UA82485C2 - Інсектицидні білкові токсини з photorhabdus - Google Patents

Description

Опис винаходу

Цей винахід стосується токсинів, виділених з бактерій, та до застосування цих токсинів як інсектицидів.

Численні комахи широко розглядаються як шкідники володарями будинків, учасниками пікніків, садівниками й фермерами та іншими людьми, вкладення яких у сільськогосподарські продукти часто пропадають або зменшуються внаслідок пошкодження комахами польових культур. Зокрема, в зонах, де вегетаційний сезон є коротким, значне пошкодження комахами може означати втрату всіх прибутків для фермерів і сильне зниження врожайності. Мізерне постачання конкретних сільськогосподарських продуктів неминуче призводить до більш 70 високих цін для людей, що займаються переробкою харчових продуктів, і потім - для кінцевих споживачів харчових рослин та продуктів, які одержують з цих рослин.

Відвертання пошкодження комахами сільськогосподарських культур та квітів Її виключення неприємностей, пов'язаних з комахами-шкідниками, як правило засновано на використанні сильних пестицидів та інсектицидів з широкими спектрами токсичності. Ці синтетичні продукти стикаються з різким неприйняттям усього населення як занадто жорстокі по відношенню до довкілля та об'єктів, що їх піддають дії таких агентів. Таким чином, поза сільським господарством, володарі будинків задовольнилися б тим, щоб комахи уникали їх будинків та місць пікніків, без знищення цих комах.

Інтенсивне застосування хімічних інсектицидів викликало занепокоєність щодо довкілля та здоров'я у фермерів, компаній, які продукують ці інсектициди, державних органів, груп захисту суспільних інтересів та громадськості в цілому. Розробка менш жорстких стратегій захисту від шкідників стимулювалася разом з стурбованістю суспільства про довкілля та з розвитком біологічних засобів, що використовують біологічні механізми боротьби з комахами. Засоби біологічного захисту є перспективною альтернативою хімічним інсектицидам.

Організми на кожному рівні еволюційного розвитку розвивали засоби для підсилення їх власного поступу й с виживання. Використання біологічних молекул як інструментів захисту й агресії відомо в царстві тварин і в ге) рослинному світі. Крім того, відносно нові інструменти генної інженерії дозволяють модифікувати біологічні інсектициди для втілення конкретних рішень конкретних проблем.

Один з таких агентів, Васіїйиз (Пигіпдіепзіз (ВО, є ефективним інсектицидним агентом і, як такий, широко використовується комерційно. Фактично, інсектицидний агент бактерії Ві являє собою білок, який має таку юю обмежену токсичність, що його можна використовувати на харчових культурах людини в день збирання врожаю. (Ху

Для організмів, які не є мішенню, токсин Ві є нетоксичним білком, що легко засвоюється.

Іншим відомим класом біологічних агентів захисту від комах є деякі роди нематод, котрі, як відомо, є - векторами переносу бактеріальних симбіонтів, що вбивають комах. Нематоди, що містять інсектицидні бактерії, сі заселяють личинки комах. Потім ці бактерії вбивають личинки. Нематоди розмножуються у вбитих личинках.

Потомство нематод поїдає вбитих личинок зсередини. Одержане у такий спосіб потомство нематод, що містить со бактерії, може потім заселяти інші личинки.

У минулому інсектицидних нематод у родах Зіеіпегпета та Нейегогпарайів використовували як агентів захисту від комах. Певно, кожен рід нематод є живителем для конкретного виду бактерій. У нематодах роду «

Негйегогнараййв симбіотичною бактерією є Рпоїюгпаврацз Іштіпезсепв. 70 Хоча ці нематоди є ефективними агентами захисту від комах, зараз важкою, дорогою й неефективною о, с справою є одержання, підтримання та розповсюдження нематод для боротьби з комахами. з» У цій галузі було відомо, що з РПИоіогпардиз Іптіпізсепе можна виділити інсектицидний токсин, який є активним лише при введенні у личинки лускокрилих та твердокрилих комах. Це робило неможливим ефективне застосування інсектицидних властивостей цих нематод чи їх бактеріального симбіонту. Корисним був би більш практичний, менш трудомісткий, такий, що охоплює великі простори, спосіб доставляння інсектицидного токсину, со який зберігав би його біологічні властивості після доставки. Вельми бажаним було б відкриття токсинів з ко пероральною активністю, що їх продукує рід Ріпоїогпардивз. Виділення й застосування цих токсинів є бажаним завдяки їх ефективності. До відкриттів, що їх було здійснено заявниками, такі токсини не було виділено або ве охарактеризовано. бо 20 Нативні токсини являють собою білкові комплекси, що їх продукують та секретують бактеріальні клітини роду

Рпоюгпарадиз, які ростуть, та увагу привертають білки, що їх продукує вид Ріоїогпардиз Іштіпезсепв. Білкові «сл комплекси з розміром молекул приблизно 1000кДа можуть бути поділені аналізом за допомогою електрофорезу у ПААГ-ДСН на численні складові білки. Ці токсини не містять гемолізіну, ліпази, фосфоліпази С або нуклеазних активностей. Вони виявляють значну токсичність при введенні ряду комах. 25 Цей винахід забезпечує інсектицидний білок, що його може бути легко введено, а також експресію токсину у о гетерологічній системі.

Цей винахід забезпечує також спосіб доставляння інсектицидних токсинів, які є функціонально активними та ко ефективними проти багатьох рядів комах.

Цілі, переваги й ознаки цього винаходу стануть очевидними з подальшого опису. 60 Стислий опис малюнків

Фіг.1 - ілюстрація збігу клонованих ізолятів ДНК, що використовуються як частина послідовності генів для токсину цього винаходу.

Фіг.2 - карта трьох плазмид, що використовуються у процесі секвенування.

Фіг.З - карта, що ілюструє взаємовідношення кількох часткових фрагментів ДНК. бо Фіг.4 - ілюстрація аналізу гомології між білюовими послідовностями білків ТерА; та ТсавВ;.

Фіг5 - фенограма штамів РПИоїогпардив. Спорідненість штамів РІіоїогпардиз визначали за допомогою гер- "СК. Верхня частина Фіг.5 вимірює процентну схожість штамів на основі бальної оцінки продуктів гер-РСК (тобто, 0,0 (немає схожості) - 1,0 (10095 схожість)). На правій осі цифри й літери означають різні штами, які було випробувано; 14-УУ-14, Нт-Нт, НО-НО, 7-УуУХх-7, 1-МУХ-1, 2-Уух-2, 88-НРВ8В, МО-1-МС-1, 4-УУХ-4, 9-МУХ-9, 8-МУХ-8, 10-УУХ-10, ММІК-МУМІК, 3-МУХ-3, 11-МУХ-Ії, 5-МУХ-5, 6-МУХ-6, 12-МУХ-12, хі4-УуУХх-14, 15-МУХ-15, НЬ-НЬ, 82-82, 48-52-АТСС43948-АТСС43952. Вертикальні лінії, що поділяють горизонтальні лінії, вказують ступінь спорідненості (що його зчитують з перетинання, що екстраполюється, вертикальної лінії з верхньою віссю) між штамами або групами штамів при основі горизонтальних ліній (наприклад, штам МУ-14 приблизно на 60905 є 70 подібним до штаму НО і Нт).

Фіг.6 - ілюстрація геномних карт штаму МУ-14.

Цей винахід спрямовано на відкриття унікального класу інсектицидних білкових токсинів з виду

Рпоюгпарадив, що мають пероральну токсичність в відношенні до комах. Унікальною ознакою РПоіогпардиз є його біолюмінесценція. Рипоюгпардиз може бути виділено з різноманітних джерел. Одним з таких джерел є нематоди, більш конкретно - нематоди виду Негйегогпабайїйз. Інше подібне джерело виділено з клінічних проб з ран людини, див. Раптег еї аї., 1989, 9. Сіїп. МісгобіоІ., 27рр., 1594-1600). Ці сапрофітні штами депоновано в |Атегісап

Туре Сийиге СоПесіоп (КоскмШе, МО) АТСС МоМо43948, 43949, 43950, 43951 і 43952)|) та включено сюди як посилання. Можливо, що інші джерела могли б захоплювати бактерії Ріпоїюгпарадивз, які продукують інсектицидні токсини. Такі джерела в довкіллі могли б бути або такими, що живуть у землі чи на землі, або водними.

Рід Рпоюгпаврдив таксономічно визначається як член родини Епіегобасієегіасеае, хоча він має деякі ознаки, атипові для цієї родини. Наприклад, штами цього виду не відновлюють нітрати, продукують жовтий та червоний пігмент та мають таку ознаку, як біолюмінесценція. Ця остання ознака не є відомою для інших членів родини

Епіегорасіегіасеае. РІПоїогпардиз тільки недавно було описано як вид, що відрізняється від Хепогпарацз

ІВоетаге еї аї., 1993, Іпї У. Бузі. Васіегіоі., 43, 249-255). Ця диференціація заснована на дослідженнях с гібридизації ДНК-ДНК, фенотипічних відмінностях (наприклад, наявності (РПоїогпардиз) або відсутності (Хепогпардиз) каталази та біолюмінесценції) та родині живителя-нематоди (Хепогпарацв; 5іеіпегпетайсае, (8)

Рпоїюгпаврадив; Негйегогпарайідае). Порівняльні аналізи жирних кислот у клітинах |(Чапзе еї аї., 1990, І ей.

Аррі. Місгобіоії., 10, 131-135; БилиКкі еї аїЇ., 1990, 9. Сеп. Аррі. МісгоріоІ., Зб, 393-401| підтверджують диференціацію Рпоюгпавадиз від Хепогпаврашв. ю зо Щоб встановити, що колекція штамів, яку описано тут, складається з штамів Ріпоїогпардив, ці штами характеризували на основі ознак, що їх можна впізнати, які визначають Рпоїогпардиз та відрізняють його від со інших Епіегорасіегіасеае і від видів Хепогпардиз (|Рапгтег, 1984, Вегдеуз Мапиа! ої бувієетіс Васіегіоіоду, «

Мо|.1, рр.510-511; АКпигві апа Воетаге, 1988, 9). Сеп. Місгобіо!Ї., 134, рр.1835-1845; Воетаге еї аї., 1993,

Іпї. 9. Буві. ВасіегіоІ., 43, рр.249-255), що їх включено сюди як посилання). Було досліджено такі ознаки: с грамнегативні палички, розмір організму, пігментація колоній, тіла включення, наявність каталази, со спроможність відновлювати нітрати, біолюмінесценція, зростання на елективних середовищах, температура росту, виживання за анаеробних умов та рухливість. Аналіз жирних кислот використовували, щоб підтвердити те, що всі ці штами належать до одного роду Рпоїогпаврашв.

Зараз бактеріальний рід Ріоїогпардивз складається з єдиного визначеного виду, Рпоїогпардиз Іштіпезсепз «

АТСС Туре зігаїп Мо29999, Роїпаг еї аі., 1977, Метайоіодіса, 23, 97-102). Численні споріднені штами було -в с описано в літературі (наприклад, АКпиг8і еї аї.,, 1988, 9. деп. Місгобіоії., 134, 1835-1845; Воетаге еї аї., 1993, Іпї 9. Буві. ВасіегіоЇ., 43, рр.249-255; Риї; еї аїЇ.,, 1990, Аррі. ЄЕпмігоп. Місгобріо!., 56, 181-186). з Численні штами Ріпоюгпардиз було описано тут. Ці штами наведено в списку таблиці 18 у Прикладах. Оскільки зараз є тільки один вид (Іштіпезсеп5в), який визначено у роді РІоїогпардиз, ознаки виду Іштіпезсепз використали для характеристики штамів, що їх описано тут. Не можна не передбачити, що в майбутньому со можуть бути виявлені інші види Рпоіогпарадиз, які матимуть деякі характерні ознаки виду Іштіпезсепв, а також деякі властивості, що відрізняються, які зараз не визначено як ознаку Рпоюгпарадиз Іштіпезсепв. Однак, обсяг ко цього винаходу охоплює будь-які види або штами Рпоіогпардиз, що продукують білки, які мають функціональну їх активність як агенти боротьби з комахами, незалежно від інших ознак та відмітних властивостей.

Крім того, як показано тут, бактерії роду РІоїогпардиз продукують білки, які мають функціональну со активність, що її визначено тут. Особливий інтерес представляють білки, які продукує вид РІПоїогпардиз сл Іютіпезсепв. Цей винахід не повинен обмежуватися штамами, які описано в ньому. Ці штами ілюструють вперше, що білки, які продукують різноманітні ізоляти Ріоїогпардивз, є токсичними при обробленні ними комах. Таким чином, до описаного тут винаходу належать штами, які заявлено тут, і будь-які їх мутанти, а також будь-які дв штами або види роду Рпоїогпардиз, що мають описану тут функціональну активність.

Тут використано кілька термінів, які мають визначене значення:

ГФ) Під "функціональною активністю" тут розуміють те, що білкові токсини діють як агенти боротьби з комахами, т у тому значенні, що вони є активними перорально або виявляють токсичну дію чи здатні порушувати або погіршувати живлення, що може спричинювати або не спричинювати загибель комахи. При вступі комахи в бо Контакт з ефективною кількістю токсину, що поставляється через експресію трансгенної рослини, через приготовані білкові композиції, білкові композиції, які розприскують, матрикс принади або іншу систему доставки, результатами, як правило, є загибель комахи, або комахи не поїдають джерело, яке робить ці токсини доступними для комах.

Термін "токсин Рпоїогпардив" означає будь-який білок, що його продукує штам мікроорганізму Рпоїогпарадивз, 65 який має функціональну активність у відношенні до комах, причому токсин Ріпоїогпардив може бути приготовано у вигляді композиції, що її розприскують, експресовано трансгенною рослиною, приготовано у вигляді матриксу принади, доставлятися за допомогою бакуловірусу або за допомогою будь-якого іншого прийнятного живителя або будь-якої іншої системи доставки.

Білкові токсини, які обговорюються тут, як правило, називають "Інсектицидами". Під інсектицидами тут розуміють те, що ці білкові токсини мають "функціональну активність" визначену тут раніше, та використовуються як агенти боротьби з комахами.

Під терміном "олігонуклеотиди" розуміють макромолекулу, що складається з короткого ланцюга нуклеотидів або РНК, чи ДНК. Такою довжиною може бути, принаймні, один нуклеотид, але, як правило, довжина знаходиться у діапазоні від приблизно 10 до приблизно 12 нуклеотидів. Визначення довжини олігонуклеотиду є 70 добре відомим для фахівців у цій галузі та не є обмеженням у цьому винаході. Таким чином, олігонуклеотиди можуть мати менше 10 або більше 12 нуклеотидів.

Термін "токсичний" або "токсичність", як його застосовано тут, означає, що токсини, які продукує

Ріпоюгпавадизв, мають визначену тут "функціональну активність".

Термін "генетичний матеріал", що використовується тут, стосується до генів, нуклеїнової кислоти, ДНК або 75 РНК.

Ферментаційні бульйони від вибраних штамів, які описано у Таблиці 18, використовували для визначення: широти продукування інсектицидних токсинів видом РІіоіогпардивз, інсектицидного спектру цих токсинів, і для забезпечення вихідного матеріалу для очищення комплексів токсинів. Було показано, що штами, які охарактеризовано тут, мають пероральну токсичність для численних рядів комах. Такі ряди комах включають 2о (але не обмежуються ними) СоіІеорієега, Ноторіега, І ерідоріега, Оіріега, Асагіпа, Нутепоріега та Оісіуоріега.

Як і у випадку інших бактеріальних токсинів, швидкість мутації бактерій у популяції спричинює утворення багатьох споріднених токсинів, які трохи відрізняються за їх послідовністю. Токсини, що описано тут, являють собою такі токсини, що утворюють білкові комплекси, токсичні для різних комах, які експонуються із ними, як це описано тут. Більш прийнятно, ці токсини є активними проти Іерідоріега, СоіІеоріега, Ноторіега, БОіріега, с Нутепоріега, Рісіуоріега та Асагіпа. Цей винахід стосується отримання білкових токсинів, гомологічних білковим токсинам, що їх продукують описані тут штами та будь-які утворені з них штами, а також будь-яких о білкових токсинів, продукованих РПоіогпара!цв. Ці гомологічні білки можуть відрізнятися за їх послідовністю, але вони не відрізняються за функцією від описаних тут токсинів. Розуміється, що гомологічні токсини включають білкові комплекси з розміром між ЗО0ОкДа та 2000кДа і складаються, принаймні, з двох (2) субодиниць, ю зо причому субодиниця являє собою пептид, що може бути таким самим, як друга субодиниця, або відрізнятися від неї. Різноманітні білкові субодиниці були ідентифіковано та наведено в Прикладах цього винаходу. Як правило, со субодиниці білка мають розмір між приблизно 18кДа та приблизно 23ОкДа; між приблизно 160кДа та приблизно «У 23ОкДа; 100кДа - 160кДа; приблизно 8ОкДа - приблизно 100кДа; і приблизно 5ОкДа - приблизно 8ОкДа.

Як обговорювалось вище, деякі штам Ріоіїогпардиз може бути виділено з нематод. Деякі нематод, подовжені с циліндричні паразитичні черв'яки типу Метайоада, розвинули здатність використовувати личинки комах як більш со прийнятне середовища для росту. Личинки комах забезпечують джерело їжі для нематод, що ростуть, і середовище, де вони розмножуються. Драматичним ефектом після інвазії личинок деякими нематодами є загибель личинок. Смерть личинок зумовлена наявністю (у деяких нематодах) бактерій, що продукують інсектицидний токсин, який зупиняє зростання личинок та інгібує активність живлення. «

Цікаво, що, по-видимому, кожен рід паразитичних нематод з комахами є живителем певного виду бактерії, - с який є унікально пристосованим для симбіотичного росту з цією нематодою. Протягом часу, що минув з початку цього дослідження, назву бактеріального роду Хепогпардиз було змінено на Хепогпардиз та Риоіогпараивз. :з» Бактерії роду Ріоїогпардиз охарактеризовано як симбіонт нематод Негегогпабайз, тоді як види Хепогпардивз є симбіонтами видів біеіпегпета. Цю модифікацію в номенклатурі відображено у цій заявці, але модифікація в номенклатурі ніяк не змінює обсягу описаного тут винаходу. со Пептиди та гени, які описано тут, називаються відповідно до основних вказівок, що їх опубліковано недавно в Моигпа! ої Васіегіоїоду "Іпвігисіопе (о Ашоге", р.і-хі (Чап. 1996)), які включено тут як посилання. ко Названі нижче пептиди й гени було виділено з штаму МУ-14 Рпоюгпараив. їх Номенклатура пептидів /генів комплексу токсинів (Тс) з

ЗЕС ПО Мо ща Геномний районі 111 о ю

Геномний рат 1 во

Геюомний рай, 1 бо ТссА ЇссА 8

Геномний рат 1 ; (послідовність у дужках вказує внутрішню амінокислотну послідовність, яку одержано на основі продуктів 70 розщеплення трипсином)

Наведені вище послідовності згруповано на основі району геному. Ген ЇсБА експресували у Е. соїї у вигляді двох білкових фрагментів ТерА та ТеорА;;, як показано у Прикладах. Може бути вигідним мати протеолітичне розрізування деяких послідовностей для одержання більш високої активності токсинів для комерційних трансгенних прикладень.

Токсини, що їх описано тут, є цілковито унікальними у тому розумінні, що ці токсини мають функціональну активність, яка є ключовою для розробляння стратегії боротьби з комахами. У розробці стратегії боротьби з комахами можна уповільнити чи обійти процес деградації білю»а шляхом введення білка безпосередньо у організм, обминаючи травний тракт. У такому разі білок, який введено в організм, буде зберігати його функцію до тих пір, поки він не денатурується, неспецифічно зруйнується чи його буде еліміновано імунною системою у вищих організмах. Ін'єкція у комах інсектицидного токсину має потенційне прикладення лише у лабораторії і, крім того, тільки у разі великих комах, які легко ін'єкувати. Спостереження, що інсектицидні білкові токсини, що їх описано тут, виявляють їх токсичну активність після проковтування через рот або контакту з токсинами, дозволяє розробити стратегію боротьби з комахами, яка грунтується лише на можливості включення цих білкових токсинів до раціону комах. Така стратегія веде до створення принад для комах. се

Токсини РІПоїогпардиз можна вводити комахам у очищеному вигляді. Токсини можна також поставляти кількістю від приблизно 1 до приблизно 10Омг/л бульйону. Кількість може змінюватись залежно від умов о приготування, умов джерела інокуляту, способів виділення токсину тощо. Токсини можна вводити у вигляді білка секреції ексудату чи клітинного білка, який спочатку було експресовано у гетерологічному прокаріотичному чи еукаріотичному живителі. Живителями, у який експресуються білки, є, як правило, бактерії. Еукаріотичними Іо) живителями могли би бути (але не обмежуються ними) рослини, комахи й дріжджі. Альтернативно, ці токсини можуть продукуватись у бактеріях чи трансгенних рослинах у полі або комахах з використанням бакуловірусного со вектора. Як правило, ці токсини вводять комасі шляхом включення одного чи кількох токсинів у їжу комах. чІ

Повна летальність щодо комах, які живляться, є застосовуваною, але не є потрібною для досягнення корисної токсичності. Якщо комахи уникають токсину або припиняють живитись, це уникання їжі буде вигідним у с деяких прикладеннях, навіть якщо ці ефекти є сублетальними. Наприклад, якщо бажаними є стійкі до комах со трансгенні сільськогосподарські рослини, небажання комах живитись на цих рослинах так само цінно, як і летальна токсичність для цих комах, оскільки кінцевою метою є захист рослин, а не вбивання комахи.

Існує багато інших шляхів того, як токсини може бути введено у їжу комахи. Наприклад, можна підробити джерело їжі личинок за допомогою токсичного білка шляхом обприскування їжі розчином білка, як це описано « тут. Альтернативно, очищений білок можна ввести за допомогою генної інженерії у бактерію, нешкідливу уінших пт) с відношеннях, яка могла би потім рости у культурі і або наноситись на джерело їжі, або приміщуватись у грунт у ц тій зоні, де бажаним є винищення комах. Також можна було б ввести одержаний за допомогою генної інженерії ,» білок безпосередньо у джерело їжі комахи. Наприклад, основним джерелом живлення багатьох личинок комах є рослинний матеріал.

Внаслідок включення генетичного матеріалу, який кодує інсектицидні властивості токсинів Рпоїогпаврацв, до

Го | геному рослини, що його поїдає конкретна комаха-шкідник, доросла комаха або личинки гинуть після живлення цією рослиною. Численні члени однодольних та дводольних родів було трансформовано. Трансгенні агрономічні о культури, а також фрукти й овочі, являють собою комерційний інтерес. Такі сільськогосподарські культури т» включають (але не обмежуються ними) кукурудзу, рис, сою, сапоїа, соняшник, люцерну, сорго, пшеницю, бавовник, земляний горіх, томати, картоплю тощо. Існує декілька способів для введення чужорідного генетичного со матеріалу у клітини рослин та для одержання рослин, що стабільно зберігають та експресують ген, який ся введено. Такі способи включають прискорення генетичного матеріалу, який нанесено на мікрочастки, для введення безпосередньо у клітини (0.5. Райепіз 4945050 Юю СогпеїЇ та 5141131 ю Оом/ ЕІапсо). Рослини може бути трансформовано відповідно до технології з використанням Адгобасіегішт, |див. О.5. Раїепі 5177010 ю Мпімегейу ої Тоіедо, 5104310 (0 Техаз А апа М, Еигореап Раїепі Арріїсайоп 013162481, Епгореап Раїепі

Арріїсайопе 120516, 15941881 та 176112 ю Зспйрегоої, 0.5. Раїепіз 5149645, 5469976, 5464763 та 4940838 та

Ф) 4693976 юю Зспіїрегоої, Еигореап Раїепі Арріїсайопв 116718, 290799, 320500 ю МахРіапск, Еийгореап Раїепі ко Арріїсайопе 604662 апа 627752 о дарап Торассо, Еийгореап Раїепі Арріїсайопе 0267159 апа 0292435, апа 0.5.

Раїепі 5231019 (о Сіра Сеїіду,О.5. Райепів 5463174 та 4762785 Юю СаЇдепе та ).5. Райепів 5004863 і 5159135 Юю 60о Адгасейшв|. Інші технології трансформацію включають "мпізКегв"-технологію, |див. О.5. Райепів 5302523 та 5464765 (0 7епеса). Технологію електропорації також використовували для трансформації рослин, (див. УМО 87/06614 ю Воусе Тпотрзоп Іпвійше, 5472869 та 5384253 ю ОекКкаїв, УМО 9209696 і МО 9321335 ю РОЗІ. Усі ці патенти й публікації щодо трансформації включено як посилання. Окрім численних технологій для трансформації рослин, можна такою варіювати тип тканини, яку приводять до контакту з чужорідними генами. 65 Така тканина може включати (але не обмежуватись ними) ембріогенну тканину, калусну тканину типів І! та ЇЇ, гіпокотиль, меристему тощо. Майже усі тканини рослини може бути трансформовано під час дедиференціації з використанням відповідних способів, що відомі фахівцям у цій галузі.

Іншою змінною є вибір маркера, що його селектують. Більш прийнятний конкретний маркер визначають за розсудом фахівця, але можна використовувати будь який з наведених далі маркерів, які селектують, разом з будь-яким іншим геном, який не названо тут, що він міг би функціонувати як маркер, який селектують. Такі маркери, які селектують, включають (але не обмежуються ними) ген аміноглікозилфосфотрансферази транспозону Тп5 (Арі ІІ), який кодує стійкість до антибіотиків канаміцину, неоміцину та 5418, а також гени, що кодують стійкість чи толерантність до гліфозату, гігроміцину, метотрексату, фосфінотрицину (біалофосу), імідазолінонів, сульфонілсечовин та триазопіримідинових гербіцидів, таких як хлорсульфон, бромоксиніл, /о далапон тощо.

Крім маркера, який селектують, може бути бажаним використання репортерного гена. У деяких випадках репортерний ген може бути використано без маркера, який селектують. Репортерні гени являють собою гени, які, як правило, не є наявними чи не експресуються у організмі- або тканині-реципієнті. Репортерний ген часто кодує білок, що забезпечує якусь фенотипічну зміну чи ферментативну властивість. Приклади таких генів /5 наведено у |К. УМеївіпу еї аі., Апп. Кеу. Сепейсв, 22, 421 (1988)), що включено тут як посилання. Більш прийнятним репортерним геном є ген глюкуронідази (5И5).

