UA44889C2 - Штам гриба nectria pityrodes montagne, який використовується як біофунгіцид (варіанти), біофунгіцид, спосіб його одержання (варіанти), спосіб пригнічення грибкової інфекції у рослин, спосіб скринінгу фунгіцидних мікроорганізмів - Google Patents

Abstract

Бiофунгiцид та спосiб його одержання, що включає вирощування грибкових штамiв Nectria pityrodes Montagne (7522, 8805, 8806, 8807, 8808), спосiб пригнiчення грибкової iнфекції за допомогою даного фунгіциду та метод скринiнгу фунгiцидних мiкроорганизмiв в зразках, що включає дослiдження в пiску та торфi.

Description

Опис винаходу

Предметом настоящего изобретения являются биологические методь! борьбь! с болезнями растений и, в 2 частности, нове микроорганизмь, относящиеєся к роду Месіга, а также их применениє для борьбь с грибковьіми инфекциями у растений. Кроме того, данное изобретение относится к составам, включающим новье штаммь рода Месігіа и используемьм для указанной цели. Настоящим изобретением предусматриваєтся метод скрининг-теста зффективньїх организмов в микробньїх штаммах, вьіделенньх из почвь.

Известньй уровень техники

Сельскохозяйственнье культурь! подверженьї различньі!м болезням, вьізьіваемь!м грибками, бактериями и вирусами, и могут бьіть пораженьі рядом насекомьїх-вредителей. Для борьбь! с такими болезнями разработань методьй культивации, химические и биологические методь. Зти методьй направленььй на предотвращение качественньїх и количественньїх потерь сельскохозяйственньїх культур вследствие болезней и поражения насекомьіми-вредителями. 19 Как правило, термин "биологическая борьба с болезнями растений" означает уничтожение патогенов растений другими организмами, которнше можно назвать биоконтролирующими агентами (БКА). Продукть, вьірабатьвваемье биоконтролирующими агентами, часто назьвают биопестицидами. Механизмь! биологической борьбьі с болезнями растений могут бьть весьма различньї, и желаемьй зффект часто достигаєтся в результате совместного действия нескольких разньїх механизмов. Зффект подавления может бьїть вьізван ийнгибирующими метаболитами, образуемьми биоконтролирующими агентами, которне иногда паразитируют на патогене или борются с ним за жизненное пространство и/или питательнье вещества.

Потребность разработки биоконтролирующих агентов еще больше возросла в связи с тем, что многие традиционнье химические контролирующие агентьі оказались вредньми для окружающей средь и людей.

Недостатком химикатов является также то, что многие вредители бьістро приобретают иммунитет к одному и с 22 даже нескольким контролирующим средствам. Вьіработка иммунитета к биопестицидам маловероятна, так как Го) на основе их действия лежат механизмь разньїх типов. Химикать! обьічно оказьвают более бьістрое и зффективное действие, чем биопестицидьі. С другой стороньі, действие биопестицидов часто бьівает более продолжительньм, чем у химикатов, так как производимьій ими зффект создается жизнеспособньми и воспроизводимь!ми микроорганизмами. о 30 Найболее важную группу биопестицидов составляют бактериальнье продуктьї, оказьвающие с целенаправленное действие на насекомьіїх-вредителей. Наиболее распространенньми являются бисинсектицидьї на основе бактерий Васіїйиз (пигіпдіепзіз. В Финляндии производится биофунгицид на основе со актиномицета Бігеріотусев, которьій зффективен против ряда грибковьїх болезней растений, источников «І которьїх являются почва и семена. Продукт, которьій предотвращает распространение корневой гнили 3о (вьізьваемой грибком Неїегоразідіоп аппозит) в хвойньх лесах, бьл получен из безвредного лесного З гнилостного грибка РІПеріс дідапігап.

Бьіли всесторонне изученьі бактерий рода Рзепдотопавз, в частности вида Рзепдотопаз Пиогезсепв, и в настоящее время известно большое число штаммов Р. Поогевсепе, обладающих фунгицидньм действиєм. См., «ф например, опубликованнье заявки на патент УУО 92/18613, РІ 92 1722 и МО 90/01327, а также европейский З 70 патент Мо 228457. с В процессе поиска микроорганизмов, пригодньїх для биологической борьбь), обьічно производится з» тестирование большого числа микробньїх штаммов с целью вьіявления их биоконтролирующей активности или других нужньїх свойств. В опубликованньїх патентах рассматриваются некоторне методь скрининг-теста.

В патенте США Мо 4647533 рассматривается трехзтапньій метод скрининг-теста, в соответствии с которьімМ 45 бактерии сначала вьіделяют из почвьі, содержащей множество спор болезнетворного грибка Руїпічт. На втором е зтапе вьіделеннье бактерии подвергают скрининг-тесту в теплице путем проращивания семян зерновьїх культур «їз» в почве, содержащей большое количество спор Руїйішт, при зтом тестируют каждьй вид бактерий и проводят контрольньй тест без зтих бактерий. На оснований теста отбирают бактерии, в присутствии которьїх растения со достигают найбольшей вьісотьї и имеют найболее развитье листья. На третьем зтапе отобраннье бактерий о 20 еще раз проходят отбор в полевьх условиях при проведений такого же испьтания, что и в теплице. Кроме того, на третьем зтапе отбирают те бактерии, в присутствий которьїх растения растут лучше всего. с В заявке на патент Финляндии Мо 92 1722 описьівается следующий способ. Сначала в соответствующей среде вьіращивают мицелий штамма Руїпйічт. Зтот мицелий покрьівают слоем стерильной почвьі, в которую добавляют исследуемье микроорганизмь!, после чего оценивают их воздействие на рост грибка Руїйпішт. На втором зтапе почвенньйй образец инокулируют штаммом Руїйпішт, вьізнівающим ризоктиниоз. В почву вьісевают

ГФ) семена растения, восприимчивого к зтой грибковой инфекции, и определяют влияние испьітуемого организма на рост растений. Для последующих испьтаний отбирают такие вещества, которье оказьвают ингибирующее о действие на грибок Руїпішт в обоих вьішеуказанньх испьтаниях.

Краткое изложение существа изобретения 60 Предметом настоящего изобретения являются микроорганизмь! рода Месігіа, в частности Месігіа ріугодез

Мопіадпе, которне оказались весьма зффективньми для борьбь с грибками РизагіШт.

Кроме того, данное изобретение относится к биофунгицидному составу на основе микробного штамма, которьій содержит в качестве активного ингредиента вьішеуказанньюе грибкове штаммь!, принадлежащие к роду Месігіа, а также известнье добавки или наполнители. Примерами таких препаратов являются составь, бо пригодньє для протравливания семян, порошкообразнье или гранулированнье составь, вносимье в субстратьі, необходимьге для роста, или жидкие составьі, предназначеннье для обработки почвиь.

Настоящим изобретением предусматривается также новьій и зффективньй способ скрининг-теста грибковьсх штаммов, представляющий собой трехзтапное испьтєтание, включающее тестирование в песке, торфе и полевой почве. На каждом зтапе испьтания грибковье штаммь!), оказавшиеся незффективньмми, исключают из последующих тестов. Грибковье штаммь!ї, показавшие найлучшие результать! в теплице, затем испьітьївают в полевьїх условиях.

Краткое описание чертежей

Рис. 1. Зксперимент по вьіявлению реакции на дозу при использованиий штамма .) 76 летом 1992 г. Процент 7/0 пораженньх ростков при инокулирований семян грибком г. Р. ситогит.

