UA73076C2 - Aqueous aerosol preparations containing biologically active macromolecules and method for their manufacture - Google Patents

Description

Опис винаходу

Даний винахід стосується способу одержання аерозолів для інгалятивного введення в організм білків і інших 2 біологічно активних макромолекул, а також стосується водяних препаратів для одержання таких аерозолів і, зокрема, до водяних препаратів висококонцентрованих розчинів інсуліну для інгалятивного введення їх в організм при лікуванні діабету.

Застосування лікарських речовин у формі придатних для інгаляції аерозолів відомо давно. Такі аерозолі служать не тільки для лікування захворювань дихальних шляхів, таких як астма; вони застосовуються також і в 710 тому випадку, коли легкі або слизуваті оболонки носу повинні служити в якості резорбційного органу. Часто при цьому утримування активної речовини в крові може бути доведене до таких значень, що стає можливим лікування захворювань також і в інших частинах організму. Придатні для інгаляції аерозолі можуть бути використані також і в якості вакцин.

На практиці для одержання аерозолів використовується декілька способів. Ці способи включають або 72 розбрискування суспензій або розчинів біологічно активних речовин за допомогою газів-витискачів, або турбулізацію активних речовин у формі мікронізованих порошків у вдихуваному повітрі, або, нарешті, розпилення водяних розчинів за допомогою пульверизаторів.

Однак у випадку молекул, які мають більш складну будівлю, таких як, наприклад, інтерферони, розпилення водяних розчинів може легко призводити до небажаного зниження активності біологічно активної речовини, здогадно в результаті зрушуючи зусиль і нагрівання. Передбачається, що в цьому процесі грає роль, наприклад, утворення менш активних білкових агрегатів. А.МІр і колеги в їхній статті "еЗїарійу ої гесотріпапі сопзепвиз іпіепегоп йо аї|ей апа шйгазопіс першіізайоп" (Стійкість рекомбінатного консенсного інтерферону до повітреструміневого й ультразвукового розпилення"), опублікованої в .). РНагт. зсоі. 84:1210-1214 (1995), описали приклади утворення агрегатів інтерферону після ультразвукового або струмінного с розпилення, яке супроводжувалося втратою біологічної активності інтерферону. Навіть якщо руйнування Ге) біомолекули (біологічно активної макромолекули) і є неповним, усе рівно в цьому випадку зменшення активності має важливе значення, так як воно викликає більшу витрату, як правило, біомолекул, які багато коштують, і зниження точності дозування активного лікарського засобу за один хід поршня. Зниження активності більш складних молекул під час одержання аерозоля не обмежується одними тільки інтерферонами, воно має місце в о більшому або меншому масштабі також під час аерозолювання інших білків |(див., наприклад, Мімеп еї аї., Рпагт/ -

Кев/12: 53-59 (1995)) і біомолекул.

Поряд із технічним одержанням аерозоля, який містить біомолекулу, необхідна друга стадія, мета якої о складається в тому, щоб абсорбувати біомолекули в легенях. Легеня дорослої людини дає велику поверхню для со абсорбції, однак воно створює також деякі перешкоди для легеневої абсорбції біомолекул. Після вдиху через ніс або рот повітря разом із зерозолем, яке воно переносить, входить у трахею і потім через бронхи і бронхіоли, - які усе більше і більше зменшуються, в альвеоли. Альвеоли мають набагато більшу поверхню в порівнянні з трахеєю, бронхами і бронхіолами, разом узятими. Вони є головною зоною абсорбції, не тільки кисню, але також і біологічно активних макромолекул. Щоб потрапити з повітря в кров'яне русло, молекули повинні перетнути « альвеолярний епітелій, капілярний ендотелій і межуточний простір, який містить лімфу, між цими двома З клітинними шарами. Це може бути здійснене в результаті активних або пасивних процесів переносу. Клітки в цих с двох клітинних шарах розташовані щільно одна до іншої, так що більшість великих біологічних макромолекул

Із» (таких як, наприклад, білки) можуть пройти через цю перешкоду набагато повільніше в порівнянні з більш дрібними молекулами.

Процес перетинання альвеолярного епітелію і капілярного ендотелію відбувається при конкуренції з іншими біологічними процесами, які призводять до руйнування біомолекули. Бронхо-альвеолярна рідина містить і екзопротеази |див., наприклад, УМаїї, О.А. па ІГапині, АТ. "Нідпй Іемеіїв ої ехорерііїдазе асіїміу аге ргезепі оз іп гаї апа сапіпе Бгопсоаімеоіаг Іамаде Яшцій" (Високі рівні активності екзопептидази у бронхоальвеолярній промивній рідині пацюків і собак) у: Іпї. У. Рпагт. 97:171-181 (1993)). Вона містить також макрофаги, які о елімінують інгальовані білкові частки за допомогою фагоцитозу. Ці макрофаги мігрують до основи бронхіального -і 20 древа, відкіля вони за допомогою механізму мукоціліарного кліренсу (війчасто-епітеліального очищення) виходять із легені. Вони можуть потім мігрувати в лімфатичну систему. Далі аерозольований білок може щи впливати на фізіологію макрофагів, наприклад інтерферони можуть активізувати альвеолярні макрофаги.

Міграція активованих макрофагів представляє собою ще один механізм поширення системної дії інгальованого білку. Складність цього процесу вказує на те, що результати аерозольних дослідів з одним типом білка можуть 29 бути лише обмежено перенесені на інший тип білка. Невеликі різниці між інтерферонами, наприклад, можуть

ГФ) робити помітний вплив на їхню сприйнятливість у відношенні до деградаційних механізмів у легені див. Воссі 7 еї аі. "Риїтопагу сайароїйвт ої іпіепегопе: амеоіаг арвогріоп ої 729-| ІареМйей питап іпіепегоп аїЇрна ів ассотрапієд ру рапіа! Іозв ої Біоіодіса! асіїміу" (Легеневий катаболізм інтерферонів: альвеолярна абсорбція во міченого йодом 725-| людського альфа-інтерферону супроводжується частковою втратою біологічної активності) у: Апіїміга! Кезеагсі 4:211-220 (1984)).

