UA34467C2 - Виділений та очищений днк фрагмент, що кодує оксалат-декарбоксилазу - Google Patents
Виділений та очищений днк фрагмент, що кодує оксалат-декарбоксилазу Download PDFInfo
- Publication number
- UA34467C2 UA34467C2 UA95058456A UA95058456A UA34467C2 UA 34467 C2 UA34467 C2 UA 34467C2 UA 95058456 A UA95058456 A UA 95058456A UA 95058456 A UA95058456 A UA 95058456A UA 34467 C2 UA34467 C2 UA 34467C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- oxalate
- decarboxylase
- enzyme
- gene
- oxalic acid
- Prior art date
Links
- 108010068005 Oxalate decarboxylase Proteins 0.000 title abstract description 81
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title description 10
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 131
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 56
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 55
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 abstract description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 29
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000002411 adverse Effects 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 76
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 42
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 17
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 17
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 15
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 10
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 5
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N cysteic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 3
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 3
- 101001027192 Homo sapiens Kelch-like protein 41 Proteins 0.000 description 3
- 102100037644 Kelch-like protein 41 Human genes 0.000 description 3
- NEEQFPMRODQIKX-REOHCLBHSA-N N(3)-oxalyl-L-2,3-diaminopropionic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CNC(=O)C(O)=O NEEQFPMRODQIKX-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 3
- IRXRGVFLQOSHOH-UHFFFAOYSA-L dipotassium;oxalate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)C([O-])=O IRXRGVFLQOSHOH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000726103 Atta Species 0.000 description 2
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 2
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108700023158 Phenylalanine ammonia-lyases Proteins 0.000 description 2
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- QXDMQSPYEZFLGF-UHFFFAOYSA-L calcium oxalate Chemical compound [Ca+2].[O-]C(=O)C([O-])=O QXDMQSPYEZFLGF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 2
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 150000002913 oxalic acids Chemical class 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 2
- 239000001508 potassium citrate Substances 0.000 description 2
- 229960002635 potassium citrate Drugs 0.000 description 2
- QEEAPRPFLLJWCF-UHFFFAOYSA-K potassium citrate (anhydrous) Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O QEEAPRPFLLJWCF-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000011082 potassium citrates Nutrition 0.000 description 2
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LJGHYPLBDBRCRZ-UHFFFAOYSA-N 3-(3-aminophenyl)sulfonylaniline Chemical compound NC1=CC=CC(S(=O)(=O)C=2C=C(N)C=CC=2)=C1 LJGHYPLBDBRCRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010049831 Alkylglycerone-phosphate synthase Proteins 0.000 description 1
- 240000001592 Amaranthus caudatus Species 0.000 description 1
- 235000009328 Amaranthus caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 235000003276 Apios tuberosa Nutrition 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000010744 Arachis villosulicarpa Nutrition 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000004221 Brassica oleracea var gemmifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 244000308368 Brassica oleracea var. gemmifera Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100268670 Caenorhabditis elegans acc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 description 1
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 244000260524 Chrysanthemum balsamita Species 0.000 description 1
- 235000005633 Chrysanthemum balsamita Nutrition 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N D-Octopin Natural products OC(=O)C(C)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N D-octopine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](C)[NH2+][C@H](C([O-])=O)CCCNC(N)=[NH2+] IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 241001649081 Dina Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101710129170 Extensin Proteins 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 208000008852 Hyperoxaluria Diseases 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 240000004322 Lens culinaris Species 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 241000283965 Ochotona princeps Species 0.000 description 1
- 108010063734 Oxalate oxidase Proteins 0.000 description 1
- 244000133018 Panax trifolius Species 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 244000299790 Rheum rhabarbarum Species 0.000 description 1
- 235000009411 Rheum rhabarbarum Nutrition 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 1
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 1
- 235000002098 Vicia faba var. major Nutrition 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000012735 amaranth Nutrition 0.000 description 1
- 239000004178 amaranth Substances 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000012511 carbohydrate analysis Methods 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000005461 lubrication Methods 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 229940127240 opiate Drugs 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003891 oxalate salts Chemical class 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000004323 potassium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 208000018198 spasticity Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- CMQCNTNASCDNGR-UHFFFAOYSA-N toluene;hydrate Chemical compound O.CC1=CC=CC=C1 CMQCNTNASCDNGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000018405 transmission of nerve impulse Effects 0.000 description 1
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Цей винахід стосується ферменту, що руйнує щавлеву кислоту. Зокрема винахід стосується ферменту оксалат-декарбоксилазі та до ДНК послідовності, що його кодує. Крім того, винахід стосується рекомбінантної молекули, що містить послідовність, яка кодує оксалат-декарбоксилазу, і клітини-хазяїна, трансформованої такою молекулою. Винахід стосується також способу захисту рослин від несприятливої дії на них щавлевої кислоти і до способу зниження в рослинах вмісту щавлевої кислоти.
Description
Настоящее изобретение относится к ферменту, разрушающему щавелевую кислоту. В частности, изобретение относится к ферменту, названному оксалат-декарбоксилазой, и к кодирующей зтот фрагмент
ДНК последовательности. Изобретение кроме того относится к рекомбинантной молекуле, включающей ко- дирующую оксалат-декарбоксилазу последовательность, и к клетке-хозяину, трансформированной такой молекулой. Изобретение относится также к способу защить! растений от неблагоприятного воздействия на них щавелевой кислоть и к способу снижения в растениях содержания щавелевой кислоть!.
Известно, что большая часть оксалатов, попадающая в пищу животньм, и человеку в том числе, имеет растительное происхождение. Некоторье овощньсє культурь в виде зеленьх листьев (напр., амарантус, шпи- нат, ревень) являются богатьмми источниками витаминов и минералов, но одновременно содержат щавеле- вую кислоту, являющуюся вьізьиівающим стресс пищевьм фактором. Указанньсе растения при их потреблений в больших количествах становятся для человека ядовитьми, что связано с образованием оксалатньїх хела- тов кальция и осаждением оксалата кальция в почках с последующей гипероксалурией и разрушением почеч- ньїх тканей (Оесазвіго, І. Рпагт, Віотеад. Апаї 6, 1(1988); Нодакіпзоп, Сіїп. Спет 16, 547 (1970)). Помимо приве- денньїх ссьілок можно указать на, по меньшей мере, два обстоятельства, в которьіх щавелевая кислота участвуеєт косвенньі!м путем. В одном из случаєв образование щавелевой кислоть! является важньм злемен- том механизма нападения, вьібранного грибком Умпеїліїпіа зсіегоїогічт, наносящего серьезньій урон таким культурньім растениям, как подсолнечник. Щавелевая кислота накапливаєтся в инфицированньх тканях на ранних зтапах патогенеза, и ее концентрация повьішается в ходе колонизации патогеном клеток-хозяев. На- копление щавелевой кислоть! в листьях приводит к их увяданию, и в конечном итоге гибели. Таким образом, щавелевая кислота действуеєт, как подвижньй токсин, перемещающийся из основания стебля и листьев вмес- те с соком (МахуеїІ, Рпузіої Ріапі Раф! 3, 279 (1973)).
В другом случає потребление І аїіпуги5 займи5 (вика) приводит к нейролатиризму, проявляющемуся в мьішечной спастичности ног, параличе нижних конечностей, судорогах и смерти. ГІ. займи5 относится к бо- гатьім белком твердьм сортам бобовьїх, произрастающих в зкстремальньїх условиях, например: в усло- виях сильньїх ветров и повьішенного увлажнения, вследствиє чего зта культура не требуєт за собой особо сложного ухода. В различньїх частях растений присутствует нейротоксин р-М-оксалил-їі -х, р-диаминопро- пионовая кислота (ОДАП). Синтез ОДАП происходит по двухстадийной реакции, в которой щавелевая кис- лота является важнь!м исходньім соединением. ОДАП вьіступает в роли метаболического антагониста глу- таминовой кислотьї, участвующей в передаче нервньїх импульсов в головном мозгу. Соответственно, дан- ньій вид бобовьїх, несмотря на вьісокое содержание в нем белка, не может бьіть рекомендован в качестве источника пищи (Міске!5оп и др. (1973)) в изданиий "Влияние современного питания на здоровье и заболе- вания, дизтотерапия (ред. Соодпагі К.5. ЗПпіЇ5 М.Е.) 5-ое изд. стр. 412-433, Ли и Фебижер, Филадельфия).
Исследования роли щавелевой кислоть! в внішеупомянутьх системах подчеркиваєт ее значение в ка- честве важного стрессового фактора. Ценность вьіделенного гена, кодирующего белковьй продукт, разру- шающий щавелевую кислоту, очевидна. Подобньій ген может бьіть использован в качестве инструмента зффективного разрушения щавелевой кислоть в растениях, в которьїх кислота накапливаєтся в чистом ви- де или является субстратом в синтезе нейротоксина, или является средой для патогенеза. И все зто может бить осуществлено переносом единственного гена в такого рода растения.
Из известньїх ферментативньїх разрушающих щавелевую кислоту систем особьй интерес представляет оксалат-декарбоксилаза из базидиомицетовьїх грибков Соїїуріа меІшіре5, поскольку имеются сообщения о час- тично очищенном ферменте, в присутствий которого происходит одностадийное разложение щавелевой кисло- ть в диоксид углерода и муравьиную кислоту (неядовитую органическую кислоту) без необходимости присутст- вия какого-либо кофактора (Зпітагопо и др. І. Віої. Спет 227, 151 (1957)). Настоящим изобретением получают очищенную оксалат-декарбоксилазу и кодирующую ее ДНК последовательность. Изобретение кроме того вклю- чает способьї применения кодирующей последовательности для создания трансгенньїх растений с низким со- держанием щавелевой кислоть. В результате, настоящеєе изобретение позволяет исключить стрессовье ситуа- ции, создаваемье щавелевой кислотой в виішеупомянутьх случаях. Кроме того изобретение делает возможньм создание аналитических систем для определения содержания оксалата в моче и сьіворотке.
Целью изобретения является вьіделение в чистом виде и полная характеристика оксалат-декарбок- силазь.
Целью изобретения также является вьіделение, характеристика и конструирование гена, которьй мо- жет бьіть использован для зкспрессийи оксалат-декарбоксилазь! в микробах и растениях.
И еще одна цель изобретения состоит во введений зкспрессирующего оксалат-декарбоксилазу гена в растения (в том числе полевье культурьі, например: подсолнечник, соевье бобьї, бобь! в целом, рапс, люцер- на, лен, сафлор, земляной орех и клевер, овощнье культурь, например: салат, томать, огурцьї, картофель, морковь, редис, горох, чечевицу, капусту, брокколи и брюссельскую капусту, цветьї, например: петунию и ро- машки и садовье растения, например: персик) с приданием в результате таким растениям устойчивости к за- болеваниям, особенно грибковь!м заболеваниям, в которьїх основную роль играєт щавелевая кислота, напри- мер, заболеваний, вьізьіваемьїх грибками рода 5сіегоїїпіа, 5сіегоїїшт, Азрегоїйц5, Зігеріюотусев, Репісшіит,
Рукпійт, Рахів, Мусепа, І енсозіота, КПі2осіопіа, и 5спігорпуПит.
