UA78516C2 - Use of inhibitors of il-18 for treatment and/or prevention of hypersensitivity disorders, and in particular of delayed-type hypersensitivity - Google Patents

Description

ІДЕ-опосередкованою. Її також називають звичай- мент, і вони руйнують клітини переважно за допо- ною алергією. Реакції гіперчутливість негайного могою позасудинного фагоцитозу. Приклади, в типу (тип І) виникають через зв'язування антигену яких антиген є компонентом тканини, включають з ІДЕ на тучних клітинах або базофілах. раннє гостре (гіпергостре) відторгнення транспла-

Розлади у вигляді реакцій гіперчутливості І ти- нтату пересадженої нирки, яке відбувається через пу також називають атонічними захворюваннями, присутність антитіла в ендотелії судини, і синдром вони включають, наприклад, алергічний риніт, Гудспасчера, який виникає через реакцію антитіла алергічний кон'юнктивіт, атонічний дерматит, але- з базальною мембраною клубочкового і альвеоля- ргічну набуту бронхіальну астму, кропивницю, сис- рного ендотелію. В експериментальному синдромі темну анафілаксію. Значно збільшилась кількість Гудпасчера комплемент є важливим медіатором випадків астми, хоча причини в більшості випадків пошкодження, але роль комплементу не визначе- невідомі. Нещодавно було помічене значне збіль- на чітко при ранньому гострому відторгненні тран- шення кількості реакцій типу | при контакті з роз- сплантату. чинними у воді білками, що містяться в латексних Приклади реакцій внаслідок зв'язування гап- продуктах (наприклад, гумових рукавичках, стома- тену з клітинами або тканиною включають множи- тологічних прокладках, презервативах, трубках ну реакцій гіперчутливості до лікарських засобів для дихального обладнання, катетерах), особливо (наприклад, інфікована пеніциліном гемолітична серед медичного персоналу і у пацієнтів, що вико- анемія, див. нижче). ристовували латекс, і у дітей з розщепленим хреб- Антирецепторні реакції гіперчутливості зміню- том і урогенітальними природженими дефектами. ють клітинну функцію внаслідок зв'язування анти-

Частими реакціями на латекс є кропивниця, ангіо- тіла з рецепторами мембрани. При багатьох за- невротичний набряк, кон'юнктивіт, риніти, бронхо- хворюваннях (наприклад, злоякісна міастенія, спазми і анафілаксія. хвороба Грейвса, інсулінстійкий діабет), антитіла

Пацієнти з атонічними захворюваннями (вклю- до рецепторів мембрани клітини були описані. У чаючи атонічний дерматит) звичайно мають спад- деяких пацієнтів з діабетом з сильною стійкістю до кову схильність для розвитку опосередкованої інсуліну були виявлені антитіла до рецепторів ін- антитілом-ІДЕ гіперчутливості до речовин (алерге- суліну, тим самим, запобігаючи зв'язуванню інсулі- нів), які вдихуються і з'їдаються, що нешкідливі ну з його рецептором. У пацієнтів з хворобою для людей, які не мають алергії. За винятком ато- Грейвса було ідентифіковане антитіло до рецеп- нічного дерматиту, антитіла-ІДЕ звичайно опосе- тору тироїдстимулюючого гормону (ТЗН), яке сти- редковують гіперчутливість. мулює дію ТЗН на його рецептор, що приводить

Гіперчутливість типу ІІ або цитотоксична гіпер- до гіпертиреозу. чутливість включає цитолітичні дії, опосередковані Механізми типу ЇЇ в основному включають ан- антитілом, комплементом і/або клітинними механі- титіла, які утворюють імунні комплекси з антиге- змами. Мішенню в реакціях типу ІІ є поверхня клі- ном. Циркулюючі комплекси активують компле- тини, а її результатом є пошкодження або заги- мент, приєднуються до еритроцитів (які потім бель клітини. Антитіло до пов'язаного з клітиною зазнають фароцитазу в селезінці), виходять з кро- антигену (тип ІЇ) спричиняє руйнування клітини вообігу та ініціюють запалення в тканинах (реакція шляхом активації комплементу або стимуляції Артюса), або фагоцитуються макрофагами, які фагоциту. Приклади пошкодження клітин, при яких презентують антиген, виділяють цитокіни і активу- антитіло взаємодіє з антигенними компонентами ють В- ії Т-клітини. ІДЕ, ІдА, до і (ЯМ утворюють клітини, включають Кумбс-позитивну гемолітичну комплекси з антигеном. Реакції типу ЇЇ виникають анемію, інфіковану антитілами тромбоцитопенічну при відкладенні імунних комплексів в тканинах, пурпуру, лейкопенію, пухирчатку, пемфігоїд, синд- особливо в шкірі, суглобах і нирках. Хронічний ром Гудпасчера і перніціозну анемію. Ці реакції імунний комплексний нефрит відповідальний за мають місце у пацієнтів після переливання несумі- більшість випадків гломерулонефриту у людини. сної крові, при гемолітичних захворюваннях ново- Стани, в яких імунні комплекси (ІК), грають, ма- народжених, і при тромбоцитопенії новонародже- буть, роль включають сироваткову хворобу, що них, вони також можуть грати роль у викликається сироваткою, лікарським засобом або мультисистемних захворюваннях, що є виявом антитілом вірусного гепатиту; системний червоний гіперчутливості, наприклад при системному черво- вовчак; ревматоїдний артрит; поліартериїт; кріог- ному вовчаку, СЧВ. лобулінемію; пневмоніт внаслідок гіперчутливості;

Механізм пошкодження краще усього проде- аспергілез бронхів і легень; гострий гломерулоне- монстрований на прикладі дії на еритроцити. При фрит; хронічний мембранопроліферативний гло- гемолітичній анемії еритроцити руйнуються в ре- мерулонефрит; і супутні захворювання нирок. зультаті або внутрішньосудинного гемолізу, або Вважають, що при аспергілезі бронхів і легень, захоплення макрофагами, переважно в селезінці. викликаних лікарським засобом або сироваткою

Дослідження іп мйго показали, що у присутності сироваткової хвороби, і деяких формах ниркоподі- комплементу деякі комплементзв'язувальні анти- бних захворювань ІдЕ-опосередкована реакція тіла (наприклад, антитіла до групових антитіл крові передує реакції ІП типу. анти-А і анти-В) викликають швидкий гемоліз. Інші Стандартні моделі реакції І типу на основі (наприклад антитіло до ГЕ) викликає повільний тварин являють собою реакцію Артюса і експери- лізис клітин; в той час як інші не ушкоджують без- ментальну сироваткову модель. При реакції Артю- посередньо клітини, але викликають їх адгезію і са (як правило місцева шкірна реакція) тварин руйнування фагоцитами. Навпаки, антитіла до спочатку багато разів імунізують для того, щоб антитіл резус еритроцитах не активують компле- досягнути великої кількості циркулюючих антитіл-

ІдО, і потім невеликі кількості антигену вводять Індукція Т-клітин може відбуватись через місяці внутрішньошкірно. Антиген преципілює з надмір- після контакту з невеликою кількістю антигену. ними дО і активує комплемент, так що швидко Повторний контакт з відповідним антигеном ініціює виникає запальне, набрякле, хворобливе місцеве фазу вияву, при якій ефекторні клітини мігрують в пошкодження (через 4-бгод.) і воно може швидко шкіру в напрямі білкового комплексу, презентова- прогресувати до стерильного абсцесу, що містить ного клітинами Лангерганса в епідермісі, з пода- множину поліморфоядерних клітин, і потім до нек- льшим виділенням цитокіну і шкірним запаленням. розу тканини. Некротизуючий васкуліт із закупоре- Діагностику алергену, що викликає реакцію, здійс- ним просвітом артеріол може бути видний в мікро- нюють аплікаційними шкірними пробами. Підозрю- скоп. Реакції не передує латентний період, ваний контактний сенсибілізатор наносять на спи- оскільки антитіло вже присутнє. ну пацієнта і закривають на 48 годин. Місце реакції

Реакції типу І, ЇЇ ії ЇЇ викликаються антитілами. перевіряють після 2 і 24 годин. При позитивній

Реакції типу ІМ викликаються Т-лімфоцитами. відповіді має місце запалення і ущільнення на ді-

Гіперчутливості типу ІМ, що включає реакції, лянці, що тестується. опосередковані клітинами, звичайно потрібно 12 Гіперчутливість уповільненого типу також є або більше годин для розвитку, і вона основана на ключовим механізмом, що визначає відторгнення мережах активованих імунних клітин. Основною трансплантованих тест-органів. характеристикою тканин є запалення, і в результа- Деякі клінічні стани, при яких, як вважають, ті може розвиватись хронічне запальне захворю- реакції типу ІМ грають важливу роль, включають вання. Гіперчутливість типу ЇМ також називають контактний дерматит, пневмоніт, що є проявом, гіперчутливістю уповільненого типу (типу ІМ) або відторгнення алотрансплантату, гранульому, ви-

ОТН. Реакції опосередковуються інтерлейкіном-2, кликану внутрішньоклітинними організмами, деякі інтерфероном-у та іншими цитокінами, які виділя- форми чутливості до лікарських засобів, тиреоїдит ються Т-лімфоцитами. При ОТН Т-лімфоцити і енцефаломієліти після вакцинування проти сказу. вступають у реакцію з антигеном і виділяють інте- Докази для останніх двох станів основані на екс- рлейкін-9, інтерферон-у та інші цитокіни. Після периментальних моделях, при захворюваннях лю- того, як Т-клітини сенсибілізовані в результаті пер- дини на появі лімфоцитів в запальному ексудаті винного впливу антигену, вторинний вплив приво- щитовидної залози і мозку. дить до реакції гіперчутливості уповільненого типу, Дерматит також називають екземою. Він від- місцевої запальної реакції, клінічний прояв якої носиться до поверхневих запалень шкіри, гістоло- займає 2-3 дні. Гістологічно ці реакції складаються гічно характеризованих набряком епідермісу і клі- з інфільтруючих Т-лімфоцитів, макрофагів і випад- нічно характеризованих везикулами (при гострому кових еозинофілів. Експериментально ОТН може стані), червоністю з погано окресленими краями, бути перенесена за допомогою Т-лімфоцитів, але набряком, мокнутієм, струпами, злущенням, зви- не сироватки, тобто антитіла не задіяні. чайним свербежем і ліхенізацією, що викликається

ОТН може розвинутись зі звичайної опосеред- розчісуванням або розтиранням. кованої клітинами імунної відповіді на інфекцію, Часто екзема відноситься до везикулярного викликану вірусами, грибами і деякими бактеріями, дерматиту, але іноді термін обмежений екземою у а саме, Мусорасіегічт (ирегсціо5із і Мусобасіегійт значенні хронічного дерматиту. Деякі також нази-

Іергае. Якщо макрофаги не можуть зруйнувати вають дерматит спонгіозним дерматитом, оскільки захоплені мікроорганізми, вони можуть зазнавати спонгіоз (внутрішньоепідермальний набряк) є гіс- диференціації в епітеліальні клітини або багатоя- тологічною характеристикою. дерні гігантські клітини. Множина таких клітин Контактний дерматит являє собою гостре або утворює гранульому. Локальне пошкодження тка- хронічне запалення, часто асиметричної або див- нини є небажаним побічним ефектом даної, в ін- ної форми, що викликається речовинами, які кон- шому захисної, імунної відповіді. Однак, якщо тактують зі шкірою і викликають токсичні (подраз-

ОТН-відповідь відсутня або ослаблена, Т- нювальні) або алергічні реакції. лімфоцити не можуть локалізувати мікроорганізми, Діагностика реакцій гіперчутливості залежить що вторглись, і у пацієнта розвивається інвазивна від типу залученої реакції. агресивна динемінована хвороба, така як гострий Реакцію типу ІМ можна передбачити, коли за- туберкульоз. пальна реакція гістологічно характеризується на-

Контактний дерматит до професійних та інших вколосудинними лімфоцитами і макрофагами. антигенів також є реакцією типу ІМ. Агенти, які його Шкірні проби на гіперчутливість уповільненого ти- викликають, звичайно мають відносно низьку мо- пу і аплікаційні шкірні проби є найбільш доступни- лекулярну масу («1кКД) і не є імуногенними самі по ми методами тестування гіперчутливості уповіль- собі, але вони є високо реакційноздатними моле- неного типу. кулами, які ковалентно зв'язуються з білками шкіри Для запобігання загостренню контактного де- або тканини. Сенсибілізуюча хімічна сполука відо- рматиту аплікаційні шкірні проби проводять після ма як гаптен, а білок-хазяїн, з яким він з'єднується, того, як контактний дерматит усунений. Підозрю- відомий як носій. Спектр потенційних сенсибілізу- ваний алерген (у відповідній концентрації) нано- ючих антигенів широкий. Розпізнають дві фази сять на шкіру під не абсорбуючий пластир і зали- патогенезу: фаза сенсибілізації і фаза вияву. Під шають на 48 годин. Якщо печіння або свербіж час фази сенсибілізації антигенпрезентуючі кліти- починається раніше, пластир видаляють. Позити- ни в шкірі, відомі як клітини Лангерганса, зв'язують вний результат тестування являє собою еритему з комплекс гаптен-(білок-носій) і презентують його Т- деяким ущільненням і, іноді, утворенням везикул. лімфоцитам в поєднанні з антигеном МНС класу ІІ. Оскільки деякі реакції не виявляються до вида-

лення пластиру, місце реакції повторно перевіря- ковалентно зв'язуються з білками, і одержані кон'- ють через 72 і Убгод. югати стимулюють утворення специфічних антитіл

Гіперчутливість також може виявлятись як ре- до лікарського засобу. Лікарський засіб, або один з акція на лікарські засоби. Раніше, ніж відносити його метаболітів, здатний вступати в хімічну реак- дану реакцію за рахунок лікарського засобу, необ- цію з білком. Зв'язування з білком сироватки, ха- хідно зазначити, що плацебо також може виклика- рактерне для багатьох лікарських засобів, є наба- ти множину симптомів і навіть об'єктивних показ- гато слабшим і не володіє достатньою силою для ників, таких як висип на шкірі. Проте, дійсні реакції антигенності. на лікарські засоби складають основну медичну Специфічна імунологічна реакція була визна- проблему. чена тільки для бензилпеніциліну. Цей лікарський

При непереносимості лікарських засобів не- засіб не зв'язується досить сильно з білками тка- сприятливі реакції виникають при першому ж вве- нини або сироватки з утворенням антигенного денні або нанесенні лікарського засобу. Це може комплексу, але основний продукт його розкладан- бути та ж токсична реакція, яку звичайно чекають ня, бензилпеніцилінова кислота, може об'єднува- при більш високих дозах, або це може бути пере- тись з білками тканини з утворенням бензилфені- більшення звичайно помірного побічного ефекту цилоїлу (БФО), головною антигенною (наприклад антигістамінний седативний ефект). детермінантою пеніциліну. Деякі мінорні антигенні