Хоча білки й іншої біологічної макромолекули принципово можуть бути розпилені, таке розпилення відбувається, як правило, із втратою активності. Тому задача даного винаходу складається в тому, щоб запропонувати спосіб одержання придатних для інгаляції аерозолів, який дозволяє розпорошувати біологічно ве активної макромолекули, зокрема, білки, без істотних втрат активності.

Нове покоління розпилювачів, які працюють без газів-витискачів (пропелентів), описується в патенті США 05

5497944, зміст якого включено в дану заявку в якості посилання. Особлива перевага описаних у ньому розпилювачів складається в тому, що вони дозволяють відмовитися від застосування газів-витискачів, зокрема фторхлорвуглеводів.

Удосконалення описаних розпилювачів розкрито в публікації міжнародної заявки РСТ/ЕРОб6/04351 - МО 97/12687. Стосовно до даного винаходу особливе посилання робиться на описану в згаданій публікації фігуру 6 (Кезрітацк8?), а також на розділи опису заявки, які відносяться до цієї фігури. Описаний у цій публікації розпилювач може бути успішно використаний для одержання придатних для інгаляції (відповідно до даного винаходу) аерозолів біологічно активних макромолекул. Зокрема, описаний розпилювач може бути використаний 7/0 для інгалятивного застосування інсуліну. Завдяки його зручному розміру пацієнт може носити цей прилад із собою в будь-який час. Описаний у цій публікації розпилювач дозволяє розпорошувати визначені об'єми (переважно біля 15 мікролітрів) розчинів біологічно активних речовин шляхом застосування високих тисків через малі сопла, у результаті чого придатні для інгаляції аерозолі утворюються із середнім розміром часток у межах від З до 10 мікрометрів. Для інгалятивного застосування інсуліну придатні розпилювачі, здатні розпорошувати 75 ДО туманоподібного стану за одне застосування від 10 до 50 мікролітрів аерозольного препарату з одержанням іннгалюємих крапельок.

Особливе значення для одержання аерозоля за винаходом має застосування описаного в згаданому патенті, відповідно патентній заявці розпилювача для розпилення без використання газів-витискачів розчинів, які містять активні речовини, білки або інші біологічно активні макромолекули.

Зручний в обслуговуванні розпилювач (розміром біля 10см), розкритий у згаданих публікаціях, складається в основному з верхньої частини кожуху розпилювача, корпусу насоса, сопла, затискного фіксуючого механізму, пружинної коробки, пружини і видатковоїатної ємності і містить у якості відмітних ознак: - корпус насоса, який закріплений у верхній частині кожуха розпилювача і несе на одному своєму кінці соплову коробку із соплом, відповідно із соспловою системою, сч - полий поршень із корпусом клапана, - вихідний фланець, у якому закріплений полий поршень і який знаходиться у верхній частині кожуха і) розпилювача, - затискний фіксуючий механізм, який знаходиться у верхній частині кожуха розпилювача, - пружинну коробку з пружиною, яка знаходиться в ній, закріплену за допомогою обертової опори на верхній «о зо частині кожуха розпилювача з можливістю її повороту, - нижню частину кожуха розпилювача, надягнуту на пружинну коробку в аксиальному напрямку. -

Полий поршень із корпусом клапана відповідає одному з поршнів у пристрої, розкритому в публікації о міжнародної заявки УМО 97/12687. Він частково входить всередину циліндра корпуса насосу і розташований із можливістю переміщення в циліндрі (див., зокрема, Фіг.1-4 - особливо Фіг.З - і стосовні до них розділи опису ме) зазначеної заявки). У момент відпускання пружини полий поршень із корпусом клапанна на своєму боці високого ї- тиску робить на рідину (відмірений розчин активної речовини) тиск у межах від 5 до б0Мпа (біля 50-600бар), переважно від 10 до бО0Мпа (біля 100-60О0бар).

Корпус клапана переважно закріплений на кінці полого поршня, поверненого до соплової коробки.

Сопло в сопловій коробці переважно мікроструктуроване, тобто виготовлене за допомогою методів « Мікротехніки. Мікроструктуровані соплові коробки розкриті, наприклад, у публікації міжнародної заявки УМО з с 97/07607, зміст якої включений в даний опис у якості посилання. . Соплова коробка складається, наприклад, із двох міцно з'єднаних один з одним пластин із скла і/або и? кремнію, із яких, щонайменше, одна пластина має один або декілька мікроструктурованих каналів, які з'єднують впускну сторону із випускною стороною сопла. На випускній стороні сопла розташований, щонайменше, один

Круглий або некруглий отвір із діаметром, меншим або рівним 1Омкм. -І Напрямки струменів у сопловій коробці можуть бути рівнобіжними або похилими один відносно одного. У соплової коробки з, щонайменше, двома сопловими отворами на випускній стороні напрямки струменів можуть і бути нахилені один до одного під кутом від 20 до 160 градусів, переважно, від 60 до 150 градусів. Напрямки о струменів перетинаються поблизу отворів сопла.

Затискний фіксуючий механізм містить пружину, переважно, циліндричну гвинтову пружину стиску, у якості

Ш- нагромаджувача механічної енергії. Пружина впливає на вихідний фланець як на елемент перескоку, рух якого

Ф визначається позицією фіксуючого елемента. Шлях вихідного фланця точно обмежується верхнім і нижнім упорами. Пружина доводиться в напружений стан переважно через механізм передачі зусилля, наприклад через гвинтовий механізм подачі, у результаті дії зовнішнього моменту обертання, який створюється при обертанні ов верхньої частини кожуха розпилювача стосовно пружинної коробки в нижній частині кожуха розпилювача. У цьому випадку верхня частина кожуха розпилювача і вихідного фланця містять одно- або багатоходовий (Ф, клиновий механізм. ка Фіксуючий елемент із блокуючими поверхнями, які висуваються всередину розпилювача, розташований кільцеподібно навколо вихідного фланця. Він представляє собою, наприклад, кільце, яке пружно деформується в бо радіальному напрямку, з пластмаси або з металу. Кільце розташоване в площині, перпендикулярній осі розпилення. Після стиску (у випадку пружини стиску) пружини, які блокують поверхні фіксуючого елемента, зміщуються всередину, заходять на шлях руху вихідного фланця і перешкоджають звільненню пружини.