Незалежно від способу трансформації ген більш прийнятно включають до вектора переносу гена, який є пристосованим для експресії токсинів Рпоїогпардив у клітині рослини шляхом включення до цього вектору рослинного промотору. Крім промоторів рослин можна використовувати ефективно промотори з різноманітних джерел у клітинах рослин для експресування чужорідних генів. Наприклад, можна використовувати промотори бактеріального походження, такі як промотор ооктопінсинтази, промотор нопалінсинтази, промотор маннопінсинтази; промотори вірусного походження, такі як промотор вірусу тютюнової мозаїки (355 та 195) тощо. Промотори рослин включають (але не обмежуються ними) промотор малої субодиниці (МС) рибулозо-1,6-бісфосфат(РБФ)карбоксилази, промотор бета-конгліциніну, промотор фазеоліну, промотор АН, с ов промотори теплового шоку та тканиноспецифічні промотори. Промотори можуть також містити деякі елементи енхансерної послідовності, які можуть покращувати ефективність транскрипції. Типові енхансери включають (але (8) не обмежуються ними) Аап-інтрон | та Аап-інтрон 6. Може бути використано й конститутивні промотори.

Конститутивні промотори регулюють неперервну експресію генів в усіх типах клітин та у будь-який час (наприклад, актину, убіквітину, СаМмМ 355). Тканиноспецифічні промотори відповідають за експресію генів у ю зо специфічних типах клітин чи тканин, таких як листя або насіння (наприклад, зеїну, олеозіну, напіну, АСР), і ці промотори можна також використовувати. Можна також застосовувати промотори, що є активними протягом 99 певної стадії розвитку рослини, а також активними у тканинах рослин та їх органах. Прикладами таких « промоторів є (але не обмежуються ними) специфічні для пилку, специфічні для ембріону, специфічні для кукурудзяного "шовку", специфічні для волокон бавовнику, специфічні для коріння, специфічні для ендосперму с зв насіння промотори тощо. со

За певних обставин може бути бажаним застосування індукованого промотору. Індукований промотор відповідає за експресію генів у відповідь на специфічний сигнал, такий як: фізичний фактор (гени теплового шоку); світло (РБФ-карбоксилаза); гормон (Ет); метаболіти й стрес. Можуть використовуватись інші бажані елементи транскрипції та трансляції. У цій галузі відомі численні специфічні для рослин вектори переносу генів. «

Крім того, відомо, що для одержання високої експресії бактеріальних генів у рослинах краще перебудувати з с бактеріальні гени таким чином, щоб вони більш ефективно експресувались у цитоплазмі рослин. Кукурудза є однією з таких рослин, для яких більш прийнятним є переконструювання бактеріального гена (генів) перед з трансформацією для підвищення рівня експресії токсину у цій рослині. Однією з причин такої перебудови генної інженерії є низький вміст (33-35 нативного бактеріального гена (генів) (та подальше відхилення у бік високого

Вмісту АТ). Це спричинює утворення послідовностей, що імітують або дублюють регуляторні послідовності генів со рослин, які, як відомо, вельми багаті на А-Т. Наявність деякої кількості багатих на А«Т послідовностей у ДНК гена (генів), які вводять у рослини (наприклад, районів ТАТА-боксу, що у нормі є наявним у промоторах генів), ко може спричинювати аберантну транскрипцію цього гена (генів). З іншого боку, присутність інших регуляторних їх послідовностей, наявних у мРНК, що транскибується (наприклад, послідовностей сигналу поліаденілування «ААйАААХ), або послідовностей, які є комплементарними до малих ядерних РНК, що беруть участь у сплайсінгу со пре-мРНК), може спричинювати нестабільність РНК. Таким чином, однією з цілей у конструюванні бактеріального сл гена (генів), що його (їх) перебудовують, та який, більш прийнятно, називають оптимізованим для рослин геном (генами), є утворення послідовності ДНК, що має високий вміст ЗЖ-С, та, більш прийнятно, послідовності, близької до послідовності генів рослин, які кодують метаболічні ферменти. Іншою метою побудови дв Оптимізованого для рослини гена (генів) є утворення послідовності ДНК, яка не тільки має більш високий вміст

СС, але її має бути виготовлено, шляхом модифікації змін послідовності, таким чином, щоб не заважати

ГФ) трансляції.

Ф Прикладом рослини, що має високий вміст (з3-С, є кукурудза. Наведена нижче таблиця ілюструє, наскільки високим є вміст З у кукурудзі. Вважають, що, як і у кукурудзі, вміст --С у інших рослинах є теж високим. 60 кодуючих білок районів генів кукурудзи 65 Запасні білки а У дужках наведено кількість генів у класі. . с Середнє об'єднаних груп, що не враховується у розрахунках загального середнього.

Для даних у Таблиці 1 кодуючі райони генів вибирали з СепВапк (Кеїеазе 71), та склад основ розраховували, використовуючи програму МасМесіогтм (ІВІ, Мем Намеп, СТ). Послідовності нітронів не брали до уваги у цих 75 розрахунках. Послідовності генів запасних білків груп І та ІІ розрізняли за помітною відмінністю у складі основ.

Завдяки гнучкості, що її надавав надмір генетичного коду (тобто тим, що деякі амінокислоти кодуються більш ніж одним кодоном), еволюція геномів різних організмів або класів організмів спричинила диференційне використання надмірних кодонів. Це таксономічне "зміщення кодонів" відображено у середньому складі основ районів, що кодують білки. Наприклад, організми з відносно низьким вмістом з-С використовують кодони, що мають А чи Т у третій позиції надмірних кодонів, тоді як кодони, що мають високий вміст ЗАС, використовують кодони, які мають С чи С у третій позиції.

Припускають, що наявність "мінорних" кодонів у мРНК гена може зменшувати абсолютну швидкість трансляції цієї МРНК, особливо, коли відносний достаток заряджених тРНК, які відповідають мінорному кодону, є низьким. Продовженням цього є те, що зменшення швидкості трансляції окремими мінорними кодонами було би, су принаймні, адитивно для численних мінорних кодонів. Таким чином, мРНК, що мають високий відносний вміст мінорних кодонів, матимуть, відповідно, більш низькі швидкості трансляції. Ця швидкість відбивається у і) синтезі низьких рівнів білка, що кодується.

Для перебудови бактеріального гена (генів) визначають зміщення кодонів рослини. Зміщення кодонів являє собою статистичний розподіл кодонів, які рослина використовує для кодування її білків. Визначивши це юю

Зміщення, знаходять частоту стрічання цих кодонів у гені (генах) що являє інтерес. Треба визначити первинні, більш прийнятні для рослини кодони, а також другий та третій вибір більш прийнятних кодонів. Амінокислотна со послідовність білка, що представляє інтерес, зворотно транслюється таким чином, що одержана послідовність «г нуклеїнової кислоти кодує той самий білок, що й нативний бактеріальний ген, але ця отримана послідовність нуклеїнової кислоти відповідає першим більш прийнятним кодонам цільової рослини. Нову послідовність се

Зз5 аналізують на сайти рестриктаз, які може бути створено шляхом цієї модифікації. Ідентифіковані сайти со модифікують далі заміною кодонів більш прийнятними кодонами другого й третього вибору. Іншими сайтами у цій послідовності, що можуть впливати на транскрипцію чи трансляцію цільового гена, є місця з'єднання 5' або

З екзон: інтрон, сигнали приєднання полі А чи сигнали термінації РНК-полімерази. Цю послідовність аналізують далі та модифікують, щоб зменшити частоту стрічання дуплетів ТА або СС. Крім цих дуплетів, блоки « послідовностей з С або С, які мають більше приблизно 4 залишків, можуть впливати на транскрипцію цієї ш-в с послідовності. Тому ці блоки також модифікують, заміняючи кодони першого чи другого вибору тощо наступним й більш прийнятним кодоном вибору. Більш прийнятним є те, щоб оптимізований для рослин ген (гени) містив «» приблизно 6395 кодонів першого вибору, приблизно 2295 - приблизно 3795 кодонів другого вибору та 15905 - 090 кодонів третього вибору, причому загальний процент дорівнює 10095. Найбільш прийнятний оптимізований для рослин ген (гени) містить близько 6395 кодонів першого вибору, принаймні, близько 2295 кодонів другого вибору,

Го! близько 7,595 кодонів третього вибору та близько 7,595 кодонів четвертого вибору, причому загальний процент дорівнює 10095. Спосіб, який описано вище, дає змогу фахівцеві у цій галузі модифікувати ген (гени), чужорідні де для конкретної рослини таким чином, що ці гени оптимально експресуються у рослинах. Спосіб ілюстровано ї» додатково у попередній заявці, що очікує розглядання, (0.5. 60/005405, яку подано 13 жовтня 1995 року), що її

Включено сюди як посилання. (22) Такий чином, для побудови оптимізованого для рослини гена (генів) амінокислотну послідовність токсинів сп зворотно транслюють (переводять) у послідовність ДНК, що використовує ненадмірний генетичний код, який визначено з таблиці зміщення кодонів, яку компільовано для ДНК-послідовності гена для конкретної трансформованої рослини. Одержану послідовність ДНК, яка є цілком гомогенною щодо використання кодонів, Модифікують далі для утворення послідовності ДНК, яка, крім того, що має високий ступінь різноманіття кодонів, містить також стратегічно розташовані сайти впізнавання рестриктаз, бажаний склад основ та не (Ф) містить послідовностей, які можуть перешкоджати транскрипції цього гена чи трансляції продукту МРНК. т Теоретично припускається, що бактеріальні гени могуть легше експресуватись у рослинах, якщо ці бактеріальні гени експресуються у пластидах. Таким чином, можна експресувати бактеріальні гени у рослинах, бо не оптимізуючи ці гени для експресії рослинами, та одержувати високий рівень експресії білка див. Ц.5.

Раїепів Момо4762785, 5451513 та 5545817, що їх включено тут як посилання).

Одним з результатів з точки зору комерційного використання трансгенних рослин є управління стійкістю. Це особливо стосується токсинів Васійив (пПигіпдіепзіз. Існують численні компанії, що комерційно використовують

Васійив (пигіпдіепзіз, та було чимало занепокоєння щодо токсинів Ві, які стають стійкими. Однією з стратегій 65 для управління стійкістю до комах може бути комбінування токсинів, які продукує Ріоїюгпарадив, з токсинами, такими як Ві, вегетативними білками комах (Сіра Сеіду) чи іншими токсинами. Такі комбінації можна було б готувати для використання шляхом розприскування або вони могли би бути молекулярними комбінаціями.

Рослини можна трансформувати генами Ріоїгпардив, що продукують токсини комахи, та генами токсинів інших комах, таких як Ві.

ІВ Ешгореап Раїепі Арріїсайоп 0400246А1) описано трансформацію 2 генів ВЕ у рослину, причому ці 2 гени могли би бути будь-якими іншими двома генами. Інший спосіб отримання трансгенної рослини, що містить більше, ніж один ген стійкості до комах, міг би складатись з тримання двох рослин, кожна з яких має ген стійкості до комахи. Ці рослини можна було б піддати зворотному схрещуванню з використанням традиційного способі схрещування рослин для одержання рослини, що містить більше одного гена стійкості до комах. 70 Крім одержання трансформованої рослини, яка має оптимізований для рослини ген (гени), існують інші системи доставляння для випадків, коли бажаною є перебудова бактеріального гена (генів). За тим самим типом генетично сконструйований білковий токсин, що легко виділяється, злитий разом з молекулою, яка атрагує комах, як джерело живлення та інсектицидної активності токсину, може бути генетично сконструйовано та експресовано у бактеріях або в еукаріотичних клітинах за допомогою стандартних, добре відомих способів. 7/5 Після очищення у лабораторії такий токсичний агент з вбудованою "принадою" може бути упаковано у стандартних пастках для комах.

Інша схема доставки являє собою включення генетичного матеріалу токсинів до бакуловірусного вектора.

Бакуловіруси інфікують конкретних комах-живителів, у тому числі тих, яких поражають токсини Ріоїогпарацв.

Інфекційний бакуловірус, що несе експресійну конструкцію для токсинів Рпоіогпардиз, міг би вводитись у зони

Зараження комахами для інтоксикації чи отруєння інфікованих комах.

Перенос інсектицидних властивостей вимагає, щоб послідовності нуклеїнових кислот, що кодують амінокислотні послідовності токсинів Ріоїогпардивз, було інтегровано до вектора експресії білка, придатного для застосування у живителі, у якому цей вектор буде знаходитись. Одним з способів одержання послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує білок з інсектицидними властивостями, є виділення нативного генетичного с ов матеріалу, який продукує токсини РІоіогпардиз, з використанням інформації, що її розшифровано з амінокислотної послідовності токсину, більші частки якої наведено нижче. Як описано нижче, наведено також (о) способи очищення білків, що відповідають за активність токсину.

Використовуючи дані про М-кінцеву амінокислотну послідовність, що їх наведено нижче, можна сконструювати олігонуклеотиди, комплементарні усім чи частині основ ДНК, які кодують перші амінокислоти ю зо токсину. Ці олігонуклеотиди можуть бути радіоактивно мічені та можуть використовуватись як молекулярні зонди для виділення генетичного матеріалу з геномної генетичної бібліотеки, яку побудовано з генетичного матеріалу, со що його виділено з штамів РПИоїогпардиз. Генетичну бібліотеку може бути клоновано у плазмидному, « космидному, фаговому чи фагмидному векторах. Бібліотеку можна трансформувати у ЕзсПегіспіа соїї та скринювати на утворення токсину трансформованими клітинами з використанням антитіл, які вироблено проти с

Зв ТОКСИНУ, або прямими аналізами на токсичність по відношенню до комах. со

Цей підхід вимагає отримання набору олігонуклеотидів, оскільки вироджений генетичний код дає змогу кодувати одну амінокислоту у ДНК будь-якої з кількох трьохнуклеотидних комбінацій. Наприклад, амінокислота аргінін може кодуватись триплетами СОА, СОС, СО, СОТ, АСА та АСО. Оскільки неможливо передбачити, який триплет використовується у цих позиціях у гені токсину, слід приготувати олігонуклеотиди з кожним « потенційно характерним триплетом. Може виникнути потреба у більш, ніж одній молекулі ДНК, що відповідає з с субодиниці балка, для конструювання достатньої кількості олігонуклеотидних зондів для визначення усіх субодиниць білка, що необхідні для пероральної токсичності. :з» На основі амінокислотної послідовності очищеного білка генетичні матеріали, які відповідають за продукування токсинів, може бути легко виділено та клоновано, повністю або частково, у експресуючий вектор з

Використання будь-якого з кількох способів, що добре відомі фахівцям у галузі молекулярної біології. Типовим со експресуючим вектором є ДНК-плазмида, хоча передбачаються також і інші переносники, у тому числі (але не тільки), космиди, фагмиди й фаги. Крім ознак, потрібних чи бажаних для реплікації плазмид, таких як запал ко реплікації та стійкість до антибіотиків чи інша форма маркера, який селектують, наприклад, ген баг їх Зігеріотусез Ппуйгозсорісиз або мігідоспготодепевз, вектори експресії білка часто потребують додатково касети 5р експресії яка включає цис-діючі послідовності, необхідні для транскрипції і трансляції цільового гена. (ог) Цис-діючі послідовності, необхідні для експресії в прокаріотах, відрізняються від подібних елементів, що сл потрібні в еукаріотах та рослинах.

Еукаріотична касета експресії вимагає наявності транскрипційного промотору проти ходу транскрипції (5) відносно цільового гена, району термінації транскрипції, такого як сайт приєднання полі-А, та місця в Зв'язування рибосом проти ходу транскрипції від першого кодону цільового гена. У бактеріальних клітинах застосовуваним транскрипційним промотором, який можна було б включити до вектора, є промотор, що зв'язує

ГФ) РНК-полімеразу 17. Як описано вище, промотори ефективно підсилюють транскрипцію мРНК. Також проти ходу

Ф транскрипції (зліва) від цільового гена вектор може мати нуклеотидну послідовність, що кодує сигнальну послідовність, яка, як відомо, направляє ковалентно зв'язаний з нею білок до конкретного компартменту бо Клітин-живителів, такий як клітинна поверхня.

Відомо, що віруси комах, або бакуловіруси, інфікують деяких комах та несприятливо діють на них. Дія цих вірусів на комах є повільною, та віруси не припиняють живлення комах. Тому віруси не вважаються такими, що можуть застосовуватись як агенти боротьби з комахами. Введення генів токсинів Рпоюгпардиз у бакуловірусний вектор могло б стати ефективним засобом передавання токсинів з одночасним підвищенням летальності такого 65 вірусу. Крім того, оскільки різні бакуловіруси є специфічними до різних комах, можна використовувати конкретний токсин для селективного націлювання на конкретних шкідників-комах. Особливо цінним вектором для генів токсинів є вірус ядерного поліедрозу. Вектори-переносники, що використовують цей вірус, було описано у літературі та зараз їх може бути вибрано як вектори для перенесення чужорідних генів у комах. Рекомбінант вірус-ген токсину може бути сконструйовано у формі, що передається перорально. Бакуловіруси часто інфікують

Комах через слизову оболонку середньої кишки. Ген токсину, що його вбудовано за сильним промотором білка оболонки вірусу, буде експресуватись та швидко вбивати інфіковану комаху.

Крім вірусу комах або бакуловірусу чи системи доставки трансгенної рослини для білкових токсинів цього винаходу, ці білюи може бути інкапсульовано, використовуючи технологію Васіййв5 Тпигіпдіепвів, таку як (але не тільки) (Ш.5. Раїепів МоМо4695455, 4695462, 4861595), які включено тут як посилання. юІншою системою 7/0 доставки для білкових токсинів цього винаходу є введення цього білка у матрикс принади, яку можна було б потім використовувати у надземних та підземних ділянках пробування. Приклади такої технології наведено у (але не тільки) (РЗТ Раїйепі Арріїсайоп УУО 93/239981, яку включено тут як посилання.

Як описано вище, може бути необхідною модифікація послідовності, що кодує цільовий білок, при експресії її у ненативному живителі, оскільки прийнятність кодонів інших живителів може відрізнятись від прийнятності 7/5 Кодонів Рпоїюгпардиз. У такому разі трансляція може бути цілюом неефективною у новому живителі, якщо не ввести компенсуючих модифікацій у кодуючу послідовність. Крім того, можуть бути бажаними модифікації амінокислотної послідовності, щоб уникнути інгібіторної перехресної реактивності з білками нового живителя, чи для вдосконалення інсектицидних властивостей білка у новому живителі. Генетично модифікований ген токсину може кодувати токсин, що виявляє, наприклад, підсилену чи послаблену токсичність, змінений розвиток стійкості до комах, змінену стабільність чи модифіковану специфічність щодо виду-мішені.

Крім генів Ріпоїюогпараив, що кодують його токсини, обсяг цього винаходу включає споріднені послідовності нуклеїнових кислот, які кодують амінокислотні біополімери, гомологічні білкам токсинів, та які зберігають токсичну дію білків Риоїогпардиз у видах комах після перорального проковтування.

Наприклад, токсини, що використовуються у цьому винаході, певно, спочатку інгібують живлення личинок сч ов перед настанням смерті. Шляхом маніпулювання послідовністю нуклеїнової кислоти токсинів Рпоїогпараиз або її регуляторними послідовностями генні інженери, приміщуючи ген токсину у рослини, могли би модулювати його о силу або спосіб дії, наприклад, для зберігання інгібуючої живлення активності з одночасним виключенням абсолютної токсичності для личинок. Ця зміна могла би дати змогу трансформованій рослині виживати до збирання врожаю, не справляючи необов'язкового драматичного впливу на екосистему внаслідок знищення усіх ю зо Ком ах-мішеней. Передбачається, що усі подібні модифікації гена, що кодує токсин, або білка, що його кодує цей ген, входять до обсягу цього винаходу. со

Інші передбачені модифікації нуклеїнової кислоти включають приєднання направляючих послідовностей для « направлення токсину у конкретні частини личинок комах для підсилення ефективності.

Штами АТСС 55397, 43948, 43950, 43951, 43952 було депоновано у (Атегісап Туре Сийиге СоПесійоп, 12301 с

РагкІамуп Огіме, КоскмШе, МО 20852 БА). Дані про амінокислотну послідовність та нуклеотидну послідовність со для нативного токсину М/У-14 (АТСС 55397) наведено нижче. Виділення геномної ДНК для токсинів з бактеріальних живителен також наведено тут як приклад.

У цій заявці використано й описано стандартні способи та способи молекулярної біології. Додаткову інформацію можна знайти у |ІЗатргоокК 3., Егіївзсп, Е.Р., апа Мапіайвз, Т. (1989), Моіесшіаг Сіопіпд, А « Габогагу Мапиаї, Соїа Зргіпу Нагрог Ргезз), яку включено тут як посилання. з с У Прикладах використано такі абревіатури:

Трис- трис(гідроксиметил)амінометан; з ДСН. додецилсульфат натрію;

ЕДТКУ- етилендіамінтетраоцтова кислота;

ІПТГе- ізопропилтіо-бета-галактозид; со Х-гал- 5-бром-4-хлор-3-індоліл-бета-О-галактозид;

ЦТАБ- цетилтриметиламонійбромід; ко т.п.О.- тисячі пар основ; їх аАТР, СТР, СТР, аттТР, І- 2'-дезоксинуклеозид-5--трифосфати аденіну, цитозину, гуаніну, тиміну та інозин, відповідно; со АТР: аденозин-5--трифосфат. сл Приклад 1

Очищення токсину з Р. Іштіпезсепз та демонстрація токсичності після пероральної доставки очищеного токсину

Інсектицидний токсин цього винаходу очищували з штаму МУ-14 Р. Іштіпезсепз, АТСС Ассезвіоп Мо55397.

Вихідні культури Р. Іштіпезсепз зберігали у чашках Петрі, що містили 295 Протеоза Пептон МоЗ3 (тобто РРЗ, Осо (Ф) І арогаюгіез, Оеїгоїї МІ) у 1,595 агарі, інкубували при 252С та пересіювали щотижня. Колонії первинної форми цих т бактерій інокулювали у 200мл РРЗ-бульйону, доповненого 0,595 моностеаратом поліоксиетиленсорбітану (Твін 60, Зідта Спетіса! Сотрапу, 51. І оців, МО), в однолітровій колбі. Бульйонні культури вирощували протягом 72 бо годин при 302С на ротаційному шейкері. Білки токсину здобували з культур, які було вирощено у присутності чи відсутності Твіну; однак, відсутність Твіну може впливати на форму бактерій, що їх вирощують, та профіль білків, що їх продукують бактерії. При відсутності Твіну може мати місце варіантне зміщення, оскільки молекулярна маса принаймні одного ідентифікованого токсину зміщується від приблизно 200кДа до приблизно 185кДа. 65 72-годинні культури центрифугували при 10000х9 протягом ЗО хвилин для видалення клітин та залишків клітин (дебрісу). Фракцію супернатанту, що містить інсектицидну активність, зливали та доводили до 50ММ

КоНРО, шляхом додання підхожого об'єму 1,0М К.НРО),. рН доводили до 8,6, додавши гідроксид калію. Потім цю фракцію супернатанту змішували з ОЕАЕ-Зерпасеї! (Рпагтасіа І КВ Віоїесппоіоду), який було врівноважено 50ММ КоНРО,. Токсична активність адсорбувалась на ОЕАЕ. Потім цю суміш виливали у колонку 2,6х4О0см та промивали 50ММ КоНРО, при кімнатній температурі при швидкості потоку З4Омл/год. до тих пір, поки ефлюєнт не досягав постійної базової лінії поглинання УФ при 280нм. Потім колонку промивали 150мММ КС до тих пір, поки ефлюєнт знову не досягав постійної базової лінії при 280нм. Нарешті, колонку промивали ЗО0мММ КСІ та збирали фракції.

Фракції, що містять токсин, об'єднували та стерилізували, пропускаючи крізь стерилізуючий фільтр, яким 7/0 був мембранний фільтр з порами 0,2 мікрон. Потім токсин концентрували й зрівноважували до 100ММ КРО,, рНб,ЗО, застосовуючи ультрафільтраційну мембрану з відсіканням молекулярної маси 1О0кДа при 4 ес (Сепігургер 100, Атісоп Оімівіоп-МУ.К., Сгасе апа Сотрапу). Пробу (Змл) концентрату токсину наносили на верхню частину гель-фільтраційної колонки (Рпагтасіа КВ Віоїесппоіїсду). Елюуючим буфером був 100ММ

КРО,, рНб,9, швидкість потоку 17мл/год., при 42С. Ефлюєнт піддавали моніторингу при 28О0нм.

Фракції збирали та тестували на токсичну активність. Токсичність хроматографічних фракцій випробували у біологічному тесті з використанням личинок Мапдиса зехіа. Фракції або наносили на корм комахи (корм з зародків пшениці для шовкопряда непарного, ІСМ Віоспетіса! Оімівіоп - ІСМ Віотедісаї!5, Іпс.), або вводили внутрішньогемоцельною ін'єкцією проби 5 мкл через першу несправжню ніжку за допомогою голки калібру 30.

Вагу кожної личинки у групі, що одержувала токсин, реєстрували з інтервалами 24 години. Токсичність припускалась, якщо комаха припиняла їсти та вмирала у межах кількох днів поїдання обробленого корму для комах, або якщо смерть наставала у межах 24 годин після ін'єкції фракції.

Токсичні фракції об'єднували та концентрували за допомогою Сепігургер-100 і потім аналізували за допомогою ВЕРХ з використанням гель-фільтраційної колонки 7,5МмМ хбоОсм Т5К-ЗЕЇ (-4000 5УУ з 100мММ фосфатом калію, рНб,9, швидкість потоку елюуючого буфера 0,4мл/хвил. Цей аналіз виявив, що білоктоксину С міститься у єдиному гострому піку, що його елюювали з колонки з часом утримування приблизно 33,6 хвилини. о

Цей час утримування відповідає молекулярній масі 100ОкДа, яку було оцінено. Фракції піку збирали для подальшого очищення, а фракції, що не містили цього білка, викидали. Пік, що його елюювали з колонки ВЕРХ, поглинає УФ світло при 218 та 280нм, але не поглинає світло при 405нм. Було показано, що поглинання при 405нм є ознакою ксенорабдинових антибіотичних сполук. ІС)

Електрофорез об'єднаних фракцій піку у неденатуруючому агарозному гелі (Мебарпог Адагозе, ЕМО

ВіоРгодисів) показав, що у піку наявні два білкових комплекси. Матеріал піку, який було забуферено у 50ММ оо

Трис-НСЇ, рН7 0, розділяли на 1,595 агарозному концентруючому гелі, що його було забуферено 100мММ Трис-НСІ ч«Ж при рН7,О, та 1,995 агарозному розділяючому гелі, який було забуферено 200ММ Трис-борату при рНВ,3, за стандартних буферних умов (анодний буфер 1М Трис-НСЇІ, рН8,3; катодний буфер 0,025М Трис, 0,192М гліцин). с

Електрофорез проводили при 13мМА постійного струму при 15923 до тих пір, поки барвник-"свідок; феноловий о червоний, не доходив кінця гелю. Дві білкові смуги візуалізували в агарозних гелях забарвленням Кумасі (Соотавві ВгіШапі ріше).

