UA48149C2 - Спосіб інгібування активності фактора тканини, спосіб пригнічення відкладення тромбоцитів, спосіб пригнічення судинного рестенозу, спосіб лікування гострої закупорки коронарної артерії за допомогою модифікованого фактора vii - Google Patents

Abstract

Винахід стосується білків, які використовуються як антикоагулянти, зокрема модифікованих форм фактора VII, що інгібує згортання крові та тканинного фактора. Модифікований фактор VII втрачає здатність до активування факторів X або IX, завдяки чому ефектно розривається каскад згортання крові. Фармацевтичні композиції, що містять модифікований фактор VII, можуть використовуватись для лікування захворювань, пов’язаних з порушеннями системи згортання крові.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение является частичньмм продолжением заявки Мо 08/327,690, зарегистрированной 24 2 октября 1994 года, которая является частичньмм продолжением РСТ/ОЗ 94/05779, зарегистрированной 23 мая 1994 года и частичньмм продолжением заявки Мо 08/065,725, зарегистрированной 21 мая 1993 года, которая является частичньім продолжением РСТ/О592/01636 и заявки Мо 07/662,920, зарегистрированной 28 февраля 1991 года с передачей прав заявки Мо 08/164,666, каждая из которьїх специально включена здесь во всей своей полноте в виде ссьлок. 70 Область изобретения

Настоящее изобретение относится к белкам, используемьм в качестве антикоагулянтов. Более подробно, настоящее изобретение относится к модифицированньм формам Фактора МІІ, ингибирующим свертьівание крови и фактор ткани.

Предпосьілки к созданию изобретения 19 Свертьвание крови представляет собой процесс, включающий сложное взаймодействие различньх компонентов крови или факторов, которое, в конечном счете, приводит к образованию фибринового сгустка.

Обьічно компоненть крови, которье участвуют в том, что определяется как коагуляционньй "каскад", являются прознзимами или зимогенами, - знзиматически неактивньми белками, которье превращаются в протеолитические ферментьі при действии активатора, активированного фактора свертьвающей системь! крови. Факторь! свертьівания, которне подвергаются такому превращению, обьічно относятся к "активньм факторам" и обозначаются добавлением прописного индекса "а" (например, Фактор Ма).

Активированньїй Фактор Х ("Ха") необходим для превращения протромбина в тромбин, которьій затем на заключительной стадии образования фибринового сгустка превращаєт фибриноген в фибрин. Существуют две системь! или два метаболических пути, способствующих активации Фактора Х. "Внутренний метаболический с 29 путь" охватьваєт те реакции, которне приводят к образованию тромбина посредством утилизации факторов, Го) присутствующих только в плазме. Серия опосредованньїх протеазой реакций в итоге генерирует Фактор ІХа, которьій в сочетаний с Фактором МІШа расщепляет Фактор Х в Ха. Идентичньій протеолиз во "внешнем метаболическом пути" осуществляется Фактором Міїа и его кофактором, фактором ткани. Фактор ткани представляет собой связанньй с мембраной белок и обьічно не циркулирует в плазме. Однако при разрьве о сосуда он может образовьівать комплекс с Фактором Мііа для катализа активации Фактора Х или Фактора ІХ в «Її присутствии иона Сан и фосфолипида (Мететгвоп апа Сепіггу, Віоспет. 25: 4020 - 4033 (1986)). Несмотря на то, что относительное значение двух метаболических путей коагуляции в гемостазе остаєтся неясньім, в последниє (7 годь! бьіло найдено, что Фактор МІ и фактор ткани играют основную роль в регуляции свертьввания крови. Ге)

Фактор МІ является маркерньм гликопротейином плазмь), которьій циркулирует в крови в виде 325 одноцепочечного зимогена. Зимоген каталитически неактивен (МУШатв еї аї., у. Віої. Спет. 264: 7536 - 7543 в (1989); Као еї аї., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА. 85: 6687 - 6691 (1988)). Одноцепочечньій Фактор МІ! может бьть превращен Іп міо в двухцепочечньій Фактор Ма Фактором Ха, Фактором ХіІіа, Фактором ІХа или тромбином.

Фактор Ха считаєтся основньмм физиологическим активатором Фактора МІІ. Подобно некоторьім другим белкам « плазмь, включенньм в гемостаз, Фактору МІЇ для активности, связанной с гамма-карбоксилированием З многочисленньйх остатков глутаминовой кислоть), сосредоточенньіїх на амино-конце белка, необходим витамин с К. Зти гамма-карбоксилированнье глутаминовье кислотьї необходимь! для взаймодействия Фактора МІ! с з» фосфолипидами в присутствии ионов металла.

Превращение зимогенного Фактора МІ в активированную двухцепочечную молекулу происходит при расщеплении внутренней пептидной связи, расположенной примерно в середине молекульі. В человеческом

Факторе МІЇ сайт активационного расщепления находится при Аго 452-Пеїз5з (Надеп еї аїЇ., Ргос. Маї). Асай. е СІ. ОБА. 83:24122416 (1986);

Ге | ТНІт еї аї., Віоспет. 27: 7785 - 7793 (1988), обе работь! включень! здесь в виде ссьілок). Бьічий Фактор МІЇ активируется расщеплением по аналогичной связи Аго 452-МПеї5з (ТаКеуа еї аІ.,0О0ВІсЇ Спет. 263: 14868 - - - 14877 (1988)). В присутствимй фактора ткани, фосфолипидов и ионов кальция двухцепочечньй Фактор Ма «їз» 20 ограниченньім протеолизом бьістро активирует Фактор Х или Фактор ІХ.

Часто бьівает необходимьм селективно блокировать коагуляционньій каскад у пациента. Антикоагулянть, с такие, как гепарин, кумарин, производнье кумарина, индандиона или другие агентьї, могут бьіть использовань, например, при почечном диализе или в лечений тромбоза глубоких вен, коагулопатий потребления (ІС) и множества других медицинских нарушений. Например, обработка гепарином или зкстракорпоральная обработка 29 цитрат-ионом (0.5. Раїепі 4,500,309) могут бьіть использовань! при диализе, чтобьії предотвратить коагуляцию в

ГФ) ходе лечения. Гепарин используется также для предотвращения тромбозов глубоких вен у пациентов, подвергающихся хирургической операции. о Однако лечение гепарином и другими антикоагулянтами может иметь нежелательнье побочнье зффекть.

Все известньюе антикоагулянтьї, как правило, действуют по всему организму, а не специфично на сгусток. 60 Например, гепарин может вьізвать тяжелое кровотечение. Более того, имея время полувьіведения примерно 80 минут, гепарин бьістро исчезаєт из крови, тем самь/м, вьізьівая необходимость частого введения. Из-за того, что гепарин действует как кофактор антитромбина ПІ! (АТІЇ), а АТІЇІ бьістро убьівает при лечений БІС, бьівает очень трудно поддерживать надлежащую дозировку гепарина, что вьізьваєт необходимость продолжительного мониторинга АТІЇЇ и уровней гепарина. Гепарин также незффективен, если снижение АТІЇІ зкстремально. Кроме бо того, продолжительноє использование гепарина может усилить агрегацию тромбоцитов и понизить их количество и явиться одной из причин развития остеопороза. Производнье индандиона также могут иметь побочнье токсические зффекть.

Бьіло найдено, что, кроме антикоагулянтов, кратко описанньїх виіше, некоторне природнье белки обладают антикоагулянтной активностью. Например, Кеціеіпозрегдег (0.5. Раїепі Мо 4,736,018) вьіделил антикоагулянтнье белки из бьічьей аорть! и сосудов Человеческой пупочной вень. МакКі и др. (0.5. Раїепі Мо 4,732,891) открьіли антикоагулянтнье белки в человеческой плаценте. Кроме того, в качестве терапевтического антикоагулянта бьіл предложен АТІ (ЗспіІррег еї аІ., І апсеї 1 (8069): 854 - 856 (1978); догаап, 0.5. Раїепі

Мо 4,386,025; Воск еї а!., 0.5. Райепі Мо 4,517,294). 70 Пролиферация клеток гладкой мьішць (ЗМСз5з) сосудистой стенки является важньм собьтием при возникновений сосудистьїх поражений при атеросклерозе, после восстановления сосудов или в ответ на другие сосудистье повреждения. Например, лечение атеросклероза часто включает в себя очищение закупоренньх сосудов ангиопластикой, зндартероктомией или редукционной атерзктомией, или имплантацией шунтов, - хирургические процедурь, при которьїх атеросклеротические бляшки спрессовьшваются или удаляются /5 посредством катетеризации (ангиопластика), удаляются с артериальной стенки посредством рассечения (зндартерзктомия) или шунтируются природньіми или синтетическими имплантатами. Зти процедурь! удаляют сосудистьій зндотелий, нарушают находящуюся под ним внутреннюю оболочку (интиму) и приводят к гибели медиальньїх 5МСв. Повреждение сопровождаєтся пролиферацией медиальньх ЗМС5 и миграцией их во внутреннюю оболочку, что характерньмм образом проявляется в первье недели и вплоть до шести месяцев 2о после повреждения и прекращается, когда происходит восстановление поверхностного зндотелиального слоя.

У людей зти повреждения составляют примерно 20905 клеток и 8095 внеклеточного матрикса.

Примерно у 3095 пациентов и более, подвергшихся ангиопластике, зндартерзктомии или шунтированию, тромбоз и/или пролиферация 5МСз во внутреннюю оболочку вьізьшвает повторное слипание сосуда и в результате зтого несостоятельность восстановительной хирургии. Такое закриьтие сосуда после хирургического с ге Ввмешательства известно как рестеноз.

Все еще существует необходимость в созданий улучшенньїх составов с антикоагулянтной активностью, і) которье могут бьіть введень в сравнительно низких дозах и не дают нежелательньїх побочньїх зффектов, присущих традиционньїм антикоагулянтам. Настоящее изобретение реализует зту необходимость, обеспечивая антикоагулянть!, которье действуют специфически в сайтах повреждения и дополнительно обеспечивают б зо друге родственнье преимущества.

Сущность -

Приготовленьі нове составь, включающие модифицированньй Фактор МіЇ, обладающие п антикоагулянтньіми свойствами. Составь! с модифицированньім Фактором МІЇ ингибируют также фактор ткани.

Последовательность Фактора МІ имеет, по крайней мере, одну аминокислотную модификацию, которая со з5 Вьібрана таким образом, что существенно снижает способность активированного Фактора МІ! катализировать «г активацию плазматических Факторов Х или Хі и, вследствие зтого, возможность ингибировать свертьвающую активность. Новьій Фактор МІЇ имеет активньій центр, модифицированньій заменой, по крайней мере, одной аминокислотьі и в своей модифицированной форме способен связьшвать фактор ткани. Для составов модифицированного Фактора МІ! типичной является в значительной степени чистая форма. «

Составь! изобретения особенно полезньї для лечения больньїх, когда превращень в фармацевтические в с составь, которье могут бьіть дань пациентам, страдающим от различньїх болезней, чтобьі лечить связаннье с . коагуляцией состояния. Такие молекульї! модифицированного Фактора МІЇ, способнье связьввать фактор ткани, а но имеющие значительно сниженную способность катализировать активацию других факторов в свертьвающем каскаде, могут обладать более длительньм периодом полувьведения из плазмь и, вследствие зтого, соответственно большей продолжительностью периода противосвертьвающей активности по сравнению с ї5» другими антикоагулянтами. Среди медицинских показаний для составов изобретения есть те, которье обьічно лечат антикоагулянтами, такие, как, например, тромбоз глубоких вен, легочная змболия, удар, коагулопатия со потребления (0ІС), отложения фибрина в легких и почках, связаннье с грам-отрицательной зндотоксемией, и - инфаркт миокарда. Составь! могут бьіть использованьії для подавления сосудистого рестеноза, возникающего 5р после механического повреждения сосуда, такого, как повреждение, вьізванное баллонной ангиопластикой, о зндартерзктомией, редукционной атерзктомией, установкой стента, лазерной терапией или иссечением

Ге распадающейся ткани, или возникающего дополнительно к сосудистьм имплантатам, стентам, шунтам или трансплантатам органов. Составьі могут бьіть использованьь для подавления отложения тромбоцитов и связанньїх с зтим нарушений. Метод подавления коагуляции, сосудистого рестеноза или отложения вв тромбоцитов состоит во введений пациенту состава, включающего в себя модифицированньй Фактор МІ, имеющий, по крайней мере, одну замененную аминокислоту в каталитической триаде Зег344, Азр242 и Нів193 в (Ф, количестве, достаточном для зффективного подавления коагуляции, сосудистого рестеноза или отложения ка тромбоцитов. Метод также находит применение в лечении острой закупорки коронарной артерии у больного и состоит во введений модифицированного Фактора МІІ, которьій включаєет в себя ОЕБЕСК-Фактор МІ! в сочетаний с бо активатором тканевого плазминогена (РА) или стрептокиназой и может ускорять ІРА-индуцированньй тромболиз.

Характерно, что фармацевтические составьь для введения людям будут состоять из белка модифицированного Фактора МІ и фармацевтически приемлемьїх носителей и буферов.

В приведенньїх воплощениях человеческого и бьічьего Фактора МІЇ остаток бЗег344 в активном центре 65 модифицирован, заменен на Су, Меї, Тиг или, предпочтительнее, на Аа. Такая замена может бьіть сделана отдельно или в комбинации с заменой(нами) в других сайтах каталитической триадь, которая включает Азр242 и Нівз193.

В другом аспекте изобретение связано с полинуклеотидной молекулой, состоящей из двух оперативно связанньїх областей кодирующих последовательностей, которье кодируют соответственно пре-пропептид и діа-домен витамин К-зависимого плазматического белка и лишенньій діа-домена белок Фактора МІ, при зкспрессии упомянутьій полинуклеотид кодирует молекулу Фактора МІЇ, которая не активирует в достаточной степени плазматические Факторь Х или ІХ, но способна связьівать фактор ткани. Молекула модифицированного

Фактора МІІ, зкспрессированная зтим полинуклеотидом, является биологически активньїм антикоагулянтом, т.е. способна подавлять коагуляционньй каскад и, следовательно, образование отложения фибрина или сгустка. С 7/0 Челью зкспрессий модифицированного Фактора МІ! молекула полинуклеотида трансфицируется в линии клеток млекопитающих, такие, как, например, ВНК, ВНК 570 или ВНК 293.

Краткое описание рисунков.

Фиг. 1 иллюстрирует конструкцию зкспрессионного вектора с последовательностью ДНК для Фактора МІ с модификацией Зегз44 на Аа. ИЙИспользованьії символь! 0-1, последовательность единицьі картирования 0-1 /5 аденовируса 5; Е, ген-знхансер (усилитель) вируса ЗМ40; МІ Р, основной поздний промотор; 55, набор сайтов сплайсинга; и рА, сигнал полиаденилирования от З5М40 в поздней ориентации.

Фиг. 2 показьівает влияние струйного введения ОЕСК-Фактора Ма на образование тромба (отложение тромбоцитов) на зндартерзктомизированной аорте бабуина по сравнению с обработанньми физиологическим раствором контролями. Артерии измеряли через 60 минут. На данной модели острого сосудистого повреждения примата ОЕОК-Фактор Мііа заметно подавлял развитие обогащенньїх тромбоцитами тромбов.

Фиг. З показьівает результатьї, полученнье при инкубации клеток гладкой мьішць! бабуина с возрастающими концентрациями или ЕМііа (незакрашеннье квадрать)), или ОЕЄЕОК-ЕМіІІа в присутствиий постоянного количества

ЕМІПа (5нМ) (закрашеннье квадрать). Уровень активациий ЕХ бьл затем определен с использованием хромогенного субстрата 5-2222. Даннье представлень в виде амидолитической активности, а именно как с об процент от активности, генерированной в присутствиий только 57НМ ЕМІПа.

Фиг. 4 изображает размер площади внутренней оболочки после зндартерзктомии сонной артерии бабуина и і) обработки с ОЕСК-Фактором МііІа в течение 7 или 30 дней по сравнению с контрольнь!ми животньми.