Ідіосинкразія являє собою стан, при якому неспри- детермінанти утворюються у відносно невеликих ятлива реакція при першому введенні і нанесенні кількостях механізмами, які набагато менш визна- ліків Є фармакологічно несподіваною і унікальною. чені. Реакції гіперчутливості (І, ІІ, ПІ, ІМ) найчастіше

Характеристики алергічних реакцій на ліки залучають детермінанту БФО. Антитіла ІДЕ до включають ІдДЕ-опосередковані реакції, які виника- мінорних детермінант можуть бути відповідальні у ють тільки після того, як пацієнт був підданий деяких пацієнтів за анафілаксію і кропивницю. Ан- впливу лікарського засобу (необов'язково для те- титіла ІДЕ були виявлені до головної, але не до рапії) один або багато разів без проблем. Як тільки мінорних детермінант. Вони можуть діяти як «бло- розвивається гіперчутливість, реакція може бути куючі антитіла» до БФО, модифікуючи або навіть викликана дозами набагато нижче терапевтичних запобігаючи реакції з БФО, в той час як відсутність кількостей, і звичайно нижче тих рівнів, які викли- блокуючих Ідс-антитіл до мінорних детермінант кають ідіосинкразичні реакції. Клінічні характерис- може пояснити здатність цих детермінант індуку- тики обмежені у своїх проявах. Шкірний висип вати анафілаксію. (особливо кропивниця), синдром, що нагадує си- Всі напівсинтетичні пеніциліни (наприклад, роваткову хворобу, несподівана лихоманка, ана- амоксицилін, карбеніцилін, тикарцилін) потенційно філаксія та еозинофільні легеневі інфільтрати, які вступають у перехресну реакцію з пеніциліном виникають під час лікарської терапії, є, як правило, таким чином, що чутливі до пеніциліну пацієнти наслідком гіперчутливості; у деяких випадках ане- часто реагують також і на них. Перехресні реакції з мії, тромбоцитопенії або агранулоцитозу. Рідко, цефалоспоринами проходять в меншій мірі. Ліку- васкуліт виникає після повторного впливу за до- вання цефалоспоринами необхідно починати дуже помогою лікарського засобу (наприклад, сульфо- обережно, якщо у пацієнта були випадки гострої намідів, йодидів, пеніциліну), та інтерстиціальний реакції (наприклад анафілаксії) до пеніциліну. нефрит (наприклад метицилін) і пошкодження пе- Гематологічні, опосередковані антитілами (ци- чінки (наприклад галотан) були описані в умовах, тотоксичні, типу ІІ) реакції на лікарські засоби мо- які узгоджуються з розвитком визначеної гіперчут- жуть розвиватись за будь-яким з трьох механізмів: ливості. при індукованій пеніциліном анемії антитіло взає-

Найбільш серйозним прикладом гіперчутливо- модіє з гаптеном, який тісно зв'язується з мембра- сті до лікарських засобів є анафілаксія. Однак на- ною еритроциту, викликаючи аглютинацію і поси- багато більш частою реакцією на лікарські засоби лене руйнування еритроцитів. При індукованій є кореподібний висип, знову ж невідомої етіології. стибофеном і квінідином тромбоцитофенії лікарсь-

Лихоманка і кропивниця також є досить частими кий засіб утворює розчинний комплекс з його спе- наслідками алергії на лікарські засоби. Якщо для цифічним антитілом. Потім комплекс вступає в терапії застосовується сироватка тварини, сирова- реакцію з сусідніми тромбоцитами (клітини-мішені ткова хвороба є ускладненням, але в цей час си- «невинні свідки») і активує комплемент, який один роватка тварини застосовується рідко. Може вини- залишається в мембрані тромбоциту та індукує кнути серйозний сидром, що нагадує сироваткову лізис клітин. При інших гемолітичних анеміях ліка- хворобу невідомого патогенезу без високих рівнів рський засіб (наприклад метилдопа), мабуть, хімі- циркулюючих антитіл до, але що звичайно асоці- чно змінює поверхню еритроцитів, тим самим, роз- юється з антитілами ІДЕ, особливо при прийомі криваючи антиген, який індукує і потім взаємодіє з таких лікарських засобів як пеніцилін. автоантитілом, звичайно з Кп-специфічністю.

Реакції гіперчутливості на лікарські засоби ос- Токсично-ідіосинкратичні і анафілактичні реак- новані на здатності білків і великих поліпептидних ції досить унікальні за видами або за часом так, лікарських засобів стимулювати утворення специ- що лікарський засіб, який викликає їх, звичайно фічних антитіл прямими імунологічними механіз- легко ідентифікується. Реакції типу сироваткової мами. Можливо, найменшою молекулою, яка є хвороби найчастіше викликаються пеніцилінами, потенційно антигенною, є глюкагон, молекулярна але іноді їх викликають і сульфонаміди, гідразин, маса якого близько 3500, Більшість молекул лікар- сульфонілсечовини або тіазиди. Фотосенсибіліза- ських засобів набагато менше і не можуть самі по ція є характерною для хлорпромазину, визначених собі діяти як антигени. Однак, як і гаптени, деякі антисептиків в милі, сульфонамідів, псораленів,

демеклоцикліну і гризеофульвіну. Всі ліки за виня- дається з 157 амінокислот, який не має очевидної тком тих, які вважаються абсолютно необхідними, подібності з яким-небудь пептидом у базі даних. повинні бути відмінені. Якщо є підозра на виник- Молекули матричної РНК для 1-18 та інтерлейкі- нення лихоманки від лікарського засобу, ліки, які ну-12 (1-12) легко визначаються в клітинах Купф- найбільш ймовірно викликають Її, відміняють (на- фера і активованих макрофагах. Рекомбінантний приклад, алопуринол, пеніцилін, ізоніазид, суль- І--18 стимулюють ІЕМ-гамма більш ефективно, ніж фонаміди, барбітурати, квінідин). Ослаблення ли- І--12, очевидно через окремий механізм (МісаПеї еї хоманки протягом 48 годин вказує саме на цей а!., 1996). Подібно індукованій ендотоксином акти- лікарський засіб. Якщо лихоманка супроводжуєть- вності сироватки, І--18 стимулює ІРМ-у не само- ся гранулоцитопенією, токсичність лікарського стійно, а діє переважно як костимулятор з мітоге- засобу найбільш вірогідна, ніж алергія, і набагато нами або 1-2. 1/-18 підсиліс проліферацію Т- більш серйозна. клітин, очевидно за І/-2-залежним шляхом, і під-

Алергічні легеневі реакції на лікарські засоби силює продукцію цитокінів ТП іп міїго і надає сине- звичайно є інфільтруючими, з еозинофілією, і мо- ргічну дію при з'єднанні з І1--12 у відношенні проду- жуть бути викликані серед інших солями золота, кції ІФН-у |Маїївмемувкі еї аї., 19901. пеніциліном і сульфонамідами. Найбільш частою Після клонування мишачих форм в 1996 році причиною виникнення гострої інфільтруючої леге- була описана послідовність КДНК 1-18 людини невої реакції є нітрофурантоїн. Він ймовірно є ІОвпіо єї аї., 19961. алергенним, але звичайно не є еозинофільним. При клонуванні І--18 з уражених тканин і ви-

Печінкові реакції можуть бути насамперед хо- вчення експресії гена І/-18 гена була виявлена лестатичними (найчастіше на фенотіазини і ерит- тісна асоціація даного цитокіну з аутоїмунними роміцин естолат) або печінково-клітинними (ало- захворюваннями. У мишей без ожиріння з діабе- пуринол, гідантоїн, солі золота, ізоніазид, том (МО) спонтанно розвивається аутоімунний сульфонаміди, валпроєва кислота і багато які ін- інсуліт і діабет, які можуть бути посилені і синхро- ші). Звичайною алергічною ниркоподібною реакці- нізовані єдиною ін'єкцією циклофосфаміду. Наяв- єю є інтерстиціальний нефрит, в основному через ність МРНК 1ІІ--18 продемонстрована методом ПЛР метицилін; також можуть бути залучені інші про- оберненою транскриптазою в підшлунковій залозі тимікробні засоби і циметидин. МОД-мишей під час ранніх стадій інсуліту. Рівні

Синдром, що нагадує системний червоний во- МРНАК 1-18 швидко збільшувались після лікування вчак, може бути викликаний декількома лікарськи- циклофосфамідом і передували збільшенню мРНК ми засобами, найчастіше гідралозином і прокаїна- в ТЕМ-у і, згодом, діабету. Цікаво, але дана кінетика мідом. Синдром асоціюють з позитивною пробою повторює типову мРНК 1І/-12-р40, приводячи до на антиядерні антитіла, і він є відносно безпечним, тісної кореляції між індивідуальними рівнями що не зачіпає нирки і ЦНС. Пеніциламін може ви- МРНК. Клонування кДНК 1-18 з РНК підшлункової кликати СЧВ та інші аутоімунні захворювання, залози з подальшим секвенуванням виявило іден- найчастіше злоякісну міастенію. тичність з послідовністю у 1-18, клонованої з клі-

У 1989 була описана індукована ендотоксином тин Купффера і заздалегідь активованих іп мімо активність сироватки, що індукує інтерферон-у макрофагів. Також макрофаги МОО-мишей реагу- (ІФН-у), одержаний у клітинах селезінки мишей вали на циклофосфамід, експресією гена ІІ--18, в

ІМакатига еї а!., 19891. Дана активність сироватки той час як макрофаги мишей лінії ВаІр/с, обробле- діяла не як прямий індуктор ІРМ-у, а скоріше як них паралельно, не реагували. Отже, регуляція костимулятор разом з І/-2 або мітогенами. При експресії І/-18 порушена у мишей аутоіїмунною спробі виділити активну речовину з сироватки ми- патологією і тісно асоційована з розвитком діабету шей після впливу ендоксину був виявлений гомо- |Воїне еї а!., 1997). генний білок масою 50-55кДа. Оскільки інші цитокі- І--18 відіграє потенційну роль в імунорегулю- ни можуть діяти як костимулятори продукції ІЄМ-у, ванні або запаленні шляхом посилення функціо- через нездатність нейтралізуючих антитіл до 1-1, нальної активності Раз-ліганду на клітинах ТП!

І -4, 1-5, 1-6 або ТМЕ нейтралізувати активність ІСопії еї а1І.,1997). І/-18 також ексепресується в сироватки припустимо, вона визначилась особли- корі надниркової залози і, отже, може бути секре- вим фактором. У 1995 ті ж самі дослідники проде- тованим нейроімуномодулятором, що відіграє ва- монстрували, що індукований ендотоксином кос- жливу роль в гармонійній роботі імунної системи у тимулятор продукції ІЕМ-у є присутнім в екстрактах відповідь на стресовий вплив (Спагег, 1986). печінки мишей, попередньо підданої впливу Р. Іп мімо 1-18 утворюється шляхом розщеплен- аспез5 (ОкКатига еї а!., 1995). У даній моделі попу- ня про-1Ї -18 і, очевидно, його ендогенна активність ляція печіночних макрофагів (клітини Купффера) відповідає за продукцію ІРМ-у при смертній опосе- збільшувалась, і у даних мишей низькі дози бакте- редкованій Р.аспез і ЛПС. Зрілий 1--18 утворюєть- ріального ліпополісахариду (ЛПС), що у поперед- ся з його попередника за допомогою 1--Ір конвер- ньо непідготовлених мишей не були летальними, туючого ферменту (І.-1бета-конвертуючого ставали смертельними. Фактор, названий ІРЄМ-у- ферменту, ІСЕ, каспаза-1). індукуючим фактором (ІСІР) і пізніше позначений Рецептор І--18 складається з, принаймні, двох як інтерлейкін-18 (11-18), був очищений до гомо- компонентів, спільно діючих при зв'язуванні ліган- генності з 1200 грамів печінки, підданої впливу ду. Частини зв'язування з високою і низькою спо-

Р.аспе5, мишей. Вироджені олігонуклеотиди, що рідненістю для 1-18 були виявлені на стимульо- походять з послідовностей амінокислот очищеного ваних ІС-12 Т-клітинах мишей (Мо5пітоїо еї аї.,

І/-18, застосовували для клонування кКДНК 1-18 19981, що дозволило передбачити наявність реце- мишей. 1-18 є білком з масою 18-19кДа, що скла- пторного комплексу з множиною ланцюгів. До цьо-

го часу були ідентифіковані дві субодиниці, що ком клінічним випробуванням, які дають основу обидві належать сімейству рецепторів 1І--1 (Рагпеї передбачати, що ІЄМ-у поліпшує симптоми атоніч- еї аї., 1996). У трансдукцію сигналу 1-18 залучена ного дерматиту (Кеїппоїа еї аї., 1990; Напіїт еї аї., активація МЕ-КВ |бібопаю еї а!., 1997). 19931.

Нещодавно розчинний білок, що має високу Даний винахід оснований на виявленні того, спорідненість до 1-18, був виділений з сечі люди- що лікування мишей інгібіторами І/-18 в моделі ни, і були описані КДНК людини і миші (Моміск еї гіперчутливості типу ІМ приводить до ослаблення а!., 1999; М/099/09063|. Даний білок був названий реакції гіперчутливості у тварин у порівнянні з кон-

І/-18-зв'язувальний білок (ІІ -188Р). трольними тваринами. Тому, даний винахід відно-

І--188Р є не позаклітинним доменом одного з ситься до застосування інгібітору І--18 для одер- відомих рецепторів ІЇ/-18, а секретованим цирку- жання лікарського засобу для лікування і/або люючим білком, що зустрічається в природі. Він профілактики розладів у вигляді гіперчутливості. належить до нового сімейства секретованих білків. Застосування комбінацій інгібітору І/-18 з інтер-

Дане сімейство також включає декілька білків, що фероном і/або інгібітором ТМЕ і/або інгібіторами кодуються вірусом, які мають високу гомологію з запалення і/або протиалергічними лікарськими

І/-188Р |Моміск еї аї., 1999). 11 -188Р, постійно екс- засобами також входить в об'єм даного винаходу. пресований в селезінці, належить до надсімейства В іншому аспекті, даний винахід відноситься до імуноглобулінів і має обмежену гомологію з рецеп- застосування вектора експресії, що містить кодую- тором 1-1 типу ІЇ. Його ген локалізований на хро- чу інгібітор І--18 послідовність, для лікування і/або мосомі людини 11413, і не виявлено ензиму, що профілактики станів гіперчутливості. Винахід та- кодує трансмембранний домен, в геномній послі- кож відноситься до застосування клітин, генетично довності розміром 8,3 т.п.н. (Моміск еї а!., 19991. сконструйованих з метою експресії інгібіторів І--18,

Чотири людські і дві мишачі ізоформи І--188Р, для лікування і/або профілактики розладів у ви- які одержуються в результаті сплайсингу мРНК, гляді гіперчутливості. виявлені в різних бібліотеках кДНК, були експре- На Ффіг.1 показано, що лікування І/-188Р під совані, очищені і оцінені відносно біологічної акти- час провокаційної проби захищає від контактної вності зв'язування і нейтралізації ІЛ-18 |Кігп еї аї., гіперчутливості (КГЧ). Мишей сенсибілізували 2000). Людська ізоформа 1--188Р (ІІ/-18ВРа) про- ОМЕВ в спину в 0 день і робили провокаційну про- демонструвала найбільшу спорідненість до 1І--18 зі бу через п'ять днів у вуха. Набрякання вух вимірю- швидким зв'язуванням і повільним від'єднанням і вали щодня і виражали у вигляді збільшення на- константою дисоціації (К(а)), що становить 399пМ. брякання підданих впливу ОМЕВ по відношенню

