UA79426C2 - Combined adjuvant compositions - Google Patents

Description

Опис винаходу

Даний винахід відноситься до застосування аміноалкілл'люкозамінфосфатної сполуки, або її похідного, або 2 аналога у комбінації з цитокіном або лімфокіном, зокрема гранулоцитарно-макрофагальним колонієстимулюючим фактором або інтерлейкіном-12, як форми (композиції) ад'юванту в антигенній або імуногенній композиції для посилення імунної реакції хребетного хазяїна на вибраний антиген.

Імунна система використовує різні механізми для боротьби з патогенами. Однак не всі з цих механізмів обов'язково активуються після імунізації. Захисний імунітет, який індукується імунізацією, залежить від 70 здатності імуногенної композиції індукувати придатну імунну реакцію для протистояння патогену або елімінації патогену. В залежності від патогену це може вимагати клітинно-опосередкованої та/або гуморальної імунної реакції.

Існуючою парадигмою у відношенні ролі хелперних Т-клітин в імунній реакції є те, що Т-клітини можуть бути підрозділені на субпопуляції на основі цитокінів, які вони продукують, і що індивідуальний профіль цитокінів, 12 який спостерігається у цих клітинах, визначає їх функцію. Ця модель Т-клітин містить у собі дві головні субпопуляції: ТН-1-клітини, що продукують інтерлейкін-2 (ІІ -2), і гама інтерферон, що збільшують як клітинну, так і гуморальну (у вигляді антитіл) імунні реакції; і ТН-2-клітини, що продукують інтерлейкін-4, інтерлейкін-5 і інтерлейкін-10 (11/-4, 1/-5 і 1Ї/-10, відповідно), які збільшують гуморальні імунні реакції (посилання 1 у бібліографії). 20 Часто є бажаним посилення імуногенної ефективності антигену для одержання більш сильної імунної реакції імунізованого організму і для посилення стійкості хазяїна до агента, що несе антиген. У деяких ситуаціях бажаний зсув імунної реакції від переважно гуморальної (ТН-2) реакції до більш збалансованої клітинної (ТН-1) і гуморальної (ТН-2) реакції.

Клітинна реакція містить у собі генерування СО8- СТІ реакції (реакції СОвіцитотоксичних Т-лімфоцитів). с 25 Така реакція є бажаною для розробки імуногенних композицій проти внутрішньоклітинних патогенів. Захист проти (У різних патогенів вимагає сильних мукозних реакцій, високих сироваткових титрів, індукції СТІ їі сильних клітинних реакцій. Ці реакції не забезпечувались більшістю антигенних препаратів, у тому числі загальноприйнятими субодиничними імуногенними композиціями. Серед таких патогенів знаходиться вірус імунодефіциту людини (ВІЛ). ее, 30 Таким чином, існує потреба у розробці форм антигенних композицій, які здатні генерувати як гуморальну, Га так і клітинну імунні реакції хребетного хазяїна.

Таким чином, метою даного винаходу є використання комбінованих композицій (форм) ад'ювантів в в антигенних композиціях, які містять аміноалкілллюкозамінфосфатну сполуку (АСР), або її похідне, або аналог, Ге»! об'єднані з цитокіном або лімфокіном, зокрема гранулоцитарномакрофагальним колонієстимулюючим фактором 3о (ОМ-СЗЕ) або інтерлейкіном-12 (1/-12) або агоністом або антагоністом зазначених цитокіну або лімфокіну. в

Зокрема, АсР є 2-КК)-З-тетрадеканоїлокситетрадеканоїламіно|етил-2-дезокси-4-О-фосфоно-3-0О-(К)-З-тетрадеканоїлокситетрад еканоїлі-2-(К)-З-тетрадеканоїлокситетрадеканоїламіно|- ВД-О-глюкопіранозидом, який відомий як 529 (раніше « відомий як КС529). З7З 70 Ад'ювант є речовиною, що підсилює імунну реакцію при введенні разом з імуногеном або антигеном. с Композицію ад'юванта даного винаходу вводять разом з вибраним антигеном в антигенній або імуногенній хз композиції. Антигенні композиції даного винаходу підсилюють імунну реакцію хребетного хазяїна на цей вибраний антиген. Вибраний антиген може бути поліпептидом, пептидом або фрагментом, що походить (1) з патогенного вірусу, бактерії, гриба або паразита, або |2) з ракової клітини або пухлинної клітини, або |З| з алергену, так щоб він перешкоджав продукуванню ЧЕ, щоб стримувати алергійні реакції на цей алерген, або (4) - з білка-попередника амілоїду для запобігання або лікування захворювання, що характеризується відкладенням (Се) амілоїду у хребетного хазяїна. В одному варіанті даного винаходу вибраний антиген походить із ВІЛ. Вибраний антиген ВІЛ може бути білком ВІЛ, поліпептидом, пептидом або фрагментом, одержаним із зазначеного білка. У т конкретному варіанті даного винаходу антиген ВІЛ є специфічним пептидом. В іншому варіанті даного винаходу ко 20 вибраний антиген є р-амілоїдним пептидом (також названим Ар-пептидом), який є внутрішнім фрагментом

Ф білка-попередника амілоїду (АРР), що складається з 39-43 амінокислот, який утворюється процесінгом АРР ферментами р- і у-секретазами.

АСР може бути присутнім у вигляді водного розчину або у вигляді стабілізованої емульсії типу "масло у воді" (стабільної емульсії або ЗЕ). У кращому варіанті даного винаходу емульсія типу "масло у воді" містить сквален, гліцерин і фосфатидилхолін. У ЗЕ-формі АСР змішують з цитокіном або лімфокіном для одержання (Ф) антигенної композиції перед введенням. Не потрібно, щоб цитокін або лімфокін входили в цю емульсію. У г) кращому варіанті даного винаходу АСР знаходиться у ЗЕ-формі. Антигенна композиція може додатково містити розріджувач або носій. Даний винахід відноситься також до способів для збільшення здатності антигенної во композиції, що містить вибраний антиген |1) з патогенних вірусу, бактерії, гриба або паразита, щоб індукувати імунну реакцію хребетного хазяїна, або |2)| з ракового антигену або пухлинної клітини, щоб індукувати терапевтичну або профілактичну антиракову дію у хребетному хазяїні, або |З) з алергену, щоб запобігати продукуванню ІДЕ для стримування алергійних реакцій на цей алерген, або |4) з молекули або її частини, що представляє молекулу або її частину, яка продукується хазяїном (аутологічну молекулу) небажаним чином, у в5 небажаній кількості або місці розташування, щоб зменшувати такий небажаний ефект, за допомогою включення ефективної ад'ювантної (імуностимулюючої) кількості комбінації цитокіну або лімфокіну, зокрема АСР з СОМ-С5Е або ІІ -12, або агоністу або антагоністу зазначених цитокіну або лімфокіну.

Далі даний винахід відноситься до способів збільшення здатності антигенної композиції, що містить антиген, вибраний з патогенних вірусу, бактерії, гриба або паразита, індукувати цитотоксичні Т-лімфоцити у хребетному хазяїні за рахунок включення ефективної ад'ювантної (імуностимулюючої) кількості комбінації цитокіну або лімфокіну, зокрема АСР з (3М-С5ЗЕ або ІІ -12, або агоністу або антагоністу зазначеного цитокіну або лімфокіну.

Фігура 1 зображує середні геометричні титри антитіл до Ар1-42-пептиду у трансгенних мишах, імунізованих наступним чином: Група 1-Ар1-42-пептид плюс РВЗ (не показаний); Група 2-Ар1-42-пептид плюс МРІтм ЗЕ 70 (квадрати); Група З-Ар1-42-пептид плюс МР тм БЕ і ЗМ-С5Е (трикутники) ; Група 4-Ар 1-42-пептид плюс 529 ЗЕ і

ОМ-С5БЕ (перевернені трикутники).

Фігура 2 зображує загальні кортикальні рівні АР у трансгенних мишах, імунізованих чотирма групами, описаними для Фігури 1.

Фігура З зображує кортикальні рівні Ар1-42-пептиду у трансгенних мишах, імунізованих чотирма групами, 75 описаними для Фігури 1.

Фігура 4 зображує амілоїдне навантаження лобової частини кори головного мозку у трансгенних мишах, імунізованих чотирма групами, описаними для Фігури 1.

Фігура 5 зображує нейритне навантаження лобової частини кори головного мозку у трансгенних мишах, імунізованих чотирма групами, описаними для Фігури 1.

Фігура б зображує рівні ретроспленіального астроцитозу кори головного мозку у трансгенних мишах, імунізованих чотирма групами, описаними для Фігури 1.

Фігура 7 зображує середні геометричні титри антитіл СА(Е9М)-МЗво вр-пептид ВІЛ-специфічного ІдС у сироватці у двох групах собакоголових макак (чотири тварини на групу). Тварин групи 1 імунізували інтраназально тільки С4(ЕЗМ)-МЗвовр-пептидом. Тварин групи 2 імунізували внутрішньом'язово Ге СА(Е9М)-МЗво вр-пептидом, приготованим з 529 ЗЕ і 5М-СзР. Стрілки вказують імунізації при тижнях 0,4, 8, 18 о і 23.

Фігура 8 зображує середні геометричні титри антитіл у пробах шийково-піхвового лаважу тварин, описаних для Фігури 7.

Фігура 9 зображує середні геометричні титри антитіл у пробах назальних промивань тварин, описаних для (Се)

Фігури 7. сч

Ад'юванти, цитокіни і лімфокіни є імуномодулюючими сполуками, що мають здатність підсилювати розвиток і керувати розвитком і профілем імунних реакцій проти різних антигенів, які самі є слабоїмуногенними. Придатний «І вибір ад'ювантів, цитокінів і лімфокінів можуть індукувати хороші гуморальні і клітинні імунні реакції, що не Ф могли б розвинутись під час відсутності ад'юванта, цитокіну або лімфокіну. Зокрема, ад'юванти, цитокіни і лімфокіни мають істотні дії у посиленні імунної реакції до субодиничних і пептидних антигенів в імуногенних /-їч» композиціях. Їх стимуляторна активність є також корисною для розвитку антиген-специфічних імунних реакцій, спрямованих проти білкових антигенів. Для різних антигенів, що вимагають сильних мукозних реакцій, високих сироваткових титрів, індукції СТІ і сильних клітинних реакцій, комбінації адюванта і цитокіну/лімфокіну « забезпечують стимули, що не забезпечуються більшістю препаратів антигенів.

У численних дослідженнях проводили оцінку різних форм ад'ювантів у моделях тварин, але в наш час квасці - с (гідроксид алюмінію або фосфат алюмінію) є єдиним ад'ювантом, ліцензованим для широкого застосування у ч людей. Іншим ад'ювантом є Стимулонтм С)5-21 (Зітиоптм 05-21) (Апіїдепісв Іпс., Егатіпопат, МА (21). Одна » група ад'ювантів, стабільні емульсії, що складаються з різних комбінацій масла або масло-у-воді, привернула велику увагу внаслідок їх імунопотенціювальної здатності. Ці форми звичайно складаються з різних комбінацій метаболізованих або інертних масел, що стабілізують або депонують антиген у місці інфекції. Одним з таких - ад'ювантів є неповний ад'ювант Фрейнда (ІГРА), що містить у собі мінеральне масло, воду і емульгуючий агент. со Повний ад'ювант Фрейнда (СЕА) являє собою ІРА плюс убиті нагріванням мікобактерії. Особливе занепокоєння у використанні цих типів ад'ювантів викликало подразнення, пов'язане з місцем ін'єкції, що часто є результатом - інфільтрації мононуклеарних клітин, які викликають гранулематозні пошкодження. Таким чином, інші сполуки і 7 50 форми досліджуються як потенційні ад'юванти.

Однією групою таких сполук є аміноалкілллюкозамінфосфатні сполуки (АСР), які описані у (Патенті

І) Сполучених Штатів Моб6113918), наприклад, стовпець 2, рядок 14 - стовпець 3, рядок 38, що включений тут як посилання (|З. АОсР мають аміноалкільну (аглікон) групу, які зв'язана глікозидним зв'язком з 2-дезокси-2-аміно-20-О-глюкопіранозою (глюкозаміном) з утворенням основної структури. Додаткові замісники 22 включають в себе фосфорилювання вуглецю 4 або 6 у кільці глюкозаміну і трьох З-алканоїлоксіалканоїльних

ГФ) залишків.

Один з таких АОСР є сполукою, яка позначається як 529 (повною хімічною назвою якої є о 2-КК)-З3-тетрадеканоїлокситетРадеканоїламіно|етил-2-дезокси-4-О-фосфоно-3-0О-(К)-З-тетрадеканоїлокситетрад еканоїл|-2-((К)-З-тетрадеканоїлокситетрадеканоїламіно!- рД-О-глюкопіранозид), що виробляється Согіха (Натійоп, 60 Мт.

Согіха виготовила також метаболізовану форму емульсії типу "масло у воді? що при об'єднанні з 529 приводить до утворення стабілізованої емульсії, названої 529 ЗЕ. Цю стабілізовану емульсію одержують мікрофлюїдизацією 529 з скваленовим маслом, гліцерином і фосфатидилхоліном. Існуюча на даний час форма є мікрофлюїдизована емульсія ЗМР-якості. Емульсії, що містять 195 масла (хоча можуть використовуватись й інші бо концентрації), описані в експериментах нижче.

529 5Е приводила до нерозрізненої макроскопічної патології тканини при введенні підшкірно мишам Ваїр/с або Зм/ізз-УУерзіег. Одержували також стабілізовану емульсію, що містить ті ж самі компоненти, але без 529, для порівняльних цілей. Конкретно, підшкірна імунізація цистеїн-делетованою версією з 39 амінокислот (-Сув) пептиду ВІЛ з 40 амінокислот ТІБРІОММЦА) (яка не має залишку цистеїну в положенні амінокислоти 17 пептиду з 40 амінокислот (нСуз)) або Ар 1-42 (внутрішнім фрагментом з 42 амінокислот АРР), які готували з комбінацією ад'ювантів 529 5Е і ОМ-С5БЕ, не приводила до помітного запалення, почервоніння, набрякання або ущільнення.

В об'єм даного винаходу входять також похідні і аналоги 529 та інших АОР. Такі сполуки містять у собі, але не обмежуються ними, сполуки, описані у (Патенті Сполучених Штатів Моб113918 (З)). 70 Включення цитокінів і лімфокінів в імуногенні композиції показало перспективність у відношенні розширення і посилення потенціалу імуногенних композицій І4)1. Було показано, що цитокін інтерлейкін-12 (1-12) індукує і підсилює клітинно-опосередкований імунітет через зсув у розширенні субпопуляції Т-хелперних клітин вбік профілю Тп1-цитокінів (тобто вбік ІдбС2-підкласу в мишачій моделі) (5-7). Було показано, що у мишей рекомбінантний мишачий 1-12 підсилює профіль Тп1-домінуючих імунних реакцій (4).