Фиг. 5 показьівает отношение площади внутренней оболочки к сумме площадей внутренней и медиальной оболочки бедренной артерии бабуина после баллонного повреждения и обработки ОЕСК-Фактором Міа, б зо Контрольная группа включала 5 сосудов, при 7-дневной обработке обследованьі 11 сосудов, при ЗО-дневной обработке обследованьї 2 сосуда (п - число обследованньйх сосудов). -

Описание специфических воплощений. «-

Новьій модифицированньй Фактор МІЇ, имеющий антикоагулянтную активность, обеспечивается настоящим изобретением. Модифицированньій Фактор МІЇ может бьіть в форме зимогена (т.е. одноцепочечной молекуль)) со

Зб МлИ может бьіть расщеплен в активационном сайте. Таким образом, понятие "модифицированньій Фактор МІ!" «Е включаєт в себя модифицированньй Фактор МІЇ и молекульь модифицированного Фактора Мііа, которье связьшвают фактор ткани и подавляют активацию Фактора ІХ в ЇХа и Фактора Х в Ха. Составь модифицированного Фактора МІ пригодньї для введения различньм млекопитающим, особенно человеку, с целью ингибирования коагуляционного каскада. Модифицированньй Фактор МІ может бьіть введен пациенту в « сочетаниий с другими антикоагулянтами или вместо них. в с Фактор МІЇ играет важную роль в коагуляционном каскаде, особенно важньм является включение его во внешний метаболический путь. Присутствуя в циркулирующей плазме в виде неактивного одноцепочечного ;» проферментного белка и подвергнувшись активации, Фактор Ма в сочетаним с фактором ткани и ионами кальция активирует Фактор Х в Ха и Фактор ІХ в ЇХа с возможньім образованием фибринового сгустка.

Настоящее изобретение обеспечивает возможность подавлять зту последовательность собьтий в ї5» коагуляционном каскаде, предотвращая или иньім образом ингибируя активацию Факторов Х и ЇХ с помощью

Фактора Мііа. Белок Фактора МІЇ зтого изобретения имеет каталитический центр, которьій модифицирован таким со образом, чтобь! снизить каталитическую активность Фактора Мііа, но сохранить способность связьувать фактор - ткани. Молекула модифицированного Фактора МІ конкурирует с нативньм Фактором Мі и/или Міа за связьвание с фактором ткани. В результате подавляется активация Факторов Х и ЇХ. о В одном аспекте настоящего изобретения каталитическая активность Фактора Ма подавляется химической

Ге дериватизацией каталитического центра, или триадь. Дериватизация может бьть осуществлена взаймодействием Фактора МІ с необратимьм ингибитором, таким, как фосфорорганическое соединение, сульфонилхлорид, пептидсодержащий галометилкетон или азапептид, или, например, ацилированием. дв Предпочтительнье пептидхсодержащие галометилкетонь! включают РРАСК (0-РНе-Рго-Агд-хлорметилкетон; см.

Ц.5. Раїепі Мо 4,318,904, включенньій здесь в виде ссьілки), О-Рпе-Рпе-Аго- и Рпе-РПпе-Агод-хлорметилкетон; и

Ф) рЕОСКсК (Бапзу!І-СІШ-СіІу-Агд-хлорметилкетон). ка В другом аспекте, каталитическая активность Фактора Ма может бьть также подавлена замещением, введением или удалением аминокислот. В представленньїх воплощениях заменьі аминокислот производятся в бо аминокислотной последовательности каталитической триадь! Фактора МІЇ, определяемой здесь как область, содержащая аминокислоть, которне способствуют активности каталитического сайта Фактора Ма. Замещения, введения или удаления в каталитической триаде обьічно производят по аминокислоте, которая входит в каталитическийи сайт или находится по соседству с ней. В белках человеческого и бьічьего Фактора МІЇ аминокислотами, образующими каталитическую "триаду", являются Зег з44, Авродо И Нівзчоз (нижний цифровой 65 индекс указьівает положение в аминокислотной последовательности). Каталитические сайть! Фактора МІ! других видов млекопитающих могут бьіть определень! с использованием доступной техники, включая, помимо других,

вьіделение белка и анализ аминокислотной последовательности. Каталитические сайть! могут бьіть также определеньі удлинением последовательности в присутствии других серинпротеаз, особенно химотрипсина, активньій центр которого расшифрован ранее (5ідіег еї аї., У. Мої. Віої. 35: 143 - 164 (1968), включено здесь

В виде ссьлки), устанавливая с помощью упомянутого удлинения аналогичнье аминокислотнье остатки активного центра.

Замещения, введения или удаления аминокислот производятся таким образом, чтобь! предотвратить или иньім способом подавить активацию Факторов Х и/или Х Фактором Ма. Модифицированньїй таким способом

Фактор МІ! должен, однако, сохранять способность конкурировать с аутентичньім Фактором МІЇ и/или Фактором 7/0 Ма за связьивание с фактором ткани в коагуляционном каскаде. Такая конкуренция легко определяется посредством, например, анализа свертьіваемости крови, как здесь описано, или анализом конкурентного связьшвания с использованием, например, клеточной линии, имеющей поверхностно-связанньій фактор ткани, такой, как клетки человеческой карциномь! мочевого пузьіря линии 982 (Закаї еї аї., У. ВіоЇ. Спет. 264: 9980 - 9988 (1989), включено здесь в виде ссьІлки).

Аминокислоть), которье образуют каталитический сайт Фактора МІІ, такие как Зегзли, Авроло МИ Нівчоз человеческого и бьчьего Фактора МІ, могут бьть или заменень, или удалень». В рамках настоящего изобретения предпочтительнее изменить только одну аминокислоту, сводя таким образом к минимуму вероятность усиления антигенности молекуль! или подавления ее способности связьівать фактор ткани, однако могут бьіть сделаньї изменения двух или более аминокислот (заменьї, добавления или удаления), а также могут проводиться сочетания заменьцн), добавления(ий) и удаления(ий). В избранном воплощений для человеческого и бьічьего Фактора МІ! предпочтительнее замена Зег на Аа, но могут бьіть замененьі Су, Меї, Тиг или другие аминокислотьї. Предпочтительно заменить Азр на Си и Ніз на І уз или Аг. В общем, замена подбирается таким образом, чтобьії как можно меньше разрушать третичную структуру белка. Модель Дайхоффа и др. (в Атласе структурь! белка 1978, Май. Віотед. Кез. Гошпа, Вашингтон, Колумбия), включенная здесь в виде ссьілки, может сч бьіть использована в качестве руководства по вьібору других аминокислотньїх заместителей. Можно внести изменение, как описано вьіше, в каталитический сайт соответствующей последовательности Фактора МІ і) человека, бьіка или другого вида и тестировать полученньій белок на подавление каталитической активности и возникающую антикоагулянтную активность, как здесь описано. Для модифицированного Фактора МІ каталитическая активность будет существенно снижена, обьічно она составляет менее 595 от каталитической Ге! зо активности соответствующих образцов Фактора МІ! дикого типа, преимущественно менее 1905.

Белки настоящего изобретения могут бьїть полученьії с использованием техники рекомбинантной ДНК. В - общем, клонированная последовательность ДНК Фактора МІ! дикого типа модифицируется, чтобьі кодировать «- желаемьій белок. Зта модифицированная последовательность затем встраийвается в зкспрессионньй вектор, которьй, в свою очередь, трансформируется или вносится в клетки хозяина. Клетки вьісших зукариот, особенно со з5 Культивированнье клетки млекопитающих, являются предпочтительньми в качестве клеток хозяина. Для «г человеческого Фактора МІ! известнь! полньєе нуклеотидная и аминокислотная последовательности. См. 0.5. Раї.

Мо 4,784,950 (которьій включен здесь в виде ссьІлки), где описаньі клонирование и зкспрессия человеческого рекомбинантного Фактора МІІЇ. Последовательность бьічьего Фактора МІ! описана в работе ТакКеуа еї аї., 9. Віої.

Спет. 263: 14868 - 14872 (1988), которая включена в виде ссьІлки. «

Изменения аминокислотной последовательности могут бьїть осуществленьії различньми методами. Для в с модификации последовательности ДНК используют сайт-специфичньій мутагенез. Методьі! сайт-специфичного мутагенеза хорошо известньі и описаньі), например, Золлером и Смитом (ДНК 3: 479 - 488 (1984)). Таким ;» образом, используя нуклеотиднье и аминокислотнье последовательности Фактора МІ можно осуществить изменения по вьібору.

Фактор МІЇ, модифицированньій в соответствии с настоящим изобретением, включает в себя те белки, у ї5» которьїх амино-концевая область (діа-домен) заменена діа-доменом одного из витамин К-зависимьсмх плазматических белков Фактора ІХ, Фактора Х, протромбина, белка С, белка 5 или белка 7. діа-Доменьі витамин со К-зависимьїх плазматических белков характеризуются наличием остатков гамма-карбоксиглутаминовой кислоть - и обьічно имеют протяженность от примерно ЗО до 40 аминокислот с С-концами, подобньми положениям на границах зкзон-интрон соответствующих генов. Методь! получения Фактора МІ! с гетерологичньм діа-доменом пи раскрьть! в О.5. Раїепі Мо 4,784,950, включенном здесь в виде ссьІлки.

Ге Последовательности ДНК для использования в рамках настоящего изобретения будут типично кодировать пре-пропептид на аминоконце белка Фактора МІ для установления надлежащего посттрансляционного процессинга (например, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоть) и секрециий из дв Клетки-хозяина. Пре-пропептид может бьїть таким, как в Факторе МІІ, или другим витамин К-зависимьм плазматическим белком, таким, как Фактор ЇХ, Фактор Х, протромбин, белок С или белок 5. Как признают (Ф, специалисть!, могут бить осуществленьї дополнительнье модификации аминокислотной последовательности ка модифицированного Фактора МІІ, которше не ослабляют существенно способность белка действовать в качестве антикоагулянта. Например, Фактор МІЇ, модифицированньій по каталитической триаде, может бьть бо также модифицирован и по сайту активационного расщепления с целью ингибировать превращение зимогенного Фактора МІ в его активированную двухцепочечную форму, как описано в О.5. Раїепі 5,288,629, включенном здесь в виде ссьІлки.

Зкспрессионнье векторь! для использования в осуществлениий настоящего изобретения будут включать в себя промотор, способньій направлять транскрипцию клонированного гена или кКДНК. Предпочтительньіми 6в5 промоторами для использования в культуре клеток млекопитающих являются вируснье и клеточнье промоторь. Вируснье включают промотор от 5М40 (З!иргатапі! еї аїЇ., Мої. Се ВіоЇ. 1: 854 - 864 (1981); и промотор от СММ (цитомегаловируса) (Возпай еї аї., Се 41: 521 - 530 (1985)). Особо предпочтительньм вирусньім промотором является основной поздний промотор аденовируса 2 (Кацїтап апа ЗпНагр, Мої. Сеї| Віо!. 2: 1304 - 1319 (1982)). Клеточнье промоторьї включают мьішиньїй каппа-промотор (Ведтанп еї аї., Ргос. Маїй!. Асад.

СІ. ОБА 81: 7041 - 7045 (1983)) и мьішИиньЬй му промотор (Гой еї аї., Сеї! 33: 85 - 93 (1983)). Особо предпочтительньїм клеточньім промотором является мьішиньій металлотионеиновьїй промотор І (РаїІтНег еї аї.,

Зсіепсе 222: 809 - 814 (1983)). Зкспрессионнье вектору могут также содержать набор сайтов сплайсинга РНК, расположенньїх по ходу транскрипции от промотора и против хода транскрипции от сайта включения для последовательности Фактора МІ. Предпочтительнье сайтьі сплайсинга РНК могут бьїть получень! из /о аденовирусов й/или генов иммуноглобуллина. В зкспрессионном векторе содержится также сигнал полиаденилирования, расположенньй по ходу транскрипции от сайта включения. Особо предпочтительнье сигнальї полиаденилирования включают ранний или поздний сигнал от 5М40 (Кашцїтап апа Зпагр, там же), сигнал полиаденилирования из области ЕІ аденовируса 5, терминатор гена человеческого гормона роста (Ое

Моїо ег аї., Мисі. Асіаз Кев. 9: 3719 - 3730 (1981)), сигнал полиаденилирования гена человеческого Фактора 7/5. Мі или гена бьічьего Фактора МІЇ. Зкспрессионнье векторьі могут также включать некодирующую вирусную лидерную последовательность, такую, как у аденовируса 2, расположенную между промотором и сайтами сплайсинга РНК; знхансернье последовательности, такие, как знхансер от 5М40.

Клонированнье последовательности ДНК вводятся в культуру клеток млекопитающих, например, опосредованной фосфатом кальция трансфекцией (УМІдіег еї аї., СеїІ 14: 725 - 732 (1978); Согзаго апа Реагзгоп, 2о ЗотайНс Се! Сепейсз /: 603 - 616, 1981; ОСгапат апа Мап дег ЕБ, Мігоїюду 524: 456 - 467 (1973)) или злектропорацией (Мецтапп еї аі., ЕМВО 3. 1: 841 - 845 (1982)). Для идентификации и отбора клеток, зкспрессирующих зкзогенную ДНК, в клетки, наряду с основньім геном или кКДНК, обьічно вводится ген, которьй определяет селектируемьй фенотип (селектируемьй маркер). Предпочтительнье селектируемье маркерь включают геньі), которье определяют устойчивость к таким препаратам, как неомицин, гигромицин и с об метотрексат. Селектируемьй маркер может бьть амплифицируемьм селектируемьм маркером.

Предпочтительньм амплифицируемьм селективньм маркером является последовательность і) дигидрофолатредуктазьї (ОНЕК). Селектируемье маркерьі рассмотреньь Тилли (Технология клетки млекопитающих. Вийепмогй Рибріїзпеге, Стонхем, Массачусетс; включено здесь в виде ссьілки). Вьібор селектируемого маркера доступен для обьічного специалиста. б зо Селектируемье маркерь могут бьїть введень в клетку в отдельной плазмиде в одно и то же время с основньм геном или могут бьть введень в одной с ним плазмиде. При расположениий в одной и той же - плазмиде селектируемьй маркер и основной ген могут контролироваться различньмми промоторами или одним -/- де и тем же промотором, последняя схема дает дицистронную единицу генетического кода. Конструкции зтого типа известнь! специалистам (например, І еміпзоп апа Зітопзеп, О.5. Раїйепі 4,713,339). Полезньім может бьіть также со прибавление дополнительной ДНК, известной как "носитель ДНК", к смеси, которая вводится в клетку. «Е

После введения ДНК в клетки они растут в подходящей ростовой среде, обьічно 1 - 2 дня, до начала зкспрессии целевого гена. Йспользованньій здесь термин "подходящая ростовая среда" обозначает среду, содержащую питательнье и др. компонентьї, необходимье для роста клеток и зкспрессии гена модифицированного Фактора Мі. Среда обьчно включаєт источники углерода, азота, незаменимье « аминокислоть, углеводь, витаминь, соли, фосфолипидь, белок и факторьі роста. Для продукции в с гамма-карбоксилированного модифицированного Фактора МІ! среда будет содержать витамин К, желательно в концентрации 0,1 - 5 мкг/мл. Затем проводится подбор препаратов для селекции клеток, которье устойчиво ;» зкспрессируют селектируемьй маркер. Для клеток, которье бьли трансфицированьї амплифицируемьм селектируемьмм маркером, концентрация препарата может бьіть повьішена, чтобь! отобрать большее число Копий клонированньїх последовательностей, тем самьм повьішая уровни зкспрессии. Затем клоньї устойчивьх їх трансфицированньїх клеток скринируются на зкспрессию модифицированного Фактора МІ.