І/-18ВРс має Ід-домен такий же або 1ІІ-18ВРа, за до обробленого розчинником контрольного вуха. винятком 29 С-кінцевих амінокислот; К(а) І.-18ВРС Лікування 250 мкг І/-18ВР в.о. на одну мишу на в 10 разів менше (2,94нМ). Проте, 1І-18ВРа і 1/І- день в дні від 5 до 8 значно знижувало набрякання 18ВРс нейтралізують 1І/-1829595 при молярному вух (А), в той час як лікування в дні від 0 до 2 не надлишку, що дорівнює двом. У ізоформ І-188РЬ надало впливу при даних параметрах експеримен- і 2-18вВРс відсутній повний Ід-домен і відсутня ту (В) (п-5 мишей в групі). Квадрати: миші, ліковані здатність до зв'язування або нейтралізації ІІ -18. І/-188ВР, трикутники: контрольні, тобто оброблені

Мишачі ізоформи І--18ВРес і І/-18ВРа, що мають фізіологічним розчином тварини. ідентичний Ід домен, також нейтралізують 295905 На Фіг.2 показана міра набрякання вух від дня мишачого 1-18 при молярному надлишку, що до- 5 до дня 30 після першого контакту з гаптеном в рівнює двом. Однак, мишачий ІІ-188Ра, який во- день 5 і другого контакту в день 19 в моделі гіпер- лодіє такою ж С-кінцевою послідовністю, що і люд- чутливості уповільненого типу з системним вве- ський 1І--18ВРа, також нейтралізує людський ІІ--18. денням 250мкг/миша/день ІІ-18ВР (незафарбовані

Молекулярне моделювання дозволило ідентифі- квадрати) або розчину (зафарбовані квадрати) в кувати велику комбіновану електростатично і гід- дні від 19 до 22. рофобну ділянку зв'язування в Ід-домені ІІ -188Р, На Фіг.3 показано, що І-18ВР захищає від КГЧ яка може відповідати за його високоафінне зв'язу- нейтралізацією 1-18. Мишей, у яких відсутній 1-18 вання з лігандом (Кіт еї а!., 20001. (КО) і мишей дикого типу С57ВІ /6 порівнювали

У 1998 було передбачено, що експресія інтер- для визначення їх здатності давати відповідь у лейкіну-18 (І -18) залучена в патогенез контактної вигляді КГЧ. У мишей з відсутністю 1-18 КГЧ роз- гіперчутливості у мишей (Хи еї аї,, 1998). Хи еї аї. вивається у відповідь на ОМЕВ, хоча менш явно, застосовували мишачу модель контактної гіперчу- ніж у мишей дикого типу. Однак у мишей з відсут- тливості з використанням оксазолону як контактно- ністю І/-18 не спостерігалось ніякого ефекту від го алергену, і показали індукцію експресії І--18 в лікування І-18ВР, що вказує на те, що протизапа- пошкоджених ділянках шкіри. Найвище підвищен- льна дія І--18ВР. при КГЧ досягається за рахунок ня регуляції було виявлене через 24 години після нейтралізації І--18 (п-5 мишей в групі). Кола: фізі- контакту з алергеном, потім експресія 1-18 посту- ологічний розчин у мишей з дефіцитом 1-18 (КО), пово зменшилась. ромби: І.-188Р у мишей з дефіцитом 1--18(КО);

Інше повідомлення про здатність 1-18 індуку- квадрати: І--18ВР. у мишей дикого типу (МУТ); три- вати ОТН-відповідь незалежно від І--18 було опу- кутники: фізіологічний розчин у мишей дикого типу бліковано Кіїспіпуд еї аї!., 2000. Однак роль 1-18 (М/Т). залишається не ясною, оскільки було описано, що На Фіг.4 показано, що І/-18В8Р не знижує про-

І/-18 сам по собі є потенційно ефективним тера- никності судин під час КГЧ. КГЧ індукували у ми- певтичним засобом для пацієнтів з атонічним дер- шей С57ВІ/6. Для моніторингу набряку, виклика- матитом ІНаби еї аї., 20011, що відповідає декіль- ного реакцією КГЧ, Емап5 Віе вводили в.в. за 2 години до впливу ОМЕВ. Мишей умертвляли через На Ффіг.8 Лікування І-18ВР не ослабляє рекру- 24 години і обробляли вуха так, щоб екстрагувати тимент клітин Лангерганса в дренуючий лімфатич- барвник, який проник з судинної мережі і скупчився ний вузол. Мишей забарвлювали нанесенням гап- у навколишніх тканинах. Проникнення в тканини з тену РІТС або розчину ацетон/дибутилфталат (1:1) судин оцінювали як кількість барвника на мг вису- на правий і лівий бік, відповідно. Пахові лімфатич- шеної тканини вуха, скоригована на концентрацію ні вузли збирали через 24 години після фарбуван-

Емап5 Вісе в сироватці і виражена у вигляді від- ня. Кон'юговані з гаптеном клітини Лангерганса ношення підданих впливу і контрольних вух. Хоча могли бути визначені за допомогою РАСЗ5 як кліти- лікування І--18ВР на день 4 і день 5 знижувало ни РІТСЯ, СО11с7 в лімфатичному вузлі, дреную- набрякання до 5695 від контрольних вух, обробле- чому забарвлений РІТС бік, але не в лімфатично- них розчином (ліва панель, ре0,01), в проникності му вузлі, дренуючому протилежний бік, судин не спостерігалось значної відмінності між забарвлений тільки розчином. Процент клітин Лан- цими двома групами. В обох групах показаний герганса, що несуть гаптен, в дренуючому лімфа- значно збільшений набряк у порівнянні з не сенси- тичному вузлі становив 1,295 від загальної кількос- білізованою контрольною групою (р«е0,05 і р«0,01). ті клітин лімфатичного вузла у тварин, лікованих

Як подальший контроль, мишей обробляли І--1288Р за 24 години і 1 годину до фарбування. Це 250мкг нерелевантного білка БСА на одну тварину не відрізнялось значно від кількості, одержаної у на день. У цих мишей КГЧ розвивалось так само, контрольних тварин. (п-5 дренуючих лімфатичних як і у тварин, оброблених розчином (п-10 мишей в вузлів на групу). групі). Даний винахід оснований на виявленні того,

На Фіг.5 лікування І--18В8Р. зменшує запальну що інгібітор І--18 надає благотворну дію на відно- інфільтрацію підданого впливу ЮОМЕВ вуха. КГЧ влення після сенсибілізації гаптеном в моделі гі- індукувала у мишей С57ВІ/б як описано. Тварин перчутливості типу ІМ у мишей. обробляли І/-18ВР або розчином в дні 4-6. Ліку- Тому, даний винахід відноситься до застосу- вання І--18ВР зменшувало набрякання до 5895 від вання інгібітору І--18 для одержання лікарського контрольної групи з розчином на 7 день. Мишей засобу для лікування і/або профілактики розладів умертвляли на 7 день, збирали піддані впливу у вигляді гіперчутливості. вуха і групували їх (п-:8) і піддавали ферментатив- У контексті даного винаходу вираз «розлад, у ному розщепленню з одержанням суспензії окре- вигляді гіперчутливості» і «алергічний розлад» є мих клітин. Клітини характеризували подальшим синонімами. Обидва терміни відносяться до роз- аналізом РАС5, основуючись на СО45-позитивних ладів або реакцій, викликаних неадекватною адап- живих клітинах. Кількість «рТ-клітин, МК-клітин, тивною імунною відповіддю. Реакції гіперчутливос- нейтрофілів і моноцитів/макрофагів, виявлених у ті є результатом в корені благотворної імунної препаратах вуха, виражають як процент від зага- відповіді, діючої неадекватно у відношенні чужорі- льної кількості аналізованих клітин (верхні значен- дних антигенів, таких як, наприклад звичайні мак- ня). Зниження вказаних типів клітин після ліку- ромолекули навколишнього середовища, яка може вання І/-188Р по відношенню до контрольної привести до запальних реакцій і пошкодження тка- групи з розчином дане в нижніх цифрах. нини. При розладах, що є виявом гіперчутливості,

На Фіг.6 показано, що активація Т-клітин осла- звичайно нешкідливий стимулятор, алерген, ви- бляється при лікуванні І-18ВР. Клітини, одержані кликає імунну відповідь, яка при повторному кон- з підданих впливу ОМЕВ вух, повторно стимулю- такті реактивується з виникненням патологічного ють при 2Х105 на комірку планшета з пов'язаними пошкодження. на ньому антитілами до СО3. Під час подальшої Розлади у вигляді гіперчутливості, а також їх культивації протягом 24 годин ІІ-188Р не додава- клінічні симптоми і вияви детально описані в «Рівні ли. Продукцію ІЕМ-у вимірювали у трьох повторах техніки» і застосування відповідно до даного вина- за допомогою ЕГІ5А. Клітини, одержані від оброб- ходу відноситься до, але не обмежено ними, роз- лених І.-188Р мишей, продукували тільки 4595 ладів у вигляді гіперчутливості, описаних вище.

ІЕМ-у, виявленого в культурах клітин, одержаних У переважному варіанті даного винаходу роз- від контрольних тварин, оброблених розчином. лад у вигляді гіперчутливості вибирають з групи,

На Фіг.7 показано, що лікування І/-18ВР. зни- що включає розлади з реакціями гіперчутливості жує кількість клітин, продукуючих ІЕМу, в запаль- типу І, розлади з реакціями гіперчутливості типу ЇЇ, ному інфільтраті вуха. Препарати клітин з підданих розлади з реакціями гіперчутливості типу ПІ! або впливу ОМЕВ вух стимулювали 5Онг/мл РМА" і розлади з реакціями гіперчутливості типу ІМ. 500Онг/мл лономіцину протягом 4 годин. Секрецію Розпади з гіперчутливістю типу | також нази- цитокіну блокували додаванням мкг/мл бре- вають гіперчутливістю негайного типу або звичай- фелдину А в останні 2 години інкубування. Потім ною алергією. Дана гіперчутливість опосередкову- клітини піддавали багатоколірному імунофлуорес- ється ІДЕ. Реакції гіперчутливості негайного типу центному фарбуванню на предмет внутрішньоклі- (тип І) виникають через зв'язування антигену з ДЕ тинних ІЄМу і поверхневих антигенів. Лікування ІЇ-- на тучних клітинах або базофілах. У поняття роз- 18ВР. знижувало загальну кількість клітин, позити- ладів з реакціями гіперчутливості типу | включені вних відносно фарбування на предмет ІЄМу до атонічні захворювання, такі як, але не обмежені 7895 від контролю. ІРМу продукував Т-клітинами ними, алергічний риніт, алергічний Кон юнктивіт,

СО8 і, в меншій мірі, Т-клітинами СО4. У МК- атонічний дерматит, алергічна набута бронхіальна й Я : - астма, кропивниця, системна анафілаксія. Анафі- клітинах і «ВТ-клітинах ІРМу не виявлений, (н.в. - : : не визначено; 7" Форбол 12-Міристат 13-Ацетат). лаксія є важкою, загрозливою для життя алергіч- ною реакцією, що виникає при гіперчутливості типу

Ї (негайній). деякі форми чутливості до лікарських засобів, ти-

Гіперчутливість типу ІІ або цитотоксична гіпер- реоїдит і енцефаломієлити після вакцинування чутливість включає цитолітичні дії, опосередковані проти сказу. антитілом, комплементом і/або клітинними механі- ОТН може виникнути при звичайній опосеред- змами. Антитіло до пов'язаного з клітиною антиге- кованій клітинами імунній відповіді на зараження ну (тип Ії) спричиняє руйнування клітини шляхом вірусами, грибами і деякими бактеріями, а саме, активації комплементу або стимуляції фагоцитозу. Мусорасіегіт їшрегсціо5із і Мусорасіегічт Іергае.

Розлади з гіперчутливістю типу ІЇ відповідно до Іншими зовнішніми агентами, що викликають ОТН, даного винаходу включають, наприклад, Кумбо- можуть бути секреції рослин, тварин, комах і реп- позитивну гемолітичну анемію, індуковану антиті- тилій, хімічні або біохімічні антигени. Вони можуть лами тромбоцитопенічну пурпуру, лейкопенію, походити з природних або синтетичних джерел. пухирчатку, пемфігоїд, синдром Гудпасчера і пер- Різні типи волокон, тканин і подібних, таких як ла- ніціозну анемію. Ці реакції мають місце у пацієнтів текс, що застосовується у хірургічних рукавичках, після переливання несумісної крові, при гемоліти- можуть викликати опосередковану Т-клітинами чних захворюваннях новонароджених, і при тром- реакцію гіперчутливості у деяких індивідуумів. Зо- боцитопенії новонароджених, вони також можуть внішні агенти, які викликають реакцію, можуть бути грати роль в мультисистемних захворюваннях, що агентами, що надходять з водою, такими як розчи- є виявом гіперчутливості, (наприклад при систем- нені солі і мінерали, що зустрічаються, наприклад, ному червоному вовчаку, СЧВ). у навколишньому середовищі, у вугледобувній,

Розлади з гіперчутливістю ІЇЇ типу включають металургійній і хімічній промисловості. реакції, в яких антитіла утворюють імунні комплек- В іншому переважному варіанті даного вина- си з антигеном. Циркулюючі комплекси активують ходу розладом з гіперчутливістю є контактний де- комплемент, приєднуються до еритроцитів, які рматит або контактна гіперчутливість. Контактний потім піддаються фотоцитозу селезінки, виходять дерматит, який також є реакцією типу ІМ, є реакці- з системи кровообігу і спричиняють запалення єю на професійні та інші антигени. Агенти, що ви- тканин. Ця реакція називається реакцією Артюса. кликають контактний дерматит, звичайно мають

Альтернативно, комплекси фагоцитозуються мак- відносно низьку молекулярну масу («1кД) і не є рофагами, які презентують антиген, виділяють імуногенними самі по собі, але вони являють со- цитокіни і активують В і Т-клітини. ІДЕ, ІдА, до і бою високо реакційноздатні молекули, які ковале-