Фіксуючий елемент приводиться в роботу за допомогою кнопки. Пускова кнопка з'єднана або кінематично зв'язана з фіксуючим елементом. Для звільнення затискного фіксуючого механізму пускова кнопка зміщується 65 паралельно площині кільця, а саме, переважно всередину розпилювача; при цьому кільце, яке деформується, деформується в площині кільця. Деталі конструкції затискного фіксуючого механізму описані в міжнародній заявці МО 97/20590.

Нижня частина кожуху розпилювача насувається в осьовому напрямку по пружинній коробкці і закриває опору, привід шпинделя і видатковуатну ємність для рідини.

При приведенні в роботу розпилювача верхню частину кожуху розпилювача повертають відносно нижньої частини кожуху, при цьому нижня частина кожуху захоплює пружинну коробку. У результаті пружина стискується під дією гвинтового механізму подачі і приводиться в напружений стан, а фіксуючий механізм самий собою входить у канавку. Кут повороту, переважно, складає цілочислені частки від 360 градусів, наприклад, 180 градусів. Одночасно зі стиском пружини вихідна частина у верхній частині кожуху зміщується на заданий 7о Відрізок шляху, полий поршень всередині циліндра в корпусі насосу втягується назад, завдяки чому частина кількості рідини з видаткової ємності всмоктується в нагнітальний простір перед соплом.

При необхідності, у розпилювач можуть бути послідовно встановлені і використані декілька змінних видаткових ємностей, які містять рідину, котра розпорошується. Видаткова ємність містить водяний аерозольний препарат відповідно до даного винаходу.

Процес розпилення починається легким натисканням пускової кнопки. При цьому фіксуючий механізм звільняє шлях для руху вихідної частини. Стиснута пружина штовхає поршень всередину циліндра корпуса насосу. Рідина виходить із сопла розпилювача у розпиленій формі. Подальші деталі конструкції розкриті в міжнародних заявках РСТ УУО 97/12683 і МО 97/20590, зміст яких включений в даний опис у якості посилання.

Деталі розпилювача виготовлені з відповідного матеріалу, який відповідає його функції. Корпус розпилювача 7 оскільки це допускається призначенням приладу - а також інші частини переважно виготовлені з пластмаси, наприклад, способом лиття під тиском. Для медичних цілей використовуються фізіологічно бездоганні матеріали.

Розпилювач, описаний у міжнародній заявці УМО 97/12687, використовується, наприклад, для одержання медичних аерозолів, які не містять газів-витискачів. Цей прилад дозволяє створювати інгалюємий аерозоль із середнім розміром часток біля 5мкм. сч

На Фіг.4а/б, ідентичних Фіг.ба/ь публікації міжнародної заявки УМО 97/12687, показаний розпилювач (Кезрітаке), за допомогою якого можуть ефективно інгалюватися водні аерозольні препарати відповідно до і) даного винаходу.

На Фіг.4а показаний подовжній розріз розпилювача при стиснутій пружині, на Фіг.4б6 - подовжній розріз розпилювача при відпущеній пружині. Ге зо Верхня частина (51) кожуху розпилювача містить корпус (52) насосу, на кінці якого закріплений тримач (53) для розпилювального сопла. У тримачі знаходиться соплова коробка (54) і фільтр (55). Закріплений у вихідному - фланці (56) затискного фіксуючого механізму полий поршень (57) частково входить у циліндр корпуса насосу. На о кінці полого поршня закріплена клапанна коробка (58). Полий поршень ущільнений за допомогою ущільнення (59). Всередині верхньої частини кожуху розпилювача знаходиться упор (60), до якого прилягає вихідний ме) фланець при розтисненій пружині. На вихідному фланці знаходиться упор (61), до якого прилягає вихідний ї- фланець при стиснутій пружині. Після стиску пружини фіксуючий елемент (62) переміщується в положення між упором (61) і опорою (63) у верхній частині кожуха розпилювача. Пускова кнопка (64) з'єднується з фіксуючим елементом. Верхня частина кожуха закінчується наконечником (65) і закривається захисним ковпачком (66), який одягається. «

Пружинна коробка (67) із пружиною (68) стиску закріплена за допомогою виступів, котрі защіпуються, (69) пт») с обертової опори на верхній частині кожуха розпилювача з можливістю її обертання. На пружинну коробку одягається нижня частина (70) кожуху розпилювача. Всередині пружинної коробки знаходиться знімна видаткова ;» ємність (71) для рідини (72), яка розпорошується. Видаткова ємність закрита пробкою (73), через яку полий поршень входить у видаткову ємність і занурюється своїм кінцем у рідину (запас розчину активної речовини).

На бічній циліндричній поверхні пружинної коробки закріплений шпиндель (74) для механічного рахункового -І пристрою. На кінці шпинделя, поверненого до верхньої частини кожуху, знаходиться головна шестірня (75). На шпинделе встановлений рейтер (76). о Вищеописаний розпилювач може бути використаний для розпилення аерозольних препаратів за винаходом з о одержанням придатного для інгаляції аерозоля.