І--12 продукується різними антигенпредставляючими клітинами, в основному макрофагами і моноцитами. Це є критичним елементом в індукції ТНІ1-клітин з "ненавчених" (наївних) Т-клітин. Було показано, що продукування

І--12 або здатність відповідати на нього є критичною у розвитку захисних ТНІ1-подібних реакцій, наприклад під час паразитичних інфекцій, особливо лейшманіозу |8), а також посиленні клітинно-опосередкованої імунної реакції на антиген з патогенної бактерії або патогенного вірусу (9) або з ракової клітини (101Ї1. Ефекти 11-12 опосередковані у значній частині інтерфероном-гама, який продукується клітинами-кілерами (МК) і Т-хелперними клітинами. Інтерферон-гама є критичним для індукції Ідбс2а-антитіл до залежних білкових антигенів |11) і

ІдоЗ-реакцій на Т-незалежні антигени (|121). 1-12, спочатку названий стимуляторним фактором природних клітин-кілерівб, є гетеродимерним цитокіном (13). Експресія і виділення білка І/-12 у рекомбінантних клітинах-хазяїнах описані в опублікованій (Міжнародній патентній заявці УМО 90/05147 (141). с

Іншим цитокіном, що має потенціал застосування як ад'юванта, є ЗМ-С5Е. (ЗМ-СЗЕ є особливим типом колонієстимулюючого фактора (С5Е). Фактори СЕ представляють сімейство лімфокінів, що індукують о диференціювання клітин-попередників, виявлених у кістковому мозку, у конкретні типи зрілих клітин крові. Як описано у (Патенті Сполучених Штатів Мо5078996 |15Ї|) що включений тут як посилання, ЗМ-С5Е активує макрофаги або попередники моноцитів для опосередкування неспецифічної нищівної нухлинні клітини Ге)

Зо активності. Була описана нуклеотидна послідовність, що кодує ген ЗМ-СЗЕ людини |15). Плазміда, що містить

КДНК ОМ-С5Е, була трансформована в Е. соїї і була депонована в |Американську Колекцію Типових Культур с (АТСС), 10801 Опімегейу Вошемага, Мапаззаз, МА 20110-2209, під номером 39900). Як описано у (патенті США «т

Мо5229496 |161), який тим самим включений тут як посилання, ген ЗМ-С5Е був також інсертований у дріжджову експресійну плазміду і депонований в (АТСС під номером 531571. Крім того, як описано у (Патенті США Мо іа зв 2073627 | 1ЛІ, який включений тим самим як посилання, ДНК-послідовність, що кодує ОМ-С5Е, який має вилучені ї- сайти глікозилювання, була депонована в (АТСС під номером 672311.

Було показано, що СМ-С5Е позитивно регулює білкові молекули на антигенпредставляючих клітинах, що, як відомо, підсилюють імунні реакції (18) і впливають на секрецію Ід в очищених сортінгом мишачих В-клітинах (19). ОМ-С5Е був описаний також як ад'ювант для імуногенних композицій (201. «

Було показано, що інші цитокіни або лімфокіни мають імуномоделюючу активність, у тому числі, але не Щ- с обмежуючи ними, інтерлейкін-1-альфа, 1-бета, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 ії 18, й інтерферони-альфа, бета і гама, гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор і фактори некрозу пухлин альфа "» і бета.

Важливими у зв'язку із системним введенням будь-якого цитокіну або лімфокіну є біологічні наслідки, пов'язані з активністю цитокінів або лімфокінів. Крім того, дії цитокінів або лімфокінів, пов'язаних з -і розвитком антиген-специфічних імунних реакцій, повинні підсилюватись, якщо підтримуються локальні концентрації цитокінів або лімфокінів. о Проводилась оцінка комбінацій 3-О-деацильованого монофосфорилліпіду А або монофосфорилліпіду А з «їз» ОМ-С5БЕ або 1І -12; спостерігали посилення різних параметрів імунної реакції (211.

Описаний тут винахід демонструє, що за допомогою комбінування антигену, вибраного цитокіну або де лімфокіну як ад'юванта і другого адюванта АСР (переважно у стабільній метаболізованій емульсії), імунні

Ф реакції, специфічні для даного антигену, підсилюються.

Антигени, вибрані для включення в антигенні композиції даного винаходу, містять у собі пептиди або поліпептиди, одержані з білків, білки, а також фрагменти будь-яких з наступних компонентів: сахаридів, білків, полі- або олігосахаридів або інших макромолекулярних компонентів. У застосуванні тут, "пептид" позначає ряд з, щонайменше, трьох амінокислот і містить, щонайменше, одну антигенну детермінанту або (Ф, епітоп, тоді як "поліпептид" позначає більш довгу молекулу, ніж пептид, але не складає повнорозмірний білок. ко Такі пептиди, поліпептиди або білки можуть бути кон'юговані з неспорідненим білком, таким як правцевий токсоїд або дифтерійний токсоїд. У застосуванні тут, "фрагмент" містить частину, меншу, ніж весь зазначений бо Компонент, такий як сахарид, білок, полі- або олігонуклеотид або інший макромолекулярний компонент. У випадку ВІЛ, антигенні композиції даного винаходу додатково містять повнорозмірні білки ВІЛ.

Даний винахід спочатку ілюструється на прикладі модельної системи з використанням пептидних антигенів, одержаних із ВІЛ. Ці пептиди описані у |Патентах Сполучених Штатів Мо5013548 |22| і Мо5019387 (231), що включені як посилання, або вироблені з описаних у них пептидів, і ці описи підсумовуються далі. Ці пептиди 65 Містять амінокислотні послідовності, що відповідають району білка оболонки ВІЛ, проти якого одержують нейтралізуючі антитіла і Т-клітинні реакції.

ВІЛ є ретровірусом людини, що є збудником синдрому набутого імунодефіциту (СНІДу). ВІЛ інфікує

Т-лімфоцити імунної системи приєднанням глікопотеїну його зовнішньої оболонки до СО4 (Т4)-молекули на поверхні Т-лімфоцитів, використовуючи, отже, цю молекулу СО4 (Т4) як рецептор для входження в Т-клітини та

Інфікування їх. Спроби індукції захисної імунної реакції, специфічної для ВІЛ-інфекції, через імунізацію мали дуже обмежений успіх. В наш час ряд підходів використовують у спробі визначення ефективної і захисної стратегії для розвитку імуногенних композицій. Вони містять у собі атенуйовані і рекомбінантні бактеріальні вектори, які експресують антигенні епітопи з ВІЛ |24), рекомбінантний аденовірус (25) або вектори вірусу коров'ячої віспи (26), імунізацію ДНК і синтетичні пептиди, що містять різні Т- і В-клітинні епітопи ВІЛ (281. 70 Було показано, що глікопротеїн др120 зовнішньої оболонки ВІЛ здатний індукувати нейтралізуючі антитіла в людях. Було показано, що рекомбінантний білок РВ1, що охоплює приблизно одну третину повної молекули ор120, містить у собі частину білка оболонки, яка індукує утворення нейтралізуючих антитіл. Однак дослідження на шимпанзе показали, що ані інтактний одр120, ані РВІ1 не здатні індукувати продукування високих титрів нейтралізуючих антитіл.

Короткі пептиди синтезували загальноприйнятими способами, і ці пептиди відповідали антигенним детермінантам одр120 і генерували реакцію у вигляді антитіл проти др120, які нейтралізували цей вірус та індукували Т-хелперні і СТІ -реакції проти цього вірусу.

Одним таким пептидом є пептид ВІЛ-Ітп, який містить С4-МЗ-мультиепітоп, названий ТІЗРІОММА) (Суз) і варіант із делетованим цистеїном ТІЗРІОММ(А) (-Сув). Ці пептиди містять у собі ТИ, Т сті і В-епітопи, але не індукують антитіла, що перешкоджають зв'язуванню СО4. Раніше було продемонстровано, що ці С4Л/З-пептиди

ВІЛ є багатообіцяючими кандидатами у відношенні індукції імунних реакцій при введенні з СЕРА або

СЕА-подібними ад'ювантами (29-34). Ці пептиди містять епітопи, що, як було показано раніше, індукують ср4вТп-клітинні реакції як у мишей, так і у людей, і вони містять як головну нейтралізуючу детермінанту, так і сайт, який упізнається СО8--СТІ як у мишей Ваїр/с, так і у людей, які є НІ А В7ж. Нещодавно було показано, що с г пептид з 39 амінокислот має як імуногенність так і безпеку у ВІЛ-інфікованих пацієнтах (281.

ТІЗРІОММ(А) (їСувз) має наступну послідовність з 40 амінокислот: і) пт ех кот ть ль Зх Зль ПЕ у тат й Ге ків мо ваг якщо чіт тк па ще тв жні). з ла льа пух і зх пут (12) сч

ТІБРІОМІМ(А) (-Сувз) синтезували без цистеїну в положенні 17 і він має наступну послідовність з 39 « амінокислот: Ге! вд "а " « дю Цей залишок цистеїну локалізований зовні від функціональних епітопів, які упізнаються ТП-клітинами, СТІ. з або В-клітинами. Інші пептиди ВІЛ з різних районів вірусного геному описані у |(Патенті США Мо5861243 |ЗБІ, с Патенті США Мо5932218 |З6Ї, Патенті США Мо5939074 ІЗ7Ї, Патенті США Мо5993819 ІЗ8), Патенті США Мо6037135 :з» ІЗ9Ї, Опублікованій Європейській заявці на патент Моб71947 І40) і Патенті США Мо6024965 |411), які також включені як посилання.

Використовували також пептидний кон'югат з 28 амінокислот, названий 5Т1/р11сС. Цей кон'югат складається з - 395 ЗІМ-епу-похідного Т-хелперного пептиду з 16 амінокислот, названого 5-1, кон'югованого з СбЗад-пептидом

ЗІМ-тас 251 з 12 амінокислот (амінокислоти 179-190 Сад), названого р11С |42). Пептид р11сС у тетрамерній (Се) формі продемонстрував СТІ -активність у інфікованих 5ІМ-тас макаках-резус Мати-А"01 (43). Пептидний 1» кон'югат ЗТ1-р11С має наступну амінокислотну послідовність:

Ф КУ Во Чаї Жук жах 8іх у Сує Тих їхо тут ащр тів Аша іх щоб зам (БНО Хо жоа3),

Використовували також пептидний кон'югат з 39 амінокислот, названий С4-МЗво бр (44). Район С4 цього

ГФ) пептидного кон'югату (16 амінокислот) вироблений з четвертого константного району білка оболонки ВІЛ-1 і представляє універсальний Т-хелперний епітоп. Частина МЗ3 цього пептиду (23 амінокислоти) вироблена з де третього гіперваріабельного району білка оболонки ВІЛ-1 і представляє критичну нейтралізуючу детермінанту.

Кон'югат Са-МУЗ во вр має наступну амінокислотну послідовність: 60 б5

Був ід жі їіа Ана ща тир о вія кі у

Бе Віа Мой Тук Аза іш аку зт іа Ат ми щи НУ І МІЖ їли дак т31ю Фу пт «у йо аа То Тук 15 лк аку (ащо їв Шоу,

Антиген ВІЛ може бути білком, поліпептидом, пептидом або фрагментом, одержаним із зазначеного білка. 70 Цей білок може бути глікопротеїном, таким як ор41, др120 або др1460. Альтернативно, цей білок може бути білком, кодованим такими генами, як дад, рої, мії, гем, мрг, Фаї, пеї або епу. Пептиди, вироблені з таких білків, будуть містити щонайменше одну антигенну детермінанту (епітоп) довжиною щонайменше шість амінокислот.

Імунна реакція на пептид ВІЛ може бути посилена ковалентним зв'язуванням (кон'югацією) пептиду з 79 молекулою фармацевтично прийнятного носія. Приклади придатних молекул-носіїв містять у собі правцевий токсоїд, дифтерійний токсоїд, гемоціанін фісурели та інші пептиди, що відповідають Т-клітинним епітопам глікопротеїну др120 ВІЛ.

В наш час передбачається, що успішна стратегія для імунізації проти ВІЛ буде вимагати індукування мукозного імунітету до ВІЛ, а також хорошої СтТі-реакці. У нещодавньому дослідженні на мишах з використанням мультиепітопного пептиду ТІЗРІОММ(А) і мукозного ад'юванта, холерного токсину, було показано, що інтраназальна імунізація індукувала нейтралізуючі сироваткові антитіла ІдсС1 (45). Наступне дослідження також з використанням пептидів петлі МЗ ВІЛ показало індукування синтезованого мукозального

ІдА-антитіла і сильні клітинно-опосередковані реакції, у тому числі пептид-специфічні СТІ. (46). Функціональна роль високих титрів системних і нейтралізуючих антитіл у попередженні ВІЛ або стабілізації ВІЛ-інфікованих с індивідуумів є невідомою, хоча вважається, що високі титри вірус-специфічного антитіла важливі у запобіганні г) поширення вірусу.

У кращому варіанті даного винаходу готують стабільну емульсію типу "масло у воді", що містить 529, яку потім змішують з цитокінами 1-12 або СМ-С5Р. Дані, представлені нижче, показують, що комбінація 529 плюс

О-М-С5Е приводить до високих титрів ВІЛ-нейтралізуючих сироваткових антитіл. Комбінування 529 5Е і ЄМ-С5Е ісе) індукує високі титри антиген-специфічних ІдС-антитіл, у тому числі як ІДС, так і ІдС2а підкласів, у зводі с піхви імунізованих самок мишей. Імунізація мишей ТІЗРІОММ(А) (-Сув)-пептидом, приготованим з 529 ЗЕ і

ОМ-С5БЕ, індукувала сильну клітинну імунну реакцію, як визначено за посиленою антиген-специфічною клітинною « проліферацією і секрецією у культуру цитокінів, а також за індукцією пептид-специфічних СТІ -реакцій. Подібні Ге! результати спостерігали при імунізації мишей Ар 1-42-пептидом з АРР із 529 ЗЕ і ЗМ-С5БЕ.

Звичайно форма антиген/«адювант 529 або 529 ЗЕ, об'єднана з ЗМ-С5Е або 1І/-12 і вибраним білком і - пептидом, індукує високі титри антиген-специфічного і нейтралізуючого вірус антитіла, істотне зрушення у співвідношенні підкласів (до вбік більшої частки комплемент-фіксуючих Ідс-антитіл (на користь Ідс2а у мишах), підвищене продукування цитокінів і клітинну проліферацію з мононуклеарних клітин у відповідь на стимуляцію « антигеном іп мійго. Ці властивості не спостерігали з формами антигену і 5Е під час відсутності 529, ні з

ОМ-С8БЕ або ІІ-12, ні без СМ-С5Е або ІІ -12. Форми даного винаходу також індукують хороші клітинні реакції, як не) с визначено за індукцією СТІ.

Із» Перевага 529 5Е полягає в тому, що ця форма не індукує гранулематозне нагромадження і запалення у місці ін'єкції; такі реакції у місці ін'єкції звичайно індукуються формами ад'ювантів типу "вода-у-маслі" або "масло-у-воді".

Був проведений експеримент для порівняння введення пептиду ВІЛ ТІЗРІОММ(А) (-Суз) тільки з 529 5Е або з 7 529 ЗЕ плюс 1-12 або 529 БЕ плюс СМ-С5Е. (Те) У цьому експерименті (таблиця 71, нижче) миші Ваїр/с, імунізовані підшкірно петидом ВІЛ ТІЗРІОММА) (-Сув), приготованим з 529 ЗЕ, індукували пептид-специфічні сироваткові титри дО після усього лише двох ть ін'єкцій. Індукувались також титри підкласів Ідс1 і Ідо2а. Включення другого ад'юванта, або ЗМ-СЗЕ, або ка 20 | -12, підвищувало загальні титри ІдсС, а також титри підкласу ІДСІ. Додавання 1-12 підвищувало титри підкласу І(до2а; додавання ЗМ-С5Е не підвищувало титри підкласу ІдСг2а. ши В іншому експерименті як міру функціонального клітинно-опосередкованого імунітету оцінювали здатність клітин селезінки мишей, імунізованих 529 5Е або 529 5Е плюс 1-12 або 529 5Е плюс ОМ-С5Е, приготованих разом з мультиепітопним пептидом ТІЗРІОММА) (-Суз), генерувати ВіІЛую-специфічні СТІ -реакції.

Як показано у таблиці 2, клітини селезінки мишей, імунізованих кожним з ад'ювантів, показали низьку (ФІ активність проти клітин-мішеней, які були або неміченими, або короткочасно міченими стороннім СТІ -епітопом

ІВ. ВіІіЛию-специфічний СТІ -опосередкований лізис клітин-мішеней помітно підсилювався при введенні 529 ЗЕ ді плюс 1-12 у порівнянні з одним 529 5Е, і все ще підсилювався додатково при введенні 529 5Е плюс СМ-С5Е (таблиця 2). бо Ще в одному варіанті макак-резус імунізували пептидами 5Т1-р11С або С4-МЗдовр і ІРА або 529 5Е плюс

ОМ-С5Е (груп, показаних у таблиці 15). Результати цих аналізів показані у таблицях 16-22 і тепер підсумовуються.