ІМ утворюють комплекси з антигеном. Реакції нтно зв'язуються з білками шкіри або тканин. Сен- типу ІЇЇ виникають, як правило, при відкладенні сибілізуюча хімічна сполука відома як гаптен, імунних комплексів в тканинах, особливо у шкірі, білок-хазяїн, з яким він з'єднується, відомий як суглобах і нирках. Хронічний імунний комплексний носій. Відома множина гаптенів, що викликають нефрит відповідальний за більшість випадків гло- контактний дерматит. Для того щоб виявити, чи мерулонефриту у людини. Відповідно до даного буде у пацієнта розвиватись контактний дерматит винаходу розлади гіперчутливості типу ІЇЇ включа- у відповідь на вказаний сенсибілізатор, підозрю- ють, наприклад сироваткову хворобу, що виклика- ваний контактний сенсибілізатор наносять на спи- ється сироваткою, лікарськими засобами або ан- ну пацієнта і закривають на 48 годин. Місце реакції титілом вірусного гепатиту; СЧВ; ревматоїдний перевіряють після 2 і 24 годин. При позитивній артрит (РА); поліартериїт; кріоглобулінемію; гіпер- відповіді має місце запалення і ущільнення на ді- чутливий пневмоніт; аспергілез бронхів і легень; лянці, що тестується. гострий гломерулонефрит; хронічний мембрано- Гіперчутливість уповільненого типу також є проліферативний гломерулонефрит; і супутні за- ключовим механізмом, що визначає відторгнення хворювання нирок. трансплантованих тест-органів, і тому даний вина-

Розлади з гіперчутливістю типу ЇМ включають хід також відноситься до застосування інгібітору опосередковані клітинами реакції, і їх розвиток І/--18 для запобігання відторгнення трансплантату. звичайно займає 12 або більше годин. Розлади з Термін «інгібітор І--18» в контексті даного ви- гіперчутливістю типу ІМ можуть включати запален- находу відноситься до будь-якої молекули, яка ня, і результатом може бути хронічне запальне модулює продукцію 1-18 і/або дію 1І--18 таким чи- захворювання. Гіперчутливості типу ІМ також на- ном, що продукція і/або його дія І--18 ослабляєть- зивають гіперчутливістю уповільненого типу або ся, зменшується або частково, істотно або повніс-

ОТН. Після того як тільки Т-клітини сенсибілізовані тю запобігається або блокується. Термін «інгібітор внаслідок первинного впливу, вторинний вплив І/-16» охоплює інгібітори продукції І--18, також приводить до реакції гіперчутливості уповільнено- або інгібітори дії 1-18. го типу. Ця реакція є місцевою запальною відпо- Інгібітором продукції може бути будь-яка мо- віддю, яка іноді займає 2-3 дні для клінічного ви- лекула, що негативно впливає на синтез, процесінг яву. або дозрівання І1І-18. Інгібітори відповідно до да-

У переважному варіанті даного винаходу, роз- ного винаходу можуть бути, наприклад, супресо- лад з гіперчутливістю є гіперчутливістю уповільне- рами експресії гена інтерлейкіну І--18, антисмис- ного типу. Таким чином, даний винахід переважно ловими мРНК, такими, що зменшують або відноситься до всіх видів клінічних станів, в яких запобігають транскрипції мРНК 1-18 або ведуть до реакції типу ІМ грають важливу роль, таких як кон- деградації мРНК, білками, що порушують прави- тактна гіперчутливість уповільненого типу, дерма- льне укладання, або такими, що частково або істо- тит, контактний дерматит, гіперчутливий пневмо- тно запобігають секреції І--18, протеазами, спри- ніт, відторгнення алотрансплантату, гранульому, яючими деградації І--18, після того, як він був викликану внутрішньоклітинними організмами, синтезований, інгібіторами протеаз, що розщеп-

люють про-1ІЇ-18 з одержанням зрілого 1-18, таки- такою як ДНК або РНК, яка гібридизується з ДНК ми як інгібітори каспази-1, і подібними. або РНК, яка кодує І-18ВР або кодують вірусний

Інгібітором дії І--18 може бути, наприклад ан- І--188Р, відповідно до даного винаходу, в жорст- тагоніст І--18. Антагоністи можуть зв'язувати або ких умовах. Термін «жорсткі умови» відноситься ізолювати саму молекулу 1-18 з достатньою спо- до умов гібридизації і подальшого промивання, які рідненістю і специфічністю з частковою або істот- фахівці в даній області техніки звичайно назива- ною нейтралізацією І/-13 або ділянки(ок) зв'язу- ють «жорсткими». (Див. А!й5ире!ї еї аї., Сигтепі вання 1-18, відповідальної за зв'язування 1-18 з Ргоїосої5 іп Моїесшціаг Віоіоду, раніше, Іптегзсіепсе, його лігандами (як, наприклад з його рецептора- М.М., 556,3 і 6,4 (1987, 1992) і Затрьгоок еї а/.|, ра- ми). Антагоніст може також інгібувати шлях пере- ніше. Не обмежуючись ними, приклади жорстких дачі сигналу за участю 1-18, який активується в умов включають умови промивання при темпера- клітинах після зв'язування ІЇ/-18 з його рецепто- турі на 12-20"С нижче розрахованої Тт гідриду, ром. що вивчається, у наприклад 2х550 і 0,595 5О5

Інгібіторами дії 1/-18 можуть також бути роз- протягом 5 хвилин, 2х55Т і 0,195 505 протягом 15 чинні рецептори 1-18 або молекули, що імітують хвилин; 0,1х55С і 0,595 505 при температурі 377С рецептори, або агенти, що блокують рецептори І/-- протягом 30-60 хвилин і потім 0,1х555 і 0,595 505 18, або антитіла до ІІ--18, такі як поліклональні або при температурі 68"С протягом 30-60 хвилин. Фа- моноклональні антитіла, або будь-які інші агенти хівці в даній області техніки розуміють, що жорст- або молекули, які запобігають зв'язуванню 1-18 з кість умов також залежить від довжини послідов- його мішенями, що зменшує або запобігає ініцію- ності ДНК, олігонуклеотидних зондів (таких як 10- ванню внутрішньо- або позаклітинних реакцій, 40 основ) або суміші олігонуклеотидних зондів. опосередкованих 1І--18. Якщо застосовується суміш зондів, переважно

У переважному варіанті даного винаходу інгі- замість 550 застосовувати хлорид тетраметила- бітор І--18 вибирають з інгібіторів каспази-1 (ІСЕ), монію (ТМАС). Див. А!,зибеї, раніше. антитіл до 1-18, антитіл до будь-яких підодиниць Ідентичність відображає взаємовідношення рецептору 1ІІ--18, інгібіторів шляху передачі сигналу між двома або більше поліпептидними послідов- за участю 1-18, антагоністів І--18, які конкурують з ностями або двома або більше полінуклеотидними

І--18 і блокують рецептор 1-18, і зв'язувальних ІІ-- послідовностями, що визначаються шляхом порів- 18 білків, ізоформ, мутеїнів, злитих білків, функці- няння послідовностей. Загалом, ідентичність від- ональних похідних, активних фракцій або похідних носиться до точної відповідності нуклеотиду нук- циркулярної перестановки, що мають ту ж дію. леотиду або амінокислоти амінокислоті у двох

Термін «зв'язувальні І/-13 білки» в даному полінуклеотидних або двох поліпептидних послі- описі застосовується як синонім терміну «зв'язу- довностях, відповідно, по всій довжині послідовно- вальний 1-18 білок» або «І/-18ВР». Він включає стей, що порівнюються. зв'язувальні І/-18 білки такі, як визначені в УМО Для послідовностей, в яких немає точної від- 99/09063 або у Моміск еї а!., 1999, включаючи варі- повідності, може бути визначений «95 ідентичнос- анти сплайсингу і/або ізоформи зв'язувальних І! - ті». Загалом, дві послідовності, що порівнюються, 18 білків, як визначено у Кіт еї а!., 2000, які зв'язу- вирівнюють для одержання максимальної відпо- ються з 1-18. Зокрема, відповідно до даного вина- відності між ними. Даний процес може включати ходу застосовуються людські ізоформи а і с 1/- додавання «інтервалів» в одну або в обидві послі- 188Р. Білки, що застосовуються відповідно до да- довності для збільшення міри вирівнювання. 90 ного винаходу, можуть бути глікозильованими або ідентичності може бути визначений для всієї дов- неглікозильованими, вони можуть бути одержані з жини кожної послідовності (так назване глобальне природних джерел, таких як сеча, або вони можуть вирівнювання), яка порівнюється, що особливо бути переважно одержані рекомбінантним шля- підходить для послідовностей однакової або дуже хом. Рекомбінантна експресія може проводитись в схожої довжини, або для більш коротких, визначе- прокаріотних системах експресії, таких як Б.соїї, них довжин (так назване локальне вирівнювання), або в еукаріотній, переважно - системі експресії що більше підходить для послідовностей з нерів- ссавців. ними довжинами.

В даному описі термін «мутеїни» відноситься Способи порівняння ідентичності і гомології до аналогів І/-138В8Р або аналогів вірусного ІІ- двох або більше послідовностей добре відомі в 188Р, в яких один або більше амінокислотних за- даній області техніки. Так, наприклад, є програмне лишків І--18ВР, що зустрічається в природі, або забезпечення від М/ізсопзіп Зедцепсе Апаїузів вірусного І/-188Р. заміщені іншими амінокислот- Раскаде, версія 9.1 (Оемегеих У еї аї., 1984), на- ними залишками, або делетовані, або один або приклад, програми ВЕ5ТРІТ і САР можуть засто- більше амінокислотних залишків додані до послі- совуватись для визначення 95 ідентичності між довності, що зустрічається в природі, І.-18ВР або двома полінуклеотидами і 95 ідентичності і 90 го- вірусного ІІ-18ВР, без надання значного впливу на мології між двома поліпептидними послідовностя- активність одержаних продуктів у порівнянні з ди- ми. ВЕЗТРІТ використовує алгоритм «локальної ким типом І-188Р або вірусним І--18ВР. Дані гомології» Зтійп апі Ум/аїептап (1981) | виявляє мутеїни одержують відомим синтезом і/або сайт- найкращу одиничну ділянку схожості між двома направленими методами мутагенезу, або будь- послідовностями. Інші програми для визначення яким іншим відомим методом, відповідним для ідентичності і/або схожості між послідовностями даної мети. також відомі в даній області техніки, наприклад,

Мутеїни відповідно до даного винаходу вклю- ряд програм ВГА5Т (Аїїв5спи! 5Е еї аї, 1990, Аеспиі чають білки, що кодуються нуклеїновою кислотою, ЗЕ еї аї, 1997, доступні з домашньої сторінки МСВІ на млумлм.пебі.піт.піп.дом) і РАЗТА |Реагзоп М/Н, Таблиця 1 1990; Реаїзоп 1998). . . Переважні групи синонімічних амінокислот

Будь-який такий мутеїн переважно має послі- довність амінокислот, в достатній мірі дублюючу Амінокислота Свнанімна трупа послідовність І/-18ВР, або в достатній мірі дуб- лег еВ, , , , сте Атв, Сів, Був, СТВ, Ні люючу послідовність вірусного ІЇ/-188Р так, щоб тей Пе, Вб, Туг, Меї, Ха! ей володіти значною мірою схожою активністю з ІІ - Ре СПУ, Аїв, Тін, Ро 18ВР. Одним з видів активності І/-18ВР є його Ти Рго, Хег, Аа, СТУ, Нів, Сів, ТЕГ здатність зв'язувати І/-18. Поки мутеїн володіє Аа СТУ, Те, Ріо; Ав істотною активністю зв'язування 1-18, він може ха Меб Тут, рве, Пе, Гем, Уа! застосовуватись для очищення І!-18, такого як за п Ав, Тне, Рго, Вег, СТУ ; . щої є Ме Ту, Ріє, Уаї, бен, Не допомогою афінної хроматографії, і тому можна Рре Тер, Меї, Тут Пе, Уа, Пеш Ре вважати, що він володіє значною мірою схожою Тл Тгр, Ме РНе, Пе, чаї, Тен, Туг. активністю, з І--18ВР. Отже, можна визначити, чи сСух Бе ТЬ Суво володіє будь-якою конкретний мутеїн активністю, Нів СПИ, Гуз, Сп, ТВг, тр, Нів значною мірою схожою з ІІ-18ВР, за допомогою біт. С», Був, Авт, Пів, Тк, Ав, Сів звичайних експериментів, що включають як об'єкт ту с снів А це такий мутеїн, наприклад, методом простого «кон- Азр Ом, Ав, Дер ші курентного» сендвіч-аналізу для визначення, чи сі: Авр, І-ув, Авл, бій, Ні, Ат, Сім зв'язує він відповідним чином помічений ІІ--18, та- Меї Ре, Це, Уаї, Ген, Мей кого як радіоіїмунологічний аналіз або аналіз Тр пр

ЕПВБА. Таблица 2

У переважному варіанті будь-який такий муте- Більш переважні групи синовімічних амінокислот їн має, принаймні, 4095 ідентичності або гомології з Амінскислота Сивонімна група послідовністю або І/-18ВР, або кодованого віру- Чет «еї сом гомолу І--18ВР, як визначено у УМО 99/09063. АтЕ Ні, Був; Атв

Більш переважно, щоб він мав, принаймні, 50905, Геч Ге, Пе, Рне, Меї принаймні, 6095, принаймні, 7095, принаймні, 8095 Ро Ав; Ро або, найбільш переважно, принаймні, 9095 іденти- тіж ТЬг чності або гомології з ними. дів реко, Аа

Мутеїни поліпептидів І--18ВР. або мутеїни ві- Уві Уа), Ме, Пе русних 1--188Р, які можуть застосовуватись відпо- у Су відно до даного винаходу, або кодуюча їх нуклеї- Це Не. Мей, Ріє, Маї, Бен нова кислота, включають обмежений набір вне Ме, Тут, Че, Тео, Рпе значною мірою відповідних послідовностей, як Кй се Ба наприклад, заміщувальні пептиди або полінуклео- Нів нів, Сій, Атя, тиди, які можуть бути звичайно одержані фахівцем сій Сім, Сів, Ні в даній області техніки, без надмірного експери- ДЕЙ Азр, Аа ментування, основуючись на методах та інструкці- Тув Гув, Ат ях, представлених тут. с ць яки

Переважними змінами для мутеїнів відповідно Ме ме; рев, Пе, Маї, Гей до даного винаходу є ті, які називають «консерва- Тер Тр тивними» замінами. Консервативні заміни аміно- Таблядя З кислот поліпептидів або білків І--18ВР або вірус- й , с. , них П/-18ВР можуть включати синонімічні Найбільи переважні групи синонімічних амінокислот амінокислоти в межах груп, які володіють в доста- Амідокислота Синонімна кислота тній мірі схожими фізико-хімічними властивостями, Зак Бег такі заміни між членами групи дозволяють зберег- Ат Атв ти біологічну функцію молекули (Стапіптап, 19741. рак Ї.еи, Пе, Меї

Зрозуміло, що вставки і делеції амінокислот також Те ще можуть бути зроблені в охарактеризованих вище Ав Ав послідовностях без порушення з функцій, особли- Уа ха во якщо вставки і делеції залучають тільки декіль- сх су ка амінокислот, наприклад менше тридцяти, і пе- Це Пе, Ме Геї реважно, менше десяти, і не видаляють або не вве | Реег переміщують амінокислоти, які є критичними для Тут Тут функціональної конформації, наприклад цистеїнові Сув Сув, Вег залишки. Білки і мутеїни, одержані шляхом таких бів ве делецій і/або вставками, входять в об'єм даного ув ден винаходу. Що | Ім ув

Переважно, групами синонімічних амінокислот Авр Авр є ті, які представлені в таблиці 1. Більш переваж- Сів сій но, групами синонімічних амінокислот є ті, які Ме: Ме Пе, еп представлені в таблиці 2; і найбільш переважно, Тер Ме групами синонімічних амінокислот є ті, які пред- Приклади одержання замін амінокислот в біл- ставлені в таблиці 3. ках, які можуть застосовуватись для одержання мутеїнів поліпептидів або білків ІІ -18, або мутеїнів солі з мінеральними кислотами, такими як, напри- вірусних І--ІЗВР для застосування відповідно до клад, хлористоводнева кислота або сірчана кисло- даного винаходу, включають будь-які відомі стадії та, і солі з органічними кислотами, такими як, на- способу, такі як представлені у (патентах США приклад, оцтова кислота або щавлева кислота.

