UA155352U - Спосіб одержання комплексного біотехнологічного продукту, що містить позаклітинні везикули від трьох типів клітин-продуцентів, для відновлення дефектів м'яких тканин - Google Patents
Спосіб одержання комплексного біотехнологічного продукту, що містить позаклітинні везикули від трьох типів клітин-продуцентів, для відновлення дефектів м'яких тканин Download PDFInfo
- Publication number
- UA155352U UA155352U UAU202301486U UAU202301486U UA155352U UA 155352 U UA155352 U UA 155352U UA U202301486 U UAU202301486 U UA U202301486U UA U202301486 U UAU202301486 U UA U202301486U UA 155352 U UA155352 U UA 155352U
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- cells
- mscs
- stem cells
- png
- cell
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 title claims abstract description 8
- 230000007547 defect Effects 0.000 title claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 210000000933 neural crest Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 5
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 claims abstract 2
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 claims description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 239000011669 selenium Substances 0.000 claims description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 3
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 3
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 claims description 3
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 claims description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 claims description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 2
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 claims 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 abstract 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 abstract 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 230000030214 innervation Effects 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000003254 palate Anatomy 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 1
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 208000035965 Postoperative Complications Diseases 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 235000020289 caffè mocha Nutrition 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000005808 skin problem Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Спосіб одержання комплексного біотехнологічного продукту, що містить позаклітинні везикули від трьох типів клітин-продуцентів, для відновлення дефектів м'яких тканин, за яким одержують мезенхімальні стромальні/стовбурові клітин методами механічної та ферментативної обробки чи методом експлантів. Для одержання мезенхімальних стромальних/стовбурових клітин виконують їх виділення з жирової тканини, ліпоаспірату та/або біоптату шкіри, мультипотентних мезенхімальних стромальних/стовбурових клітин з пупкового канатика та мультипотентних стовбурових клітин-похідних нервового гребеня, отриманих із пульпи зуба, волосяного фолікула, біоптату слизової піднебіння. Виконують обробку та ізоляцію одержаних клітин, виконують культивування in vitro з метою експансії МСК ЖТ, МСК ПК та МСК-ПНГ. Здійснюють первинне виділення МСК ЖТ, МСК ПК та МСК-ПНГ ферментативним способом або способом експлантів, застосовуючи додатковий спосіб селекції необхідної популяції клітин МСК-ПНГ поміщенням первинної популяції клітин у фібриновий гель, та їх культивування до необхідної кількості з наступним кріоконсервуванням та/або пасируванням для подальшого виготовлення біотехнологічного безклітинного продукту на основі їх секретому. Створюють майстер-банк отриманих культур клітин шляхом кріоконсервування необхідної кількості клітин на ранніх пасажах, отримують секретом клітин-продуцентів для біотехнологічного продукту, очищують отримане середовище секретому клітин-продуцентів, поєднують безклітинне кондиційне середовище отриманого від культивованих МСК ЖТ, МСК ПК та МСК-ПНГу попередньо визначеній пропорції.
Description
Корисна модель належить до галузі біотехнології та медицини, а саме - клітинної терапії, пульмонології, неврології, урології, хірургії, гінекології, стоматології. Спосіб може бути використаний як комплексний засіб для проведення терапії для пригнічення тривалих запальних процесів, відновлення деструктивних змін у тканинах внаслідок механічного, інфекційного пошкодження або вікових змін, подолання післяопераційних ускладнень, відновлення іннервації тканин та органів, регенерації тканини легень, подоланні бронхіальної астми, наслідків перенесеного ковіду-19, хронічного обструктивного запалення легень та ін. патології дихальної системи. Запропонований біотехнологічний продукт застосовується виключно під контролем чи рекомендаціями лікаря-фахівця відповідного профілю шляхом місцевих ін'єкцій, інгаляцій, аплікаційного нанесення та ін.