Смугу, що переміщувалась повільніше, називали "білковою полосою 1", а смугу, що переміщалась швидше, « називали "білковою полосою 2". Дві білкові смуги були наявні приблизно у рівних кількостях. Забарвлені Кумасі агарозні гелі використовували як шаблон для точного вирізання двох білкових смуг з незабарвлених частин - с гелів. Вирізані ділянки, що містили ці білкові полоси, мацерували та додавали невелику кількість стерильної ч води. Для контролю також вирізали частину гелю, яка не містила білка, та обробляли її так само, як і ділянки -» гелю, що містили білок. Білок здобували з шматочків гелю за допомогою електрофорезу у 100ММ

Трис-боратному буфері, рНе8,3, при 100 вольтах (постійна напруга) протягом двох годин. Альтернативно, білок пасивно елюювали з шматочків гелю доданням рівного об'єму 50ММ Трис-НСІ, рН7,О до шматочків гелю з о подальшим інкубуванням при 302 протягом 16 годин. Це дозволяло білку дифундувати з гелю до буфера, який т потім збирали.

Результати тестів токсичності для комах з використанням очищеного за допомогою ВЕРХ токсину (пік г» 33,бхвил.) та очищеного за допомогою агарозного гелю токсину продемонстрували токсичність цих екстрактів. со 20 |н'єкція 1,5мкг ВЕРХ-очищеного білка вбиває у межах 24 годин. Обидві білкові смуги 1 та 2, здобуті з агарозних гелів пасивною елюцією або електроелюцією, були летальними при ін'єкції. Концентрація білка, сп визначена для цих проб була меншою за 5Онг на личинку. Порівняння збільшення маси та смертності між групами личинок, які було ін'єктовано білковими смугами 1 та 2, показує, що білкова смуга 1 була більш токсичною при доставлянні шляхом ін'єкції. 29 При нанесенні ВЕРХ-очищеного токсину на корм для личинок при концентрації 7,5мкг на личинку відбувалось припинення збільшення маси личинки (досліджували 24 личинки). Личинки починали живитись кормом, але після о поїдання лише вельми малої частини корму, який було оброблено токсином, вони починали виявляти патологічні іо) симптоми, що їх викликав токсин, та припиняли поїдати корм. Екскременти комах ставали безбарвними, та більшість личинок виявляла ознаки діареї. Значна смертність комах спостерігалась, коли кілька доз по 5мкг 60 наносили на корм протягом періоду 7 - 10 днів.

Одержана шляхом розділу на агарозі смуга 1 значно інгібувала збільшення маси личинок при дозі 20Онг на личинку. Личинки, що отримували подібні концентрації білкової смуги 2 з кормом, не інгібувались та давали збільшення маси з тією самою швидкістю, що й контрольні личинки. Дванадцять личинок годували елюйованим білком та 45 личинок годували шматочками агарози, що містили білок. Ці два набори даних показують, що бо білкова смуга 1 була перорально токсичною для Мапдиса зехіа. У цьому експерименті, напевно, білкова смуга 2 не була токсичною для Мападиса зехіа.

Подальший аналіз білкових смуг 1 та 2 за допомогою електрофорезу у ППАГ-ДСН за денатуруючих умов показав, що кожна смуга складалась з кількох менших білкових субодиниць. Білки візуалізували забарвленням

Кумасі з подальшим забарвленням сріблом для досягнення максимальної чутливості.

Білкові субодиниці у цих двох смугах були дуже схожими. Білкова смуга 1 містить 8 білкових субодиниць 25,1, 56,2, 60,8, 65,6, 166, 171, 184 та 208кДа. Білкова смуга 2 мала ідентичний профіль за винятком того, що не були наявними білки 25,1, 60,8 та 65,бкДа. Білки 56,2, 60,8, 65,6 та 184кДа були наявні у комплексі білкової смуги 1 у приблизно однакових концентраціях та складали 8095 чи більше від загального вмісту білка цього комплексу. 70 Нативний ВЕРХ-очищений токсин характеризували далі таким чином. Токсин був термолабільним, оскільки після нагрівання до 602 протягом 15 хвилин він втрачав здатність вбивати чи інгібувати збільшення маси при ін'єкції або надання з кормом личинкам М. зехіа. Було створено тести для виявлення ліпазної активності, активності фосфоліпази С, нуклеазної активності чи активності гемолізу еритроцитів, та їх проводили з очищеним токсином. Не було виявлено жодної з цих активностей. Проводили також тести антибіотичного 7/5 зонального інгібування, та очищений токсин не інгібував ріст грамнегативних та грампозитивних бактерій, дріжджів або ниткоподібних грибів, а це свідчило про те, що він не є ксенорабдиновим антибіотиком.

Нативний очищений ВЕРХ токсин тестували на здатність вбивати комах, інших ніж Мападиса зехіа. У Таблиці 2 наведено список комах, що їх вбивав очищений ВЕРХ токсин Р. Іштіпезсепз у цьому дослідженні. ю

З вивйня яжа | Ряд | Рідтавид | Стсбдоставю сч о

Приклад 2 ю зо Застосовність як інсектициду

Далі було охарактеризовано застосовність та токсичність Рпоїюгпаврдиз Іштіпезсепз. Культуральний бульйон 89 штаму МУ-14 Рпоїюогпардиз Іптіпезсепе одержали у такий спосіб. Продукційним середовищем був 295 Васіо «

Ргоїеозе Реріопе" Митбрег З (РРЗ, Ойїсо І арогайогіев, ЮОеїгоїї, Міспідап) у деїонізованій МіШ-С" воді. Колби для культури для засівання, що містили 175мл середовища, приміщували у перегороджену на три частини по с

Б5ООмл колбу з горлом Делонга, закривали Кариї та автоклавували протягом 20 хвилин при температурі 2502 со (121,12). Продукційні колби містили 50Омл у колбі на 2,8л, яку було перегороджено на три частини по 500мл, з горлом Делонга, закрито пробкою з кремнійорганічного пенопласту Зпіп-еїви. їх автоклавували протягом 45 хвилин при 2502 (121,12). Культуру для засіву інкубували при 28 2С при 150об./хвил. у термостаті, що обертався та струшував, з ексцентриситетом 2 дюйми. Після 16 годин росту 195 культури для засівання « приміщували у продукційну колбу та давали їм рости протягом 24 годин до збирання. Продукування токсину 2 с відбувається, напевно, упродовж логарифмічної фази росту. Бульйон, що містив мікроби, переносили до й центрифугової пляшки на лл, та клітинну біомасу осаджували (30 хвилин при 2500об./хвил. при 4 с "» ІК.С.Р.--1600| НО-4ї Коїог КСЗБогуа! сепіптиде, Юиропі, УМіїтіпдіоп, ЮеїЇаулаге). Первинний бульйон охолоджували при 42С протягом 8 - 16 годин та повторно центрифугували принаймні протягом 2 годин (за умов, що описано вище) для подальшого освітлення бульйону шляхом вилучення можливого мукополісахариду, який (се) осаджується при стоянні. (Альтернативний спосіб обробки об'єднував обидві ці стадії та включав використання 16-годинного центрифугування для освітлення за описаних вище умов). Потім бульйон зберігали при 4 С до дк біотесту або фільтрування.

ФТ» Культуральний бульйон РІоіогпардиз та білковий токсин (токсини), які було очищено з цього бульйону, со 50 виявили активність (смертність та/або інгібування росту, зменшене вилуплення дорослих особин) щодо ряду комах. Більш конкретно, було виявлено активність проти блішки довговусої (личинок та дорослих особин),

ГА колорадського жука та газонних червоподібних личинок хрущика японського, що є членами ряду комах

СоіІеоріега. Інші члени ряду СоіІеоріега включають дротяників, квітогриза рапсового, земляних блошек, жуків, що поїдають насіння, та жуків-довгоносиків. Також спостерігали активність проти цикадки айстр, що є членом ряду Ноторіега. Інші члени Ноторіега включають цикад, листоблішку грушеву, мідяницю яблуневу, червеців, білокрилок та зрішШе-жуків, а також численні специфічні у відношенні до живителя види тлі. Бульйон та о очищені фракції є активними також проти совки малої, совки капустяної, совки іпсилон, совки тютюнової,

Ккз точильника зернового, совки бавовняної та плодожерки яблуневої, що є членами ряду І ерідорієга. Іншими типовими членами цього ряду є справжня міль, вогнівка амбарна південна, метелики-листовійки, совка 60 капустяна, совка бавовняна американська, мішечница поденкоподібна, коконопряд кільчастий американський, лучний метелик та совка трав'яна. Активність також спостерігалася проти плодової мушки звичайної та личинок комарів, що є членами ряду Оіріеєга. Іншими членами ряду Оіріега є галіця горохова, муха морквяна, муха капустяна весняна, муха ріпи, муха цибульна, довгоніг, муха кімнатна та різні види комарів. Активність спостерігали проти мурашки-деревоточця, мурашки аргентинського, які є членами ряду, що включає також б5 мурашку Ріхтера, мурашку кімнатного та мурашок малих.

Описані бульйон та фракція можуть застосовуватись для зменшення популяції комах та їх використовували у способі інгібування популяція комах. Спосіб може включати внесення до осередку комах ефективної кількості, яка інгібує комах, описаного активного начала. Результати наведено в таблиці 3.

Активність проти личинок блішки довговусої тестували таким чином. Культуральний бульйон Рпоогпардив (який було стерилізовано за допомогою стерилізуючого фільтру, безклітинний) або очищені за допомогою ВЕРХ фракції наносили безпосередньо на поверхню (-1,5см7) 0,25мл штучного корму у вигляді аліквот по ЗОмкл після розведення в контрольному середовищі або 10ММ фосфатному буфері, рН7.0, відповідно. Планшетам з кормом давали висохнути на повітрі у стерильному ламінарному боксі та лунки заражали однією новонародженою Біабгоїїса ипадесітрипсіага пожмагаї (блішкою кукурудзяною довговусою (Південною), СК), що 70 вилупилася з поверхнево стерилізованого яйця), а личинки другої вікової стадії ЗСК росли на штучному кормі, або личинки другої вікової стадії Оіабгоїїса мігойїега мігдіега (УУевіегп согп гооїуогт (блішки довговусої західної), МУСК) вирощували на проростках кукурудзи, що росли в Меїготіх". Личинки другої стадії зважували перед приміщенням на корм. Планшети герметизували, приміщували у зволожену камеру для вирощування та тримали при 272С протягом підхожого періоду часу (4 дні для новонароджених та дорослих особин ЗСК, 2 - 5 75 днів для личинок М/СК). Визначення смертності та маси оцінювали у балах, як зазначено. Як правило, в усіх дослідженнях використовували 16 комах на обробку. Смертність у контролях була такою: новонароджені личинки «5905, дорослі жуки - 5905.

Активність проти колорадського жука тестували так. Культуральний бульйон Ріоїогпардивз або контрольне середовище наносили на поверхню (-2,0см?) 1,5мл стандартного штучного корму, що знаходився у лунках 24-лункового планшета для культури тканини.

Кожна лунка отримувала 5Омкл бульйону, що його тестували, (обробка) та лункам давали висохнути на повітрі. Після цього окремі личинки другої вікової стадії колорадського жука (І ерііпоїагза десетіїпеаіа, СРВ) саджали на корм, та смертність оцінювали у балах після 4-го дня. В усіх дослідженнях використовували 10 личинок на обробку. Смертність в контролі сягала 3,395. с

Активність проти личинок та жуків (дорослих особин) хрущика японського тестували так. Газонні (5) червоподібні личинки хрущика японського (РоріШа |аропіса, 2-ої, 3-ої вікової стадії) збирали з зараженого лужку та тримали у лабораторії в суміші грунту з торфом та з шматочками моркви, що її додавали як додатковий корм. Газонних жуків ловили у пастках з феромоном, які було розташовано в деяких місцях, та тримали у лабораторії в пластикових контейнерах з листям клену, що було кормом. Після нанесення нерозчиненого Ів) культурального бульйону Рпоїогпардиз або контрольного середовища на штучний корм для блішки довговусої со (ЗОмкл/1,54см 7, для жуків) або на шматочки моркви (для личинок) комах обох стадій саджали по одній у лунки з кормом та спостерігали за смертністю та живленням. В обох випадках спостерігали явне зменшення поїдання ч корму (та утворення екскрементів). с

Активність проти личинок комарів тестували так. Тест проводили у 9б-лунковому мікротитраційному

Зо планшеті. Кожна лунка містила 200мкл водного розчину (культурального бульйону Рпоїогпараив, контрольного 9 середовища або води) та приблизно 20 одноденних личинок (Аедез аедурії) Для кожного варіанту використовували б лунок. Результати реєстрували за 2 години після зараження, та вони не змінювалися протягом триденного періоду спостереження. У контролі не було виявлено смертності. «

Активність проти плодової мушки звичайної тестували так. Середовище для ОгозорпійЇа теіаподавзіег готували з 5095 купленого сухого порошку та 5095 рідини (води, контрольного середовища або культурального бульйону - с Ріпоїюгпавдиз). Це виконували, приміщуючи 8,О0мл сухого середовища у кожен з трьох флаконів для вирощування "» для одного варіанту та додаючи 8,Омл відповідної рідини. Після цього у кожен флакон саджали десять личинок " Огозорпйа теїаподазіег. Флакони тримали на лабораторному столі при кімнатній температурі під світлом флуоресцентних ламп, що знаходились на стелі. Підрахунок ляльок або дорослих особин проводили після 3, 7 та 10 днів експозиції. Включення культурального бульйону до кормового середовища для личинок плодової со мушки звичайної спричинило невелике (1795), але значуще зменшення вилуплення на 10-ий день дорослих т особин порівняно з водою та контрольним середовищем (395 зменшення).

Активність проти цикадки айстр тестували так. Тест з внутрішнім прийманням для цикадки айстр (Масговіевіез г» звемегіп) побудовано таким чином, щоб допустити тільки проковтування активного начала, без іншого со 20 зовнішнього контакту. Резервуар для розчину активного почала/"корму" готували, зробивши 2 дірки у центрі донної частини чашок Петрі розміром З5х1Омм. Квадрат з Рагаїйїт М'"2 дюйми приміщували на верхню частину «сл чашки та закріплювали "0"-кільцем. Після цього пластикову чашку на 1 унцію заражали приблизно 7 цикадками та зазначений резервуар приміщували на цю чашку парафільмом донизу. Потім додавали тест-розчин до резервуару крізь дірки. У тестах з використанням нерозчиненого культурального бульйону" Ріпоїогпардивз 22 бульйон та контрольне середовище діалізували проти води, щоб зменшити контрольну смертність. Смертність о реєстрували на 2-й день, коли спостерігали 26,595 смертність у контролі. У тестах із застосуванням очищених фракцій (200мг білка на мл) використовували сахарозу у остаточній концентрації 595 в усіх варіантах для ко покращання виживання цикадок. Тест проводили в термостаті при 282С, 7090 відносної вологості з фотоперіодом 16 годин світла/8 годин темряви. Смертність визначали при 72 годинах. Смертність у контролі сягала 5,590. 60 Активність проти мурашки аргентинського тестували так. Аліквоту 1,5мл 10095 культурального бульйону

Ріпоюгпардив, контрольного середовища або води піпетували у прозорі скляні флакони на 2,0 мл. Флакони закупорювали шматочком ватного зубного тампону, який зволожували розчином відповідного варіанту. Кожний флакон приміщували до окремої чашки Петрі розміром бох1бмМ з 8 - 12 дорослими особинами мурашок аргентинських (Ііперійета Ппитіє). В кожному варіанті було три повторності. Чашки біотесту тримали на бо лабораторному столі при кімнатній температурі під світлом розташованих на стелі флуоресцентних ламп.

Смертність реєстрували після 5 днів експозиції. Смертність у контролі сягала 24905.

Активність проти мурашки-деревоточця тестували так. Робочих особин чорного мурашки-деревоточця (Сатропоїиз реппзуїмапісиз) збирали з дерев маєтку Юом/"ЕІапсо в Індіанаполісі, ІМ. Тести з культуральним бульйоном РІоїогпардиз проводили так. Кожен пластиковий контейнер для біотесту (7 1/8 дюйму х3 дюйми) містив 15 робочих особин, паперову підкладку та 1О0мл бульйону або контрольного середовища у пластиковій дозуючій склянці. Ватний тампон доставляв відповідний розчин до мурашок через отвір у кришці дозуючої склянки. Усі розчини містили 595 сахарозу. Біотести тримали у темряві при кімнатній температурі та оцінювали при 19 днях. Смертність у контролі дорівнювала 995. У тестах, в яких доставляли очищені фракції, 7/0 використовували штучний корм для мурашок, що його було змішано з відповідним розчином (очищеною фракцією або контрольним розчином) при співвідношенні О,2мл розчину на 2,0г корми у пластиковій тест-пробірці. Кінцева концентрація білка очищеної фракції була меншою за 1Омкг на грам корму. 10 мурашок на варіант, джерело води, підкладку та оброблений корм приміщували у запаковані (які було герметизовано) пластикові контейнери та тримали в темряві при 272С у зволоженому термостаті. Смертність оцінювали у балах 75 на 10-ий день. У контролі не спостерігали смертності.

Активність проти личинок різноманітних лускокрилих комах (І ерідоріега) тестували так. Культуральний бульйон РІПоїогпардиз або очищені фракції наносили безпосередньо на поверхню (-1,5см?7) 0,25мл стандартного штучного корму у вигляді аліквот по ЗОмкл після розведення у контрольному середовищі або 10ММ буфері з фосфату натрію, рН7,0, відповідно. Планшетам з кормом давали висохнути на повітрі у стерильному ламінарному боксі та лунки заражали окремими новонародженими личинками. Яйця точильника зернового (Озігіпіа пибііаійв) та совки кукурудзяної (Неїїсомегра геа) одержували з комерційних джерел та вилуплення проводили в лабораторії, тоді як личинки совки малої (Зродоріега ехідца), совки капустяної (Тгіспоріивіа пі), совки тютюнової (Неїїоїпіз мігезсепз), плодожерки яблуневої (І азреугезіа ротопегІа) та совки іпсилон (Адгоїі5 ірзіоп) збирали самі. Після зараження личинками планшети з кормом герметизували, приміщували до Ге зволожених камер для вирощування та тримали у темряві при 27 «С протягом підхожого періоду. Визначення о смертності та маси у балах проводили на 5-7-ий дні для культурального бульйону Ріоюгпарадиз та на 4 - 7-ий дні для очищеної фракції. Як правило, в усіх дослідженнях використовували 16 комах для кожного варіанту.

Контрольна смертність була у межах 4 - 12,595 у випадку контрольного середовища та була меншою за 1095 для фосфатного буферу. Іо) со з та фракції очищеного токсину на смертність та інгібування росту різних рядів/видів комах зв со бавовна 000001

Блшка довюя 11111111 « « З с

З Колорадсьий юю 00000010 .

Газоннічервяки рущикяюньий 00100011

Зявковастдя 00000015 а600в в со доросли 00000016 фо) бета 0001 з з» зо емо З со (п вумемортєвя 00001

ВЕРІВОРТЕВА ЛГ о

Совюатеяют 111000011111111101080001в000000 2 ве! щ бо Приклад З

Застосовність як інсектицидів при внесенні до грунту

Було показано, що культуральний бульйон штаму Му/-14 Ріоїогпардиз Іштіпезсепз є активним проти блішки довговусої при внесенні безпосередньо до грунту або до грунтової суміші (Меїготіх"). Активність проти новонароджених ЗСК та М/СК у Меїготіх" тестували так (Таблиця 4). Тест проводили з використанням проростків кукурудзи (Опіедй Адгізеедз бгапа Сі 614), що пророщували на світлі на вологому фільтрувальному папері протягом 6 днів. Після того як коріння досягало довжини З - бсм, окреме зерно/проросток висаджували у прозору пластикову чашку на 591мл з 50г сухого Меїготіх". Після цього двадцять новонароджених ЗСК або

М/СК приміщували безпосередньо на коріння проростку та закривали Меїготіх". При зараженні проростки потім 7/0 Змочували розрідженим розчином бульйону, загальний об'єм якого сягав 5Омл. Після змочування чашки герметизували та залишали при кімнатній температурі на світлі впродовж 7 днів. Після цього проростки промивали для вилучення всього Меїготіх" та коріння відрізали та зважували. Активність виражали у вигляді відсотків коріння кукурудзи, що залишилося, у відношенні до контрольних рослин та у вигляді пошкодження листя, що його спричинили личинки, які його поїдали. Пошкодження листя оцінювали у балах візуально та /5 Виражали як -, ж, як або кн, причому - означає відсутність пошкодження, а т означає значне пошкодження.

Активність проти новонароджених 5СК в грунті тестували так (Таблиця 5). Тест виконували, використовуючи проростки кукурудзи (ОпієФейд Адгізееаз Вгапа СІ 614), які пророщували на світлі на вологому фільтрувальному папері протягом 6 днів. Після того як коріння сягало довжини З - бсм, окреме зерно/проросток висаджували у прозору пластикову чашку на 59їмл з 150г грунту, який було взято з поля у І ерапоп, ІМ, де минулого року 2о Вирощували кукурудзу. Цей грунт раніше не обробляли інсектицидами. Після цього двадцять новонароджених

ЗСК приміщували безпосередньо на коріння проростка та покривали грунтом. Після зараження проростки змочували розрідженим розчином бульйону, загальний об'єм якого сягав 5О0мл. Після змочування незакриті чашки інкубували у камері з високою відносною вологістю (80905) при 782. Після цього проростки промивали, щоб видалити весь грунт, та коріння відрізали та зважували. Активність виражали у вигляді відсотків коріння с

Кукурудзи, що залишилося, у відношенні до контрольних рослин та у вигляді пошкодження листя, що його спричинювали личинки, що поїдали його. Пошкодження листя оцінювали візуально у балах та виражали у о вигляді -, к, -- або я, причому - означає відсутність пошкодження, а ї-- означає серйозне пошкодження. ю : на личинки блішки довговусої після змочування бульйоном після зараження (Меїготіх") (ее)

Блшна довтвую Педан | 0111 з ве 00000000 ожив тю, сч зв Середовище (фожовюю 00000000 ояятеоюгю 100 со

Бужюнваєжосю 20000000 оявисосви 1

Бульйон (вожевює 000я00000000-000000 ово я ч 2 Блшна довтюутя Задня 11111111 но с ва 00000000 ямою тю, ї» Бульйон (фововюю 00020000 |ояовеоююю оо ве 00000000 ооо

Бульюносжовю 10510000 зво вв со ю

Вплив культуральвого бульйону штаму М/-14 Рпоїогпардив Іштіпевсепв ь со вд 00000010 оомеюстм о є Булеюн ово 00201000 ожютою 105

Бик фожовю 10201110 олжювююю | м5 о Активність культурального бульйону штаму МУ-14 Рпоїюгпардивз Іштіпезсепз проти газонних червоподібних личинок другої вікової стадії в Мейготіх" спостерігали у тестах, які проводили так (Таблиця 6). Приблизно 50г ко сухого Меїготіх" додавали до прозорої пластикової чашки на 59Імл. Потім Меїготіх" просочували загальним об'ємом 5Омл 5095 (об./о6.) розрідженого розчину бульйону Рпоюгпаврдиз, вихідний бульйон розбавляли водою, 60 причому 5095 бульйон готували, додаючи 25мл вихідного бульйону до 25мл води з отриманням загального обсягу 5Омл. 195 (маса/об'єм) розчин Ргоїеозе Реріоп Мо3 (РРЗ), що є 5095 розбавленням концентрації нормального середовища, використовували як контрольний бульйон. Після просочування 5 газонних черв'яків другої вікової стадії приміщували на верхню поверхню зволоженого Меїготіх". Здорові личинки швидко ховалися в Мейготіх". Личинки, що не ховалися в межах 1 години, вилучали та замінювали свіжими личинками. Чашки бо» герметизували та приміщували в термостат на 282С в темряві. Після 7 днів личинок виймали з Меїготіх" та оцінювали їх смертність у балах. Активність виражали у вигляді відсотку смертності по відношенню до контролю. перед зараженням (Меїготіх")

Приклад 4

Застосовність як інсектицидів при нанесенні на лист

Активність бульйону РІИоїогпардиз проти точильника зернового спостерігали, коли бульйон наносили 12 безпосередньо на поверхню листя кукурудзи (Таблиця 7). В цих тестах бульйон Рпоїогпардивз розбавляли в 100 разів культуральним середовищем та наносили вручну на поверхню відрізаного листя кукурудзи при «6,Омкл/см поверхні листа. Листя сушили на повітрі та розрізали на смуги рівного розміру приблизно 2 х2 дюйми. Листя скручували, закріплювали скріпками для паперу та приміщували в пластикові дозовані склянки на 1 унцію з 0,25 дюйму 295 агару на дні для забезпечення вологості. Дванадцять новонароджених точильників приміщували на згорнутий лист, та чашки герметично закривали. Після інкубування протягом 5 днів при 27 «С в темряві проби оцінювали в балах на пошкодження, що спричинюється поїданням листя, та витягали личинки. о точильника зернового після нанесення бульйону на зрізане листя кукурудзи перед зараженням ге) що

Активність культурального бульйону проти новонароджених личинок совки тютюнової (Неїоїйпіз мігезсепв) со було показано з використанням методології занурення листя. Свіже листя бавовнику відрізали від рослини та ЧЕ вирізали листові диски (висічки) пробочним свердлом 18,5мм. Диски окремо занурювали до контрольного середовища (РРЗ) або культуральний бульйон штаму МУ-14 РВІойогпардивз Ішптіпезсепе, що його було см сконцентровано приблизно у 10 разів за допомогою Атісоп (Вемепу, МА) з тангенціальною фільтраційною «Фо системою Ргойих М12 з фільтром 1ОкДа. Надлишок рідини видаляли та випрямлену скріпку для паперу закріплювали через центр диску. Після цього скріпку закріплювали (втикали) у пластиковій дозованій склянці на 1 унцію, що містила приблизно 2,Омл 195 агару. Це робили для того, щоб підвісити диск вище рівня агару. Після « висушування листового диску одну новонароджену личинку совки приміщували на диск та чашку закривали.

Потім чашки герметизували у пластиковому мішку та приміщували до затемненого термостату при 272С на 5 (Ще с днів. Після цього періоду часу личинок, що залишалися, та листовий матеріал зважували, щоб визначити міру "з пошкодження листя (Таблиця 8). п со ю т» со Є «сл Приклад 5. Частина А

Характеристика пептидних компонентів токсину

У подальшому аналізі білкові субодиниці токсину смуг, які було виділено так, як описано у Прикладі 1, 22 розділяли на 795 пол і акриламідному гелі для електрофорезу з співвідношенням 30:0,8 (акриламід:біс-акриламід), який містить ДСН. Цей гелевий матрикс дає найкраще розділення великих білків. о Система гелю, яку застосовували для визначення молекулярних мас субодиниць Смуги 1 та Смуги 2 у Прикладі ке 1, була 1895 гелем з співвідношенням 38:0,18 (акриламід :біс-акриламід), що дозволяло розділити більш широкий діапазон розмірів, але давало гірше розділення високомолекулярних компонентів. бо В цьому аналізі одержували скоріше 10, ніж 8, смуг. У Таблиці 9 наведено розраховані молекулярні маси 10 отриманих смуг та безпосередньо порівняно молекулярні маси, які було визначено за цих умов, з молекулярними масами попереднього прикладу. Не є дивним те, що було виявлено додаткові смуги за різних умов розділення в цьому прикладі. Варіації між попередніми та новими визначеннями молекулярної маси слід було очікувати через відмінність умов аналізу. При аналізі цього прикладу вважали, що більші величини бо молекулярних мас є більш точними, ніж величини у Прикладі 1, внаслідок кращого розрішення. Однак, ці оцінки грунтуються на аналізі за допомогою електрофорезу в ПААГ-ДСН, що, як правило, не є аналітично точним та дає оцінки пептидів, які може бути додатково змінено в результаті пост- та котрансляційних модифікацій.