Настоящее изобретение в широком смьісле направлено на применение разрушающего оксалат фер- мента, примером которого может служить оксалат-декарбоксилаза, в промьішленньїх масштабах, например: в пивоваренной промьішленности или в сельском хозяйстве, в частности, для уменьшения подверженности растения к действию щавелевой кислоть! или для уменьшения в растений концентрации зндогенной щавеле- вой кислотьі. Разрушающий оксалат фермент (оксалат-декарбоксилаза) может бьіть использован для сниже- ния гибели или разрушения растений от заболеваний или иньїх явлений, в которьїх щавелевая кислота иг-
рает решающую инвазивную роль. Подобнье заболевания вьїізьіваются, в частности, среди прочих грибками вьишеотмеченньїх специфичньїх родов.
В данном описаний раскрьіваєется изобретение, относящееся по существу к очищенной и охарактери- зованной оксалат-декарбоксилазе. Фермент имеет кислотное значение р1, устойчив в широком интервале значений рН и умеренно термостабилен. Молекулярная масса фермента при определении методом НДО-
ПАГЗ (злектрофорез в полиакриламидном геле с натрийдиоктилсебацинатом) равна 64 кДа в гликозилиро- ванной форме и 55 кДа в дегликозилированной форме.
Кроме того, в настоящем описаний раскрьівается изобретение, относящееся к полному чистому гену, кодирующему фермент оксалат-декарбоксилазу, с характерной ДНК последовательностью, представлен- ной ПОСЛЕД. Мо 1. Ген кодирует фермент, характеризующийся активностью оксалат-декарбоксилазь! с мо- лекулярной массой (дегликозилированная форма) примерно 55 кДа при определениий методом НДО-ПАГЗ.
Изобретение относится также к композициям, предназначенньм для борьбь! с патогенезом растений, и такие препаратьї включают химические вещества, отличающиеся способностью разрушать щавелевую кислоту, в частности, активностью оксалат-декарбоксилазьі. В частности, соединение с активностью окса- лат-декарбоксилазь! присутствует в количестве, достаточном для разрушения продуцируемой патогенной щавелевой кислотьі. Необходимо указать, что в другом варианте применения в сельском хозяйстве такое соединение будет смешано с соответствующим агрономически приемлемьм носителем, способньім обес- печить доставку активного соединения к растению или в почву.
В данном описаний раскрьта трансформированная клетка растения, и такая клетка трансформиро- вана геном, кодирующим оксалат-декарбоксилазу. Ген, коюодирующий указанньій фермент, может включать
ДНК последовательность, представленную ПОСЛЕД. Мо 1.
Предложен способ защить растения от действия щавелевой кислоть, если растение нуждается в та- кой защите. Способ состоит в обеспечений нуждающегося в защите растения разрушающего щавелевую кислоту фермента в необходимом для защить растения количестве. Рекомендуется, чтобьї разрушающим щавелевую кислоту ферментом бьіла оксалат-декарбоксилаза, кодируемая геном с последовательностью, представленной ПОСЛЕД. Мо 1. Способьі! такой защить! могут бить самьмми различньіми, в том числе и трансформация растения геном, коюодирующим разрушающий щавелевую кислоту фермент, в частности, ок- салат-декарбоксилазу. Или способ защить! может заключаться в применений разрушающего щавелевую кислоту фермента в сочетаний с агрономически приемлемь/м носителем для непосредственной обработки растения или почвьї, на которой растение произрастаеєт.
Краткие пояснения к диаграммам.
Другие цели и преимущества настоящего изобретения станут понятньіми из последующего описания изобретения.
Рис. 1. Характер злюирования оксалат-декарбоксилазьі! с хроматофокусирующей колонки. Белок со стадии, обозначенной как Ацетон-їЇМ, наносят на колонку с ОЕАЕ-Сефарозой СІ -68 (1 х 13 см), уравнове- шенную калийацетатньм буфером (рН 4,5). Связаннье белки злюируют понижающимся градиентом рн.
Активность связана с пиком А, злюирующимся при рН 3,3, и пиком В, злюирующимся при рН 2,5. Там же показаньї белковьіе полосьі, соответствующие обоим пикам. Пики А (вертикальная полоса А) и В (верти- кальная полоса В) разделеньі с помощью 1195 НДСО-ПАГЗ и окрашиваются Кумасси голубьм. Вертикаль- ной полосой 5 представлень! маркерь! молекулярной массьі фирмь! Сигма (505-7).
Риб. 2. Оценка чистоть!. (А) Двукратнье последовательнье разбавления (вертикальнье полось 1-7) оксалат-декарбоксилазь, начиная с З мкг (вертикальная полоса 1) белка, разделяют на 7-1595 градиента
НДОС-ПАГУО. (В) Оксалат-декарбоксилазу (10 мкг, пик А) разделяют изозлектрическим фокусированием (рн 2,5-5, амфолить, Франция) в первом приближений и с помощью 1295 НДО-ПАГЗ во втором приближении.
Полосой 5 представленьі 505-7 (Сигма) калибровочнье стандарть! молекулярной массь. На рис. 2 (А) и (В) гели окрашеньї Кумасси голубьм.
Рис. 3. Корреляция активность - вертикальная полоса. Белок (500 нг) подвергнут злектрофорезу в двух вертикальньїх полосах 695 неденатурированного полиакриламидного геля; одна из полос окрашена
Кумасси голубь/м, а другая разрезана на двенадцать кусочков величиной 4 мм. Кусочки геля инкубируют в 200 мкл 0,1 М калийацетатного буфера (рн 4,5). Акриламид измельчают и вьімачивают в течение примерно суток при 4"С. Определяют ферментативную активность и коррелируют с полосой в вертикальной окра- шенной полосе. Расстояние миграции (Ре - 0,35, кусочек геля Мо 4), соответствующее ферментативной ак- тивности (0,2 единиць), коррелируется с активностью единственной окрашенной полось (500 нг). Никакой другой белковой полосьі и никакой ферментативной активности не обнаруживаеєется в какой-либо другой части геля.
Рис. 4. Сравнение продуктов расщепления по Кливленду двух форм оксалат-декарбоксилазь!. Пеп- тиднье карть создань! непосредственно в 4,5 96 слоистом геле из 15 95 разделяющего геля. Полипептидь! (10 мкг) пика А и пика В вьірезают из 11 96 НДС-полиакриламидного геля и гидролизуют в присутствий 100 мкг/мл протеазь УЗ (5. ашгеиз Сигма).
Пептидьі злектроблотируют на нитроцеллюлозную мембрану и иммунодетектируют антителами к оксалат- декарбоксилазе в разбавлений 1:5000. Вертикальньсе полось!: 1 - белок пика А и 2 - белок пика В.
Рис. 5. Дегликозилирование оксалат-декарббоксилазьі. Фермент (1 мкг) пика А обрабатьвают 1 мЕ (вертикальная полоса 3) и 10 мЕ (вертикальная полоса 4) Зндо Н (в течение 22 часов) и разделяют в 1195
НДО-ПАГЗ. Полось 1 и 2 содержат неподвергавшиеся обработке контрольнье образць! пика А. Полосой 5 (справа) представлень! маркерьї молекулярной массьії фирмь! фармация и полосой 5 (слева представлень предварительно окрашеннье вьісокомолекулярнье маркерьї фирмь! БРЛ.
Рис. 6. Иммунотитрование ферментативной активности. Фермент (1,5 мкг) в 0,02 М калийацетатном буфере (рН 4,5) инкубируют 2 часа при 2522 с различньми обьемами сьіворотки (1). Иммунокомплексь центрифугируют при 12000 х д и стандартньмми анализами определяют остаточную активность. Контроль- ное инкубирование проводят с предиммунной сьівороткой (Р1).
Риб. 7 (А) Слитье белки оксалат-декарбоксилаза-р-галактозидаза. ІРТО - индуцируемье макробляш- ки лизируют 1906 буфером Лазммли, разделяют на 1095 НАДСО-ПАГЗ, переносят на нитроцеллюлозу и зон- дируют антителами к оксалат-декарбоксилазе. Цифрь! над вертикальньми полосами соответствуют номе- рам клонов, буквой "С" указана контрольная вертикальная полоса с макробляшкой из нерекомбинантного продукта (В) Дифференцированная гибридизация РНК из иммуноположительньїх бляшек. Фаговую ДНК (500 нг), вніделенную из клонов, связьівают с мембраной Ген Скрин Плюс в дублях и гибридизируют с окса- лат-неиндуцированньїми (минус) и оксалат-индуцированньми (плюс) кКДНК зондами (2,5 х 109 срт/мг кКДНК.
Буква "С" относится к контрольной нерекомбинантной лямбда-оді 11 ДНК.
Рис.8. Трансляция іп міго. Продукть! трансляции транслируемой іп міго полной оли-(А") РНК из нейн- дуцированньх (0 ч, вертикальная полоса 1) и оксалат-индуцированньх (12 ч, вертикальная полоса 2) зта- пов иммуноосаждают и разделяют с помощью 1095 НДСО-ПАГЗ. Гель подвергают флюорографии и автора- диографии. Вертикальная полоса З показьіяваєт исчезновение линии в 55 кДа в случає присутствия очищен- ной оксалат-декарбоксилазь! в качестве конкурирующего за связьітвание с антителами вещества в ходе им- муноосаждения. (В) Трансляция с отбором гибрида, Поли(А") РНК (20 мкг/мл), вьіделенная из 12 ч оксалат- индуцированного С. МеїІшірез, гибридизируют с плазмидной ДНК (1,2 к.о. КДНК вставка в рт 7 18 У), связан- ной с мембраной Ген Скрин Плюс. РНК злюируют и транслируют в лизате ретикулоцитов кролика и продук- ть трансляции иммуноосаждают и разделяют с помощью 1095 НДО-ПАГЗ. Вертикальная полоса 1 - от- сутствие МРНК, полоса 2 - отобранная гибридизацией мРНК из вставки в 1,2 к.о., полоса З -12 ч полная по- ли (АУ) РНК и вертикальная полоса 4 - нерекомбинантнье векторнье последовательности. Указань! марке- рьї молекулярной массь.
Рис. 9. (А) Нозерн блотированиє, показьвающее 1,5 ко. МРНК для оксалат-декарбоксилазь! из
С.МеІшірез5 Поли(АУ) РНК (1 мкг) с неиндуцированного (0 ч) и оксалат-индуцированного (12 ч) зтапов дена- турируют глиоксалем, разделяют на 1,295 агарозном геле, блотируют на мембрану Ген Скрин Плюс и зон- дируют (о32Р)-меченной кКДНК (9 х 107 сріт/мг) на присутствиє оксалат-декарбоксилазьі. В качестве стан- дарта размера применяют леддер в 1 к.о. фирмь! БРЛ. (В) Саузерн блотирование геномной ДНК из с. меІшіре5. Геномную ДНК (4 мкг) гидролизуют в присутствий ферментов рестрикции, разделяют на 1,290 агарозном геле, переносят блотингом на мембрану Ген Скрин Плюс и гибридизируют с (032Р)-меченной
КДНК вставкой. В качестве стандартов молекулярного размера применялись лябда-НіпашШ/Есо К., и ри
С19НІпі 1 продукть! гидролиза.
