ3178; МЕЗ3176; МЕЗ3163; МЕЗ3099; МЕЗ3307; МЕб6055; МЕб6056; МЕб6057;
МЕ6058; МЕ60О59; МЕ6О60; МЕ6О61; МеЕ6062; МЕ6063; МЕ6064; МЕ 6065; МЕ6066; МЕ6067;
МЕб6068; МЕ6069; МЕ6070; МЕ6071; МЕ6072; МЕ6073 або МЕ6074.
В одному варіанті реалізації даного винаходу запропоноване антитіло, що містить два сайти зв'язування антигена, які зв'язуються з ЕгЬВ-2, при цьому щонайменше один із вказаних сайтів зв'язування антигена зв'язує домен | ЕгбВ-2. Переважно обидва сайти зв'язування антигена зв'язують домен | ЕгЬВ-2. Таке антитіло згідно з даним винаходом особливо підходить для комбінованої терапії із застосовуваними в даний час спрямованими проти ЕгЬВ-2 зв'язуючими молекулами, які не зв'язують домен | ЕгЬВ-2, такими як трастузумаб, який зв'язує домен ІМ
ЕтЬВ-2, і пертузумаб, який зв'язує домен ІЇ ЕгЬВ-2, тому що тоді різні зв'язуючі молекули не конкурують одна з одною за той самий епітоп.
Додатково запропоноване антитіло, що містить два сайти зв'язування антигена, які зв'язуються з ЕгЬВ-2, при цьому щонайменше один із вказаних сайтів зв'язування антигена зв'язує домен | ЕгбВ-2 і при цьому афінність (КО) вказаного щонайменше одного сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгЬВ-2 клітини нижче або дорівнює 5,0
НМ, переважно нижче або дорівнює 4,5 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,9 нМ.
Переважно обидва сайти зв'язування антигена зв'язують домен ! ЕгтбВ-2. В одному переважному варіанті реалізації афінність вказаного щонайменше одного сайту зв'язування антигена до ЕгтЬВ-2 на клітинах 5К-ВВ-3 нижче або дорівнює 5,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 4,5 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 4,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,5 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 2,3 НМ. В одному варіанті реалізації вказана афінність перебуває в діапазоні 3,0-1,6
НМ. В одному переважному варіанті реалізації афінність вказаного щонайменше одного сайту зв'язування антигена до ЕгЬВ-2 на клітинах ВТ-474 нижче або дорівнює 5,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 4,5 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,9 нМ. В одному варіанті 60 реалізації вказана афінність перебуває в діапазоні 4,5-3,3 НМ.
Наведені вище афінності переважно виміряні шляхом вимірювання афінності клітини в стаціонарному стані, при цьому клітини інкубують при 42С, застосовуючи мічене радіоактивною міткою антитіло, після чого вимірюють пов'язану з клітиною радіоактивність, як описано в розділі
Приклади.
Згідно з даним винаходом додатково запропоноване антитіло, що містить два варіабельних домени, які зв'язуються з ЕгЬВ-2, при цьому ланцюг МН вказаних варіабельних доменів включає послідовність амінокислот ланцюга МН: МЕ2926; МЕ2930; МЕ1849; МЕ2973; МЕ3004; МЕ3958 (являє собою гуманізовану МЕ2971); МЕ2971; МЕЗ3025; МЕ2916; МЕ3991 (являє собою гуманізовану МЕ3004); МЕЗ3031; МЕ2889; МЕ2913; МЕ1847; МЕЗ3001, МЕЗ3003 або МЕ1898, зображену на фігурі 16А або на фігурі 16Е; або послідовність амінокислот ланцюга МН МЕ2926;
МЕ2930; МЕ1849; МЕ2973; МЕ3004; МЕ3958 (являє собою гуманізовану МЕ2971); МЕ2971;
МЕЗ3025; МЕ2916; МЕ3991 (являє собою гуманізовану МЕ3004); МЕ3031; МЕ2889; МЕ2913;
МЕ1847; МЕЗ3001, МЕ3003 або МЕ1898 МН-ланцюга, зображену на фігурі 16А або на фігурі 16Е, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно відповідної послідовності, зображеної на фігурі 16А або на фігурі 16Е. Вказаний МН переважно включає послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕ1849; або МЕ2971 або її гуманізований варіант, при цьому вказаний гуманізований варіант переважно включає послідовність амінокислот МЕ3958; або МЕЗ004 або її гуманізований варіант, при цьому вказаний гуманізований варіант переважно включає послідовність амінокислот МЕЗ3991, зображену на фігурі 16А; або включає послідовність амінокислот ланцюга УН-МЕ1849; або МЕ2971 або її гуманізований варіант, при цьому вказаний гуманізований варіант переважно включає послідовність амінокислот МЕ3958; або МЕЗ004 або її гуманізований варіант, при цьому вказаний гуманізований варіант переважно включає послідовність амінокислот МЕ3991, зображену на фігурі 16А, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно відповідної послідовності, зображеної на фігурі 16А. Варіабельні домени антитіла переважно містять ідентичні ланцюги МН, які переважно мають послідовність, зображену на фігурі 16А або на фігурі 16Е. Антитіло з варіабельними доменами з ідентичними ланцюгами УН не є біспецифічним антитілом. Ланцюги
МН ідентичні у даному винаході, якщо вони включають ту саму послідовність ланцюга МН, яка зображена на фігурі 16А, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, або ту саму послідовність ланцюга
МН, за винятком 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот або, їх комбінації, відносно відповідної послідовності, зображеної на фігурі 16А, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37.
В одному варіанті реалізації даного винаходу запропоноване антитіло, що містить два сайти зв'язування антигена, які зв'язуються з ЕгоВ-3, при цьому щонайменше один із вказаних сайтів зв'язування антигена зв'язує домен І ЕгЬВ-3. Переважно обидва сайти зв'язування антигена зв'язують домен ІІ ЕГтОВ-3. Таке антитіло згідно з даним винаходом особливо підходить для комбінованої терапії із застосовуваними в даний час спрямованими проти ЕгЬВ-3 зв'язуючими молекулами, які не зв'язують домен ІШ ЕгЬВ-3, такими як ММ-121 (МеАБб) і КО7116, які зв'язуються з доменом | ЕгЬВ-3, тому що тоді різні зв'язуючі молекули не конкурують одна з одною за той самий епітоп.
Додатково запропоноване антитіло, що містить два сайти зв'язування антигена, які зв'язуються з ЕгЬВ-3, при цьому щонайменше один із вказаних сайтів зв'язування антигена зв'язує домен І ЕгЬВ-3, і при цьому афінність (КО) вказаного щонайменше одного сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгЬВ-3 клітини нижче або дорівнює 2,0
НМ, переважно нижче або дорівнює 1,5 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,39 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,99 нМ. Переважно обидва сайти зв'язування антигена зв'язують домен І ЕгЬВ-3. В одному переважному варіанті реалізації афінність вказаного щонайменше одного сайту зв'язування антигена до ЕгбВ-3 на клітинах ЗК-В8-3 нижче або дорівнює 2,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 1,5 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,39 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,99 нМ. В одному варіанті реалізації вказана афінність перебуває в діапазоні 1,39-0,59 нМ. В одному переважному варіанті реалізації афінність вказаного щонайменше одного сайту зв'язування антигена до ЕгЬВ-3 на клітинах ВтТ- 474 нижче або дорівнює 2,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,5 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,5 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,31 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,23 НМ. В одному варіанті реалізації вказана афінність перебуває в діапазоні 0,31-0,15 НМ.
Знову, наведені вище афінності переважно виміряні шляхом вимірювання афінності клітини в стаціонарному стані, при цьому клітини інкубують при 49С, застосовуючи мічене 60 радіоактивною міткою антитіло, після чого вимірюють пов'язану з клітиною радіоактивність, як описано в розділі Приклади.
Згідно з даним винаходом додатково запропоноване антитіло, що містить два варіабельних домени, кожний з яких зв'язує ЕгОВ-3, при цьому УН вказаних варіабельних доменів включає послідовність амінокислот ланцюга МН: МЕЗ3178; МЕЗ3176; МЕЗ3163; МЕ3099; МЕ3307; МЕб6О55;
МЕб6056; МЕ6057; МЕ6058; МЕ60О59; МЕ6060; МЕ60О61; МЕ6062; МЕ6063; МЕ6064; МЕ 6065;
МЕб6066; МЕ60О67; МЕ6068; МЕ6069; МЕ6070; МЕ6071; МЕ6072; МЕ6073 або МЕ6074, зображену на фігурі 16В, або на фігурі 1Є6Е, або на фігурі 37; або включає послідовність амінокислот ланцюга МН: МЕ3178; МЕ3176; МЕ3163; МЕ3099; МЕ3307; МЕ6О55; МЕб6О56; МЕ6057; МЕбО58;
МЕб6059; МЕ6О60О; МЕб6О61; МЕ6О62; МЕ6063; МЕ6064; МЕ 6065; МЕ6066; МЕ6067; МЕ6068;
МЕб6069; МЕ6070; МЕ6071; МЕ6072; МЕ6073 або МЕб6074, що містить не більше 15, переважно 1, 2,3,4,5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно будь-якої з вказаних послідовностей ланцюга МН.
Вказана МН переважно включає послідовність амінокислот ланцюга МН: МЕЗ3178, МЕЗ3176,
МЕЗ3163, МЕ60О58, МЕ6О6Є1 або МЕб6065; або включає послідовність амінокислот ланцюга МН:
МЕЗ3178, МЕ3176, МЕ3163, МЕ6058, МЕ60О6Є1 або МЕб6О065, що містить не більше 15, переважно 1, 2,3,4,5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно будь-якої з вказаних послідовностей ланцюга МН.
Вказаний УН переважно включає послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕ3178; або включає послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕЗ3178, зображену на фігурі 16В, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно послідовності ланцюга МН-МЕЗ178.
Варіабельні домени антитіла переважно містять ідентичні ланцюги МН, переважно такі, що мають послідовність, зображену на фігурі 16В, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37. Антитіло з варіабельними доменами з ідентичними ланцюгами УН не є біспецифічним антитілом. Ланцюга
МН ідентичні, якщо вони містять однакову послідовність ланцюга УН, зображену на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, або однакову послідовність ланцюга УН, за винятком 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінації, відносно послідовності ланцюга
МН, зображеної на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37.
Моноспецифічні антитіла згідно з даним винаходом, які специфічні до ЕгЬВ-3, мають перевагу, яка полягає в тому, що в них краща функціональна активність проти ЕгоВ-3 у порівнянні зі сполуками відомого рівня техніки, такими як, наприклад, ММ-121 (МеАБб), це означає, що дані антитіла згідно з даним винаходом здатні краще протидіяти активності ЕгоВ-З (такої як викликана лігандом функція рецептора ЕгЬВ-3 і/або викликаний лігандом ріст позитивної за ЕгЬВ-2 і ЕгтоВ-3 клітини). Це, наприклад, показано в таблиці 7 і на фігурі 38.
У переважному варіанті реалізації відповідно до даного винаходу запропоноване біспецифічне антитіло, що містить варіабельний домен, який зв'язує ЕгЬВ-2, при цьому ланцюг
МН вказаного варіабельного домену включає - послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕ1849; або МЕ2971 або її гуманізований варіант, при цьому вказаний гуманізований варіант переважно включає послідовність амінокислот
МЕЗ3958; або МЕЗО004 або її гуманізований варіант, при цьому вказаний гуманізований варіант переважно включає послідовність амінокислот МЕ3991, зображену на фігурі 16А; або включає - послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕ1849 або МЕ2971 або її гуманізований варіант, при цьому вказаний гуманізований варіант переважно включає послідовність амінокислот
МЕЗ3958; або МЕЗ004 або її гуманізований варіант, при цьому вказаний гуманізований варіант переважно включає послідовність амінокислот МЕ3991, зображену на фігурі 16А, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно вказаного МН. Таке біспецифічне антитіло згідно з даним варіантом реалізації додатково переважно містить варіабельний домен, який зв'язує ЕГЬВ-3. Ланцюг УН варіабельного домену, який зв'язує ЕгЬВ-3, переважно включає послідовність амінокислот ланцюга МН: МЕЗ3178; МЕ3176; МЕЗ3163; МЕ3099;
МЕЗ307; МЕ6055; МЕб6О056; МЕб6О57; МЕб6О58; МЕб6О59; МЕб6О60; МЕ6061; МЕ6062; МЕ6063;
МЕб6064; МЕ 6065; МЕ6066; МЕб6О67; МЕб6068; МЕ6069; МЕ6070; МЕб6071; МЕ6072; МЕ6073 або
МЕб6074, зображену на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, або найбільше переважно включає послідовність амінокислот ланцюга МН: МЕЗ3178; МЕЗ3176; МЕЗ3163; МЕЗ3099; МЕЗ3307;
МЕ6055; МЕ6056; МЕ60О57; МЕ6О58; МЕ6О59; МЕ6О6О; МЕ6О61; МЕеЕ60О62; МЕ6063; МЕ6064; МЕ 6065; МЕб6О6б; МЕб6067; МЕ6068; МЕбО069; МЕб6О0О70; МЕб6О0О71; МЕ6072; МЕ6073 або МЕб6074, зображену на фігурі 16В, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно будь-якої з вказаних послідовностей 60 ланцюга МН на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37. Ланцюг МН варіабельного домену, який зв'язує ЕгОВ-3, переважно включає послідовність амінокислот ланцюга МУН-
МЕЗ3178, зображену на фігурі 168, або включає послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕЗ178, зображену на фігурі 168, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно послідовності ланцюга УН, зображеної на фігурі 168.
У даному винаході переважно запропоноване біспецифічне антитіло, що містить варіабельний домен, який зв'язує ЕгЬВ-2, і варіабельний домен, який зв'язує ЕгЬВ-3, при цьому ланцюг УН варіабельного домену, який зв'язує ЕгтоВ-2, включає - послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕ3958, зображену на фігурі 16А; або - послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕ3958, зображену на фігурі 16А, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно вказаної УН; і при цьому ланцюг УН варіабельного домену, який зв'язує ЕгтоВ-3, включає - послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕЗ3178, зображену на фігурі 16В; або - послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕЗ3178, зображену на фігурі 168, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно послідовності ланцюга УН, зображеної на фігурі 168.
У даному винаході переважно запропоноване біспецифічне антитіло, що містить варіабельний домен, який зв'язує ЕгЬВ-2, і варіабельний домен, який зв'язує ЕгЬВ-3, при цьому ланцюг УН варіабельного домену, який зв'язує ЕгтоВ-2, включає - послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕЗ3991, зображену на фігурі 16А; або - послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕ3991, зображену на фігурі 16А, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно вказаної УН; і при цьому ланцюг УН варіабельного домену, який зв'язує ЕгтоВ-3, включає - послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕЗ3178, зображену на фігурі 16В; або - послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕ3178, зображену на фігурі 168, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно послідовності ланцюга УН, зображеної на фігурі 168.
При порівнянні з послідовностями на фігурі 16, поведінка ланцюга УН зазвичай починає помітно відрізнятися, коли вона містить більше 15 замін амінокислот щодо послідовності амінокислот ланцюга МН, зображеної на фігурі 16. Ланцюг МН, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно ланцюга УН, зображеної на фігурі 16, переважно містить 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно ланцюга УН, зображеної на фігурі 16, переважно 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін, або їх комбінацію, переважно 1, 2 або З вставки, делеції, заміни, або їх комбінацію, більше переважно 1 або 2 вставки, делеції, заміни, або їх комбінацію, і переважно 1 вставку, делецію, заміну, або їх комбінацію, відносно ланцюга
МН, зображеної на фігурі 16. Вказані одна або більше вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінація, переважно перебувають не в ділянці СОКІ, СОК2 ії СОКЗ ланцюга МН. Вони також переважно не перебувають в області ЕК4. Заміна амінокислоти переважно являє собою консервативну заміну амінокислоти.
У переважному варіанті реалізації відповідно до даного винаходу запропоноване біспецифічне антитіло, яке включає послідовність амінокислот, зображену на фігурі 160, або біспецифічне антитіло на фігурі 160, що містить не більше 15, переважно 1,2, 3,4,5,6, 7,8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно послідовності на фігурі 160, при цьому вказані не більше 15, переважно 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 замін амінокислот переважно являють собою консервативні заміни амінокислот. Вказані вставки, делеції, заміни амінокислот, або їх комбінація, переважно перебувають не в ділянці СОКЗ ланцюга МН, переважно не в ділянці СОК!І, СОК2 ії СОВЗ ланцюга МН, і переважно не в області ЕКА4.
Розроблені раціональні способи мінімізації вмісту не належних людині залишків у людському контексті. Доступні різні способи успішного переносу (прищеплювання) властивості зв'язування антигена від біспецифічного антитіла на інше антитіло. Властивості зв'язування антитіл переважно визначаються точною послідовністю ділянки СОКЗ, часто додатковий внесок в них вносять послідовності ділянок СОКІ і СОМК2 у варіабельному домені, в комбінації з підходящою структурою варіабельного домену як цілого. У цей час доступні різні способи 60 прищеплювання ділянок СОК на підходящий варіабельний домен іншого антитіла. Огляд деяких із даних способів представлений в .).С. АІтадгої і 9. Егапз5оп (2008) Егопііег: іп Віозсіепсе 13, 1619-1633, який включений у дану заявку за допомогою посилання. Отже, у даному винаході додатково запропоноване людське або гуманізоване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгрВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує
ЕтВ-3, при цьому варіабельний домен, що містить сайт зв'язування ЕгрВ-2, включає послідовність СОКЗ УН, зображену на фігурі 16А або на фігурі 16Е, і при цьому варіабельний домен, що містить сайт зв'язування ЕгОВ-3, містить ділянку СОКЗ УН, зображену на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37. Варіабельна область УН, що містить сайт зв'язування ЕгоВ- 2, переважно включає послідовність ділянки СОКІ1, ділянки СОК2 і ділянки СОКЗ ланцюга УН, зображену на фігурі 16А або на фігурі 16Е. Варіабельна область МН, що містить сайт зв'язування ЕгЬВ-3, переважно включає послідовність ділянки СОКІ, ділянки СОКЗ і ділянки
СОКЗ ланцюга УН, зображену на фігурі 16В, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37. Прищеплення
СОК також можна застосовувати для отримання ланцюга МН з ділянками СОЖК із МН, зображеної на фігурі 16 або фігурі 37, але такої, що містить відмінний каркас. Вказаний відмінний каркас може бути отриманий з іншої УН людини або з іншого ссавця.
Згадані не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 замін амінокислот переважно являють собою консервативні заміни амінокислот. Вказані вставки, делеції, заміни амінокислот, або їх комбінація, переважно перебувають не в ділянці СОКЗ ланцюга УН, переважно не в ділянці СОКІ, СОК2 або СОКЗ ланцюга УН і переважно не в області ЕК4.
Легкий ланцюг варіабельного домену, що містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, зображену на фігурі 16 або фігурі 37, переважно являє собою легкий ланцюг зародкової лінії 012, переважно перебудований легкий ланцюг каппа зародкової лінії людини
ІдМк1-39"01/0)к1701 або її фрагмент або функціональну похідну (номенклатура згідно з базою даних ІМСТ, адреса в мережі інтернет ітоді.огуд). Використовують терміни перебудований легкий ланцюг зародкової лінії каппа людини ІдмМк1-39701/(с5)к1701, ІЗ3КМ1-39/ЛОКО1І, легкий ланцюг пиМк1-39 або коротко пиМк1-39. Легкий ланцюг може містити 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот або їх комбінацію. Згадані 1, 2, 3, 4 або 5 замін амінокислот переважно являють собою консервативні заміни амінокислот, вказані вставки, делеції, заміни амінокислот, або їх комбінацію, переважно перебувають не в ділянці СОКЗ ланцюга МІ, переважно не в
Зо ділянці СОКІ, СОК2 або СОКЗ або області ЕК4 ланцюга МІ.
Доступні різні способи отримання біспецифічних антитіл. Один спосіб включає експресію двох різних важких ланцюгів і двох різних легких ланцюгів в клітині та збір антитіла, яке продукується клітиною. Антитіло, отримане таким способом, як правило, буде включати набір антитіл з різними комбінаціями важких і легких ланцюгів, деякі з яких являють собою бажане біспецифічне антитіло. Біспецифічне антитіло згодом можна очистити з вказаного набору.
Частку біспецифічного антитіла до інших антитіл, які продукуються клітиною, можна збільшити різними способами. У переважному варіанті реалізації даного винаходу вказану частку збільшують шляхом експресії, замість двох різних легких ланцюгів, двох по суті ідентичних легких ланцюгів у клітині. Цю концепцію в даній області також називають методом "загального легкого ланцюга". Коли по суті ідентичні легкі ланцюги працюють разом з двома різними важкими ланцюгами, дозволяючи утворення варіабельних доменів з різними сайтами зв'язування антигена та супутніми різними властивостями зв'язування, частка біспецифічного антитіла до іншого антитіла, яке продукується клітиною, значно збільшується у порівнянні з такою при експресії двох різних легких ланцюгів. Частку біспецифічного антитіла, яке продукується клітиною, можна додатково збільшити шляхом стимуляції утворення пари двох різних важких ланцюгів один з одним замість утворення пари двох ідентичних важких ланцюгів.
В області описані різні способи, якими можна добитися такої гетеродимеризації важких ланцюгів. Одним способом є одержання біспецифічних антитіл "виступ-в-западину". Див. заявку на патент США 20030078385 (Агаїйооп й ін. - Сепепіесі). Інший та переважний спосіб описаний у попередній заявці на патент США 61/635935, після якої слідувала звичайна заявка на патент
США Мо 13/866747 і заявка РСТ Мо РСТ/МІ 2013/050294 МО 2013/157954 АТ), які включені у дану заявку за допомогою посилання. Описані способи та засоби отримання біспецифічних антитіл з однієї клітини, відповідно з якими запропоновані засоби, які сприяють утворенню біспецифічних антитіл замість утворення моноспецифічних антитіл. Дані способи також можна вигідно використовувати у даному винаході. Таким чином, відповідно до даного винаходу запропонований спосіб отримання біспецифічного антитіла згідно з даним винаходом (з однієї клітини), в якому зазначене біспецифічне антитіло містить два домени СНЗ, які здатні утворювати область взаємодії, вказаний спосіб включає надання у вказаній клітині а) першої молекули нуклеїнової кислоти, що кодує вміщуючий тий домен СНЗ важкого ланцюга, Б) другої 60 молекули нуклеїнової кислоти, що кодує вміщуючий 2ий домен СНЗ важкого ланцюга, при цьому вказані молекули нуклеїнової кислоти наділені засобами для переважного утворення пари між вказаними вміщуючими ий і 2ий домени СНЗ важкими ланцюгами, вказаний спосіб додатково включає етап культивування вказаної клітини-хазяїна, забезпечення можливості експресії вказаних двох молекул нуклеїнових кислот і збору вказаного біспецифічного антитіла з культури. Вказані перша та друга молекули нуклеїнових кислот можуть бути частиною однієї молекули нуклеїнової кислоти, вектору або носія для доставки генів і можуть бути вбудовані в один і той самий сайт генома клітини-хазяїна. В якості альтернативи, вказані першу та другу молекули нуклеїнових кислот вводять у вказану клітину окремо.
У переважному варіанті реалізації запропонований спосіб отримання біспецифічного антитіла згідно з даним винаходом (з однієї клітини), в якому зазначене біспецифічне антитіло містить два домени СНЗ, які здатні утворювати область взаємодії, вказаний спосіб включає надання: -клітини, що містить а) першу молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг, що містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-2 і що містить тий домен СНУВЗ, і Б) другу молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг, що містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгОВ-3 і що містить 2ий домен СНЗ, при цьому вказані молекули нуклеїнової кислоти наділені засобами для переважного утворення пари між вказаними Тим і 2им доменами
СНЗ, вказаний спосіб додатково включає етап культивування вказаної клітини, забезпечення можливості експресії вказаних двох молекул нуклеїнових кислот і збору вказаного біспецифічного антитіла (ДС з культури. В особливо переважному варіанті реалізації вказана клітина також містить третю молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує загальний легкий ланцюг.
Вказані перша, друга та третя молекули нуклеїнових кислот можуть бути частиною однієї молекули нуклеїнової кислоти, вектору або носія для доставки генів і можуть бути вбудовані в один і той самий сайт генома клітини-хазяїна. В якості альтернативи, вказані першу, другу та третю молекули нуклеїнових кислот вводять у вказану клітину окремо. Переважний загальний легкий ланцюг являє собою 012, переважно перебудований легкий ланцюг зародкової лінії каппа ІдМк1 39701/0)к1701 людини, описаний вище. Засоби для переважного утворення пари між вказаним Тим і вказаним 2им доменами СНЗ переважно являють собою відповідні мутації в областях, що кодують домен СНЗ важкого ланцюга. Переважні мутації для отримання по суті тільки біспецифічних антитіл являють собою заміни амінокислот І 351К і Т366К (нумерація за
Кабат) у першому домені СНЗ і заміни амінокислот І 3510 і І 368Е в другому домені СНЗ, або навпаки. Отже, додатково запропонований спосіб згідно з даним винаходом для отримання біспецифічного антитіла, в якому вказаний перший домен СНЗ містить заміни амінокислот
ЇЗ51ІК ї Т366К (нумерація за Кабат), і в якому вказаний другий домен СНЗ містить заміни амінокислот І 3510 і Ї368Е, вказаний спосіб додатково включає етап культивування вказаної клітини, забезпечення можливості експресії вказаних молекул нуклеїнової кислоти та збору вказаного біспецифічного антитіла з культури. Також запропонований спосіб згідно з даним винаходом для отримання біспецифічного антитіла, в якому вказаний перший домен СНЗ містить заміни амінокислот І 3510 і І 368Е (нумерація за Кабат), і в якому вказаний другий домен СНЗ містить заміни амінокислот І 351К і Т366К, вказаний спосіб додатково включає етап культивування вказаної клітини, забезпечення можливості експресії вказаних молекул нуклеїнової кислоти та збору вказаного біспецифічного антитіла з культури. Антитіла, які можна отримати за допомогою даних способів, також входять в обсяг даного винаходу. Вказані домени гетеродимеризації СНЗ3 переважно являють собою домени гетеродимеризації ІДС1. Константні області важких ланцюгів, що містять домени гетеродимеризації СНЗ, переважно являють собою константні області Ідс1.
В одному варіанті реалізації відповідно до даного винаходу запропонована молекула нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну область важкого ланцюга антитіла згідно з даним винаходом. Вказана молекула нуклеїнової кислоти (зазвичай, іп мійго, виділена або рекомбінантна нуклеїнова кислота) переважно кодує варіабельну область важкого ланцюга, зображену на фігурі 16А, або фігурі 168, або фігурі 37, або варіабельну область важкого ланцюга, зображену на фігурі 16А, або фігурі 16В, або фігурі 37, що містить 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот або їх комбінацію. У переважному варіанті реалізації молекула нуклеїнової кислоти включає послідовність, зображену на фігурі 16 або фігурі 37. В іншому переважному варіанті реалізації молекула нуклеїнової кислоти кодує ту саму послідовність амінокислот, що і нуклеїнова кислота, зображена на фігурі 16 або фігурі 37, але має відмінну послідовність, так як вона кодує один або більше різних кодонів. Наприклад, таку молекулу нуклеїнової кислоти кодон-оптимізують для клітин-продуцентів антитіл, таких як, 60 наприклад, клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), клітини МБО або клітини РЕК-С6М,
Згідно з даним винаходом додатково запропонована послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг, представлений на фігурі 160 або фігурі 37.
Молекула нуклеїнової кислоти, яку використовують у даному винаході, зазвичай, але не винятково, являє собою рибонуклеїнову кислоту (РНК) або дезоксирибонуклеїнову кислоту (ДНК). Альтернативні нуклеїнові кислоти доступні кваліфікованому фахівцю в даній області.
Нуклеїнова кислота згідно з даним винаходом, наприклад, міститься в клітині. Коли вказана нуклеїнова кислота експресується у вказаній клітині, вказана клітина продукує антитіло згідно з даним винаходом. Отже, в одному варіанті реалізації даного винаходу запропонована клітина, що містить антитіло згідно з даним винаходом і/або нуклеїнову кислоту згідно з даним винаходом. Вказана клітина переважно являє собою клітину тварини, більше переважно клітину ссавця, більше переважно клітину примата, найбільше переважно клітину людини. Для мети даного винаходу підходяща клітина являє собою будь-яку клітину, здатну містити та переважно продукувати антитіло згідно з даним винаходом і/або нуклеїнову кислоту згідно з даним винаходом.
Відповідно до даного винаходу додатково запропонована клітина, що містить антитіло згідно з даним винаходом. Переважно вказана клітина (зазвичай, іп мїго, виділена або рекомбінантна клітина) продукує зазначене антитіло. У переважному варіанті реалізації вказана клітина являє собою клітину гібридоми, клітину СНО, клітину М5О або клітину РЕК-Сб6"М,. В особливо переважному варіанті реалізації вказана клітина являє собою клітину СНО. Додатково запропонована культура клітин, що містить клітину згідно з даним винаходом. Різні організації та компанії розробили лінії клітин для великомасштабного виробництва антитіла, наприклад, для застосування в клініці. Лише деякими з прикладів таких ліній клітин є клітини СНО, клітини
М5О або клітини РЕБ.СбТМ. Дані клітини також застосовують для інших цілей, таких як одержання білків. Лінії клітин, розроблені для промислового виробництва білків й антитіл, у даній заявці далі називають промисловими лініями клітин. Таким чином, у переважному варіанті реалізації відповідно до даного винаходу запропоноване застосування лінії клітин, розробленої для великомасштабного виробництва антитіла, для одержання антитіла згідно з даним винаходом.
Згідно з даним винаходом додатково запропонований спосіб отримання антитіла, який включає культивування клітини згідно з даним винаходом і збір вказаного антитіла зі вказаної культури. Переважно вказану клітину культивують у безсироватковому середовищі. Переважно вказана клітина придатна для вирощування в суспензії. Додатково запропоноване антитіло, яке можна отримати за допомогою способу отримання антитіла згідно з даним винаходом. Антитіло переважно очищають з культурального середовища. Переважно зазначене антитіло очищають афінним способом.
Клітина згідно з даним винаходом, наприклад, являє собою лінію клітин гібридоми, клітину
СНО, клітину М5О або інший тип клітин, відомий своєю придатністю для продукції антитіл для клінічних цілей. В особливо переважному варіанті реалізації вказана клітина являє собою клітину людини. Переважно клітину, яка трансформована областю Еї аденовірусу або її функціональним еквівалентом. Переважним прикладом такої лінії клітин є лінія клітин РЕК.Сб'М або її еквівалент. В особливо переважному варіанті реалізації вказана клітина являє собою клітину СНО або її варіант. Переважно варіант, в якому використовують векторну систему на підставі глутамінсинтетази (55) для експресії антитіла.
Згідно з даним винаходом додатково запропонована композиція, переважно фармацевтична композиція, яка містить антитіло згідно з даним винаходом. Вказана фармацевтична композиція переважно містить (фармацевтично прийнятну) допоміжну речовину або носій. У переважному варіанті реалізації фармацевтична композиція містить 5-50 мМ гістидин, 100-300 мМ трегалозу, 0,1-03 г/л полісорбату 20, або їх комбінацію. рН переважно встановлюють на рівні рН-5,5 - 6,5.
У переважному варіанті реалізації фармацевтична композиція містить 25 мМ гістидин, 220 мМ трегалозу, 0,2 г/л полісорбату 20, або їх комбінацію. рН переважно встановлюють на рівні рн-5,5 - 6,5, найбільше переважно на рівні рН--б.
Антитіло згідно з даним винаходом переважно додатково містить мітку, переважно мітку для візуалізації іп мімо. Така мітка зазвичай необов'язкова для застосування в терапії. Наприклад, мітка може бути корисна для застосування в діагностиці. Наприклад, для візуалізації клітин- мішеней в організмі. Придатні різні мітки, і багато з них добре відомі в даній області. У переважному варіанті реалізації мітка являє собою радіоактивну мітку для детектування. В іншому переважному варіанті реалізації мітка являє собою інфрачервону мітку. Переважно інфрачервона мітка підходить для візуалізації іп мімо. Різні інфрачервоні мітки доступні кваліфікованому фахівцю в даній області. Переважні інфрачервоні мітки являють собою, 60 наприклад: ІКОуе 800; ІКОуе 680КО; ІКОуе 6801 т; ІКОуе 750; ІКНОуе 7000ОХ; ІКНОуе вООКЗ ІКОуе
650; ІКОуе 700 фосфорамідит; ІКОуе 800 фосфорамідит (І1-СОВ О5А; 4647 Зиурегіог 5ігееї;
Лінкольн, Небраска).
Згідно з даним винаходом додатково запропонований спосіб лікування суб'єкта, в якого є позитивна за ЕгрВ-2, ЕТЬВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина або в якого є ризик розвитку вказаної пухлини, який включає введення вказаному суб'єкту антитіла або фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом. Вказаний спосіб переважно включає, перед початком вказаного лікування, визначення того, чи присутня у вказаного суб'єкта така позитивна за ЕгЬВ-2, ЕгоВ-3 або ЕгГЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина або чи є ризик її розвитку. В деяких варіантах реалізації суб'єкта класифікують як (4 або Г(ї-| за ЕгЬВ-2. В іншому варіанті реалізації суб'єкта класифікують як (--Ч за ЕгЬВ-2. Згідно з даним винаходом додатково запропоноване антитіло згідно з даним винаходом для застосування для лікування суб'єкта, в якого присутня позитивна за ЕгЬВ-2,
ЕїВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕпЬВ-3 пухлина або є ризик її розвитку. Іншими словами, відповідно до даного винаходу запропоноване застосування антитіла згідно з даним винаходом для виробництва лікарського засобу або профілактичного агента для лікування позитивної за ЕгЬВ- 2, ЕфВ-3 або ЕгрВ-2/ЕтфВ-3 пухлини. У даній заявці в обсяг терміну лікування входить профілактика.
Пухлина переважно являє собою позитивний за ЕгЬВ-2, ЕгВ-3 або ЕгрВ-2/ЕтЬВ-3 рак.
Переважно вказаний позитивний рак являє собою рак молочної залози, такий як рак молочної залози на ранній стадії. Проте, даний винахід можна застосовувати при широкому діапазоні позитивних за ЕгЬВ-2, ЕТЬВ-3 або ЕгрВ-2/ЕтЬВ-3 раків, таких як рак шлунку, колоректальний рак, рак товстого кишечника, рак шлунку та стравоходу, рак стравоходу, рак ендометрію, рак яєчників, рак печінки, рак легені, включаючи недрібноклітинний рак легені, світлоклітинна саркома, рак слинних залоз, рак голови і шиї, рак головного мозку, рак сечового міхура, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак нирки, рак шкіри, меланома та тому подібні раки. Зазначене антитіло згідно з даним винаходом зазвичай здатне знижувати викликану лігандом функцію рецептора ЕгЬВ-3, переважно викликаний лігандом ріст, на позитивній за
ЕпПЬВ-2 ї ЕгЬВ-3 клітині. Зазначене антитіло згідно з даним винаходом переважно містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен | ЕгтбВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен І ЕгЬ8В-3. В одному переважному варіанті реалізації афінність (КО) вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгоВ-3 клітини дорівнює або більше, ніж афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгОВ-2 клітини. Отже, додатково запропоноване антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгтЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-3, для застосування для лікування суб'єкта, в якого присутня позитивна за ЕгрВ-2, ЕТЬВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина або є ризик її розвитку, переважно рак молочної залози, рак шлунку, колоректальний рак, рак товстого кишечника, рак шлунку та стравоходу, рак стравоходу, рак ендометрію, рак яєчників, рак печінки, рак легені, включаючи недрібноклітинний рак легені, світлоклітинна саркома, рак слинних залоз, рак голови і шиї, рак головного мозку, рак сечового міхура, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак нирки, рак шкіри або меланома, при цьому афінність вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгЬВ-3 клітини дорівнює або більше, ніж афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕтрВ-2 клітини.
Афінність вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгрВ-3 клітини переважно нижче або дорівнює 2,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,39 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,99 нМ. Афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгоВ-2 клітини переважно нижче або дорівнює 5,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 4,5 нМ, переважно нижче або дорівнює 4,0 нМ. В одному переважному варіанті реалізації зазначене антитіло являє собою антитіло РВ4188.
В одному переважному варіанті реалізації зазначене антитіло згідно з даним винаходом містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше одну амінокислоту домену І ЕгоВ- 2, вибрану з групи, що складається з 1144, Т164, К166, Р172, 5179, 5180 і К181, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах приблизно 5 положень амінокислот від Т144, Т164, К166, Р172, 5179, 5180 або К181.
В одному переважному варіанті реалізації зазначене антитіло згідно з даним винаходом переважно містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше одну амінокислоту домену Ш ЕгЬВ-3, вибрану з групи, що складається з К426б, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах 11,2 А від 426 у нативному білку ЕгоВ-3.
Отже, додатково запропоноване антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-3, для застосування 60 для лікування суб'єкта, в якого присутня позитивна за ЕгрВ-2, ЕтЬВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина або є ризик її розвитку, переважно рак молочної залози, рак шлунку, колоректальний рак, рак товстого кишечника, рак шлунку та стравоходу, рак стравоходу, рак ендометрію, рак яєчників, рак печінки, рак легені, включаючи недрібноклітинний рак легені, світлоклітинна саркома, рак слинних залоз, рак голови і шиї, рак головного мозку, рак сечового міхура, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак нирки, рак шкіри або меланома, при цьому зазначене антитіло згідно з даним винаходом містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше одну амінокислоту домену І ЕгЬВ-2, вибрану з групи, що складається з Т144, Т164, К166, Р172, 179, 5180 і К181, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах приблизно 5 положень амінокислот від Т144, Т164, К166, Р172, 5179, 5180 або К181, іМабо при цьому зазначене антитіло згідно з даним винаходом переважно містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше одну амінокислоту домену ІІЇ ЕгоВ-3, вибрану з групи, що складається з К426, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах 11,2 А від Е426 у нативному білку ЕгЬВ-3.
Суб'єкт переважно являє собою людину. Суб'єкт переважно являє собою суб'єкта, що підходить для терапії моноклональним антитілом із застосуванням специфічного до ЕгЬВ-2 антитіла, такого як трастузумаб. У переважному варіанті реалізації у суб'єкта є пухлина, переважно позитивний за ЕгЬВ-2/ЕгтОВ-3 рак, переважно пухлина/рак зі стійким до спрямованої проти ЕгоВ-2 терапії фенотипом і/або фенотипом херегульованої резистентності, переважно зі стійким до моноклонального антитіла фенотипом. Пухлина з таким фенотипом може вислизнути від лікування із застосуванням сучасної спрямованої проти НЕК2 схеми, такої як (але не обмежуючись нею) терапія моноклональним антитілом проти ЕгоВ-2.
Кількість антитіла згідно з даним винаходом, яку потрібно ввести пацієнту, зазвичай перебуває в рамках терапевтичного вікна; це означає, що застосовують кількість, достатню для надання терапевтичної дії, при цьому дана кількість не перевищує граничного значення, що призводить до неприйнятного рівня побічних дій. Зазвичай, чим нижче кількість антитіла, необхідна для надання бажаної терапевтичної дії тим ширше буде терапевтичне вікно.
Антитіло згідно з даним винаходом, що виявляє достатню терапевтичну дію при низькому дозуванні, отже, буде переважним. Зазначене дозування може знаходитися в діапазоні схеми застосування трастузумабу або бути нижче.
У даному винаході описані, серед іншого, антитіла, які націлені на рецептори ЕгрВ-2 і ЕгЬВ-3 і призводять до ефективного інгібування проліферації ліній ракових клітин іп міїго й інгібування росту пухлини іп мімо, навіть у присутності механізму вислизання, такого як, наприклад, підвищена експресія МКС1-В1. Ідентифікували різноманітний набір зв'язуючих плечей Бар людини і миші, специфічних або до ЕгоВ-2, або до ЕгоОВ-3. Їх одержували у вигляді біспецифічних антитіл шляхом клонування в комплементарні вектори експресії, які містили мутації в області СНЗ, що призводять до гетеродимеризації важких ланцюгів. Більше 500 біспецифічних антитіл отримали в малому масштабі та досліджували в аналізі зв'язування та функціональному аналізі на трьох різних лініях ракових клітин. Різні біспецифічні антитіла вибирали і досліджували в моделі ортотопічного ксенотрансплантата, застосовуючи лінію клітин
ВхРСОСЗ3. Дана лінія клітин експресує рецептори до обох ЕгЬВ-2 і ЕгЬВ-3, й її ріст частково залежить від ліганду ЕгбВ-3. Моделі ВХРОЗ являють собою надійні та точні моделі скринінгу.
Більше того, підтвердили сильну протипухлинну активність іп мімо, застосовуючи модель ксенотрансплантата, використовуючи лінію клітин ІМТ-1. Клітини ЛМТ-1 були отримані з метастазів у плеврі з пацієнта у віці 62 років з раком молочної залози, в якого спостерігалася клінічна стійкість до трастузумабу. Клітини ЛІМТ-1 ростуть у вигляді прикріпленого до субстрату моношару й утворюють ксенотрансплантати пухлин у голих мишей. Клітини УЛМТ-1 містять ампліфікований онкоген НЕК-2, в кодуючій послідовності якого не виявили ідентифікованих мутацій. Клітини УМТ-1 надекспресують мРНК і білок НЕК-2, а рівні мРНК і білка НЕК-1, НЕВ-3 і
НЕВ-4 близькі до таких в чутливій до трастузумабу лінії клітин 5КВК-3 (Таппег й ін., Мої Сапсег
Тег 2004).
Важливо відзначити, що застосовуючи антитіло згідно з даним винаходом, добилися кращої протипухлинної дії у порівнянні із застосовуваними в цей час моноклональними антитілами трастузумабом і пертузумабом, а також хімічною сполукою лапатинібом.
Антитіла згідно з даним винаходом можна отримати на рівнях » 50 мг/л після тимчасової трансфекції суспензійних клітин 293Е. Біспецифічні антитіла можна очистити до більше ніж 98 95 чистоти з виходом » 70595. В дослідженнях аналітичних характеристик виявили профілі біспецифічного антитіла досі, які порівнянні з такими для бівалентного моноспецифічного Ідс1.
Відносно функціональної активності, біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом може демонструвати кращу ефективність у порівнянні з комбінацією трастузумаб « пертузумаб іп мійго 60 й іп мімо.
У переважних варіантах реалізації даного винаходу запропонована комбінована терапія. В одному варіанті реалізації антитіло згідно з даним винаходом комбінують з націленим на ЕгоВ-2 агентом, включаючи інгібітор ЕгЬВ-2 або агент, зв'язуючий ЕгЬВ-2.
Приклади націлених на ЕгрВ-2 агентів для застосування в комбінованій терапії зі зв'язуючим
ЕВ-2, ЕВ-3 біспецифічним антитілом, включають будь-який націлений на ЕгбоВ-2 агент, наприклад, зв'язуючий ЕгЬВ-2 агент або інгібітор ЕгоВ-2.
Націлений на ЕгЬВ-2 агент може являти собою низькомолекулярний інгібітор тирозинкінази
НЕК, такий як лапатиніб (тайверб/гтайкербоФ)), нератиніб, афатиніб, тукатиніб або А2О8931.
Націлений на ЕгбВ-2 агент може являти собою антитіло. Трастузумаб або пертузумаб, наприклад, можуть бути переважними, оскільки дані антитіла зв'язують різні епітопи ЕгЬВ-2, так що вони не конкурують за той самий епітоп з антитілом згідно з даним винаходом, як показано у
Прикладах.
Націлений на ЕгобВ-2 агент може являти собою кон'югат антитіла з лікарським засобом, наприклад, трастузумаб емтанзин або 05-8201.
В іншому варіанті реалізації антитіло згідно з даним винаходом комбінують з ММ-121 (МодБб) або КО7116 (Коспе), оскільки дані антитіла зв'язують різні епітопи ЕгоВ-3, так що вони не конкурують за той самий епітоп з антитілом згідно з даним винаходом, як показано у
Прикладах.
В іншому переважному варіанті реалізації з'єднуючу сполуку, яка специфічна до ЕгрВ-2 і
ЕгтЬВ-3, комбінують з інгібітором компонента сигнального шляху РіІЗ-кінази та/або з інгібітором компоненту сигнального шляху МАРК, таким як, наприклад, інгібітор тирозинкінази, інгібітор
РІЗКАа, інгібітор АКІ, інгібітор ттТокК або інгібітор бгс. В одному варіанті реалізації з'єднуючу сполуку, яка специфічна до ЕгЬВ-2 і ЕгоВ-3, комбінують з руйнуючим мікротрубочки лікарським засобом або з інгібітором деацетилази гістонів (НОАС). Неочікувано, автори даного винаходу виявили синергічну дію при застосуванні даних комбінацій. Отже, додатково запропонований спосіб лікування суб'єкта, в якого є позитивна за ЕгтЬВ-2, ЕгбВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина або в якого є ризик розвитку вказаної пухлини, вказаний спосіб включає введення вказаному суб'єкту: - з'єднуючої сполуки, яка специфічна до ЕгЬВ-2 і ЕгЬВ-3, й - однієї або декількох сполук, вибраних із групи, що складається з інгібітора компонента сигнального шляху РіІЗ-кінази, інгібітора компонента сигнального шляху МАРК, руйнуючого мікротрубочки лікарського засобу й інгібітора деацетилази гістонів (НОАС). Вказаний інгібітор переважно включає інгібітор тирозинкінази, інгібітор РіЗКа, інгібітор АКІ, інгібітор тТтОК або інгібітор 5гс. Вказаний інгібітор тирозинкінази переважно являє собою афатиніб, лапатиніб і/або нератиніб. Вказаний інгібітор РІЗКа переважно являє собою ВУЇ719. В одному варіанті реалізації вказаний інгібітор АКТ являє собою МК-2206. В одному переважному варіанті реалізації вказаний інгібітор тТОК являє собою еверолімусє. В одному переважному варіанті реалізації вказаний інгібітор бгс являє собою саракатиніб. В одному переважному варіанті реалізації вказаний руйнуючий мікротрубочки лікарський засіб являє собою паклітаксел. В одному переважному варіанті реалізації вказаний інгібітор НОАС являє собою вориностат. В одному переважному варіанті реалізації вказана з'єднуюча сполука, яка специфічна до ЕгрВ-2 і
ЕтВ-3, являє собою ММ-111 (МеїтітаскК РНагтасешціїсаїє). В одному переважному варіанті реалізації вказана з'єднуюча сполука, яка специфічна до ЕгтоВ-2 і ЕгЬВ-3, являє собою біспецифічне антитіло. В одному переважному варіанті реалізації вказана з'єднуюча сполука, яка специфічна до ЕгбВ-2 і ЕгбВ-3, являє собою біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом.
Отже, додатково запропонований спосіб лікування суб'єкта, в якого є позитивна за ЕгтрВ-2,
ЕтВ-3 або ЕгрВ-2/ЕтВ-3 пухлина або в якого є ризик розвитку вказаної пухлини, вказаний спосіб включає введення вказаному суб'єкту: - біспецифічного антитіла, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ- 2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгтрВ-3, й - однієї або декількох сполук, вибраних із групи, що складається з інгібітора компонента сигнального шляху РіІЗ-кінази, інгібітора компонента сигнального шляху МАРК, руйнуючого мікротрубочки лікарського засобу й інгібітора НОАС.
Також запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-3, для застосування для лікування позитивної за ЕгЬВ-2, ЕТЬВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтВ-3 пухлини, при цьому зазначене лікування включає введення вказаного біспецифічного антитіла та щонайменше однієї сполуки, вибраної з групи, що складається з інгібітора компонента сигнального шляху РіІЗ-кінази, 60 інгібітора компонента сигнального шляху МАРК, руйнуючого мікротрубочки лікарського засобу й інгібітора НОАС, суб'єкту, в якого є позитивна за ЕгЬВ-2, ЕгбВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина.
Переважно біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен | ЕтрВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен ІІ ЕгтбВ-3, комбінують з однією або декількома сполуками, вибраними з групи, що складається з інгібітора компонента сигнального шляху РіЗ-кінази, інгібітора компонента сигнального шляху МАРК, руйнуючого мікротрубочки лікарського засобу й інгібітора НОАС.
Вказаний інгібітор переважно включає інгібітор тирозинкінази, інгібітор РіЗКа, інгібітор АК, інгібітор ттТОкК або інгібітор бгс. Вказаний інгібітор тирозинкінази переважно являє собою афатиніб, лапатиніб і/або нератиніб. Вказаний інгібітор РІЗКа переважно являє собою ВУ 719.
В одному варіанті реалізації вказаний інгібітор АК являє собою МК-2206. В одному переважному варіанті реалізації вказаний інгібітор тТОК являє собою еверолімус. В одному переважному варіанті реалізації вказаний інгібітор бгс являє собою саракатиніб. В одному переважному варіанті реалізації вказаний руйнуючий мікротрубочки лікарський засіб являє собою паклітаксел. В одному переважному варіанті реалізації вказаний інгібітор НОАС являє собою вориностат.
Вказана позитивна за ЕгГЬВ-2, ЕТЬВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина переважно являє собою рак молочної залози, рак шлунку, колоректальний рак, рак товстого кишечника, рак шлунку та стравоходу, рак стравоходу, рак ендометрію, рак яєчників, рак печінки, рак легені, включаючи недрібноклітинний рак легені, світлоклітинну саркому, рак слинних залоз, рак голови і шиї, рак головного мозку, рак сечового міхура, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак нирки, рак шкіри або меланому. У найбільше переважному випадку вказана пухлина являє собою рак молочної залози. В одному варіанті реалізації вказана позитивна за ЕгЬВ-2, ЕтВ-3 або ЕгГЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина містить менше 1000000 рецепторів ЕгтЬВ-2 на поверхні клітини на пухлинну клітину.
В одному варіанті реалізації антитіло згідно з даним винаходом, яке комбінують з однією або декількома сполуками, вибраними з групи, що складається з інгібітора компонента сигнального шляху РіІЗ-кінази, інгібітора компонента сигнального шляху МАРК, руйнуючого мікротрубочки лікарського засобу й інгібітора НОАС, переважно з щонайменше однією сполукою, вибраною з групи, що складається з інгібітора тирозинкінази, інгібітора РіЗКа, інгібітора АКІ, інгібітора ток, інгібітора Згс, вориностату та паклітакселу, більше переважно з щонайменше однією сполукою, вибраною з групи, що складається з афатинібу, лапатинібу, нератинібу, ВУ1 719, МК- 2206, еверолімусу, саракатинібу, вориностату та паклітакселу, як правило, здатна знижувати викликану лігандом функцію рецептора ЕгЬВ-3, переважно викликаний лігандом ріст, на позитивній за ЕгЬВ-2 і ЕгЬВ-3 клітині. Зазначене антитіло згідно з даним винаходом переважно містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен | ЕгрВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен Ії ЕгбВ-3. В одному переважному варіанті реалізації афінність (КО) вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за
ЕтВ-3 клітини дорівнює або більше, ніж афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕтбВ-2 клітини. Афінність вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгбВ-3 клітини переважно нижче або дорівнює 2,0 НМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,39 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,99 НМ. Афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгЬВ-2 клітини переважно нижче або дорівнює 5,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 4,5 НМ, переважно нижче або дорівнює 4,0 нМ.
В одному переважному варіанті реалізації антитіло згідно з даним винаходом, яке комбінують з однією або декількома сполуками, вибраними з групи, що складається з інгібітора компонента сигнального шляху РіІЗ-кінази, інгібітора компонента сигнального шляху МАРК, руйнуючого мікротрубочки лікарського засобу й інгібітора НОАС, переважно з щонайменше однією сполукою, вибраною з групи, що складається з інгібітора тирозинкінази, інгібітора РІЗКа, інгібітора АКІ, інгібітора ттокК, інгібітора 5гс, вориностату та паклітакселу, більше переважно з щонайменше однією сполукою, вибраною з групи, що складається з афатинібу, лапатинібу, нератинібу, ВУ 719, МК-2206, еверолімусу, саракатинібу, вориностату та паклітакселу, містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше одну амінокислоту домену | ЕгЬВ-2, вибрану з групи, що складається з Т144, Т164, К166, Р172, 5179, 5180 і К181, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах приблизно 5 положень амінокислот від Т144, Т164, К166, Р172, 5179, 5180 або К181.
В одному переважному варіанті реалізації антитіло згідно з даним винаходом, яке комбінують з однією або декількома сполуками, вибраними з групи, що складається з інгібітора компонента сигнального шляху РіІЗ-кінази, інгібітора компонента сигнального шляху МАРК, 60 руйнуючого мікротрубочки лікарського засобу й інгібітора НОАС, переважно з щонайменше однією сполукою, вибраною з групи, що складається з інгібітора тирозинкінази, інгібітора РІЗКа, інгібітора АКІ, інгібітора тт, інгібітора 5гс, вориностату та паклітакселу, більше переважно з щонайменше однією сполукою, вибраною з групи, що складається з афатинібу, лапатинібу, нератинібу, ВУ 719, МК-2206, еверолімусу, саракатинібу, вориностату та паклітакселу, містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше одну амінокислоту домену Ії ЕгрВ-3, вибрану з групи, що складається з К426, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах 11,2 А від 426 у нативному білку ЕгтоВ-3.
Переважно біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, що містить щонайменше послідовність СОМКЗ, переважно щонайменше послідовності СОК!І, СОК2 і СО, зі специфічною до ЕгбВ-2 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ2926, МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973, МЕ3004, МЕ3958, МЕ2971, МЕ3025, МЕ2916,
МЕЗ3991, МЕ3031, МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847, МЕЗ3001, МЕЗ3003 і МЕ1898, зображених на фігурі 16А або на фігурі 16Е, і/або містить щонайменше послідовність СОКЗ, переважно щонайменше послідовності СОКІ, СОК2 ії СОКЗ, зі специфічною до ЕгоВ-3 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ3178; МЕ3176; МЕ3163; МЕ3099; МЕ3307;
МЕ6055; МЕ6056; МЕ60О57; МЕ6О58; МЕ6О59; МЕ6О6О; МЕ6О61; МЕеЕ60О62; МЕ6063; МЕ6064; МЕ 6065; МЕб6О66; МЕбОб7; МЕб6068; МЕб6069; МЕб6О0О70; МЕб6071; МЕб6072; МЕб6073 ії МЕ6074, зображених на фігурі 16В, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, комбінують з однією або декількома сполуками, вибраними з групи, що складається з інгібітора компонента сигнального шляху РіІЗ-кінази, інгібітора компонента сигнального шляху МАРК, руйнуючого мікротрубочки лікарського засобу й інгібітора НОАС, переважно з щонайменше однією сполукою, вибраною з групи, що складається з інгібітора тирозинкінази, інгібітора РіЗКа, інгібітора АКІ, інгібітора тт, інгібітора 5гс, вориностату та паклітакселу, більше переважно з щонайменше однією сполукою, вибраною з групи, що складається з афатинібу, лапатинібу, нератинібу, ВУ1 719, МК- 2206, еверолімусу, саракатинібу, вориностату та паклітакселу.
В одному переважному варіанті реалізації біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, яке містить: - специфічну до ЕгоВ-2 послідовність варіабельної області важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з послідовностей варіабельної області важкого ланцюга: МЕ2926,
МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973, МЕЗ3004, МЕ3958, МЕ2971, МЕЗ3025, МЕ2916, МЕЗ3991, МЕЗО031,
МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847, МЕ3001, МЕЗ3003 і МЕ1898, зображених на фігурі 16А або на фігурі 16Е, або містить специфічну до ЕгЬВ-2 послідовність варіабельної області важкого ланцюга, яка відрізняється не більше ніж 15 амінокислотами, переважно не більше ніж 1,2,3,4,5,6,7,8,9 або 10 амінокислотами, більше переважно не більше ніж 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотам від послідовностей варіабельних областей важкого ланцюга МЕ2926, МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973,
МЕЗ004, МЕ3958, МЕ2971, МЕЗ3025, МЕ2916, МЕЗ3991, МЕЗ3031, МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847,
МЕЗ001, МЕ3003 або МЕ 1898, і - специфічну до ЕгоВ-3 послідовність варіабельної області важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з послідовностей варіабельної області важкого ланцюга: МЕЗ3178;
МЕЗ3176; МЕЗ163; МЕЗ3099; МЕЗ3307; МЕб6О55; МЕб6О56; МЕб6О57; МЕ6058; МЕб6О59; МЕ6060;
МЕб6О61; МЕ6062; МЕ606З3; МЕ60О64; МЕ 6065; МЕ60О66; МЕ6067; МЕ6068; МЕ6069; МЕ6070;
МЕб6071; МЕ6072; МЕб6073 і МЕ6074, зображеної на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, або містить специфічну до ЕгЬВ-3 послідовність варіабельної області важкого ланцюга, яка відрізняється не більше ніж 15 амінокислотами, переважно не більше ніж 1,2,3,4,5,6,7,8,9 або 10 амінокислотами, більше переважно не більше ніж 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотам від послідовностей варіабельних областей важкого ланцюга МЕ3178; МЕ3176; МЕ3163; МЕ3099;
МЕЗ307; МЕ6055; МЕб6О56; МЕб6О57; МЕб6О58; МЕб6О59; МЕб6О60; МЕ6061; МЕб6062; МЕ6063;
МЕ6064; МЕ 6065; МЕ6066; МЕ6067; МЕб6О68; МЕ6069; МЕ6070; МЕ6071; МЕ6072; МЕ6073 або
МЕ6074, комбінують з однією або декількома сполуками, вибраними з групи, що складається з інгібітора компонента сигнального шляху РіІЗ-кінази, інгібітора компонента сигнального шляху
МАРК, руйнуючого мікротрубочки лікарського засобу й інгібітора НОАС, переважно з щонайменше однією сполукою, вибраною з групи, що складається з інгібітора тирозинкінази, інгібітора РіЗКа, інгібітора АКІ, інгібітора тТоОК, інгібітора бгс, вориностату та паклітакселу, більше переважно з щонайменше однією сполукою, вибраною з групи, що складається з афатинібу, лапатинібу, нератинібу, ВУ 719, МК-2206, еверолімусу, саракатинібу, вориностату та паклітакселу. В одному переважному варіанті реалізації антитіло РВ4188 комбінують з однією або декількома сполуками, вибраними з групи, що складається з інгібітора компонента сигнального шляху РіІЗ-кінази, інгібітора компонента сигнального шляху МАРК, руйнуючого 60 мікротрубочки лікарського засобу й інгібітора НОАС, переважно з щонайменше однією
Зо сполукою, вибраною з групи, що складається з інгібітора тирозинкінази, інгібітора РіЗКа, інгібітора АКІ, інгібітора тт, інгібітора 5гс, вориностату та паклітакселу, більше переважно з щонайменше однією сполукою, вибраною з групи, що складається з афатинібу, лапатинібу, нератинібу, ВУ 719, МК-2206, еверолімусу, саракатинібу, вориностату та паклітакселу.
У переважних варіантах реалізації даного винаходу запропоновані застосування антитіла згідно з даним винаходом в умовах стресу, викликаного херегуліном. Херегулін являє собою фактор росту, який приймає участь в рості позитивних за ЕгбВ-3 пухлинних клітин. Зазвичай, якщо пухлинні клітини експресують високі рівні херегуліну (називають викликаним херегуліном стресом), то відомі на сьогоднішній день методи лікування, такі як трастузумаб, пертузумаб і лапатиніб, виявляються нездатні інгібувати ріст пухлини. Даний феномен називають херегульованою резистентністю. Неочікувано, проте, антитіло згідно з даним винаходом також здатне протидіяти росту пухлинних клітин, які експресують високі рівні херегуліну. У даній заявці рівень експресії херегуліну вважають високим, якщо в клітині рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 70 95, більше переважно щонайменше 80 95, більше переважно щонайменше 85 95, більше переважно щонайменше 90 95 або 95 95 від рівня експресії херегуліну в клітинах ВХРОЗ або МСЕ7. Рівні експресії херегуліну, наприклад, вимірюють, застосовуючи кількісну ПЛР із РНК пухлини (таку як, наприклад, описана в 5патез й ін. РГО5 ОМЕ, лютий, 2013 р., том 8, випуск 2, стор. 1 - 10, і в МопезакКа й ін., Зсі гапві.Меа., том 3, випуск 99 (2011); стор. 1-11), або застосовуючи способи виявлення білка, такі как, наприклад, твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІ5А), переважно використовуючи зразки крові, плазми або сироватки (такі как, наприклад, описані в Уопезака й ін., 5сі «гапві.Меад., том 3, випуск 99 (2011); стор. 1-11). Отже, додатково запропоноване антитіло згідно з даним винаходом для застосування для лікування суб'єкта, в якого присутня позитивна за ЕгрВ-2,
ЕтфВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина або є ризик її розвитку, при цьому у вказаних клітинах вказаної пухлини рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 7095, більше переважно щонайменше 80 95, більше переважно щонайменше 85 95, більше переважно щонайменше 90 95 або 95 95 від рівня експресії херегуліну в клітинах
ВХРОЗ або МСБЕ7. Зазначене антитіло згідно з даним винаходом переважно містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен І ЕгтбВ-2. Також запропонований спосіб лікування суб'єкта, в якого є позитивна за ЕгЬВ-2, ЕГОВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина, при цьому в клітинах вказаної пухлини рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 7095, більше переважно щонайменше 8095, більше переважно щонайменше 85 95, більше переважно щонайменше 90 95 або 95 95 від рівня експресії херегуліну в клітинах
ВХРОЗ або МСЕ7, вказаний спосіб включає введення вказаному суб'єкту антитіла або фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом. В одному переважному варіанті реалізації запропоноване застосування антитіла згідно з даним винаходом для отримання лікарського засобу для лікування позитивної за ЕГЬВ-2, ЕГОВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлини, при цьому в клітинах вказаної пухлини рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 7095, більше переважно щонайменше 8095, більше переважно щонайменше 8595, більше переважно щонайменше 9095 або 9595 від рівня експресії херегуліну в клітинах ВХРОЗ або МСЕ7. Вказана позитивна за ЕгЬВ-2, ЕТЬВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина переважно являє собою рак молочної залози, рак шлунку, колоректальний рак, рак товстого кишечника, рак шлунку та стравоходу, рак стравоходу, рак ендометрію, рак яєчників, рак печінки, рак легені, включаючи недрібноклітинний рак легені, світлоклітинну саркому, рак слинних залоз, рак голови і шиї, рак головного мозку, рак сечового міхура, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак нирки, рак шкіри або меланому. У найбільше переважному випадку вказана пухлина являє собою рак молочної залози. Отже, додатково запропоноване антитіло згідно з даним винаходом для застосування для лікування суб'єкта, в якого присутній або в якого є ризик розвитку раку молочної залози, раку шлунку, колоректального раку, раку товстого кишечника, раку шлунку та стравоходу, раку стравоходу, раку ендометрію, раку яєчників, раку печінки, раку легені, включаючи недрібноклітинний рак легені, світлоклітинної саркоми, раку слинних залоз, раку голови і шиї, раку головного мозку, раку сечового міхура, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози, раку нирки, раку шкіри або меланоми, переважно раку молочної залози, при цьому в клітинах вказаного раку рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 70 95, більше переважно щонайменше 8095, більше переважно щонайменше 8595, більше переважно щонайменше 9095 або 9595 від рівня експресії херегуліну в клітинах ВХРОЗ або МСЕ7.
Зазначене антитіло згідно з даним винаходом переважно містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен І ЕгрВ-2. 60 Високі рівні херегуліну зазвичай присутні у процесі утворення метастазів (тобто міграції,
інвазії, росту та/"або диференціюванні пухлинних клітин або ініціюючих пухлину клітин).
Зазвичай ініціюючі пухлину клітини ідентифікують на підставі маркерів стовбурових клітин, таких як, наприклад, СО44, СО24, СО133 й/"або АГОНІ. Отже, даним процесам навряд чи можна протидіяти за допомогою відомих на сьогоднішній день методов лікування, таких як трастузумаб і пертузумаб. Оскільки антитіло згідно з даним винаходом здатне протидіяти росту та/або диференціюванню пухлинних клітин або ініціюючих пухлину клітин, які експресують високі рівні херегуліну, таке антитіло згідно з даним винаходом також є особливо підходящим для протидії утворенню метастазів. Отже, додатково запропонований спосіб протидії утворенню метастазів у суб'єкта, в якого є позитивна за ЕгЬВ-2, ЕТЬВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина, в якому у вказаній позитивній за ЕгтЬВ-2, ЕтВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 клітині пухлини рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 70 95, більше переважно щонайменше 80 95, більше переважно щонайменше 85 95, більше переважно щонайменше 90 95 або 95 95 від рівня експресії херегуліну в клітинах ВХРОЗ або МСЕ7, який включає введення вказаному суб'єкту біспецифічного антитіла, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує
ЕпВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-3. Також запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгоВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгОВ-3, для застосування для лікування або запобігання утворення метастазів, при цьому у вказаній позитивній за ЕГЬВ-2, ЕТЬВ-3 або ЕгГЬВ- 2/ЕтЬВ-3 клітині пухлини рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 7095, більше переважно щонайменше 80 95, більше переважно щонайменше 85 95, більше переважно щонайменше 90 95 або 95 95 від рівня експресії херегуліну в клітинах
ВХРОЗ або МСЕ7. Додатково запропоноване застосування біспецифічного антитіла згідно з даним винаходом для отримання лікарського засобу для лікування або запобігання утворення метастазів, при цьому у вказаній позитивній за ЕгЬВ-2, ЕГОВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕгЬВ-3 клітині пухлини рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 70 95, більше переважно щонайменше 8095, більше переважно щонайменше 8595, більше переважно щонайменше 90 95 або 95 95 від рівня експресії херегуліну в клітинах ВХРОЗ або МСЕ7. Вказана позитивна за ЕгтрВ-2, ЕРЬВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина переважно являє собою рак молочної залози, рак шлунку, колоректальний рак, рак товстого кишечника, рак шлунку та стравоходу, рак стравоходу, рак ендометрію, рак яєчників, рак печінки, рак легені, включаючи недрібноклітинний рак легені, світлоклітинну саркому, рак слинних залоз, рак голови і шиї, рак головного мозку, рак сечового міхура, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак нирки, рак шкіри або меланому. У найбільше переважному випадку вказана пухлина являє собою рак молочної залози. Отже, додатково запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгоВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕтВ-3, для застосування для лікування або запобігання утворення метастазів з клітин раку молочної залози, раку шлунку, колоректального раку, раку товстого кишечника, раку шлунку та стравоходу, раку стравоходу, раку ендометрію, раку яєчників, раку печінки, раку легені, включаючи недрібноклітинний рак легені, світлоклітинної саркоми, раку слинних залоз, раку голови і шиї, раку головного мозку, раку сечового міхура, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози, раку нирки, раку шкіри або меланоми, переважно з клітин раку молочної залози, при цьому у вказаних клітинах рівень експресії херегуліну становить щонайменше 6095, переважно щонайменше 7095, більше переважно щонайменше 80 95, більше переважно щонайменше 85 95, більше переважно щонайменше 90 95 або 95 95 від рівня експресії херегуліну в клітинах ВХРОЗ або МСЕ?7. Зазначене антитіло згідно з даним винаходом зазвичай здатне знижувати викликану лігандом функцію рецептора ЕгЬВ-3, переважно викликаний лігандом ріст, на позитивній за ЕгЬВ-2 і ЕгЬВ-3 клітині. Зазначене антитіло згідно з даним винаходом переважно містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен
ЕЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен ІІ ЕгрВ-3. В одному переважному варіанті реалізації афінність (КО) вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгбВ-3 клітини дорівнює або більше, ніж афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгВ-2 клітини. Афінність вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕїОВ-3 клітини переважно нижче або дорівнює 2,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 1,39 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,99 нМ. Афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгоВ-2 клітини переважно нижче або дорівнює 5,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 4,5 НМ, переважно нижче або дорівнює 4,0 нМ.
В одному переважному варіанті реалізації зазначене антитіло згідно з даним винаходом містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше одну амінокислоту домену І ЕгоВ- 60 2, вибрану з групи, що складається з 1144, Т164, К166, Р172, 5179, 5180 і К181, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах приблизно 5 положень амінокислот від Т144, Т164, К166, Р172, 5179, 5180 або К181.
В одному переважному варіанті реалізації зазначене антитіло згідно з даним винаходом переважно містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше одну амінокислоту домену ПШ ЕгЬВ-3, вибрану з групи, що складається з К426б, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах 11,2 А від 426 у нативному білку ЕгоВ-3.
В одному переважному варіанті реалізації запропонований спосіб згідно з даним винаходом для лікування суб'єкта, в якого є позитивна за ЕгЬВ-2, ЕгОВ-3 або ЕгоЬВ-2/ЕгтЬВ-3 пухлина, при цьому в клітинах вказаної пухлини рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 7095, більше переважно щонайменше 8095, більше переважно щонайменше 8595, більше переважно щонайменше 9095 або 95595 від рівня експресії херегуліну в клітинах ВХРОЗ або МСЕ7, або запропоноване антитіло згідно з даним винаходом для застосування в такому лікуванні, при цьому зазначене антитіло містить щонайменше послідовність СОКЗ, переважно щонайменше послідовності СОМКІ, СОМК2 і СОКЗ, або щонайменше послідовність варіабельної області важкого ланцюга зі специфічною до ЕгЬВ-2 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ2926, МЕ2930,
МЕ1849; МЕ2973, МЕЗ3004, МЕ3958, МЕ2971, МЕЗ025, МЕ2916, МЕ3991, МЕЗ3031, МЕ2889,
МЕ2913, МЕ1847, МЕ3001, МЕЗ3003 і МЕ1898, зображених на фігурі 16А або на фігурі 16Е.
В одному переважному варіанті реалізації запропонований спосіб згідно з даним винаходом для лікування суб'єкта, в якого є позитивна за ЕгЬВ-2, ЕгОВ-3 або ЕгоЬВ-2/ЕгтЬВ-3 пухлина, при цьому в клітинах вказаної пухлини рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 7095, більше переважно щонайменше 8095, більше переважно щонайменше 8595, більше переважно щонайменше 9095 або 95595 від рівня експресії херегуліну в клітинах ВХРОЗ або МСЕ7, або запропоноване антитіло згідно з даним винаходом для застосування в такому лікуванні, при цьому зазначене антитіло містить щонайменше послідовність СОКЗ, переважно щонайменше послідовності СОМКІ, СОМК2 і СОКЗ, або щонайменше послідовність варіабельної області важкого ланцюга зі специфічною до ЕгЬВ-3 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ3178; МЕ3176;
МЕЗ163; МЕЗ3099; МЕЗ307; МЕ6О055; МЕб6О56; МЕб6О57; МЕб6О58; МЕ6059; МЕб6О60; МЕб6061;
Зо МЕб6062; МЕ6063; МЕ60О64; МЕ 6065; МЕ6О66; МЕ6067; МЕ6068; МЕ6069; МЕ6070; МЕ6071;
МЕб6072; МЕ6073 і МЕ6074, зображених на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37. В одному варіанті реалізації запропоноване антитіло РВ4188 для застосування для лікування суб'єкта, в якого є позитивна за ЕгЬВ-2, ЕГОВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина, при цьому в клітинах вказаної пухлини рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 7095, більше переважно щонайменше 80 95, більше переважно щонайменше 85 95, більше переважно щонайменше 90 95 або 95 95 від рівня експресії херегуліну в клітинах
ВХРОЗ або МСЕ7.
Як вже описано, антитіла згідно з даним винаходом особливо підходять для лікування позитивних за ЕгЬВ-2 пухлинних клітин з менше ніж 1000000 рецепторів ЕгбВ-2 на їх поверхні.
Пацієнти з такими пухлинами, яких зазвичай класифікують як ЕгЬВ-2 (ї-| або ЕгрВ-2 |У, включають пацієнтів з первинними пухлинами, а також пацієнтів з рецидивувавшими позитивними за ЕгЬбВ-2 пухлинами. Використовувані в даний час методи лікування, такі як трастузумаб (герцептин) і пертузумаб, призначають тільки пацієнтам зі злоякісними позитивними за ЕгбВ-2 клітинами, які містять більше ніж 1000000 рецепторів ЕгЬВ-2 на своїй поверхні, яких класифікують як ЕгрВ-2 (і-ї). Пацієнтів, яких класифікують як ЕгЬВ-2 (ї4 або
ЕпЬВ-2 |У), отже, переважно лікують антитілом згідно з даним винаходом. Отже, додатково запропоновані спосіб або антитіло для застосування згідно з даним винаходом, при цьому у вказаного суб'єкта є позитивна за ЕгтЬ8В-2 або ЕгоВ-2/ЕтфВ-3 пухлина, яка містить менше 1000000 рецепторів ЕгЬВ-2 на поверхні на пухлинну клітину. В одному переважному варіанті реалізації запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує
ЕтВ-3, для застосування для лікування або запобігання утворення метастазів, при цьому у вказаній позитивній за ЕгбЬВ-2, ЕВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 клітині пухлини рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 70 95, більше переважно щонайменше 80 95, більше переважно щонайменше 85 95, більше переважно щонайменше 90 95 або 9595 від рівня експресії херегуліну в клітинах ВХРОЗ або МСБЕ7, і при цьому вказана пухлинна клітина містить менше 1000000 рецепторів ЕгЬВ-2 на поверхні клітини.
В іншому переважному варіанті реалізації антитіло згідно з даним винаходом застосовують для протидії позитивної за ЕгОВ-2, ЕтОВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлини у суб'єкта, який страждає бо серцевою недостатністю або в якого є ризик її розвитку. Наявність серцевої недостатності означає, що у суб'єкта серцева функція, наприклад, фракція викиду лівого шлуночка (ФВЛШ), становить менше ніж 90 95, переважно менше ніж 85 95 або менше ніж 80 95, переважно менше ніж 75 95 або менше ніж 70 95 від здорової серцевої функції. Вказана здорова серцева функція являє собою, наприклад, середню серцеву функцію (таку як, наприклад, середня ФВЛШ) здорової популяції. В якості альтернативи, вказана здорова серцева функція являє собою функцію (таку як ФВЛІШШ), виміряну у пацієнта перед початком протипухлинної терапії антитілом згідно з даним винаходом.
Серцеву функцію, наприклад, відслідковували шляхом фізикального огляду суб'єкта та шляхом дослідження ФВЛШ, застосовуючи наприклад, ехокардіографію або багатопроекційне радіоїзотопне дослідження серця (сканування МОСА).
ЕпВ-2 приймає участь в рості, репарації та виживаності кардіоміоцитів у дорослих як частина сигнальної мережі, яка включає комплекс рецепторів херегуліну НЕК2:НЕКА. Раніше у даній заявці описано, що кардіотоксичність є відомим чинником ризику при націлених на ЕгоВ-2 методах лікування, і частота ускладнень підвищується, коли трастузумаб застосовують в комбінації з антрациклінами, тим самим викликаючи серцевий стрес. Наприклад, комбінація доксицикліну з трастузумабом виявляє важкі побічні дії на серце. Незважаючи на зростаючу кількість клінічних випадків викликану трастузумабом дисфункції серця, механізм його дії невідомий. Беручи до уваги кардіотоксичність відомих на сьогоднішній день методів лікування, спрямованих проти позитивних за ЕгбЬВ-2, ЕгВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕфВ-3 пухлин, особливо переважно застосовувати антитіло згідно з даним винаходом. У прикладах показано, що у даному винаході запропоновані антитіла, які не впливають або в значно меншому ступені у порівнянні з трастузумабом і пертузумабом впливають на виживаність кардіоміоцитів. Це дає істотну перевагу, оскільки кардіотоксичність зменшується. Це вже є перевагою для людей, які не страждають від серцевої недостатності, й є ще більшою перевагою для людей, які вже страждають від серцевої недостатності, таких як, наприклад, суб'єкти, що страждають від застійної серцевої недостатності (ЗСН), дисфункції лівого шлуночка (ДЛШ) та/або зниженої фракції викиду лівого шлуночка (ФВЛШ), і/або суб'єкти, в яких був інфаркт міокарда. Отже, додатково запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом для застосування для лікування суб'єкта, в якого присутня позитивна за ЕгрВ-2, ЕтЬВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина або є ризик її розвитку, при цьому у вказаного суб'єкта серцева функція становить менше ніж 90 965, переважно менше ніж 85 95, або менше ніж 80 95, або менше ніж 75 95, або менше ніж 7095 від здорової серцевої функції. Вказана серцева функція переважно включає ФВЛШ.
Вказана позитивна за ЕгЬВ-2, ЕгОбВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина переважно являє собою рак молочної залози, рак шлунку, колоректальний рак, рак товстого кишечника, рак шлунку та стравоходу, рак стравоходу, рак ендометрію, рак яєчників, рак печінки, рак легені, включаючи недрібноклітинний рак легені, світлоклітинну саркому, рак слинних залоз, рак голови і шиї, рак головного мозку, рак сечового міхура, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак нирки, рак шкіри або меланому. У найбільше переважному випадку вказана пухлина являє собою рак молочної залози. Зазначене антитіло згідно з даним винаходом переважно містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен | ЕгоВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен ШШ ЕгбВ-3. В одному переважному варіанті реалізації запропонований спосіб згідно з даним винаходом для лікування суб'єкта, в якого є позитивна за
ЕтфВ-2, ЕфбВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина, при цьому у вказаного суб'єкта серцева функція становить менше ніж 90 95, переважно менше ніж 85 95, переважно менше ніж 80 95, переважно менше ніж 75 95 або менше ніж 70 95 від здорової серцевої функції, або антитіло згідно з даним винаходом для застосування в такому лікуванні, при цьому зазначене антитіло містить: - щонайменше послідовність СОКЗ, переважно щонайменше послідовності СОКІ, СОКЗ2 і
СОКЗ, або щонайменше послідовність варіабельної області важкого ланцюга зі специфічною до
ЕтВ-2 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ2926,
МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973, МЕЗ3004, МЕ3958, МЕ2971, МЕЗ025, МЕ2916, МЕЗ3991, МЕЗ3031,
МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847, МЕ3001, МЕЗ3003 і МЕ1898, зображених на фігурі 16А або на фігурі 16Е, або послідовність варіабельної області важкого ланцюга, яка відрізняється не більше ніж 15 амінокислотами, переважно не більше ніж 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 амінокислотами, більше переважно не більше ніж 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотами від перерахованих послідовностей варіабельної області важкого ланцюга; та/або - щонайменше послідовність СОКЗ, переважно щонайменше послідовності СОКІ, СОК?2 і
СОКЗ, або щонайменше послідовність варіабельної області важкого ланцюга зі специфічною до
ЕтВ-3 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕЗ3178;
МЕЗ3176; МЕЗ163; МЕЗ3099; МЕЗ3307; МЕб6О55; МЕб6О56; МЕб6О57; МЕ6058; МЕ6059; МЕ6060; бо МЕб6О61; МЕ6062; МЕ606З3; МЕ60О64; МЕ 6065; МЕ60О66; МЕ6067; МЕ6068; МЕ6069; МЕ6070;
МЕб6071; МЕ6072; МЕ6073 і МЕ6074, зображених на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, або послідовність варіабельної області важкого ланцюга, яка відрізняється не більше ніж 15 амінокислотами, переважно не більше ніж 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 амінокислотами, більше переважно не більше ніж 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотами від перерахованих послідовностей варіабельної області важкого ланцюга. В одному переважному варіанті реалізації зазначене антитіло являє собою РВ4188.
В одному варіанті реалізації зазначене біспецифічне антитіло призначене для застосування для лікування суб'єкта в умовах стресу, викликаного херегуліном, що пояснено більше докладно в інших місцях у даній заявці. Отже, додатково запропоноване біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом для застосування для лікування суб'єкта, в якого присутня позитивна за ЕгрВ- 2, ЕфВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтВ-3 пухлина або є ризик її розвитку, при цьому у вказаного суб'єкта серцева функція становить менше ніж 90 95, переважно менше ніж 85 95, переважно менше ніж 80 95, переважно менше ніж 75 95 або менше ніж 70 95 від здорової серцевої функції, і при цьому у вказаних клітинах вказаної пухлини рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 7095, більше переважно щонайменше 8095, більше переважно щонайменше 8595, більше переважно щонайменше 9095 або 95595 від рівня експресії херегуліну в клітинах ВХРОЗ або МСЕ7. Вказана серцева функція переважно включає ФВЛШ.
Також запропонований спосіб лікування суб'єкта, в якого є позитивна за ЕгЬВ-2, ЕтЬВ-3 або
ЕтВ-2/ЕТтЬВ-3 пухлина, при цьому у вказаного суб'єкта серцева функція становить менше ніж 90 95, переважно менше ніж 85 956, переважно менше ніж 80 96, переважно менше ніж 75 95, переважно менше ніж 7095 від здорової серцевої функції, і при цьому в клітинах вказаної пухлини рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 7095, більше переважно щонайменше 80 95, більше переважно щонайменше 85 95, більше переважно щонайменше 90 95 або 95 95 від рівня експресії херегуліну в клітинах ВХРОЗ або
МСЕ7, вказаний спосіб включає введення вказаному суб'єкту біспецифічного антитіла або фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом. В одному переважному варіанті реалізації запропоноване застосування біспецифічного антитіла згідно з даним винаходом для отримання лікарського засобу для лікування позитивної за ЕгЬВ-2, ЕтВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтВ-3 пухлини у суб'єкта, серцева функція якого, переважно ФВЛШ, становить менше ніж 90 95, переважно менше 85 95, переважно менше 80 95, переважно менше 75 95 або менше 70 95 від здорової серцевої функції, переважно від здорової ФВЛШ, при цьому в клітинах вказаної пухлини рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 7095, більше переважно щонайменше 80 95, більше переважно щонайменше 85 95, більше переважно щонайменше 90 95 або 95 95 від рівня експресії херегуліну в клітинах ВХРОЗ або
МСЕ7.
Також запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-3, для застосування для лікування або запобігання утворення метастазів, при цьому у вказаного суб'єкта серцева функція становить менше 90 95, переважно менше 85 956, переважно менше 80 95, переважно менше 75 95, переважно менше 70 95 від здорової серцевої функції. Додатково запропоноване застосування біспецифічного антитіла згідно з даним винаходом для отримання лікарського засобу для лікування або запобігання утворення метастазів, при цьому у вказаного суб'єкта серцева функція становить менше 90 96, переважно менше 8595, переважно менше 80 95, переважно менше 7595, переважно менше 7095 від здорової серцевої функції. Вказана позитивна за ЕгтрВ-2, ЕРЬВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина переважно являє собою рак молочної залози, рак шлунку, колоректальний рак, рак товстого кишечника, рак шлунку та стравоходу, рак стравоходу, рак ендометрію, рак яєчників, рак печінки, рак легені, включаючи недрібноклітинний рак легені, світлоклітинну саркому, рак слинних залоз, рак голови і шиї, рак головного мозку, рак сечового міхура, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак нирки, рак шкіри або меланому. У найбільше переважному випадку вказана пухлина являє собою рак молочної залози. Вказана серцева функція переважно включає ФВЛШ. В одному переважному варіанті реалізації зазначене антитіло являє собою антитіло РВ4188.
В іншому варіанті реалізації антитіла згідно з даним винаходом застосовують для протидії фосфорилюванню різних факторів, що сприяють виживаності клітин шляху АКІ (також називаного РІЗ-кназним шляхом) і МАР-кіназного шляху. Вони являють собою сприятливі проліферації шляхи передачі сигналів від НЕКЗ. Неочікувано, автори даного винаходу досягли успіху в значному інгібуванні фосфорилювання АКї ЕККТ/2 і рибосомного білка 56 (56-АР) антитілом згідно з даним винаходом, тоді як трастузумаб і пертузумаб не виявляють такої сильної дії проти фосфорилювання. Протидія фосфорилюванню факторів, що сприяють 60 проліферації сигнальних шляхів РіІЗ-кінази і МАР-кінази є перевагою, оскільки це перешкоджає росту позитивної за ЕгбВ-3 клітини пухлини. Отже, додатково запропоноване застосування антитіла згідно з даним винаходом для протидії, переважно інгібування фосфорилювання АКІ,
ЕККТ/2 і/або 56-КР. Важливо відзначити, що фосфорилювання АКІ можна значно зменшити або навіть повністю блокувати антитілом згідно з даним винаходом, як іп мійго, так й іп мімо, як показано у Прикладах. Отже, у переважному варіанті реалізації запропоноване застосування антитіла згідно з даним винаходом для протидії, переважно інгібування фосфорилювання АКІ.
Також запропоноване застосування антитіла згідно з даним винаходом для протидії утворенню комплекса НЕКЗ-рв85. Оскільки утворення комплекса НЕНЗ-рв5 є першою фазою при активації
АКІ, то протидія утворенню вказаного комплекса НЕКЗ-ре5 є переважною. Зазначене антитіло згідно з даним винаходом переважно являє собою біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен І ЕгЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує домен ІЇЇ ЕгЬВ-3. Зазначене антитіло переважно містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше одну амінокислоту домену | ЕгоВ-2, вибрану з групи, що складається з
Т144, 1164, 8166, Р172, 5179, 5180 і К181, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах приблизно 5 положень амінокислот від Т144, Т164, К166, Р172, 179, 5180 або К181. В якості доповнення або альтернативи, зазначене антитіло переважно містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше одну амінокислоту домену І ЕгрВ-3, вибрану з групи, що складається з Е409 і К426, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах 11,2 А від Б426 у нативному білку ЕгЬВ-3. В одному варіанті реалізації зазначене антитіло містить щонайменше одну послідовність СОКІ, СОК2 і СОКЗ або щонайменше одну послідовність УН, зображену на фігурі 16 або фігурі 37. В одному варіанті реалізації зазначене антитіло являє собою РВ4188.
Відповідно до даного винаходу також запропонований спосіб лікування індивіда, в якого присутня позитивна за ЕгбВ-2 пухлина або є ризик розвитку позитивною за ЕгтоВ-2 пухлини, вказаний спосіб включає введення індивіду, що потребує цього, націленого на ЕгЬВ-2 агента, включаючи інгібітор ЕгЬВ-2 або агент, зв'язуючий ЕгЬВ-2, такий як бівалентне моноспецифічне антитіло, що містить сайт зв'язування антигена, який може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгоВ-2, і біспецифічне антитіло, що містить сайт зв'язування антигена, який може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгЬВ-2, і сайт зв'язування антигена, який може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгЬВ-3.
Якщо інгібітор ЕГгЬВ-2 являє собою моноспецифічне антитіло, то зазначене моноспецифічне антитіло та біспецифічне антитіло переважно зв'язують різні епітопи на ЕгрВ-2. Різні епітопи
ЕтВ-2 переважно перебувають на різних позаклітинних доменах ЕгЬВ-2. Моноспецифічне антитіло може переважно зв'язувати епітоп на позаклітинному домені ІМ, домені ІІ або домені ІП
ЕїбВ-2. Біспецифічне антитіло може переважно зв'язувати епітоп на позаклітинному домені І
ЕВ-2.
Націлений на ЕгбВ-2 агент може містити кон'югований лікарський засіб, зокрема, коли інгібітор ЕгЬбВ-2 являє собою моноспецифічне антитіло, зазначене моноспецифічне антитіло переважно містить кон'югований лікарський засіб, наприклад, адо-трастузумаб емтанзин (кадсилаф)).
Кон'югований лікарський засіб також може знаходитися на біспецифічному антитілі або як на біспецифічному антитілі, так і на націленому на ЕгЬВ-2 агенті. Кон'югат з лікарським засобом переважно включає емтанзин. Кон'югати антитіл з лікарським засобом, або АЛЗ, являють собою важливий клас високоефективних біофармацевтичних засобів, розроблених в якості таргетної терапії для лікування людей, що страждають на рак. На відміну від хіміотерапії, АЛЗ призначені для націлювання та знищення тільки ракових клітин і заощадження здорових клітин. Кон'югат з лікарським засобом являє собою антитіло, пов'язане з біологічно активним цитотоксичним (протираковим) навантаженням або лікарським засобом. Поєднуючи в собі унікальні здатності моноклональних антитіл і здатність знищувати рак цитотоксичних лікарських засобів, кон'югати антитіл з лікарським засобом дозволяють точно розрізняти здорові та хворі тканини. Це означає, що, на противагу звичайним хіміотерапевтичним агентам, кон'югати антитіло з лікарським засобом націлюються на ракову клітину й атакують її так, що здорові клітини не так сильно уражаються. Кон'югати антитіла з лікарським засобом описані в Рідозері й ін.; Віоса. 2004 103(5):1807-14. МийПага А. Мате Неміємв Огид Оібзсомегу 12, 329-332 (2013); 70101 К5 й ін.;
Маїшге Неміемж5 Огид Оібвсомегу 12, 259-260 (2013); Мепеп й ін.; Віосопічд Спет 2015; 26:2176- 2185; спот й ін.; Сапсег Кев5. 1992; 52(5):1067-72. НоПпгег Т. ЧдЧошта! ої Апіроаду-ага
Сопіцдаїевз. 21 червня 2013 р. Підходящі лікарські засоби для включення в АЛЗ3З являють собою ауристатини (інгібітори полімерази тубуліну); майтансини (деполімеризація тубуліну); каліхеаміцини (розщеплення ДНК); дуокарміцини (алкілуючі агенти, які зв'язуються з малою 60 борозенкою ДНК); димери піролбензодіазепіну (ПБД-димери, крослінкери малої борозенки ДНК)
і с-аманітин (інгібітор РНК-полімерази ІІ). У переважному варіанті реалізації лікарський засіб являє собою емтанзин.
Якщо інгібітор ЕГгЬВ-2 являє собою моноспецифічне антитіло, то зазначене моноспецифічне антитіло переважно являє собою трастузумаб (номер СА5 180288-69-1). Його можна замінити або комбінувати з пертузумабом (номер СА5 380610-27-5) В особливо переважному варіанті реалізації моноспецифічне антитіло являє собою трастузумаб-емтанзин (Т-0ОМІ також реалізуються на ринку під найменуванням кадсилаф)).
Біспецифічне антитіло переважно містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує
ЕїЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгбВ-3, при цьому вказаний перший сайт зв'язування антигена містить щонайменше послідовність СОКЗ із МЕ3958, або послідовність СОКЗ, яка відрізняється не більше ніж трьома, переважно не більше ніж двома, переважно не більше ніж однією амінокислотою від послідовності СОКЗ з МЕЗ3958, і при цьому вказаний другий сайт зв'язування антигена містить щонайменше послідовність СОКЗ із МЕ3178 або послідовність СОКЗ, яка відрізняється не більше ніж трьома, переважно не більше ніж двома, переважно не більше ніж однією амінокислотою від послідовності СОКЗ із МЕЗ3178.
Біспецифічне антитіло переважно містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕтОВ- 2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгбВ-3, при цьому вказаний перший сайт зв'язування антигена містить щонайменше послідовність СОКЗ із МЕ3958 і при цьому вказаний другий сайт зв'язування антигена містить щонайменше послідовність СОКЗ із МЕЗ3178.
У переважному варіанті реалізації біспецифічне антитіло містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгтЬВ-3, при цьому вказаний перший сайт зв'язування антигена містить щонайменше послідовності СОКІ, СОК2 їі
СОКЗ із МЕ3958, або послідовності СОМКІ, СОК2 і СОКЗ, які відрізняються не більше ніж трьома, переважно не більше ніж двома, переважно не більше ніж однією амінокислотою від послідовностей СОКІ, СОК2 і СОКЗ із МЕЗ3958, і при цьому вказаний другий сайт зв'язування антигена містить щонайменше послідовності СОМК1, СОК2 і СОКЗ із МЕ3178, або послідовності
СОКІ1, СО ії СОКУ, які відрізняються не більше ніж трьома, переважно не більше ніж двома, переважно не більше ніж однією амінокислотою від послідовностей СОКІ, СОК2 і СОКЗ із
МЕЗ178.
У переважному варіанті реалізації біспецифічне антитіло містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгтЬВ-3, при цьому вказаний перший сайт зв'язування антигена містить щонайменше послідовності СОКІ, СОК2 їі
СОМЗ із МЕ3958, і при цьому вказаний другий сайт зв'язування антигена містить щонайменше послідовності СОКІ, СОК2 і СОКЗ із МЕ3178.
У переважному варіанті реалізації біспецифічне антитіло містить варіабельний домен, який зв'язує ЕгГЬВ-2, і варіабельний домен, який зв'язує ЕтОВ-3, при цьому ланцюг УН варіабельного домену, який зв'язує ЕгтоВ-2, включає - послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕ3958, зображену на фігурі 16А; або - послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕ3958, зображену на фігурі 16А, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно вказаної УнН; і при цьому ланцюг УН варіабельного домену, який зв'язує ЕгтоВ-3, включає - послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕЗ3178, зображену на фігурі 16В; або - послідовність амінокислот ланцюга МН-МЕ3178, зображену на фігурі 168, що містить не більше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, більше переважно не більше 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот, або їх комбінацію, відносно послідовності ланцюга УН, зображеної на фігурі 168.
Біспецифічне антитіло переважно являє собою антитіло РВ4188. Зазначене лікування можна комбінувати з хіміотерапевтичним лікарським засобом. Таким чином, лікування переважно додатково включає введення хіміотерапевтичного лікарського засобу індивіду, що потребує цього. Для лікування раку була розроблена множина різних хіміотерапевтичних лікарських засобів. Незмінно деякі з них більше активні ніж інші у боротьбі з конкретними пухлинами.
Хіміотерапевтичний лікарський засіб може являти собою, наприклад, винорелбін, паклітаксел, доцетаксел, гемцитабін, ерибулін, капецитабін або карбоплатин.
Згідно з даним винаходом додатково запропонована комбінація націленого на ЕгбВ-2 агента, включаючи інгібітор або зв'язуючий агент, такий як бівалентне моноспецифічне антитіло, що містить сайти зв'язування антигена, який може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгЬВ-2; і біспецифічного антитіла, що містить сайт зв'язування антигена, 60 який може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгЬВ-2, і сайт зв'язування антигена,
який може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгоВ-3, для застосування в способі лікування індивіда, в якого є позитивна за ЕгЬВ-2 пухлина або є ризик розвитку позитивної за
ЕїЬВ-2 пухлини.
Додатково запропонована фармацевтична композиція, яка містить націлений на ЕгбВ-2 агент, включаючи інгібітор ЕгЬВ-2 або агент, зв'язуючий ЕгбЬВ-2, такий як бівалентне моноспецифічне антитіло, що містить сайти зв'язування антигена, які можуть зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгоВ-2, і біспецифічне антитіло, що містить сайт зв'язування антигена, який може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгтрВ-2, і сайт зв'язування антигена, який може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгбВ-3. Також запропонований набір із частин, який включає націлений на ЕгЬВ-2 агент, включаючи інгібітор
ЕГтЬВ-2 або агент, зв'язуючий ЕгЬВ-2, такий як бівалентне моноспецифічне антитіло, що містить сайти зв'язування антигена, які можуть зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгГЬВ-2, і біспецифічне антитіло, що містить сайт зв'язування антигена, який може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгоВ-2, і сайт зв'язування антигена, який може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгрВ-3.