Визначали амінокислотні послідовності для М-кінцевих частин п'яти з 10 отриманих пептидів. У Таблиці 9 наведено порівняння молекулярної маси білків та послідовностей, які було ідентифіковано. У випадку ЗЕО ІЮ

Мо2 деякі аналіз припускають, що пролін у позиції 5 може бути аспарагіном (азп). В випадку ЗЕО ІЮ МоЗ3 деякі аналізи припускають, що амінокислотні залишки в позиціях 13 та 14 обидва є аргініном (ага). В випадку ЗЕО ІЮ

Мо4 деякі аналізи припускають, що амінокислотний залишок у позиції б може бути аланіном (аа) або серином (зег/. В випадку ЗЕО ІЮ Мо5 деякі аналіз припускають, що амінокислотний залишок у позиції З може бути аспарагіновою кислотою (азр). ів аналітично точним.

Приклад 5. Частина В

Характеристика пептидних компонентів токсину

Нову М-кінцеву послідовність, ЗЕО ІЮ Мо15, АІа СіІп Авзр Су Авп Сп Авр Тиг Ре Зег Су Авп Тиг, одержували шляхом подальшого М-кінцевого секвенування пептидів, які було виділено з нативного очищеного за допомогою сч 29 ВЕРХ токсину, як описано вище у Частині А Прикладу 5. Цей пептид кодується геном ісаА. Пептид, що Ге) називається Тсад;, починається у позиції 254 та сягає до позиції 491, де починається пептид ТсаА;;, ЗЕ ІЮ Мо4.

Розмір цього пептиду, який визначено на основі генної послідовності, дорівнює 25240Да.

Приклад 6

Характеристика пептидних компонентів токсину о

Ще в одному аналізі білюювий комплекс токсину повторно ізолювали з середовища для вирощування с

РІоїюгпавдиз Істіпезсепз (після культивування без Твіну) шляхом осадження сульфатом амонію (1095 - 8090) з наступною стадією іонообмінної хроматографії (Мого С) та двома стадіями гель-фільтрування. Ці умови подібні Я до умов, що використовувалися в Прикладі 1. Впродовж першої стадії визначення розміру молекул Га (гель-фільтрування) було виявлено другий біологічно активний пік приблизно 100 41ОкДа. На основі вимірів білка, ця фракція була в 20 - 50 разів менш активна, ніж великий (або первинний) активний пік приблизно со 860-100кДа (нативний). Під час цього експерименту по виділенню було також отримано активний пік меншого розміру приблизно 325-50кДа, що зберігав значну частину початкової біологічної активності. Припускалося, що пік 325кДа стосується до піку 8б0кДа або утворюється з нього. «

В цьому аналізі було отримано білок 5бкДа. М-кінцеву послідовність цього білка наведено у ЗЕС ІЮ Моб. з с Заслуговує на увагу те, що цей білок поділяє значну ідентичність та консервативність з ЗЕО ІЮ Мо5 при М-кінці, що дозволяє припустити, що ці два білки можуть кодуватись різними членами сімейств генів та що білки, які :з» продукуються кожним геном, є достатньо схожими, щоб бути активними в інсектицидному комплексі токсину.

Другий помітний білок 185кДа був стійко наявним у кількості, порівняної з кількістю білка З з Таблиці 9, таможе бути тим самим білком або білковим фрагментом. М-кінцева послідовність білка 185кДа показано в 5ЕО о ІО Мо7.

Додаткові дані щодо М-кінцевих амінокислотних послідовностей було також отримано з виділених білків. ко Жодна з визначених М-кінцевих послідовностей, очевидно, не є ідентичною білку, який було ідентифіковано в їх таблиці 9. У виділеному препараті були наявні й інші білки. Один з таких білків має визначену молекулярну

Масу 108кДа та його М-кінцеву послідовність показано в ЗЕО ІЮО Мо8. Другий такий білок має визначену о молекулярну масу 8О0кДа, та його М-кінцеву послідовність показано в ЗЕО ІЮ Мед. сл При аналізі за розміром білкового матеріалу в активному піку приблизно 325кДа спостерігали смуги приблизно 51, 31, 28 та 22кДа. Як й в усіх випадках, коли молекулярну масу визначали аналізом електрофоретичної рухливості, ці молекулярні маси піддавались ефектам помилок, які були пов'язані з відмінностями іонної сили буферів, різними потужностями при електрофорезі тощо. Фахівцю у цій галузі зрозуміло, що остаточні величини молекулярних мас не можна визначити цими стандартними способами та що

ГФ) кожна молекулярна маса зазнавала варіацій. Було висловлено гіпотезу, що білки цих розмірів являють собою з продукти деградації великих молекул білків (з розміром приблизно 200кДа), що їх спостерігали у більшому первинному комплексі токсину. во Нарешті, деякі препарати містили білок, що мав М-кінцеву послідовність, яку показано в ЗЕО ІЮ Мо10. Ця послідовність мала сильну гомологію з відомими білками-"наставниками", допоміжними білками, що, як відомо беруть участь у збиранні великих білкових комплектів.

Хоча заявники не змогли б приписати таку функцію збирання білку, який ідентифіковано в 5ХЕО ІЮ Мо10, це погоджується з існуванням описаного білкового комплексу токсину, так що такий білок-"наставник" міг би брати дв участь в його збиранні. Крім того, хоча прямо не припускалося, що такі білки мають токсичну активність, цей білок міг би бути важливим для визначення загальної структурної природи білкового токсину та, отже, міг би сприяти токсичній активності або тривалості існування цього комплексу іп мімо після пероральної доставки.

Було використано такий аналіз стабільності білкового комплексу токсину до протеїнази К. Було показано, що після 24 годин інкубації комплексу в присутності 10-кратного молярного надлишку протеїнази К активність по суті зникла (смертність при пероральному введенні зменшувалась до приблизно 595). Ці дані підтверджують білкову природу токсину.

Токсична активність утримувалася також діалізною мембраною, що також підтверджує великий розмір нативного комплексу токсину.

Приклад 7 70 Виділення, характеристика та часткове амінокислотне секвенування токсинів Рпоїюгпарадив

Виділення та секвенування М-кіндевих амінокислот:

У ряді експериментів, які проводили паралельно з Прикладами 5 та 6, осадження сульфатом амонію білків

РІіоїюгпардиз проводили шляхом доведення бульйону РІоіогпардив, як правило 2 - З літрів, до кінцевої концентрації 1095 або 2095 повільним доданням кристалів сульфату амонію. Після перемішування протягом 1 7/5 години при 49 матеріал центрифугували при 12000х9 протягом ЗО хвилин. Супернатант доводили до 8090 сульфату амонію, перемішували при 49С протягом 1 години та центрифугували при 12000 х9 протягом 60 хвилин. Осад повторно суспендували в 1/10 об'єму 10мММ Ма»РБО,, рН7,О та діалізували проти того самого фосфатного буферу протягом ночі при 42С. Матеріал, який було діалізовано, центрифугували при 12000 ха протягом 1 години перед іонообмінною хроматографією.

Аніонообмінну колонку НК 16/50 0 Зерпагозе (Ріпагтасіа) врівноважували 10ММ МаоРБО»Х, рН, 0. Осад, який було центрифуговано та діалізовано, отримано осадженням сульфатом амонію, наносили на колонку С

Зерпагозе при швидкості 1,5мл/хвил. та промивали ретельно при З,Омл/хвил. буфером для врівноваження до тих пір, доки оптична густина (0.0. 280) не сягала величини меншої 0,100. Потім колонку елюювали або 60О-хвилинним градієнтом Масі (від 0 до 0,5М при Змл/хвил.), або проводили ступінчасту елюцію звикористанням.ї У 0О1М, 04М та нарешті 1,0М Мас! протягом 60 хвилин (кожний). Фракції об'єднували та концентрували за допомогою Сепігіргер 100. Альтернативно, білюи можна елюювати одним промиванням 0,4М Масі без і) попередньої елюції 0,1М Масі.

Аліквоти по 2мл проб, які було концентровано, з С) Зерпагозе наносили при швидкості О,5мл/хвил. на гель-фільтраційну колонку НК 16,50 Бирегозе 12 (Рпагтасіа), урівноважену 10мМ Ма»РО,), рН7,О. Колонку цю промивали тим самим буфером протягом 240 хвилин при 0,5мл/хвил. та збирали 2-хвилинні проби. Матеріал вільного об'єму збирали та концентрували за допомогою Сепігіргер, 100. Аліквоти по 2мл проб, що со концентрувалися, з Зурегозе 12 наносили при швидкості 0,бмл/хвил. на гель-фільтраційну колонку НК 16/50 чІ

Зерпагозе 48-СІ (Рпаптасіа), урівноважену 10мММ МаоРО,, рН7,О. Колонку промивали тим самим буфером протягом 240 хвилин при 0,5мл/хвил. та збирали 2-хвилинні проби. с

Білковий пік, який було виділено, піддавали другому фракціонуванню шляхом нанесення на с гель-фільтраційну колонку з Зерпагозе СІ -48, що розділяє білки в діапазоні від "ЗОкДа до 1000кДа. Цю фракцію розділяли на колонці на два піки: мінорний пік при вільному об'ємі (21000ОкДа) та основний пік, що елюювався при середній мол. масі приблизно 8бОкДа. Протягом періоду одного тижня наступні проби, що їх піддавали гель-фільтруванню, виявили поступову появу третього піку (приблизно 325кКДа), який, напевно, виникав з « 470 основного піку, можливо, внаслідок обмеженого протеолізу. Біотести, які було проведено на цих трьох піках, з с показали, що пік вільного об'єму не мав активності, тоді як фракція 8б0кДа комплексу токсину була ц високоактивною, а пік 325кДа був менш активним, хоча й цілком активним. Аналіз піків комплексу токсину з "» різних ферментаційних процесів, отриманих з використанням Зерпагозе СІ -48, за допомогою електрофорезу в

ПААГ-ДСН виявив два різних розподіла пептидів, які позначено як "Р" та "5". Ці два розподіли пептидів мали помітні відмінності в молекулярних масах та концентраціях пептидних компонентів в їх фракціях. Розподіл "5", (се) який одержують частіше за все, мав 4 високомолекулярних пептиду ( »150кДа), тоді як розподіл "Р" мав З високомолекулярних пептиду. о Крім того, було виявлено, що пептидна фракція "5" має в 2 - З рази більшу активність проти точильника с» зернового. Це зміщення може бути пов'язане з модифікаціями в експресії білка, пов'язаними з віком інокуляту та/або з іншими факторами, що грунтуються на параметрах росту культур, які старіють. со Кількість близько мг фракцій комплексу токсину, що їх визначено як розподіл пептидів "Р" або "5", с піддавали препаративному електрофорезу в ПААГ-ДСН та транс-блотингу з Трис-гліцином (Зергарийтм РМОЕГ тетрбгапез (РгоВіоїєтм, Арріїей Віозувіетв) протягом З - 4 годин. Блоти посилали для амінокислотного аналізу та М-кінцевого секвенування амінокислот до Нагмага МістоСпет та Сатрбгідде РгоСпет, відповідно. Три пептиди 22 в розподілі "З" мали унікальні М-кінцеві амінокислотні послідовності порівняно з послідовностями, що ідентифікувалися в попередньому прикладі. Пептид 201кДа (ТсаА;), який наведено у вигляді зХЕО ІЮ Мо13 має і) 33905 ідентичних амінокислот та 5095 схожих амінокислот з ЗЕС ІЮО Мої (ТсрА;) (Таблиця 10, де вертикальні

Ккз лінії означають амінокислотну ідентичність, а двокрапки вказують заміни консервативних амінокислот). Другий пептид 197кДа, ЗЕО ІЮ Мо14 (Тсав), мав 4295 ідентичність та 5895 гомологію з ЗЕО ІЮ Мо2 (ТсасС). Третій пептид бо 205кДа було позначено як ТсаА;. Крім того, обмежена М-кінцева амінокислотна послідовність, ЗЕО ІЮ Мо16 (ТеБА), пептиду принаймні 235кДа була ідентичною в гомології з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ Мо12, яку було розшифровано з клонованого гену (сБА), ЗЕО ІЮО Мо11, та яка містила розшифровану амінокислотну послідовність, що відповідала 5ЕС І Мої (ТсрА;). Це вказує на те, що більш великий пептид 2З35кДа протеолітично перетворювався на пептид 201кДа, (ТсБА 5), (ЗЕБО ІЮО Мої) під час ферментації, можливо, 65 спричинюючи активацію молекули. У випадку ще однієї послідовності, послідовності, яку спочатку було розкрито як БЕО ІЮ Мо5 (ТсавВ;) в Прикладі 5 вище, було виявлено, що вона містить залишок аспарагінової кислоти (Авр)

у позиції З, а не гліцин (СіІу) та дві додаткові амінокислоти Сіу та Азр в позиціях 8 та 9, відповідно. У випадку ще двох інших послідовностей, ЗЕБЕО ІЮ Мо2 (Тсас) та 5ЕО ІЮ Моз3 (Тсав), було одержано додаткові амінокислоти. Денситометричні визначення виконували, застосовуючи пробу, що була ідентичною препарату "5", який було відіслано на аналіз М-кінцевої послідовності. Цей аналіз показав, що пептиди 201кДа та 197кДа складають 7,095 та 7,295, відповідно, загального білка в розподілі "5", що його забарвлюють Кумасі (Соотазвззіеє

Бгійапі Біце), та наявні в кількостях, подібних до інших пептидів, що утворюють більші кількості.

Обговорюється, що ці пептиди можуть бути білковими гомологами, аналогічно до ситуації, виявленої для інших бактеріальних токсинів, таких як різноманітні токсини Сгу! Ві. Ці білки дають варіації від 4095 до 9090 7/0 гомології у їх М-кінцевій амінокислотній послідовності, що включає їх токсичний фрагмент.

Секвенування внутрішньої амінокислотної послідовності:

Для полегшення клонування генів пептидів токсину внутрішні амінокислотні послідовності вибраних пептидів одержували так. Кількість близько кількох міліграмів фракцій піка 2А, що їх визначено як пептидні розподіли "Р" або "5", піддавали препаративному електрофорезу в ПААГ-ДСН та транс-блотингу з Трис-гліцином 7/5 (Зергарийтм на РМОРБ-мембранах (РгоВіойтм, Арріїей Віозувіетв) протягом З - 4 годин. Блоти посилали на амінокислотний аналіз та М-кінцеве секвенування амінокислот до Нагуага МісгоСпет та Сатьгідде РгооСНет, відповідно. Три пептиди, які називають ТебА;, (що містить ЗЕО ІЮО Мо), ТсаА;, та Тсаві (що містить ЗЕО ІЮ Мо3), піддавали розщепленню трипсином в Нагмага МісгоСпет з подальшою ВЕРХ для розділення індивідуальних пептидів.

Аналіз М-кінцевих амінокислот виконували на вибраних пептидних фрагментах, отриманих при розщепленні трипсином. Два внутрішніх пептиду секвенували для пептиду ТсаВ; (пептиду 205кДа), які названо Тсав РІЇ (ЗЕО ІО Мо17) та Тсав/-Р179 (ЗЕО ІО Мо18). Два внутрішніх пептиду секвенували для пептиду ТсаВ; (пептиду бакДа), які названо Тсав -РТ158 (5ЕБО ІЮО Мо19) та Тсав/-РТ108 (ЗЕ ІО Мо20). Чотири внутрішніх пептиду секвенували для пептиду ТебА | (пептиду 201кДа), які названо ТерА -РТ103 (ЗЕО ІО Ме21), ТсрА-РТЗб(ЗЕОЮ су

Мо22), ТеЬА;-РТ81 (а) (ЗЕО ІО Мо23) та ТерА-РТВ81 (Б) (ЗЕО ІЮ Мо24). о

Таблиця 10 ів)

М-кінцеві амінокислотні послідовності со 201 кДа (335 ідентичність та 507 схожість з БЕО ІЮ Де 1) ч с ї І с У н Кк о; Е 5 Ге Ж А БЕО ТО Ме 13 с : І 1 |: «

КЕ 0 000яї 089 ЕЕ сн 0 - А 5БЕОтТО Ла шо с "з 197 кДа (д2» ідентичність та 5385 схожість з БЕО ТО Ло 2)

М 0 М 8 0 т ЕЕ 5 У б ЕЕ її 5ЕОТОЮ/Ле14 со юю | 1 : 1 | 1 :

ФТ»

М о р 5 ? Е У 5 1 Т т ї. 5ЕО то Мо 2 со (л

Приклад 8

Конструювання космидної бібліотеки геномної ДНК РІоїогпардиз Ішптіпезсепе МУ-14 та її скринінг для

Виділення генів, що кодують пептиди, які містяться в препараті токсичного білка

Необхідною умовою для отримання токсичних для комах білків Рипоіогпардиз в гетеро логічних живителях та (Ф; для інших застосувань є виділення та характеристика генів, що кодують ці пептиди. Цим завданням займалися т паралельно. Один підхід, який буде описано нижче, грунтується на використанні моноклональних та поліклональних антитіл, індукованих проти очищеного токсину, які потім використовували для виділення клонів з бо експресійної бібліотеки. Інший підхід, що його описано в цьому прикладі, грунтується на використанні даних про М-кінцеву та внутрішню амінокислотну послідовність для конструювання вироджених олігонуклеотидів для застосування їх в ПЦР-ампліфікації. Кожен спосіб можна використовувати для ідентифікація клонів ДНК, що містять кодуючі пептид гени, таким чином, щоб зробити можливим виділення відповідних генів та визначення послідовності основ їх ДНК. 65 Виділення геномної ДНК:

Штам МУ-14 Рпоогпардиз Іютіпезсепз (АТСС ассевзвіоп питрег 55397) вирощували на 295 агарі Ргоїеово

Реріоп Моз (Ойїсо І арогайюгієев, ЮОеїгої, МІ) та компетентність інсектицидного токсину підтримували шляхом біотестів, що повторювалися, після пасажу, за допомогою засобу, який описано в Прикладі 1 та вище. 5Омл культури, що її струшували, одержували в колбах з перегородками на 175мл в середовищі з 295 Ргоїеозе Реріоп

Мо3, вирощування проводили при 289С та 150об./хвил. протягом приблизно 24 годин. 15мл цієї культури осаджували та заморожували в її середовищі при -202С до того часу, коли її розморожували для виділення ДНК.

Культуру, яку було розморожено, центрифугували (700х9, ЗОхвил.) та оранжевий мукополісахаридний матеріал, що плавав, видаляли. Клітинний матеріал, що залишався, центрифугували (25000 хо, 15хвил.) для осадження бактеріальних клітин та середовище видаляли й викидали.

Геномну ДНК виділяли адаптацією способу ЦТАБ, який описано в розділі 2.4.1 Сиггепі Ргоосоїв іп МоїІесшаг

Віоіоду І(А!йзивеї еї аї., едз дойп УМПеу апа бопз, 1994), що модифікувався для включення в нього сольового шоку та із збільшенням всіх об'ємів в 10 разів. Осаджені бактеріальні клітини повторно суспендували в

ТЕ-буфері (10мМ Трис-НСІ, 1мММ ЕДТК, рНе,0) до кінцевого об'єму 10мл, потім додавали 12мл 5М Масі; цю суміш центрифугували протягом 20 хвилин при 15000 ху. Осад повторно суспендували в 5,/мл ТЕ та до суспензії додавали ЗбОмл 1095 ДСН та боОмл протехнази К 2Омг/мл (Сірсо ВК. Ргодисів, Сгапа Ізіапа, ММ; в стерильній дистильованій воді). Цю суміш інкубували при 372С протягом 1 години; після цього додавали приблизно 1Омг лізозиму (УМогіпіпдіоп Віоспетіса! Согр., Егеепоїд, МУ). Ще за 45 хвилин додавали мл 5М Масі та 800мл розчину

ЦТАБ/Масі (1095 мас./об. ЦТАБ, 0,7М Масі). Цей препарат інкубували 10 хвилин при 652С, потім обережно перемішували та інкубували далі та перемішували протягом приблизно 20 хвилин для виведення клітинного матеріалу. Додавали рівний об'єм розчину хлороформ/ізоаміловий спирт (241, об./об.), обережно перемішували та центрифугували. Після двох екстракцій рівним об'ємом ФХІ (фенол/хлороформ/ізоаміловий спирт; 50:49:1, об/об/об, зрівноваження 1 М Трис-НСІ, рНаВ,О; Іпіегтоипіаійп Зсіепіййс Согрогайоп, КаузмШе, ОТ), ДНК осаджували 0,6 об'ємами ізопропанолу. Осад ДНК обережно видаляли скляною паличкою, промивали двічі 70905 етанолом, сушили та розчиняли в 2мл СТЕ (10мМ Трис-НСІ, рНа8,О, 10мМ Масі, 1мММ ЕДТК). Цей препарат містив се 29 2,Бмг/мл ДНК, як визначено за оптичною густиною при 2б0Онм (тобто ОЮ»ово). о

Діапазон молекулярних розмірів виділеної геномної ДНК оцінювали на придатність для конструювання бібліотеки. СНЕР-аналіз на гелі виконували в 1,595 агарозних (Зеакет? ГЕ, ЕМ5 ВіоРгодисів, КосКіапа, МЕ) гелях з О,5х ТБЕ-буфером (44,5мМ Трис-НСЇ, рнНа,0, 44,5мМ НьВО», 1мММ ЕДТК) на пристрої Віокад СНЕР-ОК 11 з

Риїзежмаме 760 Зм/йспег (ВіоКкаай І арогайгієв, Іпс., Кісптопа, СА). Параметри переміщення в гелі: початковий А юю час, Зсек.; кінцевий А час, 12 сек.; 200 вольт; температура 4 - 1892С; час форезу, 16,5 годин. Забарвлення с етидійбромидом та дослідження гелю під УФ світлом показали ДНК в діапазоні розмірів 30-25О0т.п.н.

Конструювання бібліотеки: ча

Частковий гідролізат ЗаизА 1 було отримано з цього препарату геномної ДНК РПоіїогпардив. Спосіб сеч грунтується на розділі 3.1.3 Аивибре! (зирга). Адаптації включали проведення реакцій меншого масштабу за со різних умов до тих пор, доки не досягали майже оптимальних результатів. Проводили декілька широкомасштабних реакцій з різними умовами, результати аналізували в СНЕРБ-гелях та вибирали тільки найкращий широкомасштабний спосіб проведення реакції. В такому оптимальному випадку 200мкг геномної ДНК

Рпоюгнабрдиз інкубували з 1,5 одиницями ЗаизА І (Мем Епдіапа Віоїарв, "МЕВ", Вемепу, МА) протягом 15 хвилин « 20 при 372С в 2мл загального об'єму їх МЕВ 4-буферу (що поставляється у вигляді 10х виробником). Реакцію З с зупиняли доданням 2мл ФХІ та центрифугуванням при 8000 худ протягом 10 хвилин. До супернатанту додавали 200мкл 5М Масі та бмл охолодженого на льоду етанолу. Цей препарат охолоджували протягом 30 хвилин при :з» -202С, після цього центрифугували при 12000х9 протягом 15 хвилин. Супернатант видаляли та осад сушили у вакуумній сушильній шафі при 402С, після цього повторно суспендували в 400мкл СТЕ. Спектрофотометричний аналіз показав приблизно 4095 здобування введеної ДНК. Розщеплену ДНК фракціонували за розміром на о сахарозному градієнті відповідно до розділу 5.3.2 СРМВ (цит. вище). Лінійний сахарозний градієнт 10905 - 4095 готували з пристроєм для приготування градієнтів у пробірках ШКга-Сіваг (ВесКтап Іпзігитепів, Іпс., Раїо ле А, СА) та пробу ДНК нашаровували на градієнт. Після центрифугування (26000об6./хвил., 17 годин, ротор ЗМУ4А1 ї» ВесКтап, 2022) фракції (приблизно 75Омкл) відтягували з верхньої частини градієнта та аналізували за допомогою електрофорезу в СНЕР-гелі (як описано раніше). Фракції, що містять заизЗА 1-фрагменти в діапазоні со розмірів 20 - 40т.п.н., відбирали та ДНК осаджували модифікацією (кількості усіх розчинів збільшували с приблизно у 6,3 разів) способу в розділі 5.3.3 А!йзибеї! (зирга). Після осадження протягом ночі ДНК збирали центрифугуванням (17000 х9, 15хвил.), сушили, повторно розчиняли в ТЕ, об'єднували в кінцевий об'єм 8Омкл та повторно осаджували доданням Змкл ЗМ ацетату натрію та 220мкл етанолу. Осад, який було зібрано центрифугуванням, як описано вище, повторно суспендували в 12мкл ТЕ. Концентрацію ДНК визначали, застосовуючи флюорометрію з барвником Ноеспиві 33258 (Роїузсіепсев, Іпс., ММагіпдіоп, РА) у флуорометрі (Ф, Ноеїег ТК 100 (Ноетег Зсіепійіс Іпвігитепів, Зап Егапсізсо, СА). Здобували приблизно 2,5мкг фракціонованої

Го) за розміром ДНК.

Тридцять мкг ДНК космиди руУУЕ15 (Зігаїадепе, а доМа, СА) розщепляли повністю з 100 одиницями 60 рестриктази ВатН І (МЕВ) в буфері виробника (кінцевий об'єм 20Омкл, 372С, 1 година). Реакційну суміш екстрагували Т0О0мкл ФХІ та ДНК осаджували з водної фази доданням 20мкл ЗМ ацетату натрію та 55О0мкл охолодженого до 209 абсолютного етанолу. Після 20 хвилин при -70 «С ДНК збирали центрифугуванням (17000хХ9, 15 хвилин), сушили під вакуумом та розчиняли в 180мкл 10мМ Трис-НСЇ, рНе,0. До розчину додавали 20мкл 10х СІР-буферу (100мМ Трис-НСЇІ, рне8,3, 10мММ 7псІі», 10ММ Масі») та Імкл (0,25 одиниць) розбавленої бо 1:4 лужної фосфатази кишечнику теляти (Воегіпдег Мапппеїт Согрогайоп, Іпаіапароїїв, ІМ). Після 30 хвилин при

372С робили такі додання: 2мкл 0,5М ЕДТК, рНе,0; 1Омкл 1095 ДСН; О,5мкл 2Омг/мл протеїнази К (як зазначено вище) з подальшим інкубуванням при 55922 протягом ЗО хвилин. Після послідовних екстракцій 10О0мкл ФХІ та 100мкл фенолу (Іпіегтоишпіаіп Зсіепійіс Согрогайоп), зрівноваженого 1М Трис-НСІ, рН8В,0, дефосфорильовану

ДНК осаджували доданням 72мкл 7,5М ацетату амонію та 55Омкл етанолу (-20 С), інкубуванням на льоду протягом 30 хвилин та центрифугуванням, як описано вище. Осаджену ДНК промивали один раз 500мкл 7090 етанолу (-702С), сушили під вакуумом та розчиняли в 20мкл ТЕ-буферу.