К - обработка не производилась,

В - протравливание составом "Байтан",

У 76-0 - суспензия спор .) 76, 1,2х107 КОЕг/мл

У 76-1 - суспензия спор У 76, 1,2х106 КОг/мл

У 76-2 « суспензия спор У 76, 1,2х105 КОЕ/мл

У 76-3 - суспензия спор У 76, 1,4х107 КОЕ/мл

Рис. 2, Зксперимент по вьіявлению реакции на дозу при использованиий штамма .) 76 летом 1992 г. Процент пораженньх ростков при использований здоровьїх семян. Используемье аббревиатурь! аналогичнь рис. 1.

Рис. с За по За. Гистограммьї, представляющие результать! воздействия грибковьїх изолятов, забракованньх на разньх зтапах испьітаний, проведенньх в теплице, на состояние ростков в полевьїх условиях.

К - обработка не производилась,

В - протравливание составом "Байтан 1".

Подробное описание изобретения

Ниже дается детальное описание грибковьіїх штаммов по настоящему изобретению. Приводятся даннье об с их вьіделении, подробно рассматриваются штаммь и указьмваєтся их зффективность в полевьїх условиях. о

Далее рассматриваются способьії получения биофунгицидньїх составов из зтих штаммов, характеристики составов и испьтания зффективности зтих составов. Помимо зтого описьмшвается метод скрининг-теста грибковьїх штаммов, вьіделенньїх из почвенньїх образцов.

Вьіделение микроорганизмов б»

Почвеннье образцьі, из которьїх вьіделяли грибкове штаммь! по настоящему изобретению, отбирали в со 1989, 1990 и 1991 гг. их общее количество составляло 190. Почвеннье образць! разньїх типов и из севооборотов различной ротации брали в разньх частях Финляндии, главньм образом с со научно-исследовательских станций Сельскохозяйственного научно-исследовательского центра. Образцьії брали «Е из корневого слоя (с глубиньі 0 - 15см). С каждого слоя брали несколько аналитических образцов, которье делили на части от 1 до 2 литров. «

Вьіделение микроорганизмов производили по методу разбавления (вьіделение из почвь)) или по методу культивирования на растениях (вьіделение из корней). Полученнье результать! подробно описьіваются ниже в разделе "Методьг". «

Характеристика микроорганизмов

Грибковье штаммьї, вьіделеннье из почвенньїх образцов, испьітьївали с помощью метода скрининг-теста по З с настоящему изобретению, которье описьівается ниже в разделе "Методь!". Ббіло обнаружено пять штаммов, "» которье позволили получить очень хорошие результать!. Штаммь, названньеє, . 76, 3 1431, У 1432, МО51 и КО " 2, біли отправленьі на исследование в Центральное управление сельскохозяйственньїх культур, г. Баарн,

Нидерландь. В соответствий с Будапештским договором зти штаммь! бьіли внесеньії в банк данньїх О5М (Оецізеп Заттішйпд меп Місгоогдапізтез апа 7ейкийигеп Стін) под номерами О5М 7522 (15 марта 1993 г), ОБМ о 8805 (10 декабря 1993 г.), ОБМ 8806 (10 декабря 1993 г), ОБМ 8807 (10 декабря 1993 г) и ОБМ 8808 (10 декабря ї5» 1993Г.).

Зти микроорганизмь! имеют следующие морфологические характеристики: со Морфология: спороходий без краевьх стерильньїх гифов. Периодические ответвления конидиофор при о 20 наличии нескольких ответвлений в каждом узле. Конечнье ответвления содержат мутовки фиалид, образующиеся в столбчатом слое. Фиалидьї имеют цилиндрическую форму длиной до 15мкм с апикальньіми с порами. Конидии в виде цепей или слизистьїх шариков зллипсоидной или каплеобразной формь! с коротким хилусом, 7 - 8вхімкм, гладко-стеннье без отростков.

Характер развития колонии: колония на агаре из овсяньїх хлопьев увеличилась в диаметре до 40см в 52 течение 7 дней при температуре 227С; гиалин мицелия, спорообразующие участки покрьїть! зеленьми,

Ф! концентрическими кольцами спороходия. Запах отсутствует, колония обесцветилась, зксудат ограничен, светль!й. де Структура конидиофора штамма .) 76 аналогична структуре Мугоїпесіцт мегтисагіа, но отличается от зтого вида образованием неграничного спороходия, наличием конидий в виде сухих цепей и без типичного 60 веерообразного отростка.

Представители рода Сііосіадішт отличаются от новьіїх штаммов тем, что для рода ОСііосіадішт типично образование отдельньїх кистеобразньїх конидиофоров.

Таким образом, штаммь .) 76, у) 1431, У 1432, МО5 1 и КО5 2 бьіли идентифицировань! в качестве видов

Месігіа ріугодез Мопіадпе. б5 Из зтих штаммов можно получить устойчивье составь), которье легко наносятся на пораженнье болезнью посевьі. Состав можно получить в виде порошка. Культивирование микробов может бьїть начато с инокулята, которьій представляет собой содержащую спорь пеллету (лепешку) картофельного агара с глюкозой, вьідерживаемую при температуре -80"С. Микробьії можно культивировать в жидкой среде или на твердой подложке. Питательная среда включает сахар, например сахарозу, и азот, а также небольшие количества других питательньх веществ. Для культивирования микробов можно использовать неспецифические питательнье средьі, например кукурузньій зкстракт, или специфические питательнье средьі, например ГДС (глюкоза 4г/л, дрожжевой зкстракт 4г/л, солодовьій зкстракт 10г/л) или картофельно-декстрозньій бульон.

Показатель рН равен примерно 6,0 и регулируется вначале до стерилизации. Культивирование производится 7/0 при встряхиваний в течение одной-двух недель. Биомассу можно отделить от бульона путем фильтрования через фильтровальную бумагу или центрифугирования. Бели культивирование производят в жидкой среде, к биомассе примешивают онаполнитель, например двуокись кремния, сухое молоко /- и/или карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ). Зту массу сушат при комнатной температуре и измельчают в порошок.

Методь

Вьіделение микробов а). Метод разбавления (вьіделение из почвьї) 10г почвьї смешивали со 100мл 0,595 водного раствора агара (бактоагар). Из зтой смеси отбирали три 1Омл пробь и из каждой из них готовили два разведения (107 и 1072) в 0,595 водном растворе агара. Разбавленнье пробьї встряхивали (в водяной бане) в шейкере в течение 20 - 30 минут. їмл разведения помещали с помощью пипетки на пустую чашку Петри и добавляли 20мл агара из бьічьей желчи Литмана. Зти чашки инкубировали при комнатной температуре в течение З - 7 дней, после чего в чистье культурьі на картофельном агаре с глюкозой вводили индивидуальньсе грибки. р). Метод культивирования на растениях (ввіделение из корней) 15 горшков в виде матриць с последовательньм расположением (матрица с опоследовательно су расположенньми 50мл горшками Меї-УР) заполняли почвой одного образца. В один горшок вьісевали четьіре семени пшениць ячменя или примерно 15 семян репьі, причем для каждого вида растений использовали пять і) горшков. Семена покривали песком, поливали и инкубировали в камере для вьіращивания при температуре 1570 с 14--асовьім световьім периодом. После двух недель культивирования растения вьтаскивали и промьівали в проточной воде или очищали сухой щеткой. От корней отрезали маленькие кусочки и клали на (о) плоские чашки. Используемье средь!: агар из бьічьей желчи Литмана (10г пептона, 10г декстрозь, 15г бьічьей бактожелчи, 0,01г В-кристаллического фиолетового красителя, 0,03г стерптомицина, 20г агара и 1000мл водьї), со

РОМІВ (15г пептона, 1г КНоРО,, 0,5г МаЗзО) 07 Нео, 2г авикола, З части на миллион стрептомицина, 20г агара и ее) 1000Омл водьї), картофельно-декстрозньїй агар со стрептомицином (З39мг картофельного агара с декстрозой, 300 частей на миллион стрептомицина и 100Омл водьї). Через несколько дней инкубирования вьіделяли отдельнье З грибки и инокулировали на плоские чашки картофельного агара с декстрозой. Штаммь хранили на пеллетах «ж картофельного агара с декстрозой в ампулах (Мадепе 5000-0012, стерильньій пирофосфат 1,2мл) при температуре -8070.