МеМо4959314, 4588858 і 4737462, виданих Магк еї Звичайно, будь-які такі солі повинні зберігати біо- а!; 5116943, виданій Коїй5 еї аї.; 4965195, виданій логічну активність інгібітору І--18 відповідно до

Матеп еї аїЇ.; 4879111, виданій Спопд еї а).; і даного винаходу, таку як надання благотворної дії 5017691, виданій І! ее еї а).; і лізинзаміщених білків, на ОНТ, наприклад. представлених у патенті США Ме4904584 (ЗПпауу еї В іншому переважному варіанті даного вина- ау. ходу інгібітором 1-18 є антитіло до ІІ-18. Антитіла

Термін «злитий білок» відноситься до поліпеп- до 1-18 можуть бути поліклональними або монок- тиду, що містить І/-18В8Р або вірусний 1--188Р, лональними, химерними, гуманізованими або на- або їх мутеїн або їх фрагмент, в злитті з іншим віть повністю людськими. Рекомбінантні антитіла і білком, який, наприклад, має більш тривалий час їх фрагменти характеризуються високою мірою існування в рідких середовищах організму. І--188Р спорідненості зв'язування з 1-18 іп мімо і низькою або вірусний І.-138ВР може бути злитий з іншим токсичністю. Антитіла, які можуть застосовуватись білком, поліпептидом або т.п., наприклад, з імуно- відповідно до даного винаходу, характеризуються глобуліном або його фрагментом. здатністю лікувати пацієнтів протягом періоду ча-

Термін «Функціональні похідні», що прийма- су, достатнього для одержання від хорошої до ються в даному описі, включає похідні І-18ВР або чудової регресії або полегшення патогенного ста- вірусного І-188ВР і їх мутеїни і злиті білки, які мо- ну або будь-якого симптому або групи симптомів, жуть бути одержані з функціональних груп, які зу- що відносяться до патогенного стану, і низькою стрічаються у вигляді бічних ланцюгів на залишках токсичністю. або М- або С-кінцевих груп, за допомогою спосо- Нейтралізуючі антитіла легко одержують у бів, відомих в даній області техніки, і вони вклю- тварин, таких як кролики, кози або миші, імунізаці- чаються в даний винахід доти, доки вони залиша- єю 1-18. Імунізовані миші особливо корисні для ються фармацевтично прийнятними, тобто не забезпечення джерел В-клітин для одержання порушують активності білка, яка значною мірою гібридом, які, в свою чергу, культивують для одер- схожа з активністю І--18ВР або вірусним 1ІІ--188Р, і жання великих кількостей анти-ІЇ--18 моноклона- не додають токсичних властивостей композиціям, льних антитіл. що містять їх. Химерні антитіла являють собою молекули

Дані похідні можуть, наприклад, включати бічні імуноглобуліну, що характеризуються двома або ланцюги поліетиленгліколю, які можуть маскувати більше сегментами або частинами, що походять антигенні ділянки і продовжувати час життя І - від різних видів тварин. Як правило, варіабельну 18ВР або вірусного ІІ-188ВР в рідких середовищах ділянку химерного антитіла одержують з антитіла організму. Інші похідні включають аліфатичні ефі- ссавця, що не відноситься до людини, такого як ри карбоксильних груп, аміди карбоксильних груп, мишаче моноклональне антитіло, а константну одержані реакцією з аміаком або з первинними ділянку імуноглобуліну одержують з молекули іму- або вторинними амінами, М-ацильні похідні віль- ноглобуліну людини. Переважно, щоб обидві діля- них аміногруп залишків амінокислот, одержані з нки і їх комбінація мали низьку імуногенність, що ацильними групами (наприклад, алканоїльними визначається звичайним шляхом (ЕїПой еї аї., або карбоциклічними ароїльними групами), або О- 1994). Гуманізовані антитіла являють собою моле- ацильні похідні вільних гідроксильних груп (напри- кули імуноглобуліну, створені методами генної клад, груп серинових або треонінових залишків), інженерії, при яких мишачі константні ділянки за- одержані з ацильними групами. мінюють відповідними людськими ділянками, при

Як «активні фракції» І--18ВР або вірусного ІІ-- цьому зберігають мишачі зв'язувальні антиген ді- 188Р, мутеїнів і злитих білків даний винахід вклю- лянки. Одержане мишаче-людське химерне анти- чає будь-які фрагменти або попередники поліпеп- тіло переважно має знижену імуногенність і поліп- тидного ланцюга молекули білка як такої або ра- шену фармакокінетику у людини ІКпідні еї аї., зом з асоційованими з нею молекулами або 1993). пов'язаними з нею залишками, наприклад, цукром Таким чином, у ще одному переважному варі- або фосфатними залишками, або агрегатами мо- анті, антитіло до І/-18 являє собою гуманізоване лекули білка або залишками цукру, за умови, що антитіло до І--18. Переважні приклади гуманізова- вказана фракція має активність значною мірою них антитіл до 1-18 описані, наприклад в заявці на схожу ІІ--188Р. європейський патент ЕР 0974600.

Термін «солі» в даному описі відноситься як У ще одному переважному варіанті антитіло до солей карбоксильних груп, так і до кислотно- до 1-18 є повністю людським. Технологія одер- адитивних солей аміногруп молекули інгібітору І-- жання людських антитіл детально описана, напри- 18 або їх аналогів. Солі карбоксильної групи мо- клад, у ММО 00/76310, УМО 99/53049, 5 6162963 жуть бути одержані методами, відомими в даній або АО5336100. Повністю людськими антитілами є області техніки, і включають неорганічні солі, на- рекомбінантні антитіла, що переважно одержують- приклад, натрієві, кальцієві, амонієві, залізні або ся у трансгенних тварин, наприклад ксеномишей, цинкові солі, і подібні, і солі з органічними основа- що включають повністю або частково функціона- ми, наприклад, з амінами, такими як триетанола- льні локуси імуноглобуліну людини. мін, аргінін або лізин, піперидин, прокаїн і подібні. У найбільш переважному варіанті даного ви-

Кислотно-адитивні солі включають, наприклад, находу інгібітором 1-18 є ІІ/-18ВР або його ізофо-

рма, мутеїн, злитий білок, функціональне похідне, ну, описане, наприклад у прикладі 11 У активна фракція або похідне циркулярної переста- 99/09063. Інші ізоформи молекул Ід також підхо- новки. Дані ізоформи, мутеїни, злиті білки або фу- дять для створення злитих білків відповідно до нкціональні похідні зберігають біологічну актив- даного винаходу, такі як ізоформи ІдсСг2 або Ідса, ність ІС-18В8Р, зокрема, зв'язуються з 1-18, і або інші класи Ід, такі як ІМ або ІдА, наприклад. переважно мають, по суті, як мінімум, активність, Злиті білюим можуть бути мономерними або муль- схожу з ІІ -188Р. В ідеалі, такі білки володіють під- тимерними, гетеро- або гомомультимерними. вищеною біологічною активністю у порівнянні з Інтерферони особливо відомі своєю інгібую- немодифікованим І/-188Р. Переважні активні чою дією на реплікацію вірусів і проліферацію клі- фракції володіють активністю, яка краще активно- тин. Інтерферон-у, наприклад, відіграє важливу сті І.-188Р, або мають подальші переваги, такі як роль у стимуляції імунної і запальної відповідей. краща стабільність або менша токсичність або Вважається, що інтерферон Д (ІЕМ-Д, інтерферон імуногенність, або їх легше одержувати у великих типу І) відіграє протизапальну роль. кількостях, або легше очищати. Таким чином, даний винахід також відноситься

Послідовності І--18ВР її його / варіан- до застосування комбінації інгібітору 1І--18 та інте- тів/зоформів сплайсингу можуть бути одержані з рферону у виробництві лікарських засобів для лі-

ЇМО 99/09063 або у Міміск еї а!., 1999, а також у кування розладів, що є проявом гіперчутливості.

Кіт еї а!., 20001. Інтерферони можуть також бути кон'юговані з

Функціональні похідні І--188Р можуть бути полімерами для поліпшення стабільності білків. кон'юговані з полімерами для поліпшення власти- Кон'югат між інтерфероном і багатоатомним спир- востей білка, таких як стабільність, період напівро- том поліетиленгліколем (ПЕГ) описаний, напри- зпаду, біодоступність, переносимість організму клад у МО 99/55377. людини або імуногенність. Для досягнення цієї В іншому переважному варіанті відповідно до мети І--188Р. може бути пов'язаний, наприклад з даного винаходу інтерфероном є інтерферон-р поліетиленгліколем (ПЕГ). ПЕГування може про- (ІЕМ-Д) і більш переважно, ІЕМ-Р а. водитись відомими методами, описаними, напри- Інгібітор продукції і/або дію І -18 переважно клад у УМО 92/13095. застосовують одночасно, послідовно або розділь-

Отже, в переважному варіанті функціональне но з інтерфероном. похідне містить, принаймні, одну складову, приєд- У ще одному переважному варіанті відповідно нану до однієї або більше функціональних груп, які до даного винаходу інгібітор ІЇ-18 застосовують у зустрічаються як один або більше бічних ланцюгів поєднанні з антагоністом ТМЕ. Антагоністи ТМЕ на залишках амінокислот. | надають свою дію декількома шляхами. По-перше,

Варіант, в якому такою складовою є поліети- антагоністи можуть зв'язуватись або ізолювати ленгліколь (ПЕГ) найбільш переважний. саму молекулу ТМЕ з достатньою спорідненістю і

В іншому переважному варіанті даного вина- специфічністю для часткової або значною мірою ходу інгібітором ІЇ-18 є злитий білок, що містить повної нейтралізації епітопу ТМЕ або епітопів, від- цілий І--18 зв'язувальний білок або його частину, повідальних за зв'язування з рецептором ТМЕ (да- який з'єднаний з цілим імуноглобуліном або його лі названий «ізолюючим антагоністом»). Ізолюю- частиною. Методи одержання білків, злитих з іму- чим антагоністом може бути, наприклад антитіло, ноглобуліном, добре відомі в даній області техніки, направлене проти ТМЕ. деякі з них описані, наприклад у УМО 01/03737. Альтернативно, антагоністи ТМЕ можуть інгі-

Фахівець в даній області техніки зрозуміє, що зли- бувати шляхом передачі сигналу за участю ТМЕ, тий білок, який одержується відповідно до даного активований рецептором клітинної поверхні після винаходу, зберігає біологічну активність ІІ-188Р, зв'язування ТМЕ (далі названі «сигналізуючі анта- зокрема, відносно зв'язування з ІІ--18. Злиття може гоністи»). Обидві групи антагоністів є корисними, бути безпосереднім або через короткий лінкерний окремо або разом, з Інгібітором 1-18 для ліку- пептид, який може мати від 1 до З амінокислот в вання розладів, що є виявом гіперчутливості. довжину або більше, наприклад 13 залишків амі- Антагоністи ТМЕ можуть бути легко ідентифі- нокислот в довжину. Вказаний лінкер може бути, ковані і оцінені звичайним скринінгом кандидатів наприклад, трипептидом з послідовністю Е-Р-М за їх дією на активність природного ТМЕ відносно (Сіш-Рпе-Ме)у, або лінкером з послідовністю, з 13 чутливих ліній клітин іп міго, наприклад, В-клітин амінокислот, що включає сіІш-Рпе-сту-Ага-сту-і еи- людини, в яких ТМЕ викликає проліферацію і сек-

Ма1-Геш-спу-Ссту-СіІп-Рпе-Меї, введеним між послі- рецію імуноглобуліну. Дослідження включає ком- довністю ІІ/-18ВР і послідовністю імуноглобуліну. позицію ТМЕ при різній мірі розрідженості випро-

Одержаний злитий білок має поліпшені властивос- буваного антагоніста, наприклад від 0,1 до 100 ті, такі як збільшений час існування в рідких сере- разів від молярної кількості ТМЕ, що використову- довищах організму (період напіврозпаду), підви- ється в дослідженні, і контрольну композицію, що щену специфічну активність, підвищений рівень не містить ТМЕ або містить тільки антагоніст (Тиссі експресії, або поліпшується очищення злитого еї а!., 19921. білка. ше й Ізолюючі антагоністи є переважними антагоні-

У переважному варіанті П.-188Р з'єднаний з стами ТМЕ, що застосовуються відповідно до да- константною ділянкою молекули Ід. Переважно, ного винаходу. Серед ізолюючих антагоністів пе- він з'єднаний з ділянками важких ланцюгів, напри- реважні ті поліпептиди, які зв'язують ТМЕ з клад, такими як домени СН2 або СНЗ людського високою спорідненістю і володіють низькою імуно-

Ід, наприклад. Створення специфічних злитих генністю. Розчинні молекули рецептора ТМЕ і ней- білків, що містять ІІ-188ВР і частину імуноглобулі- тралізуючі антитіла до ТМЕ особливо переважні.