Літування фракціонованих за розміром ЗаизА 1-фрагментів з Ваш 1, що його розщеплено, та обробленим фосфатазою вектором руУУЕ15 виконували з застосуванням лігази Т4 (МЕВ) шляхом модифікації (тобто з 70 застосуванням попередньо змішаного 10х буферу для літування, що поставляється виробником) протоколу у розділі 3.3.3 Аизибеї!. Лігування проводили протягом ночі в загальному об'ємі 20мкл при 15 С, з подальшим зберіганням при -2026. 4мкл реакційної суміші для лігування космидної ДНК, що містять приблизно їмкг ДНК, упаковували в бактеріофаг лямбда з використанням комерційного екстракту для упаковки (Сідараск З | Соїд Раскадіпа

Ехігасузігаїадепе) відповідно до вказівок виробника. Препарат, який було упаковано, зберігали при 49С до застосування. Препарат космиди, який було упаковано, використовували для інфікування клітин Езспегіснпіа сої

ХІТ Віце МК (Зігаїадепе) відповідно до протоколів Сідараск ПП (зоій ("Тіегіпд (Ше Совзтій І іргагу") так.

Клітини ХІІ! Віце МК вирощували в ІВ-середовищі (г/л: Бактотриптон, 10; Бакто-дріжджовий екстракт, 5;

Бактоагар, 15; Масі, 5; (Оїїсо І арогаюгіеєз, Оеїйгоїї, МІЇ), що містить 0,295 (м/об) мальтозу плюс 10ММ Мо5О,, при 37. Після 5 годин зростання клітини осаджували при 700 хд (15хвил.) та повторно суспендували в бмл 10ММ

Мао). Густину культури доводили до ОЮОво0-0,5 10МмМ МаоаБзоО). Космидну бібліотеку, яку було упаковано, розбавляли 1:10 або 1:20 стерильним ЗМ-середовищем (0,1М Масі, 10МмМ Мо95О,, 50мМ Трис-НСЇ, рН7,5, 0,01965 (м/об) желатин) та 25мкл розбавленого препарату змішували з 25мкл розбавлених клітин ХІІ Віде МК. Суміш інкубували при 252С протягом 30 хвилин (без качання), після цього додавали 200мкл І В-бульйону та інкубування с продовжували протягом приблизно 1 години з рідким обережним струшуванням. Аліквоти (20 - 4Омкл) цієї о культури розподіляли по чашках з І В-агаром, що містили 10Омг/л ампіциліну (тобто І В-Атр 4100) та інкубували протягом ночі при 372С. Для зберігання бібліотеки без ампліфікації окремі колонії вискрібали та інокулювали в індивідуальні лунки стерильних 96б-луночних мікротитраційних планшетів; кожна лунка містила 75мкл Тепгтйс ю

Вгоїй (ТВ - середовища: 12г/л Бактотриптону, 24г/л Бакто-дріжджового екстракту, 0,495 (об/об) гліцерин, 17мММ

КНоРО,, 72мММ КоНРО,) плюс 10Омг/л ампіциліну (тобто ТВ-Атр.оо) та інкубували (без качання) протягом ночі со при 372С. Після реплікації 9б-луночного планшета у планшет-копію до планшету додавали 75мкл/лунку «з стерилізованої за допомогою стерилізуючого фільтру суміші ТВ: гліцерин (1:11, об./об.; з 100мг/л ампіциліну або без нього), планшет качали недовго при 1О00об./хвил., 372 та після цього закривали парафільмом с (Рагайт?, Атегісап Майопа! Сап, Сгеєпжісп, СТ) та приміщували в холодильник при 702С для зберігання. с

Планшети-копії вирощували та обробляли так само, як і основні планшети. Всього одержували 40 таких основних планшетів (та їх копії).

Скринінг бібліотеки радіоактивно міченими зондами ДНК

Для приготування фільтрів з колоніями для зондування радіоактивно міченими зондами 10 9б-луночних « 70 планшетів бібліотеки розморожували при 259С (на столі при кімнатній температурі). Інструмент для способу з с відбитків (реплік) з 96 зубцями використовували для інокулювання свіжого 96-луночного планшета-копії, що а містить 75мкл на лунку ТВ-Атріоо. Планшет-копію вирощували протягом ночі (стаціонарно) при 37 2С, після -» цього качали приблизно 30 хвилин при 100об./хвил. при 372С. Всього 800 колоній було представлено в цих планшетах-копіях, оскільки деякі ізоляти не росли. Інструмент для отримання реплік використовували для інокулювання дублікатних відбитків 9б-луночних рядів на нейлонові мембрани Мадпа МТ (М5І, УУевірого, МА) о (0,45 мікрон, 220Хх25Омм), які приміщували на тверді середовища І В-Атр 400 (1ООмл/чашку) в пластикові чашки т ВіоАззау (Мипс, 243х243х18мм; Сипіп Маїйпізоп Зсіепійіс, Іпс., М/оса Оаїе, І). Колонії вирощували на цих мембранах при 372С протягом приблизно З годин. т. Колонію позитивного контролю (бактеріальний клон, що містив вставку послідовності 324, див. нижче) о 50 вирощували на окремій мембрані Мадпа МТ (Мипс, 0,45 мікрон, 82мМ в діаметрі) на середовищі І В з доданням

ЗбБмг/л хлорамфеніколу (тобто І В-Сатув) та обробляли разом з мембранами з колоніями бібліотеки. с Бактеріальні колонії на мембранах лізували та ДНК денатуровували та нейтралізували відповідно до протоколу, який було взято з версії 2,0 посібника для користувача Сепіиз тм Зувіет (Воепгіпдег Маппеїт, Іпаіапароїз,

ІМ). Мембрани приміщували на фільтраційний папір, який було просочено 0,5н Маон плюс 1,5М Масі, на 15 хвилин для денатурації та нейтралізували на фільтраційному папері, який було просочено 1М Трис-НСІ, рнНа,О,

Ф! 1,5М Масі, протягом 15 хвилин. Після УФ-зшивання з використанням Зігаїадепе ОМ зігайа|йпКег веї оп аціо сгоззіїпкК мембрани зберігали сухими при 252С до використання. Мембрани нарізали на смужки, що містили точно о відтворені відбитки одного 9б-луночного планшету, після цього промивали ретельно відповідно до способу во розділу 6.4.1 в СРМВ (цит. раніше): З години при 259С в Зх З5С, 0,195 (м/об) ДСН, після цього протягом 1 години при 6523 в тому самому розчині, після цього промивали в 2х 55С при підготуванні до стадії гібридизації (20х

ЗОС-ЗМ Масі, 0,3М цитрат натрію, рН7,0).

Ампліфікація специфічного геномного фрагменту гена їсас

На основі М-кінцевої амінокислотної послідовності, визначеної для очищеної пептидної фракції Тсас (яку 65 наведено тут у вигляді ЗЕО ІЮО Мо2), синтезували пул вироджених олігонуклеотидів (пул 54Рзій) у стандартний хімічний спосіб з використанням В-ціаноетилювання на синтезаторі ДНК/РНК Арріїед Віозувіет АВ1394 (Регкіп

ЕІтег, Ровієг Спйу, СА). Захисні групи олігонуклеотидів видаляли протягом 8 годин при 55 С, після цього олігонуклеотиди розчиняли у воді, визначали їх кількість спектрофотометричним вимірюванням та розбавляли для використання. Цей пул відповідає визначеній М-кінцевій амінокислотній послідовності пептиду Тсас. Визначену амінокислотну послідовність та відповідну вироджену послідовність ДНК подано нижче, де А, С, о та

Т являють собою стандартні основи ДНК, а І означає інозит: інозин:

Аміно- кислота Мес Сіп Агр Бех Рко Січ Чаї

БАР У АТОо СА(А/б) сСА(Т/С) (ТІА)(С/)(Т/А) ССІ СА(А/с) СТ!

Синтезували інший набір вироджених олігонуклеотидів (пул Р2.3.5К), який являв собою комплемент кодуючого ланцюга для визначеної амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ Мо17:

Амінокис- лота А1а Ріе Ави Пе Авр Авр Чаї

Кодони весни ТІ(Т/б) АА(Т/С) АТ(А/Т/С) сСА(Т/С) сСА(Т/С) ст

Р2.3.5К ЗО) АА(А) ТТ(А/б) ТА(Т/А/Є) СТ(А/Є) СТ(А/С) СА о

Ці олігонуклеотиди використовували як праймери в Полімеразних Ланцюгових Реакціях (РСВ 9, Воспе

Моїіесшіаг Зузіетвз, Вгапсприго, МУ) для ампліфікації ДНК-фрагменту з геномної ДНК, яку було отримано з штаму

МУ/-14 Ріоїогпардиз (див. вище). Типова реакція (5Омкл) містила 125пмоль кожного пула праймерів Р2Рзп та ю зо Р2.3.5К, 253нг геномної матричної ДНК, ТОнмоль кожного з ЗАТР, аСТР, азТР та аТТР, буфер ПЦР ІХ

СепеАтр? та 2,5 одиниць ДНК-полімерази АтріїТад? (Боспе Моіесшаг Зувіетв; 10х СепеАтрУ буфер містить со 100мММ Трис-НСІЇ, рН8,3, 500мМ КС, 0,0195 м/об желатин). Ампліфікації проводили в Термоциклері для ДНК чЕ

Ректкіп ЕІтег Сейвз (РегКкіп ЕІтег, Ровіег Сйу, СА) з використанням 35 циклів 949 (Іхвил.), 5592 (2хвил.), 7296 (Зхвил.), з подальшим періодом подовження 7хвил. при 7220. Продукти ампліфікації аналізували за допомогою сч електрофорезу на 2965 (м/об) МиЗіеєме? 3:1 агарозі (ЕМС ВіоРгодисів) у ТЕА-буфері (40мМ Трис-ацетат, 2МмМ 0

ЕДТК, рНа,0). Спостерігали специфічний продукт визначеного розміру 250п.н. серед численних інших продуктів ампліфікації при забарвленні зтидійбромідом (0,5мкг/мл) гелю та дослідженні під УФ-світлом.

Зону гелю, що містила продукт приблизно 250п.н., вирізали та видаляли з неї невелику пробку (діаметр «

О,б5мм) і використовували для подавання матриці для ПЦР-ампліфікації (40 циклів). Реакційна суміш (5Омкл) містила ті самі компоненти, що описано вище, але без геномної матричної ДНК. Після ампліфікації кінці - с фрагментів затупляли та фосфорилювали шляхом інкубування при 25 С протягом 20 хвилин з 1 одиницею "» ДНК-полімерази Т4 (МЕВ), Інмоль АТР та 2,15 одиницями кінази Т4 (Ріагтасіа Віогесйі Іпс., Різсаїамжау, МУ). " Фрагменти ДНК відділяли від решти праймерів за допомогою електрофорезу на 195 (м/об) СТО У адагозе (ЕМС) в ТЕА. Вирізали шматок гелю, що містив фрагменти з розміром 25Оп.н., та ДНК екстрагували, застосовуючи набір СОіаех (Сіадеп Іпс., Спаївмогій, СА). со Фрагменти ДНК, які було екстраговано, лігу вали з плазмидним вектором рВ5 К(к) (Зігаїадепе), який було ка розщеплено повністю рестриктазою Зта 1, та екстрагували у спосіб, подібний до описаного для ДНК рУУЕ15 вище. Типова реакційна суміш для літування (16,3мкл) містила 10Онг розщепленої ДНК рва (ї), 7Онг фрагменту ве ДНК 250п.н., тТнмоль |Со(МНз)в|Сіз та 3,9 одиниць МУеізв ДНК-лігази Т4 (СоІІарогайме Віотеаіса! Ргодисів, оо 20 Ведгога, МА) в ІХ буфері для літування (50мММ Трис-НСЇ, рН7,4; 10ММ МасІі»; 1ОМмМ дітіотреїтол; 1ММ спермідин, 1мМ АТР, 100мг/мл бичачого сироваткового альбуміну). Після інкубування протягом ночі при 14 2 ліговані с продукти трансформували в заморожені, компетентні клітини ОН5БА ЕвзспПегіспіа соїї (бірсо ВКІ) відповідно до рекомендацій виробника та висіювали на чашки з І В-Сат»зв, що містили ІПТГ (119мкг/мл) та Х-гал (5Омкг/мл).

Незалежні білі колонії вискрібали та плазмидну ДНК одержували у модифікаційний спосіб, застосовуючи лужний 59 лізислосадження ПЕГ (РКІЗМ Кеайду Кеасіоп ЮОуеМеоху тм Тегтіпайг Сусіе Зедцепсіпд Кі Ргоосоі!в; (ФІ АВіІ/Регккіп ЕІтег). Визначали нуклеотидну послідовність обох ланцюгів ДНК, яку було вставлено, застосовуючи праймери 17 (основи 601 - 623 рВС кК5 (8): ТААААСОАСООСсСАСТОдОСОСО) та І ас7 праймери основи 792 - о 816 рвС кК5(ї: АТОАССАТОАТТАСОССАДОСОСОС) й протоколи, що поставляються з набором для во секвенування РКІЗМ" м (АВі/Регкіп ЕІтег). Комплекси барвник-термінуючі дідезоксирибонуклеотиди, які не було включено, видаляли шляхом пропускання через колонки Сепігу-Зер 100 (Ргіпсеп 5ерагаїйопв, Іпс., АдеїІрпіа,

М) відповідно до інструкцій виробника. Послідовність ДНК одержували шляхом аналізу проб на ДНК-секвенаторі

АВІ Моае! 37ЗА (АВІ/Регкіп ЕІтег). Було виявлено, що послідовності ДНК двох ізолятів, 5724 та НВ14, були такими, як показано на Фіг.1.

Ця послідовність ілюструє такі ознаки: б5 , й У й й ї) основи 1-20 представляють одну з 64 можливих послідовностей вироджених олігонуклеотидів 54Рзп,

ї) послідовність амінокислот 1 - З та 6 - 12 відповідає точно послідовності, визначеної для М-кінця ТсасС (яку представлено у вигляді ЗЕО ІЮ Мо2), її) четверта амінокислота, що її кодують, скоріше є залишком цистеїну, ніж залишком серину; цю відмінність закодовано у виродженості для серинових кодонів (див. вище), їм) п'ята амінокислота, яку кодують, є проліном, що відповідає М-кінцевій послідовності ТсасС, яку представлено у вигляді ЗЕО ІЮ Мо2,

М) основи 257 - 276 кодують одну з 192 можливих послідовностей, які було сконструйовано у виродженому пулі, 70 мі) термінуючий кодон ТОА, введений при основах 268 - 270, є результатом комплементарності виродженої частини, вбудованої в пул олігонуклеотидів у відповідній позиції, та не свідчить про скороченість рамки зчитування для відповідного гена.

Мічення зонда, специфічного для гена пептиду Тсас.

Фрагменти ДНК, що відповідають наведеним вище 276 основам, було ампліфіковано (35 циклів) за 7/5 допомогою ПЦР в реакційному об'ємі 100мкл з використанням 10О0пмоль кожного з праймерів Р2Рзп та Р2.3.5К, 1Онг плазмид 03724 або НВ14 як матриць, 2Оонмоль кожного з АТР, СТР, азтТР та аттТР, 5 одиниць

ДНК-полімерази АтріїТтад? та буферу СепеАтр в концентрації їх за температурних режимів, які описано вище.

Продукти ампліфікації екстрагували з 196 ЗТО-агарозного гелю з використанням набору Оіаех та визначали їх кількість за допомогою флюорометрії.

Екстраговані продукти ампліфікації з плазмиди НВ14 як матриці (приблизно 4ООнг) ділили на п'ять аліквот та мітили З2Р-ДСТР з використанням суміші Нідп Ргіте Іабреїйпуд Міх (Воейгіпдег Мапппеїйт) відповідно до інструкцій виробника. Радіоіїзотопи, що виявились не включеними, видаляли шляхом пропускання через колонки для очищення зондів МисТгар (Зігаїадепе) відповідно до інструкцій постачальника. Питому активність міченого

ДНК-продукту визначали за допомогою сцинтиляційного лічильника, та вона дорівнювала 3,11х109 розпадів на СМ хвилину на мкг. Цю мічену ДНК використовували для зондування мембран, які було приготовано з 800 членів о геномної бібліотеки.

Скринінг з зондом, специфічним для гена пептиду Тсас.

Радіоактивно мічений зонд НВ14 кип'ятили приблизно 10 хвилин, після цього додавали до розчину "мінімальний гіб.". (Примітка: спосіб "мінімальний гіб" Взято з протоколу СЕКЕ5; "Кезігісйоп Егадтепі Іо)

Іепдій Роіутогрпізт І арогаїюгу Мапиа! мегвіоп 4,0", розділи 4 - 40 та 4 - 47; СЕКЕБ/МРІ, Зак аке Спу, ЦЕ. со

Зараз МРІ не функціонує, його наступники діють як І іпкаде Сепеїісв|)|. Розчин "мінімальної гіб." містить 1090 м/об. ПЕГ (поліетиленгліколь, мол. маса приблизно 8000), 795 м/об. ДСН; 0,6х55С, 10ММ буфер з фосфатом чЖ натрію (з 1М вихідного розчину, що містить 95г/л МаноРО,у.1Н50О та 84,5г/л МаноРО,.7НьО), 5ММ ЕДТК та с 10О0мг/мл денатурованої ДНК сперми лосося. Мембрани обсушували короткочасним промакуванням та після 32 Цього, без попередньої гібридизації, 5 смужок мембрани приміщували в кожний з 2 пластикових боксів, які (ге) містили 75мл розчину "мінімальної гіб." та 2,6нг/мл радіоактивно міченого зонда НВ14. Їх інкубували протягом ночі при повільному струшуванні (50об/хвил) при 602С. Фільтри промивали три рази протягом приблизно 10хвил. (кожний) при 259С в "промивному розчині мінімальної гіб" (02555550, 0,296 ДСН) з подальшими двома «

З0-хвилинними промиваннями з повільним струшуванням при 602С в тому самому розчині. Фільтри приміщували 70 на папір, покритий Загап Уугар? (Оом Вгапаз, Іпадіапароїїх, ІМ) в світлонепроникній авторадіографічній касеті не с та експонували з рентгенівською плівкою Х-Отаї (Кодак, Коспевіег, МУ) з двома підсилюючими екранами Юи :з» Ропі Стопех І ідпіпіпо-РіІиз СІ (ЗБідта Спетіса! Со., 91. І оців, МО) протягом 4 годин при -702С. При проявленні (стандартні процедури фотографії) значні сигнали було видно в обох копіях серед високого тла більш слабких, більш нерівномірних сигналів. Фільтри знову промивали протягом приблизно 4 годин при 682С в "промивному бо розчині мінімальної гіб." і потім приміщували знов в ці касети та плівку експонували протягом ночі при -7090. 12 можливих позитивних відбитків ідентифікували внаслідок сильних сигналів на обох дублікатах відбитків ле 96-луночних колоній. Сигнали не було виявлено з мембранами негативного контролю (колонії клітин ХІ1 Віце ї» МК, що містили руУЕ15), та дуже сильний сигнал спостерігали з мембранами позитивного контролю (клітини 50. ОНФБА, що містили ізолят 224 продукту ПЦР), які обробляли паралельно з експериментальними пробами. со Дванадцять можливих гібридизаційно-позитивних колоній здобували з заморожених 96-луночних планшетів з сп бібліотекою та вирощували протягом ночі при 372С на твердому середовищі І В-Атр.іоро. Потім їх приміщували на тверде середовище І В-Атр.іоо (З на чашку плюс З негативних контролі: клітини ХІ/1 Віце МК, що містять вектор рУУЕ15). Два набору мембран (Мадпа МТ пуїоп 0,45 мікрон) готували для гібридизації. Перший набір готували, приміщуючи фільтр безпосередньо на колонії на чашці з "петчами" ("осередками") та витягаючи його разом з бактеріальними клітинами, що поприлипали, з подальшою обробкою, як описано нижче. Фільтри другого (Ф) набору приміщували на чашки, що містили середовище І В-Атр.оо, яку було інокульовано потім шляхом ка перенесення клітинами з чашок з "петчами" на фільтри. Після росту протягом ночі при 37 «С фільтри видаляли з чашок та обробляли. 60 Бактеріальні клітини на фільтрах лізували та ДНК денатуровували шляхом приміщення кожного фільтру (колоніями догори) на пул (калюжку) (1,Омл) О,5н Маон в пластиковій чашці на З хвилини. Фільтри обсушували промакуванням на паперовому рушнику, потім процес повторювали зі свіжим розчином О,5н Маон. Після промакування фільтри нейтралізували шляхом приміщення кожного на пул 1,0мл 1М Трис-НСІ, рН7,5, на три хвилини, промакували для обсушування та повторно нейтралізували свіжим буфером. Після цього проводили 65 два подібних просочування (по 5 хвилин) на калюжках з 0,5М Трис-НСІ, рнН7,5, плюс 1,5М Масі. Після промакування для обсушування ДНК зшивали ультрафіолетом з фільтром (як описано вище) та фільтри промивали (252С, 100об/хвил) приблизно в 100мл Зх З5С плюс 0,195 (м/об) ДСН (4 рази по 30 хвилин зі свіжим розчином для кожного промивання). Потім їх приміщували в мінімальний об'єм передгібридизаційного розчину

Ібх 55С плюс 190 (м/об) (кожний) РісоїІ400 (Рнагтасіа), полівінілпіролідон (середня мол. маса 360000; Бідта) та бичачий сироватковий альбумін (фракція М) (Зідта)) протягом 2 годин при 65 2С, 5б0об/хвил.

Передгібризаційний розчин видаляли та замінювали Р-міченим зондом НВІ14, що його було збережено з попередньої гібридизації мембран з бібліотекою та який денатуровували при 9529 протягом 5 хвилин.

Гібридизацію проводили при 602С протягом 16 годин з качанням при 5боб/хвил.

Після видалення розчину міченого зонда мембрани промивали З рази при 252 (5боб/хвил, 15 хвилин) в Зх 70. 88С (приблизно по 150мл для кожного промивання). Потім їх промивали протягом З годин при 682 (Б5боб/хвил) в 0,25х 55С плюс 0,295 ДСН (промивний розчин мінімальної гіб.) та експонували на рентгенівській плівці, як описано вище, протягом 1,5 години при 252С (без підсилюючих екранів). Це експонування виявило дуже сильні сигнали гібридизації з ізолятами космид 22012, 25А10, 26А5 та 26810 та дуже слабкий сигнал з ізолятом космиди 8810. Не спостерігали сигналу з колоніями негативного контролю (рУУЕ15), та дуже сильний сигнал спостерігали з мембранами позитивного контролю (клітини ОН5БА, що містять ізолят 5724 продукту ПЛР), які обробляли паралельно з експериментальними пробами.

Ампліфікація специфічного геномного фрагменту гена іїсав

На основі М-кінцевої амінокислотної послідовності, яку було визначено для очищеної фракції пептиду Тсав; (що її описано тут у вигляді зЕО ІЮ Мо3), синтезували пул вироджених олігонуклеотидів (пул РВЕ), як описано для пептиду Тсас. Визначену амінокислотну послідовність та відповідну вироджену послідовність ДНК наведено нижче, де А, С, о та Т є стандартними основами ДНК, а І означає інозин:

Аміно- с кислота Тец Ре ТЬг о сСіп Твж тей пує січ Аїа АгЕ (о)

РВЕ ви ТІТ АСІ СА(А/Сс) АСІ (С/ТУГУІ лАХ САА СсІ Ки з ів)

Синтезували інший набір вироджених олігонуклеотидів (пул Р8.108.3К), який являв собою комплемент кодуючого ланцюга для визначеної амінокислотної послідовності внутрішнього пептиду Тсав ї-РТ108 (яку со описано тут як БЕО ІЮ Мо20): чЕ с

Аміноки- Меєс Туг Туг Іїе біп А1а біп Сіп со слоти

Кодони АтТе ТА(Т/С) тТА(Т/С) АТ(Т/СІА) сА(А/сСу ОАКБЛ сСА(А/С) сСАхА/с) «

РУЗ.108.3В. З'ТАС АтТ(А/С) АТ(А/С) ТАТ) стТ(Т/С) сс ст(т/сє) ст - с и "» Ці олігонуклеотиди використовували як праймери для ПЛР з застосуванням пробірок Ноїсеїаг 50 Тирез (МоїІесшіаг Віоргодисів, Іпс., Зап Оіедо, СА) для ампліфікації специфічного фрагменту ДНК з геномної ДНК, отриманої з штаму МУ-14 РІпоїогпараиз (див. вище). Типова реакційна суміш (5Омкл) містила (нижній шар) (се) 25пмоль кожного пула праймерів, РЗЕ та Р8.108.3К з 2пмоль кожного з дЗАТР, асСтР, аСТР та аТТР в буфері ПЛР з 1х бепеАтр? та (верхній шар) 23Онг геномної матричної ДНК, вВнмоль кожного з аАТР, асСтР, аСТР та аттР та 2,5 одиниць ДНК-полімерази АтріїТтад в буфері їх ЗепеАтрУ. Ампліфікації проводили шляхом 35 циклів, як

Т- описано для пептиду ТсасС. Продукти ампліфікації аналізували за допомогою електрофорезу на 0,795 (м/об)

Го! 20 Веакет?біЕ агарозі (РЕМ) в ТЕА-буфері. Спостерігали специфічний продукт з визначеним розміром 1600п.н.

Чотири таких реакції об'єднували та ДНК, яку було ампліфіковано, екстрагували з 1,096 ЗеаКет ГЕ гелю з сл використанням набору Оіаех, як описано для пептиду ТсасС. ДНК, яку було екстраговано, використовували безпосередньо у вигляді матриці для визначення послідовності (набір для секвенування РКІЗМ ) з використанням пулів праймерів РЗЕ та Р8.108.3К. Кожна реакція містила приблизно 10Онг матричної ДНК та 22 2БПМОЛЬ одного з пулів праймерів та проводилася відповідно до стандартного протоколу, як описано для

Ге) пептиду Тсас. Аналіз послідовності, отриманої з подовження праймерів РВЕ, виявив коротку послідовність ДНК ще (та амінокислотну послідовність, яку кодують):

САТ ссА тто нТтТ сст 60

Аер А1а Геч (Уа1) А1а яка відповідає частині М-кінцевої пептидної послідовності, описаної у вигляді БЗЕО ІЮ Моз (ТсаВ;).