Згідно з даним винаходом додатково запропонований спосіб лікування індивіда, в якого є позитивна за ЕгоВ-2 і позитивна за ЕгбВ-3 пухлина в головному мозку або є ризик розвитку позитивної за ЕгОВ-2 і позитивної за ЕгЬбВ-3 пухлини в головному мозку, вказаний спосіб включає введення індивіду, що потребує цього, антитіла, що містить сайт зв'язування антигена, який може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕГОВ-2, і сайт зв'язування антигена, який може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕГОВ-3. Пухлина переважно являє собою метастази пухлини молочної залози. Переважно антитіло може зв'язуватися з епітопом на позаклітинному домені І ЕгбВ-2. Переважно антитіло може зв'язуватися з епітопом на позаклітинному домені Ії ЕгЬВ-3. Спосіб переважно додатково включає введення націленого на
ЕпПЬ8В-2 агента, включаючи інгібітор ЕгбВ-2 або агент, зв'язуючий ЕгбВ-2, такий як моноспецифічне бівалентне антитіло з сайтами зв'язування антигена, які можуть зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгОВ-2. Переважно вказаний спосіб додатково включає введення націленого на ЕгЬВ-2 агента, включаючи інгібітор ЕгЬВ-2 або агент, зв'язуючий ЕгоВ-2, такий як моноспецифічне бівалентне антитіло з сайтами зв'язування антигена, які можуть зв'язуватися з оепітопом на позаклітинній частині ЕгЬВ-3. Інгібітор ЕгбЬВ-2, такий як моноспецифічне бівалентне антитіло з сайтами зв'язування антигена, які можуть зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгоВ-2 або епітопом на позаклітинній частині ЕгбВ-3, може включати кон'югат з лікарським засобом. Вказаний лікарський засіб переважно включає емтанзин. Моноспецифічне бівалентне антитіло з сайтами зв'язування антигена, які можуть зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгЬВ-2, переважно являє собою трастузумаб, пертузумаб або їх біоаналог з такою самою послідовністю амінокислот варіабельного домену.
Антитіло, що містить сайт зв'язування антигена, який може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгЬВ-2, і сайт зв'язування антигена, який може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині ЕгОВ-3, переважно являє собою біспецифічне антитіло. Біспецифічне антитіло переважно являє собою антитіло РВ4188. Додатково запропоноване антитіло, що містить сайт зв'язування антигена, який може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині
ЕгЬВ-2, і сайт зв'язування антигена, який може зв'язуватися з епітопом на позаклітинній частині
ЕгЬВ-3, для застосування для лікування індивіда, в якого є позитивна за ЕгЬВ-2 і позитивна за
ЕтВ-3 пухлина в головному мозку або є ризик розвитку позитивної за ЕгЬВ-2 і позитивної за
ЕїбВ-3 пухлини в головному мозку.
В індивіда є ризик розвитку пухлини, як зазначено у даній заявці, якщо у вказаного індивіда була пухлина та вказана пухлина добре відповідала на лікування, надане зазначеному індивіду.
Наприклад, якщо індивід увійшов у повну ремісію, так що кількість пухлинних клітин в індивіда неможливо виміряти за допомогою звичайних методик, таких як чергова візуалізація за допомогою сканування методом магнітно-резонансної томографії (МРТ) або комп'ютерної томографії (КТ). В такого індивіда, на жаль, набагато вище ризик розвитку пухлини або у вогнищі вихідної пухлини (рецидив пухлини), або у вилученому вогнищі (метастатична пухлина), або ризик розвитку пухлини нового походження (наприклад, викликаної лікуванням). Індивід, у якого є ризик, отже, переважно являє собою індивіда, в якого була пухлина й який перебуває у повній її ремісії.
Запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгЬВ-3, при цьому зазначене антитіло може знижувати викликану лігандом функцію рецептора ЕгбВ-3 на позитивній за ЕгоВ- 2 ії Еї6В-3 клітині. Антитіло переважно може зменшувати викликаний лігандом ріст позитивної за 60 ЕтВ-2 ії ЕгЬВ-3 клітини. Антитіло переважно може зменшувати викликаний лігандом ріст позитивної за ЕгбВ-2 і ЕтЬВ-3 клітини, при цьому вказана клітина містить щонайменше 100000 рецепторів ЕгбВ-2 на поверхні клітини на клітину. Переважно вказана клітина являє собою клітину МСЕ-7, клітину 5КВК-3, клітину МСІ-М87, клітину ВхРО-3, клітину ВТ-474 або клітину
УІМТ-1. Перший сайт зв'язування антигена може переважно зв'язуватися з доменом | або доменом ІМ ЕгоВ-2. Другий сайт зв'язування антигена переважно перешкоджає зв'язуванню ліганду ЕГОВ-3 з ЕгрВ-3. Також запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕГЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгтоВ-
З, при цьому вказаний перший сайт зв'язування антигена зв'язує домен | ЕгоВ-2 і вказаний другий сайт зв'язування антигена зв'язує домен ІШ ЕгбБВ-3. Додатково запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгГЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгоВ-3, при цьому афінність (КО) вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгЬВ-3 клітини дорівнює або більше, ніж афінність вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгЬВ-2 клітини. Антитіло переважно може знижувати викликану лігандом функцію рецептора ЕгбВ-3 на позитивній за ЕгбВ-2 і ЕгбВ-3 клітині. Антитіло переважно може зменшувати викликаний лігандом ріст позитивної за ЕгЬВ-2 і ЕгЬВ-3 клітини. Афінність (КО) вказаного другого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгтбВ-3 клітини переважно нижче або дорівнює 2,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 1,39 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,99 нМ. Афінність (КО) вказаного першого сайту зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгтбВ-2 клітини переважно нижче або дорівнює 5,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 4,5 НМ, переважно нижче або дорівнює 4,0 нМ. Афінність (КО) вказаного біспецифічного антитіла по відношенню до клітин ВТ-474 переважно нижче або дорівнює 5,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 4,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 3,2 НМ, і/або при цьому афінність вказаного біспецифічного антитіла по відношенню до клітин
ЗК-ВВА-3 нижче або дорівнює 5,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 3,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 2,0 нМ. Додатково запропоноване антитіло, що містить два сайти зв'язування антигена, які зв'язуються з ЕгЬВ-2, при цьому щонайменше один із вказаних сайтів зв'язування антигена зв'язує домен | ЕгбВ-2. Афінність (КО) щонайменше одного з вказаних сайтів зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгбВ-2 клітини переважно нижче або дорівнює 5,0 НМ, переважно нижче або дорівнює 4,0 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 4,0 нМ. Також запропоноване антитіло, що містить два сайти зв'язування антигена, які зв'язуються з ЕгЬВ-3, при цьому щонайменше один із вказаних сайтів зв'язування антигена зв'язує домен І ЕгрВ-3. Афінність (КО) щонайменше одного з вказаних сайтів зв'язування антигена по відношенню до позитивної за ЕгтбВ-3 клітини переважно нижче або дорівнює 2,0 нМ, переважно нижче або дорівнює 1,39 нМ, більше переважно нижче або дорівнює 0,99 нМ.
Вказана позитивна за ЕгоЬВ-3 клітина та/"або вказана позитивна за ЕтбВ-2 клітина переважно являє собою клітину ВТ-474 або клітину 5К-ВВ8-3. Антитіло переважно містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше одну амінокислоту домену | ЕгЬВ-2, вибрану з групи, що складається з 1144, 7164, К166, Р172, 0179, 5180 і К181, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах приблизно 5 положень амінокислот від Т144,
Т164, К166, Р172, 5179, 5180 або К181. Воно переважно містить сайт зв'язування антигена, який зв'язує щонайменше одну амінокислоту домену ЇЇ ЕгЬВ-3, вибрану з групи, що складається з і 2426, і виставлені на поверхню амінокислотні залишки, які розташовані в межах 11,2 А від
К426 у нативному білку ЕгтбВ-3. Зазначене антитіло переважно містить щонайменше послідовність СОКЗ зі специфічною до ЕгЬВ-2 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ2926, МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973, МЕ3004, МЕ3958,
МЕ2971, МЕ3025, МЕ2916, МЕ3991, МЕ3031, МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847, МЕЗ3001, МЕЗ003 і
МЕ1898, зображених на фігурі 16А або на фігурі 16Е. Зазначене антитіло переважно містить щонайменше послідовність СОКЗ зі специфічною до ЕгоВ-3 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ3178; МЕ3176; МЕ3163; МЕ3099; МЕ3307;
МЕ6055; МЕ6056; МЕ60О57; МЕ6058; МЕ6059; МЕ60О60; МЕ60О61; МЕеЕ6062; МЕ6063; МЕ6064; МЕ 6065; МЕб6Об6б6; МЕ6067; МЕ6068; МЕбО69; МЕбО0О70; МЕб6О71; МЕб60О72; МЕ6073 і МЕб6074, зображених на фігурі 16В, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37. Зазначене антитіло переважно містить щонайменше послідовності СОКІ, СОК2 і СОКЗ зі специфічною до ЕгЬВ-2 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ2926, МЕ2930,
МЕ1849; МЕ2973, МЕЗ3004, МЕ3958, МЕ2971, МЕЗ025, МЕ2916, МЕ3991, МЕЗ3031, МЕ2889,
МЕ2913, МЕ1847, МЕ3001, МЕЗ3003 і МЕ1898, зображених на фігурі 16А або на фігурі 16Е, або при цьому зазначене антитіло містить послідовності СОК, які відрізняються не більше ніж З амінокислотами, переважно не більше ніж 2 амінокислотами, переважно не більше ніж 1 60 амінокислотою від послідовностей СОКІ, СОК2 і СОКЗ із МЕ2926, МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973,
МЕЗ004, МЕ3958, МЕ2971, МЕЗ3025, МЕ2916, МЕЗ3991, МЕЗ3031, МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847,
МЕЗ3001, МЕЗ003 або МЕ1898. Зазначене антитіло переважно містить щонайменше послідовності СОКІ, СОК2 і СОКЗ зі специфічною до ЕгтбВ-3 варіабельною областю важкого ланцюга, вибраною з групи, що складається з МЕ3178; МЕ3176; МЕ3163; МЕ3099; МЕ3307;
МЕ6055; МЕ6056; МЕ60О57; МЕ6О58; МЕ6О59; МЕ6О6О; МЕ6О61; МЕеЕ60О62; МЕ6063; МЕ6064; МЕ 6065; МЕб6О66; МЕ60О67; МЕ6068; МЕ6069; МЕб6О70; МЕбО71; МЕ6072; МЕб6073 і МЕ6074, зображених на фігурі 168, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, або при цьому зазначене антитіло містить послідовності СОК, які відрізняються не більше ніж З амінокислотами, переважно не більше ніж 2 амінокислотами, переважно не більше ніж 1 амінокислотою від послідовностей
СО, СОКа2 і СОКЗ із МЕ3178; МЕ3176; МЕ3163; МЕ3099; МЕ3307; МЕ6055; МЕ6056; МЕб6057;
МЕ6058; МЕ60О59; МЕ6О60; МЕ6О61; МеЕ6062; МЕ6063; МЕ6064; МЕ 6065; МЕ6066; МЕ6067;
МЕ6068; МЕ6069; МЕ6070; МЕ6071; МЕ6072; МЕ6073 або МЕб6074. Зазначене антитіло переважно містить специфічну до ЕгЬВ-2 послідовність варіабельної області важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з послідовностей варіабельної області важкого ланцюга:
МЕ2926, МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973, МЕЗ3004, МЕ3958, МЕ2971, МЕЗ025, МЕ2916, МЕЗ3991,
МЕЗ3031, МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847, МЕЗ3001, МЕЗ3003 ії МЕ1898, зображених на фігурі 16А або на фігурі 16Е, або при цьому зазначене антитіло містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, яка відрізняється не більше ніж 15 амінокислотами від послідовностей варіабельної області важкого ланцюга МЕ2926, МЕ2930, МЕ1849; МЕ2973, МЕ3004, МЕ3958,
МЕ2971, МЕ3025, МЕ2916, МЕ3991, МЕ30О31, МЕ2889, МЕ2913, МЕ1847, МЕЗ3001, МЕ3003 або
МЕ1898. Зазначене антитіло переважно містить специфічну до ЕгбЬВ-3 послідовність варіабельної області важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з послідовностей варіабельної області важкого ланцюга: МЕ3178; МЕ3176; МЕ3163; МЕ3099; МЕ3307; МЕб6055;
МЕб6056; МЕ6057; МЕ6058; МЕ60О59; МЕ60О60; МЕ60О61; МЕ6062; МЕ6063; МЕб60О64; МЕ 6065;
МЕб6066; МЕ6067; МЕ6068; МЕ60О69; МЕ6070; МЕ6071; МЕ6072; МЕ6073 і МЕ6074, зображених на фігурі 16В, або на фігурі 16Е, або на фігурі 37, або при цьому зазначене антитіло містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, яка відрізняється не більше ніж 15 амінокислотами від послідовностей варіабельної області важкого ланцюга МЕ3178; МЕЗ3176;
МЕЗ163; МЕЗ3099; МЕЗ307; МЕ6О055; МЕб6О56; МЕб6О57; МЕб6О58; МЕ6059; МЕб6О60; МЕб6061;
МЕб6062; МЕ6063; МЕ6О64; МЕ 6065; МЕ6О66б; МЕ6067; МЕб6О68; МЕбОб69; МЕб6О070; МЕ6071;
МЕ6072; МЕ6073 або МЕ6074. Зазначене антитіло переважно проявляє антитіло-залежну опосередковану клітинами цитотоксичність (АЗКЦ). Антитіло переважно дефукозильовано для того, щоб збільшити АЗКЦ. Воно переважно являє собою людське або гуманізоване антитіло.
Антитіло переважно містить два різних важких ланцюга імуноглобуліну з сумісними доменами гетеродимеризації. Вказані сумісні домени гетеродимеризації переважно являють собою сумісні домени гетеродимеризації СНЗ3 важкого ланцюга імуноглобуліну. Переважно обидва плеча містять загальний легкий ланцюг. Вказаний загальний легкий ланцюг переважно являє собою легкий ланцюг зародкової лінії, переважно перебудований легкий ланцюг каппа зародкової лінії людини, що містить фрагмент гена ІЗ9МКІ-39, найбільше переважно перебудований легкий ланцюг каппа зародкової лінії людини ІДдМКІ-3901/Л5УКІ01. Антитіло переважно додатково містить мітку, переважно мітку для візуалізації іп мімо. Також запропонована фармацевтична композиція, яка містить біспецифічне антитіло, зазначене у даній заявці. Також запропонований спосіб лікування суб'єкта, в якого є позитивна за ЕгтЬВ-2, ЕгбВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина або в якого є ризик розвитку вказаної пухлини, який включає введення вказаному суб'єкту антитіла або фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом. Також запропоноване антитіло згідно з даним винаходом для застосування для лікування суб'єкта, в якого присутня позитивна за
ЕтфВ-2, ЕтЬВ-3 або ЕгрВ-2/ЕПЬВ-3 пухлина або є ризик її розвитку. Біспецифічне антитіло переважно значно не впливає на виживаність кардіоміоцитів. Зазначене біспецифічне антитіло призначене для застосування у суб'єкта, серцева функція якого становить менше ніж 90 95 від здорової серцевої функції. Також запропонований спосіб лікування суб'єкта, в якого є позитивна за ЕгЬВ-2, ЕтЬВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина або в якого є ризик розвитку вказаної пухлини, який включає введення вказаному суб'єкту: - біспецифічного антитіла, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕТЬВ- 2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгтрВ-3, й - однієї або декількох сполук, вибраних із групи, що складається з інгібітора компонента сигнального шляху РіІЗ-кінази, інгібітора компонента сигнального шляху МАРК, руйнуючого мікротрубочки лікарського засобу й інгібітора НОАС, переважно однієї або декількох сполук, вибраних із групи, що складається з інгібітора тирозинкінази, інгібітора РіЗКа, інгібітора АК, інгібітора ттоОК, інгібітора 5гс, вориностату та паклітакселу. Також запропоноване біспецифічне 60 антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгрВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгбВ-3, для застосування для лікування позитивної за ЕгрВ-2,
ЕтВ-3 або ЕТЬВ-2/ЕТЬВ-3 пухлини, при цьому зазначене лікування включає введення вказаного біспецифічного антитіла та щонайменше однієї сполуки, вибраної з групи, що складається з інгібітора компонента сигнального шляху РіІЗ-кінази, інгібітора компонента сигнального шляху
МАРК, руйнуючого мікротрубочки лікарського засобу й інгібітора НОАС, переважно введення вказаного біспецифічного антитіла та щонайменше однієї сполуки, вибраної з групи, що складається з інгібітора тирозинкінази, інгібітора РіІЗКа, інгібітора АКІ, інгібітора тТОР, інгібітора
Згс, вориностату та паклітакселу, суб'єкту, в якого є позитивна за ЕгЬВ-2, ЕТОВ-3 або ЕгЬВ- 2/ЕтЬВ-3 пухлина. Вказаний інгібітор тирозинкінази переважно включає афатиніб, лапатиніб і/або нератиніб. Вказаний інгібітор РІЗК переважно являє собою ВУ 719. Вказаний інгібітор АКІ переважно являє собою МК 2206. Вказаний інгібітор ТТОК переважно являє собою еверолімус.
Вказаний інгібітор бгс переважно являє собою саракатиніб. Вказаний націлений на мікротрубочки лікарський засіб переважно являє собою паклітаксел. Вказаний інгібітор НАС переважно являє собою вориностат. Також запропонований спосіб протидії утворенню метастазів у суб'єкта, в якого є позитивна за ЕгЬВ-2, ЕТЬВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕТтЬВ-3 пухлина, в якому у вказаній позитивній за ЕгЬВ-2, Егбб8-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 клітині пухлини рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 70 95, більше переважно щонайменше 80 95, більше переважно щонайменше 85 95, більше переважно щонайменше 90 95 або 95 95 від рівня експресії херегуліну в клітинах ВХРОЗ або МСЕ7, який включає введення вказаному суб'єкту біспецифічного антитіла, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгГЬВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгОВ-3. Також запропоноване біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгоВ-2, і другий сайт зв'язування антигена, який зв'язує ЕгОВ-3, для застосування для лікування або запобігання утворення метастазів із позитивної за ЕгЬВ-2, ЕТЬОВ-3 або ЕгрВ-2/ЕтЬВ-3 клітини пухлини, в якому у вказаній позитивній за ЕгОВ-2, ЕгВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 клітині пухлини рівень експресії херегуліну становить щонайменше 60 95, переважно щонайменше 70 95, більше переважно щонайменше 8095, більше переважно щонайменше 8595, більше переважно щонайменше 9095 або 9595 від рівня експресії херегуліну в клітинах ВХРОЗ або МСЕ7.
Запропонований спосіб або антитіло для застосування згідно з будь-яким із пп. 36-50, який відрізняється тим, що у вказаного суб'єкта є позитивна за ЕгЬВ-2 або ЕгЬВ-2/ЕгЬВ-3 пухлина, яка містить менше 1000000 рецепторів ЕгЬВ-2 на поверхні клітини на клітину. Зазначене антитіло переважно являє собою антитіло згідно з даним винаходом. Вказана пухлинна клітина переважно являє собою клітину раку молочної залози, раку шлунку, колоректального раку, раку товстого кишечника, раку шлунку та стравоходу, раку стравоходу, раку ендометрію, раку яєчників, раку печінки, раку легені, включаючи недрібноклітинний рак легені, світлоклітинної саркоми, раку слинних залоз, раку голови і шиї, раку головного мозку, раку сечового міхура, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози, раку нирки, раку шкіри або меланоми.
Переважно серцева функція у вказаного суб'єкта становить менше ніж 90 95 від здорової серцевої функції. Вказана серцева функція переважно включає фракцію викиду лівого шлуночка (ФВЛШ). Вказаний суб'єкт переважно страждає від застійної серцевої недостатності (ЗСН), дисфункції лівого шлуночка (ДЛІШ) та/або зниженої на г 10 95 фракції викиду лівого шлуночка (ФВЛШ), і/"або при цьому вказаний суб'єкт переніс інфаркт міокарда. Також запропоноване застосування антитіла згідно з даним винаходом для протидії, переважно інгібування фосфорилювання АКІ, ЕКК і/або рибосомного білка 56.
З метою ясності та стислості опису ознаки описані у даній заявці в рамках одного або різних варіантів реалізації, проте, повинно бути очевидно, що в обсяг даного винаходу можуть входити варіанти реалізації, які містять всі комбінації з всіх або деяких із описаних ознак.
КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР
Фігура 1. Титрування антигеном мономерним НЕКЗ2 панелі плечей НЕКЗ, які також присутні в активних біспецифічних антитілах до НЕК2ХНЕКЗ, в комбінації з одним плечем РОЗ178. Всі моноклональні антитіла до НЕК2 панелі НЕК2ХНЕКЗ, за винятком РОЗ025, досліджували в аналізі титрування антигеном НЕК2 методом ЕГІЗА.
Фігура 2. Функціональна активність біспецифічних антитіл до НЕК2 х НЕКЗ, досліджена на клітинах ВХхРОЗ при стимуляції лігандом або без неї. Пунктирні лінії представляють активність трастузумабу, який є еталонним антитілом в даному аналізі, при стимуляції лігандом або без неї.
Фігура 3. Криві титрування моноклональних антитіл до НЕКЗ2 і НЕКЗ (верхнє зображення) і відповідних біспецифічних антитіл до НЕК2 х НЕКЗ (нижнє зображення) в аналізі на МСЕ-7.
Фігура 4. Вплив лікування антитілом на розмір пухлини ВХРОЗ-Іис2 в день 31 в ортотопічній 60 моделі на мишах. Біолюмінісцентна візуалізація (БЛВ, ВІ!) - ріст пухлини, виміряний за допомогою біолюмінесценції.
Фігура 5. Вплив лікування антитілом на розмір пухлини ВХРОЗ-Іис2 в день 31 в ортотопічній моделі на мишах. БЛВ -- ріст пухлини, виміряний за допомогою біолюмінесценції.
Фігура 6. Аналіз методом сортування клітин зі збудженням флуоресценції (БАС5) біспецифічного антитіла до НЕК2ХНЕКЗ і відповідних вихідних моноклональних антитіл на клітинах МСЕ-7 і ВХРОЗ-Іс2, експресуючих НЕК2. МРЇ - середня інтенсивність флуоресценції.
Фігура 7. Аналітичне дослідження методом високоефективної ексклюзійної хроматографії (ВЕЕХ) та катіонообмінної високоефективної рідинної хроматографії (КО-ВЕРХ). РВ4188 (верхнє зображення), вихідне моноклональне антитіло проти НЕК2 (зображення посередині), еталонне моноклональне антитіло Їдс проти респіраторно-синцитіального вірусу (К5М) (нижнє зображення).
Фігура 8. Інгібування проліферації клітин УМТ-1 в м'якому агарі серією титрів антитіла.
Фігура 9. Інгібування проліферації клітин ВТ-474 (верхнє зображення) і 5КВКЗ (нижнє зображення) в матригелі серією титрів антитіла.
Фігура 10а. Викликані НКО проліферація та розгалуження/інвазія клітин 5КВКЕ-3 в матригелі.
Фігура 10. Інгібування викликаної НКО проліферації та розгалуження/нвазії клітин ЗКВЕ-3 в матригелі антитілом РВ4188 на відміну від вихідних моноклональних антитіл.
Фігура 10с. Інгібування викликаної НКО проліферації та розгалуження/нвазії клітин ЗКВК-3 в матригелі антитілом РВ4188 на відміну від моноклональних антитіл проти НЕКЗ.
Фігура 104. Інгібування викликаної НКО проліферації та розгалуження/інвазії клітин БЄКВАК-3 в матригелі антитілом РВ4188 на відміну від комбінації моноклональних антитіл проти НЕКЗ з трастузумабом.
Фігура 10е. Інгібування викликаної НКО проліферації та розгалуження/нвазії клітин ЗКВАК-3 в матригелі антитілом РВ4А188 і комбінацією РВ4188 плюс трастузумаб.
Фігура 11. Підвищена інгібіторна активність РВ4188 в НЕК2-: клітинах М87 у присутності 100 нг/мл НКО.
Фігура 12. Активність АЗКЦ антитіл РВ4188 і РВ3448 при титруванні дози.
Фігура 13. Підвищена активність АЗКЦ біспецифічного антитіла у порівнянні з моноклональними вихідними антитілами або їх комбінацією.
Фігура 14. Активність АЗКЦ дефукозильованого РВ4188 у порівнянні з трастузумабом відносно клітин, експресуючих НЕК2 на низьких (верхнє зображення) і високих (нижнє зображення) рівнях.
Фігура 15. Активність АЗКЦ дефукозильованого РВ4188 на НЕК2--- клітинах ЗКВЕ-3 у присутності репортерних клітин, експресуючих високоафінний або низькоафінний варіант Есук.
Фігура 16. Послідовності нуклеїнових кислот й амінокислот ланцюгів УН, загального легкого ланцюга та важких ланцюгів антитіл згідно з даним винаходом. У тих випадках, коли на даній фігурі вказана лідерна послідовність, вона не є частиною ланцюга УН або антитіла, а зазвичай відщеплюється в ході процесингу білка в клітині, яка продукує вказаний білок.
Фігура 17. Вплив лікування антитілом на розмір пухлини в моделі ксенотрансплантата ЛМТ- 1 у мишей. Ріст пухлини вимірювали шляхом виміру об'єму пухлини штангенциркулем в різних групах лікування. Зверху - ріст пухлини протягом 60 днів; знизу - інгібування росту пухлини (ТОЇ) після закінчення періоду лікування (29 днів).
Фігура 18. Криві виживаності Каплана-Мейєра в різних групах лікування в моделі ксенотрансплантата ЛМТ-1 у мишей.
Фігура 19. Інгібування індукуємого лігандом росту М87. РВ4188 дозволяє усунути індукуєму
НКО проліферацію М87 в широкому діапазоні НКО, на відміну від вихідного антитіла проти
НЕКЗ. Показані результати для концентрації антитіла, рівної 40 нг/мл.
Фігура 20. Вимірювання афінності в стаціонарному стані клітин міченого 125І-"332 НЕВН2ХНЕВНЗ (РВ4188) відносно клітин ВТ-474 (зверху; три незалежні тести) і відносно клітин 5К-ВВ-3 (знизу; три незалежні тести). Неспецифічне зв'язування визначали, застосовуючи 100-кратний надлишок неміченого НЕК2ХНЕКЗ.
Фігура 21А. Картування епітопів НЕК2. Виявлені залишки, що мають вирішальне значення, представлені у вигляді чорних сфер на кристалічній структурі НЕК2, виявлені залишки, що мають вторинне значення, представлені у вигляді сірих сфер (ідентифікаційний номер (ІН) в
РОВ: 1578).
Фігура 218. а) Кристалічна структура НЕК2 (Мо в РОВ: 1578), на якій підтверджені залишки епітопу
РОЗО958 показані у вигляді ясно-сірих сфер і навколишні залишки (ї/- п'ять амінокислотних залишків) показані у вигляді темно-сірих сфер. Б) Виставлена в розчинник поверхня області 60 епітопу, на якій підтверджені залишки епітопу показані сірим кольором, а навколишні залишки
(ї4/- п'ять залишків) - чорним кольором. с) Докладне зображення області епітопу, на якій підтверджені залишки епітопу показані ясно-сірим кольором, а навколишні залишки (ж/- п'ять залишків) - темно-сірим кольором. 4) Первинна послідовність амінокислот області епітопу НЕК2 для РОЗ958, на якій показані підтверджені залишки епітопу (сірий колір, підкреслені), оточуючі залишки (чорний) і віддалені залишки (сірий колір, курсив, не показані на а, Б і с). Фігури й аналіз зроблені з використанням Уазага (м/млу.уазага.ога).
Фігура 2160. а) Кристалічна структура НЕКЗ (Ме у РОВ: 4Р59), на якій показаний залишок епітопу Агу 426 у вигляді сірих сфер, а всі виставлені на поверхню залишки всередині радіуса 11,2 А від Аго 426 - у вигляді чорних сфер. Б) Виставлена в розчинник поверхня області епітопу з Агуд 426 і віддаленими залишками показана сірим кольором, а всі виставлені на поверхню залишки всередині радіуса 11,2 А від Агу 426 показані чорним кольором. с) Залишки в області епітопу з
Агуд 426 показані ясно-сірим кольором, а навколишні залишки (всі підписані) показані темно- сірим кольором. Фігури й аналіз зроблені з використанням Уазага (мулу.уазага.ога).
Фігура 22. Підтвердження залишків, що мають вирішальне значення для зв'язування плеча
Бар 3958 із НЕК2. Трастузумаб включили в аналіз як контрольне антитіло. Зв'язування визначали методом ЕАСЗ із титруванням і виражали зв'язування у вигляді площі під кривою (АС) у порівнянні зі зв'язуванням трастузумабу. 0О143У не вважають частиною епітопу 3958, оскільки зв'язування трастузумабу з даним мутантом також блокується.
Фігура 23. Залишки, що мають вирішальне значення для зв'язування РОЗ178, представлені в кристалічній структурі НЕКЗ. Виявлені залишки, що мають вирішальне значення для зв'язування РОЗ178, представлені у вигляді чорних сфер на кристалічній структурі НЕКЗ (Мо у
РОВ: 4РБЗУ).
Фігура 24. Підтвердження того, що К426 є залишком, який має вирішальне значення для зв'язування РОЗ175 із НЕКЗ. Два антитіла проти НЕКЗ включили в аналіз як контрольні антитіла. Зв'язування визначали методом ЕАС5 з титруванням і зв'язування виражали у вигляді
ДИС у порівнянні зі зв'язуванням з НЕКЗ дикого типу (ДТ).
Фігура 25. Відсутність токсичності РВ4188 при серцевому стресі іп мйго. Інкубація кардіоміоцитів із РВ4188 або моноспецифічними еталонними антитілами у присутності З мкм антрацикліну доксорубіцину. Життєздатність кардіоміоцитів визначали шляхом визначення кількості АТФ і виражали у відносних світлових одиницях (КІ). Т - трастузумаб; П - пертузумаб.
Фігура 26. Зв'язування РВ4188, у порівнянні з трастузумабом й антитілом до НЕКЗ, з клітинами з ампліфікованим НЕК2. Проводили РГАС5 з титруванням на вказаних лініях клітин, експресуючих різні рівні НЕК2. Площа під кривою серединних значень сигналу фікоеритрину (РЕ) наносили на графік для кожної лінії клітин.
Фігура 27. Зв'язування серійних титрів РВ4188иІс з клітинами 5КВЕ-3, попередньо інкубованими з насиченою концентрацією РВ4188, трастузумабу або антитіла негативного контролю. РВ4188И72 однаково ефективно зв'язується з ЗКВЕ-3 у присутності трастузумабу або контрольного антитіла.
Фігура 28. Інгібування проліферації клітин в умовах стресу НКО біспецифічними антитілами до НЕК2ХНЕКЗ, які складаються з одного і того самого плеча Бар НЕКЗ і різних плечей НЕКЗ, які спрямовані проти чотирьох доменів НЕК2.
Фігура 29. Синергічний вплив комбінації РВ4188 з лапатинібом на ріст і морфологію клітин
ЗКВВ-3. Ліворуч: отримані з використанням мікроскопа зображення клітин, оброблених в різних умовах; праворуч: морфологічні зміни, представлені графічно залежно від умов обробки.
Фігури ЗОА і В. Інгібування опосередкованого НКО фосфорилювання клітин М87 і ЗКВЕ-3 антитілом РВ4188 в експерименті в динаміці. Трастузумаб ї- пертузумаб й окремо НКО включали в експерименти як контролі.
Фігура 31. Інгібування опосередкованого НЕО фосфорилювання клітин М87 антитілом
РВ4188 в експерименті в динаміці. Трастузумаб ж пертузумаб і лапатиніб включали в експерименти як контролі.
Фігура 32. Зміни рівнів АКТі фосфорилювання АКІ оцінювали через 4 години після введення двох або чотирьох щотижневих доз РВ4188. Рівні фосфорилювання в лізатах пухлин оцінювали за допомогою аналізу І итіпех. Аналіз проводили у двох повторах й аналізували п'ять пухлин на групу.
Фігура 33. Опосередкований РВ4188 вплив іп мімо на опосередковану НЕК2:НЕКЗ передачу сигналів, досліджене шляхом аналізу Мега Тад на матеріалі пухлини ЛМТ-1. Пухлини аналізували через 4 год. після введення доз, пухлини, отримані з тварин, яким вводили ФБР, бо включали в експерименти як контролі.
Фігура 34. РВ4188 пригнічувало просування за клітинним циклом. Клітини, висіяні в аналітичне середовище, інкубували з титрами антитіл у присутності стандартної (1 нг/мл) або високої (100 нг/мл) концентрації НЕО. Через 24 години (або 48 годин для клітин МСЕ-7) аналізували розподіл клітин за різними фазами клітинного циклу (фазами 50/51, 5 або С2/М).
Коефіцієнт проліферації розраховували як відношення між відсотком клітин у фазах 5 і С2/М і відсотком клітин у фазі (50/51. П « Т - пертузумаб «т трастузумаб.
Фігура 35. Інтерналізація антитіл, мічених рН-чутливим барвником, в ракові клітини з підвищеною експресією НЕК2. М87 (А, В) ії 5КВА-3 (С, 0), висіяні в аналітичне середовище, доповнене 1 нг/мл НКО, інкубували протягом 24 годин з 100 нМ мічених рН-чутливим барвником антитіл. Після збору клітини офарблювали міченим АРС вторинним антитілом до Їдс людини, щоб детектувати пов'язані з поверхнею антитіла. Клітини аналізували за допомогою
ЕАС5 за флуоресценцією в каналі РЕ (А, С), щоб визначити інтерналізацію, і в каналі АРС (В, р), щоб визначити зв'язування антитіл з поверхнею.
Фігура 36. Активність АЗКЦ трастузумабу у порівнянні з комбінацією трастузумаб «з пертузумаб по відношенню до клітин, отриманих з двох різних донорів.
Фігура 37. Вирівнювання послідовностей амінокислот і нуклеотидів варіантів ЕЗ3178. Ділянки
СОК показані.
Фігура 38. Криві титрування моноклональних антитіл до НЕКЗ в залежному від НКО аналізі з використанням клітин М87. РІЗбО58, РОбОЄЇ1 і РОбЄО65 являють собою варіанти РОЗ3178. РО1337 являє собою негативний контроль, специфічний до правцевого токсоїду. Результати нормували на фонову проліферацію у присутності ліганду на кожному планшеті.
Фігура 39. Профілі КО-ВЕРХ для моноклональних антитіл до НЕКЗ. РОбО58, РОбОЄЇ і
РОбО65 являють собою варіанти РОЗ3178. Розрахована ізоелектрична точка (рі) області УН і час утримання (ІК) основного піка наведені для кожного антитіла.
Фігура 40. Отримані іп міго ізоболограми для комбінації лікарських засобів з РВ4188 на лініях клітин з ампліфікованим НЕК2 при стресових концентраціях НКО (А) або вирощуванні в матригелі (В).
Фігура 41. Крива росту пухлини для підшкірної пухлини (4ий пасаж), використаної для внутрішньочерепної імплантації.
Фігура 42. Система бальної оцінки набряку головного мозку. Приклади Т2-зважених зображень МРТ прикладів бальної оцінки набряку головного мозку від О до 4. Білі стрілки вказують на вогнища пухлини, а жовті стрілки вказують на набряк.
Фігура 43. Маса тіла й об'єм пухлини в момент включення мишей в групи А-О. Не спостерігали відмінності в масі тіла або об'ємі пухлини між групами (однофакторний дисперсійний аналіз, р-0,43 (маса тіла) і р-0,92 (об'єм пухлини)).
Фігура 44. Об'єм пухлини після початку терапії для чотирьох груп лікування. На графіку представлене середнє значення їх стандартна помилка середнього значення (СП), М-8 - б/групу. Для кожної групи об'єм пухлини наносили на графік до тих пір, поки щонайменше 6 тварин були ще живі.
Фігура 45. Маса тіла після початку терапії для чотирьох груп лікування, виражена в грамах (ліворуч) й у вигляді відсоткової зміни щодо маси тіла в момент включення в групу (праворуч).
На графік нанесене тільки середнє значення, М-8 - б/групу. Для кожної групи масу тіла наносили на графік до тих пір, поки щонайменше 6 тварин були ще живі.
Фігура 46. Індивідуальний об'єм пухлини мишей, яким вводили середовище, виміряний за допомогою Т2-зваженої МРТ.
Фігура 47. Індивідуальний об'єм пухлини мишей, яких лікували Т-ЮОМІ, виміряний за допомогою Т2-зваженої МРТ.
Фігура 48. Індивідуальний об'єм пухлини мишей, яких лікували МС А-128, виміряний за допомогою Т2-зваженої МРТ.
Фігура 49. Індивідуальний об'єм пухлини мишей, яких лікували Т-ОМ1--МОї А-128, виміряний за допомогою Т2-зваженої МРТ.
Фігура 50. Приклади Т2-зважених зображень МРТ однієї миші з групи А (М23). На зображеннях показані фронтальний (зверху) і осьовий (знизу) зрізи.
Фігура 51. Приклади Т2-зважених зображень МРТ однієї миші з групи В (М35).. На зображеннях показані фронтальний (зверху) і осьовий (знизу) зрізи.
Фігура 52. Приклади Т2-зважених зображень МРТ однієї миші з групи С (М42). На зображеннях показані фронтальний (зверху) і осьовий (знизу) зрізи.
Фігура 53. Приклади Т2-зважених зображень МРТ однієї миші з групи 0 (МО3). На зображеннях показані фронтальний (зверху) і осьовий (знизу) зрізи. 60 Фігура 54. Вимірювання індивідуальних мас тіла мишей, яким вводили середовище,
виражені в грамах (ліворуч) й у вигляді відсоткової зміни відносно маси тіла в момент включення в групу (праворуч).
Фігура 55. Вимірювання індивідуальних мас тіла мишей, яких лікували Т-ОМ'І1, виражені в грамах (ліворуч) й у вигляді відсоткової зміни відносно маси тіла в момент включення в групу (праворуч).
Фігура 56. Вимірювання індивідуальних мас тіла мишей, яких лікували МСГ А-128, виражені в грамах (ліворуч) й у вигляді відсоткової зміни відносно маси тіла в момент включення в групу (праворуч).
Фігура 57. Вимірювання індивідуальних мас тіла мишей, яких лікували Т-ОМ1--МОЇ А-128, виражені в грамах (ліворуч) й у вигляді відсоткової зміни відносно маси тіла в момент включення в групу (праворуч).
Фігура 58. Бальна оцінка набряку в головному мозку на останньому скануванні МРТ для кожної миші. Об'єм пухлини в момент бальної оцінки відрізняється між даними групами, й об'єм пухлини може впливати на рівень набряку головного мозку. Середній об'єм пухлини у тварин, яких лікували Т-ОМІ1 ії Т-ОМ1 МО А-128, був менше у порівнянні з тваринами, яким вводили середовище або МС А-128. З цієї причини, результати слід інтерпретувати з обережністю.
Фігура 59. Крива Каплана-Мейєра результатів виживаності для всіх груп. Серединне значення виживаності становило 13, 19,5, 29 ї 42 дні для тварин, яким вводили середовище,
ТОМІ, МОГ А-128 і Т-ОМ1--МО А-128, відповідно. Криві виживаності значно відрізнялися (р п « 0,0001, логарифмічний ранговий критерій).
Фігура 60. Попарне порівняння кривих Каплана-Мейєра. Значиме більше серединне значення виживаності спостерігали для мишей, яких лікували Т-ОМ'І (19,5 днів), МСГ А-128 (29 днів) і Т-ОМІ МОЇ А-128 (42 дні), у порівнянні з мишами, яким вводили середовище (13 днів). Не спостерігали відмінності в серединному значенні виживаності між мишами, яких лікували Т-ОМ'1 і МСГ А-128. У мишей, яких лікували Т-ОМ1--МО А-128, спостерігали значиме більше серединне значення виживаності у порівнянні з мишами, яких лікували Т-ОМІ1 або МСГ А-128 окремо.
Фігура 61. Дизайн дослідження для клінічного випробування комбінованої терапії (двокомпонентної та трикомпонентної).
Фігура 62. Введення двокомпонентної терапії у клінічному випробуванні комбінованої терапії.
Фігура 63. Введення трикомпонентної терапії у клінічному випробуванні комбінованої терапії.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1
Методи, матеріали та скринінг антитіл
Лінії клітин:
Лінії клітин ВХРО-3-Ішс2 (РегКкіп ЕІтег 125058), М87 (АТССО СКІ -5822"7М), 5К-ВВ8-3 (АТССО
НтТВв-30 м), ВТ-474 (АТССО НТВ-20 М), ЛМТ-1 (0547 АСС 589), 1929 (бідта Аїагісн 85011425),
К562 (05М7 АСС10), НЕК293Т (АТССФ -СВІ -11268"7М), СНО-К1(05М72 АСС110), МСЕ-7 (05М72
АСС 115), МОА-МВ-468 (5300279-513, Сеї| Іпе 5егмісе5) 5К-ОМУ-3 (АТОС Ф НТВ-77 М), МОА-МВ- 175 (АТСС-НТВ-25), МОА-МВ-453 (АТСС-НТВ-131), МОА-МВ-361(АТСС-НТВ-27), 28-75-1 (АТСС-СВІ-1500) ії МКМ-45 (05М2 АСС409) отримували в АТСС, О5ЗМ2 або 5ідта АЇїагісн і підтримували звичайним способом в ростових середовищах, доповнених 10 95 термоіїнактивованою фетальною бичачою сироваткою (ФБС). Клітини НЕК2О9ЗЕ РгеезіуЇє одержували від Іпмйгодеп і підтримували звичайним способом в середовищі 293 Егеесіуів.
Одержання рекомбінантних векторів людини, курчати, пацюка та векторів із заміною доменів (клонування НЕК)
НЕК2 людини. Повнорозмірний НЕК2 людини ампліфікували за допомогою ПЛР із кКДНК, отриманої з РНК, виділеної з лінії клітин раку молочної залози ДІМТ-1. Праймери, використовувані для ампліфікації НЕК2 людини, описані далі. Прямий праймер:
ААдОСТООСТАССАССАТОовАоСсТооСсООсСстТТОотТос, зворотній праймер:
ААТААТТСТАСАСТОССАСОСТССАСАСССАСО. Повнорозмірний ампліфікований продукт розщеплювали за допомогою Ме! і Хба! та згодом клонували у відповідні сайти рсОМАЗ.1 (Іпміїтодеп).
Послідовність перевіряли шляхом порівняння з еталонною послідовністю МОВІ
ММ 004448.2. Для отримання конструкцій, експресуючих тільки позаклітинний домен (ВКД)
НЕК2 людини, для цілей трансфекції й імунізації трансмембранний домен і ВКД НЕК2 ампліфікували за допомогою ПЛР і повторно клонували у рМах!. Для цілей трансфекції одержували іншу конструкцію в рОізріау шляхом ампліфікації ВКД НЕКЗ, в даній конструкції
ВКД НЕКЗ з'єднували з трансмембранним доменом РОСЕК. 60 НЕКЗ людини. Повнорозмірний кКДНК-клон НЕКЗ людини одержували від Огідепе. Для отримання конструкцій, експресуючих тільки ВКД НЕКЗ людини, для цілей трансфекції й імунізації, трансмембранний домен і ВКД НЕКЗ ампліфікували за допомогою ПЛР і повторно клонували у рМах1. Додатково одержували іншу конструкцію у рМах!, за допомогою якої ВКД
НЕКЗ з'єднували з трансмембранним доменом РОСЕК. Всі послідовності перевіряли шляхом порівняння з еталонною послідовністю МСВІ ММ 001982.3.
Позаклітинний домен НЕКЗ2 яванського макака ампліфікували за допомогою ПЛР за кКДНК з нормальної тканини товстого кишечника яванського макака (Віоспаіп). Праймери, використовувані для ампліфікації НЕКЗ2 яванського макака, описані далі:
Прямий праймер: ААДОСТООСТАОСАССАТОСДОСТООССсООССтТОСтТАС Зворотній праймер: ААТААТТСТАСАСТООСАСОТССАСАСССАСО. Повнорозмірний ампліфікований продукт розщеплювали за допомогою МНеіІ-Хра!І та згодом клонували у відповідні сайти рсОМАЗ.1. Клон секвенували та вирівнювали з доступними послідовностями макаки-резусу (ХМ 002800451) для перевірки правильності клону ЕгЬВ-2.
Позаклітинний домен НЕКЗ яванського макака ампліфікували за допомогою ПЛР за кДНК з нормальної тканини товстого кишечника яванського макака (Віоспаійп). Праймери, використовувані для ампліфікації НЕКЗ яванського макака, описані далі:
Прямий праймер: ААОоСсТООсСТАОСАССАТОАОООСОААСОоОСОСТсСтТОо, Зворотній праймер: ААТААТТСТАСАТТАСОТТСТСТОООСАТТАСС. Повнорозмірний ампліфікований продукт розщеплювали за допомогою МНеіІ-Хра!І та згодом клонували у відповідні сайти рсрМАЗ.1. Клон секвенували та вирівнювали з доступними послідовностями макаки-резуса (ЕМБММИ РОО000027321) для перевірки правильності клону НЕКЗ.
За основу для послідовності НЕК2 курчати брали еталонну послідовність ММ 001044661.1.
Химерні конструкції із заміною доменів одержували шляхом заміни доменів І1І-ІМ у послідовності
НЕКІ курчати на домени І-ІМ людини. Послідовності, що містять мітку тус, оптимізували для експресії в клітинах ссавців і синтезували в Сепеагїг!і.
За основу для послідовності НЕКЗ пацюка брали еталонну послідовність ММ 001044661.1.
Химерні конструкції із заміною доменів одержували шляхом заміни доменів І1-ІМ у послідовності
НЕКЗ пацюка на домени І-ІМ людини. Послідовності, що містять мітку тус, оптимізували для експресії в клітинах ссавців і синтезували в Сепеаг!і.
Одержання ліній клітин, експресуючих на надлишковому рівні НЕКЗ і НЕКЗ.
Для отримання ліній клітин, які експресують високі рівні НЕКЗ на своїй поверхні, одержували вектор експресії у ссавця шляхом розщеплення рестриктазами Мої і Крпі з одержанням повнорозмірного НЕКЗ. Потім вказаний фрагмент клонували у відповідні сайти вектора реОМАЗ.1(-Упудго. Вектор експресії повнорозмірного НЕКЗ2 і НЕКЗ, кодуючий ген стійкості до неоміцину, використовували для отримання ліній клітин, які експресують високі рівні НЕК2 на своїй поверхні. Перед трансфекцією вказані плазміди лінеаризували шляхом розщеплення 55рі і Е5рі. Обома векторами окремо трансфікували клітини К5б62 й одержували стабільні пули клітин після селекції із застосуванням антибіотика. Отримані лінії клітин (К562-НЕН2 ії К562-НЕНЗ) експресували високі рівні НЕКЗ і НЕКЗ на своїй поверхні.
Імунізація
Імунізація НЕК2. Використовували чотири різні стратегії імунізації. В когорті МоА шість мишей С57ВІ/6б імунізували 2х109 клітин 1929, тимчасово трансфікованих НЕБ2, в 200 мкл, шляхом інтраперитонеальної ін'єкції. Потім мишам вводили бустерні дози 20 мкг білка ЕгЬВ-2-Ес (КМО 5узіетв), розчиненого в 125 мкл Тіегтах сСоЇд, шляхом інтраперитонеальної ін'єкції в день 14, з подальшими бустерними дозами 2х105 клітин І 929, тимчасово трансфікованих НЕК, в 200 мкл, в дні 28 і 42. В когорті Моб шість мишей С57ВІ/6 імунізували 2х1059 клітин 1929, тимчасово трансфікованих НЕК2, шляхом інтраперитонеальної ін'єкції. Потім мишам вводили бустерні дози 2х109 клітин 1929, тимчасово трансфікованих НЕРБ2, в 200 мкл, шляхом інтраперитонеальної ін'єкції в день 14, з подальшими бустерними дозами 20 мкг білка ЕгЬВ-2-
Ес, розчиненого в 125 мкл ТПептах СоїЇд, шляхом інтраперитонеальної ін'єкції в день 35 й останньої бустерної дози 20 мкг білка ЕгЬВ-2-Ес, розчиненого в 200 мкл ФБР, шляхом інтраперитонеальної ін'єкції в день 49. В когорті МОЕ шість мишей С57ВІ/6 імунізували 20 мкг білка ЕгЬВ-2-Ес, розчиненого в 125 мкл Тіептах бої, шляхом інтраперитонеальної ін'єкції.
Потім вводили бустерні дози 20 мкг білка ЕгбВ-2-Ес, розчиненого в 125 мкл Тіептах сої, шляхом інтраперитонеальної ін'єкції в день 14 і 28 й останню бустерну дозу 20 мкг білка ЕГЬВ-2-
Ес, розчиненого в 200 мкл ФБР, шляхом інтраперитонеальної ін'єкції в день 42. В когорті Моб шість мишей С57ВІ/Є імунізували за допомогою вакцинації ДНК в Сепомас (Фрайбург,
Німеччина), відповідно з їх протоколами. Запропоновані не вміщуючі ендотоксини вектори, використовувані для вакцинації ДНК, кодували трансмембранну та позаклітинну частину НЕК2, 60 клоновану в рмах1. Потім вводили бустерні дози ДНК в день 14, 28 і 66.
Імунізація НЕКЗ. Використовували чотири різні стратегії імунізації. В когорті МоВ шість (С57ВІ/6) мишей імунізували 2х106 клітин 929, тимчасово трансфікованих НЕРЗ, в 200 мкл, шляхом інтраперитонеальної ін'єкції. Потім мишам вводили бустерні дози 2х105 клітин 1929, тимчасово трансфікованих НЕКЗ, в 200 мкл, в дні 14, 28, 49 і 63. В когорті МоО шість мишей
С57ВІ/б імунізували 2х106 клітин 1929, тимчасово трансфікованих НЕКЗ, шляхом інтраперитонеальної ін'єкції в день 0, 14 і 28. Потім мишам вводили бустерні дози 20 мкг білка
ЕїбВ-3-Ес, розчиненого в 125 мкл ТПіептах Соїд, шляхом інтраперитонеальної ін'єкції в день 49 й останню бустерну дозу 20 мкг білка ЕгЬВ-3-Ес, розчиненого в 200 мкл ФБР, шляхом інтраперитонеальної ін'єкції в день 66. В когорті Моб шість мишей С57ВІ/6 імунізували 20 мкг білка ЕгЬВ-3-Ес, розчиненого в 125 мкл Тіептах СоїЇд, шляхом інтраперитонеальної ін'єкції.
Потім мишам вводили бустерні дози 20 мкг білка ЕгоВ-3-Ес, розчиненого в 125 мкл Тіегтах
СоЇд, шляхом інтраперитонеальної ін'єкції в день 14 і 28 й останню бустерную дозу з 20 мкг білка ЕгЬВ-3-Ес, розчиненого в 200 мкл ФБР, шляхом інтраперитонеальної ін'єкції в день 42. В когорті МоН шість мишей С57ВІ/б імунізували за допомогою вакцинації ДНК в Сепомас (Фрайбург, Німеччина), відповідно з їх протоколами. Запропоновані не вміщуючі ендотоксини вектори, використовувані для вакцинації ДНК, кодували трансмембранну частину РОСЕК і позаклітинну частину НЕКЗ, клоновані у рМах1. Потім вводили бустерні дози ДНК в день 14, 281 66.
Визначення титрів антитіл.
Титри антитіл проти НЕК2 в сироватці з імунізованих мишей С57ВІ/б визначали за допомогою ЕГІ5А на ВКД білка ЕгЬВ-2 (Вепдегтевазувіетв) й аналізу ЕАС5 негативних за НЕК2 клітин К562, лінії клітин МСЕ-7 з низькими рівнями експресії НЕКЗ і клітин 5КВК-3 і ВТ-474 з ампліфікованим НЕК2. Титри антитіл проти НЕКЗ в сироватці з імунізованих мишей С57ВІ/6 визначали за допомогою ЕГІЗА на білку ЕгрВ-3-Ес й аналізу ЕАС5 негативних за НЕКЗ клітин
К562, лінії клітин МСЕ-7 з низькими рівнями експресії НЕК2 і клітин 5КВЕК-3 і ВТ-474 з ампліфікованим НЕК2.
Титри антитіл проти НЕК2 і НЕКЗ в сироватці перед умертвінням тварин представлені в таблиці 1 і таблиці 2, відповідно. У тварин у всіх когортах розвилися відповіді антитіл проти
НЕК?2 або НЕКЗ.
Виділення лімфоїдної тканини.
З всіх мишей, вакцинованих ДНК (когорти Моб і МеН), витягали селезінку та дренувальні лімфатичні вузли. З всіх тканин одержували суспензії окремих клітин, а потім тканини лізували в реагенті Тризол. Селезінки витягали з всіх мишей з когорт МоА - МоЕ, за винятком однієї миші з когорти МосС, яка загинула після першої бустерної ін'єкції. З всіх селезінок одержували суспензії окремих клітин і виділяли всю фракцію В-клітин, застосовуючи процедуру поділу методом магнітно-активованого сортування клітин (МАС) або шляхом збагачення СО19 (когорти Мо А, Е,
Е), або шляхом збідніння клітинами, що не відносяться до В-клітин (когорти Мо В, С, 0).
Одержання бібліотек фагового дисплея з імунізованих мишей
Для кожної миші конструювали одну фагову бібліотеку. Для цієї мети використовували матеріал від всіх мишей у кожній групі (5 або б мишей на групу) для одержання фагових бібліотек із застосуванням наступного підходу. З кожної окремої миші виділяли РНК, синтезували КкДНК і проводили реакції ПЛР, специфічні для сімейства генів УН. Потім очищали всі продукти ПЛР сімейства МН від кожної миші, визначали концентрацію ДНК, розщеплювали та лігували у вектор фагового дисплея, що містить загальний легкий ланцюг, для одержання фагової бібліотеки химерних антитіл миші/людини. Усі фагові бібліотеки містили » 106 клонів з частотою вбудовування » 85 95.
Селекція фагів, що несуть Гар-фрагменти, що специфічно зв'язують НЕК2 і НЕКЗ
Селекцію фрагментів антитіл проводили, застосовуючи бібліотеки фагового дисплея антитіл. Для селекції використовували бібліотеки, отримані із застосуванням імунізації, і синтетичні бібліотеки (згідно з описом в де Кгиїї й ін. Мої. Віої. (1995), 248, 97-105).
Селекція та скринінг фагів НЕК2
Фагові бібліотеки вивільняли за допомогою хелперного фага МС5-М13 (5ігагадепе) і проводили два раунди селекції в імунопробірках (Мипс), покритих рекомбінантним білком. У першому раунді імунопробірки покривали ВКД білка ЕгЬВ-2 (Вепаептеавзузіетв), тоді як у другому раунді імунопробірки покривали ЕгЬВ-2-Ес (ЕМО бЗувзіетв). Імунопробірки блокували 4 9У5-вим розчином знежиреного сухого молока (ЕК). Бібліотеки фагового дисплея антитіл також блокували 4 95 ЕЇК перед додаванням фагової бібліотеки в імунопробірки. Інкубацію з фаговою бібліотекою та білковим покриттям в імунних пробірках проводили протягом 2 год. при кімнатній температурі при обертанні. Імунопробірки потім промивали від п'яти до десяти разів 60 0,05 У6 Гуееп-20 у ФБР, а потім промивали від 5 до 10 разів ФБР. Зв'язані фаги елюювали із застосуванням 50 мМ гліцину (рН 2,2), додавали до Е. соїї ХІ -1 Віше й інкубували при 37"С для інфікування фагами. Згодом інфіковані бактерії висіювали на чашки з агаром, що містять ампіцилін, тетрациклін і глюкозу, й інкубували при 37"С протягом ночі. Після першого раунду колонії зіскрібали з чашок і поєднували, після чого вивільняли й ампліфікували з одержанням збагаченої бібліотеки першого раунду. Потім проводили селекцію збагаченої бібліотеки на ЕгрВ- 2-Ес («МО Бувіетв5), застосовуючи описаний вище протокол. Після другого раунду селекції відбирали та вивільняли окремі клони з одержанням моноклональних препаратів фага за допомогою набору Міпіргер. Потім ідентифікували позитивних клонів фага, що зв'язують ЕгрбБ2, за допомогою ЕАСЗ зі зв'язування з лінією клітин раку молочної залози ВТ-474. Секвенували гени МН із всіх специфічних до ЕгЬВ-2 клонів. Перебудови гена УН визначали за допомогою програмного забезпечення УВА5Е2, щоб ідентифікувати унікальних клонів. Потім досліджували за допомогою ЕАС5 зв'язування всіх унікальних клонів у форматі фага з клітинами НЕК29З3Т (негативний контроль), клітинами НЕК293Т, тимчасово трансфікованими ЕгЬВ-2, і клітинами ВТ- 474.
Селекція та скринінг фагів НЕКЗ
Фагові бібліотеки вивільняли за допомогою хелперного фага МС5-М13 (5ігагадепе) і проводили два раунди селекції в імунопробірках (Мипс), покритих рекомбінантним білком. В обох раундах селекції імунопробірки покривали ЕгЬВ-3-Ес (ЕМО Бувіетв), тоді як в другому раунді імунопробірки покривали ЕгоВ-2-Ес (КМО 5Зузієтв). Для того, щоб подолати зсув відбору в сторону Ес-частини злитого білка, обидва раунди селекції на ЕгЬВ-3-Ес проводили у присутності 150 мкг/мл ЇдС людини. Імунопробірки блокували 4 95 ЕЇК. Бібліотеки фагового дисплея антитіл також блокували 4595 ЕїЇК перед додаванням фагової бібліотеки в імунопробірки. Інкубацію з фаговою бібліотекою проводили протягом 2 год. при обертанні.
Імунопробірки потім промивали від п'яти до десяти разів 0,05 95 ПГиуееп-20 у ФБР, а потім промивали від 5 до 10 разів ФБР. Зв'язані фаги елюювали із застосуванням 50 мМ гліцину (рн 2,2), додавали до Е. соїї ХІ-1 Віше й інкубували для інфікування фагами. Згодом інфіковані бактерії висіювали на чашки з агаром, що містять ампіцилін, тетрациклін і глюкозу, й інкубували при 37"С протягом ночі. Після першого раунду колонії зіскрібали з чашок і поєднували, після чого вивільняли й ампліфікували фаги з одержанням збагаченої бібліотеки першого раунду.
Потім проводили селекцію збагаченої бібліотеки на ЕгЬВ-3-Ес (ЕМО Зузвіетв), застосовуючи описаний вище протокол. Після другого раунду селекції відбирали та вивільняли окремі клони з одержанням моноклональних препаратів фага за допомогою набору Міпіргер. Позитивних клонів фага ідентифікували за допомогою ЕАСЗ5 зі зв'язування з лінією клітин раку молочної залози ВТ-474. Секвенували гени МН із всіх позитивних клонів. Перебудови гена УН визначали за допомогою програмного забезпечення МВАЗЕ2, щоб ідентифікувати унікальних клонів. В аналізі РАС5 досліджували зв'язування всіх унікальних клонів у форматі фага з клітинами К562 (негативний контроль), стабільними клітинами К562-НЕКЗ і клітинами ВТ-474.
Всього проводили 36 раундів селекції на форматах антигенів ЕгЬВ-2 і ЕгЬВ-3. Всі скринінгові процедури селекції дозволили отримати 89 унікальних клонів Рар, спрямованих проти НЕК, і 137 унікальних клонів Бар, спрямованих проти НЕКЗ. Бар вважали унікальним на підставі унікальної послідовності його НСОКЗ, що вказує на унікальну подію рекомбінації МОУ). У деяких випадках одержували клональні варіанти з ідентичними НСОКЗ, відмінними СОК'І і/або СОК2. З бібліотек імунізованих мишей відбирали кластери клональних варіантів, що містять заміни в гені
МН, які відображають варіанти афінності.
Селекція/визначення характеристик антитіл
Одержання моноклональних антитіл
Гени МН унікальних антитіл, судячи з послідовності гена УН і деяких варіантів зазначеної послідовності, отримані з фагових бібліотек з імунізованих мишей, клонували в кістяк вектора
ІдО1. У зазначеному процесі використовували дві різні продукуючі лінії клітин: клітини НЕК29З3Т і 293 Ргеезує. Прикріплені до субстрату клітини НЕК293Т культивували в б-ямкових планшетах до конфлюентності, що становить 80 95. Клітини тимчасово трансфікували сумішшю індивідуальних ДНК із ЕОСЕМЕ і додатково культивували. Через сім днів після трансфекції збирали супернатант і змінювали середовище. Через чотирнадцять днів після трансфекції супернатанти поєднували та фільтрували через фільтр із діаметром пор 0,22 мкм (запогіив5).
Стерильний супернатант зберігали при 4"С.
Адаптовані для суспензійної культури клітини 293Е Егеезі|уЇе культивували у флаконах Т125 на платформі, що струшується, до досягнення щільності 3,0х1059 клітин/мл. Клітини висіювали при щільності 0,3-0,5х106 життєздатних клітин/мл в кожну ямку 24-ямкового планшета з глибокими ямками. Клітини тимчасово трансфікували сумішшю індивідуальних стерильних ДНК 60 з поліетиленіміном (РЕЇ) і додатково культивували. Через сім днів після трансфекції, збирали супернатант і фільтрували через фільтр із діаметром пор 0,22 мкм (Запогійи5). Стерильний супернатант зберігали при 4"С.
Одержання біспецифічних антитіл
Біспецифічні антитіла одержували, застосовуючи власну СНЗ-методику, що забезпечує ефективну гетеродимеризацію й утворення біспецифічного антитіла. У зазначеній СНЗ-методиці для забезпечення ефективного утворення пари з двох різних молекул важких ланцюгів використовують, сполучаючі певний заряд точкові мутації в області СНЗ, відповідно до наведеного раніше опису (РСТ/МІ 2013/050294; опублікована як УМО 2013/157954 АТ).
Очищення до для функціонального скринінгу
Очищення дО проводили в малому масштабі («х 500 мкг), середньому масштабі («10 мг) та великому масштабі (10 мг), застосовуючи афінну хроматографію. Очищення в малому масштабі проводили в стерильних умовах в 24-ямкових фільтрувальних планшетах, застосовуючи фільтрацію під вакуумом. Спочатку підводили рН середовище до рН 8,0, а потім отриманий в малому масштабі продукт інкубували з білююм А на гранулах сефарози СІ-48 (50 95 в об'ємному співвідношенні) (Ріегсе) протягом 2 год. при 25"С на струшуючій платформі при 600 об/хв (струшувач для планшетів Неїідоїрп). Потім гранули збирали за допомогою фільтрації під вакуумом. Гранули промивали двічі у ФБР, рН 7,4. Їду елюювали при рН 3,0 за допомогою 0,1 М цитратного буфера та фракцію дО негайно нейтралізували за допомогою
Трис, рН 8,0. Заміну буфера здійснювали шляхом центрифугування, застосовуючи багатоямкові планшети МийЗсгееп ОКгасе!-10 (МійПіроге). Зразки виявлялися у кінцевому буфері ФБР, рн 7 4.
Перевірка специфічних до НЕК2/НЕКЗ Ід
В аналізі РГАС5 досліджували зв'язування антитіл з ВТ-474, НЕК293Т ії НЕК293Т з підвищеною експресією НЕК2 або НЕКЗ. Для цього клітини збирали, застосовуючи трипсин, і розводили до 1059 клітин/мл у буфері для ЕАС5 (ФБР/О,5 96БСА/),5 мМ ЕДТА). 1-2х105 клітин додавали в кожну ямку 96-ямкового планшета з округленим дном ямок. Клітини центрифугували протягом 2 хвилин при 300 9 при 4"С. Супернатант відкидали шляхом перекидання планшета(- ів). Додавали 50 мкл кожного зразка Їдс при концентрації 10 мкг/мл й інкубували протягом 1 год. на льоді. Клітини однократно центрифугували, супернатант видаляли та клітини промивали двічі буфером для ЕАС5. Додавали 50 мкл розведених 1:100 антитіл миші проти ЇдС людини-РЕ (Іпийгодеп) й інкубували протягом 30-60 хвилин на льоді в темряві. Після додавання буфера для
ЕАС5 клітини однократно центрифугували, супернатант видаляли та клітини промивали двічі буфером для ЕАСЗ5. Клітини аналізували на проточному цитометрі ЕАС5Сапіо з встановленим модулем НТ5. Зв'язування антитіл із клітинами оцінювали за середньою інтенсивністю флуоресценції (МЕ).
Для перевірки здатності до неспецифічного зв'язування використовували аналіз ЕГІЗА.
Досліджували реакційну здатність антитіл до НЕК2 і НЕКЗ по відношенню до антигенів фібриногену, гемоглобуліну та правцевому токсину. Для перевірки здатності до специфічного зв'язування НЕК2 і НЕКЗ, досліджували зв'язування вказаних антитіл з очищеними рекомбінантними позаклітинними доменами ЕСЕК, НЕК2, НЕКЗ і НЕК4. Планшети
МАХІБОВР'"М для ЕГІЗА покривали антигенами протягом ночі. Ямки планшетів для ЕГІЗА блокували ФБР (рн 7,2), що містить 5 95 БСА, протягом 1 год. при 37"С. Антитіла, які пройшли селекцію, досліджували в двох повторах при концентрації 10 мкг/мл, розведеними у ФБР-2 95
БСА, і дозволяли зв'язуватися протягом 2 годин при 2570. В якості контролю одночасно проводили вказану процедуру з антитілом, специфічним до нанесенних антигенів, і з антитілом негативного контролю. Планшети для ЕГІ5ЗА промивали 5 разів у ФБР-Т (ФБР-0,05 ую Гмееп 20 в об'ємному відношенні). Зв'язаний дб детектували за допомогою розведеного 1:2000 кон'югованого з пероксидазою хрону (НКР) антитіла (антитіл кози проти миші, ВО) ії дозволяли зв'язуватися протягом 2 годин при 25"С. Планшети для ЕГІ5ЗА промивали 5 разів у ФБР-Т (ФБР- 0,05 95 Ту'еєеп 20) і зв'язаний дО детектували за допомогою вимірювання ОЩ на 492 нм.
Групування епітопів, специфічних до НЕК2/НЕКЗ Ід.
Антитіла у панелі антитіл проти НЕКЗ2 групували на підставі їх здатності взаємодіяти з ВКД
НЕК2, отриманим з інших видів (миші, курчати), і на підставі їх зв'язування зі специфічними доменами в молекулі НЕК2, тобто, з доменами І, І, Ш ї ІМ, із застосуванням химерних конструкцій.
Антитіла у панелі антитіл проти НЕКЗ групували на підставі їх здатності взаємодіяти з ВКД
НЕКЗ, отриманих з інших видів (яванський макак, пацюк), і на підставі їх зв'язування зі специфічними доменами в молекулі НЕКЗ, тобто, з доменами І, ПЇ, ШІ ї ІМ, із застосуванням химерних конструкцій.
Для даної мети клітини СНО-К1І тимчасово трансфікували відповідними конструкціями, 60 застосовуючи суміші ліпофектамін/ДдНК. В химерній конструкції із заміною доменів, домени
НЕК2 курчати або НЕКЗ пацюка заміняли на відповідні домени з людини. Зв'язування специфічних антитіл вимірювали за допомогою ЕАС5. Експресію конструкцій підтверджували, застосовуючи антитіло проти тус. РАС5-забарвлення з трастузумабом включали в якості контролю специфічного зв'язування з доменом ІМ. Антитіла в кожній групі можна впорядкувати на підставі інтенсивності фарбування (МЕЇ).
Панель з 65 антитіл до НЕКЗ2 можна розділити на сім груп (таблиця 3). 1. Специфічні відносно домену І (25) 2. Специфічні відносно домену ІІ (2) 3. Специфічні відносно домену ЇЇ (23) 4. Специфічні відносно домену ІМ (7) 5. Специфічні відносно домену ІМ і що вступають у перехресну реакцію з доменом миші (2) 6. Що вступають в реакцію зі всіма конструкціями (2) 7. Що вступають в реакцію тільки з НЕК2 людини (4)
Конкурування з трастузумабом
Два антитіла, віднесені до групи, що вступає в реакцію з доменом ЇМ НЕК, інгібували проліферацію клітин 5КВА-3. В обох антитіл були аналогічні області СОКЗ за винятком однієї іншої амінокислоти. Досліджували здатність одного антитіла Ро1849 конкурувати з трастузумабом в конкурентному аналізі ЕГІ5А. В даному ЕГІ5А планшети покривали Ес-НЕКЗ й інкубували з антитілом ЇдО при концентрації 15 мкг/мл. Після інкубації протягом 15 хвилин фаги залишали для інкубації ще на одну годину. Після цього фаги детектували. В таблиці 4 показано, що РО1849 і трастузумаб можуть одночасно зв'язуватися з НЕК2, оскільки в ході ЕГІ5А не спостерігали втрати сигналу. Дійсну конкуренцію спостерігали тільки коли одні і ті самі фаг й антитіло поєднували у вказаному аналізі.
Панель з 124 антитіл до НЕКЗ можна розділити на п'ять груп (таблиця 5): 1. Висока реакційна здатність відносно домену ПІ, реакційна здатність відносно пацюка та миші, і незначна реакційна здатність відносно домену ІМ (8) 2. Високая реакційна здатність відносно домену ПІ, реакційна здатність відносно пацюка, людини й яванського макака, незначна реакційна здатність відносно домену ІМ (8) 3. Що вступають в реакцію тільки з НЕКЗ пацюка, яванського макака та людини (43) 4. Що вступають в реакцію тільки з НЕКЗ людини (32) 5. Що вступають в реакцію зі всіма конструкціями (33)
Аналіз проліферації ліній клітин
Клітини ЗК-ВА-3 культивували в ЮОМЕМ-Р/12, доповненій -глутаміном і 1095 термоінактивованій ФБС. Клітини ВхРОС-3-іис2 культивували в КРМІ1640, доповненій 10 95 термоінактивованій ФБС. Клітини МСЕ-7 культивували в КРМІ1640, доповненій 100 мкМ МЕАА, 1 мМ пірувату натрію, 4 мкг/мл інсуліну та 10 95 термоінактивованій ФБС.
Для аналізу проліферації клітин 5К-ВА8-3 субконфлюентні культури клітин промивали ФБР, трипсинізували й інактивували трипсин додаванням культурального середовища. Клітини розводили до 6бх107 клітин/мл в культуральному середовищі. Антитіла розводили до концентрації 10 ії 1 мкг/мл і додавали в об'єм 100 мкл в 96-ямкові планшети з чорним дном (АВдепе АВ-0932). Клітини додавали при щільності 6000 клітин/ямку. Клітини культивували протягом З днів при 37"С, 5595 СО, при відносній вологості 95 95. Додавали АЇатаг Віцетм (Іпийгодеп), дотримуючись інструкцій виробника, й інкубували протягом 6 годин при 37"С, 5 95
СО, при відносній вологості 9595 у темряві. Вимірювали флуоресценцію при довжині хвилі збудження 550 нм і довжині хвилі випущення 590 нм. Ступінь інгібування росту порівнювали з такою для такої самої концентрації трастузумабу (таблиця 6).
Для аналізу проліферації клітин МСЕ-7 і ВхРОС-3-Інс2 субконфлюентні культури клітин промивали ФБР, трипсинізували й інактивували трипсин додаванням культурального середовища. Клітини промивали двічі більшими об'ємами аналітичного середовища (середовища КРМІ 1640, що містить 0,05 95 БСА і 10 мкг/мл голотрансферину).
Клітини МСЕ-7 розводили до 5х107 клітин/мл в культуральному середовищі. Антитіла розводили до концентрації 10 і 1 мкг/мл і додавали в об'єм 100 мкл в 96-ямкові планшети з чорним дном (АВдепе АВ-0932). Клітини додавали при щільності 5000 клітин/ямку у присутності кінцевої концентрації 1 нг/мл людського рекомбінантного домену ЕСЕ МКО1-бета 1 людини/НКО1-бета 1 (396-НВ-050 ВМО). Домен ЕСЕ МКО1-бета 1 людини/НКО 1-бета 1 далі у даному тексті будуть називати НКО. Клітини культивували протягом 5 днів при 37"С, 5 95 СО, при відносній вологості 95 95. Додавали АІатаг Віце"М (Іпийгодеп), дотримуючись інструкцій виробника, й інкубували протягом 24 годин при 37"С, 5 95 СО2, при відносній вологості 95 95 у темряві. Вимірювали флуоресценцію при довжині хвилі збудження 550 нм і довжині хвилі 60 випущення 590 нм. Ступінь інгібування росту порівнювали з таким для такої самої концентрації 5О0
МедЬьб (таблиця 7).
Аналіз проліферації ВхРС-3-Інс-2 використовували для скринінгу біспецифічних антитіл.
Клітини ВхРОС-3-Ійс-2 розводили до 8х107 клітин/мл в культуральному середовищі. Антитіла розводили до концентрації 10 і 1 мкг/мл і додавали в об'єм 100 мкл в 96б-ямкові планшети з чорним дном (АВдепе АВ-0932). Клітини додавали при щільності 8000 клітин/ямку у відсутності або у присутності кінцевої концентрації 10 нг/мл НКО людини. Клітини культивували протягом 4 днів при 37"С, 5595 СО, при відносній вологості 95 95. Додавали АІатаг Віце"М (Іпуйгодеп), дотримуючись інструкцій виробника, й інкубували протягом 4 годин при 37"С, 5 95 СО, при відносній вологості 95 95 у темряві. Вимірювали флуоресценцію при довжині хвилі збудження 550 нм і довжині хвилі випущення 590 нм.
Для того, щоб мінімізувати крайові ефекти, зовнішні ямки 9б-ямкових планшетів повністю заповнювали ФБР.
Впорядковування за афінністю специфічних до НЕКЗ2 дО
Ми використовували спосіб, описаний у Оемазп (РМАБ, 1990), для впорядковування антитіл в аналізі ЕГІ5ЗА з обмеженою кількістю антигена. Застосування знижених концентрацій антигена для покриття усуває спостережувані перехресні реакції та може використовуватися для детектування антитіл з високою афінністю/авідністю. Отже, концентрацію антигена на твердій підкладці поступово зменшували, щоб досліджувати слабку імунологічну реакційну здатність.
Серійними титрами ВКД білка ЕгоВ-2, починаючи з 2,5 мкг/мл і до 0,019 мкг/мл, покривали планшети для ЕГІЗА МАХІЗОВР'М протягом ночі. Ямки планшетів для ЕГІЗА блокували ФБР (рН 7,2), що містить 595 БСА, протягом 1 год. при 37"С. Антитіла, які пройшли селекцію досліджували в двох повторах при концентрації 10 мкг/мл, розведеними у ФБР-2 95 БСА, і дозволяли зв'язуватися протягом 2 годин при 2570. В якості контролю одночасно проводили вказану процедуру з антитілом, специфічним до нанесених антигенів, і з антитілом негативного контролю. Планшети для ЕГІ5А промивали 5 разів у ФБР-Т (ФБР-0,05 95 Ту/"ееп 20 в об'ємному відношенні). Зв'язаний Їдо детектували за допомогою розведеного 1:2000 кон'югованого з НЕР антитіла (кози проти дО миші, ВО Віозсіепсез) і дозволяли зв'язуватися протягом 2 годин при 2576. Планшети для ЕГІЗА промивали 5 разів у ФБР-Т (ФБР-0,05 95 Тмееп 20) і зв'язаний дО детектували за допомогою вимірювання ОЩ на 492 нм. РО1849, РО2916, РО2926, РО2930,
РО2971, РО2973, РОЗ004 і РОЗОЗ1 досліджували в аналізі ЕГІ5А при титруванні антигеном
НЕКЗ (фітг. 1).
Зв'язування генів МН НЕКЗ з різними легкими ланцюгами каппа
Для того, щоб досліджувати зв'язування МН НЕК2, отриманих з різних бібліотек фагового дисплею, панель антитіл до НЕК2 клонували й експресували в контексті іншого ланцюга каппа
МК, тобто МІ із МЕНО7945А. Отримані дб піддавали аналізу ЕАС5 на клітинах К5б62 і стабільних клітинах К562-НЕК2З. Гени МН, отримані з комбінаторних бібліотек і некомбінаторних бібліотек, наведені в таблиці 8. Всі ланцюги МН МЕ2971, МЕ3958, МЕ2916, МЕ2973, МЕЗ3004,
МЕЗ3025, МЕ3031 можна скомбінувати з легсим ланцюгом МЕНО7945А без значної втрати специфічності та зв'язування антигена, що спостерігають при комбінуванні із загальним легким ланцюгом ІЗКМ1-39. Ланцюг МН МЕ1849 не вдалося скомбінувати з варіантом легкого ланцюга каппа із збререженням специфічності та зв'язування антигена.
Інші антитіла до НЕК2 і НЕКЗ
Антитіла, які інгібують функцію НЕК2 або НЕК, відомі в даній області. Додаткові антитіла сконструювали згідно з опублікованою інформацією й експресували в клітинах 293Е Егеевіуів.
Антитіла проти НЕКЗ2 пертузумаб і трастузумаб одержували на підставі інформації, розкритої в
О52006/0212956 АТ (Сепепіесп). Антитіло проти НЕКЗ МоАрб одержували на підставі інформації, розкритої у УМО 2008/100624 (Ме!їтітаск Рпаптасеціфсаї!5, Іпс.) і повторно клонували у вектор з кістяком ІдО1. Інформацію про антитіла проти НЕКЗ 1-53 ї 01-59 одержували з 5 7705103 В2 (03 Ріагта Ас). Інформацію про антитіло проти НЕКЗ ГОМ716 одержували з 05 2012/0107306. Інформацію для конструювання антитіла "два в одному" проти ЕСЕК і проти
НЕКЗ МЕНО7945А одержували з М/О2010/108127.
Скринінг біспецифічних антитіл проти НЕК2ХНЕКЗ
МН з панелі антитіл проти НЕКЗ2 і НЕКЗ повторно клонували в навантажені сконструйовані вектори таким чином, що при експресії важких ланцюгів антитіла відбувалася примусова гетеродимеризація важких ланцюгів, яка призводила до утворення біспецифічних антитіл після трансфекції. Використовували три різні стратегії при комбінуванні плечей проти НЕК2 і НЕКЗ у біспецифічному форматі Ідс: 1. НЕКЗ2 (блокування ліганд-незалежного росту) х НЕКЗ (блокування ліганд-незалежного росту) 60 2. НЕК2 (блокування ліганд-незалежного росту) х НЕКЗ (блокування ліганд-залежного росту) 3. НЕК з різних груп епітопів х НЕКЗ (блокування ліганд-залежного росту)
У деяких біспецифічних комбінаціях антитіла, отримані в групах 2 і 3, перекривались з антитілами групи 1.
Всього було отримано й очищено 495 біспецифічних антитіл в 24-ямковому форматі.
Досліджували здатність всіх антитіл інгібувати проліферацію експресуючої НЕКЗ2 і НЕКЗ лінії клітин підшлункової залози ВхРС-3-Ійс-2 (Саїйрег). Ефективність антитіл визначали в НКО- залежних і НКоО-незалежних умовах шляхом монохромного скринінгу, при цьому антитіла були присутні при концентрації 10 і 1 мкг/мл. В аналіз включали трастузумаб в якості еталонного антитіла, а також антитіло негативного контролю при таких самих концентраціях. Функціональна активність 80 антитіл, що виявили кращу біспецифічність до НЕК2ХНЕКЗ (на підставі комбінованого інгібування), при концентрації 1 мкг/мл показана на фігурі 2.
Вибирали, відтворювали й очищали в 24-ямковому форматі антитіла (всього 40), які проявили найбільше високу інгібіторну активність у порівнянні з антитілом позитивного контролю, і повторно досліджували шляхом монохромного скринінгу ВхРО-3-Ійс-2 при концентраціях 10 і 1 мкг/мл. Вказані антитіла додатково титрували в аналізі МСЕ-7 в НКО- залежних умовах і порівнювали з комбінацією трастузумабу та пертузумабу (1:1) й антитілом негативного контролю. На фігурі З наведений приклад кривих титрування трьох біспецифічних антитіл у порівнянні з вихідним антитілом проти НЕКЗ і комбінацією трастузумаб «- пертузумаб.
Вихідні моноклональні антитіла показані на верхньому зображенні, а біспецифічні антитіла показані на нижньому зображенні (фігура 3).
ІСво для біспецифічних антитіл, моноклональних антитіл й антитіл порівняння розраховували, застосовуючи нелінійний регресійний аналіз, за допомогою програмного забезпечення Ргізт. У програмному забезпеченні Сгарп рад перераховані значення ІСво для біспецифічних антитіл в аналізі на МСЕ-7 й їх інгібіторна активність в аналізі ВХРСЗ для порівняння. Виявили більш ефективну інгібуючу активність у панелі з 12 біспецифічних антитіл проти НЕК2ХНЕКЗ у порівнянні з комбінацією трастузумаб « пертузумаб. Крім того, біспецифічні антитіла були в тому самому або більшому ступені ефективні у порівнянні з вихідним моноклональним антитілом РОЗ3178 (таблиця 9).
Біспецифічні антитіла, які інгібували залежний від ліганду ріст клітин, складалися з плечей проти НЕКЗ в комбінації з плечима проти НЕКЗ: 3178, 3163, 3099 і 3176. Плечі як проти НЕК, так і проти НЕКЗ найбільш ефективних біспецифічних антитіл також, як і бівалентне моноклональне антитіло, були здатні інгібувати незалежну від ліганду проліферацію 5КВАК-3 (обидва плеча проти НЕКЗ2 і НЕКЗ) (таблиця б) або залежну від ліганду проліферацію МСЕ-7 (плечі проти НЕКЗ) (таблиця 7). Більшість ефективних антитіл складалися з плеча проти НЕК2, що розпізнає домен І, в комбінації з антитілом проти НЕКЗ-3178.
Інгібування росту пухлини ВхРС-3-Ійс2
Антитіла, описані в таблиці 9, досліджували в моделі ксенотрансплантата підшлункової залози ВхРОС-3-Ішс2. Лінія клітин ВХРО-3-іс2 експресує як НЕК2, так і НЕКЗ, й її вважають лінією клітин, експресуючою низькі рівні НЕК2. Самкам мишей СВ17 5СІО у віці 8-10 тижнів на початку дослідження ортотопічно трансплантували у підшлункову залозу 1х109 пухлинних клітин в об'ємі 20 мкл. Для цього миші одержували анестезію й їх клали на правий бік, щоб забезпечити доступ до лівого боку, і робили розріз довжиною 0,5 см в області лівого боку.
Підшлункову залозу та селезінку виводили на поверхню й у субкапсулярний простір хвоста підшлункової залози вводили шляхом ін'єкції 1х1059 пухлинних клітин в об'ємі 20 мкл. Через один тиждень після імплантації одержували дані біолюмінесценції (ВІ). За 15 хвилин до візуалізації всім мишам вводили інтраперитонеальні (і/п) ін'єкції 150 мг/кг люциферину (О-люциферин-ЕЕ (без ендотоксинів), калієву сіль, номер в каталозі Еб552, Рготеда). Візуалізацію ВІ! здійснювали один або два рази на тиждень, використовуючи вид ліворуч. Тварин зі значеннями, що різко відхиляються, - на підставі ВІ //об'єму пухлини - виключали, і мишей випадковим чином розподіляли в групи по 7 мишей кожна. Лікування починали на 8 день експерименту.
Тваринам у групі лікування антитілом вводили дозу 30 мг/кг антитіла щотижня протягом З послідовних тижнів (дні 0, 7, 14 і 21). В день 0 лікування тварини двічі одержували навантажувальну дозу, тобто, 60 мг антитіла/кг. Останню візуалізацію здійснювали в день 31.
Дві моделі ксенотрансплантатів ВхРС-3-ІШс2 тестували з різними панелями біспецифічних антитіл і вихідними антитілами. У першій моделі ксенотрансплантата ВхРО-3-Іш0с2 (фігура 4) одна група одержувала антитіло негативного контролю проти КМ (Сі Ідс), одна група одержувала контрольне антитіло трастузумаб й одна група одержувала антитіло позитивного контролю трастузумаб ї- пертузумаб (1:11 в об'ємному відношенні). Інші сім груп одержували 60 одне з моноклональних (РО) або біспецифічних (РВ) антитіл: РОЗ3З004, РОЗ178, РВЗ3566,
Б2
РВЗ3710, РВ3443, РВ3448 і РВ3441. Докладна інформація про склад біспецифічних антитіл наведена в таблиці 9.
Всі п'ять досліджених біспецифічних антитіл були здатні інгібувати ріст пухлини. Середня маса пухлини (ВІ) у тварин, яких лікували біспецифічним антитілом проти НЕК2 х НЕКЗ, була сходна з такою у тварин, яких лікували комбінацією трастузумаб - пертузумаб (фіг. 4).
В другій моделі ксенотрансплантата ВхРО-3-Ішса2 (фігура 5) одна група одержувала антитіло негативного контролю проти КМ (Ст дб) й одна група одержувала антитіло позитивного контролю -- комбінацію трастузумаб «т пертузумаб (1:11 в об'ємному відношенні). П'ять інших груп одержували одне з антитіл РОЗ3163, РВ3986, РВ3990, РВ4011 і РВ3883. Докладна інформація про біспецифічні антитіла РВ наведена в таблиці 9. Дані біспецифічні антитіла містили три різні сполучні НЕКЗ плеча в комбінації з тим самим плечем до НЕК2 МЕ2971 і додаткове плече до
НЕКЗ2 в комбінації зі зв'язуючим НЕКЗ плечем МЕ3163. В даному експерименті у пухлин в контрольній групі не виявили такого самого рівня прискореного росту, як у першому експерименті, що затруднило інтерпретацію результатів. Проте, біспецифічні антитіла проти
НЕКОХНЕКЗ РВЗ3883 і РВЗ3990 мали інгібіторну активність, аналогічну такій в комбінації трастузумаб - пертузумаб (фіг. 5).
На підставі отриманих іп мімо й іп міго результатів вибирали панель біспецифічних антитіл, з яких плечи проти НЕК2 складалися з МЕ2971, МЕ3004, МЕ1849 і плече проти НЕКЗ складалося з МЕ3178. Плечі МЕ2971 і МЕ3004 були мишачого походження та були гуманізовані.
Зв'язування біспецифічного антитіла проти НЕК2ХНЕКЗ у порівнянні з таким у вихідних моноклональних антитіл
Зв'язування біспецифічних антитіл проти НЕК2ХНЕКЗ у порівнянні з таким в їх вихідних аналогів визначали шляхом аналізу ЕАС5. ЕАС5 проводили на клітинах ВхРС-3-Іиса2 і клітинах
МСЕ-7 з серійними титрами антитіл в діапазоні 2,5 мкг/мл - 0, 01 мкг/мл. Панель досліджуваних антитіл складалася з біспецифічного антитіла РВ3566 і вихідних антитіл: антитіла проти НЕКЗ
РОЗ178 й антитіла проти НЕК2 РОЗО04. Результати МРЇ наносили на графік, й отримані графіки для обох ліній клітин показали, що біспецифічне РВ3566 більш ефективно зв'язується з обома лініями пухлинних клітин, ніж антитіло проти НЕКЗ РОЗ178 й антитіло проти НЕК2 РОЗООЯ4 (фіг. 6)
Гуманізування МЕ2971 і МЕ3004
МЕ2971 і МЕЗ3004 гуманізували відповідно до методики, відомої в даній області.
Всього сім гуманізованих/деімунізованих варіантів послідовності МЕ2971 експресували, підтверджували й описували іп мйго як моноклональні й у біспецифічному форматі в комбінації зі специфічним до НЕКЗ антитілом МЕЗ3З178. Те ж саме здійснювали для семи варіантів послідовностей МЕЗ3004, які одержували шляхом заміни НСОКЗ МЕ2971 у вказаних семи варіантах МЕ2971 на НСОКЗ із МЕ3004. Аналізували експресію, термічну стабільність та функціональну активність всіх гуманізованих варіантів. На підставі продукції, цілісності, стабільності та функціональної цілісності був вибраний варіант МЕ2971 (2971-маг2) як оптимальний гуманізований варіант МН для використання у біспецифічному форматі з МЕ3178.
Даний варіант 2971-маг2 був перейменований в МЕЗ3958. бБіспецифічна комбінація
МЕЗ3958ХхМЕЗ3178 проти НЕК2ХНЕКЗ дозволила одержати РВА188.
Одержання у великому масштабі, очищення й аналітичні дослідження РВ4188
Адаптовані для росту в суспензійній культурі клітини 293Е ЕгеезіуЇє культивували в колбах
Ерленмейєра на платформі, що струшується до досягнення щільності 3,0х106 клітин/мл. Клітини висіювали в колби Ерленмейєра ємністю 4 л при щільності 0,3-0,5х106 життєздатних клітин/мл.
Клітини тимчасово трансфікували сумішшю індивідуальних стерильних ДНК з РЕЇ і додатково культивували. Через сім днів після трансфекції збирали кондиційоване середовище, що містить біспецифічне антитіло, шляхом низькошвидкісного центрифугування протягом 5 хвилин при 1000 9д, а потім високошвидкісного центрифугування протягом 5 хвилин при 4000 д. Зібране кондиційоване середовище концентрували на касеті Загіогіи5 Нуйдгозапй з відсіканням за молекулярною масою 5 кДа до об'єму, що становить приблизно 600 мл, і потім проводили діафільтрацію проти 4 л ФБР. Антитіла зв'язували на колонці з «35 мл МарзеїЇесібЗиге ХІ (11 70).
Специфічно зв'язані з білююм А білки видаляли шляхом промивания колонки в режимі зворотного потоку 150 мл ФБР, 150 мл ФБР, що містить 1 М Масі, 100 мл ФБР. Зв'язані антитіла елюювали, застосовуючи 100 мМ цитрат, рН 3,0 в режимі зворотного потоку та збирали фракції об'ємом 5 мл у пробірки ємністю 10 мл, що містять 4 мл Ттгіз5, рН 8,0, для нейтралізації.
Елюйовані антитіла потім очищали гель-фільтрацією, застосовуючи колонку Зирегдех 200 50/1000. Очищене антитіло стерилізували фільтрацією, застосовуючи шприцевий фільтр з діаметром пор 0,22 мкм. Концентрацію Їд0 визначали шляхом вимірювання ОЩ на 280 нм і 60 розраховували концентрацію білка на основі послідовності амінокислот. Досліджували агрегацію (ВЕЕХ) та чистоту (ЕФ у ПААГ/ДСН, нативна мас-спектрометрія (нМе), ІОХ і ІЕФ) білків. Зразки білків зберігали при -80"С.
Очищення до для аналітичних досліджень та досліджень ксенотрансплантатів.
Очищення в середньому масштабі проводили на системі АКТА 100 Ехріогег, застосовуючи колонки НіТтар, МарбеїІесїі Зиге й знесолюючі колонки НіТгтар. Зразки завантажували зі швидкістю 5 мл/хв. Колонку промивали 2 об'ємами колонки ФБР. дб елюювали при рн 3,0 за допомогою 0,1 М цитратного буфера. Потім зразок знесолювали, і він виявлявся у кінцевому буфері ФБР, рН 7,4. Отримані дб фільтрували через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм (Запогпіив). Концентрацію (дб вимірювали, застосовуючи систему Осівєї з сенсорами білка А.
Досліджували агрегацію (ВЕЕХ) та чистоту (ЕФ у ПААГ/ДСН, нм, ОХ і ІЕФ) білків. Зразки білків зберігали при -80"С.
Аналітичні характеристики РВ4188
РВА188 (МЕ3958ХхМЕ3178) піддавали аналізу із застосуванням ВЕЕХ і КО-ВЕРХ (колонка
ТОК деІ-ЗТАТ, діаметр частинок 7 мкм, внутрішній діаметр 4,66 мм х довжина 10 см).
Аналітичний профіль РВ4188 в цілому узгоджувався з поведінкою нормального моноспецифічного ІдС1, такого як вихідне плече проти НЕК2 РОЗО958 і моноклональне контрольне антитіло проти К5М (фіг. 7).
Визначення афінності.
Афінність моновалентного зв'язування антитіл РВ4188 і РВ3448 з рекомбінантними НЕК і
НЕКЗ визначали за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (ППР, Віасоге Т100). Для проведення всіх описаних експериментів застосовували Віасоге"м Т100 (СЕ НеаїБсаге, Упсала,
Швеція). Підготовку поверхні сенсора й аналіз взаємодії проводили при 25 "С. Буфер і реагенти
Віасоге здобували в СЕ Неаййсаге. Поверхню сенсорного чипа СМ5О покривали ЕгрВ2-Ес і
ЕВБВЗ-Ес(КМО) в калій-ацетатному буфері (рН 5,5) на цільовому рівні імобілізації 500 КИ.
Рухомий буфер являв собою НВ5 (забуферений Нере5 сольовий розчин): 10 мМ НЕРЕ5, рН 7,4, 150 мМ Масі, 0,005 95 Гшееп-20, стерилізований фільтрацією через фільтр з діаметром пор 0,2 мкм. Біспецифічні антитіла розводили до 100, 50, 20, 10,1 ї 0,1 нМ в НВ5 їі пропускали з високою швидкістю потоку (30 мкл/хв) через поверхню сенсорного чипа СМ5 зі зв'язаними антигенами. У програмному забезпеченні ВіАемаінайоп модель аппроксимації кривої для моновалентної взаємодії 1:11 дозволяла визначити значення афінності плечей НЕК2 (моновалентна взаємодія), значення афінності плечей НЕК2 можна було визначити. Внаслідок низької швидкості дисоціації плеча НЕКЗ, афінність неможливо було визначити. Для визначення афінності плеча НЕКЗ сенсорний чип СМ5 покривали РВ4188 при цільовому рівні імобілізації 500 КО. Антигени Нег2-Ес і Нег3-Ес розводили до 100, 50, 20, 10,1 ї 0,1 нМ в НВЗ5З і пропускали з високою швидкістю потоку (40 мкл/хв) через поверхню зі зв'язаним РВ4188. Для визначення значень Коп і Кок застосовували програмне забезпечення ВіАемаїЇчайоп в комбінації з моделлю, яка враховує те, що поверхню сенсорного чипа покривали моновалентною молекулою, і те, що антиген ЕгЬВ-3-Ес являв собою бівалентну молекулу. Значення афінності антитіл РВА188 і
РВЗ3448 представлені в таблиці 10.
Визначення афінності РВ4188 на клітинах.
Значення афінності зв'язування також визначали шляхом вимірювання афінності стаціонарної культури клітин, застосовуючи клітини ВТ-474 і 5К-ВВ8-3. Аналізували чотири Ідо: 1) РВ4188 (біспецифічне проти НЕК2ХНЕКЗ), що містить антитіло проти НЕКЗ2 3958 й антитіло проти НЕКЗ 3178; 2) РВО215 (біспецифічне проти НЕКЗХТТ), що містить антитіло проти НЕ ВЗ 3178 й антитіло проти ТТ (правцевого токсоїду) 1337; 3) РВ9216 (біспецифічне проти НЕК2ХТТ), що містить антитіло проти НЕК2 3958 й антитіло проти ТТ 1337; 4) герцептин (моноспецифічне проти НЕКЗ). Ід мітили радіоактивним "25І, використовуючи попередньо покриття пробірки для йодування І0ОБО-СЕМО Ргесоаїей Іодопайоп Тибез (Ріегсе) і прикладені інструкції. Мічений ЇдДО розводили до активності «1-2х108 імп/хв/мл в 25 мМ Трис-НСІ, 0,4 М Масі, 0,25 95 БСА, 5 мМ
ЕДТА, 0,05 95 МаМз. Концентрації білка визначали за допомогою набору для аналізу білка ВСА
Ргоївіп Авзау КІії (Ріегсе). Аналіз методом проточної цитометрії мічених і немічених Ідс із застосуванням клітин ВТ-474 і 5К-ВВ-3 показав відсутність або тільки незначні ознаки зниження зв'язування після внесення мітки. Вимірювання афінності в клітинах стационарної культури проводили, як описано далі. Клітини висіювали в 9б-ямкові планшети й інкубували при 4" з різними концентраціями міченого дос. Незв'язані радіоактивні частинки видаляли через 4 год. і вимірювали пов'язану з клітиною радіоактивність, застосовуючи лічильник гамма- випромінювання криничного типу. Неспецифічне зв'язування вимірювали шляхом додавання блокувальної рецептор концентрації (100-кратний надлишок) неміченого антитіла. Кожну умову досліджували в трьох повторах і проводили по три незалежних експерименти на антитіло. 60 Значення Ко розраховували на підставі нелінійної регресійної моделі, яка компенсує неспецифічне зв'язування, застосовуючи Ргізт 6.04 (програмне забезпечення ОгарпРад).