Ефективність розпилювального приладу може бути досліджена іп мігго у системі, у якій робиться розпилення

Ш- розчину білка з уловлюванням туманна в так називаній "пастці" (див. Фіг.1). Активність білка в аерозольному

Ф резервуарі (а) порівнюється з активністю в уловленій рідині (Б), наприклад, за допомогою імунологічного аналізу або за допомогою аналізу на біологічну активність білка. Цей дослід дозволяє судити про ступінь руйнування білка в результаті розпилення. Другим параметром якості аерозоля є так називана частка, котра

Б інгалює і у контексті даного винаходу визначається як частка крапельок тумана із середнім аегродинамічним діаметром (САД) менше 5,8мкм. Частка, яка інгалює, може бути виміряна за допомогою "імпакторів Андерсена"

Ф) (Апдегзеп Ітрасіогв). Для гарної абсорбції білка важливо не тільки домогтися розпилення без істотної втрати ка активності, але і генерувати аерозоль із високою (приблизно 6095) інгсалюючою часткою. Аерозолі, які мають САД менше 5,8мкм, значно краще досягають альвеол, де вони мають помітно більш високі шанси бути поглиненими. бо Ефективність розпилювального приладу може бути також досліджена в системі іп мімо, причому в цьому випадку грають роль такі фактори, як сприйнятливість стосовно легеневих протеаз. Як приклад іспитової системи іп мімо може служити система, за допомогою якої собаці вводиться по трахейній трубці аерозоль, який містить білок.

Через відповідні інтервали часу відбирають проби крові і після цього заміряють рівень білків у плазмі імунологічними або біологічними методами. 65 Відповідними є розпилювачі, описані в згаданих публікаціях: у патенті США 05 5497944 і міжнародній заявці

МО 97/12687, особливо показані на Фіг.ба/ь (у даній заявці Фіг.4а/5). Переважне розташування сопла для розпилення запропонованих відповідно до даного винаходу водяних аерозольних препаратів біологічно активних макромолекул подано на Фіг.8 патенту США.

Несподіваним способом було встановлено, що вищеописаний розпилювач, який не містить робочого газу, за

Допомогою якого можна розпорошувати задану кількість без використання робочого газу - зокрема 15 мікролітрів - аерозольного препарату під високим тиском у межах від 100 до 500бар через щонайменше одне сопло з гідравлічним діаметром 1-12 мікрометрів, завдяки чому утворяться інгалюємі крапельки, із середнім розміром часток менше 10 мікрометрів, добре придатний для розпилення аерозольних препаратів білків і інших макромолекул, так як він здатний розпорошувати широкий спектр білків без якоїсь помітної втрати активності. 7/0 ЛПереважно при цьому розташовувати сопло так, як показано на Фіг.8 вищезгаданого патенту США. Особливо несподіваною виявилася здатність розпилювачів такої конструкції розпорошувати інтерферони, які звичайно можуть бути розпилені лише зі значною втратою активності. Далі несподіваною виявилася висока активність інтерферону омега, після розпилення за допомогою цього приладу, не тільки в дослідах іп міо, але й у дослідах іп мімо.

Ще одна перевага способу, який заявляється, складається в тому, що він також дозволяє розпорошувати висококонцентровані розчини біологічно активних макромолекул без істотної втрати активності, що є несподіваним. Застосування висококонцентрованих розчинів дає можливість використовувати прилад досить малих розмірів, який зручно постійно носити в кишені або в сумочці. Показаний на Фіг.4 розпилювач задовольняє ці вимоги і дозволяє розпорошувати висококонцентровані розчини біологічно активних молекул.

Такі прилади особливо зручні, наприклад, у тому відношенні, що вони дозволяють діабетикам самостійно проводити інгалятивне лікування інсуліном. Переважно використовувати висококонцентровані водяні розчини з концентрацією в межах від 20 до О9Омг/мл інсуліну, більш переважно, від ЗО до бОмг/мл інсуліну й особливо переважно, від З3 до 4Омг/мл інсуліну. В залежності від розміру наявного в розпорядженні резервуара розпилювача розчини, які містять інсулін у концентрації більше 25мг/мл, переважно, більше ЗОмг/мл, сч забезпечують інгалятивне введення в організм терапевтично ефективної кількості інсуліну за допомогою ручного приладу вищеописаної конструкції. Інсалятивне введення інсуліну сприяє швидкому настанню лікувальної дії і) активної речовини, завдяки чому пацієнт, наприклад, незадовго перед прийняттям їжі, самий може вводити собі необхідну йому кількість інсуліну. Завдяки малим розмірам приладу "Респімат" пацієнт у будь-який час може носити його із собою. «о зо Прилад "Респімат" (Фіг.б6 у міжнародній заявці УУО 97/12687) має дозувальну камеру постійного об'єму, яка дозволяє пацієнту визначати й інгалювати необхідну для нього дозу інсуліну на основі визначеного числа ходів - поршня (викидів аерозоля). Поряд із числом ходів, дозування інсуліну визначається концентрацією розчину о інсуліну у видатковій ємності (72). Концентрація розчину інсуліну може складати, наприклад, від 25 до

З9Омг/мл, причому переважні більш висококонцентровані розчини, приблизно від ЗОмг/мл і вище. ме)

Спосіб одержання висококонцентрованих стійких розчинів інсуліну описаний, наприклад, у міжнародних ї- заявках УУО 83/00288 (РСТ/ОК82/00068) і УМО 83/03054 (РСТ/ОК 8300024), вміст яких включений в дану заявку у вигляді посилання.

Запропоновані, відповідно до даного винаходу аерозольні препарати, які містять інсулін, вводяться в організм за допомогою вищеописаного пристрою, не повинні мати динамічну в'язкість, котра перевищує « 40. 1600,10 5Пахс, із тим, щоб інгалюєма частка у аерозолі, який утворюється, не знижалася нижче прийнятного - с рівня. Переважні розчини інсуліну, які мають граничну в'язкість до 1200 х10Пахс, особливо переважні розчини, "з які мають в'язкість до 1100 х10"Пахс (Паскальхсекунда). Для зниження в'язкості розчину лікарського засобу, якщо це потрібно, замість води в якості розфактора можуть бути використані суміші розфакторів. Це може бути 15 здійснено, наприклад, шляхом додавання етанолу. Частка етанолу у водяному розчині може доходити, - наприклад, до 5095, переважно, частка етанолу складає 30905.