Рис. 10. Регулирование зкспрессии гена оксалат-декарбоксилазьі. Показана полная РНК (10 мкг), вьіде- ленная из культур С. МеІшіре5 в различнье моменть! времени после добавления щавелевой кислоть. (А) Ок- рашенньй зтидийбромидом 1,295 агарозньїй гель, демонстрирующий сравнительное содержание денатуриро- ванной глиоксалем РНК. (В) Полная РНК, перенесенная на мембрану Ген Скрин Плюс и гибридизированная с оЗгРрР-меченной кДНК вставкой в 1,2 к.о. (С) Относительное количество поли (АХ РНК, кодирующей оксалат- декарбоксилазу (С) на оснований интегрирования площадей денситометрического следа в авторадиографии (В). Показана также удельная активность фермента, вьіделенного из той же культурь.
Подробное описание изобретения
Очищенная оксалат-декарбоксилаза настоящего изобретения, ее применение в качестве средства борьбь! с патогенезом и ее применение для трансформации растений суммарно дают способ борьбь с забо- леваниями растений, в которьіх решающую роль играєт щавелевая кислота, как в ходе патогенеза, так и на инвазивном зтапе. Настоящее изобретение особенно перспективно в связи с тем, что настоящим бедствием промьішленного виращивания важнейших сельскохозяйственньх растений, например, таких культур, как под- солнечник являются некоторьсе видь! грибков, таких как 5сіегоїіпіа, секретирующих щавелевую кислоту.
Преимущества настоящего изобретения могут бьіть использовань!ї либо трансформацией растений, ли- бо применением оксалат-декарбоксилазь! в качестве традиционного пестицида, найболеєе вероятно в сочета- нии с соответствующим агрономически приемлемьм носителем. Одно из важнейших преимуществ примене- ния оксалат-декарбоксилазь! в качестве пестицида заключается в ее зкологической чистоте, т.е. в отсутствий загрязнения окружающей средь и безвредности для растений.
В случаеє внешнего применения фермента для защить растения или его части от патогенов фермент может бьїіть разбавлен с образованием раствора или суспензии или может бьіть смешан с твердьім разба- вителем для использования в виде дуста. Конкретньій характер применения фермента частично будет оп- ределяться целевь!м патогеном-(ами) и растением-(ями). Подробнье методики подбора общих способов защить! характерньїх культурньїх растений и борьбь! с патогенами можно найти в изданий "Способь; вьіяв- ления пестицидов для борьбьї с патогенами растений", под ред. К.О. Ніскеу Американское фитопатологи- ческое Общество, 1986. Вспомогательнье вещества, которье могут бьіть добавлень в препарат, включают средства, способствующие солюбилизации, смачивающие средства и стабилизаторь! или средства, даю- щие микрокапсулированньй продукт. Такие вспомогательнье вещества хорошо известнь! специалистам.
Для внешней обработки могут бьіть также использованьії рекомбинантнье микроорганизмь!, как в жиз- неспособной форме, так и после превращения в нежизнеспособную форму с применением способа, не де- зактивирующего фермент.
Вьіделениєе чистой оксалат-декарбоксилазьї из С. МеІшіре5 описано в последующих примерах, также как и характеристика вьиіделенного фермента. При хроматофокусирований разделяют две формь! фермен- та. Два изозима, как показано, родственньії по аминокислотному составу, пептидному картированию и им-
мунологической перекрестной реакционной способности. Пик А, злюирующийся при рН 3,3, подвергнут до- полнительньім исследованиям: Кт, как найдено, равен 4,5 мМ и величина Мтах ровна 166 мкмоля/мин/мг.
Субьединичная молекулярная масса гликозилированного фермента 64 кДа в то время как масса деглико- зилированного белка равна 55 кДа. Фермент показьіваєт кислотное значение р1, очень стабилен в широ- ком интервале значений рН и умеренно термостабилен.
Ген, кодирующий происходящую из грибков оксалат-декарбоксилазу, имеет последовательность, соответствующую ПОСЛЕД. Мо 1, и его клонируют способом, описанньім в нижеследующих примерах. Если вкратце, то коюдирующую фермент кКДНК получают иммуноскринингом Хаї 11 зкспрессионной библиотеки.
Трансляция іп міго отобранной гибридизацией мРНК дает белок в 55 кДа. Геномная Саузерн гибридизация указьіваєт на кодирование оксалат-декарбоксилазьі единственньїм геном. кКДНК зонд гибридизируется толь- ко с теми видами мРНК, которье содержат 1,5 килопар оснований (к.о.). Показано, что мРНК индуцируется щавелевой кислотой. Наблюдаєтся временная связь между ферментативной активностью и содержанием
МРНК, указьвающая на то, что зкспрессия оксалат-декарбоксилазь! регулируется на транскрипционном уровне.
Ген со строением, соответствующим ПОСЛЕД. Ме 1, содержащей кодирующую последовательность зрелого фермента оксалат-декарбоксилазь!, может бьїть связан с генетическими регуляторньіми злемента- ми, необходимьми для зкспрессии структурального гена в определенной клетке-хозяине. К первому типу необходимого регуляторного злемента относится область генного промотора, содержащая ДНК последова- тельности, распознаваемьсе по биологическому механизму клеткой растения и индуцирующие транскрип- цию ДНК последовательности в матричную РНК (мРНК). Затем мРНК транслируется в белковьй продукт, кодируемьсй областью структурального гена. Промотор присоединяют впереди или у 5'-конца гена оксалат- декарбоксилазьї, что может бьіть осуществлено стандартньмми известньми специалистам методами. См. например, Мапіаїїз и др. (1982), "Молекулярное клонирование", Коулд Спринг Харбор Лаборатори, Нью-
Йорк, стр. 104-106.
Области промотора, которье могут бьіть использовань для зкспрессии гена оксалат-декарбоксилазь в клетках растения, включают промоторьї, проявляющие активность в широком спектре разнообразньх растительньїх тканей. К примеру, 355 промотор из мозаийчного вируса цветной капустьї может оказаться пригодньїм для зтой цели. К промоторам другого типа, которне могут бьіть использовань! в клетках расте- ния, относятся промоторьі, зкспрессирующие в более жестких условиях. Зтот класс включаєт промоторь, проявляющие активность только в определенной ткани-(ях) растения, и/или активность которьїх индуци- руется определенньмми стимулами, например, повреждением. Примером промотора зтого типа является регуляторная 5'-область из гена фенилаланин-аммиак-лиаза (РАС). Промоторь! данного типа обсуждаются в работе І іапд и др., (1989) РМАБ5 США, 86, 9284-9288. Зкспрессия гена оксалат-декарбоксилазь! в микроб- ньїх хозяевах может бьіть достигнута применением промоторов, получаємьх из микробиальньх источни- ков. Примерьї подобньїх промоторов включают ігр промотор для зкспрессии в бактериях, таких как Е. сої (пример применения зтого промотора даєтся в работе: Атапп и др. (1983) Сепе 25, 167-178) или глице- ральдегид-фосфат-дегидрогеназньїйй (САРО) промотор для зкспрессии в дрожжах (пример применения зто- го промотора дается в работе: Едепз и др. (1984) СеїІ, 37, 629-633). Последовательности генного промото- ра могут частично или полностью происходить из промоторньїх последовательностей, которье могут бьіть обнаружень! в клетках, отличньїх от клеток-хозяев, если только такие промоторь! отвечают вьішеуказанньім требованиям для транскрипции и трансляции.
Вторьмм генетическим регуляторньім злементом, присутствие которого возможно, но необязательно, присоединяемь!м к гену оксалат-декарбоксилазьі, является терминатор или последовательность полиаде- нилирования, зффективно промотирующий прекращение транскрипции гена, а в зукариотах, кроме того, промотирующий полиаденилирование, т.е. присоединение любого числа аденозиновьїх нуклеотидов к 3'- концу МРНК. Для присоединения области терминатора позади или 3'-конца гена используют стандартнье известнье специалистам методь! (Мапіаїі5 и др., стр. 104-106, см. вьіше). Примером такой последователь- ности терминатора полиаденилирования может служить последовательность из гена октопин-синтетазь из
Адгорасіегічт іШшптегїасіеп5 Ті плазмидь, о чем сообщают в работе: Юесгеме и др. (1982) І. Мої. Аррі. Сепеї 1, 499-511. Примером такого же терминатора для зкспрессии в микробиальном хозяйне является последова- тельность Упо-независимого терминатора транскрипции из ЗаІтопеїПа їуУрпітигшт, См., например, М.Е.
Му/іпКІег (1987) "ЕвсНегісніа соїї и ЗаІтопеїІа туУрпітипт, Клеточная и молекулярная биология", гл. ред. Е.С.
Меїапага:, Американское общество микробиологов. Геннье последовательности терминатора могут также частично или полностью происходить из последовательностей терминатора, которне можно обнаружить в клетках, отличньїх от клеток-хозяев, если только такие последовательности отвечают вьиішеприведенньм требованиям для превращения транскрипции и полиаденилирования, предьявляємь!м к клеткам хозяевам.
К еще одному типу регуляторного злемента, которьій может бьіть присоединен к гену оксалат-декар- боксилазьї, принадлежит ДНК последовательность, кодирующая сигнальньйй пептид. Сигнальньй пептид присоединяется к аминоокончанию белка и и осуществляет локализацию белка на клеточной стенке или его секретирование из клетки-хозяина. В ходе процесса локализации сигнальньй пептид отщепляется с об- разованием белкового продукта, имеющего последовательность зрелого белка. ДНК последовательность для сигнального пептида вставляется между промотором и областью кодирования. Для присоединения
ДНК последовательности сигнального пептида могут применяться стандартньєе, известнье специалистам методь (Мапіаїі5 и др., стр. 104-106, см. вьіше). Примерь! подобньїх сигнальньїх последовательностей вк- лючают сигнальньйй пептид из гена зкстенсина растений (Спеп и Магпег 1985, ЕМВО І, 4, 2145-2151), из бактериального ре!ІВ (пектат-лиаз) гена Егм/іпіа сагоїомога (І еїі и др. (1987) І. Васіегіо! 169, 4379) и из преп- рофактора дрожжей (Зтійй и др., 1985, бсієпсе, 229, 1219-1229). Последовательности сигнального пептида могут кроме того частично или полностью происходить из сигнальньїх последовательностей, обнаруживае- мьІх в клетках, отличньїх от клеток-хозяев, если только такие последовательности отвечают вьішеуказан- ньім требованиям к обработке и локализации белка в клетке-хозяине.
Для вставки гена оксалат-декарбоксилазьі в растение-хозяин используют любой из разнообразньх способов, применяемьїх для введения в растение чужеродного гена. Методика, виібранная для проведения трансформации растения геном оксалат-декарбоксилазьії, меняется в зависимости от растения-хозяина. В виде примера одной, хорошо разработанной методики, которая могла бьї оказаться полезной для транс- формации растения геном оксалат-декарбоксилазьї, можно указать осуществляемую через Адгорасіегйт трансформацию.