Графіки, що містять апроксимовані криві для зв'язування (Я проти НЕК2ХНЕКЗ (РВА188) з обома лініями клітин, наведені на фігурі 20. Отримані значення Ко для всіх 24 тестів, включаючи середні значення, наведені в таблиці 12. Коротко, середні значення КО, визначені із застосуванням клітин ВТ-474 і 5К-ВВ-3, становили 3,2 і 2,0 нМ для НЕК2ХНЕКУ, 3,7 і 1,3 нМ для герцептину, 3,9 і 2,3 нМ для НЕКЗХТТ, і 0,23 і 0,99 нМ для НЕКЗХТТ, відповідно. Таким чином, продемонстрували більше високу афінність РВ4188 до НЕКЗ, ніж до НЕК2, що відрізняє його від біспецифічної молекули проти НЕК2ХНЕКЗ-ММ-111, яка направлено взаємодіє з НЕКЗ2 з більшою афінністю, ніж з НЕКЗ.
Антипроліферативна активність відносно клітин раку молочної залози з ампліфікованим
НЕН2г
ЛМТ-1 в м'якому агарі
Досліджували ефективність РВ3448 і РВ4188 відносно інгібування росту стійких до трастузумабу клітин ДУІМТ-1 в м'якому агарі. Для даної мети підготовляли 96-ямкові планшети для суспензійних культур клітин. Наливали та залишали для отвердіння 100 мкл м'якого агару для отримання шару на дні (кінцева концентрація 0,6 95 у повному середовищі). Потім зверху додавали 50 мкл м'якого агару для отримання верхнього шару (кінцева концентрація 0,4 95), що містить 10000 клітин ЛІМТ-1/ямку, отвердівали і такі 96-ямкові планшети інкубували протягом ночі при 37"С, 10 95 002. Наступного дня додавали антитіло негативного контролю, пертузумаб ж трастузумаб (1:11 в об'ємному відношенні), РВ3448 і РВ4188 в середовищі ЮОМЕМ у напівлогарифмічних розведеннях з концентраціями в діапазоні 10-0,003 мкг/мл. Потім планшети інкубували в інкубаторах для культур клітин протягом 8 днів. Нарешті, клітини інкубували з
АІатаг ВіІсе протягом 3-5 год. при 37 "С і визначали інтенсивність флуоресценції (збудження: 560 нм; випущення: 590 нм). Представлений приклад дозозалежного інгібування проліферації
ЛМТ-1 антитілами РВЗ448 і РВ4188 (фігура 8).
ВТ-474 і БКВЕ-3 в матригелі
Досліджували ефективність РВ3448 і РВ4188 відносно інгібування росту клітин ВТ-474 і клітин 5КВК-3. Клітини досліджували в компанії ОсеїЇо, розташованої в Лейдені, Нідерланди, яка вирощує клітини в тривимірному матригелі та використовує аналіз головних компонентів, щоб відрізнити необроблені клітини від оброблених клітин. 2000 клітин 5К-ВВ-3 або 2250 клітин
ВТ474 висіювали в 15 мкл матригелю на ямку в 384-ямковий планшет (Сгеїіпег 781091).
Наступного дня в культуральне середовище додавали напівлогарифмічні розведення антитіл в діапазоні концентрацій від 10 до 0,003 мкг/мл під час відсутності або у присутності 5 нг/мл НВО.
Тестовані антитіла включали антитіло негативного контролю, пертузумаб « трастузумаб (1:11 в об'ємному відношенні), РВЗ3448, РВ4188 і біспецифічне антитіло "два в одному" проти
ЕСЕАХНЕНЗ-МЕНО7945А. Додатково включали дозозалежне розведення НКО в якості позитивного контролю. Кожну дозу досліджували в чотирьох повторах. Клітини інкубували протягом 7 днів в інкубаторі для культур клітин при 37"С, 5 95 СО2. Потім клітини фіксували й актиновий цитоскелет клітин офарблювали фалоїдином, а ядра офарблювали барвником
Хехст. Потім одержували флуоресцентні зображення на разних рівнях гелю (серія зрізів за віссю 7) і сполучали отримані зображення. Вимірювали широкий спектр морфологічних ознак (всього 800). Для аналізу вибирали тільки ознаки, які відрізнялися при обробці середовищем і при обробці НКО. Ознаки, які були пов'язані з ростом, середня площа сфероїда та кількість ядер на сфероїд найбільше значимо відрізнялися при обробці середовищем і при обробці НАС.
Проводили як багатопараметричний, так й ооднопараметричний аналізи. Для однопараметричних вимірів виконували І-тести для порівняння обробки (НКС або антитілом) із середовищем. Визначали Р-значення для кожної точки. Аналіз головних компонентів (АГК), спосіб виявлення низькорозмірних комбінацій даних з високою розмірністю, на які доводиться більша частина варіабельності, застосовували відносно концентрацій антитіл для побудови графіків даних. На фігурі 9 продемонстрирований ефект комбінації пертузумаб « трастузумаб (171 в об'ємному відношенні), РВ3448 і РВ4188 у присутності НКО. Для обох ліній клітин раку молочної залози з ампліфікованим НЕКЗ2 виявили більше високу активність РВ4188 у порівнянні з комбінацією пертузумаб ї трастузумаб, РВ3448 й антитілом "два в одному" МЕНО7945А у присутності НКО.
Переважаюча антипроліферативна активність РВ4188 у присутності НКО відносно клітин раку молочної залози з ампліфікованим НЕК2
Активність РВ4188 у присутності 10 нг/мл НКО відносно 5КВА-3 і ВТ-474 порівнювали з такою у панелі антитіл НЕК2, НЕКЗ й їх комбінації. Аналіз проводили в матригелі, як описано вище, й аналізували морфологічні ознаки. На графіку з результатами АГК, представленому на 60 фігурі 1Оа, видні викликана НАС: проліферація та розгалуження/інвазія клітин 5КВЕК-3 в матригелі. На фігурі 106 показано, що антитіло РВ4188 може повністю обертати викликаний
НКО фенотип, тоді як комбінація вихідних моноклональних антитіл (РО3958-РО3178) не виявляє такої дії. Більше того, РВ4188 виявився набагато більш ефективним у порівнянні з усіма дослідженими антитілами проти НЕКЗ (фігура 10с). Крім того, комбінації окремих антитіл проти НЕКЗ з трастузумабом (сучасний стандарт лікування при метастатичному раку молочної залози (пВсС)) виявилися нездатні звернути викликаний НКО фенотип (фігура 104). Додавання трастузумабу до РВ4188 у присутності НКО зменшувало проліферацію та розгалуження/нвазію клітин ЗК-ВВ-3 у порівнянні з РВ4188, застосовуваним окремо (фігура 1О0е).
Переважаюча антипроліферативна активність РВ4188 відносно клітин раку шлунку з ампліфікованим НЕК у порівнянні з моноклональними антитілами до НЕКЗ і НЕКЗ.
Підвищена експресія МКО1-В1 являє собою ключовий механізм стійкості до націлених на
НЕКЗ способів лікування (УМізоп, 2012). Для того, щоб оцінити, чи буде підвищена експресія
МАСТІ-В1 перешкоджати антипроліферативній ефективності РВ4188, панель антитіл досліджували при концентрації НАС 100 нг/мл на лінії клітин раку шлунку М87 (з ампліфікованим НЕК2). Клітини М87 культивували в КРМІ 1640, доповненій 10 95 термоінактивованій ФБС. Для аналізу проліферації субконфлюентні культури клітин М87 промивали ФБР, трипсинізували й інактивували трипсин додаванням культурального середовища. Клітини промивали двічі великими об'ємами аналітичного середовища (середовища КРМІ 1640, що містить 0,05 95 БСА та 10 мкг/мл голотрансферину). Антитіла розводили з одержанням напівлогарифмічних розведень з концентраціями від 1 до 0,0001 мкг/мл. Клітини додавали при щільності 10000 клітин/ямку у присутності 100 нг/мл кінцевої концентрації НКО. Клітини культивували протягом З днів при 37"С, 5595 СО2, при відносній вологості 95 95. Додавали АЇатаг Вісе"М (Іпийгодеп), дотримуючись інструкцій виробника, й інкубували протягом б годин при 37"С, 5595 СО2, при відносній вологості 95 95 у темряві.
Вимірювали флуоресценцію при довжині хвилі збудження 550 нм і довжині хвилі випущення 590 нм. Показали переважаючу активність РВ4188 у порівнянні з такою в моноклональних антитіл проти НЕКЗ2 або проти НЕКЗ (фігура 11).
Біспецифічні антитіла проти НЕК2ХНЕКЗ викликають АЗКЦ
Активність АЗКЦ являє собою важливий механізм протипухлинної дії терапевтичних антитіл при раку. Моноклональні антитіла людини, націлені на рецептори сімейства НЕК, такі як цетуксимаб і трастузумаб, викликають АЗКЦ. Вихідну та посилену активність АЗКЦ антитіл
РВ4188 і РВ3448 визначали в затвердженому аналізі АЗКЦ іп мійго. Трастузумаб й антитіло негативного контролю включили в даний експеримент в якості контрольних антитіл. Зі здорових донорів одержували цільну кров і фракції МКПК. Кожне антитіло досліджували на клітинах- мішенях, експресуючих високі рівні НЕК2 (5К-ВВ-3) і низькі рівні НЕК2 (МСЕ-7). Клітини -мішені навантажували 5'Стг (АптегзПпат) й опсонізували із застосуванням вказаних концентрацій антитіла. Цільну кров або фракцію МКПК використовували в якості ефекторних клітин в реакції в об'ємі 200 мкл в КРМІ 1640-10 95 термоінактивованій ЕТС. Клітини спільно інкубували протягом 4 год. й оцінювали лізис шляхом вимірювання радіоактивності в супернатанті, застосовуючи гамма-сцинтилятор. Відсоток специфічного лізису розраховували, як описано далі: (експериментальне значення імп/хв - вихідне значення імп/хв)Хмаксимальне значення імп/хв - вихідне значення імп/хв)х100, при цьому максимальний лізис визначали у присутності 5 95 Поп
Х-100, а вихідний лізис - у відсутності антитіла й ефекторів. На фігурі 12 показано, що біспецифічне антитіло РВЗ3448 виявило активність АЗКЦ, подібну з такою в комбінації пертузумаб т трастузумаб. Біспецифічне антитіло РВ4188 виявилося ефективним при високих концентраціях антитіла (10 мкг/мл).
Біспецифічні антитіла проти НЕК2ХНЕКЗ продемонстрували більше високу АЗКЦ у порівнянні з комбінацією вихідних антитіл
У відмінній моделі експерименту за АЗКЦ використовували репортерний біоаналіз АЗКЦ -
АрсСсС Керопег Віоаззау (Рготеда). У даному біоаналізі використовували сконструйовані клітини Уигкаї, стабільно експресуючі рецептор ЕсуКПШа, варіант М158 (висока афінність) або
Е158 (низька афінність), й елемент відгуку МЕАТ, що запускає експресію люциферази світлячка.
Підтверджували правильність аналізу шляхом порівняння результатів, отриманих у репортерному біоаналізі АЗКЦ, з результатами, отриманими в класичному аналізі вивільнення 51Сг. Дані аналізи АЗКЦ проводили, застосовуючи набір АОСС Віоаззау від Рготеда, в 384- ямкових планшетах з білими ямками. В даній моделі експерименту клітини ЗКВК-3 висіювали при щільності 1000 клітин/'ямку в ЗО мкл аналітичного середовища (КРМІ з 4 95 сироватки з низьким вмістом Ідс) за 20 - 24 год. до проведения біоаналізу. Наступного дня культуральне середовище видаляли. Потім одержували в двох повторах серійне розведення антитіла РВ4188 60 і вихідних антитіл РО3958 проти НЕК2 і РОЗ178 проти НЕКЗ, а також їх комбінації. В ямки додавали по 10 мкл розведень антитіл. Вихідна концентрація антитіла становила 10 мкг/мл, й одержували 10-точкові напівлогарифмічні серійні розведення для побудови повної кривої залежності доза-відповідь. Нарешті, додавали 5 мкл ефекторних клітин з набору АОСС Віоаззау (15000 клітин/ямку, М158). Клітини інкубували протягом 6Н при 37 "С. Потім додавали 15 мкл субстрату для люциферази ВІО-Сіо та через 5 хвилин детектували люмінесценцію в спектрофотометрі для прочитання планшетів. Отримані результати показані на фігурі 13. У біспецифічних антитіл проти НЕК2ХНЕКЗ РВ4188 виявили більше високоефективну АЗКЦ у порівнянні з вихідними моноклональними антитілами до НЕК?2 і НЕКЗ або їх комбінацією.
Посилення АЗКЦ при застосуванні РВ4188
Активність АЗКЦ можна підсилити за допомогою різних методик, однією з яких є видалення фукози. Видалення фукози призводило до підвищеної протипухлинної активності в декількох моделях іп мімо ШипіШа, 2010). Для максимізації активності РВ4188 застосовували технологію дефукозилювання (Спепуд Їіш й Апагеїа ее. АЮОСС Епрапсетепі ТесПппоІодіез бог Мехі
Сепегаййоп ТНегарешіс Апіїроду. Апіїбсоду ІШегарешісв-Тгепавз іп Віо/Рнаптасеціїса! Іпаизіту 2009 (13-17), яка дозволяла запобігти фукозилювання М-зв'язаної вуглеводної структури в Ес- області. Ефективність АЗКЦ дефукозильованого РВ4188 у порівнянні з такою у РВ4188 дикого типу визначали в аналізі АЗКЦ з вивільненням 2'Сг, застосовуючи експресуючі низькі рівні НЕК2 клітини (МСЕ-7) і клітини з ампліфікованим НЕКЗ2 (5К-ВВ8-3). Обидва антитіла використовували у вигляді серійних розведень та включали в аналіз антитіло негативного контролю та трастузумаб. На фігурі 14 показане підвищення ефективності АЗКЦ при застосуванні дефукозильованого РВ4188 у порівнянні з його варіантом дикого типу та/або трастузумабом в клітинах як з високими, так і з низькими рівнями експресії НЕК2.
Дефукозильоване РВ4188 виявило підвищену активність АЗКЦ у присутності низькоафінних рецепторів ЕсукШа
Активність дефукозильованого РВ4188 досліджували на репортерних клітинах АЗКЦ, що містять або варіант рецептора ЕсукКШа М158 (висока афінність), або варіант рецептора ЕсукШа
Е158 (низька афінність). Серійні титри антитіл, тобто, контрольного антитіла, трастузумабу та дефукозильованого РВ4188, додавали в комбінації з репортерними клітинами АЗКЦ, які несуть різні варіанти ЕсукІШа, до прикріплених до субстрату клітин 5К-ВНА-3. Активність АЗКЦ вимірювали шляхом вимірювання активності люциферази. Дефукозильоване РВ4188 виявило активність, рівну такій у трастузумабу, в комбінації з високоафінним варіантом М158 рецептора
ЕсукПШа. Напроти, дефукозильоване РВ4188 виявило підвищену активність АЗКЦ у порівнянні з такою у трастузумабу, в комбінації з низькоафінним варіантом Е158 рецептора ЕсукКПа (фігура 15).
Дослідження з ксенотрансплантатами ЛІМТ-1
Клітини карциноми молочної залози людини «ДІМТ-1 ростили в ОМЕМ, що містить 10 95 фетальну бичачу сироватку, 100 одиниць/мл натрієвої солі пеніциліну С, 100 мкг/мл сульфату стрептоміцину, 25 мкг/мл гентаміцину та 2 мМ глутаміну, до моменту імплантації. В день імплантації клітини молочної залози ЛІМТ-1 збирали під час логарифмічної фази росту та ресуспендували у холодному ФБР. Вік самок мишей СВ.17 5СІО (СНагіез Кімег) становив 8 тижнів на 1 день дослідження, і маса тіла була в діапазоні від 16,5 до 20,7 г. Кожній миші вводили шляхом підшкірної ін'єкції у правий бік 5х10924 пухлинних клітин (0,2 мл суспензії клітин).
Пухлини вимірювали штангенциркулем в двох вимірах, щоб відслідковувати розмір за середнім об'ємом пухлини, двічі на тиждень. Після досягнення пухлинами розміру приблизно 100-150 мм3, тварин включали в дослідження ефективності. Тварин зі значеннями, що різко відхиляються, об'єму пухлини виключали, і мишей довільно розподіляли за групами по 10 мишей в кожній. Мишам вводили шляхом ін'єкції раз на тиждень (антитіло) або раз на день (лапатиніб) протягом періоду, що становить чотири тижні. Докладна інформація про групи лікування представлена в таблиці 11.
Розміри пухлин вимірювали щотижня за допомогою штангенциркуля. В дослідженні ефективності виявили, що РВ4188 в обох схемах введення доз було однаково ефективним і більш ефективним, ніж лапатиніб або комбінація пертузумабу та трастузумабу. Результати представлені на фігурах 17 і 18.
РВ4188 може долати опосередковану НКО стійкість.
Підвищена експресія МКО1-В1 являє собою ключовий механізм стійкості до націлених на
НЕК2 способів лікування (УмМівоп, 2012). РВ4188 досліджували у порівнянні з вихідним моноклональним антитілом проти НЕКЗ РОЗ178 в серійних розведеннях у присутності зростаючих концентрацій НКС (МАСТ1-В1 ЕСЕ). Для даної мети клітини М87 культивували в
КРМІ 1640, доповненій 1095 термоінактивованій ФБС. Для аналізу проліферації 60 субконфлюентні культури клітин М87 промивали ФБР, трипсинізували й інактивували трипсин додаванням культурального середовища. Клітини промивали двічі великими об'ємами аналітичного середовища (серед КРМІ 1640, що містить 0,0595 БСА та 10 мкг/мл голотрансферину). Антитіла розводили з одержанням напівлогарифмічних розведень з концентраціями в діапазоні від 1 до 0,0001 мкг/мл. Клітини додавали при щільності 10000 клітин/ямку у присутності зростаючих концентрацій НКО (0,04-39,5 НМ). Клітини культивували протягом З днів при 37"С, 5595 СО2, при відносній вологості 95 95. Додавали АІатаг Віпетм (Іпийгодеп), дотримуючись інструкцій виробника, й інкубували протягом 6 годин при 37"С, 5 95
СО2, при відносній вологості 9595 у темряві. Вимірювали флуоресценцію при довжині хвилі збудження 550 нм і довжині хвилі випущення 590 нм. Показали переважаючу активність РВ4188 у порівнянні з такою у вихідного моноклонального антитіла проти НЕКЗ (фігура 19).
Отже, у випадку механізму вислизання, такого як, наприклад, підвищена експресія МКО1-Д1, біспецифічне антитіло згідно з даним винаходом є переважним.
Картування епітопів специфічних до НЕК2/НЕКЗ ІдО
Експерименти з мутагенезу методом дробовика
Аланін-скануючий мутагенез застосовували для картування епітопів РОЗ3958 і РОЗ178 до
НЕК і, відповідно, НЕКЗ. При мутагенезі методом дробовика одержували клони, в яких кожний амінокислотний залишок позаклітинного домену НЕК2/НЕКЗ (ВКД) замінений на аланін. Потім одержували ряд клітин шляхом зворотньої трансфекції (патент О52011/0077163А1). Для цього
ДНК кожного клону змішували з ліпофектаміном і поміщали отриману суміш у заздалегідь визначену ямку 384-ямкового планшета. Клітини НЕК293Т додавали в кожну ямку та через 24 год. вимірювали експресію білка. Потім вимірювали реакційну здатність антитіл шляхом імунофлуоресцентного фарбування, яке дозволяло картирувати зв'язування й ідентифікувати залишки, що мають вирішальне значення для зв'язування антитіла. Рівні експресії конструкцій
ВКД НЕК? ії НЕКЗ перевіряли за допомогою аналізу БАС5, застосовуючи доступні для придбання моноклональні антитіла (МАТ 1129 (НЕКЗ2) від КО і МАТ 66223 (НЕКЗ) від КУ).
НЕН2г
Зв'язування моновалентного аб РіЗ3958 з мутантними ВКД НЕКЗ2 досліджували в аналізі при концентрації 0,25 мкг/мл, і використовували суворі умови промивання (рН 9,0, 350 мМ
Масі). Це дозволило ідентифікувати три залишки, "що мають вирішальне значення" (Т144,
К166, К181), в НЕК2, для яких виявили менше 35 95 остаточного зв'язування ар РОЗ3958 відносно НЕК2 ДТ, при цьому зберігалося зв'язування контрольного МАТ. Для двох залишків (Р172, С179), які розташовані поблизу залишків, що мають вирішальне значення, в структурі
НЕКЗ2 виявили значиме, але менше виражене зниження зв'язування та назвали їх "що мають вторинне значення" залишками (таблиця 13 і фігура 21А). Всі дані виставлені на поверхню залишки розташовані в домені | НЕК2, і разом вони утворюють переривчастий епітоп на поверхні молекули НЕК.
Експерименти для підтвердження епітопу НЕК2
Конструкції, що кодують ВКД НЕКЗ дикого типу (ДТ) та варіанти ВКД НЕКЗ2, перераховані в таблиці 13, експресували в клітинах СНО-К1. Три залишки домену І, які виставлені на поверхню та в структурі перебувають поруч із певними, що мають вирішальне значення залишками, вибирали для додаткового аналізу. В конструкцію ВКД НЕКЗ вводили точкові мутації Т164, 5180 і 0143, здійснюючи заміну на тирозин, й отримані в результаті цього конструкції також експресували в СНО-К1. Варіант /159А ВКД НЕКЗ2 експресували в клітинах СНО-КІ1 в якості контрольного зразка.
Досліджували зв'язування біспецифічного антитіла РОЗ958хХТТ з варіантами ВКД в експерименті ЕАС5 з титруванням. Антитіло проти НЕК2 трастузумаб, яке зв'язує домен ЇМ
НЕК2, використовували для підтвердження експресії ВКД НЕКЗ2 на поверхні клітини. Середні значення МЕЇ наносили на графік і для кожної кривої розраховували площу під кривою, застосовуючи програмне забезпечення СтарпРай Ріізт 5. Зв'язування НЕК2 ДТ використовували для нормування даних. Результати аналізу ЕАС5 показали, що, додатково до
Т144Д, КІббА, К181А, Р172А, О179А, мутації Т164М і 5180 призводили до значимого зниження зв'язування антитіла РОЗ3З958хТТ (фігура 22). Мутація 0143 призводила до різко вираженого зниження експресії, про що свідчило зниження зв'язування контрольного МАТ, отже, його потенційну роль в епітопі РОЗ3958 неможливо визначити.
НЕВНЗ
Аналіз методом ЕАС5 зв'язування до РОЗ178 при концентрації 0,25 мкг/мл з мутантними
ВКД НЕКЗ призвів до ідентифікації двох так званих "що мають вирішальне значення" залишків (Е409, К426), заміна яких на аланін викликала значне зниження зв'язування у порівнянні з НЕКЗ
ДТ, при цьому зберігалося зв'язування контрольного МАТ (таблиця 14 і фігура 23). Обидва 60 залишки розташовані в домені І НЕКЗ і просторово віддалені. Більше того, Е409 перебуває всередині гідрофобного ядра НЕКЗ, що робить малоймовірним його участь в утворенні епітопу
РОЗ178.
Експерименти для підтвердження епітопу НЕКЗ.
Клітини СНО-К1 трансфікували конструкціями з мутаціями ВКД НЕКЗ (перерахованими в таблиці 14), ВКД НЕКЗ ДТ і двома контрольними конструкціями (Н407А і У424А). Зв'язування
РОЗ178 з варіантами ВКД НЕКЗ досліджували в експерименті РАС5 з титруванням. Два контрольні антитіла, зв'язуючий домен І (ММ-121) і домен Ії (МЕНО7945А) НЕКЗ включали для підтвердження експресії ВКД НЕКЗ на поверхні клітини. Середні значення МР наносили на графік і для кожної кривої розраховували площу під кривою, застосовуючи програмне забезпечення СгарнРаай Ргізт 5. Зв'язування НЕКЗ ДТ використовували для нормування даних.
Показали, що мутація К42б6А має вирішальне значення для зв'язування РОЗ178, тоді як зв'язування з Е409А неможливо підтвердити внаслідок втрати експресії на поверхні клітини (фігура 24).
Активність РВ4188 на кардіоміоцитах іп міїго.
НЕКЗ приймає участь в рості, репарації та виживаності кардіоміоцитів дорослих як частина сигнальної мережі, яка включає комплекс рецепторів херегуліну НЕК2:НЕКА. Кардіотоксичність являє собою відомий фактор ризику при націлюванні на НЕК2, і частота ускладнень підвищується, коли трастузумаб застосовують в комбінації з антрациклінами, тим самим викликаючи серцевий стрес. Для дослідження потенційної токсичності РВА4188 і порівняння його з трастузумабом і комбінацією трастузумабу та пертузумабу у присутності антрацикліну доксорубіцину застосовували модельну систему, засновану на отриманих зі стовбурових клітин людини кардіоміоцитах. Отримані зі стовбурових клітин людини кардіоміоцити (Ріигіотісв ВМ) висіювали при концентрації 20000 клітин на ямку у білі аналітичні планшети з плоским дном (Соппіпд 655098). В день 5 культивування середовище заміняли на культуральне середовище, що не містить глюкозу та галактозу, доповнене 10 нг/мл НКО. В день 7 додавали тестовані антитіла в комбінації з доксорубіцином (3 мкМ). Життєздатність клітин оцінювали в день 9, застосовуючи аналіз СеПТег-СіІо від Рготеда. Моноспецифічні антитіла досліджували в одній концентрації 68 нМ, тоді як РВ4188 досліджували в трьох концентраціях у присутності З мкм доксорубіцину. На фігурі 25 показано, що жодна досліджена концентрація РВ4188 не впливала на життєздатність кардіоміоцитів. Напроти, як трастузумаб, так і комбінація трастузумабу та пертузумабу знижували життєздатність кардіоміоцитів.
Зв'язування РВ4188 з клітинами, які вміщують різні рівні НЕК2.
Зв'язування РВ4188 у порівнянні з таким для трастузумабу й антитіла проти НЕКЗ 01-59 аналізували за допомогою ЕБАС5 на лініях клітин раку молочної залози та раку шлунку, експресуючих різні рівні НЕК2. Клітини вважали НЕК2----, якщо вони експресували мільйони копій НЕКЗ і/або містили ампліфікований ген НЕК2. Використовували наступні лінії клітин: МСЕ - 7 (НЕЯВ 2 -); МОА-МВ-468 (НЕН2 «з, МКМ-45 (НЕН2 -), МОА-МВ-175 (НЕН2г-), МОА-МВ-453 (НЕН2 -ч-), МОА-МВ-361(НЕН2 4-5), 28-75-1(НЕН2 ---), УМТ-1 (НЕН2--н-),. ВТ-474 (НЕНг-ч---),
ЗКВА-3 (НЕН2----), 5К-О0У-3 (НЕК2--, М87 (НЕК2----). Клітини культури у фазі експонентного росту збирали із застосуванням трипсину та розводили до 1052 клітин/мл у буфері для ЕАС5 (ФБР/О,5 96БСА/0,5 мМ ЕДТА). 1-2х107 клітин додавали в кожну ямку 96б-ямкового планшета з округленим дном ямок. Клітини центрифугували протягом 2 хвилин при 300 д при 4"Сб. Супернатант відкидали шляхом перевертання планшета(-ів) з наступним однократним струшуванням. Додавали по 50 мкл кожного зразка до в серійному розведенні від 3,16 нг/мл до 10 мкг/мл й інкубували протягом 1 год. на льоді. Клітини однократно центрифугували, супернатант видаляли і клітини промивали двічі буфером для ЕБАС5. Додавали 50 мкл розведеного 1:100 антитіла миші проти (390 гамма людини, кон'югованого з РЕ (Іпмігодеп), й інкубували протягом 30-60 хвилин на льоді у темряві. Клітини однократно центрифугували, супернатант видаляли і клітини промивали двічі буфером для ЕАС5. Клітини аналізували на проточному цитометрі ЕАаАС5Сапіо з встановленим модулем НТЗ. Кількість пов'язаного антитіла оцінювали за серединним значенням флуоресценції. Результати наносили на графік і визначали площу під кривою (АОС - сукупна оцінка серединного значення інтенсивності флуоресценції) для кожного антитіла в кожній дослідженій лінії клітин (фігура 26).
На підставі даного експеримента зробили висновок, що РВ4188 з більше високою афінністю зв'язується з клітинами НЕК2--, клітинами НЕКи- і клітинами НЕК». у порівнянні з трастузумабом.
Одночасне зв'язування з трастузумабом
РВА188 і трастузумаб не конкурують за зв'язування з НЕК2.
РВ4А188 зв'язує домен І білка НЕК, тоді як епітоп зв'язування трастузумабу локалізований в 60 домені ІМ. Для того, щоб продемонструвати, що обидва антитіла не конкурують за зв'язування
НЕК2, проводили аналіз зв'язування з клітинами молочної залози 5КВК-3 з ампліфікацією
НЕК2. Спочатку неміченому антитілу дозволяли зв'язатися з 5КВК-3 в насичуючих концентраціях. Потім додавали мічене РІТС РВ4188 в діапазоні титрів і вимірювали флуоресценцію за допомогою ЕАСЗ5. На фігурі 27 продемонстровано, що РВ4188172 зв'язувався однаково ефективно з клітинами у присутності трастузумабу або негативного контролю.
Попередня інкубація клітин ЗКВВА-3 з РВ4188 запобігала зв'язуванню РВ4188И17с, Таким чином, трастузумаб і РВ4188 не конкурують за зв'язування з НЕК2.
Зв'язування домену І НЕК2 біспецифічною молекулою проти НЕК2ХНЕКЗ дозволяє подолати херегулінову резистентність.
Для того, щоб перевірити, чи є переважним орієнтування РВ4188 на димер НЕК2ХНЕКЗ для інгібування проліферації клітин в умовах стресу НКО, одержували біспецифічні антитіла, які складаються з плеча НЕКЗ і плечей НЕКЗ2 3178, націлених на будь-який з доменів І, ІЇ, І або ІМ.
Одержували по два біспецифічних антитіла проти НЕК2ХНЕКЗ до кожного з доменів І-ІМ НЕН2.
Плечі НЕК2 включали: МЕ3958 і МЕЗ003, націлені на домен І; МЕ2889 і МЕ2913, націлені на домен Ії; МЕ1847 і МЕЗ0ОО1, націлені на домен ПІ, ії МЕ1849 і МЕ1898, націлені на домен ІМ.
Кожне плече Раб до НЕК2 комбінували з плечем Бар до НЕКЗ 3178 і досліджували їх ефективність відносно інгібування проліферації клітин у присутності високих концентрацій херегуліну. Титри антитіл тестували на експресуючих низькі рівні НЕК2 клітинах МОСЕ-7 й експресуючих підвищені рівні НЕК2 клітинах М87 і 5К-В8-3. Субконфлюентні культури клітин
М87, 5К-В8-3 і МСЕ-7 промивали ФБР, трипсинізували й інактивували трипсин додаванням культурального середовища. Клітини промивали двічі великими об'ємами аналітичного середовища (серед КРМІ 1640, що містить 0,05 95 БСА і 10 мкг/мл голотрансферину). Антитіла розводили з одержанням напівлогарифмічних розведень. Клітини додавали при щільності 10000 клітин/ямку (М87, 5КВ-ВВ-3) і 5000 клітин/ямку (МСЕ-7) у присутності визначеної в експерименті викликаючої стрес концентрації НКО (10 нМ для 5К-ВІА-3, 100 нМ для М87 і МСЕ-7). Клітини культивували протягом 3-4 днів при 37", 5595 СО2, при відносній вологості 95 95. Додавали
Аіатаг Віше"М (Іпийгодеп), щоб оцінити проліферацію. Поглинання вимірювали при довжині хвилі збудження 550 нм і довжині хвилі випущення 590 нм. У всіх проведених дослідженнях тільки біспецифічні антитіла, націлені на домен І НЕК2, були здатні інгібувати проліферацію у присутності високої концентрації херегуліну (фігура 28).
Комбінації лікарських засобів із РВ4188 іп міїго.
Для дослідження можливості комбінування РВ4188 з низькомолекулярними лікарськими засобами, РВ4188 комбінували з лікарськими засобами, що перешкоджають на різних рівнях сигнальному шляху РІЗК або МАРК. Більше того, досліджували комбінацію з хіміотерапевтичними засобами й інгібіторами циклінів. Комбінації тестували на клітинах з підвищеною експресією НЕК2, що ростуть у присутності НКО в матригелі (5К-ВА-3 і ВТ-474) або у присутності концентрацій НКС, викликаючих стрес (М87 і 5К-ВВ-3, як описано в аналізі проліферації). Інгібіторний ефект комбінацій лікарських засобів досліджували шляхом візуалізації або шляхом вимірювання рівня проліферації із застосуванням АїЇатаг Вінє, як описано раніше у даній заявці. Спочатку визначали ЕС20 РВ4188 і досліджуваних лікарських засобів. Потім проводили титрування у шаховому порядку РВ4188 і лікарських засобів. У всіх досліджених лініях клітин спостерігали синергію з інгібіторами тирозинкіназ (афатинібом, лапатинібом, нератинібом), інгібітором РІЗКа ВУ 719, інгібітором АК МК-2206, інгібітором тТОК еверолімусом, інгібітором бгс саракатинібом, руйнуючим мікротрубочки лікарським засобом паклітакселом й інгібітором НОАС вориностатом (який написаний з помилкою на фігурі 40 як "вороністат"). На фігурі 29 показаний приклад синергічної комбінації РВ4188 з лапатинібом на клітинах 5КВКЕ-3, які ростили в матригелі, яка призвела до морфологічних змін і зниження росту клітин. Розраховували ступінь інгібування росту, отриманого для кожної комбінації.
Зрушення ефективності можна показати за допомогою ізоболограм (Сгесо й ін. 1995), на яких показано, наскільки менша кількість лікарського засобу потрібна в комбінації для досягнення бажаного рівня у порівнянні з кількістю окремого агента, необхідним для досягнення даного ефекту. Значення інгібування, отримані в експериментах з комбінуванням, використовували у програмному забезпеченні Апаїугег від СНАГІСЕ М для отримання ізоболограм. Ізоболограми різних комбінацій лікарських засобів, досліджених на клітинах з ампліфікованим НЕКЗ2, представлені на фігурі 40. Аналіз ізоболограм показав, що РВ4188 виявило синергічну дію в комбінації з лікарським засобом афатинібом, лапатинібом, нератинібом, ВУ 719, МК-2206, еверолімусом, саракатинібом, вориностатом і паклітакселом. Дані результати демонструють, що лікарські засоби, які впливають на шлях РІЗК, особливо ефективні в комбінації з РВ4188.
Крім того, ефективні комбінації з інгібіторами тирозинкіназ. Більше того, комбінація з лікарським 60 засобом, що перешкоджає росту та міграції/нвазії, саракатинібом може виявитися переважною в умовах метастазування.
Інгібування фосфорилювання іп міїго антитілом РВ4188
Збирали клітини з культури в експонентній фазі росту та висіювали в б-ямкові планшети (3,75х105 клітин для М87 і 1,5х109 клітин для ЗКВЕ-3) в середовище для голодування клітин (клітини М87: КРМІ-1640, 0,05 95 БСА, 10 мкг/мл голотрансферину; клітини зЗКВК-3: ОМЕМ/Н-12, 2 ММ -глутамін, 0,05 95 БСА, 10 мкг/мл голотрансферину) й інкубували протягом ночі при 37"С, 590 СО2, при відносній вологості 95 95. На наступний день, додавали антитіла до кінцевої концентрації 5 нМ й інкубували клітини протягом однієї години при 37"С, 5 956 СО2, при відносній вологості 95 95. Потім додавали НКО до кінцевої концентрації 100 нг/мл. Через 1, 3, 6 або 24 години при 37"С, 5595 СО2, при відносній вологості 95 95 планшети поміщали на лід, клітини промивали двічі холодним ФБР. Потім додавали 0,3 мл льодяного лізуючого буфера (СеїЇ зідпаїйпдуд КТК Мо 9803 або ІС Мо 7018) та клітини лізували протягом мінімум 30 хвилин на льоді.
Далі вимірювали концентрації білків, застосовуючи ВСА (Рієгсе Мо23235). Концентрації білка доводили до 2 мг/мл за допомогою лізуючого буфера. Потім лізати тестували в аналізах
Раїй5сап ВТК 5ідпаїїпу Апіїбсау Аттау (Сеї! зідпаїїпуд Мео7949) або Раї5сап ІпігасеїІшаг Зідпаїїпа
Агтау. Всі етапи інкубації проводили із запечатаними ямками на орбітальному шейкері при кімнатній температурі. Лізати (75 мкл) розводили в 2 рази до концентрації 0,8 мг/мл 75 мкл буфера для розведення Атгтау Ойшнепі Вийег, доповненого коктейлем інгібіторів протеаз, і тримали на льоді. Ямки для тестування блокували 100 мкл блокуючого буфера Аттау Віоск
Вийег протягом 15 хвилин. Блокуючий буфер видаляли, лізати поміщали в ямки та залишали інкубуватися протягом 2 годин. Лізат аспірували й ямки промивали 4 рази 100 мкл буфера для промивання. Потім додавали по 100 мкл коктейля детектуючих антитіл в кожну ямку й інкубували протягом 1 години. Коктейль антитіл аспірували й ямки промивали 4 рази 100 мкл буфера для промивання. В кожну ямку додавали 75 мкл стрептавідину БуїїднівоМ,
Стрептавідин СуїїдніВО М аспірували й ямки промивали 4 рази 100 мкл буфера для промивання.
Багатоямковий ущільнювач видаляли та предметне скло промивали протягом 10 секунд 10 мл деіонізованої води. Предметному склу дозволяли висохнути й обробляли для візуалізації на
ОдузеефСіх. Інтенсивність флуоресценції плям розраховували, застосовуючи програмне забезпечення Ітаде 5іцаїо.
В клітинах М87 і ЗКВК-3 РВ4188 повністю блокувало фосфорилювання АКІ протягом перших 6 год. інкубації, на противагу комбінації трастузумаб ї- пертузумаб. До того ж, спостерігали сильне інгібування фосфорилювання ЕКК і 56 на противагу комбінації трастузумаб «з пертузумаб. РВ4188 не інгібувало фосфорилювання НЕК?З (фігура 30)
Аналізи методом вестерн-блот
Для підтвердження інгібування фосфорилювання, спостережуваного в тестах КТК і внутрішньоклітинного Раїйзсап, проводили аналізи методом вестерн-блот клітин, оброблених
РВ4188, комбінацією пертузумабу та трастузумабу, і контрольним антитілом у присутності викликаючих стрес концентрацій НКО. Збирали клітини культури в експоненціальній фазі росту та висіювали в чашки діаметром 10 см (20х105 клітин для М87 і 7х109 клітин для 5КВЕ-3) в середовище для голодування клітин (клітини М87: ВРМІ-1640, 0,0595 БСА, 10 мкг/мл голотрансферину; клітини 5КВАК-3: ОМЕМ/Е-12, 2 мМ І-глутамін, 0,0595 БСА, 10 мкг/мл голотрансферину). На наступний день додавали антитіла до кінцевої концентрації 5 НМ й інкубували клітини протягом однієї години. Потім додавали НКС до кінцевої концентрації 100 нг/мл. Через 1, 3, 6 або 24 години чашки поміщали на лід, клітини промивали двічі холодним
ФБР, переносили у пробірки Еррепабогі і лізували за допомогою 250 мкл лізуючого буфера КІРА (20 мМ Трис-НСЇІ рн 7,5, 150 мМ Масі, 1 мм МагЕДТА, 1 мм етиленглікольтетраоцтова кислота (ЕГТА), 1 95 МР-40, 1 95 дезоксихолату натрію, 0,1 96 ДСН, 2,5 мМ пірофосфат натрію, 1 мМ бета-гліцерофосфат, 1 мм Мазу(о4, 1 мкг/мл леупептину). Лізису дозволяли тривати протягом 30 хвилин на льоді. Лізати клітин центрифугували та збирали супернатанти у нові пробірки
Еррепадогї. Концентрацію білка визначали, застосовуючи спосіб ВСА (Ріегсе). 30 мкг лізату розділяли на 4-12 95 гелі Вів-Тіз МиРаде (Іпуйгодеп) і білки переносили з геля на нітроцелюлозну мембрану. Мембрани блокували протягом однієї години у буфері ТБСТ, що містить 5 95 БСА, й офарблювали вказаними антитілами згідно з інструкціями виробника (СеїЇ 5ідпаїїпд ТесппоЇоду). Мембрани потім інкубували з кон'югованим з НКР вторинним антитілом, інкубували з субстратом ЕХЛ (ЕСІ) і піддавали авторадіографії, використовуючи рентгенівські плівки (АтегеПат). Всі детектуючі антитіла одержували від Сеї! Зідпаїїпуд ТесппоЇоду: Рпозрпо-
АКІ (зег 473) Мо4060, Тоїа! АК Мо4691, Рпозрпо-НЕКЗ2 (Туг 1221/1222) Мо2243, Тоїа! НЕН2
Мо2242, Рпозрпо-НЕКЗ (Туг 1289) Мо4791, Тоїа! НЕКЗ Мо4754, Рпозрпо-ЕВНКТ/2 (Тпиг 202/Туг 204)
Мо4377, Тоїа! ЕКК1/2 Мо4695, Рпозрпо-56 КР (Зег 235/236) Мо2211, Тога! 56 КР Мо2217, антитіло 60 кози проти антитіл кролика, кон'юговане з НКР, Мо7074.
Отримані результати показали, що РВ4188 викликав тривале інгібування фосфорилювання
НЕКЗ, що призводить до інгібування обох сигнальних шляхів МАРК і РІЗ-кінази з вираженим ефектом інгібування фосфорилювання АКІ (фігура 31).
Фармакодинаміка РВА188 іп мімо
Аналіз фосфопротеїнів за допомогою І итіпех.
Пухлини (100 мм?) мишей, яким трансплантували ЛІМТ-1 й яких лікували 2 дозами РВА188 і 4 дозами РВ4188, видаляли через 24 год. після введення доз. Пухлини піддавали швидкому заморожуванню та переробляли з одержанням порошку. Лізати пухлини одержували в концентрації 50 мг пухлини/мл, додаючи холодний лізуючий буфер ВіоКай (доповнений 0,4 95 фактора 1 ВіоКаоє, 0,2 95 фактора 2 ВіоКає і 2 мм фенілметилсульфонілфторидом (ФМСФ)) до замороженого порошку зразків, інкубували при 4 С на качалці протягом 60 хвилин, щоб гарантувати повний лізис. Зразки центрифугували при 4 "С протягом 10 хвилин при 16000х д і розділяли на аліквоти. Загальну кількість білка визначали, застосовуючи реагенти Віогаа ОС
Ргоїєїп Аззау, відповідно з інструкціями виробника. Аналіз І итіпех. Зразки лізату пухлини ОІМТ- 1 обробляли й аналізували присутність в них: загального АКТ, АКТ(Зег473) і АКТ(ТНгЗ308), застосовуючи комерційно доступні набори І штіпех від Мійїроге (Мо в каталозі 48-618МАСЄ (Мо партії 2532050), 46-645МАС (Мо партії 46645М-1К)). Кожний зразок досліджували в двох повторах. Готували розведення в розріджувачі для зразків, щоб завантажити приблизно 25 мкг цільового білка на ямку, для визначення всіх загальних і фосфорильованих аналізованих речовин. Набори МійШіроге використовували відповідно до інструкцій виробника.
У пухлинах, які лікували РВ4188, виявили підвищену експресію АКІ у порівнянні з не підданими лікуванню пухлинами. РВ4188 повністю інгібувало фосфорилювання АКТ як після застосування двох доз на тиждень, так і після застосування чотирьох доз на тиждень (фігура 32).
Аналіз фосфопротеїнів за допомогою метода МегатТад.
Пухлини (100 мм? або 400 мм3) мишей, яким трансплантували ЛІМТ-1 й яких лікували 1 або 2 дозами РВ4188, видаляли та фіксували в 10 95 нейтральному забуференому формаліні. Мишей, що несуть пухлини об'ємом 100 мм", вбивали через 24 год. після разової дози РВА188 (25 мг/кг), тоді як миші, що несуть пухлини об'ємом 400 мм3, отримали 2 дози на тиждень в розмірі 25 мг/кг, й їх вбивали через 4 год. після введення доз. Потім зразки розміщували у парафіні.
Робили зрізи товщиною по 7 мкм за допомогою мікротома (І ЕІСА) та поміщали їх на позитивно заряджене предметне скло (МУК), підписане серійними номерами. Предметне скло сушили на повітрі протягом 30 хв, а потім прогрівали в нагрітій до 60 "С печі. Далі зразки обробляли для проведення різних аналізів МегаТад. Аналіз загального НЕКЗ (НТ) проводили згідно із заявкою на патент США Мо 12/340436, аналіз загального НЕКЗ (НЗТ) проводили згідно з патентом США
Мо 8349574; із заявкою на патент США Мо 2013/0071859, і нарешті, аналіз гетеродимера НЕК2-
НЕКЗ (Н2г30), НЕКЗру 1289 (НЗру 1289) і кінази НЕКЗ-РІЗ (НЗРІЗК) проводили згідно із заявкою на Міжнародний патент Ме РСТ/О52014/033208. В обох схемах введення доз було очевидно значиме опосередковане РВ4188 зменшення кількості димерів НЕК2:НЕКЗ у порівнянні з не підданими лікуванню контролями. Не спостерігали відмінності в кількості загального НЕК,
НЕКЗ або фосфорильованого НЕКЗ між пухлинами, які лікували РВ4188, і контролями. Для пухлин, які аналізували через 4 год. після введення дози РВ4188, продемонстрували значиме зменшення кількості НЕКЗ-резх (РІЗК) у порівнянні з не підданими лікуванню контролями.
РВ4188 пригнічувало просування за клітинним циклом стимульованих НКО ракових клітин
Здатність РВ4188 впливати на просування за клітинним циклом досліджували на лініях ракових клітин, експресуючих різні рівні білка НЕК2. НЕК2-- (МСЕ-7), НЕК2 ----- (клітини ОІМТ-1,
ЗК-ВВ-3 і М87) клітини висіювали в аналітичне середовище (клітини МСЕ-7: ВРМІ-1640, 0,05 95
БСА, 10 мкг/мл голотрансферину, 1 мМ пірувату натрію, розчин замінних амінокислот МЕМ
МЕАА; ЛМТ-1: ОМЕМ, 0,05 95 БСА, 10 мкг/мл голотрансферину; клітини 5К-ВА8-3: ОМЕМ/Е-12, 2
ММ -глутамін, 0,05 95 БСА, 10 мкг/мл голотрансферину; клітини М87: ВРМІ-1640, 0,05 95 БСА, 10 мкг/мл голотрансферину). В кожну ямку 24-ямкового планшета висіювали 300000 клітин
МСЕ-7, або 400000 клітин М87, або 150000 клітин 5К-ВВА-3, або 150000 клітин 2ІМТ-1 в 1 мл аналітичного середовища й інкубували протягом ночі при 37"С, 5595 СО2, при відносній вологості 95 95. На наступний день до клітин додавали РВА188, або пертузумаб « трастузумаб, або РОЗ3178, або РО1337 у присутності кінцевої концентрації НКО 1 або 100 нг/мл. Через 24 години (для клітин УМТ-1, М87 або 5К-ВВ8-3) або 48 годин (для клітин МСЕ-7) інкубації при 37"С, 595 002, при відносній вологості 95 95, до клітин додавали 5-етиніл-2'і-дезоксіуридин (ЕЧО, кінцева концентрація 10 мкМ) на 2 год., а потім збирали клітини й офарблювали для оцінювання вбудовування Ед, застосовуючи набір Сіїск-її ЕдО АїІехаРіІног488, дотримуючись 60 інструкцій виробника (І їе ТесппоЇодіез, Мо в каталозі С10425). Щонайменше за 30 хв до аналізу клітин за допомогою проточної цитометрії на ЕАС5Сапіо, клітини інкубували з 200 нМ барвника
ЕхСусіє, що випромінює в далекій інфрачервоній області спектра (ІМеТесПппоіодіеб5, Мо в каталозі Е10348), і 100 мкг/мл РНКази А (І ШеТесппоіодіе5, Мо в каталозі 12091-039).
Реєстрували подію в каналі АІехЕРІшог488 (для детектування Ед) і в каналі АРС (для детектування фарбування загальної ДНК барвником ЕхСусіє). Результати аналізували шляхом встановлення дискримінаційного вікна на окремі клітини на діаграмі розсіювання з відображенням ЕЗС за шириною та ЕС за висотою, і встановлення всередині нього дискримінаційних вікон для фаз клітинного циклу 50/51, 5 і 52М на діаграмі розсіювання АРС проти АіІехаРіІног488 з одержанням популяцій ЕдОпеодрСіом, ЕдОрвоз і 6ЕДОпездрОгогй, відповідно.
Дані представлені у вигляді коефіцієнта проліферації, розрахованого шляхом розподілу відсотка клітин у фазах 5 і С2/М на відсоток клітин у фазі 50/51. На фігурі 34 показано, що
РВ4188 стабільно більш ефективно, ніж РОЗ178 або пертузумаб - трастузумаб, інгібує проліферацію, викликану стандартною (1 нг/мл) або високою (100 нг/мл) концентрацією НКО.
При високих концентраціях НКО РВА188 все ще інгібує просування за клітинним циклом.
РВ4А188 викликає інтерналізацію рецептора
Характер інтерналізації антитіл вимірювали, застосовуючи чутливі до рН барвники. Даний спосіб був описаний в даній області у УМО2013134686 АТ, де такі барвники, коли вони пов'язані з антитілом, проявляють підвищений сигнал флуоресценції, якщо їх піддати більше низькому рН.
Це відбувається, коли зв'язані з барвником антитіла інтерналізуются з поверхні клітин-мішеней в слабокислі ендосоми (рН 6-6,5), а потім в кислі лізосоми (рН нижче 5,5). Для того, щоб досліджувати, чи відбувається інтерналізація РВ4188 в ракових клітинах, антитіло з'єднували з рН-чутливим барвником з реакційно-здатною групою сукцинімідилового ефіру (Рготеда, Мо в каталозі С51783А01), дотримуючись інструкцій виробника. Для порівняння в аналіз включали мічені барвником антитіла проти НЕК2 (трастузумаб, пертузумаб, РОЗ3958), проти НЕКЗ (РОЗ178, МеоАбБб) й антитіло негативного контролю (проти правцевого токсину, Р1337).
Збирали культури ракових клітин 5КВК-3 і М87 з підвищеною експресією НЕК2 в експоненціальній фазі росту та висіювали на 96-ямкові планшети (15х103 клітин на ямку) в 100 мкл аналітичного середовища (клітини М87: КРМІ-1640, 00595 БСА, 10 мкг/мл голотрансферину; клітини 5КВА-3: ЮОМЕМ/Е-12, 2 мМ І-глутамін, 0,0595 БСА, 10 мкг/мл голотрансферину), що містить 1 нг/мл НК, й інкубували протягом ночі при 37 "С, 5 95 СО2, при відносній вологості 9595. На наступний день додавали 20 мкл мічених чутливим до рн барвником антитіл до досягнення кінцевої концентрації 100 нМ й інкубували клітини протягом ночі при 37 "С, 5595 СО2, при відносній вологості 95 95. На наступний день клітини збирали шляхом збору не прикріплених до субстрату клітин і трипсинізування прикріплених до субстрату клітин. Після промивання клітин буфером для БАС5 (ФБР, 0,595 БСА, 0,1 95 азид натрію) клітини офарблювали міченим АРС антитілом до ЇдС людини (дасквоп Іттипогезеагсі, Ме в каталозі 109-136-098, розведення 1:100). Клітини аналізували за допомогою проточної цитометрії на БАСб5Сапіо (ВО Віозсіепсез), вимірюючи серединні значення інтенсивності флуоресценції (МЕЇ) в каналах РЕ і АРС, щоб визначити інтерналізацію й остаточне зв'язування антитіл з поверхнею, відповідно. Результати, представлені на фігурі 35, показують, що РВ4188 інтерналізується в такому самому ступені, як і трастузумаб, в той час як комбінація трастузумаб я- пертузумаб призводить до підвищеної інтерналізації. Комбінація трастузумаб ї- пертузумаб знижує АЗКЦ у порівнянні з трастузумабом окремо (фігура 36). Отже, очікують, що рівень інтерналізації РВА4А188 залишить ефективність АЗКЦ незмінною.
Одержання та визначення характеристик варіантів антитіла проти НЕКЗ 3178
Були розроблені варіанти антитіла проти НЕКЗ МЕЗ3178 з метою поліпшити властивості антитіла. Мутації вводили в ген УН в каркасну область 1 (ЕК), визначаючу комплементарність область 1 (СОК1), ЕК2, СОК2 і/або ЕКЗ, при цьому СОКЗ і ЕК4 залишали без модификації.
Розробка включала, але не була обмежена мутаціями, які вводили, щоб видалити мотиви посттрансляційної модификації (РТМ) (наприклад, шляхом заміни мотива дезамінування М5 на
МО), щоб знизити гідрофобність поверхні (наприклад, шляхом заміни І на Т), або щоб підвищити ізоелектричну точку (рі; наприклад, шляхом заміни О на К). Всі 20 варіантів (див. фігуру 37) експресували у вигляді біспецифічного антитіла в комбінації з плечем проти правцевого токсоїда (ТТ) та досліджували у функціональному аналізі МСЕ-7, й у всіх 20 варіантах виявили ефективність, подібну такій як в антитіла МЕ3178 у даному форматі. Всі 20 варіантів також досліджували у даному форматі в аналізі ЕАС5 зв'язування різних титрів варіантів з МСЕ-7, й у всіх варіантах виявили дуже близькі профілі зв'язування, дозволяючи припустити, що афінності всіх варіантів подібні. Для додаткових експериментів вибрали три кращі варіанти МЕб6О58,
МЕб6О61Ї і МЕб6О65, які містили мутації десяти, трьох і семи амінокислот, відповідно (див. 60 послідовності на фігурі 16Е і фігурі 37). Відповідне моноспецифічне (901 РОбО58, РОбОбБ1 і
РОбОб5 одержували й очищали у великому масштабі. На фігурі 38 показано, що інгібіторна активність даних трьох варіантів в аналізі проліферації залежної від НКСО лінії клітин М87 подібна з такою у РОЗ3178. Профіль КО-ВЕРХ зазначених трьох варіантів був подібний з таким у
РОЗ178 відносно гетерогенності заряда, а також ширини та симетричності піка, як показано на фігурі 39. Час утримання (ІК) основного піка приблизно корелював з рі антитіл, тобто більше високе значення рі призводило до більше тривалого часу втримання. При розробці біспецифічних антитіл або сумішей антитіл, вибір варіантів антитіл з оптимальним ЇК важливий, оскільки можна полегшити очищення бажаних компонентів антитіл, застосовуючи катіонообмінну хроматографію.
Приклад 2
Визначали ефективність біспецифічного антитіла МСГ А-128, спрямованого проти НЕК? і
НЕКЗ, у мишей з внутрішньочерепними пухлинами з отриманих із пацієнта ксенотрансплантатів (РОХ). Ефективність МСГ А-128 порівнювали з Т-ЮОМ'1. Крім того, комбінацію МСГ А-128 і Т-ОМІ1 порівнювали з лікуванням окремими агентами.
Тварини
Дослідження проводили на 43 (включаючи 11 запасних тварин) самках голих мишей ММК (замовлені тварини однакового віку з точністю до одного тижня, у віці приблизно Є тижнів) з розплідника дапміег І арх, Франція.
Розміщення та догляд за тваринами
Контроль за станом здоров'я.
Мишам проводили клінічний огляд при надходженні на Кафедру експериментальної медицини, будова 10.3, Університет Копенгагена, згідно зі Стандартними процедурами тваринницького комплексу. Навчений персонал доглядав за мишами під ветеринарним наглядом. Всі тварини були здорові, і не було зроблено зауважень до умов їх утримання.
Акліматизація.
Перед початком експериментальних процедур мишам давали можливість акліматизуватися протягом 14 днів.
Розміщення та навколишнє середовище.
Тварин розташовували в кімнаті/лабораторії для тварин. Кімната освітлювалась з дотриманням циклу 12 годин світла та 12 годин темряви. Світло включали з 06:00 год. до 18:00 год. Мишей утримували в індивідуально вентильованій клітці (ІВК, ІМС) типу І, Тесппіріавзі (820 см2, висота 15,5 см, максимум 8/мінімум 2 миші на клітку). За тваринами щодня доглядали лаборанти, тоді як ветеринари оглядали тварин у лабораторії раз на два місяці або за запитом лаборантів. Кожна клітка була підписана з вказівкою щонайменше ідентифікаційного номера дослідження, групи та кількості тварин і тестованої сполуки. Клітини обладнали одноразовою пластиковою вставкою після внутрішньочерепної імплантації пухлини.
Підстилка.
В якості підстилки використовували деревину осики від Вгодагаєп/Ріпп Тармеї Оу, РІМ-73620
Корттейнен, Фінляндія. Підстилку заміняли раз на два тижні.
Поліпшення навколишнього середовища.
Тваринам пропонували запас матеріалу для гніздування, Вгодагаеп, при кожній заміні підстилки. Більше того, в кожній клітині були дерев'яні палички від Вгодагаеп/Ріпп Таруеїоу, БІМ- 73620 Кортейнен, Фінляндія, і виготовлене на замовлення прозоре червоне пластикове укриття.
Дієта та питна вода.
Гранульований повноцінний корм "Акготіп 1319", збалансована дієта для пацюків і мишей, був доступний без обмеження, і його заміняли кожні 14 днів. У тварин був вільний доступ до водопровідної води, яку заміняли щотижня. У питну воду додавали естроген після внутрішньочерепної імплантації пухлини.
Гуманні кінцеві точки.
Тварин вбивали з міркувань гуманності. Гуманні причини вбивства тварини включали, але не обмежені перерахованими: випадки, коли у тварин виявляли ознаки постійного страждання, болю або страху. Особливі гуманні кінцеві точки для даного дослідження обумовлені системою бальної оцінки, представленої в таблиці 16. При відповідних показниках мишей вбивали шляхом зсуву шийних хребців.
Методи.
Часова шкала для дослідження, представленого в таблиці 17.
Внутрішньочерепна імплантація пухлини
Збирали підшкірну пухлину 5713608 РОХ (4ий пасаж), вирощену в голій миші ММРЇ, криву росту пухлини див. на фігурі 41. Мишам, що несуть пухлини 5713608, додатково давали 60 естроген після імплантації пухлини. Пухлину промивали ФБР і відтинали з поверхні залишкову кількість сполучної тканини. Пухлину розсікали на маленькі шматочки і розщеплювали акутазою та колагеназою ІМ з одержанням суспензії окремих клітин. Розщеплення зупиняли додаванням середовища, що містить фетальну бичачу сироватку, і суспензію клітин фільтрували через фільтр із діаметром пор 100 мкм, промивали ФБР і ресуспендували у ФБР. Життєздатність пухлинних клітин перевіряли шляхом фарбування трипановим синім, і кінцева концентрація становила 18 мільйонів життєздатних клітин/мл. Життєздатність всіх клітин становила більше 80 95. Не розділяли клітини на стромальні або пухлинні, і розчини також містили деяку кількість уламків клітин. Для 5113608 продемонстрували високу насиченість пухлини клітинами. Клітини тримали на льоді до моменту інокуляції.
Миші одержували в якості анестезії гіпнорм/мідазолам (1 мл/100 г маси тіла) і поміщали в стереотаксичну рамку для фіксації голови. Робили поздовжній розріз на шкірі черепа, щоб оголити саМмагішт. У черепі свердлили отвір на 1,5 мм праворуч від зшига задаїйаїїв5 і на 0,5 мм за від Бгедта, застосовуючи мікродриль. Десять мкл суспензії клітин (180000 клітин) вводили шляхом ін'єкції на глибину 2 - 2,5 мм при швидкості потоку 60 нл/сек, застосовуючи шприц ємністю 100 мкл із голкою 25 калібру, поміщений в мікроінфузійний насос. Голку залишали на З хвилини перед витягуванням. Бупівакаїн (0,2 мг/100 г маси тіла) і лідокаїн (1 мг/100 г маси тіла) вводили в місце розрізу для місцевої анестезії та шкіру з'єднували за допомогою шва. Мишам проколювали вухо, вставляли ідентифікатор і повертали в клітки, де за ними спостерігали до тих пір, поки вони повністю не оправлялися від анестезії. Мишей перевіряли щонайменше двічі на тиждень (маса тіла та клінічні ознаки) після інокуляції пухлини або частіше, якщо були присутні клінічні ознаки або втрата маси тіла.
Магнітно-резонансна томографія (МР-візуалізація).
Розвиток пухлини відслідковували раз на два тижні за допомогою Т2-зваженої МР- візуалізації (аксіальна та фронтальна проекції). Першу процедуру візуалізації проводили через 19 днів після інокуляції пухлини. Тварини одержували анестезію під час процедур МР- візуалізації (севофлуран, 2-495 у навколишньому повітрі, доповненого 10095 02 при співвідношенні приблизно 4:1).
Включали в дослідження на підставі двох патологічних зображень МР-візуалізації, на яких був зареєстрований ріст пухлини й об'єм пухлини, приблизно рівний 10-20 мм3. Мишей, які задовільняли критерії включення в дослідження, випадковим чином розподіляли в одну з чотирьох груп. В дослідження включали перших 32 мишей, які задовольняли критерії включення. Мишей випадковим чином розподіляли за групами таким чином, що у всіх групах був однаковий середній об'єм пухлини на момент початку лікування.
Терапія
Мишам вводили дозу будь-якого з перерахованих агентів: середовища, МС А-128, Т-ОМІ1 або МСГА-128-Т1-ЮОМ'І1, згідно з таблицею 18. Лікарські засоби розводили в стерильному сольовому розчині перед кожним введенням дози. Мишей поміщали під нагрівальну лампу приблизно на 5-10 хвилин перед ін'єкцією тестованої сполуки, щоб зробити дану процедуру як можна більше швидкою. Мишей поміщали у фіксатор для хвостової ін'єкції та вводили дозу тестованої сполуки у бічну хвостову вену у вигляді однократної внутрішньовенної (в/в) болюсної дози. Об'єм дози становив 5,0 мл/кг.
МР-візуалізація та контроль маси тіла після терапії.
Розвиток пухлини відслідковували раз на два тижні за допомогою Т2-зваженої МР- візуалізації (аксіальна та фронтальна проекції) протягом перших двох тижнів після початку терапії та щотижня до 6 тижнів після терапії. Тварини одержували анестезію під час процедур
МР-візуалізації (севофлуран, 2-495 у навколишньому повітрі, доповненому 10095 02 при співвідношенні приблизно 4:1).
Тварин вбивали шляхом зсуву шийних хребців за індивідуальними показниками відповідно до гуманних кінцевих точок, таблиця 16. Головний мозок з пухлиною висікали та зберігали в 4 95 формальдегіді протягом 24-48 годин і переносили в 70595 етанол. Співвідношення фіксатор:тканина становило щонайменше 20:1.
Аналіз зображень.
Об'єми пухлин вимірювали на зображеннях шляхом обведення областей інтересу (ОЇ) на окремих зрізах й обчислення об'єму ОЇ. ОЇ обводили як на аксіальному, так і на фронтальному зрізах, і середній об'єм пухлини в двох проекціях використовували в якості об'єму пухлини.
Набряк у головному мозку оцінювали вручну, привласнюючи бали за шкалою від 0 до 4, де бал
О відповідав відсутності набряку головного мозку, а бал 4 свідчив про масивний набряк головного мозку, див. фігуру 42. Аналіз зображень проводили, застосовуючи Ногоз (Ного5
Рго|есі (2017). ОІСОМ ітаде міеміпуд апа теазигіпд. (Ногов)|. пер:/Лумлиу. погозрго)есі. огу/). 60 Результати
Включення в дослідження та випадковий розподіл за групами.
Перших тварин включили в дослідження через 23 дні після внутрішньочерепної імплантації пухлини. Дати включення й об'єм пухлини при включенні в дослідження для всіх тварин наведені в таблиці 19. Маси тіла й об'єми пухлин мишей в групах А-О в момент включення в дослідження показані на фігурі 43. Не спостерігали відмінності в масі тіла або об'ємі пухлини між групами (однофакторний дисперсійний аналіз, р-0,43 (маса тіла) і р-0,92 (об'єм пухлини).
Фігура 43: маса тіла й об'єм пухлини в момент включення мишей в групу А-О. Не спостерігали відмінності в масі тіла або об'ємі пухлини між групами (однофакторний дисперсійний аналіз, р-:0,43 (маса тіла) і р-0,92 (об'єм пухлини)).
Контроль після терапії.
Т2-зважені МРТ проводили в день 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35 і 42 після початку терапії для вимірювання внутрішньочерепного об'єму пухлини. Середній об'єм пухлини після початку терапії для кожної групи зображений на фігурі 44. Індивідуальні об'єми пухлин для тварин в кожній групі показані на фігурах 46-49. Приклади Т2-зважених зображень мишей показані на фігурах 50-53. Ріст пухлини був інгібований в мишах, яких лікували Т-ЮОМ'І1 ї Т-ОМ1 МОЇ А-128, тоді як спостерігали вповільнення росту пухлини у мишей, яких лікували МС А-128, у порівнянні з мишами, яким вводили середовище. Спостерігали значиму відмінність в об'ємі пухлини через 10 днів після терапії (р-0,009, однофакторний дисперсійний аналіз), і середній об'єм пухлини мишей, яких лікували Т-ОМІ1 ї Т-ОМІ1 -МО А-128, був значно менше, ніж такий у мишей, яким вводили середовище (р « 0,05 з виправленням на множинні порівняння; критерій Тьюкі).
За масою тіла мишей уважно стежили після початку терапії. Середня маса тіла мишей в різних групах показана на фігурі 45. Вимірювані маси тіла для кожної миші в різних групах показані на фігурах 54-57 як в грамах, так й у вигляді відсоткової зміни відносно маси тіла в момент включення в дослідження. За результатами індивідуальних вимірів маси тіла очевидно, що більшість мишей втрачали масу тіла до досягнення гуманних кінцевих точок.
Бальна оцінка набряку головного мозку
Стаз пухлини (присутність пухлини, яка не росте) спостерігали у тварин в групах Віо.
Оцінка зображень МРТ, найбільше близких до моменту вмертвіння, показала, що у деяких тварин був присутній набряк головного мозку. Це могло сприяти погіршенню стану мишей та необхідності вмертвіння. Проводили бальну оцінку набряку в головному мозку вручну за шкалою від 0 до 4: 0 вказував на відсутність набряку головного мозку, а 4 вказувало на масивний набряк головного мозку (таблиця 20 і фігура 58). Спостерігалася схильність до більшого набряку в групах, які лікували Т-ОМ'І (групи В і 0). Проте, не було значимої відмінності в набряку головного мозку між групами (непараметричний критерій Краскела-Уоліса).
Інтерпретувати дані результати потрібно з обережністю, тому що бальну оцінку набряку проводили не в той самий момент часу та не під час умертвіння. Також об'єми пухлин відрізнялися між групами, що також могло впливати на набряк головного мозку. Отже, дане дослідження не було розроблене для докладного вивчення впливу лікування на набряк головного мозку.
Аналіз виживаності.
Мишей вбивали внаслідок досягнення гуманних кінцевих точок згідно з таблицею 16.
Незважаючи на ретельний контроль, чотири миші були виявлені мертвими в клітках під час дослідження. З тварин, які були виявлені мертвими в клітці, не зберігали матеріал пухлини ех мімо. Криві результатів виживаності Каплана-Мейєра для всіх груп представлені на фігурі 59.
Криві виживаності значно відрізнялися (р х 0,0001, логарифмічний ранговий критерій).
Серединне значення виживаності тварин, яких лікували середовищем, Т-ОМІ1, МОЇ А-128 і Т-
ОМІ1--МО А-128, становило 13, 19,5, 29 і 42 дні після початку терапії, відповідно. Попарне порівняння кривих Каплана-Мейєра представлено на фігурі 60. Значиме (логарифмічний ранговий критерій) більше серединне значення виживаності спостерігали для лікування Т-ОМІ1 у порівнянні з середовищем (19,5 у порівнянні з 13 днями, р-0,020), МСГ А-128 у порівнянні з середовищем (29 у порівнянні з 13 днями, р «х 0,0001) ії Т-ОМ1--МОїЇ А-128 у порівнянні з середовищем (42 у порівнянні з 13 днями, р «х 0,0001). Не спостерігали відмінності в серединному значенні виживаності для лікування МС А-128 у порівнянні з Т-ОМІ1 (29 у порівнянні з 19,5 днями, р-0,10, логарифмічний ранговий критерій). У мишей, яких лікували Т-
ОМ1--МОЇ А-128, спостерігали значимо (логарифмічний ранговий критерій) більше серединне значення виживаності у порівнянні з мишами, яких лікували Т-ЮОМІ1 (42 у порівнянні з 19,5 днями, р-0,0005) або МС А-128 (42 у порівнянні з 29 днями, р-0,013).
Обговорення
Т-ОМ1 ї Т-ОМ1-А-МОА-128 інгібували ріст пухлини, тоді як МСГ А-128 призводив до 60 уповільнення росту пухлини, що визначили за Т2-зваженим МРТ. Серединне значення виживаності мишей, яких лікували середовищем Т-0ОМІ, МС А-128 їі Т-ЮОМ1--МОЇ А-128, становило 13, 19,5, 29 і 42 дні після початку терапії, відповідно. У мишей, яких лікували МС А- 128, спостерігали значимо більшу виживаність у порівнянні з тваринами, яким вводили середовище (29 у порівнянні з 13 днями, р«0,0001), й у мишей, яких лікували Т-ОМІ1 МОЇ А-128, спостерігали значимо більше серединне значення виживаності у порівнянні з мишами, яких лікували Т-ЮОМІ (42 у порівнянні з 19,5 днями, р-0,0005) або МС А-128 (42 у порівнянні з 29 днями, р-0,013). Спостерігали схильність до підвищеного набряку в групах, які лікували Т-ОМІ1 (групи В ї ОБ). Проте, не було виявлено значимої відмінності в набряку головного мозку між групами (непараметричний критерій Краскела-Уоліса). На закінчення, МСГ А-128 виявив ефективність відносно виживаності мишей з внутрішньочерепними пухлинами 5Т136ОВРОХ як у вигляді монотерапії, так і в комбінації з Т-ОМ'І1.
Приклад 3. ІЇ фаза випробування комбінацій на основі МС А-128 при метастатичному раку молочної залози (МРМ3): МС А-128/трастузумаб/хіміотерапия в НЕК2-позитивному МРМ3.
Хоча у даному прикладі описане введення Ме А-128/грастузумабу/хіміотерапії, не передбачається, що даний приклад обмежений застосуванням набору даних конкретних терапевтичних агентів, і він поширюється на описані зв'язуючі ЕгоВ-2 і ЕгЬВ-3 біспецифічні антитіла в комбінації зі зв'язуючим ЕгоВ-2 агентом, включаючи інгібіторний агент, і хіміотерапією.
ЦІЛІ
НЕВ2г- позитивний /ампліфікований МРМ3З: МС А-128 т трастузумаб «х винорелбін
Первинна мета: - Оцінити ефективність МС А-128 в комбінації трастузумабом х винорелбін відносно рівня клінічної користі (РКК) через 24 тижні на підставі критерію КЕСІ5Т 1.1 (на розсуд дослідника) у пацієнтів із НЕК2-позитивним/ампліфікованим МРМ3З, у яких спостерігалося прогресування на попередній спрямованій проти НЕК2 терапії яка включала трастузумаб з пертузумабом, і кон'югат антитіла проти НЕКЗ з лікарським засобом (АЛЗ).
Вторинні цілі: - Оцінити РКК через 24 тижні на підставі КЕСІЗ5Т 1.1 згідно з централізованою перевіркою - Оцінити виживаність без прогресування (ВБП; на розсуд дослідника та централізованої перевірки) - Оцінити частоту загальної відповіді (ЧЗ3В) на підставі КЕСІ5Т 1.1 (на розсуд дослідника та централізованої перевірки). - Оцінити тривалість відповіді «(ТрВ) на підставі КЕСІ5Т версії 1.1 (на розсуд дослідника та централізованої перевірки) - Оцінити загальну виживаність (38) - Оцінити безпеку та переносимість МС А-128 в комбінації з трастузумабом хз винорелбін - Охарактеризувати фармакокінетику (ФК) МСІА-128 в комбінації з трастузумабом х винорелбін - Охарактеризувати імуногенність МСГ А-128 в комбінації з трастузумабом
Пошукова ціль: - Оцінити потенційні взаємозв'язки між біомаркерами в зразках пухлини або крові та протипухлинною активністю (включаючи НЕК2, НЕКЗ, димери НЕК2:НЕКЗ, херегулін й інші потенційні біомаркери)
ДИЗАЙН ДОСЛІДЖЕННЯ
Відкрите міжнародне багатоцентрове клінічне дослідження 2 фази проводили, щоб оцінити ефективність комбінацій на основі МСІГА-128 в двох популяціях з метастатичним раком молочної залози (МРМ3З), НЕК2-позитивним/ампліфікованим. Оцінювали дві комбінації лікування в 15-20 клінічних центрах в 7 країнах Європи і США.
Пацієнти з НЕК2-позитивним/ампліфікованим МРМЗ, у яких підтверджена надекспресія
НЕКЗ за статусом імуногістохімії (ІГХ) З-- або ІГХ 2 в комбінації з позитивною флуоресцентною гіоридизацією іп 5йи (РІЗН), у яких спостерігалося прогресування за КЕСІЗТ версії 1.1 на 2-4 лініях спрямованої проти НЕК2 терапії в умовах лікування ад'ювантом/ неоад'ювантом, неоперабельного місцеворозгалуженого/ метастатичного раку, включаючи трастузумаб з пертузумабом й АЛЗ проти НЕК2, були придатні для участі в дослідженні. Для включення в дослідження опиралися на статус НЕК2, вказаний в медичній документації, та придатність до участі в дослідженні згодом підтверджували в максимально короткий термін шляхом перевірки центральною лабораторією. Пацієнтів, яких заднім числом визнали непридатними для участі в дослідженні, неможливо оцінити в рамках первинної мети, й їх можна замінити. Необхідно забезпечити доступність документального візуалізаційного підтвердження прогресування 60 захворювання на останній попередній лінії терапії, коли це можливо.
Спочатку МСГ А-128 вводять з трастузумабом (двокомпонентна комбінація). Безпека перевіряється Незалежним комітетом з моніторингу даних (НКМД). Після оцінки безпеки двокомпонентної комбінації оцінюють МС А-128 « трастузумаб «ї винорелбін (трикомпонентну комбінацію) паралельно з двокомпонентною комбінацією (див. фігуру 61).
Як двокомпонентну, так і трикомпонентну комбінації оцінювали в двох етапах з вихідною оцінкою безпеки на 4-6 пацієнтах, яких перевіряв НКМД, з наступним розширенням когорти для дослідження ефективності, як описано нижче. Розв'язок про перехід/ не перехід до трикомпонентної комбінації ухвалював НКМД після оцінки безпеки двокомпонентної комбінації у пацієнтів. Розширення когорти для дослідження ефективності обох комбінацій триває паралельно.
Вступна оцінка безпеки. Після того, як 4-6 пацієнтів одержали щонайменше 2 повних циклу (б тижнів) МСГ А-128 «т трастузумаб, НКМД проводив перевірку безпеки. Якщо двокомпонентну комбінацію вважали безпечною, то починали вступну оцінку безпеки трикомпонентної комбінації. НКМД оцінював безпеку трикомпонентної комбінації після того, як 4-6 пацієнтів одержали щонайменше 2 повних циклу (6 тижнів) МС А-128 т трастузумаб «т винорелбін.
На підставі спостережуваної безпеки у перших 4-6 пацієнтів (небажані явища (НЯ), серйозні небажані явища (СНЯ), їхнє відношення до досліджуваного лікарського засобу й інші клінічно значимі параметри (наприклад, лабораторні показники), доступні дані про ФК, імуногенності та цитокіни) НКМД, дослідники та спонсор ухвалюють рішення щодо можливого додаткового вступного періоду для оцінки безпеки кожної комбінації (тобто двокомпонентної та трикомпонентної).
Розширення. Після вступної оцінки безпеки кожну комбіновану терапію, яку НКМД порахував переносимою, розширювали до 40 пацієнтів, які підходять для оцінки ефективності.
ДОСЛІДЖУВАНА ПОПУЛЯЦІЯ
Критерії включення
Пацієнти повинні задовольняти всім наступним вимогам, щоб їх включили в дане дослідження: 1. Підписана інформована згода перед початком будь-яких процедур дослідження. 2. Жінки з гістологічно або цитологічно підтвердженим раком молочної залози з ознаками метастатичного або місцеворозгалуженого захворювання, що не піддається якому-небудь місцевому спрямованому на лікування втручанню: а. Документально підтверджена надекспресія/ампліфікація НЕК2, визначена як позитивна за імуногістохімією (ІГХ) З, або ІГХ 2- в комбінації з позитивною флуоресцентною гіоридизацією іп зі (РІ5Н), на підставі локального аналізу найбільше пізнього біоптату пухлини (переважно метастатичної, або ж первинної), або свіжого, або архівного, зібраного протягом 12 місяців до проведення скринінгу. р. Документально підтверджене прогресування захворювання (за оцінкою дослідника) на 2-4 лініях спрямованої проти НЕК2 терапії в умовах лікування ад'ювантом/ неоад'ювантом, неоперабельного місцеворозгалуженого/ метастатичного раку; трастузумаб плюс пертузумаб і кон'югат антитіла проти НЕК?З з лікарським засобом (наприклад, Т-ОМТІ) - всі повинні були бути введені раніше (у будь-якій послідовності). 3. Вимірне за допомогою рентгенологічних способів захворювання, що можна визначити за
ЕКЕСІЗ5Т версії 1.1, під час або після найбільше пізньої лінії терапії. 4. Вік » 18 років на момент підписання інформованої згоди. 5. Показник загального стану за шкалою Східної об'єднаної групи онкологів (ЕСОС), рівний 0 або 1. 6. Очікувана тривалість життя 2 12 тижнів на думку дослідника. 7. Фракція викиду лівого шлуночка (ФВЛШ) 2» 50 95 за даними ехокардіограми (ЕхоКГ) або багатопроекційного радіоіїзотопного сканування (МОСА). 8. Нормальне функціонування органів: а. Абсолютне число нейтрофілів (АЧН) 2 1,5х109/л р. Гемоглобін г 9 г/дл с. Тромбоцити г 100х109/л а. Кальцій в сироватці в межах норми (або скоректований харчовими добавками) е. Аланінамінотрансфераза (АЛТ), аспартатамінотрансфераза (АСТ) «х 2,5 х верхньої границі норми (ВГН) і загальний білірубін х 1,5 х ВГН (у випадку залучення печінки допускається
АЛТ/АСТ х 5 х ВГН і загальний білірубін в межах норми)
І. Креатинін в сироватці х 1,5 х ВГН або кліренс креатиніну г 60 мл/хв, розрахований за формулою Кокрофта-Голта або за формулою МОКО (Модійсайоп ої Оієї іп Кепаї! Оізеазе) для 60 пацієнтів у віці » 65 років д. Альбумін в сироватці » 3,0 г/дл
ДОСЛІДЖУВАНЕ ТА СУПУТНЄ ЛІКУВАННЯ
МОЇ А-128: 750 мг внутрішньовенної постійної дози, яку вводять протягом 2 годин в день 1 раз на З тижні (дЗм/).
Премедикація парацетамолом/ацетамінофеном, антигістамінами та кортикостероїдами (відповідно до стандартної практики) є обов'язковою для кожного введення МС А-128 шляхом інфузії.
Трастузумаб: 8 мг/кг навантажувальної дози вводять внутрішньовенно протягом 90 хвилин на день 1 цикла 1, потім, починаючи з циклу 2, вводять внутрішньовенно 6 мг/кг протягом 30-90 хвилин на день 1 кожного циклу, д3м/. Для пацієнтів, яким проводять вступну оцінку безпеки, введення трастузумабу відтерміновують на день 2 циклу 1.
Винорелбін: 25 мг/м? вводять внутрішньовенно протягом 10 хвилин, в дні 1 і 8, кожні З тижні.
Для пацієнтів, яким проводять вступну оцінку безпеки, введення винорелбіну відтерміновують на дні 2 і 9 циклу 1.
СХЕМИ ЛІКУВАННЯ
Для всіх комбінацій цикл вважали складеним з 3 тижнів. Проводили спостереження протягом б-годинного періоду після початку інфузії первинної дози МСГ А-128 і/або трастузумабу та протягом 2-годинного періоду для всіх наступних введень.
Двокомпонентна комбінація (див. фігуру 62): - Вступна оцінка безпеки (4-6 пацієнтів): в циклі 1 МСГ А-128 вводили в день 1 і трастузумаб вводили в день 2. Починаючи з циклу 2, трастузумаб вводили в день 1 через 30 хвилин після завершення введення МС А-128. - Розширення: для всіх циклів МС А-128 вводили в день 1, а потім вводили трастузумаб через 30 хвилин після завершения інфузії МСГ А-128.
Трикомпонентна комбінація (див. фігуру 63): - Вступна оцінка безпеки (4-6 пацієнтів): в циклі 1 МС А-128 вводили в день 1, а через 30 хвилин вводили трастузумаб, і винорелбін вводили в дні 2 і 9. Починаючи з циклу 2, винорелбін вводили в день 1 через 30 хвилин після трастузумабу та в день 8. - Розширення: для всіх циклів МСГ А-128 вводили в день 1, потім через 30 хвилин вводили трастузумаб, а потім вводили винорелбін через 30 хвилин після завершення інфузії трастузумабу.
Як для двокомпонентної, так і для трикомпонентної комбінації, якщо окремий пацієнт не переносив введення всіх лікарських засобів в один день, то для даного пацієнта зберігали схему введення доз циклу 1 вступної оцінки безпеки.
Призначення лікування: спонсор почергово призначав підходящим для участі в дослідженні пацієнтам двокомпонентну або трикомпонентну комбінацію, для вступної оцінки безпеки або доступного розширення, для кожної комбінації.
Адаптація до лікування - Не допускали зниження дози МСГ А-128 або трастузумабу. - Дозу винорелбіну знижували або припиняли його введення у випадках зменшення числа нейтрофілів або підвищення рівнів білірубіну, згідно з інструкцією із застосування (5РО), і переривали, якщо з'являлася нейротоксичність ступеню г 2 (МСІ-СТСАЕ версії 4.03). - Інфузію МСГ А-128 припиняли у випадку інфузійної реакції (КК), і повинні були остаточно припинити при важкій ІКК. При легких або помірних реакціях інфузію можна було відновити при 95 швидкості інфузії та збільшити тривалість інфузії до 4 годин. - Введення МС А-128 і трастузумабу можна було відкласти на період максимум 6 тижнів між інфузіями, щоб впоратися з НЯ, зокрема, при клінічно значимих зниженнях ФВЛШ, ознаках застійної серцевої недостатності або постійної діареї ступеню 2 або ступеню 3-4.
Тривалість лікування 50 Досліджуване лікування вводили до підтвердження прогресуючого захворювання (згідно з
КЕСІ5Т 1.1), неприйнятної токсичності, відкликання інформованої згоди, порушення пацієнтом режиму лікування, відповідного рішення дослідника (наприклад, клінічного погіршення), переривання лікування на » б послідовних тижнів, скасування якого-небудь досліджуваного лікарського засобу. Пацієнтів потім спостерігали для оцінки безпеки протягом щонайменше 3555 днів після останнього введення досліджуваного лікарського засобу та до моменту відновлення/стабілізації пов'язаної з ним токсичності, і для оцінки прогресування захворювання та статусу виживаності протягом 12 місяців.
ПРОФІЛАКТИЧНА ТА СУПУТНЯ ЛІКАРСЬКА ТЕРАПІЯ
Дозволена 60 - Введення парацетамолу/ацетамінофену, антигістамінних засобів і кортикостероїдів є обов'язковим з кожним введенням МС А-128. У випадку ІКК або гіперчутливості, пацієнта ведуть відповідно локальній клінічній практиці, відповідно до клінічних показань. - Всю лікарську терапію, необхідну для підтримки гарного самопочуття пацієнта й яка, як очікують, не буде перешкоджати оцінці досліджуваного лікарського засобу, включаючи підтримуюче лікування симптомів і НЯ або стандартне лікування супутніх станів, можна давати пацієнту на розсуд дослідника.
Заборонена - Супутнє постійне введення пероральних кортикостероїдов (10 мг/день еквівалента преднізону), інгібіторів ТМЕ-альфа, антитіл проти Т-клітин (внаслідок ризику подавлення імунітету). - Будь-які експериментальні лікарські засоби під час дослідження або за 4 тижні до першої дози досліджуваного лікарського засобу. - Системна протиракова терапія або вакцина проти жовтої лихоманки під час дослідження або протягом З тижнів до першої дози досліджуваного лікарського засобу.
ОЦІНКА БЕЗПЕКИ/ПЕРЕНОСИМОСТІ - НЯ (СТСАЕ версії 4.03), СНЯ - Лабораторні параметри: гематологія, біохімія, згортання крові, аналіз сечі, цитокіни - ЕКГ, МОСА/ЕхоКГ - Історія хвороби, показники життєво важливих функцій, показник загального стану та фізикальний огляд - Супутня лікарська терапія - Зміни дози (зменшення, переривання, відстрочення), припинення приймання внаслідок токсичності
ОЦІНКА ЕФЕКТИВНОСТІ
Пухлину оцінювали на підставі КТ/МРТ з контрастом згідно з КЕСІ5Т 1.1 кожні 6 тижнів після початку лікування. Об'єктивні відповіді необхідно було підтвердити щонайменше через 4 тижні після першого спостереження. Централізовану перевірку результатів візуалізації незалежними) рентгенологом(-ами) проводили для всіх пацієнтів (на етапі скринінгу й у період дослідження).
Остеосцинтиграфію проводили відповідно з клінічними показниками для пацієнтів з метастазами в кістках на момент включення в дослідження або передбачуваними ураженнями у період дослідження.
Пухлинні маркери (СА15-3, СЕА, СА27-29) оцінювали в день 1 кожного циклу.
БІОМАРКЕРИ
Кандидатні діагностичні біомаркери оцінювали у пухлинній тканині (при скринінгу, необов'язково через 12 тижнів і в момент закінчення лікування (ЕОТ)) і крові (перед введенням дози в день 1 кожні 4 цикли та в момент закінчення лікування).
Пухлина: НЕК2, НЕКЗ, димеризація НЕК2:НЕКЗ, слідуючі в сигнальних шляхах білки (наприклад, РІКЗСА), херегулін, фосфорилювання НЕК2, НЕКЗ і білків в сигнальних шляхах
МАРК і АКТ, інгібітори експресії, такі як РТЕМ, мутації у пов'язаних з раком генах, включаючи гени сигнальних шляхів НЕКЗ і НЕКЗ, злиття генів з херегуліном.
Кров: поліморфізм Есу-рецептора, мутації в ДНК пухлині, що циркулює у плазмі, діагностичні біомаркери в сироватці (наприклад, розчинний НЕК, херегулін).
ФАРМАКОКІНЕТИКА
Зразки крові збирали для вимірювання впливу МСГ А-128 і трастузумабу на сироватку. Для винорелбіну не проводили відбір зразків для дослідження ФК.
Відбір зразків для дослідження ФК проводили в наступні моменти часу:
Двокомпонентна та трикомпонентна комбінації: МС А-128 - Цикл 1: день 1, перед введенням дози, в момент закінчення інфузії (ЕОІ) і через 2,4 і 22 години після ЕОЇ, потім у будь-який момент часу в день 8 (або день 9 для початкового оцінювання безпеки трикомпонентної комбінації для пацієнтів) - Цикл 2: день 1, перед введенням дози, ЕОІ (початкове оцінювання та розширення) і через 2, 4 і 22 години після ЕОЇ, потім у будь-який момент часу в день 8 (тільки початкове оцінювання) - Цикли З і 5: день 1, перед введенням дози і ЕОЇ - Кожні 4 цикли після цього: перед введенням дози
Двокомпонентна комбінація: трастузумаб - Цикл 1 день 1: перед введенням дози і ЕОСІ (тільки розширення) - Цикл 1 день 2: перед введенням дози і ЕОСІ (тільки початкове оцінювання) - Цикл 2 день 1: перед введенням дози і ЕОІ (початкове оцінювання та розширення)
Трикомпонентна комбінація: трастузумаб 60 - Цикли 1 і 2, день 1: перед введенням дози і ЕОІ (початкове оцінювання та розширення)
ІМУНОГЕННІСТЬ
Зразки крові (5 мл) збирали у всіх пацієнтів, щоб оцінити титри в сироватці антитіл проти
МОЇ А-128 перед введенням дози в день 1, перед введенням дози для циклів 1, 3, 5, кожні 4 цикли після цього та в момент закінчення лікування.
ЦИТОКІНИ
Зразки крові збирали, щоб проаналізувати панель цитокінів (ТМЕРа, ІЄМу, 1-18, 1-6, 11 -8, І - 10) в сироватці у пацієнтів початкового оцінювання безпеки, як описано далі:
Двокомпонентна комбінація (тільки початкове оцінювання): - Цикл 1: день 1, перед введенням дози, через 2, 4 і 22 години після закінчення інфузії (ЕОЇ)
МОЇ А-128 - Цикл 1: день 2, перед введенням дози, через 2 години після ЕОЇІ трастузумабу - Цикл 2: день 1, перед введенням дози, через 2, 4 і 22 години після ЕОЇ МС А-128
Трикомпонентна комбінація (тільки початкове оцінювання):
Цикли 1 і 2: день 1, перед введенням дози, через 2, 4 і 22 години після ЕОЇ МСГ А-128
СТАТИСТИЧНІ АСПЕКТИ
Обсяг вибірки
Початкове оцінювання безпеки: для 4-6 пацієнтів, які підлягають початковому оцінюванню безпеки, потужність виявлення НЯ з дійсною частотою 33 95 становила від 80 до 90 95.
Розширення для оцінювання ефективності: для 40 підлягаючих оцінюванню пацієнтів, що одержували двокомпонентну або трикомпонентну комбінацію, отримали достатню точність, Щоб виключити З0 95 (нижня межа 9095 довірчого інтервалу (СІ) »30 95). Поріг рівня клінічної ефективності (РКК) через 24 тижні визначали на підставі припущення, що ВБП підпорядковується експоненціальному розподіленню з середнім значенням 5 місяців (клінічно значиме) і 3,5 місяців (клінічно не значиме).
Кінцева кількість пацієнтів залежить від результатів безпеки й ефективності під час дослідження. Припускали включити до «130 пацієнтів, що дозволяло включити по 40 пацієнтів у кожну з двох планованих комбінованих схем лікування, при цьому частота пацієнтів, що не підлягають оцінюванню, могла становити «10 95.
Визначення
Всі кінцеві точки ефективності визначали й аналізували на підставі оцінювання пухлини згідно з КЕСІ5Т 1.1.
УКЕ: частка пацієнтів з кращою загальною відповіддю: повною відповіддю (ПрВ), частковою відповіддю (ЧВ) або стабілізацією захворювання (С3) 2 24 тижнів.
ЧЗВ: частка пацієнтів з кращою загальною відповіддю ТрВ або ЧВ.
ВБП: час, що сплинув від початку лікування до рентгенологічного прогресування або смерті внаслідок будь-якої причини.
Співвідношення ВБП: співвідношення ВБП попередньої схеми лікування до ВБП при досліджуваному лікуванні.
ПрВ: час, що сплинув від початку відповіді (ПВ або ЧВ) до моменту прогресування або смерті внаслідок присутнього раку.
ЗВ: час, що сплинув від початку лікування до моменту смерті внаслідок будь-якої причини.
Кінцеві точки
Первинна
РКК за рентгенологічним оцінюванням дослідником через 24 тижні
Ключова вторинна
РКК через 24 тижні згідно з централізованою перевіркою та ЧЗ3В, ВБП і ПВ на розсуд дослідника та централізованої перевірки
Друга вторинна:
Безпека: частота, вага та взаємозв'язок НЯ, лабораторних відхилень від норми, СНЯ, вимірювань ЕКГ і ФВЛИШ і показників життєво важливих функцій
Переносимість: припинення приймання внаслідок НЯ, зміни дози внаслідок НЯ, імуногенність й оцінювання цитокінів
Друга ефективність: ЗВ
Фармакокінетика: Стах, Сон, ПлоЩа під кривою, Сі, Мев, Їтах і їн» для МС А-128 і Сво і Сон для трастузумабу.
Аналізовані популяції
Піддана лікуванню популяція: пацієнти, які одержують щонайменше одну дозу МСГ А-128.
Придатні для оцінювання ефективності: пацієнти, які отримали щонайменше 2 повних цикли (б тижнів) лікування та пройшли оцінювання в момент включення в дослідження й одне 60 оцінювання пухлини у період дослідження, або які перервали лікування раніше внаслідок прогресування захворювання.
Аналізи
Розподіл пацієнтів і демографичні дані аналізували у підданій лікуванню популяції, ефективність аналізували у придатній для оцінювання ефективності популяції та безпеку аналізували у підданій лікуванню популяції.
Кількісні змінні коротко представлені із застосуванням описової статистики. Безперервні змінні представлені у вигляді М, середнього значення та/або серединного значення, стандартного відхилення, діапазону. Категоріальні змінні представлені із застосуванням частот і відсоткового складу.
Критерії для успішної первинної кінцевої точки: серединне значення ВБП, рівне 5 місяців, вважали релевантним, при цьому поріг активності для РКК через 24 тижні встановлювали на 45 95.
РКК ї ЧЗВ коротко представлені з відповідним 90 95 точним ДІ для біноміального розподілу.
Для ВБП, ЗВ і ПрВ функцію виживаності оцінювали, застосовуючи метод множинного оцінювання Каплана-Мейєра; оцінювання ймовірності та 90 9о ДІ наведені у визначені моменти часу; серединне значення тривалості та 90 95 ДІ також запропоновані. ПрВ оцінювали тільки для пацієнтів, що відповіли на лікування.
НЯ наведені в таблиці під термінами, переважно використовуваними в Медичному словнику для нормативно-правової діяльності (МеаркАФ»), і сгруповані за класом органу відповідно з частотою та важкістю. Вага НЯ грунтувалася на СТСАЕ 4.03.
ФК, імуногенність, цитокіни та біомаркери аналізували централізовано й описували окремо.
Таблиці.
Титри в сироватці у різних когорт імунізованих мишей, визначені за допомогою ЕАС5. О - день визначення титру антитіла. Таблиця 1: відповідь проти НЕК2. Таблиця 2: відповідь проти
НЕКЗ. Використовувані лінії клітин зазначені (МСР7, 5КВКЗ, ВТ474). В стовпчиках наведені значення для різних мишей.