Аналогами запропонованого способу одержання біотехнологічного продукту на основі екзосом, отриманих від різних типів стовбурових клітин-продуцентів для регенерації пошкоджених м'яких тканин, є:
Винахід (Патент КК 20190028677А, Південна Корея|, який захищає спосіб отримання екзосом з підвищеним вмістом факторів росту, що включає культивування стовбурових клітин в середовищі, що включає епітеліальний фактор росту, фактор росту фібробластів або їх комбінацію та саму популяцію очищених екзосом на колонках, як основу фармацевтичної композиції для вирішення проблем шкіри обличчя. Серед стовбурових клітин-продуцентів екзосом в даному патенті описані МСК ПК, МОСК ЖТтТ та МОСК кісткового мозку, які перед отриманням кондиційного середовища для виділення екзосом культивують у безсироватковому середовищі ДМЕМ із додаванням рекомбінантних факторів росту. Недоліком даного методу є застосування рекомбінантних факторів росту як ксеногенного елемента, а також спосіб очищення екзосом на колонках, що несе за собою ризик низького виходу очищених екзосом та є придатним підходом для промислового виробництва.
Найближчим аналогом є винахід (Патент О5 2017/0121685А1, СШАЇ, який захищає спосіб отримання екзосом від мезенхімальних стовбурових клітин та саму популяцію очищених екзосом як фармацевтичної композиції для лікування запальних процесів. Отримують екзосоми від культивованих мезенхімальних стовбурових клітин жирової тканини шляхом фільтрації через фільтр пропускною здатністю пор не менше З кДа, або шляхом ультрацентрифугування.
Зо Щонайменше 20 9о отриманої популяції екзосом згідно з патентом характеризується розміром 150-300 нм, молекулярною вагою З кДа, експресією маркера тромбоспондин-ї (ТОР-1). Даний тип екзосом рекомендовано застосовувати для терапії запальних станів кишечнику, хвороби
Крона, ревматоїдного артриту |. Недоліком даного методу є використання лише одного типу клітин-продуцентів, що значно обмежуватиме ефективність застосування даного підходу.
Описана популяція екзосом в патенті має розміри від 150-300 нм, що не входить в межі визначення екзосом від 50-150 нм. Описаний спосіб очищення екзосом шляхом фільтрації може призводити до втрати позаклітинних везикул меншого діаметра та молекулярної ваги.
В основу корисної моделі поставлено задачу, яка полягає у розробці способу одержання комплексного біотехнологічного продукту із значним вмістом біологічно активних речовин широко спектра дії, для стимуляції ефективного відновлення пошкоджених клітин, перешкоджанню загибелі клітин, індукції власних стовбурових клітин організму до проліферації та заміщення втрачених, вираженої протизапальної та нейропротекторної дій, покращення іннервації та кровопостачання периферичних органів та тканин, та має відповідати низці вимог: безпека, якісний склад, вирішення декілька проблем одночасно, стабільність, доступність.
Поставлену задачу вирішують тим, що спосіб одержання комплексного біотехнологічного продукту, що включає позаклітинні везикули від трьох типів клітин-продуцентів, для відновлення дефектів м'яких тканин, включає етапи, за яким : одержують мезенхімальні стромальні/стовбурові клітин методами механічної та ферментативної обробки чи методом експлантів, згідно з корисною моделлю, для одержання мезенхімальних стромальних/стовбурових клітин виконують їх виділення з жирової тканини, ліпоаспірату та/або біоптату шкіри, мультипотентних мезенхімальних стромальних/стовбурових клітин з пупкового канатика та мультипотентних стовбурових клітин- похідних нервового гребня, отриманих із пульпи зуба, волосяного фолікула, біоптату слизової піднебіння, виконують обробку та ізоляцію одержаних клітин, виконують культивування іп міїго з метою експансії МСК ЖТ, МОСК ПК та МСК-ПНГ, здійснюють первинне виділення МСК ЖТ, МОСК ПК та МСК-ПНГ ферментативним способом або способом експлантів, застосовуючи додатковий спосіб селекції необхідної популяції клітин бо МСК-ПНГ поміщенням первинної популяції клітин у фібриновий гель, та їх культивування до необхідної кількості з наступним кріоконсервуванням та/або пасируванням для подальшого виготовлення біотехнологічного безклітинного продукту на основі їх секретому, створюють майстер-банк отриманих культур клітин шляхом кріоконсервування необхідної кількості клітин на ранніх пасажах, отримують секретом клітин-продуцентів для біотехнологічного продукту, очищують отримане середовище секретому клітин-продуцентів, поєднують безклітинне кондиційне середовище отриманого від культивованих МОСК ЖТ,
МСК ПК та МСК-ПНГ у попередньо визначеній пропорції.