Предпочтительнье линии клеток млекопитающих для использования в настоящем изобретении включают со клетки СО5-1 (АТСС СКІ 1650), клетки почек новорожденного хомяка (ВНК) и 293 (АТОС СК. 1573; Стапат еї - аІ., У. СіІІп. Мігої. 36: 59 - 72 (1977)). Предпочтительной линией клеток ВНК является штамм ік 7 і813 (У/аесніег апа Вазегде, Ргос. Май. Асад. сі. ОА 79: 1106 - 1110 (1982), включено здесь в виде ссьілки), в дальнейшем е отнесенньій к ВНК 570. Линия клеток ВНК 570 зарегистрирована в Американской коллекции типов культур (Че) (АТСС), 12301 Рагкіажп Ог., Роквилль, Мзриленд 20852, под номером СКІ. 10314. Линия клеток ВНК ІК (813 также известна в АТСС под номером СК! 1632. Кроме того, в рамках настоящего изобретения могут бьїть использовань! и другие клеточнье линии, включая клетки Каї Нер І (гепатома крьісьі; АТСС СК 1600), клетки

Каї Нер ІІ (гепатома крьісьі; АТОС СК 1548), клетки ТСМК (АТСС СС. 139), клетки легких человека (АТСС НВ 8065), клетки МСТС 1469 (АТС СС 9.1), клетки СНО (АТСС СС 61) и клетки ОЮКХ (паць апа Спавіп, Ргос. о Майк. бос. 5сі. ОБА 77: 4216 - 4220 (1980). іме) В рамках настоящего изобретения для получения модифицированного Фактора МІ может бьть использована технология трансгенньїх животньїх. Предпочтительнее продуцировать белки в молочньїх железах бо самок млекопитающих. Зкспрессия в молочной железе и последующая секреция целевого белка в молоко преодолевают многие трудности, связаннье с вьіделением белков из других источников. Молоко легко собирается, доступно в больших количествах и хорошо охарактеризовано биохимически. Более того, основнье белки молока присутствуют в нем в вьісоких концентрациях (обьічно 1 - 15г/л). С коммерческой точки зрения очевидно, что предпочтительнее использовать в качестве хозяина видьі, которье дают большое количество б5 молока. В то время, как могут использоваться мелкие животньсе, такие, как мьіши и крьсь (которне являются предпочтительньми при подтверждении принципиального зтапа), в рамках настоящего изобретения предпочтительнее использовать домашних млекопитающих, включая (но не только) свиней, коз, овец и крупньй рогатьй скот. Овцьі являются особо предпочтительньми благодаря таким факторам, как предшествующая история трансгенеза у зтого вида, вьіход молока, стоимость и вьісокая доступность оборудования для сбора овечьего молока. Для сравнения факторов, влияющих на вьібор вида хозяина см. ММІРО Рибіїсайоп. У/О 88/00239. Обьічно желательно вьібирать ту породу животного-хозяина, которая разводится для получения молока, такую, как овца породь Еазі Егіезіапа, или интродуцировать молочную породу размножением трансгенной линии на более позднем зтапе. В любом случае должно использоваться известное животное и в хорошем состоянии. 70 Для получения зкспрессии в молочной железе используют промотор гена молочного белка. Группу генов молочного белка составляют геньії, кодирующие казейин (см. О.5. Раїепі Мо 5,304,489, включенньй здесь в виде ссьІлки), бета-лактоглобулин, альфа- лактоглобулин и кисльій белок сьіворотки. Предпочтительньмм является промотор бета-лактоглобулина. В случае гена овечьего бета-лактоглобулина, как правило, будет использована проксимальная 5'і-рланкирующая последовательность из 406 нуклеотидов, хотя предпочтительньми являются /5 более значительнье фрагменть! 5-фланкирующей последовательности, примерно до 5 тьс. нуклеотидов, такие, как сегмент ДНК в 4.25 тьіс. нуклеотидов, окружающий 5'-рланкирующий промотор и некодирующую часть гена бета-лактоглобулина. См. МУпІеїам/ еї аї., Віоспет. 9. 286: 31 - 39 (1992). Применимь также и подобнье фрагменть! промоторной ДНК других видов.

Другие области бета-глобулинового гена могут также включаться в конструкцию, т.к. могут Зкспрессироваться геномньсе области гена. Принято считать, что, например, конструкции, лишеннье интронов, зкспрессируют плохо по сравнению с теми, которне содержат такие последовательности ДНК (см. Вгіпзаег еї аї.,

Ргос. Май. Асад. сі. ОБА 85: 836 -8 40 (1988); РаїтКег еї аїЇ., Ргос. Май. Асад. сі. ОБА 88: 478 - 482 (1991); МУпІеїам еї аї., Тгапздепіс Кев. 1: З - 13 (1991); МО 89/01343; и МО 91/02318, каждьйй включен здесь в виде ссьілки). В зтом отношений обьчно о предпочтительно использовать, где возможно, геномнье с последовательности, содержащие все или некоторне нативнье интронь! гена, кодирующего целевой белок или о полипептид, следовательно, дополнительное включение, по крайней мере, некоторьїх интронов, например, из бета-лактоглобулинового гена, является предпочтительньім. Одной из таких областей служит сегмент ДНК, которьій обеспечиваєт сплайсинг интрона и полиаденилирование РНК от 3-некодирующего участка гена овечьего бета-лактоглобулина. При замене на природнье 3-некодирующие последовательности гена зтот (зу зо овечий бета-лактоглобулиновьй сегмент может как усилить, так и стабилизировать уровни зкспрессии целевого белка или протеина. В рамках других воплощений область, окружающая АТО инициации модифицированного -

Фактора МІІ, заменяется соответствующими последовательностями гена специфического белка молока. Такая «- замена обеспечивает предполагаемое ткане-специфическое инициационное окружение для того, чтобьі усилить зкспрессию. Удобно заменить полностью пре- про- и 5і-некодирующие последовательности модифицированного со

Фактора МІ! последовательностями, например, гена ВІ С, хотя можно заменять и меньшие области. «Е

Для зкспрессий модифицированного Фактора МІ у трансгенньїх животньїх сегмент ДНК, кодирующий модифицированньй Фактор МІЇ, оперативно связьівается с дополнительньіми сегментами ДНК, необходимь!ми для его зкспрессии, чтобьі образовать зкспрессионньіе единицьі. Такие дополнительнье сегменть! включают вьішеупомянутьйй промотор, а также последовательности, которне обеспечивают терминацию транскрипции и « полиаденилирование мРНК. Зкспрессионнье единиць! затем будут включать сегмент ДНК, кодирующий ств) с секреторную сигнальную последовательность, оперативно связанную с сегментом, кодирующим модифицированньй Фактор Мі. Секреторная сигнальная последовательность может бьть ;» последовательностью нативного Фактора МІЇ или какого-либо другого белка, такого, как белок молока. См., например, моп Неїпіе, Мисі. Асідв Кевз. 14: 4683 - 4690 (1986); Меаде еї а, 0.5. Раїепі Мо 4,873,316, Которне включень здесь в виде ссьлок. ї5» Конструирование зкспрессионньїх единиц у трансгенньх животньїх удобно осуществлять включением последовательности модифицированного Фактора МІ в плазмиду или фаговьй вектор, содержащий со дополнительнье сегменть! ДНК, хотя зкспрессионная единица может бьіть сконструирована с помощью других - последовательностей лигирования. Особенно удобно создать вектор, содержащий сегмент ДНК, кодирующий белок молока, и заменить кодирующую последовательность молока последовательностью полипептида о модифицированного Фактора МІЇ тем самьм создавая смешение генов, которе включает зкспрессионнье

Ге контрольнье последовательности гена белка молока. В любом случае, клонирование зкспрессионньїх единиц в плазмидах или других векторах благоприятствует амплификации последовательности модифицированного

Фактора МІ. Амплификацию удобно проводить в бактериальной клетке-хозяине (например, Е. сої), таким образом, векторьі будут включать источник репликации и селектируемьй маркер в хозяйские бактериальнье клетки. (Ф, Зкспрессионную единицу затем вводят в оплодотвореннье яйцеклетки (включая змбрионов на ранней ка стадии развития) вьібранного вида-хозялина. Введение гетерологичной ДНК может бьіть вьіполнено одним из нескольких способов, включая микроиньекцию (например, 0.5. Раїепі Мо 4,873,191), ретровирусную инфекцию бо аепівсп, Зсіепсе 240: 1468 - 1474 (1988)) или направленную интеграцию с использованием стволовьх клеток змбриона (Е5) (рассмотрено Вгадіеу ей аїЇ., Віо/ГТесппоїрду 10: 534 - 539 (1992)). Яйцеклеткам, имплантированньм в фаллопиевь трубьії или матки псевдобеременньїх самок, дают развиваться до срока.

Потомок, несущий введенную ДНК в зачаточном состоянии, может передавать ДНК своему потомству нормальньім способом, по Менделю, с образованием трансгенного стада. 65 Специалистам известньі! обьічнье процедурьі для получения трансгенньїх животньїх известнь!. См., например, Наап еї аІ., Манипулирование мьішиньїм зародьішем: лабораторное руководство. Соїд Зргіпу Нагрог

І арогаюгу, 1986; Зітопез еї аї., ВіоДесппоїоду 6: 179 - 183 (1988); УМаї! еї аї., ВіоЇ. Кергод. 32: 645 - 651 (1985); Вийіег еї аІЇ., ВіоДесппоюду 8: 140 - 143 (1990); Ерегі еї аЇ., ВіоДесппоїоду 9: 835 - 838 (1991);

Ктітрепіогі еї аї., Віо/Гесппоіїоду 9: 844 - 847 (1991); УМУаї! еї аї., 9. СеїЇ. Віоспет. 49: 113 - 120 (1992);

М. Райепі Мо 4,873,191 и 4,873,316; УЛРО - УУО 88/00239, МО 90/05188, МО 92/11757; и ОВ 87/00458, которне включень! здесь в виде ссьілок. Техника введения последовательностей чужеродной ДНК млекопитающим и в змбриональнье клетки других видов изначально отрабатьівалась на мьішах. См., например, Согаоп еї аї!., Ргос. Май). Асад. 5сі. ОА 77: 7380 - 7384 (1980); Согдоп апа Киадаїе, Зсіепсе 214: 1244 - 1246 (1981); РаітКМег апа Вгіпвіег, СеїЇ 41: 343 - 345 (1985); 7/0 Віпвіег еї аї., Ргос. Май. Асай. Зсі. ОЗА 82: 4438 - 4442 (1985) и Нодап еї аї., (там же). Впоследствий зти приемь! бьіли адаптированньі для использования на более крупньїх животньїх, включая домашних животньх (см., например, публикации УУРО - УУО 88/00239, УМО 90/05188 и УМО 92/117577; и ЗІтопзг еї аі!., ВіоДесппоїіоду 6: 179 - 183 (1988). Итак, в большинстве известньїх до настоящего времени зффективньїх способов генерации трансгенньїх мьішей или домашних животньїх несколько сот линейньїх молекул ДНК, представляющих нтерес, /5 ВВвоДдят в одно из проядер оплодотворенной яйцеклетки в соответствии с разработанньми приемами. Может бьть использована также иньекция ДНК в цитоплазму зиготьї. Можно также использовать получение трансгенньїх растений. Зкспрессия бьівает генерализованной или направленной на отдельньй орган, такой, как бугор. См. Ніай, Маїшге 344: 469 - 479 (1990); Едеірацт еї аїЇ., 9). Іпіепегоп Кев. 12: 449 - 453 (1992);

Зі|топз еї а!., ВіоДесппоіоду 8: 217 - 221 (1990); и публикация Европейского патентного бюро ЕР 255,378.

Модифицированньй Фактор МІЇ, полученньй в соответствии с настоящим изобретением, может бьіть очищен аффинной хроматографией на колонке с антителом к анти-Фактору МІЇ. Особо предпочтительньім является использование кальций-зависимьїх моноклональньїх антител, как описано у У/акарауавзні еї аї., 9. ВісІЇ. Спет. 261: 11097 - 11108 (1986) и ТпІт еї аї!., Віоспет. 27: 7785 - 7793 (1988), включенньїх здесь в виде ссьлок.

Дополнительная очистка может бьіть осуществлена традиционньіми методами химической очистки, такими, как с ов ВьІсоКозЗффективная жидкостная хроматография. Известньі и другие методь! очистки, включая осаждение цитратом бария, которье могут бьіть использованьії для очистки модифицированного Фактора МІЇ, описанного і) здесь (см., как правило, Зсорез К., Очистка белков, Зргіпдег-Мепад, М.У., 1982). Предпочтительньім является достаточно чистьій модифицированньй Фактор МІ, по меньшей мере, 90 - 9595 гомогенности, самьм предпочтительньм - 98 - 9995 гомогенности или более, используемьій для фармацевтических целей. Ге! зо Очищенньій частично или, по желанию, до гомогенного состояния, модифицированньй Фактор МІЇ может использоваться в терапевтических целях. -

В рамках одного из воплощений изобретения модифицированньй Фактор МІЇ расщепляется в сайте «- активации для того, чтобьі превратить его в двухцепочечную форму Активация может осуществляться в соответствии с известньіми в зтой области процедурами, такими, как описаннье Озіегиа еї а/!., Віоспетівігу 11 со з5 2853 - 2857 (1972), Тпотаз, ОЗ Раїепі Мо 4,456,591, Недпег апа Ківіеї, У Сіт Іпмеві 71 1836 - 1841 (1983), «г

КіІзІієЇ апа Ецікамла, Вейппо Іпві МІК 73 29 - 42 (1983), которне включеньі здесь в виде ссьілок Образующаяся молекула затем преобразуется в лекарственную форму и вводится, как описано ниже

Молекульі! модифицированного Фактора МІ! настоящего изобретения и фармацевтические составь на их основе особенно удобньі! для введения людям при лечений различньїх состояний, включая внутрисосудистую « Коагуляцию. Например, хотя тромбоз глубоких вен и легочную змболию можно лечить традиционньми в с антикоагулянтами, модифицированньй Фактор МІЇ, описанньій здесь, может бьіть использован для того, чтобь предотвратить возникновение тромбозмболических осложнений у пациентов с установленньім вьісоким риском, ;» таких, как перенесшие хирургическую операцию или страдающие застойной сердечной недостаточностью.

Кроме того, модифицированньй Фактор МІ может действовать как антагонист опосредованной фактором ткани

МнДдукции коагуляции, тем самьм, блокируя продукцию тромбина и последующее отложение фибрина їх Модифицированньй Фактор МІ, как таковой может оказаться полезньім в подавленийи активности фактора ткани, приводя, в частности, к подавлению свертьівания крови, тромбоза или отложения тромбоцитов со Молекульї модифицированного Фактора МІ настоящего изобретения могут бьіть особенно полезнь! в - лечений гиперплазии внутренней оболочки или рестеноза вследствие острого сосудистого нарушения. Острь!ми сосудистьіми нарушениями являются те, которне возникают бьстро (т е. от дней до месяцев) по сравнению с о хроническими сосудистьми нарушениями (например, атеросклерозом), которье развиваются в течение всей

Ге жизни. Острне сосудистье нарушения часто возникают при хирургических процедурах, таких, как реконструкция сосудов, при которьїх используются приемьї ангиопластики, зндартерзктомии, атерзктомии, шунтирования и т.п.

Гиперплазия может также возникать как отсроченная реакция в ответ, например, на шунтирование или ов трансплантацию органа. Поскольку модифицированньй Фактор МІЇ обладаєт более избирательньм, чем гепарин, действием, обьічно связьивая только фактор ткани в сайтах повреждения, и, благодаря тому, что

Ф) модифицированньй Фактор МІ! не разрушает другие коагуляционнье белки, он будет более зффективнь!м, чем ка гепарин, и с меньшей вероятностью вьізовет нежелательнье кровотечения при профилактическом применений для предотвращения тромбоза глубоких вен. Доза модифицированного Фактора МІ для предотвращения во тромбоза глубоких вен находится в пределах от примерно 5Омкг до 50Омг в день, более типично 1 - 200мг/день, предпочтительно 10 - 175мг/день для пациента весом 7Окг, введение должно начинаться, по крайней мере, за 6 часов до хирургического вмешательства и продолжаться до перехода пациента на амбулаторньій режим. Доза модифицированного Фактора МІ! для лечения рестеноза будет различаться для каждого пациента, но, в общем, будет находиться в упомянутьїх вьіше пределах. 65 Последние достижения в лечениий коронарньх сосудистьїх заболеваний включают использование механического вмешательства для того, чтобьі или удалить, или переместить виновную в нарушений бляшку с целью восстановления адекватного тока крови в коронарньх артериях. Несмотря на использование разнообразньїх форм механического вмешательства включая баллонную ангиопластику, редукционную атерзктомию, установку сосудистьїх стентов, лазерную терапию или иссечение распадающейся ткани,

Зффективность зтих приемов ограничивается примерно 4095 рестенозов, возникающих в течение 6 месяцев после лечения.

Считается, что рестеноз является результатом сложного взаймодействия биологических процессов, включая отложение тромбоцитов и тромбообразование, вьісвобождение хемотаксисньїх и митогенньїх факторов и миграцию и пролиферацию клеток сосудистой гладкой мьішШць во внутреннюю оболочку расширенного /о артериального сегмента.