Осуществляемую через Адгорасіегішт трансформацию с применением гена оксалат-декарбоксилазь проводят по методикам, хорошо известнь!м для зтого способа. Вначале в штамм с перетрихальньми жгутика- ми Адгорасіегішт їшптеїасіеп5 в качестве промежуточного хозяина вводят генную кассету, пригодную для зксп- рессии в растениях. Генную кассету оксалат-декарбоксилазьь вводят в Т-ДНК область рекомбинантной плазмидьї, содержащей поддающийся отбору маркерньй ген, например, ген, коюдирующий неомицин-фосфот- рансферазу 11, фосфинотрицин-ацетилтрансферазу и т.п. Такие методьі! освещень в литературньх ссьлках, в том числе в работе: Ногзсп и др. (1985) Зсіепсе 227, 1229-1231. Кусочки растительной ткани, например: листьев, семядоли или гипокотиля совместно инкубируют 2-3 дня с бактериями, после чего бактерии уби- вают антибиотиком, например, карбенициллином. В культурную среду растительной ткани включень! допол- нительнье антибиотики, соответствующие применяемому поддающемуся отбору маркерному гену, позтому растут только трансформированньє клетки растения.
Вьросшие из трансформированньх клеток растения затем анализируют на присутствие и зкспрес- сию гена оксалат-декарбоксилазьі. Для идентификации отдельньїх трансформантов могут применяться им- муноанализь и анализь! на определение активности оксалат-декарбоксилазьі. Толерантность к зкзогенной щавелевой кислоте также может бьіть использована в качестве функционального теста на интактньсе клет-
Ки.
Как уже отмечалось, для трансформации растения помимо трансформации через Адгорасіейт имеются и некоторье другие методьі. Примерами таких других способов переноса ДНК является злектро- порация, т.е. индуцированная химически доставка в протопластьії, микроиньектирование, биолистирова- ние, а также и другие методьі. Примерами тех типов растений, которье не особенно склоннь! к трансфор- мации, осуществляемой через Адгобасіегіцт, представляют собой сою, а также некоторье зерновье, в том числе кукурузу. Указаннье растения только вьигрьівают от попьіток их трансформации другими методами, отличньїми от трансформации, осуществляемой через Адгорасіегт.
Некоторьсе аспекть! настоящего изобретения будут более подробно раскрьїть! в следующих неогра- ничивающих изобретение примерах.
Пример 1.
Очистка и характеристика оксалат-декарбоксилазь
Методика зксперимента
Микроорганизм и условия вьиращивания
С. МеІшіре5 (штамм 5 АТСС 13547) внииращивают на поверхности средьії, содержащей 595 декстрозь, 196 пептона, 0190 КНгРОх, 0,О059о Ма5ох х х 7Нго и 195 солодового зкстракта Дифко (рН 5,2). Микроорганизм виращивают при 252С из мицелиального инокулята в стационарньх культурах в обьеме средьі, составляющей одну пятую обьема сосудов для куль- тивирования. Через 25 дней после инокулирования добавлением в каждьй сосуд для культивирования 12,5
ММ щавелевой кислотьї индуцируют образование фермента оксалат-декарбоксилазьі. Спустя 2-3 дня пос- ле добавления щавелевой кислоть! мицелий собирают, мицелиальньйй слой промьівают холодной дистил- лированной водой и хранят при -2020. С. МеІшіре5 вьиідерживают на скошенном агаре той же средь! (Чакобру,
Мештоав' іп Епгутоіоду 5, 637 (1962)).
Очистка.
Стадия 1. Получение сьірого зкстракта. Замороженньй мицелий растирают 10 минут в смесителе Уо- ринга либо с сухим льдом, либо с жидким азотом. Порошок зкстрагируют 10 минут при 42С тремя обьема- ми калийцитратного буфера (рН 3) и суспензию центрифугируют 30 минут при 10000 х д и 42С. Надосадочную жидкость фильтруют че- рез двойной слой сьірного полотна.
Стадия 2. Осаждение ацетоном. Методика концентрирования ацетоном взята из работь!: 5пПітагопо и
Науаївпі (І. Віої. Спет. 227, 151 (1957)) за исключением того, что две последние стадии не проводились.
Указанньсе проценть! дань в об./06б. с учетом складьіваеємьх обьемов. (а) Низкую температуру (-102С) для осаждения ацетоном создают применением бани соли со льдом. Образец охлаждают до 09С и первое осаждение ацетоном проводят добавлением по каплям при постоянном перемешивании охлажденного 33,390 ацетона к надосадочной жидкости (Ацетон-Ї). Смесь приводят в равновесное состояние в течение минут и образовавшийся осадок удаляют центрифугированием в течение 20 минут при 22С в предвари- тельно охлажденном роторе при 10000 х 9. Осадок, полученньй из 33,33 - 5095 фракций, растворяют в од- ной пятой начального обьема холодного калийацетатного буфера (0,1 М, рН 4,5). Раствор фермента диа- лизуют 16 часов при 42С относительно двух перемен 0,02 М калийацетатного буфера (рН 4,5) и образо- вавшийся в ходе диализа небольшой осадок центрифугируют (Ацетон--|ІІ). (Б) Надосадочную жидкость переносят в 4095 ацетон (Ацетон-- (ІІ) и полученньїй осадок отбрасьвают. Осадок от дальнейшего добав- ления к 5095 ацетону (Ацетон-ІМ) растворяют в небольшом обьеме 0,02 М раствора ацетата калия (рн 4,5).
Стадия 3. Хроматофокусирование. ШО ЕАЕ-Сефарозу СІ -68 (фармация) уравновешивают в 0,02 М калийацетатного буфера (рн 4,5) и используют для заполнения колонки на 10 мл (слой 1 х 13 см). Получен- ньій при последнем осаждений ацетоном осадок пропускают со скоростью потока 10 мл/ч. Колонку промь!- вают двумя колоночньмми обьемами 0,02 М ацетата калия (рН 4,5) и злюирование осуществляют созда- нием внутреннего градиента рН с помощью 4 мМ кислотной буферной смеси (0 -аспартиновая кислота, І1- глутаминовая кислота и глицин, по 4 мМ каждой, рН 2,3). Злюирование проводят при скорости потока 10 мл/ч и отборе фракций по 2 мл; белки регистрируют по поглощению света при 280 нм; фракции анализи- руют на ферментативную активность и в каждой фракции определяют рН. Фракции, проявляющие фермен- тативную активность, обьеединяют, диализуют относительно водьі и концентрируют в микроконцентратора
Амикон (отсечка 30000). Хранят фермент при 496.
Ферментативньй анализ.
Активность оксалат-декарбоксилазьї определяют измерением вьіделившейся из /7С/-щавелевой кис- лоть! (Амерсхам, 4,1 мсі (ммоль) ""7СО». Ферментативньй анализ проводят в небольших стеклянньх про- бирках, создающих 1 мл следующей реакционной смеси: 0,2 М цитрата калия (рН 3), 0,005 М оксалата ка- лия (рН 3), 5,6 нмоля (0,0227 мкСі)/1б/-щавелевой кислоть и 0,2 мл раствора фермента. Перед добавле- нием фермента пробирки инкубируют 5 минут. Пробирки закрьівают резиновьми пробками и инкубируют 30 минут при 372С во встряхиваемой водяной бане. Реакцию прекращают иньектированием через резиновье пробки 0,2 мл 5095 (об./06.) трихлоруксусной кислоть! и пробирки встряхивают еще 60 минут с целью погло- щения вьіделившегося ""СО»5 в 0,2 мл метилбенззтоний гидроксида (Сигма), помещенного внутрь стеклян- ной пробирки в пластиковом сосуде. Пластиковье сосудики извлекают и их содержимое переносят в 5 мл сцинтилляционной жидкости на основе толуола и в жидкостном сцинтилляционном счетчике определяют радисактивность. В холостье пробирки перед добавлением фермента либо добавляют 0,2 мл ТХУК (50965), либо фермент вообще не добавляют. В кинетических опьітах величинь! корректируют по радиоактивности, полученной для термически денатурированного фермента.
Определение единиць активности.
Однако единица активности определяеєтся, как количество фермента, вьіделившего 1 мкмоль "7СО» в минуту при 372С в стандартньїх условиях анализа. Общая зффективность анализа обьічно находится в ин- тервале 60-7095. Белок определяют микроаналитическим методом Гомгу (Реїегзоп, Апа! Віоспет 83, 346 (1977)). Значения Мтах и К определяют построением кривой Лайнуивера-Бурка (Гіпеу"еамег и Вик, І. Ат.
Спет. бос. 56, 658-666 (1934)).
Определение молекулярной массь.
Молекулярную массу оксалат-декарбоксилазьї определяют гель-фильтрационной хроматографией.
Очищенньій фермент (100 мкг в 100 мл) пропускают при комнатной температуре через ЕРІ С колонку для гель-проникающей хроматографии (Супероза 12, 10 х 300 нм) при скорости потока 0,5 мл/мин и примене- нием 0,02 М калийацетатного буфера, 0,1 М КСІ (рН 4,5). Применяют следующие стандартнье белки: триоглобулин (660 кДа, Фармация), ферритин (440 кДа, Фармация), каталазу (230 кДа, Фармация), альдо- лазу (158 кДа, Фармация), алкоголь дегидрогеназу (150 кДа, Сигма) и карбоновую ангидразу (29 кДа, Сиг- ма). Состав субьединицьї определяют злектрофорезом на пластинках полиакриламидного геля с додецил- сульфатом натрия и применением буферной системь! Лазммли (І аеттії, Маїиге 227, 680 (1970)).
Оценка чистоть!.
Однородность очищенной оксалат-декарбоксилазьї определяют разделением 10 мкг белка (пик А) злектрофорезом на двумерном геле по методике О'Раїтеї|, І. Віої. Спет 250, 4007 (1975)).
Аминокислотньй состав.
Образцьї гидролизуют 6 М НОЇ в течение 22 часов при 1102 в звакуированньх и запаянньх пробир- ках. Продуктьї гидролиза анализируют на аминокислотном анализаторе (ЛКБ 4151, Альфа Плюс). Цистеин и цистин определяют в виде цистеийновой кислоть! после окисления надмуравьиной кислотой. Триптофан не определялся. Гидролиз МВ протеазой осуществляют по известной методике (Сіемейапа, Меїпоадз іп
Епгутої 96, 222 (1983)).
Углеводньй анализ.
Окрашивание гликопротеинов осуществляют применением реактива периодат-Шиффово основание.
Содержание природного сахара определяют фенол-сернокислотньїм методом (Меке|му и др., Агоп. Віоспет
Віорпуз 132, 99 (1969)) с глюкозой в качестве стандарта. Фермент дегликозилируют зндо-р. Мм-ацетилглюко- заминидазой Н из 5. ріїсаїше (Бозрингер Маннхейм, 40 мЕ/мкг) по методике Тримбля (Тгітбіе и др., Апаї.
Віоспет 141, 515 (1984)).
Приготовление антисьіворотки.
Оксалат-декарбоксилазу (1 мг/мл) денатурируют кипячением 10 минут в ФБС в присутствий 0,595
НДС. Белковиьй антиген (150 мкг) в ФБС змульгируют с полньім адьювантом Фройнда и иньектируют под- кожно Ново-Зеландскому белому кролику. Последующие бустернье иньекции делают в неполном адью- ванте Фройнда подкожно спустя три недели. Четвертую иньекцию делают внутривенно. Титр антитела оп- ределяют иммунодиффузией методом Оустерлоуни (Сагмеу и др. 1977), Методьі Иммунол.", 3-тье изд. В.А.