Сама форма пептиду ЗТ1-р11С, очевидно, добре переноситься у всіх випробуваних тваринах. Однак з ад'ювантом ІРА були відзначені істотні реактивності сайту ін'єкції. Крім того, можливі мінорні несприятливі бо ефекти форми ад'юванта 529 5Е/3М-С5РЕ спостерігались відразу ж після кінцевої імунізації. Форма пептиду

5Т1-р11С, що містить ІРА, була здатна індукувати сильну р1!1С-специфічну клітинну імунну реакцію в одній з двох випробуваних Мати-А"01-позитивних макак-резусє. Форма пептиду 5Т1-р11С, що містить 529 5БЕ/3М-С5Е, також була здатна індукувати р11С-специфічну клітинну імунну реакцію в одній з двох випробуваних

Мати-А"01-позитивних макак-резус.

Форма пептиду С4-МЗвовр, Що містить ІРА, була здатна генерувати максимальні титри антитіл ЕГІБА у плазмі в діапазоні 1:25600-1:102400 і титри сироваткових нейтралізуючих антитіл проти ЗНіІМдо в і ЗНІМао вр.

Форма пептиду С4-МЗво вр, ЩО містить 529 ЗЕ/5М-С5Е, була здатна генерувати максимальні титри антитіл ЕГІЗА у плазмі в діапазоні 1:6400-1:12800 і низькі рівні реакцій нейтралізуючих антитіл проти ЗНІМавов, але не проти 70. ЗНІМвовр.

При невеликому числі тварин на групу (дві) важко зробити конкретні висновки. Однак рівень імунної реакції, як гуморальної, так і клітинної, генерованої обома формами пептидів, що містять 529 5БЕХЗМ-С5ЗЕ, був кількісно більш низьким, ніж імунна реакція, що спостерігається у тварин, яким вводили ІРА як адьювант. Слід також відзначити, що ІРА не є схваленим компонентом у композиціях для комерційного застосування для людей. 7/5 Крім того, мається деякий обмежений доказ того, що функціональні властивості і фенотип (тобто профілі цитокінів) клітин-респондерів можуть розрізнятись у залежності від використовуваної форми адьюванта.

Ще в одному експерименті тварин із другого виду приматів, собакоголових макак, імунізували пептидом

С4-МЗдовбр, який був модифікований заміною глутамінової кислоти при амінокислотному залишку 9 на валін.

Одержаний пептидний кон'югат, названий С4А(Е9М)-МЗдо єр, має наступну послідовність: 7 то іл зіва діа зв Мої Єр бін ча їі щу зе Ма Мой ук ліва ик ал тка іа ла йди

Ше аку ші ла їли ваш ї1ї4 біу жа ЩІ Мк сч да жію Тут хів виє люд (80 то щінб). о

Тварин імунізували пептидом СА(Е9М)-МЗво вр, або без адьюванта, або з комбінацією 529 ЗЕ плюс СМ-С5Е.

Ці результати вказують на те, що пептид С4(Е9М)-МЗдобр при введенні внутрішньом'язовою ін'єкцією у комбінації з 529 БЕ/ЗМ-С5Е індукує значимо більш високі титри пептид-специфічних до у сироватці, ніж та ж «о зо сама кількість пептиду С4(Е9М)-МЗвебРг, що вводиться інтраназально без ад'юванта (Фігури 7-9). Результати цього експерименту ясно демонструють, що пептидний імуноген ВІЛ при введенні у комбінації з придатною с комбінацією ад'ювантів здатний індукувати системний гуморальний імунітет. «Е

Бажані імуногенні композиції для попередження або лікування захворювань, що характеризуються відкладенням амілоїду (аутологічної молекули) у хребетного хазяїна, які містять комбінації ад'ювантів даного Ме

Зв винаходу, містять у собі композиції, що містять частини білка-попередника бета-амілоїду (АРР). Це М захворювання називають по-різному: хворобою Альцгеймера, амілоїдозом або амілоїдогенною хворобою, р-амілоїдний пептид (також названий Ар-пептидом) є внутрішнім фрагментом АРР із 39-43 амінокислот, який утворюється процесінгом АРР ферментами рД- і у-секретазами. Ар1-42-пептид має наступну « послідовність: - со аержйя м те во Ма Мо шк іх бух в тах Бі пл . ща ця зле чи Шк з іль а Вр жа), ше де ши За

Б щу мі тів тів Мія ія Ян Ті бу Бір на чьї Тіз Ма ши з шьп. -1 395 У деяких пацієнтів відкладення амілоїду приймає форму агрегованого А р-пептиду. Несподівано було показано, що введення виділеного А р-пептиду індукує імунну реакцію проти Ар-пептидного компонента іс) відкладення амілоїду у хребетного хазяїна І47). Таким чином, імуногенні композиції даного винаходу містять у їз собі комбінації ад'юванта даного винаходу плюс Ар-пептид, а також фрагменти, похідні або модифікації

Ар-пептиду і антитіла до Ар-пептиду або його фрагментів, похідних або модифікацій. Один такий фрагмент о Ар-пептиду є пептидом з 28 амінокислот, що мають наступну послідовність (481:

Ф аль ль жі Же ЛЕМ Жід Леь йншю у ут Ша чнз щіж ів

Фі хе Бай т Ж Шьв вів біл Бар ай «ід йль за Бал

С ли шнту.

ГФ) Інші фрагменти Ар-пептиду, які є цікавими, містять у собі, але не обмежуються ними, амінокислоти 1-10, ко 1-7, 1-6, 1-5, 3-7, 1-3 і 1-4, які можуть вводитись у некон'югованій формі або кон'югованими з стороннім білком.

Ряд досліджень був проведений з А р1-42-пептидом і різними ад'ювантами. Далі представлені узагальнені бр результати.

У першому експерименті миші Зм'ізв-УУерзіег, імунізовані підшкірно у сідничну область Ар1-42-пептидом, генерували титри пептид-специфічних антитіл Ідс, ІдсС1 і Ідс2а, демонструючи, що Ар1-42-пептид є життєздатним вакцинним антигеном. Додавання ЗМ-С5Е до 529 ЗЕ і Ар1-42-пептиду приводило до підвищених титрів антитіл Ідс, Ідс1 і доза у сироватці у порівнянні з реципієнтами 529 ЗЕ і Ар1-42-пептиду (див. таблиці б5 3-8). Сироваткові антитіла у індивідуальних мишей, що одержують комбінацію 529 ЗЕ плюс ОМ-С5БЕ, підвищувались у більшому числі випадків і підвищувались швидше, ніж у індивідуальних мишей, що одержують тільки 529 ЗЕ (дані не показані). При повторенні цього першого експерименту з більш старими мишами

Зугізв-УМервіег (у віці 6-8 місяців замість менше З місяців) спостерігали результати, схожі з результатами у таблицях 3-8 (дані не показані).

У другому експерименті мишей Зм/ізз-Уерзієг імунізували підшкірно у сідничну область Ар1-42-пептидом і 529 ЗЕ з кількостями СМ-С5Е, що варіюються. Титри до кінцевих точок збільшувались залежним від дози чином у міру збільшення ЗМ-С5Е (від 0,1 до 1 до 10мкг) (таблиця 9). Титри дО для всіх комбінацій 529 ЗЕ плюс

ОМ-С5Е були більш високими, ніж для груп, що одержують інший ад'ювант, 05-21, один або з ЗМ-С5РЕ. Титри підкласу ЇдДС1 також збільшувались для різних груп 529 ЗЕ плюс ЗМ-С5Е у порівнянні з групою, що одержувала 7/0 529 ЗЕ плюс ЗМ-СЗЕ у першій дозі і тільки 529 ЗЕ у другій дозі (таблиця 10). Титри підкласу Їд02а також збільшувались для різних груп 529 ЗЕ плюс ЗМ-С5Е у порівнянні з групою, що одержувала тільки 529 5Е, залежним від дози чином (таблиця 11).

У третьому експерименті мишей Зм/ізз-Уервзіег імунізували підшкірно у сідничну область Ар1-42-пептидом і 529 ЗЕ з кількостями СМ-С5Е, що варіюються, або без кількостей ЗМ-С5Е, що варіюються. Титри кінцевих точок 75 |до збільшувались для різних груп 529 5Е плюс ЗМ-С5Е (0,5 до 2 до 5 до 10мкгГг), хоча і не в залежності від дози (таблиця 12). Титри підкласів як ІдсС1, так і (д02а також збільшувались для різних груп 529 5Е плюс

ОМ-С5БЕ у порівнянні з групою тільки 529 5Е, хоча і не в залежності від дози (таблиці 13 (Пос11 і 14 Пдсг2а)).

У четвертому експерименті використовували трансгенних мишей, що експресують варіантну форму білка-попередника амілоїду (АРР), що має мутацію при залишку 717, з валіном, заміненим фенілаланіном (49).

Ця мутація пов'язана із сімейною хворобою Альцгеймера у людей. Ці трансгенні миші (названі мишами РОАРР), які прогресуючим чином розвивають багато патологічних ознак хвороби Альцгеймера, у тому числі відкладення Ар, нейритні бляшки і астроцитоз, і, отже, служать як модель тварини для хвороби Альцгеймера людини.

У цьому четвертому експерименті мишей РОАРР імунізували підшкірно Ар1і-42-пептидом з різними с адювантами або без адювантів і при дозах, показаних у таблиці А. Зокрема, миші групи 1 одержували о

Ар1-42-пептид з МРІ тм (Согіха, Натійоп, МТ) у стабільній емульсійній формі (ЗЕ) як позитивний контроль; миші групи 2 одержували Ар1-42-пептид з МРілм ЗЕ плюс мишачий ЗМ-С5Е; миші групи З одержували

Ар1-42-пептид з 529 ЗЕ плюс мишачий СМ-С5ЗЕ; миші групи 4 одержували РВ5 як негативний контроль. Групи 2 і

З виявляли більш швидке збільшення величин титрів анти-Ар1-42-антитіла, а також більш високий максимальний ке, титр, ніж групи 1 або 4. сі

Однак титри в групах 2 і З знижувались до еквівалентного титру позитивних титрів групи 1 у межах 2-3 місяців (Фігура А). Групи 1, 2 і З показали значиме зниження рівнів А Д у головному мозку при вимірюванні за З допомогою ЕГІЗА (таблиці В-С і Фігури В-С), більш низькі амілоїдні навантаження (таблиця О і Фігура 0) і (о) меншу нейритну дистрофію (таблиця Е і Фігура В), у порівнянні з негативними контролями групи 4. Групи 27 і З мали значиме зменшення астроцитозу в порівнянні з позитивними контролями групи 1 (Фігура РЕ). -

Таким чином, ад'ювантні (імуностимулюючі) властивості 529 ЗЕ і ЗМ-С5Е або ІІ -12, очевидно, є синергічними при приготуванні сумісної композиції.

Антигенні композиції даного винаходу модулюють імунну реакцію поліпшенням реакції у вигляді антитіл « дю хребетного хазяїна і клітинно-опосередкованого імунітету після введення антигенної композиції, що містить з вибраний антиген з патогенних вірусу, бактерії, гриба або паразита і ад'ювантну кількість АСР, такого як 529 с (у водній формі або у формі стабільної емульсії), комбінований з цитокіном або лімфокіном, зокрема ЗМ-СЗЕ або :з» І--12. Було показано, що інші цитокіни або лімфокіни мають імуномодулюючу активність, у тому числі, але не тільки, інтерлейкін 1-альфа, 1-бета, 2, 4, 5,6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 і 18, інтерферони-альфа, бета і гама, гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор і фактор некрозу пухлин альфа і бета. - 395 Агоністи або антагоністи визначених цитокінів або лімфокінів також знаходяться в обсязі даного винаходу.

У застосуванні тут термін "агоніст означає молекулу, що підсилює активність зазначених цитокінів або (Се) лімфокінів або функціонує таким же чином, як зазначені цитокіни або лімфокіни. Прикладом такого агоністу є 1» міметик зазначених цитокінів або лімфокінів. У застосуванні тут термін "антагоніст означає молекулу, яка інгібує або запобігає активності зазначених цитокінів або лімфокінів. Прикладами таких антагоністів є ко 50 розчинний рецептор ІІ -4 і розчинний рецептор ТМЕ.

Ф У застосуванні тут термін "ефективна ад'ювантна (імуностимулююча) кількість" означає дозу комбінації описаних тут ад'ювантів, яка придатна для індукції збільшеної імунної реакції на вибраний антиген у хребетного хазяїна, у порівнянні з хазяїном, що одержує цей вибраний антиген під час відсутності цієї комбінації ад'ювантів. Конкретна доза буде залежати частково від віку, ваги і медичного стану хазяїна, а також від способу введення і конкретного антигену. У кращому варіанті ця комбінація ад'ювантів буде

ГФ) використовувати 529 у діапазоні 0,1-50Омкг на дозу; у більш кращому варіанті використовують діапазон 1-100мкг 7 на дозу. Придатні дози легко визначаються особами з кваліфікацією у даній області. Антигенні композиції даного винаходу можуть бути також змішані з імунологічно прийнятними розріджувачами або носіями загальноприйнятим чином для приготування ін'єкційних рідких або розчинів суспензій. 60 Антигенні або імуногенні композиції даного винаходу вводять людині або хребетному, що не є людиною, різними шляхами, у тому числі, але не тільки, інтраназальним, пероральним, вагінальним, ректальним, парентеральним, інтрадермальним, трансдермальним |див., наприклад, Міжнародну заявку МУМО 98/20734, що включена як посилання), внутрішньом'язовим, внутрішньоочеревинним, підшкірним, внутрішньовенним і внутрішньоартеріальним шляхом. Кількість антигенного компонента або компонентів антигенної композиції буде бо варіюватись в залежності від конкретного антигену, а також від віку, ваги і медичного стану хазяїна, а також від способу введення. Знову, відповідні дози легсо визначаються особами з кваліфікацією у даній області.

Переважно, хоча і необов'язково, антиген і комбінацію ад'ювантів вводять одночасно. Число доз і схема введення доз для антигенної композиції також легко визначаються особами з кваліфікацією у даній області. У деяких випадках ад'ювантні властивості комбінації ад'ювантів можуть зменшувати число необхідних доз або часовий хід схеми прийому лікарського засобу.

Комбінації ад'ювантів даного винаходу придатні для застосування в антигенних або імуногенних композиціях, що містять велику різноманітність антигенів з великого кола патогенних мікроорганізмів, у тому числі, але не тільки, антигенів з вірусів, бактерій, грибів або паразитичних мікроорганізмів, що інфікують людей і 70 хребетних тварин, що не є людиною, або антигенів з ракової клітини або нухлинної клітини. Антиген може містити пептиди або поліпептиди, одержані з білків, а також фрагменти кожного з наступних компонентів: сахаридів, білків, полі- або олігонуклеотидів, ракових або пухлинних клітин, алергенів, аутологічних молекул (таких як білок-попередник амілоїду) або інших макромолекулярних компонентів. У деяких випадках в антигенну композицію може бути включена більша кількість антигенів, ніж один антиген.

Бажані вірусні імуногенні композиції, що містять комбінації ад'ювантів даного винаходу, містять у собі композиції, спрямовані на попередження та/або лікування захворювання, яке викликається, без обмеження, вірусом імунодефіциту людини, вірусом імунодефіциту мавп, респіраторно-синцитіальним вірусом, вірусом парагрипу типів 1-3, вірусом грипу, вірусом простого герпесу, цитомегаловірусом людини, вірусом гепатиту А, вірусом гепатиту В, вірусом гепатиту С, папіломавірусом людини, поліовірусом, ротавірусом, каліцивірусами,

Вірусом кору, вірусом паротиту, вірусом коревої краснухи, аденовірусом, вірусом сказу, вірусом чуми собачих, вірусом чуми великої рогатої худоби, метапневмовірусом людини, пневмовірусом птахів (раніше названим вірусом ринотрахеїту індичок), Хендравірусом, Ніпавірусом, коронавірусом, парвовірусом, вірусами інфекційного ринотрахеїту, вірусом котячого лейкозу, вірусом інфекційного котячого перитоніту, вірусом інфекційного бурсального захворювання птахів, вірусом Ньюкаслської хвороби птахів, вірусом хвороби Марека, вірусом сч респіраторного і репродуктивного синдрому свиней, вірусом кінського артеріїту і різними вірусами енцефаліту.