Подавление аккумуляции тромбоцитов в сайтах механического повреждения может лимитировать скорость рестеноза у человека. Терапевтическое использование моноклонального антитела к тромбоциту СріїБЛііа способно снизить уровень рестеноза у человека (Сайй ей а. М. ЕпаІ. У. Мей. 330: 956 - 961 (1994).

Антитело может связьшваться с рецептором СріїБ/ЛПа на поверхности тромбоцитов и тем самьм подавлять /5 аккумуляцию тромбоцитов. Зти даннье предполагают, что подавление аккумуляции тромбоцитов в сайте механического повреждения коронарной артерии человека оказьшваєт положительное воздействие на окончательньїй результат лечения. Поскольку в сайтах острьїх сосудистьїх нарушений происходит аккумуляция тромбоцитов, то генерация тромбина в зтих сайтах может бьіть ответственна за активацию тромбоцитов и их оследующее накопление.

Как показано в последующих примерах, модифицированньій Фактор МІЇ настоящего изобретения способен связьшшать находящийся на поверхности клетки фактор ткани. Например, ОЕСМК- Фактор Мііа связьвает поверхностньій фактор ткани с одинаковьм или более вьісоким сродством, чем Фактор Мііа дикого типа. Однако

ОЕСК-Фактор Ма не имеет ферментной активности, но связьівается с фактором ткани и действует как конкурентньій антагонист Фактора Міа дикого типа, тем самьм ингибируя последующие зтапьї внешнего с об метаболического пути коагуляции, приводящие к генерации тромбина.

Молекульі! модифицированного Фактора МІ! настоящего изобретения, поддерживающие связьивание фактора і) ткани, подавляют аккумуляцию тромбоцитов в сайте сосудистого нарушения путем блокирования продукции тромбина и последующего отложения фибрина.

Благодаря способности ОЕСК-Фактора МІ блокировать генерацию тромбина и ограничивать отложение Ге! зо тромбоцитов в сайте острого сосудистого нарушения, молекульі модифицированного Фактора МІЇ, которье обладают активностью связьівания фактора ткани, но лишень ферментной активности, могут использоваться - для подавления сосудистого рестеноза. «-

Таким образом, составь и методь! настоящего изобретения имеют широкую область применения. Например, они полезньь для предотвращения или подавления рестеноза, сопровождающего типично механическое со з5 вмешательство, проведенное с целью либо удаления, либо замень! виновного в нарушений материала бляшки «г при лечениий повреждений коронарньїх или перифирических сосудов, таких, которье сопутствуют и/или следуют за баллонной ангиопластикой, редукционной атерзктомией, установкой сосудистьїх стентов, лазерной терапией, иссечением распадающихся тканей и т.п. Соединения будут типично вводиться за 24 часа до вмешательства и в течение 7 дней и более после него. Введение может проводиться разнообразньми способами, как описано в « дальнейшем. Соединения настоящего изобретения могут также вводиться системно и местно при установке в с сосудистьїх имплантатов (например, покриїітием искусственньїх или модифицированньїх природньїх имплантатов

Й артериальньїх сосудов) в сайтах анастомоза, хирургической зндартерзктомии (типично для зндартерзктомийи и?» сонной артерии), шунтирования и т.п. Модифицированнье Факторь! МІЇ и Ма находят также применение для подавления гиперплазии внутренней соудистой оболочки, раннего склероза и венозной окклюзии, связанной с трансплантацией органов, например, возникающей после трансплантации костного мозга. ї5» При лечений установленного тромбоза глубоких вен и/или легочной змболии ударная и поддерживающая дозьі модифицированного Фактора МІЇ в зависмости от веса пациента и тяжести заболевания изменяются в бо пределах от примерно 5Омкг до 50Омг/день, более типично 1 - 200мг/день и более предпочтительно 10 - - 175мг/день для пациента весом 7Окг. Благодаря сниженной вероятности нежелательньїх кровотечений при инфузии Фактора МІЇ, можно заменить им гепарин или снизить дозу гепарина в ходе или после хирургического о вмешательства в сочетаний с тромбзктомией или змболзктомией.

Ге Составьї модифицированного Фактора МІЇ настоящего изобретения очень полезньії для предотвращения кардиогенной змболии и в лечениий тромботических ударов. Благодаря малой вероятности нежелательньмх кровотечений и избирательности действия, модифицированньій Фактор МІЇ можно давать перенесшим удар, и он может предотвратить распространение закупоривающих артериальньх тромбов. Количество введенного модифицированного Фактора МІ будет меняться для каждого пациента в зависимости от характера и тяжести (Ф, удара, но дозь, в основном, будут находиться в пределах, предложенньїх ниже. ка Фармацевтические составьі модифицированного Фактора МІ, включающие ОБЕсСК-Фактор Мі и представленнье здесь, окажутся полезньми в лечении острого инфаркта миокарда, благодаря способности бо Модифицированного Фактора МІ! подавлять коагуляцию Іп мімо. Модифицированньй Фактор МІ! может бьїть дан в качестве адьюванта с активатором тканевого плазминогена или стрептокиназой в период острой фазьї инфаркта миокарда и может ускорить ІРА-индуцированньій тромболиз. При остром инфаркте миокарда пациенту дается ударная доза, по крайней мере, от 5О0мкг до 50Омг/день, более типично 1 - 200мг/день и более предпочтительно 10 - 175 мг/день для больного весом 7Окг в качестве ударной и поддерживающей дозь. 65 Модифицированньй Фактор МІЇ дается до, в сочетаний или вскоре после введения тромболитического агента, такого, как активатор тканевого плазминогена.

Модифицированньй Фактор МІ! настоящего изобретения полезен в леченийи коагулопатии потребления (ПС) и других проявлений, связанньїх с грам-отрицательной бактеремией. Для пациентов с БІС характерньі широко распространеннье микроциркуляторнье тромбь и частье острье кровотечения, которье возникают от Мстощения необходимьх факторов свертьивания. Благодаря своей избирательности действия, модифицированньй Фактор МІ! не будет, как традиционнье коагулянтьі, осложнять кровотечения, связаннье с

ОІС, но задержит или подавит образование дополнительньїх микроваскулярньїх фибриновьїх отложений. Таким образом, модифицированньйй Фактор МІ данного изобретения, включая ОЕСМК-Фактор МІЇ и ОЕСК-Фактор Ма, полезен для подавления отложений фибрина, связанньх с зндотоксемией и зндотоксиновьм шоком и, /о следовательно, смягчает зффекть, вьізьіваемьсе грам-отрицательной бактеремией. Показано, что ОЕОК-Фактор

Міа у мишей проявляет дозозависимьй зффект при блокированиий отложений фибрина в почках и легких, а у бабуинов увеличивает вьїживаемость леченьїх животньїх. В случае острой бактеремии, зндотоксемии или ІС пациенту дается ударная доза, по крайней мере, от примерно 5Омкг до 50Омг/день, более типично 1 - 200мг/день и более предпочтительно 10 - 175мг/день при весе пациента 7Окг, после зтого поддерживающие /5 ДдОоЗзьІ в пределах от 5Омкг до 50Омг/день, типично 1 - 200мг/день при весе пациента 7Окг.

Фармацевтические составь! предназначеньі для парентерального, местного или локального введения при профилактической и/или терапевтической обработке. Предпочтительнее фармацевтические составь! вводить парентерально, т.е. внутривенно, а также подкожно или внутримьшечно. Таким образом, зто изобретение обеспечиваєт составь! для парентерального введения, которне включают раствор молекул модифицированного Фактора МІ! в приемлемом носителе, предпочтительно в водном. Могут использоваться разнообразнье воднье носители, например, вода, забуференная вода, 0.495 физиологический раствор, 0.395 глицин и т.п. Молекуль! модифицированного Фактора МІ! также могут бьіть заключень! в липосому в качестве лекарственной формь! для доставки в (или нацеливания на) сайть! повреждения. Липосомньсе препарать, в общем, описанньєе, например, в М.5. 4,837,028, 5. 4,501,728 и И.5. 4,975,282, включенньїх здесь в виде ссьлок. Составь могут сч об стерилизоваться стандартньмми, хорошо известньми приемами. Получаемье в результате воднье растворь могут переноситься в упаковку для использования или фильтроваться в асептических условиях и і) лиофилизоваться, причем лиофилизованнье препарать! перед введением смешиваются со стерильнь!м водньім раствором. Составьі могут содержать фармацевтически приемлемье вспомогательнье вещества для приближения к физиологическим условиям, такие, как поддерживающие рН и буфернье агенть, б зо поддерживающие тонус агенть и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлористьй натрий, хлористьй калий, хлористьїй кальций и т.д. Концентрация модифицированного Фактора МІ! в зтих лекарственньїх формах - может широко меняться, а именно, от менее чем 0.595, обьічно 195 или, по крайней мере, около того, до 15 - 2095 - по весу и будет вьібираться прежде всего по обьему жидкости, вязкости и т.д. в соответствии с особенностями вьібранного способа введения. со

Таким образом, типичньій фармацевтический состав для внутривенного вливания мог бьі содержать 250мл «г стерильного раствора Рингера и 10мг модифицированного Фактора МІЇ. Применяемье методьі приготовления вводимьїх парентерально препаратов известньь профессионалам и более детально описаньі, например, в

Ремингтонской фармацевтической науке, 16-ое издание, Маск РибіїзпІпуд Сотрапу, Истон, Пенсильвания (1982), которая включена здесь в виде ссьІлки. «

Составь),, содержащие модифицированньй Фактор МІІ, могут вводиться при профилактической и/или з с терапевтической обработке. При терапевтическом применений составь! вводятся больному, как описано вьіше, в количестве, достаточном для лечения или, по крайней мере, для того, чтобь! остановить болезнь и ее з осложнения. Количество, адекватное достижению зтого, определяется как "терапевтически зффективная доза".

В зтом случае зффективное количество зависит от тяжести заболевания или нарушения, а также от веса и общего состояния пациента, но обьічно изменяется в пределах 0.05 - БбОмг модифицированного Фактора МІ! в їх день для пациента весом 7Окг, причем чаще используются дозь! 1 - 200мг модифицированного Фактора МІ! в день. Следует помнить, что материаль! настоящего изобретения могут, как правило, использоваться при со серьезньїх заболеваниях или нарушениях, т.е. в уурожающих жизни или потенциально угрожающих ситуациях. В - таких случаях, с учетом минимизации посторонних веществ и общим отсутствием иммуногенности Модифицированного Фактора МІЇ у человека, возможно и может считаться желательньм введение пациенту ве врачом значительного избьітка составов модифицированного Фактора МІ.

Ге) При профилактическом применениий составь,, содержащие модифицированньй Фактор МІЇ, вводятся пациенту, восприимчивому к заболеванию, или при опасности заболевания или нарушения для того, чтобь усилить у пациента собственнье антикоагулятивнье возможности. Такое количество определяется как дв "профилактически зффективная доза". При таком использований точнье количества снова зависят от состояния здоровья пациента и его веса, но, как правило, изменяются в пределах 0.5 - 500мг при весе пациента 7Окг, (Ф, более часто 1 - 200мг/7Окг. ка Можно проводить однократное или многократнье введения составов с дозами и режимом, вьібранньім лечащим врачом. Для амбулаторньх пациентов, 60 которьім необходимь! ежедневнье поддерживающие дозьії, модифицированньй Фактор МІ может бьть введен, например, непрерьівной инфузией с использованием портативного насоса.

Местная доставка модифицированного Фактора МІ! может бьіть осуществлена, например, путем перфузии, с помощью двойньх баллонньїх катетеров, стентов, гидрогелей, используемьх для покрьтия баллоннньх катетеров, или другими хорошо известньми методами. В любом случае фармацевтические лекарственнье 65 /формь! должнь обеспечить количество модифицированного Фактора МІ! данного изобретения, достаточное для зффективного лечения пациента.

Пример 1.

Зкспрессия Фактора МІ! с мутацией Зег344 -» АІаз44.

Для того, чтобьї генерировать Фактор МІ! с мутацией Зег344 -» Аіа344 в активном центре плазмиду ЕМ!І((565 вот 2463УрОХ (0.5. Раїепі Мо 4,784,950, включенньій здесь в виде ссьіІлки; плазмида зарегистрирована в

Американской коллекциий типов культур под номером 40205) расщепляли с Хра | и Крп І с образованием фрагмента в 0.6 тьісяч нуклеотидов, включающего кодирующую серин-344 область. Зтот фрагмент клонировали в Хва І, Крп 1-расщепленньій М1Зтр19, как показано на фиг. Зта процедура и последующие зтапьї, описаннье ниже, обьічно осуществляются в соответствии со стандартньіми протоколами (как описано, например, Мапіай5 7/0 2 аї,, Молекулярное клонирование. Лабораторное руководство, Со Зргіпуд Нагрог Іарогайгу Ргезз,

Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк (1982), включено здесь в виде ссьІлки).

Мутагенез проводили на матрице М1З3 в соответствии с методами Золлера и Смита, см. вьіше, используя мутагенньй олигонуклеотид 7С1656 (5 То СС СС оС ТС ССС ст 3) и "универсальньй" второй праймер 2087 (5 ТСС САС ТСА СОА СОТ 3). Продуктьі реакции скринировали с использованием обработанного киназой 7С1656. Позитивнье бляшки собирали, получали матричную ДНК и секвенировали от

Рв І-сайта при 1077 до Крп І-сайта при 1213. Анализ последовательности подтвердил наличие желаемой мутации. Мутантньй клон обозначили 1656.

Затем с использованием клона 1656 бьіл сконструирован зкспрессионньій вектор. Последовательность с внесенной мутацией вьіделяли из вектора М1ІЗ в виде фрагмента Реї І-Крп І с 0.14 тьісє. нуклеотидов. Зтот фрагмент лигировали к фрагменту Ніпа ПП-Хва І с 1.7 тьс. нуклеотидов из РМІЇ (565 ї 2463УрОХ, к фрагменту

Хва І-Рваї І с 0.5 тьіс. нуклеотидов из ЕМ1І (565 - 2463УроОХ и фрагменту Крп І-НіІпа 111 с 4.3 тьісє. нуклеотидов из ЕМ (565 ї- 2463УрОХ, как показано на фиг. Присутствие желаемой мутантной последовательности подтверждали расщеплением мутантного клона и клона дикого типа с Рвї І, вставкой мутантного Фактора МІ! в

МІЗ со оКрп б о Хра |, получением саузерн-блотов расщепленной ДНК и зондированием блотов с сч ов радисактивномеченньйм 271656.

Клетки почек новорожденного хомяка линии ВНК 570 (зарегистрированнье в Американской коллекции типов і) культур клеток под номером 10314) трансфицировали двумя изолятами (обозначенньми 8544 и 8545) зкспрессионного вектора 1656. Клетки получали разбавлением 1 : 10 клеток ВНК 570 в пяти 10см-планшетах с неселективной средой (модифицированной средой Игла (ОМЕМ), содержащей 1096 змбриональную бьчью (ду зо бьіворотку и 170 смесь антибиотиков РОМ (СІВСО | Ме Тесппоіодієв, Гайтерсбург, Мзриленд). Через 24 часа, когда клетки достигли 20 - 3096 слияния, их сотрансфицировали с одним изолятом зкспрессионного вектора, - кодирующего мутацию 1656, плазмидой рі86 (включающей аденовирус 5 огі, знхансер от ЗМ40, основной -/- де поздний промотор аденовируса 2, лидерную последовательность аденовируса 2, сайть 5- и 3'-сплайсинга,

ОНЕК'-КкДНК и сигнал полиаденилирования от 5М40 в рМі- 1 (І изКу апа Воїснап, Майте 293: 79 - 81 (1981)) и со 10мкг ДНК-носителя (фрагментированной под действием ультразвука ДНК спермь! лося), как показано в «Е

Таблице 1. В пробирки на 15мл вносили ДНК, затем добавляли 0.5мл буфера НЕРЕ5-2Х (25г НТНТ5, 40г Масі, 1.8г Ксї, 0.75г дигидрата Ма?2НРОЗ, 5г декстрозьі, разбавленнье до обьема 2.5л дистиллированной водой, с рн 6.95 - 7.0) и перемешивали. В каждой пробирке осаждали ДНК добавлением 0.5мл 0.25М раствора хлористого кальция при барботирований воздуха через раствор ДНК в буфере НЕРЕЗ с помощью пастеровской пипетки. « Пробирки встряхивали, инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут, снова встряхивали. в с Смесь, содержащую ДНК, прибавляли по каплям с помощью пипетки в планшеть! с клетками. Планшеть встряхивали и инкубировали при 37"С в течение 4 - 6 часов. После инкубации в каждьйй планшет добавляли 2мл ;» 20906 глицерина в смеси Тгіз-буфера и физиологического раствора (0.375г КСІ, 0.71г Ма2НРО4, 8.1г масі, 3.Ог

ТтіІв-НСЇІ, 0.5г сахарозьі, разбавленнье до общего обьема л, с рН 7.9). Планшеть! встряхивали и вьідерживали 2 Минутьі при комнатной температуре. Затем из планшетов удаляли среду, заменяли ее 2 мл смеси Тгіз-буфера с ї5» физиологическим раствором. Планшеть! вьідерживали 2 минуть при комнатной температуре, затем смесь буфера и физиологического раствора заменяли 1Омл неселективной средьі. Планшеть! инкубировали при 377С со в течение двух дней. - й 2 с окленвм! вм! -400111110 вм нин нн НЕ ня НЕТ з вро ми о з После двухдневной инкубации клетки разбавляли селекционной средой (ОМЕМ, содержащая 1095 бр дмализованную змбриональную бьмчью сьворотку, 196 смесь антибиотиков РОМ и 1508М метотрексат) и с разбавлением 1 : 100,1: 250 и 1: 500 помещали в макси-планшетьі. Планшеть! инкубировали при 37"С в течение недели. Через неделю среду удаляли и заменяли селекционной средой, в планшетах контролировали образование колоний.