Таблиця 1
Відповідь проти НЕК2 щ Е МЕЖІ ЖК ЖЖ ЕП ЖЖ ше пе: ше нин
Таблиця 2
Відповідь проти НЕКЗ сур тд й ж так
Макса яак Я Жак ВІ МБО
Зк 0 кВ яко УА ЗЕ 0 о ОВ к- щВ 5 5 зв» кВ
Зо
Таблиця З
Розподіл на групи антитіл до НЕКЗ в залежності від їх реакційної здатності відносно химер НЕК2 курчати/людини і реакційної здатності відносно НЕКЗ2 миші. "Кількість" вказує на кількість унікальних антитіл в кожній групі
Специфічні відносно домену
Специфічні відносно домену ЇЇ
Специфічні відносно домену ЇЇ
Специфічні відносно домену ЇМ
Специфічні відносно домену ІМ « перехресно реагуючі з антигеном миші 6 |Що вступають в реакцію зі всіма конструкціями
Що вступають в реакцію тільки з антигеном ДТ людини
Таблиця 4
Конкурентний ЕГІЗА із застосуванням дос і фагових антитіл. В конкурентному аналізі використовували чотири антитіла до: два антитіла до НЕК2, що розпізнають домен ЇМ (трастузумаб і РО1849); одне антитіло, що розпізнає домен ІІ (РО2971), й одне антитіло негативного контролю проти К5М. Спостерігали зникнення сигналу, коли конкурували фаг й антитіло, які кодовані однаковими генами варіабельної області; тобто МЕ1849 і РО1849, і
МЕ2971 і РО2971 нншшЕнш МЕТ849 МЕ2971 | ме2708
РО1849 0043 0,04 рог971 ННІ 00000000 ше
МАТ проти КБУ 0,044 с, 0,047 шишишшшшшНИи її. 0,038
Таблиця 5
Розподіл на групи антитіл до НЕКЗ в залежності від їх реакційної здатності відносно химер НЕК2 пацюка/людини і реакційної здатності відносно НЕКЗ і НЕКЗ іншого виду. "Кількість" вказує на кількість унікальних антитіл в кожній групі 4 Висока реакційна здатність відносно домену ЇЇ, реакційна здатність відносно пацюка та миші, і незначна реакційна здатність відносно домену ЇМ
Висока реакційна здатність відносно домену І, реакційна здатність 2 відносно пацюка, людини й яванського макака, незначна реакційна здатність відносно домену ЇМ
Реакційна здатність відносно НЕРЗ пацюка, яванського макака та людини
Реакційна здатність відносно НЕБЕЗ людини
Що вступають в реакцію зі всіма конструкціями
Таблиця 6
Функціональна активність найбільш ефективних моноклональних антитіл до НЕКЗ2 при концентрації Ідо 1 мкг/мл. Відсоток активності у порівнянні з еталонними антитілами, тобто, трастузумабом в 5КВА-3 і МоАБбЄ в МСЕ-7. Для антитіл до НЕКЗ домени всіх антитіл, за винятком
РО2926, були картовані на домени І, ІІІ або ЇМ
РО ІН Група епітопу | Домен НЕБ2 КВВ-3 МСЕ-7 раг916 НЕН2 ЇЇ 7171 7777171777717171771115896 | 3096 раг973 НЕН2 ЇЇ 7171 777717177771717171114996 | 5896 щ нЛ(Ч
РОЗОО4 НЕВ2 | 1 Її 11 4995 | 56956
Таблиця 6
Функціональна активність найбільш ефективних моноклональних антитіл до НЕКЗ2 при концентрації Ідо 1 мкг/мл. Відсоток активності у порівнянні з еталонними антитілами, тобто, трастузумабом в 5КВА-3 і МоАБбЄ в МСЕ-7. Для антитіл до НЕКЗ домени всіх антитіл, за винятком
РО2926, були картовані на домени І, ІІІ або ЇМ
РО ІН Група епітопу | Домен НЕБ2 КВВ-3 МСЕ-7 ра1849 НЕН2 разог25 НЕН2 ЇЇ 7171 77771717777717177113896 | 2896 2 рОг971 НЕН2 ЇЇ 717 Ї7777171777171171171112596 | 5196
РОЗОЗІ НЕН2 ЇЇ 717 Ї7777171777171717177113396 | 9896 раг926 НЕН2 рРОг930 НЕВ2 | 3 ЇЇ т 109 | 79
Таблиця 7
Функціональна активність найбільш ефективних моноклональних антитіл до НЕКЗ при концентрації до 1 мкг/мл в аналізі залежних від НКО МСЕ-7. Відсоток активності у порівнянні з еталонним антитілом МодЬб ро ІН Група епітопу МСЕ-7 раз178 НЕВЗ 162 96 рОЗ163 НЕВЗ 119 96 раз176 НЕВЗ
РОЗО99 НЕВЗ
Таблиця 8
Забарвлення в аналізі РАС5 антитіл до НЕК, у яких МН НЕКЗ використовується в комбінації з легким ланцюгом, відмінним від загального легкого ланцюга, вказаного на фігурі 16. МЕЇ вказує на середню інтенсивність флуоресценції при аналізі РАС5. Номер МЕ НЕКЗ зазначений в дужках, зв'язуючі НЕКЗ клони в контексті відмінного легкого ланцюга вказані сірим кольором
ММС
Клітини К562 (отр.контроль) Кьв2 НЕН2 род462 (МЕ2971 вияв ре4463 (МЕЗ3958 вв ро4474 (МЕ2916 во
РО4478 (МЕ2973 ев рОд481 (МЕЗО04 шли
РОДІВ2(МЕЗ025) 1717101010101010101010101029911111111111012000 ро4483 (МЕЗОЗ1 во
РО4465 (МЕ1849
МАТ проти НЕВ2 во. ИВІВ
МАТ проти АЗМ
Таблиця 9
Функціональна активність головних біспецифічних антитіл до НЕК2 х НЕКЗ (позначені із застосуванням префікса РВ; кожне РВ містить плече проти НЕКЗ і плече проти НЕКЗ, як зазначено в таблиці) у порівнянні з антитілами порівняння в аналізі залежних від НКО МСЕ-7 і
ВХхРОЗ. На підставі профілей зв'язування при застосуванні химерних конструкцій проти НЕКЗ2 і
НЕРКЗ, антитіла можна розділити на різні групи. Для антитіл проти НЕКЗ2 домени всіх антитіл, за винятком РО2926, можна картувати на домени І, ІЇЇ або ЇМ
Плече проти | Домен | Плече проти Група .
Назва НЕВ2 НЕВ2 НЕВЗ НЕВЗ | МОР ВхРОЗ 11111111 пово (ом)
РВЗА4І 2926 3178
РВЗ44З 2930. | | 3178
РВЗ448 1849 3178
РВЗ565 2973. | 1! 1 3178
РВЗ566 3004 | 1! | 3178
РВЗ567 2971 | 1! 1 3178
РВЗ709 3025 | 1! | 3178
РВЗ710 2916. | 1! | 3178
РВЗ883 2971 | 1! 1 3176
РВЗ986 3025 | 1! | 3163
РВЗ990 2971 | 1! ЇЇ 3163
РВАОТ І 2971 | 1 1 з3099
РВЗ437 3031. | 1! | 3178 разЗ178 3178
Мідрб | ЇЇ Ї7777171717171717171171Ї171717171717111504 77111796 трастуз. х пертуз. 177111111119552 | вл трастууумаб| ЇЇ 77777111 5о0 11111361
Таблиця 10
Значення афінності моновалентного зв'язування антитіл РВ4188 і РВ3448 з НЕКЗ2 і НЕКЗ, виміряні в аналізі ВІАСОРЕ. В обох біспецифічних антитіл однакове плече проти НЕКЗ. н/п - не проводили
Рв «(| КО на Нег2 (НМ) КО на Негз (нм)
РВЗ448
РВА1Т88
Таблиця 11
Групи лікування в дослідженні ксенотрансплантата ЛІМТ-1
ЛЯ ло ІФБР////777777777717171717171717171717Х 171- | і/ (1 р/тижх 4 (начало в день 1) 2 110 |Лапатиніб.////777171717171717171 111150 | п/о /1 р/добу х 28 (початоквдень 1)
РВА188 - 125 | і/п /1 р/тижх 4 (початокв день 1)
РВА1Т88 7-1 25 | іл /1 р/тижх 4 (початокв день 1)
Пертузумаб я трастузумаб| - 2,5 | і/п |1 р/ тиж х 4 (початок в день 1) 06 01 10 |Пертузумаб нтрастузумаб| - | 25 | і/п |1 р/ тиж х 4 (початок в день 1)
Таблиця 12
Афінності міченого "25 (3 проти НЕБ2ХНЕРВЗ (РВ4А188), НЕКЗХТТ (РВО215), НЕБ2ХТТ (РВУО216) і герцептину (моноспецифічного до НЕК), які визначали за допомогою вимірювання афінності стаціонарної культури клітин ВТ-474 і 5К-ВВ-3. Результати були отримані в трьох незалежних експериментах нн вТ-474 ЗК-ВА-З 3,750,5 НМ 1,30 НМ
РВА188 3,250,5 нм 2,0-0,4 нм
НЕВ2ХТТ 3,9-0,6 нм 2,350,7 нм
НЕНЗХТТ 0,2320,08 нм 0,9920,4 нм
Таблиця 13
Середні реакційні здатності зв'язування білків (і діапазони), перераховані для всіх виявленних залишків, що мають вирішальне значення. Залишки, що мають вирішальне значення, які беруть участь у "зв'язуванні Р3958ГРаб, ідентифікували як залишки, мутовані в клонах, які були негативні за зв'язуванням з РОЗ3958Еаб («35 95 ДТ), але позитивні за зв'язуванням з контрольним
МАТ 1129 (280 95 ДТ). Виявили два додаткових залишки, що мають вирішальне значення, які не задовольняли рекомендованим граничним значенням, але мутації в яких в меншому ступені зменшували зв'язування антитіла. Нумерація залишків відповідає нумерації РОВ ІН 1578
Зв'язування Раб РОЗ958 Зв'язування контрольного
Залишок Мутація Фо від зв'язування ДТ МАТ Позначення
НЕН2 ; Фо від зв'язування ДТ (діапазон) . (діапазон)
Т144А 31,9 (11 82,1 (13
ВІб6вА 32.2 (5 93,7 (17
ВІВТА 10,1 (5 98,6 (34
Р1І72А 52,5 (2 94,9 (24 Другорядний
С179А 41,7 (18 87,9 (25 Другорядний
Таблиця 14
Середні реакційні здатності зв'язування білків (і діапазони) перераховані для обох залишків, що мають вирішальне значення. Залишки, що мають вирішальне значення, які беруть участь у зв'язуванні РОЗ3178, ідентифікували як залишки, мутовані в клонах, які були негативні за зв'язуванням з МАТ РОЗ178 («20 95 ДТ), але позитивні за зв'язуванням з контрольним МАТ 66223 (570 95 ДТ). Нумерація залишків відповідає нумерації РОВ ІН 4Р59
Зв'язування РОЗ178 Зв'язування контрольного
Залишок Мутація Фо від зв'язування ДТ МАТ Позначення
НЕВЗ . Фо від зв'язування ДТ (діапазон) ; (діапазон)
Е409А 16,74 (8 79,63 (0
В426А 3,17 (5 93,08 (36
Таблиця 15
Перелік виставлених на поверхню залишків усередині радіуса 11,2 А від Агу 426 в НЕВЗ:
Ї ви 423 І 423
Туг 424 Уд2г4
Авзп 425 М425
Спу 427 с427
Сіу 452 са52
Таблиця 15
Перелік виставлених на поверхню залишків усередині радіуса 11,2 А від Агу 426 в НЕВЗ:
Таблиця 16
Система бального оцінювання для контролювання гуманних кінцевих точок
Показник Бал
Зміни маси тіла «20 Чо 0 »20 Фо З
Зовнішній вигляд
Нормальний 0
Недостатній догляд за поверхнею тіла 1
Невеликі укуси або подряпини. Наявність відокремлюваного з носа/очей 2
Сильні укуси або подряпини. Аномальне положення тіла, кінцівки, тремор тощо З
Неспровокована поведінка
Нормальна 0
Невеликі зміни 1
Аномальна, знижена рухливість, зниження рівня пильнування, неактивні 2
Необумовлене видавання звуків, самоскалічення, або дуже неспокійна, або нерухома З
Поведінкові відповіді на зовнішні стимули
Нормальна 0
Невелике пригнічення/посилення відповіді 1
Помірковано аномальні відповіді 2
Люті реакції або коматозний стан З
Потилична пухлина
Немає 0
Пальпована 1
Сумарний бал" " Умертвіння миші за умови: - Сумарний бал » 5, або - Бал дорівнює З для будь-якого одного показника, незалежно від сумарного балу
Таблиця 17
Хронологія експериментів на тваринах
Дата Процедура 03/08/16 Прибуття 10/08/16 Закінчення акліматизації 17/08/16 Внутрішньочерепна інокуляція пухлини 05/09/16 Перші процедури МР-візуалізації до початку терапії 09/09/16 Включення в дослідження першої тварини і початок терапії 04/10/16 Включення в дослідження останньої тварини 2510/16 Останній день терапії 12л1/116 Умертвіння останньої тварини
Таблиця 18
Огляд досліджуваних груп і введення дози
Група К-сть Сполука Доза мишей
А 8 Середовище 4х2 р/тиж, 5 мл/кг в/в (сольовий розчин)
В 8 т-оМму 4х1 р/гиж, 10 мг/кг, розведений в сольовому розчині, 5 мл/кг в/в с 8 МС А-128 4х2 р/тиж, 25 мг/кг, розведений в сольовому розчині, 5 мл/кг в/в
Т-ОМ'І, 10 мг/кг - МОСГА, 25мг/кг, розведений в сольовому р 8 Т-ОМ14МСІА-128 розчині: 4х1 р/гиж, 5 мл/кг в/в МСІА-128: 25 мг/кг, розведений в сольовому розчині: 4х1 р/тиж, 5 мл/кг в/в
Таблиця 19
Дата включення в дослідження й об'єм пухлини в момент включення в дослідження
Група Мо миші Дата включення Об'єм пухлини (мм3)
А 16 09/09/2016 15,9
А 17 09/09/2016 111
А 21 13/09/2016 17,6
А 23 13/09/2016 13,5
А 26 13/09/2016 11,6
А 11 16/09/2016 11,0
А 36 20/09/2016 9,3
А 1 27/09/2016 9,5 в 9 09/09/2016 12,3 в 14 09/09/2016 16,7 в 25 13/09/2016 18,6 в 35 13/09/2016 92 в 24 16/09/2016 10,0 в 5 20/09/2016 15,7 в 32 23/09/2016 101 в 34 04/10/2016 144 с 18 09/09/2016 13,7 с 43 09/09/2016 13,2 с 7 13/09/2016 11,2 с 29 13/09/2016 114 с 42 13/09/2016 16,6 с 30 20/09/2016 9,8 с 37 20/09/2016 14,8 с 27 04/10/2016 9,5 р 8 09/09/2016 21,7 р д1 09/09/2016 12,5 р 38 13/09/2016 15,9 р 39 13/09/2016 10,6 р 40 13/09/2016 9,7 р З 16/09/2016 11,6 р 31 20/09/2016 9,8 р 19 23/09/2016 13,8
Таблиця 20
Бальне оцінювання набряку головного мозку . Бал набряку головного мозку й .
Група Мо миші 4 З 7 10 14 24 28 з5 до Підсумковий бал
А 01 1 2 З З З З
А 11 0 1 1 2 З З
А 16 0 0 1 1 1
А 17 0 0 0 1 2 2
А 21 1 2 2 2 2
А 23 1 1 1 2 2
А 26 1 2 2 З З
А 36 2 2 2 2 2
В 05 0 1 2 2 2 2
В 09 1 1 2 З З
В 14 0 0 1 2 З З
В 24 1 2 2 З З 4 4 4
В 25 0 0 1 0 2 2
В За 0 0 1 1 2 2 З З
В 34 2 2 З З З З
В 35 0 0 1 1 2 2 З З с 07 1 2 2 2 1 2 З З З З с 18 0 0 0 0 0 1 1 с 27 1 1 2 2 1 1 1 с 29 1 1 2 2 З З 4 4 с Зо 2 2 З З З З З З З с 37 1 1 2 2 З З З З З с 42 0 1 1 1 1 1 1 с 43 0 0 0 0 1 2 З З р ОЗ 0 0 1 2 2 З З 4 4 4 р о8 0 0 0 1 2 З 4 4 р 19 0 0 0 0 1 1 1 1 н/в 1 р 31 2 З 4 4 4 4 4 4 4 р 38 0 1 2 З З З 4 4 4 р 39 0 0 0 0 1 2 З З 4 4 р 40 1 1 1 2 2 З З З 4 4 р ді 0 0 0 0 0 0 0 0
Бібліографічний показчик
Апеада СІ, ЗімкомеКкі МХ, О5Брогпе СК, Регег2 ЕА, Ридіїві Е, Сіаппі С. 2011. Ттєеаїтепі ої
НЕН2-розійме Бгєавзі сапсег: сштепі 5іайи5 апа їшште регзресіїме5. Маї Вем Сіїп Опсої. 2011 Мом 29:9(1):16-32.
ВаїКо ОМ, Мійег ТУУ, Могтізоп ММ, Ниїспіпзоп К, Моипд С, Кіпепап С, запспе М, дее 0,
Роїуак К, Ргаї А, Регои СМ, Апеада СІ, СоокК А5. 2012. Тпе гесеріог їугозіпе Кіпазе ЕТВЗ таїпіаіпе Те Баіапсе Беїмееп Іштіпаї! апа Ббазаї Бгеазі ерйіпеїйшт. Ргос Маї! Асай 5сі О 5 А. Уап зп09(1)у221-6.
ВазеїЇда У, Сопез у, Кіт ЗВ, Іт 5А, Неда ЕК, Іт УН, Котагп І, Реагіпі УЇ., РіепКомувкКі Т, Кпок А,
Сіаж Е, Вепушпе5 МС, ВКо55 С, Змаїп 5М. 2012. Репигитаб різ ігазіигитаь ріив досеїахеї! Тог теїавіаїйс Бгеаві сапсег. М Епді У Мей. дап 12;366(2):109-19. де Кгиїї еї а. Мої. Віо!. (1995), 248, 97-105
Емег М5, Емег 5М. Сагаїіогохісйу ої апіїсапсег ігеаїтепів: М/наї пе сагаіоіодіві пееаз о Кпому.
Маї Нем Сагаїйої! 2010;7:564-75
Спцатетгі даіп КК, Сазрег Е5, СеїІег МІ, еї а. А ргозресіїме гапдотігей сотрагізоп ої ерігибісіп апа дохогибісіп іп райепів мій адмапсеа бргеазі сапсег; У Сіїп Опсої! 1985;3:818-26
Успшйа ТТ, АКпа НМУ, Рагзопе К, Рієїд5 С, І емів РпНїййрз СО, Егівдтап 15, Затраїйй 0,
ЗІім/Комекі МХ. 2009. І ідапа-іпДаерепаєпі НЕН2/НЕВЗ/РІЗК сотрієх із аізгирієа Бу іазіигитар апа і5 еПесіїмеїу іппіріеа Бу пе РІЗК іппібійог 1000-0941. Сапсег СеїІ. Мау 5;15(5):429-40.
У,пйа, Т. Т., К. Рагзопв, вї а!. (2010). "Буирегіог Іп мімо ЕпНісасу ої АГисозуїаїейд Тгазіигитаб іп
Ше Тгєаїтепі ої НЕН2-Атріїєа Вгеазі Сапсег." Сапсег Везеагсй 70(11): 4481-4489
Мегспапі єї аІ. Маштге Віотесппоіоду, Мої. 16 дшу 1998 рр 677-681
Мівзіт А, Ноодепроот НЕ, Тотіїпзоп ІМ, Ріупп С, Міддієу С, Гапе 0, У/іпіег 0. 1994. Апіїроду
Ттадтепів їот а "зіпдіє рої" рпаде аїзріау Іргагу аз іттипоспетіса! геадепіб5. ЕМВО 4). 1994 Рер 1713(3):692-8.
Осапа А, Мега-Вааййо Р, Зегида В, Тетрієїюп А, Рапаїєйа А, Атіг Е. 2013. НЕВЗ омегехргезвіоп апа зигуїмаї іп зоїїа Штотгв: а теїа-апаїузів. ) Маї! Сапсег Іпвії. Рер 20:105(4):266- 73. зегдіпа ММ, Ваизсп М, Уапо 0, Віаїк у, Напп В, 5поКаї КМ, Моаззег ММ. 2007. Евсаре їот
НЕН-Ттатійу їугобвіпе Кіпазе іпрібйог Шегару Бу Ше Кіпазе-іпасіме НЕНЗ. Маїште. дап 25:445(7126):437-41. зепаеєтег еї а). Сапсег Сеї! 20, 472-486, Осіорег 2011 зЗеспоебетг! В, Рабег АС, її 0, Папа МС, Сто5бу К, Опзут М, ВигтепКома 0, Расе Е, Ууаїюп 7,
Мівє Г, Ршднат А, 5019 У, Мівізеп ОВ, Епдеїтап УА, Ууопду КК. 2010. Ап ЕГЬВЗ апіїбоду, ММ-121, ів асіїме іп сапсег5 м/йй ІІдапа-дерепаепі асіїмайоп. Сапсег Вез. Маг 15;70(6):2485-94.
Зпатевз еї а). Р О5 ОМЕ, Рергиагу 2013, Мо1.8, Із5!це 2, рр 1-10
Таппег М, Карапеп АЇ, дУипніа Т, Вабеєт ОО, Стептап 5, ЕІо У, ЕІепій5 К, Ізоїа у). 2004.
СНагасієгігайоп ої а помеї! сеї Іїпе езіаріїзней їот а раїепі м/ййп Негсеріїп-тезівіапі Бгеаві сапсег.
Мої Сапсег Тнег. 2004 Рес;3(12):1585-92.
Уагаєп У, Ріпе5 .2012. Тне ЕВВВ пеїмогк: аї Іазі, сапсег ІШегару тевів зузіетв5 Біоіоаду. Маї
Вем Сапсегуи! 12;12(8):553-63.
ТНегу 9.-С. еї аї., Везізіапсе 0 НПитап ерідента! агоУлЛИи Тасіог гесеріог їуре 2-іагдеївйа
Інегарієв, Єиг ) Сапсег (2014), Мої. 50, Ізвце 5, радез 892-901
М/аднула 0, Ранйан-Рай М, Степієг 0, єї а). Тгазїшгитаб теадіаїеа сагаїіоіохісйу іп їТте зеціпу ої
Ше адіимапі спетоїйпегару ог Бгєазі сапсег: А гейгозресіїме зіцау. Вгеазі Сапсег Ве5 Ттєаї 2009;117:357-64.
Менптап Т5, Вааб М, Савзірії СІ, ЮОоуоппаз В, Ротегапі» УН, Віа НМ. 2006. А зувієт ог диапійуіпд аупатіс ргоївіп іпіегасіп5 аеїїіпез а гоїе Тог Негсерійп іп тоадиіайпа Ева іпіегасіїоп5.
Ргос Маї! Асаа 5сі 0 5 А. Оес 12:103(50):19063-8.
ММіїзоп ТА, Егіауапа У), Мап У, Репиєї! Е, Випоп І, СНап Е, Репа У, іп Е, У/апд У, 5озтап У,
Віра5 А, її у, Мойаї У, 5йшйепіп ОР, Коерреп Н, Мегспапі М, Меме В, ЗешШетап 9. 2012.
Міадезргеайд роїепіа! Тог дгоулн-Тасіог-агмеп гезізіапсе о апіїсапсег Кіпазе іппірпог5. Маїшиге. УциЇ 26:487(7408):505-9.
Уопезака еї а!., 5сі.їгапзі.Меай., Мо!.3, Ізвце 99 (2011); рр1-11 папа Н, Веге2ом А, Мапд О, 2папд С, Огебіп У, Мигаїї В, Стеепе МІ. 2007. ЕГЬВ гесеріогзв: тот опсодепез іо їІагоаєївйа сапсег Іегарієв. /) Сіїп Іпмевзі. Ацд;117(8):2051-8.
Стесо, Вгамо, Рагзопз (1995) Тне зеагсй ог зупегду: а сійіса! геміем їїот а гезропзе зипПасе регзресіїме. Рпаптасої. Нем 47 (2): 3931-85 м «пушІУєМ мих Ми
ПЕРЕЛІК ТКУ МОВО о Хаимзива Е «ІК Ммехмит МшЖ. витотрв К ек зх пан ох БМ но КА міч токіУї жіктих пхоювей ее о ст кт ке «їй» вгант, нЗнілений на ЄВ, їз бБісненивічме зве З сажа у ЖК лих хх вав КВ зв'язування НМ, ще мкл Є одокики удвох фай перхкї кжех мерхва іі 0 зуменуніняї ШМК Її Бо 0 поло З моли вка ав'юнують еипЗзжом ва позазжловивній зЗзвохина ЖКЕщ- л БЕЗ, зм лУкуввни: тела Ох или скани их М А, ШеМмідє ко Ом ту Ку іншим Гео Ех ех,. ХК ХК Ки ПУЖЛМИНОК
СТВ Ух, те тощо ва
КИМ МОДА
«ДОГ жк ам гу Ви «ай І ог В ТУКА хЖМя КУ КАМ им МУ МІХ
ОК, пра ди в 8 З кІАчщі-х шинах ауру шко злак ви В «Ай БЕ КТуКачав.В сажа ж м щі «Би Оле їд сушоох мо вд в ол Ко ху ша зх
КОХ поїв, КУ шо КО пет «мі ше сх жо «ВМ 00 А повзе ХУ дк у сшодіуєсм й ОКО
Али ХХ КАЙ БЕК Ух
УОЛЕ- 5
УМХ Хх юю Ех «ОКХ ІМ дет мк гл оди ви щи
ФК ощхх піків хау мері чех, шли ІИМАХКЕЮ ЗХ ЕМИЛК ВЕН КМ
Ух ох гаї МЕЗО «еп МЕ ЗКе
ПК
Межі АХ
ОК ЖХбої ст тю я сте шт М єпи
ХХ Дт ТХБЛЕКИЧМ ЗБОКУ
МОЖ ЖІ ФЖСЖІх кю ема ж
ОД Кх
МАХ х спирту поса саш о ЗМме сама р са шу Ук «а УС шу Я У «є ХЕ ж Ж жо: т кт ку М КЗ хе бі ФУ жук
Ми Мі пів Бе сіб бів ех бі ЖЕб уз ве з п йо
У Ку її
З вах см сур де: ба ж вва у бом Кщое пд щей вик зх хви а тт З ХМ рф Ух вс о шк ВО см мує АЮ ЖИ ХМ ЯКЕ ВО Ми хг, Кім Ли м СА ху ти Же Ж кр Толі лу ле бкзак о Моххух ОД «шк. С ож
Мах Кув БО пі Ав ек Уві Меї біб пек СУ пр ки ех щі УМ
З хх ср хх я сек ки
Море ЖОВ ложе осфужут Ж ощсих сжехут що ході ічеж о др сдуєу оєУщих оджоюі ших сто пдре. їх та о чдУукА ВУХ Є ас сем ех зас сов чим ва са жк Кс Ва їх
Фк ШХвіах ЖТюа ЇЙ у ббдюаю ЩІ во М фреує п ЗК бах Тк хх ії куу ЇЇ ото
ЕМО жЖНа АК ЗА АВЖ ОВІХ Меї дЕВЗ ХХ ООЖЯКУ людшю ХиКОСаЕЮ КЕЖ ЇВ. люк ве тк «їх
ХУ ях хе ап СЕЗ паз Са зо лов зас ес ва ос ще БІ с всех зи че 55
Ск Хлзії (їх божу їх їбх3їх их ТІ; Ту Же Шик Ж Сі бю ка віх шк М о АМ ЖМ хаАжоАЮ МВ ЗАВ ОВО ТЕ УНК МАВ М ММ ЗМЖ ВАВ ах За 55 утри опоЕо сзце КК век суреу свуєчт фщум сіру пуща же ев с рве дод свя зав.
Ману жк жа ож Се аж их зе ЯМ а ше ше Бе вва Кшс аа шлю фу сх Ст ско ох т з же Ж МОМ Зжа поко їх жує то Же
Ніз Блвопів їж кБяа джу лів Бу дів ТМЄ МеУ Тв Уві др о Мув Бах п м за «к ж Щлх М КО : : : ; в звіу фс ус поет о схІвих бом амо мий спади су смс е схов їх ук щі Же о фу хи Ба» а хо ВО ее щи бах зі са сш зви заш ше За хм дамо и хх каси кн же МУЮОЖ ОМ З Мк шк ОХ жінк Ж т том вже Мих жука вах ов к хежЖ Кавове і ТСух Мет діб беб БУВ цех бео ТМ БЕ 3 ве лах їх хм пл
З Зх МИ зхежц ствах пюдю и дю аж диву пжитжих ум драми с ижиж веди фу МО см хх о ж ВІ «Ії М БИ ща пи ЗХ ща ше Я ре джу МЕМ ЖИМ чех МОМО МАКУ КО с ши ху Фе бю й Кз З. ки т же дам Ж ху Зх мух уз ду зам А жі Ух ХУ Іа ж АК сту ее жи Зк КМ В ЗА АЖ тп Зелуих ог з5 Та Ж сс пса ба сп аа зе до чи Бе дик ВУ
ШО ож ша ох ХМ ух кН ши СС ва их ге бр ФА. сю мох зи жа жк Жим сах шо жНЕ овалу МЖК де жмжЖ Уві Беж шк її тр
МІ 5 ке Ж, а
Ме к ту ях «ВІЇ 7 муху кр скки «шій ПЕ «иа» шШеУчна послідовність свя
У
«брови квест укІй і
А внут киВвеввукция
КН - кох я ск ух боку фах у ум 3 че бу М Ж у Жах Мн ях їн
Ма ж ЩА КМ АВ ЗАМ ОБЖ іх Же 03 їжа ві Буш Вт су Іі 3 й М Ма
Сбехк жі МУК бів бщжж бос ма Зі бюу Пас; бок буру вв ВБВк ів о Жею ам Ум жи лАФш мМХх ши му ха ЗзшХ чу ЖК мих ММ о жхлЕ ЗА Кук и 5 ко тк дн жа 2Мхяю у Уч бсщовю бруд Мк тк га вх м чо
Ні МеЖї шо жжтюв ові Бу Бір беж жо Зізч був Зв зем шо же о в ух щи 45
ПС жи М шо х С 2 дж СК Ж ж ро СВ КН 3 ж шу Ж х Тхір: піж блю Її бив ВКо бек фі пі Тв ТБКоДіва Вів дя їв бе Ба ке Кк КК щи мо 5 Би
Мк ЩІ ту о ською з ан ЖК шк тує бухж о Жінки Ва ЖК и ЗЖхєж
Ах Аз ув Мів їх Же їж баї бер обу бе Хвк би Ск Аза бух сах яЖЕ «ки Я
ТО ТМ КА
Зак т Форум Ж ож Ж Кам: Му боках Яру ово руч курія жк нує бадує бум мак Бай мез Шу Ж Сей; їТлЕЖ ЖежЖ бів БЕБ о шекх сів хах БНФ оЇЖх вуж 85 за ва чу З Ки ; пох м Мих ка т т «а: їх МК ях тві хе Ак а Ав їх бдех Бне вер ові тк пЕм аж Сук ЖЖ лк хо те К т:
М ща 115
Уві лвж Уві беж ве зх «ійх З ких АВ
ЕК ТІВ хо кут їж
ШОК. У »жмуьхУ пихи зум я с жк 0 мотучня поету ит
У
ЖЖ
Олю ж УУкІМ ам У «кв СИНІ МЕ ЕЕ хОКор хх з «Не Я
Я ж ка ЩЕ их то ат же ЖК лев Уч й кю стжакк о рю Кк у І іш уж Кіз Маї вл Кр Уж був іа ЗЄжЖ вже силь Був ЗВЖ Бем БІ5 ч щ т їх ч ж не КЗ 15 «я В хм С кл єди мрім жи ЕХ ноти То, Я «т: пкт др тир ил «а пе усна посла щовІ се клю «ик я кою тум, ум Ми ОН «Те «САМ В ку х самих
Жила Мб тлу ВА оч В ха жів ді КБе дже ВІ 2 Х,
Зх. ХЕ ке к
Ж, й як ах сек х ж Дх з «шим аж Шеучно сові ие се
КК Укуси ККУ ВВЕ са ДИНА Мих А Є хо ак шо сам Ох
Жету Сік хх бек бу іх Кит Ма джч со веж с ше ме дшфК Во я х ик с «ЕД В шк тру ки ях тк, кп ток АУМІТ» ши ою позна п І же г. сон мМ ОСНОВЕ
Ел
ХК. рих гу щшштахк акцію 0 МИЛО «УЗИ оду я ж оуким ис дрсмеуті і и вії ку до КАК МИЧ ВИМОЛЬКА В ККУ
КЕ зп їла «ЕК ХХІ сх ВІ
Ах 5 міти уст кииву стики В рувичим бі ЖЕ и озлухх яти сут хі Бус ж о уче см су ех ще «зІсссквцосч часних се ато сам са св се Сех ЧО ЯК ще Ка ж
КЗ хі Заг Тек їі суху (ШЕ Ж 051 хі іч ві лів бе бі Бі пек сі» 5іа Бім Бе ен нн НН НН НН ячих о жк жави х те то сію оцих аа
НН шк ща о ша шк ах хе ло ше Ну ЗЕ БУ Фе МЕ даю Сб: фУлеию ТИш Ж ОЗ мае хх ик жде Ух фаху бюро тод і мух ЕЕ же ох тв бе Бий Зі дів Беж УЩщІ ЖЖ меж ак сей М МЕ КМ СК У ЖЕ
А вм я вози КИ в емо ВЕ о да жунх Ів вто вн хво УЖ Ох ххх за хх ах о Ми о вше о сЗвЖЕ со вка о с зрч вуз аа ово ЩО ша ща Зах Зах «ФК ке со Ху фщоже же Ми Жештяє ОКО о Хе Кк ока Кв їж МК ск ЕМ З мах
Твжовне Тв БФбе Тук Бк їі йіз Жкюв МеК уж ЗіБ Уа КА ос ЖЕ за зв 48 єм ке: тиж й жжуж СаО джу що сен узи оця пи пу о у по мое З 5 айс ска ща Саух зе ша ха КК са ну бла ач ВЕ ах з МК ті боезуї. ЖК Ух ие Же Я єв лозі диму 3ЩЇ ше фі ем ба шому их У кх сор жи ак веж щи шим б Бл ЗУ дви БВ нів Кто ЄтУжш ЕХ щи ВВЕ п МмиК ях я ши їде фут сви дих Кк пом же дом сміх дози Хоб тУ КО Жов чи ща аа Ох ад
Меч МЕМ жо ЖИХаХ ОМеХАТИ ол САША М МІ ие ШЖЄЖА мМ МІК ЩИХ ХМ ЖА Ж Му, ЛЕТ би жу и Ж ЖИ Лоу Ух М хх Же юю тих м СТЕ їх Жогус ху
СшЖМ ОК КАМ ОМА ММ МУ ХУ ж КО КМ МО Теж Уві В муш мих ах ко серих -чЗ
Б МОУ т ЇХ . ду жан о фен щей стуки Мох ум худу Уфа суди" джек Ме суфУцю тує жждуЮ. слу б ее ек в жи ЗК виш Каша Че що чо сл пов апа пе Зак оЗатИ БЕ МЕ дар ах Ж тої жу тому; М х Боміх їаое Му бод Шви бю мух жу Ж
ХХІ ЕКО ОЩХ УА ЕМ БМХ що ля ж АКщОЇ зе АЛ жах сег ми ОЕЖ ший ВЕ «ЕВ
Те 5 ве ек о фей жк жо Ка ЖЖ вже ско ; жжвох сша ка жЖаж жди ж сук цих пах
Феї ще аж сво Ж пов а за аа с ке Жах каз КК ЯК ЯМ о хЖжІуХ сек бах ках їх жк ом ж ке, збозжх сЖ У зум Ах І ХХ
Вісь Мві бує Тек Су дів буч беж даю о Бже пеєб Ту теє ву КЕ Мек 7 ше. пк то ах шо ЗЕ милі дих бот о кох су яжежо сухих жів ак кити МКК іх схвуЖК БАНОК число хво спсОеч Зч схааА са во Се Ко сит ЗМ С Я СО божі бах лмєеу ля ж ЕІ ж беж Хо хз сх хі дах шЖкує ев ТЕ же щіУ ші А тах Беж ЗВ вих УК Бах Бе
ОТ хх КІ хи ЗХ хе «Ок скиж кс члуд у Ки хх жк МЕЖ ее ссМмлткІМ Ох їх Ух зу т труд к іх с ж ВИК учна ких ех
Ох
Уа ЛИАя Микиту ему
ОІВ СМ ВІНОК
КК Бк «п тухтах ха и зу й сл йщу лік Ж о Ух сових ІВ Жабо бю кю Ви
Б Ма УАЗ БАК АХАЖ МТ УВК лЕАЖ МАВ ЗАМ ВИ ах КМ ОО Жх піх й 4 х 1 жо 1 х З Ж дрож жждих Жук Вк тую жує Мох їлЖ Жхшум Я и у Саую Бк, Фу пах бок щех Мазі Май Беж ее Му КУБ Ух ж ВАХ ж мл ж КМВХ же ЖЕ Х «ке ХЕ ах м Кк Не
Мк Тл Ж ся Му имя Жоєукл лож т Я сю ххх Ж чук юю Я му (ЗУ сб Ж ло пе іш ів ХК Мак м заАщв жВО ВАВ Беж вух ках зем щівВ ХЕ ГІіє зв ад Як
Ж ки Жду Муха М ок же Чек Ше жо Фогужу ХЕ ую Жов Му Ж хх ку КУМ ач пен Бве Мі БЕОо дУжК Хек вою ож вк Буш ТЕ БА Ав дам ЕЕ - шок коду чо й ЩО бок ви тм М хо сухо Тих СИМ їі с бСак баку Ши: ем С жю 134 спе
МЕ УМ ЕЕ АФК КК Ж ОМ Млх ЖК ях Ж НИК ЕК СХ Жах ж Ух до "тк тк ча
ШО же 5 о боки Я тишу Сук же їі ЖКк им хх шу Саух Ж хх схе кає їх
МЕМ ема БЕЖ ДУ ЩО УХА п ех ОВ ОМ М жк кшК Оу т дкох я
КО ЗЕ У
Що вот жу ус Же. фоаплі бою Масу еко 5 М ау а Мона 063 хе й вач шах вжи КО фр САУЖ ЖК шт ВІВ ж ВО ЖЕ ЖЖ Оу Ак тка зах 14 їм Ко х 15
Ток ух ле Фитих ЕЖЬ г че хат аж рая се Жах сек УА жк Уві ЖвеобБах
Вольво ОТЖЕ
КОХ ДК еко х «У я ел код КК Ах шо я 0 Ту
Я МІЖ
«АТ Опов ий МОМ НОВМКЕ неоху ху хх «ех самотня кежажт ду кв - ТАЖ сит у я МАХ МЕХУяЄ пу ба жу З ЖЖ мМ лама ЩІ чі ца ж сті ха аж бахам божу Зх
МК ОСКЖХ МЕ МЛМ ЛУК МЖК МУ МУ ХК ТМ МОЮ ХА ХОМ ЖЖ КАХ АХА
4 к тв 5 ї 5 «В ДМ ша Де 5 ве с зх КУ сту хо х щи ОКХ 5 «вії ПЕ
СТЕЖКА 0 Шеухоютю звіра ра Кі хижий жива ІЕМ а кий Же хх
СОТ суки: КЕКУУЦ І «ие КОМА МЕМ оку Кк, ту «ОУН Ж
Хосе Фу М шу реко ло Зх сш Зав ма ЖЖ був жу х х шк ж оєух, «їх «ех хо «ЕК 1 ит Ук туге ож ВЖК, Ех
ЕК Темп тету ев хв В с
Хнх Ж до ВУХ КІ. яна внас «КУ я ТЕТ КУ КЕ КИ ше УМ ОВ МЕЗО
ФУ її
Шожхо бчяио їв Ж кт Мугує СЮлує фе Ж о му Ю ОЗ хвою
Бех два жо їспь Бук Теж Бе бів Ме хе КУ ї Бу ії «Пій» «Вії» ЗБ у ме
У У АГЕТУ ше т 5 шо нн я МЕЖ ХІИХВ ХОЛІ ВАМИ К
ХОМ
«их «лужне м, змі ВЕ «Мей МИТ КЗ
ЕХ лиж КЕН ТИЗОМ АОС му ті зл «вий МО. 5 ех їх орлом рало Ва ІООросу КІ ух фею жо вус В сх І ше ек в ту дотаі ав є х хоп ЦЕ Ж гу. кю КК пе УВІ б без сві Зіз ех Зі ле За ВХ
У К БУ х х х зи мсют: фетьой хе хжемую ху рохжио се ю дк, ко Ж жу ож жу охо сих двох СЕТ тп см, Сб цип ще мою с ща же жк х З щи цс и ща кг а
Ул Жук ит у сх жо не бе оду Між сту КА дою са КТ и 0 ЕХ: ча Бій Б щі Бе За ей Б ев пе сш хв БІВ вк БАС Бо
Ж я ра
ОХ ОМ «ЕХ спражАщн Же дя кю шефи В кковя іа пк пк ех Кох жи хе. Ж УВИК УФК синам фюрж пРіце Б че кс вах з їакоше ака свое крок се оз чех сса цс ва ІЯ5 ж Ж Хе ме бу Ж юю дош ою Мін що щих С Ж й Ж гу. тд вх Бе беж ех Лек жіЖ Меб й їжев оті ВК с Ада вже ЗУ Буш ях ак ях не СХ ди ужжаю си жд сяжиж в жи ев У аж я УМО Ж дю ие щих У пе п СІ лм І З З зов очЕк ва са тах дак ча зач аа аа Ах МВА
Хе Жлмсю КМ ам бно Ж СК дуже мухи Ману Ж юю Же баки Ж хе бе
МКУ АВ АХА М АЖ Ж фе Ма а зх шЖх БЮ А ЖЕ Жад АЖ УК зе шх -
З о Бен пори а чн и в и НН Нв р НН КН се
ПЕ що. сао мамо зеЯ За пис са пеш вее Ж ЖЖ я ца це ВХ се Ка
Жівж Хі що Ма Ши З те 1 око ах бук Ж дк й ша щи ке
УЖ лук ТБ АХ УА дж ХК ТАК КИ АЖ хаос АКСО х щи Зап ООЖХ ка ша КК тк
М щл її ТХ соку дві щас сід аї ст дав ой вве шо сала влад и сок ни дос М чаш зви ому пе ов ст мая жом вве о вас вав що ря ВХ вк КУ лою Жду Пе Ж ишуло ЄМажує ОЖоеуї СИМ ФЖумія схдачя Сдує Ж му Ковию Вох Кия ою соту жк зе вва аж фено жк їм жд Ме важ сек ся ак ВІВ БУ Ка ТИ стучамо жжмею Мою форум екжа ето домом сш. амикк Зогзах дих фул босих ну йх у. фУдуех так зо: пф ах ас у» Зса зЗа со щас Бо сш Бшже Мам БО 55 Ве що ї хв ба Му т З Жажи 0 ою беж Са Та Шу фі Фе тя хкма Мі тТУух ТУЮ Су бів бив шоу вер о сбжк Бі ех Туш шеж мах тує
ЕК поем сх щх ще ЩО их ДОЮ. уж ду оду. зику сут сце ож мине схе («ім ризи фе ую ев зак че ми зах щас а «ща ЗщеЕ ж ЗК я Вио ме СИ ще зи ко оя Жук Може уже ж шт ки ил А їж Мою охо Хто ую и ек ЄКдх, иа Мне де ЖЖ ЕЕ НАМ АХ щу їж фі Зам КМЕ ді БЕЖ МЕ толк «Е Уа
МОХ ОХ ХХ ЖЕ ух чи
Ж ЖЖ жо жити
АК КК
«М МЕ яму мих м ю трохи захи і м І чую
ОХ ЦО УчЧчЕА ПЕКЛО ОУМ них ще
ЗК
УТ птиці МІЖіі ВИ М ахікомоеуммУ
Ти КАМИ ПАМ ТУНІКА МИ КОХ «ни 1 ск ха її тоді ЗІ ст бе ТУТ КУ ха їх ця 1 тема ТУ жкте ще жа МАЛЮК щем ж аАМ ОБЖ о мМу АЖ МАК М жах шаг Же жу ЕФ
Я В я 5
М З ІМ ех ана Жолуїх ач Ж екю Му со їх ох ох й хх ІМ ЛИ Юа а Шу СИ
ЕЕ сим с Ми ЕЕ и Ж мідь ЖЕ шо КІМ Ж КІЗш ах ЗЕ хх ЖЕ жа ак а
У 5 п хх ки ЛЕ ке Же С Тло Му ен ЕХ їх Ж ку (ХУ Жака КУ Можу їжу хх х 3 т тої р З т І х Ох 3 ї ї пі ву пішЖ ЇХ У жа жа ЗІ БО шу МУ БУ Ма ша КК УВА леж «її вк
У те Б я Фк я ЄХижж меж "х Сто ди ж ож дозжх Мк У су Мо оз, Хе ах ї ххзух Кк ХУ Зх х ї хе Шухх тома жь Зх Мк Тех ї зу Мах зб хв вх А МЕМ МУ в воза ях ме му ЖЖ ух ків да шо щЕк ВАХ п КЕ Ж
УКХ НУ ще том Я хо уату ШУМ бі ба бор щеня щу Дж Шауюо Тв ем ее Жопуї Мде кжЗ аж ак ме ЗК охАВ шЕЖ МИ БЮ яв -ех ня вне жпХ ший ще
ОХ ЕЕ Кк щ
Ме ях, бокх й З тов Іл Ми й хо їх щу В т лем ки М уки рда обхювиє їж их Ух Я Мо са и и КК Х з. их 2 Х КУ У пе паб Ме АацощБеє г А КУ ВЕ МАЮ ВА СУ зе дів Уді ЕК УК УМ що 5 М
Ж що ЗЕ ії Ж пі ши срок Зх ба т Шамо чук бід ЩЕ де Міка ду ав о БУх пів юю тек Зі беж тТух хеж пек Хек Ада Бе зво Ууж ТЖе ак як я
І сп є
Мк їз КАХ ех г ко и ЗИ Ках Жожхах їм бах тн м Же
ХО їх МЕМ ме дома ві ве Сі Хв Беж «ж ж
ОД Кк
КА ч у их А
Кк -. кої
Ж хх хх туди «кій ЕТ
ТЕ сив ккВ сим ук шко а ие, кеї» щеУчна послідовно стЕ
НК
«ших
ЛЕ зт кв ми часи щИиМА МЕТУ ох, пою
А КАХ саше бю МК жа думи ВІох
ВЕЖ ЖЖ ОАш ЖК ІА ї ху
МК ж ких ло кт З ки АХ її п ти ша ЛЕ
Код ее Томи мим оФУсТ ТІ ха
МІ ХМК ДЗ АНА ХКУК
«ЄОЛУМЕв
АКТИ пожеж пкт кг вах «Ми» сце КІ Я ши ДК ох мя хх кл хе В ож жах х ТЗ о ух дов Зозем Мчудх Лббхезу їх Хом 0 0 толусу чав їх БЕЖ БК Блю жа Бех бБат Му СУК ТУ Вл йо Беж вх мув 4 « кт кщ їх Х 45 дм
Ера
ЕХ, соку В хв дя сту 3 ей АК «їж МЕ те АКА. ме 0 Зх пусті веж чем кою КАХ шЕМЧІЕН МОМ ОАВЧНМИХЕК
СЕ лають отетхіль ЖУдМт 0 чел шо МЕІКаЗ си «Кк «ака І
Таж бом 201 щу «ню Ма по бах о вам бах пух
ЗМ АЮ УЖЕ са мех УЖ ВК ЖЖ СЖКоАЛ Же БОЮ ОКшЕ гуму аж
Кк ВІКУ їм «хі» ЗА шлю тух тер:
КК ЗУ мл рло щмахлкіус рек уж дує вжи «ХУ МЕШшУучхІ хни Хе. пежеу гу «ех «ший МЕТУ
Он гр
Ж
ФВ МІ ги сл УУя шк ТКХУЖХ УА БОС ІМ МИХ км ме кА ок ЇЖІ жк
СаО ї5 ин в и НН В НН НН НИ НН НЕ НН НН п застосо зоисатеи сш З о сля ся зва са Кк. жа ак ла є ще Ме герою ЕН жі. ож С Жовтя ТУЯ Факс хе Вк іл боку їі УА АЛМ МАМЯ ОМ Ах Зак шу М оОжКж ее Я ї п її жу утхІюх си УМ. сжсує его ел; їх мохи жах Ким Жов сф тем о фо ми ох зак чи меш їх ше си хо щем ше СХ их МО ки ЗХ шк ек ме хУщ фоетк Люжчя Сх З а ЗК Ж ко Вам служ су Мох ія Мрхю їх ах "ві вхп ож хім Аїв де Уві МУ Кей Бех сСУх Бах діа хв бі тек хо її Ки ях М я пн НН НИ хо ев люд их мож ах смт» кових ужито где ча чиї Екс ам ща Зо Ках ва вве Коч схЗ а пе ау СОС сша ся Мах усу Мр Моя А (во фуфя Мт Ж що жах Ми Ж Фони й Ви юю фе ха сх і ббе тях пах Тех Хжж їі а бо їв БЕЗ БІО Бош ВЕ о БАЖ БІВ
Б т й м к да в Зх ХК фр со ту фею сво сума доц УВО оц шо сих дю о жк о дощ о ва во ча че ПО ша Ка МЕ чив оаей ЕМ ЯМ ше В ак я ЯМ я Ах ек НН НА ЧК тк хх срхуди дУухихо т хе жом У у ша фе ста ї хо ХУ хі да Су т ж ї змо Ух ср думи З ху Хм СУуї у У шу стих кам з мА КЖЕВ ЛАЄ МІВ ЗУ БА УЖ ЖІ зам ож АК ЛК ОО КмВХ КУ хх КІ АК щх «ВАХ хх за па до фам БК сн се що сени вив ст цу са се сна лу а швах щи Фа сю жу ж Ва чек Во му шию ще ща ща ККУ я хаус ана сх тк Фурока Мекж М хи туда МО до км Жомхї на Ко ж М бок пу у їх бу ЩЕ мах хе лк їз мо Лем Ск 1. ів пі; ду
МЖх За мА ж Х це Ах ШОМУ Ж Ла АТХ мо АЖ МАЯ Ам ОА ОКХ
Ух сх ях «ча ї- т у ше М Б ТК
Феужих о фожух о що сжухих Мовою сх фу слух ера сутжух пет хворо пет бе схе кро еВ дж
М а З еОо ЗИ МА ОХ вс З ке ша КАЄ З їх ще З то хе УВО ЩИ Кк щ и ч ХЕМК мить: КЕ
С с еф УУУК. ох, ХО. хх. Мк и Ж от їх Со Ж очеширт Ки Що шк Уа ки Фе їв Бех лат 5івБ ТУЮ Ме осів без; Шех дех б ЇХ Бех Біб Аве ех
ХУ сом, хх 2 5 ЗО пуее о фею ДУХ Же Б окЖ о ужиох Зукщо сх тпжетух хтів дю хх боже гущу У сити а цеж фо как ке сш зо ваз з ее сао сах 5-5 бас ца щем шо Ах
Ж ка сбхеж Жах бою й що Коко ке Зах дРЯ зх ха Жоуєх бух Жах Я хх Фах іа ві Туш Ме сСув Біб Ба бо Бко Бі ТУХ АБр отТУюЮ АбвЮоМію Бу
Зк з ххх АК
У 5 що МАУ оту ОО ж оку й укожию єтм схеку ЖЖ йо кою сич сжааьо уж самих их с МО ЩІ а ЯКЕ ШТ СИХ ря ЛОЮ т шщоурМа пких НЯ ХОМА сх х 55 тоне Мих її бах сбочух їз хх те хз п ох За М її Шехує Вб
ШЛЕ ї гтМа жа ж шк хр АЖ т іАЖ СКМ БЖ ША СУТЕ МЖК ЛИХ У їх як 3
ОЖлЛА КА Мк
КЕ я я жим» тю Я ко ЯМ Му туту гук
Мо АТАК
У Му бета вив і тра мус я «аох й Уучна ПОСЛІДОВНІ ЕЕ туту онуки ср на
МІД сини ана же опт ж «МІНІ х 4 вт тя с Комі Же Ж яю пу 2 ху Ж мах ох Мт тк Хм і В пів чаї щіб Беж Бу бій спек бі ла Біч їжа МВА вх рКо щіу Мій ї 5 М їх «лавки ж тої ЗихУух щшекю дк бум о дак лях бою сою дхрвІаМ Сем га іх чу хМЖО ЖЖ му сам ЗеЖ МУ зу йо ел ААУ МУХА ке ХЛ Ж ОжАЮ уж сетх КУ тр
У ке З
Таки КО к х се ті че з х я ма, ще ХХ аку кана ау ех и т М я в» Ж пад тку Мих жу сх жк 3 ему Мет а м о бухту іа; т
МшХ АК УВІ ЗЖЮ ММ беж бів хв Вже па ши д МО шАЛЬ КУБ ААА
Ех КО 45 хм ух Ж спе мух су Жуж її жк Єва дж бує ем Б їлум Ок
Мав душ БА КУЮ же му ЖЖ мі Ли ва ТЕ ЖЕ ЖЖ МБО Ам ому РЕ кА КУ т. шах ХК ЖЕ ож щу Кк : - еко : се р й жим що Е ех таж хх ках «хх ле Блдоду ЖЕ та та ії: бажо Жхи бук х хо Яну маш У Бу Бі тиж Це ТвЕ зіз ків піч цех бек пер ТЕЖ дія З ЖЕ р хках чук у
Се т ТВ 5
У а ЧНІ оон там Се би її Жщдух бохо що (ла ее З уУУгк
Мет ій ме дек беж дез ХХ Зех Бай о Зев Бех Вів Узі Жуж ББа пек тк ах до щХ ж Б аох оте ска Шк УЖ У я. о ижи Умпежчх к. г ОК ха Яка, Те чух, у хх. теж Межа. ММ я
Аа вка пі Буз Міз бух Ззо їм Хо піз БЕ тТЕр ве ві беж Жже
З З З х З х З 5 Я 5 ле ЖЕ Сех
І ТБ В тк жав му врахо же шт 3 ЖЖ сушка хх шок ща АЖ БЖ МО Ж Оу Би що БК ше:
МА мя «ЕХ м «Ах ХК
ЖЕ МЕ
Ко е Мед сухе уруввхі сстх як шхЖиКаВ ПпОоСНАОВМмМУХе у и ких уж ть жу дк ховав КІщЕ МЕВ КР дно у їх хамам КВ ше с кщу хх ще У ж . хх сх с кі ко - с
Кбкяж бує жк Ж шк щи буси сх ом ЗЛ ву вх куки 3» х шує Ку пі Тж ЩУКк їі ДаиМй ХК ев Дже біз ду Бко пу пі ша бю Ва ср ря а жа ОХ ел а «ЖІ Б оку тлу ож ХВКОМ шо 1пУК УКХ Сутиски Ух.
ЖК М МОМ ПО НК у: кА. а ЩО жк м жур ккд «М сини МЕ ходтктум, К как ОВ а її ти вах кі ТМ
ША ЗАЖААЮ м жи ВК кА У
Я Е х в ке хи кит от х як АЖ штук туге коки ДХ « 1 ро» Перечин сим ДОВ МмОгутЕ подо ММК ДЖ МІХ АМ ОЕМ МОВНЕ
Ки код нору слу зву ки МО ЕХ ди ск чав» м
ХУ Куда ХЕ дода у хх же да. кхч Ек я РК дув. Бл беж пуф кто ніш ТУук йзБ т ее дво бі Жха Жкр бе Уа ТУЖ х шк до
АХ З М ет имя тк шо КА пд ср
ТАКОАОКЄ ЖЖ
У душити
КА МАМ сту су. пох зум «я ПЕБущжна меру щуоанаве тки дую, хо ту лжунх скиту
Сх ЕК я Ха мМ о в и ШК ИН и АХ БІК КИХ А лТМИБОЛЛдДлаМНМКт В ик ву тскшткх ушу ХМК юю Кк. шою жа
ОН Як У пуд тя лит мужа их сок вк сажо си у сумок ух, дк сосок, Фуко сижую пучок. ему уро шу пессосвосо списа су Пи су КМЗ аа я ТМ сх ро ща Со Зк я хім їжа божі фоажм Я Ух «ши що в Ка
Зв хі ів їж чув св щех біФж іш сам ай ч В ж х гу ЕК ж щочум усе к су си у му дощ лУЮІ жи ЕЕ при їж ик сук соя зу чхщ ва жил: чу щи ха З аа жкщ ши Мхшш аа ще Се що ха МУ дж поля ОН чн Феож ж КА хи ок Ха гг тогую БО шо и ку ум сві йВкоа КЕ со вія йех МА ме Бач ех су ке дав ах піч ХеЖЕ -х ве не
ХХ я я
ЗИМ О свожж дує Уже піз Мах щи дю би сф щи о ст ужити сту ух ко. с шк ої що їзо сас зи ва о ща зач с ща ях А Ка МЕ пк Ед си Тк чЧку буде Сл ов сржж ХА Ж жк. ія божих ж м М ж
Ук жі жлу сек ТЕЖ ух АЖ ОВ ЖЕ жюуХх БУХ ОАЄ ЩЕ а ЖК ЕМ см ж за ав
ЗК «А В іс гУв пе бачую ща фчовм сдуг що хіх о ох жо беж КОЖ щи воду «- Кк ще св ща сб в ха за вих Са Бо За ЗО ща Са Вих Ма сю тку і Махух у тар оку білу Жерео буих бю дух гу рек умо ую
МАМ зе М ЖЕ у. ів БЕ щ АВ УЖ жх ат Бех у т ЖЖ ках УЖ
Кк му 5 ях АХ Ух дже що хх ож ке віх сх валах во слу В бен сви в кох ЯК -и аах дз аж СКС ва ср ва оче зує ЩА ВМ щи сам спав шк кох бус шує 2 ху Ж бах ах лозою ол Мо, Хо о Жамух бук Ж шт Ку х де тУх Ват АВ Ух Ва та Зх Мо МЕ ЛЬ Ж КМ Ох зх ів Бім бів ЖЕ дОЕХ дО хутх чук щу хе їх їй жо фі УК дея фа бах соди Кол) шах во жу ою бр стлуєх вуди Мо бу
ЗАЖАЖА ОЖЖЖЮКХ САЖА МО ЗДЖУВА МЖК ТУЮ УКХ ЖАТКИ ОМА ку МО ФУ ОК хУУКю КА Ю А Заиг МАК Х яОЖ ех Меисе фу ЩО юзе» фдокі Я З жкуа бук Між Хахг СУ сквіи ск о Жоою бе кт ЖЖ ЇМ ів теж Ме Ма Без щеж Беж бе ХВЖ хо біб БО б5аЕ -х ще хх хо З Зо жу Мо же жом з Ко ооожкт присвя х щодо жк юю жи жи ох ог теоло щу та ж Бе зсв вда соб паб бах сао смс пас бас се бає Б
Хо ду Му дур фо ДОЛ ех дово схо ку тю Ж Зах се пляж ді Зал ЖЕжЕ БвЕ СУ Зі Ак Ж» ВЗ ою щаш ЖшЖж вв Вк ХВ ТУХ ак зни лак
Ж АМЕ ях нн НВ НН НК У за пес ве сх У це асом пек ощиМмО з що аск ши с ах Х Ме бБиз її жу меж сік Ж ут тм жк ку тв їм Жак бХоух ме БАшЖ ВА ЖЕ АЖ Ух рАЖ АВЕ УМО ЗА ЕХ а МНЕ ВБеЕ 118 з та
КА п Х НК АФ «й ЇХ ШЕ штуку ях кт ху Мо ою а тун сту ж АРК
УЛ ОТ ТМізумєтетім сечі з п «Ж ОЦЕ МЕН МОВО ких ши ж шив тнчМа Вонеогрукиья
У ше ух ж МУ тлу ха ах їх бик ТУ Жах Жар тах Ко ї тота ХВ Же Ше віх Зк
С мА ОВ ж мУФ ОВ о ОжшК вам сю ша І дл А АЖ КО му МАВ ж хи Холм Хо ж Фа М Ж шує ХО ох. Хаус бе ММ хх Ух: Ме ХХ вк аж. лк хз кож Хо фиТх Я їхати ХХ хх 1 Ж: гу х М Ху ТЕ Фе Ж Х І
Ж НА муз вот щеЖЕ Су Пе Вів вес сце Теж дл вва же пою ЕЕ жі чук а
У 2 Бе бек Жах ім Маску туї фату тк Фома Щек б фу хх З хро Жах ді Мат
АЖ БО АБО ЖЕ УМ МКУ ше БЖ КЕ ї Мо шоу ЗАМ ша Ох У хіх зетж М вд Хкух ТУ Ух Хом її св бек ж Му сука сажі М Ж Ж ке ви ж ХА бух Б У ех бе ТУЮ ТДХ тує ХУЮ Б БК Буш бле
І що кХ хи ща БО «ох й ду ох Мхфа сн тощо В жд Кк дк Аж іх шу. Сх Фо МЕМ. х Між зт Щі Бу Вій Тбье ск ТЕ біз ум сію Беж ЧЕК Бех Тв жів ях ал ер сук ех поь Ко ХХ Ми
Зк Мох То Фа ух : пере Мішок у. Мк ко що Ех Зк Ух ехо
Мак Між ід) бах Беж їв ТВЖ бах Бала Веюв бек Афе УВу ЖеЖ бе Се хх КН 5 ху щух даси ЖІ хх Саул ви Сх уже ух щбосеух м коту ЖШуька ол бусдю хи ав Бк б вад УК Ум ЧЕ ще МК КК ОЖУх КІН піч У ХЕ ку
КУ З « х Я Х о Ж 5 - чук ЧК дух та іт З па МК хм ар ск. жива лю ТК хх джем. пУкюж пк х «єр. щі ко їй щу Жах тбвВк Збаж Сак баї бе хх т її
М Мк екв СВ тА КАХ її МУ
ЕК УМ
«ер шУ ЛЕ «шк ПОушн о НЕК Сх
ОК
СЕ ст вих стрі МЕИЙ
Боня св. МЕ Оя ох сті в о М ки
В кі бек іа яю Жах жан, Ех од, поч жи жк ж Я У Кене ою Кья їх шку хе А хг ку: бві бїочж і бух тк І ій у лив І спам ЩеЕ ши Ха ее ЖК ВА ше Ай Ох БЖ У БА У ЕВ дБА ях -Е ь ТОЖ
У е ІВ хх
ШОКУ а ка» Кк поь тет
СКК ко АК
У уж Ук пек дк тн ши МІК иМИа СЛАВКО ТУК В.
КУ
КИТИ злтуу кича мулла «шеїм КОКЯ МЕЗООЯ «у з «НІ 5 чн ин А НВ
ЖК МАЕ УЖ БІ де АК
Х Я З
Ві Кк
Мк г хе
КИ о утік Я хе АЖ АЖ ха тре бижж о х хАХОХ
Ер ту Зону м фей тут їм «жі Ще чна посяде
ККУ
КОЖ Ж ж. МНК МЕ Я шо ВК с ких ж
Же БК м лиж Ую. ЛАЛОСю ас мех Кк Тем аж ЇХ лу З ж М ЖЖ Еш КуЖ ОА Е ще МЖК ОХ МК ЄМ са Ух
Щ х, ЗІ
А не Кх «Еш же
Кз КК
КМ КЕ шля жи
Жде ДК
ММ де вихо юої Ух Кі пу Мк хКА БЕЗ ТОМІВ «суку «ЖЖ
Ву ку тя ТОК КОХ ща тих, М «ММ шк пе нь ик ки КК оку уже шФ тати т ШЕ соми Кг жу мит СО пишосюсстадста ивакощшсх зозсвовчис Заачсвакк запа ечш лає БЕ р НН я НН зеде ккд вихо що В дк ко щу дих дам ск дк. аг ин дива полиця СКК ееКютовиют соска СеАЄЄ пох присл ежикиую их ск Ммекехпівиучиких УМ Мі мів ВІК КУЄ си С Вуж ОКО щу ту ЗЕ
Земан поеопсечашО стшшеОау ЗК мое КК КК ж дош хек я щи М дув вузи Б еудочВ В узді ду ту им и види КОМІ ВВ ав
Зими шдим УК ОВская ЗиЗВшКХУМ СК а М с що шик ІК МКК Кі пхфовзом и уко щи іх оцих фс цих вк Ка На и о і ока ке І вЕЛСТСЮОСВОЄ ВОУКЦмИМНсе есе сечова ема КУМ ЖМи
Кк кий ев ушу Фут щи печу вуУю б аю уд шт шк ючи ти Ж у В ви ефе же щи тк
Мк а шмеСкиоУв Мекки си хх ОвиМ пос сче Ох пасток ВсесваКо тк 5
ВИК пд СКУ АК Ка В ще вав «ср ат хо ВМ Ж
КК чо
ХОМ МО секр ух сви Мих «ай» омеуЧчне МеВ УЮ ект, ах су слу кеВ «ша ОЖЩУ МЕЖІ пк і «В КХ к т. Між ам СКТЕ Жде буя тт Ф оч Можу Ми БУ шк Ж де ЖУК юю Код ТЕ х вів ЖЖ ЖЖХ Ме БЕХ ТЕ У Му свй Зк Кжше зАЮ АБ ОСА мащ УМ « к т їх я
Ах я Аж я дети ві тку «АПУ ж стр м, хх ха г я Ех ут сих МЖ дя 00 мозок ої тиме ек кА ЦО У ВІ ОХ ДОМ
ТЕМ
Ек шили Ду ГУТУКОВ МЕТИ хо АКНЕ МЕЖ ж гуч су кекит «ки сх я ТО хх ж тех (я 2; ШТ. в, м ші їі Бе во сад я к в ря «ЕОМ Ж - з «іх М ка Ум хо ї й МЕ
Ж Су Піх Удод ЖІ жо КК их хх жу чмая песець их
МУР ок и мок ту, Уют и УТ «з слов ОМЕш году січ з «я хх дже, ї тіж ХР шує сою до ех Ма В пе з це Ах ех т.
ЖЕО шо З Ук АхЖЕ АВ оБаЖ ав Же шо пав ОХуУК
Ю г ки
Ух М о
КК руч зт хкх Ва як ж, ж хх да ки моли «кі МЕ «кА ЩІ Оси ВНІсть с хрмудуа
МК ол, ми сх Ми сип» шу густа Ух х вежі ех «ті» Жиедимча пюСлЛідеВнІекк клюють ст худу «ДИ ТЕ. ЛИХ стежу сту вивих уза жу зів сх и оухт жим а сеоерр суду. осРщує дет У чере ссацми см ом с р саму ша дах З жк у шк че шт шк сек, ЖК у Км Хо с бик хе Ко її Ж
АК ОЕМ АЙ Є лу КВ ЕХ АЖ А НАМ МеВ
КІ х ЗЕ
Х КУ ії:
Кох зх ско мах свои зи ско суль сег Жорж ками» СсУуутю фо яко семи що Зої чо ваз сш сте м клав ВК ша йхе шо З ва що УК СО СВО Км ан ших Жанни УЗ да бю Миша Ж тк та Фе пк У км я «кв Мк ку з Ул г : х кг хх їх т У бух» бле І до ХК ше
УВА хо бо Зі тТвх де ув) буж їв дпех Су дух вка ех лів ЗХ
ЗЕ Ії ххх лк
ЗЛ «М ОЙ в ух щих о гул х ще ее од пово беж Між срщож сив век и» сут меду 34
ВІ жЖтн вот ро ве Кех ав за? Ме; зба за сач за сКж пов са її
Зк ау Мне ах Ку акне Ве ЖК Сх Ул ж жу А же Мк Ж т
Тур Ваз ЖвжЖ осі т ххх не Ж о ваш ЕЙ тхВ ВО МУ са. ще ЧО КЖ о шАФ хх 3 пи тп хх
КЗ Зх Ж тих см ми ех Ж сх пух Як беж І жду ощИКК о ху и ож -чЕ ча сх пе се ак щи сн вих стат ЗИМ шив вк щем Са асти тах ВК
Я лжи Ж Іл Хоч хіх ше Хезежо Жим ТА ших Мо 21 фа МУК Мах сСпиж без озій їх зе ліз ХХ із ТУХ Бо здаж ех щі Тух ЖЕ ТУХ а 5 ж дедкях дю. сх гюду кс вай пас засл пис вов сс вих сса сдва ха ие сад сш а зво Защ ее аа БО ваш що ви ЕЕ ММ ол я ЩЕ СХ я єтеу км води У фохухєю Шумрез ОТ охо 07 ско Жоутіх МО що си ує Толя С ан Ху Ку ха бук ж
УМХ ЕК щшаеМм ву Хе ЗУ о шАш шу яка МАК зи Сх ЗЕ Бій Си щі ках ше КОХ сл "ТЕ о 5 ТМ ТЕ фс ожив схожим тож ж са де Вож щуфує худу сему пою Бо сжщию ге схе ТУ
Хм ами АХ Що ков їх ФООБяНИ ХХ ро мере шШАЖ ЗК ему НУ ОСА Є жа яке біо бу вою со Зако вк Ма є Зам Ма Ма Гм бе йозуу фа Кам ок
Зах обжи ТЕ 5І8 У ух -щ-х іш ви Бах жах дей Щпх вх БІ ДА поОсЕЖ що РЕЖ ак ко щу ще хх жа у дек уф чн, ни НН НО схожрю ж жи жк ех Зах
Ж КВК С КеК оо жу сш ша кас Уж Бе сво ча с ак Зах хо Ру бік» о фМрсу а Зо ес ми Я ко бі РУ зв ста Ж хо бу се
Зі УЩА ЩеЖ Ва сУж вів Бех Ехо Нія Сус бі ЖЖ дво ЕЕ ТВ ТУх
Ук кох ах о 105 жк ха у Божу зх духо схоже фани уже ж жим буки дико болю ке 3 ме щих сх заз че вс пов сс ап во о « щош а ие
Те що шо шк Мен Жах СМ ж ау м ЛЮ Мою мю АШЩ Мб МЕЖ клея міш да. їЖЕф шаем ХВЖ АЖ ЕЕ ТЕ ЗАЗ же ва 5еЕ ВЕ ож 5 км. км Он МКМ «лі вх хо ЗЕ пт ях у 3 тій АХ ек А еру сце «й НЕ
ФК Ж 0 Мжхеувюв фен уреуктї гк
Я МУ ПЕОМ НАУ муку, ами
КТ пухкому пуску
Які СКК КиКищи БОКУ мчля жк зх жом оду
Собі Кі ях сш Хода Сіл: хриа й Та З Кая ую Пліс пк
АЖ МІ а АЖ Ту а зай зеЖ САУ БАЗ май зем У А АЖ щ ЖК АУ уп 4 Кк зх з і х хо Ух
Фуую З Клей Код Жах очко шу Ко шко (Зір ур вк Ша Жех іх тЛТек --х чщА Му Б ЗШ СЖВ вуж па ешЕ А ВЕЖ ВУ вБпе Ж ау УМХ ях жк ря че хх ї
КЕ 5 її тую Ходжу о том Жожии бе о тхх тік ок пи ках Я м т тт Кі бат Її УЗА муз бів йки Бе щі хв Зі ее сам о Жха Дж "Ех «5 35
Ж МУ ХХ
М фо хе т о сим бе їх ах бука ях сохне сажу там Ма т вух уко
Мія вх Хі ТУХ Же бу дек шт щук хи тТуУухХ ТЕ вав САМ Ба ЖЕ пох жи я
М ХХ щи
Хоюх жу ах Ж ВО ож брюк. бю я якої й ам о ламную Д, ношу бін В ж ша Ж Ма дав КпЖ ве хВБЖ Ав ша СА Беж СЕ Уа ХПХ ЛА ОКУК с іх ж аж о ЕЕ КУ шо дж Ж 5 ші. Мо Жака Мих ЗУ блю ху Жевж бик М шо Аж Меса і зх
Мех Від їм: дм беж Ї5м3 СБУ Щек біц зво АахХ ВАВ У. Її маш ЖЕ
ЗЕ ча ке
ЩО о я
Ж су Деу бе Ма що бу (їх білу шт ді Морх Ме Ма ідо жк бак М хх вла ДЕЧч БЕ мів УЖЕ СМ УЖ АБ ОВчро УК я ЕМ АВ тв кЕ воша х лАДУ У хай
КАК КО Ам
Мов ж хх Ум сю ж мл моху пи «ТК ХУ ХМК ОСА ах лах М ЕК МНЕ
Ух, ол
Ок жи ше и пд жі «Кк «ша ік
СИ ох тт хІЖЮ ХК їж Ох
Вже що кін пу і вих ож ІК МІК ВОК КО КО
МТД лк ху зе цВ рок «уро ще ІК Я ков жа
ВМ Олю жу уже Му болі б ТА Ж Я Ж ом Хканом Ж ух ж 29 кох схо пі жу жук МАВ що Зхв У СУ БО БЕ КЕ е пі си м Уа хЗА т 5 х її Ж
А Ге ко я «йЦУух Я са й сер тю сукуюи сх их ж БиКуЖИиа КОКОН тку хм
СК, хім МЕ хи угон «ЖОМУ, З «чих й дет щі Тл ВЕ тля ік --мйи жа о БУужЖ жОаЄс вух зЗау
КУ в
УТ "хи ах Ж нт, ох
ОКОМ? МЕ тя уд іш МК Х пох у сх : х кА 0 Ж УчЧчЕНа БИУСДа Вус
Еф «ИСМЮМ про сере вени «шах СЕК МЕЗПХЯ ком ха «шк де
Туз ДЕ лях бак ЛЗ ау Сх ух їх йо. боруєь тарюх М в лящ
Еко БА ХУшЕ сш ж Аве вд ЖК Кук кЖмНе ув УВУ т хх КУ
Х х ще сх жи дк:
ВО
«КД А вза тич ви ААУ сх Тусу Тео і мі тіки уУєа пручесдя с ж МЕЖ ЗЕМ ТОКМАК НН тлу киЖМУ кали Ма
КЕ
ЖИМ А ха у ХуздУкуниа пІМоМілевиієвь оби ми ПІНА ИН дл тка г УА
Бе ТЯМ я КМ ни тк тк каш» 5 песен Зогатио сб Мт свй сте Фон сви Беж ца сеї па стих Тула фени сросахоавсо сбау Чо Сея сбощ іа са по ша чех аа сс пе
Й жо уж жду Жуки Мина КУ жу ОК жо іл оЗадї біл оїши Зі Шів Жеж ЗішЖ Віз ба їж - Фе хх
АХ х КК з. не віче х ХЕ Е. «ся ув бід ска свщат жк базу фер що в ме фра сб з га
Що ша ше сх ех сш оч аа мі Ба со З ше шк Бак ККУ МАК яти фани думи ЕХ ха Мод мує ХМ Бодя Жоєтут Мая Ме Ж кж Ж ом Жтеує ФМ Му чих ач Ка вАУ алла вх ща МеВ ще сшж у ми впав ЗК а У КУ ї5 кВ 5 пут фо ух вве щує Б щоку. щи Корж ФК сю сему ІВ кос : ча ще ЖКс ваше Фе сво сао иа в пес жи вал се ку пек ща хну тах ефек ЗБ МУ М ух Мк фе біти Мем ХАОС М пек Хек ша ах ївх Бе ТвЕ Сл Теж ТУХ її дви їжеЕ Узі Бу хів дк КО БУ с о о 45 ; й з же я ск ехо Сом, др пісні «щих во що ку пе щи о ух Е ЩО щік брзхх їх с их Чпва ж вит чо ЗИ ЖЕ кох чт а Ух. пах ОКО ее ак
ЖЖ ук Жосухя Х ет тут Ж су Ж мот соскою я Шамо (ШЕ ху ХУ о ДОВ а ХК и ФК чи ем пам КЕ бле Ам пла ха т ко Бо іа ех (КУ ніз БЕ Же 45 зу З з вот з тех феоміє лугу о змо оці фл ху суми хх изичих Уа емо вив ци пі що учи й мас ав ча За їж че ие В ЗО вив ОВК аа ІК ЗАЗ БМ У стели Жду ТК тож ду бокашу КМ ши т о Ку сш бю у Ме Я Жожумо теж дев обід ЗУ ББе Буд піт Був Дів ТВ; їжа Ту ТБж БЕЗ без дах дя їх зт ЗЕ о 5 ТК зї фу зд Ту о укіжу фол юю гою тки мух пом и уж фот сМижко С фодйно ужуухх смІВК жу ТК
Хе я ІМ СИХ Же о вх си ша о ЖнмМ сМи ми як шк Му ЗО - хшх сума су КМ ХУ ж сххр Ве ТЕХ Жора ух к ще бек м фен су ще
Ми МК АВК ОТАК У ЖК КцЖМ А МУЖМ Мк А МУ МУК с АВ Юм лох їх тк
У В що их я оц жк -жЕ оси шКжЖИр сих дужекх я їудх яко джу Му ке, 22: УЄУЄДУ Ж чех спо сах со її Зо За оси зо сво Кс ВЕ Бас Зоя кі у Я фото жу сю СМ флЕхах я Ха джу СМ Ук Мою Жозех сут ОТ Ж Я зх УЗ ку діа Уста. ШжУх Бк пта Зів ДАЕ ха їз ХУуКХ БВ дв отТУК ДАІ паж БУ ту стефкту Зк що мо 305 о нн я НН а гіч сих си палю суки Жук йсх щи ж уж ух усю КЕ «вп ожив са ЩО Бере зба вояж вес боФф о фсе ес чо Бо з ДМ ббхзиж Мк й а Ж (у божих зок ЖК в м ххх дію Мр
ТУЮ Бл дев тв: УЖжЮвОШІу ТВх вх ТВЕ Беж УВА Теж бе дех ах ж ЖК. Р и ААУ ши стр Зк «Ел тру хх
МК КК
«3155 Це мету у Ж. УКХ ХК пев жук га
СКУ ЖУАН КАН КМЗ
«еще
Соник оче, з ситах, ФВ. хжзита хх ш тів Мем у чі хх й МНН МОВО УКНАЯ ли жк се 35 ре яв з -х сх у ой Ж хі бі АВ дю п кох їж Зх; є ч ї то їх ШухУ От хе 1 ї з ХЕ сх мих ПЕ Жди ех Жах ж МВ із Бій Цех 53 шо ВВ МАМ ВЖМ ЖК Ек чЧ жу аю АВ і 5 10 ще
АХ Х КМ ло бах ЯКЩО тт Жхуї Шкум о бе боку З що аж С кт поту МУМрч» фуУбуку СК ух ВХ У ак У Муз їм беж Су Бен Дів вЕж сію ЖЕ ЖК Ве тблх пу ТЕХ ва 55 ща хм хо м бак Ж г Хе сука МУ Ж ккк я боже ких ле 2 у. Ж ке жк ї. тал сх з бут а хх У се ОТЖЕ М я 3 жа Кф т 2
ТК Хів Ак ТКВ УВІ бе Бів5 вка хе діуУ пів Кі Бер о ФО ТтївБ Ті 38 «а «а
Кі. й ті жує щи, (33 ж міх що ства бю СПУ сс (ах бок М ків ВЖЕ їз Ух Еш мі ВЖЕ щі ніш Твпж цех Хуж Хви ЧО Бу БЕ
А шк шх ше У що товжу хе сх сум Ж т жо бі смак ля У хз Жуки Му М пе ух ж жк
Був Зі ба із ТАЖ без твх о бвж о щіб фр ех Беж бес Тк Аза тТуХ мії ср че У
ХК то І ща фах. о у Ж дух ух ие суть СК жу А ех их ВОЗ що хх туге ЖУЮУк бзху
Ме Б3)й Ме; ех 5еж дев Зв Бех ско бер Бек вів ТВі Жук КБе сух
Ек ци щк ха ВИ З
МІ Фу мих хх «межа ЖІМУше Ху зМаеюю Ж зу вх ху ку ую Мих Хосе їх Мо дів Аж о жКо ІЗ ТУЮ БОж Хв беж діЗз ось щі ТУуХ Ве дво о УІі Тер я сту ще хх
А УВІ АКА зді аю оду Хр фак: ХО їереує 1270 деку в со уж ЕМ вже СПЕ вк Уа УНх Уже аж кпвЕ зд докт
ЕЕ КМ кю «а «МУ ОХ
КОХ гіхмуе кхкіки цк ж Жести ух м ех хм, ки З АХ ПУ НА ЗЕМ, КВК ТКУ я Юх ек Мія «ши СВО МЕЖІ
Кі хх
КОХ г пет жав обер ЮНЕ їз) о ТУук вів Ті фіз хо (Мн ймху Ма 1
ЖЕ У в УК це я ЕМК В МЖК ХА М МА ЖЖ ОКА А ек що Ж а ї вої 15 аку в Я «др 3 «ЕАїУ ВХ ож Уч ях 0 ДК о и Дт яким сечу шоку я ще кет Му чна поси ДОВиМиКе
ДИВ
ОДУ ЖЮ. зе крав а «дик ЕЕ Ий
У их. «ДИ ке МИМУУИИХА МОСКВИ ян вх ал
Ки іш... ІБ ци й гук р «ами й пиво Випеаце саз ЗиЗ св соч ФМ пащ ом си пис ча Зі ЗЕ ж хом ШК Чо «ка соду Зі що хи бій ві бів ев Уві піс шек БАУ Дів сом У щ. : а
М -8 Хо ке мк зе суху ун м Ук с -- шив су докт чих одутеут стих кас ЗИ зау веа сх Фа йос вус зб зва сх вас бух зач оо аце ве пає ів:
Уееш бофк хм Фо сти ДЖАЗ Сток т я ож стХалую Я ке М й ма КМ щу спхтує
Бує цеж вх 01У Віз Жак чаї Був Би їв Су: є Аза дек па ук «її кит ї їв Б й з же ас песо бас бас з вас Оу щи Це ому щих ма щем ша жи їжте ха п што Жезах Ж шо й тн. Щй ожина Ку сих ТТ кт ЕІ у їж Бе Зпж віє Жук Теж Ії АБИ їхв Уві вже сів Віва Кко Сх БМ -к " ї ке їх
З 35 о
КА Не «жі сома и учора - є Чек уче учи фі» сх вищу дух ци ке фак БО ша се йо Фк вч З їв виш со щи БО ще Ко дк ще їз ил ожуха ЖЖ ХіжуЄ СХ ас ки кн йому ЖЖ у сухе мс 0 бук їх Мем Кі и су Мам осі Ж Хі піу Зк лів уж Бо бішж ех Су Ту ТВХ щеЄ
ВИ З дове тиху соду ще Кк КК НИ НН «г межа ючих рити ких ко ких ТУ цех дос сад зач Со саб5 зас зав Зоо воо о ссз асо чоб Зас сава зво ща как ВУ ж бу ко ак ж ж жом ох бр чо біюж З й Так бух Вів із Бу Бе пін Бі їх Аза о ЇТБІ бем сих Аза А си Є ї му Ух и
КО 5 КВ КУ бета мух дуже суха а Ша о Ше ях с ш- кри ех гофемх тек ку. й їх Феут те У аси вс вин бас іс Здав па до за сс па вдо З вх ля о з їн з ї З х х СЕ СУ їн е- рих Мега ЖММах Жо с0Ма Киуух СТ 2 оп яю ож Води Сем ПІТ Хо Ом
Її вх ваш їТКЕ Ага ше Мет Сів їду Шщех ше вий Же чо зв.К зам ав охХАк м а по ва ВХ ке
НИ, сфе розу й дик я пунк сви дк ким Б ор те се ке. - реЯЖ щи оз ї с тез ших тост пос взвоа соб се ЗОч ство сво дао Фей век що Зк
З що удо Хата Му ту І пу ди У ртяу ТИ бю ФМ сія. о що ха
Аза Уві їУЮ ЖпЕе уз Вів Аа ВЕ БЕЗ Мі Тек їж АЖ ех МА ЕВ пес. ко чі
За ММ Її ок ех" ки кое, У шо пон и зи Ух вч хх Зщ ж чес Мас Час сза чо а со р ВО ща со За чшЕ
ФУ ч між у ех й сх «ку м їж км гу Фен «ох
ЕБе ліз Хшжж ТЕ ЗКУ поло ЖЕ бе УЮ ЇВх УВА ЗаежЖ шах з1й зч5 В що МК ї1хО «і ЗВ «Ж1ї» 151 шк зва «кА ПЕУ ши жаю Прухгрщої врдеяж зів ях «сек ее БеспідОВнасть кутю ие
Кт сфор ха вкотре ходимо и 0 ще Хм Ми ВюмУтТижкЕях «В: де
Косяк жущ Ух ож Кі Сом Ж хо що й г -е т. о фухи суха С ій Уві Пі їм Уві пів Беж пі Вів біб УВА Був Був ХО У Дів 4 ке й ч їх ЕЕ ї ща Ме ОХ
Ше ЩЕ Ж ку Ми г. «оду Ж нта УК и ма М дю Жбудже МОМою іКуюю же жо глум дих Мах бе Сбеоб Зек СУ Суз Дів Бех йіж Жех їВЕ КВ ТА пів Кук
КІ хи Зх «Й МОХ З ща хи, я х вх Е ї р но У те Ди, ТЕ г х с жк, Тож в - х се че
ТУкК Кїв вв о ТїкО Уві Акт бів вів бо Бі Біва іш зе осмля ЖТхво ва люк 7 «ЕЕ а 46 «5 кі юю ку Жах Кк ба у бою 05 юю бах ую. Мкгах бхуют ОМА о Ж ках ЖМхх
Ах Зх що нш хшЖ Ж о шУую ЗЕ КУ АЖ х ЛЕО ЖУК жав АК УМ КВ за за «В г гол 2 : е : ще 4 ох ж с х кої в Ок жу З. Жах ди ВЕ са ета зі Шок бруд бевмує Же що чую
Ей їх у АЖ ММ й їде ТБх Аказ Зеш ож пе ЖЖ дек ТВЖ два Тех ре «в хе по
У Ж її я мес ша бики ою Жаіх бах Да бо Ма ба но жів Мі бек ЮК хх
Ме пів пев Зшж беж бец дк йех Бічз зо ТУ дів УВА ЖжЕ Ви» ста
З зх жк
Ма Б мл про Можу Кк Тк Ж «Фони Ма Ку Мк МЛ с ТІК Зо Му МУ ТА хх
АВ ТК КЖо мух В КМУ Ж же хе мА ОК ке ді ТЖЕ АК АХ ху УТ З чї
КАК хМх АК теж ШО у Зм Хома. ХВ Крус Ку шум жах
МАТ ша АК Кн а ХвХ Уа Зх ожЕ ух тай
Коко КАХ
М х КО чиї З
ТК оту я хе хх Се я ОТ ж х жо жх ке жу КК УККАКА М Кю В. ее
ЛАД ми
Уют, гемо му «ЖЕ СЕВІ МЕЗО «ЯМ о пом бах Між СУ у дів ТУукх теж її дав 1 к 3 х
Ух хх ка Зх
ЗЕ ях " «Ух а
Коїоя Ул хижих МАЕ а Что кта кг кута Кат оку «М шжтУузна поши
У й
ХОККХМХИ
Люк сУтвжисх вх ТУє «ших шини МЕЗОшЯ
У дх «ЗМ оду КОЛ жу Мр Уві к си Ах Жіхуєує Мф стол бек ОЗ Сука сюоихх самок и
КАК ДА жвХ Б щАШ МЖК КОМ БЕ ВЕ ЖЕ Янв х Ід аж КО ХУ - ї км дк ї ш А А
ТЕ юю
У ту ух: де «кі 45 шу мя ж
ЛЗ хх вас Ж киш Пе Ж я ух, А пучку Кожанка а у,
Жди МКУ НЕ ММК юь
ЛАТ я, худих
ТК мл милий а МІНІ МЕЧА «до 45 дянех Щужух ТЕ аж юо см су о У схо пхж Ух ВІ ха шхсО КЖО У жук УМЕ ММ щеЖ КА ХІМ СХ МАВ ЖЕ х хо т з. З Ка вч т «10» 45
Ех яву
Фет кю тм
КАЖУ ОО МИХ ота ку Ул ух: ху руту ох І М «М Зх щи чВІА ЕН КВ АТХ
ЕК отут тю уки ту «чі МЕ
«а0б» а пров жим утуУєЄ МИ Ук А ой руки ви мими Кг век щи
ЧИ МК ЖИ КОМ ЕКС ОСИКИ сс УА КВК щі М Ве сна самє сехчосеацяос МгсоззоКах воскова сови касах шк пустих же у сЗоУску ліві Куди зи вує их п жк м и и ВІ зно паца сис овчч зиоошасна поса БЕК Ске са ВО доки их ака м г В ср яких к мах мк же ох сфе С щоки ТЕ зеф«сцикіІах зссєвстаєсв зезвавакс свзчцесвзаз Чосзвсастовз сечова ча ж до уки ких це тиху й мечі Мр сум кеВ жо клеми оо фу вив ню ку фору ще
ХМК шли кака пМисечссмащ сих хек є М Ка км З кум им шк уми ув щу тим тхори их Ух лом и ди о сум сем в ха бах киЕкскоаксозв зоасоласик віахккасев соди кекс Ених чом маау ве продов ивира сич ику і узи вк из ше Інн г МЕ «ие 44
ХК ка ЖК «ші» ї6 некутук, їду кажи МЕЖ оку ті Фет се тру ке им, ки йрКУчня МЕДОВІ «тухутум,
Кия
Кут, ск еи Кт укл у ти «шим ШИКА МЕЗО «ях я пт ху сек ТМ хх ку Ли ЯМ. Ж оку Лю. бок и «ах МИ пу ух п чш чАШ УК УМЕ ЗА Валох ЖЕО жа УМ АВ ЕЕ БЕ Ух ее Ії Ж МЕМ ЩО ї В То МЕ мкг до ші а ек ук БУ
КА х «ка СПЕ
МИ хх коо коки т тку и, «ЖА З» Щи жчна пес воВимсь
ГО іу я
МИ ти МИ и дИЕ МЕЖ «Ох 45
Жук я; педа ДЖ що сво їх х ази обов ЗНО ЖЖ вже шим ї 5 кіт нд шим Я
ЖК хм 1 р КАХ
ХЕ Кок, жу як ЕХ «ві» Шуучня поси асв. ав» сю сти де сим МОВ МЕЗИЗ
ФАО ж у ЖЖ фею кн бури щих ж 7 Чую ЗЕ у ке п Жві ТУхХ ва Тух бр о піу із їж бе Бій ТУук ї ну 15 «аю З «ЦО: «па а ВЕ лют я а и а
А ОКУ ПОТЕН се ст Мая ста» МЕЗО
ЯМ, я
ШК 0 фотка зсуву кої вм жави Же дуже меСмАамМахе
ТУЮ УТ х ХУ
КОЖ МК А жо КОМІ
ЕК й
ЖІ -ї укуси ихут устами сте В ур Теж же ми шк и ММ о жу жуки тк Ж У зсисссаоИ села чио стаз З сла У ЧІ ша С ще що пак Її це Ух
Фхтоя. аку доджіх Дб о схе Сік Кн ста Же шілобал ів Бей) Май мае Беж Фі Ж зів щім Уві х х, яд
Ах Бе МУ жи хо се жи ифизух уки Фо г уж одужує Соки ПОВИ сиві? суєжех йуувих ЗЕ заз вав со щщо чес вас под р мо зх ро вам ОК За За сво 1-3 споджке Тожем Жу чн АХ дж Ос «ую ЖЖ хх сх -оожтею Ж аж Зх садом І Ж тех. вуж Буз Бжхо щі Аз бек Уві Буд Бев Мах Се БУ зів вх БАУ ЖУК хх Ук Ух
Кк йо ях шроуижуч Же ще ких г ее Не в где юю ря ЖЖ ба кож ех ее а чис о вк Зо баб пас вс вво Кос чо са ла сах сов ост ле хх ехо уки си ОЗ ж спек кл «ршюрх ЖК ана дю Ж я ЖУК я УЗ
ТВх о ББз о їТвх Бі ЕЕ ЖЖ Лі два ЖК о Уні АЖ ЗОВ ків Бк спа пак дл щік я ща 5 30 пси Фея . ї пе Дю. с. с шк ії . с. м с г н з сетцн Уж гато «фе сх сіємо сркми» Воду сіє чт тех еко фо пе ве ХВ ще сх пай жу з зро во зе ав сс зни бо есе аю ос о ЛЕВ ху т т хо бунт хх Же ор ахо Мк бе ЖК ка ЕХ, оби рих МУк є бо піУ Бо бі Тхо зів о сіу Ех Зі Тек БІО біЖж Бек ЗУ Жук ХБЖ щВЖЕ хо Ва сви зо ср вах БО сао зас за со воо ша ос Чеб За да це аа тую Краю ро жо Ше її гої ху З Пе томі Сем хід о ою Мі Шеж
Тух Бій щі Бу Ме Бім Сі йка ів Тк зїема ТБ ів АЕрозМ) пес ше ях шо ху як
ВО 5 т Кк щи зис вже чол кас я зЗаа ска уп ве сс соч ащо сеї дах ве ах
Ася ме кі м. хо. хх Ми ши о, как ХУ ж Жов фкоюж о ак сх ху У пух ех ху се : ях. ї х То. ХУки Тишет Дожк У ях ївВх: дек Трх Аза тех Ве Бі Бео ех Чек Бен Зх Зех щіз Ав о жВЕ гу ще тет
ВЕ НЕ Ку ім муки бази жує жи фут ки ке ска Води стежити се ся бики ех ЗА ча вх ївб тс до Чо вза сео Сас во Чо сб дво че Са кає Зав
Кох Уго Мах глухо щі ож яко ВА Уржуд Ж рн ек ошехч. М пр. . кіз Маї Тух Ве Суб віз Бех Ре Між Тек ЗКУ бек Аве Аню тТхз» Тує 5 че ч2а5 зх Тр ММ ех ох гум Мажуу ве сам их си фея АЮ ом джочмах ге флак оч. зи
ШЕ «ес щи ену Ос са щи ВО Му З ти ами че ки а ї МЕ
Е ВМ хе ххх су КИ пух о МУК З 3 ж м 41 Шк сх Ух
Жпае бі УВІ ТхрвобБКУ щем бу ВЕ фі Маї ТАх У дек Мах
ЗЕ мох хх
МУ МА Ко чи» яВ сх я 54 «ЕМ АХ шою пу вих КУ
КУ а, М вух Чо Ужкя. ї «жі т штУчЧна песо тх «КУ «ТЕЛЕ гени ее нюх
Не, ема свмина КОВКИ ей: ах щи вся гл чу єї то як 1 шум су що галі ЩШщЯ фот, боЖеми 3 В
Пій та бій ео Увх щіб в ЗУ Вів ль Уа пу був Вхо са Аве
В КЕ й -
М М а 15 полу г бек тої бум ху йе та ск дк ХЖжах не УК 5 п че цех Уві Бу їжа йех беж Беж йів веж обі Тех СЛ рве тах дів уж ех ук же
В ж Зо тю Кі: В я МУ Ве ках Зою 23 4х Ж в Є оУг; їх мух Же
УЖЕ тіж ли КЕ У щі пе с ЗИ пів вк Ж УК ШЕ У Вам сш ЖИ ХХ Те я ЗБ
Тхл ах чаю У дк люди Сфуфчка, 7 5 ух Ок тТсхжеаже ТИЛ о лиж кж Зак ТТ бФожжшк іх під Вже їі Тух Вже зм Бех пі бЛуж Їж хх Ух діва ба Був Вие пе їх хх 2 За що сх же джу Во Ме км Мом Ва ситу Кожух во брюк уж дО, г пів БУ ка лів тиж Бей: жах вів Ха бід ех ТВЖж Хе ТОХх Дів Жук ви зу сш З що то З МЕ
Масюк тод ств фащои Ху х тех бл жаху вою М ща Жим ех
Маж сів бе Шев бе вен вх Беж ую Бав ТВвЕ Аза Уві Тух ВБша Сув жд п по що Зо Же хз щі уст ЩЕ ж ха ХЛ ах ху Жті щує бик бує Шви їх ах 4 буку СУ у пів ва со май ФК М УЖ мВ ЕЕ КВ УМ За ші Ж мщЩоЮ КБ у у ий ячг
ТІНІ ТУ 115 тУжах (Тт4 хв УК Таз; лі ває її бю бух зів ше ЖТМК їм Ма жйпх Уа сек хех т ВК
Ах ОХ ож дк «их 5
Кн « си їх потуж тю, дуги сш ЕХ дсю я мдхс кт кож пре КУ, лю ох зак гу пре ст
М штучка БОС ДОаВЕ ть «ше ик у ач УКХ ІТ ТУ «Екав пІВІ Ме кої В: «я 45 хо Шик Меч ЙО Досмкх
ОКУ НАНА У ІТК МЕЖ МАХ кл жук шк ОВ мя х х ї х в З о хх «ві» 5 ххх я кЕ їх М кал пре
Он МА «хх Шесома сезишіщОоВнНІ ск бак яких а аж»
Ку» спе? мЕзаа «вет щи МЖІЗ8 г кх
Уся Му де Ж баню Жим іх пух Бо Жежю сб Єр бе З в м їх ЖМаех М ж вищ аж о УЖ Кс шу ЖЖ АЮ МУХ КАмЖ ОО МВХ Ух Ав Ав уж ЖМ АХ
З В її тА
М - Кк и
Бе «ав Ж ету т к, Се хи КА Я
Ку ТУХуХ
ОК МЕ совно Я ЖЕ ки п и о я ке шЕжчна г дивна
ЄМ ве тах мета сажки» СриЗ МЕ
НО мя ТІ «КЕ Ах
Ук 5 шок т ж Жака Кох Хо ТУ аз У ЇХ ж й жо лів ТУЮ СОУ ЖУК Аве М їх Ух пе М Ух ї к ІВ ях т ях я шт ее Ам ше
КА ЗХ
ХК дух Т)містатам гемо іюі стеку сн,
КАХ МКМ ЦЕМИККЛУХиИ А М. пох
ТУТ
МАЛЕ
КУТУ ти дик «і» хХодчюуй послідов ісхх
ЖАКА АНЯ ХММЯАЖХНТММА ЗАМ А ММА МТМ МОХ пктухи, вул ве ок ЗМ хх да І потр шо «м з Що. ХХХ жиди юні жи есе ии досві сук ти мрію ей зе фі ке ха юю як З
Чесно Зосаоваос сСач За Сай со Зк Сея хе оса ще ЧчаМ ЗЕ щк не хй- а м ща ЗУ Ок Св г ке В ух жк сів Уві Бів їй ува пі Хек о біфж Віз сін МБ ї З А сур ли муж жу яких ач ту ту ау фази фо пом сво им о фжіту яких З
У ЗТ ЯМУХО ЕН рою хи т І «КА ба ж Ве а В МАК ММ іл т ку її, ків даю щі зак щі сом га ау Ж шідую суб бою
МУ леж КЕ БО У БА мех УМ му до си ХОЖЕВ МУ мав стеж Аз ЖЕ тк Зв З
МУ хм «их фах іх ах мечее се аск вх фосж взає Жежму брфю. тетаю очи жи Фе тує од З их вам ЩО гм: щи Жах ха ас нн: Бех Зо пи се чи с з дах кВ схвкру Мох бі 03 їж й біжи й Щі шо б лі фюмсу тк Ж ню у Ту
ЇВ Віра жМмЖх ща и аз мех Вів ХЕ Мо ХО Ах маш Р їх У МАХ я 35 БУ кує п фрахт ужрє дит оуяуєту оф ще подих ех сщепфя пуіж о улужі схтких пою сих ак чем ши очах У ЗУ ща Ма жом МО по ем Вше ча заг час Зах МАЕ
Южне я ус он ин НН НН и НН ххх гі Тома мок Я г У : скат фа т бою 83 іх Мих же пі без сім їв ЩМеЄ Зібж то Кі дво Бо Вк бек і БІ Жнж Аве пд щк ви жк и ро от си сід В содиж гр дерих см поч суюйєх щих диву судруз щен Бр У ші СЕ Ач УЮ НИХ КО жна ще М КА ВК Ж МОм ЛА ща МАООЄУХХИ Ху КЗ пелую ї ше (її Бллю З их (8 Тато дач ху ср шин р Коко з Мкую бух
ЖЖ Кіа пі у т БХНВ АЛЬ МК УК ХВ Тв Ме о Таж ХЕ ко ке їв Ох ж де за чЕд,
Б Бе КМ БА порти осуджех слеуМмь стихи фосує фі же сю схижих суєуую ежйуж о сьІжІ Кок о сжтвих со У ту чис зас сл сно їз из о сс а за спо За пек шо зе ЗО ша хх м» ДОЛЕ я Х ї-У СА У З ра І - п Хома лю бЗакю оф Ус там Ма вет Тл йоучемо ТО ее Му Км Тож їі ее Тлх БА КОМУ ххАМ ЩО Беж КО иа хо мак М ММК ОХ Е 2574 пе гу йо 5 зо пе фра жою фо Божа ско ож ско у о дю фу о кож жов о бі бик зак цих щи ак осас ме о пиз Ба пе КА ЯК Ки СМ СК «ов сс М
Жлом їж бі бан ує стяжку ту кажи Ж ку ЖЕ ут КВожує Йоду М сх ТМ Фу сххоує хів Уві їжкх Тк Сух ів дху дер Віз бі Шех жу Біб Ббе ЗУкО бек з5 - ад 135
ПІ ДЕ МУ тег Шеачи смужа ВОМ ек що оче пжежа ри о НА по сх се КУ Ки ЗЕ шШакожяеу спи їх зах їв чн дбав чу вла сУбтрощеах шен ко ККих зх В тбудхє Ману С ах КУ Фодюжу бек Мод Ж аж Та жа б жах ух Мо ху сю їУух Жтрв оці Ббе аврв о їх Тео щі Бій Бі ТБ Без о чві ТБ Узі БЕ щі ВА ї-О пул ТЕ
Ех Ж Хх ж х «ВЕЖ шли й о ї х Е А дя под ху АХ кур ме жі «фа ШЕ «Ех Ще: І ТВ ГУ ях МОЖ МАВ КАМИ М ДЕК МЕЖ УК хи МИ чн
ОМ ення сю с :
ФО тік мм хи мроокех ую
Я ОМВК МОУ УКМиХ
ТУ Тх аММиМ ще
ТУ хх іх бум (І тім Фа Мі хе хм дк Та фіхж хх дж ВХ хо їх
ПА ОА бій Без УВІ Зіт щек спі вх БІО Маї фев бу ВхО ще ВІД 1 5 1 ІБ
Фрх їбщ їла б ру до їх до бе М ха бус ЗШ. Же Се 25 ду борже
ЗЕ ВМ му Жах Ж С У ЕМ ЗХ ї зЗ'яеЕ ша КУш БЕ па ТБЖ 1 ЖУК ух Зк Зх
М а Б жа СХ 0 сб хх ї ух Тож 3 З - тож Ж их «ою ех КО з. же аж су сх у МА хх у Тк уз Ж ожх 1 ЗУ Ж г ж їх З КУ 7 з и жхх се
УК Мих мош ХХ Ущах КЕ сома Ам КО АХ ж УукАХІ мАу ЖИ ЕВ ХЕ хе тк хх зх о ЗУ ЗЕ
Та жу 3 КА уче Шах. се с Ст ки ах Ух п Ж аж, Міка ТЕ ої же, Хе і: міш Жхрв» її два ге Ав двух Бі лу КБХх дао Те Вів ЗБ Був Бе піх кт шт
У ха --
ТЗ ж хх мох ТУ Мидех жи кх й йо свуУ Бе їм киш же о 3 Ще Ак вам мі ДЖ в зЗмЕ же жо важ вай ах ОжЖ а сежЖ ЯМ БА сих ж тх леж, гл
Ен Ти 5 ще
Мк і т жху Жак Ж ж жом: б мамо уж Мосує су боку те жує км м о ту
Ме жів ем Хек Ах йо Вхо беж вв о АВо ЖБК Ав За) Тх Хух «ув
В зй ак
ПО я ех Я -щ ща шо Мк аз Машу ЩІ їхк сук: Се ую ЗМ ЖІ кю ЖУК ож,
Бій дк Зав Ні мі Бек жа із Ве Тк бе тек їЕВБ ОБішЖ Бля дах пи зар за
ММ КА КАМ т кине тую ау МУ її Моє томі у свое уд ох: Жчук
ТУужш Жкв Між Ба шу ТВ цем УУВХ ТБ ві ех ве ж хх ххх
ДОА д- ше вк па «Ех М «іх В хх УВУ «кі» НЕТ «шах цежчиа поснідевнушть ша Е
ММ дра уст делі тудх
Ко см. МУК саййх За ку туж же Мак Ні ї У сих 5 чЕїїк 17 яку, тт «їв Пр «ОМ ПемотіїчіІ чо зх К а сок «ЕІ» цеучнав послідовність реж «Еш ка у хі У мим СЕ зош сиве МиЗзІ7и одн, ди еапо» 55 пех Ж й их йди Важ пі щі же Мат сх В в пі пох реве щі
ЖЕ хажшж АВ КЖЄ ВЕК ЮК ау шу хмих БМ ух тьх ША ух МОН с а 7 ак 5 х ге КУ КЕ пів стю му кдд «й» я тр, -х «и ОВ шт З «пі» БЕЗ
Клея то куму пе и ни чех пжежчна послідовність тих
ХМ мо Лу КТК жа КЕ же и 0 КИМ МЕТ
Ме ох ж ха Мкхк дж іх нею Ми й по Му Мб хи: ЕХ ко Ж, хе пк
Хзр із Зі Шек беч Ні РБе Тхв беж Тух Тв Бі бе йзю ТУЖ : І г «й 35
У Я М о ет ух я и т: «ТЕР» Зо
У тух тег худих МИ шт ху» Зх хеткоути осмоукамиі зкпужім і схов ся ШРК МН ФЕСККУК Хе
АК ижра хх ож тв «й МЕТ
ЕВ ЕЕ жк мі 0 Жести г маі вмів
Жак ХОЗАУВМЕЮ КИМ АДАМА ЛІК тютюн круг за «ше (и, . ЗНА «ках ж . Бо сів вух ую ср лу аву ІІ т скщух УК фо стру КУМ о сут схо дусі Ка г щчерсляишмннина чЯпсамнс ча З В У МЛ ЩІ ЗЕ ща НВ ХХ ще хе
Шо 7 Й пи ха ВО ж фот бо Кс Ж ку де ЖАХ ж Тодркч бллаз Мві шій їх. їв жало Звж БАЖ БУХ МАЮ ех ; - «м « « І в ре в : гг
ФОДю Жуан сек сжУ фс ля вухо ому коки пу сх Мо отже ект чада чів сем пОЖ щ оу бибв ост вав сх Ком ак ска пе мех одна КК 195 хо є жу рт 3: обои Коди Жука Сен "тує МО Хе ди (вах ких
Уві бій гхоа Зі Бі Бех їж АхкФ їни Зек КСра бів ДА Беж шу Же ед І у "йо дуика - х У ко «си жи тих мк МІ сп си да їх оч хво вас Мах зер асо зЗо с з сЗО са У мВ Ве ях : т 7 ї що й 7 пам счг ук шк зак тліє ЖХіхиу Хе фею сб КЗ ж Же п ре я вч ах Ах фен Фі тр ж Бпе беж хшвЕ ТТ 5іЗ Мах Бех їх Ува3А дЕщ мав да хо БА БУМ сум Зк ох «КЕ «І ж че січ За у ВЕ їз и вк шує зе вах сф ма ес Вам ЗХ зх
ТО о ба: Лі пачку ХМ ож ЙО с жа о бу бік ум у ск Мія дощ Ку М
ОашЖ меш а МЖЕ о УЗо шяех ів лав МЕ СА мВх бі БЮ юеК Вк ЖЕ що я пох Фу бурим Жука УМ ут що шеуих ужхофуУюх Мих щазу мрУ пойжум о охоефи їж Ух мо гоуж ух с сви дев зао се зо ваз зоб 55 Сб зоз зко о5 за во за Со шк ул Бк Фесужт бом у Ці Фовжах Му. ожеєю їі пен СТУ бик вв Ком бесіжт мк у хУХ Алла а меш Мал ж мм МК Є пе олвк їіїі8 Беж де ФОМИ МК МІХ: Ма
КІ Ко, ча Шм щи КО КМ я
С А но Не м их схо тою і Кожух ом Ммх уко ки жуком. лах ся дна ями ас Ся Жашо та ша ву п Варо Хо За А КЕ З Му «ЕХ
Зоштши. Щоаеач Лю Жора Муз Ж гм ЖЖ у У кум их Ж Жни хо Ж Ме кВ ойшиа УиЖ АшО УЖ Ма лов Бе за БЖ МБО аж хо за АЮ аж їй 5 за живо сжвех ММ вищ сижй ттухах Віт седув о бух ом щи сих мом вд Кри Кок зах
ЩО КВ МО Ех зе чекав вав ча І СБУ Сам со Ка со Я М хі жк мам сах би щу ку Ж Жкуї ЖМузх Мед фу бач бах ю бує т
Ваш жах ух Ух и Ба Зх яв ЖК ОМВО шК хо Же Ху Кук кт
Зк тий їй
Сея Ми ЗА
Фах Же у -: ск шах ЖУК ОХ Уже о щи де их умо вич ую их спе мк зщчкх МЕЖ зак кас баз чо ше ще ЗО ба що Во ще Ксео Зх ДМА се тюки Ж зруме бінру БЕ х; К о ки ок Косі та см а ау Сх бі ке Аве об ттв Бах Баш зах ЖЕ во УВО ТВ УВА ож мех х ж хх жи
АК МІ КУ жд сх «ва ХВ кмин з ук ди хх
ТЕ Ме ттщих
ЖАДОМАМ МАЕ лю ту, с АНЯ ж ВУЗІ ПОЛІВ ккд хо я
ФО флемсесрм ошеумтимттї хокш ух СНІГИ УВІ Ума я «ад» ЗВ тлі, їв й Таро Жах ЗУ уж сл ха шах їх З ех Ж жо Зк шля хх ще мл АТ ми же) ха мих їАшЖ Баш СУ ЗНО то мА ОКХ шу АЮ х х, чІх КЕ 4 5 АК ї5
Же о Жбоех Км боту баках сука М м бу гу ах ст м ВЕ Жиге Шахує букжх ех МеВ о вжу ем шк Ста Вів Ва Бик сії вва оОЇВЖ ЖВе беж Ох ух
М ж, ШОН ж м п
Мі са жди же ЕТ Фожео Ж ж Може КТ ка стеж чок Ж В я см ух дів ее Жак ту ТОМА ЖЕК бвалі сад ЖЕО шу Ж У Ме вве УВА
Кая ОК як ви хо жк
Фа зх «3 хо ДЖ вл піну Шок. ХУ дою Ж ббажах бхжехє В з ма ху
Мак Азв їі бШех ЗрРеУ Беж ТУ З1У Бех ТБх бчЖЕ ТУ Бій дз ет УВІ а ЗА ви
Фо їх Жоеое Ж: бок Ж сх Жде Жчевх щу Вл ще бл ож ва То че
МУ ща ака важ жк се щеш дж бер ода дах мув ААУ пЕобеи Тух
Ех та КО що
Зої ЕЛ Жах шу аю Ком жна МО пт їх троє ОХ до паю бак сек дОіхх мем ша ех Ха беж їм я бів Біб ве жах лав о ва УЖ тУк СУК
БУ ; Е З Х ї жк лох х мо що з5
Ж Мою Ж Же МУ божу ту Хзмию ММ зо дж М жк «С ка ХУ Хосе Мжкж Ме іа вч хв Тв їх ТУух Без БуЗз бЄжх ТУкК Тк ау бае Ав ожшх ЕВ че Ії мот «шч
ММК ЗУ ОМ
ХУ же ЖЖ Ук. Та шу її мукою чех Жстую Ши
ХЕ ша хиКу МИ МЕМ ща кл ща Ом БЕХ
ТЕ їй сок ха си» УЗ сі
Ж ї си 5 жи гу3Уж «ій ПЕТ
УТ же УкІ М украй секту ен «ші щтУучна песлідавнІшкь яти, код ект, схгкрх вашу я шк щКмМщА БЕК «Ним дош бує Я Мне жу
Бек БУК ів МБ йеЕ ї я кед Мих км
АХ ше штррю сту «ЕЕ 7 сер тУБУЕ ех ПКУ
МОМ ВМежУЄ ки МК кп і кг У
МАК МУКУ ХОКМА ДІВО КОКю
КЕ шлю ти БИСІЕ ше БМ ВЕ МЕЖ
ШОУ КОТ
«ЧО» ва
Ще тТіхх Шоу (1 Маму С іх Ма Ма бук Меню М сах о Мхам ДВ Ж а сш щех ВА СК ЗУ щі Бех СВЖ ТУх ХУ вла яв Щек ВА ув ї Х ІВ хх зах
АХ ому, хх, о я вх «ЕВ ока ФІ Жир.