Наприклад, розчинні ТМЕ-КІ ії ТМЕ-КІЇ застосову- Інгібітор І--18 відповідно до даного винаходу ються відповідно до даного винаходу. Зрізані фо- переважно вводять місцево, тобто, локально. При рми цих рецепторів, які містять позаклітинні доме- контактному дерматиті, наприклад інгібітор 1-18 ни рецепторів або їх функціональні частини, є можна вводити безпосередньо в пошкоджену ді- особливо переважними антагоністами відповідно лянку шкіри. до даного винаходу. Зрізані розчинні рецептори В іншому варіанті даного винаходу інгібітор 1І--

ТМР тип-! і тип-ІІ описані, наприклад у ЕРО14431. 18 вводять системно, переважно підшкірно або

Зрізані форми рецепторів ТМР є розчинними і внутрішньом'язово. були виявлені в сечі і сироватці як білки з М.м Даний винахід, крім того, відноситься до за-

ЗокДа і 40кДа, що зв'язують та інгібують ТМЕ, які стосування вектора експресії, що включає кодуючу називають ТВРІ їі ТВРІЇ, відповідно (ЕпдеІтапп еї послідовність інгібітору 1-18, при одержанні лікар- аІ., 1990). Одночасне, послідовне або роздільне ського засобу для профілактики і/або лікування застосування інгібітору І/-18 з антагоністом ТМЕ розладів у вигляді гіперчутливості. Таким чином, іабо інтерфероном є переважним відповідно до передбачається підхід з використанням генної даного винаходу. терапії для доставки інгібітору 1-18 в сайт, в якому

Відповідно до даного винаходу ТВРІ і ТВРІЇ є він потрібний. Для лікування і/або профілактики переважними антагоністами ТМЕ для застосування розладу у вигляді гіперчутливості, вектор генної в поєднанні з інгібітором 1-18. Похідні, фрагменти, терапії, що містить послідовність інгібітору продук- ділянки і біологічно активні частини молекул реце- ції і/або дії 1-18, може бути ін'єктований безпосе- птора, функціонально схожі на молекули рецепто- редньо в уражену тканину, наприклад, дозволяючи рів, також можуть застосовуватись відповідно до таким чином уникнути проблем, виникаючих при даного винаходу. Такі біологічно активні еквівале- системному введенні векторів генної терапії, таких нти або похідні молекули рецептора відносяться як розбавлення векторів, досягнення або уражен- до частини поліпептиду, або послідовності, що ня клітин-мішеней або тканин-мішеней і побічних кодує молекулу рецептора, які мають достатній ефектів. розмір і здатні зв'язувати ТМЕ з такою спорідненіс- Застосування вектора для інфікування і/або тю, що взаємодія з пов'язаним з мембраною реце- збільшення ендогенної продукції інгібітору 1-18 в птором ТМЕ інгібується або блокується. клітині, звичайно не активної відносно експресії

В іншому переважному варіанті людський роз- інгібітору І--18, або яка експресує недостатню кі- чинний ТМЕ-РКІ (ТВРІ) являє собою антагоніст ТМЕ, лькість інгібіторів, також передбачене даним вина- що застосовується відповідно до даного винаходу. ходом. Вектор може містити регуляторні послідов-

Природні і рекомбінантні розчинні молекули ТМЕ- ності, що функціонують у клітинах, в яких потрібно рецептора і способи їх одержання описані в євро- експресувати інгібітор І/-18. Такі регуляторні пос- пейських патентах ЕР 308378, ЕР 398327 і ЕР лідовності можуть бути, наприклад, промоторами 433900. або енхансерами. Регуляторна послідовність може

Інгібітор І--18 може застосовуватись одночас- бути потім введена в правильний локус геному но, послідовно або роздільно з інгібітором ТМЕ. шляхом гомологічної рекомбінації, таким чином

В іншому переважному варіанті даного вина- регуляторна послідовність функціонально зв'язу- ходу лікарський засіб додатково містить протиза- ється з геном, експресію якого потрібно інфікувати пальний агент, такий як М5АЇ!Ю (не стероїдний про- або посилити. Технологію звичайно називають тизапальний лікарський засіб) У переважному «Ендогенна активація гена» (ЕБА), і вона описана, варіанті СОХ-інгібітор, і найбільш переважно, наприклад у УМО 91/09955.

СОХ-2 інгібітор, застосовують у поєднанні з інгібі- Фахівцеві в даній області техніки повинно бути тором 1-18. СОХ-інгібітори відомі в даній області зрозуміло, що також можливо зупинити експресію техніки. Визначені СОХ-2 інгібітори, наприклад, І--18 безпосередньо, не застосовуючи інгібітор 1І-- описані в МУМО 01/00229. Активні компоненти мо- 18, тим же методом. Для цього негативний регуля- жуть застосовуватись одночасно, послідовно або торний елемент, такий як, наприклад, елемент, роздільно. який викликає мовчання, можна вбудувати в локус

Реакції гіперчутливості часто лікують протиа- гена І--18, що приведе до зниження або припи- лергічними лікарськими засобами, такими як анти- нення експресії ІЇ/-18. Фахівець в даній області гістамінні препарати, кромолін, глюкокортикоїди техніки розуміє, що таке зниження регуляції або або симпатоміметики. Тому даний винахід також припинення експресії ІІЇ-18 має той же ефект, що і відноситься до комбінаторної терапії, що включає застосування інгібітору 1-18 для профілактики інгібітор 1-18 і протиалергічний засіб. Застосуван- і/або лікування захворювання. ня антигістаміну і/або кромоліну, і/або глюкокорти- Даний винахід також відноситься до застосу- коїду, і/або симпатоміметичного засобу при роз- вання клітини, яка була генетично модифікована з дільному, послідовному або одночасному метою продукції інгібітору І--18, для виробництва застосуванні з інгібітором 1-18 є переважним від- лікарського засобу для лікування і/або профілакти- повідно до даного винаходу. ки розладів у вигляді гіперчутливості.

У наступному переважному варіанті даного Даний винахід також відноситься до фармаце- винаходу інгібітор І/-13 застосовують в кількості втичних композицій, особливо корисних для про- від близько 0,0001 до 100Омг/кг ваги тіла, або від філактики і/або лікування розладів у вигляді гіпер- близько 0,001 до 100мг/кг ваги тіла, або від близь- чутливості, які включають терапевтично ко 0,01 до 10мг/кг ваги тіла, або від близько 0,1 до ефективну кількість інгібітору І--18 і/або терапев- 5мг/кг ваги тіла, або від близько 1 до Змг/кг ваги тично ефективну кількість інтерферону, і/або тера- тіла. певтично ефективну кількість інгібітору ТМЕ, і/або фармацевтично ефективну кількість протизапаль- методами. Біодоступність активного білкак(ів) від- ного агента, і/(або фармацевтично ефективну кіль- повідно до даного винаходу також може бути по- кість протиалергічного агента, зокрема, антигіста- ліпшена методиками кон'югування, які збільшують міну. період напіврозпаду молекули в тілі людини, на-

Як інгібітор І--18 композиція може містити інгі- приклад, зв'язуванням молекули з поліетиленглі- бітори 1-каспази, антитіла до 1-18, антитіла до колем, як описано в заявці на патент РСТ УМО будь-якої субодиниці рецептора 1-18, інгібітори 92/13095. шляхом передачі сигналу за участю 1-18, антаго- Терапевтично ефективні кількості активного ністи І--18, які конкурують з 1І--18 і блокують реце- білка(ів) є похідними від множини параметрів, птор 1-18, і зв'язувальні 1-18 білки, їх ізоформи, включаючи тип антагоніста, спорідненість антаго- мутеїни, злиті білки, функціональні похідні, активні ніста з 1-18, будь-яку залишкову цитотоксичну фракції або похідні циркулярної перестановки, що активність, виявлену антагоністом, спосіб введен- мають ту ж активність. ня, клінічний стан пацієнта (включаючи бажаність

І/-188Р ії його ізоформи, мутеїни, злиті білки, досягнення нетоксичного рівня активності ендо- функціональні похідні, активні фракції або похідні генного 1-18). циркулярної перестановки, такі як описані вище, є «Терапевтично ефективною кількістю» є така переважними активними інгредієнтами фармацев- кількість, при введенні якої інгібітору І--18 приво- тичної композиції. дить до інгібування біологічної активності 1--18.

Інтерферон, що міститься у фармацевтичній Доза, що вводиться пацієнту у вигляді одиничної композиції, переважно є ІЄМ-р. або множинної дози, може варіювати в залежності

У ще одному переважному варіанті фармаце- від множини факторів, включаючи фармакокінети- втична композиція включає терапевтично ефекти- чні властивості інгібітору І--18, спосіб введення, вну кількість інгібітору ТМЕ альфа. Фармацевтична стан і характеристики пацієнта (стать, вік, вага композиція відповідно до даного винаходу також тіла, стан здоров'я, зріст), тяжкість симптомів, су- може включати один або більше СОХ-інгібіторів. путнє лікування, частота лікування і бажаний

Визначення «фармацевтично прийнятний» ефект. Коректування і зміна вказаних доз, а також охоплює будь-які носії, які не впливають на ефек- іп мімо і іп міго методи визначення інгібування 1-18 тивність біологічної активності активного інгредієн- у пацієнта знаходиться в компетенції фахівця в та і не є токсичними для пацієнта, якому їх вво- даній області техніки. дять. Наприклад, при парентеральному введенні Відповідно до даного винаходу інгібітор 11-18 активний білок(ки) може бути складений у формі застосовують в кількості від близько 0,001 до одиниці дозування для ін'єкцій в носіях, таких як 1бомг/кг або від близько 0,01 до 10мг/кг ваги тіла, фізіологічний розчин, розчин декстрози, альбумін або від близько 0,1 до 5мг/кг ваги тіла, або від сироватки і розчин Рінгера. близько 1 до Змг/кг ваги тіла або близько 2мг/кг

Активні інгредієнти фармацевтичних компози- ваги тіла. цій відповідно до даного винаходу можуть вводи- Способом введення, який є переважним від- тись індивідууму множиною способів. Способи повідно до даного винаходу, є введення підшкірно. введення включають внутрішньошкірний, че- Також відповідно до даного винаходу переважним резшкірний (наприклад препаративні форми з по- є внутрішньом'язове введення. Для введення інгі- вільним вивільненням), внутрішньом'язовий, внут- бітору І--18 безпосередньо в місце його дії також рішньоочеревинний, внутрішньовенний, переважно вводити його місцево. підшкірний, пероральний, інтракраніальний, епіду- У ще одному переважному варіанті інгібітор ІІ-- ральний, місцевий, ректальний та інтраназальний 18 вводять щодня або через день. способи. Можуть застосовуватись будь-які інші Щоденні дози звичайно застосовують у вигляді терапевтично ефективні способи введення, напри- розділених доз або у формах з уповільненим виві- клад, абсорбція через епітеліальні або ендотеліа- льненням, ефективних для досягнення бажаних льні тканини, або шлях генної терапії, де молекулу результатів. Друге і подальше введення можуть

ДНК, що кодує активний агент, вводять пацієнту проводитись в дозі, яка є такою ж, менше або бі- (наприклад через вектор), що викликає експресію і льше вихідної або попередньої дози, що вводить- секрецію активного агента іп мімо. Крім того, бі- ся пацієнту. Друге або подальше введення може лок(ки) відповідно до даного винаходу можна вво- здійснюватись під час або до розвитку захворю- дити разом з іншими компонентами біологічно ак- вання. тивних агентів, такими як фармацевтично Відповідно до даного винаходу інгібітор 1-18 прийнятні поверхово-активні речовини, наповню- можна вводити індивідууму профілактично або вачі, носії, розріджувачі і розчинники. терапевтично до, одночасно або послідовно з ін-

Для парентерального (наприклад, внутрішньо- шими терапевтичними заходами або агентами венного, підшкірного, внутрішньом'язового) вве- (наприклад прийом декількох лікарських засобів), у дення активний білок(ки) можуть бути представле- терапевтично ефективній кількості, зокрема, з ін- ні у вигляді розчину, суспензії, емульсії або терфероном і/або інгібітором ТМЕ і/або іншим про- ліофілізованого порошку у поєднанні з фармацев- тизапальним агентом, таким як інгібітор СОХ, і/або тично прийнятним носієм для парентерального антиалергічним агентом. Активні інгредієнти, які введення (наприклад, водою, фізіологічним розчи- вводять одночасно з іншими терапевтичними за- ном, розчином декстрози) і домішками, які підтри- собами, можуть вводитись в одній або в різних мують ізотонічність (наприклад маніт) або хімічну композиціях. стабільність (наприклад, консерванти і буфери). Даний винахід також відноситься до способу

Препаративну форму стерилізують звичайними одержання фармацевтичної композиції, що містить суміш ефективної кількості інгібітору 1-18 і/або індукованої контактної гіперчутливості (КГЧ). Міру інтерферону, і/або антагоніста ТМЕ, і/або інгібітору КГЧ вимірюють за набряканням вуха у відповідь на

СОХ з фармацевтично прийнятним носієм. сенсибілізатор, що наноситься місцево.

Даний винахід, крім того, відноситься до спо- Тест на набрякання вуха миші, який викорис- собу лікування розладів, що є виявом гіперчутли- тали для одержання даних, представлених на вості, який включає введення фармацевтично Фіг.1-3 (див. нижче), детально описаний (Сагтгідне ефективної кількості інгібітору І--18 пацієнту, що еї а!., 19941. Коротко, мишей сенсибілізували нане- потребує цього. сенням локально 25мкл 0,595 розчину 2,4-

Виходячи з представленого вище повного динітрофторбензолу ІДНФБ; бідта Спетісаї! Со | в опису, фахівцеві в даній області техніки буде зро- ацетоні/оливковій олії (4:1) на поголений живіт (0 зуміло, що те ж саме може бути здійснено в широ- день). Через п'ять днів 20мкл 0,295 ДНФБ в тому ж кому спектрі еквівалентних параметрів, концент- носії наносили на праві вуха і тільки носій на ліві рацій і умов, не виходячи за рамки даного вуха. винаходу, і без надмірного експериментування. Миші одержували щодня, в 5-8 дні,

Хоча даний винахід описаний в поєднанні з 250мкг/миша/день гПпІЇ-18ВР. (рекомбінантного ІІ-- конкретними варіантами здійснення, повинно бути 18ВР. людини або фізіологічний розчин в контро- зрозуміло, що можливі подальші модифікації. Дана льній групі внутрішньоочеревинно (в.о.) (Фіг1А) заявка охоплює будь-які варіанти, застосування або вони одержували 1І--188ВР в дні 0-2 (Фіг.1В). або адаптацію даного винаходу, які дотримуються Товщину вуха вимірювали подвійним товщи- загалом, принципів винаходу і включають такі від- номіром (Мішоуо Согр., Каулазакі, Уарапі, і набря- хилення від даного опису, які відомі або звичайно кання вуха оцінювали відніманням значення до використовуються в області техніки, до якої відно- контакту зі значення після контакту, і подальшим ситься даний винахід, і можуть бути віднесені до відніманням будь-якого значення набрякання, ви- представлених раніше в даному описі суттєвих значеного для обробленого носієм протилежного ознак, визначених у формулі винаходу. вуха.