Мічення зонда, специфічного для гена пептиду ТсаВ; 65 Приблизно 5онг очищеного на гелі фрагменту ДНК ТсавВ; мітили ЗгР-ЯОСТР, як описано вище, та радіоізотопи,

що не було включено, видаляли шляхом пропускання через колонку МІСК (РПагтасіа). Було визначено, що питома активність міченої ДНК дорівнювала 6бХ10 розпадів на хвилину на мкг. Цю мічену ДНК використовували для зондування мембран з колоніями, отриманими з членів геномної бібліотеки, які гібридизувались з зондом, специфічним для пептиду Тсас.

Мембрани, що містили ці 12 колоній, які було ідентифіковано в скринінгу бібліотеки ТсаС-зондом (див. вище), звільняли від радіоактивної, ТсаС-специфічної мітки шляхом кип'ятіння 2 рази по 30 хвилин в 1 літрі

Ох 550 плюс 0,195 ДСН. Видалення радіоактивної мітки перевіряли з б--одинною експозицією плівки. Потім звільнені від мітки мембрани інкубували з отриманим, як описано вище, зондом, специфічним для пептиду 70 ТсаВ;. Мічену ДНК денатуровували кип'ятінням протягом 10 хвилин та потім додавали до фільтрів, які після цього інкубували протягом 1 години в 100мл розчину "мінімального гіб." при 602. Після гібридизації протягом ночі при цій температурі розчин зонда видаляли та фільтри промивали так (всі в 0,3х 55С0,1956 ДСН): один раз протягом 5 хвилин при 252С, один раз протягом 1 години при 602С в свіжому розчині та один раз протягом 1 години в свіжому розчині. Після 1,5-годинної експозиції на рентгенівській плівці відповідно до стандартних 75 процедур спостерігали 4 колонії, що сильно гібридизувалися. Це були, як і з зондом, специфічним для Тсас, ізоляти 22012, 25А10, 26А5 та 26810.

Той самий розчин зонда розбавляли рівним об'ємом (приблизно 10Омл) розчину "мінімальний гіб." та потім використовували для скринінга мембран, що містять 800 членів геномної бібліотеки. Після гібридизації, промивання та експозиції з рентгенівською плівкою, як описано вище, було виявлено, що тільки чотири космидних клони 22012, 25А10, 26А5 та 26810 сильно гібридизувались з цим зондом.

Виділення субклонів. що містять гени, які кодують пептиди Тсас та ТсавВ;. та визначення послідовності основ їх ДНК.

Три гібридизаційно-позитивні космиди в штамі ХІІ! Віде МК вирощували з качанням протягом ночі (200об./хвил.) при 302 в 100мл середовища ТВ-Атр.оо. Після збирання клітин центрифугуванням, космидну Га

ДНК одержували за допомогою комерційно доступного набору (ВІСргертм, 5 Ргіте З Ргіте, Іпс., Воцідег, СО) о відповідно до протоколів виробника. Тільки одну космиду, 26А5, було виділено успішно у цей спосіб. При розщепленні рестриктазою Есок 1 (МЕВ) та аналізі за допомогою гель-електрофорезу було виявлено фрагменти з приблизними розмірами 14, 10, 8 (вектор), 5. 3,3, 2,9 та 1,бт.п.н. В другій спробі виділити космидну ДНК з тих самих трьох штамів (культура в мл; ТВ-Атр.іоо, 302) використовували тіпіргер-спосіб з кип'ятінням (Емапе М) с. Апа с. Умані, 1987, "Совтій месіоге йог депотіс маїкіпуд апа гарій гевігісбйоп тарріпд" іп Сціде Юю с

Моїесшіаг Сіопіпд Тесппідцез Мей. Епгмтоїіоду, моІ.152, 5. Вегдег апа Кіттеї, еаз., роз. 604-610). У цей спосіб успішно виділили лише одну космиду. При розщепленні рестриктазою ЕсобБ. 1 та аналізі за допомогою Ж гель - електрофорезу ця космида виявила розподіл фрагментів, що є ідентичним розподілу, який було виявлено сч з космидою 26бА5.

Зо О,15мкг проби ДНК космиди 26А5 використовували для трансформації 5Омл клітин ОНБА Е. Соїї (Сірсо ВК) с відповідно до протоколів виробника. Ізолят однієї колонії цього штаму інокулювали в 4мл середовища ТВ-Атр1оо та вирощували протягом 8 годин при 372С. Додавали хлорамфенікол аж до кінцевої концентрації 225мкг/мл, інкубацію продовжували ще протягом 24 годин, потім клітини збирали центрифугуванням та заморожували при « -2020. ДНК космиди 26А5 виділяли шляхом стандартного лужного лізису (тіпіргер) (Мапіаїйіз еї аї., цит. вище, 70 р.382| з модифікацією, що полягає в збільшенні всіх об'ємів на 5095, та з перемішуванням або обережним о, с змішуванням, а не за допомогою вортексу, на кожній стадії. Після промивання осаду ДНК в 7095 етанолі її "» розчиняли в ТЕ, що містив 25мкг/мл рибонуклеази А (Военгіпдег МаппНеїт). " Ідентифікація фрагментів Есок 1. що гібридизуються з отриманими з 05724 та ТсаВ;-зондів.

Приблизно 0,4мкг космиди 25А10 (з клітин ХІ 1 ВІше МК) та приблизно 0,5мкг космиди 26А5 (з ампліфікованих 49 з хлорамфеніколом клітин ОН5БА) розщепляли окремо приблизно з 15 одиницями Есок І! (МЕВ) протягом 85 со хвилин, заморожували протягом ночі, потім нагрівали при 6592С протягом 5 хвилин та піддавали електрофорезу в

КкЗз 0,790 агарозному гелі (Зеакет? ІЕ, їх ТЕА, 80 вольт, 90 хвилин). ДНК забарвлювали етилійбромідом, як описано вище, та фотографували під УФ-світлом. За цих умов продукт розщеплення Есок 1 космиди 25А10 було ве 50 розщеплено повністю, але пробу космиди 26А5 було лише частково розщеплено. Агарозні гелі, що містили (се) фрагменти ДНК, піддавали депуринізації, денатурації та нейтралізації з подальшим блотингом за Саузерном на нейлоновій мембрані Мадпа МТ з використанням протоколу з високою концентрацією солі (20х 55), всі ці сл засоби описано |в розділі 2.9 А!йгибеї еї аі. (СРМВ, цит. вище)). Потім перенесену ДНК зшивали УфФ-світлом з нейлоновою мембраною, як описано раніше.

Фрагмент ДНК, специфічний для пептиду ТсасС, який відповідав вставці плазмидного ізоляту 74, ампліфікували за допомогою ПЛР в реакційному об'ємі 100мл, як описано вище. Продукти ампліфікації з трьох

ГФ) таких реакцій об'єднували та екстрагували з 196 ЗТОЗ-агарозного гелю з використанням набору Оіаех, як т описано вище, та кількісно визначали за допомогою флуориметрії. Очищену на гелі ДНК (10Онг) мітили З2рР-ДСТР з використанням суміші для мічення Нідп Ргіте І абеїїпуд Міх (Воейгіпдег МаппНеїт), як описано вище, аж до бо питомої активності 6,34х108 розпадів на хвилину на мкг.

З2р-мічений зонд 574 кип'ятили 10 хвилин, потім додавали до буферу "мінімальний гіб." (при нг/мл), додавали мембрану з блотом за Саузерном, що містила розщеплені фрагменти ДНК космиди, та інкубували протягом 4 годин при 60 2С з обережним струшуванням при 50об./хвил. Потім мембрану промивали З рази при 2592; протягом приблизно 5 хвилин в кожному випадку (промивним розчином "мінімальної гіб. "у, з подальшими бо двома промиваннями протягом 20 хвилин (кожен) при 60 «С. Блот експонували на плівці (з підсилюючими екранами) протягом приблизно ЗОхвил. при -702С. Зонд (324 сильно гібридизувався з фрагментом Есок 1 5,От.п.н. (видимий розмір) обох плазмид, 26А5 та 25А10.

Мембрану визволяли від радіоактивності кип'ятінням протягом 30 хвилин в 0,1х 55С--0,195 ДСН та відсутність радіоактивної мітки перевіряли експозицією на плівці. Потім її гібридизували при 602С протягом 3,5 годин з денатурованим зондом ТсавВ; в буфері "мінімальної гіб.", що використовувався раніше для скринінгу мембран з колоніями (див. вище), промивали, як описано раніше, та експонували на плівці протягом 40 хвилин при -709С з двома підсилюючими екранами. У випадку обох плазмид, зонд Тсав; гібридизувався слабко з фрагментом Есок 1 5,От.п.н. та сильно з фрагментом приблизно 2,9т.п.н.

Пробу ДНК космиди 26А5, яку було описано раніше, (з клітин ОН5БА) використовували як джерело ДНК, з якого субклонували цільові смуги. Цю ДНК (2,5мкг) переварювали з приблизно З одиницями Есок 1 (МЕВ) в загальному об'ємі ЗОмкл протягом 1,5 годин з отриманням продукту часткового розщеплення, що було підтверджено гель-електрофорезом. Десять мкг ДНК рвс Кк (т) (Зігаїадепе) розщепляли протягом 1,5 годин з одиницями Есок 1 в загальному об'ємі 20 мкл, що спричинювало повне розщеплення, як було підтверджено 75 електрофорезом. Обидва препарати розрізаної Есок 1 ДНК розбавляли до 5О0мкл водою, до кожного додавали рівний об'єм ФХІ, суспензію обережно змішували, відкручували у мікроцентрифузі та водний супернатант збирали. ДНК осаджували 150мкл етанолу та суміш приміщували при -202С на ніч. Після центрифугування та висушування розщеплену Есок 1 плазмиду рВ5 К5 (ж) розчиняли в 10Омкл ТЕ; частково розщеплену 26А5 розчиняли в 20мкл ТЕ. Здобування ДНК контролювали флуориметрією. 20 В окремих реакціях приблизно бОнг ДНК рВ5 К5 (Ж), розщепленої Есок 1, лігували приблизно з 18Онг або 27Онг частково розщепленою ДНК космиди 26А5. Літування проводили в об'ємі 20мкл при 1593 протягом 5 годин з використанням лігази Т4 та буферу з Мем/ Еподіапа Віоі арх. Суміш для літування, розбавлену до 100мкл стерильним ТЕ, використовували для трансформації заморожених, компетентних клітин ОН5БА Е. Сої (бірсо

ВІ) відповідно до інструкцій виробника. Різноманітні кількості (25 - 200Омкл) клітин, що їх було. / Є трансформовано, висіювали на свіжоприготовлене тверде середовище І В-Сатзв з 1ММ ІПГТ та 5мг/л Х-гал. о

Чашки інкубували при 372С протягом 20 годин, потім охолоджували в темряві протягом приблизно З годин для підсилення забарвлення для відбирання інсертів. Білі колонії вискрібали та переносили на чашки з "петчами" того самого складу та інкубували протягом ночі при 3726.

Два "ліфти" колоній кожної з вибраних "петч"--ашок готували так. Після перенесення білих колоній на свіжі о) чашки круглі нейлонові мембрани Мадпа МТ притискали на "петч"-ч-ашки, мембрану піднімали та піддавали со денатурації, нейтралізації та зшиванню під впливом УФ, як описане вище для мембран з колоніями бібліотеки.

Піддані зшиванню "ліфти" колоній інтенсивно промивали, обережно змиваючи надлишок залишків клітин «І тканиною. Набір гібридизували з розчином зонда 74 (Тсас), описаного раніше, а інший набір гібридизували з с розчином зонда ТсаВі, який було описано вище, відповідно до протоколу "мінімальної гіб", з подальшим 32 промиванням та експозицією на плівці, як описано для мембран з колоніями бібліотеки. (ге)

Колонії, що виявляли сигнали гібридизації, або тільки з зондом 524, з обома зондами 074 та ТсаВ ,, або тільки з зондом Тсав;, відбирали для подальшої роботи та клітини висіювали штрихом для виділення окремої колонії на середовища І В-Сатзв з ІПТГ та Х-гал, як описано раніше. Приблизно 35 окремих колоній, з 16 « ізолятів, переносили до рідких середовищ І В-Сат з5 та вирощували протягом ночі при 372С; клітини збирали центрифугуванням та плазмидну ДНК виділяли за допомогою стандартного лужного лізису (тіпіргер) відповідно т с до Мапіаїзз еї а!. (цит. вище, р.368). Осади ДНК розчиняли в ТЕн25мкг/мл рибонуклеази А та концентрацію ДНК "» визначали флуориметрією. Розподіл продуктів розщеплення Есок 1 аналізували гель-електрофорезом. Наступні " ізоляти здобували у звичайний спосіб. Ізолят А17.2 містить тільки повторно ліговану РВС К5 (ї) та його використовували для (негативного) контролю. Ізоляти Ю38,3 та С44,1 (кожний) містять лише 2,9т.п.н., фрагмент 49 Есов 1, що гібридизується з ТсаВ;, який вбудовано в рВС КБ (ж). Ці плазмиди, які названо рОАВ2О00 та со рОрАВ2001, відповідно, показано на Фіг.2. ко Ізолят АЗ5,3 містить лише приблизно 5 т.п.н., фрагмент Есок 1, що гібридизується з 574, який вбудовано в рвВс Кк (Ж. Цю плазмиду назвали ррАВ2002 (також Фіг.2). Ці ізоляти забезпечили матриці для секвенування в днк. бо 20 Плазмиди рОрАВ2000 та рраАВ2001 одержували з використанням набору ВіСргер їм, як описано вище.

Культури (ЗОмл) вирощували протягом ночі в середовищі ТВ-Сат з5 аж до ОО со02, потім плазмиду виділяли с відповідно до інструкцій виробника. Осад ДНК перерозчиняли в 10Омкл ТЕ (кожну) та цілісність проб перевіряли розщепленням Есок 1 та аналізом за допомогою гель-електрофорезу.

Реакції секвенування проводили в двох повторностях, з однією реплікою, що використовує як матрицю ДНК 99 ррАВ2000, та з іншою реплікою, що використовує як матрицю ДНК ррАВ2001. Реакції проводили, застосовуючи

Ге) спосіб циклічного секвенування з комплексом дідезокси-барвник як термінатором, який описано вище для секвенування ДНК 74/НВ14. Початкові раунди секвенування використовували як праймери праймери і ас7 та ко 77, описані вище, плюс праймери, основані на визначеній послідовності ПЛР-ампліфікованого продукту Тсав; 60 (ТНІЗАТТОСАСАСТОССААТСОоСстТтТооС, 5 ТН12ОАСАСТАСТАТССАСАССОСОСАТОАТСТ).

Після аналізу первинної структури та підготовки кожного секвенуючого продукту, кожен укорочували до 250-350 основ, залежно від повноти хроматографічних даних, що інтерпретувалися програмним забезпеченням

Регкіп ЕІтег Арріїей Віозузіетз Оімізвіоп ЗедЕаб75. Подальші "стадії" секвенування виконували шляхом вибору підхожої послідовності для нових праймерів. За невеликими винятками, праймери (синтезовані, як описано вище) мали довжину 24 основи зі складом, що мав 5095 З-С. Секвенування у цей спосіб проводили на обох ланцюгах фрагменту Есок 1 з величиною приблизно 2,9т.п.н.

Для подальшого використання як матриці для секвенування ДНК одержували плазмидну ДНК з ізоляту рОАВ2002, використовуючи набір ВіІСргер. Реакції секвенування проводили та аналізували, як описано вище. 7/0 Спочатку праймер ТЗ (основи 774-796 рвс Кз (8 СОСОСААТТААСССТСАСТАААОС) та праймер 17 (основи 621-643 рВС КБ (5). ОСОСОТААТАСОАСТСАСТАТАС) використовували для праймування реакцій секвенування з фланкуючих вектор послідовностей зі зчитуванням у вставлення ДНК. Інший набір праймерів

Й (С24Е: СТАТССАТІА СА АСОСТОТСАСТТССС;

ТНІЗ: СССААСТОСАСАСССТТСТААТОСАТАС;

ТНІД:АТСТТСОСТОССТоСОССТААТОСАСАТААС; та

ІЇМ/1-204:. СОБААСТОАСАССОТТОТААТСОАТАС) застосовували для опраймування с внутрішніх с послідовностей, які визначали попередньо шляхом секвенування з використанням вироджених олігонуклеотидів Го) субклонованих ПЛР-продуктів пептиду ТсасС. На основі даних, отриманих під час початкових раундів секвенування, конструювали нові набори праймерів та використовували їх для "прогулянки" по всій довжині фрагменту «5т.п.н. Всього використовували 55 оліго-праймерів, що дозволило ідентифікувати в цілому 4832п.н. неперервної послідовності. щі 3о При об'єднанні послідовності ДНК інсерту фрагменту Есок 1 ррАВ2002 з частиною визначеної послідовності о ізолятів рОАВ2О00/ррАВ2001 одержували спільну послідовність суміжних нуклеотидів довжиною бОО5п.н. (яку наведено тут у вигляді ЗЕО ІЮ Мо25). При трансляції довгих відкритих рамок зчитування у відповідні - амінокислоти ця послідовність ясно виявляє М-кінцевий пептид (який описано у вигляді ЗЕО ІЮО Мо3), що його се кодують основами 19-75, безпосередньо після залишку метіоніну (стартова точка трансляції). Далі по ходу транскрипції, в тій самій рамці зчитування, при основах 1738 - 1773 знаходиться послідовність, що кодує со внутрішній пептид Тсав;-1108 (який описано у вигляді ЗЕО ІЮ Мо20). Також в тій самій рамці зчитування, при основах 1897-1923, кодується М-кінцевий пептид ТсаВ; (який описано тут у вигляді ЗЕО ІЮО Мо5) та рамка зчитування продовжується без переривання до кодона термінації транскрипції при нуклеотидах 3586 - 3588. «

Відсутність всередині рамки зчитування стоп-кодону між кінцем послідовності, що кодує Тсав -РТ108, та 70 початком кодуючого району ТсаВ. та відсутність помітного сайту зв'язування рибосом безпосередньо проти но) с ходу транскрипції від кодуючого району ТсаВ; вказує на те, що пептиди ТсаВ; та ТсаВ; кодуються однією з відкритою рамкою зчитування з 3567п.н., що починається при парі основ 16 в ЗЕО ІЮ Мо25, та найбільш ймовірно, вони утворюються з єдиного первинного продукту гена з 1189 амінокислот (131586Да; який описано тут у вигляді ЗЕО ІО Мо26) в результаті посттрансляційного розщеплення. Якщо амінокислота, яка со 15 безпосередньо передує М-кінцевому пептиду ТсаВ;, являє собою С-кінцеву амінокислоту пептиду ТсаВ ;, то прогнозована маса ТсавВ;, (627 амінокислот) дорівнює 70814Да (яку описано тут у вигляді ХЕО ІЮО Мо28), що дещо

Кз більше, ніж розмір, який спостерігався за допомогою електрофорезу в ПААГ-ДСН (6б8кДа). Цей пептид кодувався б неперервним відрізком з 1881п.н. (який описано тут у вигляді ЗЕО ІЮ Мо27). Можна думати, що нативний те С-кінець ТсаВ; лежить дещо ближче до С-кінця Тсав/--1108. Молекулярна маса РТ108 |З,438кДа; визначена під о 50 час аналізу М-кінцевої амінокислотної послідовності цього пептиду| передбачає розмір з 30 амінокислот.

Використовуючи цей розмір пептиду для визначення С-кінця кодуючого району ТсавВ; |СіІи у позиції 604 5ЕО ІЮ сл Мо281, отриманий розмір ТсаВ; можна визначити як 604 амінокислоти або 68463Да, що більше погоджується з експериментальними спостереженнями.

Трансляція кодуючого району з 1686 пар основ пептиду ТсаВ ; (який описано тут у вигляді БЕО ІЮ Мо29) дає білок з 562 амінокислот (який описано тут у вигляді зЗЕО ІЮ Моз30) з прогнозованою масою 60789 Да, що добре

Ф! погоджується з розміром б1кДа, який спостерігають.

Потенційний сайт зв'язування рибосом (основи 3633 - 3638) було виявлено на відстані 48п.н. по ходу кі транскрипції від стоп-кодону для відкритої рамки зчитування їсавВ. При основах 3645 - 3677 виявлено послідовність, що кодує М-кінець пептиду ТсасС, (яку описано тут у вигляді ЕС ІЮ Мо21). Відкрита рамка 60 зчитування, що починається цим М-кінцевим пептидом, триває без перерви до основи 6005 (2361п.н., що її представлено тут у вигляді перших 2361п.н. ЗЕО ІЮО Мо31). Ген (ІсаС), що кодує весь пептид Тсас, (середній розмір «165т.п.н.; 71500 амінокислот), має містити приблизно 4500п.н.

Інший ізолят, що містив клоновані фрагменти ЕсокК 1 космиди 26А5, Е20.6, також ідентифікували за його гомологією з названими раніше зондами 074 та ТсаВ;. Аналіз в агарозному гелі продуктів розщеплення Есок 1 бо ДНК цієї плазмиди, що її утримує цей штам (ррАВ2004, Фіг.2), виявив вставлені фрагменти визначених розмірів

2,9, 5 та З,Зт.п.н. Аналіз послідовності ДНК, що ініціюється від праймерів, які було сконструйовано з послідовності плазмиди ррАВ2002, виявив, що фрагмент Есок 1 З,Зт.п.н. РОАВ2004 лежить поруч з фрагментом

Есок 1 5т.п.н., представленим в ррАВ2002. Відкрита рамка зчитування з 2361п.н., яку виявлено в рОАВ2002, продовжується без переривання на наступні 2094п.н. в рОАВ2004 |яку описано тут у вигляді пар основ 2362 - 4458 5ЕО ІЮО Мо31). Аналіз послідовності ДНК з використанням ДНК батьківської космиди 26А5 як матриці підтвердив неперервність цієї відкритої рамки зчитування. В цілому, ця відкрита рамка зчитування (ТсасС 5ЕО ІЮ

МоЗ31) містить 4455п.н. та кодує білок (Тсас) з 1485 амінокислот (який представлено тут у вигляді ЗЕО ІЮ Моз21.

Розрахований молекулярний розмір 166214Да погоджується з визначеним розміром пептиду Тсас (165кДа) та 70 вироблена амінокислотна послідовність співпадає точно з послідовністю, яку описано для М-кінцевої послідовності Тсас ІЗЕО ІЮО Мо21).

Відсутність амінокислотної послідовності, що відповідає БЕО ІЮО Мо17, яку використано для конструювання пула вироджених олігонуклеотидних праймерів, у виявленій послідовності вказує на те, що утворення продуктів

ПЛР, виявлених в ізолятах 574 та НВ14, які було використано як зонди в початковому скринінгу бібліотеки, 7/5 Здійснювалося шляхом випадкового праймування зворотного ланцюга однім з праймерів в виродженому пулі.

Крім того, утворена білкова послідовність не містить внутрішнього фрагменту, який описано тут у вигляді ЗЕО

ІО Мо18. Ці послідовності показують, що плазмида ррАВ2004 містить повний кодуючий район для пептиду Тсас.

Приклад 9

Скринінг геномної бібліотеки Рпоюгпараицз на гени, що кодують пептид ТеБА;,

Цей приклад описує спосіб, що застосовується для ідентифікації клонів ДНК, які містять гени, кодуючі пептид ТебА;, виділення цього гена та визначення його часткової послідовності основ ДНК.

Праймери та ПЛР-реакції

Поліпептид ТсБА.., активного проти комах препарату має мол. масу «206бкДа. Амінокислотну послідовність

М-кінця цього пептиду описано у вигляді 5ЕСО ІЮО Мої. Синтезували 4 пула вироджених олігонуклеотидних сі праймерів ("Прямі праймери": ТН-4, ТН-5, ТН-6 та ТН-7) для кодування цієї амінокислотної послідовності, як описано в Прикладі 8. їх показано нижче. (о) зо Таблиця 11 ю (ге)

Аміно- РЕе Іїе сіп сСіу тує Бек Агр ТГеч Ріе « кислота с (ге) тТн-4 ЗЛІ С) АТІ САдК) ссІ ТА(Т/С) тсІ САТ) СТІ т-У

ТН-5 УТІМ) АТІ САДИ) СсСІ 0 ТА(Т/С) АСК) са) СТІ тт-3 « с 70 тТНн-в ЛО) АТІ СА) ОСІ 0 тТА(Т/С) ТСІ САС; о т(А/с) тт-3 З з тн-7 9ЛІЙО) АТІ СА(ДА/) о сСІ 0 ТА(тТ/С); АС) САТ) тт) тт-3

Крім того, було визначено первинну ("а") та вторинну ("Б") послідовність препарату внутрішнього пептиду (ог) (ТеЬА;-РТВ81), що описано тут у вигляді ЗЕО ІЮ Мо23 та ЗЕО ІЮ Мо24, відповідно.