Бенджамин Инк., Н.-Й.). Аффинную очистку антитела проводят по методике (Імакі и др., Сеї! 57, 71 (1989).
Вестерн блоттинг и иммунодетектирование.
Белки переносят на нитроцеллюлозную мембрану (Шлейхер знд Шузлл), через которую 3 часа при 1592 пропускают постоянньй ток в 150 мА по методике Тоубина (Том/бріп и др., Ргос. Маї). Асад. сі США, 76, 4350 (1979)). Иммунодетектирование проводят с использованием антител к оксалат-декарбоксилазе в раз- бавлений 1:5000 и детектированием реакцией с щелочной фосфатазой (Амерсхам, Супер-скрин система им- муноскрининга).
Результать!.
Максимальную активность оксалат-декарбоксилазь! получают спустя 2 или 3 дня после добавления щавелевой кислотьї. Результать! типичной методики очистки приведень! в таблице 1. На хроматофокуси- рующей колонке фермент разделен на два пика: пик А, злюирующийся при рн 3,3, и пик В, злюирующийся при рН 2,5 (рис. 1). Пик А очищен 1670-тикратно с вьходом 2,995, а пик В, злюирующийся совместно с дву- мя незначительньми примесями, очищен 614-тикратно с вніходом 1595 (таблица 1). Примеси могут бьіть удаленьї пропусканием через колонку Сафарозьії 4В для гель-фильтрующей хроматографии, и полученньй белок использован для определения аминокислотного состава. Вследствиє вьісокой чистоть! пика А соот- ветствующий ему белок используют для последующей работьі. Соответствующий пику А продукт злюй- руется единственньїм пиком на колонке Суперозь 12 для бьістрого определения белков жидкостной хрома- тографией и 10 мкг белка дают единственное пятно при злектрофорезе на двумерном геле (рис. 28). Пос- ледовательнье двухкратнье разбавления фермента показьівают, что, по меньшей мере, 45 мг белка могут бьіть обнаруженьї окрашиванием Кумасси голубь!/м (рис. 4А). Расстояние миграции ферментативной актив- ности (Р: - 0,35, кусочек геля 4) коррелируется с присутствием единственной окрашенной полось на недена- турированном ПАГЗ (рис. 3). Никаких белковьїх полос и никакой ферментативной активности не обнаружено в каких-либо других частях геля. Таким образом, соответствующая пику А белковая полоса характеризуется ак- тивностью оксалат-декарбоксилазьі. Препарать! фермента стабильнь! при 4 или -202С. При хранений при 4С в концентрации 1 мг/мл в 0,02 М ацетате калия через 4 месяца определяют » 70 95 первоначальной активнос- ти.
Даннье аминокислотного состава для двух пиков указьівают на присутствие в очень больших коли- чествах (2295) кисльїх аминокислотньїх остатков (таблица 2). Зтим могут обьясняться очень низкие величи- ньі рі для них, хотя количество амидированньїх фрагментов в нативном белке не определялось. Двум пи- кам соответствует очень близкий аминокислотньй состав, за исключением в два раза более вьсокого со- держания метионина и тирозина для пика В и в два раза болеє вьісокого содержания цистеийновой кислоть для пика А. На сходство дополнительно указьівают пептидньсе картьї, полученнье для двух пиков примене- нием МУ8 протеазьі из іарпуіососсив' ацйгев (рис. 4). Аффинно очищенньсе антитела, направленнье против белка пика А, перекрестно реагировали с белком пика В. Аминокислотньїйй состав, пептидньсе карть! и им- мунологическая перекрестная реакционноспособность все зто указьіваєт на то, что два пика, разделеннье хроматофокусированием, родственньїм друг другу. Две формь! с различньіми значениями р1 могли возник- нуть в результате различной степени амидирования или различного содержания кислотньїх аминокислот, или вследствие микрогетерогенности в составе олигосахаридньх цепей.
Молекулярная масса нативного фермента, определенная гель-фильтрацией, равна 560 кДа. Злект- рофорез на 7-1595 градиенте НДС-полиакриламидного геля показал присутствие единственного пептида в 64 кДа (рис. 2А). Именно такой молекулярньй размер устойчиво получался со всеми различньіми процен- тами применяемого геля и буферной системь! Лазммли. При обработке фермента зндо-рД, М-ацетилглюко- заминидазой Н размер основной полосьі дегликозилированного продукта составляєт 55 кДа (рис. 5). Най- дено, что фермент гликозилирован, а вьісокий кажущийся молекулярньй размер, полученньй гель-фильт- рацией, может бьіть связан с тенденцией определенньїх гликопротеинов нековалентно взаймодействовать в растворе (Рагасп-Сагзоп и др., Віотесппідчнез 7, 482 (1989)); Ківїптап и др., Віоспетівігу 25, 312 (1986)).
На оснований кривьїх Лайиуивера-Бурка рассчитана кажущаяся величина Кл, равная 4,5 мМ в случає оксалата калия в качестве субстрата. Зто даєт Мтах 166 мкмоль/-мин/мг. Фермент конкурентно ингибирует- ся фосфат-ионами, и при добавлений в реакционную смесь 90 мм Роз: для Кі получено значениє в 9 мМ.
Фермент отличается специфичностью к оксалату в качестве субстрата, но лимонная кислота, уксусная кис- лота, оксальуксусная кислота, янтарная кислота и муравьиная кислота в качестве субстратов не использо- вались.
Фермент не дезактивируется в широком интервале значений рн, и оптимальное значение рН для де- карбоксилирования равно 3. После нагревания 20 минут при 802С фермент сохраняет 7895 начальной ак- тивности. Почти полная дезактивация происходит после нагревания 10 минут при 9620. На активность фер- мента не влияют реагенть! сульфгидрильной группой: так фермент сохраняет 9595 своей активности в при- сутствии 50 мМ п-хлорртутьбензолсульфокислоть! или 50 мМ йодацетата. Оксалат-декарбоксилаза сохра- няет 4595 своей активности после вьідерживания с 1095 НДС 30 минут при комнатной температуре. Однако при нагреваний до 602С с 1095 НДС почти вся активность исчезаєет. На гликопротеиновую природу белка указьівает положительное окрашивание реактивом периодат-Шиффово основание. Фермент связьіваєтся с конканвалин-А-Сефарозой и злюируется о-метилманнозидом. Фенол-сернокислотньмм методом установ- лено, что содержание нейтральньх сахаров составляєт 1590.
Иммунотитрование фермента 8 мкл сьірой антисьіворотки к оксалат-декарбоксилазе снизило началь- ную активность надосадочной жидкости на » 6095 (рис. 6). Антисьіворотка к оксалат-декарбоксилазе в раз- бавлений 1:5000 позволяет обнаружить минимум 1 нг белка пика А. Антисьіворотка перекрестно реагируеєт со всеми пептидами, полученньіми в результате гидролиза протеазой УЗ (рис. 4), и с дегликозилированнь- ми формами пиков А и В фермента. Антисьіворотка, подвергнутая аффинной очистке и созданная против белка пика А, перекрестно реагировала с оксалат-декарбоксилазой пика В и оксами-СоА-декарбоксилазой из Охаїорасіег Тгптідепе5, штамм ОХВ. Антисьмворотка не реагирует с оксалат-оксидазой из Ногадет
МиїЇдаге (ячмень).
Пример 2.
Молекулярное клонирование и зкспрессия ДНК, кодирующей оксалат-декарбоксилазу.
Методика зксперимента.
Молекулярное клонирование.
Полная РНК извлечена из порошка С. МеІшіре5 полученного растиранием в жидком азоте, по методи- ке Спотслгупвкі и Засспі (Апа!. Віоспет. 162, 156 (1987) и поли (А") РНК отобрана в процессе двух циклов хроматографии на олиго- (ж, Т-дцеллюлозе). Синтез КДНК, клонирование и иммуноскрининг библиотеки осуществлень! согласно инст- рукциям фирмьі! Амерсхам. кКДНК синтезирована из мРНК-культурьі, индуцируемой 12 ч оксалатом, путем олиго(ат) праймирования 5 мкг поли (А") РНК и клонирована в ЕсоР1 сайт рестрикции лямбда-ди 1. Для иммуноскрининга упакованнье фаги вьиращивают в Е. Соїї МІО90 г в качестве хозяина. Антитела к оксалат- декарбоксилазе для удаления фоновой реакционноспособности предварительно адсорбируют 1 мг/мл кле- точного лизата Е. Соїї МІО90, после чего используют в иммуноскрининге. Для обнаружения положительньх клонов применяют коньюгат козьего антикроличьего 1 до с щелочной фосфатазой. ДНК получена из имму- ноположительньїх фагов по методике Оеї! Заї (Віоїесппідцев 7, 514 (1989)), в которьїх бьіл определен раз- мер вставок. Слитье белки охарактеризовань! по методике (Апа! Віоспет 156, 354 (1986)); связь между вс- тавками исследована применением одной из вставок в качестве зонда. Вставки в 1,2 к.о. из клона номер З субклонирована в рТ218 (ЮСБ) и использована в других зкспериментах в качестве зонда.
Дифференцированная гибридизация.
Дифференцированная гибридизация иммуноположительньїх клонов изучена путем получения одноце- почечньїх КДНК зондов, синтезированньх из мРНК, вьіделенной из мицелия, индуцированного оксалатом 0 и 12 часов. Рекомбинантную фаговую ДНК (0,5 мкг) связьявают с мембраной Ген Скрин Плюс в дубликатном
Найбрислот ""фильтрующем устройстве согласно инструкции, содержащейся в руководстве фирмь! Ген Ск- рин Плюс, и гибридизируют с кКДНК зондами, индуцированньіми и неиндуцированньіми оксалатом. Удельная активность зонда составляеєт 2 х 109 срт/мкг кКДНК.
Гибридизация.
Гибридизацию ДНК и РНК блотов проводят при 4222 формамидньм методом, указанньім в руко- водстве фирмь! Ген Скрин Плюс. Предварительную гибридизацию в течение примерно суток осуществляют в 5095 деионизированном формамиде, 195 НДС, 1 М хлориде натрия, 1095 сульфата декстрана. Блоть гиб- ридизируют с денатурированньм зондом (1-4 х 105 ор/мл) 24 часа при 402С. Мембрань! последовательно промьівают по 2 промьівки каждьім: 2Х55502 при комнатной температуре, 2Х552 плюс 195 НДС при 6520 30 минут, 0,ІХ.55С при комнатной температуре 30 минут. В настоящем случає для интенсификации скрининга увлажненнье мембраньї в пластиковьїх упаковках подвергают воздействию пленок Кодак ХАР.
Приготовление зонда.
Субклонированную в рТт218)у ДНК гидролизуют в присутствии ЕсоК1 и разделяют на 295 низкоплав- ком агарозном геле. Вставку ДНК обрезают и метят (0-2Р)дАТФ методом хаотичного мечения праймера (Теіпрего, Моде!5іеїп, Апа! Віоспет, 137, 226 (1984)).
Вьіделение геномной ДНК и Саузерн анализ.