БУС Мих о ля фМлтевуємогь жим жит й ході й ких сло ЩЕ ЖшЖ ЯМОК ДОВ ОК
Ки
Бк пу лук куди ме ек чим ВКА Я сао І жом уч пу. Мауса ХЕ тло Ах під М УЖ я тож Ж ге дже ЖЕО ев оКУуХ БЕ ВкОо Тук беж ТЕ Від Бе же ох їх 5 Х Х ї Я У й г З
КУ х оту
Х ще да порт дя «М Бе ск ОХ сук жк п «ок МОМ
КІ Ху хви джек й дрож КВ КЕ КИ сей» щем чна после вь
ЕЕ ках МЕлЛуБа «Я Ко
Ух тки ТИ стук що вух вів сере ск км пух Ки КО зЧИишсиММ: фо воечочиачиЄ чис зо сеа коша тую духу мух ви зх умо хім о скпефоомоч м міч С жим ху их сих якому ужив ож и М ої У лУдЕ
Мом ма ща МУКИ МСА шМЖМУВНОХ Зак ах В пив кори и пз кю ди кт Пон жев; их ШК. два их жу тури ОИЖ Ж». ня ак оіж п ижьум, св КЕ сам їх луна соло че Е ЕН КЕ шах ет Со сссеве КЕ зни и кисню куди З м п у ие. Ех рн в НН А ШЕ прати п о я ТЕТ сива кешпнличи есваастакЯ свопи подо щшисзсдааа почав ии мМ пекли доли ве Види ср Е ІКІФДН ДІ у М ЕВ ЗОЇ шШхисяксу: асани маса сазан света соми сецКаецеих ЕМ
Ж ожещ ит жи дупу ов де У іч му жу путі кт М іхухевичих шт Кк є ЗК
БУК ВАН ВО Моя ККУ КЕ ау по НА к м ХЕ : ї бак а о и На а КУ 45 злочи посох очеиав сен х М
МК Ж ж. дех
ММ З
«ЕР АЖ ши тюоя жтЖжи.
БК МЕТ
ЕК ТК ук ютт жиле уко щу ух сх ШИК ІОВ ОТ м
ЖАКА шк ту пух утуєіюти кажи ль «вал» ЩО МЕТ ал я
КН» ла р с ших ехо сржшеь Зк ж
Ум соя щомах Жеахим М ух сади Кі ях хо См Каф сяє КМ х туш жах ІВ. теж іє аа жКЗ йва ет ха ку дО АТ КЕ дів оси Ку КЕ Х х. їй г З 3 х п їх 3 Но
КК меш кож, ад «Ел я а е х ою Ка
Ж ухуМмуУ пу их мжкх со щі Трохтіуеів сої теххіхім ії ку «КУ шщхжЖ ча монах «БУХ «ЕМ СКО МЕЖ жук кох «ЖИ КЕ : с н дих ке х з шо ов дош Же
Ще ех лм их Ж ух мів Ма бек су пкт бек дів б ЖдвуУ бух
ЩЕ Е ЕК чх Ж ЖЕ чола миле ЕК ех УЖЕ уж га ЕЕ БАК З Ж с ї ї УК тд х Щ ке ЛА ки кш «кВ как ре кл ЖЕ ях СТУК ше х пі «ши ОАЕ копи Уже ФК Кк рей уко вих і ЕК «ВК мМХшЖЧЕА КОМА
ОРІ хи и киш БЕК стул ках
Кк мли уима маси девНнАКЕ сх вт Кл «ЕК їм о МИХ хх КЕ
ВО Що се до дтв сек. шоу о Кен гум у Ж их их ж а и я и а о ОМ НК же ам ме ЩЕ чЗщаоссказкс чимале Заж ке пай жк свл опт ск зо ше че ша ше ИТ т ОТИТ пе хе я Пк т ж х о т о У с кю у й тал: За г таз що іт Шжхух У ід ап ог
Ме ува щій ев ошуи Юа о БжЗ Бій іа зі дез - зах ж ї з х що АХ док зах с «ож ох ояеду поумух долу ю КУЄ ки Жде сивих. КК одих зп чис ща ли су Вс Км сс За щи Ти М ми Кс шк ас ММ
КЗ Ух СКК Тит КО БУ У У 1 - . с ж дин чаї же Жоуч лю лю вк КІ кош вм Мах гмуд бохо й Шеву БЕ та Аж Б А МОСК ШК а МмЖ жа сах СУ вух їж чех хау ЖЖ 15 й «Я
Мх и
СЕ удуей що за «тку. Прлдя щеиит сщежя гої жк хи вдо жуки Ку З ша ЗК М ЩА АХ А шко жи ям УМ мас ха шо пе ср оч З ши З м я в се : . Фк (9 дк ку сх т те Шев брж о жфкк мав ців твО паї лов Пій дей Ве Бі Ів
ТЕ о бве св лек ХК жк ОМеб нів тк Уві з м веж КО ЗІ ХВ х " я хг
ЗИ Ж о лі вдх
З х. пк ЕЕ хе ЗИ тан бечк дл стузй ВЕ БЕ оп ЕЕ вих са а Ба до фе 1 че ск йавосч вЗос Фо Ве же ває У М ве ве шах вах яке пет г й 5 з тІ т /, ї с ххх та фан МОЖ ЧО филку ТЕ 4 АЮ ж Улочу Ка Машу Мету бе. бо дух Ж хЕх ве ке щу ем шій же Їка Біт св Бе дав жо Зак Б» аж ях МИХ ОВ х щи пух
Ко Т- -е : худ : : Є хосщужеоюо ФК лю сво счЯМою воша. дусі фу ВЕК ож ЩО сов вия Би ех свут І Жж Умег дже Яд ст -з зо ен Ка тах ках ВКМ ХлА ВІНКУ ко в ща пс жвщ о де во ши шен ча ще : . -х - КЗ ЯК ше ПД же Кеш ше
Ух «Я ж Ло Між іх ХМ шк Жах ЩЕ у Кк Та же У ву ОСИ Же чук вай Бай ому бе БшЕ ЗишЖ мув ваша КБЖ їЇзма ЖЖ УВА БЮ УТ Бе
Я -х ких с ща А їй іх
УЖЕ мог : х ЗЮЖ Зам вве ожех ТЕ : ; з фо жах Кат суку ех двух дюижі щі АБ В ск зай кв око ва
Б Кк виз чо сах вх чаш с аа ЗУ ОБ аоа ши ча ВЗ ОКех
У в що заую М : : кож буде (Ж ме бук їх хх сі Кіа Жея Ма ій Ж буру й бама Жкж бе хв» ВЗ Вау
Мах Ще ХА Аза ХУух Мах сів БУ ех ще беб тв ек (и в я де ВЕ ТЕ 5 Щ5 ХХ ; г зах
Фе зв ох пот паж уд аж жу зд боух сво пдв са ЕЕ вх зах ши сі ха ех ке - чив Уа з ща рах ЖХомх част пе ЩА Ж ех
Та : хе З - ач У : і ши сем п - же Сошужі пла С Ах їх
Зо Жов жа би здо без Ул Я» дош Тік ов Оу АЖ жа
Вів щем т чк КУХ Ух дів Ах ОКУ сіє шк Кук о ЗАВ ж У
З зах ЗХ
Бод А жМм
ЗХ У мох сх
Кк кжеша одує сжеуєе пек мом сю хх ем суті фону тип фу ЕК. Зх
ЗА аж Хв мер ЕК щоаво фра ХМ КІ ри ше Бу БО Ко є х и А п 7 аску зах оо Кеди хо Жов ктує пек ст тії мує Маю щу плве жі сухує Жов
Мек аа ек жжЕв ші свое ах Беж ча ТЕ У 5 вк ще
І «орд «тк а
МАК МВ М пужр ж до «Кн ї «ай У ве
Кл Ух
КАТЕ жу скутм ув ук «Ж ОЗЕхХ
У: ін жкмтїоу ди и умо
КУА щу ОТ ВН ХИТ
ЄШЕК
СТВ тікіспкУавутки СМІТ
ЕХ Жя УЕУЖКИ Ж ВО ККЖМЕХ УКВ Ж ВХ Хек джек ЖАН ик Фодшує й вд З сус ау у у бух ЖЖ Жокю бах тах ср
ЩОКА МУ МО ЛЯ А ем ЖЖ ще ш жна А МмшМ Мах зх ЖЕ А ш ЕК т т як «ех х У А ТЕ ки В т Ж Жид паю Ж Хо жи Ук стю ук ЛУ «ке ку вух ех ві муз пев Зк СУ бух діа Беж шу бує ХВх ВБеа Жвж Хевх ТеЄ тв з за
Су «Кх -И «ку шко грй о оту сх Мету З ве їх КІЗ Жкмі сх ув жу
ТхвоМес нта Же ба З їла БІК АХ БЕ їз Аку хм А ЕМ ся КЕ ох та Зх х
В 5 5 рія Зо о пидху Са штук хх Ммтфуче сїтуюте огібкуче дев КІ ї дак КАЄ
ЕФ зе фо АБ Бе мех аю Зв тю же Тих Теж ай пік Буж Бе
Ки п шо
Х ЩЕ ке ТУХХ фол СК ке Ж умо Ж ла пам сто сххх Ах Ов Ніно дтекає стих буру Ж В студ ух
Її: швом ух дав Тих маш тв хх Ат тах ши щах 5ежЖ гі ів Ку х м ск вх с
Ко г У ши є с. о - як Ух щ с ок село, А сх. а Ах у ОВУ, ду. яки от пазу МЖуух Жде спр Мб ще ФУ жк тку М с: сюди Му ся ек сут щео ех Бер ас тах Бек Б АЮ ощех ЗАВ Бе ТУХ Теж тв х м Ух о
КЗ Зо Їх
Що Хоми мк кі є ки ох Тжачє фо Жах З 1 аж ля кМеУЄ жк ме яку ма ЗХ ща БУ БИ Ж Зулю Зав ЗУ АшЖ ща Мах кар ТУх Ах УЖ «Ах З АдА ах
МКУ ММ КЕ сит м гу . Ху, ККУ тх ох ХХ ня ж дж хо хз Зк х Ре ух г пів оЗАФ ТВх Бах ВА ТВХ УА Жех щЕЕ хіх Не
ВО ЕВ ее дО «4 их їх прлля «ее -Х ех турукх
ХВ ПАТ шлю Змі тет пік ие,
МІЖ У ЗМОДСЗІММ ЗА УАВМК А и К «Ух йх
КАМИ реч сежеюют вах ль до «ий ЩІ МеДКХ кг Кк Ол «ЯМ Її
Кок Маю жим, пк ух. з ек ЖЖ схо Ме НІЖ х ш- ї З а ою ш- ха А МАХ студ ж мч
ИЙ М рт, пд п БК «Ве Пров За оВнА мих суто ою І «ше век «ка СУВХ МЕЗО коти кох «ам я
УЗ лм дк и щи боуюш сбпкри СТЕК цу ка Фа сво Шк бхаж таж ї53м дашок Бах вий ек щи тах ЖАХ Тух вЖМ мів Бу Ва ух т. М Ж хх хх че ж яко еУ Ж
«каз ща «А М же АК
ЖАХ МЖК кор у Шлхх ухтутух сут Урий ему сек
ХК АХ шум МІНА дес хх «8302 ноти й ху, гж й фе ЗКУ «Ех Шелл МЕМЕщИ «100 Ж сі» ах тах кі Жеки що 131 Жах лах 1 Бу бою Сх
ВУ А БЕ жЖЖ вав Ам 1 У шу А Мах. ММ ОКХ
У ї: че ї їх КК
М вом Ах ни от
Ж АШИ «І се ЗІ сли пух чи
Ох ЛЕХІ ХХ.
У Же Поихлуюя пен пек ве
Межі и УК ККУ ЕК КИ стулья
КЕ тт ха У «шах МЕ
КЕ дж, дю кю шк й кто. кет чи Миша В ПОН МеВНИОчВ туту Ра тух за
Мих и А ЗЕ холи лет «ЯК ТМ кі утохтх рути Ух их В ежежувих смовтю смУж дхІуех ей ха Маю ую ви режи уфутЯ фжмдсх сс ке
Феасерасосви зола с сва чо сви БО ЗІ спав с ЗХ Мих ча З се НА длиле зп жу фоажах ЗЕ ту Жук ЖІ Мі гул ст пам Ук щіМм іа жо ЗА БЕЖ МУ МАО ЖАХ 4 «ж хх ї ш ве пед. схожа ше УЮ сжІЗТЕ жим бом сх ми уж фіз ут сут щощІж су лей схуд Мод за мижІу хе мМ шу ВИК МВ о ЗЕ ЕМ МО КЕ НИ МАО КО КЯ У е ще ща т жит А аж Й «-х шт т о жуж їх ж Ж ке 3 бух хх Ме
Тем бе жує іх хі бо М т Ж ду ма Же 3 би щі с
АЖ шу Кс щмАаАМ о ЯякУм ск дам МВ УВА мах МУ Бу лав шк сек ЖЕ
ТІ хх л «й ХОМ
Шемет Ме ух щук уМ сжІЖІМ Мом ЖК ж жи сужеу оку ФУТ Аиуюх стуки ул уУуУТО У лух 1
МТМО АХ ХІМ ох ми Как вла нм с (СМ ме сш цем КО щи мав же т. ех ССкок лк сек сі у щі о учу Цех ут ста Ал бут (їїЗч; в
ЗВО Ал ма УЖ ЖУК ВК ув ТХ МОоУщАХ АК км слюхяю КК ХА ах чі яр «ж
К 35 й ге (Со ек цею ту хі ув сиж о лрже ях слух чем жу СВІЖЕ мух. жук мим мех Кк ча ж Зоя За аж ло с Зм ма ж ЗаОо век за м ЗИ Ве їз сю там тка же Мк ТЗ ха жах о Мік ДУ бФесуж жим 1 жи Ж ам бум Жлує
ВАМ АНА КМ ЛК Ме. іі ТЕО їж М Ж ЗМ шах у БАК ЗЕ 588
В В Же
МК о фжомю ще УМІМЖК СОЮ сходи схожих пет еко хм МК кум их ие жах мим фею ТВ ча щшскав паз зва КО са ща ж зе ак ВОЗ сш У шах ее ше В зу Кт тож Живим її су фо хід у мк м дечх ХмеУ Мк духу
Ух жа ІВ му сля іа о віу мч КМ МЕ тлх Бе ч АЗЕ Х Зк ЩеЕ ж ве За У
Ем ЇХ То ї х ; : : поотя ка меж о ми мам о синя фомае схо суму учфак мету пев двох церк Вк зкумо сувух ще каску шк ак вка СК зб ах ще слу чи ЗУ сш чо ие чаМ о ши су Сея ж Моктє У ом Кл ню Бі ех Ко Шок ач Тих Щи Ке Митух. ху Ук же їж Б Ж ТІ вла Ще Мат пі сн) дех Хе ЧО би мех лщрох АХ я ВУ ВО сжучих аж ду м оц ших б сжаек жу сим жо мож вх В му шах дощу» М дих ак що в НК сао КК ех во зе ик СИХ За ос п шк ЯК а ак
МІ ху смяує суду їчзума ЩІ Км ху шум беж Ху де стук му В соки ха Уувх МуУЖ Тек Ста Мі Ахщ са ще ху ЗУуш дж м Щек жа ХуЄ аж пе Ж йо ше АТАК пофужо ми їжу МУ ск т я же сих Уж зе ту ких хом мим сами щити хі ух Живе? акк б що пе сх с сах поз пис о сав Цщ я шоб ке я рю ше ЯМ
ХУ. Жора Мі їх Фолс Мои МИ, З. у. хх ТЕ а Ух . Ж оку з ех о Ху хм гля му: маш гума А вожжЕ же шою ап жу ВЕ Бем УВО С мА ОХ чай / ЗК яри х 1: НЯ а ре я ьже у - Зх
АЖ А скодохе ких «ИеО тк ж м доли
ЛА АВ сл тету хх ДК АКА
Ух в Не
Жахи 0 ж Уучна послань не о
Ж ку Си где ву ке доска й У дання 0 СКМ ВН кю т
ЛІКИ щеЯ ті ту пі во дл щі бб-к пі дтв щі Щі Бош Бзе ту щі МІ чі тувь лій ве чві БІВ цех У ва БА 3 шву ВШ КЖО ЗІ КІВ п Х, ЯК тож
М Ух АК в
Му МВ фо ТІ ау буру Ж Ж б сх бу ім Во ЖЖ 2 хе ме
КОМ У З дао о Х во му Ма оешж іш У МшЖ АТХ г Те ВЕ чаш ух
М ек их ж х 5 еЯ
Збежю ЩЕ БЕК м кн т бокс їі уУ щі тк 2 Ж ФО ма Тем її у 7 ух. дек тс ек хв БК УЖ Зх ща ов же Бу зів аю мМ КМ ОХ Мах
УМХ Б 5
Ул їх шк и ж хата ах бу Ж ях ке МИ Як мкм Ки бат їх хх я . су б т» жу СІ Кк вх Має Ж У п так: гу піт ТЕЖ Ха Мав Зо Аа ех Бу ща ке Яви А Мі сив У УЛ ша жк Фк ща туз ЖЕ ах шок Зауї пі со ЗУ оте дет Чех Шену Ж ба Шошах ік о ЩІ перу шкді маю лк жа СМХ Ме тм же чаш охмпх ех Аж МК УМХ ль ЕХ ах ж хх Ж ще НЕ) сх У зма хх: Жде Жарко их Жов фу Шу ик ше сш 5 що В ба ре су
Бе щі Сей Ж Ах ОМ ЯКЕ МУЖХ ЖЕО КІ МКК вив УвЕ Х ЖЖ ОВУ мух щих. до ту ях ЗИ мя ла ач ах бує ку ох Жан б хмо ба щи леж Шье ми й их йх ків ба лу Бах КЗ бжВ З Мо бах зви Зх БЕ АБИ Ва Ве ди тя я тр зв
КМ М Я Кк отпеже сб рю Ж Ух і Зо й одлі ж бу та ще дю
ЖК АЖ мМ хеАК МАМ СЮ КМ жа ХХ Ж ХУЖЕК сх їх 5 їх
МА М я ку, т их ТЕ пек сх «Ех 7 «ка ж ЦЕЕ ну р дак укови м оди, зро уже, «свій ЩИХ ЧНО ТРОСА ХАЕС ЕЕ»
ЛЯ лю я сих «кий БЕ МКЕащаУ ет в «Ве ТЕ
Пруку її» ех Ск хи бю біс Мі бик шен Же» Від пів Тева Ба ПІВ
АЖ ІЗ «ШОК ДУМ кг аг Оу сх Ж ЖЖ ТЕХ ЖІ АЖ ОМ Ж ЛХ ЖК дм ЖК ОО ХВО КАХ з х В зх і Х їЕ її
У вче сему
СО Тхх Ї
ОККО вия
УЖ я ок Дт М «в ВЕЖ
СЮ тХ пкт хх кхужи мі є дж отУюх
КИМ ПЕ ЖУК Кон В АсУю
ЕМВ шин хв Бе щі кажи ММА ми
КТК Бе
ОМ ХХ
Ток Так Жила дк уж Зоя Каюкає Ж зв МУК Тов ох би хх Ту пошж цех й Зуж вкор беш Бек жи ТЕ БРВ дек жів Бе АЗвОСуХ 4 ш хм Б - - ЛЕ ем тух т --к
Ж кю та
Как ТЕ «туя «кі в КК «Б сах ВЕ жк МЕ я у тремтіти се тм сх дО Жоржух
ЖУКОВ ЖЖ ЧчНА ПОСЛАВ Те
ОО КК
СЕМ ел їх схуд ве. ; Фата твід режі С
КД Х ЗажальниМм десни кавнише БК І- 3; ах ск а «НІМ Ота хо ли Тл Как им Ж ста су дл шоку т ду сх. м щі буку чу ТЛ хх даювожКіє піз ВО те бів же руб дес ях їдех ех Вів дех У шуу х х НЕ та
Фк оения ШЕ Яхру кю роко ж же жк М жотя ОМ Шоашеюю ШОЮ Шах Ку Хара Ж хз ав йкч Уві тВЕ бів Тйх Се вкчЗ вія ес піз ве їів Зв ех тТрх су тд их в ДЗ за ї ля мі ему бі ж блем Жах бі лж би Кох бе Жяумо о Жахи їм Ж р а ле КЕ БОАУЖ шаль їх АТ леж Б ААУ ож ав вже г МІЖ лим МАВ КА а й «5 се Ві ік бах ам о Ж др зх бом іх їв км бом щит Мед бух ма
ЖК за Мав вах БЖ ем БІО ех ЗА Зво БЖ ех дЕщ Ве деш щЕЮ жах шк ж же ж щи аж шу о Ку ПУ дж То хз хе к, Укх а ою УКВ Чех сах сих Жож ГА ХУ, ик Оу у вк осаюЮ чит Ах тоже СКМ бнх бМЖж бі дек Як лам щі Бе
Е ТО ІВ ща
Ух Модаж Мих 05 я «х я Ма ЗУхакає хх А в сЄдсих Хм ЗЕ ор Жеиз ех, п;и вче па вай ПЕ ЖЕ КуУЖ СУ жа Ба ЕЕ УшЕх ех ВЕ ЖЕО ЖЕ а лох Зх ши о У
Тек о БеБе дію Щі сфе ву їдігй Ша М т їла Щек СЄвк Уві іа В
БЖ ББВе сів сів пе ХВ був Уві 036 бів був дж Теж Уві вія ІЗ
Ти жк кт
Є Аме А лужне са хУММ ЖЗКЖах Мо ах Же щіутх фени Ух Хохеу Г01хе ї3 У Тих тк щем гаї чу вжоОо 5-х Уві Баш дів Бе жк Бо век дае Зм пі їм Муз Бех А ех ях Зк «МАЛУ шим КАХ які І сдохк дб хв ум Ж ем Кхіх во Мох Ж бах ух зни хе ту н іх пах бла ех УкІ УВА сСтжш оба Сем МО Аа Бе ТУух БО дк БМ МІВ зоб хек є х 13 135 145
Ух ДЖ Є окт жа фесрує М гаю КІ З ме м о Ж ду ові дом Ж ха мУщ Жах п хх МО УЖ Ж ЛЮБЕ АЮ ль М хх ЗЕЖ ЖолнА ях аз ж чих сив 4 у їах МА 155 і
Уа Маки Щі ка го КА Ж Ху ол б Ск Ме бе ам бала цю стьш ек аа Ж Єва са во ще буз ля» еЖ ТйАХ ТХує бах ем щех «Ек ком ж
АЖ С 35
Фоми Ук Том сн Фет. СХ фо Ж за рами ХМ име М и Ж хжаа ЩІ що босу ВВ Мах ах ЖЖ Бе) жЖвах Ме Беж Ук йів бе бук БАЧ Бу Віз був Уві ТтЕ и теж ху їйо 155 У
ЖоСтоу біжи Ж. а жа А шу Я М цю шумі Фу Же Хуан ХМ см Ж ха Му аа се зай ша КЕ МУ аз БаАшЖ мив шек беж ке УА ХХ ЖЖ ше хх тод ха З
КУ им «КУ
Мр Ж фе са я дже пе бар оОмЕ Я АШЖ СОМ МА
В сх й дек хг «ші 350 ут лушит «ша ПЕ
КЕ Укоухеєкєтть ках ох й ор ях Ку шуму. «ші штучна поспіенІсюе ск, ее
ЖК декому ту мі суми думах ким
Чикшаи БаЖжиМми пам щи З АчУЗНИНА Ех «впаж За йт ах що фл ті м я Ж зх ща та: У Жахи тлущо бро Сну Кі ат мя АВ ме ЖЖ сао зе у лав аль ЖваА БУВ СУ КЕ ау дпа ві ко зв ж х ух и ЛА
Се ХУ б ем їх бук Хо Слух ло Уа ЧО ж. Дік боже В що бід
Еш ОО ж ВХ ж СМІХ ж са Ех Аж БЖМ СУК ОХ Ва Мих Ді Ох жк «ек ява, ух
С жу ик ж о хх
Птюуяє ЩО я є, що Ме жк ни Отож Ждкєх КУ я тах ось Кгплсжа сЖе же Ки хвЕжЖ жає лав УЖЕ У у сл Аа ЖЖ ша ФБХлОогаіУ дама сум сКже ї3їа
Я х ву Х З 5
Уж Жжеку ах Мч Люта КУ хо бою Ж А тиху Жук Же ла З се КЕ пОЖ К О КЖЕ МЕТ пед у ЕК Ж АЖ ЮТЬ ЗК ЖК Мо мех З не шві
Й п Мих У. щЕУ и во
Шк В кт Можу хе джу У хх ЗК СМ м Ж Ст міх Ме Мах Мт бю сту хат МАМО ЗК ів ТМ ма ТЕ ІВ АВ їх їх б о ХМ хІУК м КК жЖ Ода ЖЕ їх тд че 25 во ТА ка щи
Мих їх Тік Ж Шах ує бує Щоки рю Й боги Зою 1 Ж ха КК їх кас і ШЕУ ХшЖ МК адм АК ЕХ КУ ЕІ зав аж дав У Я УЖ КА Буш -еЕ под їх
ЕВ ба а с фра Шу Шен ЗЕ тк ха Ху ЩО бах ММ Тех Жуля Б хг лів же вхо БЕш МВ ЖК ЩСУх з» бек Дів УХв жМпЕш ів хуЖ ЖК ЗА
Ак пох Ж
РЕЯ Ку Мк
СА сю а Мам н хи Ко йо Жили. г но со: Ме хх як Кут сус пі жу мо ую там Хе М т Жак Мр т ховаю ОХ здии гії їх ЗУ ші хож Їж М Уща ЇЗВх УВО беж ЩО дів щих ЖК дк шоу БжЖО бах як Зв тк
А х КУ КИ х хвоя фуру Шюкету Жошлї Бо ет Жир Жак ЗМ Жук жи 1 ку іх 1
Уж Біже жо Ба Віз бко Беж Шех був беж КЕ Беж зпіУ АЖ ВУ Вів дих ТА п
А Х-МА хи
І тах Ж ЖЕ оближеш ток У Хі Ж же Зх Скажу Ех Хм ет же, ЗК Ії
Аа АН сою ЕЕ Бач ва Бук КАЖЕ т ШЕ оЖжих жк ам кже вах Мих ВЗ ж жи СХ, ох
І ІВ ХХ кам яшжад о одн здат, Ж В дво Зощшкт ЄМіуує Мои й шк Кр й 2 хе маш Шу Ж мес ЇКБ ажи беж і вів їм ТвХ беж Бі Зах Мів ТВБЕ Бе Бе Віа тт км, лк
КО КК м їж жа й дум боакаю жі: Ж вах біжу ббузе Я сухих стем Я тащЗ є а
У МЖК бе ХУЖАТ пе хх у АЖ Ж НАОМІ Ха Ж ЕЕ чі маї тах Мі ча хх щік
УЖУ АЩІ А їх аж Лех Мк Ти ЕІ МК ТАЛУ Може му пах каУ их Зх
МК) ХУ СНАХ ХМаЖ М БУХ вж щи Кв уж о шує ван щі ди МІ у ж суукух тах ї ІМ ККУ
Хол Хна їм зму Уа ДЕ уж М зт кош МІЖ зо му У жк лук тк Кю зу Бо Щек май ЖЕ зу Ух Ач їма Зощ о Уеа УМ КЕО Буд Чех Ми ж веЯ реа хм жк У ом Жохках бу. Ж У. іо їчхек Комі ЖУюся й С хо Же Ж Ж ошкут Ж ето єх. бзю Був Жжпх Буш їв Му ВХ СЕ Сум їжкЗз Ах же За Бемо бен о -ху "іх ьна 5 УК хх М кой Ж ї- з Хе Фа жа жк Кк ЖК Же ж Жов со Х «хе Ме бро ба М
Щ т КІ ЗБЕ УА Ма фа Ба Бу х Бу ж КК МУ да ОХ ЖО МЕ Мах
А а ху, п М ей
Тке бему щен Лв бю бл За ма їі г В А дав ух ях ую МА
Тіє дех дже ЇВ Кжео 50 Уа5 їх Суз Уві УВА Мах зво Уао ех НІВ по зу зи я вай шт їз Же ШУ (Я ж ХХ Ж ку Хухує Жак с Аіжує літ хх йхЗ зх ХК 05, жк ма ЗВ бує бий Зі та Кп Аев жжкрв о тТух Уго) йиюев о сбхю ща па вх ди и зав
ІВ Ж ва чі: х - 3 х кт Ж . : оч -ї их Тем ик бро я піз йяй Аїа Бук ТИЖ Муз БтОо Ма пі піч сію КТ Ав мек Твх Тих гуси ак гуде з хз За
Же ЖЕО ух ие гоких хм ХУ тМосажт лоту т жу Ду ТІК кох жу ТУ дж ах Уві Зет Уві ем теж Уві ее Нв осли во дже бе Ай ПУХ мих щ. чом Зх пу
ЗИ У м Я пок Ж хх Мбеуаю СКУ екв ЖК Маю Мов 1. жк. 8 5 т ху в кос: д т З. пу їж
ЕВ ОВ УшЕ мух Є М їх Ж ха ож АТХ У р хв Бе Кеш АХ КАМ АЖ 7 ї 7 сеї ел лк
За ЗЕ 5 хх. гоже Сн, до пуд где СЖовю жо юЕ хе. жк с Ук поко п їжу М ту пом гий таж бів Бек МЕ ків ше АХ М БУМ шк АК З пів шо ів УзЗЕ
Й кт й т Зап о 35 НУ т Фк в вкл Жук бо Желе жі ЖУК морях тож йо ях Я мл тек ЖЕ йхр хо Бихо беж ха бів щібю Ме Те Буз аз» ів Уві пах й «Ж кв ких
ЗБ Бо
Жодшжх мае ми суху ух Ж жа Мк 5 тйежчя бужких З щи Кс я тлі щ АХ іє ЖЖ сСуз діа Уві БЖ Зі ВБе УЖ вхо Беж Аво їі Азія ува Ав дує км зем,
ЗБК ЗТ ех як -х фронти Жду ФК ут МК ах ану ку у доме бля сао У тіж Бін Кум
ТЕТ со Беж дев Зі ій їз БАЗ йва Аво тТУухХ Бу Таж ТВЕК Бк Ка
ТМ БКЯ ЗІ апа «АВ щи «У Ж еВ Ме ке йююж вці іо аж баз Шо бнмі Же Зах Та Ті фе Ми
УВК вес ах Бех Ав» Біу Беж РБе Бпш реа бух Бех пу їжу Жах Уві
У МН шо Х 05 а С чи жов понщея озуу Трод, ЖЖ дю ФС як Кажу Ук ХХ бр: фії дух ХІІ Мих зво Му бек дже ЖЖ омпів слів Біб дав Зі Бе Бек брв5 Бех УВІ) Ме т що як т ЗЕ хг ря 5 435 і хх жо тожохх ЖЕ в Що о бум Ор Ух т у жук о б бе нНіз Бій аіз бею Вха А бі тТух ЖЕ Іа бе щех бе Бек сем век кКЕ зх аж
З ЕК 45
ЖК У ах кл шоу свв «ех г сх, зи
Еш ЗА спруюю 0 бр
ЕХ ПЕ кт алу зксххттусм схо г хх кА жучна послідовна сюю ноту же кЖ У
У кох йв Ук млгт т см са мохом кан й я пйпсажЕмими анцях ли лв'озашваннв не ие «ЖИ х т зло Я Кома тм ох шк ТО г КУ т «Я ж офуєх бу же Же Я ки 3 пів Заї ій рев Заї бів Бех Пі вів піз Уві вуУув Був Бк пі дів т я чи щ
Кк їі Кк їй
Сема ал Зам ЗУ ам був їди Ж бує І сбхаяю кри ВБфу км сх АВ сх
Вк жа вух тва ЖЖ МУВ шум МАВ БЖ шу КУХ Х ВЕ ВБа ТВЕ шою ЖЕ гуд вх З
КО АХ «А ббуус В 3 ак ВК Феякцня ЖЖ де МОХ ки ЕК хе ши Ж Ж у Мем Кв а
УшжЖ Мей пла жЖЕ Ва ДЕФО АВ Ба ЖЕ шум дю аж ем ба уки Ма
БУК ях ке їй ся кВ лле хни Же и Му Кшк о Жкук сїлу зх бе ши чук Віа і Хан Мед
МАМ хм ав ни шХхо ж ЖЖ я БА ЖОАЖЖ ЖИ УХА ЖЖ ЗМК
ЩА Кх ОТ см 5 те ші ік Ки МЖК бе з сбие жи ам Хе па біжу бук Жмає Я що бе
ВАВ ща ш ХЕ ВД ХВ Ме Кл Ху З ан хИЖ шак АХ У їм біз Ккя
В 7 зх ху хаехУ ЖОВ Ух « ме чи тів щем ех що; пух кру щл ст с а го тах
ЖК ше БЖ Бах МЕ Фан виш ОшЕ пам оБшю жх КВ ва Беж Су ЖК ОО ник др з
Зо ЗО їх ; х пі що г 5 ку мия Фо ДЖ с о Жак бю бере сб ху ад Вк
Аіз Зх у бер Вів іє бек Худ Ві Б бер обех ТУЮ бер ЗУ ББе вав
ВАН ца хл стаю ях То ю Ж я кт дю ок ЩИщ Око І сю ух Вк Ку ух сток теж ЩЕ слі щі щі ТБжЖ Бе: Уві ТБ о Зві Заж Бех Аза о Мех НЕ ув до дм з
Кк МАМ ДАК, охоче ЖЕ ви ма ТЖК ох ож ча же Шеж юе Жов дих зима дух Сл хх
Зк ЖЕО Мах ЗА ЕМ БК Ме. дів БК щих ОКЕ м хх мк веж її У хр з'жк х ке
КО 155 КО тах у пчжя щх АТ Ху ТЗ ах сукехх Хо: ЖЕК Уже Можу СИ км їх, 183 Ще
АЖ ЖЖ тА ВАВ зем МАМ УМ и УМ дж ВО МУ ОМ ке ЖЖ ів БЕ я хх з хх Зк
АХ ДИКЕ ЛОТУЯ М дов рум ЕК бе ех дод фам 05. в що в зр ке Я хи кох ло рожх чаї Ткх щі Бек тов бди Як о пів МЕВої Те шех Бош Маї Па ТЕ шк ям хмуре
Я хх
М ЕК ко їЗЖус: їх 13 ен Ж дих її Му аю ах б УМіжає Же СТошивм ех ж пе дуюю ЩиУх ква де 5иа Ух бац жів мех Вес сіб ев бек дах ше мех 5щкК УВЕ ще вия бої кК АУЮ А ро ТЕ я мам Хе Кх сем т таж ТЯ жу "Ух і. УЖ бю СЕЗ ех їжак йо
І МЕ о щі БЕЖ ЕК БЕ НК їх їх ЩМЕ СОВА ОВК ОХ шо КА МЛК ЗЕ
Мая й В оче ня Фоше божа боже Хо Дж сукри тожвк. их яка Жоккжи Коен Ж ОМ уко бух зах йши хв СУ БЖе Бек дей ХВвх му УЖЕ баюв Бе Кк Ма еВ ев ях вії й
Товт Жар балі бю Ж сі фо бхфуж стяжка Тех, сСбажш Мн Ж Ожо ду хх бее вк су бар Був ТЕ Же ХХ сую БЖКО БЕ СУ Жко вла ха М люта пк ях ху Кк су ах я Ка З а
Зк Мамі ст» туз 3 Жхую ЗК Я ба; Зм Їх Межа Же оо ов: бл ща ее ке опау ша Вже хвх УЗ Бе Бази ба хо же бив вже ММ КЗ а зай ку «Ж лам Кая три жоаміх Му ті оре бут уж буті ШРІ АНЯ ру сббож Че Яр Ж доку їтвх цем Ме жів БЖ Ах ЕК хх ки Уж ТвХ ях а ГТ щі Уві де КІ зиск тукв. ух и ХК кОКМ
ХУ Кшии КЕ ох КУ ух ха їжею Аж СОЯ СЖосує КУкех Щури МК У беру
У Бек Мі ОБів дао БЖ са УВЕ БУ Кбе ди То бух Уві. БЕ оку тик сугут се хо М ша хх. Є ху ЕІ Костя ЩО поь А Жов ку Мдчию КЛ дет. У Же Ж ух
Уві Біб во МЕ дай ав БУВ БЖ Се РЕо жа а Бі і беж Ав
З І З Я
«т тд яхт
М Зх НО с зок бак ес Шеі Са Зав 3таї Би Жак Май їемі Чім ік х труух пЕх пе Тух Джо ві Уві зЗеж Уві їж їх Уві фей хз БМ й ТК де Фу іх кА
И с ЖАХ ке
Ком ех ху Хохеу Й ОХ зх бзажем Ж хг МЕЖ сх. о шує Жак. Ж босом чи її вавоЗу БУВ 30 ТЕ Був СЖВ Був Уа. ВешЖ За дув Віз Бец Ко зах 353 135 фло жах Жах «лк фл ку Ж Лошу ду Жозхву. Ку Ж «ху зу Ж пух фожчиж ій кхо хів ців Бух БЖ 5 Беж БУВ лава МУш хм ЩУВ ШКО Вже
БЕН ак ЩО дк Жах ха беж СКК, оОСЖк по ж сах В ТА в т дик «же Жозе СВ я
Ето пів тві Ту ТНК пу Бе кб Беж дЕЗ іс бів ес ТБЖж Бе дак лю КЕ Ж
М ЗО Б пл хм мам та тож їм тм ЩА тож їл зж ХМ сті ие Ходи У іх
ТЕ Ома ЇХ Ж) СУ Кк МкщОо ха. МЕ ою ОК Ме М КЕ ЗЕ де чі хи тич: ВУ
ЗК Бе ЗИ ха я дж ха у Ви дулю Ж Ск ху базу 0 Фо ж о Жовжки М пів Уві Зіз же сьо МЕ Вжиа зі біпо жжо сл еб аа ТУхХ МЕ ЖЕ пе скл Зав Ук сх и ша ММ хуУУМи я дхжитм ще Аж Ж с Фуко ох ТА ок таке ЕК Ж; това бут ру Хо їв вже КО Узі БД йеюе Бех Баш шеж шеж Бо БК ше шу ши Зуж як ж Я
ЖИХ 48 вх
Жоазії жа щі Жук Мних Ман т ж хо Мом г їТУЮиМ буфети цей Тих Ущі 5 МУ беж жо же о шов ів іє дяк Уві Ве о пас сСув
З ах але жа ех в иа в Мох мі (іх щі їх Між дк Не що лу ТМ ст м ж кум МИ тю ж хі мжЖХ мМ ощАВ дме Оп За мВ Сх я ТАМ КВІТ му шощЕХ шо кОтУу Оу ко. т «а Я хви са дек шт бі що, Й
З М МК сплю пух ех «и їх «ше ди 0 ЛеДХ
А шк
Кл су ддее ик жай кжжкихак й пу их,
САМ ШЕУ чКИ ПОС ВХКУх
ТЕХ Гу бок ММ
ТЕЖ с сих ще «Я Вх пе иль и пу ким кам уж т люк ук ух ке «ВЕ КодУуюче неошиідови УЮ сх зт стю «УЖ Жи КИ ТЕ кох ЕТ ша Ся сс садсз зосзкнес свя по себя «а са звЗ Бех зе пе чи сс За пк ж нн пух вки: КЕ ск боки із во філ ле фа жів Беж шім Аза ою би т ї хх х х Кк ам лу муч іш о ожежаж м ум че ННЯ Жеихух Сф'ужит пфцшомічМО мк хжаух шощоих Бжя ців аеча жо: зи вої Сез «КО ва з со би ве их с ув щас 3: «а ож ім сУка, сМає бок А ли т Же бмм Жду Ж бук ТМЕхуУ З
ЗА Акш Еко іш ТВ ех Уві МБ У Бех уз БУ АізЗ Важ ї хх ж Ж пи ве п ж ож жор ух пивом жу фоизу у прірви КДЖ Бачу ден скУХИМ чут з й с смс жи Зак ас ку ва зах КЗ ча ве са вищ се ї зщ сах ЖЕ
Тож ую же Сол Мам товки Ж схоже 15 пох Уч Кс. кор м
Віз ЕЕ їв Хна о їшк без бі (3 ТЕ Уві Був св Кк БЕ щі Ж Ах хх кк ай 3 ЗУ й сх с с : : : 4 ж
Фев кВ жВв ем Я хх оку ще ЖИ жо хх Ж сте іх. а жо ск чес се дат ЗУ вкх сов з а Ка сх спав Зах Фо За ас вх ЖЕ т же сфоовсї Жах йти беж ут ж ЖЖ С ах бек ус», 2: 2 ак тає ст у Між г ку м ам ож А ому ВА АЖ АЖ ХК о жАМ МАМ ММ їу МЕ АЖ 45 КЕ 55
Кол МІК о ско сі вух ск ем йо су пух кг їж чаєм хумних х з дих Тк
Сяну За чим Зах МК я Уж а ох ще м з'сх З ВЕ чи ча зав ' ке ких стат Жажах ськ Ж окххх Мих т їжа МІ їх ку М що Мі тн ую У Ві Жду Коху
КтЖ дав дам Ме Км Буш АЖ Ба БІ ЖИХ Ме жиХ ІА ЗВ зу мех ях ши т хе -5к У ТЕ т дк ок р Ше хх хх міч сою ий джеми у де шо лук у в аа
КК вВащо ли ще зви а тхаФф ж ЗК щи ше Я Во М ша ви сс хо
Зк сю Оу що баку фен 151 соемух Мк ак б ахує Моє бшуж ТЛ а до «ра ек бе їпЕх ій сук БЕ БУ Бей беж щім -еш їх дек щи даю ще
Ж Б За си. жи лу ом ек ді мук ссиж уки ЕМ ФВ ом ків КОЖ сжехо пуд и чеж ке бах бе се сбов за ав Час каз сдаї бас ав аж Ук Вод ЗИ
КО жїщ Тек ж х, жк хх. Ко ж аж Ко, аж о Уж З вк Тих МО х ав УА ЖжЖух ж Ку йіа БЕЖ БУ ше Ж Бар оХжЕ ДУує Же лав Ме п тих чпи ша ММ М : й тех щас ас коп очах Сава Зо вас поз ЗО ас жк б Я:
Ха Же Му: ЇХ дя жу їз Ж Жак ХУ Ж у 3 ну х- їмУю ЖуУх ЗК ос ж ам охАУ шБХ жшю же уп А ВІ хх «хх дум
ЕК Я М лю ср
СЕ» Та кт утумх «яв ТК Е ж хх Мана сек ех т 0 жу чЕа УЗИ КУ ь ле «Ек Х люка стек фтюуммоКоІкІ дув ук си См китичка ВавинВУКихя шли с крик я пл ах Хв фТм їх (Тл ч тії дк Зах й хх сла божу її 0 Жак Мем. ау ОК
Ши МІВ дон. ож веду АТХ УМ АЖ дю ЇЖА ЗВ жа АХ Ж А ох ВЕ ї М А ї5 йшж ві Був За) Хвео Пе бок ів Хе їі аж АТ Бен в кп Ячую
УМИЖО ж шум же ВЕЖ СУБ Му Але ЮК АЖ УЖ яхАЖЮ ЖЕ хлЖжЖ ав ую ем «Кк су ж Кк КЗ хх Тл х 5 беж ХВ лу СЕ ох ож ие Ск ЕК т хх ка у жк СТ рез бле Бій те УВА Був зіп дкз Бе пі ов ошАУ ем пав тер о їі1в под ах сх:
Ж Я «5 сх аю ХО Ж сх см фаху КАХ її «ех ше ска Ж Мая шує Жах Жук ТЕ шим шк КАК ух БЖ БА слу заю швалу хм ка уж ОБ АВ ОБУ Ул шк жу а
ЗО 5 З
Фокж В току 51 - 5 ж ща рн Вшу флюс бом ух КІ сік зт у Був Аза тих іа ЇБЖ вів ДЕ Оу м Х жк шк ХМ АВ КУЄ
КЕ ох Ух пе
БО ТО т щи
Жак мо ВЕ З духі КЗихю БЖ ха Торуха Лйх є МЖушчи ЖХ єю фо Сем хто о хужах МОМ їх
Ме жав Маи Щех Бе ев бхвх Беж ЩАб Даю о с-шЕ аа ді ЖУК Бе Сх рев За а ж ка. ЖЖ я ПКодкам, Жасмо дим Молю У тб хю Зв ух ух М бос Пт У іа Хка Злу Ве тую Вяв ТУЮ мух ЖЕ Аза Ме Хар Тух Жкв ЗЕ ва тт жк ха
Ам «ЕЕ ЗОЛИ
Ж лу хг Же Ха М бик пом ММА УЖ М о жк. КМХО жк лИВЖХ УЖ 3: Е ак
Мах А схов худ «ніш «В Іх В «ШЕ ПКЕЕ жк Хкомухівщих уро ех пек «шах ручна пошив.
Сак
ЕХ пет едикт мВ
Ех ДВІ мех
А, и «а Уй сот Урктнч Ж ож БУ Ух аа жу їх іє БІВ
З 5 тлі, -х як КУЄ МУ
ФЛ К З В
ЖЕ Б
«жІш ПКЕЕ
ТЕС ле уд дки мо шхихех Ей ту І т в «ЕХ М ж чнщ МАН АЩОоВНАЦИК
КОКО Ям,
Кия пр. ен НЯ «ие СОБІ МЕНЯ «ані о ст Ох ска Фумсих Ох У фа Ж шк Вика СТ 8 ках Мох пе жо Курс бо хаї Бі теж бує Блю шо сеж Бі е Тв Ті Ту Бак бів Бе Бе щув
Б. к Ах ок ї Я хи ДЖ шу
УЗ хх. То ве У І Зх
МУ ж
МАМА
«Іще ПКЕЕ «ЕІ шжУчКа ГОСП ДОВН МИ ху трв
Ек
СУжж б 0 х и путь з вра «ЕЕ Се МЕеКаВЗ т Ж. хр С Ж ха Зб Ж о мжтех СТЕ щі х те пожежу. шт йяю бек до ух Бе бук Бі МОБ бер ТЕХ на те я
А У М ще пох жу ОХ «рію ли
ОКХ І
УК м их
Ж МИХ шу Тих ман важ тва км вича КВ ОСИ АННУ КУЬ «ВО сть меха З -ШшЖИю МЕ жу фуе ем
МАК
КИ в хо ПОЛУ ПОС ДОСВНИ Хе доку ху су жо Ко ЕВ МИ додомемм, со
У пх ен и В А НН НН НН стад си ду жи ЕФ Ух оою о ско. к
ПЛЕМІННІ ИН КК шк ХХ шк ща що к ОК де ОМА МВ КМ МУ шо с 5 пня т олив ток Ж ще ЖЖ жу у фі жю Жіни ЖХ та шив ща му зе шов ШУ ЖЕ АЖ ЖЖ мА Я ї М її я х лю
ФЕНИ кут сичике сжгутх ко віки уже повія юлу мує битих жи фу Ех дих вай шкз ву сек а з - пи то вч щЕЗ Кк ха ха З с ех У ка ку жи сроюювх с Жук Кк що дк Ж Ха що шко зах жа А фу Му
МВА пув БЕ сі ЖОВ ех в» Уа її бах СУБ Був бів ВЕ БК Зух па тд
МОХ я Ямх житя вжи зда о мий оз ух тич зх ябможкн в щолх сих ща п ЩщВ ютхй щу 5 а р вав Бе всех час зо зай зб пає коч ЗО зач св вав св Ба а85 Мя5
Фу Мо Я Зх тота, диню х ЖК шк ЖЖ жо ДЖ пу ОВК шо ою Кг тих ЖИМ ее х Уу Ж МЕ: жу К Ж бок ВІК хек їж тд ек обхив їпх в ОжжК жа Мет Азо Кв о хУаА Ме Ав Мах Вів сш Буд за 35 за ди ЖИ АВ АХ її дез Зах вх ЗК сш хх Ек очКух КЕ ще Ве Аля а НИ сту. ло жом оо Ж бах Дух божу им. КТ, Ех. Угщї Ж да
МйХ ЕМО Ж ММ СКК АЖ Му МБ ж ОО жи ле Ех маш АБ УА АЖ
ОК, ХЕ Кк ях М СХ шт пуикано Ум и пу оя сугжІх Єккі сміху са дух МО Кожух дае «Ж йжми пух фезЕх пах зви зас зве жай ие аа час вва Зо ви МЕ вх УК маш шу он шов
Хсга х Мт Мов бю Ж Ж ух Ж шує 42 МУК ах Ж одхуєю МКУ Сік фе Може Мою
ТЖЖ йзв оса Ба Бе вх Баш ву За НЕ Баи жмж тА АБ пк Бех
Кошти луйвим Уха гот жук ще КУж суми у ЖоУм УК уєх схожою жУКМИт Ус Ки Ух ги ж Ж
МА вВши ЖОВ це вас чу жа Ом Ук ж меш вив Ух Уа чех ВЕ ЖЕ дихає Же А ох Жбакух За б Жах фетр Мох їм бі Жири Жшу ву мих 5-и із віщо ЖК ЖК А ми де щомшЕ емо жих ще а ЖЕ ЖИ реж Ох У ко ва За сухо фею шу жесу ню осо схачи кто жесжиж жі шкемюЕк сут хи ж дес зад цие щи ет ха Ко са а опе ск ме ща Ям а ПОН Ме Мов Я лох У бмум жах пек Км щоках Ух жо ж ХЖокужч ЗО дух М ша С Хе
ТАЖ ши СА шЖ х ЖЕ Кут ЖЕ Ж юю ММ АЖЮ ОЛІЮ ЛЮБА ЖЕ ках жк ж х СКжИ ги п м,
Ік пе Ки нн в в НН НН НН я зу
МЕ Я З ж ВМО У шу дм о ВІ Ж
ТЗ «у В хіх Вих Жим Зб аж У Мк о Се
АЖ дО АЖ ЖМХ Ж У ві їпж тві щЩеж шве з 175
КК ох ок У Ж
Кох аг ж ач
УМ ю век свй ПЕТ шо у Зх отіщв тую Ук Їх «ОКХ МУЗ ІМК МАНУВН КУМ пе юн хх
ОК утУ пек ми коки уч іюкхет ою сим жНинНа КОВУКВУКиХ я
ТА до
КО по сет жо Жар о бдаз 23 б Мк Фе Шает й Яви ЗК Жю Юет (бю ЖІ шим Ма вуз с АВ соя ЗеЖ му ЕКО си же УА вуж Куш БА я
ЗХ Х І ік ех ЩІ кла Ж босу ха Жов КЗ Жуля ХЕ дж М Жим ЩТУХ ТУ о 4 Хувде
ТЕХ Яд сих із І ЗЕ ОО пе: г зх МЕ сх се Ул «вк Уа МУ їі цех Ста Буш Ав Бех зЗАЖ теЕ Щек вве но йяв ТУХ ак як Зк
М ех 3 ох й Жах Ху Су Ж одхшх я ТЕ, о а ММ жа Кожух, само това Ж ТЕ» же. Ко
БУ Ме даю Тео тва бжв о із Бек БІВ Зі БЖ леж ев Ба жхеш Те со Й хх ко Й
М ЗО С ху а ою К ке г. хо КК жи аа Кк хх ик: г шу зи шу лап Ах вап ошжЕшй АВ ще Е щі теж ах ба ОО ТУК вм їв межа г че ші ще шт и и ви кочуж БМ же оз й Мах Ту мох хм хх Хенах ж бує Мих З ж іЗ ЗЕ вх щі Був Уві ТБ ев їж ові зер Ак дет бек Зах дів ів Тух хи тка Ек ді
Со їв їх й р ЖЖ Же доуєаж б ЖЖ Торез бах їй 0 М «що М У хо Таж у
Мей БЕч бо Бхя бек пеб БЖ дек іч Азо Так дів Май теє Тех се
В ЗО З
КУ хе ее їла М Щоки Ух ЖЖ у ев су я ВМ. БУЛУ її Кк уж слу мех люжже маж Без жхвола ха веж зр ех ЖЕО лам УМ ОУН Ж ОК Ж ЯК чкХх У чжк
МЕ до вже йжим мих СТУ Су бах ев СЕМ УХУМ ме МЕ тах
КА
КИ й ж В «Врах ЛЕ «МК лих Межі фік муз іх ж Ме СЕМ ХЕ УХА МУКИ М
СК
КАТ
ЖЖ я, леж ваше чем КЖЕКІі МЕ «а
ХМ оккчеа хх Ж я Кх. Мп кі х пог Щи ї сх ви МК. ся ва г МО. у Ех Фк. в меч
Мар оїух МУ меж Адв жхв За МеВ бів Бек Ні ПУ Куз ЗшжЖ беноБах х шо дух їх ке -й КК Ах ши Кук о «КУ БЕ ел к икК Кк к с ХК тУжое ко ї ОХ це Ї
Кир я Ух. дае м я «дах ато «шах» шешМмА МОДИ «ВІ ши ЕЕ КЕ
Км уня кх. «Я да ів фмБ В АФ ух з « еру тую 0 ЩЕ ев Кох ТЕ «Ж каш ПЕЕ хх. т Ум УтУКиУ М сти м сти Му м «Їй щетина песлащеані си «КОТИ жу М юкх туту схті о зах ки ЛА МИТА шжжонж бошат Жеу Жош К іа ху ко су у. пів їжи Тхов АВ Мія БаЄ й Бах х Кк. й «ТЕ кв, досу «А щ «їж ие
Ки АВ ВЕ су пи «ВІ Мих
ХЕ змови дети жом Я мех «АХ ТУКА БОМ ше
Не вк зач ща лк 0 МЕ: гук
ЖЖ
Ки дсп преуютий кору ка у чую клжоки. БОМ пе ОВ ТНК шу Ттох моя Ул «А ХІТ ТЕМ ха ЯМІ ком ох чан В
ПОЕМІ ООВНОМА ВИННУ КЕ Кр І УК Ку в ща ше сх щі Те
Т- ж жа божих ЗИ жи хау КЗ ж ТЛ ах Фі ха ЗА
ШАХ ОЖЕА АМЕВ о ме У. Ам мВ А МАМ УМ | ЖВУ п дк / я
Ж У А
ЧУ мя соби см ВИ о дея спжжсужі дхужив Му мож межі ож Ммо ами ех жи джу мХу Деу ж
ФЕМ Се ж м За мМ со ВО її пою ки МО МО КО х МВ ММ кщМ суд стра кої 3 Жокуж лук о Жамі; Ще бат ска лу жі ша ку ШК
ТВі Бій Бхо лу Ак Жах Цеб хз гав зе був Лів ліз Бех щі» БВ «5 ких У 1 Я 5 по сю жржк ях ккижих фе теж а су чн уаж
Мем ж не ери пах дос вк сов ка чес оса пас щек са мг ау А ЗА сф М Фе ак Ме У ж ЖЕД ую тіл ху дк Я по Жах ТУ хо Мо
Тк Бк Щек ех Жук Біт Меї Йіш ТкЕб УВІ Жхо Ай Аза Вже щі Куз путх ср 4х
УМХ М чи ше с зе са а пов ших ап ке сво вес че вч ває нн сво Ме лох пох То Мб уєсех Жук ху ча аку сх їх чи ох т Фо тм шу дим укуч жЖж Та Бі М ха шк бух БЮ щаж беж вва Буи ХУуХ ще що х В
ЯКЕ ПІ З г г го Ж т що булу ди фах сжфеж о мом оУтеви УЖ хе жук служ фу муж сових ОО их а
Ма ЯМ ВО ММ ЖЕК ван дм СЯ КОКО ОО ВО КО Хе На ВК Ж їх пк БУ ба іму дк босу лу Щоеу дУк се обр Стік м им как йшжк йих їтк іа дви щех Уві Му пі Аже БМе ТВ дів пеЕж вк КВ Ав щеах я п ек «ЖЕ «З Я ТІ ЕЕ им ж мале уж ож Кох ск хм і ме муж. и ж хи х дк прах чну тих зае вам со ша Май сш са а за ваше ший що що ша хх вишу жк
Ж гу б ук ЧО ж МеЕєдяє Пбодьут Ж вх шуми Сжохх двух шу под ок іа ж Ку
МЖЕ ший ЖМмЕ ува ТЖЕ ляга щат Ве дае аж Бе АЖ ВВ їх АК ОКХ о па я тт Ех Ки ВЕ К Ж свт цащ ця Ер бе шо с У - ву МІК ж хай ци що КА ес ж. чов за чес каз се се с СЕ ще БО У
Хліба Ме сам сФошмщо їМХ ге о су ас ЛИ є Кужіе Ж ке Жах бою Зх
Бай ва ЗУ ЖЕ УФВ о МТ мА КЕ УЮ ХМ ХК МЕМ М ОшЖ МАК п сих чик
ВУ жи ММА
Фе моху хе ле ем х ї дош май их Ж Ух ре
Фо сію аю пев єружех ох хр тер Ух вих щих сх вив зи ви чаї ха кб ос са сш асо ско м вшо МО ак ж Кя
Фріс Кошти Му Мік ЕХ ах тю хх ах МОЖ фор теуї Умжутх хх ою Же
Бе вне Жех СЕВ БЬУ ЗАВ БУ Тих Мей уві маш УВА же БЕХ ях зх я з МОУ їх мож пелу си ше мим ях ж сек же 0 дме ек ЗБ
ТЕО, Ім єті мо сухих слух. ж є 0 ВІКУ чНХ КМУ
СЮ ех пиву тичиа коди тиКи и иЖеЖхюя ТЕУМУМ МИХ МХТЖЖМАЮ ХУ Є АЮ ДОМА КУ УХ
Кан СД «ост М се жор З сук ТЯ 81 ху п М ситах хи й й бен ХХ Кк
Сай Ома АВ мем УМА САМ ОБЖ БЮ жу ВУ УА ЖАХ ід ВЕОо 3 ї дх її ж з г 5
Ноя Б З 15 пок божа фею Тддлх бу о с В СЮ су шк ДУМох бхву а дугах Мер Покже Суах
Ж АМИМ ЯМУ АМКУ УМХ їв пах 5 їж кл ЇВ ля Ж бек ую
А сх хх Б ки яку яки ад Зм ху М алуй ЖК СЖочую МІ о Фває лю Ж хи Чет Іза іму ХА маш щи Ми КО МВ Еш Іхії мли КЕЮ КІМ у селу ЗАЕАЮ АЧХ ОЧАХ и їй ях сп ЗМ вх
З ю хи Ст те ЖШеух ск сло Тіз ши Мох т док ббіуує бує 534 шує буди М вій Маі Кіє Щек ТУЮ вв Бу Бек Бах ут Тук Теж дів бив лек УЖУ по ке х з М в
Ж ди Ж вх би ЖЖ Кін Ох я ес Ходвих боже Шут Хо мх МЖахух Сі божу СИихеже ув БУ Еч КНе Ти бів дех 5 вв ол ЖЕ мую вив ах и ух
М, хи т Й й
З ти а и
Ж жук СХ о бах дак іже т шу М жи ях ах ТУ, У ло 5 ХІМ пхжжже баюМо бух мем Ап Мет де хеУ їм джхо іа БУ ав Ха вів УВА Ух ЖЖ КУ ех -к ке
КО З Ба
Зо Хо ко Жнчу Мкух Жах Жито Мжт Жах Же бліх бук Мах ММ бе хх
Мі БУ щі ХХ ЖЖ Вів сбже сб Бен» ще ше бо Аае тує тжрожпху дом «а НЯ
Іа 15 г
Ж ЖЖ їж оо пн кає КОХ Кая ов мМ Му ск Мі У АТМ а ОУН леж Х " зав толк
ТА їж
М В «а пк АК М
У В
ТАК 2
ФУТ УК ТЕО шк ОБУ
Хо Ту ж уми х хі хе уже сх,
Мам МЕМ ОКУ НОВ хтЖКк ж жк хх клею чу діда «Ей КИКА МІЯ; п юю 5 «005 КЕ
Ж ха Ск ле щі їж КЕ їх Ж МшаХО КЕ 4 З шк в зи
КК Зо лк кю чсх ка хх хе 0 тре
А ОК а и ж. Прут каже їх дк З Кф жим ху пе ЕХО МЖК ЗАМИ У ТК АВ КМКУКУЮ хи ХЕ «устя я
Кк хі су дю я «ки Щоки МЕНЯ км що «аж СВО ти Ж Зб бю Вошеуу КЛ, їх вожатих ббухж Ж я шо дулю ХОМ хви тва ів Беж СУух бар Біб Бек Зав БУуз ТК ТЕ впіа бно бек УВА ХВ х « чо щк
Х -Х У хх щих че ж «ам щі шлю чу
М дек тують уки ши КЕ лу Пк. ее кре «ВЕ я ше пОоследе Бас Е и у хх
Уже си шУухВи
Кдх куми мих а «НЕ па Фетр боже КОХ лю. Ж: гою т Мак КИ ую ЗИ дх Мох про пи ЖЕ же ів ВОЗ бе дн Жак бу Бе во Же у хо зроух
Х Є Же тв ск «кв СЕ «ім йо рт дих киеїшМ МЕЖ
УТ Тх чх змити уки Її Усе УМ
ШИ МКМ ПО КМЕККВНУ ХУН ек «ВВЕ
КеВІМ «лю Же лив ВХ
Ук ТОЗАМУ МІХ ХІМ КОХА Ди
Ус Не кача ходи Ук ко КОМІ «ах ЗЕ шуми поле с ше шок ша ска сш ше м чех ще її Ух я доки и х уж шпях "Е с. зянуоши и з с її гу зве тя тож 1 де се Зпу ЕХ тоди сів о УщаО БА іш пав зав швЕ Бі Хв аа це ї й їИ щи она ех Ше рони ме «МК с МАК С Ж ЗВО МАЕ що ях КИ
ФО Ж охеки Жуих Ж ж Од дає Р бл жом хе фах Жошохмо Зб «кю б Може г УЖ ЖК А Ле шк жа сш ОНИ а ЕВ муж хмЖ МЕ у Ж г Ж їх ух худ во а ХО год БЖ зво що щу фев що ств ему жов що що ем ее ху ме зай ей Ки ше ж ще с ЗМУ сви ся жи вва оз ач Сех си со хай рі ЖИМ Зиму ж сбекюо смс Мушу и Меню ХК Хм КВ пиво ЖК Ж Ж ох
Аа ве Кхо ді Щрж ТЕ Ме бла Тер УЮ ба Зі вка БюБ Зож ДЕ чої жк й
У 35 З жу. кам. ж же що УЖ их ВКМ кю дЕ САУ ЗУ пря «3 Ям. йо Ух «АН «Ух тк ща си Зп осо КЕ зав виш ЗБ вва осо вас о оз сви шо ау Ве лек Жовах 31 бе Ж су вак ую ори дувт Тел Же» беж бю чую худ аж іх Блю ух же ші Кук Хі вас БЕ хх СВ БАЖ Кук жів Був
Ук Х пе к «5 що не Же в хх хохух В щих що жу пощу ж вух яких суки Око ек «жу у жеких УА вас вах «с ще СОУ м ас З пис о Се Ух це се аа со ЖАВ
Хо Жах о сх таж вх чем о тохуї бує В в ух бат чу
Зк оаБа Бій ЩУЖ Ба Бош дев Бу Аз Їх Бей ХУ йа ЗЕ Му ех шо я ах У
Ж я В її ех заожфом» лає вто соууюеюк Же, щи жі щу скол рат щонух беж щук бо шо пики сви. тк ше айс иа че Ка хх ПпООСЕКу МОм МЕЧ НЕО МК с хи НИ ВО ще КК б ща УЖ Ж в ММ с Зіжьх Що ше Тож СИ Ж Жкзе ї бодкжі у де во ІМ АХ АшЕ Ук Бій сем дп Ж ви ОСжаХ СХ Ж БАХ ака ОВЕ кох. яке кю кожи ер о ик сус сдчая ху їмо пжажиу Ж дулю кеауж о фей лу ща що Мах кс сх во зо;Зз чав ес озиа ес За Ех век пас аа чо зош Ж суще сту кіш ру обоуєду кан У я щи жу Вк яри МКуі ж ів бзіа тех Ту Се ТБж хе сів ШУ їЇЗе ЖЖ бік Віва їв о ЖуУж Жкр : , зак еру пови сехуфо их даю ох вію ую ух хх ВІК з ж свй пз вих се ЗК 5 ЗМ се шх ДІВ
ЇХ хи м Уж у Жах ЗМ Ж ує ХВ Жак Шу мя ам ої МЕ и Уві вх УВІ сш 5 їх ж
КАХ ОКХ ет З «Ж ОМА хо МАХ ОА
ЯЕЛЕОЕ: ЖІ
АХ Ж У яку Ілпжіжтк Мо и ОК
ОК АЙ МММИА ЛЮК ЖМИ АКММ КУ Хе
СЛ Ікх.
СКУ
УЮ год овмеммів ен вуйхви гія ши сСИиМмстехчнаВ ВИаНсКеецУя ху хх ха Ж узі чу жу та М ПУТ м. фу Ії хх пово КК юю Жде їх бах їмо Із піц Уві ЗЕ сце ла са Жех її кв о смІ а ол а му КЕ їі КУ ДО
З у ЕЕ їх х й АЛЕ Ух тик Я сток Км Феднює бл Ж охо ЗУ кю КО хо бю боках хе ек У сх жу шпак ві му пад ожшК Са МУжЖ ЇВЕ Бек за щук вве Ба Ба їз Гук а ек, пе
У ях ще ев» Ма іа бере уві БУ Кт ж Ух За Є ЖЖ У ж їі 3 З ТЕ тів пи вчК ОО кКЖ хз БУЖ сом ау же веж вжероаАШ це АЮ ХВ хх --ї - де
КУ зо 45
З ля бю Ж ех Икх Фі п Жах са лом о бля щєхух «зЕу ТХон Меах ма ж СК рХО хом Валі шко ща СТЕК їх ІБ ОКЕтЖ У пу впав я КО
ЗИ 55 и таз Ве їж В що МОм Стеж у щі ща Жуомх Маю Мою зав Зук В х ож
МУ ФМ УЖЕ АХ МЛК мя ТК Ж ФК у НИК ШЕ ие ВМ ска ух
У Е З Є: З а вк рух РК й
З С хх ЗЕ
ЗУ ФА ко Ж ами мих ух С шу Ук уко ЗКУ. ие у хх ХХ З ю щ жу ук ТТ
Ме жів їм: вза Баш бе тв у ож Ка АД ЖЕ Ав мех ТУуХ УЖ Ма вх Зв а5 сф очи і ШК кю СК буру ж Ми же Кк хо Уфуює бе о юю Ж ву. ШИ же Ж Тож тах АЖ люлі Ж Ав ВХ су ЖІ ЖЕО ЖЖ ШжХЕ ХхА Ж си АЖЮ УКВ Ж АЖХ ОМ ха «ах зій ж А о
Хм ов А Жди Мдух
ХА МІК жа шах хх
КК етики ух «КЕ ма пив и п «В КЕ
С чи кеїши ПЕ
Ко ше Фета квт кри КВ век єю
Кк Ях Хм МОЛ КДКА: ее
КОВИХ
СК лди Ус фах ет ко ОКА МЕ У не мук ле «ЕМ 5
ЖЖ Птху МЛкиих Ж отож же Ж Ж джем БУЛУ ом дж Ух жи БИ ха Же ж
ОА КУ ЕО ХК ЖЕК Ні те жа мУш же ж Ки КУ ДЕ У мае за ї к хв ї5
Ж Ко «М «АХ етрр вух ту «а» ОЗ «СЕМ ОК кекх ще ши мя тую
Жх ки МК «3 м 0 босу реа ві ет ке: МУЖТАНО КІХОТ К В
УКВ кох пока, мед се
Хе ска Ел «а Ж ше т кожи тож х хай пів су ВЕБ Бу АВ - к 41 5 ех вух ЗЕ я ЗК,
ер ия щу гак суто жа ЦЕХ «ка» щеУчнАа послідовні є реф жу сиків Да МЕН «а 5
С их а Же ня БК хи ХЕ щоохь «с й
Зіз шщіш Сів тв бі не ТВК тех з І «аа 7
ЦЕХ 5 «сит штУуМма Меси»
ЕМО,
КК им Смт жк как МЕТУ
СТЕК
ЕХ
ТВ и НН НН с ЖХицУЮЧН ПОШИ ВИВНІСЕ
ККУ ГО «85 «НМ ОКУ прссснухссу зусовсоосю сво зу сет зу Фо ва боб о ча по зас зо я
То ху жу дви у єв Шу й хо (Зх вт ж ех іп Уві бів цей Уві сій Ба ЗЕ шЕЖ сю У
А КЕ т х 5 18
Уж их жди с уже жих прив их св ух. ках схе веужии и. жу жи фа дкеуду. Жук оує пе йо са сх ом За хо сі зче Ко со щас За оо ше Фа ше вж тю хл жі Вл ах си Жах божого бух беж. КЯя Щі Єв Ох У ча дав ВЕ сів джу Бех мезо) ха пев) пе Су Віз Аа Бех А Бе чо ут та ско. ІЛ 3 зими Кбіт най вано ЖОВ шоне дет ви Бі сб суне са и бод ож во З «ЕЕ
ВЗІМО МА жу Я БжКо Фо Кор лан еря рос Са се см ше ех За Мк
Поу ЩЕМУдУ бі Же бук я жк ВІН Сх и поки С Ух пух ТА аю СК аух
Їж ва Бех йеве тує біу Меї Кіз їж Узі йхя Бій із БЖ пі щхВ
ІВ Як ща соч Ву рі зі ха з зб сов се ЗК Ззща вах жаб аа ме МЕ сло нд їх Ж те кл дз Ж Жах МЖхуєє сту 255, жу з Ж п
МОЖ їн піс їТже УЗ пів Уді їі Бех Те 5аш Бі бек Ази ув уЕ щі БВ Б
Ме пед ща ос За лаас цес са Кс виб ща поЄ во БК ад ше ав
Тем Ко ач ши хх Хо Ж єх Кому. УК Ж Жує сезону де ск муж хв де НК Уві уж Пе дже ЕМе ТМк фа де ВЧ Ба АВи Бех
Би У ТО ТЕ ва зас зоб се паб по св Зб во «це са во сб чаб че зо ЧЕ
У жк Мо. теж ж т ок и кс Укдоши жди се. З що у бом У му муз дам жк В тує ве слов мес два Зежх сем Аж Бай мі вер Ах уко. Ех 52 ха щ5 ща щежс ЧК ба о Бе ЗОЗ за чат зе сб сабо сус зоб Б зу ше Зак
З Жу о сих зл суххе Ух пходеую Сж я У почи ЖЖ У Яка Жодехи ВЕ х. кіз Узі ес ТУК Шух йіз гу де піж ББе вро вп ве тах Бец дех
ЗЕ їпа 125 ще п ча шах ех зе спав ос во ста зе вс ее хе а ЗНУ г туя де іх Ми уж Ул ах их ж рум Ж чі КВК пекфу хо Кл бу Мих щіт пе дв о ТУЖ Тв обі ів СЛУ ХЕ ев УВА ТХВХ Уукі бак Зех о точ че
Мк 115 Я о сиве ЗВ стужн ж
БУ М
СТЮ ка пд тихе Кк ОЗ ж Ілик вами жу живи ик
М А КУМ ПСО ДЕНО
«тус дух хай «аг щимтетннна ков ТЕКУ ХХ п ка ту ху пе Я хо їв же Тим що Мах УЗ ж фу КМ хх ЗУ зн ем Кк ов
ШО Ма їх Ал лив ЖЕ о Ж АК БУ шу Уві Об БЕ щі у жа х Кчя З ЗЕ ня ме ях че
Фен Єві вану Жосухт сум дує М ОК Шолом ЖЖ у ЖУК Ж ж Жан ок По су х-ак їж ЗЖш фїше ХвЕ СУ ліз Ба Зв щБеУу Ва Ву Бай ожевЕ Беж БшЕ
ЕЕ тк с єї ї х Ж -О жах ж а су бе ко Уже пз ж тах т «хо бо Фк Ж Ху ях. хх ші Мес Вів Ту» сві важ бів ді Бк і був бі Бе біз Жке Уві п щ й
КУ ЖИ ЕК
За ЕоЗЖ ж Меумоде Му Ж МУ Шк Уж юю Сх з ух фуд ХУ де М под ФЕюуимо Кт.
Вій ув ле сет гук яр хів ех вв Буз Же тук ака КО мах ЖЕХ я Ба ви ож й дю офужехх Жимах бю Зах Хр ес ект Жов Ме Кз Ще ПИ фачяе ст ужхіх Мк му ЗА: Ж ОК дн СТЬ ї МЕ КЕ ЖЕ дО КИ МК АМУЛІ Ж ЖІЖЕА САТ АЙ юЮ ж ох ех пд І
БУ ТЕ Її З
ЖЖ кни хе со Жах ок пак ск - жа бу екй жи М ММ жосж аж й ккх їж» щі Мек бшв щеж ев Де Ві сх ба їх 5) во є хх Ку
НЕ зо за сою бло Жашту ХЛ Жубуко Можу бр бух Ме бум Мах злу Шви Ще Ха Жеж
Кіа Би хво бі бле ха йеш Твх Те Бес сах З1У Бе бе жук ХВ
Ул су ЖЕ
МшМ Упо МІ
Тл ж пул жує фу хх а схе ХК Уж щире
МУ У хх М ЯКЕ їж МО СВ ЖЕ сМЗх ІМ «ЛИ а
УК чу ж вий ох куму 0 Вер «ЕїЇш ЦЕХ а ух ЗкеУЧчЧНАаА ПОСІВИ
ОКОМ я кухни послані
Кок ляже й Ж гер пух ме меіаай сей Ева МЕХВВя «ані ща
М -су ХХ Вкох дач о вже З Мах Усіх осуд їла бах Х га
Ант діт Вл Ба Аа жи ТВЖ їж Зак ЗКУ Бе ой Тух з у хг ко м У мере кл ей БО шо В бут мьх, ТІ оди АХ
Км жк км сккв сх скокмуж й - як .