Проведение испьттаний в теплице по методу скрининг-теста «

Испьїтание в песке

Семена зерновой культурь! вьісевали в слой песка. На зти семена и субстрат, необходимьй для роста, со Ш-й) с помощью пипетки наносили сначала мицелий и спорьї патогена в водной суспензии, а затем спорь! испьітуемого ц грибка, после чего семена покрьвали песком. Через две с половиной недели проверяли интенсивность "» проявления симптомов болезни. Из последующих испьтаний исключали грибки, которйе не влияли на интенсивность болезни, или сами оказались патогенньми.

Испьітание в торфе «г» Семена зерновой культурь! замачивали в суспензии спор патогена и сушили. После зтого семена смачивали в суспензии спор испьітуемого грибка, сушили и вьісевали. В качестве субстрата, необходимого для роста, ве использовали пропаренньій торф. Через две с половиной недели культивирования проверяли состояние (ее) ростков. Штаммь! грибков, которье препятствовали возникновению болезни, отбирали для испьітаний в полевой 5оО почве. со Испьітания в полевой почве (Че) Измельченную и увлажненную полевую почву помещали в горшки емкостью 1,5л и в каждьй горшок вьісевали 36 семян зерновьїх культур. Перед посевом семена обрабатьвали так же, как при испьітаний в торфе, причем использовали по З репликатньїх горшка для каждой обработки. Симптомь! болезни у ростков проверяли

Через четьіре недели культивирования.

Штаммь, показавшие хорошие результать! в зтих испьітаниях, отбирали для полевьїх испьітаний, которье о позволили окончательно определить биопестицидную зффективность микробньх изолятов. ко Патогенность грибковьїх штаммов

Зкспериментальньм путем проверяли возможнье вреднье воздействия грибкового штамма . 76. бо Полученньве результать! показали, что зтот грибок не оказьівает патогенного действия на растения. Испьттания проводились в отношений растений 33 видов.

Зкспериментальная часть

Следующие зкспериментьї иллюстрируют возможности применения настоящего изобретения. В разделе (А) рассматриваєтся использование суспензий пор Месігіа ріугодез штаммов .) 76, у) 1431, У 1432, МО5 1 и КО5 2 65 по зтому изобретению для борьбь! с болезнями растений, вьізьшваємьми главньм образом видом Ризагішт зрр.

В разделе (В) описьіваєется способ получения и использования составов на основе зтих штаммов. В разделе (С)

рассматриваются зксперименть!ї, с помощью которьїх исследовали действие, оказьіваемое грибковьім штаммом

У 76, и в разделе (0) приводится осуществление и оценка метода скрининг-теста по настоящему изобретению. (А) Использование грибковьїх штаммов в виде суспензий спор

Зксперименть! с суспензией пор штамма У 76

Летом 1992 г. на трах испьітательньїх площадках проверяли воздействие суспензий спор штамма ./ 76. В зтих испьтаниях использовали семена двух разньх зерновьх культур; семена пшениць, искусственно инокулированнье Ризагішт ситогип, и семена ячменя, зараженньєе Р. Мімаіе естественньїм путем.

Результатьі испьтаний в отношений пшениць приведеньій в таблице 1. Показатели урожайности 7/0 искусственно инокулированной пшениць дань! в таблице 2.

Результать! проверки ростков ячменя представлень в таблице 3. Зта болезнь не оказала статистически значимого влияния на урожайность ячменя. : всходов и развитие болезни у ростков вені С ВШ ростков пишне З

ДІВ інно НИМ ПИ "Байтан" 00000003 ин т т НН то ПО щ

ПИ інн НИМ ПИ "Байтан" 00000083 00 ера вм 0010101010000000000015000000000000000000101001005Ф бе "Байтан" всю « з ч

Зксперименть, проведеннье на трех испьітательньїх площадках летом 1992 г. в отношений искусственно инокулированноий пшениць. « - з с ;» й с» пімаіе). Появление всходов и развитие болезни у ростков ун с с й пораженньх ростков со

Семена, протравленнье составом до 1,2

Фк со ПОЛОН ПОН С ПОН НН

ШЕ алвівни НО ПО "Байтан" 50000058 о

ОНИ Пі НН п "Байтан" нини нини 60

Испьітание по вьіявлению реакции на дозу штамма .) 76, проведенное летом 1992 г.

Поскольку штамм У 76 продемонстрировал действительно хорошие результатьь во время опьтов, проведенньїх в начале лета 1992 г., біло исследовано воздействие зтого штамма в зависимости от дозь на зерновую культуру, посеянную в начале лета. Йспользовали как здоровье семена пшениць, так и семена, 65 искусственно инокулированнье Ризагішт сиЇтогит.

Зтот зксперимент проводили на небольших делянках площадью 2м 2. Вели наблюдение за появлением всходов и проявлением симптомов болезни у ростков. Образць! ростков для проверки развития болезни брали через четьіре равньїх периода времени. Образцьі для каждой обработки брали с четьірех делянок, посев на которьїх бьіл произведен отдельно для каждого времени отбора образцов. Количество ростков указано в таблице 4, а процентньіе значения пораженньїх ростков приведеньі! в таблице 5 отдельно для пораженньх и здоровьїх семян. Даннье, представленнье в таблице 5, графически показань на рисунках 1 и 2. й 0 сема вркнвююю 1 ин ї шшшшш 00101111 Семена протравленнью составом Бай! 71111111 66 1111110 Суспенмясторутвисюютковму) 01111111 во сч й о инокулированньх грибком РЕ. ситогит, и здоровьхх семян. Сокращения аналогичнь! рис. 2.

Обработа! 00000000 Количество дней после поязления воходов

Ф зо пн Ес ст о ЕС со во 00000в0111100ввв001111000 тов со з зв « и нн У У ох ЕС « твої 171111111ляаі77771111явої77777ввеяї77777711717 тав ші с Полевньге опьїть! с использованием суспензии спор .) 76, проведеннье летом 1993 г. ц Зти опьїть! біли проведень! на научно-исследовательских станциях Хокиойнен, Метиойнен и Палкане. В "» опьітах использовали образцьї семян шести типов: - пшеница "| ціа", зараженная грибком РЕ. ситогит естественньїм путем; - пшеница "| ціа", искусственно инокулированная грибком РЕ. ситогит. с» - пшеница "| ціа", незараженная; - пшеница "і аагі" незараженная; те - ячмень "Кизіаа", зараженньій разньмми грибками Ризагішт и грибком Віроїагіз зогоКіпіапа естественньім (ее) путем; со 50 - овес "Лу", зараженньй грибком РЕ. ахепасецт естественньїм путем.

Здоровье семена бьіли посеяньі только в Хокиойнене; в отношений других четьірех образцов семян опьіть

Ме, проводились в каждом из трех испьітательньїх районов. Для проведения опьітов делянки площадью 10м 2? засевали шестью дублированньіми образцами, предназначенньіми для каждой обработки.

Все образцьї семян подвергали аналогичной обработке: К - необработаннье контрольнье семена;

В - химически обработаннье семена, протравленнье составом "Байтан 1"; о к«) 768 - суспензия спор .) 76 из культурь! на плоских чашках (8,4х109КОЕ/кг семян).