Корисною моделлю передбачено, що культивування МСК ЖТ та МОСК ПК здійснюють у ростовому середовищі с0-МЕМ з 10 95 фетальної бичачої сироватки, 10 нг/мл основного фактора росту фібробластів (БЕСБЕ), 2тпМ стабільного глутаміну та 1 95 розчину антибіотика/антимікотика при 37 "С, 5 95 СО», 5 95 Ог та 95 95 вологості в СОг-інкубаторі.
Також запропонованим способом передбачено, що культивування МСК-ПНГ здійснюють у ростовому середовищі х0-МЕМ з 5 95 фетальної бичачої сироватки, 5 нг/мл основного фактора росту фібробластів (БЕСЕ), 10 нг/мл епідермального фактора росту (ЕСЕ), 1 95 інсулін- трансферин-селену, 2 мМ стабільного глутаміну, антибіотиків/антимікотиків на культуральних флаконах з додатковим покриттям желатином/колагеном чи ін. компонентів позаклітинного матриксу.
Крім того, у способі враховано, що очищення отриманого кондиційного середовища (секретому) виконують шляхом диференційного центрифугування, ультрацентрифугування та фільтрації через 0,22 мкм нейлоновий фільтр для очищення від клітин, дебрису та апоптотичних тілець.
Перевагами наведеного способу є наявність унікального складу продукту, що включає комбінацію позаклітинних везикул, отриманих від культивованих аутологічних/«алогенних МСК
ЖТ, МОСК ПК та МСК-ПНГ, що несуть в собі значну кількість біологічно активних речовин, широкого спектра дії. Одержаний склад дозволяє максимально швидко та всесторонньо відновити пошкодження м'яких тканин, дистрофічно-деструктивні зміни у тканинах, знизити рівень запальних процесів та відновити іннервацію.
Запропонована корисна модель пояснюється за допомогою доданих креслень, на яких
Зо зображено:
На Фі, 1 зображена типова морфологія мультипотентних мезенхімальних стромальних/стовбурових клітин пупкового канатика (А), мультипотентних мезенхімальних стромальних/стовбурових клітин жирової тканини (Б), мультипотентних стовбурових клітин- похідних нервового гребеня (В) в культурі іп міго. (фазово-контрастна мікроскопія, масштабний відрізок 100 мкм).
На Фіг. 2 наведена кількісна характеристика готового біотехнологічного продукту на основі комплексу екзосом, отриманих від різних типів стовбурових клітин, для регенерації пошкоджених м'яких тканин. А - концентрація позаклітинних везикул в розчині готового продукту, результати Мапорапісіе Тгаскіпд Апаїузіз (МТА) (Мапозідн: І М10), Б - розподіл позаклітинних везикул у розчині за розміром, результати Мапорагіїсіе ТгаскКіпуд Апаїузів (МТА).