Всі представлені тут посилання, включаючи Набрякання вуха вимірювали на 0, 5, 6, 7, 8, 9, журнальні статті або абстракти, опубліковані або 12, 14, 16 дні. неопубліковані патенти США або зарубіжні патен- Іншу модель використали для одержання да- тні заявки, видані патенти США або інших країн них, представлених на Ффіг.4-6, див. приклади ниж- або будь-які інші посилання повністю включені в че. І--18-зв'язувальний білок (І--18ВР) застосову- даний опис у вигляді посилань, включаючи всі да- вали для нейтралізації 0-18 під час ні, таблиці, фігури і текст, представлені у вказаних експериментально індукованої контактної гіперчу- посиланнях. Крім того, повний зміст посилальних тливості (КГУ) нанесенням 2,А- документів, вказаних у посилальних документах, динітрофторбензолу (ДНФБ). Умови експерименту що наводяться в даному описі, також повністю були наступні: включені як посилання. 1. 0 день: сенсибілізація

Посилання на стадії відомих методів, стадії 25мкл ДНФБ (0,595 в ацетоні/оливковій олії звичайних методів, відомі методи або звичайні (4/1) як носій) на поголену спину методи не є допущенням того, що будь-який ас- 2. 5 день: контакт пект, опис або варіант втілення даного винаходу 5мкл ДНФБ (0,295) на кожну зовнішню і внут- описаний, розкритий або запропонований у відпо- рішню частину правого вуха 5мкл носія на кожну відній області техніки. дорзальну і вентральну частину лівого вуха

Представлений вище опис конкретних варіан- 3. 6 день: зчитування тів так розкриває загальну суть даного винаходу, Перевірка товщини вуха як ознаки запалення що інші, застосовуючи спеціальні знання в області Значення виражені як збільшення набрякання техніки (включаючи зміст вказаних в даному описі (мкм) підданого впливу вуха до контрольного вуха посилальних документів), легко можуть модифіку- 4. 6 і 7 дні: обробка величин товщини вух для вати і/або адаптувати для різних областей засто- аналізу сування такі конкретні варіанти втілення без над- В цій моделі піки набрякання припадають між мірного експериментування, не виходячи |Ііз 6 і 7 вдень. 1-18 нейтралізували щоденними ін'єк- загальної концепції даного винаходу. Тому такі ціями 250мкг І--18ВР (у фізіологічному розчині) на адаптації і модифікації маються на увазі як еквіва- тварину, або під час сенсибілізації в 0,1 їі 2 дні, ленти описаних варіантів втілення, основані на або під час контакту в 4, 5 і 6 дні. описі та інструкціях, представлених вище. Повинно Реакцією при контактній гіперчутливості (КГЧ) бути зрозуміло, що фразеологія або термінологія є гаптенспецифічні запалення шкіри, опосередко- застосовується тільки в описових цілях і не обме- вані Т-клітинами. Більшість гаптенів індукують олі- жує даний винахід, таким чином фразеологія або гоклональні Т-клітинною відповіддю, що включа- термінологія даного опису повинна бути інтерпре- ють в основному ефекторні Т-клітини СО8»У, в той тована фахівцями в даній області техніки в світлі час як Т-клітини СО4"регулюють реакцію КГЧ у описів та інструкцій даного винаходу, разом зі формі її зниження (|Воитг, Н., еї аї, 1995; сгарре еї знаннями фахівця в даній області техніки. а!., 1998). Для дослідження ролі 1-18 в КГЧ мишей

Приклади сенсибілізували нанесенням на шкіру ДНФБ, а

Приклад 1: Обробка ІІ -18ВР знижує контактну потім піддавали повторному контакту через 5 днів гіперчутливість нанесенням гаптену на шкіру вуха. При повторно-

У всіх представлених нижче прикладах вико- му нанесенні гаптену мишам вводили в.о. ристовувалась мишача модель експериментально 250мкг/миша/день гпІ--138Р або фізіологічний розчин. І--18ВР або фізіологічний розчин як конт- який проник з судин і акумулювався в навколишніх роль вводили щодня протягом З днів, на 5-8 дні тканинах. Проникність судин оцінювали як кількість після першої сенсибілізації ДНФБ (0 день). Повто- барвника на мг висушеної тканині вуха, скоригова- рний контакт з ДНФБ на 5 день спричиняв значне ну на концентрацію Емапз5 Віце в сироватці, і вира- набрякання вуха в обох групах (Фіг.1А). Міра на- жали у вигляді відношення піддане впли- брякання у мишей, оброблених фізіологічним роз- ву/контрольне вухо. Хоча лікування І-1988;, ва4ї5 чином (трикутники), була набагато більш вираже- день знижувало набрякання до 5695 від контроль- ною, ніж у мишей, лікованих І--18ВР (квадрати), ної групи, яка одержує носій, (Фіг.4, ліва частина, причому вухо поверталось до практично нормаль- ре0,01) не відмічалась значна різниця у проникно- ного стану вже на 9 день. сті судин в обох групах (Фіг.4, права частина).

Зміна набрякання вуха, що спостерігається Обидві групи показали значно збільшений набряк при лікуванні І--188ВР, в дні 0-2, була статистично у порівнянні з несенсибілізованою контрольною незначущою (Фіг.18). Час введення ІІ -188ВР, ма- групою (р«е0,05 і р«е0,01). Для подальшого контро- буть, є важливим фактором для досягнення спри- лю мишей обробляли 250мкг нерелевантного біл- ятливої дії при лікуванні І--188Р. ка БСА на одну тварину на день. У цих мишей КГЧ

В даній моделі контактної гіперчутливос- розвивалась так само, як і у оброблених носієм ті/контактного дерматиту на основі мишей триден- контрольних тварин (п-10 мишей в групі). не лікування інгібітором І/-188Р. давало значний Іп мімо дослідження проникності судин (Емап5 сприятливий ефект на міру набрякання/запалення, Віпє) викликаного обробкою гаптеном. принцип: ін'єкція (в.в.) Емап5 Віце і екстракція з

Приклад 2. Лікування 1І--188Р знижує контакт- тканини-мішені (вухо) ну гіперчутливість після вторинного впливу Дані для оцінки:

Мишей С57ВІ/6 сенсибілізували нанесенням Стандартна крива Емапо Вісе (ОЩего(/нг) на шкіру поголеного живота 25мкл 0,595 розчину Концентрація Емап5 Вісе в крові (ОЩего(/мл

ДНФБ (0 день). Мишей піддавали першому впливу або мкг/мл, відповідно) 20мкл 0,295 ДНФБ на вуха на 5 день. На 19 день Вага висушеної тканини вуха (іпсилатерально- мишей піддавали другому впливу ДНФБ. Набря- го і протилежного, мг) кання вуха вимірювали в 0 день (сенсибілізація Вміст Емап5 Віце у вухах (іпсилатерального і гаптеном), 5 день перший вплив, 6, 7, 8, 9, 12, 14, протилежного, ОЩего/мкг або нг/мг, відповідно) 16, 19 дні (другий вплив), 20, 21, 22, 23, 26, 2814 30 Протокол в поєднанні з індукованою ДНФБ дні. Середні значення з середньоквадратичними КГчЧ відхиленнями для кожної групи представлені на на 5 день експериментально індукованої КГЧ

Фіг2. Мишей обробляли щодня 250мкг/миша/день вводять 100мкл Емапз5 Віпеє |: 7,5мг/мл Емапз5 Віце

І/-18ВР в.о. (п-5; Фіг2 незафарбовані квадрати) (52129) у фізіологічному Масі, 10Омкл, в.в.| в.в. або фізіологічним розчином (п-:5; Фіг.2, зафарбо- ретроорбітально за 2 години до контакту миші з вані квадрати) в дні з 19 до 23. ДНФБ

Як показано на Фіг.2, лікування І--18ВР значно вводять 1І-188ВР в.о. за 1 годину до контакту знижувало набрякання вуха, особливо після вто- на 6 день (24 години після контакту вуха з ринного впливу гаптеном. ДНФБ) вимірюють набрякання і умертвляють тва-

Тому терапія з використанням І/-18ВР особ- рин ливо підходить для терапії розладів у вигляді гіпе- беруть зразки крові і обробляють таким чином рчутливості, при яких пацієнти звичайно повторно додають ЗОмкл сироватки до 97О0мкл фор- зазнають впливу одного і того ж алергену і потре- маміду (-1/33 розбавлення) бують лікування для того, щоб подолати запальні визначають ОЩ при 620нм (-51 ОЩего дорів- реакції, викликані впливом. нює 33 ОЩего/мл)

Приклад 3: І--18ВР захищає від КГЧ за допо- збирають іпсилатеральні і протилежні вуха і могою нейтралізації 1--18 обробляють таким чином:

Для того, щоб пересвідчитись, що захист від сушать 24 години при 802С набрякання досягається при терапії І/-18ВР за- визначають суху вагу вдяки нейтралізації 11-18, мишей дикого типу подрібнюють і екстрагують барвник за допомо-

С57ВІ//6 і мишей, у яких відсутній 1І--18, порівню- гою їмл формаміду, обережно струшуючи протя- вали за їх здатністю давати відповідь у вигляді гом 24 годин при 552

КГУЧ. Миші з відсутністю 1-18 розвивали КГЧ у від- фільтрують для видалення залишків? |? фільтр повідь на ДНФБ, хоча менш помітну, ніж у мишей для зразка-препарату УУпаїйтап 5мкм РТЕЕ міш,, дикого типу. Однак у мишей з відсутністю 1-18 Ме6984.0350 ефекту від лікування І--188Р відмічено не було, як ! Збалансований сольовий розчин Хенкса без показано на Фіг.3, що вказує на те, що протизапа- Са?» і Мд2- (СІВСО Ме14170.070) льна дія І--188Р. при КГЧ досягається за рахунок 22,595 трипсин/ЕДТК (105) (СІВСО Ме35400-

І/-18 (п-5 мишей на групу). 027)

Приклад 4: І/-188Р не знижує проникності су- 3196 Бичачий сироватковий альбумін у фізіоло- дин | Й гічному розчині з фосфатним буферої, наповню-

КГЧ індукували у мишей С57ВІ/6 як описано ють кювети, осаджують при кімнатній температурі вище. Для моніторингу набряку, викликаного реак- протягом декількох годин, щоб дозволити жирам цією КГЧ, вводили Емап5 Віце в.в. за 2 години до сплисти вгору контакту з ДНФБ. Мишей умертвляли через 24 визначають ОЩ при 620нм години, і вуха обробляли для виділення барвника, Значення, що розраховуються змепісні ваті АНЯ ВНІ В УНВОНеЙ я чі кінцевої концентрації це ; жан пет попа А т тт пп патчі Кн - інкубують протягом 35хв. при температурі піюннкнених у вупеврАнця вне не в сухої змо - з"

Вішпосне цронекнечня в 7. переносять половинки вух дермою вниз на зивинех: -у ни но нини нейлонове сито (сито для клітин), вміщене в 10мл й ССРХ/ВО9о ЕС5 на льоду, і обережно перемішують

Результати: для виймання клітин з позаклітинної матриці

В основному в набрякання під час КГУ за- 8. видаляють сита з великими залишками лучені два процеси: проникнення рідини з судинної 9. двічі промивають холодним ССРХ/1095 ЕС5 мережі в навколишні тканини, що приводить до 10. рахують клітини Аналіз ГЕАС5 набряку, І транссудація запальних клітин з крово- 1. повторно суспендують клітини в забарвлю- носних судин в місце пошкодження тканини. ючому буферіз для ЕАС5, всі подальші стадії про-

Застосування Емап5 Віце як індикатора пока- водять на льоду зало, що незважаючи на загальне зниження на- 2. використовують 102 клітин на фарбування брякання, лікування ІІ -18ВР не знижує проникності 3. додають 1мкг ЕС-Віоск, 10хв. судин (Фіг.4). 4. додають антитіла СО45 в поєднанні з анти-

Приклад 5: лікування ІІ--18ВР знижує запальну тілами, направленими проти цікавлячих маркерів, інфільтрацію і утворення ІЄМу в підданому впливу 1мкг кожного, ЗОхв.

ДНФБ вусі 5. двічі промивають

КГЧ індукували у мишей С57ВІ/6 як описано 6. збирають в загальному 0,5х109 випадків за вище. Тварин обробляли ІІ -18ВР або носієм в 4-6 допомогою ЕАС5 дні. Лікування ІІ-188Р знижувало набрякання до 7. аналізують специфічні маркери після відсі- 5890 від контрольної групи на 7 день. Мишей умер- кання живих клітин СО45-., Результати: твляли на 7 день, піддані впливу вуха збирали, Для дослідження запальної інфільтрації в місці розділяли на групи (п-8) і піддавали ферментати- контакту одержували суспензії окремих клітин з не вному розщепленню з одержанням суспензії відді- підданих і підданих впливу вух і аналізували за лених клітин. Клітини характеризували аналізом допомогою ЕАС5Б, відтинаючи живі клітини СО45--

ЕАС5, що відтинає СБ4А5-позитивні живі клітини. (Фіг.5). Як показано, СО45-- клітини, присутні в не

Кількість оВтТ-клітин, МК-клітин, нейтрофілів і мо- підданих впливу вухах, є в основному убт- ноцитів/макрофагів, виявлених в препараті вуха, клітинами і дентритними клітинами шкіри. Запаль- виражали в процентному відношенні до загальної ний інфільтрат через 24 години після впливу скла- кількості клітин, що аналізуються. Також розрахо- дався з Т-клітин СОВ8 і СО4, нейтрофілів, моноци- вували зниження кількості вказаних типів клітин тів і МК-клітин, збільшуючи загальний рівень клітин після лікування І--188ВР по відношенню до контро- СО45-- у вусі приблизно в два рази. Відповідно до лю з носіІЄМ. зниження набрякання, обробка ІІ -18ВР. знижувала

Для вимірювання продукції ІЄМу, клітини, оде- загальну кількість лейкоцитів, які інфільтрують ржані з підданих впливу ДНФБ вух, повторно сти- місце контакту. Це впливало на всі різні типи клі- мулювали при 2х107 на комірку планшета з пов'я- тин запального інфільтрату. Зниження складало заними на ньому анти-СОЗ антитілами. Протягом від 2095 до 4095 в залежності від типу клітини. подальших 24 годин культивування І/-188Р не Дослідження подальших характеристик влас- додавали. Продукцію ІРМу вимірювали в трьох тивостей інфільтрату, одержаного з вух лікованих повторах за допомогою ЕЇ ІЗА. І-18В8Р. мишей, показувало погіршену продукцію

Препарати клітин з підданих впливу ДНФБ вух ІМЕуУ при повторній стимуляції анти-СОЗ (Ффіг.б). стимулювали 5Онг/мл РМА" і 500Онг/мл лономіцину Аналіз ГАС показував, що ІЕМу в основному протягом 4 годин. Секрецію цитокіну блокували утворюється Т-клітинами СО8 і в меншій мірі Т- додаванням мкг/мл брефелдину А протягом клітинами СО. Цікаво, що убТ-клітини і МК-клітини останніх 2 годин інкубування. Потім клітини підда- не залучені до продукції ІЄМу (Фіг.7) вали багатоколірному імунофлуоресцентному фа- Приклад 6: І-18ВР не ослабляє рекрутименту рбуванню на предмет внутрішньоклітинного ІРМУ і клітин Лангерганса поверхневих антигенів. ІРМу вироблявся Т- Метод: клітинами СОЗ8 і, в меншій мірі, Т-клітинами СО4. У Мишей забарвлювали шляхом нанесення гап-

МК-клітинах і убТ-клітинах ІРМу виявлений не був. тенів РІТС (50мкл 4мг/мл розчини) або носія аце- (н.в, не виявлено; " Форбол 12-Міристат 13- тон/дибутилфталат (1:1) на правий і лівий боки,

Ацетатї). відповідно. Пахові лімфатичні вузли збирали че-

Одержання суспензії окремих клітин рез 24 години після фарбування. Кон'юговані з

Ферментативне розщеплення мишачих вух з гаптеном клітини Лангерганса визначаються за одержанням суспензії окремих клітин основане на допомогою РГАС5 як клітини РІТСя, СО11с в лім- протоколах з (Зспинег, б апа 5іеіптап, К.М. (1985) фатичному вузлі, дренуючому забарвлений РІТС і ейіпаї еї а!ї., (1983). бік але не визначаються в лімфатичному вузлі, 1. відрізають вуха, розділяють по 5 вух на пре- дренуючому протилежний бік, забарвлений тільки парат носієм, (п-5 дренуючих лімфатичних вузлів на 2. промивають 7095 етанолом групу). 3. розділяють за допомогою пінцета Результати: 4. вміщують дермою вниз на 7,5мл ССРХ! при Міграція клітин Лангерганса (ІС), що несуть температурі 377 антиген, в дренуючий лімфатичний вузол зале- 5. додають 5мл 2,595 трипсину? (10х) з одер- жить від прозапальних цитокінів І--18 і ТМЕо; і ре-

гулюється каспазою-1 |(Апіопороціо5 еї аї., 2001; вепзйігайоп іп тісе. У Іттипої! 166:3672-3677.