Аерозольний препарат переважно має в'язкість до 1600 х109Пахс, причому особливо переважний інтервал о від 900 до 1100х10Пахс. (ав) Переважні далі аерозольні препарати, водяні розчини яких мають в'язкість у межах від 900 до -І 50 1600Х109Пахс, причому особливо переважні, водяні розчини з в'язкістю в межах від 950 до 1300Х10-9Пахс.

Ще одна задача даного винаходу складається в тому, щоб запропонувати аерозольний препарат, придатний щи для використання в способах, котрі заявляються.

Предметом винаходу далі є аерозольні препарати у формі водяних розчинів, які містять у якості діючої речовини біологічно активні макромолекули, зокрема, білок або пептид, у кількості від Змг/мл до 10Омг/мл, 25 переважно, від 25 до 100мг/мол.

ГФ) Зненацька виявилося, що запропонований, відповідно до даного винаходу, спосіб дозволяє розпорошувати до придатних для інгаляції крапельок відповідного розміру також і більш в'язкі розчини макромолекул. Завдяки ді цьому, за одне застосування в організм може бути введена більша кількість діючої речовини і тим самим підвищена терапевтична ефективність макромолекул при інгалятивній терапії. 60 Запропонований, відповідно до даного винаходу, спосіб дозволяє використовувати водяні аерозольні препарати, які містять макромолекули (наприклад, альбумін), із в'язкістю до 1600 Х10Пахс (виміряною при 252С). При в'язкості 1500х109Пахс інгалюєма частка проте складала 3295.

Переважні більш в'язкі розчини макромолекул, які мають в'язкість до 1100 х109Пахс. У таких розчинах 65 інгалюєма частка часток, котрі містять діючу речовину, досягає приблизно 6095. Зазначені граничні в'язкості визначалися за допомогою віскозиметра Оствальда за відомим з літератури методом. Для порівняння, в'язкість води складає 894х10ЗПахс (виміряна при 252).

Для ілюстрації переваг запропонованого способу нижче описуються досліди іп міго і іп мімо із розчином інтерферону омега.

Досліди іп міго із приладом "Респімат" і інтерфероном омега

Резервуар приладу "Респімат" (а) заповнювали розчином інтерферону омега з концентрацією 5мг/мл (у 520ММ тринатрійцитрату, 150мММ Масі, рН 5,5). Активували прилад і розпорошували об'єм біля 12,9мкл (один хід поршня) у повітряному потоці, який має швидкість 28л/хв. Розпилений розчин уловлювали в пастці (Фіг.1).

Інтерферон омега визначали в розчині, який знаходиться в резервуарі, і в розчині, зібраному в пастку, 70 імунологічно, за допомогою ЕЇІЗА, і біологічно, шляхом інгібування руйнування кліток АБбБ49, інфікованих вірусом енцефаломіокардиту. Імунологічне визначення інтерферону є відносно простим методом. Дослідження із розпиленими білками, за опублікованими даними, обмежені в деяких випадках імунологічними вимірами. Однак додаткові біологічні виміри дуже важливі, тому що вони є особливо чутливим і терапевтично релевантним методом кількісного визначення руйнування білка. Вони не завжди дають той же результат, що і фізико-хімічні 75 або імунологічні методи, тому що молекула може втратити біологічні здатності без зміни її зв'язку з антитілом.

У трьох дослідах було встановлено, що кількість інтерферону, який імунологічно ідентифікується в розчині (Б), зібраному в пастці, складала, у перерахуванні на вихідний розчин, 84905, 7790 і 9895. Біологічні виміри з тими ж розчинами давали відповідно 5495, 4795 і 8195 повторного знаходження інтерферону, який біологічно ідентифікується в розчині (Б), зібраному в пастці. Ця дуже висока частка показує, що при розпиленні за допомогою приладу "Респімат" порушується відносно мала частина активності інтерферону. Туман із приладу "Респімат", як вказувалося вище, подавали також у імпактор Андерсена за допомогою повітряного потоку зі швидкістю 28л/хв. Заміряли частку часток із розміром менше 5,8мкм (інгалюєма частка"). Інсалюєма частка відповідала 7095 (імунологічні виміри). Білки, такі як інтерферони, часто використовуються в лікарських сполуках разом з альбуміном людської сироватки, щоб забезпечити додатковий захист чутливих інтерферонів. С

Також була випробувана одна сполука, така же як зазначено вище, але додатково яка містить альбумін людської о сироватки (0,595). У трьох дослідах регенерація інтерферону, який імунологічно ідентифікується в розчині (б), котрий уловлюється в пастці, також у перерахуванні на вихідний розчин, складала 8395, 83905 і 79905. Біологічні виміри з тими ж розчинами давали відповідно 6095, 5495 і 6695 повторного знаходження біологічно активного інтерферону в розчині, зібраному в пастці. Інсалюєма частка (імунологічні вимірювання) склала 67905. Ще в (Се) одному досліді концентрований розчин інтерферону омега з концентрацією 5Змг/мл завантажували в резервуар приладу "Респімат" і потім розпорошували. У чотирьох дослідах у розчині (Б), зібраному в пастці, знову - знаходили, у перерахуванні на вихідний розчин, 10095, бОбо, 6895 і 72905 інтерферону, який імунологічно («в ідентифікується. Біологічні виміри з тими ж розчинами давали відповідно 95906, 9895, 6195 і 8395 повторного знаходження інтерферону, який біологічно ідентифікується в розчині, зібраному в пастці. Високий відсоток о повторного знаходження показує, що за допомогою приладу "Респімат" можуть розпорошуватися також - концентровані розчини білків без надмірних втрат активності інтерферону.