Через восемь дней, после образования колоний, произвольно отбирали двенадцать колоний из планшетов с ве разведением 1 : 500 трансфекции изолятов 2544 и 8545. Каждьй клон помещали в ячейку 6- ячеечного планшета и вьіращивали в селекционной среде. Через 7 дней планшеть! сливали, и каждьій клон помещали в десятисантиметровьій планшет с селекционной средой. Клонь), описаннье вьше, и контрольнье клетки, трансфицированнье с целью зкспрессиий Фактора Мі дикого типа, бьли метаболически помечень 358-метионин-цистеиновой смесью для мечения белков (МЕМ Юиропі Віоїесппоіоду Зузіетв, Уилмингтон, Дзлавер). Клоньі внращивали и подготавливали к зксперименту с импульсной меткой в селективной среде.

Клетки смьівали смесью физиологический раствор-фосфатньїй буфер (Зідта, Сент-Луис, Миссури) и в течение 4 часов подвергали импульсу от 355-Сувз-355-Меї в 20мкКи/мл. Через 4 часа собирали супернатант и клетки.

Клетки лизировали, в основном, как описано І епкК апа Рептап (СеїІ 16: 289 - 302 (1979)), и 400мкл каждого лизата проверяли со стафилококком на безвредность (Зідта, Сент-Луис, Миссури). 70 Образцьі! метаболически меченьїх клеток подвергали радисиммунопреципитациийи (КІР) инкубацией с бмкл поликлональной антисьмшворотки анти-Фактора МІ в течение 4 часов. К каждому образцу добавляли бОмкл промьтого белка А стафилококка, и образцьі встряхивали при 4"С в течение 1.5 часа. Образць центрифугировали, супернатант отделяли. Осадки промьівали дваждь! 0.7М буфером КІРА (10мМ Ттів, рН 7.4, 196 дезоксихолевая кислота (СаІріоспет Согр., Ла-Джолла, Калифорния), 1956 Тритон Х-100, 0,196 505, 5ММ 7/5 ЕОТА, 0.7М Масі) и один раз 0.15М буфером КІРА (10мМ Ттів, рН 7.4, 195 дезоксихолевая кислота (СаІріоспет

Согр., Ла- Джолла, Калифорния), 1950 Тритон Х-100, 0.195 505, 5 мМ ЕОТА, 0.15 М Масі)). К каждому образцу добавляли краситель в 100мкл буфера 5О5Х1 (50мМ Тгі8-НСІ, рН 6.8, 100ММ дитиотреит, 295 5ОБ5, 0.190 бромфенол синий, 1095 глицерин), образць! кипятили в течение 5 минут, после чего центрифугировали, чтобь удалить белок А. Прогоняли 5Омкл каждого образца в полиакриламидном геле. Результать! показали, что 9 из 10 клонов секретировали модифицированньй Фактор МІ.

Пример ІІ.

Антикоагулянтная активность модифицированного Фактора МІ.

Способность белка модифицированного Фактора МІ подавлять свертьшание крови измеряли в одностадийном анализе с использованием Фактора МІ! дикого типа в качестве контроля. Рекомбинантнье белки с г получали, в основном, так, как описано вьіше, из клеток, культивированньх в среде, содержащей 5мкг/мл витамина К. Различнье количества модифицированного Фактора МІ (из клона 544) или рекомбинантного і)

Фактора МІ дикого типа разбавляли 5ОмММ Ттгіз-буфером с рН 7.5, 0.1956 ВБА до обьема 100мкл. Смеси инкубировали со 100мкл Фактор МІІ-дефицитной плазмь (Сеогде Кіпо Віо-Меаісаї Іпс., Оверленд-Парк, Канзас) и 200мкл тромбопластина С (Оаде, Майами, Флорида; содержит тромбопластин кроличьего мозга и 11.8мММ Сажкт). Ге!

Зо Анализ свертьявания проводили в автоматическом таймере коагуляции (МІ А ЕЇІесіга 800, Меаісаї І арогаїгу

Аціотаїйоп Іпс., Плизантвилле, Нью-Йорк), время свертьівания преобразовьвали в единицу активности Фактора -

МІЇ с использованием стандартной кривой, полученной для нормальной обьеединенной человеческой плазмьс (с/р допущением, что она содержит одну единицу активности Фактора МІ на мл; получена обьединением обработанньїх цитратом сьівороток от здоровьїх доноров) с разведением от 1: 5 до 1 : 640. По зтому методу со зв препарать модифицированного Фактора МІ! не обладали детектируемой коагулянтной активностью. Таблица 2 «Е показьшает результатьь анализа, вьраженнье во времени свертьшвшания, для контрольньх (нетрансфицированньх), кондиционньїх для клеток ВНК сред (-/- витамин К), Фактора МІЇ дикого типа и двух изолятов клеток, зкспрессирующих модифицированньій Фактор МІІ. Активность Фактора МІЇ представлена как уменьшение времени свертьівания по сравнению с контрольньіми образцами. « - - ї» тель 18,00 з г

Фактор МІЇ дикого типа со -

ЩЕ

3е)

Для того, чтобьі определить влияние модифицированного Фактора МІ на субстратьї фактора плазмь, препаратьї одифицированного Фактора МІ и рекомбинантного Фактора МІ! дикого типа или нативного Фактора

МІЇ инкубировали либо с Фактором Х, либо с Фактором ІХ, их активацию контролировали анализом свертьівания или злектрофорезом в полиакриламидном геле. (Ф) Пример ІІЇ. Способность модифицированного Фактора МІ! связьівать фактор ткани ко Способность модифицированного Фактора МІ! конкурировать с Фактором МІ! дикого типа за фактор ткани и подавлять его вертьівающую активность бьіла оценена одностадийньм анализом свертьівания в присутствий бор лимитирующего количества фактора ткани (тромбопластина).

Время свертьвания определяли одностадийньм анализом подобно тому, как описано в примере ІІ. В смешанньїх зкспериментах использовали лимитированное количество фактора ткани, постоянное количество

Фактора МІ дикого типа и увеличивающиеся количества генетического варианта Фактора МІЇ. Подавление прокоагулянтной активности Фактора МІ/МІа проявилось бьї как увеличение времени свертьівания в опьїтах с б5 нарастающими количествами генетического варианта Фактора МІ.

Величину активности Фактора МІ! в тестируемьхх образцах вьічисляли в процентах по стандартной кривой,

полученной на основе измерений активности Фактора МІ в нормальной обьединенной плазме. Стандартную кривую активности Фактора МІ получали с использованием серии разведений нормальной обьединенной плазмьї в фосфатном буфере (РВ5) в пределах от 1: 5 до 1: 640. С зтой целью бьіло принято допущение о том, что нормальная плазма содержит приблизительно 5ООнг/мл Фактора МІЇ, и зто бьіло принято за единицу активности. Смесь, состоящую из 100мкл Фактор МІІ-дефицитной плазмьї, 100мкл разведенной плазмь! и 200мкл тромбопластина-С (ЮОаде, Майами, Флорида), использовали для измерения времени свертьмвания с использованием автоматического таймера МІ А ЕЇІесіга 800. Для получения стандартной кривой результать представляли в графическом виде как процент активности (1 : 5 - 10095 активности) против времени /о бвертьівания в секундах.

По условиям анализа бьіло необходимо, чтобьі в состав средьі, содержащей дикий тип и вариант Фактора

МІ, входило не менее одного процента сьіворотки. Разведения в РВ5 бьіли сделаньі таким образом, чтобь падение времени свертьвания происходило в соответствии со стандартной кривой. Типичньм бьло минимальное разведение 1 : 2. Окончательньй обьем составил 100мкл. В зкспериментах использовали два /5 различньїх варианта человеческого Фактора МІЇ с замещением зег344 -» Аа, обозначеннье как клоньі "МО" и "Ж6". Результать!, приведеннье в нижеследующей таблице, показьівают, что, по мере увеличения количества варианта Фактора МІЇ, снижался процент активности Фактора Ма. » реакцию). пн нн ЕТ ос НО

Пи «т Є Я НОЯ ПО ПОЛ м1р111110010111111в м 51111111 же 111вомю!//7171111ломи/7777771111101111111111в нмиеи,11111000111 в 00011110 дю ввмми11111110010010вв 00001106 нн нн НЕТ ПО НО НЯ пи т НОЯ Ос ПОЛЯ в11000ями1111100ми111111110100111111 вв з 000 вну 11000000 ми

С внвьню 00000001 мают, «

Зксперименть показали, что Фактор МІ! с замещением зЗегЗ44 - » Аа конкурировал с нативньім Фактором МІ! пт) с по дозозависимому профилю и ингибировал прокоагулянтную активность нативного Фактора МІ/МІа. Можно бьіло заключить, что вариант человеческого Фактора МІ с заменой бег344 -» АЇа конкурирует с нативньм :з» человеческим Фактором Мііа и, следовательно, подавляет активацию Фактора Х и/или ЇХ в человеческой плазме.

Пример М. їз Реакция Фактора МІ! с РРАсСК.

Рекомбинантньй Фактор МІ! біл продуцирован в трансфицированньх клетках почек новорожденного хомяка. со Белок очищали и активировали, как описано ТпІт (Віоспетівігу 27: 7785 - 7793 (1988)), ВгіпКопз еї аї., (Ргос. - Майн. Асад. сі. ОБА 86: 1382 - 1386 (1989)) и Віоегп апа Тіт (Кевз. ОіІвсі. Мо 269, 564 (1986)), которье 5р ВКлючень здесь в виде ссьлок. Клеточную среду собирали, фильтровали и разбавляли, чтобь! снизить ве концентрацию солей. Затем разбавленную среду фракционировали анионообменной хроматографией,

Ге; используя для злюции буфер, содержащий хлористьій кальций. Фракцию, содержащую Фактор МІЇ, собирали и затем очищали иммунохроматографией с использованиегм моноклонального антитела к кальций-зависимому антифактору МІІ. Дополнительную очистку проводили, используя двукратно анионообменную хроматографию, в вв Хходе которой Фактор МІЇ злюировали соответственно растворами хлористого кальция и хлористого натрия.

Фактор Мііа получали в последнем злюате. (Ф) Рекомбинантньїй Фактор Мііа (1мкМ) в 50мММ Ттів-НСІ, 100мМ хлористом натрии и 5мММ хлористом кальции, с

ГІ рН 7.4 инкубировали с 20мкМ РРАскК (О-Фенилаланил-Пролил-Аргинил-хлорметилкетон; СаІріоспет, Ла-Джолла,

Калифорния) в течение 5, 20 и 60 минут. Затем добавляли буфер, содержащий хромогенньій субстрат 5-2288 во (п-нитроанилид О-изолейцилі-ї -пролил-і -аргинина; Карі Мігит АВ, Молндал, Швеция) для того, чтобьі! получить 2.5-кратное разведение и конечную концентрацию 0.3ММ для 5-2288. Измеряли вьіделение п- нитроанилина и сопоставляли с результатом, полученньмм с необработанньм Фактором Мііа в качестве контроля. Полученнье данньюе указьвают на то, что в изученньїх условиях Фактор Ма инактивируется полностью через приблизительно 60 минут. 65 Пример У.

Генерирование ОЕОК-Фактора МіІа.

Рекомбинантньй человеческий Фактор Ма бьл получен, как описано в Примере ІМ. Рекомбинантньй человеческий Фактор Ма в 10ММ глициновом буфере с рН 8.0, 10ММ хлористом кальции и 50ОММ хлористом натрии разбавляли до концентрации 1.5 мг/мл. К Фактору Ма прибавляли 10-кратньй избьток

Ррапзуї!-І-с1ІцШ-сС1Іу-Агд- хлорметилкетона (СаІріоспет, Ла-Джолла, Калифорния 92037), которьйй бьіл растворен в дистиллированной воде. После двухчасовой инкубации при 37"С к смеси добавляли второй 10-кратньй молярньій избьток ОЕСКсСК и инкубировали еще 2 часа при 37"С. Затем к Фактору Ма прибавляли третий 10-кратньій молярньій избьток ОЕСКсСК и инкубировали приблизительно 16 часов при 4"С. Для удаления свободного ЮОЕСКсК образец ОЕСК-Фактора Мі тщательно диализовали против Тгіз-забуференного 7/0 физиологического раствора (0.05М Тгів-НСІ, 0. М масі, рН 7.5) при 4"С. Введением свободного ОЕСКСК в смесь, содержащую Фактор Ха, получена стандартная кривая для измерения количества свободного ОЕСКсСК в растворе по мере ингибирования хромогенной активности Фактора Ха. Анализ смеси с ОЕСК-Фактором МіІІа показал, что после зкстенсивного диализа отношение свободного ОЕСКсК к СЕСК-Фактору Ма составило менее 0.595, тем самьім подтверждая, что ингибирование, наблюдаемоє для ОЕСК-Фактора Мііа в различньх /5 тест-системах, приведенньх ниже, не связано с присутствием свободного ОБОКСК.

Пример МІ.

Генерация Фактора Ха на клетках крьісиной гладкой мьішць.

Клетки сосудистой гладкой мьшць! бьли проанализированьь на наличие поверхностного фактора измерением способности клеток стимулировать превращение Фактора Х в Фактор Ха с использованием специфичного для Фактора Ха хромогенного субстрата.

Клетки крьісиной сосудистой гладкой мьішць (Сіомез еї аї., У. Сп. Іпмеві. 93: 644 - 561 (1994)) помещали в 96б-ячеечнье планшеть (Атегісап Зсіепійіс Ргодисів, Чикаго, Иллинойс), 8000 клеток на ячейку в ростовой среде (Табл. 4). см й

Логан, Юта)

Ф що «

Через 48 часов инкубации при 37"С среду заменяли на сьівороточную свободную среду (Таблица 5). -- с з5 - « о З с хз»

Клетки инкубировали 72 часа при 37"С. После инкубации к клеткам добавляли или 1Онг/мл РОСЕ-ВВ (человеческого рекомбинантного фактора роста тромбоцитов), или 1095 змбриональную телячью сьіворотку для ве стимуляции зкспрессии фактора ткани (Табтап еї аї., У. Сп. Іпмеві. 91: 547 - 552 (1993)). В параллельную со серию клеток не добавляли ни РОС, ни сьіворотку для того, чтобьї контролировать подлинную активность нестимулированньїх клеток. После б-часовой инкубации к клеткам прибавляли рекомбинантньій человеческий - Фактор Ма с окончательной концентрацией 1ОНМ. Одна серия клеток не получала Фактор Міїа в качестве їх 20 отрицательного контроля. Клетки инкубировали 2 часа при 37"С, промьівали буфером НЕРЕ5 (10ММ НЕРЕБ, 137мМ Масі, 5мм Сасіг2, 11мМ глюкоза, 0.195 ВБА). После промьівания клетки инкубировали 5 минут с 5Омкл на с ячейку 200нМ очищенного Фактора Х плазмь! человека в Тгіз-забуференном физиологическом растворе с 5ММ

Сасі2. В каждую ячейку добавляли 25мкл 0.5М ЕОТА и 25мкл 800мкМ раствора хромогенного субстрата 5-2222 (Карі Ріапгтасіа, Франклин, Огайо). Планшетьї инкубировали 40 минут при комнатной температуре, затем го анализировали при 40Ббнм с использованием прибора ТНЕКМОМАХ (Моїіесшаг Зегмісев, Менло-Парк,

ГФ! Калифорния).