Здійснюють первинне виділення мультипотентних мезенхімальних стромальних/стовбурових клітин з жирової тканини, ліпоаспірату та/або біоптату шкіри, мультипотентних мезенхімальних стромальних/стовбурових клітин з пупкового канатика та мультипотентних стовбурових клітин-похідних нервового гребня отриманих із пульпи зуба, волосяного фолікула, біоптату слизової піднебіння, різними методами механічної та ферментативної обробки чи методом експлантів. Біологічний матеріал отримують за добровільною згодою донора, після проходження всіх необхідних інфекційних скринінгів та збору анамнезу в умовах операційної/маніпуляційної під місцевою (локальною) або системною анестезією. Транспортування анатомічного матеріалу/біоптату з операційної/маніпуляційної в біотехнологічну лабораторію здійснюють на холоду (4...--8 "С) в спеціальних термоізоляційних контейнерах протягом не більше 72 годин з моменту забору матеріалу. Ізоляція клітин проводять після обробки анатомічного матеріалу/біоптату механічним способом, ферментативним або їх комбінацією, наприклад біоптат піддають дисоціації за допомогою суміші розчинів протеолітичних ферментів, наприклад, 0,2 95 колагенази ІА, пронази, диспази,
ДнНКази і/або їх суміші при температурі т4...-40 "С і, можливо, при постійному помішуванні на шейкері-інкубаторі при 1-1000 об./хв., протягом необхідного часу (від 5 хв до 24 годин).
Культивування іп міїго для експансії МСК ЖТ, МОСК ПК та МСК-ПНГ.
Таблиця
Імунофенотип мультипотентних мезенхімальних стромальних/стовбурових клітин жирової тканини, пупкового канатика та мультипотентних стовбурових клітин-похідних нервового гребеня після експансії в культурі іп міго 6073 | ср9о | сото5 | соз4 | сСо45 | НАВ | Мевіп мекжт 9923 | 9620 | 9485 | 001 | 021 | 005 | - мокко | 99935 | 9917 | 9877 | 003 | 001 | 050 | -
Примітки: МСК ЖТ - мультипотентні мезенхімальні стромальні/стовбурові клітини жирової тканини, МСК ПК - мультипотентні мезенхімальні стромальні/стовбурові клітини пупкового канатика, МСОСК-ПНГ - мультипотентні мезенхімальні стромальні/стовбурові клітини-похідні нервового гребеня.
Здійснюють первинне виділення МСК ЖТ, МОСК ПК та МСК-ПНГ ферментативним способом або способом експлантів, застосовуючи додатковий спосіб селекції необхідної популяції клітин
МСК-ПНГ поміщенням первинної популяції клітин у фібриновий гель, та їх культивування до необхідної кількості з наступним кріоконсервуванням та/(або пасируванням для подальшого виготовлення біотехнологічного безклітинного продукту на основі їх секретому. Культивування
МОСК ЖТтТ та МОСК ПК здійснюють у ростовому середовищі с0-МЕМ з 10 95 фетальної бичачої сироватки, 10 нг/мл основного фактора росту фібробластів (БЕСБЕ), 2 тМ стабільного глутаміну та 1 95 розчину антибіотика/антимікотика при 37 "С, 595 СО», 5 95 О» та 95 95 вологості в СОг- інкубаторі. Культивування МОСК-ПНГ здійснюють у ростовому середовищі о-МЕМ з 595 фетальної бичачої сироватки, 5 нг/мл основного фактора росту фібробластів (БЕСЕ), 10 нг/мл епідермального фактора росту (ЕСЕ), 1 95 інсулін-трансферин-селену, 2 мМ стабільного глутаміну, антибіотиків/антимікотиків на культуральних флаконах з додатковим покриттям желатином/колагеном чи ін. компонентів позаклітинного матриксу.