Бажані бактеріальні імуногенні композиції, що містять комбінації ад'ювантів даного винаходу, містять у і) собі композиції, спрямовані на попередження та/або лікування захворювання, яке викликається, без обмеження,

Наеторийиз іпїйцеплае (як типовим, так і нетиповим), Наеторпйи5 вотпив, Могахейа сайагтпнаїв,

Зігеріососсивз рпецтопіає, Зігеріососсив руодепе5, Зігеріососсиз ада|асіаеє, Зперіососсив Таесаїів, «о зо Неїїсорасієг руог, Меївзепа тепіпуйідів, Меївзепа допогппоеае, Спіатудіа іаспотайв, Спіатуаїа рпештопіае, СПіатуадіа рвзіцасі, Вогдефейа репивзвів, АППоіїососсив оїйайів, ЗаіІтопейПйа (урпі, ЗаїІтопегІа с їурпітигішт, ЗаітопеПйа споіегаезиіз, ЕвсПпегіспіа соїї, ЗПідеМйа, Міргіо сПпоІегае, Согуперасіегіт «Е дірпіпегіае, Мусобрасіегішт (шбрегсціовії, Мусорасіегішт амішт-Мусобрасіегішт ізігасейшШіаге сотріех, Ргойеив тігарійїв, Ргоївиз мцідагів, З(арпуососсив ацгеи5, е(арпуіососсив ерідегтідів, Сіовігідіпт ейапі, Ме

Зв Геріозріга іпіегодап5, Воітейа ригодопегі, Равіецгейа Наетоїуйса, Разіеигейа тиосіда, АсНпорасіїй5 р ріеигорпештопіае і Мусоріазта даїзеріісит.

Бажані імуногенні композиції проти грибкових патогенів, що містять комбінації ад'ювантів даного винаходу, містять у собі композиції, спрямовані на попередження та/або лікування захворювання, яке викликається, без обмеження, Азрегойив5, Віазіотусез, Сапаїда, Соссідіодез, Сгуріососсиз і Нізіоріазта. «

Бажані імуногенні композиції проти паразитів, що містять комбінації ад'ювантів даного винаходу, містять у з с собі композиції, спрямовані на попередження та/або лікування захворювання, яке викликається, без обмеження,

І еевптапіа тайог, Авсагів, Тгіспигів, Сіагаіа, Зспівіозота, Стгуріозрогідійт, Тгіспотопавз, Тохоріазта допаії і ;» Рпеиштосувіїв сагіпії.

Бажані імуногенні композиції для індукування терапевтичного або профілактичного антиракового ефекту у хребетного хазяїна, що містять комбінації ад'ювантів даного винаходу, містять у собі композиції, що -І використовують раковий антиген або пов'язаний з пухлиною антиген, у тому числі, без обмеження, специфічний для передміхурової залози антиген, карцино-ембріональний антиген, МОС-1, Нег2, СА-125 і МАСЕ-3. і, Бажані імуногенні композиції для ослаблення реакцій на алергени у хребетному хазяїні, що містять їх комбінації ад'ювантів даного винаходу, містять у собі композиції, які містять алерген або його фрагмент.

Приклади таких алергенів описані у |(Патенті Сполучених Штатів Мо5830877 (51) і опублікованій Міжнародній о патентній заявці Мо МУО99/51259 |52)|, що включені тим самим як посилання), і містять у собі пилок, отрути

Ф комах, лупу тварин, спори грибів і лікарські засоби (такі як пеніцилін). Ці імуногенні композиції перешкоджають продукуванню ІдЕ-антитіл, відомої причини алергійних реакцій.

Бажані імуногенні композиції для ослаблення реакцій на аутологічні молекули у хребетного хазяїна, що дв Містять комбінації ад'ювантів даного винаходу, містять у собі композиції, що містять аутологічну молекулу або її фрагмент. Приклади таких аутологічних молекул, крім Ар1-42-пептиду, описаного вище, містять у собі іФ) інсулін з Д-ланцюгом, що бере участь у діабеті, молекулу 517, що бере участь у такому захворюванні, як ко гастроезофагеальний рефлюкс, і антигени, що негативно регулюють (знижують) аутоімунні реакції при захворюваннях, таких як множинний склероз, системний червоний вовчак і ревматоїдний артрит. 60 У випадку ВІЛ і 5ІМ (вірусу імунодефіциту мавп) ці антигенні композиції містять, щонайменше, один білок, поліпептид, пептид або фрагмент, одержані із зазначеного білка. У деяких випадках в антигенну композицію включені множинні білки, поліпептиди, пептиди та/або фрагменти ВІЛ або ІМ.

Комбіновані форми ад'ювантів даного винаходу придатні також для включення ад'юванта у полінуклеотидні імуногенні композиції (також відомі як імуногенні композиції ДНК). Такі імуногенні композиції можуть 65 додатково містити допоміжні агенти, такі як бупівікаїн |див. Патент США Мо5593972 |53), який включений як посилання).

Для кращого розуміння даного винаходу представлені наступні приклади. Ці приклади наведені тільки з метою ілюстрації і не повинні розглядатись як такі, що обмежують об'єм даного винаходу.

Приклади

Приклад 1

Матеріали і способи

Наступні матеріали і способи використовували в експериментах, повідомлених у прикладах 2-7 нижче.

Тварини

Самок мишей Ваїр/с у віці 7-9 тижнів придбавали у ТаїЇсопіс Рагт»в, Іпс. (Сегтапіомп, МУ). Самок мишей 7/0 Зжізв-УМерзіег у віці 7-9 тижнів також придбавали у ТаїЇсопіс Рагтв, Іпс. Всіх мишей утримували в обладнанні, схваленому Американською Асоціацією осіб з догляду за лабораторними тваринами. Мишей акліматизували до обладнання для їх утримування протягом одного тижня перед початком досліджень.

Антигени

В експериментах із ВІЛ у прикладах 2-3 нижче використовували два різних синтетичних пептиди. 7/5 Послідовність мультиепітопного пептиду НІМ-1-му ТІЗРТОММА) (-Суз) (також названого тут ММ-10) є наступною:

Бе щЩь їв жі зЗль ний ще бів ід тка лу зна зи Ши ук хід іш щу ще ль тує зад зл м жує жту ї3о жін

Шо у ль ж Кок лів Я Жук Чи и йше а ж з ШЖнале

Цей пептид був описаний раніше |33, 34) і містить послідовності з др120уму ВІЛ-1, які індукують СО4 7

Тр-клітинні реакції як у мишей, так і у людей, головну нейтралізуючу детермінанту і сайт, який упізнається СО8"

СТІ у мишей Ваїр/с. Цей пептид був наданий доктором К. Зсеагсе |бике Опімегайу, бигпат, МС). Для аналізу

СТІ. з метою порівняння використовували сторонній пептид, названий ШВ. Цей пептид відповідав епітопу СТІ. у с 22 УЗ-петлі Нім-1-у6 (Агу Сіу Рго Сіу Агд АіІа Рпе Ма! Тиг Пе (ЗЕСО І МО:8)), і був придбаний у Сепозуз (3

Віоїесппоодієз Іпс. |Пне УуУоодіапаз, ТХ). Пептиди солюбілізували у стерильній воді і розбавляли у придатних буферах або культуральному середовищі для клітин перед використанням.

В експериментах з амілоїдом прикладів 4-6 і 8 нижче використовували пептид, названий Ар1-42. зо Послідовність Ар 1-42 є наступною: і-й мир мів тіл. Ши же Ябо люр чи ЯБу бух ім чаї шія щін сч

Міль три їли кі ші Я Кіа йза АЩЬ кі ж ож вла Бе З віх ла ма Ті Шу їла о унії бу від ка а їв вів Ф з5 Ка ть ший, ї-

Цей пептид був описаний раніше (47) і відповідає внутрішньому фрагменту з 42 амінокислот білка-попередника амілоїду. Ар1-42 одержували від ЕІап РНаптасеціїсаіз |Зошй Зап Егапсізсо, СА). Пептид солюбілізували у стерильній воді і розбавляли у придатних буферах або культуральному середовищі для клітин « перед використанням. З

Ад'юванти с Всі препарати ад'ювантів, які містять 529, одержували від Согіха |Натійоп, МТ). 529 5Е готували у з» вигляді попередньої емульсії типу "масло у воді" (0,8-2,595 масло) на основі сквалену, що має концентрації 529 у діапазоні 0-5Омкг/мл. Фосфат алюмінію готували у власній лабораторії. Повний ад'ювант Фрейнда (СЕА) і неповний ад'ювант Фрейнда (ІГА) придбавали у Оіїсо І арогайюгієез, Оеїгоїї, МІ. Пептиди ТІ5РІОММА) і ад'юванти

Фрейнда емульгували у співвідношенні 1:1 з використанням двох спарених шприців. Рекомбінантно 7 експресований мишачий І/-12 одержували від Сепеїйісз Іпзійше (|Сатрбгідде, МА). Рекомбінантний мишачий (се) ОМ-С5Е придбавали у Віозошгсе Іпіегпайіпа! |Сатагійо, СА) у вигляді ліофілізованого порошку без носія.

Стимулонтм 5-21 придбавали у Апіідепісз Іпс. |гатіпоапат, МА). т Імунізації ко 20 Мишей імунізували підшкірно у сідничну область у загальному обсязі О0,2мл, порівну розділеному на кожну сторону сідничної області. Імунізації виконували при різних тимчасових інтервалах, зазначених нижче. Антиген с і цитокіни розбавляли у забуференому фосфатом сольовому розчині до придатних концентрацій і готували з ад'ювантами менше ніж за 16 годин перед імунізацією, у стерильних умовах. Імуногенні композиції змішували обережним струшуванням і зберігали при 4 9С. Ці форми перемішували вертексом безпосередньо перед імунізацією.

ГФ) Аналіз сироватки з використанням твердофазного імуноферментного аналізу 7 У тварин брали кров перед початковою імунізацією і у зазначених тимчасових точках. Аналіз сироватки був представлений у вигляді середнього геометричного окремих титрів. Для аналізу специфічного для пептиду ВІЛ антитіла і розподілу підкласів пептид суспендували або у карбонатному буфері (15ММ Ма»СО», З5мММ Мансо», бо р 9,6), або у РВ5, при концентрації мкг/мл і вміщували у 96-ямкові мікротитраційні планшети (Мипс) в обсязі 100:1. Після інкубування протягом ночі при 37 «С планшети промивали і блокували (0,195 желатин/РВ5) при кімнатній температурі протягом 2-4 годин. Планшети ЕГІЗА промивали промивним буфером (РВ5, 0,190

Твінтм20) перед додаванням серійно розведеної сироватки (РВ5, 0,195 желатин, 0,0595 Твін тм20, 0,0295 азид 65 натрію). Після 4-годинного інкубування ямки промивали і придатні розведення біотинільованих антиізотип/підкласів-антитіл додавали для інкубування при 42С протягом ночі. Ямки промивали та інкубували з кон'югованою зі стрептавідином пероксидазою хріну. Після інкубування ямки промивали і виявляли АВТ. Ямки зчитували при 405нм. Титри стандартизували з використанням контрольних сироваток.

Той же самий протокол використовували для аналізу А р1-42-пептид-специфічних антитіл і розподілу підкласів, за винятком того, що використовували концентрацію 0,Змкг/мл на мікротитраційний планшет.

Одержання клітин

Для аналізів проліферації і аналізу цитокінів іп міго одержували клітини селезінки мишей у зазначених часових точках. Суспензії окремих клітин одержували з пулів від 3-5 мишей. Для аналізу проліферації і цитокінів клітини суспендували в круглодонних 9б-ямкових культуральних планшетах, попередньо покритих 7/0 протягом ночі пептидньіми антигенами ВІЛ, контрольними білками або тільки середовищем КРМІ-10. Клітини селезінки додавали при 5х10? клітин на ямку з використанням культурального середовища, що має 2х добавки.

Клітинні культуральні супернатанти збирали з ямок у трьох повторностях для аналізу цитокінів після трьох або шести днів після початку культивування. Відразу після збирання супернатантів культури короткочасно обробляли ЗН-тимідином протягом 18-24 годин і збирали для кількісного визначення проліферації клітин.

Приклад 2

Реципрокні титри кінцевих точок анти- ТІЗРТІОММА) (-Сув)-ІдДО для загальних дос і підкласів

Реципрокні титри кінцевих точок підкласів Ід вимірювали з об'єднаної сироватки (п-5 Ваїр/с) через п'ять тижнів після початкової імунізації, через два тижні після вторинної імунізації. Мишей імунізували підшкірно у сідничну область 25мкг Т1ЗРІОММ(А) (-Сув) з використанням у цілому 0,2мл, розділених порівну на дві

О/Ммл-ин'єкції на кожній стороні при тижні 0 і тижні 3. 529 5Е розбавляли для одержання емульсії, що містить 12590 скваленове масло і 25мкг 529 на дозу. БЕ є емульсією-носієм типу масло у воді, що складається зі сквалену, гліцерину і емультуючого агента. Рекомбінантний мишачий 1-12 надавали у кількості 4Онг на мишу.

Рекомбінантний мишачий ЗМ-С5ЗЕ вводили при 25мкг на мишу. Результати наведені у таблиці 1 із середніми геометричними титрами плюс стандартні помилки для кожної групи. с о 1111 пюриннввихтюю 0

Ф зо сч -

Приклад З Ф

Аналіз СТІ у мишей Ваїр/с в.

Для імунізації мишей використовували протоколи прикладу 2. Оцінювали СТІ -активність клітин селезінки, виділених з мишей через 14 днів після вторинної імунізації. 529 5Е готували з 25мкг 529 ЗЕ, що містять 1,2590 масло з 10мкг ЗМ-С5Е або 40Онг ІІ -12 або без них, плюс 25мкг ТІЗРІОММА) (-Суз). «

Для аналізу СТІ. клітини селезінки витягали з імунізованих мишей через 14 днів після вторинної імунізації.

Використовували власне кажучи раніше описаний протокол. Коротко, поєднували клітини селезінок, що не о, с містять еритроцити, із трьох мишей на групу. Ефекторні клітини селезінки (4х105 на мл) повторно стимулювали у "» 24-ямкових культуральних планшетах в обсязі 1,5-2мл протягом семи днів з 1їмкг/мл або пептиду "ММ-10", або " 10-мірного пептиду епітопу СТІ. "ПІВ" або без пептиду НІМ. Обидва епітопи СТІ були обмежені Н-209, Культури доповнювали 10Е/мл рекомбінантного мишачого 1-2 (Віозоигсе) протягом останніх п'яти днів культивування. Для 45 . . с. . Бі. - аналізу цитотоксичної активності клітини Р815 мітили Сг" ії короткочасно обробляли 5мкг/мл пептиду (ПІВ або

МІМ-10) протягом чотирьох годин і додавали до культивованих ефекторних клітин селезінки. Якщо не (Се) використовували пептид НІМ, то серію клітин-мішеней не піддавали цій короткочасній обробці. Використовували 1» триразові розведення відношень ефекторних клітин до клітин мішеней ("Е:Т") 30:1-1,1:1. Процент СТІ -активності розраховували у вигляді проценту вивільнення хрому з використанням рівняння ((специфічне вивільнення ко 50 хрому-спонтанне вивільнення хрому)(максимальне вивільнення хрому-спонтанне вивільнення хрому))"100.