В МВ УЧчНЯ КОСИ ДОВН ть
МЛ ду
ХО ж шу тку ФЖЕТ КУ кий МЕЗО моль ких нюх. пли сімох Тл й пед сх «М колиш посі веВНІь
КАК ІЕЕ х главу
ЖЕ ЖЖ І СУ хек чщх ех ї1 нкуфря у иви ри сжухи лі ежежекк можу жав можу КК дрорию руч ик че г тел кох чис щих щеос ска зе ска се аа се що зда сом ЗА с МЕ о тки м Фонажі онжуй, Су буму Ж ж Жеюкух Ж - ка ех Яка Бе муз ім ех Зку Ехо Заю ме
КІ : з
А ве УМ см іж схов ЮК. ЄрІфІХ вжи Вмих щи Зк вже Кох мах ши Ж ор ВІ зве аж Ва мех и що па ач вва Важ ши КК сш и КИ НКУ хау
Щасти пек БІ Же В поши МЕ ". ОО Стр повює бики Ту Ох ХМ. Ех гу мк ке Ех У МЕ і щеж щі фужи бе ВНХЕ шт ву Же шк пу ве чЕ ек хе хо й ж язапуУо жо зара я. у д фо ижуєя о УС псих имя ех тром а. Ох оч с и УФУЧІХ ких ЗК ча Ме аа ба СМ 5 ЩО т аа ЦО чл чу шу ВІ Ок ЧУ з х я
Ж Зак: шу ЛИЖ о шк сс; ке В Зк КаК т жк Хм й ж буси шк їди
Віва Бне мех Теж Зак ФероМеє вай тТкв УВО Беж шій Аж БЕ БУ КВ до ек ха
З ЗЕ о : Кк м. мий джодеь Ск п жжлуло утучу пев. ста ки вві мото ФеижІВ СУМ УЖ да 35 х дах ст Зах ща а заз с вес має сс зла заг чав Бе ак о УК нх ; гаю с Я ве : о пихтух ран су пух М ому тах вик
Чі ав ТІ о б т гу дет бл ш й Шу гіїї? це їм ще їі дих ще бе с ух АВ І ВІ СО Ух БЕК ау БЮ БАЖ Б АБ БИ
Я БЖ же
З БЕ В х що ЗЕ сиза діа Бех сьо сем ащех смт» вся сУБО дж сода ваш ее кв їв; ЗВО зап ва Ме вав зо ввш о Зо Ва ош ВМ ЧИ НО аж с ях птфашо безжу и хужик ЖЖ га боюяую 2 зи ву тис КУ кі ху ї у йде
УЖ йБви му БЖ Же ж сс: и дів ТтВх беац ТЕХ дів Я БУ щеЖ
З я я : що пе
БИ 5 НЕ ТВ ; : г. с сяк ка
Зх сюужаж мамо дже у ІК ек сік Фу су аж ж ще УЗ ЙВ стдю шкід КВ ШЕ їн вай Зо дос сви са зво со вве зр па яса ОК ЧА пе КЕ МІК их ФУ УМ, їх хо Ж дока КУ. - М Зі Ж ух ЖЖ бнуво їі Щі бах цех фах Чет дів Ні їв) і їі; Ват лах Зо Тв беж па Бордо Бех й пе що
ЧЕ я з слина жи М вух сажа шт поив іх си аву сей жах 3 ши же Коен БЕ Я чи щі песо Змі бу чо ву чав бач ЗМ ча ка щей щи Ка мк жо з її ск КІ йеха ла же міх суїм Там іх бах ів Бід ку: б
Мія шва хуш БЕ -Ув А АХВ со у ще зам омау Мам озАМ омлАа АК ЖМе к тут х гук
МТУ А ААУ
Зоб бКв5ї сб смс дво зом вс сах чо вс зп бл дах У ше хе за Ме се З ВИС СУ Я ас чих Ме Зх ТУ хлоа сх. о чну їх Келих хг св Ж би уж пай жук кжЖЕ ЗАЖ В АЖ ве ог Уві ТІ Мі Бах За
ЕК т 158
МЕМ 15 ММ шк і-ї теки КМ рок т хо АК
ШК у Уж сш ОП
УКХ ли 00 МмнУіхіої охо і сук о гум ков 0 БІВ учне пеплІдешХ гу
Ух, бю ект лим, піхов хо чості Ух по секчЕх шує ка жених «мих 15у гало Ж ск овух Вуха І у Таж М зх блахтуї (УЗ Хі М хх бо МЖім ІТ жЖ ша ожва ФУ ме Муз бай ше БА БЕ Є іх їде) ЩІ ще БЕшж душ Ай ї в 15 їЗ
А Я М одно сом 11 1 аті; їх ау бах їх В Му м сх йдем лов ьо Мох Мк Му «ех УА МТВ зв Зах Су му ав лих МУ Ве Аа Кб Бех хух ву «кг 7 СЯ Зк
БУ Ж ве
Чек бара о Що Оу ЗЖхі Ж оєрт 3 хо боже Жук КУ з Ж км жах т лхх гаю іх Зх їхр Ме: Зал жк УВУ Му ів АКО га шБфУ Ста ща ев Ба ЖК КІ 7 ср х І
Зх с ай
У ях о ех У бує Туш ОА є Фе Х хе Ж же й Жуки Ж дж Хв п іт ЖЕ ТАБ ТУЮ Бо Бі аб іш во тів Ва Тех ВВ БУ Був БВа кл ке тх
М хх У пох гак Ото. щ ХК Зодутх ЗИМ ее Мого ому схе ух рак уж юю си Ач уж паж су Бі ТВж Бей їж ліз вар ЗзшЕБ Бех щех пек тн дів віх ех 7 же. -кї яв
Кк за ше Кк
ОХ Се т Бе
Ух ги тТаміх Ж се З хут Ж Жлуво (ба й шу Ппдж зак с ц бен ЖУїмам гео їжі беж зас Вжов Зеж бе ївх Бех бе яр дех дів стві ТЕ Бе сСжЗ шо що по
З ЩО ях х Шок МИ ТЕ Ху КЕ це Ж пород ж тк. Ж Му ря їх жк ів му КОХ їе і Бех щі й мес Са і КЕЖО Кл ів МЕ ЖЖ АЖ АВ тп пок І
АЛКХХ ке «АД тах ір ЖМк ї м ал ВК ще бує же мА Зп вм ща ВЖЕ ВА ЕК ше чех ч ЗВ ях М шотк ух ІІТ
МАМУ пе «КМ ік дек у: жін ша их сту її сх пчя . тк Мохохотиох Вус перрі екв, ше 0 МЖуУчНА КОМОД сту
ХХ спа св: МЕЗО
Ж МУКА шк УМХ ок у Ж «й БшЕ мах бно и сеіУ фгхаун ММжі М Уха Хі Мох їкуу їх хм 13 їх Там гл уж деж жо Мей аАшщіи Хлю Ва Мущ кіп же Ба Ку ву ла ЖК Хм ч 2 «т хЕ : г г 3
К ро Я хо соух м ях «віп За ух ше
АЖ 5
УК лю ІМ
Мисик МК шт Утомсжвуєтих УтезрМ Ії гм гу,
Ж УчЧУА ПО У ДКНВНКА Кх «діду каш ЕК МЕЛОСУ дор тож «Ор ЩО шШамп щпіє Тов вна будо пат
ТОМА Сюж шує жи мух мах ій Ф ее С
ЕМ шия «т т жо Ж Ян сит тую сти ж БЕХ
Ж ре Пурхмуїм о мери оті нки --к їж шен ПпОоспПАДИВНишЕЕ што ха АЇ кеююту ем ме «а СИВА МЕМ кт «ЛЕ «ас 15 ст сх ех посух так Вк Кт льох. Зх мкм: пл Мі сам мо Зло ТТ З у со ких хау АК Ме о сжожЖ ме Ам о КК ме дв Ух
Я щ хх я я ЕК іх ш х чо щ о НН не ах
ЖК МА лю 0 МЕ
Ж МК ване Уккескк хх шусчеч г суки ху
ОК я шуми пвх «ЩИХ тре мк ця «их МУК ат хек ж МОщУКЗа ХМ А ЛО ВМ ОХ тюки кох туту хо ІЕМ о» ЗАВ «ДК ж ка ДО пЕХ ЖИМУ дути ух пЖІхИх ВЕ ерифеИМ УДК ЖИ зо ех сет сгщ ач є уж скщи сік ща щи щи па жов ем КО Ку сещ их ща ре ще ж ке їх «Ж тА ж хода гу Мох ха Му дозу ху сів Вл Ай зба) Уві саоБах ст ів Зав ВХ
А х чо
Ка Ке хх ож даю смию ке як дон жест се ж ут сих со фах же Ум ух Ки ач вас сх с що Мпа че аа шко аа бчс ва ЧК Ми ЗК ХО ТЗ
Поках Жашо Куди Пт ж ун ХК Хм ХВ хр тю тах Сем І ж іх
МУш ВУЖ ЕКО сСеж МАВ меж У муй УВА ХВХ Су зу вав св зе КЕХ к Б, т; їх ша КУ «жа нак живих ск Же пхих ек ее сумо жу яки ск пом єфемахо вч кам то ОМ. вив ЕЕ пос зще ас ках Бо Во тех поч за пе се ос ово оце АК Ж
Моя. кр. бук ХЛ же хв ТМжке дови лох Ман чи С а чакт С у 1 ж вк жна Хвх ж ух жУж Ме наз ХжЖе Уві Зкш Бі вів о вКОо еж о
В За за уж. аж удо жиху х т сх же щік дрів т сок де жу Фет чів що о що ле сх ща а со С вис ща ОС са вас ще сф вив як Ох хо бом бл бю з аю мор Жліт Х Жкоешу ДЗ де Ме Ж хх Ока м дів без) Ас Тхр ет щі Жжев їі Аза Хе щі Беж ау бу УМпЕ ВЕК я дк шк я ЗЕ ла емо сжіх доми схову. ДК зможу жи З гуУєю стою бе пкт у ду дух се до Б аа. са ве ва МЕ с Зщчо зе же по во ос вач че Я КК Ж жук Мою жо токах у. ку Ти У ж мосту у жа Ху ку г ех СХ 2 Хр тек Вів БУ Муз бме із б3У дк Уві хх МеБ о ЩВК хо с жах ще
Ба їй та т
. - : з ; тку псом сер оємих жати Біде прю о фегвоюх схвуї зах уч сежІх м ух подих сви ом З зе вци зе щес Квез зеч савУ ско щи вч Є ача ее спас зво во ХЕ
УуУсфусю. ушу СЕ Ж оду бути: Май: СО з башт: Ма Що Зікаїі Казот ух Жжх хи ММ хе
Твх йех їх дів Тех МеК о Зів ей бек Ас без) Бжч беж Зав йзе ТАх кА ех їх о У ща зЗш вс хаї со С чо здзЗ за ск ос ше со шах ше Бач СЕ Зо жо само мех Мк ба М Фожот кВ С Мк яв я МА ху лам беж Шах віз ТЕ ЖСує Тек СЕ Ві Ах блю БІБ слу ЖвЕ джу МУ Кп оУжв хв щи хи зи
БУК МЕ М пог гоже жи ММ ск щі Кимх сухо се сусЮЕ пет Кі хв куди ту Жужах ча х сво ща дао мех ес вк ос ОО са зе Зм бе ше ас ри кх Бан
ЖУхмаси жк ЖІ я У ш Ух т ЗУ дднує пис с ка КІ СТИХ т Ох Ж ки І рух Ж сх
Фк Тжв о піт Бре дяв Тух Тв Бі шій БА їБх ем ові Жлх УВА цех ях 4 да
КЕ ХХ км чия ТЕХ аг АД пк «жил МО кое х
Кк ХЛ дк шк тУїюу:
ЖЖ МАХ
ФМ Ж 0 Крок меоуюою Зрачарі реовкх тео «ша йреучнвеа нозлідевяея юю
ЕК хи ссямЕвтичниа КОнОствукция поожоугум, я
УНК 3це ую Ж их ж тує п ж Жир їду щі ж Я 7 шко олуєїм Тк ж аж ЩО х
Сл жа ща ан хх 3 --чЖ іа ваш ОвЕ Уа А ву о мжВ ж ійшаУ кад і 5 їй з х й КК А
Фів ЩЕ лу А сою сткз Коха Хо ху їз ке чаю Ж во б ху Жигу ївх Ма) зу: УВІ) ЗВ Се зе3 йБів Бех Біфж ТУ ТВ Бе ТВ січ Тех за зе «чх
КУ ХО М
Цією МУ Хі ту Пт тт Мт КИТ МОЖ о дже и жи СУ м дл бек КИ Хек Фу хх щен Мав ох ОХ ЕюУ вх Фо бла вже БО ат Аа Кеш бо уко ВК
А З Б ко тжау КЗ зе Вжру гію бури (їж Бі тк ах жих ді їла бою Бе пат Жхв їі за бо Зах Хек Бі іє вх ви ЖУх Кіз Був Бу РВЕ уж тво ошемо Хек 0 їх жує мм ща М жи КУ їжа бю У Б ЧИ
ЇМО АУ ЖК ВА ак Бе ТМмкг жа БІ тах БЕЖ Тв ОВО пи жів ЖЕ (5 --З Хо че жене. У. х ом. шк В осхуж, од ую М, ож се ж Зреих ку тк
Мет щі бер» Беж Ак Бей Аж ше Ав Яр ТК Вів ТвВЕ ТВ бух сух пах гри: ск
КЕ Б а дя дожет х їз ах пох й МЕ Жах Ме С раю ха сил жк Хом пух вів хз бр о Нів бі бек Аж бів Бе хв оБек Жук ТхИ со Бе Ер
ЗО зх зх
Мем ОХ А селам лм У -к з жк УК У хи міш УА хи уко
ВЖЕ УЖЕ ВАМ ХМІЛЬ ОЮО і м вк обави Маї ТВЕ о Маї Щек дах ха КОЗУ
КК КК
«ВМЕх МЕ? ст ж У
ОК ХМ ж ши ОБЖ
ОТ ж 00 Метт пруток зуощ гі т,
АВМ ЩеЖчНаА ПОСЛІДОВНО ке рек НА
Ки СИМ КБ у ч вх хе Еш:
сухя де бок Ух ее ку Му тах бу а боже В що Мак Кок Віку Лк хе КАЄ За ха Сай шеХх БУХ ща ШК ЗШ Ух Ав о мую БУ іа в ЕЕ ча «щ
А нн КМ У
М у ря, хопуж «вик МЕ «РЕх 15 тр, що «Ек ПЕУ ла ту У. ем, зх ух. Боже м щеечма послідов сть стул снах хе мер Ммеклща «аль ОВ МЕВБСКВ
ЙДУ, з ге ких їз х їх її їх ох КЕ ся А ІїЬ Кая «жене фуд Може сеЖ ли у сх ех. Соткум дев нів біж жа вхп пів Кре Тер Беж тТух тТтв обБоу Ка вавв ожух
ХК х 15 Шо стаю дя хг; М ТА ех схе хаїе МАК «о бе 3 Зк перу ще жерти винні штеежи у, ки мн КРОК ВІККА рек чжшМми «МЕККА «ЕХ дет, Шеф окіус тктхоху і Хотите, хек 0 МОДУ ОСЛАВИ «вжи ЗІ. З «а ЩЗ пу нн и вижив пихи Ки жо жи о усу сю МІЖ ших Ко юю же яки ие лк ччсесстачсса босвиві се За свЯ ка чо со с я зо да че ПЕ
Й Й кі жу жа с у ж Мих й В ях ха їеУї бій Заії Бі Бех тва) БМ ех піжЖ Аза ЗАВ УВА 4 Кк з х М м шо вд м нау срср іх БІ ВЗ ве тн Бе вднт гц таж ва ви тай ввевз вай сш цещ щи щоб ЗК рум ме кас ве це Мо о щ сАс АшЕ бокс Ж жук Ха х Її? 3 Ж р Жито Ж ХК ж Кк ож В Хна ЖК ж теж зу му жо пф із жеж Свї »жщ ча пак еВ Ху - вл жиЖ іх Ух як кре «ак
Еш БК ж пи бо влє ще кзе бах зт сво пек са сер дес сс сна са З ЯЕ
Желе МУ схе 0 п В с аж Вк Я їз Ме її паж их Ва ях же ля їйх Ва тах пі ТУК Тух Мес Мі Тов УЗА БЕ Ав лі Б Уж ОВ
ТПЕОКх "КК и мом с що смж М сх ем пі с Кк: пуд що з щожк сже о щу дк а а с са Ст ва дез ''кв во вай сс пах ЗУ щи щ Ви За В
Я же Жора КУ боже ау 2 ку Мбеу о ж гі юка Кк хи кує в лішж ем віч тТко Ме сбіф Тв бів жи ВЕЗз бів ЗК щіУ 3 ЖБх Аша 45 кі жк зх пи М ве у НН ще яутуєт о тукзкх оухачих ощовом дуттих окт огущих оо где -к
Кв цпсз сах заз ЕС з зас у Зо вс вк сс са Час оч соЄ ж «Фу і в б ва Ток тку Жасвю Ук Жир у Ж Щожує Че бу
Туж іа сао був Бе Бу зі дже Уді ТЕ Мет ТБх Ака Аве Же ех
А их «вх хе: ви Ба хм їж дич зу дош буму Біб зіз з без виб зах сл вив соб за лаз Зоо заз що ж ес я син За че Ка ще зе па ЗУ Бек ша щас а Кая жук Мох сим о Ж жо ска мк Ух аж Жук щу т ах Жовіє си Ж фам Мох
ТМк ща упвх дів беБж Ме са їди их ДЕЩО ЛЖУ ОФЕ а дав км мук. пжих кує фак их уки НК хе жи ду (ЖК дна и зму ек зак жо шк Зак кас а чо ва АК са ощих о Єчк па ХК щу Сех 45 оо жи Укр фа уки їх ке покою ВЕ КУ хе уже. МОЇ ку ЖЩТухит же же вія зві ЗК жук СуВ вів Мк Ав нів сь ВЕ АЕЯ Ва Кр Жко ЕХ
Мне що. 155 роко фоачоум оитофує ДЖЕ сему фо сржех пн нн А зах їаве жа сес ми чаї ак ос Зоо давав за впо су ще воКш щи лю МЕ
Хрін Ле ФО хи Жук шо бує Моне МИ жу лозу 2 хе Му х жах ж зе У Ша їшк Жжю 5іЖ КЕне Ащв о тУк Тхв о Зі» Фів ЗА ТЇТБх Бе Уві Тв Уаї Еш зчА м я я ів хіх Май их жук А
КК. як хв «ух 4 яти жи
А МУ ок втроки ання и ня м ФМумхеукту вити УС УТаЖИЇ Феї.
ЖУдшМ ВКЛ ОШОЖВИЮ Хе АТУ КМ КО КЕ АТХ пери дині
ЛИ асан т х змови я ЖК
Дух Мем мана ВНС тешЕМмх
ДК хх шо еКежеси АСК лі кю Ха у Ж жжхх ХХ ха сад ХЛ Вот «й. щи Кок ЖК ТА хх іх шАМ ОК КАТ ДМА УА АБО Я СУ СА БАЛІ Улью му Бу КК аю сх ї ц ІЙ 15 х 8 ях Я
Си ХЕ ток ЗХ ща Хм Ж дл ал Зх СМхуєє ЗМ Жех фін Сб Ех МУ їву УФі бзи Ві Щек був БУ віз шт щібж Уж тих Бе о бвж паж ХуУЖх -х сек не
ЩО у ли
Хмуихх Ме йо ках ти ши СЛ ж З же (вах жом Фу Жахах сХ а жу се3е їх Меї біз ТВ Уві вка ій вів Бе ша дій Беж Ма ім сх МЕ до вт хе іп 415
Ж ди пу УС фр хмоузях ху Мах т а ик Ж тк МІ «аз б шал КЖЕ да ВОМУ БЖ ОА Мах АЖ БУХ СХ ме ВВ ОТ УЖ для мав ую УМ до жк ах
ЗИ ХО А боже т яко фу ія ск у о Жолет ко дуже бак бу бух ота мА йже Уві вх сет жах БЖ дероКаю Беж ли Жес ХОХ БІ ЖЕ хх як У: сх пе а се о жа Ми дат ен ож г о дам хе Мк хх чор М їх» схе ув жк ух
Ме іч зе; ек дкУу Її) де ек аж дою Жах Віз ві ух ТЕ Сух ох ще Б ах що У хіщ кн ха Ма Й Жабо іш Бе су Мер аж бою й3іч» Шбх шу ла АкКУ Авв Ні кі Беж би дав РВЕ їХхв знЖх Ух ЕВ БМ Кля аю «Ай тк 15
Ме КК АХ хм бе ХХ хх геї зах лює ба З ж їв Ж ку їж Ткв Зіу Зіпй БІ Ки бе УВО ТБ УВА Бек дже «ЧЕ «ху
ІБ 128 сту чо с еп 11У «Ж її сгу кує р «ша пЕтЖ ше 2 г. н. "ї «м. х. г
ТЕ пи Уго ву ко МЕ ЖиВВ МАВ утутугут
БЕ шу ожтхевиї зум «жк СО МЕМ
Кок ях ся їх
Меч о іх ем т я: ша ЕКЗ Жах ря ик сх КУ й Ж кує ДУ хо
КУ Ті дв; же біб щех їіУ щі ТПжЖ ввОй ЖУК діз БІ бБУую ББе Бе - К яв «ке ї х їх х -к є юХ -й мі чок
КК». зол
Ух КЕ
ОК, ту жа дик ем ти Ук жити вх. ї ще хх о нн «мах пе ша ОО МАЯМІ КОХ се
КкЖХ тк зем тт «их МЕЛЕ є УЖ, хх сх Шок ФкУВУХ Тих ММОДКЮ ик, оЖужиО до х ХО МЖУ ЖАКА КЗ УКА ОЕНАТУМЕ
Куна ха ах вся 1 я БА рату, т ках Аж сви их жнку сих іч е ке Кт Ей фло ди жи те М дхуутю сжижіх ско тю сж В що дев посилає ач що сао сво фс оз се бе ща шу хе шк ЖЖ жо сонати мя екю рю Ж хека хумї
ВАШЕ ТЕКА. ЗМАХЬ Мей и їхАЖЬ ХВО АХА Мов са ї щ Зх
Х хе Ах щумеж Ж сечу ужуміх лк ЖЕ ше стужек фо сжоивух ххх ву чо гяку щу М щи зе дими вер оснтх (Б Хе У Ж З СИС пес За ЯК Ки ща я ЕН У
Жожате Фі Кк ТТ жах хм о суха Ук Зх ЛЕ сСувУ сх Кл ЖЕ Хе. ОК хи кю, птв о Бжш Бхоа сі пів Бе УА Був Май Щек Сж Муз ВВ дек Ц3У ЖУК
КЕ ай з
ХУ М я пе рум вузи уже о жодее МдюМ о поко кових боєкжо єюж ам ек ду хо ує фвичях хр УЖ ик тка дю ес звис вБеЖ шас Мах ВЕ СУ и ДК Я ХВ С ко ше К СУ ї45 сх : не А ; Он я ж «к БУ сг пев УЖЕ ж дує ую БА ОО Я см ож тт юю Вл їн Її (їх хх ки ж жах уж жк ех п Же тах ВІЗ ЗА ав БЕ БА ад - З У І х хр Кк до
СК о в ет жу. жи жи ЧИН Феофан юю жо сімю уж ами сік іже суд думи хе. чай со ласо за зе чча 55 аа зи пом дач ЗОЗ ЧО Ме ха вес МЕ
Утошоюц Мощадо Фу. Маю ую СЕ ща М ж лох бом дю Мт ж хх Ж ка ЖЕух СМ ж стажі м мамо ше СХ ММ Б їх - ХМ Аа ЯМИ ШКО ХОММ їх жЖ о шому жк Є дав с " ех вч
Як м пох фут Уві, мік свіжою ску; феуєт аж пече сук деле сукжкю сірі соб фах ту хо шим Мас ак ЖК А ЩО ЗІ ЕМ Я о ОО ЗМК КІВ вро КУ
Тека р Уа Уа, шви ок ФЛ хи ж СК щ Мр ж де муж реиж о шко хр оже Фоми
ТУух Аза ІБ Бу» БЕ Пій Бі Бк чаї Бах Ме ЖБЕ жа бе вх ее
Я Ж х і та Її
БО Бо з її дис» аижую жозую ЖЖ Еюж фот дл у сажу УК ек дуба ек дав БУ аю ств ВХ п а ах диж шу ас же Зав СК а кн М жа МК се ра я
КК ЖЖ кни Ск, КЕ Уа ку м ях жа пот Мер ШУ же Хо руш ну. Р ХУ ик зах веж їВЕ УВА Хук Бей цем маз ек гЗз сей ДЕЗ ВЕ бе да ЖЕ - я сп ке ще МО а сті уж лу пу фон, ви пре те су їжу: Ян екю додкожжи Же од веж
ФІ ж їв са о дев зав пвх св а щи с бек СЕ ру Ме йо
Ж ж мих спати сб 53 а ни йишух Фо філе сук Же Щі Шо боках ую па м АшЕ ШУ МЕЖ ав ЖЕ 8 ер ни зу ШЕХ БЖ ВІВ шВве жо мех щи в 135
Ко же сив жо мую Кожух сум ув км дже дич Ж кажу ж ею дк жужих уки ВУ
Зо щи ОС ЖУК Я У к МО ви ХМ ВАК Кк в ще Вк КО ЕМ зна те Ну 251 ми чна Жах біва ее їх ше ах ЖУмаз точ що Жан о бр
УЖ їв Му же А ЖУК МО са АЛЬ 5 У Ж ши та Тк Ма ще
СН че й хо ох 5 що пу чу
Я МВА
Укущя сх
КО т
АЖ А ск т
КУЛЯ м її
Зк КОМ хх
Ж Ох, Умнх же ЖЕ ях ах Міниттре РКууогт Мих ех, хода ЗШ МчКа ПЕС ЛОВнА С «Ддх ств я ну ния ож КИ мимениешмщиа БІК жк рчу кох «ДН. КЕ у яко ж тк мо Жах ХХ т Хор УЖ жо СИ пеожа ж Жокує Жовехю Жах, Ж лу У ху ма М ет І ВА ХУ ОжЖ ща ща АВ ах м лу жо ме ЩОКА : в тв хв ж Іх о дО
Фу фо бом ййщо шву фах Жлує Сб Ша ху Зх кут Еродх Сб уж бе
ЕХ МА зу Уа ши ху УК Ав ше ж КшЖ СХ Бе Вве о твЕ се Ух ск Ж пе
А Р КА чук век Бій плит па ку ів діє бу вою Же стр зкмройіц сг меж ху зе Ма шЕ її УА вх мА ХАКІ КОМАХ у А М Ж емо хни Кк ще Ж
ЗЕ хх як
З Б 5
Хо ж» бе Ка ту лює ве Же шу п кВ трюмо те му бак ххх
ТА хх є КО ХУ жим ж ба Їх рук фе Дж тва зх їх хх хх щу ХВ КАШ ВВ сЖж оз МАшЖ ДА ЗБК М БОС Х іш У ЖЕ ЖЕ
БЕ У ще
Жорж птах твоє Тих Ми МуиУю сті форму Жогаях Ті бару Жбуяе фФккюк о брує ХХ Жду ме ж ж ж МЕ Ми тах ЖЕ ч ваг о свХх ше Зах ож фах За ЖЕ ж р «ук ах
КИ Їх ЄТУ М жу М ТУ те уже бежня. Ж рут жк дян я Хе КО щі Ху ЗХухю Ж 2
Майї іч ее» Беж ду в зем ха Щек БЕ ве Ха дов ах щЕжЕ ХК у
ЕК їх. ТК й у Я во ше а що Оя Хот ща МОМ Б ха с ож ЇЖА и Му бе Ше ах лікує Мас й м: ЮК ше Мии а щі ар мів бів Бак Ів Мія ЕК ЖЖ сек ЖюЖж Же паж Ба оОжее тах СЯ Зх
АХ КУ МЛК тихі ббмжу ОЇ хо се Фах Се Тл За тм ЗКУ сЖЄууюво бахж
МУ ї ХТО КЗАУ АЖ ЖЕО КУ ї ж Кл Ж МУ жа ОХ век хат щих ех
Іл І
АХ ДК мк ях
КЕ ех пал мо М ош МИМОО «юю 0 ТрЕтВ
Ток КАХ юю туя Хублхж ки мито жк Є межи Аж кеша ЕМ ТОЛК ому
КОД МЕХ
ОСТ Во при ще ка ОЦІ МЕБОКУ «М сю бе Моє Дах ІА хх пек ЖУК ОС меж Ух . хо. 3 У сраку шу че КК КА кт т
Ам Ко
ТК жи
ХУ НК лю Іо меди учи ех жа КУА МЕДИ кал
УФ КУКИХХ мок ка кох ке
ШО ЗОМ у «са БИ МЕН «ой укр сю «виш Ух
Трах Ж шу Б біко її ббіха лк му кут Ко хе Зо Зона 1 о же Ами Кт Бів Зі щі Бери ЖЖ Хавап о жЖее віз сей дув бле Ав ї 5 їв 15 ул «ел ЛІВ «а Е ух ах «и ЛЕ ох ТАКА «о олик 0 у ТЕЛ КВ ВВ, сам щх ша ефек ву фев ШОВ щу раю
ДЖЕ ось шламу МК щя БАаАЗОМ ножах «хх «Я 11 кв
Зоо їжи соми С ах Зк Же Жук Фламо Ме тах п. 3 ж тд В мес су КУ БІВ ав тах дів б Тк Буш зб ЗА вве ніш СУ Вам х ке п З ї. їх КК де дод м лошухі БО м жо Ук Сто: ях пох и де о НН У ява дов -еи ів Бе жЖиЕ Опзпощіє йо ХХ 5 БЕ Щек ва пав пу за Ук жк ж ХО яю
Мі кі ше Ух Шоу ШКріх мк б'хсоу Хо шал Маха б уту їж Жажу 3 зу 1 Ж пав оКжяк Сук мжЖх ЖІ мих Межі муж ща М ХМК Ех щ Буш АХ АЖ жи ЖЕ
ЕЕ шт ХЕ
ХХ ак же тд кож, ж хи «де
Мк туту хи Кі
ДИ т. з и Мах. ил КК; Кн х Як ж жі шжучна послід ність
ХВ
«оутуту сер «вам МЕЗО сою хОКоЖІ
КА МОЖ ЖИЯА пе МАО ВО КУ сети ку сх клю ве 1 хакі меж 137
ММ я У; ци Уж сулюує хр ужфужх о сер фей тжучу се хх ско 5 флюс вру тжучу их си ка «СІ пОш щу м ЧЕ щи ЗБ чч аз чаш БОМ Б цим ЗУ тік М жах Хом Ху шт ма ж шок г 1 ожжом Жук ми: СХ іБАЖК ЖАХ ЖЕО СУКА кхАМОВЖЕК ОЗ ОІВ Бе фо УМ МДЖ зу ЖК кА КАХ 3 к и Зк 3 ня М Ух хи хо вом ож уж сих ЖЖ щолкох спж ж См жити фол фу Же жи шу ул жи оду КЕ. б ода Зап є мс сем жаФф щи лим За Св ес оске вс о ак НУ ех чаї їн; бві Шах сСух Го дів беж ПІ То Ббвж Шве ТЕ ці Тею жлжею ж дм ХК мм еВ КД УК ж ККД КМ М МУ сшіАЖМ. УЖ х ож ху тк ту ж ж в
ОщКО дуфуУю мих бери ушу маси; хх фути шо очі ери ЖИ У сих Мом ех тий
Как в сяє се чо поз баз со сл Зх пав ж сш заз оз ак ха
Єбххжо жимі БЕ ж З Можу УЖ Ох Уже кв «лі лодиь М ЇМоуєю фо
Тех Меї кі ТхО Уже йха Бів ів БЕЗ БФ ща іа джен Ма КЖТ МЕ пт ххх я
Ух З 5 чив сла щиж ва хх ик дю. таж ЖИ щі ща БМ жлух а ваг ща КЖ хи чи с ким вас МК Кот жк ро ща як ее БАС ЧИ ЗБОЇ а СЕ М ху ж би Жесу Шк» й 3 и ак сим дат си КЗ тов т хх ууксх пат тв аж З же Ззек дшжех АЖ мау лм КУХ лій МУ ЗУ КЦЕ хм хх пл ше М ск пох Же ЖІМ мож ск куту кун пеуміх скуу тес сети бух пусті сін су уз у У т У засл щи з Зо вс зо вши кн ва зош пос ву сн виз ЗИ о ше
З а Х З МОУ а х -
Хо 2 хи муж ЗІ: Хе ЗМ лю ок Ву ща Щек МЖбуокє Зуре бу ла чив вав ож до зві тво мес тех Ак са хм Бех жа Вес ж вла тТух хх худ хе я
Й т Б де зЕс що ста пає вон сет вуз беж спри прах ви сл ех Жак їі Ба Ех вка ше «Ук еЗзш аЯш сс су Тк м Зах Ви щи а Ме ах Ка «Ж х
Мам сля Хв уще ку Тл им ме ббефюми Жошту ЗЕ В я хр Мекку Уже Убо
Ме ша св беж Ак їєб вч ех зве о йзе би дав о тбах жеЄ ТУЖх Сух
ЗЕ З кіт учи УК сек х ме о фай у дм ух мує тс фоух Вуж ужужух Ве о жа чі ча аце пз сах чечЕ КК осщК се пе со их Как мер о СКК Оощає ЗЕ
Ж й сад М хо схо у кит Мі СУМ хх базу Піаже Зах Тк зх лій Аж БО Мі ЗЕ щеж ха Ми ле Хв дек Ух ХЕБ Оу БО зе и Ку така
АХ дя МКУ рем о фею сишию укл уж лани ж кюр о су В свя шк Мити рек ли
КЕ Кк У же Ма ЕМ вшМ ми Ще о ща шо дл
Умута ух 0 тет Ух у Жахи ТЕ ня її ую ще
Хіт біс шт Ж фі ку ух що ск ж щої рю я шо хАКЕ у МЕТ ХА БТХ ДУЖЕ ж хм ЖЕБА ВХ ХХ чех зв
АК я ке зоса и
АХ Ко мя зх как ших ел хо тжате
Кк У м Ах ПіуюхезіІМ лук кості Мт
А духу МОСС ких
ТУ 0 теки юка косих и В дах охоти чМа кеВ УКНЯ
ДНЕя Ж, зд «КУ КМ їз б же їх: ії бро бею 03. Ві Жшт а тах біо їн іє від ша В із меш УА АХ БК С Х Ів вх в ощ шу з Кка оса АЖ х В ж 15 «СХахкат жд Же ЗЕ щої Соми їткми о їх Що Ше Лех се жує Бу: Покех «(Ж ви М
ОК ВИ у же Зши су му мл УЖ аж ж ух АК Же жк КЕ судк «к зх хо ЖЕ хКА тхухи З Жї мо бю Я кю як А о лаюух фе ра дО Я ю лоує Кут би ха
ЖК ОМЖК МА ТЕ Мо Уа сх ав олАН ЕЖО Оу МАВ Дав М мА АХ жа
У ЕН ЩІ
ХК шк рн Ж В солені хом Ж юа млдру С ую В стає Жоржа ТУЮ я ві жив іже веж Бу» цеж ве УМ мо ТВх бай Тшк вів Мов ба ЕВЕ ді ще Р ня «з яч - с : ких з : х я - ч
Іо СХ я жом Кл СУБ фу СКМ жому (1 рон мує М шах Ме Ж в о
ІБАККОЖАУ Ах ЩО ТвК ше ТОЖ АХ щоїАВЗ ЖлАК схем АМХ шах о хмяЖ лав ху дов сту з щд
ЖЕух КЕ КО жи
Же їх З і уж в ха КАН ху Ще іш Хахк Жутує й
Май осГеом оо щах ч ав аж и ар Бе Злх вав лих муж ух мух хх Ук х
ВХ З я що во Мо І тк Сх ім ВХ щкоа бу буки сбшуу бан ї0ії5. Юбоз й ків БЕ ч АВ мВ ЗхУ мех ЖЕ АВ ВХ ЄМКЮО ХХ КМ СУ ше же УЮ г «лк ях, мк М 130 скул Нешенку п лУ М т жи ук У кує ху чуже їй хх Мо тек ЖЕЕ іс ів ше Тлйх Лв УА ТлпЕж МБ пах ЗЕ ха хм
МК як «аа БЕЖ
УК У хеЖА ДН ОААКХ
Кт Торт фі Я ді М ик ході 0 МОЖ ЧЕНІ БОС УХ
ШО вч туя «шах МЕЖ В хо КК -
КК тя шк ах жи УК ме доку
НОЯ КІН ТММ ВОК
КУТУ шх РИХ ве ххх АВ «ай ех
КК МАХ штаму тій уж дшетуху сим ож Жук ухлнеу й ких. ужиті хм ажфаж п цуУЮ дови КВ сжужих урну а ка З сва сш ВЗ шва МК ва КЕ че ща веч вва КК ЩО ЗИ чЕ жом Х - я х вч З М а - Вч ту, що мл СК мя ту лх Тихе ШТ пу ЩЕ ж ЧК Ох я Ж луг бу КЕ хх
УА Ж ЖАТЬ ЖИ У жид Ж А МЛ ВО Ж ЗУ ОБО КЕ жа БІ т Ж Ех УА ня - ех У с хати зх шуй ма фи о ми уже сдклж я шжаО ких твоя. ямах о сах Я пух ху вових ЩЕ їха чи ваз чех Зоб бе зе ща Боб се Жах вс бо во р ках Я
Фк Ін ти ХЕ Км й Ж о М Мк бага МУ іх У Мих ДЗ ту. Мод зх жа шу УА ЖК еВ МУШОК МЖК АЖ МУК КОХ це жчж БУ шоку ку ще ж а ах За
Ходоєс щу о шу ху ххх УЖ зУсх З слі х жує сумуй блехю Ух пи шк Ммахо в суу а сво вв хво Су За иа с ЗИ сс за шва зе КЕ а о у Ка бує Во ЩЕ бля Же усу Ж ух А: ЗУ жа ма у Щоохо подуєі Тк Жрж кої сш Ж маш ЕВ хи КО МО ска ЖЖ ж ЕХ Ж це ж Сх КЕ Ме Ух 48 3
Ук хі. теж щи ую освземМ їси дує теж чути сфутеду осв Жоуй жжехдю схе ик шк ух щфізЗ -- Бо вве 5 Бої зах ЗУ доб во зве Мах Чом аву за і35
Жке же СУ жо ТУ Жодне ду 0 р Вір є у іду Ж скла Ж МУ пф ЖЕ СЕ аа Бус ек ВЕ АЖ БЖ ТЙК М шк ОМ мМ Ж СК
У ке «ких
Гм ЩОМ, тї
СХ ТО ке і с с с х х . сую о х я що . ол с я . - сі доли, ких вирі тв схіжах СЕК жом сю ще зжох сет схоче же ско скажи: мо дія дея 2 стач щас ще зе 5 ас зоес ащо с ЗОЗ сс шо йщ вша щи ша у
Ух Ж ск шиж УТ Флаею Кжх Мах Може ЄМ я М ки Мк ох ММ ОХ, Ум пів зі жо Ук Бек МавЕ їм дже ба тТмт дек ТЕ йдевЕ Те ІЗ тує х а ух що їх ЕЕ ХВ щЕ ща ша щи ВЗ о Я ВЗ. ее ща пав Зо чУм а - ви как ка
Зв сх Жодки МУ. ж Ж ХМ жк Ху М Е хухккя х Мк он ОМ їз
Мат бів Без дах дк Ба Ах Зах За ве ее ів ївЕ Сук БЖ Ку их смог ся ЗМО жави ую охеуйо сх делю юю уки со ух ух султим От я ЗЕ, чов'заа час Баї З ОК о сво Ко Кв 5 Бас Суб За 5 дах аІЕ но здох Ж їх ТЕ Фуко Соми г сови СХ їх хухжаи сег шк їх аку, вів йкЗ ев Мі ЗіЖ цех Беж НіЗз Бе ТУЮ Бех тУКк їх Біб ве яде
Зо тов д та
КА МОМ АСК, ву ча ес пав чек а сс якос всш Я Се МОГ
Ж Ман Ж -х кю й ж ок тс ТМ шо го с сли
Ушк хЖЕ шУуу мав БА ЖМХ мши жа АЮ УА БЕХ ЖЕ 15 «Еш ЛЕ кит кю КВ
КК ж «війн ПЕТ кали шжузна попів
Ех
ЛКК и кул фбзтілохузоахмм ис маь іх ниж І ОЗ зе ЖЖ и «обр айви Мк
ТМ Хо МОЖ дя, пох жи й кни СО СЕ бод. ку ВУ оку пу тоже Ся п З оп олею ва бів Бек Бу вів ЖЕ о Удо Бек бе Бк бю йЕж
« х ях й х
І ц лм ї з стад ве В сон МУ зу хз У ме ХК сб мою фр М тхлое мтх цех ві: Му Уві ЖЖ сСуз Буш дів Зак пів ТУЮ ЗБ гбВе бтве ау ТУЮ
У ув чи
М ко Я статуя по ДІЯ до Мб УУ клю оту тор жом Ж Жокуук ЇХ Мор ку
ХЕ ме над КЕ ма ХЕ са Я ЖЕ М їхАХК ВООх У їх іа 5 КТ мах. ко хом х ку хг 5 ( БУ ж хи дою скриню беху бах й єх Пе б жк Во Жохлу Мавк ик
АМСУ Ох ХО ЖК ТЕН ЛК АХ су зу УЖ ХВО ЖЖ пав ому ми ме
С жк Як. хи я БЕ тео СКЛ жхо Же с Жшю Зджую Хм би Мк кю Ха Ак аю ках М ст
ЗУ шо жи ах ех Мет хвЕ Бе І ТКЕ ОБ ТВ сеш ЖИ Іа ух ще Си «к ско ж т 5 й
Мо ви Жах а ких бах кг ох Мих хі ЗМКрче Ж а Ж ака Меколео фахх
ККУ АК Ммщи мЖ ВІЗ ЗМ БХ мах ЗОМ а ш Ух БУВ ях ух ККУ МОХ ца чл 5 хо У шу
Хв М юх шк, Мі ах се о фе ЩА зуби бер се сбхкшж Жде Кат ЖУМох М ке аа вк хво ів о см цех ха Ніз Бе їх бе сих Тр хім Би дав 13а їв їїй жо ис чо чеки ку скл іа 21 х брюк З кі я лрвою ї8. бо ах
ЖЖ АЖ о маАМ Бай се Кв Ми ВХ Адже мах ех шо чу
КЕ ХМ лк В, Се
ЕХ кА я лу «ем ти ту ЗІ «Кай МИ
Іл тк. па ек в г а Трохохозйв жк мех КК ее МІЖ УМІ ПО КИ То сн люк
СЕМ
ХУ ЕКО ИУ сЖейе ЖЕБИВ : «ЛИТІ Ом, о и пвх нн не ож кю ІА КИТИ ХШКЕ КО ДОА КВ ЩА КУ ре МИ рух мету тМа хх Ух пн 153 ж УКХ «ад З охо ж схдта джу сзщує хай жах ик ах сажею жує гелі сук між дра ба фр и пк
МЕЖ У а ЯКЕ І М ЯК АХ с ща я ау А м ща ке шу щащоя ря о УОЗ уко пе хм жи Жак фло стваєлю тА КЕ тіїне Защ її 1 ху Хо хол ху сх зу ЗЕрї ха Ти ших ші Мід по шВА АЙ О КНО УК ХВАХІОТНВК ХК ів дж ГО Ум Му ЕКО Оу о
Н 5 п зх й КУ І ЗЕ щичш жи жу ач зсшжо жом яжо Вик КО жу жекіикя пажож СЖжум мези умі Води ЇМ. коса щи аа що Ку зо зва че ек ща ес вки сх Вес стщ ас ЗЕ
ЧАК х 5 т кож кс хЕ. х Мак: Ж. чу с се. чт ак, ях » ЖЕ у тк сич я
Фе її хи Ми ху Ки М зу Ж хе ок У ЕХ ху БУ ук
КО А Ж ЮЛ ОО му ла ЕЕ ож кУЖ ВЕ о БЕНеЄ Тв 5 Ж Мих ск Ек ч«х о Е пе іх 8 хо КМ тат вт с БІНЕ пу га Ка с жк Е зх мав мм ше бвш вм ва 1544
МЕ Вр ех хе ще шк МІ ще мих жав пев І ми В С В М зує арх жо кт Я ие м В Яких Ж у АХ ди Жах 2 Женух ім
Їх Мах йоОж бе ува вес сіб Вій Еко леж САМ ОЗЕУ Св ощіІв Те Ме ту хх ВЕ х 3 жк меж хх ми замі СРрех пуйюх дю ххх фе дкюж фра. бою ужурих обу дедуєт Жов о фе жах дю ек 57 ще Кча а ас осв са зас чаї зас аов ває как очев су ваз кх ЇщЕ пшожюю Турка СЖ Кен Кук Жду Шоу А лю шобкфасюе тери Ж СХ ик щи пу хе їі Аве Буз жомї Жнж слі БУ КБ дае ХежЖ АХїв шій Був Ве
З ще мм, по щ-- ще є г. я г. м й с. пам Ж г си х г. с с зем су жів Ів іх фо дити мит ту пустих Жов бо кори що мм кох их п Ого І З-с ас Зб Зо сне бас во сту виш с Зо хе «М кт й кош ка у КМ Ж дк В щи ЖК жиле Мах КО оре пи пів жа чаї ТЕ Ме ве Ха дво Св Бех її бех Же Віа Тих дя ї «ку 7 т сх
Б т у ЩО щст судж джур ще ема сх вера Бо Е си ат в Но ЗЕ вах сади За и Ви ТА МАД МАЛИМ ЗМІЮ МК ВА УМО МЕЖ. УКОВУХ СА УЖ І КАД СМ ОСХ В Ву ХХ тяжко ваш лож кдд Жди Соки Вод Фан ик уж Не Во Ту рн Жкує у
УЕШХ УХАЖЬ МЖК Я ТАКЕ ден ЛЮЩЦ ЛИ ЖІ З води дав ува УЖ КжЖх ух з зи 5 в Кк ах угетіх мІм гхІЮО хе пе ОПюКІЯМ хо ту міфи фужих жу Жов жен сту сю жк Ух чив за дви сшаї оз Мо сЗо св по бу 5 свс Ов зе МК ще АВ кою ее усі ЩО и Жах ж Мік бра боту Мах Жбагу сечу ЕВ ЩЕ Фата
Хів вк зе Вів Зі Бех ЗЕ Вуз Ве ТІ Зеш ТЕХ ТЕв бах Бе ак . мот . ЖЕ ах
МЕ М ОКХ кож мое сжижух В се се су Кк дих дже кіяух суду ах таМоО пе сало лам ау ак сУМст ЖК ЗЕМ КО ЛАК ТЕ ЗЕ студ СсШеж Тл 8 гу Пд Ж хі їжі ск са бощшуюе шах
ЖЖ ЖЖ су КУМ шА М ММЖ ЗЯЖМ А АТХ А ж сх
Е Бе
ЕЕ лк суч й сл «ат Их каїї Бий ее Мехіко ср пев ек шжучни тону дошнАС «ЕЕ
МВТ 0 гума еко хе Я
Код Мо -щихетичнве кових УКиаВ ву у кажу ік у о вах жохах їж ау Жов б че що ше ж Ж ре і
МАЕ ЖЯх М ам ВІ ОВ БУ лука ВВЕ УА мч БЖ БЖ щАш кк ч « дк з: х Му КН 45 б їй туш у ек. стату Тед ля б їх тару Ма ни сб ку бе ак оУмк ух А жюмЖжЖ УМ ж Аж Ех мк ЕХ КК їх ЕФ ТБ 3 у ЖЕ т-к зд --х ий В З тека ен Р Ї до смоуч ху суч хх ач М ла ХХ ях боку Ж З у с
КтЖ Ме Міз СЄСЕквоУВа Вже спів Біж Еко слі щі БУ ев о біб ТХюв МЕ зх й КЕ ха а ко ж
Як ие Хом ж уже ЖУТЬ У М хх ут в мах чую Ж т чом цБіж ЖЖ її Аа КЖкоа пом беж піт Бі Твх Аа бук хів бо Бу Ве й ВХ щи хх рожа лу Нюх их МИ аву Мах МКМ ох хе СГ як Ши Зб ж МОЛ у суду хіп сі вк Уві їж Мек ЖЖ дЕч бар тво Жах КАЄ Жеж ЖвЖ БА Жук вк . За з З в ТО т що
УА тож ох аз Тл Що Ж жо Во бік Кл Ж бує Маки й
Мас сій сїео щах Без бБво ез Хе ав оби сих Біля УА Тек Же СуВ тУк гц ЕЕ ще У
З: М бами. С б им ЖК, сек хуя зжежу МеЇ о СН й Жде ду учуч ТТ гію хх га із вх дав нів Сі Зевх ях Нів Бне їтТжр зек їх їЕрв опІю важ АВ
ЗУ хх зл
А для 45
Піжама Ак пі і У і ХХ пІщее її Фу ке
УЖ КЖе дж ав шаф МвХх ММ мА ИЖ МЕМ Мк шЖ тех зад зо ом. я ул ее ка крах соте хо МІ де УЖ ЕВ скій ДЕК пехкор ту ЖЕКи пече і таку мі ке, чиїх ЖЕУВА ПОСЛІДОВНІ сЖЕ ча ххх «жа МЕ В
Тр че
ЕТ чо мідь пе мою око хІМлОуЖияа ШМД тую хлх Р ЕТЕу
Хек жюх ж ж МЖК Х гі се ЗУ «них иа ек Ж ох мої сУКоф пф схов Ж срищч еВ рек схо в мя В мм им ак преч ши са сш Се м С щу шк ас що у Ба с З ще зх гру ЖЖ ти т кшхо Ух Ух даю М В : хі їжа тру сік КІ піс ві бій сен Маї Зів дек Біу АтТа зво Уві Бра БУВ Вуз БІ АТМ х х лох їх
Я їх КЮ хх вечро ух жих хіх жуки лютих Божих хви ж о сви жо ур Бо дреми еЯуз шк жу пож Ех т ох ша пащі чу Ко му ЗК БК Ка о ще ЗА Вам ре ї3с Ж сш ст мо жу СМ еєх бЗажах Же ОТ Ся КИ ТПолжах ПЗУ Тк ПИ жу ОЗ КУ уж и У БУ ВХ МЕ БУВ БУВ в МАХ М СКК УК КНе ЖжВи І У Ух туя -- ха
Кк Я ку з жо дили. ЖІ тус; дих Же Ит ухиКу. зл хи М Мк щи В. пукІї ад кас ащі сао а ся со сао За с За се ше сс ому р ак кв тиху кекс КЕ ши ДУ мамо Ж Муки бю тя Ор х жаху вх аю Ме.
КтУЖ Ме БВ ЖЖ УВА ЛК кА ВІ Ка МОМ ів їм: па ТЕ Ю Маг 38 й вах 35 за й нн НН НН НН НН да отже дифе спуск іміх СЕК сви см пу Ск с хр за ща висо вам пок о цав вза пах че зо вав МО де Заб ва КЕ я
Аа і Ж си й кое Ух Я жі ЛУ Хбаюа Кот : Фоажщ ЖІ ше ТжЖев їж: Ави МЕ солх вах Бі ША ЖЖ Хзпокеж і Буш Бе Мне йо шк хо
Сея Ех ОЇ ен Не ух Я кож суди Ухуух су ці слюдхєу Вих суд жах сел: ут В щу МК тай мус ве чес же ЗБ ММ щи ще КО щас виз чор авоа КК ока ХМ я пелу Ки й хх дж ии Мвк Жамаж 7 ул ую сон Мою уд пе Ж біп іч Важа і Бек Мет ЩфнЕ ди піз ТК ощежЖ Жак Бах ТБЖ АХ ОХ УЖ
Ва то ль Я спреї вже сем мічит сухтуєю ем Ішж меудо жо секмих жуть щмух хх уж жом фу ау ху. ах ше шу зах ВО с зна 5 ца пе ак хв ака Ме ве Ос кВ бл ж М хіх Мам Кжмеж М шу ку беж двух їж хе. ОБ сю сему кс Жуки
МНК їхАЖ АНЯ ЖЖ м вже Х ЕР ІК ОММЖ сл хх КУЖ МЕ мух с 7 " вад ще
У ЗО ма зса вав чЧах сеї Чек мес Я сво Еш аа Сех ве бе За Б Бах ЗК
З оо вже дя Ма шУКді ша й. ММЗ ЗБ сбет Мох ббаже сЖбеу сі фе Ва ів ке Мар Кіш Бі Бек дже Мін бе Тк беж Тут Тюр Зіж Ре Бер «ви злу я ща хм ШО МКК дор боуру сет дк Щомію фею сей ойеих жа их проф й ах аз час сей євую ст я ще сс щи Жено ЗГю дІЖ смути Мас Ху Мт рах Бан тн до Ж жу бу Мая
ЖЕ ЖЕ Мо КАК їх ї У Ум ше УВІ ЖК ВЕ ВЕ х ЕХ зт кою ях, ему зу «ит хв че ко ІК вудка уде
МАМ де
МКК ху як ПЕ
ТЕС Мах ктів мух и, ж де хОоЕІ КОМ ПУХУ ЖІ Е ЕМ ІК КВ І КУТ «Кум коди
ГОД ЛЖтх пф ті щНИи МТУ ТУ чі вик СЕТИ ХУ ТУ А сек, кр
НИМ до ті жу в тодуєює ЩЕ шк уж М кю ку їх жхкмжої Жук раю джених Зо ій ува пав сш Ха ща беж піч Ав бар Уа у БУ жа СО У аЕг х хо ВЗ Кк ж я яю Як
Ху лих ЖХохжем й умо ох тах З сю Жах ГІ хі кує МУК Є Зк й а в
Ж ХА МеВ ЖАХ ЕС У муж дпа ЗЕ шу МУХА Ві жи Ві Ж ЖЕ
Зх тк Зах о ж ке
Тен мое 4 бек ЯКУ бом Уж «що фа КЕржх сила сю ху КУТаа яеу; Меще муж Мек КБав уж УВІ вке ів дів ке шт зЗій дів Бе о Же Же тру ХУ Кк
М Б ща ех хо НК осі М сто хх ні чув Ка хх ХО фо. ож Уж спж жк 3 ав уж по аж пу ж Тех Аа жук Ба. її Буш кеш
ТЯ ву хг зей ай Жим фену Мк ут Я у; Умов буду Мр мух СИМ Я оч сів лу Ма ві бе Ме їн вк піз би пех ТБЖЕ бЗЕ ЗБЕ вії ТтЕ пі «ж ке БК о ТЗ 1 З
Хаж йо Ж у лу. дж ух Фо соня Жду Жито шовний ус оф у жк Ка бак ек св о їви мех бо цей дЖжа дес дар Дер тв дів ТБ о бшж ХЖк лу до ту ЩЕ
З що що ж скло коша Я о дб аю сжщю Коло Кб жо руд: бу кое у ев я а ке хів АЕт Аз о Мів пі Баш АеЗ ла БВе Ту Бек їЄмЕ Тв опа Бе АВО яке т я
ХО АТЗ ІК сияючє рижжнм Же Ж хх я Кая МОМ т ожужа КУ Ума УМ дра хх
У ЖЕ ша ат ШУ Же БВ оУВвА ЖЕ ВЕ БЕ ях
ВЕЖ 1 кА хорд «Ай хе її ЗХ
Мт туя ми
Зо КМ корт Пісежуєтух м печей хек ме ик «АВ Джим МЕМ ДМК Сх «их хр сек я «ик МЕ щи еВ
Ю Х Бодуюча посла деЕнА ХЕ кох хутух вух тр
ХТО Ек їх вжи т чо «ММ кал здох шко ФУ хх бує жк (бомех УМО же ев суми УКХ моих юки щЖУКохУ Увулу» ОХ «с ЗО се ОБ ЗОЇ са Се За че паз ж вс; ва со З Я З вк Я: уд ху хх тех КМ х пл Ж пот їжу ( : вер у ав тік мо адм Х її аж туї чу й жа их Я «жи Тло Мемує «1 лу І х сщй ожва пи їм тугі ів Беж ОщЕ У віз іч чі Ж Оу шЖжжЕ шу лама - Е З г 5 х 5 КЕ АЛЕ
МАЮ кро ер емо ке о Ко о ВвеаБрозех и ча Бас ях У БУ ВНІ че ас ЗЕ емо Ух Жуки ху х йхеху та Моя бак СХ кт Мах Аж хи зумкуУ ж ЕТ т блю зак оУми вт УВА чех ст Му5 ха жеЖ У ШЕ ВЕ М Ма Тв Б У ух їх тк пи т ТЕ и
Зо КУ я Кугуж су х «ки сжожу ких жим Ух схежих Уж ж сЕщот бум В чик їй ас сво мюроятч су су ше сс за аа дО се о ха З А соєжеже Зло аж с ву Може МИТО Фо ен стлжю М ж жу ПЕ оує ОМ мая А
Сх ех йхвоже щі Ус Ай Ві БЕБ СМ са їж де СВБ ОХ г шк р як 35 яку М Я о НН а в КН НН НН НК З Я Но НН о НА о І що зл ам ФО Зб с-м час ва: ча МОЄ воз зас Макса са ж Мк ВЕ хх туя ле Хе Ж ОТ ут бив Ж кт о брак Ву Всю нею іх ТЕ тож Уж їх Ж хх дО КжОо ЗАМ ЖЕ бу ЗБЕ ївх де 7 Жх З В в Бе пеач ЧУ щерошко асо З зл о ззо а кос ах ово вка чом кає М чо Ух хе жи жк ву Мою Ул дея Хо оч Маха Ж, ХЕ «буку ві шщ екк их же Ал тва їЗВвх Вес їй вкч ВО їмх ЗеЖ лів ЖЕ Твк Вл у ЖК «ке «і «х ух ха Му ща : , пшм 2 кг п мо п жи: сфе хоч МІУ о сю гро жо жо щу в хи к а
ЗХ. ча є КУ ЖУКЯ пе йосе Се Фф шн сшх свеоІ що и лМУК З їх ОК ай ка Е Ж
Уа ТАТ Хо й жу т. с ок я с ле йо Ух, Мох М хх зі зу тт т Саме ет щі бує дек АХхе сей АКкщ мах ОБ ОА СХ ВЕ оаів Мах шк ОКУЖ ув пе щг зх
Уа Ще ж чих пух хо жу от сечі уж ям сук ку ол аж сеозвох нажиж ку оо ткх Зх са ВІ «мах с х ве Мох ско ВХ Мах Ох ше це У її ОЗ пос ч х ЗЕ я лежу дж лій ж У а дою сах сеї Чеки «ак мли лю кю ФУренх Мо хіа дкч хвв мів Зі ех вже Міф ВВ ТЕв пек ЖтРтЕ їх БА Бапа ЗВ
Коже о фбнтує усу гру (ХИЖІ свомех леж гук спам ри фею рив чулих вах ки;ч що са Фк ами с вес ши Зо См ак ж пк срлную хау аж й ху Жах Модно тихої сйфухю їж то дує Ме
ВЖх КЖЕ ЗА У САМ і ю ЖЕК дю ММ Ж БЕ Зді ек аж як, лют
АХ км сігую 3 ЗЕ
М МАК
Ух чи
Мо «СЕ шести УтКУЙ ни Мах кій» ДЕ фчна броні девнісиь сах
ЗАЖк ЖЕ с У
ТК УК ТК пока зей ик сь ож 0 кммЕЕСИЧНаА ВБЗаНОТЮУКИУХ ст т тут ча шу аж Мк гак жо шя Жй ж му жу и зу щу я ДЕ жо бік бу Кк В
Зап ов мам мем жа МОЖ А ЛАВ АВ УЖ му му ХХ УЖАХ Тк и к й ЗЕ 3 х 15 Ме дюни ЗИ их сяк Межа тки Жуки дума хх ох ую їх ср МО кл
Зект УМ же аз бек Шу Ба Ба бек бу Жук Ж ЕБе Тв сі Ху хх в лох хи Кк зе
Б й ЩЕ ою бек ХХ щ у ятику Па Кк що Хюеню їх А кі ух їх Уижих їх ту ще їх Ве Кіз ТЕО Уа ка пли Вів Бже Зб В шт рез ан Же ОМеЕ ї5 З ЗБ
Ж юх. ба сто дос Жізех бл дк пак (7 бю МУМю о Моз Му Ж ТІ Жах Бвоа
АЖ КХВ да Ка Же М ех АД МЕ ЖЖ ВО су Яка МАТ ОБЖ хм ух яку ях.
ТО ТО У
ТЕ Кк о усих Суха жу я юю Ма бю а аж аж ТИМ Зх Му
Мат люки ВИП ОМА ХЛ ОХ КДЖ му ВО лиж ою вж щі ПЕ ТМЖ ді УК -к Ук чЕ п ц з Не :
Кп ТО я У ше Ар Ту ка ож Фошут Ж ето дам Фши кує Я А г бує му хх
Мекозі їжи жек ва ме АЮ Зек дар йжв ТаХх ій УЗА ТУЮ ЖЖ СуВ
ФУ г КК
М ММ шо жо жк а ща шо й; ше ке Ма. Ма Ченую Мор Хату скраю хх чих б дай ли ав да шеу ЗЕ АЖ МВ ІМ Уже Ж ЖК КЕ ОщАШ БУВ ТЕ
У ЖЖ хх іще м АНА
Уж рем Ж хе «1 Ж ую Мр стук Ж ж ую Ії Жим су: їМЖж ЖХш Б са щоб ЖвжЖ меб УА ОТ ША ех мех ххх чех
ДО ММ
ШЛЕ М дкчу у
ХИЖАК. МЕ «вт ЕК те М ПЕ шлю чЗмхУ зак ДЕК
ЕД 00 Минлоріощо жофх ох же туту тв,
ХК п УЗЮНО МКБО ОВ МК
ТЕКУ
ХЕ МА ем фр
Жан 0 ММ
КОМ я я
КИ ИЩТя мо НН
КИМ КОД УКВ ТЕЗУ ОТ ЕХ силитфтко ща сер я Її кА КІ
Ко Ем сту «аоих її тм ж тету сей жур суми и ттуших ух суддю стеж Ок Зсхкх са стежу стсух БУ
МУ. зо. Мом да МЕ С З меш м Ж МК їх ЄЕХИ сжмти ОЕХУ З а хм І З м 8 ие пржою Ки дя у У их А х. У КВ боже хіх Кодех ок тв жк: КОЖ ше
Та Зх ві ках т т ЖК їх і ше ха хе удо бажаю БО Ка З
СОТ УУКО да ІМ УЖ шо Ж щАшЖ Мав ВЕ УВА їх шо муш Жхо сАУ Я - 5 чої зх х З А ке: сей тв я йтк кож (ж У люта тки сжольшх жи жу: бе що жує Мао уки зр. Ж т тіхщо жх г г. тв пфщтж ТМ фай ру п пу жо ех тах Же 5
М ЕІ жо а и МК Ме ва МКУ МА ке атсш щешж ап ще ВЕ 5
Шин Вуж жк жу фу ою, же т ТК жу уж Мох КЕ ке ж юю жк, сте ЗК тк ж уж чує Тл ії ую і у ах бю Вбих ва сті у пшжЖКЕ о МаХ сум хе хвах фі му ож сек шоу сх шжЖ жк КЕ ОАЕ мА ху Ж ет хх зх с ту з
Кк жо «МЕ шо рек смеши Дощу ежих соку ху вр же меж че онов їЖеОВ жк хр Жде ще «иа пес вич сало ау чи св спр Ки ІМх щем па шк ле ЧУ СЕ ЗЕ щ З ух У ях зуух КАТ Жук м х. М їкус ЯТЬ я Мах ух КО Жуль м по одя кти, сш муж мим МАО ЖЕО лкК у МАО АЖ КК ЖАХ СІЯ Віа ев б ЖЕНЕ тк х ах
Ж зи З густі Можу деку дощу сире ф. що цем о тує сторі ще са МВ му пох сф КО З
МЕ М ЖЕ БИ КО пе ВЖК ЕМ ДЮ ЖКОЛЮ ж ах пи ваш м Мк їз
ЖЖ ЧЕ дез Кок жк, в их, Фо ся сх Мо МИ шк дм Мо оте Жодаж Хе ло Же тв ка За жи Док і Му Ме У обмін Ж КУ х х пФ ТЕ Божок як МЖ щемхЕ ак маку Ме СУМ КК ж яв Му ЕХ То скОЖмю фе жух пюих о жах ук еф. дичу аж УбІкКт хіх См у у мо Ума їмо ЯК па ефе ще жк ас лу лю же щем Все о МеМо лох Вр се с ХМ Же
ЛИКУ лю ох МІ чую МК Ж ю о В х з У ю Жшну Сб КУ Між Ж Ю М чу масо шеУ й та АХ Ме Тих дже зів их ех ле ЗБЕ их Аза ЕК ке «г «дк Ж ку з В В хх ша соми Уж ка межу скучм фо суч рми пету жиє де ВО ж шин т жу
ВК асошт мор ж Бо НМ МО ХНА ча ву че авг В ЕЕ кВ СЕ «жи пк СЕ уЖ Ж одлнкт Ху и ож Жук дух оку МОВУ Щи ХиКмое їхеу сбехо гтук
Ми оса би ЖвЕ й Ме ЗАКО ЕХ да МНЕ СХ пк Аа ТВ Оу МЕ кХшЖ МмуВ
УМ жю. мо Ж я ВИ ТУ ск сно ух тд сте Бім о счжЕ жд ЖІ КБЕмж Бик о кдд вух жрлатх Мк се ще щи ма ще ме КУ Б ОБе ща Ж ж МК КМ па Я А км Еш хі Кииж о дхм Міщм тат леву б і Юа ем Ждую Матус бе сю со Кл із вже Ав Бі зу Бек Хха НУ ББе ЖевБ Бек Хукю бже шуб Ві бе те тп хх
АшАК ке КУ шо: ежАх ому зУжких джує хи ух шк суден ом сова фе хм птичух пек Зз'ї ше са се св (вих ВОЗ ше ше веб о щох Моє Є КУ тю ат су гам су бах йо у Я шаю бще ж х зт СЕ КІ у. хи ЛЕТ шк ї ек з п МЕ
ЕК ТХ МОУ лу Ам ОХ вк цею ХА ТВх шжеК ше ОХ пр поч ххх ок з и же чок
Кл В Ку
КК МА У як тя сел
Ки Мах ким Кт
У ЖЖ МВ хх вих, УЖ да ка МшжУучна ПОСЛА ДсВНЬСиВ
Кв
ЖЕК пет укл УЄІЮ каже Живко кукі шк У важмчиа КОВИХ ММмХ
Мои УЖ «апп їі хі ЗЕ ство бокач 323 33 м Жора ча же Ж Ж тх Те у Ії ск А ій ві ів Ума Заї Зі Бех іш Вів Ба оїаі БУ Ззше БЕ Зі ВІВ 5 «й 5
Х Пп М їх котам їйчЗУу З бок км В тож же сбужау СМ єю Ж лом ою жу бух Мов пу Мі Сх кю Мж уж
Заж уві БУ Узі бек Сув зу Бі Беж бі БУХ МАЖж ЕБе ЖлХ ЗУ ТуХ ст у Б
І кВ Ве
Б - діях ех Уа ще Ха ло ую се Із Ж тах 3453 ою Я
БУуж Ме Мпажа Жжро ув вже шов Вів ска жі Біб зів зам ошів Тр ЖЕЕ з хх їх
Ж С жа т жу Му Жов Жим жо ду Мою жує й у СМ ж оежчі Ух: Ж су боку М шо У шу ЖК шо На жит км З жим А уУ ЗАК лишХ УЖ вм К МБ леми КУНА -к ви кзх веж. СЕ що
Уха ОХ ка. жи У сома Мухк Моє фу та бю бат Ка деух СМ 5 до бак й слу Бк ва аж Ме Ул ахи Бк освЕ Беж їйпх бдех Хв ди ух я зум сх п их їх со Ії в М х ще
Машу ж тодтух юю Ко и ше А фодяує ім жи рег ж фо
Ме шов Бе щеЖ ех ме З ЗХ хар МК ОКЛХ Аза їж т УЖЕ ЖЕ Ух
Кум щи ЕК да МК Же
Фото божих Це СЕК кю ПК ми ЩЕ Фукойк о их бе бу МИ де Ж гу ТУ сво пам лпКч В Божа жЖ бю мжЖ лАжО ХК о пе сткх воши ЖК хжЖЮ маю шк Ж КУ тва Зах Зк
УМ АІХЕ КАМ хкірає сб Іі хх ГА ЖЖ хі сфвимо схожі хі а ХЕ пою хи їМЖ жх о сю ІБ БЕ У їх ви) о Хві тв омщі Ех де чі: в
АК хм кій 25
Ех ТЕ «іст ЩЕ ше о ння ж щОжиКа послань
ТЕЖ, ж
ТЕТ мЕшещя дик МЕС ВА ек. же и сфор рН ум их вка АНУ ПЕОМ УЮ ета ком мк кА ТЕЖ
Ж Кк пої
М х їх и жу мих лм ща ЖИ ЯМ сума хи ж ож суду сову тий жу сах, Кк стад ЗК м спи що сл и че хх За пз Ач за Бех с У 55 й юки ах б І т у ую 5 МІ жах ХЖЦ Ж Жахи т ох
ЩО Ух мат зем ВА СА ЗХ БА св МАВ УЖ МУ пу ЖК мА ЛАВ - х ж «Кк ж х КУ ї5 оч я и сек Можно пт щу вок їжа Ба І Южож ве ся жах чЕ тка з вай ще Кво с ва Бк хх ща ак вжО БО ЗО це Ве жк бу ЖК Ж ож ЖЖ Ху о ж Мощі Ж Фе Ху Ман Міхно ххккк Ж хх Ми вах т Бу Ул ик МУЖ су вн ЕК МАУ КУЖ АЛУХ ша ЖИ АХ Ух ха Ек за «ХХ дО КО
ФО шк пек жк. ех де щоКЮ уж й жи уко пжужик ати мо соефих о дути к ах тав з щООЖІЕ х ще уч аа ше ще Ко х ще сай За ж 3 х ча ах Май сю жук шо у І хх Ж що до Же о Мк ше Жосуу С г ер їух Ме Вії Ткр УВУ За май За Еш АЖ ІВ БАУ мвб БаМ тк МЕ хук с «а
Зх І ах «іч Кави У ІЮ цих оо Ум щІжЖВ о сфуже си су п аю оо ик зві да ЕК «55 чи КІ ше ОК шо с зам що Б Бо; - З ЗК с Ах ча ках ее Ху Як
Ток Мр ЖК ому чех ЛУ Йо ух ХЛ ує Із Лю бе баг ТІ вм тож ОХ шу АЖ АБ ж Еш м ЕК УМ АЖ ЖАХ МН КЖХ да лу УЖ АВ роки Ж Не ях У ви шо стиску пж и сдлеют дт ск оо в НН НН НИ ко джу фе уких тт чер чи аву Зх всшщж ЗО вес су дао мером ст ас пов зе Ще У зн а і я сени ЛЖно Жоя Жодхсту МЛК дю ЩО я ушу рук Ж хо сук меж СОМ Ака ЗА Хийж Мех бах БЕ Але ЖЖ снах ЛЕ Шеж ЖХвх Ав ух ех тк - Кк су їх Ух Ж щ:
СО То ТТ с
МОМ сжоуух ом уж уже схожу схо сп Ж хм їжу мову ФфІМх пк жк о охо КЕ те. В с зі шм си заг ша ша вим пе па сах За ко ач Ха Сас ще ях зе а сб зо ах ска в ше пас зас зоб щи пФ ВЕ КдоО ху х
Жах Ск ох Щиеу. ше ок аж еко Тем АЖ Ух лок Ки хо ую ск ди
Мет пів без їх йкЕя Бе хх Беж дао Бар о їжМих дів Уві жук хшж мВ хх хх ще я У шу пут: вч жом. де Би о «чик о фр Вк сажіх Бук ах Фо ожчижжх ВОМ о сх ЕХ шо ВІВ яко оси ще КО жч х а оо хх що Еш саи що есе х ЗЕ ех ха що бик ходу 3 шо (3 я фо Коуує (5 Живко сх Фрі Соя Мб ФІЗ їх ЖММах ах дів дис ажю Ні маш шжежЖ КИ НІВ зе Ер шеЕ ТуУХ ї ке ці ш ме АС соту ук мах се КИ ОМ «ауто Бо «є му фе дує м их том ем Му дув пу с чу зап ха очах сс с ще вес ис сКМих Вік ТЕ
Пожежу ух М їх аж в бохо ХХ Жах їж дух
ТУЮ ЖтВ БУ ів ожЕт ККУ Ве: Ув3 жа тва сдаж ВЕ їх хх
Коко ек у в з й ел Ух їй пз 135 ве ях. ях хр пгт век МІК ой 0 БЕК УчХМа ПОЛА сеуехатн
КИ
ХВ ж Сорт упумиа етх ж ту Сухе «диня -михажична МмоОМлУТвуУкКІВ ем, у ложу «лим 5 пі п с їх МА сі аю сі в сах хх Ух б Мету сік Ж їА ОО ЄВА ЗАМ ма о УДаО ії ХМВХ сою а МР УВА ву ЗшЖшЖ ХО сш да 1 Кк ч-ж чо 3 я ке А
Маму» сх чом і мух ау хм щі шухм її мо Ячум о Зб Ехо то уже КТ жа беж зижЖ ша мул ов ОжшЖж Буш УЖ Яма ВК Смеж ж мл Сже ЛЕ ос Ку Ж їх ро зл
ХУ КЕ Я чу ую ще шо ст же Зх жк фл Ж А шк бле (У ЇЖЕ у акт сі їу СМ Мф хи мам маш Же УВА ВК ов Аа ЖЕФ шу мА шаеУ ММ АБ Еш ше я де ак
ЗУ я 5 тку у сук ху пре Й де ПА сю у Ям жу бек ків жк как піших е їі ве шує Мі Хе іш Мі тки Джек Ек Атв Кі Тишж ЩИХ;
ХНУ ЖХТю ВІ лю КК ОВО ОЗежЖ ау му длт ож Ух МАВ КАК Ху хе що ро І ме шУ и
Хом І х Жоутек СЕ лугах долу СМ є дошк бе чУМох дтаю ЗМ йткуа Жим я У Може хув'синху двпжоч УВА КИажЖ Мак За АЖЧч вав о хиаж мех Ул Щек жлЕ Ва УЖЕ вх Та ТЕ ТЕХ
Фу У21 2 Ж шугх Мун Жук ЖошуУЄ бохо зах шу усу Со КТ в Хо ках бук ух.
М А мамі Ме АМОр да ФНу мех Бк ва мок АВ У УЖ ку У й 5 с зв
З дану оц Мом філ Фухуз дач іш фена ку; Фо Ми бу (о Ше ж
Ві Ж Баш мав БА шЕХ ЛЛХ бів га КЖХЮ ше ТуЖ ТЕ шов ке Яр «м м «хх
БЕ АТ ОА
Же о Жеру і У їз ває зом пк рік тА м бр
Те Ех Мо У ЛЮ КМ АФК О АМ ЖЕ їпЕ УА шк бе т теза
М МВ шк ку я 4 «шійМ Уді хЕ ТЕ ст лу даху ки МНЕ я ж рих суті смаку ик
ТАКИ ЦЕМУучнХ ЗИСК КО усе «ЕТ тю схахдю ді дя «ша МЕНЕ иа
Кан
«вх Єсдиюча поси дивНнУсеь
ШетЕ лук хх ІЧ х ож Я ки «вою ЗИ соєю сек уст скімлу сих де мию УЄШ вуєтию вже о емо фесту поміж моді ДНО тую во ри ад ста я са ост ри зт ск БО ще ча щи пещ осеу ме ЗУ ее о аю. би жду ж мон пд МТ жу хх ж а Мк оса ог Ду З ах п пів Уві Сів дев о Увь щібз ак шує Аза із та Буш жа РЕО паж о Вуа х х а сх х я вн Мо я фол же ню мому жах фімух жЖосутх уткох шує фу вмч помах о шим фу пюдтую утихуя дух Кк пд ЕХ ДНЯ КО КЕН зи оди щи шк Ос Ме МИ вшс це ав У роя Х-8 о Жожую хм їх по ЖОшжцм Жоутх Ло де шк ж Ж ує За Зк бує Зх. Ж
Хе Фаї Пе5 сві Бех Сов Без іа йвк піт Тук ТЕЖ Ве ТВК 51 КУХ зв з за «М ой Кок ку СА меху МІЖ ях ЄЕК си ж л. Фжехв що же а гущу М уко хе кає зт сш ох Я соч сад щмш Є що сча я со ЗУ Меч вк же
Тмжжже Жак БК м тих чі щохах БІК ото щем у Ж Ук Аллу За сі сб мм їтж Мет мів же Уві вжЖщ А Аса т іш м У ВеБ ща кю Уж зв «в 45 учи тис дб дн п сх ва и Же вовни Кв св солні вия Ж ХУ ща ще ал кмх СЕ ФК З ще ж Во У хи жа у Ва УК ОВ я Мн Ж хе жк тех ож ЖЖ уж Же УМО ю жк ру ух у я ким
Зі ЖЕв Лів ав КО (ЩЕ Бек обиж ОеЕ ШМК Алв ТУХ ів ів М Тех щі З щ скат се ВоОМТ ска соч МКУ в фемт сво вч Бо ще вн вва шее Кве А пев жа му тп ня т ас є шем ам Ме ж ша ану Ве ср хо КІ 3 У Жак щих ХМ сфруух о Медщам СО Ею о Дек Же фр без Му Му фам й Хек пі ШіУ рі Уві ТВ Ме ТБ Бе бо їТвБху Бас ТбВх Бех Тв дів Беє па ЗВ Як Ще 3 сек ж, мч - їй г ні . « 7. г. Я їх со. Є Є ща с КЕ Ех пфснт рокі сжебчм: фежиє щі ож же они сеелуєс вдає дрож жу су С А з авспотаЗ с ач заз сс аа Се Чай час с зе ща Сас вве ще я
Шо я МЖошмив Км Во Жоже беж Кк я Жити ХЕ тк може жу птах
ВЕУ бим ЗИ шик пе ММ ж Зх Др Оле ІМ зм УА У УК В се до щи п ща реко ус сл ем ІМЯ КАМ о сужжЖж о сю ВО кожух же, «шу Же ошуєюух МЛМ сере ЗК що вав сах па оч Мо о са и бЯш си Бах ке що БУК як В
М то Жак Ж Ще їх оке Жбоуд жах ЩІ їх бух бю ке боуу ШУ лу Ж Же ій АХ ОТ АЖ жу УК АК ЗМО ТЕС Бо-Ж же АЖу шу це Ви кт ех Б 1 105 КЕ дж Вера джур гам ЖУК Ю схіімо «Уж дв дб еме жк Вус ху ли ех ра у сн ЗМ Жежуха Ме вах І качаю ТД су жк хе Мом оду КУ во ХУ же бух
Тую Тк Біж Зав сту ТЕ Бео бві Те стві Бех бах ж хо хв жа ЩО ять лу
КВ хх ку ха хоЖе шия Мах тк МЕ
Жди ТАКА кі у ПЕкочна гелі тут ше
Код их МКК Ск ХЕ Мк. Ме м ЖЕ
КЕНЕ шли тпоржрукмініві Кз вррууї В
Коди еМмихчниви ЖОМУ КЕКВ
АК ЛЕ сх ж і вмій ум бід фа кт и ри З та до Жук Ж
МУК ЖУК ХМК АЮ ЖК Хелм ЗАД МАВ ММ УМХ мух Бе я ЖЕ А лу - ке кл -х
Ї я ТО КО яко тжщ о болі ЩЕ ду й фах ЗК ки Жах. Бус ром ЗУКуна ЖК ЖК Жах о Мохоже ех Уві сЗув о бві Беж су ЗЕ їв бу Бі Жук Жвж бе ЗБЕ БЕЖ ЖУХ хх те Бо о я М жебуаши жом ЛЕ Фах ЖЕ Ж ве й ОВУ дачі ак тую и хи Жодту ЖЕ Мак кує
Ху Мас Ні їжЖв Уві Бе ав вія БЕЗ слу Зав шу Бер ша Єегв оМаЄ -к кА хх ех щх я
ФУ Пуудючх СС ЛЕ Фе дек с стек Е Жду кн же М м З ТІ Хода МУ ку Те й оз Аа КХхОо ЗАЖ ЗМ ЗМУ ВЕ их В ТУ дів щаіп Буш пе
ЕЕ й ЕК
ФУ ха франіжо ХОМ г. ХК Ук Ви у лу Тс Ше Мо Жак іо М Луки «е-а зіУ й УВА ТВ Мо тах ВЕ Ха» То Шех БЕ 5 Ж Аа ук п т 1 В
Кара Ж Ж ех хоче біду Що жах Коха Жошіею ХЕ хе Ж ж ХА Тут ЛЮлуд Стхтлю
Мек лав це» ес Аха цеб Зк Зеж Мав о беЕ ТВ Віа Єві Теж бек Сух
За я : її ся сх т «її з т. х бли Мао мах ЩІ дугу ів ко ває Мів йфе й йо Нів Ше Жеєс За бек Св йіє Бін» Бай ув ЗЕЩ ОУН Е Ка У жшх ЖК МЖК укр ЖЖ ЖК Уж у МЕ Ех шт жк зх
Ме Ми МАК - : й схо м ж бує Ж (я Ма ж кі фу Там її Же а бух йщуе
КЕ ТЕ можу А млу Їх баки УВІ ТЕХ Уві ех ВЕ
Щі дев 3
МА Ко апр ук, з хх ших І и вх
ХО ДО шк тк Фе
Хо А
ТЕ ума 0 прут жук б урні сов хи ши чия КЛЕМИ ВНАКТЕ слуху хо ут, кеВ мови МЕМ
Кто у і ТЕ кан Комухича пом щевньсть сут їх Кк, с КМ хе У шт «т «НЕ Юля ск ех же до мч пря пдея ст осі ЗО са чої п Зап с се ож а тв з сво ск зу са Моск о ЗО дач З вв зве сс ех 5
АД ЛУ жа Ук Седих і Ек ЩА Жохує октаву тече ТР їх ав ва щіб Сен зві сім Зеж Зі Віа Бі Уві Був цув БЕЗ сі 818 с х Кк х їх і З М 15 г кат ЗЕ ох ви соки Уж живи че У жу х нео ду дм хоч ку сих вуж Кг ЗК ксв «с заз ще оо сло аа опе ож паза хви ве дО аяе че ка У З саше ві тек ша ща сна ох щі сухж (35 стук Че фШро Зук сх ех сг Уві Сей УВА щах бу Був бла Бех бу тУК АЖ Жре тв се тТух "уд жк за о кой и 5 У к су и - гаю мг ння ин НК НН 3. их о доки сову Бушту сук ке фо суди уффтш сю о фже сао с як Ів Киї ВХ. ї1453 че вакч жає кочу Яма че ма щи МК кру ет в: Я - -ко я Оу в ж
Прууж Меик зії 5 беж Заї вки Щі їз Бра біс щі. Жах Зах 23 бЧбеєу Вб її Ме ма КЕ Можщ Бжщ шо лав ЕКО АК ЗАТ АЖ ли щу М ОК за зо «8 х ооосютух що ХЖІЖК, уче ох вд Вщк Ззди фа цдІв БЕХ З жав с вб'с аво сс сава з щу чу вся ав ет Зо ау За шу а о км у сх зх ех хх с хижі х ж АН п пк ЄВ: де їт.ь ів щу Мйіє біз б теє ав реє вт Хан Там: б Мех
Її КЕ КК ав ОБЖ піз ах ПІ ж оАМ ХЕ МОВ Т УЖ ВА му вн Бл 7 т Кк ж ща па Б зи зас що ж воб ага зоб аву зас вопз бос зе ззо зов оп бю 242 ча Зас спа чо зма чо о ще За ВИЗ мк Зло Я сх поко по Кж ож, хо о йки ке ки бе см бак Мем Фе жк Ак мух щІіп сІЖ ха ві їн Мет Те ха вив їйг Бек о їпх Щек ЇВ лів Ух ж т т у «УК 2 ще 15 Те що ке ; . топа суду при у ково вовк вк 5 рез ни приви охІжех хи суд КЕ сханх цем о ви щих паї га де ках КК зі ща си зи хі У же щи см сх Зп у 5 й ШО же У г го ла стдчи Стаж сопе Ши кох щомує ЖК У жо г спе сияуве (ТАЖ
Мет пін ем жЖек Аж Без вх ех йо дк Тв дів ба жук тек щШУх г ГхЖЯ 5 ЗИ ще . ке 5 я 5 пеки ком В хх» а суєти хвиж мкм схлув ФУ ох ом туди ох оч фе "ж Бору му КІ чаї ЗЕ зо ве «Фах па оєвше ом осм оса о ЖамІх Кошик о ЕНХ зб оо КО се х 7 щі : х пк що шк що с 2 я ик й й ек Кеті Щі Хек Кжух ЩО Єеух бек ди у Чбек беж; і йкеа Ще іа Ак вАщЕ о Мів СУ Бех ах Вів ББе Тв о Хек ТуУужЖ ТЇкв пі Бе Ав 7 -х ху «тр хх
АЦе А ДЕ
У : : пе жо феджеу о смужок п ех сх ФК іх сві Б ітх дке ЗЕ ках с си се чик зо сс Зо ваб ча бо пах сук б ші ж ах Має Мн ЗІ Вр її бе б
УУЕ ЖЕ УЖ ЗА БУ ЖЖ мм Уа ЖВЕ Удь ХЕ БЕ т: МЖМ сяк я
І хо «Еш АВ се и «ух
АКА сх туухУ
КАХ мА
Ку УКіддох хи мк дк м (1 чех «КАХ ПТУЗНА ЛеСЛМВМАУКЕ «рр сим «Кай» Сиве ачнЕ КОНСТВукнія «дувутує «зи «а ОБ Уя с с с ср с -х. 4 с ж п тиж бах кт ПЕ В плн дам штанів лу шу й м й в ща хв тах хажо ЖЖ ск В ща Уж мап ом ха б ЗХ маму ЗА МАВ ох му зе ХХ мА МА : в їй Не
Си Що да з срекх КК хх жу хо Хай В межи Мн ТУ так; «ЕМ ка сх йек баії був уді аж Ста Був ВІЗ Бе ШЕУ ТУЮ ЖВЕ ВІ ТВ осі УЖЕ ох ск веж ко Го ме
Пузию Ще ЩО шо ие ох фе ТІ жх, ХО Жир и ЕТО Гах Жах ст бух хо:
Тек Меї Мі Тхо ЗМеаЗ джу ій АІВ же хів ів сі зма Біб те Ме й хі ах х ве ЖИ а г ки своею а щі жа Ех шодо М Фе флт нтию ХУ Ж лю Жижх іч жжерв Кі ва БЕ БІВ бе Бау сі ЖЕ ав ОТЖЕ йіЗ Му Душ же де ше " -х " ве Й ТМ
Ж дя Ж жи тот ДУ уява МО Жди жо о ДЗ дю Маю бик М Ж ОХ СИ пів пів Зк Уві Жря Мес хне хз бажаю їБЕ ех тм йеЕ ТВ Віз Ух «В й з В
ЗЕкна вт Ж ою дк ю аж им фен ан Ко х я ММ КО що базу Лу сі кщ мес ув оечи БЕК Аж МБеб й Бех дав Баю ХМжЖ лів Хща жук хе ув я зв ак ої Лук з паб Шо, Є сих Пожиз Мою Фу у. и Сх, се ЕК; м пе ха, МУ; лу. ї М хх хе и т ох и У м м. Фо ЧК м г. я, Є. ла віч АВ Ма за вах вч паз Ба ткж ЖЕ ЖЖ їх сБА1 п БчЕ тв лк з А
А хи Ек
Пана Ж дя, Ж ою у БЖ зх. ММ Жду 13 ж дон ХХ с
Тує бктю БУ ік шоу ЗТ Юа» Мах ТЕ ді ШЕ дех о «уд отк Ех
Людини я «лів п таж
Мод «ОК слузсик уд хуя» МНЕ жала ЦЕжчЧчНВ МІСНІ Е мим «й МЕ КВ хиаї МЕКСЕЗ «аа» кеш Щи цУЮЧИЕ ПпЮшДЕДиВиИТЕ як ОХ іди
Тек КМ ек ЕТ
МАН пух
ЗКУ АХ сови ве жиє ЖЖ вуаюу уж вх ФУ ЖУКТЮ сви фути жуки ою мому лм сжексю Кфумах й
КК -Е їх гу ОЇ ТК Я - ЕІ ех З Кк ж я шк Зх сиУХ Я їх сю ж у Кут ЩО ЖЖ У ху ХУ кох Зах живу Ж В Ж со умо Ук ЖУК У х ща ва Зх фев УВО Біб Бех ЗіЖ ів за УК бе Ве ЖЖ Еш Яка се х я 3 хх КУ 5 КІ фон СЕУ сжмолю ух мм мужа жо Жеажуих зму вим сУжУх ОО Жеор, уєтх жує ккіх уФфуєуУ ШОщИх ТУ косе а дам ср бле ас За зе Беж спла бе зн ще ЗпОо ре сво З е жк ох жи нн сн соді СМ Мекаще ЗУМ Ух «Ж УЮ ак Ж до Ух їй ві сив ші ШВК Сеж мтв Біва беж шу Тс ТВх Вде тв Ба ТУ ох хе чх хм - в
За ша сви Зонх Уе ср озхіха мов сх ШЕ пив ак пох ее в жи фоскою вх Я «ак Бе о су ще жом сему шок Кс що ау зу сю а Кк У ЕТ
Ліка фай їх шо кі ХХ щоутю 1 я Ж о Жим 0 хв бла ММК їх а у Мк
Тих Ме Бі« ТЕВБ УВА Ах б ІВ Бо пі БУ сБХУ іо БУМ яке я до. їх Са
ХХ ак Зх тех фр др сени УЗ дж ща КВ спо во ще кажи моз щих БЕ ОХ ча п вис о щеК ск се хм ях щи ви аа КУЄ чЧев о се а ех же т оду Медок КО ж «Ух ох Сени Ло жя Ше пф Фехею, Т дже Ох яю я СК Якою
Піж Тв її бай жк ча ех щі Біб ТБх Жваи ТЕЖ Вів я фу ЕТ що ва с
З МІ -К у г ї с суч с. счия сх су птшюрж о сежум хе кАх сжкх о щзиа Ж хжо музу сої щи маю фоутх ому? сфжуух щит ссжтеІю Біт Заг --к ши У ем ЗМУ Ак ж у ше М Ж Ну ВЕД Мо дИХ ша ша г сет км тА же дик СМ охлмху йо км бр стук о Фезу бю Ба тек пів Бі АкО Уві ТЕ Мек лЕжЖ дез Дар ТВ Щек отТажх щек ЖМме бів ЖЕ сх Ук сек сок їх ю т що
Мі жів ШУЙ міх кож ти ХЕ ЖАН гару сивіє щи мМ му сет а вад КІ зах
ВК тА У Ж ШУМ ВМО т зво чваж зом чих и Ас Ве еп ца о. ск Шлшко Жде. о жи Ж жде х о ех х Ж У Б» я Оу, межи
Ме щі ем жк Бк Сем Ах Щек ев Ер їв Айва УВА Хуж Бук ся ло пло п т щКх Ел
З Я Б сет пхежо КО чо фр ЖІ о тмжЖж сво жі рурут жи біз Свеувк єю ОВО гр 35 чив ча чес са ЗК КК сх ям БК ОБ м шас Б Я БЕ Ах ХА по ще бе Іі ж фр буд щу Еощо рНах сб бурю баки сббжау 4015 дах й кіз Бжс аз я Біт пек Ажу біз ЯВе їхв о де теж тив і пе АБЕ зо5х зн пл
МО др Те де убив жук сем СИ. схожує см ажо ужих хау вро Яеуєух мк ех
ХлЕКО Ж БІО ана ЖК Ему ХХ М МО Фр ХНАяХ У «Ж жах т ще м, с Бан Ед ам ХК Же жук яю КЕ «аж З л
ТЕ жЕвБ щі Бі БЕ Тв пав УВІ тах Мо) мах ЗЕ
ЮК Кк ше хх лм я М
ЖК ІУЙ ЖЖ
У ло яру
КА ЛоОЖУТУ «па ПЕТ
КЕ Тек жкУ кт ух Кк. УКЛ МК яд км шжучна подану
КЕ як сЛЖЮ гедхдемк ик паху же КБУ ИЧНЕ КОВО УКкия
Лу лЕ ам М аж З сш їх Мав ск зл а Ай фа бек бек сю піт Мел ій ів Ма сій ек плу вів ів Уа вуз Бу вхо зу І т З її 15 се п У ех сит йо Суши ж ши . ще по жу мах уки рах хкх ну ОС Ж кю 0 ТК ей ча бла Заі Беж се Ммиж дів ще Бр тек жиЕ бБе жвж шує тує а Ж ЗО я. пс ТИВ. з А я Сук дк Хі р мя у Як 2 с я о я рю - м У М юю -3 хх їх і а її и Ту ух, е ох Ж хх дуть Же й. їм м х. ке ех ху шах м КВ МВ МЕЧ В від Ка є ХА ОК ї У вам Ам ЖЕ Мах
Ух л ах
Мх Я г ху ку Ж шк Ма кю М Ух їх Кк хх ке іх Ж Ук Тут МК, аю хо тів ба Без дув бе Біб ш3іу Хв а хек Аза сі фу ВРХ шк шк щх «В Нео зи
ТУ Кл язик жо ще Мах б ж домиу ух тю бах ж сивою В коофрнах оо Вуж пів сіу ка УЖ Те Ме ТВЖ вка вже її дах тнж дек ЗБЖ вів ЗУЄ
ВЕ ЕН М що й Ки жи Томи уки Вк, т още под склу Кох буде Су є Й ХК жо ТІ теку ах
МеБ КИ Ме) вже йке іо Аже Жек йже Зв тах Ба ві є Тук ух ще що -х
З У
Зоо фут ши ЩЕ жи ра Шк Блюрх ЩЕ ДТЕК «га Мк аю Кк У ях
Аіз вкт вар НІВ СЕУ Зеж ка Мі бе бхв БЖ ТЖЮ ТЕ Бі Бе Яво чл хі Зх лу МК ям стіхсюо Моєму. ВЗ Ек: ТИЛ ФУ рах ру пошу ДИ Ку ж Зфшую що їук ЖЕБв БЕ зла зЕУ ТВж без бах БЕ Чві Бек Бех
ВІЗ ІїЩІ сх вух «з
ХМК ВК шах З т Саня шу раю 0 ЖК
Ах ДАТЕВО тах Ук меїжи я уУхожучт хр пе «их пеУчнАа ПОСЛІДОВНО ТЬ
СОУ ками
СЕУ Ту Зк уси ие д хай» МЕЕЦЕХ ли
ТОЖ я
ШОУ ту по ке кет жука мк,
Кожен их АМКУ МОСК КТ ю клю їх Ка в МТ ТЕ ува сх: Ол ам КА щи хіЯн ет кеш жу зу сх он не НН о Но НУ шусдоатчт о еЙ жжижу тех К паечо що св МІ Зі оз он зна щи сх ще вах вве ше з Зк паю аж Кк жави ЖІ й ню іх у и У Жуки Жук Жах Кл М
ЖАЛЮ УЖ МАЛЕ ще УЖ -еїь БЕ ЗЕ дов са ва ве Був Же шу АВ - х т сю Й я ї хх ТІ Ол дме кави ско іх мор же пла ми фо сію Фешуєт де кофе ЖКиучу у ух ща
ХЛА З Кз с В че М Ме ах КУЄ ех щі са Зее ек ви Кл Ма З дю ЖЕ лою джу Форт сб бою М Кан кю Мк юю В ще Щек. ючи ївх Уві СУБ бві бек су був Ві дех біб бук фБж Ве жнж мех Хух як хв як ще кл У вк ож пе ча З шеа шеф чо Ко кх чи сах ще а за З ах їх - я Я СК Б КЗ і вок 5 ху суха кн ко в пет ж Мо Шеф чу гу У томі сеча у ук їух Жеї Мміз Тхр УВІ Аж бік ліз БЕО полу ФУ БА БЕ ба Же Ме ск їх хх, о чу зу схе се шию жк я зом до у ск пжежж ла жи о сви зро Же Жуки муж о си її ух ча спа вт ас аК сеча Зо са Коб дов се свт са оз й ва ЕЕ ІЗЕ гія жи із й фев, їх Жах хо Фруюм сб вом був КЗ до ях Хо п ЖЖ Іде А БЕЖ с аж АВ БЕ ЖАХ МН тжХх Бій щі Буш БЕ щи За ге зок пе де тах ВІ; дб вдос виш час веЗ ис во вий дос нер йде Ех см СЯЄ Бр хх ти м ве час вич ик вес ко яся шко хи
Ж У Ж М зх тик жк ат жи Кущ Можеху Жуєрка хюх сфе МК бху Жан хЖа 0 мух. іп Зі вх Ма о ТБи Мей ТБж яка Аввотах Беж ХВБх дек Жаж У Те пд «чу ек пк з ях х «їх са соб щЗзс ва сЗ вп леї заз зво во сп зе БВ ХвоО бле зад ка ча са Ум зач су ва хи се яво во о За КК Св ях У
Жим жи я лоджія нею ох бом ож о Мине М КЗ ЛЕКАЛ бр каю Жутгує брат
МК сш ме ще Вч вжи Бк ше ЗУ де ла БоЗ ува жЕЖ шк уж хо що о хх З ща схе жу см ВО гум о шк в Мк муж Моїх Жде Бум си ВВ о м УзЕ веЗ 5 в вам а ах ках Я І ох ща сх ме ж Я шо ее БУ ЇХ м МЕМ Ах с ї хіх зиж о й Ще її лу Шен Мі Хром Мах Можу Мал ббкжі Мі: их; хх хів вх Ап Ба паж ех Бо нів ББе тов Бех беж сх осі пе ляВ т ВЕ чик тлі щи ЖК МАК вд нн НН В НН НА НН лджрт ьо ша с: спав с впшс с сок воб ЧУ и вих ЯК
Таку сб: сх ха їх бу ХХ їй ц бу. 37 Жмуу бух їУК Тхв ЗА МАЄ СЕУ Тавх ес» УВА Твх б щех деЕ дя й зх
М ММ шеху ж г, - рах хана МЕ хх «а ких ДЖ я тет со Ку З
З юю Хек пкт еч тк ж чех щежчжа посадову педту дя «ШЕ я Ух, гід отит перці
Ши нм м І В а Ко «а т чних їлВ пое жері гі таку Мих аж 3 й сім щі бою бо бу іх» Щі
МАТ Ж ХАЙ АБО МОУ АЛ ХА ШЖ АЕС іч Уві буж ШЕ ЖЕ УХА ЛЕ х х тк КЕ
А -х хм ж «бух, т Ху ххх Мая лах у, хх іх «. ме ДЕ ах МЕЖ Жічат бУМех ов ех їж ЗБ У У ща ОшЖ СУ Ом АВ ОМ Х 3 ШОКУ Сл Бе ТвЕ Баш т ТЕ ск «Кк а «А «І ди зиаж б МА мо Уж ую 4-2 дом ЕХ. як дже те г ХХ Її 03 ев КЕ їтбк Же Бі тхт Уві ак ій Біда шко Ху ів Беж бл із КЕ Жах зю КУ м що 45
Стою б ПК дош Шу ТЗ (3 и о Жфоух ЛЗкухт Мо бу В мм олово хх па хв лів Бак Бо Зій БУ ді Бех СпК Аве Тк пів щі Муз наш - За Б т ХХ Ха цс ММ А М Моск ох ЗУ о Мох жо МУМюМою фу б Му ші ЗІ Ах Зах жах Ме Те Вх3 Бер сп Бех ТИЖ хз Твх хаі Ех ки «гу з щу
Ба це 15 що жк й ся - Фі Синя о божа Кк Фшси Ак ог Ми о М жк би шк
Мет ів вес хею Вк Бер ВЕ Бек Біб вБзв жнж йів Май сржЖ Зую Су
Ох фаза ТЕ м Тк аю Кее пох УМ бж Її ко ах й их Зм се х ле МЕ « АВЮ В їхАш лиш ОЖе Вл БП жЖш св МК УК о ї ЖЕ па Ваш -д чаї я жу їх їп5 її сту Збазиж сл М жа Жфуує тую ХК Же їй бує ае
КЖЖЕ УЖЕ АЖ АВ мА їй Ма А УМХ Уч ЕК НЕ тк зи
Кок КМ су - а «ЕВ ЛЮ уж
ЕХ ІЕЕ ж мк «жах дик очи Жовтих УК им Ух хх штучна МОЛОКА ХЕ «ак
КЕ с т В стики МЕЖІ
Ух
М п хх ХтнуУЮУи УМ Щі «Ух ях ДОМОХАУИчеМЕ ЗІМММЖА КВ МК М МИ ул ляу їх Ех
КК ЖАХ яю 3 се ку вк пул ду
КОХ АХ сову их хви уеїе фе вхщив Ба суувтє укр ох суки ОК ДУ до та укулуя пут Я паро са м во ож ря ХК Ж БАК БУ що ОЯ КАМ ФУ що їх т жу Щи СК ит т одутя ТІК сто Ел Олю (лу ХХ Ж хх «ха: уж я Ха с шатах Аль се УШЩХ БВ СБжю С У вів Бі Уві х Ух У ЕКО ЗаУ від - - їж 3 Е 4 ве з М тощо уеохж о пове жах Деилрє есуюч сво оси Фей о фрою орех фут фе фжто сюдтоє ожуедех боже. Зк
КО роя с же. І НН ще жа щи Кк кі шк ви ще о вие ЩЕ ЖК хе сдах ХУ Хом Емо душею гі Кох СА що доме 83 хе ам ж бак ках ЕТ хх ур тат стві уж УВА ет Сх Був Зла ах Бі сек аж же жтмих су ук па лу пл кі ко КН їощоі шкі тк їз ту джем хтеуді стік сут тий сУщрії СІК ТХ ЖЕ п-поужхдоу фею ще ех 384 кв В ша іщЯя чжО ба СВ ЗУ ше чпщча ква не ке Уа Б ач «Улеш бау МІ ту и фктау АОС що Ши т хи жу ТЕ хи Ж кру; «3 Чек ух хг
ЇЧЕ ВЕ Мун Тхв УВЕ вка йзій дів Бжб Зіш зіз ЗУ Беб дбав Жхюо мех
Бя її КЕ
Зх 0 «ВЕ меж о їж иЖ щем моих жа хе Уж си УК о щих шоу 2 ДЮ жу У хи оч хо пече сені Бо вас ос пава ох З ЕЕ тк вив ввО КЕ ща па а шк КК і ву Ж й М С -о Жаую о т ку ку п ж шує зу ЩІ пи ех Жах МОХ щАіУ кое ка ша БЖОо ЗОЗ Щщех Фе Беж тв За був аа а тв я
Ме Я їх сх А ще сану (щи йомі Зх во в веж вику чаш вом; МОЄ вс вас вив че ба ай чЕмж зи ва желе жу а см ви С Зо зас о аса чо Мак хе їх Ж Ж кт Я тку м о ще Ж ку Му ву бузу Ма Бек Же 3 до те ше Ж лк УВА КВ мех Ж Ах щи ХХ хх аж хви Зла А КуУХ
КЕ х жк М
В о т ща щук жу ехвіш суквиМ ЖЖ сб свт Бе (жде рії щи же о суфрує фо фФещую су уй» ча ко ам шк Во шк мс вл ек мм жу я жк о 5-5 Бак са че КЕ зміни 13 хіх Же бо Хе хм о бак лі Кв ск Мід и бе беж гохе
МЕ їхА В лм хи Ж мах ЗжМ АК аж їхАВ влюЮ о хмЖ хів Уві З у Ух МУ кг гг ЗЕ зо з сеуу пу сф У кри Во сю су кам фут; баз оду Жили чо Во уухе ха зе зща зві сво ак Ск пе вх Мах с ще Кз сце За ЕК о заК 55 що ще оду «ож Ії ау их Ям їх ббоусжу Ям сх уУ уж Її Е Ук ому дів ВжЖа др нів біб пах дже Мів Ве Її йдех тує Тк ЗУ ЕВ дав пи «ща кт
ММ Мих МИ тато фут оУулуУтУТ (З г дрзух уж и УМ» дух оф чує дж» ШУ кВ Є сф св Є Ввос шерочє веб сх поко втх ве «вті він ак у А у ще Ж ощуії що рую 1 жим Ж я
КУух же А У Хміль їхАш ЗЛАХ ам ЗА ХИХ ММ ЖЕ ОК уз тт
АХ шк «пл ЗАД
ТАК АХ ки шу я хуй м хх їж ши хуя «жох
Бак чКЯ МУ си ик 00 Пуха супро сек коти
КОКО МКМ ХК МІК М хе
ККД пот тр Фунт еру тиж 0 мМимщтеХшчНнЕ КеНВОеКрУя сн тах «ам У
Ул, хащі вах Мем юку їх Фа ЕТ х йо уж дж Ж ех Ху Жианию СХ ук сій ож Кава Бем а са Щек біш бла М Уа Ку БУ жа щу Іі
В т кп Й х
А -х я В сш ХР Толя ВА Жива ск бок З о бу 033 шк бок Мах ТЕ Ме ую ак бах МОЇ бує Мах ек сСув Ме ва беж лі Жух ТИЖ пре ТЕ БУ ТЕЖ ку тік З:
КЕ В за
Бару Ваше ЗТ с Се З щої 0 Же й п жан ВУ дю ж хг хх У пою щу зе їжи Має Ків СЕ баі ах пів діа Вжа Суб спів Біб Бевз бій ТкКОо Мах зи хх за
Я Зо За дхлсьуи Кочую Ку у рути Кох Фк МУ я Мухи Ук божейм о жхлю ОО я ТК я боках ХУ их у КЕ КО Е А лАО Бу ша Беж п Х щек их бат жи МІВ му що КІМ: т шк Фо п Й
ЗХ ХХ щу іа фак ж ла ва ух М Жуту Ще ЖЕ бі МКУ брухж Шерюо Я во бу
Зв бут ВХ Уві ТБ Ме се аку БевоТвВеЕ ВЕЖ Тах ех ТБЖ бів Тую ги тех чи щх ва т Є МІХ до ЖК Фішка Жикю божі Ве бохо тра Вуж сію В оїх ї3К Я бу Молю п кас щі: ео шах Беж Сей еф Бех зум вве хпх па Уві ВЕ Хук Уже щи пи Зк
ЖЕ щи Ух о СК оюжих се ж УТ кк Ж аю о ож ЩЕ Крах Че Іжа бббуєсжи ЯМ сетер ОДЕХ хх ків вка Ав щі пі беж вху Нів ВБе Тр БЖ ТуХ ТЕР БІ ВБИВ яв дов як а
НК МУ КАК сире. ВК жт сх жу ЖЕ т кох жо У х. тиж ж Кх. еко тук жкхв піФ шов зі та бе Уві ЖЖ в) Хнах вх
І т КЕ хв
МАХ Км жо за
КК УА
«вії» ЗЕ ста ві ди МА х
М Ж НЕЕ РОКОМ ХУ
СУ УК ох
НУ чел «дже МЕ» скажу ок
ЖЖ МОЗМ ЖЖУЧВ УМ ХІМ ХК мі ххх пвх
ХОЖЖТХ ЕК хи КОЖ «апа 181 сх у Уєтоу сжУеж ту ук му деож ужмусу кому жтк КУ ОК ная ке диких й свт кт са сб дов свч ет фр одех Оу поту веж заф соб (фо дою 18 жо дж шує з с Ех Хом ж ОТ ще У Ук Хоххю сух бжим Иа Ж пів тай! ЗІБ їеш УБЕ чів Бех пі ів під ві беж БУ ка Зі Зав ї 5 о 5 жі жк мор стках фею Боже» до ср ви па Бору пух Вжот щих ме бах Зх
ШМК З еЗ рЕжнем ШИ ОХлКе Ва ши ще з6щЗа о гаю сх Кл вому ще се І екю Ж Ж оку ХІН дум буд СПА ПК щ. - ЖЕ и рн МЕ о Жхфюх Му ЖК Ку Пт у шеЕ ВО ж о жеМ МК еЖ жив А ше АЖ КТК шви Ве УЖ му ух ж в За оду УК уж щу СБучеж ке тежою хору сухих же тир гещоу Ук до охо Жито щ ча ас ЗБ сао Сх ач сла с щисо сс зів гав ЗУ ЕЕ чав КЗ я Аа
Хе Мщк Мов бе а же р Ж що бжелу іх хх бом іх ту Мдж
ТУх Ме хх Теж Узі йхв ОМ Дів Вже сіб БА Біт Беца н МЕ щ ах а кп я І
Я М БУ кут го у прішф жк. фещиж дюиж жу стек де: зда оку ЯМОмеюи шоп щоки содхх ве ав сш І аво ше Є вч ач ЧУ - ща вола ве ах а дО ЕХ шк ле
КІТ же Жах блуд їхжех М о са Вк ж нм бик бі. тіж хм ке паю ЖБК АЮ шЕЖ БЖ ау МАХ лММ ОК мВ АЖ УМ КК ст 55 и же ТЕХ щи пає сни ЗВ щї Вб щЇє ос Звй за во саше вою аа всв пе Бах -х а п кеч счщ зЗщ ЩО вощч вв ах З ща ВО хе М бо вив о ко Ме У сх Асжа кожи шко зх ска од Жодажу СТ шу ВМ ох спазм помре хх м пи ЗіЖ вхо У ТВЕ жеї ТБЖ ау БшО ТЗх ех МОК еЕ жи Мхаі ТУ за т ща
ХУ Бо НЕ М - КОН уч кю жах Жак жефіІЖ о му ФУ о мови жу пути ухум дужки м жіщох яеоау с жів сн ха жах Кок ощОох ще бах чех зво ва с зо са хай сце ККУ аж М хо Фуко ЖнУув о Тахіс Моно Ву вт Мих жЖву кі що В смагже тух йз
Мей ЗіБ Без шех ек їн) Аз ех Бе йо Тих Аз ві Жую УЖ СПУ се пт ща
Ех Мо ХО сти м ле шуй деку фе или ру ж «до віл фшеже Се фе тд Ве ЖеОо пк ча чт вче шик са зо сеЕ сек шах Вже же сш ке ск м жк де Же
Ст. Порт Ж хх ТІ Є у шк ш- Жам В в ОТЕ ми. Ху соки ЯМужу Ж у ВК Сто вів веч хат нів і беж Бжа пів ББе Тк; одах ТуЖ Тхв о сАЖ КЖБеа дер хом з жи
ММ АЛЕ. МАМ зе не а пвКме фот мує уж жеомх отут оту и фу я яку так ча щас св си вк с щиЄє вел щи Щи Ок іє усю пу ту В дя. Ж км яю жк Ми. пф Ка сщешдю вух.