Геномная ДНК вьіїделена из лиофилизованньх С. МеіІшіре5 по методике 20іап и РиККіїа (Мої. Сеї!. Віо! б, 195 (1986)). ДНК дваждь расслоена на Сесі градиенте с целью получения ДНК, способной гидролизо- ваться ферментом рестрикции. Четьіре микрограмма геномной ДНК гидролизуют различньіми зндонуклеа- зами и разделяют на 1,295 агарозном геле. ДНК переносят на мембрану Ген Скрин Плюс по методике ще- лочного блоттинга (Кеей, Мапп, Мисіеїс Асід5 Кез 13, 7207 (1985)).
Трансляция іп місто.
Поли (Ах) РНК транслируют применением лизата ретикулоцитов кролика согласно инструкциям изго- товителя (Промега). Транслированнье белки осаждают особой антисьівороткой и анализируют злектрофо- резом на НДС-полиакриламидном геле.
Гибридньй отбор.
Гибридньій отбор мРНК оксалат-декарбоксилазьї осуществляют гибридизацией в течение 4 часов при
БОС поли (А") РНК (20 мкг в 200 мкл 6595 формамида, 10 мМ РІРЕЗ (рН 6,4), 0,4 М масі, 8 мм ЗДТА, 0,5 95
НДС, 100 мкг/мл тРНК дрожжей) с мембраной Ген Скрин Плюс, с которой связана денатурированная кДНК (4 мкг). Фильтрь! подготавливают согласно руководству фирмь! Ген Скрин Плюс, а гибридизацию, промьівку и злюирование гибридизованной РНК осуществляют по следующим методикам: дади5, МеїШтоаз іп Епгутої! 152, 567 (1987)); Рагпез и др., Ргос. Маї). Асай 5сі США 78, 2253 (1981). Злюирование РНК зкстрагируют смесью фе- нол-хлороформ (1:1), осаждают в зтаноле, переводят непосредственно в смесь для трансляции іп міго и имму- ноосаждают по методике Апаегзоп и Віобеї (Мейподз іп Епгуто/оду 96, 111 (1983)).
Нозерн блот анализ.
Один мкг (поли(А") РНК или 10 мкг полной РНК денатурируют глиоксалем и разделяют на 1,295 агароз- ном геле по методике Самбрука (Затбгоок и др., (1989) "Молекулярное клонирование. Лабораторное руко- водство", Коулд Спринг Харбор Лаборатори, Коулд Спринг Харбор, Н.-Й.), после чего капиллярно блотируют на мембране Ген Скрин Плюс согласно инструкциям, приведенньім в руководстве фирмь! Ген Скрин Плюс.
Фильтрь! зондируют З2Р-меченной вставкой кДНК в 1,2 к.о.
Результать!.
Как отмечалось вьіше, кКДНК зкспрессионная библиотека сконструирована из мРНК, индуцированной 12 ч оксалатом, в Х4ї 11. Примерно 47000 рекомбинантов подвергнуто скринигу антителами, предвари- тельно обработанньїми лизатом Е. соїї. Получено и очищено пятнадцать иммуноположительньх бляшек, из них 12 перекрестно гибридизированьі. Зти кодированнье слитье белки имеют размерь, сравнимье с раз- мерами вставки (рис. 7А). Фаговая ДНК из иммуноположительньїх клонов иммобилизована на мембране
Ген Скрин Плюс в дублях и зондирована индуцированньїми и нейндуцированньіми оксалатом ДНК зондами.
Дифференцированная гибридизация 15 иммуноположительньїх клонов показала, что 12 из них гибридизи-
руются с КДНК зондом из оксалата плюс мРНК и не дают никакого сигнала с оксалатом минус мРНК (рис. 78). Таким образом, зкспрессия 12 клонов индуцируется оксалатом. рт218у субклон вставки в 1,2 к.о. из У, клона З использован для отбора гибридизацией мРНК. Транс- ляция іп міго отобранной гибридизацией РНК и иммуноосаждение продукта трансляции дает линию для кДа (рис. 8В, вертикальная полоса 2), что совпадает с размером продукта, полученного с полной по- ли(Ах) РНК (полоса 3), и соответствует размеру дегликозилированного белка. Белок в 55 кДа не бьл по- лучен в отсутствие мРНК (рис. 88, вертикальная полоса 1) или применением нерекомбинантньїх вектор- ньїх последовательностей (полоса 4). Продукт в 55 кДа получен с 12 ч индуцируемой мРНК (рис. 8А, по- лоса 2), но не в случає нейндуцируемой (0 ч) мРНК (полоса 1). Показано, что 55 кДа линия относится к оксалат-декарбоксилазе, поскольку очищенная оксалат-декарбоксилаза конкурирует за области связьва- ния антигена и вьізьшвает снижение интенсивности 55 кДа линии (вертикальная полоса 3) в опьтах с трансляцией іп міго и иммуноосаждением.
Геномньій Саузерн блоттинг с применением в качестве зонда вставки в 2,2 к.о. показал при- сутствие единственной линии для продуктов гидролиза зндонуклеазами Ватні, Есо К1, Ніпа1!11, Руш11, з5р1, Хра!1 и хпої1, что указьівает на наличие единственной копии гена (рис. 98). Две линии разной интен- сивности, полученнье применением Крп и Рз, вьізвань! наличием внутренних сайтов (каждому фермен- ту свой единственньй сайт) в 1,2 к.о. КДНК вставке для зтих ферментов. Можно видеть (полось на рис. 9А), что зонд в 1,2 к.о. гибридизируется с единственньіми видами мРНК в 1,5 к.о. из индуцированной 12 ч окса- латом поли(А") РНК, в то же время при отсутствии индуцирования гибридизация не происходит.
Из той же партии культур с различньїх зтапов после индуцирования отобрань образць, которье ана- лизируют на содержание РНК, ферментативную активность и на полньій белок. Нозерн блоттинг полной
РНК показал, что линия для 1,5 к.о. отсутствует в 0 ч и достигаєт пика в 12 ч. Через З дня после индуциро- вания обнаружить РНК не удается (рис. 108). Ферментативную активность можно обнаружить через 12 ч после добавления оксалата, пик активности наблюдается во 2-ой день, после чего происходит устойчивое снижение активности. Какой-либо связи с увеличением или снижением полного белка не наблюдаєется (рис. 10С). Таким образом, наблюдаєтся временная зависимость между появлением ферментативной активнос- ти и содержанием мРНК, поскольку уровень мРНК достигаєт пика через 12 ч после индуцирования, а мак- симальная ферментативная активность наблюдаєтся через 48 ч после добавления щавелевой кислоть.
Пример 3.
Клонирование оксалат-декарбоксилазь!.
Для присоединения ДНК, кодирующей транзитньй пепти, к гену оксалат-декарбоксилазьі из РОХО1 применена ПЦР (полимеразно-цепная реакция). Вьібранньїм транзитньім пептидом служит ген зкстенси- на из Місоїапа ріштвра-5ісіоїЇйа. Целиковьй транзитньй пептид плюс две аминокислоть! зрелого белка зкстенсина подвергают слияния в восходящем направлений от АТС декарбоксилазь. В ПЦР 5'-олиго- нуклеотидом служит ЕХТОХО-5; 5-СААСАССАТАССАТССАТТТОТ ТТ СААдаИ "АтТа СА АДА АТО ОСТ ТС СТА
Ватні! "Меї Су Гуз
Меї Аа 5ег І єи «- некодирующая ДНК -»
ТТ ассСАСА ТТ ТТА ата СТ ТА атТа ТСА СТТ АОС ТТА аСТ/ТСТ
Рпє Аа Тнг Рне І єм Маї Маї І еи Маї Зег Г еи 5ег І єи Аа Зег
СІАА (АТО ТТС ААС ААС ТТО САА) сти |Меї Рне Тр Тгр Ре Сіп
І-Ї Перекрьівание с началом гена оксалат-декарбоксилазь х Начало трансляции у начала транзитного пептида / Сайт процессинга в трансляционном продукте
В ПЦР 3-олигонуклеотидом служит ЕХТОХО-3, предусмотренньій относительно последовательности в положениях 210-190 в исходной рОоХО1 последовательности (в нисходящем направлений от Крп1 сайта): 5в-таашаТСсАСТОСТСТСАТТ-3".
Применением указанньїх праймеров в ПЦР с применением в качестве матриць! плазмидной ДНК рохХО1 получень только смазаннье продукть!.
Для получения продуктов полной длиньі зти первичнье продукть! подвергнуть! повторной ампли- фикации с оприменением отого же 37 но нового 5-праймера, а именно ЕХТОХНК-6, (5-
СААДОАСОСАТАСОСАТССАТТТО-3), представляющего отдаленную 5'-последовательность виішеприведенного ЕХТОХО--5.
После второго круга ПЦР появляется линия для ожидаемого размера молекуль (прим. 290 п.о.). Ее вьіделяют, гидролизуют в присутствий Ватн1і-Крп1 и клонируют в рОХО1 в пределах бьівшего пребьіва- ния Ватн1-Крп1 фрагмента (125 п.о.). В общей сложности вдоль вставки секвенируют семнадцать клонов, содержащих более крупньіїй фрагмент.
Для одного клона подтверждено содержание необходимой последовательности в пределах ВатнН1--
Крп1 вставки. Комплекс транзитньій пептид-ген оксалат-декарбоксилазьі удаляют из зтого клона в виде
Ватн1і-Есок1 фрагмента, в котором полимеразой Кленова создают тупье конць, после чего вставляют в зЗтаї сайт плазмидь рік, кі.
Рекомбинанть! идентифицировань! гибридизацией и их строение подтверждено/ориентировано диаг- ностическим гидролизом (Ніпа111-ЄЕсомк1, Крп1, Ніпо111 и Р5И). Клон, содержащий ОХ-О кассету в той же ориентации, что и пр11 кассета, назван рек21-ОХ-0О кассете, вставленной в Зтаї сайт.
На рис. 11 показана нуклеотидная последовательность 1402 п.о. КДНК вставки в рРОХО!1.
Рис. 12 иллюстрирует конструирование плазмидьі рекг1.
Пример 4.
Трансформация табака применением вьішеописанньх векторов. (а) Перенос векторов в Адгорасіегійт
Конструкть! введень! в А. Шштетгасіепо І ВА4404 прямой трансформацией по опубликованньїм методи- кам.
Для проверки отсутствия рекомбинации в ходе переноса вектора в Адгорасіегічт рестрикционньім гидролизом и Саузерн блоттингом установлено присутствиє и целостность конструктов. (о) Трансформация дисков из табачньх листьев.
Листья табака (М. їарасит), сорт Самсун) в виде дисков трансформируют по хорошо разработанньім ранее опубликованньім методикам. Содержащие конструктьї идентифицированьії методом ПЦР и отобрань для последующего анализа.
Пример 5.
Определение в трансгенньїх растениях активности оксалат-декарбоксилазь!.
Ферментативную активность определяют анализом любого из двух продуктов распада, образующих- ся при декарбоксилированиий оксалата (диоксид углерода и формат). Вьіделение 7"СО»2 из 11б-щавелевой кислотьї определяют по сле-дующей методике (Мепйіа и райца, 1991). Содержащие реак- ционную смесь (см. ниже) стекляннье пробирки перед добавлением зкстракта/фермента вьідерживают пять минут. Пробирки герметизируют и вьідерживают 30 минут при 372С во встряхиваемой водяной бане.