В таблице 6 приведень! значения интенсивности поражения болезнью отдельно для каждой обработки и іме) образцов семян. Показатели урожайности суммировань в таблице 7. во

ШИ я сені ваш естественньимм путем |искусственно "ціа" пшеница "' аагі" хокиойнЕНГГ11 в5 квоти тя11111м4211112о61 Б в 09 20 2 10 14 0,7 вв ов тя ою 381 БЛ мивтойнвнії ГО квар вк міт вра вив яв в ом опАЛАНЕООООЇ 1 кварти вав вав вав 70 зтвв ому ве 7128о111

ШИ ші ваш за естественньмм путем |искусственно "ціа" "І аагі" хокиойненії ГГ

Св лют 01110005, 00111100000в5ю1000000вмо0000вово, 2 мило 11 ж вв 011110ю000000000звю0 в вювю 0111109,

Свв вів 01000006, 0000000008ю сч зв тк 11

Ск яв 00000006, о

С вроавюрвюю 0101011мю011000000юю утеврояамо|вяазої змо зво! - - - Ге) 30 Испьітание штамма у 76 в отношений воздействия на твердую головню пшениць! и гниль корневой шейки ячменя. (ее)

Летом 1993 г. штамм .) 76 бьіл включен в полевье опьІітьІ, в ходе которьїх десять химических фунгицидов, со используемьїх для протравливания семян зерновьїх культур, испьітьївали в отношений воздействия на твердую головню пшениць (вьізьіваемую грибком ТШейа сагіев). Штамм У 76 применяли в виде суспензии конидий, а «І

Зв Химикатьі - в соответствий с инструкциями по использованию. Опьітьі проводили на делянках площадью « 0О,1м2 при пятикратном дублированиийи (таблица 8). « : з (- сокращение количества пораженньх колосов) с з 5 що ї» со

Фо с В составе "Байтан" активньім ингредиентом бьіл триадименол. Состав "Байтан 1" представлял собой смесь, которая включала триадименол и имазалил. Состав "Тайссато 5 " содержал карбоксин и имазалил. Активнь!м ингредиентом в составе "Паноктин" являлся квазатин.

Во время полевьїх опьітов по испьітанию химикатов в отношений уничтожения гнили корневой шейки ячменя

ГФ) (вьізьіваемой Віроїагіз зогоКкіпіапа) также производили обработку семян спорами у 76. Опьїтьї проводили на з делянках площадью 1Ом 2 с четьрехкратньм дублированиєм. Не бьло обнаружено никаких различий в появлениий всходов при различньїх обработках. Штамм 476 позволил в значительной степени устранить во симптомь! болезни (таблица 9), хотя зтот патоген сильно отличаєтся от грибков, Ризагішт, для борьбь с которьїми он бьл вьібран. бо Прелюд І 5 85

С Таюватювжидкйсюютв 10000006 0000опантинлю! Зв нн Інн о нини (В) Препарать, полученньсе из грибковьїх штаммов, зффективность их применения в полевьїх опьітах

Порошкообразньсе составь! из грибкового штамма . 76 бьіли полученьі! следующим образом:

Состав 1

Культивирование производили в колбе Зрленмейера емкостью 1л, в которую помещали 0,5л питательной средьі), содержащей 4г/л сахарозьі, 4г/л дрожжевого зкстракта и 10г/л солодового зкстракта. Показатель. рн доводили до 6,0 перед стерилизацией в автоклаве. В качестве инокулята использовали пеллету агара со спорами, которую хранили при температуре -807"С (картофельно-декстрозньій агар). Скорость вращения шейкера равнялась 150 оборотам в минуту, культуру вьиіращивали при комнатной температуре (227С) и период культивирования составлял от 7 до 12 дней. Клетки отделяли фильтрованием через фильтровальную бумагу. С су биомассой (клеточной) смешивали ЗіО», сухое молоко и карбоксиметилцеллюлозу в следующих количествах: о биомасса 2095 двуокись кремния 5595 сухое молоко 1595 Ге»! карбоксиметилцеллюлоза (795 водньй раствор) 1095 со

Зту смесь в течение 2 дней сушили на открьїтьїх чашках Петри при комнатной температуре в стерильной со атмосфере. Толщина слоя составляла 1 - 2см. Вьісушенную смесь измельчали в порошок. Жизнеспособность препарата равнялась ТОКОЕ/г(КОЕ - колонигобразующая единица). «І

КОЕ (колониегобразующая единица) - зто единица, которая используется для определения - жизнеспособности микробов.

Разбавленную суспензию микробов помещали на плоские чашки агара и через несколько дней подсчитьявали колонии. Если известна степень разведения, можно вьсчитать количество колоний или количество микробньїх клеток в первоначальном образце. « 20 Состав 2 -о

Клетки культивировали так же, как при получениий состава 1, после чего с биомассой смешивали 510», с сухое молоко, карбоксиметилцеллюлозу и аскорбиновую кислоту в следующих количествах: з биомасса 6095 8ібо 2095 їх сухое молоко 1495 карбоксиметилцеллюлоза (795) 395 ї аскорбиновая кислота 395 (ее)

Зту смесь сушили так же, как при получении состава 1, и измельчали в порошок. Жизнеспособность зтого (о) 20 препарата составила 10/КОЕ/г. с Состав З

Клетки культивировали так же, как при полученийи состава 1, после чего с клеточной биомассой смешивали сахарозу и крахмал в следующих количествах: 25 биомасса 2095

ГФ) сахароза 2595

Ге крахмал 5595

Зту смесь сушили так же, как при получении состава 1, и измельчали в порошок. Жизнеспособность зтого 60 препарата составила 10/КОЕ/г.

Состав 4

Штамм У 76 культивировали в твердой питательной среде с наполнителем из 5іО». В качестве питательного бульона использовали 895 солодовьій зкстракт (Мальтакс МРІ10, І айдеп РоїКіто). 120г питательного бульона смешивали в химическом стакане с 50г порошкообразного силикагеля и на 20 минут помещали в автоклав при бо температуре 1207"С. Охлажденную среду инокулировали 1Ог суспензии спор .) 76, которую получали путем соскабливания спор с чашки картофельного агара с глюкозой в стерильную воду. Зту среду инкубировали в течение 20 дней при температуре 16"С, после чего ее 2 дня сушили при комнатной температуре.

Жизнеспособность сухого препарата составила 10/КОЕ/г.

Остальнье штаммь! по настоящему изобретению можно получить аналогичньім образом.

Зффективность применения порошкообразньх составов в полевьїх опьтах.

Рассматриваемье ниже опьітьь проводились Институтом зашить! растений в Сельскохозяйственном научно-исследовательском центре Финляндии летом 1993 г. при использований порошкообразного состава штамма .) 76. Зти опьтьі проводились в Сельскохозяйственном научно-исследовательском центре в 70 Хокиойнене, Миетойнене и Палкане. При проведений зтих опьітов использовали образць! семян шести видов: - пшеница "| ціа", зараженная грибком РЕ. ситогит естественньїм путем; - пшеница "| ціа", искусственно инокулированная грибком РЕ. ситогит. - пшеница "| ціа", незараженная; - пшеница "і аагі" незараженная; - ячмень "Кизіаа", зараженньій разньмми грибками Ризагішт и грибком Віроїагіз зогоКіпіапа естественньім путем; - овес "Лу", зараженньй грибком Е. ахепасецт естественньім путем.

Образцьі здоровой пшениць! сеяли только в Хокиойнене, а опьіть! с четьірьмя другими образцами семян проводили на всех трех испьтательньх участках. В ходе опьтов засевали делянки площадью 10м 2 с шестикратньім дублированием для каждой обработки.