Аналіз отриманих культур МОСК ЖТ, МОСК ПК та МСОСК-ПНГ на відповідність критеріїв визначення, а саме фібробластоподібна морфологія, здатність до формування колоній (колонієутворююча здатність КУО, кожен тип клітин висівають на культуральний пластик з розрахунку 1 клітина на 3-5 см? та культивують в ростовому середовищі з 20 95 фетальної бичачої сироватки протягом 14 днів з наступною фіксацією 95 95 етанолу, фарбуванням за
Романовським-Гімзе, аналізом), здатність до направленого трилінійного диференціювання, відповідним фенотипом: наявність більше 85 95 клітин в популяції позитивних за маркерами ср105, 2090, СО073 (додатково нестин для МСК-ПНГ) та не більш ніж З 95 клітин несли на поверхні маркери СО34, СО45, НІ А-Ог. Проведення інфекційного скринінгу отриманих культур на можливість контамінації мікоплазмою та ін. інфекційними агентами (Фіг. 1, таблиця).
Створення майстер-банку отриманих культур клітин шляхом кріоконсервування необхідної кількості клітин на ранніх пасажах.
Отримання секретому клітин-продуцентів для біотехнологічного продукту. Здійснюють нарощення необхідної кількості клітин-продуцентів. Засів в кількості 105 клітин на культуральний
Зо флакон площею 175 см" або мультифласк площею від 525 см", культивування у ростовому середовищі до досягнення 70-90 95 конфлуентності, після чого здійснюють заміна ростового середовища на безсироваткове при подальшому культивуванні протягом 24-72 годин.
Очищення отриманого кондиційного середовища (секретому) шляхом диференційного центрифугування, ультрацентрифугування та фільтрації через 0,22 мкм нейлоновий фільтр для очищення від клітин, дебрису та апоптотичних тілець.
Поєднання безклітинного кондиційного середовища отриманого від культивованих МОСК ЖТ,
МСК ПК та МСК-ПНГ у певному співвідношенні (від 1:1 до 10:1 і т.д.), фасування у стерильний флакон об'ємом від 1-10 мл та наступним аналізом отриманої партії продукту на предмет кількісного складу (визначення концентрації та розміру наявних позаклітинних везикул на спеціально розробленому для аналізу наночастинок приладі Мапозідні) та загального вмісту білка доступними колориметричними та спектрофотометричними методами. (Фіг. 2)
Готовий біотехнологічний безклітинний продукт, що містить позаклітинні везикули, в тому числі і екзосоми, від трьох типів стовбурових клітин, МСК ЖТ, МОСК ПК та МОК-ПНГ, для місцевого застосування з метою регенерації пошкоджених м'яких тканин, зняття запалення,
відновлення іннервації, являє собою стерильний прозорий розчин об'ємом від 1 мл, без додавання консервантів, з концентрацією позаклітинних везикул щонайменше 1х105/мл.
Продукт стабільний протягом 6 місяців за умови зберігання при -20 "С та протягом 14 діб при т4...-6 С. Після відкриття флакона продукт зберігати при 4...-6 "С не більше однієї доби. Не допускати повторних циклів заморозки/розморозки. Продукт транспортують на холоді при т4...-87С або в сухому льоді для недопускання розморозки попередньо замороженого продукту.