Досліди іп мімо із приладом "Респімат" і інтерфероном омега

Інтерферон омега вводили інгалятивно і внутрішньовенно в роздільних дослідах одному і тому ж собаці. У « різні моменти часу імунологічно і біологічно заміряли рівень інтерферону в крові. Крім того, заміряли рівень 70 неоптерину в крові. Неоптерин є маркером для імуноактивації; він визволяється макрофагами після - с интерферонного порушення (|Рисив еї а! "Меоріегіп, Біоспептівігу апа сіїпісаі иве аз а тагкКег їог сеїЇїшаг ц іттипе геасіопве", Іпї. Агсп. АїПегду Аррі. Іттипої. 101: 1-6 (1993)). Вимір рівня неоптерину служить для ,» кількісного визначення ефективності інтерферону.

Введення інтерферону собаці робилося під наркозом за допомогою пентабарбиталу після попереднього

Впливу основного седативного засобу. Тварину інтубували і робили їй штучне дихання (контрольоване за - І об'ємом штучне дихання: хвилинний об'єм 4л/хв., частота: 10 ходів поршня на хвилину). Усього було виконано на приладі "Респімат" 20 ходів поршня. Кожний хід поршня виконувався на початку вдиху. По закінченні фази вдиху о робилася 5-секундна пауза перед видихом. Перед введенням наступної порції інтерферону омега тварині (ав) дозволялося зробити два дихальних цикли без стороннього втручання. Кров для сироватки і гепаринової плазми брали перед введенням інтерферону й у різні моменти часу до 14 днів після введення інтерферону. Інтерферон ї омега визначали у гепариновій плазмі імунологічно за допомогою ЕГІЗА і біологічно шляхом інгібування 4) руйнування кліток АБбБ49, інфікованих вірусом енцефало-міокардиту. Сироватковий неоптерин визначали імунологічно. На Фіг.2 показаний заміряний імунологічно (Фіг.2а) і біологічно (Фіг.2б) рівень інтерферону омега після введення 20 порцій інтерферону омега (тобто виконання 20 ходів поршня) за допомогою приладу "Респімат". Зненацька після інгалятивної дачі був відзначений дуже високий рівень неоптерину в сироватці. У досліді іп міго кількість розчину, яка видається приладом "Респімат за один хід поршня, відповідала в

ІФ) середньому 12,8мг/хід. Тому варто очікувати, що при концентрації розчину 5мг/мл за 20 ходів поршня приладу ко "Респімат" буде введено біля 1,28мг інтерферону. Виміри неоптерину після введення цієї кількості показали рівні, помітно більш високі і які утримуються на протязі більш тривалого часу, у порівнянні з вимірами 60 неоптерину після внутрішньовенного введення 0,32мг інтерферону. Цей результат проілюстрований на Фіг.3.

Високі рівні неоптерину є доказом того, що введення інтерферону за допомогою приладу "Респімат" може забезпечити високу біологічну ефективність.

Як показує другий приклад, переваги приладу "Респімат" для розпилення біологічно активних макромолекул не обмежуються тільки интеферонами. 65 Досліди іп міго із приладом "Респімат" і марганецьпероксид-дисмутазою

На Фіг.1 показаний прилад для розпилення тест-субстанції разом із стосовною до нього пасткою, яка використовувався в дослідах. У цьому досліді резервуар (а) приладу "Респімат" заповнювали З,Змг/мл марганецьпероксид-дисмутази (Мп5ОЮ) у фізіологічному розчині з фосфатним буфером (РВ5). Прилад активували і розпорошували біля 1Змкл об'єму (один хід поршня) у повітряному потоці, який рухається зі швидкістю 28л/хв. Точна розпилена кількість визначалася гравіметрично (виміри в трьох послідовних дослідах: 12,8; 13,7 і 14,3мг). Розпилений розчин уловлювали в пастці (Б). У цій пастці містилося 20мл РВ5. Додатково добавляли 2мл 5-95 альбуміну бичачої сироватки для стабілізації білків у пастці. Визначення МиЗО0б у розчині, який містився в резервуарі, і в розчині, зібраному в пастці, робили імунологічно за допомогою ЕЇГІЗА і ензиматично шляхом відновлення кількості супероксиду за реакцією ксантин/ксантин-оксидази. У трьох дослідах 76 було заміряно 7895, 8995 і 8396 МиЗОб, яка імунологічно ідентифікується, розпиленого розчину в пастці (Б). Не було встановлено втрат ферментної активності, які піддаються виміру, після розпилення. Інгалююча частка (імунологічні виміри) складала 61905.

У нижченаведеному прикладі описується одержання запропонованого, відповідно до винаходу, аерозольного препарату, який містить інсулін у якості діючої речовини.

Приготування розчину інсуліну і заповнення розпилювача 175мг кристалізованого інсуліну (натрієва сіль), отриманого від великої рогатої худоби (відповідно 4462,6 міжнародної одиниці, за даними виготовлювача) розчиняли в З,5мл стерильно очищеної води (вода ЗегаїЇриг 8).

Потім при легкому перемішуванні добавляли 8,5мкл м-крезолу (відповідно 8,65мг) і 7,5З3мг фенолу, розчинених у 100мкл стерильної очищеної води. До цього розчину добавляли Зб5мкл розчину 7пСіІ» з концентрацією 5мг/мл (відповідає масовій частці цинку 0,595, у перерахуванні на застосовувану кількість інсуліну) і рн встановлювали на значення 7,4 за допомогою 0,2н. Маон. Об'єм суміші доводили до 5мл стерильною очищеною водою і суміш фільтрували через стерильний мікропористий фільтр (розмір пір 0,22мкм). 4,5мл аерозольні препарати переводили у видаткову ємність (72 на Фіг.4) розпилювача ("Респімат"). Ємність закривали ковпачком і встановлювали в прилад. с

Отриманий таким чином аерозольний препарат має концентрацію інсуліну біля Зб5мг/мл, причому в'язкість цього розчину складає біля 1020Х10Пахс. і9)