Все образцьї семян подвергали одинаковой обработке: К - необработаннье контрольньсе семена;

В - химически обработаннье контрольнье семена, протравленнье составом "Байтан 1";

У 76РК - порошкообразньй состав ./ 76, используемьй в виде сухой протравки (8,4Х109КОЕ/кг - найбольшеє количество, поглощаемое семенами); с

У 76РМ - порошкообразньй состав .) 76, используемьй в виде жидкой протравки (8,4х109КОЕ/КГ). г)

В таблице 10 приведеньі величиньі интенсивности поражения болезнью отдельно для каждой обработки и образцов семян. Показатели урожайности суммировань в таблице 11.

Ф зо со

ПИ и По ер Ше о Пес зн Ве й естественньім путем искусственно "ціа" "І аагі" (ее) хи 1 в 004111 3555 М вв вв а0010010м0111111006440о1 мийні 01 ря в вро 5101111111866111 с мекв юямав1111111 хз вим виробам ' АКА 11 квести вав вм66 ь РК ває ї» уже вав вам (ее) я (Че) (кг/га) о-ви и естественньім путем искусственно "ціа" "І аагі" во хиойнн 011

О00101010177777777втвю вто 0111111186ю,0011111100000вв,0010000вю0100000вово ю во МивтоЙНЕНІЇГ/1ТГ кв вію 00000100ю00000000000звю вро юю 01111190 ак вюю ввю 00000046

Сем вибо вію 00001001 вв пАЛЮНЕ,ЇГГ//С/О1С/Ї11

К 4670 5560 3630 2950 чтерМ/ авто! вато зво зво 11111111

У

Кроме того, в 1993 г. проводили испьітания по зффективности воздействия составов, полученньїх из штамма

У 76, на разньсе грибки. Результать! зтих зкспериментов приведень в таблицах с 12 по 18.

Таблица 12

Зффективность подавления штаммом .) 76 грибков Ссаситаппотусев на инокулированной пшенице Роїкка, произрастающей в песчаной почве.

Вегетационное испьттание с прикрьітием

Обработка Появление Процентполностью здоровьх) Индекс поражения воходов Ж ростков оз

Пораженнье болезнью семена (не 78,7 65,3 0,76 5,8 0,28 обработаннье штаммом .) 76)

Протравливание сухим составом . 76 (состав 81,3 76,0 0,55 101 0,Аб 4), г/кг

Протравливаниє жидким составом .) 76, 90,7 81,3 0,31 10,4 0,43 1О6КОЕ /мл

Индекс поражения: д р (в) здоровье семена 1 незначительное поражение 2 сильное поражение сч

З отсутствие всходов щі 6)

Таблица 13

Зффективность воздействия препаратов .) 76 на грибок Різагішт ситогит, поражающий пшеницу Роїкка. Вегетационньсе испьтания при использований торфа в качестве субстрата. КЕ - виращивание в твердой фазе (состав 4), К - культивирование в жидкой фазе в шейкере Ге) (состав 1), М - микробь из культурь на агаре

Обработка Процент появления Процент полностью Индекс поражения Сьірой вес, г/репликац. со всходов здоровьх растений (0-3) со -

Протравливание жидким составом . 76 72 А 1,17 14,0

Ротв дов ' ' «

КЕ 40/931, 109КОЕ/мл

Протравливание жидким составом -/ 71 49 1,21 18,0 76 В 10/2 С, 10бКОБ/МЛл зтеміобковми! 111761581111106е111111111 ме с 70 Индекс поражения: ч » (в) здоровне растения " 1 незначительное поражение 2 сильное поражение

З отсутствие всходов

ЧК»

ЧК»

Таблица 14 (ее) Зффективность воздействия препаратов .) 76 на грибок Руїпіит, поражающий огурць. Результать дань в виде средних значений для трех вегетационньх испьітаний (РрНб.2, рнб чи рн 74) со Обработка Процент жизнеспособньїх проростков Индекс поражения (0-2) Сьрой вес г/репликацию со 0000овдоровнеовмона7/11111111111111111111119861111111111110041111111111111

Протравливаниє жидким составом .) 76, 58 0,52 5Б 10бКоОє/мл (Ф) Индекс поражения: ко

О здоровне растения 1 погибшие растения 60 2 отсутствие всходов

Таблица 15

Зффективность защить грибковьім штаммом .) 76 цветной капустьі, произрастающей в песчаной почве, зараженной грибком КПіг2осіюгіа взоїапі. 65 Вегетационное испьтание в теплице

Обработка г Процент появления Процент полностью здоровьх

Протравливание жидким составом У 76 в количестве 94,7 72,0 241 0,84 107 КОЕ/мл

Таблица 16

Зффективность защить грибковьім штаммом ./ 76 ячменя "Кивіава", произрастающего в песчаной почве, инокулированной грибком Ривагійт пімаІіє. Вегетационное испьтание на открьтом воздухе, с прикритием

Обработка Процентпоявления Процент полностью здоровьїх) МИндекс поражения (0) Сьрой вес, всходов растений - 3) г/репликацию пишних є: Ос НАС 75 Протравливание жидким составом .) 76 80,0 52,0 0,91 9,7

КЕ, ЛОбкКоє/мл

Протравливание жидким составом .) 76, 81,3 52,0 0,93 10,3 1ОбКОЕ/мл

Индекс поражения: д р (в) здоровне растения 1 незначительное поражение 2 сильное поражение сч

З отсутствие всходов 7 о

Таблица 17

Зффективность воздействия грибкового штамма .) 76 на грибок АгГегпагіа Бгаввісісоіа, поражающий цветную капусту. Результать! дань! в виде средних значений для зкспериментов, вьіполненньх при трех разньїх температурах (1570, 207"С и 257С) Ге)

Обработка Процент появления всходов Индекс поражения (0 - 3) Свьірой вес г/репликации. со нин т НН ПО НЄ со

Протравленнье жидким составом .) 76, 0,22 35,4 «г 106бКоє/мл -

Индекс поражения: (в) здоровне растения 1 незначительное поражение « 2 сильное поражение шщ с З погибшие растения или отсутствие всходов :з» Результать! зкспериментов по ввіявлению зффективности воздействия пяти штаммов Месігіа ріугодев по настоящему изобретению (У 76, ) 1431, МОБ 1 и КО5 2) на грибок Ризагішт ситогит, поражающий пшеницу, приведень! в таблице 18. Результать дань! в виде средних значений, полученньїх в двух зкспериментах, в одном ї» из которьїх в качестве субстрата использовали торф, а в другом - полевую почву. г» Таблица 18

Зффективность воздействия пяти штаммов Месігіа ріїугодев (у 76, у) 1431, ) 1432, МО5 1 и КО 2) на грибок Ризагіт ситогит поражающий бо пшеницу. Результать! дань! в виде средних значений для двух вегетационньїх испьтітаний (торф и полевая почва) о 20 Обработка Процент полностью здоровьх Индекс поражения (0 - 3) Сьірой вес, г/урепликацию растений

Фо

Протравливаниє жидким составом ./ 76, 73 107КОЕ/мл

Протравливание жидким составом . 1431, 0,51 8,5 10 7коє/мл

Ф) Протравливание жидким составом . 1432, 72 0,78 ка 10 7коє/мл

Протравливание жидким составом МОБ 1, 10 76 8,8 во ТКОЕ/мЛл

Протравливание жидким составом КОЗз 2, 76 8,3 10 7Ккоє/мл

Индекс поражения: б5 (в) здоровне растения

1 незначительное поражение 2 сильное поражение

З отсутствие всходов - (С) Характер воздействия штамма .) 76

Предварительньсе исследования характера воздействия штамма, / 76 в качестве антагониста других грибков производили с помощью микроскопа и лабораторньїх испьтаний.