Claims (5)
1. Спосіб одержання комплексного біотехнологічного продукту, що містить позаклітинні везикули від трьох типів клітин-продуцентів, для відновлення дефектів м'яких тканин, за яким одержують мезенхімальні стромальні/стовбурові клітини методами механічної та ферментативної обробки чи методом експлантів, який відрізняється тим, що для одержання мезенхімальних стромальних/стовбурових клітин виконують їх виділення з жирової тканини, ліпоаспірату та/або біоптату шкіри, мультипотентних мезенхімальних стромальних/стовбурових клітин з пупкового канатика та мультипотентних стовбурових клітин-похідних нервового гребеня, отриманих із пульпи зуба, волосяного фолікула, біоптату слизової піднебіння, виконують обробку та ізоляцію одержаних клітин, виконують культивування іп міїго для експансії МОСК ЖТ, МОСК ПК та МСК-ПНГ, здійснюють первинне виділення МСК ЖТ, МОСК ПК та МСК-ПНГ ферментативним способом або способом експлантів, застосовуючи додатковий спосіб селекції необхідної популяції клітин МСК-ПНГ поміщенням первинної популяції клітин у фібриновий гель, та їх культивування до необхідної кількості з наступним кріоконсервуванням та/або пасируванням для подальшого виготовлення біотехнологічного безклітинного продукту на основі їх секретому, створюють майстер-банк отриманих культур клітин шляхом кріоконсервування необхідної кількості клітин на ранніх пасажах, отримують секретом клітин- продуцентів для біотехнологічного продукту, очищують отримане середовище секретому клітин- продуцентів, поєднують безклітинне кондиційне середовище отриманого від культивованих МОСК ЖТ, МСОК ПК та МСК-ПНГ у попередньо визначеній пропорції. Зо
2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що культивування МОСК ЖТ та МОСК ПК здійснюють у ростовому середовищі «-МЕМ з 10 95 фетальної бичачої сироватки, 10 нг/мл основного фактора росту фібробластів (БЕСЕ), 2тпМ стабільного глутаміну та 1 95 розчину антибіотика/антимікотика при 37 "С, 5 95 СО», 5 95 Ог та 95 95 вологості в СОг-інкубаторі.
3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що культивування МСК-ПНГ здійснюють у ростовому середовищі а-МЕМ з 595 фетальної бичачої сироватки, 5 нг/мл основного фактора росту фібробластів (БЕСБЕ), 10 нг/мл епідермального фактора росту (ЕСЕ), 1 95 інсулін-трансферин- селену, 2 мМ стабільного глутаміну, антибіотиків/«антимікотиків на культуральних флаконах з додатковим покриттям желатином/колагеном чи інших компонентів позаклітинного матриксу.
4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що очищення отриманого секретому виконують шляхом диференційного центрифугування, ультрацентрифугування та фільтрації через 0,22 мкм нейлоновий фільтр для очищення від клітин, дебрису та апоптотичних тілець. шен НН
Фіг. 1.
«А а. ії - : і о хх їх І і та ! сепикти о « с Фо І то нак ак ж зжо ЖУК х Бе о я - і Се дО ЖИ я Ка Е х . їх Ж 3 Ж ЖЖ о са кни Ще яеАА 7 с х і -х РО ужити йу щої ЖОВ ох й ї У Ко ' ОЄОиги з ОХ У ЗИГИМНИ хе. М Х ї щ- ' НК КО о ж 7 ши шеше х К И «
5... : М : З КОН МК жо ах - . КК ЕК С я Ж х х їх : ; Ж са Оу В А ши х : з мо 0 Хо ж х Бо і Я : ТК ЕХ ух здох З Е Го СХ ке ку Мох з - с, УМО т : хе ГЗНеНе : зе ОК В цу ; З ї х у і ОКО и муутинт нику Е ї л -5 и МН СХ охо т МКМ БУ Її х ве ОО М т Чак пику ом : ЕЕ, - ЖЖ жито я Я КО ОО У ЗО Ж «Кк І ТОМУ ТЕЦ ТІ ї х зн Х ЖИ хо но пу ї "З п КЕ тю йод ПО І: З ще І Кия ЗЕ шюкот і У "В х й зх -кк сх 0 І ММ ту Вннннттятятянятяяятнних в нн в Я З ї Оу утри кухни кят ук кує х Хо дю жо жо 2 хх ск жо жо хх г хе же Мо Бе як мех Же же ме ев пух ДАЕ СЕК Фіг 7.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU202301486U UA155352U (uk) | 2023-04-06 | 2023-04-06 | Спосіб одержання комплексного біотехнологічного продукту, що містить позаклітинні везикули від трьох типів клітин-продуцентів, для відновлення дефектів м'яких тканин |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU202301486U UA155352U (uk) | 2023-04-06 | 2023-04-06 | Спосіб одержання комплексного біотехнологічного продукту, що містить позаклітинні везикули від трьох типів клітин-продуцентів, для відновлення дефектів м'яких тканин |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA155352U true UA155352U (uk) | 2024-02-21 |