Ф Вивільнення хрому оцінювали після б-годинного періоду інкубації. Середнє спонтанне вивільнення хрому завжди було менше 1595 від максимального вивільнення. Результати даних із дня 28 показані у таблиці 2. зв о 0 пенидмноо | пеляднв | Безпеляду З ю яв новою 48 в в врв 259 во 141 м 012 1312 3 б5 Приклад 4

Реципрокні титри кінцевих точок анти-Ар 1-42-Ідо для загальних Ідс і підкласів

Одержаних аутбрідингом мишей Зм/ізв-УУервіег поділяли на групи по 10 мишей кожна. Кожна група одержувала ЗОмкг Ар1-42-пептиду, що відповідає внутрішньому району АРР із довжиною 42 амінокислоти.

Перша група не одержувала ад'юванта; друга група одержувала 5Омкг 529 ЗЕ, що містить 2,595 масла; третя група одержувала 50мкг 529 ЗЕ, що містить 2,596 масла плюс 1Омкг зМ-СЗЕ; четверта група одержувала 10мкг

ОМ-С5Е; п'ята група одержувала ЗЕ, що містить 1,2595 масла; шоста група одержувала ЗЕ, що містить 1,2590 масла плюс 1Омкг ЗМ-С5Е; сьома група одержувала 5Омкг 05-21. Мишей імунізували підшкірно у сідничну область загальним обсягом 0,2мл, розділеним порівну в кожну з двох ділянок у основи хвоста/сідничної області.

Імунізації виконували при тижні 0 і тижні 3. 70 У мишей брали кров у дні 0, 20, 35 і 70. Сироватку аналізували з окремих мишей. Реципрокні титри кінцевих точок анти-Ар1-42-пептид-дДО для загальних дб і підкласів вимірювали в окремих сироватках (п-10

Змізз-УУерзієег) на тижні 5 і на тижні 10. Результати до кінцевих точок наведені у таблицях З (тиждень 5) і 4 (тиждень 10). Результати підкласу Ідо1 наведені у таблицях 5 (тиждень 5; групи, що не одержують ад'юванта або 05-21, не вимірювали) і 6 (тиждень 10). Результати для підкласу Ідо2а наведені у таблицях 7 (тиждень 5; 75 групи, що не одержують ад'юванта або 05-21, не вимірювали) і 8 (тиждень 10). о сч 2 о

Ф зо сч з

Ф з щ « ші що г» з -

Ф ь г) 50

Ф з о вювєвю 00010099 й ? шини бо Титри кінцевих точок анти-Ар1-42-ІдО тижня 5 о і ю

Приклад 5

Реципрокні титри кінцевих точок анти-Ар1-42-ІДО для загальних Ідс і підкласів з кількостями ЗМ-СЗЕ, що варіюються

Одержаних аутбрідингом мишей Зівв-Уерзіег поділяли на групи по 10 мишей кожна. Кожна група см одержувала ЗОмкг Ар 1-42-пептиду при тижнях 0 і 3. Перша група одержувала 25мкг 529 ЗЕ плюс 10мкг ЗМ-СЗЕ; (о) друга група одержувала 25мкг 529 5Е плюс мкг СМ-С5Е; третя група одержувала 25мкг 529 ЗЕ плюс 0,Тмкг

ОМ-С5Е; четверта група одержувала 25мкг 529 ЗЕ плюс 10мкг ЗМ-С5Е у примуючій дозі і потім 25мкг тільки 529

ЗЕ у другій дозі; п'ята група одержувала 25мкг 05-21; шоста група одержувала 25мкг 25-21 плюс 10мкг ЗМ-С5БЕ. с

Мишей імунізували підшкірно у сідничну область загальним обсягом 0,2мл, розділеним порівну в кожну з двох ділянок у основи хвоста/сідничної області. с

У мишей брали кров у дні 0, 21 і 42. Реципрокні титри кінцевих точок анти-Ар1-42-пептид-ЇдДС для загальних «

Ід9о і підкласів вимірювали в окремих сироватках (п-10) на тижні 6. Результати дО кінцевих точок наведені у таблиці 9. Результати підкласу Ідс1 наведені у таблиці 10. Результати підкласу Ідс2а наведені у таблиці 11. (22) з й, ч о з с 5 : 7 Перед оо Ето о додало тльи ово - і " Перша доза 529 ЗЕ (25)45М-ОЗЕ (10); друга доза тільки 529 ЗЕ (25). се) г я іме) ! но -

Ф з о іме) 60 вв 529 ЗЕ (2534ОМ-С8Е (1) 116222 143140

" Перед оо Ето о додало тльи ово " Перша доза 529 ЗЕ (25)-М-СОЗЕ (10); друга доза тільки 529 ЗЕ (25).

Приклад 6

Реципрокні титри кінцевих точок анти-Ар1-42-ІдО для загальних дос і підкласів з кількостями СМ-СЗЕ, що 70 варіюються

Одержаних аутбрідингом мишей Зм/ізв-УУервіег поділяли на групи по 10 мишей кожна. Кожна група одержувала ЗОмкг Ар1-42-пептиду на тижнях 0 і 3. При імунізації на тижні 0 перша група одержувала 5О0мкг 529

ЗЕ; друга група одержувала 5Омкг 529 ЗЕ плюс 1Омкг ЗМ-СЗЕ; третя група одержувала 5Омкг 529 5Е плюс 5мМкг

ОМ-С5Е; четверта група одержувала 5Омкг 529 ЗЕ плюс 2мкг ЗМ-С5Е; п'ята група одержувала 5Омкг 529 5Е у5 плюс О,5мкг М-СЗЕ; шоста група одержувала 1905 5Е. При імунізації на тижні З перша-п'ята групи одержували ту ж саму дозу, що і при імунізації на тижні 0, за винятком того, що 529 ЗЕ була зменшена з 50 до 25мкг.

Кількість ЗЕ, одержувану шостою групою, збільшували з 195 при імунізації на тижні 0 до 1,295 при імунізації на тижні 3. Мишей імунізували підшкірно у сідничну область загальним об'ємом 0,2мл, розділеним порівну у кожну із двох ділянок у основи хвоста/сідничної області.

У мишей брали кров у дні 2, 20 і 35. Реципрокні титри кінцевих точок анти-Ар1-42-пептид-ЇДО для загальних

ІдОо і підкласів вимірювали в окремих сироватках (п-10) при тижні 5. Результати дос кінцевих точок наведені у таблиці 12. Результати підкласу ІдС1 наведені у таблиці 13. Результати підкласу ІдДо2а наведені у таблиці 14. сч зв о

Ф

» сч ч

Ф і - « щ З с г» 4 -І

Ф в й м

Ф зв о іме) Приклад 7

Імунізація ТА-СТІ - і С4-МЗ-пептидом макак-резус 60 Наступний експеримент спланований для прямого порівняння кількості комбінованих форм пептидів і ад'ювантов у приматів (макак-резус) для ідентифікації потенційних комбінацій пептид/ад'ювант для переходу до клінічних дослідів на людині. Конкретно, форму 529 5Е, що містить ад'ювант, оцінювали у порівнянні з неповним ад'вантом Фрейнда (ІРА) у комбінацій з (1) пептидним кон'югатом, виробленим з 5ІМ-епм Т-хелпер/Зім дад СТІ. (511-рііс), що має наступну послідовність: б5 зво бів іо Ті йла тах ху жів зда жа у

Жит ім і чук Биль Ші іде був Ж и ие й ацер тіа й в в Ілка (ЩО хо Ж): або пептидним кон'югатом С4-МУ3, виробленим із ВІЛ-1 (С4-МЗдо бр), що має наступну послідовність:

Ше Чі ль Хе див Ша Якр а бів тві ку ло За Аз Мой Яут ів іт лу ка ша даю Ай

Чх Шу бл іш іль ис ід Бір Яге Щіж жу

Біл ть Яух вів ке йшж СК їв жна).

Побудова дослідження: 19 Для цього дослідження використовували всього 8 тварин, 4 Мати-А"О1-- і 4 Мати-А"01-, як описано у таблиці 15. юю с 2 юю о юю

Тварини групи 1 одержували О0,5мл Тп-СТІ - пептиду (1,Омг/мл) в емульсії типу вода у маслі з 0,5мл ІРА у ее, 30 загальному об'ємі 1,0мл. Тварини групи 2 одержували О,5мл 5Т1-р11С (1,Омг/мл), об'єднані з 240мкг ЗМ-СЗЕ су людини, 5Омкг 529 ЗЕ з кінцевою концентрацією масла 195 у загальному об'ємі 1,0мл. Тварини групи З одержували О,5мл пептиду С4-МЗдовр (2,О0мг/мл) в емульсії вода у маслі з О,5мл ІРА, кінцевий об'єм 1,Омл. -

Нарешті, тварини групи 4 одержували 0,5мл пептиду С4-МЗвоР (2,0мг/мл), об'єднані з 250мкг ЗМ-СЗЕ людини, Фу 5Омкг 529 ЗЕ з кінцевою концентрацією масла 195 у загальному об'ємі 1,Омл. 3о Усіх тварин імунізували внутрішньом'язовою ін'єкцією зі схемою введення на 0, 4 і 8 тижнях. Проби в периферичної крові брали безпосередньо перед тижнями 1 або 2 після кожної імунізації для моніторингу індукції

СТІ. за фарбуванням тетрамеру, р11сС (Суз Тиг Рго Туг Азр Пе Авп сіп Меї; ЗЕО ІЮО МО:3, амінокислоти 19-27), специфічним реакціям ЕГІБРОТ і СТІ -реакціям загальної маси культури (Групи 1 і 2), а також за реакціями « пептид-специфічних антитіл (Групи 1-4). 50 Безпека і переносимість З с ЗТ1-Р11СЯЕА: Форма 51Т1-р11С-ІЕА, яку вводили внутрішньом'язовою ін'єкцією в одному місці три рази з» тваринам групи 1, була пов'язана з істотною реактивністю місця ін'єкції. У однієї тварини (93х021) розвився абсцес розміром 1,5см у місці ін'єкції через два тижні після другої імунізації. У іншої тварини (95х009) також розвився абсцес розміром 2,0см у місці ін'єкції через два тижні після третьої імунізації, що прорвався 45 через шкіру і зажадав накладення пов'язки. 7 ЗТ1-р110-529 5Е/6М-С5Е: Форма 511-р110-529 5БЕ/ЛЗМ-С5Е, яку вводили внутрішньом'язовою ін'єкцією в (се) одному місці три рази у тварин групи 2, була пов'язана з мінорними несприятливими ефектами. Обидві тварини групи 2 мали блювоту незабаром після одержання третьої імунізації при тижні 8. Інші несприятливі ефекти не ве спостерігались. ка 20 Са4а-МЗво бр ІЕА: Форма С4-МЗво брІЕА, що вводили внутрішньом'язовою ін'єкцією в одному місці три рази тваринам групи 3, була пов'язана з істотною реактивністю місця ін'єкції. У однієї тварини (98п013) розвився що абсцес розміром 1,0см у місці ін'єкції через один тиждень після другої імунізації. У іншої тварини (98п007) також розвився абсцес розміром 1,5см у місці ін'єкції Через один тиждень після другої імунізації. Цей абсцес у тварини зажадав дренування і накладання пов'язки через чотири тижні.

СА-МЗво вер 7529 ЗЕ/6М-СЗЕ:

ГФ) Форма С4-МЗдобРн529 5Е/ЗМ-СЗЕ, що вводили внутрішньом'язовою ін'єкцією в одному місці три рази тваринам групи 4, була зв'язана тільки з одним мінорним несприятливим ефектом. Одна з тварин групи 4 о (95х011) мала блювоту незабаром після одержання третьої імунізації на тижні 8. Інші несприятливі ефекти не спостерігались. бо У всіх тварин групи 1 і групи З, в яких тварини одержували ІРА як ад'ювант, спостерігали істотні реактивності місць ін'єкції. Ці результати вказують на те, що 0,5мл ІРА погано переносяться при введенні внутрішньом'язовою ін'єкцією в одному місці ін'єкції. Слід також зазначити, що З з 4 тварин, що одержували 529 5БЕЛЗМ-СЗЕ як ад'ювант, мали блювоту на тижні 8 незабаром після імунізації. Хоча відомо, що анестетик (кетамін) пов'язаний із блювотою, не було документовано жодного випадку блювоти тварин протягом ходу цього бо дослідження. У той же час, існує недостатньо доказів, щоб зв'язувати блювоту тварин з якими-небудь шкідливими ефектами, пов'язаними з 529 5Е/ЗМ-С5Е.

Результати: Індукція клітинних імунних реакцій (Групи 1 і 2)

Фарбування р11С-тетрамеру свіжовиділеної крові:

Перед імунізацією і через один і два тижні після імунізації свіховидідену периферичну кров від усіх

Мати-А"01-позитивних тварин (Групи 1 і 2) піддавали скринінгу на присутність р'1С-специфічних СОЗ'СОВ8"

Т-лімфоцитів за допомогою фарбування розчинного тетрамеру МНС Класу І. Як показано у таблиці 16, тільки у однієї тварини (93х021), серед тих, які одержували ЗТ1-р11С-петид у комбінації з ІЕЄА, виявлена наявність індукованих імунізацією клітинних імунних реакцій у нестимульованій периферичній крові.

Таблиця 16

Процентне фарбування р11сС-тетрамеру і р11С-специфічніреакції ЕГІЗРОТ у свіжовиділеній периферичній крові

Тиждень ПРО Тиждень 5 Тиждень 6

Перед імунізацією 1 тиждень після 2-ої імунізації 2 тижня після 2-ої імунізації

Тварина/група Форма Фарбування | ЕІ ІЗРОТ |Фарбування тетрамеру ЕГІЗРОТ Фарбування | ІЗРОТ Число 5ЕС на 106 тетрамеру Число ЗЕС (свіжої крові Число ЗЕСтетрамеру (клітин свіжої кровіг | на 106 на 106 свіжої крові клітин клітин 93х021 (1) ЗТ1-р11 СЕ 0,02 Немає 0,15 5б,3 012 21,9 даних 98п002 (2) |8Т1-р11С529 0,05 0,01 6,3

ЗЕ/СМ-С5Е 98п002 (2) |8Т1-р11С529 0,05 0,04 15,0 0,01 9А

ЗЕ/СМ-СВЕ с 5 000000000000007770000077000000777777777000700700070070700202020202020020о

Тиждень 8 Тиждень 9 Тиждень 10 4 тижні після 2-ої імунізації) 1 тиждень після 3-ої імунізації 2 тижні після З-ої імунізації

Тварина Форма Свіжа кров ЕІЗРОТ Свіжа ЕСІЗРОТ Свіжа кров ЕСІЗРОТ кров Ге) зо 9БХО0О (1) ЗТ1-р11 СЕ Немає 0,01 2,5 0,02 1,9 даних се 93х021 (1) ЗТ1-Р11СНЕА 0,02 Немає 0,14 Немає даних 0,02 Немає даних даних « 98п002 (2) ЗТ1-р11С-529 Немає Немає даних 3,8 Ге»)

ЗЕ/СМ-С5Е даних 98т002 (2) 8тТ1-р11С529 0,02 Немає 0,02 |Немає даних -

ЗЕ/СМ-С5Е даних

Наведені у вигляді проценту СОЗ"СО87 Т-лімфоцитів свіжовиділеної крові, що зафарбовуються позитивно р11С-тетрамером; МО, не виконували. « с. - , и, нщ ! с -

Р11С-специфічні реакції ЕГІБРОТ: для додаткової оцінки індукції клітинних імунних реакцій у тварин Групи с 1 ї 2 лімфоцити свіжовиділеної периферичної крові піддавали скринінгу на присутність р11С-специфічних :з» со3"с087 Т-лімфоцитів за допомогою аналізу ЕІ ІЗРОТ. Як показано у таблиці 16, тільки тварина 93х021, що продемонструвала детектовані рівні рНО-специфічних СО8" Т-лімфоцитів відповідно до аналізу тетрамеру свіжовиділеної крові, мала детектовані р11С-специфічні со8" Т-лімфоцити відповідно до аналізу ЕПІЗРОТ. У -І кожному випадку, позитивна реакція, визначена аналізом р11С-тетрамеру, підтверджувалась позитивною р11С-специфічною реакцією ЕГІ5РОТ. ее, р11С-специфічні клітинні імунні реакції після стимуляції пептидом рі11С іп міго: У спробі збільшення ї» числа р11С-специфічних клітин перед аналізом свіжовиділені лімфоцити периферичної крові стимулювали іп 5ор Мйго пептидом р11сС і гп--2. Через 14 днів одержані ефекторні клітини піддавали скринінгу на зв'язування о р11С-тетрамеру, а також на р11С-специфічну літичну активність у стандартному аналізі СТІ з вивільненням