Таблица 6 показьвает увеличение поглощения для ячеек, обработанньїх Фактором Мііа, по сравнению с о контрольньіми ячейками (без добавления Фактора МІ). Увеличение поглощения является прямьім измерением уровня Фактора Ха, генерированного в ячейках, и последующего расщепления им хромогенного субстрата, 60 внісвобождающего хромофор. Зти даннье демонстрируют также, что уровень хромогенной активности в клетках, предварительно обработанньїх или РОСБ-ВВ, или 1095 змбриональной телячьей сьівороткой (ЕС), бьл вьіше, чем в нестимулированньх клетках. б5

Контроль -043

У - -

Зти результать! отчетливо показьивают, что на поверхности клеток крьісиной сосудистой гладкой мьішць! наблюдается Фактор МІІа-зависимая активация Фактора Х в Фактор Ха.

Пример МІ.

Ингибирование поверхностноклеточной хромогенной активности ОЕСК-Фактором Ма. 70 Клетки крьісиной сосудиситой гладкой мьішцьі помещали в планшеть с 96 ячейками, как описано вьіше.

Клетки культивировали в течение 72 часов в бессьівороточной среде, как описано вьіше; затем обрабатьівали 1096 змбриональной телячьей сьівороткой в течение 6 часов для стимуляции зкспрессии фактора ткани. После стимуляции в каждую ячейку добавляли только буфер (контроль), ЛОНМ Фактор Ма или 1ОНМ Фактор Ма жк 100нМ ОЕСК-Фактор Ма. Клетки инкубировали 2 часа при 37"С, затем промьівали буфером НЕРЕ5. После /5 промьвания клетки инкубировали в течение 5 минут с 5Омкл на ячейку 200НМ Фактора Х в Тгіз-забуференном физиологическом растворе с добавкой 5мММ хлористого кальция. В каждую ячейку прибавляли 25мкл 0.5М ЕОТА и 25мкл хромогенного субстрата 5-2222 (ВОмМкМ). Клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 40 минут. Хромогенную активность анализировали при 405нм, как описано вьіше.

Таблица 7 показьшвшаєет хромогенную активность в ячейках, обработанньх только Фактором Мііа, и ор Торможение стимуляции, когда ОЕСК-Фактор Міа соинкубировали с Фактором Мііа. Зти результать демонстрируют, что ОЕБЕОК-Фактор Мііа действует как конкурентньій антагонист связьівания Фактора Мііа, тем самь!м подавляя активацию Фактора Х в Фактор Ха и последующее расщепление хромогена 5-2222. см 5 о

Пример МІП. о

Дозозависимоє ингибированиеє ЮЕСК-Фактором Ма поверхностной хромогенной активности на клетках «ф крьісиной гладкой мьІішць.

Клетки крьісиной сосудистой гладкой мьішцьії помещали в планшеть с 96 ячейками при 4000 клеток на -- ячейку в ростовой среде с добавкой 195 змбриональной телячьей сьіворотки (как в Таблице 4, но без 1090 с змбриональной телячьей сьіворотки). Через 5 дней среду удаляли и к клеткам прибавляли или возрастающие

Зо концентрации только Фактора Мііа, или ТОНМ Фактор МііІа с возрастающими концентрациями ОЕСК-Фактора Ма. М

Клетки инкубировали в течение часов при 377"С. После инкубации клетки промьівали, затем инкубировали с

БОмкл 200нМ Фактора Х в Тгіз-забуференном физиологическом растворе в течение 5 минут при комнатной температуре. В каждую ячейку добавляли 25мкл 0.5 М ЕОТА и 25мкл 800мкМ 5-2222 (Карі РНагтасіа), « планшеть! инкубировали 40 минут при комнатной температуре. Хромогенную активность анализировали при З 70 доБНМ со считьивающим устройством для икропланшетов, как описано вьіше. с Таблица 8 показьявает дозозависимое повьішение хромогенной активности по мере увеличения количеств з» Фактора Мііа, добавленньїх в ячейки. При добавлений в клетки смеси ОЕСК-Фактора Мііа и Л00НМ Фактора Ма (Таблица 9) наблюдалось дозозависимое ингибирование хромогенной активности. При молярном соотношений рЕСК-Фактора Мііа к Фактору Мііа, равном 1 : 1, ингибировалось приблизительно 9595 хромогенной активности. 745 Зти даннье позволяют предположить, что в зтом зксперименте, в культуре клеток гладкой мьішцьі у ОЕСК- е Фактора Міїа бьіло значительно более вьісокое сродство к поверхностному фактору ткани, чем у нативного (ее) Фактора МііІа. Если бі СЕСК-Фактор Мііа и Фактор Ма имели равное сродство к фактору ткани, то в том случає, когда две молекульі бьіли добавленьі к клеткам в равном молярном соотношении, уровень наблюдаемого - ингибирования не бь/л бьї таким вьісоким. їз 50

Фо о ще 6о Таблица 9 показьівает дозозависимое ингибирование ОБОК-Фактором Мііа хромогенной активности Фактора

Ха на клетках крьісиной гладкой мьішцьі. Увеличивающие концентраций ОЕСК-Фактором Мііа соинкубировали с 1О0НМ Фактором Мііа, хромогенную активность Фактора Ха определяли с использованием хромогенного субстрата 5-2222. б5

Концентрация Фактора Мііа (нм) 00405

Пример ІХ 70 Ингибирование образования Фактора Ха ОЕСК-Фактором Мііа в анализе растворимого фактора ткани.

Превращение Фактора Х в Фактор Ха с использованием очищенного рекомбинантного раствора фактора ткани установлено с помощью хромогенного анализа. Фактор ткани бьл зкспрессирован и вьіделен из

Засспаготусес сегемізаеє (ЗНПІдетаїзи еї аї!., у. Віої. Спет. 267: 21329 - 21337 (1992)). Растворимьій фактор ткани бьіл очищен и охарактеризован д-ром МУ. Кізієе! (Университет Нью- ексимо). Реакционная смесь содержала 6б5,9мкл растворимого фактора ткани (2.2мкМ) 29.Омкл РСР (1ММ, Зідта, Сент- Луис, Миссури), 29.5мкл человеческого Фактора Х (4.1мкМ), 2.77мл буфера Хенкса (25мММ Тіз рН 7.4, 150мМ Масі, 2.7мМ КСІ, 5мМ

Сасі2, 0.195 В5А). В каждую из 96 ячеек планшета добавляли 40мкл смеси фактора ткани и Фактора Х, 25мкл

Фактора МіІіа, разведенного ТВ5, и 25мкл ОЕСК-Фактором Мііа, разведенного ТВ5. Для контроля использовали 4Омкл смеси фактора ткани и Фактора Х; контроль включал 4О0мкл смеси фактора ткани и Фактора Х, 20мкл

Фактора Мііа, разбавленного ТВ5, и 25мкл только ТВ5. К реакционной смеси в ячейки добавляли 1Омкл хромогенного субстрата 5-2222 (4мММ), смесь инкубировали 2 - 10 минут при комнатной температуре.

Результатьі анализировали при 405 нм со считьвающим устройством для микропланшетов, как описано вьіше.

Стандартная кривая получена с использованием возрастающих концентраций Фактора Мііа, добавленного в сч ов Отсутствие РЕСК- Фактора Мііа. Результатьі, представленнье в Таблице 10, показьівают, что существует дозозависимое усиление хромогенной активности по мере увеличения количества Фактора Ма, добавленного к (8) реационной смеси. Одновременное добавление изменяющихся количеств ОБОК-Фактора Мііа и Л00нНМ Фактора

Мііа привело к понижению хромогенной активности (Таблица 11). Зти даннье демонстрируют, что ОЕСК-Фактор

Мііа действует как конкурентньїй антагонист связьівания нативного Фактора Мііа с растворимь!м фактором ткани, б зо тем самьм ингибируя образование Фактора Ха, что определяется по снижению хромогенной активности по отношению к хромогенному субстрату 5-2222. «

Таблица 10. «-

Стимуляция хромогенной активности Фактора Ха возрастающими концентрациями Фактора Мііа, добавленного к растворимому фактору ткани. Изменение оптической плотности измерено с использованием 00 зв Хромогенного субстрата 5-2222. « « й З - ї» 15 ї» (ее) Таблица 11. - Подавление хромогенной активности Фактора Ха при добавлений ОЕСК-Фактора Ма к растворимому фактору ткани в присутствий нативного Фактора Міа. Изменение оптической плотности измерено с т. использованием хромогенного субстрата 5-2222.

Фо вто о ово ю о

Пример Х.

Подавление коагуляциий ОБОК-Фактором Ма.

Стандартнье анализь! свертьивания с целью изучения влияния ОЕСК-Фактора МІ! на время свертьівания бо проводили следующим образом: 100мкл нормальной плазмь! бабуина, полученной обработкой с цитратом натрия в качестве антикоагулянта, добавляли к 100мкл возрастающих концентраций ЮОЕСК-Фактора Мііа, разведенного ТВ5 (20мММ Тгтгів, рН 7.4 и 150мММ масі). Образцьі смешивали и недолго инкубировали при 37"7С.

Затем добавляли к автоматическому счетчику времени коагуляции ЕїПесіга 800 (Меадісаї! І арогаюгіез Аціотайоп,

Плизантвилле, Нью-Йорк). После инкубации 200мкл препарата фактора ткани, содержащего 20мММ хлористьй кальций, добавляли к препаратам СЕСК-Фактора Ма. Препарат фактора ткани готовили в виде зкстракта свежезамороженной мозговой ткани бабуина в физиологическом растворе и характеризовали по способности инициировать коагуляцию плазмь! бабуина. Бьіла вьібрана концентрация фактора ткани, которая обеспечивала время свертьівания порядка 40 секунд. 70 Данньюе, представленнье в Таблице 12, демонстрируют дозозависимое увеличение времени при добавленимй ОЕСК-Фактора Мііа. Такая низкая доза, как 1мкг/мл, вьізьівала значительное увеличение времени свертьівания. й т

Пример ХІ. сч

Подавление накопления тромбоцитов ОЕСК-Фактором Ма Исследована способность ОЕСК-Фактора Ма подавлять накопление тромбоцитов в сайтах артериального тромбоза при механическом повреждений у о нечеловеческих приматов. Использовали модель зндартерзктомийи аортьі! у бабуинов, в основном, как описано

Гитвзаеп еї аї., Віоса 81: 1762 - 1770 (1993). Часть артерии бабуина длиной 1 - 2см удаляли, инвертировали и вьіскабливали для удаления внутренней и примерно 50956 средней оболочки. Артерию вновь инвертировали, Фо зр Канюлировали по обоим концам и помещали в зкстракорпоральньй шунт бабуина, тем самьім освобождая посредством шунта механически поврежденную артерию бабуина от тока крови. Перед пуском крови через шунт Ж животному впрьскивали внутривенно собственнье тромбоцить, меченнье 111іп. Уровень накопления «- тромбоцитов в поврежденной артериийи определяли с помощью видеомонитора гамма-камерь!.

В исследований способности ЮОЕСК-Фактора Ма ингибировать накопление тромбоцитов применяли г) струйное введение ОЕСК- Фактора Міа или физиологического раствора в качестве контроля, которье « проводили перед открьїтием шунта. Измерения поврежденньїх артерий проводили непрерьівно в течение 60 минут. ОЕОК-Фактор Мііа в дозе 0.005мг/кг ингибировал накопление тромбоцитов. При струйном введений мг/кг подавление накопления тромбоцитов составило примерно 9095 через 1 час после введения препарата. Зти результать! представлень на фиг. 2. « 20 Пример ХІЇ. ш-в

ОЕСК-Фактор Ма подавляет сосудистьій рестеноз, возникающий после баллонной ангиопластики у с кроликов с атеросклерозом. :з» Исследована способность ОБОК-ЕМІа модулировать развитие патологических изменений после баллонной ангиопластики у кроликов породьії Новозеландская белая (МАМ/) с атеросклерозом. Зта модель хорошо 415 охарактеризована и считается подходящей для оценки действия соединений с антитромботическими їз свойствами на развитие сосудистьїх нарушений

СіІтріе еї аїЇ.,, СігсшацЦоп 86: 1536 - 1546 (1992); Кодовіа еї аїЇ., Сігсшайоп 89: 1262 - 1271 (1994)). (о) Животная модель, использованная для оценки ОЕСК-ЕМіІа, в основном, такая, как описанная Кодовзіа, там же. - Анестезию кроликам проводили внутримьшечной иньекцией Ббмг/кг ксилазина и З5Бмг/кг кетамина.

Проксимальнье бедреннье артерии подвергали веносекции ниже паховой связки с наложением проксимальной - и дистальной лигатурь. Вьіделеннье сегментьь канюлировали с иглами 27 размера. Вьїходнье отверстия с создавали проколом игльі. Вьіделеннье сегментьї промьивали физиологическим раствором от оставшейся крови, сушили воздухом, пропускаемьм со скоростью 8Омл/мин в течение 8 минут. После вьісушивания воздухом вьіделеннье сегменть! снова промьівали физиологическим раствором и удаляли лигатурьі. Гемостаз вв / поддерживали необтурирующим местньмм давлением. Сегментьї ограничивали металлическими зажимами.

Локальньй спазм снимали местной обработкой 195 ксилокайном. На следующий день после операции животньх (Ф) переводили на диету, включающую 195 холестерин и 695 масло земляного ореха, на один месяц до баллонной г ангиопластики. Для снятия постоперационной боли давали 10 мг/кг тиленола перорально в течение 3 - 5 дней.

После хирургической процедурь! давали 1см7 амбипена в течение З - 5 дней. 60 Доставка тестируемого препарата животньм включала начальное струйное введение непосредственно перед баллонной ангиопластикой, сопровождаемое непрерьівной системной инфузией через внутреннюю шейную вену с использованием осмотического насоса. Продолжительность инфузии препарата составила З суток. Контрольнье животнье получали 150 МЕ/кг гепарина струйно до баллонной ангиопластики, затем следовала инфузия физиологического раствора. Животньімм, получавшим БЕСК-ЕМІа, проводиди струйное 65 введение с дозой мг/кг, сопровождавшееся инфузией 5Омкг/кг/час.

При установке осмотических насосов для непрерьвной системной инфузии у животньїх проводили анестезию, как описано вьіше, и поддерживали ее в течение всей процедурь! дополнительньіми 1М иньекциями кетамина и ксилазина. Через разрез вдоль средней линии шеи вьіделяли отслаиванием правую внутреннюю шейную вену, дистальньій конец лигировали. Силиконовую трубку (РЕ-160) вводили в правую внутреннюю шейную вену. Подкожньій тоннель бьіл создан для прохода силиконовой трубки. Зту трубку соединяли с осмотическим насосом. Осмотический насос имплантировали подкожно на спине у кролика. Правую общую сонную артерию вьіделяли отслаиванием, дистальньій конец лигировали. Посредством сосудистого скальпеля устанавливали интубатор 5Е и перемещали его до соединения с дугой аортьі. Кровь брали для определения гемостатических параметров, содержания препаратов и холестерина. Внутриартериально впрьіскивали. 20мг 7/0 Ксилокайна. Контрольную ангиографию шейной артерии проводили посредством катетера Бермана 5БЕ, расположенного под аортальньм разветвлением с использованием З - 4мл ренографина, введенного вручную через З секунднь!.

После удаления катетера Бермана в нисходящую аорту вводили 0.014-дюймовьій проволочньїй направитель и располагали его над аортальньмм разветвлением. Под рентгеноскопическим контролем вводили баллонньй /5 Катетер для ангиопластики соответствующего размера от 2.0 до 2.5мм, продвигали его над проволочньм направителем и вводили в стеноз. Баллон накачивали до батм. в течение 60 секунд вручную. Проводили три накачивания с интервалами в 60 секунд. Зту процедуру вьіполняли в обеих бедренньїх артериях у каждого животного.