Family
ID=89908171
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAU202301486U UA155352U (uk) | 2023-04-06 | 2023-04-06 | Спосіб одержання комплексного біотехнологічного продукту, що містить позаклітинні везикули від трьох типів клітин-продуцентів, для відновлення дефектів м'яких тканин |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA155352U (uk) |
-
2023
- 2023-04-06 UA UAU202301486U patent/UA155352U/uk unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230405180A1 (en) | Mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or mesenchymal stem cell-hydrogel-undegradable support composition for skin regeneration or wound healing | |
| Huang et al. | Pulse electromagnetic fields enhance the repair of rabbit articular cartilage defects with magnetic nano-hydrogel | |
| Lee et al. | Effects of cryopreservation of intact teeth on the isolated dental pulp stem cells | |
| Soares et al. | The influence of Aloe vera with mesenchymal stem cells from dental pulp on bone regeneration: characterization and treatment of non-critical defects of the tibia in rats | |
| JP7097698B2 (ja) | 幹細胞材料およびその製造方法 | |
| JP2010538681A (ja) | 人または動物胚から間葉系幹細胞を抽出及びその分泌物を抽出する方法 | |
| Yang et al. | Platelet poor plasma gel combined with amnion improves the therapeutic effects of human umbilical cord‑derived mesenchymal stem cells on wound healing in rats | |
| RU2574017C1 (ru) | Средство для лечения ожогов и ран на основе цитокинов и факторов роста, секретируемых мезенхимными клетками человека, способ получения средства и способ лечения ожогов и ран | |
| US20030202965A1 (en) | Methods and compositions for the preparation of cell transplants | |
| ES2861385T3 (es) | Método para producir un gel que contiene un lisado de plaquetas | |
| Zhu et al. | Co-culture of the bone and bone marrow: a novel way to obtain mesenchymal stem cells with enhanced osteogenic ability for fracture healing in SD rats | |
| CN103013910A (zh) | 人退变椎间盘软骨终板干细胞、制备方法及其应用 | |
| UA155352U (uk) | Спосіб одержання комплексного біотехнологічного продукту, що містить позаклітинні везикули від трьох типів клітин-продуцентів, для відновлення дефектів м'яких тканин | |
| EP4227404A1 (en) | Osteoblasts differentiated from mesenchymal stem cells and composition for treating bone disease comprising same | |
| Wang et al. | Construction of tissue‑engineered bone using a bioreactor and platelet‑rich plasma | |
| US20250313811A1 (en) | Process for preparation and cryopreservation of dental pulp from definitive teeth and products thereof based on isolated mesenchymal stem cells | |
| CN108066824A (zh) | 一种制备表皮缺损治疗药物的新方法 | |
| RU2620167C1 (ru) | Способ получения средства для стимуляции регенерации на основе продуктов секреции мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека | |
| Sabbatini et al. | The Human Amniotic Membrane: A Rediscovered Tool to Improve Wound Healing in Oral Surgery | |
| TWI566774B (zh) | 治療關節疾病的組成物及其方法 | |
| Melfa et al. | Characterization of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells from tissue harvested with the guided SEFFI technique and co-cultured with calcium hydroxyapatite | |
| CN108057131A (zh) | 一种含有干细胞的新型试剂盒 | |
| Heidari et al. | Three-dimensionally decellularized human amniotic membrane scaffold: structure, processing, and biological properties | |
| Burukcu et al. | The investigation of diverse physiological and therapeutic impact of cellular-based products derived from human cumulus cells | |
| RU2800991C9 (ru) | Способ биофабрикации трансплантата в виде клеточных сфероидов для регенеративных технологий восстановления хряща субъекта на основе надхрящницы собственного реберного хряща субъекта и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга этого же субъекта |