ТУ жЖЕвошет зів ЗКУ ТвЕ таб Уві Те УВА Бек беж «ях пов
Ех в
Я ву КЕ «жа 5 Е ку гуд «ШРІ п
АСК тк читуме
АХ МЕ юку ЦінземіІум жуків жк ех хви 0 НЕ чЕІ ХСН
У гу «ЕМ
ХП т шк гук ах стук
Ж чюжМитНвхма КИ шиАМ ха ах бах її ко їх ві іх Шок ім Ах Щім Св гай бе бух Щіє дів полі за шал омше Ух Бак о зу паж шов ВА Мей МЕ ВХ щАШЖ І
Б 5 хх ке
Х р Кк ко се я Ж хи ТЯ ую їх М не М о дя Ж шу лиш МУ Жорукуа ЖЧНрею ЖХ ох бал бек Уві хв Уа ек бе Беж дов ек аж УЖ ТЕБЕ ЖВеа Тв Бауу ШЖЕ
За хе З й хх ху ю схутує В а мо пе «и ше «В до хана лу г жу кт Хнуху 8 бу Ме
ТУук Ме нів тТжев Уві Аж сля Аів вео і Фіп мБіюЮ дев ЗА тхе Мех щи ек ве 35 ЕЕ Я
ТХіх жи іш ба бек і бе Хі Мі ЖевУ йно Жию ві Міє їм і
УА ЖЕ аж ЛЕО КК САМ сНеЮ ху сАЮ МУ ДЖЕК жюма їаю зу жшпеЕ ек ки ех пк це г
З и ТУ
Ті кю ж ху нн Тк ЖЖ м Ву е ОМ м уию ахі Жек Ще ср шШуум ска їх чук шлаїю су вхо Аля МІ жи ка Ак М йог КЕ ЕХ СЮ Ве о Зві 7 Ж а Ух хх м
Гн Я Тх ЗО фею. Ал х «ду уже. Томах о леку. боже ме Жх п х жу УВУ сур Му
Ме сли лем дих ех лей да ех взш зю сих Ав У беж Теж Су ще З жо Хом ак з ХО «ху жо Йов що Жим я с собу атУї Кж поса кій й КУ же За жав мшХ Ж мл ХЛ КЕ ХХ АК В су КпЕе але злих чув 4
КУ ке КВ
Жуки ле У кі жи их Я Моя жу «ххх т х їх же їх ух хи зу та Хр Жах ххщї то
ХЖж УЖЕ ОКУ бій пі Жах ба Уві КНж Уа Беж дах -«х кох
А 120 жу чу ке ад сук ж пу ви гео шлю пл
КА Ж ММ
«ск еееж тт струє й рук су чі Че учмиа лпюшнлУнисе мг
КЕ кожи пек ди ом
ХУ ши сок МЕ сту уки хи т ме шШоиомауУхух пух У мим жк с
Хай ож 0 МЛИЖУЖМЯ ТІЛО НАСК дату з ау
Кок их ТЕХ» г «апйж 183 у уми зом сек ж Уха М ЖЕ ам жив дви ух Мои мода си схе ж хх пор ке свт ссжр от св бл ср ж сах пбороаедх заф осот су дою 48
Фі джеж ТЕ Сх, Хосе Ж Ск Фах ок У ке У Хто Хо ж Фужих ЖЖ Ж пів Ул сік беб тя сіб ех БЖ ів б УА фа Був хо Бі дув
З х п т
АХ М ре ен ги джу. ух вуж де жах Між ді жує с хжох я уже М мою сих Фе Зк тсхв о шко ал Зо сс ще заз сл Со са вс Всое ста вео чад ве ЗЕ рн ХО томг «тщ о с ттжуке Жожауша ЖОТс Жил Кк зх ВЕ ух турки Фк ко ому жкечж ва зу ча ЗЕ сша МУ мав сшЖ З я УЖ МК їм: ТЕ маш МК чЖк ря мч іх пе Я
Же жу БУ ск ди Кк ку Ми ик схо ших сю дме см сжежих о г о. ск зи
КЗ Зк сах ач З су мезо ЧК пов ща се ща сх пвзЗ ке аа ках
ЗЧвка. Кум ТЕ беж КУ о фанат М жи Ж Ки Ж жо ж як Хр ж тт жк ях
Тут Мех чів Тк уз) дев пів АВ о Бкз спі ЗіБ ОЗЬу мех СПре тТжрв ее пр хг як п з 35 ху Вже двох ши до ху дух сх жи мат сподух Кома "хх поле Кк хр зав та зи: зв: ос оз: ву: За Зп са зао5 бе зов заз а МЕ г сх си Ж М ХУчех пл же «т ху їх Ме ех Моря З ух Жах ЖЕ щу ТЕЖ сх5 дво ГЕО щі Бак ол БішЖ жах аа тех іа ув БУ Ба кох т г ех ха У мая шк ше ап жу ас АК о ЕЕ КУМ а АЖ КВ БЕК Ех «ЛО кед жк жу СУ Имя Ж Хо Же кох шо жує ВЕ хууьу БУ у іє Бі дхсо ві тик оМмах БЖ ХХ Бев тих дес тв Уж Тв ла Ук ж т, "В УЗ
Я М їх щу сиди о жщею жі ууУкох мож жу сх МО хо МКУ худ мим ду ВОМ о бог кі МЕ ач дпеац сб м чщщ спи мор мот се чат зи си а Ве сво ке ОХ с БУК Ж они Же сш Ж штж Жана Молету ща й Ж «що Зихечи жує їтк
Ме Бл зу Ж хо мем ВХ беж дар оважю тб Аза ЗВ Жук Ух УЖ в за щх м У ВО ; у ; шх ; «Яд со міо ож о лкщом. шик ож. уж мед ко ов сб ож фор бери о сем се щев зе щаїх ов «а Ме век паж се оф сет баш сечо с бок Фах У
ЕЕ п дм. Кк ЗХ по жи ут, о ТУхкш. зу екю Женя ж СЕ жк ЖК Ме
І КЕ же Ж БК ЛУК Зх - Беж ше Мже Ж Кук жо ру КІ да їх их я БУ им УА ММ со : ; : з : джу хо Я вжи се БУК фо ри їжі щих дж жи внук ях св Ж Ж са У ких АЖ ЩО ВК. др ба В ЖуУж у кжх дея тал Ех п ку кю Ж шу І Ки тую.
Тек ТЕ сі бл ів Жах бе ві БЕ УВА ет шах «сх яхту ще до нер жк х : «ках жа ее хляй чи МУ Я У шили мия ту сш СМ дою жу МОХ М К «ЕВ дети и «ДЯ -кмришшУна КОоМекКеУЖНИМ «кала 343 пк ДОВ ЖАЛО І Ж жу ЖИТЬ т ут КУ зало ж ж ехо Кум Є БЖ ох ші Жал дію МАО УВІ ав шжежЖ сша Бі бів ах Бе БУВ Бр БА мів
З З Я х ш 35 їх ве З М АХ г шо ж току жи жи сек Фоовж т сла МлО - Мода ххх. ї су хх. ги ку їх ха ха ЖЕК ВВ У кВ ідо ще І ше лих Бе таж щі У Ух ск ЕК ох
М шо ЖЕ бек б хо Мун ЩО коник 2 ху й що ху ВІ т ку бод М 5 Ж дк»
Ме Ме Ві бе УВК ха ав Бі ге шБішЖж щ5ОВ оз рев ців жке МЕ хх З я смт ко ху Сн Мякі Ук Ж м Фк МА вх ки "КК жк бмікше Ж рок Хо З ле ЖК щі ТЕв їі5 хаз жо ців бек щі бу ЖВЖ Зав ТЕ вів пік Був Ве шт КІ йому ЗОВ Мережко ую ою йомує Мохудю Сфери Жде МОЗ що чт уУ
АХ А ВКч Кщх УМХ Ме ТЕХ Ах сор оОхАХ ех кл шк ках МАВ УКХ ших км хі гук
У ТЕ Та ВО лих. жди, Жожіх хни ку жериж у Люжеоу сю ік КУ че М я. хе Ко кв тек їж ох вЕке: паю сожи ше аа сей дже ех вар ваза їве дів ув Сех уж Ку пк зкгх як
З ЖЕ 5
Мт уж ха Ма їх ух пази ЕХ мо ДУ Мн Мк Мане ух 1 ко ВК. доку
Ме вже вав ніз Біт шах Аа Вів бББе хв шех ЖЕ ТКв о жАЖ КБа й ча хек ль ау мВ Ка У5е їххж ел Уу2 км ку НК, я. ток ж ОК ух її лм І Я ух. Ки ж.
Тмх жЖжЕ су пов ші ЖвЕ дез во жважЖ ові Беж БУХ ж ж ха д.д КМ сх чаї се КУ «ЖИ и жк МЕ че МИХ
СВТ зукох. сви ту Сом хіх с кА ЩЕ УМиА ПІКІВ ик кя ох ж ОХ полю МЮю меш
Ж МХ меш
ЖЕК
А МКедуюлямй слиз дети.
еп жтют хх КЕ
ЕЙ її. Й ТЖ
УКХ ах
ОДУ АТО зУліу хжйету зу Ужйю таж суку ум сзеуию ім Уецмгр сх ді Зши у схеию тех ак каз щи сеча скЗз с хва Зх с же сне поіш за в Со що шко ЖІ ше ж мо тож о а Ми пфакан тк Ку из ЖЖ бохо Мо ким БІ Кк Жах їй ЖЯКА СсЕМІУ. Сх СМ ЕК мМ ож МІВ мА ОК му Ох УДО ЖЕ АХ Іі у - з тк
А ва Ах ох
Жеххих жи можу ких сфжух сжоеких їх ех сфе хО дуже уж Же лиих спеумож Ж т хокею вир пре, ЕХ У
МхЮ ЩІК ЖАН ХК кро Ме ВО соки ща Мам щи о ес вм Я ВО же
Фони о ї Жов ХО Фо бі а гожм Щщ я Фе УМО хе Лічу СМ ж ТУужщ их мух ТО жк бе уд т КА му ж диВЖ БЖ Аоу лМАД сЧАК ККУ МУ АХ БЕ Тих ж ЖЕ
Ех п У «М й Б фе щу жом уже уми зукІ. дю джує. ЛУКА о жжІУщо МешуцЬ ЇЖиЖи фер ув беж у щен ха тат ат сво жа па сщча ср ощеи ос пише са с сх за с В М схе Мох о ЧИЯ дохетж М хо де тал У МР Мем 2536 Уже М,
Ух МеХ іє Тур Оу Ви бів ІВ Бе пі ів Аж беж пам ТО Ме зх чо чї хжж. Аж мих Мом са хви ЩЕ сажа о кждж що пидеих Ж сажлих уеоуит щодую мав хх ша се ас зво со паї вже за шо ся аво Се Зоя шаф он Ух АЕ
Фк ж сш бах Кк Ву по дю пою ах Чуже бдкєі Лхеж й їу Ук Хо ке ик Ж ч Як Ух Дим, Ех їх ЖЕ КК ї кА сис хх ух и У т КЕ ха жк
МЕ КЕ що АЖ ККО зай Зх му ЗУ ТЕ Мем Ух В АЗАХЕ Ху КІ ем ше о
ЗЕ щ ки - і - фу я - Фе січ - ск я дити кю ще ч Же о Ук Їх шейеж УФИщЕх сиву тк сих суку скузут свичох утри паче фішку оажух пефеух стих о фодріих 2 ча че щі ши ас аа ЗИс вої шас Зоа її Вс во да шо ах ах
Ура ж я свою у Мурко Жар уз жнлко В має Ж СК ом Щодию Між же. ОО у лихе же шапошжам т ВІ ЖДЖ Ме жах Дт ЕЮ жМиК дж лаАФ веж ТЇВЕ Ді УЮ п сх Ух хи я т У ще х тоже ажи пу шпютю вежею п УЖ щит ЖУК езуюи уЖжаих ким ЄЖуХ КО с зо феод МУ ІЩЕ «щу час ска во ве ж зЗше ке спе щас сеї ЩО ща ке ха ку їх БУ дові а сонне снтю фоіхує сборіх бом Кока Боуех сіє Бо о Ум ОХ Сб сут фу
МАК се АУМО В шНІЖ ЛАКУ їн що щч щаХ КЕ ка щшОСУТКХ Аїв ві т Ук Ж ух ве за За хи му и г КО скещу й су фа ож, сс лю ото пе жопа оду бю Ж Ко ту плюф аж вна сам са оба їж с Єв Зо о се хо са Зо хи чає ДЕ. фору ер ошщну шо т юю ою ю що М'яке ЗоЖуех Ж дів аж ви Мов сах Щек вка Я» орле ще МВ УЖЕ ХО БУЄ ЕЕ АВ х вх / ох сх
НЕ ММ ХВ ин НН В НВ тка аж Са си са ЕЕ вес сх сп век жо хоп ВЕ ЖЕ тиж СД я и и жа ви р ки дк жа ою ЩО ММ «ке тах тя ях М зов а там о ме ХА Шум пох Е
МУК ЖК сх ЗБ БАВ ВК Ме Уще тп шва Ж БшЕ тк зав хі М шле лу че
ХОКОК М хх ит тд хо М
М я тукУтх
ФК їІ1К меж че : «ЕВ Мох іхохоу Кі км кк о св.
ШК жу чНА рю юв ножу
КОЛЕЛЕ ТА ху ех
Я Ж оком КУ Ку УВІ Ж
З 0 ЕХ ЮНА. ВОСКУ КІ Х я
МИ зах
ЖИМ 185 лох хз: КЛ в Я СКЛІ КУ ери. ЯК ж, М. ух ЕЕ оз Ж ж. я Фр Ся
СХ ЩА ЖАТЬ Лу Ма хи Ж ААУ Важ і ХО МеВ ву БЖ щу МОВА. 4 Кк чт жк і з й ту х т М й
Хо же тоже пу Жду бах жи Му Мк АХ дм пк рух Ух село ТЗ ж ие же пйж ек муз ша ес су сич йіж Беж пає тУух Щек о Кве їж ща шує
Ух СКК ех аг ко К-
Ууею фе. ЩІ о сану 42 жожую хх й ух КТ хх сах сх хх ку Мах Му пе тк ек Вів тТЕБ У вхо ЗІЗ Дів Був Зку щіє ЩА дев БМ тхв ша т ха их же М а хіх ленту СУ то Кох Жежк ЖК а Жук гаку Ва р ххх а жом в ово Бо
Му Сх жЖЕ АЖ АЛЕ КлЛеЗ алу Ж А БУЄ ме вано у ЖОВ БО м КЕ ке ще й ке М жи Щожмуж Ж ОМ Є Ми Мі мує у Хе МУ бомжі Мкхмк Ж Мк сш шал ЗМ кеш УВО хви Ме жвВх ку ав ве жех жає Жеж тиж Лів тух п ухух зд ще п 1В їй ЗИ
Шо лу тоххх Кум бяж бах ет Маю бат ет СКУ Ба а бів бак бота
МеК су си Би АЕ ПО О Ху Ж КАМ ЖЕО Зх ЖЕ ЗА т М ук ув щу З ЕК дд БА оу ХА що в. дош дж ди Ми Ж и ВЖЕ ху МІ суне бю уж Міна за Ж Х дів вки вще Бі моОсЖяж Ка Бк їме Халюо сзжвж уж ТЕ щу юх їхах Же ї2
Ії пл ЖІ ха
МЕ ЕЕ дек хх. а М Усю Ж м ее зби ХМ ожлх ХК т) м Ж щ Фа Жду беж ЖЕЄ ж лох ФА Тих Тех МВА МУ зві Бех БЕЖ . зЗхЕ зах
КАХ Ком ситу вк лодт
МАЯ
«Му 372 «шашв МЕ
НК межу кат роя я го се Уж ма осади те. «МК шу МЕЖА душожх я ЕКО «ЕК» «ВІ» Конуюча поши дОовнаекь
ШК туня хх вжи у УМ кю А шенню 14 сек ж єю о єму свиню т их хек Утечож ве о фут гу МИ дою хи сх доку, Зх стач що се йпиш че сб се ча щи о сб ва а сикоОзО що ях ях ж ЖЕ Ж м оз МВ Ж о. т ат що кі жі ХУщОЇ ЖЖ Жага Женя ті Між по Ма щб3ми Сем УА ЗА Хе ЩА молю мАш о ча мух Му ЖК ХА Я 1 х їх хх
А Не А Мо че квує ж ех Му Мои додаю с ух тео щі щи вух щи Во кдд ЕЕ са в аа чо сс зо ах що еС о сдоеЗ бас во о ско зоб шк маю ше сом 33 її а КУ бою ак тим іх бух кі Моск МУказ Зк Же бо Ж
ЖЕ У М Уа ще чаш си УЖ вав ЕЕ БАШ ЖУК АК ОХ їв ж ех Ух зл ЗЕ «Кк
КО 5 ММ
ФеодоЮ уж жк блжижо жа УтиЖ щу ующийк жде уж о фе бом (ЖЕ ке». зхмох Кум уки - 2 как від сво Бер) пз су св ос соб сода свза сс сект два со ВІЗ 3ч8 замі Ко є бух З ж не ої Фк ЖЖ А дн Ж ху я ХУ сну а
ЖУК Мек нів Тхв Увь Дкч ж ААВ Вжко піт Бан ша Мо) Бісї їв БЕ
Зх а «5 ; . : ке зжемми ож ще схусх жи о Но о и З на НН НН НАНУ їх ципе зе Зкс вайо сек хх со ех хе сш аве сеї вс свя ва ще ЖК
Ті ах сиякую Ж що ую ру Щохує ЖИ та М Ск у МУ ую чук сла и ж З зх ХУ сЕУ ТЖв їз мам ВкОо бБеш сом Бі пек ТБЖ дао ТУ Ав осів Був Ба
КО 55 в
Оащрони зам зро же ВО ЯН ВО щих ОКО же о В АК УВО У
Ах (Я у оу чу сть ЖЕ сф воли жу во мм МТМ буде с зу ме ТЕ поем «ів бі вка а) Же МЕ ТВх вкое дю Тв Бех Ж їх Тв УЗ Тух 2 - и суд че
РУ ТхХ ТЕ Б
Яйож та шк м ще чн ост тр» фуечря ефе же м жо кіжі ху хи щчЕх сх щих зач се 6 аща КОХ ча Вас ВИМ КОЗУ КА тах Кап Я з ху. как (7 08 То Му Між боуїх боже о буде В бо є Ву хх сббажує Мак ха
МеК омАМм ме Мах ДК Бе джу щежЖ АВ вжЮ їх пав ВА ХУК ХЕ КЗ се ях
БЕ За ТЕ
КЕ За ше тус. хухх. су хУх уж фею шчукАМ ми МО о вх сажа фодкує Жудуж скукех ее ЗЕ зп ва За пах с ши сах сви се Же лож ах с ОБ МЕ ща 35
Між Же шк м ши ще Кк Мі ох бух дує буяє Мом Зк ШКох Хо ті ха дшю ів са вк Ах Вів йпш їж о хшЕ бух ТЕБ ціФ ББа ТАШЕ 1 тк з1ї15
ЯМ А щі
КО Ор ПМ І - зп би З ви Фе ме вн х ЗЕ тег кутю сл жи т Я; ах їм З Ма кА ща ух
ЖЖ КИМ АЖ КАК ОЮ и КЕ Бей УВА ЩМйаЖ зва ше ВХ чех Б чия І к«влх їа «іх КЕ кій ПЕ нти и Пуер мок сії фев сх я т Щеиечия Весною ее жк се бум нма манки ж
КОЖ ся суч иа БОМ КиеЕцьх
МУ тіа «85 ше еЯ ЗХ
ТЕЗ хз ток г бі ро фіуум (Х з й хх за ох Фожкк Лот їжа г хх В щ ців МВа дбай Бека зах жів беж йпоу Вів ів Мах вуз з хв обу АВ 3 х. та ї5
Федонін МО, хо Кок хлів я Ттюе Жук у ФОНІ іх же Шаую сюеж дат ва пух 'шах ех СВ БУМ МАХ ХхМЖЖ їх ЖЖ АК Є тах ех ТуУХ т - «о В ях о ее о сш цею Ж У Щишхує ЖЖ 0 Мою М Ж рю ов ДУ лик ши УЛ м г шх дух Аа КОЖ
Тк Ме Яів ТкБ УЗА ЖЕоч Зав Аж Бко сем пів Бі зи Бій же ее пт «и ж ух ку. буди зах «її Жкую Же жа лю й ік тож Ж
У Тв сіє Ява бус пек АУ шах Ж Ж М СВТ ХКЖ АЛ ХЕАК леж КНУ де ко о
В ХХХ О ск Жар жи КТ чухрх а хо ьо оно со лу М, са Зп ХУ бю пів Зі дк Уві те Мевсрйк вх дер твх аж с Щек жах УВО УЖЕ 3 - ще и и т Бе що живи ом то дтиу ж Й ях щи схожий будо КТ Ви свя Тк. Ж т хе вах кв
Ме оси Бе мех ув їж! ащоже Фо Ач пе Кл Х їз У ГУ ТУ Ох УК БУ
Ук Е «її ВЕ п З йо бе спощя до сах ще Кк ом зда КЗ Саух бежтух т жах у ж дія ві Бе ів іє ек БЖ НЕЗ Бір тк одат тТук Тв пі ВКе 555 ср ЗВ м я и Тр са ЖК дея ЖЖ ку Мт ух Три ри г Ї оч лиж их ку С, хх
Ту ТквБ іл сою же Жах бе) Маі твЕ Уві бек Зах ож зв хх їжа «І 4 кот ху «ЖЕ ЗЕ
ЖК Ка, я
Мая ОК дет ну Чеки ужив мекв і
ТЦК штучна телів или «и х «ша МЕБИТЬ «я. її хх
УМ жк 0 ерехмуднх реве вмч кали,
АЖ хУММУМНИ МОМ КІКе суть кої туту пе їх ТАТ вн Те З аю Ку ВК «чом їх
ЗИ жи дих сл ниж У СИ ме ин су и пост Ве ух ши мс - ше Че тат ст жо сов ск чаї ще зва з ах ва35 сс ща ее ча мкл ж ет форма тя я м жу а в не да жів Уві ці БЕ Уві бки ех пу із Бі УВІ бу їв бе Бу ІВ ж ц их хе
Х роя А М дк ем пеу хви Ух синя кх. «со щи. уж Кк сф. зжо ж жо лі совка. п сви соку, г 5-Х. З щу ЕМ ЖЕ КО в т дана ще с пер ак ово жи вдо Зп ае че строю. г ї «шо жж і Жокдя бу Кох аж ож їжа й ка сб пери - пбуржсюю ММ кю уж цвк УаУ МЕ Уво би Су Буш Ас БЕ Бі жЖух ХВх Бора жк же БЕЖ дез ща рН пи жу кл укіс ЖЖ. жом уж жх мМ сем хау ек че
ВЕ ВО цес би це са ес се Сб сце вав о Сх жаа СЗЗ ас ж ака ух беж Де Кік КЕ х. Женя МІЖ ХО щі. Ж «КТ У ль шк т н я. г Енн те. їжЖк Ме» Чі бхв очі й бо» о йав БЕ Сас ба шАУ бе ій же Ме ик г 3-1 «Ж Б 5
Зав зе вс вас се ож вяшБ за Со вом Зак каб ов баб аа КЕ їх
ІА ях чеку її кат бем бак бака 0 у уж М ж до ЩО ї ще
Уж ТЕ Зі ав сжЖоОо Зах бак Зі Щеж ТВх дз теє із Зіб Муз Бо я йо В сащ ЩО хи зс апа як Зо зе зве ве, пОо вс зоб оса зп сах хай
С ХУ чуУ щу Мах ЖК М зх НЯ сскян Ме сни бує Ме умо зма ут жд Уа) тих мех ТВк Ба Авр о тТви бек є ве ТВе дів Бех
КО т т а спра дит жу чут В п триж мо ами жиму жІІх ми хни па Ко м у УЧ -кй ака зап сб зи БЕ ся во се заз ах во Фе а тах хво ще ян сі хи тю пд ж х Тож саке я Кк тк хх ня жи
ВБЖЖ ЗК димі Ва дек ївн пс дек са дво Те хів Маі Жук БУК СТВ ож пав жа мно жо ох жи жу фу сю жу ум 0 о хутух гм учсжих хатка ЖЕ шо зх Я а шк ше Бе пе Бик ле ОБУ ще п кодах 35 хт зепж. СА одуут КІЛ шк дю им. Щі 833 У ух Ши ж Мк юю СМ їх ж ЖУК Ух У із АХхЕш Бе Бі Бе дек Кто щів ве тор ошех Тек ТЕросіб БА Аве зах до хх
МА КК Хо
Фе джут 32 а ему УЩ В щу ЯК о Од МАВ ше рай с КхЯ ж зріохах о ббждя М же аа де СМжемо божі лін же хйщЯ Мох Хі
ВЕ ЖЕш А мАЛО УМ ЖОХ УМ СУКА ЖК УЖ ХО ЗЕЖ зак лот
ДА ММ
У и ж щи хЖММУ ММ ут вч чі я
ЛУ хх, те
КАК МмЖ А
МР Ену 0 ЖМеомо зими ух пухом кв «МК шу ЗЕ ММС КНУ Хе шЕхх «м мно удима ем ви Юм я кю я ЗВАТИ МУ ЄМ ДЕК М Ж АКА «ами км
Му» ШУЙ тую і 3 ща І Ж Жан ах й хі ЗО бдкх би акт Б ді пе ких ЖЕ МЕ БЖ МА ММ АЗК Од МО ЖЖу ме Бе мух мує МЕ Мекку жкюхе хх по ку товжжк ж Ох ой ХЖоєвяю М аю ШІ КУ баг Сх Ем М У С дю хе шах ча мус тах ОБЖ У СУ Ві ОБ КУ Ух їмж Ве Жах ОЗ у кжх о -х а
КМ КУ М схем ВЕ шо М и Хі доми т ж ЮК щшо ХУ, ток Хм Ж ж тав Ех му Ко ух Мет міш ТЕ мо жж ЖАХ сіб ва вес іх ЛТЕУ хх і. т а БМ КЕ Мах п їх 5 мя чи ВОЗ году бу хо ер ту Що Мою хр Мудає і фу бує ю Бах а Жоххж Має їх М ЖЕ я СМТ м Є МК АХ ж жи М Я Кук па АТ хеж МОЄ ща ше й в хх м
Ряд КУМ со о. Соми Жах ЗМури Жов Му Ява С же Вже пів сжіж вк ува ЇВ Мес Та беч ше баж Бек ТИХ 5еЕ ЇХ Аів Бух кВ ча з дя зе Ж т Хаему 8к Хжхум М нтух Ждує бу Ду Зае Кж Л Зблжю ча у у мех ща оши ще Зех ме ку Беж БІ Бар БЖ Віз У шк УЖЕ МУ шк Зо ХЕ
Хо Моск от же ах ВХ ХХ ри Му МИ ж Ук я Жах аю о Же АїчуУ Що х дж хіа АХ аю АЖ БУ ЩЕ дкц ВЬВ Бе бхв зе Сук ТЖВ о щАв Ба АЮ з щих я Зорі кщк МК; 5 ух жлх же І хе 3 ж ЕХ ах Мих КЕ дл У ХУ Мая ик
Тут ткож щІб Кат Же ео Мах ЖВх ду Беж МаЕ до ж
ДОМУ дж
ОХ и хх «ее З сл
КА се а КОМ а чи 0 МщЖМХ
Ту ж Же хкох хе ча лох
КОДУ штучна Попа
КЕНКХ оку лю зак «ий МЕТ ку де
ХІМ
Ще хе Є м
Фе 00 З удуємумею пі кукі ок хідівеню 0 ОМОМХЕКИЧА МОВО ДОВН АХ: люту хх ее че
Б Оя зи й і хай ІБ . ; х хек Ки еліт ук см ши со яужіє кто фу лу биї щодуж з Ж гу вк
МА МЕ У Ц КАХ ак МЕТ см с КУ Я ФЕМ СН СЕЗ КЕ а щи Зк ші ж же сток КМ У ще кує Ж шк ху о жі Мо б ої Ум м
Маю У Ай їн; Маю Біб Бех щі ла Бім сві бує БУВ же пі Аа - ш З БУ
М т 3 ДУ
Яукхю тжкуУє си сок Жодних сот кує мух свее о ФУ Мокдм щих Ох о дфтзі же ве З Е
ХО М а З КН хе КджАЖ СКМ АЮ І МО КУ» ЇХ МЕЖ Хе ДУХУ М ОК ахе дод ЖК я уж ТЕ Х мих й Же Уха Ток. Ж ж Що Шо ау туф ж жа жл ж кв шех че Муз Уві Беж Су зук дів беж боб тбже жвЕ Бйпя жОаЖ От Тк чок сіЩ Зх ще З ЖИ вав дужиж здо ох ек - см шжичАх их сук ьо ук п хо фут де аа ме вх сег баз чич сша ок оо ЕЕ ча са З ж ща хе чия ії пред са 1; 12 ожив т лож ше хі как (ж 3 хх Ти лек у ун Жид
Тех Ме Зіз Тв Меї Ах Бі» ів хо пі бів шіє під Ткв Ме 25 о За сожвя ен: ее з ле г г нюх я ом Ух лис. гак ж кож я пза бле вс зво сс сах ва па доб зса вве ба дива сад зва МЕ
Ж ха усе т Хода Жан їх и СХ як МУМя . пух. хх т Жікжех а ш ЖК АВ ва КО пек бек жа САМ ме йду вок ІЗ 53 м СК що к шк ва щх во цу сти ру их жах р дей и жу тиж меми фу леми веж хати ж фея Зах зва вас зо зм воз їх зоз зз3 ча зош бос зоб зо зса ща Ка 48
ТАЗ у ЖЖ я фон ух Я су В 33 о « см, ще я чКЖу их я цін бі ака Уві тв Мет тТВх вкз во жЖвт ех вс Бех ТВж Уві Тух пе п пк А «к та ів що зи ж сни пух. молжих о а. тус ку пщожо сжлух «их сук кої КУ о кож вок З ча ваз с вче їм ска За ско Зап щас соб ще чу ж ат ЯЗ зах І Жодює Масу «тоже Тоижчя Ж моих ОХ, ам Кук б ау лк пехж т зх біс мес дів їжи Хек пеж зво дхс Бех Ано вро їх вів Уві ТУК тех ув :5 ФІ ЕЕ пу КО з примх пк гфИЙ шУМ о жи КМ ужуююМ уж Мор кре УМО фе щеж маржу бут КМ су ЗЕ св вче Зах св о ЧаКЕ КОС с св сс сце ої бас со зо СЕК оце Я
Ж йо хі міф бік; дже вм Мі йо бах кух ба слу боючю МУ зі й вів ЗЕ дав нів 535 БЕК дже бів ре Тхвр о беЕ ТУЮ Ткв 51 РБа Аяв я гр «пд Ех
ЗМУ в МО ух сшжиж Уж уУх ся щищ о СМ сухих дохо жи фе их дуду я ме сщщ5 Зщше са ЩЕ во «з С вес ще о вих Між ббадюо ЯЕ ще Го в щи Ж же Хм лому ТА сту ЕВ и г шк КК й мМ ши АХЬ їх ХЕ Я ск о май тк БЖ МвіІ Ж живе 75 окт
Мал жк ди жу, жо че МИХ пи хХ али А хх о «віз ПЕЖ т у х ех їх х Хе? «Ії» Штучна послідовна єть сих «тив Свататачзна хЗнстоУукНнія «чн» 158 ж Жах то ух Ат ку їх жк В їжи х дже КЗ хх В шов Уві Зах зви Уві Сай ек сі Віз БУ За му зув Ехо слу Вів
ТЕ к її х щц х З Б М шах Ж Тези Я бек Хо жук М фу ях жк жи оо чн. т є се век Ух ежа Уж зеЖ мух Му Ів ех Су Тук Жиж ЕЗв ЖКУ Зі ТуХ 283 25 зе кі «ко УС скан Му М хо суху Я Мо сх У були ск ую ху т мл гону ще ик Ме лів їТхо Уві хз сіб віз Бк пі бів ям ла їж ЖЕ ех
Б «5 сх Че Ті М пкмо ж их ГГ ХО ак лю же Мт пу ДО. т ж м У сім жжкроїав й ск бах Бех піїУ Бу тах ав Тех вів Б Бе вва сх хв до ж а БО бів щіо Бе Сі ТЖве Мах жнЕ йхи дез ЇВ дах Жвт йву Же ді фею ха А ж що жлпх Ме Жнк ма бе ул Зеж ХВ Щдех хлаж жд ЕЕ ху о тя Зм бук МШиуют о Козу фею Жаль би Жодрую МЕ ую Зою рас тра Р тка
Мат сАм хе Бек Беж ме; Ахоп Бех йве Аяв ЇВкх вза хаЗ3 Жеж ТУх Су що г що що За Ж що «чих т їж Сх. к тх ра. «ж їх. їх ЛУ каже, я, а Та с. Ко Ух ча ів Акт зр Вів пів беж же із Брж Жер о йех Ту бр обі ББе ав зви лек пах,
ММ 0 ЖК зму ке ТЯ же Ку іх я ММ ло сух УЖ Мр. хр сухе хлою тує їКо сі Зі бі Жбж їн во Теж ота пе Бех з пр
ВЕУ КІ
ЕЕ ру, жк "и о ве осо тк
УДО А КАТЕ Ж ск про уд «ше ДЕ ее т Ох "мими и ВК жа щи ПИ жчМмЕ ПОМ У ДОКИ ж ж км лих «Шило МУ кова кт шШЖеуєхожучи КІ пет ВИ і гм хе ММА ВОНО ВАЦТКЕ дети хх У ух чих Т.к и Ех, Оу я ами ХВ сяє ФФУ СУКИ сек жу сеолуих Су йх бсжежую ТО у сежоех пом сзову ий шхЕЖКУ мах 8. щ печ чи се кий жо свя см ЗО Яке зач ж Ве аб є р о Бу по хи у жи фоуїї ХКщі т у У я пн жу Ж куки дек ХЕ Ох їх ш- жа аж фа Су ХУ МЕЖ сш ек А ов МЕ му же шАУх дама т - Ак Кк ї а КО ОХ фреш ж о сту су бори Я зобі жо ок» титул віх щи мух живи тем ЖОощм ЗЕ їз ЗК за: че БО бдо защ зо 5 53 їз во БЕ вос ох я зе
Фу ж баз жа фаху би бом іх уж хо Мох му ВЕК Мб 23 ях Иккве
Хв МВі ПУБ Кал о свжЕ Сша пт: ів Бек пі Туюх ЇСЛЕ КБе таж щу КДЕ
З Х З З В в ххх як В, КЖ
М. де М во щи гуща Пер -. схо Удих Бр КЕ Ж режі що ЖИВ кВ хе Бі де НОЖУ ва ва сво вач чу соч осв чок ОМ ув са ча сов Чаа Кеч во ЖЕ трек дра Шу будо Ко Фучии ЕХ Фея. т Є я Ж кр кю торі Мая Му. Мох бек вет май ЕТ ВЕ ЖЕ Ве ФАК м КК А У Аж ЗЕ без Св отТЕЮ Ме
З що 5 кри Федр сети св жи іно джем уер футТких омюдї прави СОДИ спдкащу. окмедьєю о сер ЖК З ча ща а вве сс Бек ов че чає абз авс КЯК чо сад веб КЕ Їж
А м жду ром ев дк Же обу жк а тлахоює Тесужи ММ о у Й Жоюкт МЖЕе по МЕ ох ЛАБ ЖИ ЗЕ МК УМ Ж Зх. М ОК БО КУ А а щ ів Ех хг ща я що : зай дню. ужитих суєрею соч свв доб ож сфехик дути й» пихи о боамет. сих сте дуизщум вину С жуя зд: чаж опас в чиї: 0 ас зе вай чек оц СУ Зоб зао зо о ах ках що жо 7 м моз ях й х фу ЖЖ Ж шен ВМ бу Жуша ПЮояео Мои Ж з Не ня и ьо ос пів щі вки Уді ТВ Мав ТВ вхо Аввоснж ех ТК дек ТВж Аїв Тух 8 ча та що
Ти; жу Мох дети щу жк У шк и ан хх мих жі тож мо фтжюх ТБ. вищ ну схмих ЗО алу У Ку жо шаЄ см ЗК ще ї ЗЕ КОЖ пи Ка х ЗВ. ск тух р жав зх пу Жощея Хокоч був оз кит р ва їх бе Му Є мес ім во; ЗЕ Ат їжи да йех йо За Тл пів чаї Ту ТУух Суж
ЗЕ ск й тп 85 З За сут. ІЧ о ФУМОМО м ра паж с х ом дес не феоижо ор ово уд ак чив за щи сах оч ще се шосе тоащ сих Каб хат соми Ех ак ДК о щує боаже ЩЕ У Хр Ще МОХ Ме лм Мк бйхує Яку з Мк й лів Аж дви Нв Біт Мек вже Між БКе Тор обех Теж ТЕМ Обі Бе АЖ
КТ МБ ЕН
; . - ще іо же утіх ЖК дез шт уж сф Ес ху ДК Та ка С по свв озучЕ во зо ацЕо асо збе оо ЧЕ ат
Ж спа шк КУ жах бхрищм. Ук ЖЕ жиру АХ Ше Шедох
Тк Же хіт пів о сіб твЕ ге) У вх Ма дах БЕЖ
Оу її
КО АК
Уж
ЕХ АхКЕЯ км пора «ЕК їх
ХЕ Тих Уход
Хек їх
АКТ ЗЕМ у ту дл у жов ди КР, ходова. ДЖЕМ ОСЛО ху хоку см ее Ж МОЖ М ках оо Кк хорнкк ща с що гм кує ХК хи шк Гуз З су і я СХ жу лу Же 0 ах Що
ЯйоалоМмаї щі лев ВЕ а аю щі Вів ім ва Му ув БЕ РУ АВ 4 В 3 з
А А по ком хв ХК ток сСУжУ жу (бана Мом М Фк Ох Ул Сук ж Жим бхфуе МУ кю Піх тах ек Уві бує 53 Беж сує Був дів дек Біу Тух Скж Бе ТВ Бім Тух у щ и: и я КО У кун ЖЖ кА Хукже Ко юух о Зк ДТ МАХ ВЕЖ жа Женя МЖК пожсує Вед ет Мек Ні тТхв о Мах акщ ій вій Бу о схе км БМ ОЮ ЖжЕрО ММ. --Е їх Кк
З КУ 5
УМХ дю хі. чу плахає Жохж гі хх (Зфау сід щу сйчхю лю їдуєх Ж піт тжв о Ті аж Бкоюб об шах і ХХ а вав обУж вів сів БУВ БУНе
З х же " КЕ З З кл сх до
В хх ше те ву У и юн 4 й ма м щоку Мі Су Москвою бу бю Що б піп вх: Ма Стах Ме тв ЖЕ ОМ ЛК ОН их хМах АБПХ дов ЕК щц " ЛА КЕ М
Вл хК УК и се их сон сш му її жа хо Жди йозафу ЛУ ж ух Тех кока
Мек сію їсч бек дк Без жа лек ев дв ТВ АХ узі Тує ТУх Суд гео з що Кеж век хід Мои хх мл шо їі: іде ку Я ох; ЇТрудь СМ ях бе же Зежу Лі ЩЕ ХЕ ді хжа дар НІЯ БУ Баж Зхц Ні вве Кур о 5ех Хужх Тер БЖ Бе йв5Ю зав зах зв
Аме що То
Тк Тк УТ ах УЕох Ох тд Жов У м хх ї аж «у ке ту т ї с т паж т Я ху У ль т хх х тх, з ніх
Тих УЖЕ маш АТОМІ МАХ зай УВА жи ВІ Су СУ -Е З аку 115 іх5 гер же те як Ах ми хх ту
НКИ их «іа ме хжашж ДЕК. кот ик, т й че рин а чел «Ел» Шеечва писані
ТЕ куки Мих шли окр жк БЕ ВКА клехаю кА
ЛЕТ т, пи ке жи хх кю ех,
Хежіди т 0 БОЖУ МОЛІ деВИ ХЕ
УК «т ртуУктух ка ТІК «а щУ 155 : : . й педиж тв щі сяг ух свт У сфрму М вжду ст що зви | зжажох о зр й спа пе о їх щ очкя ша ие хх ІМ ОО ї зач сла вва авт сх ДЕ КНУ 88 г хв У ж Ж кг йте й же посту МЖК. щу ж ЖАН Жду Коля Жбите сах -ів Уві піс свв Уа бів Беж Бі ів БІБ во БУВ ую Без Аж ІВ ч ГУ ло я 4 З Ки А фс у да жу ему бує ших ско Ко тв Вдих що жу сом гру Мод Як ша Фр шу с КК с Мошкн щМм хх її зав св ос со в ос аа же біжу ВАМ МКУ ойкеачу би Ж ожк оно бу іх баку ММК Жуки йо ую Ж хм у
Феху: в х щит зе б іх - хе ха МТ Шви бін а питу мк УМА ешЖ ЖАН ЖК УЮ зу За мих Ж ЖЖ МЖК їв ЖВХ БАЖ ТУуХ туї 7 Зх «де кл «КИ во вир стує очуж Ужфру см соту Уфилує ЕКО дов смщуу МЖК о сади фо де ча ов ВУ си ож ще Я ма щх пОоК ож се В КУ зве с вк ве ЖУ хм емо Ма 8 сю ХУ щем єм Жах мих их 8 ух Жах ух: ох; ож Мо
Ктж Мш-Е Каа би стві Бгщ зів дів КО опа бак ошАв їх Бічз тТхюв МЕЖ я їх с 5 я я зах ту аж пах Хух ДАО фу о дує дФутуЮ о зжуєує щумщ си ЩІ їн бл пд МЕЖ тк
ЩО КАУ НК ВНУ пи щи а ж За с ви ве ах ЖЕ КМ ВХ МК ЖК тУХ ву ан т 30 йону: ам. ому Му ІЛ Ж и кре Же хх Вк ТА ВУ Ж му Ух ща Ж МЖе КАШ ШТ ЖК лк ХХ АЖ СБУуу аж Лаб УЮ АЖ ОО БАВ М УМА о ва ка сам сс дов че всей аа зве ай ба ат Боб вес ває во см ща їх Ж В ше ро ерш ща ВМХВ ВЕУ ак че а жк Кс веж ер ве щмих со «хх
УЗ ж ду щоож Лдо ВО щИ Жди ЗК у кое Фени СТ ує Цеишахо Ж скл беж що бук мА ота йхш хв ках меж твВе жу дво ожлк ЗК ха оси ВХ ав жу де ж теж сту муж дм сеЖчяж во Ж сюди ж у УЖЕ ср жд Е боки Ви е ЗИ шли ще и дно Нерон ве чих ре жен жи Бо ЧК Сак СВК ОК св ек ЖИ я бі Мк ок хіх Вожуф жу Довж ще пер 5 джу Ск ха тю Ж ккх
Важ Оп шо ЗВ де З їж МЕ ЩщОсНаХх ле ваве п пів МА УЖ Ежх ух на ЩЕ 5 ериеуВ меду жу сну вже фїх зе зує ки фажех мим фея будую перу о ткщ Кк са С ОКО МКК ЩО МОЖ їі -хй ках ке шт ах сек ос Зчя шио ОКК ЗЕ
Ж ух хх 3 ск Хо й Між сю тк Фр блуз джех жу ККУ Жах люМма ях ще пла ше еЖж Ак ма зе ТЕ вояж жк же саму КОЛ Ме тп їх пря що АХ ТЕ
УЮ жи ож є ежеж су и «за ж Жхх меж фжЕжУ вим век У мак ач ще сов жа во ми чом Зою щем о вжх ІК прожи п лу БУ у жа же Ура тс хв рух дж ск їж Жхев оба сію бач ТвЖ себз Зв. жВх ві Бек Бех 115 ї58 ль зах
ОК А Кк А «дії» І24 жим 0 МИХ хом воже 0 МІФУ чНаМ НУО ть я Кх я ге су що ий м «ие сенат на КОМИ УКмЗ «ща» 155 як «ж ие аж ух их ФУ ко лк В я тт ти тлу Тайм Мк (1 М їх я МВ (хай Бе ЖЖ АТ ЗеЖж іл У АК спі Ук Ж жи ВЖЕ МА сь й мк сх 3 5 їй 15
Соаучях м Ж хх хух г. плужмю То піч й ко й ж аю ТИХ буфер АЛ о ки деж Чві Був Узі Беж Су Буз діл Ваех пі ТУух ТВж ВБе дж пох жу туту 7 т х
КА г 3 пк ща ЩЕ са деку ЗЕ у о В ж ут ЩІ Уже і же б шу хор току ЇХ г, Муюеу фору тет Меб о Ніз Тяєв Уві Ахе пів КА Еко діт Зій сі би БА ЖЕ Ме їх «0 5 их гу: Уж соя м ак Де жом. пи тре що ак, Кк ВІ ож, Мих, таж ср. т з ТЕ зу шк ОКХ г моя лу Я ії у г І пу ЖЖ ЇХ) дян Бк Бех Беж Со Бі ТБЖ лЛяй тТУК іа б3Аю Му БЕ що Б в яті и коню тм М -Уржма Може ач У Фени Ж бок Пю т ас зів щі Аж Уві тах Ме ТБ АХ ЗО ТВпх Зек сів ЗеЖ ТЇВК Асв Тух хх ки п -к
Я їх хи
Мат вл кх Фа Жудегж Жов фун Ханюк о Каву к яку Я дк Мусже біжу й
Мак бід їж Хв Аж їск дхб 3-5 Кар вар ТВх Аіз Уа Тух Тк Сув
Ом я Поки, З ж ж и лк їі меле Чи Му усе КЕ то Ж. ох
Жхіа Вкс Боб ків ЗЕ Же Бе біз Бе Уже Жах те ЖК ос Же во
АХ х т х їх
ЗИ 15
Тека хо ІЛ оку ти ку ж хи диво їі бшим о б
Мих Тк о шю Бі шів Тквж їемз Уві ТвК УВІ) Бех бек тт й же Ми схж т км я пе ет о 5
БИ --Е кер зи
ТІ ДЕХ коп ех кимось Я фу ХВ мех «АХ шЕУчна послі щшОоВНикь «ШК
ЖИ Ме
Х км ол «вв 157 кВ Бач дос; ту ЩЕ и Кафе Как ЗЕ кави ов деки щи и ше м ери ца «ВА щи «У ЖЕ слу Ср Те чиІш или» ДНК «її» БррУчна послідовність хи мно хи «ЯМ кове Мее «аНях БІВ ха мож ів Ух у кекс их розу ув сте 2
МКМ АК КЕТІ ТОВКИ с «А «жін ОШ «евів Я «ТЕО м, те кни ЩИХ
М вим ех втезхежж и «ел ДреУхна осів Ість
ХИТ я су ке. «ших пукх Ууя
«аж 153 задстачеха зоасовсеца зепоозоуєс счово че кий УК «іх Ж «ій» ДН «иа» щежена зоеоліщжевніси» «ВХ квейх врейнеюр «аа ї1Б5 завиайекеєса осот оса аопеа У Я «Ей ІБ «1» ЗЕ «вки ДЕК «Ей шеУчна песлідевність «ЖК «аю Ях мраеу «ух ОБ зазчстедссз чоевссзкцчазт рода звсочо чо й «Ай І155 «Вії 35 «жи ДЕК «вій» Бежучеа ослів внІсхе
Ко вен «Я зи
Вега щас оС З

Claims (27)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Комбінація трастузумабу, хіміотерапевтичного лікарського засобу та біспецифічного антитіла, що містить перший сайт зв'язування антигену, який містить варіабельну область важкого ланцюга з СОКІ, СОК2 і СОКЗ, що мають послідовності АУМУІМ, КІХРОБОУТ5УАОКЕОО і РРМУХО5БАМУЕАУ, відповідно, та другий сайт зв'язування антигену, що містить варіабельну область важкого ланцюга з СОКІ, СОМК2 і СОМКЗ3, що мають послідовності ЗУУМН, ММІМРМБОСТМУДОКРОС і ОНОБАКНЕМУЗУУУСЕОУ, відповідно, де перший сайт зв'язування антигену та другий сайт зв'язування антигену містять варіабельну область легкого ланцюга з СОК1, СОК2 ї СОКЗ, що мають послідовності О5І5ЗУ, ААБ ії ОО5У5ЗТРРТ, відповідно, для застосування в способі лікування індивіда, в якого є позитивна за ЕгбВ-2, ЕпоВ-3 або ЕгрВ- 2/ЕТЬВ-3 пухлина або ризик розвитку вказаної пухлини.
2. Комбінація для застосування за п. 1, яка оввідрізняється тим, що зазначений хіміотерапевтичний лікарський засіб вибраний з винорелбіну, паклітакселю, доцетакселю, гемцитабіну, ерибуліну, капецитабіну та карбоплатину.
З. Комбінація для застосування за п. 2, яка відрізняється тим, що зазначений хіміотерапевтичний лікарський засіб являє собою винорелбін.
4. Комбінація для застосування за пп. 1, 2 або 3, яка відрізняється тим, що трастузумаб містить кон'югат лікарського засобу.
5. Комбінація для застосування за п. 4, яка відрізняється тим, що трастузумаб являє собою трастузумаб емтанзин.
6. Комбінація для застосування за будь-яким із пп. 1-5, яка відрізняється тим, що біспецифічне антитіло містить специфічну до ЕгЬВ-2 варіабельну область важкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО: 39 та специфічну до ЕгтбВ-3 варіабельну область важкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 53.
7. Комбінація для застосування за будь-яким із пп. 1-6, яка відрізняється тим, що зазначений перший сайт зв'язування антигену та зазначений другий сайт зв'язування антигену зазначеного біспецифічного антитіла містить варіабельну область легкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО: 74, де зазначений легкий ланцюг містить 0, 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот або їх комбінацію, з яких зазначені 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот або їх комбінація не є областю СОКІ1, СОК2 або СОКЗ або областю ЕКА зазначеного Мі -ланцюга.
8. Комбінація для застосування за будь-яким із пп. 1-7, яка відрізняється тим, що зазначений перший сайт зв'язування антигену та зазначений другий сайт зв'язування антигену зазначеного біспецифічного антитіла містить варіабельну область легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 74.
9. Комбінація для застосування за будь-яким із пп. 1-8, яка відрізняється тим, що біспецифічне антитіло містить специфічний до ЕгЬВ-2 важкий ланцюг 5ЕО ІЮО МО: 75, специфічний до ЕгоВ-З важкий ланцюг 5ЕО ІО МО: 76 і загальний легкий ланцюг 5ЕО ІО МО: 74.
10. Комбінація для застосування за будь-яким із пп. 1-9, яка відрізняється тим, що в зазначеного індивіда є позитивний за ЕГЬВ-2 метастатичний рак молочної залози.
11. Комбінація для застосування за п. 10, яка відрізняється тим, що зазначений індивід являє собою ЕгЬВ-2 їі або ЕгтрВ-2 з---.
12. Комбінація для застосування за будь-яким із пп. 1-11, яка відрізняється тим, що зазначений індивід має стійкий до спрямованої проти ЕгоВ-2 терапії фенотип і/або фенотип херегулінової резистентності або стійкий до спрямованої проти ЕгЬВ-2 терапії моноклональним антитілом фенотип.
13. Спосіб лікування індивіда, в якого є позитивна за ЕгтоВ-2, ЕтОВ-3 або ЕгтЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлина або є ризик розвитку позитивної за ЕГЬВ-2, ЕТЬВ-3 або ЕгЬВ-2/ЕтЬВ-3 пухлини, де зазначений спосіб включає введення індивіду, який потребує цього, трастузумабу, хіміотерапевтичного лікарського засобу та біспецифічного антитіла, що містить сайт зв'язування антигену, який містить варіабельну область важкого ланцюга з СОКІ, СОК2 і СОКЗ, що мають послідовності АУХУІМ, КІУРОБСУТЗУАОКЕОС і РРУУУОБАМУЕАХМ, відповідно, та другий сайт зв'язування антигену, що містить варіабельну область важкого ланцюга з СОКІ, СОК2 і СОКЗ, що мають послідовності ЗУУМН, УЛМРМЗОСТМУАОКРОС і ОНнНОЗКНЕМБУМУСЕОМУ, відповідно, де перший сайт зв'язування антигену та другий сайт зв'язування антигену містять варіабельну область легкого ланцюга з СОКІ, СОК2 ії СОКЗ, що мають послідовності О5ІЗ5У, ААЗ і ОО5УЗТРРТ, відповідно.
14. Фармацевтична композиція, яка містить трастузумаб, хіміотерапевтичний лікарський засіб і біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигену, який містить варіабельну область важкого ланцюга з СОКІ, СОК2 і СОКЗ, що мають послідовності АУХЇМ, КІУРОБСУТ5УАОКЕОС і РРУУМО5АМУЕАХ, відповідно, та другий сайт зв'язування антигену,
що містить варіабельну область важкого ланцюга з СОКІ, СОМК2 і СОКЗ, що мають послідовності ЗУУМН, УЛМРМЗОСТМУАОКРОС і ОНнНОЗКНЕМ5УМУСЕОМ, відповідно, де перший сайт зв'язування антигену та другий сайт зв'язування антигену містять варіабельну область легкого ланцюга з СОКІ, СОК2 ії СОКЗ, що мають послідовності О5ІЗБУ, ААЗ і ОО5УЗТРРТ, відповідно.
15. Фармацевтична композиція за п. 14, яка відрізняється тим, що зазначений хіміотерапевтичний лікарський засіб вибраний з винорелбіну, паклітакселю, доцетакселю, гемцитабіну, ерибуліну, капецитабіну та карбоплатину.
16. Фармацевтична композиція за п. 15, яка відрізняється тим, що зазначений хіміотерапевтичний лікарський засіб являє собою винорелбін.
17. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 14-16, яка відрізняється тим, що біспецифічне антитіло містить специфічну до ЕгЬВ-2 варіабельну область важкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 39 та специфічну до ЕгтрВ-3 варіабельну область важкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 53.
18. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 14-17, яка відрізняється тим, що зазначений перший сайт зв'язування антигену та зазначений другий сайт зв'язування антигену зазначеного біспецифічного антитіла містять варіабельну область легкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО: 74, де зазначений легкий ланцюг містить 0, 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот або їх комбінацію, з яких зазначені 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот або їх комбінація не є областю СОКІ1, СОК2 або СОКЗ або областю ЕКА зазначеного Мі -ланцюга.
19. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 14-18, яка відрізняється тим, що зазначений перший сайт зв'язування антигену та зазначений другий сайт зв'язування антигену зазначеного біспецифічного антитіла містять варіабельну область легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 74.
20. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 14-19, яка відрізняється тим, що біспецифічне антитіло містить специфічний до ЕгЬВ-2 важкий ланцюг 5ЕО ІО МО: 75, специфічний до ЕгрВ-3 важкий ланцюг 5ЕО ІО МО: 76 і загальний легкий ланцюг 5ЕО І МО: 74.
21. Набір із частин, який містить трастузумаб, хіміотерапевтичний лікарський засіб і біспецифічне антитіло, що містить перший сайт зв'язування антигену, який містить варіабельну область важкого ланцюга з СОКІ, СОК2 і СОКЗ3, що мають послідовності АУХ1ЇМ, КІУРОБСУТ5УАОКЕОС і РРУУМО5АМУЕАХ, відповідно, та другий сайт зв'язування антигену, що містить варіабельну область важкого ланцюга з СОК!І, СОК2 і СОКЗ3, що мають послідовності ЗУУМН, УЛМРМЗОСТМУАОКРОС і ОНнНОЗКНЕМБУМУСЕОМУ, відповідно, де перший сайт зв'язування антигену та другий сайт зв'язування антигену містять варіабельну область легкого ланцюга з СОКІ, СОК2 ії СОКЗ, що мають послідовності О5ІЗБУ, ААЗ і ОО5УЗТРРТ, відповідно.
22. Набір із частин за п. 21, який відрізняється тим, що зазначений хіміотерапевтичний лікарський засіб вибраний з винорелбіну, паклітакселю, доцетакселю, гемцитабіну, ерибуліну, капецитабіну та карбоплатину.
23. Набір із частин за п. 22, який відрізняється тим, що зазначений хіміотерапевтичний лікарський засіб являє собою винорелбін.
24. Набір із частин за будь-яким із пп. 21-23, який відрізняється тим, що зазначене біспецифічне антитіло містить специфічну до ЕгЬВ-2 варіабельну область важкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 39 та специфічну до ЕгбВ-3 варіабельну область важкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 53.
25. Набір із частин за будь-яким із пп. 21-24, який відрізняється тим, що зазначений перший сайт зв'язування антигену та зазначений другий сайт зв'язування антигену зазначеного біспецифічного антитіла містить варіабельну область легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 74, де зазначений легкий ланцюг містить 0, 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот або їх комбінацію, з яких зазначені 1, 2, 3, 4 або 5 вставок, делецій, замін амінокислот або їх комбінація не є областю СОКІ1, СОК2 або СОКЗ або областю ЕКА зазначеного Мі -ланцюга.
26. Набір із частин за будь-яким із пп. 21-25, який відрізняється тим, що зазначений перший сайт зв'язування антигену та зазначений другий сайт зв'язування антигену зазначеного біспецифічного антитіла містить варіабельну область легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 74.
27. Набір із частин за будь-яким із пп. 21-26, який відрізняється тим, що біспецифічне антитіло містить специфічний до ЕгоВ-2 важкий ланцюг 5ЕО ІО МО: 75, специфічний до ЕгЬВ-3 важкий ланцюг 5ЕО ІО МО: 76 і загальний легкий ланцюг 5ЕО ІЮО МО: 74. мо зо т -е А Я ва ' ди Ес І Ж же Кави хранік сажки Ж В я «ее ВОрОВО Фа й й «вн. ВСМВеВ я ї у й а МАТ проти ВУ ще щі ї в Канаенерйя ск
Фіг. 1
Ї. дожила кет опкжетуч Вих кктухютех ков юуюь квт всех же І фе чу З че - ВН Мак Кік ЯК КБ І НА ІК ЕЕ КК ЗЕ ЖЖ ЕКО ТЕ ЕХ Е АЕН 5 и ЖЕННЯ НИЖЕИ Ж ЕНИ: НЕК Е КИТ ТЕ ЕЕ ТЕ КО ЕЕ ЕЕ КТ ЕЕ КНЕЕ с. ВИННННВННЯНИ НИЖ КЕ о ЕЕ ЧЕ КЕНЕ В КЕКВ Х о я НН НЕ НК ЕЕ ИН Я М щш ЩЕ ЕНН я Ух ШНЕК «Ж ЖЕ ж ж з ї ж : Я Є ке ВЕНИ НІК ї ! 5 ше: ШИ ше ша щ хе ВНІ ЕОЧН ї ; ОБ ИТА І 5 5 : Ж З Кз ! : ШИ салона : МИШК зежих Ж езайтнанк ЖЕ ж кіст евкорааноях фркантий
Фіг. 2 Кван чу: М, жав Р: беевнв фін вв: ЩО 000 ння х і Же В і іненнккноа Ко З ї--4 ГІд я с де 7 МК З дек ВАЛА В КВН КОЗУ ї 4 Тр дн ко вне 5 ї нн ння В З Ж РБНИЗ - 400004 я ТЕ З РОЗВ ' ше т же т а, ї же З і КЕ їж РОК З е і Що. Ак Прихужикьь 2 З0офо- Ян я й 1 пн рун роті ше й Я РУ З Мед яти й 4 Ем и Ж, ення і не пкт я : М не х т» МАБп ще нУу ї Я о-ви ж ВОНВ - ! хна хв х 1 наякеню -- з 7 МК У ї 5 : не і. вроеми я - М х о А ОРВК ї 5 АКА ж ВВІВ Б Я й х з ї р. г. 5 1 Он, со РЕШЮЄ 2 З0000- ж ОБ що З денна не дя Хажжжжхяяжюютьюя чу у юю нн нн о 1 - З 4 а 8 З ах з ПШедів нт
Фіг. З
Зав То хр умиь МЕ нертузумак, 1 Же Во ЗА, воєн В Есе вва Дон оз. х ї . а зап ї 1 , тив и , . ї г ж 77"; Ел их 83 « ше ки меш та а, й А фіг. 4 з пемажу 0 растувуває, ЕЕ: пертктумає, ше Хол РО; МАТ, код БЕ: пісне чн: вниз. Ей лю. ж -
аа. ою" й і . ж як со ХЛ 7 Про а «їх мя ж ж й ово бод ев ою а аа; «г ее іа
Фіг. 5
МоОеТ я шк а РОЗКОЄ в «й РЕЗЕЕЕВ: Е щи 5 Їемемюмюмюмювювкячячян зи в Я о З че чай мЕгЛЯА ! рак РОЗ ВВО Е зав й х оососікіюсівот тою ші рн т Ж ж мкгума
Фіг. 6 ВК: РЕ 1НХ ДЕЛІ зав: ВЖК Я авасні ЗК віч Я Ззанаве у Кран 1 РВЕ ЯКИХ Зввквофкевиви МЖК У Я АТ денж, хай ЗЯв ям ' , х 7 як - Е 4 -Е Ї щи Е а 5 : ва : 4 Е ї ! й Її а і ї м 4 і ше ! жа ХК ж ж ж юю жи тика кт кт й ге Ї, «жиму а свв Й отновтвнси с ОМ Ся веж з я» 80 Ве що Мб Б» 65 ве ще
Фіг. 7
КО-НЕКХ: В ЯК ЗОВ ВЯЗАХНЯ ЖКЯУХ З кра За, хроваких Я фран: Я: КНЯЄ ВОК Кеоефіковнни МКК В ЯН ІД уретрі о осо о ом м м ла ла а аа а а а ла дал лан ан плн и тя кн я вел ев, Ба ЗМУ на ве і зе й яке о ж 4 їз з Фа за в а 155 а ЗБІР за
Фіг. 7 іпродевження) ВЕЖ: вихбе монекзенальне вахта птоха ях ЖК ал ВИК Же Я дра ВІЗ Зрази: Я; БЕХ ЖНр ЇХ гака анани Ж ЖЕ ВЕК иЯХ ї м оБашк: хви Іо вах і ! жа ; І ї В ! В Ї І "в ї М ХЕ у ах в Й сх ку в вд я Як 5 ща о за
Фіг. 7 (продовження!
КОВКИ вихідне музею варення крива НЕК ЕХО НК. Акіяса Я арх Ж зркаюях АВ Бека ж: МУХА КУ Кммказомкнняни МЖК: З НН шо Хм ж Довж. хви ТЯ я Ж я І з ї ка ва. І : : : г же ЩЕ : ши ; х - І 5 ; . шк : че сш ! ши Ж -е і і І 1 я з гео ис ионосе «долю фвооооонодівнну кум юсвеювся окіст ск ок ВИК. вав Зв аб вв вв о 90 мо же зо жа
Фіг. 7 (продовження) ВЕЖЕХ; сталонне монокловнальне м протя НЯХУ ЗВО АНАЛІ КИК ІЗ тру ВЗ прямек ЗІЯ фриомю Кх РОСТЕ умкрістяшне БЕК: О0ОСКОНИД, В тя ж, зеак аа же й чо | . о ЖЕ і; й У ше Я 4 г літ ії 1 Й ї о а ; Х | с ілеюнй -е й Ї дення дов ен ого кн С о памяток чно ооо тн ВАЖКЕ ва а че ак вк ЗБ зав
Фіг. 7 (продовження)
КСО-НЕРХ; етилен захв Бех проте В МОБ АНАЖІВКЕХ вени казню в Зразок 42: ВОЗІВ |коенфіковне НЕ ка Ні зах МЕ Довж: лакноні ЗЯНК вк т і яаЖе г і зе
Б. зх КЕ х Ж Ех : й Ж і і 4 й ши ль ЖЖ о кАл фо Ж дж КВОТ ік ковток ВА ЗК зе 20 яв ве вв ща б 335 б ве жа (ріг. 7 (продовження) ре ван ! ря Траст ниргум / знек ІАЕ КО БЮ ! щш І як вве . - вв ккал АНА А Ан НК В свое: що
В т. ВН 0 ФО окнннрннфнниф нн ТЕ Кф, ком й ж Й ки хо є М Жар за со ія ї В ЗВО фени идертяадрт тт р дв ееи чечаченик х ви ви ' 4 мЕгча ДЕ
Фіг. 8 уж ВВЕ і вт 1 же Кірсвнухю ' ї жк Пекун кума - З днина оваладвогвой я. -Е - Е ри Ж оезваннйь. соні кю в са що " зе Я маш м г -й ся і з ен я: ане зб ма че Воза'єметна)
фіг. З ге Ваза ' же Ва і кн 1 зве Пес ваоуюь І зйзж Пере ава. хреепучумоі М Ж ж Е «ех жа ум : 2 5 : Ж 5-х з : х 0 Кр у еонстьня Фе я НАХ хг пеня рн Ж Ух ї " 5 З 7 с 7 нний «каа маку ма
Фіг. з (продовження!)
ДИКЕ птн Я ЕЕ Жак Дт яти єси ЗК КТК ЖК я Ясен кукі Ес Кік кх їв з ЗЕ то " іо ке т ХО шою з Ї як в Ви ДОМ Но
ТО . ска . жо ї їх з шо КК о влбікух 335 чі Я роя к і ТОЖ у Жінківув кв СОН ВЕК я Ї ї ОБ, онко У
Б... Шк Я ЖОВ ак в ї : Ж с: З. . . й се х : ЖЖ їх ХО їхіа : ж я с о сх х
Яд. КН п, -ВВЯ 8 ВХ я 6 В.О х
ЖЖ. 1 ІА т т ї ї ї х їх . ї ї її 111 х х Її ї їх х. їй ї Я хх ж Еш І о ї Іі юне ХХ х жк її ії її ї і се нн і Зачна ї ВЖЕ ОХ ОЇ КО окодюллллланнссок п ни ОВО ї КкЯ Усе ОХ ї т ї хорт х ва Ж ; хоть ІН У ї ї Її Е ї Ка Я х Ве В ОЗ ї 3 ї ї Ех І ш кої ж ІСІ т ї х ї ї х У дав х х ОО ОВ ОБгТЬ уко р В охх кофе Б Х із 115111 5 ж жі х ї хв х шо фр Пеня 111 Оті х ї Її 15 Ж ї м т КВ З с ї Їде Ж 3 ХЕ ї ві ОКО еВ рев фондю Я Е «вх Ух хх ї:114щ5І ї живи. ї х ї КК т вої 11115 ї ї Н ї ї ї зх х Е т й 1243 ї їх 3 ж х У х Ж ші її 1131 ї В де лдкнкцан Ж :
ХУ. Мф сфе духу мк и ЖК Ж з аа 11 у м м м с ДЕ: Я 11:11:15 ї ЦЕ і ї Ж 5 Й сн х Ж 11:15 ї ; 3 ї ї їй ВН х "Ж 1 ОО дю фм и фо фююсс Мк Е ІНШЕ х їде Ж Н ї х 5 ех ї К хи 115 ї З: Ї ї ї ї З ї Е хви й 155 : КУ І ї х ї 5 її ї зав її: А Х ней З х ЖЕ ОВ; її: фея нн ан сп снід, нях х з У її І х ку Е ; їх ї Ват ї ой ї Же З Ха ХЕ їх дек 1 3 ї с. ї ре : хх х ї с її 1. Дефо р Донна фран как я ї Р КВ ї у Н Її ї х 15 ї . у ОК Ї ї З З ї ї 15 х ОБ І НК : ; 3 ї ї ї З зр х З 1 ї ї ї ско . - ЖОВ ЖК З окис кети опи соти щи ВИДОВЕ С КЕВВЯЗЕКВІ ВІВ ВИ і ж и її СОСОК С. їх з ї о ї ї Кф нею екю нн юєе ет юю екю денно и. ірина тий ще ПОЖ дж кю тю фот ня ди х ях З БОЖКО Є х. х іх мо В її Ж ДПК ек ооо нку фічкчкчь ук унчмкх кю урн й х ВО ОМ КУ т : х х х о в х х 1 Корж ююсесоюодосеоюют ооо юютитююк оф пооюоо оо дою есоссосо етос Е хх Є 7 х х з х пр вюх В ані Фу збе не ренненех рненбрнннннх ен ї авг КУ 3 Ж ї т. т МОХ М пика ми Ме Кк жиє ее ВК мк й ДК ВК КАХ же я к 5 ща з у ку Жосктчь я гу хх. Котюк ее ва ее ї СК БЕК ху Зако їх ї х ХК НЕК НВ ї І ЕЩ вав ; ї г ВОЗІ а РОЕ І ШЕ озатекни няу Сохнкккннккхкюю як ввкнннанннннянни ч х ї т ї ї ї Ї Ж Е : І ї Ї їх х ї 1 : : 3 : кож Ж т ї ї ї ї БЕ Е : : : ! І Е т Її : : і Ї ї ТЕДДІ тт фе Кф тот о тост сесетснн Еї ї : ни жі і і ї : : : ї 5 і ї ї : Ех «ї 3 : сх Е Її а : 3 : - КДД ер нн я жі ї й іде : : Е 1 ї І : і х 4: х і : 5 е : З х їх х : : Ф : ї х тя Ки А нн м. ї ЯК» и ТЕ й т ї КЗ й Ж їх : 1: ї 1 ї їю. Ж ї : ; ї 3 ї що ТЕ ї : З ї ж і ї ЕООБЕЗ с. Діеєтееттт тет есоттстттсст ес ку Я МЕ вдруюд юю Мету отетеие м о Кусто флот - п ї : 5 : : 3 ї 1 : є: З ї Ж г ЗК голлоггототтотсттос соток че . : АЙ фе іреотсетототеттететфоте тт ДК фр ї їх ї ї ї 3 ї ї Е 3 : ї ї ї ї 1 : як : : х ї : : т З Її св: Шугєкехххюкттккхук ххх кхткккуккиикиин нини кукує кити кукі Кк к Кк ЯК т т т й т Е З х ї ї н ї - 1 ї Ж ї : : ж ж ЩЕ : : х ї : : З ї ї Ї Її : ї 3 : : ї : : НИ . ДН Дике ик кн КК Кк Кк кА К КАК хх ккккнкнЯ Ж ту : : : Ї ї Я ї : : : Н : : х : : : - ї ї Е х ї ї : о: ї Й ї : ї ї : їх а Зп " сдкккккккккккчнн КАК КК КК КК КК КК КК юх дкокмаке р ша це щу МНН КК ЖЖКНАКАН в екв хни т Й Ха злакова ее нн нн ня Ї і 1 о ИН Коня з : ЯН Я НІХ ! і ! і ! 1 з пк -к же З і Ж вве КЗ важила і ! хх с км ях з і С яна Шо ЗШ оухторнвх ва. ШЕ: ї : : 1 Її ї ї Н щі і ї ї ок; пеки Кир ; Я : : і ї7 се а 7 : : : і : 1 : : : : ее і : ї дев нн в ВВ дон мене анна ЕК : ; У, жа : ї ої | ов : ї дріт ВА кедр ли лах ху ут оре : ОАЕ : ї - ї І Ж ЗК щи їж ї ї
БЕ. ро уже : КЕ : 3 Ж : : ї во : в з! : : з ї : ї ж: : : ЩО сі ! Її СЕ : : ї | Ї ЯБВД- тет ну шипи «Вот оте фе фут ї ї : у ї ї їх з хх їх Її : Во: І : сш і : : : : У к3 нн в в в в З мо ! : Кн Е х ї З : Ко І : ш і : й : ; ти В ї ї Ї КІ ї ї Ї : За хо к Ї ї х ї ї : ї Ех 5: : ї : її ї Ко : г : а ВЕК В Б 5 ЩЕ факт ків еТ кквкмл о ЇЇ остов Но рддннннннннннн Дозкалеквевн вена і КАМИ х ПЕВНИХ : В ї ие т за де і я ВН Щі 14-59 3. прастювувий Я дохму кс ! З ЗВАНЬ ЗКУ ЗУМЯ Щ КІЗ в правим М пхтнютих З юююккююккєюкєюююєсюєєюююєссс осот кн т Кр ! ї ї ї ї і Ї І ї ї І : Ж ї г хх ї 1 зобогеттссотсстттстттоотт тет. ї К ї ВД я фея кет тет ЕХ ї ; ! : : її хх ї : ї с ї кг Ії : : їжа і в : В р . ще ' ї . ї : : ей В кіх : КЕ х : ; ЗО жу ї КЕ 5 ; : зв НОСІ ї и в! ї З ее В В ж КЕ. : Ек ї К ж. КУ доюююєюююююююиєю юки у у у у у у ут у до туту тю коуч вк й ж | Кт ї і ТЕ ї ї : їй і ї І в 1 нії ї х : ї НІ ж ІВ ЯІДВ елллититеяя политики лилоКх ПУХ У УР У У У Ух У кун І і. а х п ї ї т її Е тЕ ї : ї ї т Кк Зх ї І : Ж їх ї я : : і : В ш І! : ! ж : КЕ ЗД З і Не : КЕ . С дииииииии І ЩТТИКХТН ЛКК КН КН Кук кю кю к с ккюююююєкюкюююннх У я : ! ї г. І.
В. І ро ро : КЕ : ї І : 3 т КЕ я НЕ ЖЕКи ефе Кит ех ї : ї т і я. Ї : : Її Е х 1 ї : : є у їх і ВК б ЗЕ ав 5 рення " ин АНЯ сон . В Вих єювв вева пока : о ще Кт. СЯ ї БАНК АЕН ї о Щ ва фенів за Хо зо А : ГТ вемняя е приєзузунай ї «ай й 1 ШЕ ххтажвниху т З дкккккннккк кн КК КК КК КК КК КК ооо КК нм Ве мнннн ДУ КК ККУ КК КК КАХ КК УК А КМ КК КК КК КК КК ЖК ЖЖ КК АЖ ЖК КК КК кін жин т: : : : : : ії | ї : : : : : А : : Її е Ї : ; вне: : У з 1 : : їх т : ї ї ї ЩЕ : я ж ї і її хх: ї К Дітххххуєуютухукуєкюю ку ккк ке кк кю юю юєєєюєюя шо х : я а ї : ЕЕ ко : Ї Си : нщьшш : і Ж ї : з и Е5У ї І і З ллианнлианилали лання ная Дала М алла лання А ладнання Е тов. : ; : ' НЕ ї : Іа ж ї : я КМ ах Е : : : і -к ДЕ я У У У УК фр у и ше : : . : ї ї ї ж Її 1 В ему етнос остео ноююіДосонюнсинноЯ о | щу і Ж х 3 ї ї х ХА с ужжжмхию миня з фа фе юю З ї Ї і : : Ек; і ВВ кий й ВЕ З ва Ех рих ТАК кн і раль х Й Без лкженнвнікнаи
Фіг. 1ОЕ ! з ВАТИ ї ч ссжнж ї прое РОМ че МАВ лм ів і. Го МНЕ ЕВ: Ї о СХ о ше що ко. но М КС з "Поло осо В - ккд Й шо Ж Ї и і Бо ож 7 Е - ВООЗ : ж т щ " що зх Як ї Ей б Я : ож с ! що я з к ЕЕ Бак Тх ох ї з З а ! Що енкрносостофнн З зи " Ж - ке я : їх ЖЕ ' г Ж 5 МВ Я М Б і Ж і Вихеня ї у ча че Канвентрація ТС; вгма
Фіг.
оон вва ах Траси Її фо трун не Марк ВК і; КУ я - . Е Е : Я : Я еко но как : ех Ясон й г т Ж френч кл у КВ Кк ро дф как у фур как ку Тр кін. Вк Ж Б зе Кия Конпенкрація об ніна
Фіг. 11 (продовження! чав: ї скл «аг ? Тон МАкВяНи КВУ і ож їз ' я и Є: ШЕ 1 зак ВВЕ і в ак іс : жк - в х й ук ЙО інст І змен ще а ще Я Б че ніх мен : рт яке Ен Мат хр БЖ шої че ВрАІВА 5 ! о що ня че ; ЖЕ | Х і. ж НЕ КУ Ж ой щ и Ж о г т а. і жк. дя - Ї З КЕ: ви | - ні дав дом леж ту Жора я вжи аа за за 1 в че їв ім ма «ріг. 1
Как ро і ОО ян ВУХ З Гог ввив і КО ге воза во її : - : а ї Кз ; . чи А У о їх Я г і р Е : їх жи х ; : вд нене нн я ва ; й на 5 й, Ко г ; Я ГУ КЕ К ках ї Щ: же Я Верн зе з ще Женентрація Тибх сгбн «Фіг. 15 шк есе ; Низький НЕК ! як Ту ! з І й Дофувозввияеи В у ВО до . с ре МАК вро В і Ж вва Їоечцннниннн кекс) ти т Ї ко ЩЕ че Оу ж : сі ї. Є Х нн ; ШИ вано вм 0 а не АЛ, мем іі Зритумя ! тех й ВОШНЕДТ ВЗисокні НЕК пе і п фе Же і ї зво М окон ВІКУ Е а х х г ЕЕ ВУ : хв» ХМ в. г. Ж Бу я о ж В 780 однюеійоооосккосок нюх ж і тео ей охоро нння ре ї хо й З ЩЕ ях ві х :
х 2. . і он ан о З че а АТ, мкм
Фіг. 14
Наріане Бсук з анпевконь афіннієтв СУЯ) Гендер вва КВН її ОСА Е зо ВЕК вижн БУ Я: Хілл АКА КАЛ ВТ КАТ ТКА ВТК ЖЖ дама 1 ї Ж х ак : Ук З х З ма х я Ж ї щі і що : : Ка ща ; ж Ж оо т ях я Ф я Я С ї МОЮ ! й х 1 й Ж ніконняь ТЕ ях ї В З що й ЕЯ ПАН ой за Нихіжна ча аж зе Ковнентраній Піх ля ріг. 15 Варіант сук з низькою аФінніссв (КІЗ зн Пофужниткевис В ІНЯ ї ОД 00» Маре ВХ , - ши. - - є С - Й шОККо : . - і ш 4 Ж В КОЮ 9 | й Ж Ж | й -щ Я Я же 5. і у і: я - 8 Ї ж фоні фен ВВ она ик тн ня арніки за пихіхна ча ще не Конпенурааія б (мах
Фіг. 15 (продовження)
МЕЗО: зваіннинієть ВаМЯСьНИМ ПОМЕТВ жакет певна анурія, каз за зо ФУВКХ Треоелідуанють злу квівавнях кислу оф веаннья МЛК» Му: КІН» зідеріяетх певна ЕЕ ВИСО ОКО БЕСА МКК сс САБЕ СОСОК ОБАКСТОАЮС ТООТБАААКЄ ЩЕ МУКА СПУ ОАТЕТ СОТОК ТТСТДВТТАС ТАТА СТАС АТ їлі БАТОН АВК ААНИХ КТБДАдААВ СТІВА ІУТОКАБАКА ТалАТЄКТАЄ ХЕ САТ аКх АсТОСККВса АССАВАТТКТ СКУ СгКЛАСААТОА СТІ ТИВСЯХ З атестслає вемсстеся тТесВЕСтКаа Фета пСрОоващеєт сто ВО ТРАСИ АсААбрУюВО СТИСК СОТ ОКА МКАС ТАК ЗІ соте ТіослЕову ант ВЕНУ КСО ВЖИВ У КРАХУ СКАКУН КЮВУВК КЕН Є ТАНОК АКАТМУ КМТ АК КТК ВОМУ ту СВІ: УМ КО РЕК ТЗ: МОТЕН А УОЗ: КЕ
Фіг. 1бА ВАЖНИ ЩЕ пекан ВаенеиКх кі Важ БАНК Ра ВКМ. ВО ЗК Ящук ВУХ Хр квууау» ВИККВУНІЗЕКВНВКИЄ З'УХНКУ З КОДЕК ЖЕО ІЕЕ А ДУКЕЯ УКВ МОМ Макквжов жено печева ї збо шесаТООЄЮЮ АеОТсЄВит КАСУ ОбККИСТЧАНС ТОБТО БІ МОВА КТКА СТОЖТСАЖХІ СТО ТАВНОХ ТТТООКТАК АСЖЖІУСККТК ККСТАТЕКТЬТ ІІІ АОС ВАСУ АТОБаАлх СТАВ ОС ВТТОБАААТЕ ТАТО ТА ІБ) сацтСаТОМ АСТААВТВСЯ ВІКА ТІ САМА ОСКАСАТВ КІЗГАДАДАА АХ АЛССТСТ АОС АСАБТСТАЮТ УКУС СКОАКТАКА ТОЖ НАКТ СТОКТОКТТА З ттастотосв ваза САТТАТАТІА КТС БАСТАСТМУ БК ААСИААЄ БІ СТОК БСК Комикс ЗекНИ як БУКВА КРОЛІ КА МАСОК ЕЕ БІКТУЧЕМЕКИКАТ ТЕКУ КІ КМТ ВАТУ САВКА АН ЗБУТУ може БУКА Е Саки ЧЕМРЕКЬ Може МЕТ АМЕУ
Фіг. 108 (продовження)
ВЕЖ: певуВЕДхек Не ЗЕКрОЗЕК вух «МЮВ важвванх ЛІВ ХВКМ я: ВЕРН, ЗКУ За яру є БЕХ ТЕН вен Як: ЗК ВОНІ НВ КВК ВК КІЗ дк ВВ ЗВЕК ЗНЗ Св» ВСКОВУЖ: КСВ ВІВ: ДЕОВеВЕУк Є МОУ 13 СЕМ ОКО АОС ШТОК собовАВОКЄ ТОСТСКАОСЄ щі шо стбаваєтт сет тОосає СстСтТеБАТЄ ВЕК Те мата і5Щ оКАКЮТОВОС КЕСКАЄТЄ САОБКААОВИ СТОЮ БТОБСАФКТА ТАКСАТАТКЙ ІДі зссоаютАВТ лартастато гАЦАСТсшу ЧАлОБОВА ТАС СОМАЦАЄВА ЗА ТТККААЄВАЄ БЮСТА ОСА ТювА СМС ТВАВВ ОВК СОКІВ ЗЕ заснув дана МОСТА КІСТ ЕК ТТ АТО КА З: Моє ЩСАССВТСУ СА Мосліднакеть аж ікУкВКк: УК УВНИКУУ У В САТИН ВААС УАУВКЮКВ МУХА ВАК ПОКОЧКНЬ ТОМ АВТ ОСАЦВ АКОУКО СЕУ соки БУОМИ Сива: жи К УТА СО СЦКК АВХ
Фіг. 154 (продовження) ЕІ: зоезинннеть варякельном ссааєть вожкего лаки аезиих, що за яке Тіско она» ВЕККСТОКЕКННННХ КОНУС У ВБІК НЕБЕЗ УКВ. КОХ ЖЕК Во НИВКИ ї БА БОКАТК АТОМ БААОСМЕТЄТ ШОСТА ТАКО І ОКА БІОААШТТЕ ОСТОСАМСВС ТРСТООСТАЄ АТТКТОКСТВ ВСТАЄТАТАЖТ Б ВААКНИ ТО Об СТОЮ АСТУАВЕИ ВТ авАА ТТТАМСТО Іі авта ВІТА АІЦеДААТТ САС АВ СВК АСТА СТОСАВААОВ Я Аж ТКА АС СТАКА ММК САО САВКА ТТ КТС ЩІ ТЕТЄТОЗМОА ЗБАСЕНУЦСЄК АСТАТЧАЧТА СКОАСИ КС ОТУТ АКТОМ ЗВУ що Сто «ТАКО СКАКХ ТІосліднвеютт МЕРЕ КАЖЕ АКІ ВІКІ САУ ІА ВОВК ІК ХРОВОМЕ УЕМЕКККИКАТ ТАКА ЖИВИ АУ ТК ОНКО СВК КН СУ МЕКЕКО СЕН ОБУ Х
Фіг. 15А (продовження!)
ЗИЕНКМ: песлідимеве Варені «Нео вам ЗаНЕнкая Вкрияч ян. их нут СКВВНХ Віко НКАУ КЕ ООН Нелі НК ВИХ КУН. ЗАКО ЄХ ПОН 3 Оса ВО ОТО ВАСКО ТОНУСУ еМУТЕМИНОКХ ЩЕ пес ФупАлОКІЕТ се ААСЄ ТЕСЛОШСТЯК АСК БСТАСТАТАК її вавстева Авосавє стовасає стою аттосваюа ТТТАТОСТМХ ЗІ ВАФЛІ АСКТАСТВАЮВ авт СВАШрОСАЛЮ ОСА КУА ЯКЕ КТСК КНУ СС А МИ АСК САШЄСТОВМА УСТОАСОВСТ КТС ХКСТА МО ТЕТ А АБАССККАЮТ АТОБІТАЖОМ СОМСТЮБІКС МЕ СООСАКАЄК ЗБЕ АСК АСОВТК АС СОКА ШЕ Тковта авт» с ухя КУ ТУ КОН АККУВЕЦ АЗК КАНУЄТ ВІВ У КОВО ЖАВНИХ ЖЕК КАТ ТАКЕ УМ ВМ ТКА КУ ККУ ПРКеТУВЕ МІУ КИ ККУ КЕНЕ МИ РЕЯ МОЖ РЕЖ
Фіг. 10А (продовження!) ЗА ЖЕ: пехлідення м: время кім важку ЛИНІея ЗТ. вне З 'ялує У Віримо МКС КЕНЯ НЕК МКУ Е ПЗУ КМ ВОСКОМ КЕМЕУ КВК ЕД ес КеньУ М пет а пТАААКТЕК ССТОСлАОК ТІСТО ТАС АКТТІЖАЄСТЬ СТАТИ ТАТ І вБАСТИСсОТО ВАШ СТУБАСВЮЮУ ВИТТОНСВЄ АТТОоСлАЄЄВА КТТАТССТОЄ ТЗ аастостАтТ АСТТАСТаСА ВІКА САБО ШОКАСВТОВ СТОЯВ лІ АТСТСКМ ВСУ СТАСВ ОСаВСТСВУ САБССТОВСА ТСТаАХАЄТ СТОСТаУСТА Ж ТТ ТУГА АМС ТС ТАТА ССО ТЕТ ЦЕНА ВЕ парт есте тюА ВЕ НЕА ОЯ АН А И ТАКСИ УВА СКАТ А КМ У КОВАНІ ТЖеКВЕКИОКАТТА ТЕ ВАНН Я ТВА УСНУ АКА ТЕТУ Ок ау ТК: ВЕК ПОЖЕЖА
Фіг. 16А (продовження!)