Наблюдения под микроскопом позволили установить, что гифьї .) 76 взаймодействуют с грибком Р. сиштогит /0 "У первне отчетливо воспринимаемьсе реакции происходят очень бьістро. В местах соприкосновения мицелия клетки гифов грибка Ризагішт начинают разлагаться примерно через час после взаймодействия. Сначала клеточнье стенки теряют свою форму, затем исчезает содержимое клеток, и, наконец, полностью разлагаются клеточнье стенки. Процесс разложения гифов грибка Ризагіцт медленно распространяется. При вніращиваний смеси у 76 и Р. сцітогит в течение нескольких дней гифь! грибка Ризагт полностью пропадают. Под действием штамма .) 76 разлагаются также спорь зтого грибка (как конидии, так и хламидоспорьї), но медленнее, чем гифьі. Обьчно гифь штамма 9) 76 свободно обволакивают спорьі грибка Ризагішт до их разложения. Проникновение штамма .) 76 в гифьї грибка Ризагіцт не наблюдалось.

На оснований наблюдений под микроскопом биьл сделан вьівод о том, что штамм ./ 76 с орее всего вьіделяет в окружающую среду биологически активньіе вещества. По своей природе они могут бьіть подобньї ферментам їли антибиотикам. Действие штамма ./ 76 может бьіть связано с вьіработкой именно таких веществ, так как не бьіло обнаружено признаков его паразитирования на других грибках, и вследствие медленного роста он не может зффективно бороться за питательнье вещества. При вьіполнении испьітаний на целлофане бьіли также вьісказаньії предположения о вьіделений зтим грибком метаболитов, действующих на рост других грибков.

При вніращиваний штамма ./ 76 и Р. сштогит в непосредственной близости друг от друга на очень тонком сч ре субстрате формируется зона ингибирования, в которой прекращаеєтся рост грибка Ризагішт. На субстрате нормальной толщиньі такой зффект обнаружен не бьл. Зто, вероятно, связано с диффузией в субстрат (о) вьіделяемьх веществ в небольших концентрациях. Кроме того, бьіло установлено, что летучие вещества, вьіделяемье штаммом . 76, также замедляют рост грибка РЕ. ситогит.

МИспьітание на целлофане: На субстрат, необходимьій для роста, помещали целлофановую пленку, на Фу которой культивировали штамм У 76. После культивирования в течение 10 дней пленку вместе со штаммом У 76 удаляли. Вещества, вьіделеннье штаммом 476 и прошедшие через пленку, оставались в субстрате. В качестве 00 контрольньїх образцов использовали чашки, в которьие помещали целлофановую пленку без штамма .) 76. со

Результать! испиітания на целлофане приведень в таблице 19. « » - (р) Вьіполнение метода скрининг-теста и оценка полученньїх результатов

Испьгтания в песке «

Субстрат для посева

В качестве субстрата для посева использовали песок с размером зерен 0,2 - 0,7мм Кашпівіоп Бога Оу, З с Ї оїтаа). Песок увлажняли путем смешивания 4 частей песка с 1 частью водьі. Из матриць! последовательно з» расположенньіїх горшков (МеймМР 96), вьірезали пластину размером 5х7 горшков (емкостью 5Омл), которую помещали в пластиковьій ящик. Горшки наполняли увлажненньїм песком так, чтобьі он не доходил до верхнего края на 1 - 1,5см. В каждьй горшок вьісевали по три зерна яровой пшениць "І ціа".

Обработка те Заражение грибком Ризагішт сцІтогит. Грибок Р. сцітогит вьіращивали на чашках картофельного агара с їх декстрозой при комнатной температуре в течение 1 месяца (до полного спорообразования). Мицелий со спорами отделяли от чашки и смешивали с дистиллированной водой при помощи гомогенизатора со "Ультра-Турракс". Количество спор доводили до 10спор/мл. Зтот раствор замораживали в виде ЗОмл порций в (оо) 20 мешках "Мини-грип" до -207"С. Для проведения испьтаний замороженнье растворьі оттаивали и вновь с смешивали. Зтот раствор использовали как есть (основной раствор) и в виде разбавления до 10 7.

Патогенность штаммов Ризагішт сохраняли путем последовательного заражения им растений (семена пшениць инокулировали суспензией грибка Ризагіцт, после чего патоген вновь вьіделяли из пораженньмх ростков).

Суспензия антагониста. Пеллету картофельного агара с декстрозой, содержащую антагонист, брали из морозильной камерь!ї, делили на три части и помещали на три чашки картофельного агара с декстрозой. Чашки

ГФ) инкубировали при комнатной температуре (в темноте) в течение трех недель. Основной раствор суспензии 7 антагониста готовили путем соскабливания содержимого из двух чашек с оантагонистом в 5БОмл дистиллированной водьі. Полученную смесь перемешивали с помощью гомогенизатора "Ультра-Турракс". Из бо основного раствора готовили два раствора - разведения до 1071 и 103,

Обработка семян. На посеяннье в горшки семена с помощью пипетки наносили сначала 1мл суспензии ЕК. сцітогут, а затем їмл суспензии антагониста. 15 семян в пяти 5О0мл горшках обрабатьвали всеми шестью комбинациями суспензий с разной плотностью спор (два разведения суспензии Р. сцтогут х три разведения суспензии антагониста). 65 Контрольная обработка. Для тестирования одного грибка использовали пять горшков, в которье дополнительно вьісевали 15 семян и обрабатьівали только основньїм раствором испьітуемого грибка.

В испьтаниях на песке одновременно тестировали от 15 до 30 грибковьїх штаммов. В день начала испьітаний также производили посев в горшки, которье служили для проверки состояния семян и патогенности инокулята Р. сцтогит. Контрольнье семена, посеяннье в отдельную матрицу горшков, подвергали трем обработкам, которье включали; без инокуляции (только вода), инокуляцию основнь!м раствором РЕ. сиштогит и инокуляцию разбавленньм основньім раствором ЕЕ. сцітогит (10 72). Каждую их зтих трех обработок производили в отношений З0 семян, посеянньмх в 10 горшков.

Условия роста

После нанесения с помощью пипетки грибковьїх суспензий семена покрьівали увлажненньїм песком. Ящики с 70 горшками заворачивали в прозрачньй пластик и переносили в камеру для вниіращивания (температура 10" - 15"С, 14-часовой световой период).

Наблюдения

После вьращивания проростков в течение 16 - 18 дней их тщательно промьмшвали в проточной водопроводной воде и исследовали симптомь! болезни. Ростки, у которьїх корневне или колеоптильнье клетки 75 побурели, и непроросшие семена, оставшиеся твердьми, считались здоровьіми. Ростки с отчетливьми симптомами болезни и непроросшие семена, которне стали мягкими, бьіли признаньї больньіми.

Первьіми исследовали растения, подвергавшиеся контрольной обработке. Если из семян, обработанньх водой, развились только здоровье растения, и у семян, обработанньїх патогеном, наблюдались четко вьіраженнье симптомь! болезни, результать! испьітания считались действительньми и производилась проверка растений, обработанньїх грибковими штаммами.

При испьітаний в песке оценку, присваиваемую каждому вьіделенному грибковому штамму, определяли, исходя из количества обработанньїх им растений, которье оказались больньіми. Если всхожесть растений, обработанньїх испьітуемьм грибком, бьіла значительно меньше, чем у контрольньїх здоровьїх растений, или бьіли обнаружень! симптомь другой болезни, зтот грибок считался непригодньім для дальнейших исследований. су

Если поражения отсутствовали, каждую из шести комбинаций плотности спор патогена и спор испьтуемого грибка оценивали отдельно по следующей шкале: і)

О - все 15 растений здоровь! 1 - не более 2 пораженньїхх растений 2 - 3 - 5 пораженньїх растений Ге»!