Реакцию прекращают иньектированием 0,2 мл 5095 (об./о6.) трихлоруксусной кислоть (через пробку). Про- бирки встряхивают с метилбензотоний гидроксидом (0,2 мл), содержащемся в пластиковом сосудике, поме- щенном внутри стеклянной пробирки. Пластиковье сосудики извлекают, их содержимое переносят в 5 мл сцинтилляционную жидкость и жидкостньім сцинтилляционньім счетчиком определяют радисактивность.
Реакционная смесь 0,2 М нитрат калия, рН З 0,005 М оксалат калия, рН З 5,6 нмоля (0,027 мкС)/"С/-щавелевой кислоть
Образование формата определяют по методике Мадго и др. (1988), видоизмененной с учетом разли- чий в биохимических свойствах оксалат-декарбоксилазьі, вьіделенной из СоПуріа МеІшіре5, а не из зеїіегоїїпіа. Применяют двухотапную методику. Вначале готовят реакционную смесь, содержащую 20 мкл 40
МКМ щавелевую кислоту (добавлением гидроксида калия рН доводят до 3,5), 15 мМ о-фенилендиамина и 0,1 М альбумина бьічьей сьіворотки в цитратном буфере (0,2 М). Добавляют зкстракт/фермент (конечньй обьем 0,5 мл) и реакционную смесь вьідерживают 20 минут при 2520. Декарбоксилирование прекращают добавлением К»НРО»х (до конечного значения рН 7,5). Добавляют и смешивают половину обьема 45 мМ ли- тиевой соли никотинамидадениндинуклеотида (НАД). Через З минуть! добавляют 15 мкл формат-дегидро- геназьі (ФДГ, 80 Е/мл). Концентрацию образовавшегося формата устанавливают определением повьіше- ния поглощения при 340 нм реакционной смеси до и спустя 20 минут после добавления ФДГ. Для каждого зкстракта проводят контрольньій анализ без щавелевой кислоть! и затем рассчитьвают активность в пе- ресчете на белок.
Пример 6.
Олигонуклеотидь! для ПЦР и саузерн анализа.
Для диагностических ПЦР, подтверждающих присутствие гена оксалат-декарбоксилазь! в регенери- рованньх ростках, из генной последовательности вьібран олигонуклеотид (олиго) ОЕС1. В сочетаниий с 355 олигонуклеотидом (43) зтот олиго дает диагностическую линию, соответствующую прим. 280 п.о. Указан- нье олигонуклеотидьі используют для подтверждения трансгенного статуса укоренившихся ростков.
Две других олигонуклеотидньїх последовательности (ОЕС2 и ОЕСЗ) применяют для создания 5'-окса- лат-декарбоксилазу зондирующего фрагмента в примере 450 п.о., предназначенного для применения в
Саузерн анализе трансгенньх растений и их потомства.
Олиго ОЕСІ1 - 5 в кодирующей оксалат-декарбоксилазу последовательности, предназначен для при- менения вместе с олигонуклеотидом в диагностической ПЦР. 5-ада Ада пАТ САС ат пада САС; Са та - 3"
Олигонуклеотидь! ОЕС2 и ОЕСІ1 - посреди и 3" в области кодирования оксалат-декарбоксилазу, при- меняют совместно для создания зондов для Саузерн анализа.
ОЕС2: 5- ССА ТА СОА СОоСсії ТАС АТТ СТ ОСТ САС - 3
ОЕСЗ: 5- ТО досі ААС АТА ДОС ЗАТ АТО АСС АСС - 3"
Таблица 1
Результать! типичной методики очистки? (мг) активность активность очистки (единиц (единицьїі/мг) активности) 1. Сьірой зкстракт 4480 950 0,21 1 100 2. Ацетон ІІ 120 6о8 5,06 24 64 3. Ацетон ЇМ 3,8 260 68,8 328 27,3 4. Хроматофокусирование а. ПикА 0,08 28 350 1670 2,9 о. Пик В 1,24 160 129 614 16,8 аЙспользовано 150 г растертого в жидком азоте порошка.
Таблица 2
Аминокислотньй состав 11110101 пяквя01110
Авх 10,57 10,31
СІх 11,75 11,52 ув 32 2,96
Ага 2,84 2,89
Ні 2,66 2,74 спу 8,44 9,44 зег 7,23 7,19
ТНг 8,56 8,48
Сув- 0,66 0,28
Туг 0,84 1,85
Аа 11,03 10,92 чаї 6,31 6,52
Ї ен 7,719 7,19
Те 4,00 3,86
Рго 8,64 8,46
Ріе 5,13 4,68
Меї 0,34 0,69
Тір но? но
Аммиак що) що) аМольньсе проценть. оНе определялся. сОпределен в виде цистеийновой кислоть.
0.26 А в 0.25 0.22 в 0.20-4 о . и 0.18 0.16 5
Ф 3 е ш 0.15 Е 1 0.12 9 9 -6о0.10 28 х ; 5 й оо «ч 7 " А . х 5 т 9 ЕЕ а 0.06 По й 4 0.02 ої і 1 1 Г 0.02 0 ув ї опор ніш 2-6 Зала вія яю щію 005 080001200160020.24 28 32 36 40
Номер фракции
Фиг. 1 5 1 2 3 /й 5 6.7 8 9 кОа І І І | |! І І 1 | І баню 97- шо ще 66 - рми ще ше 5 зв - а - 29 - іні !
Фиг. 2А
Нн" (о) кОа --- - | 56 я 3-45 е/-36 а|- 29 в-24 -20
Фиг. 2Б 0.1 0.0 8 0.06 Й щ - ї - ч 2. 0.05
Фо х - (Ж. ї а и. - 9 0.02 р ш -
Є
«4 1 56 8 10 12
Номер среза геля
Фиг. З 1 2 - в:
Ж 13
Шк «-ь «а а «- «я»
Фиг. 4 12 З і 5 кба кра 97 -|- -1-95 б -| ав св» - 1, | - 57 ьз -| «в - з 29 -| «ав 30
Фиг. 5
РІ
100 5 во - 80 !
КОХ
. 70
Е
Гу ее 60 т о. ре,
У 50 ев) : г) 2 в 30 - (я ч 20 0 2 й 6 8 1012 14 16
Неочищенная сьіворотка (м1) --сжл»-
Фиг. 6 1.23 4 6 7 8 910 17 12 13151516 С
І 1 | І І 1 |! ' І "и - кОа
Й ! їх -200- ' 2 р І аг Ш 2.80 жав с . як -т- гі -11 6 Що що і -97 - -68 - що 2
Й ь» - 635 І
Фиг. 7А
1.2.3 4 6 7 8 9 10111213 1415 16 С
І Н І І |! |! І! ' І | | |! ПИ ' І
Іо! 2 о ' о х звивини фіїде й 0.
Фиг. 76 1 2 3
Ка 94 - 67- 03- 30-
Фиг. 8А 1 2 3 5
КОа -94 -687 -53 -30
Фиг. 8Б
Ов 12
Кь в.0-417 4.0- 3.0---- 2.0 - 1.6 - 1. 0- 0. 5-
Фиг. 9А
Чась! 901224 4872 96 120 п ши ши ши и кь ДИНИ іш .: пе ' е ї ех. р 5.1 -2 й А и 54 -Оориркце пром : Є ра з чу, КК 2.0 -42 Я 1.6 --5 В Як ви й » В г : 7. Б й од; х УНН
Ши " Ще ж и, .
Ай,
У ТЕН
Фиг. 10А пдв. - -
Е бор сова о чо чт. а ш» час ошптг жа атжж
Ц І 1 І ' ІН М І
Кь ч - - 21,20 - |- 5.15 - -- 1. 4,96 - че» -5.20 їн -2.01 -1.90 -158 -1.37 - - - 09й - 0.52 - 0.39 -0.21
Фиг. 9Б
Часьї 12096 72 5825 120
І І І І 1 / 1 - "Фе
Фиг. 10Б т 90 5
З
; з і 0.0 А 80 - - ГА: .Ф т ох Ф
Н М і г: "и ід 70 З я пишк : 5 / ьо в 8 3.0 / че, бо З
Ез / хе а. - / ж Га
Е ' хх ш-. в х 50
Кк х х ій -О
Ф 2.0 ід 0 2 - х в
Е х х зі | » вЗО ХМ о ся 1.0 є 20 0.5 10 о отричичиааитть Є опнитаантьнуннння 0 0 1 2 3 Їй 5 6
День -------
Фиг. 10С
5ЗЕОЦЕМСЕ ОГ ТНЕ 1502Бр сОМА ІМ5ЕКТ ІМ рохої
Ват НІ 5! 4 ОБС1 і ПЕАТССАТСОСАТТССОАТОТТСААСААСТТОСААССТСТоСТСАСТОТС БО
АТССТТСТО|ССОСТТТТАССОСТОСАСТОССТТТОСССТССАССАССАС 100
СОСААСТСОААСТОССАССССТАССТСААССОССССАСАССССАССОаССА 150 СТСТССССТТСОССАССАСТОАТСССААСССССТОСТСТОбААТОАСАСС 200
АСТСАСССАССОСТТСТАААСССАСАСАССААССАОСТТОСТОССАСААТ 250
ССААССАССССАТААТСТОССТАТАСАССТТСАОААТССоСАСТТОСТСС зоо
ССССАСССАСТАСТОАТСАТОССТТТСТССОСТААТОСОСАдАСТООССАТТС з5О
АССТТСАССААОСАСССАСТОСАСАССССТСОСТОСОСТССОСАССАСАА доо
ТСАССТССТТТТОССТСТСОССАСТААТСТСОСТТОСАСАААТАТОССЯТС 45БО
ТТСААССАСССССТАТСАСССАССТОСАТТОССАСААСААСОоСТОоАСсТОС 5оо
ССАТАТСТТСТСААСООСТСТАСССАААТСТСАССТОТССАТААССААСО 55О
ССОССААТТАТАТТТССАСССТССССССТОСТСАТТТОТОСТАСТТСССАС воо
САСССАТТССТСАСТСОСТАСААОССАСАОСССАТОАТССАСААСОСТСА в5о
ПО рн он не у ДИНИ
САСТТСАТСТТАСТСТТТОСАТТСАСОСОССТТСААТОАССАССОТАСАТТ т70о
СТТОСТСАСТІБАСТООСТТТСССАТСТТССААТСОААСТТАТССТОААСА 750
АСТТСАСАСССААСААТСССОССОСАТОСТСТСАСАТАССТОСТСААСАС воо
СТАТАСАТСТТСССТАСТОСААССТССТОССПАСААССАССсоСАССССсСТ взо
ТАССССАСАССССАССОСТТССССТТССАТАТТСАТТСААСТІСТССТСТО зоо
ТССАССССАСОССАСТАТТССОСТОССАСАСССААСАТТОСАСАТТССАСО з5О
АССТТСААСАТТТСССТСОСТАТСОССОТОССССАССТТАСАстТТсАССсС 1ооо
ТОСТОСТТТСАСАСАССТОСАСТОССАТСССАСТСАССАССАСТОСАСАТ 1050
ТСТТСАТСТСТОСАААСОССАСССТСАСААТТТТСССТОСССАСАСТСТА 1100 СССТСТАССТТТЯАТТАССААБСТОСТОАТАТСЯСТТАТсТттССТасА|ТС 1150
ТАТОСОССАТТАТСТАСАСААСАТТОСАААСАССАСТТТОАСТТАТСТОС 1200
АССТСТТСААТАСССАСССТТТТОСТОАТСТСАСТСТААСТСсАСТООСТО 1250
ССОТТААСАССТСССАСТСТССТОСАСССОСАССТОААСТТОСАССАССА 1300
САСАСТТОСССАССТСААССАСТТТОССАССААСССсСАСТСТТСТТОоСсТС 1350
Есо КІ
СТСТОААСТСААСТТТССТТССТТТАААСТСАТСАААТТАТСАТТОСААТТС 1402 зі
Фиг. 11
Конструированиє р5ц21
Ватні
Ди о 117 1402 сигнал сигнал| Ватні Краї ЕсоКіІ -- Оксалат декарбоксилаза - (рРТ2180) вес « « ПА 6 ХУ рРОХо1
РСК рохХ0О1 с олигонуклеотидами 001 и 002
Продукт переваривания с Ватні и Крпі
Клонирование в роХоО1 без Ватні/Крпі 5' фрагмента
Ватні Крпі ЕсоКІ 4-41 Сигнал | Оксалат декарбоксилаза З- (рРТ7180) / рОоХО2
Вьіделение ЕсоКІ/Ватні фрагмента и тупьіх концов с фрагментом Кленова
Клонирование в р/К1КІ1 рестриктированную Зтаї . Ї ї
А А
Ніпді / ВаштНіІ Краї КрпІ ЕсовіІ
А З3ЗНА---------------3-3-3--3-- -аа---- Є 2 - ж - 2 - -- 4- рК21
Фиг. 12
Тираж 50 екз.