У подібний спосіб було сконструйовано та синтезовано 4 пула вироджених олігонуклеотидів ("Зворотні ко й '" ! й праймери": ТН-8, ТН-9, ТН-10 та ТН-11) для кодування зворотного комплементу послідовностей, що кодують т» частину пептидів ЗЕО ІЮ Мо23, яку показано нижче. со (л

Ф) ко 60 б5

Таблиця 12

Амін ТЕ Тут Теп ТНтї бек о Ре Січ бій о Уаі АїТа 0 Авп окис лота

ТН-8 З'ЇСЇ АТАЙ) САТ ТСІ Асі ААдДо) СМ) сп) сСа1 сої 0 пеюю тТН-З З'СІ АТАЛ) АД) ТСІ АСІ ААфО) СТО) сг) сАат о сб1 пс»

ТН-10 З'ТСІ АТАД) САТ ТсІ ОСА) Або) СТО) СТІК) САТ сі пед»

ТН-11 З'ТСІ АТаАд) АД) ТС ТС) Аді) Сп) СГС) САТ ссІ лем

Набори цих праймерів використовували в реакціях ПЛР для ампліфікації фрагментів гена, що кодує ТебБА ;, з геномної ДНК штаму МУ-14 РПоїогпардиз Іштіпезсепз, яку було отримано в Прикладі 6. Всі реакції ПЛР виконували за способом "Ної 5іагі" з використанням Атріїм/ахтм детвз та інших реагентів та протоколів Регкіп

ЕІтег. Як правило, суміш (загальний об'єм 11мкл) МоСІ 2, аМТР, 10х буферу ІІ для ПЛР СепеАтр? та праймери додавали до пробірок, що містили одну воскову бусину, (10х Сепе2йтр? РСЕ. Вийег ІІ складається з 100ММ с 29 Трис-НСЇІ, рНеВ,3, та 500мМ КСІ). Пробірки нагрівали до 8023 протягом 2 хвилин та давали їм охолонути. На (9 верхню поверхню воскових затворів, що утворилися, додавали розчин, що містив 10х ЗепеАтрУ РСЕ. буфер Ії,

ДНК-матрицю та ДНК-полімеразу АтріїтадУ. Після розплавлення воскової пробки та змішування компонентів шляхом термоциклювання кінцеві умови реакції (об'єм 5Омкл) були такими: 10мМ Трис-НСЇ, рН 8,3; 5ОММ КОСІ; 2,5 ю зо Масі», 200мкМ кожного з ЗАТР, астР, астР, аттеР; 1,25мМ в одному пулі Прямих праймерів; 1,25мМкМ в одному пулі Зворотних праймерів, 1,25 одиниць ДНК-полімерази АтріїТтад та 17Онг матричної ДНК. Реакційні суміші 09 приміщували до термоциклеру (як у Прикладі 8) та проводили ПЛР за такою програмою: «У сч з со ч и, з с в (появ 0 . "» Серію ампліфікацій проводили при трьох різних температурах відпала (552, 602, 6523) з використанням пулів вироджених олігонуклеотидів. Реакції з відпалом при 659 не давали продуктів ампліфікації, видимих після електрофорезу в агарозних гелях. Реакції, що мали режим відпала з 602С та містили праймери ТН-5-ТН-10, со давали продукт ампліфікації, що мав рухливість, яка відповідала 2,9т.п.н. Менша кількість продукту 2,9т.п.н. т продукувалася за цих умов з праймерами ТН-7-ТН-10. При відпалі реакцій при 5529 ці пари праймерів продукували більше продукту 2,9т.п.н., та цей продукт одержували також з парами праймерів ТН-5-ТН-8 та ї» ТН-5-ТН-11. Додаткові дуже слабкі смуги 2,9т.п.н. було видно в доріжках, що містили продукти ампліфікації від со 20 пар праймерів ТН-7-ТН-8, ТН-9, ТН-10 та ТН-11. Для отримання достатньої кількості продукту ПЛР-ампліфікації для клонування та визначення послідовності ДНК готували 10 окремих ПЛР-реакцій з праймерами ТН-5-ТН-10 (л та їх проводили за описаних вище умов з температурою відпала 5520. Всі реакційні суміші об'єднували та продукт 2,9т.п.н. очищували екстракцією по Оіаех з агарозного гелю, як описано вище.

Додаткові послідовності, визначені для внутрішніх пептидів ТСБА;, описано тут у вигляді ЗЕО ІЮ Мо21 та ЗЕО 22 |О Мо22. Як і раніше, було приготовано вироджені олігонуклеотиди (Зворотні праймери ТН-17 та ТН-18), що

Ге) відповідають зворотному комплементу послідовностей, які кодують частину амінокислотної послідовності цих пептидів. ко 60 б5 й Таблиця 14

З 5ЕО тре 21 0 Аміно- Меє сіцй Тих Сів Авп І1е сіп Січ Рко кислота тТнН-17 3-ТАС сСтТтТ/С тсІ СТТ/С тТТА/й ТАїЇ сттТ/С стт/С 6б6-5

ТГаблицдя 15

З БЕО Тр Мо 22

Аміно- Двп РкЕо І1е Авп І1е Авп Так біу Ше Агр кислота см о тТН-18 3-Та/)У СсІ ТАї ТАК) ТАТ ЛІД) ТСІ ССІ тТАт1 або

Вироджені олігонуклеотиди ТН-18 та ТН-17 використовували в експерименті по ампліфікації з ДНК ою зо Рпоюгнарадиз Іштіпезсепе МУ-14 як матрицю та праймерів ТН-4, ТН-5, ТН-6 або ТН-7 як 5-(Прямі) праймери. Ці реакції ампліфікували продукти приблизно 4т.п.н. та 4, бт.п.н., відповідно. Ці ДНК переносили з агарозних 00 гелів на нейлонові мембрани та гібридизували з Р-міченим зондом (як описано вище), який було приготовано з продукту 2,9т.п.н., ампліфікованим за допомогою пари праймерів ТН-5-ТН-10. Обидва продукти ампліфікації - д4т.п.н. та 4,бт.п.н. сильно гібридизувалися з зондом 2,9т.п.н. Ці результати використовували для побудови с карти, що розташовує внутрішні пептидні послідовності ТеБА;, як показане на Фіг.3.

Послідовність фрагменту, що кодує ТеБА;; 2,9т.п.н. со

Приблизно 200нг очищеного фрагменту 2,9т.п.н. (отриманого, як описано вище) осаджували етанолом та розчиняли в 17мл води. Одну половину використовували як матрицю з 25 пмоль пула ТН-5 як праймерів, а іншу половину використовували як матрицю з праймером ТН-10. Реакції секвенування проводили, як описано в « дю Прикладі 8. З пулом праймерів ТН-10 не було отримано вірогідної послідовності; однак реакції з пулом З с праймерів ТН-5 продукували описану нижче послідовність: з 1 ААТССТОТТО АТОССТАТОС СОоМОсСсоссТ ТООСТОСАДТ ССАТСТОСТО АссссОссТТ 51 ТАТТМСАСО АНТМСТОСОС ТОАСФССАДА ААМТОСААТО АЛАСААСТТС ААТТТМТТАС 15 121 СТАСАТАЛАС СТОССССООМ ТІТАСАААСМ ТТАМТОМТСА ОССАСАКААТ ТТТОСТТсАС со 121 САААТТОСАС ССМТОСТТСТ СТОТАТТОАТ ТМОССссСТОС ССОССТТОСА АМННААААЯНА 241 ССАЛАТМСАС ААСТТСАССТ САТОСМТТТО ТИССМАМСТТ МІССТТТАСО ТСОССАСААА ко 3101 ССТІМТСАМС АСОМІТМТОА ААСТОТОСОО САЛАТОСТОС АТСАМОСТСА МеСАССМТТМ 361 СОССАТТОЯ

ФТ» со На основі цієї послідовності було сконструйовано секвенуючий праймер (ТН-21, с 5-ССОООСОАСОТТТАТСТАСО-3) для основ зворотного комплементу 120-139 та ініціації полімеризації у напрямі 5-кінця (тобто ТН-5-кінця) очищеного на гелі ПЛР-фрагменту 2,9т.п.н. ТерА ;. Визначену послідовність показано нижче та її порівняно з біохімічно визначеною М-кінцевою послідовністю пептиду ТеБА; ЗЕО ІО Мо. 5Б Підтвердження послідовності ПЛР-фрагменту 2,9т.п.н. ТоБА; о (Підкреслені амінокислоти: послідовності, що їх кодують вироджені олігонуклеотиди) ко 60 б5 бЕО тр ль1 й Е 1 0 сб З 5 0 п ' ЕЕ сб - - А 2,9 оС АТС САС ССО ТАТ АСТ САС СТО ТТТ ОСТ ААТ СстТ сстТ т.Пп.н.,

М 0 с 0яї 5 0 ЕЕ С М ВК А т З гомології виробленої амінокислотної послідовності з послідовністю, визначеною біохімічно, випливає, що

ПЛР-фрагмент 2, От.п.н. являє собою район, що кодує ТерА. Цей фрагмент 2,9т.п.н. використовували потім як гібридизаційний зонд для скринінгу геномної бібліотеки Ріпоїогпардивз МУу-14, отриманої в Прикладі 8, на космиди, що містять ген, який кодує ТебБА;,.

Скринінг космидної бібліотеки Рпоїогпарадив 7 Очищений на гелі фрагмент ПЛР 2,9т.п.н. мітили ЗР з використанням набору для мічення Воепйгіпдег

Маппвпеїт Нідй Ргіте, як описано в Прикладі 8. Фільтри, що містили залишки приблизно 800 колоній з космидної бібліотеки, скринювали, як описано раніше (Приклад 8), та позитивні клони висіювали штрихом для отримання окремих колоній та повторно піддавали скринінгу. Три клони (8А11, 25058 та 2601) давали позитивні результати с дв протягом декількох стадій скринінгу та характеристики. Гібридизації ТсрА ;-специфічного зонда ніколи не одержували з будь-якою з чотирьох космид, що ідентифікувалися в Прикладі 8, які містять гени (саВ та ісас. (о)

ДНК з космид 8А11, 25058 та 260 розщепляли рестриктазами Від 2, Есок 1 або Ніпа З (окремо або в комбінації одна з одною), та фрагменти розділяли на агарозному гелі та переносили на нейлонову мембрану, як описано в

Прикладі 8. Мембрану гібридизували з Згр-міченим зондом, отриманим з фрагменту 4,5т.п.н. (отриманого ю зо шляхом ампліфікації геномної ДНК Рпоюгпараиз з праймерами ТН-5-ТН-17). Розподіли (малюнки смуг), отримані з космидних ДНК 8АТ11 та 2601, були ідентичними з розподілами, отриманими з геномного ДНК, що її с розрізають у подібний спосіб, на тій самій мембрані. Було зроблено висновок, що космиди 8А11 та 2601 є «У точними відображеннями кодуючого локусу геномного ТеБА;. Однак, космида 25058 має один фрагмент Ва! 2, що є дещо більшим за геномну ДНК. Це може бути результатом розташування інсерту всередині вектору. с

Послідовність ДНК гена, що кодує ТсеБА со

Гібридизаційний аналіз на мембрані космиди 2601 виявив зонд 4,5т.п.н., який було гібридизовано з одним великим фрагментом Есок 1 (більшим, ніж От.п.н.). Цей фрагмент очищали на гелі та лігували в сайт Есок 1 рвс

КЗ (т), як описано в Прикладі 8, для створення плазмиди рВО-51/К1. Часткову послідовність ДНК інсерту ДНК цієї плазмиди визначали "прогулянкою праймера" від фланкуючої послідовності вектору з використанням « процедур, описаних в Прикладі 8. Подальшу послідовність генерували шляхом подовження від нових з с олігонуклеотидів, що їх було сконструйовано з раніше визначеної послідовності. При порівнянні з визначеною послідовністю ДНК для гена ісБА, яку ідентифікували іншими способами (яку описано тут у вигляді ЗЕО ІЮ Мо11, з як описано в Прикладі 12 нижче) було виявлена повну гомологію з нуклеотидами 1-272, 319-826, 2578-3036 та 3068-3540 (загальна кількість основ - 1712). Було зроблено висновок, що обидва підходи може бути використано для ідентифікації фрагментів ДНК, які кодують пептид ТебА|. со Аналіз отриманої з гена ІсБА амінокислотної послідовності

Послідовність фрагменту ДНК, яку ідентифіковано як ЗЕО ІЮ Мо11, кодує білок, амінокислотну послідовність ко якого описано тут як ЗЕО ІЮО Мо12. Деякі ознаки підтверджують ідентичність цього гена як гена, що кодує білок їх ТеБА;. М-кінцевий пептид (ЗЕО ІЮО Мо1: РНе Іе Сіп Су Туг Зег Авр Геи Ре Су Авп Ага Аа) кодує амінокислоти 88-100. Внутрішній пептид ТеБА;; ТоБА;-РТВ81 (а) (ЗЕО ІЮО Мо23) кодує амінокислоти 1065-1077, а ТсрА;-РТ81 (Б) о (ЗЕО ІЮО Мо24) кодує амінокислоти 1571-1592. Крім того, внутрішній пептид ТсрА-РТ56 (ЗЕБЕО ІЮО Мо22) кодує сл амінокислоти 1474-1488, а внутрішній пептид ТсрА/-РТ103 (5ЕО ІЮО Мо24) кодує амінокислоти 1614-1639.

Очевидно, що цей ген є аутентичним клоном, що кодує пептид ТсрА;, який виділено з препаратів інсектицидного білка штаму МУ-14 Рпоїюгпардиз Іштіпевзсепз. Білок, який виділено у вигляді пептиду ТеБА ;, утворено внаслідок розщеплення більш довгого пептиду. Доводить це той факт, що нуклеотиди, які кодують

М-кінцневий пептид ЗЕО ІЮО Мої! ТсрА;, мають перед ними 261 основу (кодуючі 87 найближчих М-кінцевих

ГФ) амінокислот) більш довгої відкритої рамки зчитування (ЗЕО ІЮО Мо11). Ця рамка зчитування починається

Ф нуклеотидами, що кодують амінокислотну послідовність Меї Сіп Авзп Зег Гец, яка відповідає М-кінцевій послідовності великого пептиду ТсБА, та яку описано тут як ЗБЕБЕО ІЮО Мо1б. Можна думати, що ТсрА є бо білком-попередником ТерА).

Спорідненість генів (сСБА, ісав та їсас

Гени ісавВ та ісасС є тісно зв'язаними та можуть транскрибуватись у вигляді однієї мРНК (Приклад 8). Ген

ЇСЬА знаходиться на космидах, які, очевидно, не перекриваються з космидами, що несуть кластер ісаВ та їсас, тому що відповідні скринінги геномної бібліотеки ідентифікували різні космиди. Однак, порівняння 65 амінокислотних послідовностей, що їх кодують гени ісавВ та ісасС, з геном ІсСбБА, виявило значну міру гомології.

Консервативність амінокислот (Ргоївеіп Айдптепі Моде ої МасМесіогтм бедцуепсе Апаїувіз Боймаге, зсогіпа тайіх рат250, пази маІШе-2; Кодак Зсіепійіс Ітадіпд Зувіетв, КосПпевіег, МУ) показано на Фіг.4. На лінії оцінки кожної частини в Фіг.4 направлені догори значки (7) вказують гомологію або зміни консервативних амінокислот, а направлені донизу значки (М) вказують відсутність гомології.

Цей аналіз показує, що амінокислотна послідовність пептиду ТеБА від залишку 1739 до залишку 1894 є високо гомологічною амінокислотам 441-603 пептиду ТсавВ; (162 з 627 амінокислот Р8В; ЗЕО ІО Мо28). Крім того, послідовність амінокислот ТерА 1932-2459 є високо гомологічною амінокислотам 12-531 пептиду ТсаВ; (520 з 562 амінокислот; 5ЕО ІЮ Мо30). Зважаючи на те, що пептид ТеБА (ЗЕО ІЮ Мо12) містить 2505 амінокислот, всього 684 амінокислоти (2790) при С-проксимальному кінці його є гомологічними пептидам ТсаВ, або ТсаВ;, та 7/0 гомології розміщені колінеарно з розташуванням можливого препротеїну Тсав (ЗЕ І Ме26). Розмір проміжку в гомології ТСЬА співпадає з місцем сполучення між частинами ТсаВ; та ТсаВ;; препротеїну ТсаВ. Ясно, що генні продукти ТеБА та ТсавВ є еволюційно спорідненими, та припускається, що вони мають загальну функцію (функції) в Ріоїюгпаврадивз.

Приклад 10

Характеристика цинк-металопротеаз в бульйоні РІоіїогпарадив: Інгібування протеази, класифікація та очищення

Аналіз інгібування протеази та класифікаційні аналізи: Тести на протеазу виконували з застосуванням

ФІТЦ-казеїну, який було розчинено у воді, як субстрату (кінцева концентрація в тесті 0,08905). Реакції протеолізу проводили при 259С протягом 71 години в підхожому буфері з 25мкл бульйону РІіогпардивз (загальний реакційний об'єм 150мкл). Проби також аналізували на присутність та відсутність дітіотреїтолу.

Після інкубації додавали рівний об'єм 1295 трихлороцтової кислоти до осаду нерозщепленого білка. Після осадження протягом 0,5 години та подальшого центрифугування 100мкл супернатанту приміщували в 9б-луночний мікротитраційний планшет та рН розчину доводили доданням рівного об'єму 4н Маон. Потім протеоліз визначали кількісно, застосовуючи флуориметричний планшет-рідер Ріпогозсап І за довжин хвиль с

Збудження та емісії 485 та 538нм, відповідно. Протеазну активність вимірювали в діапазоні рН5,О - 10 з приростами 0,5 одиниць. Використовували такі буфери при остаточній концентрації 5ОмММ: ацетат натрію (рН5,О - і) 6,5); Трис-НСІ (рН7,О - 8,0) та біс-Трис-пропан (рН8,5 - 10,0). Для ідентифікації класу протеази (протеаз), що її спостерігали, вихідний бульйон обробляли різними інгібіторами протеаз (кінцева концентрація О,5мкг/мкл) та потім випробовували на протеазну активність при рНа,0 з застосуванням описаного вище субстрату. Інгібітори ку зо протеаз, що їх використовували, включали Е-64 (І -транс-епоксисукциніллейциламідо|4-гуанідино|-бутан), 3,4-діхлоризокумарин, Лейпептин, пепстатин, амастатин, етилен-діамінтетраоцтову кислоту (ЕДТК) та со 1,10-фенантролін. «г

Визначення протеази, проведені в діапазоні рН, виявили, що дійсно наявна протеаза (або протеази), що виявляють максимальну активність при рН «8,0 (Таблиця 16). Додання ДТТ не впливало на протеазну активність. с

Потім вихідний бульйон обробляли різними інгібіторами протеаз (Таблиця 17). Обробка вихідного бульйону со описаними вище інгібіторами виявила, що 1,10-фенантролін викликав повне інгібування всієї протеазної активності при доданні при остаточній концентрації 5Омкг, з ІСво-бмкг в 100мкл вихідного розчину бульйону 2мг/мл. Ці дані вказують на те, що наявною у найбільшій кількості протеазою (протеазами) в бульйоні

Ріоїюгпавдиз є ферменти класу цинкметалопротеаз. « - "з активність, виявлену в продуктах " 1-го дня Риоїогнардив Іштіпезсепе (штам Уу-14)

Активність? со ю пинистлини с: ЛИ Н ь со сл нити ни НН ЛИ в 01000000 зв в 00100006 о ле а Флуор. одиниці - Одиниці флуоресценції (Максимум --28000; тло --2200). 60 бо Контроль 13053 9)

вм ме пибфенантолня 10819 воолеятн 00000116 петиине 116

Контельзямсо 00000000010011000000ю6000000000018

Ь Відсоток інгібування відносно протеазної активності при рН 8,0 с Інгібітори розчиняли в метанолі 9 Інгібітори розчиняли в ДМСО

Виділення цинк-металопротеази виконували шляхом нанесення діалізованого отриманого осадженням 10 - 8095 сульфатом амонію осаду на колонку С) Зерпагозе, зрівноважену 50ММ МагРО,, рН7, 0, як описано в

Прикладі 5 для токсину Ріоіїогпарадизв. Після інтенсивного промивання використовували градієнт 0 - 0,5М Масі для елюції білка токсину. Більша частина біологічної активності та білка елюювалася в діапазоні 0,15 - 0,45М масі. Однак, було виявлено, що основна протеолітична активність була наявною у фракції 0,25 - 0,35М Масі з деякою активністю в фракції 0,15 - 0,25М Масі. Аналіз з застосуванням електрофорезу в ПААГ-ДСН фракції 0,25 - 0,35М Масі показав основну пептидну смугу приблизно боОкДа. Фракція 0,15 - 0,25М Масі містила схожу смугу бОкДа, але при більш низькій відносній концентрації білка. Подальше гель-фільтрування цієї фракції з застосуванням колонки Зирегозе 12 НЕ 16/50 дало основний пік, що мігрував при 57,5кДа, який містив переважну (29095 всього забарвленого білка) смугу 58,5кДа при аналізі з застосуванням електрофорезу в сеч ПААГ-ДСН. Додатковий аналіз цієї фракції з застосуванням різноманітних інгібіторів протеаз, описаних вище, показав, що ця протеаза була цинкметалопротеазою. Майже уся протеазна активність, наявна в бульйоні о

Ріпоїюгпавадиз при 1-ому дні ферментації, відповідала цинк-металопротеазі -58кДа.

В другому виділенні цинк-металопротеази (протеаз) брали штам МуУ-14 Рпоіїогнардиз Іштіпезсепв, що зростав протягом З днів, та протеазну активність візуалізували за допомогою гель-електрофорезу в поліакриламідному ку гелі з додецилсульфатом натрію (ПААГ-ДСН), з доданням желатина, як описано |Зсптіаї, ї. т., ВієаКіеу, В. апа

Меаївоп, К. М. 1988). Розділяючі гелі, що використовувалися з ДСН (5,5х8см), готували з 12,595 поліакриламідом со (4095 вихідний розчин акриламіду/бісакриламіду; Зідта СНетісаї! Зі., ЗІ. Гоціз МО), до якого включали желатин /«ф при кінцевій концентрації 195 (Віогад ЕІА дгаде геадепі; Кісптопа СА) при розчиненні у воді. Концентруючі

ДеСН-гелі (1,0х8см) готували з 595 поліакриламідом, також з включенням 0,196 желатина. Як правило, 2,5мМкКг с білка, який піддавали тестуванню, розбавляли в 0,0Змл буферу для нанесення для електрофорезу в ПААГ-ДСН с без дітіотрехтолу (ДТТ) та наносили на гель. Білки розділяли в ДСН-буфері для розділення (І аеттії, О.К. 1970.

Маїшге 227, 680) при 02С та при 8мМА. Після завершення електрофорезу гель промивали протягом 2 годин в 2,590 (об./06.) Тритоні Х-100. Потім гелі інкубували протягом 1 години при 37 2С в 0,1М гліцині (рНе8,0). Після « інкубації гелі фіксували та забарвлювали протягом ночі 0,195 амідо чорним в суміші метанол-оцтова кислота - вода (30:10:60, об./об./об.; бідта СНетіса! Со.,). Протеазну активність візуалізували у вигляді світлих зон - с проти темного, забарвленого амідо чорним тла, зумовлених протеолізом та подальшою дифузією включеного ч желатина. Спостерігали принаймні три окремі смуги, що продукувались протеолітичною активністю при 58, 41 та ни ЗакДа.

Аналізи активності різноманітних протеаз в культуральному бульйоні штаму МУУ-14 на третій день ферментації проводили з застосуванням ФІТЦ-казеїну, розчиненого у воді, як субстрату (кінцева концентрація в тесті со 0,02906). Експерименти з протеолізу проводили при 372С протягом 0 - 0,5г в Трис-НСІ (рНаВ,0) з різними т білковими фракціями в загальному об'ємі 0,15мл. Реакції зупиняли доданням рівного об'єму 1295 трихлороцтової кислоти (ТХК), розчиненої у воді. Після інкубації при кімнатній температурі протягом 0,25г проби т. центрифугували при 10000х9 протягом 0,25г та брали аліквоти по О,1Омл й приміщували в 96б-луночні со 20 мікротитраційні планшети. Потім розчин нейтралізували доданням рівного об'єму 2н гідроксиду натрію та кількісні вимірювання виконували з використанням флуориметричного планшет-рідера з довжинами хвиль (л збудження та емісії 485 та 538нм, відповідно. Вимірювання активності проводили з ФІТЦ-казеїном з різними концентраціями протеази при 372 протягом 0-10 хвилин. Одиницю активності довільно встановлювали як кількість ферменту, необхідну для продукування 1000 одиниць флуоресценції на хвилину, а питому активність 22 визначали як одиниці/мг протеази. Дослідження з інгібування проводили з застосуванням двох інгібіторів

Ге) цинк-металопротеаз: 1,10-фенантроліну та М-(а-рамнопіранозилоксигідроксифосфініл)-І ен-Тгтр (фосфорамідону) з вихідними розчинами інгібіторів, розчинених в 10095 етанолі та воді, відповідно. Вихідні концентрації ко дорівнювали, як правило, 1Омг/мл та 5мг/мл для 1,10-фенантроліну та фосфорамідону, відповідно, з кінцевими концентраціями інгібітору 0,5-1,О0мг/мл реакційної суміші. Обробка триденного вихідного бульйону УУ-14 60 1,10-фенантроліном, інгібітором усіх цинк-металопротеаз, призводила до повної елімінації всієї протеазної активності, тоді як обробка фосфорамідоном, інгібітором термолізин-подібних протеаз |(МУеамег,

Г.Н.,Кевіег,МуУ.К., апа Майпемув, В.М/. 1977, 9У.Мої. Віої. 114, 119-132), призводила до «5695 зменшення протеазної активності. Протеолітична активність, що залишалась, не зменшувалась далі при додатковому додаванні фосфорамідону. Протеази триденного бульйону МуУ-14 РІИоіїогпардиз очищували так: 4,0 літри бо бульйону концентрували за допомогою спірального ультрафільтраційного картриджа Атісоп типу 51МІСО, який приєднано до фільтраційного пристрою Атісоп М-12. Матеріал, що проходив, який мав нативні білки розміром менш тООкДа (3,8л) концентрували до 0,375л за допомогою означеного ультрафільтраційного картриджа.

Матеріал, що залишався на фільтрі, містив білки в межах розмірів 10 - 100кДа. Цей матеріал наносили на Колонку НК16/10 РНагтасіа, яку упаковували сильним аніонообмінним матеріалом Регзеріїме Віовузіет (Егатіпдіоп, МА) Рогозе? НО), який зрівноважували в 10мМ буфері з фосфату натрію (рН7,0). Білки наносили на цю колонку при швидкості потоку 5мл/хвил., потім змивали білок, що не зв'язався, буфером до Агово-0,00. Потім білки елюювали за допомогою градієнта 0 - 1,0М Масі протягом 40 хвилин при швидкості потоку 7,5мл/хвил.

Фракції аналізували на протеазну активність, як зазначено вище, та активні фракції об'єднували. Протеолітично 70 активні фракції розбавляли в 2 рази (за об'ємом) 10ММ фосфатним буфером (рН7,0) та наносили на колонку 10/10 Мого О РНагтасіа, зрівноважену в 10ММ фосфаті натрію. Після промивання колонки буфером до А 280-0,0 білки елюювали за допомогою градієнта 0 - 0,5М Масі протягом 1 години при швидкості потоку 2,Омл/хвил.

Фракції аналізували на протеазну активність. Фракції що мали найбільшу кількість фосфорамідон-чутливої протеазної активності, яку було зумовлено протеазою 41/38кДа, іпіта, об'єднували. Було виявлено, що ці 75 Фракці оелюювались в межах 0,15 - 0,25М МасСі. Фракції що містили переважну кількість фосфорамідон-нечутливої протеазної активності, протеази 58кДа, також об'єднували. Було виявлено, що ці фракції злюуються в межах 0,25 - О0,35М Масі. Потім фракції фосфорамідон-чутливої протеази концентрували до кінцевого об'єму О0,75мл за допомогою мембрани Віотах-5К ММУМІ центрифугального фільтруючого пристрою

Мійіроге Шга-їтее?. Цей матеріал наносили при швидкості потоку 0,5мл/хвил., на колонку Рпагтасіа НЕ. 10/30, яку було упаковано Зерпадех 0-50 (Рпагтасіа), зрівноважений в фосфатному буфері (рН7,0) (10мММ фосфат натрію-0,1М Масі). Потім фракції що мали максимальну фосфорамідон-чутливу активність, об'єднували та центрифугували через мембрану Віотах-5бОК ММУУ центрифугального фільтруючого пристрою МіШроге

Огаїее?9.15, Аналіз протеолітичної активності, вирга, показав, що цей матеріал мав тільки фосфорамідон-чутливу протеазну активність. Після об'єднання фосфорамідон-нечутливої протеази, білка 58кДа, М її концентрували в тому самому пристрої та далі розділяли на колонці Зирегаех-75 (Ріагтасіа). Фракції, що о містили цю протеазу, об'єднували.