После баллонной дилатации ангиопластический катетер извлекали и снова вводили катетер Бермана в го положение З см над аортальньм разветвлением. Для уменьшения спазма внутриартериально вводили 20мг лидокаийна. Постоперационная ангиограмма бьла получена, как описано вьіше. Растр (1см) располагали на уровне бедренной артерии для того, чтобьі! рассчитать фактический диаметр. Затем удаляли катетер. Правую сонную артерию лигировали шелком З - 0, рану ушивали послойно. Амбипен и ацетаминофен давали, как описано вьіше. с

Протромбиновое время и концентрацию ОЕСК-ЕМіІа в крови определяли непосредственно перед струйньм введением препарата, через 1 час после струйного введения и через З суток в конце непрерьівного введения. і)

Получали 1 - 2мл обработанной цитратом плазмь! и определяли протромбиновое время и уровни антигена.

Стандартньїй анализ свертьівания использовали для того, чтобьї контролировать протромбиновое время у контрольньїх и обработанньїх ОБОК-ЕМІа животньїх следующим образом: 25мкл тестируемой плазмь! кролика, Ге! зо обработанной цитратом натрия в качестве анти коагулянта, добавляли к 150мкл ТВ (20мМ Ттів, рН 7.4, 150ММ масі). Образцьї перемешивали и присоединеньі к автоматическому коагуляционному таймеру ЕЇІесіга 800 - (Медіса! І арогагієв Аціотайоп, Плизантвилле, Нбю-Йорк). После инкубации к плазме добавляли 200мкл «- препарата тромбопластина (Зідта Спетісаї), содержащего 25мММ хлористьїй кальций. Вьібирали концентрацию тромбопластина, при которой время свертьивания контрольной кроличьей плазмь! составило примерно 20 со зв секунд. «г

Метод ЕГПІ5ЗА (иммуноферментньій анализ) использовали для определения концентрацимй ОЕСК-ЕМІа в образцах плазмь контрольньїх и обработанньх ОЕСК-ЕМІа окроликов. Анализ включал разведение моноклонального антитела к человеческому анти-ЕМІ! (Ог. МУ. КІзІєї, Университет Нью-Мексико) до 20мкг/мл в 0.1

М карбонатном буфере , рН 9.6 и добавление 100мкл на ячейку в планшеть! с 96 ячейками. Затем планшеть « инкубировали при 4"С в течение ночи, после чего промьівали дваждь! водньм буфером (РВ5, рН 7.4, в) с содержащий 0.0595 Ту'ееп 20). Подавление неспецифических сайтов связьшвания достигали при использований

Й 200мкл блокирующего буфера на ячейку (РВ5, рН 7.4, содержащий 0.059565 Тмееп 20 и 195 ОА), инкубации при и?» 37"С в течение 2 часов и последующей обработки промьівньїм буфером.

После блокирования добавляли серию стандартньїх разведений ОБОМК-ЕМІІа, изменяющихся в пределах 20 - 9.027нГ/мл, наряду с серией разведениий тестируемой кроличьей плазмь! (1 : 100 до 1 : 4000 в блокирующем ї5» буфере) по 100мкл на ячейку. В качестве отрицательного контроля использовали плазму неиммунизированньх кроликов. Затем планшетьї инкубировали в течение 1 часа при 37"С, после чего обрабатьвали промьівнь!м со буфером. - Определяли ОЕСК-ЕМІИа добавлением О0Омкл на ячейку разбавленного 1 : 1000 кроличьего 5р поликлонального антитела к человеческому анти-РМІ! (Ог. Ківієї, Университет Нью-Мексико) в блокирующем ве буфере. Планшеть инкубировали 14 при 37"С, затем пятикратно обрабатьшвали промьівньм буфером.

Ге) Специфическое связьіивание антитела определяли с использованием 1О0Омкл на ячейку разведения 1 : 2000 коньюгата козье антитело к кроличьему дО - пероксидаза (Тадо, Іпс.). Планшеть! инкубировали 1ч4 при 37"С и шестикратно обрабатьшали промьівньм буфером. В заключение добавляли 10О0мкл раствора субстрата дво (0.42мг/мл дигидрохлорида о- фенилендиамина (ОРО) в 0.2М цитратном буфере с рН 5.0, содержащем 0.390 перекись водорода). Через 1 - З минутьь при комнатной температуре цветную реакцию останавливали

Ф) добавлением 100мкл на ячейку 1 н. серной кислотьї и содержимое планшетов анализировали при 490нм с ка использованием микропланшетного спектрофотометра. Концентраций ОЕСК-ЕМІа ов образцах плазмь! определяли сопоставлением получаемьїх значений А490 со значениями стандартной кривой для ОБОК-ЕМІа. во Результать! анализа образцов плазмь! на протромбиновое время и уровни антигена ОБОМК-ЕМІІа приведень в Таблице 13 и Таблице 14, соответственно. Данньіе представлень для каждого животного в отдельности. В

Таблице 15 приведена сводка средних величин времени свертьшания. Во всех случаях обработаннье с

РЕСК-ЕМіІа животнье имели повьішенное значение протромбинового времени в точке, соответствующей 1 часу после струйного введения; в точке, соответствующей третьему постоперационному дню, оно почти достигало 65 уровней предварительной обработки. Анализ антигена ОБСК-ЕРМіІа также вьіявил его вьісокий уровень в точке, соответствующей 1 часу, изменяющийся в пределах 2 - бмкг/мл, и уровни намного ниже в точке,

соответствующей третьему дню. Уровни ОЕСК-ЕМІа, оизмереннье через 1 час, соответствовали предполагаемому повьішению протромбинового времени, установленному обработкой нормальной кроличьей плазмьї с ОЕОК- ЕМііа Іп міго и определением протромбинового времени анализом стандартного разведения тромбопластина.

Число животньхх Обработ-ка |Предвари-тельная обработка |Время свертьвания (секундь) я ів

ПИ НИК НН НЕК

С ввововтма 00101010 мА сч 5)

М/А - нет данньмх

Ф зо

Число животньх |Обработка | Предвари-тельная обработка « нин ши іон шк ій нини со зв 11111101 Контольі 0 МА - 61111111 Контолуо 0 МА) не г От НТ 11111111 контор 071101 « нт т У ШЕ НЕ т НОЯ нт ли У т ЕТ 8 с я 11111111 оБовРУн 032 лог й вв оБовРУНнар ла лез вв) вв ововемнар 65 яв) в» со 11111111 ововямна! | ово ов - М/А - нет данньх. т с

Пеларннйстях 00000010 ло зв щі С жютльо вр оо; лв1100000вв м С Ввсяма 60232108

Зепарнйтттх 00000000 частою бо

С жаюрюо 6м5 33600001

С бввяма, 6) лов) 50000026 бо Непарньій і-тест Х З дня после жюрі вролев лів

Через три недели после ангиопластики непосредственно перед умерщвлением повторяли контрольную /о ангиограмму, как описано вьіше, используя левую сонную артерию. Через вертикальньій абдоминальньй разрез изолировали дистальную аорту и вставляли перфузионную канюлю над аортальньм разветвлением.

Дистальную аорту промьшшвали 5Омл физиологического раствора, затем фиксировали Іп мімо введением в течение 15 минут при 120мм рт. ст. 5б0О0мл раствора Нівіоспоїсе (АМКЕЗСО, Солон, Огайо). Как только начиналась перфузия, животньїх умертвляли сверхдозой нембутала (Змл (б5мг/мл) раствора пентобарбитала внутривенно). Сегмент (5см) бедренной артерии иссекали билатерально. Для оптической микроскопии ткань сохраняли в растворе Нізвіоспо!се.

Для того, чтобьі обнаружить появление повреждения в сайте баллонной ангиопластики, из иссеченньх бедренньїх артерий вьрезали Змм срезь, заливали парафином, брали срезьй областей артерии с множественньми поражениями. Готовили препаратьі срезов на опредметньх стеклах, окрашивали ро Тематоксилином, зозином и красителем Мап Сіетвоп. С использованием программь! Биоквант проводили морфометрический анализ для получения данньїх о просвете, внутренней и средней оболочке артерий. С помощью морфометрического анализа срезов от поврежденньїх артерий проводили измерения всей площади просвета; площади внутренней оболочки, полученной измерением области во внутреннем зластическом слое и вьчитанием соответствующей площади просвета каждого среза; площади средней оболочки, определенной сч ов Мзмерением области внутри внешнего зластического слоя и вьчитанием площади внутри внутреннего зластического слоя. Измерения повреждений внутренней оболочки (интимьї) бедренньїх артерий у контрольньх (8) и обработанньхх ОБОМК-ЕМІІа животньїх показали, что наблюдалось значительное снижение размера интимь! у животньїх, обработанньх ОЕСК-ЕМІИа (Таблица 16). В противоположность зтому, измерения медиальной области не вніявили заметньїх отличий между зтими двумя группами. б зо « - со зв бесвтиа. 0060000ояз;0ле? «

Группа Средняя (мм?) Станд. откл. |Вероят-ность (2-сторонний тест)

М ни іонні НА пооіній рвсвямта| лоозгаоло 71 ч

Й Й ші

Даннье ангиографических измерений представлень в Таблице 17 в виде значений среднего светового с диаметра (среднего диаметра просвета) (МІ 0) я/- стандартное отклонение для контрольньїх и обработанньх :з» рЕСВК-ЕМіІіа животньїх для всех трех временньїх точек: непосредственно перед ангиопластикой, сразу после и через 21 день после ангиопластики. Нє отмечено значительньх различий в значениях МІ О между контрольнь!ми

М обработанньми СЕСК-ЕМІІа животньіми ни до, ни сразу после ангиопластики, Однако, заметное повьішение їз значения МІ О наблюдалось у животньїх, обработанньїх ОБОК-ЕМІІа, на 21-ьій день после ангиопластики. со - то» со

Вест 00лоизвз) 00019000 5 (2-сторонний тест) о ще Вест 00018323)

Группа Коли-чество МІ О|Станд. откл. Вероятность ві ОМ 00 боденюту встємна! лоза ом!

Пример ХІПІ. бо Подавление ОЕСК-Фактором Мііа генерации поверхностного Фактора Х на ЗМСз бабуина.

Проведен поверхностноклеточньїй хромогенньій анализ, в основном, как описано вьіше в Примере МІЇЇ, для определения зффективности ОЕЄОК-ЕМіІа в подавлений связьівания ЕМііа с поверхностноклеточньїм фактором ткани и последующего превращения Фактора Х в Фактор Ха на монослойньїх клетках гладкой мьішць! (ЗМС5) бабуина. Метод является модификацией методик, описанньх закаїЇ еї аї., 9. ВіоІ. Спет. 264: 9980 - 9988 (1989);

УУПадоозе еї аї., Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА 87: 7290 - 7294 (1990). Бабуиновне ЗМО» получали из Университета

Вашингтона (Сизтл, Вашингтон) и культивировали из имплантатов аорть Бабуийновье 5МСв5 вносили в культуральнье чашки с 96 ячейками в концентрации 8000 клеток на ячейку в 200мкл на ячейку средьї ОМЕМ с добавкой 1095 змбриональной телячьей сьіворотки и вьідерживали в зтой среде в течение 4 дней при 37"С в атмосфере 595 СО2. При анализе удаляли 11О0мкл культуральной средь! и в ячейки добавляли возрастающие 7/0 Концентрации РМІа в комбинации с ОЕСК-ЕМіІІа. Бьіла получена стандартная кривая для концентрации ЕМіІа, изменяющейся в пределах 5 - 0.4НМ. Для оценки ингибиторного действия ОЕСК-ЕМіІа на активность ЕМіІІа в тестируемье ячейки добавляли возрастающие концентраций ОЕСК-ЕМІа в присутствии постоянного количества (5НМ) ЕМіїа. И ЕМІа, и ОЕЄСК-ЕМІа разбавляли буфером НЕРЕ5 (10мММ НЕРЕЗ5, 137мМ Масі, 4мММ

КСІ, 5мМ Сасі?2, 11мММ глюкоза, 0.195 ВЗА) и 1Омкл 10х исходньїх растворов, добавленньїх к клеткам. Клетки /5 инкубировали с тестируемьми соединениями в течение 2 часов при 37"С, затем триждь! промьівали буфером

НЕРЕЗ. Затем в каждую ячейку прибавляли 5О0мкл 200нНМ раствора Фактора Х в Тгіз-буфере (25мМ Тгтгів, рН 7.4, 150мММ Масі, 2.7мМ КСІ, 5мМ Сасіг, 0.1956 ВА). Через 4 минуть! при комнатной температуре добавляли 25мМкКл 0.5М ЕОТА для того, чтобьї остановить превращение Фактора Х в Ха. Прибавляли 25мкл на ячейку 0.8М Фактор

Ха-специфичного хромогенного субстрата 5-2222 в Тгіз-буфере и через 60 минут измеряли поглощение при 405нм в микропланшетном считьявающем устройстве ТПегтотах (Моіесшаг ЮОемісез Согр., Менло-Парк,

Калифорния).

Результатьі, представленнье на фиг. З, демонстрируют дозозависимое увеличение амидолитической активности в ячейках, обработанньїх ЕМіІІа (незаштрихованнье квадратьї). Повьішение поглощения является прямьмм измерением уровня Фактора Ха, генерированного в ячейках, и последующего расщепления им с ов Хромогенного субстрата. Добавление возрастающих количеств ОБОМК-ЕМІа при постоянном количестве ЕМІа (5НМ) вьізвало дозозависимое снижение амидолитической активности (закрашеннье квадрать!). Зквимолярнье і) количества ЮЕСК-ЕМІИа и ЕМПа способньї ингибировать более 9095 хромогенной активности. Даже при сниженном 10-кратно уровне ОЕСК-ЕМІа еще наблюдаєтся 4095 ингибирование хромогенной активности

Фактора Ха. Зти результать! подтверждают заключение о том, что ОБЕЄОК-ЕМіІІа является чрезвьічайно сильньім Ге! зо антагонистом активации Фактора Х в Ха в присутствии ГМіІІа на поверхности интактного клеточного монослоя

ЗМСв. Пример ХІМ. Влияние ЮОЕСК-Фактора Ма на возникновение сосудистого тромбоза и сосудистьх - нарушений у бабуинов. «-

Бьіла исследована спосбность человеческого ЮЕСК-Фактора Ма ингибировать фактор ткани (ТЕ) и опосредованное активированньм Фактором МІ (ЕМІПа) образование сосудистьїх нарушений (МІР), со з5 индуцированньїх механическим повреждением сосудов у нечеловеческих приматов. «г

РЕСК-Фактор Мііа вводили внутривенно в течение 7 дней (5 животньїм) или З0 дней (1 животному), начиная непосредственно перед возникновением механического сосудистого повреждения. Измерения образования сосудистого повреждения проводили на 30-ьій день. Результатьї, полученнье у 5 обработанньїх животньх, сопоставляли с данньіми для 5 параллельньїх контролей с инфузией наполнителя в буфере. «

Базовье значения получали при определении у животньїх: а) количества тромбоцитов, нейтрофилов, в с моноцитов и зритроцитов; б) уровня плазменного фибриногена; в) уровней активности плазменньїх факторов коагуляции МІЇ, Мііа, Х и М, наряду с антигенностью РМІЇ; г) базовьій образец плазмь!ї для определения антител к ;» анти-Фактору Ма.

При анестезии галотаном и стерильньїх операционньїх условиях животнье, меченнье аутологичньіми 111Іп-тромбоцитами, получали внутривеннье вливания с использованием всей системь непрерьівного ї5» внутривенного введения (начальное струйное введение 1мг/кг, сопровождавшееся непрерьівньім внутривеннь!м вливанием 5БОмкг/кг/час). Животньм проводили хирургическую зндартерзктомию сонной артерии, со билатеральную ангиопластику плечевой или бедренной артерии с помощью катетера Фогарти. - ОЕСК-ЕМИПа вводили в течение 7 или 30 дней непрерьвной инфузией через венозньій катетер с Мспользованием всей системь. Через 30 дней после хирургического вмешательства животному давали ве галотановьій наркоз и проводили фиксацию іп 85йи методом оперфузии под одавлением с 495

Ге) параформальдегидом, содержащим 0.19 глутаровьій альдегид, в течение ЗО минут. Затем отбирали сегменть (содержащие ранее поврежденньве сайтьї) с использованием методик Нагкег еї аї., СігсшайнНоп 83: 41 - 44 (1991);

Напзоп еї аї., Нурепепвіоп 18: 1170 - 1176 (1991). Образцьі подвергали вторичной фиксации Іп мІго (490 параформальдегидом, содержащим 0.175 глутаровьй альдегид), замораживали и подготавливали для морфометрического анализа области поражения.