Ф хрому. Результати аналізу р11С-тетрамеру і функціональних аналізів СТІ. показані у таблиці 17. Тварина 93х021, що постійно виявляла р11С-специфічні імунні реакції у свіжовиділених лімфоцитах, продемонструвала дуже високий рівень зв'язування тетрамеру і функціональної активності СТІ через один тиждень після другої імунізації. Це свідчило про індукцію дуже ефективної р11С-специфічної клітинної імунної реакції. На противагу результатам, що спостерігаються у свіжовиділених лімфоцитах, одна тварина з групи 2 (98п008), 5Т11-р11С0-529 (Ф, ЗЕ/ЗМ-С5Е) почала виявляти доказ р111С-специфічних клітинних імунних реакцій через два тижні після другої ко імунізації. Однак р11С-специфічна імунна реакція, що спостерігається у тварини групи 2, була значно більш низького розміру, ніж реакція, що спостерігається у цієї відповідаючої тварини з групи 1. 60

Таблиця 17

Процентне фарбування р11сС-тетрамеру і функціональні р11С-специфічні СТІ -реакції після стимуляції пептидом р11сС іп міго

Тиждень 0 Тиждень 5 Тиждень б

Перед імунізацією 1 тиждень після 2-ої імунізації 2 тижні після 2-ої імунізації бо Тварина/група Форма Фарбування СТІ 20:11 Есть Фарбування сті 201 Фарбування | СТІ 201 тетрамеру З тетрамеру ЕТ тетрамеру ЕТ ее ре ре ру рр даних взюгти) овТлРисЕА 005000000000з000663 вив 0265 98п002 (2) ЗТ1-р11С-529 0,21 немає даних немає 0,73 немає

ХІН и НІ ННЯ ПОН нан мВ ПОН ее ши б шо о

ЗЕ/СМ-С5Е даних даних ннншнШжжяаяЮШЄшдЛлВИІОООООЛЛЛЛВЛВВВВВВВВ 05 Канни КЕнтсння Кднннння 706 4 тижні після 2-ої імунізації 1 тиждень після 3-ої імунізації 2 тижні після З-ої імунізації тетрамеру ЕТ ЕТ тетрамеру ЕТ ва ібн восінннй ВИ НННОЬННИ ШОБИ НИКИ ПВ даних : даних даних пос сел він ЗМ НЕННЯ НБН ПЕСНИ НЕ

ЗЕ/СМ-С5Е даних вашій с ан ІНН НБН НБН НЕ

ЗЕ/СМ-С5Е даних и Петтннютситю тт тя тин анаведені у вигляді проценту СО3"7СОВ8 7 культивованих клітин, що зафарбовуються позитивно р11С-тетрамером.

Аналіз внутрішньоклітинних цитокінів: для додаткової характеристики функціональних і фенотипічних с 25 властивостей імуноген-індукованих пептид р1і1С-специфічних лімфоцитів внутрішньоклітинну експресію о піддавали моніторингу на експресію цитокінів Тпї-типу ІРМ-у, ТМЕо, 1-2 і цитокіну ТН2-типу 1-4.

Внутрішньоклітинну експресію цитокінів піддавали моніторингу в лімфоцитах периферичної крові після початкової стимуляції іп мійго у присутності ТОмкм пептидів р117С і гпІЇ/-2. Потім ці культури підтримували протягом 14 днів з 40Е/мл ІІ -2. Через два тижні культивовані клітини стимулювали або тільки середовищем,або «(О 30 1ОмМкМ пептидом р11Сжапі-Нитап СО28 і апіі-питап СО494 протягом однієї години. Через одну годину ці клітини сч обробляли Брефелдином А протягом додаткових п'яти годин, щоб дати можливість внутрішньоклітинним цитокінам сконцентруватись в ендоплазматичному ретикулумі. Внутрішньоклітинну експресію цитокінів «Ж визначали потім кількісно проточною цитометрією (таблиці 18 і 19). Фу

Як показано у таблиці 18, через два тижні після стимуляції пептидом рі1С іп мйго СОЗ " лімфоцити

Зо периферичної крові тварини групи 1 93х021 (5Т1-р11С-РА) показали низький рівень експресії цитокіну ТН1-типу, - причому менше 1,595 усіх клітин активно секретували ІЄМ-у, ТМЕо, або ІІ-2. Приблизно 895 усіх СОЗ" лімфоцитів після стимуляції пептидом р11С іп міго активно секретували цитокін Тп2-типу 1-4, і було виявлено, що секретуючі ІІ -4 клітини були обмежені субпопуляцією СОЗ"СО4" лімфоцитів. Після короткочасного повторного « піддавання дії пептиду р11С, субпопуляції рі1!С-тетрамер "7 і СО3'СО8' лімфоцитів активно секретували -в цитокіни Тп1-типу ІЕМ-у Її ТМЕо, але не могли бути індуковані до секреції значимо збільшених рівнів 1/-2. с Після повторного впливу пептиду р11сС секреція цитокіну Тп2-типу ІІ--4 не змінилась. ;» 7 зпотетнерє 0090 ово 0 0оово о всаяленихова 00 0оввет вело ва 2 ю я

Ф ннннннннннннншШнжжяяшяШяяоянШНнняяяааааааааааа з о іме) во ос: ІННИ НИ НН НИ ННЯ НИКИ НО я НО НН НС з ьсо3со4 3310 3789 11 1428 2567 1,8

25.1. Індекс стимуляції.

ЬНаведено у вигляді числа зазначених клітин, що зафарбовуються позитивно на зазначений цитокін, на 109 СОЗ34 клітин, мінус фонове фарбування (ізотипічний контроль).

Як показано у таблиці 19, через два тижні після стимуляції пептидом рії1С іп міо, СОЗ "7 лімфоцити периферичної крові з тварини 98п008 групи 2 (5Т1-р11С0-529 5БЕ/ЛЗМ-СЗЕ) показали низький рівень експресії цитокіну ТАИ1-типу, причому менше 1,095 усіх клітин активно секретували ІЄМ-у, ТМЕо або 1-2. Цікаво, що приблизно 2095 усіх СЮОЗ" лімфоцитів активно секретували цитокін Тп2-типу 1-4 з 2,5-кратним збільшенням числа ІЇ/-4 продукуючих клітин у порівнянні з твариною групи 1. Як і у випадку тварини групи 1, було винайдено, що секретуючі 1/-4 клітини є обмеженими субпопуляцією СОЗ 7СО04" лімфоцитів. Після короткочасного повторного впливу пептиду р11С, субпопуляції рі1С-тетрамер" і 203708" лімфоцитів тварини з групи 2 могли стимулюватись до секреції ТМЕо, але не ІРМ-у. На противагу тварині групи 1, після повторного впливу пептиду можна було спостерігати значиме збільшення експресії І-2 С0О3"С08" лімфоцитами. Як і у випадку тварини групи 1, після повторного впливу пептиду р11сС секреція цитокіну Тп1-типу ІІ--4 не змінилась. с 29 Результати: Індуковані імуногеном гуморальні імунні реакції (Групи 1 і 2): Ге)

Для оцінки індукції імуноген-специфічних гуморальних (у вигляді антитіл) реакцій титри ЕГІ5ЗА анти-ЗТ1-р11С-антитіл вимірювали у сироватці тварин групи 1 і 2 безпосередньо перед імунізацією і через 1 і 2 тижні після другої і третьої імунізації. Результати підсумовані у таблиці 20. со

Таблиця 20 с

Титри кінцевих точок ЕГІЗА сироватки з макак-резус, імунізованих ЗТ1-р11с (групи 1 і 2) з Ш0 ЛШОШО2О2 1 ЛО ЛО ОИ- 0 « «О р о ло ло блоо т нини т того « - є ШТ « Щ« 2 2 лЛ лю 20 5120

І» 111111 п Я ПО НОТИ твоо а 001020 98пО08 2 8Т1-р11с2529 5Е/СМ-С8Е 5 200 -і нн нн а ПО п ПО

Ф ШТ « « (« 2 л5 ОЗ тво » нини нишшшииини ни ли бло во 70 а Титри зв'язування кінцевих точок антитіл у вигляді величин, реципрокних щодо найвищого розведення плазми, що дає зчитування 00 експеримент/контроль (Е/С)»3,0. 4)

Індуковані імуногеном гуморальні Імунні реакції (Групи З і 4):

Для оцінки індукції імуноген-специфічних і ад'ювант-специфічних гуморальних (у вигляді антитіл) реакцій 29 титри ЕПІЗА анти-С4-УЗво вр і анти-зМ-СЗгР-антитіл вимірювали у сироватці тварин групи З і 4 безпосередньо

ГФ) перед імунізацією і через 1 і 2 тижні після другої і третьої імунізації. Результати підсумовані у таблиці 21. з Результати показують, що максимальні титри Са4-МЗво.вр-антитіла у плазмі генерувались на першому тижні після другої імунізації у всіх випробуваних тваринах. Максимальні титри антитіл у плазмі у тварин групи З (С4-МЗво.вр'РА) були на кілька порядків величин більш високими, ніж максимальні титри антитіл у плазмі, що 60 спостерігаються у групі 4 (С4-МЗвоевр 529 ЗЕ/ЗМ-С5Е). Тварини групи 4 показали низькі, але детектовані рівні титру анти-СМ-С5Р-антитіл, що мали максимум через один тиждень після третьої імунізації.

Таблиця 21

Титри кінцевих точок ЕГІЗА плазми з макак-резус, імунізованих С4-УЗво.вр (групи З і 4) бо Тварина/група Форма Тиждень Титра С4-УЗ антитіл Титр анти-питап-сМ-СЗЕ-АБ ин я ПО Я ПОН Но сн

РО ПИ ПОЛОН ПОЛОТНО ПОЛО ННЯ ПОН св 09111156 юю 11111116

Я

1001 01111115 п 1нвю011111ю вію вв юю |00 експеримент/контроль (Е/С)»3,0.

Індукцію нейтралізуючих антитіл у тварин групи З і 4 також піддавали моніторингу; результати підсумовані у таблиці 22. Ці результати показують, що як у тварин групи З, так і у тварин групи 4 розвивались нейтралізуючі антитіла, що були здатні нейтралізувати вірус ЗНІМдо в іп мйго. Титри ЗНІМвов-нейтралізуючих С антитіл, що спостерігаються у тварин групи 3, були звичайно більш високими, ніж спостерігаються у тварин о групи 4. Крім того, після кінцевої імунізації сироватка трьох тварин із групи З показала низький рівень нейтралізуючої активності проти ЗНІМво в-штаму цього вірусу, який є важко нейтралізованим.

Те зо 10111 неираліуючанитляю 00000000 -

ЕЕ ИН ССЗ ПН НЯ Осло НО МАН 00150008 ел ПО ПО НО НН НО НО сти КИ 11 тт

ЕСЕ ТЗН У т НИ ПОН пОННННЯ НОЯ НО КА: в 1сю 1

ПО ПОН ПО: ПОН ПОН ПО - 111 1в ї» ян І ЕП ЗИ ПОН

ЕС СЕ сте ЗННННИ НОНОСЛОННННЯ ПОН ПО

РН ПИППННЯ ПОЛОН КОН ОННН КОН с НО сет - ПО ПОН ПО: ПОН ПО НН ПО 1111111 що ПИ ПОН НОТ ОН НОТ ПО оте 000000 ббювюввомою 00000000 "ет ІН ПОМ ПОН КО ТОНН НО КТ НО тп 611111 ши ПО ПОН ПОТ ПОТ ПО юю 1єю . о вимірюваної за поглинанням барвника нейтрального червоного. ка Приклад 8

Дослідження терапевтичної ефективності на трансгенних мишах РОАРР, оброблених Ар 1-42 і ад'ювантами во Наступний експеримент був призначений для порівняння числа комбінованих форм ад'ювантів у трансгенних мишах РОАРР для випробування терапевтичної ефективності Ар1-42-пептиду.

Побудова експерименту: Трансгенних мишей РОАРР у віці 10,5-12,5 місяців (самців і самок) поділяли на чотири групи з 40 мишей, відсортованих таким чином, що кожна група відповідала кожній інший, якнайближче, у відношенні віку, статі і трансгенного батька. Ці групи описані у таблиці 23: б5

Таблиця 23

Ар1-42-пептид був одержаний від ЕІап Рпагтасеціїса!в, 529 ЗЕ і МРІ м ЗЕ були від Согіха їі мишачий СОМ-С5ЗЕ 70 був від Віозоцгсе. Усі миші одержували ін'єкції на тижнях 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ії 24. У мишей брали кров через 5-7 днів після ін'єкції, починаючи після другої ін'єкції. Групи 1, 2 і З ін'єкували підшкірно обсягом 200мкл, тоді як група 4 одержувала дози 250мкл підшкірним введенням. Тварин умертвляли на тижні 25 даного дослідження. Титри одержували з використанням розведення, що дає величину 5095 максимального зчитування оптичної щільності.

Результати:

Імуногенність і реакція у вигляді антитіл: Усі групи досягали їх максимального середнього геометричного титру (СМТ) антитіл до Ар1-42-пептиду або при другому (КС529-ОМ-С5Е), або при третьому крововидаленні (МР тм БЕ, МРІ тм БЕНОМ-С5Е) (див. Фігуру 1). При максимумі ОМТ, МРІ тм ЗЕНОМ-С5Е був 16400, тоді 529

ЗЕНОМ-С5Е був 13400 або приблизно у 1,5 разів більше контролю МР! тм 5Е 9700. Однак ці титри на двох ОМ-С5Р-вмісних формах (групи 2 і 3) падали до приблизних рівнів МРІ тм ЗЕ-контролю з кінневими СМТ МРІ тм

ЗЕ-4600, МРІ тм БЗЕНОМ-С5Е-5350, 529 БЕНОМ-СБЕ-4650.

Для визначення, чи було кінцеве зменшення титру двох ЗМ-С5Е-вмісних форм обумовлено реакцією анти-СМ-С5БР-антитіл, застосовували ЕГІЗА для визначення, чи утворювались анти-ЗМ-С5Б-антитіла в ході імунізації Сироватки з усіх тварин, що одержують СМ-С5Е, титрували проти мишачого СОМ-С5Е, С 259 Ввикористовуваного у всьому цьому експерименті. Не був одержаний доказ анти-ЗМ-СЗЕ-антитіл у жодній з ге) оброблених тварин (дані не показані).