Дослід іп мімо із приладом "Респімат" і висококонцентрованим розчином інсуліну

Введення інсуліну собаці робилося під наркозом за допомогою пентабарбіталу після попереднього впливу основного седативного засобу. Тварину інтубували і робили їй штучне дихання, як описано вище. Кожний хід (Се) поршня виконувався на початку вдиху. Між фазою вдиху і видиху робилася 5-секундна пауза. Перед введенням наступної порції інтерферону тварині дозволялося зробити два дихальних цикли без стороннього втручання. -

Кров брали за 1 годину до введення, одночасно із введенням і в різні моменти протягом 8 годин після введення. ав

Рівень глюкози в крові вимірювали у свіжій крові за методом Траша, Коллера і Тричлера (КіІеіп. Спет. 30; 969 (19841) за допомогою приладу "Рефлетрон" ("КеПейгопе" фірми Берінгер Мангайм). Зненацька було виявлено, що о застосування висококонцентрованого розчину інсуліну також дозволяє досягати високої біологічної ефективності їч- (зниження рівня глюкози в крові після інгалятивного введення інсуліну). Цей результат поданий на Фіг.5.

Водяні аерозольні препарати за винаходом, якщо це необхідно, можуть містити, поряд із діючою речовиною і водою, також і інші розфактори, такі як, наприклад, етанол. Кількість етанолу обмежується в залежності від « розчинності діючих речовин тим, що при занадто високих концентраціях діюча речовина може випасти в осад.

Можливе введення добавок для стабілізації розчину, наприклад, фармакологічно прийнятних засобів, які - с консервують, таких як, наприклад, етанолу, фенолу, крезолу або парабену, фармакологічно прийнятних кислот, ц основ або буферних сумішей для регулювання рнН, або поверхнево-активної речовини. Крім того, для стабілізації "» розчину або для поліпшення якості аерозолю можна вводити добавки хелатоутворювача для зв'язування металу, такі як, наприклад, ЗДТА. Для поліпшення розчинності і/або стійкості діючої речовини в аегрозольному препараті можуть бути додані амінокислоти, такі як аспарагінова кислота, глутамінова кислота (аспарагін, - І глутамін) і особливо пролін. с | Крім інтерферонів, пероксид-дисмутази й інсуліну, переважними діючими речовинами в запропонованому, відповідно до даного винаходу, аерозольному препараті є наступні: о Антисмислові олігонуклеотиди

Орексини ї Еритропоетин 4) Фактор альфа-некрозу пухлини

Фактор бета-некрозу пухлини 6-С5Е (колонієстимулювальний фактор гранулоцитів)

ОМ-С5Е (колонієстимулювальний фактор макрофагів/гранулоцитів)

Анексини

ІФ) Кальцитонін іме) Лептини

Паратгормони 60 Паратгормонний фрагмент

Інтерлейкіни, такі як, наприклад інтерлейкін-2, інтерлейкін-10, інтерлейкін-12,

Розчинний ІСАМ (молекула внутрішньоклітинної адгезії)

Соматостатин

Соматотропін 65 ІРА (активатор тканинного плазміногену)

ТМКАРА

Пухлиноспецифічні антигени (у вигляді пептиду, білка або ДНК)

Пептидні антагоністи брадикінину

Уродилатин

ОНЕН (гормон, що вивільнює гормон росту)

СК (фактор, що вивільнює кортикотропін)

ЕМАР Ії

Гепарин

Розчинні рецептори інтерлейкіну, такі як віЇ-1-рецептор 70 Вакцини, такі як протигепатитна вакцина або протикорева вакцина

Антисмислові полінуклеотиди

Транскрипційні фактори. --в |. тжох і щ с / їх з'єднувальна деталь Розпилювач / , , Й 7 "Респімат" резервуар для рідини

Вакуум-насос (а) у пристрої "Респімат" 28 піхв.

Н о. .

Фе пастка с

І ко (8) ! улеовлена рідина

І і

І скляна Фрітта

С. (Се)

ВЕ

Як, , м. : Фіг: 1 «в)

Фігг . - із)

Виміри з інтерфероном омега (а) із допомогою че імуноаналізу (ЕПБА) або (5) із допомогою біоаналізу (антивірусна ахтивність) на собаці Ме 95-1467 5 1600 се пня я : « - 1400 (а) ЕТІ5А З ня 1200 с т ' й т 4000 но ДЕ то 600

ЕЕ а - 5 400 Я шо сх ' сю з хо. " т о ь с - -фй- Я о о 2 4 6 8 12 - 2 години після введення інтерферону омега ща

Е 1800

Б в б 1800 медаль - 1400 (В)біоаналіз ж й 1200 - І 1000 о і . З 800 о 8 во : і

Я 400 " 60 Ф

Е 200 .- о ; . В- й у 0 2 4 6 З 10 24 години після введення інтерферону омега б5 й

Фіг. З Вивільнення неоптерину у плазмі після введення аерозоля або внутрішньовенно інтерферона омега собаці Мо 95-1467 с н - 45 нншачт'ТТчТчТ'ТтчтТчтн'ТтжнжнТчТтнтлншнлнтнлнлнивтни тини п

Е - т 3.5- ! . 5 . юю а І 8253 е г. в О454Я.

БО) в )

Фі - - 0.5 - чн о 5 р рн тр и «Я Я | «С8 -- -9,5 БО 100 150 200 250 300 що І години після введення інтерферону омега -45 дн оте : -- 4.28 нг (8 0 40бмекг)аєрозоль -й- 0.32 мг (н. Зо всле) с що | І (5) я! МК Авв і Фі Є (Се) - Кг зо іх У свв ї- щ (ав) ше дани 1

Ти З ще 52 - (7 ло, в виш й ій ; их є ДАЩЕУ жна, 5а «

СК 51 ШО що с 55-. ДГ

Ин.