Відкрите акціонерне товариство «Патент»
Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3-72 -89 (03122)2-57- 03
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US98569592A | 1992-11-30 | 1992-11-30 | |
| PCT/GB1993/002462 WO1994012622A1 (en) | 1992-11-30 | 1993-11-30 | Oxalate decarboxylase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA34467C2 true UA34467C2 (uk) | 2001-03-15 |
Family
ID=25531712
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA95058456A UA34467C2 (uk) | 1992-11-30 | 1993-11-30 | Виділений та очищений днк фрагмент, що кодує оксалат-декарбоксилазу |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5547870A (uk) |
| EP (1) | EP0673416A1 (uk) |
| JP (1) | JPH08503851A (uk) |
| AU (1) | AU677976B2 (uk) |
| BG (1) | BG62574B1 (uk) |
| BR (1) | BR9307548A (uk) |
| CA (1) | CA2149907A1 (uk) |
| HU (1) | HU219140B (uk) |
| RO (1) | RO112764B1 (uk) |
| UA (1) | UA34467C2 (uk) |
| WO (1) | WO1994012622A1 (uk) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5635616A (en) * | 1995-06-02 | 1997-06-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Human oxalyl-CoA decarboxylase |
| US5945273A (en) | 1997-06-03 | 1999-08-31 | Human Genome Sciences, Inc. | Human oxalyl-coa decarboxylase |
| US7745599B1 (en) * | 1995-06-07 | 2010-06-29 | Danisco A/S | Hexose oxidase-encoding DNAs and methods of use thereof |
| US8178090B2 (en) * | 1995-06-07 | 2012-05-15 | Danisco A/S | Recombinant hexose oxidase |
| US6297425B1 (en) * | 1997-03-21 | 2001-10-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Gene encoding oxalate decarboxylase from aspergillus phoenices |
| US20040120941A1 (en) * | 1997-05-23 | 2004-06-24 | Allison Milton J. | Materials and methods for treating or preventing oxalate-related disease |
| US6355242B1 (en) | 1997-05-23 | 2002-03-12 | Ixion Biotechnology, Inc. | Materials and methods for treating or preventing oxalate-related disease |
| US8486389B2 (en) * | 1997-05-23 | 2013-07-16 | Oxthera, Inc. | Compositions and methods for treating or preventing oxalate-related disease |
| PT983076E (pt) * | 1997-05-23 | 2010-01-05 | Oxthera Inc | Microrganismos de degradação de oxalato ou enzimas de degradação de oxalato para prevenir doenças relacionadas com oxalato |
| ZA986308B (en) * | 1997-07-18 | 1999-11-24 | Pioneer Hi Bred Int | The induction of stress-related factors in plants. |
| US6166291A (en) | 1997-07-18 | 2000-12-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Production of pathogen resistant plants |
| EP1755655A4 (en) * | 2004-05-07 | 2011-03-30 | Oxthera Inc | METHOD AND COMPOSITIONS FOR REDUCING OXALATE CONCENTRATIONS |
| PT1962873E (pt) * | 2005-12-14 | 2013-08-29 | Oxthera Inc | Composições farmacêuticas compreendendo bactérias redutoras de oxalato |
| ES2362897T3 (es) | 2005-12-16 | 2011-07-14 | Oxthera, Inc. | Composiciones y métodos para reducción del oxalato. |
| EP2504428A4 (en) * | 2009-11-25 | 2013-09-25 | Captozyme Llc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING OXALATE RELATED DISEASES |
| US20110191903A1 (en) | 2009-12-31 | 2011-08-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Engineering plant resistance to diseases caused by pathogens |
| EP3277099B9 (en) | 2015-04-02 | 2024-05-29 | Oxidien Pharmaceuticals, Llc | High efficiency oxalate-degrading enzymes for degradation of insoluble and soluble oxalate |
| CN107868776A (zh) * | 2016-09-23 | 2018-04-03 | 武汉康复得生物科技股份有限公司 | 糖基化草酸脱羧酶及其制备和应用 |
| US12359212B2 (en) | 2019-11-22 | 2025-07-15 | Mozza Foods, Inc. | Recombinant micelle and method of in vivo assembly |
| US11326176B2 (en) | 2019-11-22 | 2022-05-10 | Mozza Foods, Inc. | Recombinant micelle and method of in vivo assembly |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4652452A (en) * | 1985-02-11 | 1987-03-24 | Calgene, Inc. | Oxalic acid removal in beer production |
| US4956282A (en) * | 1985-07-29 | 1990-09-11 | Calgene, Inc. | Mammalian peptide expression in plant cells |
| WO1988008450A1 (en) * | 1987-05-01 | 1988-11-03 | Birdwell Finlayson | Gene therapy for metabolite disorders |
| ATE105585T1 (de) * | 1987-12-21 | 1994-05-15 | Univ Toledo | Transformation von keimenden pflanzensamen mit hilfe von agrobacterium. |
| HU214357B (hu) * | 1991-02-25 | 1998-03-30 | Zeneca Ltd. | Készítmény és eljárás oxálsav lebontására és az oxalátok mennyiségének csökkentésére növényekben, és eljárás növények védelmére oxálsavat kiválasztó gombákkal szemben |
| FR2673644A1 (fr) * | 1991-03-05 | 1992-09-11 | Rhone Poulenc Agrochimie | Sequence adn codant pour une oxalate oxydase et plantes transformees contenant cette sequence et resistantes au sclerotinia. |
-
1993
- 1993-11-30 EP EP94900946A patent/EP0673416A1/en not_active Withdrawn
- 1993-11-30 HU HU9501503A patent/HU219140B/hu unknown
- 1993-11-30 WO PCT/GB1993/002462 patent/WO1994012622A1/en not_active Ceased
- 1993-11-30 JP JP6512936A patent/JPH08503851A/ja active Pending
- 1993-11-30 UA UA95058456A patent/UA34467C2/uk unknown
- 1993-11-30 AU AU55711/94A patent/AU677976B2/en not_active Expired
- 1993-11-30 RO RO95-00988A patent/RO112764B1/ro unknown
- 1993-11-30 CA CA002149907A patent/CA2149907A1/en not_active Abandoned
- 1993-11-30 BR BR9307548A patent/BR9307548A/pt not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-10-18 US US08/324,533 patent/US5547870A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-19 BG BG99731A patent/BG62574B1/bg unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1994012622A1 (en) | 1994-06-09 |
| AU5571194A (en) | 1994-06-22 |
| EP0673416A1 (en) | 1995-09-27 |
| BG99731A (bg) | 1996-02-28 |
| AU677976B2 (en) | 1997-05-15 |
| HU219140B (hu) | 2001-02-28 |
| BG62574B1 (bg) | 2000-02-29 |
| HU9501503D0 (en) | 1995-07-28 |
| HUT71786A (en) | 1996-02-28 |
| RO112764B1 (ro) | 1997-12-30 |
| US5547870A (en) | 1996-08-20 |
| BR9307548A (pt) | 1999-06-01 |
| JPH08503851A (ja) | 1996-04-30 |
| CA2149907A1 (en) | 1994-06-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA34467C2 (uk) | Виділений та очищений днк фрагмент, що кодує оксалат-декарбоксилазу | |
| US5866778A (en) | Newly characterized oxalate and uses therefor | |
| Jacobsen et al. | Characterization of two antifungal endochitinases from barley grain | |
| Lusso et al. | The effect of sense and antisense expression of the PR-N gene for β-1, 3-glucanase on disease resistance of tobacco to fungi and viruses | |
| JPH06507070A (ja) | 植物キチナーゼ遺伝子およびその使用 | |
| Stermer et al. | Association of heat shock induced resistance to disease with increased accumulation of insoluble extensin and ethylene synthesis | |
| US7695751B2 (en) | Detoxifizyme with activity of transforming aflatoxin and the gene encodes thereof | |
| KR100346928B1 (ko) | 항균단백질 | |
| Meir et al. | Transforming a NEP1 toxin gene into two Fusarium spp. to enhance mycoherbicide activity on Orobanche—failure and success | |
| US10253074B2 (en) | Nontoxigenic Clostridium botulinum strains and uses thereof | |
| JP2000175698A (ja) | ピラノースオキシダーゼを含有するピラノース測定用試薬 | |
| Keon et al. | A comparison of the biochemical and physiological properties of a polygalacturonase from two races of Colletotrichum lindemuthianum | |
| US7232673B2 (en) | Antimicrobial protein from Lyophyllum shimeji | |
| CN115975981B (zh) | 一种抗黄单胞菌属病害相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| US6399858B1 (en) | Chitinase gene from stenotrophomonas maltophilia | |
| JPWO2001021657A1 (ja) | 新規タンパク質、それをコードする遺伝子及びそれらの利用法 | |
| Rahman | Purification and characterization of alpha-amylase from Bacteroides amylophilus strain H-18 | |
| AU9725398A (en) | Fumonisin-detoxifying enzymes | |
| Mdluli | Analytical determination of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase using monoclonal antibodies | |
| Feltman | Development of the polygalacturonase inhibiting protein (PGIP) for delivery of foreign proteins to the surfaces of plant cells | |
| MXPA04012451A (es) | Cepas mejoradas de trichoderma como agentes de biocontrol, metodos para su obtencion y su uso para el control de enfermedades causadas por hongos fitopatogenos. | |
| HK1106272B (en) | A detoxifizyme having activity of transforming aflatoxin and the gene encodes thereof |