Ф) Мсследовали 11 нормальньх зрельх бабуинов (Раїо апибрів). Шесть животньїх получали вливания ка (5Омкг/кг/час), остающееся пять служили контролем, не получавшим ОЕСК-ЕМІа. Животнье бьіли дегельминтизированьі! и находились под наблюдением, чтобьі избежать заболеваний, в течение трех месяцев бо перед использованием. Все процедурьі бьли утвержденьі Институциональньм комитетом по уходу и использованию животньїх и находились в соответствии с процедурами и методами, изложенньми в "Руководстве Национального института здоровья по уходу и использованию лабораторньїх животньмх", и подобньми институциональньми правилами. Инвазивнье процедурьї проводили под анестезией галотаном после индукции кетамином (1Омг/кг внутримьшечно) и валиумом (0.5мг/кг внутривенно). Для последующей 65 Кратковременной иммобилизации при проведений постоперационньх зкспериментальньх процедур использовали гидрохлорид кетамина (5 - 20мг/кг внутримьішечно).

Зндартерзктомию сонной аотерии проводили посредством разреза по средней линии шеи с использованием приемов, описанньїх Напвоп еї аї., Нурегіепвіоп 18: 1170 - 1176 (1991); КгиреКіІ еї аї., СіссшШайНоп 84: 1749 - 1757 (1991), включенньїх здесь в виде ссьілок. Зндартерзктомию использовали в качестве модели сосудистого Ннарушения вследствие ее клинической важности и потому, что, как бьло показано, МІР, вьзванное зндартерзктомией нормальньїх артерий, является воспроизводимьм. Кратко, обьічную сонную артерию иссекали из окружающих тканей от ключиць! проксимально до бифуркации сонной артерии дистально. Обьічную артерию пережимали с использованием атравматических сосудистьїх зажимов на каждом конце вьіделенного сосуда через З минуть! после струйного введения сульфата гепарина (100МЕ/кг внутривенно; ЕїІКІпз-ЗІтт Іпс., 7/0 Черри-Хилл, Нью-Джерси) и отделяли см, проксимальньій к дистальному пережиму. Затем проксимальньй артериальньій сегмент вьіворачивали над изогнутьм зажимом. После того, как достигалось максимальное вьіворачивание, в вьіделенном в просвете сегменте накладьівали одну пару полипропиленовьїх швов (7 - 0) на любую из сторон проксимально и вторую пару дистально. Затем проводили Зндартерзктомию, начиная в 1см от отделенного конца вьівернутого сосудистого сегмента и продолжая на измеренное расстояние в см. Зта /5 процедура включаєт механическое удаление нормальной внутренней оболочки и частичное уплотнение средней оболочки с использованием зажима и хирургического микроскопа (увеличение 32х). После зндартерзктомии сосуду возвращали его обьічную конфигурацию и налагали анастомоз "конец-к-концу" с помощью полипропиленового шва (ТО) и постоянной техники при 2.5- кратном увеличении, рану зашивали послойно.

При морфометрическом анализе исследовали срезьі, залитье парафином и обработаннье красителем для компонентов соединительной ткани (коллаген, зластин) и смесью гематоксилин- зозин, с использованием фотоскопа (7еіІ55), соединенного с системой обработки изображения (Тпотаз Оріїса! Меазигетепі Зувіетв,

Колумбус, Джорджия), состоящей из камерь микроскопа ССО вьісокого разрешения (580 линий), присоединенной к монитору вьісокого разрешения (700 линий), компьютеру ІВМ 386, 80 МБ с графическим сч ВВОДОМ ВьІсОКОго разрешения для получения и хранения изображения. Количественную обработку изображения проводили с использованием орфометрического програмного обеспечения (Орітавз, Віозсап Іпс., Здмондс, і)

Вашингтон). В артериальньхх поперечньх срезах анализировали общую площадь пролиферативного повреждения неоинтимь! и соответствующую площадь артериальной средней оболочки. Для статистического анализа сравнение между группами проводили с использованием і-теста Стьюдента (двустороннего для парньїх ду зо М непарньх данньх).

Результать! показали, что площадь интимь! значительно снижена у животньїх, обработанньїх ОЕСК-Факторм -

Ма в течение 7 дней и наблюдавшихся до 30 дней, по сравнению с контрольньмми животньіми, которье не «- получали ЮЕСК-Фактор Ма (фиг. 4). Подобнье результатьї полученьї у животньїх, обработанньїх ОЕСК-

Фактором Мііа в течение 30 дней и наблюдавшихся до З0 дней. со

Предварительнье исследования с моделью баллонной ангиографии плечевой артерии не наводили на «г мМьІісль о заметном преимуществе терапиий с ОЕСК-Факторм Мііа. Однако, на бабуйинах не бьіло показано, что зта модель является протромботической, в которой ключевую роль играет фактор ткани.

Мсследования баллонного повреждения бедренной артерии у бабуинов действительно показали статистически значимое преимущество ОЕЄОК-Фактора Мііа по сравнению с контролем, как показано на фиг. 5. «

Пример ХІМ з с Влияние ОЕСК-Фактора Мііа на ІРА-индуцированньй тромболиз.

Постоянное образование коронарньх тромбов при остром инфаркте миокарда опосредовано, в первую ;» очередь, фактором ткани (ТЕ) в комплексе с Фактором Ма через внешний коагуляционньій метаболический путь. Біло изучено влияние дополнительного ингибирования коагупяционного каскада в различньїх точках

Ввнешнего метаболического пути на зффективность тромболиза, индуцированного активатором тканевого їх плазминогена (ІРА).

Тридцати шести собакам с индуцированньми злектрическим током коронарньми тромбами в ходе со тромболиза с ІРА (мг/кг, дольше 20 минут) назначали одну из четьірех дополнительньїх обработок: 9 получали - клещевой антикоагулянтньй пептид (ТАР), селективньїй ингибитор Фактора Ха, в дозе ЗОмкг/кг/мин в течение 90 5р Минут. Комплекс ТЕ-Фактор Ма подавляли рекомбинантньім ингибитором метаболизма фактора ткани (ТЕКІ) ве (100 - 15О0мкг/кг/мин в течение 90 минут) у 9 собак и ОБОМК-ЕМІІа (1 - 2мг/кг струйно) в качестве конкурентного

Ге) антагониста активированного Фактора Мііа у 9 собак. В качестве контроля 9 собак получали физиологический раствор. Собаки находились под наблюдением по поводу реокклюзии в течение 120 минут после тромболиза.

Даннье о влияний зтих агентов на зффективность тромболиза приведеньй ниже в Таблице 18 (даннье ов представлень в виде средних значений ч/- ЗО). о ю 111 рересторірєсяма| тет тав 5 х Значение отличается от контроля с физиологичесикм раствором с уровнем значимости альфа - 0.05.

Из зтих данньїх следует, что ингибирование внешнего метаболического пути либо Фактором Ха, либо 65 блокадой комплекса ТЕ-Фактор Ма с ОЕСК-ЕМПа или ТЕРІ ускоряло (РА-индуцированньій тромболиз.

Селективное ингибирование Фактора Ха более зффективно поддерживает раскрьттое состояние артерии после успешной реперфузии.

Пример ХМ.

Модифицированньй Фактор Ма ингибирует образование внутрисосудистьїх тромбов, не оказьївая воздействия на системную коагуляцию.

Для того, чтобьії определить, приводит ли ингибирование связьівания Фактора МІ! с ТЕ к антитромботическим зффектам, бьли инициированьй изменения циклов кровотока (СЕМ5), вьізьіваемье рецидивирующим тромбообразованием, путем помещения внешнего зажима вокруг кроличьих артерий с поврежденньм 7/0 Зндотелием (метод Фоттса). После помещения зажима вокруг артерий СЕМ8 развивались со средней частотой 11 ж4у- 2 циклов/час у б из б кроликов в то время, как скорость кровотока в сонной артерии составляла в среднем 5 17/- 295 от базовьіїх значений при самом низком уровне СЕМ5. После наблюдения СЕМ» в течение 30 минут животнье получали вливание человеческого рекомбинантного блокированного по активному центру (Рпе-Рпе-Агд-хлорметилкетон) Фактора МІ! (ЕМіІІаЇ) (0О.1мг/кг/мин в течение 10 минут). Фактор Ма! полностью 7/5 бнимал СЕМ» у 6 из 6 животньх (частота СЕМ - 0 циклов/час; р « 0.05; скорость кровотока через сонную артерию равна 106.995 от базовьїх значений; р - М5 против базовой линии). Через 30 минут после ингибирования СЕМ5 вводили человеческий рекомбинантньй ЕМііа в дозе 0.1 мг/кг/імин в течение 10 минут. Инфузия Фактора МіІІа восстанавливала СЕМе у всех животньїх, тем самьм показьюшвая, что связьивание Фактора Ма с ТЕ бьіло конкурентньім. Значения протромбинового времени, времени активации и агрегации тромбоцитов ех мімо в ответ 2о на АОР (аденозиндифосфат) и тромбин после инфузии ЕМіїаІ не отличались при сравнений с базовьіми значениями. Таким образом, ЕМІІ-МІіа играет важную роль в инициированиий тромбообразования п мімо.

Введение Фактора МііаІ вьїзьшаєт на зтой модели сильнье антитромботические зффектьі, не оказьвая воздействия на системную коагуляцию.

Из всего упомянутого очевидно, что полученьії составьі Фактора МІЇ или Ма с модифицированньми сч об Ккаталитическим сайтами, способнье связьввать фактор ткани, однако не способнье существенно активировать

Факторьі! Х и ЇХ. Поскольку модифицированньій Фактор МІ! специфически прерьіваєет каскад свертьівания, не і) нарушая или не удаляя факторь! свертьівания, введение препаратов модифицированного Фактора МІ! будет сопровождаться меньшими нежелательньми побочньми зффектами, чем те, которье известнь! по опьту современной терапии. Далее, модифицированньій Фактор МІЇ, описанньй здесь, может бьїть легко получен Ге! зо рекомбинантньми способами. Таким образом, зффективность, удобство и зкономическая вьігода от низких доз и снижения частотьі введения, а также относительная потеря токсичности составляют преимущества, - обеспечиваемьсе составами настоящего изобретения. «-

Хотя вьішеупомянутое изобретение и описано достаточно подробно с привлечением иллюстраций и примеров для улучшения понимания, очевидно, что могут бьїть предпринять! некоторье изменения и со з5 Модификации в рамках прилагаемой формуль изобретения. «г

Claims (1)

1. Формула винаходу

   «

   1. Способ ингибирования активности фактора ткани у пациента, заключающийся во введении пациенту ш-в с терапевтически зффективной дозьі состава, отличающийся тем, что упомянутьій состав состоит из фактора МІЇ, имеющего, по крайней мере, одну модификацию в своем активном центре, модификация которого :з» существенно подавляет способность модифицированного фактора МІІ активировать плазматический фактор Х или ІХ.

   2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что модификация включаєт в себя реакцию фактора МІ! с ингибитором їз серинпротеазь..

   З. Способ по п. 2, отличающийся тем, что ингибитор протеазьі представляет собой фосфорорганическое бо соединение, сульфонилфторид, пептидсодержащий галометилкетон или азапептид.

   - 4. Способ по п. З, отличающийся тем, что ингибитор протеазьі представляет собой пептидсодержащий 5р галометилкетон, вьібранньй из ОапзуІ- РПІе-Рго-Агд-хлорметилкетона, Юапзу!-СІШ-СІу-Агд-хлорметилкетона, - БапвуІ-Рпе-Рпе-Агд-хлорметилкетона и РПе-РПе-Агд-хлорметилкетона. Ге 5. Способ подавления отложений тромбоцитов у пациента, заключающийся во введений пациенту терапевтически зффективной дозьі состава, отличающийся тем, что упомянутьій состав состоит из фактора МІЇ, имеющего, по крайней мере, одну модификацию в своем активном центре, модификация которого Сбущественно подавляет способность модифицированного фактора МІ активировать плазматический фактор Х или ІХ. (Ф) 6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что модификация включает в себя реакцию фактора МІ! с ингибитором ГІ серинпротеазь..

   7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что ингибитор протеазьі представляет собой фосфорорганическое бо боединение, сульфонилфторид, пептидсодержащий галометилкетон или азапептид.

   8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что ингибитор протеазьі представляет собой пептидсодержащий галометилкетон, вьібранньй из ЮапвуІ- РПНе-Рго-Агда-хлорметилкетона, ЮапзуІ-СІШ-с1Іу-Агд-хлорметилкетона, БапвуІ-Рпе-Рпе-Агд-хлорметилкетона и РПе-РПе-Агд-хлорметилкетона.

   9. Способ по п. 5, отличающийся тем, что модификация фактора МІ! включает в себя замену, включение или де Уудаление, по крайней мере, одной аминокислоть! в каталитической триаде Зег, Авр, Нів.

   10. Способ подавления сосудистого рестеноза у больного, заключающийся во введений пациенту терапевтически зффективного количества состава, отличающийся тем, что упомянутьй состав включает в себя фармакологически приемлемьй фактор МІ, имеющий, по крайней мере, одну модификацию в своем каталитическом центре, которая существенно подавляет способность модифицированного фактора МІ активировать плазматический фактор Х или ІХ.

   11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что модификация фактора МІ осуществляется реакцией фактора МІЇ с ингибитором серинпротеазь.

   12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что ингибитор протеазьі представляет собой фосфорорганическое соединение, сульфонилфторид, пептидсодержащий галометилкетон или азапептид. 70 13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что ингибитор протеазьі! представляет собой пептидсодержащий галометилкетон, вьбранньй из ЮапзуІ- РПНе-Рго-Агда-хлорметилкетона, ЮапзуІ-СІШ-с1Іу-Агд-хлорметилкетона, БапвуІ-Рпе-Рпе-Агд-хлорметилкетона и РПе-РПе-Агд-хлорметилкетона.

   14. Способ по п. 10, отличающийся тем, что модификация фактора МІ! включаєет в себя замену, включение или удаление, по крайней мере, одной аминокислоть! в каталитической триаде Зег, Агвр, Нів.

   15. Способ по п. 10, отличающийся тем, что он используется для рестеноза, являющимся вторичньім по отношению к механическому повреждению артерии.

   16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что упомянутое механическое повреждение вьізьівается баллонной ангиопластикой, зндартероктомией, редукционной атерзктомией, установкой стента, лазерной терапией или иссечением распадающейся ткани.

   17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что состав вводят пациенту в течение 24 часов до механического повреждения упомянутой артерии.

   18. Способ по п. 15, отличающийся тем, что состав вводят пациенту после механического повреждения упомянутой артерии.

   19. Способ по п. 10, отличающийся тем, что он используется для рестеноза, наблюдаемого в сосудистом сч имплантате, стенте, шунте или органном трансплантате. з й о

   20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что состав вводят пациенту в течение 24 часов до установки упомянутого имплантата, стента, шунта и органного трансплантата.

   21. Способ по п. 19, отличающийся тем, что состав вводят пациенту после установки упомянутого имплантата, стента, шунта и органного трансплантата. б зо 22. Способ по п. 10, отличающийся тем, что он включает в себя дальнейшее введение упомянутого активатора тканевого плазминогена или стрептокиназь. -

   23. Способ лечения острой закупорки коронарной артерий у пациента, заключающийся во введений «- пациенту состава, отличающийся тем, что упомянутьй состав включает в себя фармакологически приегмлемьй фактор МіІЇ имеющий, по крайней мере, одну модификацию в своем каталитическом центре, которая со Зз5 Ссущественно подавляєт способность модифицированного фактора МІ активировать плазматический фактор Х «Е или ІХ в сочетаний с активатором тканевого плазминогена или стрептокиназой.

   -

   . и? щ» (ее) - щ» іЧе) іме) 60 б5