Кітрег еї аїЇ., 1992|Ї. Отже, І/-18, як вважають, З. Воиг, Н., еї аі. 1995. Ма)ог півіосотрайрішу сприяє пересуванню І С |Ситреграїси еї аї., 20011. сотріех сіазв 1-гезійсієй СО5--Т сеї апа сіазв 11-

Тому лікування ІІ-18ВР могло б ослабити рекрут- гезійісієй СО4-1 сеї, гезресіїмеІу, теадіасе апа ний Г.С і, отже, ослабити імунну відповідь на ОМЕВ гедшіакге сопіасі зепейіїмйу о аіпіоПИогорепгепе. під час фази впливу. Для перевірки цієї гіпотези Еиг. 9. Іттипої. 25:3006-3010. мишей забарвлюють шляхом нанесення гаптену 4. Спаїег, К.Р. еї аї., іп "Біхій Іпіегпайопаї!

РІТС або носія на правий і лівий бік, відповідно. Зутровійт оп Асііпотусеїа|евз Віоіоду", Акадетіаї

Дренуючи шкіру пахові лімфатичні вузли збирали Каїдо, Видарезі, Нипдагу (1986), рр.45-54). через 24 години після фарбування, і оцінювали 5. Сопії, В., У.МУ. данпа, С. Тіпії, У.Н. оп, апа кількість клітин РІТС-- на лімфатичний вузол. Ліку- Т.Н. щуор. 1997. Іпдисбйоп ої іпепегоп-датта вання тварин І--18ВР за 24 години і 1 годину до іпдисіпд Тасіог іп (пе айдгепаї! сопех. 9. ВіоЇ. Спет. фарбування не змінювало кількість (С), що не- 272:2035-2037. суть гаптен ІС, присутніх в дренуючому лімфатич- б. Ситбреграїст, М., А.). Оєаптап, б. ному вузлі через 24 години після фарбування Апіопороціоз, Н.МУ. (згоме5, апа І. Кітрег. 2001. (Фіг.8). Тому в даній моделі немає значного внеску Іпсепешкіп (1.)-18 іпдисез Іапдегнапв сеї! тідгайоп

І/-18 в пересуванні І.С. ру а штоишг песгозіз Тасіог-аїрна- апа 1/-1 рейа-

Приклад 7: І--18ВР знижує тривалість гіперчу- дерепаепі теспапізт. Іттироіоду 102:323-330. тливості уповільненого типу в іншій мишачій мо- 7. Оемегеих у). еї аї., Мисіеєїс. Асійв5. Вев., делі ОНТ 12,387-395,1984.

Методи 8. Оібопай, 9. А., НауаКажа, М., Роїмагїї,

Гіперчутливість уповільненого типу О.М., 7апаї), Б. апа Каїїп, М. (1997), Машге

Мишей сенсибілізували внутрішньовенною ін'- 388,16514-16517. єкцією 1059 ВАЇ В/с-спленоцитів і піддавали повтор- 9. ЕІШоїй, М.., Маїпі, А.М., Реідтапп, М., Гопд- ному впливу на 5 день 13х106 ВАЇВ/с- Еох, А., Спапез, Р., ВІ)І, Н., апа УУосау, .).М., 1994, спленоцитами (5ХОмкл ФРФБ) в праві подушечки Ї апсеї 344, 1125-1127. лап. У контрольні ліві подушечки лап вводили 10. ЕпдеІтапп, Н., О. Моміск, апа 0. УМаїїасн. 5О0мкл ФСБ. Набрякання правої подушечки лапи 1990. Тим їштог песговів Тасіог-біпаіїпо ргоїеїп5 розраховують для різних днів відніманням значен- риййва їйот Питап шпіпе. Емідепсе г ня перед впливом і значення набрякання, виміря- іттипоіодіса! сгов5-геасіїмну мій сеї! звибїасе штог ного в лівих подушечках лап, зі значення після песговів Гасіог гесеріог5. У. Віої. Спет. 265:1531- впливу. 1536.

В експериментах адаптивного перенесення 11. Сапідце 9. Ї., Місоїаз 9. Р., Егадіпаїв В., суспензію клітин з лімфатичних вузлів сенсибілізо- Вепелта С, Вошг Н., 5сптій О. Сопіасі ЮОегташів ваних спленоцитів або не оброблених мишей 1994 Арг.; 30(4):231-7

ВАЇВ/сС піддавали виснаженню відносно клітин 12. Сагарре, 5., апа бспулагл, ТТ. 1998. в220: і 608: інкубуванням з щурячим антимиша- Іттипогедшіаюгу теспапізтв іпмоїмей іп еїсйакноп чим В220-РІТС і СО8-РІТО з подальшим розділен- ог аПегдіс сопіасі Нурегзепзйїміу. Іттипої. Тодау. ням на колонках МАС5 з парамагнітними анти- 19:37-44

РІТС мікрошариками |(Мійепуії Віоїесп, Аєцбрипт, 13. Нари еї аї., 9У. Іттипої. 2001,166: 5439-

Саїїогпіа, США). Елюйовані препарати, збагачені 5347.

Т-клітинами СО4", вводять в хвостову вену реци- 14. Напіїт еї аї. (1993). 9. Ат. Асад. Оептай)і. пієнтної миші (2х10 клітин/миша). Через 16 годин 28:189. мишам вводять 13х105 ВАЇВ/с-спленоцитів (без 15. Кіт 5. Н., Еїбепвієїп М., Вегпіком Ї., еритроцитів) в праві подушечки лап, і набрякання Рапшалі с., Моміск О., Вибіпвієїп М., Оіпагеїюо С. А. відстежують всі подальші дні. Результат Зігисішга! гедицігетепіє ої віх пайгайу оссигтіпд

Гіперчутливість уповільненого типу (ОНТ) ви- івоїогтв ої (Пе 1-18 Бріпаїпу ргоїеїп 0 іппіріє П -18. кликається Т-клітинами СО4- з очевидним регулю- Ргос. Маї! Асад. сі ОБА 2000:97:1190-1195. ванням у формі зниження Т-клітинами СО87 16. Кітрег, І. апа М. Ситрегбраїсн. 1992.

Ісгарре еї аї., 1998). Поведінка Т-клітин СО4» від Зійтшайоп ої Іапдегпапе сеї! тідгайоп Бу штог мишей, лікованих І--18ВР, вивчають на моделі песговів Тасіг оаюрна (ТМЕ-арна). 9. Іпмеві.

ОНТ. Тваринних С57В/ /6 сенсибілізують внутріш- Оептай)|. 99:488-508. ньовенною ін'єкцією 1095 алогенних ВАГ В/с- 17. Маїїзгемувкі, С.В., Т.А. Зайю. Т. Мапаєп Воз, спленоцитів. Через 5 днів 13х105 ВАЇВ/с- 5. Мацйдн, 5.К. Оомег, у. Зіаск, М.Р. ВесКктапп, апа спленоцитів вводять в праві подушечки лап, разом К.Н. агарзієїп. 1990. СуюкКіпе гесеріог5 апа В сеї з або 10мг/кг рекомбінантного І--18ВР людини в.о., Тпсопе. Ї. Весотбріпапі воїШбІіе гесеріог5 або носієм. Місцеве запалення вимірюють визна- вресійсанйу іпрірі 1/-1- апа І/-4-іпадисеа В сеї ченням набрякання подушечки лап через 24 годи- асіїміев іп міо. 9. Іттипої. 144:3028-3033. ни. Кеїегепсе5 18. Місаїеб М.)., Т. Опівикі, К. Коппо, ЕК. 1. АнвБспці 5.Р. еї аї., 9. Мої. Віо!., 215, 403-410, Тапаре, 5. Овпіо, М. Матбра, Т. Тапітоїю, К. 1990, Айеспи! 5.Р. еї аї., Мисієїс. Асіаз. РВез., Тогідоє. М. ції, М. Ікеда, 5. ЕРикида, апа М. 25:389-3402, 1997 Кигітоїю. 1996. Іпепегоп-датта-іпдисіпуд Тасіог 2. Апіопороціо5, С, М. Ситрегбаїсн, В.). еппапсез ТТ НПеірег 1 суюкКіпе ргодисіоп бу

Оєагтап, ВА.). Вапієї, І. Кітрег, апа А.МУ. Стомев. війтшіаеа питап Т сеїІв: зупегдівт Ум іпіепеикіп- 20.01. Бипсіопа! сазраве-! ів гецдиітей тюг 12 юг іпіепегоп-датта ргодисійоп. Еиг-9У-Іттипої

Іапдепапе сей тідгайоп апа оріїта! сопіасі 26:1647-51 іп: 0014-2980.

19. Макатига К., Окатига Н., У/ада М., Мадаїйїа 26. Бііпді, МА., Запаег, О.М., І Ціта, М, УМо!й, К.,

К., Татига Т. Іптесі. Іттип. 1989Еер.;57(2):590-5 Репатрегоетг, Н., апа 5іїпа!.сх. (1983). Меспапівт ої 20. Моміск, О.Кіт, 5-Н, Рапішаелі, С., Вегпіком, ОМ-В-іпдисей ітраїптепі ої Ше апіїдеп-ргезепііпд

Г., ОіпагейПо, С, апа Вибіпвієїп, М. (1999). Іттипку сарасіу ої тапйпе ерідепта! сеїї5. у. Іттипо). 10,127-136. 130,1586-1591. 21. ОКатига Н., Мадаїа К., Котаївзи Т., 27. Тиссі, А., ЧУЧатев5, Н., СПісперопісне, В.,

Тапітою Т., Микаїа У., Тапабе РЕ., Акіїа К., Топдоє Воппеїсу, .У., Оауег, 9.М., апа 2ибріеєг, ВА.Н., 1992,

К., Окига Т., Рикида 5., єї аї. ІпТесі. Іттип. 1995 УЛттипо). 148, 2778-2784.

Осі.;63(10): 3966-72 28. О5піо 5., Матра М., ОКига Т., Нацогїі К., 22. Ратеї, Р, Сажка, К. Е., Воппеп, Т. Р., МиКада У., Акіа К., Тапабе Р., Копівні К., Місапеї

Оомег, 5.К, апа бітв, у. Е. (1996), 9. Віої Спет. М, Еції М., Тогідоє К., Тапітою Т., Рикида 5., ІКеда 271, 3967-3970. М., ОКкатиган., Кигітої М. 9. Іттипої. 1996 23. Веіппоїдега!. (1990). І апсеї 3351282. Уцп.1;156(11):4274-9 24. ВоШе Н., депКіпе М.А., Сореїапа М.(2., Коїр 29. МозПпітою Т., ТаКеда, К., Тапака, Т.,

Н.У. Сіїп. Іпмеві. 1997 Реб. 1:99(3):469-74 Опкизи, К., Казпіматига, 5., Окатига, Н., АКіга, 5. 25. ЗепШег.(. апа бієїптап, Мигіпе ерідегтаї! апа МакКапізпї, К, (1998), У. Іттипої. 161, 3400-

І апдетапе сеїЇв ташге іп роїепі 3407. іттиповіїйтиаюгу аепагійіс сейв іп міо. У. Ехр. 30. Хи єї а. (1998). 9. ої Іпіепегоп апа Суїюкіпе

Меа. 161, 526-546. НАезеагсі 18:653-659. як -я- ПОВЕ -- ЩОВЕ ;

Зк що -й- чаововечевві що В Ї тк похінукіння з - що т Ше 2 З г Ех В К У в. 5 ри М г: їд Т. фн-- - ІЗ 3 щі і: у. хи вон т 5 1ий Ер І: ТЕ й й. ши ЕЕ -суснннрн снннретттнтну о коми лао пивом п ме пи пасе сов в ме но; Ми в з нини ан т еру о їі ко рів пе дв бу їж па що то 5 ман со 2 б вен оо шко ок); 205 зар Зп хикосіжнкО рено КК і ! ! ! же попфрУ ко й | І яв пл 8 300 І» ше ллейт Фіхюлиювик поеним у ДІ А Аа А А А ї й : | й й Колухютня Й й Ізмеїхоїння ШУМУ їси їх /, «Крит С-ї Ге ШИ х Ж ; ід ши Ще вро я "з и

У іх Й 4 і мін ї Кн сл Ас пса - й дк «о - Ба зі Гах да с

Ії й і 5 ші в І йщ Й в "64 п и п о и по и в а: ТВО раєй вве Несе, лес яра ПОЯВИ Ноні АВС ре р би ва ра рія 4 о їиб --- ЕТ

Чик.ї «Фа ! жк ЗОСІЙ зав її - 13»

ЗИ Ве сезсибілізаваці

ГНН КИйНя ОСІ С мАишО Соня о йлев РНЕСВВК е ос НИ ДИНИ ИНА В КА ! ши ше ЕВ ЕЕ

Н пиатремів. Й «сеї їо0ум лейл о3а ол ПТМ ВАН

ГаибнотумАКН ОАЕ Тел й Я ва Б КИ

СОЛКЛЕННЄ Кір оохмко кою кни 0 ЮНИЙ ВИНЮСНА ННЯ «нт, 2 Зхг. 6

ДРЕНММНІЧ ІН ! вро титри І

ПОКГЕ в з. зайве»

І вимови кі їжак Шосе ЗВ 1 ; же: МИ вс Со ка рочки сис ве ви Й п нн ши и З ЗА МИОВНИН роолюшніхе НОСІЙ 5 0 оман п ун нн нон і ВЕ с В з одер и доилзві Н

Її вк ШВА т ДОВІДНОСВО | рак анна ШИ пояанк зам хо ї Б ОХ во | | «Ка. | виманив й інн зв Манн пив че зни пи опо нон чинно ходах ріс Я. "55 1

Н З Н п.аї Н а КВ ух і жаї ЗШ ан и Кн МИ «ВІД | є ше "ЕН "ВЕ. у ! сля і 43 : о і но ЗАРАННОГО БАКИ сток Є ! нн нн на а нн п а ВЕ ОЇ, ДЕК У М и Ж і; полка тат но реч | ня ую І і | 85 пат ШИ Ши М й ши о

РО бименюванох БМАлкомоинном протном Я гидино ШЕ

Чит, 7 Фі.

Комп'ютерна верстка В. Мацело Підписне Тираж 26 прим.

Міністерство освіти і науки України

Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна

ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601