З - 6 - 9 пораженньхх растений 4 - 10 - 13 пораженньїх растений со 5 - не более одного здорового растения с

На оснований шести вьшеуказанньх оценок вьібирали грибковье штаммь!, которье использовали на следующем зтапе испьтаний, т.е. в испьтаниях в торфе. Для последующих испьтаний бьіли отобрань! такие З штаммьї, которье не менее трех раз получали оценки 0 и 1. Если грибок не получил ни одной оценки Об, его «ф отбирали для последующих исследований, если он получал не менее четьірех раз оценку 1.

Испьїтания в торфе

Субстрат для виіращивания «

В качестве субстрата для вьиіращивания использовали пропаренньй, удобренньй и известкованньій торф. До 70 осени 1992 г. применяли непросеянньій неочищенньій торф из Торронсуо, а затем просеянньій неочищенньй - с торф из Зруахоки. (Внесение удобрений: 800г доломитовой извести и 100г удобрения У-Іаппоз/100л торфа ц (у-Іаппоз - в торговая марка, означающая финское универсальное удобрениеє). Увлажненньій торф помещали в "» пластиковьне ящики (28,5х49,5х9,4см, ящик "Маттиїй компаний УУеїрив Коривіа, Миоміупіута Оу) в виде слоя толщиной 5см. На дно ящика клали пластиковую пленку.

Обработка «г» Т - Здоровье, нейинокулированнье семена яровой пшениць "І ціа".

Полив производили дистиллированной водой. ве Е - Семена, инокулированнье грибком Р. сцітогут. Семена вьімачивали в основном растворе Р. сиштогит (ее) (раствор использовали в избьточном количестве), содержащем примерно 10бспор/мл (культивирование грибка со 50 Еивагішт сравни с испьтанием в песке). После обработки семена рассьшпали на бумаге и оставляли для вьісушивания на ночь. іЧе) ЕО - Инокулирование грибком ГР. сцтогит производили так же, как в случае обработки Р. Когда семена вьісьіхали, их смачивали основньім раствором антагониста. Основной раствор получали путем соскабливания мицелия и спор из одной чашки антагониста в 25мл дистиллированной водь». Обработку производили посредством встряхивания семян и раствора антагониста в маленькой пластиковой склянке. После обработки семена сушили на бумаге. о Е2 - Инокулирование грибком ЕР. сцтогит производили так же, как в случав обработки Р. Обработку іме) антагонистом вьіполняли так же, как в случае обработки РО, с использованием основного раствора антагониста, разбавленного до 107, 60 В торфе делали 10 рядков, в каждьй из которьїх вьісевали по 30 семян. Посев производили в следующей последовательности: защитньй ряд, ЕР, БО, Е2, Т, Е, РО, Е2, Т, защитньйй ряд. После посева семена покрьівали торфом, которьій увлажняли.

Условия роста

Посеяннье семена вьіращивали в теплице при температуре около 157С. В темное время года при помощи б5 лампьї с несколькими нитями накаливания создавали дополнительное освещение в течение 12 часов/день. При необходимости посеяннье семена смачивали водой. Период культивирования составлял 18 дней.

Сортировка

Ростки промьівали и определяли у них симптомь!ї болезни аналогично тому, как зто делали после испьітания в песке. На оснований результатов наблюдений, полученньїх после обработок Т и ЕР, принимали решение о достоверности испьтания. У здоровьх контрольньсх растений (Т) не допускалось наличие более 12 пораженньх растений (из 60 посеянньїх семян), а в контрольной группе (ЕР), зараженной патогеном, должно бьіло бьїіть не менее 52 пораженньїх растений (из 60 семян). Испьітуемьй грибковьій штамм считался приемлемьм для следующего зтапа испьітаний (опьіть! в полевой почве), если из семян (60 семян), обработанньїх раствором, имеющим одну из двух концентраций, развивалось не более 19 пораженньх растений. 70 Испьітания в полевой почве

Субстрат для посева.

Используемую почву (песчаная глина) брали с опьітного поля в Хокиойнене. Почву измельчали руками или (зимой 1992-1993 г.г.) просеивали через грохот с отверстиями размером 1хі1см. Пластиковье горшки емкостью 1,5л (диаметром 14см) заполняли почвой так, чтобьі верхний край оставался пустьім на вьісоту З - 4см. На дно 7/5 Горшка клали фильтровальную бумагу.

Обработка 1. Здоровне семена. Смоченнье только дистиллированной водой. 2. Контрольная группа, обработанная грибком Ризагішт. Семена смачивали инокулянтом Ризагіт (препарат, используемьй в испьтаниях в песке), содержащим 10 бспор/мл; зтот раствор использовали в избьточном Количестве. 3. Инокулирование, произведенное так же, как в контрольной группе, обработанной грибком Ризагічт. После вьісьїхания семян их обрабатьвали суспензией антагониста, которую получали путем смешивания мицелия и спор из одной чашки с 25мл дистиллированной водьі. Обработку производили в пластиковой склянке, куда помещали 130 семян (120 - 150 семян) и мл (или 1,5мл) суспензии антагониста. Га 4. Контрольная группа, обработанная фунгицидом. Инокулирование производили так же, как в контрольной группе, обработанной Еизагішт. После вьісьхания семена обрабатьвали 2г протравливающего порошка і) "Байтан 1" на один кг семян. Кроме того, производили ранее применявшиеся обработки составами "Серезан" и "Тайссато 5".

В горшки внісевали по 36 обработанньїх семян, по три дубликата на каждую обработку. Посеяннье семена Ге»! покрьвали полевой почвой. Условия роста бьли такими же, как при испьтании в торфе. Период культивирования составлял четьіре недели. со

Проверка и сортировка с

Ростки промьівали и оценивали у них симптомь! болезни:

О - полностью здоровье растения, З 1 « незначительное поражение грибком Ризагішт; «Її 2 хх от среднего до сильного поражения болезнью;

З - ростки полностью побурели - гибель растений.

Зффективность испьітаний в теплице «

Летом 1993 г. біл проведен один широкомасштабньій полевой опьіт по проверке метода скрининг-теста по 70 настоящему изобретению. В ходе зтого испьітания проверяли, правильно ли бьіли вьібраньї для дальнейшего - с тестирования грибковье штаммь, вьіделеннье во время серии опьтов, проведенньїх между октябрем 1991 г. и ц февралем 1993 г. Для обработки семян произвольно вьібирали 60 штаммов из тех, которье бьіли отвергнуть! "» при испьітаниях в песке, но не оказали патогенного воздействия на пшеницу. Из штаммов, забракованньх во время испьітаний в торфе, отобрали 92 штамма. Бьіли отобрань! все 58 грибков, использовавшихся во время

Миспьтаний в почве. 43 грибка бьіли забраковань! во время зтого испьітания и 15 бьіли отобрань! для полевьх «» опьтов.

Помимо вьішеуказанньїх 210 обработок испьтание включало б контрольньїх обработок: необработаннье е семена (К), протрав-ливание составом "Байтан 1" (В) и четьюфе грибковьїх штамма, исследованньіх в (ее) предьідущих испьітаниях, в том числе . 76.

В зтом испьтаний использовали пшеницу "І ціа", зараженную грибком РЕ. сцтогит естественньім путем. бо Наблюдения велись за рядом длиной 1,4м, в котором бьіло посеяно 5,5г семян. Для вьіполнения всех 216 (Че) обработок бьло посеяно шесть дублирующих рядов. Рендомизация достигалась с помощью кубической решетки зкспериментальной конструкции. Таким образом, уменьшали ошибочнье вариации, связаннье с почвенньмми факторами. Через пять недель после посева ростки вьжкапьшвали из почвьі, подсчитьівали и Моследовали симптомь! болезни.