Рівні АР у головному мозку: Усі три групи обробки значимо зменшували нагромадження як загального

Ар-пептиду (Фігура 2 - окремі результати; Таблиця 24 - об'єднані результати) у кортикальній області головного мозку миші РОАРР. Аналізи ЕГІЗА АР (загального і форми 1-42) виконували як описано раніше (54) з ее, використанням солюбілізованих гуанідином гомогенатів головного мозку. Статистичні порівняння виконані з Га використанням критерію вірогідності Манна-Уїтні. «

Ф з вве | меіве Ммрівегомове ве вегомсове в зменшення 12011861 «

Величина Р (М-М/) 37 0,000135| 0,0001 ЗА 0,000131 2 шим Мор им 2 с » 1 Свв мне мязезомове рювекомсве - т Депяюн о 0 овляоря ом 00000010 2925 зменшення | 02006808 з. ВелюиаР(МУЮ 00 оо собою соб мо о 4) Амілоїдне навантаження: Ступінь амілоїдозу визначали кількісно в лобовій частині кори головного мозку з використанням імуногістохімічних способів, як описано раніше |55). Усі три групи обробки знайшли значиме зменшення амілоїдного навантаження (Фігура 4 - окремі результати; Таблиця 26 - об'єднані результати). о юю 11111000 ве |мРівє |мрі вєзомоове вою везомоовю,

Медіанасьяву | 7980 бле 000обо 00 во зменшення | в00о1ве5

ВеличнаР(МУЮ 00000010 00001 65 Нейритне навантаження: Дія обробки на розвиток нейритної дистрофії у лобовій частині кори головного мозку оцінювали імуногістохимічно, як описано раніше |55). Усі три групи обробки значимо зменшували нейритне навантаження (Фігура 5 - окремі результати; Таблиця 27 - об'єднані результати). ; 0000001оеве |МРІвЕ Мі ЕхоМ.СеЕ 529 ЗЕхОМСВЕ, зменшення | 20066885 о ВелиинаР(МИЮ 000с0015а собою 00сооот

Астроцитоз: Ступінь астроцитозу в ретроспленіальній частини кору головного мозку визначали кількісно, як описано раніше |55). Групи обробки, що містить ЗМ-С5Е, знайшли значимо зменшений астроцитоз (Фігура 6). 75 Приклад 9

Імунізація пептидом СА(ЕЗУ)-МЗвз/вр собакоголових макак

Метою цього експерименту була оцінка імуногенності виробленого з Нім-1 Епм пептидного кон'югату

СА(Е9М)-МЗвз бр, який вводиться з комбінованою формою ад'ювантів даного винаходу іншому виду приматів, собакоголовим макакам (Масаса Гавсісціагів). С4-МЗвз бр-пептид, описаний у прикладі 7, модифікували заміною глутамінової кислоти в амінокислотному залишку 9 на валін. Одержаний пептидний кон'югат, названнний СА(Е9М)-

МЗвз во, використовували, і він має наступну послідовність: ща ід ків Ж Мн Шо пр бін чай аз щу сч

Щи Бі Мий Тут Аль че ие ть з. за. за о

Ше Ме Ше вд лю ше ГП Яр їхо ку аку

Від та ри дів ки Же (ВИД ль со) я . с , й . й я, й й й

Заміна глутамінової кислоти на валін (Е9М) у районі С4 цього пептиду збільшує імуногенність пептиду вище СМ імуногенності немодифікованого пептиду в мишачій моделі. -

Цей вироблений з НІМ-1 Епм пептид здатний індукувати гуморальні імунні реакції у мишей. Однак внаслідок труднощів екстраполяції результатів, одержаних на мишах, до людей, необхідно випробувати потенціальні (22)

ВІЛ-1-імуногенні композиції на приматах (не людині) перед переходом до клінічних випробувань Фази І людини. У їм цьому експерименті оцінювали як внутрішньом'язовий (ІМ), так і інтраназальний (ІМ) способи введення. Тварин імунізували п'ять разів на тижнях 0, 4, 8, 18 і 23. Один раз на тиждень до тижня 25 включно брали проби крові і шийково-піхвові і мукозні промивання і аналізували на присутність антитіл до цієї імуногенної композиції.

Побудова експерименту: Для цього експерименту використовували всього вісім собакоголових макак. Група 1 « 70 це одержувала ад'ювант; група 2 одержувала форму адюванта 529 БЕ плюс ОМ-С5Р. Тварин містили і -о с оцінювали в обладнанні з догляду за тваринами. з» з? се) ї» Імунізації: Всі інтраназальні імунізації доставлялись з використанням розпилювального (спрей) пристрою для носа з відміряними дозами по 1ООмкл. Всі внутрішньом'язові ін'єкції робили у чотириглавий м'яз за ко 20 допомогою голки і шприца. Усіх тварин імунізували за схемою 0, 4, 8, 18 і 23 тижні.

Ф Форми:

Група 1: 1000мкг СА(Е9М)-МЗво вр-пептиду в стерильному нормальному сольовому розчині, кінцевий обсяг 200мкл (по 100мкл у кожну ніздрю).

Група 2: 1000мкг С4(ЕЗ9М)-МЗ во вр-пептиду, 50мкг 529 ЗЕ і 250мкг ЗМ-СЗЕ людини, кінцева концентрація масла 195, кінцевий обсяг 1,0мл (500мкл у кожен чотириглавий м'яз за допомогою ІМ ін'єкції). (Ф) Аналізи для моніторингу імуноген-індукованих імунних реакцій: Безпосередньо до і після імунізації всіх г) тварин уважно спостерігали у відношенні імуноген-індукованих гуморальних імунних реакцій з використанням наступних аналізів: во (1) Визначення сироваткових титрів анти С4(Е9М)-МЗво вр-пептид-Ідо-антитіл за допомогою ЕГІЗА. (2) Визначення мукозних (шийково-піхвових, назальних) титрів анти-СА(Е9М)-УЗ во'бр-пептид-Ідс-антитіл за допомогою ЕЇГГІЗА.

Результати: Безпека і переносимість імуногену:

СА(Е9М)-МЗво врпептид при введень окремо або у комбінації з адювантами 529 ЗЕ/ЗМ-СЗЕ дуже добре ве переносився. У тварин, імунізованих внутрішньом'язово з використанням голки і шприца, не були відмічені несприятливі реактивності у місці ін'єкції. Всіх тварин уважно спостерігали на зміну в температурі тіла протягом 24 годин безпосередньо після кожного введення імуногену. В жодний момент часу під час дослідження жодна з тварин не показала ненормально підвищених показників температури тіла.

Імуноген-специфічні реакції у вигляді сироваткових антитіл:

Проби сироватки від усіх тварин одержували безпосередньо до і через один і два тижні після кожної імунізації (протягом 25 тижнів). Через два тижні після кінцевої імунізації всі проби сироваток аналізували на присутність анти-С4А(Е9М)-МЗ-пептид-ІдсС-антитіл. Інтраназально імунізовані тварини групи 1 (тільки

С4(Е9М)-МЗво вр-пептид) не показали більш високих титрів анти-С4(ЕЗ9М)-МЗво вр-пептид-ІдС-антитіл..- у сироватці, ніж неімунні рівні (Фігура 7). На противагу цьому, тварини групи 2 (ІМ-введення 70. СА(ЕУМ)-МЗво вр-пептидун529 ЗЕ/ЗМ-СЗЕ) розвили значні рівні СЕЗМ)-УЗ специфічних Ідс-антитіл, (Фігура 7).

Середній геометричний титр кінцевої точки, що повідомляється, розраховували з використанням найнижчого титру з кожної окремої тварини, який є в З рази більшим, ніж показник для об'єднаної "ненавченої" сироватки при тому ж самому розведенні.

Тварини групи 1 (без ад'юванта) мали титри аНга-СА(Е9М)-МЗво.бр-Ідб-антиТтт у пробах шийково-піхвових лаважей, які були більш високими, ніж неїімунні рівні, тільки після четвертої імунізації, але після цього знижувались (фігура 8). На противагу цьому, тварини групи 2 (з оадювантом) мали титри анти-СА(ЕЗ9У)-УЗвовр-ІдО-антитіл у пробах шийково-піхвових лаважей, що були більш високими, ніж неімунні рівні, після першої імунізації і збільшувались після кожної наступної імунізації (хоча було якесь більш пізніше зниження у кожному випадку) (фігура 8).

Тварини групи 1 (без адюванта) не показали титри анти-С4(Е9М)МЗво вр-І9С-антитіл у назальних промиваннях більш високі, ніж неімунні рівні (Фігура 9). На противагу цьому, тварини групи 2 (з ад'ювантом) розвили значні рівні титрів анти-С4(Е9М)-УЗ 89 вр-Ідс-антитіл у пробах назальних промивань (Фігура 9).

Бібліографія 1. Мозтапп, Т.К., еї аї., 9. Іттипої., 136, 2348-2357 (1986). сч 2. 0.5. Райепі Мо5057540 3. 00.5. Рабепі Моб113918. і) 4. Апіегв, 9.О., еї аї., У. Іттипої., 158, 3947-3958 (1997). 5. Зспагіоп-Кегаеп, Т., еї аї., У. Іттипої. 154, 5320-5330 (1995). 6. спаїїв, НМУ., еї аї., У. Іттипої., 154, 4623-4629 (1995). со зо 7. Митау, НМУ, апа Нагіргазпаа, .., У. Ехр. Меа., 181, 387-391 (1995). 8. 0.5. Рабепі Мо5571515. с 9. 0.5. Рабепі Мо5723127. «Е 10. 0.5. Райепі Мо5976539. 11. РіпкеІтап, Р.О., апа Ноїтез, 9., Апп. Кеум. Іттипої., 8, 303-333 (1990). Ме) 12. Зпаррег, СМ., еї а!., У. Ехр. Меа., 175, 1367-1371 (1992). ї- 13. Корауазвнпі, М., еї а!., У. Ехр. Меа., 170, 827-845 (1989). 14. Рибіїзпеа Іпіегпайопаї! Райбепі Арріїсайоп МоУУО 90/05147. 15. О.5. Райепі Мо5078996. 16. 0.5. Райепі Мо5229496. « 17. 0.5. Райепі Мо5073627. з с 18. АІдегзоп, М.К., еї а!., У. Ехр. Меа., 178, 669-674 (1993). . 19. Зпаррег, СМ,, еї аї., У. Іттипої., 154, 5842-5850 (1995). "» 20. О.5. Райепі Мо5679356. 21. Рибіїзнеа Іпіегпайопаї! Раїепі Арріїсайоп Мо М/О 00/69456. 22. 0.5. Райепі Мо5013548. -І 23. Ш.5. Райепі Мо5019387. 24. Спагьії, А., еї аі., Массіпе, 11, 1221-1228 (1993). ісе) 25. Майк, К.У., егаі., АЛІЮБ5 Кев. Нит. Кеїгомігизез, 9, 395-404 (1993). ї5» 26. доппзоп, К.Р., еї аї., 9. Мігої., 68, 3145-3153 (1994). 27. Ешег, О.Н., еї аі., АІОЗ5 Кез. Нит. Кеїгомігизевз, 10, 1433-1441 (1994). ко 28. Веггої»вКу, У.А., еї аї., У. Сііп. Іпмеві, 88, 876-884 (1991).

Ф 29. РаїкКег, Т.У., еї аї., У. Іттипої., 142, 3612-3619 (1989). 30. Нагі, М.К., еї а|., У. Іттипої., 145, 2677-2685 (1990).

З1. Наупез, В.Р., еї аї., 9. Іттипої., 151, 1646-1653 (1993). 5Б 32. Наїї, М.К., еїг аі!., Ргос. Маї). Асад. Зсі., ОБА, 88, 9448-9452 (1991). 33. Вапшей, .А., еї аі!., АІО5, 12, 1291-1300 (1998). (Ф. 34. Наупез, В.Р., ег аі., АІО5 Кез. Нит. Кеїгомігизев, 11, 211-221 (1998). ко 35. 0.5. Райепі Мо5861243. 36. 0.5. Райепі Мо5932218. 60 37. 0.5. Райепі Мо5939074. 38. 0.5. Райепі Мо5993819. 39. 0.5. Райепі Моб0О37135. 40. Риріїзней Еигореап Раїепі Арріїсайоп Моб71947. 41. О.5. Райепі Моб024965. 65 42. МіШег, М.О., еї а/!., У. Іттипої., 147, 320-329 (1991). 43. Кигода, М..)., еї а!., У. Ехр. Меа., 187, 1373-1381 (1998).

44. Пао, Н-Х, еї аї., 9. Мігої., 74, 254-263 (2000). 45. Біааїв, Н.Р., еї аї., 9). Іттипої., 157, 462-472 (1996). 46. Рогдадог, А., еї аї., У.

ІттипоЇ., 158, 834-841 (1997). 47. Рибіїзпеа Іпіегпайопаї! Раїепі Арріїсайоп МоуУУО 9/27944. 48. О.5. Райепі Мо4666829. 49. Сатевз, О., еї аіІ., Майшиге, 373, 523-527 (1995). 50. Рибіїзпейд Іпіегпайопаї! Райепі Арріїсайоп МоУУО 98/20734. 51. 0.5. Райепі Мо5830877. 70 52. Рибіїзпей Іпіегпайопаї! Райепі Арріїсайоп МоУУО 99/51259. 53. Ш.5. Райепі Мо5593972. 54. доппзоп-Моса), О., еї аї., Ргос.

Маї!. Асад.

Зсі., ОБА, 94, 1550-1555 (1997). 55. Зспепк, О., еї аі., Майиге, 400, 173-177 (1999).

Claims (67)

19 Формула винаходу

1. Антигенна композиція, яка містить вибраний антиген з патогенних вірусу, бактерії, гриба або паразита, або з ракової клітини, або пухлинної клітини, або з алергену, або з аутологічної молекули і ефективну ад'ювантну (імуностимулюючу) кількість комбінації (1) аміноалкілллюкозамінфосфатної сполуки (АСР) або її похідного, або аналога і (2) цитокіну або лімфокіну або агоніста зазначеного цитокіну або лімфокіну, де ця комбінація ад'ювантів підсилює імунну реакцію у хребетного хазяїна на зазначений антиген.

2. Антигенна композиція за п. 1, де вибраний антиген є поліпептидом, пептидом або фрагментом, виробленим з білка. сч

3. Антигенна композиція за п. 1, де АОР використовують у формі стабільної емульсії типу "масло у воді".

4. Антигенна композиція за п. 1, де цитокін або лімфокін вибраний із групи, що складається з (о) гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора та інтерлейкіну-12.

5. Антигенна композиція за оп. 4, де оцитокін або лімфокін є гранулоцитарно-макрофагальним колонієстимулюючим фактором. со зо

6. Антигенна композиція за п. 5, де АОР використовують у формі стабільної емульсії типу "масло у воді".

7. Антигенна композиція за п. 4, де цитокін або лімфокін є інтерлейкіном-12. с

8. Антигенна композиція за п. 7, де АОР використовують у формі стабільної емульсії типу "масло у воді". «

9. Антигенна композиція за п.1, яка додатково містить розріджувач або носій.

10. Антигенна композиція за п. 9, де АОР використовують у формі стабільної емульсії типу "масло у воді". б»

11. Антигенна композиція за п. 1, де АсР є чн 2-КК)-З-тетрадеканоїлокситетрадеканоїламіно|етил-2-дезокси-4-0-фосфоно-3-0-(К)-З-тетрадеканоїлокситетраде каноїл|-2-КК)-З-тетрадеканоїлокситетрадеканоїламіно|- Е -Об-глюкопіранозидом (529).

12. Антигенна композиція за п. 1, де вибраний антиген є антигеном з вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ). «

13. Антигенна композиція за п. 12, де вибраний антиген ВІЛ є білком ВІЛ, поліпептидом, пептидом або З фрагментом, одержаним із зазначеного білка. с

14. Антигенна композиція за п. 13, де вибрані антигени є пептидами ВІЛ, вибраними з групи, що складається "з з пептидів, які мають наступну амінокислотну послідовність: п цує Фіз Т1ю тіє йшла Шеб Тхр біз бі Уаї О1у Ту лів Має - тух аіа Суя Тих Аку РКО Аа Тух аец Цув Аго туї Аку їІ16 т нія 116 41у тго Ч41у Аку кіа Бі Тух Твг Тв ук (880 Її? ї» МпОо:1): м) Іше Ба Т16 І124 Ана Шаб тхр бів бій Уаї біу Ццує з1а мех Ф Тук Аіа Тит Ак ко Ана тТух Анв цужв Ах Мтж Ак Іза нів І1їа 01у їхо 0б1Уу Аку Аїд Ба Тук Тіх Тк Іль (880 Ії» 5» Шол1)2 о АК 9413 Т16 х10 Ана Жок Ткр Мія ШПув уаї о1у Гу ляд чаї т Тук ва іч 91у Сує Жйх го Тут аюр 7116 Ані сів Ме ї4у го (ШЖО хв МОх31, б5 і : Іїе СБУ Ржо Ч1у Ах Аа йбе Тут Віа Аху Ати (850 ІВ ШОс4)з и ув бій Т1є її Але Має Ткр біп туві чні б1у мує вів Має ю Жук Аза тії Аву хо Ашт Аво Авп їж А Сі Агу Імлпі Бог 116 01у ?ко 01У Ага Аіа ба Тух ата Ату йкЯа (ШО хв МО: 5. .