МКЕННЯК» гену НЕД НК еНЕКІ сКЕИНі ВаЄКОЮХХ лю ВКУКе ву МК ЗВ я Тен вікі кеВ. ЖАХІВ ЗО ГЯ ВЕН З КЕ вх ВАДУ: ЖЕО ЗЕНИК ВА і ЗбощАаєтіСа БІОС СТА БТ АТ ТТСЬКСТЯ ЗУУТАКТАКАТ ДЖ ЗВАЄТОЮОКО дубом СРО ВК ОАККщ ДІТКИ УЕТАТКЕ КЕ і Аа гАТ АСТТАСТАКА зт клану САВКА СТО ЗАЗ КАТОК АКТОСКТАТА ТИАКСТСВЮ СОС ТОВСА ТТОАООАЄТ СТОСТОТСТА З тттСЕсТтОСа абОШСКОСАКТ дтОосттАСюва Кома ТТОСТСВСТ ОО АСНХ ЗБ АСВ ДСС ТККА Тісно ВМкМУКее ПС УМАНІ ВІТ САТ ВІКІ У КОВКА ЕЖУ КВ ОКАТСКАВЕВ КМ ММА У АКТ КК МИ КА сТТУге КОН СЕ КУЄ КОРОН КЕ МЕЖ; КК ВНЗ У ПА
Фіг. 158 (продовження) ЗАЕВКВ. вве» ВНІ ОН НК ККЕКІВОКСТЗ ІВАН НС ОЗНЕНКУ ГІВ ЕЕ ІМЕЯ, ВНУ ЗВ ЗУЄ МНН Кеслідееннть зуклейновх жиле Я ту Зауучтня МО НУ ваютєть вух водзеві» краях крему: їі вра моса ос в оряєст скат зов томеє ТреТОВеЮЄ БЕ Тео А ОТБААССИ СТОК ААСЄ ТС АСТРА СТАЄ ТАТАТ 151 ваастовете даємо сте ВТС МТТОСААЄВА ТІТАТОСТОЄ їіВвтР себто ТсаАТ АСТРОСТВЬАХ ЗМОВА КАМУМСВАВ ФССАСАСТО СТАСВОЛАДЯ. За акт астесстаєх тосеестсве сс тасаА ЗТ СТУСА ХО ТЕСТ АЮАССТАТСТ АСТТТОАТТА СОСВОНИ ТАТКО ТОМИ ЯН МАС СТОЮ ДУКАССВІКУ СКАД Тенти ніст: заікноюух: УЧИ КИНІАКЕУКЕОУ Кі САУ МКУ КО АК УВО Теж ТАМ КАХ МАННУ ТАКУ СТВ СЕК КУМ ВВР. СПЕ ТУКА ОХ
Фіг. 1658 (продовження!)
Кнастіавнске. нжееоетіннкх. хзкмах Спа деурєвенх знов аю ВУ: КЕКВ» ДАНЕ Ю синяк В ТЕО ОТАК СТУСА СВОЄ ВСТА ССТАСТВКАТ РТ сВАСТОМИЄ Спа СМС СВОО СКТОБААТО ТКС БАА ТОТАЄКОСО5 М Стос ВССЕОСТАОВ СКСАвАВИТ КОАССВОХ БОСАКССТЬ СОБКО ВА ФА СИМ КК АСЕЦССТАСЬ ТеОААЄТОВО САБЕСТООЮИ ЗОСОВОБАТВ ШКОСОБТОТА М стек вм ЕеКККО ТОТАСТАСА САМЄ ТУЄ ТТТБССТАЄТ БОБОКСАЮВИ ЗІ сАСКЮТОВІС ВЕК ЄТКСЯ Т Послідковннеть закненеи СОСНУ У КАРА КЕ КК КАН ВОВКИ УЮ УКХ ТЕТ АСКУОСКАКТАЮЕЧКВ ВАМИ БЕК КАХ УКСАНВ У УПАК АКС ТУРУ СКК АТХ Срвко: ВРИВОВО УТ у КВ СКЗ: ККУ ІКАЯКАХ
Фіг. 16А (продовження) ЕЕ: укосн ен. ІК ВАНЯ ЗНКНУУХ ВВОКТИТЬ З ВВІВ Я НІЧ, них Б кхуе кВА Х Трекові мУхлещвих КНоОВА Мідкуекана сосен Вико Бінекоь підемо певтеах ї ших ЯССАТНССЄ ВОСТОСАЮМТ ОА ЕСТ БОКОСТЯАЮЄ ТОБТО ЩА нео тТтТЄв ІбААОЄТТ ССТЕСААСЄ ТЕСПОСТАЄ АСТТТСВСТО ССТАЄТАТАХ їЇ25 ААВСТОВОТЯ АЧС АЧОЄ СТОБАСІ дет цАВТО ДІТОСААЄВ ТТАТОСТОЯ ЕВІ ЗАСТ ТАТ АСТТАСТВЕА БТААТТІ КАЦОБОСАНВ БССАСАСТВА СТСАВаААВА 43 АТЕСТЄСВМЕК ВСТОСКТАЄХ ТАСБАСТСМх САБКЕСТОВСА ТСТОВОВАЄТ СПОТеТСТА ХО тттстатОсь вот т АТОАТТаКоа Сет ТТТОСТТАСТ ЗО САНОВ За пастетевя аск Терен уж. ко НИКВ ях СУТ ААН У ВРИ АЖ КАТА У ВОВКИ МАКРО Е ТЕТМЕМЕНОКАТТАВЕН А КНУ А ТКА САНУ КО ОСАМЖЕАХ КІ ТУТ УВХ СБ АХ ВОМ Ся МЕЗО сок аеро жкАх
Фіг. 168 (продовження)
ЗЕ ЯНКА. звкокінкВнЯ тв» еф ВИХ «УЧЕНІ ВЕЖ» ЗМЕН В ЗМІЯ, ІН ЗВЕР ЗЗНе ВХ Дексвівов ев НАРКОЗ. МНЕ Я КВК. ПОТ КВУ Кіксті МИ: КЕНЕ; Ак ВЕНУ КЕ Е шен Ко САТ Мет ВеТОКАСВ Особа Ода Ж КК ОСОМУ БІБаеМми ОА СТО ААЄНІ СОМИ СТІ ОСТ АСТАСАХ зх КАСУ СБС САСБОСАЄЮЮ СКАТ ЖЕО ОВА ТСТАСЮКСТ ії спос Ас МоАССТАЮВ СОСУМУМАЄТТ ССМЗОБСЯА ШЕСВККСТОЮ СОБОСВАЮОА ЇЖІ сазовссАЮЄ ЛЕЖОКСТОСА ТОБАЛСТОМЕ ПАБОСТООЄ АСКБАСВАТА КОБКСЄСТЄТВ МК шттстОСюкс ВЕС ОССВСт ВкБИСтТАЄТА СДАЄТЮСТЯЄ КТСБООБТСУ БО З кассстоєте асбатстогв ст Такнхае В мнтть. мекв УСЕ У СІК УКАРОВВ У КІВ АЧТ ТКА КАВА КВН ЗБЕУАДКАЖ КН ТАТ ТАКЕ КВЕСТ АХ КЕОСАВЕН КЕ рОМ КОМУ НЯ МПА СНАХ СН: ПЕЖО КО АКА КО ВІК КО УС
Фіг. 155 (продовження!) МЕЕЗЖТН: сеномхоххнте евріноюхьнх сс зажкее: ЛИМЖКТ. яЕгКУХ Вк, ЛЕК Зак вух СИНЯ Гевко ем ех екв КОН КЕ Піх у а СК ИИНННИИ ВОДУ МІВ Зулеркюю ХеМч У 1 Бо аоров сан Вова соте оБоосткаєв ТОДАВАМЄ ні БжСТОВ ЗГОааТСк СОСТОСАаН ТУТ ТАС АССТТСАСОВ ОСТАЄТАТАТ АЖЕ сл САС СТО ААСВ СПОН ТИХ МИС АКТА А ЇЖІ суто аСьаЄТАТИ САСАСААМУТ САС АСВ ЯТСАКЦАТОА ПОАОВАЄС з еуссатомє Зеедестаса ТОВСТІ САБОеСТовнА ПОТОВЮАСВ сООБКеТТА ЗПЇ тато єь вола А ТО БРИТВА ТСН ТАТО ТЕЗА ВІ аа АКОТ КА СКОТТА Піолевовиенчть повен УС УА КО УВК ВС АТО У МН ВОАС ВСЕМ пет АСкинУТ МІВ ЧНр У Е ВЕК Т АНУ САВИНОСЯВНЕЖВ НИК Пен КуУті кт кн ПІК КУТ СОКАХ КМ МАСОК КОХ КЛ ЗНО ЕН ОКО
Фіг. 158
ЗЕ ТЯ повхзвннвікті» зн К СКАТВЯКСІ НОІЗВОКТЬЯ пз Вісі ЗЕРНО, ВОВЕа ЗВ Яеапме ФЕВНЯ ЗТ ЕСліЕКУВаНОА. зву КЕКВ. ЖВКДИКЕ КИТ. ПКжАе ав іст землю кімена» зонеркяхе пезхенех ї шоороюоююя зсоатОое зБетТорАве тт совет тет ЩІ ее сіб Коти СТО АСТМА СТАТКИ З Бест ПИСК СабБоцАВОВИ СТО БІСТОАОСТА ТТАВТОВКАЄ МІ ТОБ ТА ДСБТАСТАКО САСбАСТОКУ ПАС ГОНКА КСАДАВАСАА ааї ттоКАВОоВаЄ ОБСТА ОСА АТЕВА СВІТОВА ШКОСВОСЬК ССБСТСТвА ЗК ЗтАСТОпОСяь адаАсАТТКОТ ПОЕТА ОТАСТаСТОС БОСТІТОвТІ АТ КСА ЗБЕ доептакоєт что В Піна похзна екв аміаком ЕКО ЕКОН КОКО КК ТК КУ УВО ВОК УМОВОЮ ТеХАПЯУКОКВЕ ТК ТЛ ММ НАКОТАХКСАВОА ЖК КИ ЮИ СОКУ СКК: ЖАВ КА: АГ УНК КАН УК СОБІ КВУ У Ву
Фіг. 1655 (продовження) БЕЗ АХ: поссаевени: пкр лен ссеноті ВОжекуМо кання нені ха зв'я КНУ Тк ОВК тЬ ВИК ВКННХ КСО ОНИ КОКОН Не КИ ВИКО Кен Ж ЗОВ тСя ВУАМОДТСТ ССТОСЬН ТЕСТОМ АЄ Вест О ЗСТАКТАТВХ ТИХ ОВК СОВСАКОКК КОВКА СКСТТЄАСТЮ КТС ТОБ ТА ІБ СЕТИ ВОВКА САСОБАВИТІ БОМ Х ПІКУ ТОВ СОВОК ЖАХ УТОКАТСАЕИ ВЕЖ КНА БЕХА ТВ ВК Ти ЗЕ ТОМОЮМЧСЯ КМТ ВІ кІВште А ВААС ВЕСТ ТІТКА ТОБТО ТОЖЕТАТТЕ ІБ шоБОСаТ ВОЮ СОБТЕСКЕ т Тк ЗМЕН Пуск как МН УВО АРОК ВВ НМУ ОМ УАИЕРОСВУТМІВИ КЕ У МЕ ВИМОГАХ С АКОВКВНЕ КАК пек УТУВЕ СИНКУ УМА СЕН ЖИВ КТК У АСК ЕСЕ «СЕК: ВЕХОЕНК УА
Фіг. 168 (продовження)
ЗВЗНН зо КАВ Ме» ВК ОН КОЗУ ВВ и пан В ВНУТ кВ Я Я КВК ох ЗВУКІВ КЕКВ ІекоВовНтЬ кодує ВИК задевнеге пет И 1 ЄКом ас мега с аесАВОсТ ВИТ аБО Тео А пет МАНТУ СБС ТІСТІ АСК ТОК СТВОМ МІХ скАСТОВОХВ ВУСА ПРЕСАХ ССТТОЖОЮ КТК ТІАТКТТЕ ЖІ тома ЕТау ВСТА АтСВАВОГК СААССК Ам ПОС АТТАВ САТ АК я ВКМ АТАКА ТКАШЄТСУЮ СОСКА МОТО АОКАКТ СМТ А ЖД ТІТКА ВОВНУ АТС СИМ ВШ МКУ Е КА зві заст МОСС в щу Гео ВВ МНК КУЗОВ СКАТ МН КОКОН Троя МЕМ ТК САНОК ООН КНУ ПТУ ТУВХ ІМК УЖЕ ОКХ ОР К ТКУ МО ОБ ОО ВКОСАМЕХ
Фіг. 165 (продовження! ЗЕ; тер сповавжіякиВ, вк виВн ЗМК КАМИ ЖЕО НВО ВК, ЗУ са яд ев Трон ть НУК НННХ ХК Нр ТК ВВЕ керує МВ ЗИ ОВ ПЕН Ії ВОК АННИ ВТК АВС ОТО У СТ ЗНОС ТКАНІ ТВА щі пит БО СОС ТІСТА ТАК ВЕ КРТ Мі КАС СОННИК СЕЛА СТАС АТБ ТОВА ТККАСКК ТА ІЗ са КАНТА СВО ОТ ТКА ТСН КОЛОСОК ТЕ ЦК ЕАТСВК ВОМ КТ ПОВИ ТА КАСКО ТСН КОКО ТА, Зі ттастуроєв Мис ява ШТКІВАСВВС ТКА КТОАКТАТТЕ БІ КУ Е АРКА ССО Тонко вату ТУ, АКУРАТНИМ НВ ОМАН ТВОГО ОКА ТА КУ ВОВК МУК АКУ УНК Та СБ МОВО ЖИМ ЕМВ М КВН. І ОБЕ ККЗ КЕКАВНХ
Фіг. 166 (продовження!) ВА Вуаля сНУК МК сижЕІНе" ІННИ ТУ а ВУ ВАНІ КРОК АЛ АКИТУВ ЗЕД ООИКЕ ТЕТ ЕЕЕ БОКАХ КВІТНЕ У АВК тр КЕ АВС МКУ КК КО ВИК У КОТ ВИЛА АВТЕКНЕУ У АСК ПНО ВУ ТКУ
Фіг. 16С
ІКИХККНЇ НАЕК ДЯ З Вл ТКаНЕ Фе КК Я. судів ау СВАТИ УКВ ККУ КК ЗБТАККТ КИМ ТМ ТКУ ТТ КВК КВК АХУ КЕСАКЕК У УМА ЖК ТУТ УВІАХТВОВІ УК АРБХКА ТМ МАСУ УВА М ТКЕАКЕІНМІ КІТ ТЕМУ КУЛАК УВК КС РЕСКАТЛКЮРИЧК ЕВЕР КЕ СУ УЮ КЕ КМ УНИЗ КРЕККО КО ВУ УВУ НОМ МОКЕКОКУ УМ ВАНЕКТОКАК ФОРКЕРВЦ УК ТМТРМВЕКМ КОТУ УРАЖЕНИМ ТКУ КІЗ ЕЛ УВК КСВ УМАНІ ОВО наживи даних док в кзуаи а Се НАУКО КУ АКТІ НИВ КМУМЕМЕ ПОЕМУ НВ УТІМ А КМ ВВ АК САКОСНОКНЕ ВХ Е ПУНКТУ ТУ АВ ВУ УК АГЯЗАЯ ИН АВС ВЕ ЖЕК У В УЖ УМХ ЕЛ УНІКЕА УТ ОВМЕН У І КУ ТУРУ УКОСУ МНЕ КУ ВЕВУКРЕХ СКК ТРСТВАРБІ КЕ СЧХРЕУК РКК КУ КУМ ВМЛВНУВЕМХ ЖУК КУНВАКТЬКИКЕОУМТУВУ УТ УКОСУ АКА КТК АКОНІТ ЕРМАКЕМТ КО АСУ КНУ ВЦИА ЕК ОВО
Фіг. 160 невнесення зе НЕК вих ВЯКАМЯВ зх внут: ПЕРЕВ скат ІК КОР НЕНЦ КОКИ ще, КУ: За яю ЕХ У іоколіеввк тт» ЗВУ ВаХ ВОЛЮ ХВідТН рН ВІВ ЗІОКХЗ КВ Єз» ян КЕНЕ» Зара ВеВУВаУ ЖК ї ОБесКВ ОС ООБОЮ Вептескаєют БСлсАЮТСТ пОЕВСТОВЕЄ ТОдТВАОКЕ ХАТА МАКІВ СТВОМ ХТКЕЛУВМКАЄ ВЕСТИСЯ АТІКА АХ АСВ дАВСАЄН КТК ОСТ АТО АСІВА ТАКО ІІ Без Ут места ати Самоа ВСАВОВСТБА СТИ аБАКВА зі аташе астокстиа песвшстома СоБеКтоАСЬ СТО СТО СТА ММ ТУТСтТОУ ТК ДОА ОВСТ МТА АЛТАЮ ПАЄТАСТНКІ ГОЛІВ ЗА КТК КАК УТ Кррелувавне ку: ВоВЗсВКУ В КУН УВК Кука ТЕ КОРОК КВТ КВОКНО ВЕЖ ЕВЕОСКАТЬТ ЖЕК АХ МО КСВ ЕХО У КСВ КМУ ЕН КХ хЗУТеКЕ сему САМКИ ТРЕК КУТУ МЕ СЕК СУК К Ж АВЦУЄ
Фіг. 16Е
МЕЖ В колу вНе НЕОН ВЕ ТКНВ КК АМННІ ЯЗ Кк: ЕВ КВН В, Ве: ЗВ я ННЯ КОС КОКТ І ВСЮ МКУ ЖИМ ВИХ КЕКЕОКУ, НЕК СКК НКУ. ММК: МІБВО ІК; ВОК ЕК ГУК ВКК ї ООСККАСКСЄ ВССВТОСВ ОТАК КСАМФСЯУТСТ ХКУВТНЬЕК ТК ВААЄ Щі ТБОСДЄТТСВ шудАадаТАТ ССТОСАВКОЄ КРСТОШТТАЄ ТСАТТОАЄТО АСЕВСАААКТ ІЗ пає: ЗВО КТСВАЛАЮІ ССТКЮВАТЕЮ МЕТОВААаТВ ТВА ІБ сажі «ТІТКА АККАНАУКТ СИНКУ ВТО ТО ТКАЄВХ ТЯ МПОЕТЮСАН ЄЕАОЄТАЮХ РОЦМСТСКО СМУКТОВЕХ ЗТ СТЕК ЗУ ТАТІ ДОМІ ОДА ВИТЬ КОМА КК КАК За «КК Песни КУКСЦОКСРЕЕ УВУ ОСА УТ ВМІК УКОВВУ КОЖЕН МЕКСИКУ ТНК МЕТ КА КСВ МАМОЮ КЕ Уч ся ОжкМі УКВ КВУ: ОК ЕВАХ КЕКВ СКЛА МІВ
Фіг. ЛЕ (продовження!) ЗЕ: весло вах НКТ пеки ВЕН: аа, Не я Не ЕХ Кохлевніуь НУКЛеНН ВХ Ха ЕХ КЕеСН НИ МЕЗО НкиВоюмь ЖЕК Вівкехеь вежу го кеВ У ї ща: МОВНЕ АСОМ ПОТ КСЕ БОСОбанНЯУ ТОБТОСАВИЄ й ТОшОВОБТКС СТУКАЄ СС КТС ТТИ МЕЖА БЕТА ІЛ ОСИ ККОТК СУМКА КУКА МИТА ЕМХ СТБ ТА ТАТСОТАТОВ ІЖК поБааоТаАТ АААТВСТАТО СМУВСТЄЄМР ВАМ КЦА ТЕСТ ССЗВАЦАККА І ТЕККаАлИВАК АЕС ТЕСАВАТОВАЬ САСККТ ОМА СТ АКЕМАЮУЬ КОАТУУ ТА МОЖ ТАТО ТА ЗАВЕМНМ ВНМ ЧАТ ВАШТКЛУЮ УНУС ТАТЕ УМСА ЗІ ТАКІ АСК А УК Пакт поххежекікся ВЖЕ ВХМКУЕ ООН КІ КЕ С МК ЕЕ ОМ УВО ОК АК МКУ ТАНЯ ТВО С ВАВ КОСА ВНИМ ООТЬЖЕУКЕ СМБО ЯКУ СІ УТІК ХАІ СО УКУСУ
Фіг. 12Е (продовження)
МЕЖ: зво лик Ва ИКЕВ ОНК ЗКИВК КОН ка СОЯ ХККК іх ВНІ, ЯКО ЗВ ЗМК ВЕН Пів дювкюв, ЗХ КНУ КККДКІКТН ВІВ КК ОВК КІМН КЕ ВТе КЧЕІНКЕ ВК ЗК КОВІ НО МАКИ пОАОМАХ КНТ ТОКОСВНЕАЄЄ Б Теж СТОК СТЕ ВИ ТИТА ВАТКОЮ ТОТВЕ ТК ЖАХ ШЕ ТМУКТ А АаАСВЄАЕЕН СКМ КННУХ ТРОСА АТАК ГІВІ ТЕКТИ ІЖІ теАСтеБЕТАТ АТІАВЕАМЯ АТАЦІ САЛЕОАКАНО БОСВОСТТОА СТОСАОВСАВ ЇЖЕ МТС ААК СВК КТК ТОК. КОНТ ТАТО КСВ ЗК ТАКТИКУ, ВАК ГАЛСТННІХ ТЕТУ УСС лКУая КТС КАЄ ЗБЕ КОМА Там ненн у» Вени ВУАН АКРОАХУКЕ КТЗ УМ НЄ КВ КНУ у ПЕЧМСВЦ ЕТ КАК ЕК РАВКОВ ТУ ВІНКУ СТВ ВОГО ж СОКАМИ СО ВОКЕКЕ ІІ НЕТ
Фіг. 16Е (продовження) ЗЯЖТНКВ: гема лнВ Нв Укр «МУ оуі ВЯХУХНИТІ ВЕН ВВЯ В. ВРУ ЕКВ; ЗВКУ З зору ВК я Нанвинкт»: КеКлоНИВВх Оле х ВКА уК В Ніна яККоих КОН» ЗоскН пек їі ОО КОТОВ НІ ЕТ ОВАНІ КТ ЗНАКОМ ТОБ КВ ВО мух БІБ Стат СУТО ТЕ ВКА БСК БІЛ АТО МО АшОКТК ООН ПТО ВІКА ТАЖСАТАТОХ ВІ кат АТАК КАК ТОСО АЛКИМОСИМИ ТІКАЄ КА Ка КТ ОВОААЄ КК ТЯТА МУ ААТОМА СБС ТОАЦВ СТОК СОВОК ТА ЩЕ ОБТАЕТОТОСА ВАТУ ПОВ Н ТАКТ ЧТ ТОБ. БІ НУК МКК СУК Тест ь наве К ОУН Є ВОВК ВСАА АК КО МЕ КУ ВАВОКОК ЕВ У АТХ ЗКУ АЮЧУВЦКАЗКАКВ АКТОМ КАСКО АТ САКЕ ККУ ТОВКИ ЧЕК ТВ ЕК КС КЕ У БУ СОХМЕ УА КИ СЕК СЕК ТТН
Фіг. 19Е (продовження)
ВАК пекві Овни. ВОК ВМНОМ СМ ВЖКККС ЗАВ МЕМ Зх и ЗЕук КМ ТЦК ВКЕМУКПаКХВ НИХ ЖІОМЄ КН ХК вв. БОЖЕ мамою ВЕЖ ЖОго УК М ПИСК ПТК ВАННЮ ПВСУ ВОАС КОТИ ВЕ Мн Жжетсв ЗМУ ТТТ СТЕ ЯВОС ТРСТОЮВАЖ ЩеЖГІЄВУТУ ВСТУП фе паче АБОСАЛЕОС КРАН КТК АТМ КРІТ ЖІ БОЛЛЧЕНИХАТ АТТАВСТАСВ ДРОБСААВТК СУМИ АВ КАТА КТС ЯМ ДІКА АМКУ ЗОСАОИТОВК САФКСТИСА ТКА СТОК ТА З ТРОСА ЗБАСОМОВАН ТСОБАСТБВБА СКОТТ сут БОКИ ЗУНАЄ ЗХ БТ АКЕ ЧЕКАВ ПОЛ ІНЕНННТЬ ВІНКІВ ПИ КОКО УКИВ КАК У ММ МКК СЕК ПЕВ МК УСВА ЖАННА ТУТ КТК СІК Уже ОВЕС УЗН МІК СІВ К ОКА ЕАХ
Фіг. 15Е (продовження! УВневввнв ес кекеаввнаю: ве ЛЕ зважьє ВУ КЧНЖЯ пехАлАДВНЯТЬ МОНЕ КН ЗК ХУ сеанахн ЗиНТкІН щох а яке ЛЕВА Еівов ока ність нуБлеТмвв вно КЕкреснеВа оку овнне КО КН ел о МО ї ВИТ КЕКС МОВО ВТ НІХ ТОМА Бі тен ТКА ШСАДЮСТОВ СОТОСЗАВОЄ ТІТОВ ВЕСТ БСТАСТАТАТ ІАІ БКаКтО сера СТЕК ТСТТав Та ВПНМА ТО ТОБТО ІВ дАадтештцаК ВСАА СТа Падаееету ТАКА ТАТА СКЛО З КА АСК ТАЬ ТОК СЛОВО ТНА ЗКТЕАКИНЯ СЕКТ АСКТА МК Тра вола ВТС ТУТ ТАМ ЗББАТТАТВ ЗЕ вена все а СК Екоєн неон неть ВИВККНИ ТРЛН ВНІ КРОКАМИ Ва У СОРТУ АБИ ТЕКУ ТМ АЮ АВК ВАТУ КАВОЮ МЕ ТК СОТ УМА СОМ ІЧ ОК КК БЖ ГКС
Фіг. 15Е (продовження)
ЗЯЕБОА: поснкаювеветі Верн ком ВУ; ЗАКИНУВ В ЗМ яю КВУ Зрада вукашІНихаНи ЖЕКу пек тізЕреєтека ПЕКИ НКНУ НМ ВКщУЄ МІВКЬ ЗІ ІЧ КО ОО ЗГТ СеТеСАВЕС ТІСТА ВЕСТ СТАС КІ АК ТОВ СОАСНМОС СУА ШОСТКА АТАКА ВААС ВЕ ему тот КАВА ТО САСКАВОТЕ ТАБУ ТСАСОАТО СОМУКАСАЄ ЇХ БРОБАСКВВІ АВК КТАКСВ ПУСКОМ КАОСТОАЮВ ТеЕтОомОеКА КВОТ УТА ВО ТАС мМА ВОК ТЕТ ГЕТТО ТКУ ВІЦАТІАКТВ М совно косі СОСНА певних ВОК УКОСИ ВОМ ОЦК ОСТ АОКЕКОВУТМІНИ ІАЕ ВНИХ АННИ КВУ мента КК КУМ АВЛЯО ХУХМЕККОНЯ ВТ КАМИ МОЄ ХНН КК НЕ АК КК УКХ «Фіг. 16Е (продовження!) ЗЕМ зкактн мМ ВК ОК млЕякох У КД Яка пок МЕ Кт: КЕН, Кк ЗЖ Зак НУ З кар кул ОВиН в ВВ УВК ЗАКО ПК АНУ ВНЕ ТЕ КЕ ВОК ЗОМ ПЗВ ДК КО КАК МКК сек ОН ТЄК АСУ СОС ТИВЕО ТаЛАВАНОКЄ ж НА БІО КОТОМ ВТК ОО ВАС ВКА КТТВКТАТАХ ІІ пелет СУМКИ СТУ ОТУТ МТООБАННМА ТАКТ Я ІІ СОБОР ТЄТ АЄДАДЄТАТЕ КАСАФААЄТ ТСВЕННЄАВН ОТСАЄВАТЕХ СОВА Таї ТОК аКОВОВу ВЕК ТОМА КТНО СаО МОСТА СОТ ЗІ тУВСТСТОКА МБАЖАТЕАНЕ ВУСТ УТВОРЮЄ ТАС ТМБКТАТН: ЗБ пон НаеЕ места ссеКа пеенакначиеть ВМінокН СУПЕР КУ АН КК ТКМН КУН КУ МЕРА СІМ АСЦКРООКУ МІНІ ЕМКОН ВК МЕ ПЕТ вима ПОЕМАХ МОЗ ІНОЗ Еу
Фіг. 16Е (продовження)
«йо ХА: вере Ка; Вих на тез х З . ей ЕВ давати СЕ яд; зх ве ожвюкви, З СВ ; че Є РЕНІ ВВО ЗО ЯКЕ раз не пк Й : я а ВН ЯВНІ іл рах на тижя. т ! зай С: Перекзумав трасуют май іскмйв МІН: зі жо: Мертвий третинний соків МІНЕТ : Єерезннині іст ака ня в КУ ії ЕТ сквевс РАКА КК АК КК А АК со де ов зеконій осонні ча, ї ШИ я ШИ : Й ! Ж ї се Мой он З Ж ї Й я Є ще ей А Е. Е я : й срожей Й денній є . ще ї ги Я ми 3 м о НУ А вок 3 зе ї Я Я МЕ й 5 х ще ню вай тай шо к Ж Кк ї: З Я Яких У В Е х КЕ і: дк З ж й З Ж ! і З Ж : З Б ї хе ш : х : В ме : в я і пнежеякмороррненніниуоюнниниохфонтинумо ому кмином рилим крали В Б і КУ Я щі що ві Де
Фіг. 17 ТОЇ після закінчення періюзу лікжвання с лик МУ : 5 З НН Ж ПЕКИ КК х БОНН ЕЕ: я НЕННЯ ЕК» ях зоні 2: Вже й ЕЕ: 15555 МИ зе ШОЕ ККИВКИ КЕ. Ж ШУБИ И НЕ ЕН Иеих - ДАНИНИ КА КАНА ИНИ КИЙ В ЯВИ осв зва: ї ШЕ: ИН б ; яння «3 ; й
Фіг. 17 (предовження!)
ч са Ї ях КІВІ сере В Каж: вона ве кнанях ХО ! я ЗИ: вив тнні СНО ук раз ва веме ж А : жде СО ВЕІІЖрЯ ня: ваз ни вжи, я Я : зі Я: ВВ ННКВ МІВ Ве: ра на тиж Я ! зе бубо Пере еум раст най ее ЯКА заке ЄНи Мер кеувай красти най ем ЯКА ААУ ХК КА КК КК КК НК КК і кі і і і кі кі і Кк і кі кт жів Графіє Каплзва мера да НМ Я З у І ї М за Же і ; жк 2 т У Ж і Б я йо» Ва ой ; ш ї хі Е Е- З ОБ Вів о ! яко хх З ш 5 в ж ь ШЕ й - З я Ж З З : ск К що ї З Ї : ля
Фіг. 18 З ий во мини и а З ся Ж в й Фо Б а Кк і А Ж Я Я яв сй г їн Й і; - же ку - В жк аюптекеютовтутххювтизикюктквехеюа юю ж З ож ж і Ж т щ с щи ще 3 ча а (Не) -е НЕ я МНУЄ;
Фіг. 15
НЕКЛНЕКУ М ВК з Ки ле вм -Ж й Коривекс рація се пнйсукуюа і КЕ есте мери нЕНІЖНЕНЗ МІ пк Клео фон - В ; Ж З я й я зо щі Жовкві є рах КЕ Щ НЕК НЕНЯ МК РЕК» За вм СІ З: З ЯК 5 Ковцева раня се
Фіг. 20
ВЕН КН МЕ Ко п М їй осо» фе Е Ки в яв ФО юю Кевоевтраків сл ін укутни г. й З чу век вн нЕНЗНКВ МО - зерня: во ВоЯ І Киех ЗО НМ шяв КК ! ; в ре зоодяЯ ї я Х я Ж й я БІ Кавцзекегрванх СЕ ЕВ НЕНІ Ки 5 НАМ У ж й І - хо ХК я я НК ня ч о З БК, що Коввевье юр я ЯК В
Фіг. 20 (продовження)
меш дій"
зн . ї й Ї Дена Кей Ел у но не ях й З Бон о ні нн й ев арх А ДИ і леннн У Щ Є з К- ча «ріг. ЗА сон» СК Ся 4 і й й кош» х ч и о ОК ю
Фіг. 216 (3
Пн: п НН , ще б Ж | є Ве ОВ ой НН ії с СОУ М НН НН ОО ши Шо. ще о У и й. й ЕЕ і - шк ше ас в с 5 М шо її 6 ПО о ОІвя У Є 0 я ен в нн ння
Фіг. 218 (В) я ії З ми а чо . Ж сім о т. збути Бе ай зна 7 ке з я : Тв . 5
Фіг. 215 (с) ще їв земне жна а клав вом я
Фіг. 218 Та)
ій, ч/ У о й З ! З м) » Ж й са і ! 7 я Яіть, а | ІВ ЗУ і. дв. і ; у ти щи
Фіг. 216 га ее ОМ НН з» її они сннВ б 5 ЩЕ Б - ( її. ШЕ й. 0 с і а сш Б чи її я ШЕ М БО З з Я п
Фіг. 21 (Б) са І КНУ КО секс МН ші счоввави за " ЗЕ А те г й ря фіг. 21
РЕ зв мякі Кеті УК ях Я Ті х. -ї Відносні плен пі кривою СС втунютуюм пе жах т т - НЕ: ! ж УЖЕ правопо огтт того КК КТК Аа КК А КА КК КК кн Ж За ж ж ЖЕ ВЕ Я БД я ях - ВО КН ню фронт» Ж : ІЕС ще хе Ж: ще Ба не ж лях ох ях Кох. Ах Б ж: 0 ОА Кг ТЗ ж ОО шо В Б к щк Ще ШЕ 035 5 ЩЕ Зо | ';, Е З ЩЕ ШЕУ 55 о Ще ке В ве» ЗОБОВ фен е й 00 ЕЕ жи. Кк и ко ко як ЩЕ Ж жо ко ж МИ т Вітри А КНОА ВІВ ТОА (УА У ТЕХ ЗНУ лвзаннванй
Фіг. 22 ї: Ж у ДИ. Б фохккютжкюттннкя а и со ану ой о А я в. ї й 7. дак Шо у сова , й а ці ння - й Б М з З я со в Є ж в вх 5 век ЗМК й Ос й лу повна дня ОК Я щи Кока ВИДИ Кл вах Ж ВІ а я - : Зх о бе З че ії: к Пенн ої фе р-ні шо у і
Фіг. 25
Відносні МНС НЕК Ж що Я о шо ПУ ТЕ дель, МО ЗБК сроснееєєєєкєкєєкннтссх Дфосссссссссссксхскссттт тро Дфеюєєссесссккхсххх шт : х г: КОХ у ще Дронннтянняттяктнахто ів хуя хуя ВВ ЕН ее ї КЗ зе ЖК З ХО ЗВ офоооосюоссо ВВ носно нм - ІЙ : ЕС Ії хи а фо ання БО ЗВО вав ЩЕ р ееесс ЩЕ Же реосссоссс» Х МРЕВ то Ва ДЕ ВЕДЕ ен ЩЕ Ще вав Бо ДЕ ее Я дрене маконжеа Кк а Ка 3 ло Ко шах Б кни Хокнкжнккккккю с ск ЗО ЯКО ЕООКО БИ Ба КУ ДЕ ББЛТА ВКвА ЯЗ КАСА поменоний метою ПЕН
Фіг. 24 зак - : Не З як їі з оц ще г. | фею и В Т- вдучї ж Б « во І ще васкві й я з ве ЖЖ 88 М М
Фіг. 25 вав я тя дру лЕрту СН НЕК Ж 2 Трастуземай СНЕВОЇ - звмаги МИ РЕВЕ НЕКОеНЕВЯ - ода ; й ; , Ж Н ж | й їх ! ях ж зок й З ш ш | ві Я ше | я щ і з з БЕ ; ! ся в ! Ше : не ; зо ї - | ги й ШЕ НИ УЩЕ зі З М х Ж р.
Ж. п В ново о и ДЗ она В КВ в ЛК найк ЕВ т рук со ИН е і я ; й : їх а ; с Я я «в Як з : їх х Я я КК Ка ей ЕЕ ак "І Ди с 7
Фіг. 26 сне ГЕН ТУВУМАВ зоячьх т Кей» М ву КО ясне Нет. ково, | рення пе х з ТАЛА ють ах г са і ЩО ші Й Ка Же їй т Ж ! їК 8 аз й в й що і Ка шо цю. р : май ; ще а ще щи че ча че Кемнімент вв жених уукювног вжтиеквне умань
Фіг. 27 ши А с мн о ВАЗ іновмії ех хе РАН ння: ВИ; Мен як РАЗ ізо ве о Брастухумаєй о В ізон і МЕН ко Ног. ковх рол з я ВАЗ бізомі акняу 5 Бихіжна з зігандою І В ВМ зом і вкЗКа як Бихілня без лісу
З у. ВК Ма - ВО ща 5 ! ще , СК ї кН пп че в " жо «В о У х 5 міх ож : Но в о ж ЕЕ шк ЩЕ : З феЖ еру КК Кн ення че мо ко ще Ще ще ще Канценнвини ВСЕМ с Е Ех і хх 5 сі ї і ! о тв й НОМ Як зх 1 й ой я Я й Баг С сов В ок о і ї В : ж ЯКО я Ше де двх З че не оц ще че ще Концентрація ЕС М фіг. 28
: Ж рана ком В ме х расові заз: і ож РО хом В а -е ВЕН пом Й МЕН Ї ее ВЕ МЕНЕ Фогрястузумає ТО ВОЗ дом ВІ ЗБ о Не. кевтроль і ж ВЕ пи Я вана; 0 Михізнх є ліранном ; «ак ВЕЗНАВ зом ВІ) Мем Ф Бихідня без нісвняу не МЕЖ: ЗАСЖ-Я ВХ Я й шля вою шви сна воня ї й з Кекс і я ж Ж обо що ж 7 ШК дев одес юю юнау о оодре сере те от ее ту З о ояво нео Я не я Комент ВЕК ін АХ
Фіг. 28 (продовження) МСо сш Шатвній в ; ! к : їх ше ! : : « м | ! З х : СО онте. де ЗХ г т хі : кВ щ КЕ і що ші 5 ох КО їх їх КЕ ; 55 о ; За В КЗ я
Фіг. 25 уроку ооно плит РА АНТ НА НА НН КН КОТА Кен ско оюоо ово одосоровооо о ооооооесссессесссессеесесссессеесеес ' Е сан еарнні КН нене ї - з КЛЕМ ІЕМ ЗК х шин й ше : | ! І Ж А у ; ї ї З Ж Ве шк: ся й і 55 в. . що СЕ я ща й ій ЩЕ ОО і І ЖЖ ВО деки і БОКУ Ж З 1 й виш ви їх я ; ! І ДОО І Б що з пе 5 | ! . З т В ЕН В І БУ Ж в Гі БУХ ї ОБЖ Ве | . В. . Б БІ . ж В З з БЕ зненя з ЖЕ Я : ВХ Ще Бо БЖ В ! і. Б й ВШ ї ож Ж КЕ ! ке ща Ще ІК ! ї Б М ї ї Її: їр ов овк З 1 Зк обро ОЗ ЯКО ї Михічне НЕ Не В нови МеВ ОР «вим РНК МТВ рен кава я няня нення в Каїна МЕ НЕ : Ж і ЗХ лет х кг ї а ; ТОВ о ї во ох ж ! . То ! ї ВЕ і ККУ Ва ї ро ! Б КО я пек і ж і; ТЕ її. Ка ук 2 Ж а ЕЕ. й іі В. ші І. 1. о. | І. Ех | її І. КІВ: х М З З Ж з " з З з 5 3 я і й їх КР обр вра ік жо БЕЗ ік лю бр ду Е ШМихіцнз 0 МЕЗО неза кву еВ ї 5 нм вних ВМТ
Фіг. 308 х чу ї уча ї ! Е ; "Кнібщни МЕ? БАХ : рожа Е ї ї ; Я ОО Х ї жа | як і : яв жо Бін МО. ж а. БЕ І ши х же Ж : В «а й ї КО а з ї її КО у Б і. ще Ех КВУ Ва ї їв. 3 й Ой но : ї 5 ї КУ; я ; З З х Ж Її ЕН ї КО Я ЕКЗ З ї ЕВ в ї їх ж ї і Я ЖЕ З З Т ЕВ ї ТЕЙ 0 анна І | 5 й . ва (ЯК ї Вихна зве юее ниОЛОвеИ нич Куди Ум РМК. ха вм ЕЕ Деми «чну ї кана З ї о одевн, КЕ її ж ЕЕ х ї ще о ш КЕ КОЖ ; г ОБ в'я ва ме КЕ, . ПЕ : - М Х М Ко у їж і З. З зни х ТК 3 (ЖЕ | З В іш. Іще 1 "І З я Б: Е . БО. ФУ ве 5 Юа ви в ШУ Е ЗОВ о Б ЗО ї кох г ЯКО ВО З їх Е те Ї хх Ку ї й їх М ЗК овк ЗЯК 0 4к ог об ж ік Зб як г Вахині МБ ЕК чневнево яечиву г
Фіг. З30А (продовження!) рт : с реве се ; і я БВ ІКлісанв МУ За : ко ЗУ З - х ЕЕ «ін Ж ек рн о щ Я Кк : ж | В : КЕ | о Ж : і ож В КО й КО З З 1 11 ї де ях : К Ух К ЯК Я : ТОБ ші ще СІВ З як щ НК Ї КЗ БУ Й г ва АЖ ії. я и ща Кі РУ жк - і. а іт і. . й Я вч В Б. ЕЕ ші. КО БОБ ШІ ЩІ В ПЕ Я всю Ясне НИ Я. Е їх: ік Зк б МЕ іє З» бром їх Зк Бк. . Мекка на НЕК не ои ше цчеО З дннннннннннадннкт тн нет НН
Фіг. 30А (продовження)
: | Кап КАВИ | нене їх 7 їш У р хх ще т З 1 ї - 3 ій : т Те БЕ Е І. з. шщщ і 4 І т ХМ ВОЯ З ж і кі ей. п о і. ІЕЗ ія ше 11 а Не : БІВ 0 ОВ ом Її З З М З г. я ! У шок ЗИ 5 В Е ! . МОВ шк і! ЕК як с В Ж. фани З ! БО ще Ї; х т зн Ка | МОМ ння и М Мокій ії Е. і Х їх їх дк г Уе її Зб бр ще мок Бе ї ОСС ОСС поет еееетчоеоенеоеоеено ск ініініікінх : Бвженя ве яке наз ше Рв наз в о, яв РН ем теН , ян Кдітнна ЗКАННЯЯ | ЕН Її ж ЦД обооееююсосооооюююсоюеоооссссссссттьнй важ ра У дО Ж : 5 ші БЕ ба; : ж Жвхіщюв ваку ов е нва щеРВШ нев ВМ РН оон МКУ
Фіг. 208
В МЖКдісени ЗКОВВОЯ 000 БАКУ їх Кохоскюєюкююнннннн : 1Ех : іш в зі се ок МО СМАК Ко осо Ї ТЕХ | жк Ва их ши 15 зе й . КУ т . ЩІ. ех о | ще хх з ЕК ШЕ вої ОБ її . В мо ж ї ЗЕ: Ж Ж Ж З ІЩЕ з
| . І ШЕ й Те -к ЩЕ - : і ЕКО ії БЕ у ж: Ко пБХ ня о ех з МО вк ЕЕ; В ХВ і. а І . вик Ж ЕКО В: В ХЕ з В Я: І Я. Ж у ЕЕ Кг Е я З Б. ща. !
шк. " гг «тег «єв еЕ. Шихілна ІОН МЕ ОЮКИ НеФЖеЖЮО і зм Рая нт ЕЛ ана М я св ; ще ЕОМ Зосьню Бо я І. ТЕО вк ОО о сяк М її. ше І - В о Ка й Па ВО Б о В | КО ща ОО ек й пре | І ІБ ї КО В БОЖОЇ: ВЕЖ її . КО зах ЗБ Ж жк Яева са сауні Я фар вні во о и БО іс їєб Зк бр ой; Тр о бромх іо як же і Вихмшеа зх МеВ навів навчав ! «НМ РНаНИ дет жа аа аа ПК а
Фіг. 308 (продовження)
р нт ноти тнинте не нннтнннн ; Її СОБЕАЮМЮ Дн я у нн . - Ж Хосе оюєєюююююстюсссс жо ж Тех с Еш а робо йо шою о Ян мож х З З пек х МКК ЗБК ЕХ ! де а У ше с в с. її вх ЗНМ У Я їх що х що п т Ї се 555 знах со: ТЕ : 83 55 що що М Ж Р : а З як З в їх Ве З ке Я : 53 5 КВ осн її . її їв ЗрооаМК Як З бю Їр Зробе дЯк . Вехінна нав ев неза: нене і «ВМР НМТ Дюк юю юю ААЖЖЖКЖЖАЖКЖЖ КК АВ В А А В В В А КК ММК КА ААЖЖВВАЖАКЮЮК КАК КАК АВК КУКИ ВАВ ЖЖ ЖЖ ЮЖЖЮЖЮЮЮВВЖК КАВА
Фіг. ЗО (продовження! 5» ж ва Тео заавнвнвввнвююменнкок: іл па - 1 З М їз 5 і З 65243 НВОбовзнви) хх є пен нн нн нн НЕ МЕИМЕИИИКИИИИКИ ИМЕНИ НИКИ З с НЕК ЕК КК ВВ Ж тож ен п п пк п НЕ НЕО ЕХ ХОМ ОЗ М ОО а ; нн о АК ЕВ ОК ВВ М оакааеж ж и и І М МОМ НН ЗУ РЕ 7 м ОО о КІ певне нин рр ломмнмммнм Нм НН р МСС : ; ви С у деко стввя фіг. З гженроєв ля З фосфо-АКЕ-ХегіїЗ я заоч ВР, - - ! | З Ва Те "хх ШЕ оодоолнй а їх ШЕ: ШИ я ж ! В ва : : Е не - Зв ІЩЕ: гЯ : | 5 а. щи що г у Мо з х Е х ; 8 В о в я а. Ж а З е х З е Х Е з З Тк ЕхЗ мдееевевевеееьь годе ванна ина авт пп кк пк лижник. Фхірчнж вх щи, Як рт. хі Гксвреєя Зк АКТИ щі ай Ор Ж хе З 8 5 її пе як Її з ж Б ЧЕ її - У 3 З ж 3 ; ах в ж ж т е Кз зааггмюовавова "мегогмвими: ахірчнж. хі детиж.
Фіг. 32
Загельний НЕБІ Загальний НЕКЗ о: м ; я о йк Ох жа ще а В я ж й й й з ж вно" й " т и Я я днмер НЕБЖ НЕК Е я я В " ? а ж я Фе с боворююеввиня НЕК НЕКЗ рРІЗ-кіназа иненннвннневннваннввнннаннний; 33 їж 00 ВЧТ 1-й щ " Е ро" ай і і 4 ! щі а Ше ак а. а ши аз " я й я й Кй дій « с с
Фіг. 33
Кониептрація НЕКЄ Сляанлартна Висока
2 . ши вія вй » - ЕЕ | фибонндсфконя Б в о щов Е ' о, ж 5 езнстсофннтчнох Ясен Уа ж 5 дп : . БА І В, те - тори отровуреренногесььотресноу фе пнтунтрнтнрнтенененннняя з4аззааачах завада одесі (вм Е овкйеєті (ем ОХ т 5 о іжетит ; так ва; а "Її «а, танні й в Й без нко ЕЕ ооо вен сер т їз : ; попки Ех і . м , - З з ай а фреегдреввосрегогреввореввдреваегвннснинкяй З грн уникненню кккнтрннннийх Зв ззіазалатн за заялаьтвтхх зоря) (вм) вве) (вм) Ж 8 Я
Фіг. 34 Ковцевзтрація НЕО Ставдерува Висока р : - ки сккю кю а в ший ; 5 м на й Б ва ше 5 в а : ша У ж кону ж да о її ще 5 Я а сооенних ні - ВО ет КЕ мо с дфесеестрсесссорссоссероссссероссооооеевсорвессетуннооі ФА реформатор фекВ сени 5543 а лада й: д-р Я Я тт я й т. Ж зно - реа ж в і , ненні | бе нко) За Я й об З ва ча к к ; чи Е ! Мн ек зо е в феоософровео ооо орто ронной З ве рон ун но ооо я в я чзіізачачах ові ес (ем) 5 іврцяво) ом г
Фіг. 34 (продовження)
ще 4 і в Й о ще ше до у сх, щі їх й 8 ки ки Ж що 5 хо шк ке в ща о я завиті ПН Я
Фіг. З5А ОО: о за КЕ о й а ШЕ ше Бах зн як ШЕ ше ще : жо ЩЕ Й в. С ра ВЕН ДО КК ння зерня да 3» еф о і сю ВК ай ок В ав а й по КК Е х х Ж - в я сей легку вве СН я
Фіг. Б я ї зе « і ої з що її Я і е ї- КЕ ЗК : шк Око око ов й о а ак ях є щей ще 0 ся БО Мати Во М
Фіг. час і
« І. - що й. х ші ж й шо ши з я яж ПВ ЖИ вмірвюнв» чара З» 5 ЯМ Я я З ях є - а : хе ОК і а па ай У ой и я хх Я я «ЖЕ «ЕЕ днк С На
Фіг. 350 я Трастузумав перу май ве Нет. контроль : Короюююююссссх З
Тх. ! З !
ВВ. 5 же В й Шк В я ву
8 в. ЯК ей нний х ве: «Ве в енд зага АТ зе У Я и В в : дич У ак зх В В ї вия дині щи БИ ЯН в З 5 заиаа Е «Фіг. 6
Нарізна аннях зерен знак ненх вжріів ЗК ТЄ З ЗХ х ха з ЗЕ яв ке «Б мкЗУе ВВОКУуМОМО ее ки ЗОеОМООюнНе ВЕК усталеному наухттчитанухи же зеххухучихюху жжижЙВо хлемжаафютих БЕЖ хллстеоомйнссткктютайжеттловикхя жкжех явка юки жах ах ох юка МЕ сосок хссзносоВисанчттих ввхе хчеекхчтнкхтня жк хижа хютнахх ВЕК сосочок Вус нячатня жен яхт яна вх хх Жоххх ШОН хослахстсхоталуттхуєтихс тати хетжх сваххзахтнахкт жи хе кт ажююик МЕЖОВИХ охала сотка єютохахувххчєтих жкхет ххх хсоВісткх хевойЙх вом еейкюке ВЕБ -зУхжезуххкозУховВмяІахчовУхясі вах зх ВуУхВАВиА жжх і хзжккжняае МОХ усслкуссттху лих лнікттлуюихху ккал уж ххх ж аЯВе не окютююх МЕЕВЖХ у..спзсссзхкстхч тує ютититяяя хх хосхжеажючехух хе охуєеовижке ЖЕ кА КК ЖИ ОМ Й Ж и жи и ж жу и хжезіх охо хмкя ЖШЕЕНУХ слкукюслуктулхучлиххутлахткухткх Жкхте ххкаклжжнхюнюя кю ойкх жених МЕЖОДХ солхуєлтутохучстлухалхуєскучтия жавлю яяхежихжтхуєто жим «Шен жжнхкх ЕВ ж ж юю ж ж пе ию мож мож шою Жожеюм мож ж юю юю ЖЖ ВМ ож ж ем ж юю пек Й пок вжи, 2 МЕЕВЕВ слуху уюу хуя ннухтах жкнхт лхуттяхютчхтня жхефкетакктовккя ВЕЧОЮУ сгзхуєзекхооухстоюєттютстнххся аж сдхттохтозктто жвхффхежакяята хх ЖМЕЕВВИ ууслалулнхсяхучюаатнххютня мо Жиосжх секлюо кахлю ххх НК. сект ЖЕСТ, духо лоту хчтутюєтихх кжхжа ххслхх слух енку жа ефитжежнхтт МЕЖ ЕХ созустллхтехятвату латаття жк т яхт х жить жкххфк хм же хх МЕЕЙХ соляну кутку ти жк км хх жк жк о жк ходк о х дев хх ВРУ ссесхкаеснкоовкечтюч стани жанняг хеожх отхкотххсохххо жозхфемюховжххюовх я ще Же ЗЕ за зе же ЖЕЗБУЕ ЗКМВВЕКЕК КМИН В ЕК Хек ОККО ВКМ НН ВЕ сусло ЖісахужихчслічЖахтлх ежаеетжиютькюю мо хто ких х МЕ зо Космос хєКахкко хеехххеахтєвххю ухх ухетахче ШЕЖВАХ осксоляковлаофколихтАкхтко жежжкю тах юю сх жюхеюкх я МЕФОВЕ сб Воно уєохосоЖхісох вехеонкхювухтьх кезженхктхх НЕБО косих жнкуч тують тєта ФЕВ ВКХОВКЮОХ ху х ЕЕ сосен жхсзхухстхосахсоЖахсА Фвктевкютокюєь ххсжетакххх МЕНЮ, со. схаХЖонаюоххкутххтолиухуххю жжежхсояхютихе ух аххуютхя ШЕЕВЕХ сля лайеаауєтолу тах ся хх важка жах тяж ххх х МРЕВ постоли хєавчютхюатхкитткко жкеажххк ах ахх сх ами ЗК ж нує юна єна о Малих вмУЖжайьижаМмьМх жи Ав як ке кх Же Ж. чн «В кхвзІикхасоавххо ххх акЕмеажиум зах ххах БУ ОЕХ соску ланйелахх тати єтьх ХХ ТАЛА ЖЖААЛИАХ жтАСТАХТАХ МБО У сссзгкетякєтттичтсуєтьтктяккттх тзиеєанкжовжюсю хкежеанкєюх ВЕЖ яю жу «Ж «Ж ож ож юю «Ж. кжжожжко ххаАахихеамУмаюхМм о ль Я А Ох Ем и А тА п п п р ЗКУ УХ сослхтвекЖенкхстанМенклувняюткхх кжеЖКхХ КМ ЖКХ таж ЖЖ усслхсаояжелххстлххсхахтохучтихя вух жнкажжВхтАХ хехюватхХ ЖУК у.усозостхсвткхютьхутхчютхатих Зохксоухюваююев хе жевАХкх
Фіг. у
Керівтавнізнсия ззовні ЗК Ва вели фкркізна м ЖЕК КУН Гек? кзнаж лерної вес во МУИТВ ВОНО ОН ТО АВ КН КИ АВ ВРЮ сухсзкхевкхоокхковикхавхасаумескязвкхякавикавнн ванних ка Майн хха ах ЕЕ кт я ж явних Ах ААЖеяюУ ях ам Вахм АЖ ВАХ СВКЕ Св и ї а в вини и МА МОМ ОМАН ЧИЙ МОВО осот твчиєвикист зсспхуєстутаахх как их оаажее ня жееяже ее же ВУБОКХ якостях мож А В ож ОА ХК жд ос ст св их поси ой ж ЖОВ Ж ж м жк ж я ак кож Ко МЕБОЄК олукомжковахсооххєссях ВМбусссзхсесьхчек жхсовкевжктьах ванна нкжейвкм ем Ех зе нояояояїщяьщжяияяи я тя вв кА и А й А НІНА НКИ МЕ а ж А ля жикжажк кжжикійеЙки ким ою жжжя ж жж жах єЙхжжежх ювжкжео жежиж ВЕЖУ стае вже єв кфоїй» кто юю мк ось ххх кож екс єюаже МБО сухесннховя вехкхескх я ос ВК лукивиневкунтьктьхивєиюиєт жжткх МЕЗКІЕ СЕОБКОНА ОВНА АН КИ А В В ВК СА Еш хЖеЖхухегохкезхиіеоххевоКАесхх св оозкекейкх ее юєькиєвккжекх ЖЕО злаках чтосухиснтх жахи чтехєвавучьо же хтважетажетктев тя жи МЕ сдллулахуяллух палала ли АХ совлАЄОАА ТК юю х юки х хх ж я Кї жен кими нан ЗМО МНН и КУ КАХ МЕФОЕЯ солод нхкселиксехчняхксоти ех ктевохлевжкевиюсввнивануваннимиихг МНЕЕОКЕ усолххтлух тс уххєттххття меле тт т хи во ЖЕ ВК Я КК хе ЖОЖ оккю я фЖом я МЕЖ сухлохухевкуєнкухєтнкхч кктутААУЄКХУЄМАК Є МАХ АЮ ВАК ВАХУХАХЄО КАК х ЕЗ МЕ АЛІСА МР дачу жееннчєатаччтткчуєтххуєекняе м ВЕК ЕЯ. пехеллхтвачитав тент ють МЕ КХ сляхогнкоювичтоююхие вих ююхяювьня я
Фіг. 37 іпродовження)
ЗМІН УМ СОЦ НЕМОВ І ІКОН КОС КВК КК УК ОК Ва памоокаосваес кт стви соска ств канва вена ВОСКОМ Ева а КОКО ВО ВК ВВС ОВК ЕВ ЕВОФОС ВН ВОК ЕЕ МЕ мМчКНа т сао ца стоки КК СКК вки в ОККО песо масок остакт ан вив вка о ав а ее оа даси канави ак уксадовскив ВСКВЦ ЦИ В ОККВВ КККСОКСВВ КТ ООСОК ОВЦ К С КВ В ВЕ «ктаруц аа тик кВ КК ТВ СЕК КК ВВ ЗВ ВЕК ВТК РО У ЗМ УК сте ЕООаКИК ЮК квест о В вс ква В ОУН Ва КК еВ а КЕ СК ЕС В СВО ЗЕетОсссва есте С КЕКВ ОО засос свв МЕ ствол квасі вас нац ик о Ов ВВ КТК КНеВКК Кс Кс Ве ОВ Ко КК ЕВ патоки вв ока вк вки ка МКК ВИСКА ВОК ВС ВВ КК ОВ ВК КО ВХ аксіом фіг. 37 (продовження!
БЦ зн Ж капу са какао опа сс уванакх Ост е СКК дон ток екве Веа т еКеК в ОК О СКК То ВВ ВО затим свасссмм вах во стає ак огасновани вк вовка ВКМ ОВС я сивим МО СВО С еВ Є аККНКТОкООванаа кеВ ОТ сКсКеЕВ НС Ккт Ва к НСа кисоскодткассиксКавх МЕС зн ке В каст оса ее уаоасак с ооо нас ака коса КСВ сКЕКЕООАКВСА КВК КВК от акт сова това аку кааекк сани суокакаакк вовни ково ка в МК Каси ВВ ТКС ПНО ОВК КВ СЕ ЗМЕН нрав КВК КВК СВК ОВК КЕ КВОТ КК ізскетор св МЕН зи ж КОДЕК ЦО В Оу ок Он ОВС КОКО Кс Я сего кКЕВ в ВК дев сце ковка пахвами КСВ Оса КВК Ве ОК КАК КК ЗККВОССВ ОВ КВ КВК ТК ОС ЕК ВЕК Ка КК Ко кое о НЕТВСТОееН В В ПО ТОК ОВК КС КК ВІ КОТЕНКО В засеКеоукк Ве ее за КМ ПпЛОЧЕВС СТО се СЕ ЕВ КО КК ВОК С Коса пекодо давства сука ва воски пеСВОнОвсвсвк ис ри Кф о а ОО ОВ Кф ВО У асивс ток юсваа кВ МеВ ЕВ ТВО НС Ка КО оВСаВИ
Фіг. 37 (продовження)
мг змишна УК сатана тома Кс тсво вас тест осно скектвові ве тсвссоюоєтаста т вкостомда вв кссвовавовост оо яитоцене оса това вом о овен сви Конан ково Ок асоА Вста НК Все о С КВ Коко Во са ВСЯ ВЕК ТОК В Ви Кит Кт и ОК СТВВВМ КО В К тиском косах Ма зму ЖЕ садово оса ес ова кого о ке еВ сТКЕХВоВ вста Ко КВК ВОК ОККО С ОВНА ВОК ОВК дари лена кс вето ев сао кеВ несВвосоавсеси снопа ве Во АК ВВС Вуха стдтВена ан ВККС КВК ТОВ КК ВЕТО Во таскстццусасецикксекцх МІН сазві сосок сова коза ков ОО Во ОВО сек умова ситет совІвсакссевескск аква вс о кс ва ке Кк черешкові вовни кс акне Кн ов кН засада сокксвскадсаєа сс о в о ту еВ Ох зітхає мотива ВсВЕКТоВ с Ес ТОК о КТ а ВКВо КИСССТОВ ОКХ ВЕН «М и кам асноскоовезоктооствадоговомкавсвовосс овен тестя Воя Ікра КВК ВЕК А ока ВК КК КЕКВ КЕ секвоаакова каско ото коквсаовнох Косово о ник ов ЗесабОцавесНе есе ав еВ остов ко ВВ ЗІТАКТ ТСН СН ЕК КЕ АК КК НН КК Ос таро оцтсвК Коса " -
Фіг. 37 (продовження)
МЕ МЕМ УМ кВОК КЕ Кокс тн ток, токсин ця КВК кс какао КОС Ка УК ВЕ ВВ В СОН ОН КОКО Вот ве ВВ СВК ВИДАМ ик ВЛА ВОК ВК СОТОК КО КВК зктвсми осадові тато КОВО еаа КВ КОВЕ окис МЕ ам пацюки в ско ток тала ст Кухар закладена анода се ЗЕВС ваше Кт аКВ оц ОВС ВОК ОВК КВК хІбактцеоса Оси киска тиву ке са ово евава хассиецот екс сацх Ре хм М саке вес о свое ково сова ов Се ди ВЕК пк Кос СтКСТООВЕМКа КСВ КК Ва ак ко кокос ко ав о ца Дао Ке Ото Нова ЕВ КСВ В ОК ее ССО ОЦК ВККС ЯК Ка КУЦ Со ВО ОВ КВ ВВЕ ЗКЕЯСмтоеаца са все КСВ КО ие Кт ОВ касок МЕМ касова СВ и КВ ВК Св ик со щО сЕККТОВН ас ВеесККке Ва КЕ ик ок В ІЗ КОНЯ ОВК ВЕ З КК ОКО МСЕК М ЕВ СО КУ В ВО ОВ В ЕС МЕНІ С В ВК ОТО КВН ОН ВОК ТОВ ТС КОН ВВЕ ЗКТВСЕКЕП Викид Кс КНЕУ вО ка КТ КВ КАЄ ТОВ Ва ХВеКк тес
Фіг. 37 (продовження!)
МУ карусосвескоу оса стека онов кВ Есе ПЕКТОВОВОВСВ КЕКСИ КВК КВК ЦК ВВ кою Ко ве СК а аку да аква тасанаитавсв на свв не ВК КВ КК ВК ВЕК ВВ КК КК ОСЕНІ ЗІТаст сна Ковка ОН ОК Ва АСК БНО КВК СВТ ЕК МОУ оІНКВ ОЦ ков Ес р Ка ОО КО ОВУ КК В НК КК А ВВЕ СІЛЕТВОж ВККС т КС СТВО ВК В ВК СО пе УОДО КОВАНІ КЮК КВБИОО СК В еВ КИ ОВ ВДВ КЕ ООК КК а Я ВК МОНЕ ВОСКОВА КО ПЕС КВ С КОВО СВ ЕК КВК ЗЕ КО сВиВам ситет СВОЄ СЕ СВК КВ КТ сЕКК КСВ Кох ОО ЗМЕН яв сарана енер аксони свяо СИТОСТІ о КО СВК ЕОМ КВ КЕЕОЦЕВ К ВН ММ КОНГО ЦК ВСЕ КО КВ ЕВ ВВ КТ Ко В ЕК ОЕК ІОВА ик с ОВК ВО КО КВК ВВ ауто уац аа ск КК УКОСУ усе МЕ хви я КВК КЕКВ ОВ у КК КЕКУ ЕК ЄВУ ЗУ ЯНВ водо КСВ ВЕ ВВЕ КТС анякНя СЕТСКОЦаКВСВССЕК гас ас и С ОВС НВК ОВ шинок есте авев кВ Е КОКС В ак ох Ов Ва астапоцасвс есе свВс ВОК таєювє Ковосвев офисе вам ЖЕТаСтВО ННІ СВ ис КВЕЕ пОЕ КВО С КВК СО касесюткасКо кс весВе
Фіг. 537 (продовження!)
я БОБ: І ! І ВОМУ: Й Е нннпянтннняяяяяяяяяянлюттс хх з КЗ жк х : о кох : шк ча з щи ща з З ща чке онюює ще Концектрація НУ, вих «ріг. 59 ная МЕМ ВЕ ВЕЖ Не КЯ ТЗ. ран МЕ о, Жовнеук То ЗУХЗ УВО, днеменковани КЕ СУК ВЕД озна Довжжвнні ДО ян . й З ВОЗЕТВоЗі | і ! і Фі облаюті Не ТЕ ; ! що ів ожновнога іє ЖЖ ХВО х ! Ї х ; Ж Е ї ; щк ж я, в з х ; те ож 4 ск У зн НН усу а ЗО а ща 353 о за да НТК Ха св 5 оризак М раму З: МОВО інеквфенаня ВЕК Ж ЗИД З Бак с Ж Леежхнилі ЯЗ які во» ї Я РОБОББНОЇ ШЕ : : рі ойчаі УН х У : і ! Ох пк основного піку т ОККО ! за як ! їв - - х з ; ТУ : я 1 нен НН НА АН В А во окр Кк нин в ну ой З тво а о 250 зав Ж ненні
Фіг. За ща КВЕИМНО МУК БУК зежкнхх ЯКУ Чим КОКОН іа жфкавами Ку Ж ВМ ХЕ М ДУМКУ АКА КАК КК КАК КУККАКУ АХ КА КАК АК КАХКК Ж кК ККкекнК м КК ; зх обева. вва нм я Же тв ге : ї РОМЕН. . ї : (ріеіаен УМ х ЗА ' ча | М осені о ку я 5 гу я ї . о г З 85 лав го в В ї її З ож ; З Же ! . м УКХ З і ЩЕ м я ! Ж У з У ее З З Кок поовадост кн а КК а о кн Ва ща ща 58 а Ба З МВ Ю МИ МТК Тех зна М: рак З: ЕК ІбволиняннаНи ІК Же ВХ Ока СКОБ. ЖИВЕ КЕЙ М 3 ІНК : ї : Ж Її нн а З НЕ З зак ПК ВНОВНОКВ Ку В Ж : і Х Ж . : . ї ; х чок ї : ї ї : Ж з Я КУ 33 : х З : З їх : ху х схе лк ин ооо М: ве В ж те ща 5 о
Фіг. 39 (продовження!)
ЗНЗ м Аню Кк ї " " " т т ЩО дев офсет ок бювку я ев в об кфофнк ча ї : З хх ж вКу - міх ї Я Ох до ЩО Я й чь Вч і; Фо о Ех ії С ЕІ у А ЩЕ я че як як м у Ах Ж ож ї ча ек їх зе К. х ї с» с ї ся ха ї х ок с: ехо фр фр р фр я ; опр рд р ря г І зам В . ші Афатнан ї лавах нній ї Ї Ї Її Во рев ВВ ЩО ве ов йно обоновойсо Ж їх жк к ї я ї бо Е Кк Чі ве шк х чу, В ї з ж, ЩЕ а вк ка ж че є «ЖОшж щу З Ки х 5 Вч ач: з хх з м Із з ке МАХ х с 5 її я нак - чу кі - 5 чо змі їх чу, ї ї ч. х кі ч кю ч ї а павни З їх їх ок ки Ку а МеВ собйккю ги 5 г -к ка ОДА й й ж КЕ яю пря в Ван В зим. ї х БЖ 5 Мк. я 5 азатачна | «Аавеивнній ї ї ї ен нн Кн КК НН
Фіг. 340А КО вовкові ОО юхбоовоеве ооо Вих он ВО ж ОО 5. х Ж жк ж їе а з ЕК їж і ТУ сих: ЖЖ ні ІК аск ЩА ше Щек ва 1 І Іі ї «ої в Комі ни ах, Ж ку ї їх ту МО х ЖЕ жк 5 їх Коб ї Кк Бі о ех, шк хо Ж ВА ОО ЖОЕ Ї Е хо о ЕВ я ШЕ: ку « й Мік ЕК т Ж йя І Її : 5 чу Ж З х їж У х Я і ї ї - х г З і кі ї Ії Ж ї - КЗ ж ї ї ї хх уд т й рик кв ди ; прут ее, : Неретнні ї Меракни ! Ї : : З Ї я ожох с ї ково ож о ж со Ї ще дебо ОБОВ ово ш ооо жов нен ї хх 1. ОК Ж. ї У ЖЖ ї р с не Кк ї ; ї т а їх з КУ В ас : - КАН : ча шк ї ї ФО ї че хх Ку ї ДОД щ ех З М ОБ ж : чех МОБ : я. З р ВЕ он ч Ж ЕК о ЕІ в З х ї ся ММ З з нд пок ож Кі ї че З Е -к що «КО джк 5 ; Ж к їх хх : КУ щ. се Е х її Хр ум фуру р м фр мрух Ї нн: Кеті. Ї рю : в зав я со НВК Е сх уж, аж й ї хі я УК 5 : Квералінує ; Кикрезіее і Е т 7 Ж 3 фіг. 40А (продовження)
фе в в я в вок вн ен дама оо нн чн . ї п и и я денно вовною Дню Вособонодоо фін З ЯН г, БКЦ що «Я. Ж ж ча Же: ш : чо ВЕ. В В ЖЕ -- і шк я Б я «1 я т й я : ртуть пер ; г з нМ 00000000 Вам - Вероністат Борокістат ; що рофвковж вовк іх паю ї Кк хх 3 Ж ї З х - : ші, зак КТ. Би я у як Р В в: Ек м ок ЖЕ ж Я МОЖ ік У Я и В х зе З ко у в ї ча ші: ик ЗЕ я Ж. БІщІ ІМ ет БЕ ОК ВІ 0, З и ї з ще з Я як - Шк ї Х ен ие Ж ї ї сх і 1 я УЖ неї: пн я т і шкі я Шо коня нн : оферту утро Корені уретру ; Е а БОМ в н | ким ' ; Саракатиній Саражнуни . шин шк :
Фіг. 40А (продовження!) зв ма З х З а і Ж : Е в К Е ік їі кі | їх Я а АК я КЕ БЕ 813 М в: - ЦЕ ее - ї Ма ж . до х й З
; . Б'Ї і. а со іні 3 Ж Я, їх 5 их З « зе ї т б ср че ну ЕЕ: Е сх а х т джу ванм в ММ:
о. ! : Маклітаюсех Наклітаксевя
Фіг. 40А (продовження)
АНЯ в р нання : - КВК Е ще добове ок мин йнек днк т м з її як ОХ ї ї ї фен ходи кої ва ше В : ТОЖ щі їх СЕ о Ме ї Я АК т «ЕК : я Ж ШО ні як Ж. ж ї вк ОК І х ШЕ й з Од З х їх ше ь Аж В я Ж Ов їж її е ВЕУ т Ого Її і ке М фа хе КО. мк Ж і її мо я ж Ж» і - і є ті я я і» ї Ж я хх їх В Ах х 00 Ж . їх х ее і їх пу рф З Корвет у ру рр : в Ка ПКТ ТЕТЮТю ТИ : В За ним В Ззашм
: с. : шк ка вушме | ве х : фен ее ененетененененененененененененнннннннт : Жх їз ї х: ї Тов ок і М : я ЖЖ У дах х ов ва щі зай хх се шою ї : й «ОКО ! - с ші й Б вк чек ЖІ шк ЕЕ ЩЕ кві ї й - ї Ке МОЖ з З ща ек ЖК хм ЕЕ ча. щі і ЕК Її Ж х А а тоже жк МОЖ жі ше чо я пк Ж сх я їх шо у: ЕЖ ех я. я МЖК о ї ОБ 1 с І КО Сх ех У з шк В оо Ж ші : ЕЕ зу шуми М ке О жо Її і з, - Я Ко КК КІ
! В. чн Б КУ т В як як с, г. Я ще о т о аї з чи я М ші і : Яся 0 Хонккнкнн Овни ко е Це я 3 коре я ше : М ! ї ї ї х х ї т я Ка х : еефофее р ф. З В Зк В кожи жк з АК ВЖК ї ; : ех а ;
Фіг. 430 що Ж, | і жать ОО : М А я ско - г» зак ТО Її -х Б сх х Ж «о ї ща З зай ; зі із ек Я вч с й я ЕН БО во Дні після інокуляції Фі
Фіг. 41
ОВК В о В В ОО Б Б ОВ В Б: ен ВН НН шиї ши щ Я БО МОЯ КЗ ТУ ПЕ Щ хх Я С ши ШЕ НН З! х У КО ЗОНУ й Ко КУ ШУ о. КХ х же ЗВ ОНН ННИК г Ех
ЕЕ. ши 00 чи 000 З Б м КЕМЕК К, ЗА Ше ее я що і Ко З о щі с У г 5 Я КО з п
Фіг. 42 Маса тіла в мом Огєм пухлини в момент я включення до гриви - веЕлнічення до група Ех ЖЕ, що а ж . че, є х а ї ж ж 8 ра ж їх 4 Як : : дьй як 2 | В Я ге жд мя - я ни Не ОМ а ої й 8 я хх мк с - й ЕЕ
Фіг. 43
Об'єм пухлини ї і я в : КО та ТОМ В ох х кр й ії б тех МЕС АЛЯВ 1; и ТОМІ «МСБАЯІВ
ЕН. Я я ОМ у М 05 10 35 20 25 30 55 43 45 Дві після початку терапії
Фіг. 44 Маса аа серпи Зміни мне зіза (кренн Б щи Ж. - : так ЗАНЖЕ ях Я ї ях ВІ х . я. ення ПЕТ УКВ Ді зве зсакку тералнї ень дослі ення
Фіг. 45 Хереловниве Хередовише ка. Зх ве ВІ зате ЩЕ жк зн ЗА ще зх ЩЕ З КЕ як ЖК Ку; - Ж ем, гу ж -кі ї КУ «ви х з Яні ісяя пече перянії Дні після початку черяийї
Фіг. 46
Ем ЖЕ : ЗВгжвииі Її ІН вай сх зак Ще ше я КЕ : сем щей Е теє ВІ Як ше - в г ши Ж В ХЕ : Х Ки лю: й Б : й: ж: , бо ДЕ О0оЗео0 ко ОО Ох Дні ення ззееватні тера Дні після почаяжу херанії
Фіг. 47 зе а зиск В зож: Зкж. і: ТЕ жену ші Ї ЯН жені жд ще ше М з і ше Й й г У Сл і: КЕ Же ме: ПЕК ні Ї Зк ЩЕ во ЖЕ Ї Ш їд. ї ше. : 4 В ЗІЖ : ї й я : : Ні ніс очах тера Я нс печатку теравиї
Фіг. 48 КЕ В ана тре сова ха: н . в ; з . ІН ни ГЕ ІНяшві по: жа ПТУ. ск ян У сяжнн ПМ, дк . : мл ВХ б пн їв М Ж : я є | - ї г з ї ї! СК Уч кі ї : г ї 1 ден віьіньх ший Ку Ін ше вве ві й В " п вже чих У яе я що Ді без помах тен Дві вісля пежеку терапії
Фіг. 49
Трена У МЕ оз НН ЛО М Б п В В В нн щ ши ши ч К чи. шщЕ Ех я НК ЕВ ООН о ЕХ о о. ж ще ШЕ ШИ ШЕ В о с с о а З м Ох її У . пе і о СК: МО ЩЕ. ОН ОКО КОКОН о ОЗ
Фіг. 50 М М НН нон МО и ш нн ши щш : КК БУ КУ КУКИ СЯ БЖ БК МК КЕ ЗО З М У КО ОЗ В КО ех З КХ З, Кк ВИ Ен У 5 ШЕ о ОН . й ЧЕ шо НК НН С ВВ С ВХ ЗЕ:
я. си ше ШК І МН ни БУ Бе Бо е Х У й - - р У КК Ж КУ ХО З Фу КУ М оно М м ММ с 55. З ШО -- ОК КЗ КЗ ЩЕ ВХ ОВ ОМС З о ОН ШО НИ ШЕ о Я с М КО ве о НН Й В З хх ЕС ОХ ОХ І СЕ шк ОН шен Бо В ши
Фіг. в
Е ОО У ОО В В В В хх ВО ОО ОМ и ОХ ш-т 0-35 МО я ее х ОО Я ії см М М М п Я а Я М Шо Б А ЕЕ МЕНЯ ВХ Ше в) - саме 5 0 КО нь ОО ЗНО ши БУ ЩЕ АЖ З я ОН я ЕХ : їн ОХ Бо ай Ко о КУ В в ШК КУ Б і с о Й КО ОКХ Я о 0 00 НВ СКК КО о о НН Я КЕ о НК КОЗА ОХ М ШЕ Я КК ПКУ БО Ко о ЗК ЕН ШО ШЕ о а ШО ОД НН ОХ КА Б Я У Вс о НЯ Б Я Ка ООН: ї НН Б НИ М: о б У й шо Є о. дк ЩЕ в ШЕ. КЗ БУ НЕ Я Б йон БУ Он аннея Б Я хх Ох їх ЖЕ У р Не Б о В В В С о я хх Щщ-- Я Я Б ХХ щ- КУ Колшня Я КУ Б ї в КЕ я СЗШ ЕК КОП БЕ У І Я о ОН Б КОС ОМ ОН І НЄ ОН НЕ С НН ОК СОКВНЕЯ не С НОВА ХК Я В и Б ОО ЕИКО ВК ПКС КВ
- с. ши шж- о. ШЕ ш- Еш ши єе шо З Кк БО й КО МОН ОЙ Бех Х й ЩЕ Ко шо БО М КО Я - Кк КУ Б М ек кни, ЩЕ БУ Б
6. Я АК Я ОО : АСК ОК ВО М М С : ЗУ Кок о НН чис : Я МО РУ В ОХ ОО ШЕ ж ЗЕ в: С й 3 ЕХ БК КУ У ЗК С ЯКО ОХ ОО Б м ОК о НН НН Я ОО СОН КН М М У и ща ПЕК ОО Я ХО ОО о в ОМ М М ОНИ З о НИ В З м й шк 5 Ох З Ой КУ во ОМ ша я шк ся с БО В З й ши БУ «ЕН В ж в НН НН ОК ОН ОН Я КК ИН ОМ ЕК НН ОК Я ОК В ж 5 ОК М б : щи Д ф(- ши ОВ ро й ЕК З ПИЙ Ж. Ви пис В ОХ ОО Я ОККО З Ко оо 3 Я КК У КК вй ОК З Ох о Боско о З ЩЕ я ОО ОК : Х КОХ око 0 сФріг- ба А Ох м В СЯ ЕВ Ка АЖ ВЕУ ее У ВСЯ ще КОХ а и НН он нн В нн ще ши ше» є ше ши ЧИ У КИ х Ж в Ж З ПИВ Я С К Куй я вк Ж БЕ ШО оо х Бо ЗНУ осо ХХ у зол ЗИ КОХ її ЖЕК Я о Ж ВК КУ СКК ВОВ ВН в ВК ЕВ Ех : з х фея з хх ово С сх зов Я Бе ЕВ М Я сх я СИС БУ КІШКИ ж Кн у БК ТК Ко 3 БЖ. оо М о ВШ С ККУ кс у Ех ще о НЯ ОК СК НН Ку ОК. Поу о Я Кн СО КК В Же як а: ШЕ С КО й ШИ: 5 ШЕ Еса й а ВК КУН Б х ко ЩО Я що 0 ЗОВ Не МІ МНН ОМ КК МОНО СТЮ СТО Б х Е Х зн іа знан пси нн нн ПММММММММ МИ
: г. ш З СУ ГЕ:
й Ж. БО У ЗНи В в ШЕ З УЗИН З ОКОМ НЯ Ки - же ОККО КО в НЯ с НН ЕХ що с Б Б: ШК БО ВН о о УНК В о КВН о в У Ка НК ВХ с: З В ос КОН оо У ОХ ЦП ОН Бе в й й ВООЗ І КУ й ой КУ КЗ Б і т Б ЕХ г основ 5 І и в КОКО ОХ не А В КК нн МОМ М ОО ше я . ЕЕ Ж Б сова ОВ
Ше. з ше ши ШЕ ко ММ ши ШК Ши ше МЕ ОО В Я хх В щу УНН В; БОШ ПОВ ПОМ : ДОН я ОО КАН, п ШЕ с ВН ОК ЯН о І ге ше Б оо КК МНЕ У КВ ше 5 БИ с З, Сх шо В ВВ В Зх БВ с НЕ ИЙ оо БВ З С у Кс ЗВ З ОМ сс КОМ е ПЕ і Де З ДИ НО : ї р У о Я - г У шЖ ПЕН я щини У МО Я ЕХ
ЕЕ. іу же ее ШИ с ОМ ККУ ше КОМ НН НИ ОН ОХ НО Ж с совок: ЗХ ХО ОНКО ОК з: -щ-- с І ЯН М.Х Б. ВИШ: ЗМК й с ОН і ке М У КУ рт Є Кох ОХ ! ОЗ ж БУ йй ке ї хх Я КЗ МЕМ ж М МОМ
Фіг. 53
«В і Хе а : ох; Нм б о. ІН мані Кох їм й зкнкк Х ї зах ДР ре не ке нки ян НУ НН ченнк «В зв К ? хи яке ХХ Ж 4 ї їж Е- яккю ЇХ : у ОВ тв 7 х х х Й мо І ех І ЗЕ : ; М 7 м ке З І І 7 Дві після тнє зерен Ж Дні після початку тера Середовище Середавние дя СЯ зва: Я Е | шянаі Я ІН нні я ! я ше ШЕ ОВД соя и: ОО я | за м І ч : -КВ х хх В з ш м кв ю 50 ож жо Дн іст пнях керанії З Ди після печатку терашії
Фіг. 54 те А і що М - ОМ КК Нева ї Тані шк МЕ тек ЖОВ ді х я би й - Б за «оОЖеЕфН сосок, ехо тякя як Ж. КЕ во З іх ,ч з з ХО т Я зай | х ноя ШИ ОК дйінннтнняну : , : : В ее спек - 7 т х ЖОВ г З як ОХ Ж ях ях Дві нісля печатку вера: 8 «Яні хист вена тера тов й чтвмя жі шЕ ж сх : оо Хе ок вня в. сх Є че г Ж їх сш х Б ж тайни дк, Шежннй іх х їн чаші НЯ Я с яко Ж 0 фей у стендах нки аа ше Кх х ска ЗЕ В М. КОХ з дк УХ м ії х ке : -ї й ї 3 сккко З Ха - Ем зе і : я оо ВОЖжою ї шн Б шо шо я В Ди хнет мекв неріамнї. ї Дві пен воєн Керн Ж сріг. 55
НЕ МАЙ за тк ТЕ ще І: ОБ До Шви 8: й с. Нео; ж КЕ І зо УЗ шенні фено фх етики юю есювюттює ман є І моя м х я в ОВО шов Я з б мВ ж в в Зі після понетю черні З Ві після печатку керемії везе - мерА чех - В я. ві Е ключ Шев АЙ с Шинві Е щ " р ра І зи Ж ї з І ще «й вені зоКооднджжюцюкі: Сайко Е Ко дено зе БОЖ яр А ню Ж р хо со ко о Й Я ще - ДЕ Я З ї я ї. 33 . і і і йо ооо 5006 здох . . лк я ВЕК броню тир ва вл вовки кие Двіляя трачатнх ТЕН ї ДНЕЛЕКВ ТНОЧИТХ тери
Фіг. 36 Асад АВ ТЕ Новий б й т жо - й шо: 7 ярі Шев Не я НЕ манчккї ях, І Ук тк ХО ЗРМДЙН сохою оночиннкжх сенюєккессбю нею Х В ТЗ НИХ дон зн» Я З я Б пк зе В соя ИЙ бан я ХА ак а и кв » жо в п їх Бо МО кож Де після початкх теролії є Ді пієзя точнетвх терені в-Я т-сщ ке АЯВ ше Ве АВ Зк: оса ї - ї скк ! х б с: : ко ОН я х з т дат У бли 0 Шавей ЗО, ІН митні що и Ба - и зр Мадух джлдлнстлля чик ЗК тофу х ар ще С а яке Же ж к ож. х ск я ох з А -е Я ом ; я Ж у ее у " У ох ЖоОдиОВо т КЕ ек х КІ я ве Ай вісн вгучкаттв зерен Е Дні яісзя печегех терені й
Фіг. 57 і Я ОЗрожен ВЖЕ т рани ай: жа сних є м За ж ЩО оо ее М У - 5» ж я ещ а в і зх З ж ХЕ ! «
Фіг. 58 Співвідношення вижнижння вок фена 000 ппжнннннснснне 00 Йв Середовище її | |. є жа ТЛО ЙО фдннннйріннярннясуюния 0 сееенн 00 ВАЗЕДАОВ х | І Б. ж ЛНУ МЛІААНЮВ і З, оннсистгсн см Рухіюсьтьхк вот алалухьмоьвея. вові вл і 000 нс Ані після почаенх тера
Фіг. 59
Є піжвіхнопвкня вжива нин: Єніввіднотення вижкватня. В нн кекс ооо дних МХУХНКНУчЕнну тлогтютсю ст слихикнжскю . с шин й... сш й ! і х в вв мн з з, х Ж я Ж Е та Ко КЕ а що Дві після точатну терикції ЯТВЕ енсхЕк звочаеку: терапії зайн СЕДЕВОВННЕ зве ТЕЖ зей, (ву демннН я КО АЙ у і що т . пожити кноттетх г фкАЕККнта ПУ у рт т вк щ кі сте те кох ОР Кює ую овен " 4 не щей пт т тини ! хо В: га ненннннюс ре в В Ж в ж В ож юю ох Дні нісля теочвуху зерації Днізпісня початку терапії так СЕрОЛЕВНШЕ є трав КВ та ТОЖ а ВАдО ВЕВ ш інееововосня всаюєсюх стелею : ххх ке кююююстєкех течеех віх хто тв стю я щ Їше очи сет 4 жен как чайні чні сни ЯК, 5 ї споуоеничк кання «скужизхжиксьх жжеоєюм а вв ї 8 веіих ОЗ БУ З їЕ ж У я Же «в КЗ я схе Дні після поча тера У хвеня зиочитьте зерні яко БО «БОБ ках ско ВКЛ Е а ЗЕ ел
Фіг. 50 Нечаткова кіна безвеки о Резина (зв ваг зв яку да "в вк ни НА ІВ Є зрастуза ний МСА В преєтувнняє Де вже Ду (ен ) почаєнь сіння Джека Разшерення (грн кж до вх - Б ЗАСТ Ае ЕКЙ ракте МІСТ че раді кек зненфко Бе» зало» ме кі З цех они «вісн Вечнх ши Ша йо ви (жо
Фіг. 61
Тіват дінки: безтекв: Режавнрняня Хражов Гек і ДЕ | Крик Ту день Я раз в ЗІ Е І лу укладка і Н і фе ех : - ІК ЕМ ІЕ: ЕІ нате 1000 тради, З З МЬАЧНЯВ 0000 ПрастувУв обраний, ОЗ сажею одне бе 130 мон» на Ж | Жбавняяе 00 явка: у ЯКве Ж ебхвви Вів». З» день Я ря в ЗНУ Ї Крик їх лень рн в Ж Кен они щі Ї рю ДУМ, . є І ріки: МСЕ АНЕЯ и ТВОЯ | Н сх. ВСЕ ІЖЯ Третий обіжне обме 50 вит, Не Бони 300 яви інкасо тв З З вк, тянКЕя о джек КО ЗООрх вже МЕС оосюсюсюосююєтсютюткі СУХУ нн нок Ж З водальшн огодиненм еру 00 У подальениає березу хрерівлюм сростеревення щісля початку НЯфКУЗИЇ Керяннної сеостврезення вікслх початку фії КУЗЯ Є ТРОЕМ УТОВСЮТО ЕЕЯ НеЇХ МАЄ НХ Мерія кози й д-кеавин мере внедень для неїх несуумтх веелеек. З рве Я зручно кеукріснно бно внесе У век З урастучумно повизких клю тунукаея 0 хв, заккажски зурек я ЯК жа
Фіг. 62 Єочаткава сх беулекиу Разширених о Шк Те какния 0 Шо СП лек Деякі і Ї о Щркл юнь зав І Дсней пу ІМСГАОЯК, у Чвхикв? ЕВ ЕВ 00 МОКАЗЯЮ: у ееней зі Неере ЩІ ВЖБЯИІ, ї 11 мг ої ГО їх Ах ах Ін ле хі и 11 тий їх хе их и ЖИР То Ки і ІНК: Зав ІЙ бхввжї Ії ій хвовля | і їхав | ІОЖИКАОХ Її Же си б хдавк БІ би о З НЕ Тихо ж ТІ Б ППП тим ЛИКУ ЗК ТИ Кухлі пп М Ї г Зоя З, дике З Срох З меду Що | Ян Шнкх б, лив гра кнЖь СПД рими жи трретиєттюю, й ск юю жюжююю уки Н ит Дт титен а п дохюукюююєюююююю 1 дуууумуюимю КЕ МСА: Трялужй) ді ММадюж Ї Я тре 1 : мн Туйстимаю сровнк 3112 НАВ ВІ Б Пе» і рю ри ЗБ вн : й ра і І Прима а І КК Б Я ом НЕ Е ЖИКВЯ І Дгжко АЖ Зах вх і їйхашя ї В Тхка З і КОЗНМИНЯ СІ Зголю 1 ЗО вк ха Е хи | й Цбхвжя Хі КІ Тс срддтянтятянн нн Ед нрі фі оснЙ Кл ПТ: сееннняя т 220 ТТ й . : Ж пожацтам болодннних; сер сиостороження миля З али скоечит; проза я У - З позальним 5 тойивим Періалом се начерк МВА врервннех дози і З-кадниним перівдом для кікмеререназнвя сля почяТКУ ТУ пефрвиаоя жі пол, Й . ігор, с. хоч себя фраз рт у ВХ НаСТУ ТИХ. ДВС» лючи і д-уаляаним верімниа ля вих настузвих й . с внелЕце, У пит 2 трастузумає пацконо їжі валить щро гуру б У никаї З триста потрібно булі» пвслятя як вритямм В) ха.
Фіг. 63
UAA201910171A 2017-03-31 2018-04-03 Агент, націлений на erbb-2, і біспецифічне антитіло з сайтами зв'язування антигену, які зв'язують епітоп на позаклітинній частині erbb-2 і erbb-3, для лікування індивіда з позитивною за erbb-2, erbb-2/erbb-3 пухлиною UA129382C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201715476260A 2017-03-31 2017-03-31
EP17164396 2017-03-31
PCT/NL2018/050205 WO2018182421A1 (en) 2017-03-31 2018-04-03 Erbb-2 targeting agent and a bispecific antibody with antigen-binding sites that bind an epitope on an extracellular part of erb-2 and erbb-3, for treatment of an individual with an erbb-2, erbb-2/erbb-3 positive tumour

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA129382C2 true UA129382C2 (uk) 2025-04-09

Family

ID=61972188

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201910171A UA129382C2 (uk) 2017-03-31 2018-04-03 Агент, націлений на erbb-2, і біспецифічне антитіло з сайтами зв'язування антигену, які зв'язують епітоп на позаклітинній частині erbb-2 і erbb-3, для лікування індивіда з позитивною за erbb-2, erbb-2/erbb-3 пухлиною

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP3600412A1 (uk)
JP (1) JP7304815B2 (uk)
KR (2) KR20250131840A (uk)
CN (1) CN111032081A (uk)
AU (1) AU2018246872C1 (uk)
BR (1) BR112019020507A2 (uk)
CA (1) CA3058342A1 (uk)
IL (1) IL269655B2 (uk)
MX (1) MX2019011658A (uk)
PH (1) PH12019550203A1 (uk)
SG (1) SG11201908833TA (uk)
UA (1) UA129382C2 (uk)
WO (1) WO2018182421A1 (uk)
ZA (1) ZA201906364B (uk)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116407626A (zh) * 2020-01-29 2023-07-11 美勒斯公司 用于调节免疫细胞衔接效应的手段和方法
WO2025188180A1 (en) * 2024-03-04 2025-09-12 Merus N.V. Erbb-2 and erbb3 targeting agents for use in the treatment of malignant cells or cancers that have elevated nrg1 expression

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20070111201A1 (en) 2001-04-30 2007-05-17 Benjamin Doranz Reverse transfection of cell arrays for structural and functional analyses of proteins
NZ537277A (en) 2002-07-18 2008-04-30 Crucell Holland Bv Recombinant production of mixtures of antibodies
US20060212956A1 (en) 2005-03-14 2006-09-21 Genentech, Inc. Animal model of ligand activated HER2 expressing tumors
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
SG178789A1 (en) 2007-02-16 2012-03-29 Merrimack Pharmaceuticals Inc Antibodies against erbb3 and uses thereof
US7705103B2 (en) 2007-06-22 2010-04-27 3M Innovative Properties Company Polydiorganosiloxane polyoxamide copolymers
PL3456190T3 (pl) 2008-06-27 2022-06-06 Merus N.V. Wytwarzające przeciwciała transgeniczne zwierzę z gatunku myszy
SG172983A1 (en) 2009-01-15 2011-08-29 Lab Corp America Holdings Methods of determining patient response by measurement of her-3
CN104447995A (zh) 2009-03-20 2015-03-25 霍夫曼-拉罗奇有限公司 双特异性抗-her抗体
NZ607337A (en) 2010-08-20 2015-06-26 Novartis Ag Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3)
WO2013134686A1 (en) 2012-03-09 2013-09-12 Promega Corporation pH SENSORS
SI2838917T1 (sl) 2012-04-20 2019-11-29 Merus Nv Postopki in sredstva za produkcijo heterodimernih IG-podobnih molekul
IL301147A (en) 2014-02-28 2023-05-01 Merus Nv An antibody that binds to ErbB-2 and ErbB-3

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201908833TA (en) 2019-10-30
AU2018246872B2 (en) 2021-04-01
WO2018182421A1 (en) 2018-10-04
BR112019020507A2 (pt) 2020-08-04
NZ757546A (en) 2024-07-26
IL269655B1 (en) 2023-05-01
CN111032081A (zh) 2020-04-17
JP7304815B2 (ja) 2023-07-07
KR20190140944A (ko) 2019-12-20
CA3058342A1 (en) 2018-10-04
JP2020515594A (ja) 2020-05-28
ZA201906364B (en) 2025-12-17
IL269655A (en) 2019-11-28
AU2018246872A1 (en) 2019-10-17
IL269655B2 (en) 2023-09-01
PH12019550203A1 (en) 2020-07-13
EP3600412A1 (en) 2020-02-05
MX2019011658A (es) 2019-11-18
AU2018246872C1 (en) 2023-05-18
KR20250131840A (ko) 2025-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101493261B1 (ko) 직장암의 치료 방법
UA120753C2 (uk) Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20
UA118749C2 (uk) Конструкція антитіла до cdh19 і cd3
UA128001C2 (uk) Націлені на пухлину агоністичні cd28-антигензв'язувальні молекули
UA125898C2 (uk) Антитіла до tigit
UA129471C2 (uk) Білки, які містять антигензв'язувальні домени пов'язаної з калікреїном пептидази 2, і їх застосування
UA129050C2 (uk) Антитіла до cd3 та їх застосування
UA126656C2 (uk) Біспецифічна конструкція антитіла до psma і cd3, яке залучають t-клітини
SA517390370B1 (ar) عوامل ربط للمستقبلات المناعية من نوعية واستخداماتها (tigit)
UA126441C2 (uk) Химерні антигенні рецептори, націлені на bcma, та способи їх застосування
UA103912C2 (uk) Антитіла проти ангіопоетину-2 людини
UA118961C2 (uk) Антитіло, яке зв'язується з tl1a, та його застосування
UA126281C2 (uk) Антитіла проти сигнал-регуляторного білка альфа та способи їх застосування
SA516370515B1 (ar) أجسام مضادة ضد cxcr4 ومتقارنات جسم مضاد- عقار
UA112062C2 (uk) Cd33-зв'язувальний агент
UA113838C2 (xx) Антитіло, яке зв'язує мезотелін, та імунокон'югат
UA98762C2 (uk) Моноклональне антитіло, яке зв'язується з tat226, та імунокон'югат
UA126897C2 (uk) Антитіла проти dr5 і способи їх застосування
UA118757C2 (uk) Зв'язуюча молекула для всма та сd3
UA119226C2 (uk) Антитіло, яке специфічно зв'язується з axl, та його застосування як продукту для адресної доставки при лікуванні раку
UA123759C2 (uk) Застосування моноклонального антитіла, яке інгібує шлях пов'язаного з геном кальциноніну пептиду (cgrp), для лікування або зниження частоти випадків мігренозного головного болю у суб'єкта
AU2018333290A1 (en) AXL-specific antibodies and uses thereof
JP6628290B2 (ja) 阻害剤
JP5868176B2 (ja) 抗癌活性を有する抗体
UA129382C2 (uk) Агент, націлений на erbb-2, і біспецифічне антитіло з сайтами зв'язування антигену, які зв'язують епітоп на позаклітинній частині erbb-2 і erbb-3, для лікування індивіда з позитивною за erbb-2, erbb-2/erbb-3 пухлиною