Результать! испьтания иллюстрируют четьюре гистограммь!, приведеннье на рис. с За по За. Между о изолятами, забракованньми во время испьітания в торфе, и непатогенньіми изолятами, забракованньми во ко время испьітания в песке, не бьіло обнаружено никаких различий. Испьтание в торфе дало очень хорошие результатьі. Штаммь!, отобраннье после него для последующих испьітаний, бьіли в среднем гораздо лучше, чем бо отвергнутьсе в ходе испьттания грибки.

Во время испьітаний в песке и торфе неправильно бьіло забраковано всего несколько грибков. С другой сторонь, при испьітаний в почве бьіло отвергнуто достаточно большое количество очень хороших изолятов, но из тех изолятов, которьіе бьіли отобраньй для полевьїх опьітов, лишь два из 15 показали отрицательнье результать! в естественньїх условиях. 65 На оснований полученньїх результатов можно сделать вьвод о том, что испьтания в песке и торфе позволяют надежно отобрать лучшие антагонисть! для дальнейших исследований, а вот во время испьітаний в полевой почве могут бьіть забраковань! даже хорошие антагонисть.

Отборочньсе испьітания грибкового штамма ./ 1431

Из грибковьїх штаммов по настоящему изобретению штамм .) 1431 исследовали во всех трех отборочньх испьтаниях, виіполненньх в теплице.

При испьітаниий в песке штамм . 1431 получил оценки 0, 0, 1, 1, 1 и 2 и бьл отобран для последующих испьтаний.

При испьїтаниий в торфе с использованием штамма .) 1431 бьіли полученьї следующие результать!: т: З пораженньх растения то ЕР: 36 пораженньїх растений

РО: З пораженньх растения

Е2: 7 пораженньх растений

Во время испьітаний в полевой почве с использованием штамма ./ 1431 при вьіполнений разньїх обработок т бьіли полученьї следующие процентнье значений пораженньмх ростков: здоровне растения 6695 контрольная группа, обработанная грибком Ривзагійт 8795 протравливание составом "Байтан 1" 3195

У 1431 1995

На оснований отборочньїх испьітаний, проведенньїх летом 1993 г., штамм .) 1431 бьл отобран для полевьх опьтов вместе с 61 другим грибковьім штаммом. В зтом испьитаний использовали яровую пшеницу "І ціа", искусственно инокулированную суспензией спор грибка ЕР. сштогит. Семена вьісевали на однорядньїх делянках с (1,4м) при шестикратном дублирований зтого опьіта. Через 34 дня после посева ростки вьікапьвали из почвь, г) промьвали и определяли симптомь болезни. При разньїх обработках бьло получено указанное ниже количество здоровьїх ростков на метр ряда: контрольная группа, обработанная грибком Ривагійт 5 Ге) протравливание составом "Байтан 1" 56 со

У 76 61 у 1431 65 (ее) другие испитаннье штаммь 30 - 38 «

Отборочньсе испьітания грибкового штамма У 1432 Й

Штамм У 1432 исследовали во всех трех отборочньїх испьітаниях, вбіполненньх в теплице.

При испьттаний в песке 1432 получали оценки 0, 0, 0, 1, 1 и 2 и бьіл отобран для последующих испьтаний.

При испьїтаниий в торфе с использованием штамма .) 1432 бьіли полученьії следующие результать!: «

Т: 10 пораженньїх растений шщ с ЕР: 60 пораженньїх растений и РО: 10 пораженньїх растений "п » Е2 37 пораженньїх растений

Во время испьітания в полевой почве с использованием штамма у 1432 при разньїх обработках бьіли їз полученьії следующие процентнье значения пораженньмх ростков: т» здоровне растения 5695 о контрольная группа, обработанная грибком Ризагійт 9895 протравливание составом "Байтан 1" 1895 со 41432 3896 (Че) -

На оснований результатов испьітания в полевой почве штамм ./ 1432 бьіл изьят из полевьїх опьітов.

Микроорганизмьї, внесенньсе в банк данньх

На оснований Будапештского договора следующие микроорганизмь! бьіли внесеньї в банк данньїх по адресу 59 реМ-Юешцвейе Заттіцпд моп МіКгоогдапезтеп па 7ейКиМегеп ОСтрН, Мазепегодег МУед 15, 0-38124

ГФ) Брауншвейг, Германия. з щ б5

Claims (12)

Формула винаходу

1. Штамм гриба Месіга рігугодез Мопіадпе ОМ 7522, используемьїй в качестве биофунгицида.

2 2. Штамм гриба Месігла ріугодез Мопіадпе О5М 8805, используемьй в качестве биофунгицида.

3. Штамм гриба Месігіа ріугодез Мопіадпе ОЗМ 8806, используемьй в качестве биофунгицида.

4. Штамм гриба Месігла ріугодез Мопіадпе ОМ 8807, используемьйй в качестве биофунгицида.

5. Штамм гриба Месігіа ріугодез Мопіадпе ОЗМ 8808, используемьїй в качестве биофунгицида.

6. Биофунгицид, содержащий микроорганизм, отличающийся тем, что он содержит грибковьій штамм, 70 вьібираемьй из группьї, включающей грибковье штаммь! Месігіа ріугодез Мопіддпе ОБМ 7522 или Ю5М 8805 или Ю5М 8806 или ОМ 8807 или ОМ 8808.

7. Биофунгицид по п. б, отличающийся тем, что он дополнительно содержит наполнители и/или добавки/ обьічньсе в зтой области.

8. Биофунгицид по п. 7, отличающийся тем, что наполнители и добавки вьібирают из группьї, включающей 72 двуокись кремния, сухоє молоко, карбоксиметилцеллюлозу, сахарозу, аскорбиновую кислоту и крахмал.

9. Способ получения биофунгицида по п. 7 или 8, отличающийся тем, что включаєт вьиіращивание грибкового штамма по любому из пп. 1-5 в приемлемой ростовой среде, отделение клеточной массьі, добавление к ней наполнителей и/или добавок, вьісушивание и измельчение зтой массь! в порошок.

10. Способ получения биофунгицида по п. 7 или 8, отличающийся тем, что включаєт вьіращивание грибкового штамма по любому из пп. 1-5 в приемлемой среде вместе с двуокисью кремния и добавлениє, при желаниий наполнителей и/или добавок, внісушивание и измельчение зтой массь! в порошок.

11. Способ подавления грибковой инфекции у растений, включающий нанесение на растение или его семена или внесение в субстрат для роста растения биофунгицида, отличающийся тем, что используют биофунгицид по пп. 6-8. с 29

12. Способ скрининга фунгицидньїх микроорганизмов в образцах микробов, включающий следующие зтапь!: Го) (а) испьітание в песке, в соответствий с которьім семена зерновьїх культур внісевают в слой песка, на семена и субстрат пипеткой наносят мицелий и спорь! патогена, а затем спорь! испьітуемого грибка в водной суспензии, после чего семена покрьвают песком, через определенньій период времени проверяют интенсивность симптомов поражения ростков и отбраковьівают грибки, которье не повлияли на развитие болезни или сами о оказались патогенньми; й (Б) испьтание отобранньїх грибков в торфе, в соответствии с которьим семена со зерновьїх культур замачивают в суспензии спор патогена и сушат, а затем смачивают суспензией спор испьітуемого грибка, сушат и вьісевают а О'бработанньій паром торф, вьиращивают в течение определенного со периода времени, наблюдают за состоянием ростков и отбирают для последующих испьтаний изолять, «І однозначно подавляющие развитие болезни. «

-

. и? щ» щ» (ее) (ее) іЧе) іме) 60 б5