ДЕЛЬ стві Ще ПУ --7 7 Я ек пня

І. пек лвТИя о Пе Тег о 72-А а тор і -0.720 Аа. - Ве | са іш ків Ав, | -е 7 о Фіг. за ко 60 65

. | ї 80 : й є а дя

Ен

Я а й цищ; з й З аще ее 1-й-х ХК и

РАЗ Кия м бі ДИ МИ 5-й КК З ши щи

Деу тись п рк се кі о в » ви 7 сі т

Де Я

Кс жи ДЕЛІ пет Б І сч

Де ди ще се І ге) де ге вв » (й м.

Фіг 46 я о со 35. , : -

Фіг. 5 Рівень глюкози в крові після введення інсуліну ' із допомогою пріладу "Респімат"-собака Ме 95-1479 140 17-------титт Я -- не ШО « 40: | | - с 1204 хм

Кк й 5 100 -і І В Й І .

Фо к вої Й (ав) . З -.20 ЕЗ св -ш во т - Щ

І й що І й з. й о

І

60 | ві. В - . : нНй іш ід Ши -і 0 1 2 Кі «4 5 6 т 8 . й години після введення інтерферону омега б5

Claims (15)

Формула винаходу - - . не . . . -

1. Водний аерозольний препарат для інгаляційного введення в організм, що містить діючу речовину, який відрізняється тим, що як діючу речовину містить взяту у концентрації від 25 до 100 мг/мл речовину, вибрану з групи, яка включає антисмислові олігонуклеотиди, 70 орексини, еритропоетин, фактор альфа-некрозу пухлини, фактор бета-некрозу пухлини, 6-С5Е (колонієстимулюючий фактор гранулоцитів), ОМ-С5Е (колонієстимулюючий фактор макрофагів/гранулоцитів), анексини, кальцитонін, лептини, паратгормони, фрагмент паратгормону, інтерлейкіни, такі як інтерлейкін 2, інтерлейкін 10, інтерлейкін 12, інсулін, пероксид-дисмутазу, інтерферон, сч розчинний ІСАМ (молекула внутрішньоклітинної адгезії), соматостатин, о соматотропін, ІРА (активатор тканинного плазміногену, ) ТМК-АРА, «со зо пухлиноспецифічні антигени (у вигляді пептиду, білка або ДНК), пептидні антагоністи брадикініну, і - уродилатин, о ОНЕН (гормон, що вивільняє гормон росту), СКЕ (фактор, що вивільняє кортикотропін), со ЕМАР Ії, їч- гепарин, розчинні рецептори інтерлейкіну, такі як віЇ -1-рецептор, вакцини, такі як протигепатитна вакцина або протикірна вакцина, антисмислові полінуклеотиди, « 20 транскрипційні фактори, причому концентрація (3-С5Е (колонієстимулюючий фактор гранулоцитів) не з с дорівнює 25 мг/мл, при цьому препарат призначений для розпилення без використання робочого газу за допомогою :з» розпилювача, що забезпечує задану кількість препарату, зокрема 15 мікролітрів, під високим тиском у межах від 100 до 500 бар через щонайменше одне сопло з гідравлічним діаметром 1-12 мікрометрів з утворенням інгаляційних крапельок із середнім розміром меншим ніж 10 мікрометрів. -І

2. Водний аерозольний препарат за пунктом 1, який відрізняється тим, що як діючу речовину містить інсулін.

3. Водний аерозольний препарат за пунктом 2, який відрізняється тим, що як діючу речовину містить о інсулін у концентрації вище ніж 25-90 мг/мл.

о 4. Водний аерозольний препарат за пунктом З, який відрізняється тим, що як діючу речовину містить інсулін у концентрації 30-60 мг/мл.

- 5. Водний аерозольний препарат за пунктом 4, який відрізняється тим, що як діючу речовину містить Ф інсулін у концентрації 33-40 мг/мл.

6. Водний аерозольний препарат за пунктом 1, який відрізняється тим, що як діючу речовину містить пероксид-дисмутазу.

7. Водний аерозольний препарат за пунктом 1, який відрізняється тим, що як діючу речовину містить інтерферон. (Ф)

8. Водний аерозольний препарат за пунктом 71, який відрізняється тим, що як діючу речовину ка містить о-інтерферон.

9. Водний аерозольний препарат за будь-яким з пп. 1-8, який відрізняється тим, що він додатково містить бо одну або декілька допоміжних речовин із групи поверхнево-активних речовин, таких як змочувачі, емульгатори, стабілізатори, підсилювачі проникнення і/або консерванти.

10. Водний аерозольний препарат за будь-яким з пп. 1-9, який відрізняється тим, що він додатково містить амінокислоту.

11. Водний аерозольний препарат за пунктом 10, який відрізняється тим, що як амінокислоту він містить б5 пролін, аспарагінову кислоту або глутамінову кислоту для поліпшення розчинності або стабільності діючої речовини.

12. Водний аерозольний препарат за будь-яким з пп. 1-11, який відрізняється тим, що він має в'язкість при 259 С до 16002105 Пас, визначену віскозиметром Оствальда.

13. Водний аерозольний препарат за одним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що його водний розчин має в'язкість при 252 С у межах від 90051079 до 16002105 Пахс, визначену віскозиметром Оствальда. що він має в'язкість при 252 С у межах від 9002105 до 11002109 Пахс, визначену віскозиметром Оствальда.

14. Водний аерозольний препарат за п. 13, який відрізняється тим, що він має в'язкість при 252 С у межах від 90021079 до 11002109 Пахс, визначену віскозиметром Оствальда.

15. Водний аерозольний препарат за п. 13, який відрізняється тим, що його водний розчин має в'язкість при 259 С у межах від 95051075 до 13002105 Пас, визначену віскозиметром Оствальда. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2005, М 6, 15.06.2005. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. У р с щі 6) (Се) ча «в) со і - -

с . и? -І (95) («в) - 50 42) Ф) іме) 60 б5