15. Антигенна композиція за п. 14, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: ув 415 116 х1і6 Ав Ме гр біп 41з уві й1у цує Аза моб тут Аїа Сує бик Асу Рхо Алй Тух Аип Шу Ага цу Аку тів хо Лів 16 91у рхо 41у ку Аїа Те Тух Тит ТЬу Цув (ХО ї0 що 1 г

16. Антигенна композиція за п. 14, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: Був бів хів ті Анд Меб Тк й1з біз Чаї б1у Та лів ме сч тТух Аза ТИЖ Ахи Рхо АЄТ Тух нап Цуя Асу Цув Аку Іїв пів о її 63зу хо 215 АБУ лів Вів Тух Жнх Чнх уж (8ЕО Ір МОо:2). ге;

17. Антигенна композиція за п. 14, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: сч ка Фі» І1Ф х16 Ав Тйх Тир нів Цув тні 013 І вп чаї ч Тух тес Фіз 41у Сув Тк Жго Тух Авр І1Ф9 АЛяю 012 Меб ївц Ф з ВЕО ТР МОса). м

18. Антигенна композиція за п. 14, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: їжте бід 519 116 вев Ша: тТхр іп ім чаї б1у Іув вза мах « Тут Вів ЖЖ Дхб йко Ма лаз вп Тьх Ак бім лхо Ба бах - о чав щу М б1У є ати мів та тух Аза дгв ар (ЩО їх "з ип4,. "

19. Антигенна композиція за п. 14, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність:

з. Є Фіз І1Ф ІЗ Ав Ме Тхр бів туаї тУАї біж їуя Ата Мах В тух Аза ТіК Ахд Рхо Або Аве Аа ТЬк Аву 014 аку ва зх І«е) . к т1їа 91У Рко щу аку Кіш Ж» Тух АїТа Ахо Аку (ЕКО ІБ 2 ЩМО:8). о

20. Антигенна композиція за п. 12, де АСР використовують у формі стабільної емульсії типу "масло у воді". Ф

21. Антигенна композиція за п. 12, де цитокін або лімфокін вибраний з групи, яка складається з гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора та інтерлейкіну-12.

22. Антигенна композиція за п. 21, де цитокін або лімфокін є гранулоцитарно-макрофагальним вв Колонієстимулюючим фактором.

23. Антигенна композиція за п. 22, де АОР використовують у формі стабільної емульсії типу "масло у воді". Ф)

24. Антигенна композиція за п. 21, де цитокін або лімфокін є інтерлейкіном-12. ка

25. Антигенна композиція за п. 24, де АСОР використовують у формі стабільної емульсії типу "масло у воді".

26. Антигенна композиція за п. 12, яка додатково містить розріджувач або носій. 60

27. Антигенна композиція за п. 26, де АОР використовують у формі стабільної емульсії типу "масло у воді".

28. Антигенна композиція за п. 12, де АОР є 529.

29. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, яка містить вибраний антиген з патогенних вірусу, бактерії, гриба або паразита, індукувати імунну реакцію хребетного хазяїна, що передбачає введення зазначеному хазяїну антигенної композиції за п. 1. 65

30. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, яка містить вибраний антиген з патогенних вірусу, бактерії, гриба або паразита, індукувати імунну реакцію хребетного хазяїна, що передбачає введення зазначеному хазяїну антигенної композиції за п. 9.

31. спосіб збільшення здатності антигенної композиції, яка містить антиген ВІЛ, індукувати імунну реакцію хребетного хазяїна, що передбачає введення зазначеному хазяїну антигенної композиції за п. 12.

32. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, яка містить антиген ВІЛ, індукувати імунну реакцію хребетного хазяїна, що передбачає введення зазначеному хазяїну антигенної композиції за п. 26.

33. Спосіб за п. 32, де вибрані антигени є пептидами ВІЛ, вибраними з групи, яка складається з пептидів, що мають амінокислотну послідовність: о а ба г1е Т16 Аєп Меб бхр 013 а15 Уаї Ф1у Цув їв маеї Шів 119 ТУ Рко 41У Агу Аа УБо тТух Тіт ТЕ цув (850 Тр й МО11), Іа бів тів Г1Ф Аво Маб Тгр бід 015 уаз су їує Аза має тух А14 ТьжЖ Ак КО Ані Тух Абю ув Ату Цув йку ї16 Щів м а Я1У хо ФІУу Асу Ала Ріо ЗУух Тех Тих уж (00 Ів щоз2)1. Аху ба 16 Хе лю ТЬк Тер Мія ув таї О1У 18 деп чаї » ЛИЖ їеч 913 91У Су ТЬЕ Рго Тут Мер І16 ака бів Меб тт С (Ява ІЮ МО:3)» о Му» 415 110 Т16 Аєз Меб Тур бів біз Уві с1у цуа зала моб Тут Аїва Тк Ахд РКО Ве Ава Авп ТЬж Ву 010 Агу їй тв о » Же 61У Уго 01У Агу аа сч Же Тут А1а Аку лк (МО хо МО:4),; ща з » Жуж Віа Твг Ахд рко Ав веп Ав обвк аку Фів ху тля век ТіФ Ж1у ?хо 01У Агб Аа Бр Тут Аза Аку Ак (ЖБО І

МО). " «

34. Спосіб за п. 33, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: -о с ув Чі х1е Ї16 Аво Меб Ткр Оз Фіз уаї О1у Щщузв лів моє хз Тук іа Сує Тіж Аку Рко Ав Тух Аню Шут Агу ув Аго І18 й нів ї1з 0ї1у Рго Фіу ау Ат ?іа Тук ТЬх ТЬтг Мув (БЕО Ії? - МІ. с

35. Спосіб за п. 33, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: в Цує іп 16 116 лап Ше Тло бів бі Укі б1у їла Аза Має му Тух Кіа Тік МКУ РКО Ана Тух Авп Куй Аг Туз Ако Іза мів Фу їі 52уУ Рко б1Ж Ахао Аза йо Тук Твху Те їув (БО І» МкО:2,. ря

36. Спосіб за п. 33, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: о Ак Фів т1іє Т1і4 ша ть їср мів ув Угі 01у ув лка чаї ю тух їз Фі 41У Сує Тіт Рхо Тух Аер Ії Лип Піп Ме: їм (вЕо г МО). 6о0

37. Спосіб за п. 33, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: б5

Цуп Яма ї1а І16 Аво Моб тТкро а1в вія туаі С3у їм ліва Моб " жів Яку хо їу ко Аза іа Тух Аза Ах йху (ВО їз що 4,

38. Спосіб за п. 33, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: о Б бів 119 Т1ю Аєт Ме Тхр біп чаї аз С1у Цує Аза мех Тух Аа ть: Аку Рко дип Ато Ана Тк Агу Са Ака Іа Ячх іа 41у їхо ху Атий й1їа й Тух Ала Ах аку (ЯКО ЇВ МО13).

39. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, яка містить вибраний антиген з патогенних вірусу, бактерії, гриба або паразита, індукувати цитотоксичні Т-лімфоцити у хребетному хазяїні, що передбачає введення зазначеному хазяїну антигенної композиції за п. 1.

40. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, яка містить вибраний антиген з патогенних вірусу, бактерії, гриба або паразита, індукувати цитотоксичні Т-лімфоцити у хребетному хазяїні, що передбачає введення зазначеному хазяїну антигенної композиції за п. 9.

41. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, яка містить антиген ВІЛ, індукувати цитотоксичні Т-лімфоцити у хребетному хазяїні, що передбачає введення зазначеному хазяїну антигенної композиції за п. 12.

42. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, яка містить антиген ВІЛ, індукувати цитотоксичні сч Т-лімфоцити у хребетному хазяїні, що передбачає введення зазначеному хазяїну антигенної композиції за п. 26.

43. Спосіб за п. 42, де вибрані антигени є пептидами ВІЛ, вибраними з групи, яка складається з пептидів, о що мають амінокислотну послідовність: ха йїл тів тів ви Моб Тр бін січ Уаї б1у цув Аа Ма о зо Ук Аза Су Тіт вка тео Ма кап МЕЧ Цув Ах Х1Ф о с Шів 15 61У Рго б1іу дхб АТА Рбе Тук тьх ТБх ув (950 19 шос1); Ф зв І1е гів Аа Мес Ткр біл обі уаї 91у ув Аза моб ге Тух А1а ТЬх Ак Рхо АБа Тук Аєп Цує Аху Цув Агу І16 нів І15 Ф1Уу Рхо Ф1уУ Ак Аза на Тук Тіх Тйх Кул (ВМ) 10 « Мог2), - "7 аку ів Хм с Же Мал Тих Тхр нів Цух чаї 91у Цує Ав чаї (шко хо що:х3), - аа Фів їІ1в Х1е Али Ше Ттр 915 91 чУаі О1у їде Ата має се Тук вів Тьх АтО РКО Аєа Авп Ато Так АГО Січ ко їла Вех 0 ЩО) о; 7 42) Ка бій Т1о ї1Ф Ави Мей Тхр Фів Чаї Чаї б1у ув Аза Моб ух Аїа їх ба. й Вед го Мп, Ави Ма Ті аку «41 Аху ілі цех о І1Ф 01у йхо О1у Ак9 діа Же Тух Кіа Аху Ак (ЩО Ір юю п 5,.

44. Спосіб за п. 43, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: о Б Фіз Т1і6 Ті Ава Ме; хр бів 015 уаз слу Шу Аза мах віз пе сна, Анш Ро Ма Тух Аво ЩЦує Аху Цув Ху 16

45. Спосіб за п. 43, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність:

Ма Ткр біп 41з Уві Я1у Був ліа Меб вів тіж Ахш РКО Лю Тут Лев Куй Аку Ццув аку їі нів - 118 01У Рхо у ху Кіа Ре Тух Тк Тьк цує (62О І Мо:2).

46. Спосіб за п. 43, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: ки бі Х1і6 ї16 зва то Тих тр нія Цуї чаї 41у цує Авп туваї Тут їжа Фіз 01у Сує Так Рго Тух Ар І19 Ав бій Мах їжи (ка го ЖОс3),.

47. Спосіб за п. 43, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: щує іп 16 І16 Аква Моб Ткр біз бі аї Ф1у їуа лів на 720 пог4). "

48. Спосіб за п. 43, де пептид ВІЛ є пептидом, що має амінокислотну послідовність: та бів тів Хі Аво Ме Тер до Чаї чаї 01у а за Жек сч о» ТШЖ від тіж Ак Жхо Ми Мих Депп оч вк біс Аг їм Бех о 16 гу Рхо С1у Аху вія Мао тук Аза Ахо аху спо тв Мо: 5).

49. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, що містить раковий антиген або зв'язаний з ісе) пухлиною антиген з ракової клітини або пухлинної клітини, індукувати терапевтичний або профілактичний с антираковий ефект у хребетного хазяїна, що передбачає введення зазначеному хазяїну антигенної композиції, яка містить зазначений раковий антиген або зв'язаний з пухлиною антиген з ракової клітини або пухлинної - клітини, і ефективну ад'ювантну (імуностимулюючу) кількість комбінації (1) АОСР, або її похідного, або аналога ду і (2) цитокіну або лімфокіну, або агоніста зазначеного цитокіну або лімфокіну.

50. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, яка містить вибраний алерген, пом'якшувати - алергійну реакцію у хребетному хазяїні, що передбачає введення зазначеному хазяїну антигенної композиції, яка містить зазначений алерген і ефективну ад'ювантну (імуностимулюючу) кількість комбінації (1) АСР, або її похідного, або аналога і (2) цитокіну або лімфокіну, або агоніста зазначеного цитокіну або лімфокіну. «

51. Антигенна композиція, яка містить вибраний антиген з молекули або її частини, що представляє молекулу З або її частину, яка продукується хазяїном небажаним чином, у небажаній кількості або місці розташування, щоб с зменшувати такий небажаний ефект за допомогою включення ефективної ад'ювантної (імуностимулюючої) "» кількості комбінації (1) АсСР, або її похідного, або аналога і (2) цитокіну або лімфокіну, або агоніста " зазначеного цитокіну або лімфокіну.

52. Антигенна композиція за п. 51, де вибраний антиген є поліпептидом, пептидом або фрагментом, виробленим з білка- попередника амілоїду або антитіла до нього. -

53. Антигенна композиція за п. 52, де вибраний антиген є пептидом АД , який є внутрішнім фрагментом з шо 39-43 амінокислот білка- попередника амілоїду, або фрагментом пептиду АД . ї ! - !

54. Антигенна композиція за п. 53, де вибраний антиген є пептидом ДД о оощо має амінокислотну о ще послідовність: 42) ляр Алла біл бе Му Мі дяр Бек Сіу тук Я3Зп чаї Біз нів бів ців Пео чуаї ве Же Аза біз Авр аз б1у бах йап сув о с1іу ліва Хі 110 01Уу Іа Ме Уаї зу біу Уаї чаї їзе дав ю (вБто хв жо: 6),

55. Антигенна композиція за п. 54, де АОР є 529. 60

56. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції, яка містить вибраний антиген з молекули або її частини, що представляє молекулу або її частину, яка продукується хазяїном небажаним чином, у небажаній кількості або місці розташування, зменшувати такий небажаний ефект за допомогою включення ефективної ад'ювантної (імуностимулюючої) кількості комбінації (1) АСР, або її похідного, або аналога і (2) цитокіну або лімфокіну, або агоніста зазначеного цитокіну або лімфокіну. 65

57. Спосіб збільшення здатності антигенної композиції запобігати або лікувати захворювання, що характеризується відкладенням амілоїду у хребетного хазяїна, що передбачає введення зазначеному хазяїну поліпептиду, пептиду або фрагмента, вироблених з білка-попередника амілоїду або антитіла до нього, і ад'ювантної (імуностимулюючої) кількості комбінації (1) АСР, або її похідного, або аналога і (2) цитокіну або лімфокіну, або агоніста зазначеного цитокіну або лімфокіну.

58. Спосіб за п. 57, де вибраний антиген є пептидом Аг , який є внутрішнім фрагментом з 39-43 амінокислот білка-попередника амілоїду, або фрагментом пептиду АД .

59. Спосіб за п. 58, де вибраний антиген є пептидом АД , що має амінокислотну послідовність: ю йАвр аїв бі: Ма ко Мія Авр Бех 41іу Тух біс Чаї Ків нів їв цу пам Чаї Тьа ба вів бі Ар чаї 91Уу Яйаг дав ув Ф1Уу іа 16 116 й1Уу 120 мМеЄ Чаї йїу 41у Уаї чуаї хів аз їз чБШО ТІ шок б).

60. Спосіб за п. 59, де АОР є 529.

61. Ад'ювантна композиція, яка містить комбінацію (1) аміноалкілллюкозамінфосфатної сполуки (АСР), або її похідного, або аналога і (2) цитокіну або лімфокіну, або агоніста зазначеного цитокіну або лімфокіну.

62. Ад'ювантна композиція за п. 61, де АСР використовують у формі стабільної емульсії типу "масло у воді".

63. Ад'ювантна композиція за п. 61, де цитокін або лімфокін вибрані з групи, що складається з гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора та інтерлейкіну-12.

64. Ад'ювантна композиція за п. 61, що додатково містить розріджувач або носій.

65. Ад'ювантна композиція за п. 61, де цитокін або лімфокін є гранулоцитарно-макрофагальним сч колонієстимулюючим фактором.

66. Ад'ювантна композиція за п. 61, де цитокін або лімфокін є інтерлейкіном-12. Ге)

67. Ад'ювантна композиція за п. 61, де АОР є 529. (Се) сч « (22) і - - с ;» -І се) щ» г) 50 42) Ф) іме) 60 б5