Аналіз очищених протеаз 58кДа та 41/38кДа виявив, що, у той час як обидва типи протеази повністю інгібувались 1,10-фенантроліном, тільки протеаза 41/38кДа інгібувалась фосфорамідоном. Подальший аналіз вихідного бульйону показав, що протеазна активність одноденного бульйону МУ-14 мала 2395 загальної М) протеазної активності, зумовленої протеазою 41/38кДа, з збільшенням до 4495 в триденному бульйоні МУ-14. со

Стандартний аналіз за допомогою електрофорезу в ПААГ-ДСН для тесту чистоти білка та отримання аміно-кінцевої послідовності, проводили з використанням 4-2095 градієнтних гелів (МіпіРіиз Зергасеї!в), «І придбаних в Іпігедгаїей Зерагайоп БЗувіетв (МаїйсК, МА). Білки, які треба було піддати аміно-кінцневому сч секвенуванню, приміщували блотингом на мембрану РМОЕ після очищення, іпіта, (Ргобіоїтм Метрьгапез; Арріїеа

Зо Віовузіетв, Еовіег Сйу, СА), візуалізували за допомогою амідо чорного, вирізали та посилали до Сатбргідде 89

Ргоспет; Сатьгідде, МА, для секвенування.

Розшифрована аміно-кінцева послідовність протеаз 58кДа (ЗЕБО І Мо45) та 41/38кКДа (5ЕБЕО ІЮО Мо44) з бульйону триденного М/-14 була: ОМ-ОЗЕКАМЕКІ К (5ЕО ІЮ Мо45) та ОБСООСОКМТМТОІНК (ЗЕО І Мо44), « відповідно. Секвенування протеази 41/38кКДа виявило декілька аміно-кінців, кожен з яких мав додаткову амінокислоту, яку видаляв протеолізом. Випробування первинної, вторинної, третинної та четвертинної - с послідовностей для поліпептидів 38 та 41кДа дозволило розшифрувати наведену вище послідовність та "» виявило, що ці дві протеази є гомологічними. " Приклад 11, Частина А

Скринінг геномної бібліотеки Рпоїогпардиз з використанням антитіл проти генів, що кодують пептид ТерА

Паралельно до описаного вище секвенування відповідне зондування та секвенування проводили на пептиді со ТерА; (5ЕО ІО Мо1). Це секвенування проводили шляхом отримання бактеріальних культуральних бульйонів та т очистки токсину, як описано в Прикладах 1 та 2 вище. Геномну ДНК виділяли з штаму МУ-14 Ріпоїогпардив

Іштіпезсепз, що зростав на середовищі Грейса для культури тканини комах. Бактерії вирощували в Ббмл т. культурального середовища в колбі Ерленмейера на 250мл при 282С та 250об./хвил., протягом приблизно 24 со 20 годин. Бактеріальні клітини з 100мл культурального середовища осаджували при 5000х9 протягом 10 хвилин.

Супернатант викидали і потім осад клітин використовували для виділення геномної ДНК. сл Геномну ДНК виділяли за допомогою модифікації способу ЦТАБ, який описано в Розділі 2.4.3 Аизибеї (зирга).

Розділ, що має заголовок ""агде Зсаіе Св8вСіІ ргер ої расіегіаї депотіс ОМА", використовували до стадії 6 (включно). В цьому пункті проводили додаткову екстракцію ДНК сумішшю хлороформ/ізоаміловий спирт (24:1) з 25 наступною стадією екстракції сумішшю фенол/хлороформ/ізоаміловий спирт (25:24:1) та кінцевою стадією

Ге) екстракції сумішшю хлороформ/ізоаміловий спирт (24:11). ДНК осаджували доданням 0,6 об'єму ізопропанолу.

Осаджену ДНК зачіпляли та намотували на кінець зігнутої скляної палички, занурювали ненадовго в 70905 етанол ле як кінцеве промивання та розчиняли в Змл буферу ТЕ.

Концентрація ДНК, яку було визначено за оптичною густиною при 280/26Онм, дорівнювала приблизно 2мг/мл. 60 З використанням цієї геномної ДНК одержували геномну бібліотеку. Приблизно 5Омкг геномної ДНК частково розщепляли рестриктазою бацЗ Ат. Потім використовували центрифугування в градієнті МасСі для фракціонування за розміром частково розщеплених фрагментів ДНК. Фракції, що містили фрагменти ДНК зі середнім розміром 12т.п.н. або більше, як було визначено за допомогою електрофорезу в агарозному гелі, лігували в плазмиду Вінпезсгірі, Зіга(адепе, І а доіа, Саїйогпіа, та трансформували в штам ОНба або ОНВОЕ. сої. бо Окремо, очищені аліквоти білка посилали до центру біотехнології гібридом при Вісконсинському університеті

(Мадізоп) для отримання моноклональних антитіл до цих білків. Матеріал, що було послано, являв собою очищену за допомогою ВЕРХ фракцію, яка містила нативні смуги 1 та 2, що їх було денатуровано при 652С, та 20мкг кожної ін'єкєували в кожну з чотирьох мишей. Стабільні клітинні лінії що продукують моноклональні антитіла одержували після зливання клітин селезінки з неімунізованих мишей зі стабільною лінією мієломних клітин. Моноклональні антитіла здобували з гібридом.

Окремо, одержували поліклональні антитіла, беручи білок смуги 1, очищений на нативному агарозному гелі (див. Приклад 1), який потім використовували для імунізації Новозеландського білого кролика. Білок одержували вирізанням смуги з нативних агарозних гелів, недовгим нагріванням шматочків гелю до 65923 для розплавлення 70 агарози та негайним емульгуванням з ад'ювантом. Повний ад'ювант Фрейда використовували для первинних імунізацій та неповний ад'ювант Фрейнда використовували для З додаткових ін'єкцій з місячними інтервалами.

Для кожного введення, приблизно 0,2мл емульгованої смуги 1, що містить 50 - 100мкг білка, доставляли шляхом численних підшкірних ін'єкцій в спину кролика. Сироватку одержували за 10 днів після останньої ін'єкції та додаткові кровопускання виконували з тижневими інтервалами протягом З тижнів. Сироватковий комплемент 75 інактивували нагріванням до 562С протягом 15 хвилин та потім зберігали при -202С. Потім моноклональні та поліклональні антитіла використовували для скринінгу геномної бібліотеки на експресію антигенів, які могли б детектуватися за епітопом. Позитивні клони виявляли на нітроцелюлозних фільтрах, що застосовувались для підйому колоній. Було вжито імуноблотингу позитивних клонів.

Аналіз клонів, що визначалися як імуноблотингом, так і аналізом за Саузерном, спричинив експериментальну ідентифікацію п'яти класів клонів. В клоні першого класу був ген, який кодує пептид, що називається тут ТебБА і.

Було отримано повну послідовність ДНК цього гена (ТебБА). її представлено як ЗЕО ІЮО Мо11. Підтвердження того, що ця послідовність кодує внутрішню послідовність ЗЕО ІЮ Мо1, демонструється наявністю ЗЕО ІЮО Мо1 у позиції амінокислот 88 від розшифрованої амінокислотної послідовності, яку створює відкрита рамка зчитування 5ЕО ІЮ

Мо11. Це може бути підтверджено посиланням на ЗЕО ІЮ Мо12, що є розшифрованою амінокислотною Га послідовністю, що створюється ЗЕО ІЮ Мо11. Другий клас пептидів токсину включає сегменти, що називаються вище як ТсавВ;, ТсаВ; та Тсас. Після скринінг у бібліотеки поліклональними антисироватками цей другий клас о генів токсину ідентифікували у вигляді кількох клонів, що продукували різні за розміром білки, які всі перехресно реагували з поліклональними антитілами на імуноблоті та, як було виявлено, мали гомологію ДНК на блоті в аналізі за Саузерном. Порівняння послідовностей виявило, що вони відносяться до комплексу генів, що Іо) називається вище ТсавВ та Тсас. Три інші класи клонів також виділили при поліклональному скринінгу. Ці класи продукували білки, що перехресно реагували з поліклональними антитілами та також мали гомологію ДНК з со цими класами, як було визначено блотингом за Саузерном. чЕ

Ці класи було названо Клас І, Клас ІМ та Клас М. Також можна виявити моноклональні антитіла, що перехресно реагують з Класами І!, ІІ, ШІ та ІМ. Це дозволяє припустити, що всі вони мають високу білкову с гомологію. Таким чином, очевидно, гени екстрацелюлярних білків Рпоїогпардиз Іштіпезсепз являють собою со сімейство генів, що є еволюційно спорідненими.

Для подальшої розробки концепції, що можуть існувати еволюційно споріднені варіації в пептидах токсину, які містяться в цьому організмі, було вжито два підходи для дослідження інших штамів Рпоїогпардиз Іштіпезсепз на присутність споріднених білків. Це було зроблено за допомогою ПЛР-ампліфікації геномної ДНК та за « допомогою імуноблотингу з використанням поліклональних та моноклональних антитіл. в с Ці результати показують, що споріднені білки продукуються штамами Рпоюгпарадиз Іштіпевзсепе МУХ-2, М/Х-3, ц МУХ-4, МУХ-5, МУХ-6, МИХ-7, МУХ-8, МУХ-11, МУХ-12, МУХ-15 та МУХ-14. "» Приклад 11. Частина В

Секвенування та аналіз клонів токсину Класу ПІ-їсс

Подальше секвенування ДНК проводили на плазмидах, які було виділено з клонів Е. соїї Класу ІЇЇ, описаних (се) в Прикладі 11, Частині А. Було показано, що нуклеотидна послідовність являла собою три тісно зв'язані відкриті рамки зчитування в цьому генному локусі. Цей локус було названо (ес, а три відкриті рамки зчитування о було названо іссА 5ЕО ІЮО Мо56, їссВ ЗЕО ІЮ Мо58 та їссС ЗЕО ІЮ Мобо (Фіг.6В). Розшифрована амінокислотна с» послідовність з відкритої рамки зчитування іїссА показує, що цей ген кодує білок 10545ОДа. Цей білок було названо ТссА. Перші 12 амінокислот цього білка збігаються з М-кінцевою послідовністю, яку було одержано з со білка 108кДа ЗЕО ІЮ Мо7, що її було ідентифіковано раніше як частину комплексу токсину. с Розшифрована амінокислотна послідовність з відкритої рамки зчитування іссВ показує, що цей ген кодує білок 175716Да. Цей білок було названо ТосВ. Перші 11 амінокислот цього білка збігаються з М-кінцевою послідовністю, яку було отримано з білка з визначеною молекулярною масою 185кДа 5ЕО ІЮ Мов.

Розшифрована амінокислотна послідовність їссС показує, що ця відкрита рамка зчитування кодує білок 111694Да й цей білковий продукт було названо Тесс. (Ф) Приклад 12 ко Характеристика штамів Ріоїогпардив

Для підтвердження того, що колекція, яку описано тут, складається з штамів РПоїогпарадив, ці штами 60 оцінювали за мікробіологічними ознаками, які є характерними для Ріоіогпардиз та відрізняють його від інших видів Епіегорасіегіасеае та від видів Хепогпардиз (Рагтег, ..). 1984. Вегдеуз Мапиа! ої Зузіетіс

Васіегіооду, моЇ. І, рр.510 - 511. (ей. Кгеід М.К. апа Ной, 9.05.). МУМШіатве апа М/УйКіпв, Вайітоге.;

АкКкпигві апа Воетаге, 1988, Воетаге еї а!., 1993). Цими характерними ознаками є: грамнегативні палички, розмір організму 0,5 - 2МмкМ завширшки та 2 - 1ОмкМ завдовжки, червона/жовта пігментація колоній, наявність 65 кристалічних тіл включення, наявність каталази, неспроможність відновлювати нітрати, наявність біолюмінесценції, спроможність поглинати барвник з середовищ для вирощування, позитивна реакція на продукування протеази, температурна межа зростання нижче 37 С, виживання за анаеробних умов та рухливість (Таблиця 18). Стандартні штами ЕзспПегіспіа соїї, Хепогпардиз та Рпоїогпардиз включали до всіх тестів для порівняння. Всі результати погоджуються з тим, що всі штами належать до родини Епіегобасієегіаседе та роду Рпоюгтабраиз.

Люменометр використовували для виявлення біолюмінесценції кожного штаму та забезпечення кількісного та відносного вимірювання утворення світла. Для вимірювання відносних одиниць емісії світла бульйони від кожного штаму (клітини та середовища) вимірювали при трьох часових інтервалах після інокулювання в рідкій культурі (6, 12 та 24г) та порівнювали з фоновою освітленістю (не інокульовані середовища та вода). Перед 7/0 вимірюванням емісії світла з різних бульйонів густину клітин визначали шляхом вимірювання поглинання світла (5бонм) в спектрофотометрі Сійога Зузіетве (ОбБегіп, ОН) з використанням зіррег-елементу. Потім робили підхожі розведення (для нормалізації оптичної густини до 1,0 одиниці) перед вимірюванням освітленості. Потім аліквоти бульйонів, які було розведено, приміщували в кювети (З0Омкл кожна) та знімали показання люменометру Віо-Огрії 1251 (Віо-Огрй Су, Тм/ікі, Ріпіапа4). Період інтеграції для кожної проби дорівнював 45 7/5 секундам. Проби безупинно перемішували (крутили в кюветах з перегородками) під час зняття показань для забезпечення доступу кисню. Позитивну відповідь було визначено як »5-разову фонову люмінесценцію (-5 - 10 одиниць). Крім того, освітленість колоній виявляли шляхом накладання на фотографічні плівки та візуально, після адаптації в темній камері. Характеристики забарвлення за Грамом кожного штаму визначали з комерційним набором для забарвлення за Грамом (ВВІ, СосКеузмійе, МО), що використовувався разом з контрольними слайдами забарвлення за Грамом (Різспег Зсіепійіс, Рійвриго, РА). Потім проводили мікроскопічну оцінку з використанням мікроскопу Цейса (Сагі 7еїзв, (зеппапу) з 100х масляним імерсійним об'єктивом (з збільшенням окуляру 10х та збільшенням корпусу 2х). Дослідження під мікроскопом розмірів окремих штамів організму, опис клітин та тіл включення (останнє - після логарифмічної фази зростання) виконували з застосуванням вологих мікроскопічних препаратів (уеї тоипі зіїдез) (10х збільшення окуляру, 2х збільшення корпусу та 40х збільшення сі об об'єктиву) за допомогою мікроскопії з масляною імерсією та фазово-контрасної мікроскопії з мікрометром

ІАКпигві, К.). апа Воетаге, М.Е. 1990. Епіотораїйодепіс Метаїйодез іп Віоіодіса! Сопіго! (ей. Сацдієег, К. апа о

Кауа, Н.). рр.75-90. СК5 Ргезз, Воса Каїоп, ОА; Ваодпаїідчціап 5., Воуег-Сідіо М.Н., Тнаїег, 9У.0., Воппої 0.,

Воетаге М. 1993. ВіоІ. СеїІ 79, 177-185). Пігментацію колоній спостерігали після інокулювання на бактоагар (Васіо пийгіепі адаг, Осо Іарогайогіез, ЮОейгоїї, МІ), який було приготовано відповідно до інструкцій, що юю додавалися. Інкубування відбувалося при 28 2С, та описи робили після 5 - 7 днів. Для тестування на наявність ферменту каталази колонію організму, який тестували, видаляли на маленькій пробці з чашки з живильним со агаром та приміщували на дно скляної тест- пробірки. Один мл розчину пероксиду водню, приготованого в чЕ лабораторії, обережно додавали по боковій стінці пробірки. Позитивну реакцію реєстрували, коли відразу ж або в межах 5 секунд з'являлися бульки газу (як припускалось - кисню). Досліджували також контролі з с неінокульованим живильним агаром та розчином пероксиду водню. Для визначення відновлення нітратів кожну (о культуру інокулювали в 1Омл Бакто-нітратного Бульйону (Оїїсо Іарогайогіез, ЮОеїгої, МІ). Після 24 годин інкубації при 282 визначали утворення нітритів шляхом додання двох крапель реагенту з сульфаніловою кислотою та двох крапель альфа-нафтиламінового реагенту |див. Осо Мапиаї, ТОК еайіоп, Оїїсо І арогайгієв,

Оеїгоїї, МІ, 1984). Утворення чіткого рожевого або червоного забарвлення вказує на утворення нітриту з « нітрату. Спроможність кожного штаму поглинати барвник з середовища для вирощування визначали з - с бактоагаром МасСопкКеу, що містив барвник нейтральний червоний; з бактоагаром ТегоїййоІ-7, що містив барвник а бромтімол синій, та бактоагаром ЕМВ, що містив барвник еозін-У (агари з Оїсо І арогайгіез, ЮОейгоїї, МІ, всі "» було приготовано відповідно до інструкцій, що додавались). Після інокулювання на ці середовища поглинання барвника реєстрували після інкубування при 28 оС протягом 5 днів. Зростання на цих середовищах є характеристикою для членів родини Епіегорасіегіасеае. Рухливість кожного штаму визначали з використанням о Тест-середовища для визначення рухливості (Васю Мойцйу Тевзі Меаішт (Ойсо І арогаюгіез, ЮОейгоїї, МІ), яку т було приготовано відповідно до інструкцій, що додавались. Проводили уколочне інокулюванням кожним штамом та рухливість оцінювали макроскопічно за дифузною зоною зростання, що розповсюджується від лінії інокулята.

ФТ» В багатьох випадках рухливість також спостерігали під мікроскопом з рідкої культури на вологих препаратах 20 (жеї тошпі віїдев). Біохімічну живильну оцінку для кожного штаму виконували з застосуванням ВВІ. Епіегоїшбе І со (Вепюп, ОісКіпзоп, Сегтапу). Дотримувались рекомендацій, що супроводжують цей продукт, за винятком того, сп що інкубацію проводили при 282С протягом 5 днів. Результати погоджувались з раніше наведеними даними для

РІіоїогпардив. Утворення протеази визначали спостереженням гідролізу желатина з використанням бактожелатину (Осо Іарогайгіез, Оеїгоїї, МІ), чашки готували відповідно до інструкцій, що додавались. 29 Культури інокулювали та чашки інкубували при 282С протягом 5 днів. Для оцінки зростання при різноманітних о температурах чашки з агаром (295 ргоїеозе реріоп МоЗ з 27 бактоагаром (Оїїсо І арогайюгіез, Оейгоїї, МІ) в деіонізованій воді| засіювали штрихом з звичайного джерела інокулята. Чашки герметизували Мезсоб Піт та ко інкубували при 20, 28 та 372С протягом періоду до трьох тижнів. Чашки, що не виявляли росту при 37 С, не виявляли життєздатності після їх перенесення до термостату на 28 С протягом одного тижня. Потреба в кисні 60 для штамів Ріоїогпардиз тестували так. Проводили уколочне інокулювання у рідке бульйонне середовище, що містило тіогліколат (Осо І арогаюгіез, ЮОеїгоїї МІ). Трубки інкубували при кімнатній температурі протягом тижня та потім культури випробовували на тип та ступінь зростання. Індикатор резазурин демонструє рівень помірного окислення або зону аеробіозу (Ойсо Мапиа), 10-2 еаййоп, ЮОйсо Іаброгайюгіез, ЮОеїйгої, Мі).

Результати щодо зони зростання, отримані для штамів РІоіїогпарадив, які було тестовано, відповідають бо результатам для факультативного анаеробного мікроорганізму.

Таблиця 18

Таксономічні ознаки РвобогНардйив іатіпевсепа

Ознаки, що їх оцінюють

Штам с б І Ії ї 14 х хх / дкй| х х х х х х Е х х х 5

А- грампозитивний штам, В- кристалічні тіла включення, С- біолюмінесценція, ЮО- форма клітини, Е- рухливість, Е- відновлення нітратів, с3- наявність каталази, Н- гідроліз желатина, І- поглинання барвника, .)- пігментація, К- зростання на ЕМВ-агарі, І - зростання на агарі МасСопКеу, М- зростання на агарі ТегойоїІ-7, М- факультативний анаероб, О- зростання при 202С, Р- зростання при 282С, 0- зростання при 372С; с (8) ів) (ге) «І с со - с ;» со ко

ФТ» со «сл

Ф) ко 60 б5 мо ВЕД НЯ БА ПЕНІ ПЕ НЯ ПЕ НЯ БА ПЕНІ НЕЯ НБ А НБН НБН НІ НБН ; х хі хЗ| і-й їх ї ї Кл Ж її ї-й ї х-2 х х | кй х х х х ї х х ХЕ ї х

З

Вк Й НЕОН НБН А НЯ НОЙ НЕ НЕО ПО По НЯ МО НЕ НЕ НЕ НБН НЕ м в НЕ Я о З ПИ Ж НЕ НЯ НЕ оо НБН НИ НЕ ПНО БИ НЕ М

З

На НЕО Я МЕТИ НЕ М НЕ ПЕС НЯ оо НЕ НИ НО НЕ ЕН НЕ ЩЕ 5 ; І ї х | х4| х х х ВІВ хх х х х х ї 5 я хх З фрІ4Й| х х ї ї ї х х х їм ї

З

ХВ ї х Гтх4| 5 х х ї х їх х х х х 5 м а НЕ ПЕД ЕІ НЕ НЕ НИ НС ПЕНЯ ос НЕ ПЕ НЕ ПЕС НЕ БЖ 5 ї || х х ї || ж ї х х Ж х

З я | хіх хіх ||| 111 с 8 о

Пшіо НЕ ПЕ ПЕ ЕЗЯ НЕ НЕ НЕО ПЕ ПЕ НБН НЕ НИ ПЕНЯ НИ НИ НЕОН

З

Ук х ях | хі | х х ї х|БК| х х х ї ХЕ х ї ів)

М іі ПЕЖО НЕО ПЕ ПЕ НЕ НЕ НЕ НЕО МЕН оо НЕ НЕ НЕ НЕО НЕ НЕ ПЕ НА 5

ВАЛИ НЯ ЕІ Я НЯНЯ НЯ Я с НЯ НЯ НЯ ПЕ НЯ І 5 МИ 5 см х З р|рІхІЯ | х ї х х | ХТ| х х З х іл х « со

Б ле БД Я НЕ НЕ НЕ НЕ НЕ Бе ПЕН НЕО НИ НС НЕ НБН

З

РЕВЕ | хіх хх іх | іі « 5 зо ел - р кій ГГ хз хіх но) с 5 зам жі ПЕВ НЯ ПЕ Я НЕ НЕ ПЕ НЕ НЕО я ПИ НЕ ПБС НЕ НЕО БЖ п 5

МІВ Ж хх я їх х Ж ї ї ї х І х 8 ам Бо Ел ПЕД НЕ Я ПЕ о НЕ ПЕ ПЕ ПИ ПЕС НЕ ПЕН НЕ НЕ ПЕН В т 5 ра й х | к4| 5 Ж х ї ва ї Ж х Ж х в ГТ АКТ ТАТ ТТН (ее) . пеня ло лин о жо миня, нин нин ння ння. нн --м- мин. нні іні і- ж миня ох ння ння ж, нн - нн нн чу. «сл ж/- позитивний чи негативний щодо ознаки, га- паличка, 5- підходить за розміром до цього роду, КО- червоно-оранжева, ЇК- ясно-червона, К- червона, О- оранжева, У- жовта, Т- рудувато-коричнева, І У- ясно-жовта, УТ- жовто-рудувато-коричнева, І О- ясно-оранжева. вай ДИ Я Я Я и и ПЕ НБН ПЕ ПЕН М ЛОЖІ ПЕ ПК МБ о В я ж КЗ ж я К Би я ж х жк Ех - зи По ПИ В НЕО Пе А ПЕ ПЕ ПЕЖО НИ ПСИ ПЕ ПЕ НЕК НЕО ПЕЖО ВЕЖІ ЕЙ сл іо ПЕД ВЕ БИ БА ПЕ ПЕ ПЕ ПЕ ПЕ ПЕ В ПЕС ПБС ПЕНЯ ПЕН 5 ох ПЕД НД НЕ ЕІ НЕ Я НЕ НЕ ПЕС НЕО ПО ПО НЕ МЕН НЕ НЕ НЕ

З г АТ б5 З

Аналіз жирних кислот клітини є визнаним інструментом бактеріальної характеристики на рівні роду та виду

Погпабепе Т.0. 1985. Іірій Апаїузів апа Кеїайопепір 0 СПетоїахопоту іп Меїйодз іп Місгоріоіоду. Мої1.18, 209-224; Соодейом, М. апа О'боппеї, А... 1993. Кооїв ої Васієегіаї Зузіетаїййсв (ей. СоосеПйом, М. апа

О'Вапієї, А.О.) рр.3-54. | опдоп: Асадетіс Ргезз Ц.), що їх включено тут як посилання та використано для підтвердження того, що наша колекція має спорідненість на рівні роду. Культури було відправлено до іншої, контрактної лабораторії для аналізу метилових ефірів жирних кислот (ГАМЕ) з застосуванням Системи ідентифікації мікробів (МІ5) з Місгоріаї І (МІОІ, Мемжагк, ОБА). Система МІЗ складається з газового хроматографу НемЛей Раскага НРБ5ВООА з колонкою з сплавлених 595 метилфенілсиліконом капілярів, що 7/0 бкладаються з діоксиду кремнію (25мМ хб0,2мм). Як газ-носій використовують водень та детектор на основі плазменої іонізації працює разом з автоматичним пробовідбірником, інтегратором та комп'ютером. Комп'ютер порівнює метилові ефіри жирних кислот проб з мікробною бібліотекою жирних кислот та порівнює з калібровальною сумішшю відомих жирних кислот. За розсудом контрактної лабораторії штами росли протягом 24 годин при 2823 на триптиказному соєвому агарі перед аналізом. Екстракцію проб в контрактній лабораторії 75 проводили за стандартною методологією ЕАМЕ.

Не було прямої ідентифікації штамів відносно до будь-якої люмінесцентної бактеріальної групи, іншої, ніж

Рпоюгпабайїіз. При виконанні кластерного аналізу, що порівнює профілі жирних кислот групи ізолятів, профілі жирних кислот штамів були спорідненими на рівні роду.

Еволюційна різноманітність штамів РІоіїогпардиз ов нашій колекції вимірювали шляхом аналізу опосередкованого ПЛР (Полімеразною Ланцюговою Реакцією) геномного фінгерпринтінга ("відбитку пальців") з використанням геномної ДНК з кожного штаму. Цей спосіб засновано на родинах послідовностей ДНК, що повторюються, наявних по всьому геному бактеріальних видів, які відрізняються |див. огляд Мегзаїйоміс, ..,

Зсппеїдег, М., Ое Вгиїп, Е.У. апа І ореКкі, УК. 1994. Меїйодвз Мої. СеїІ. ВіоіІ.,, 5, 25-40). Вважають, що три з них, екстрагенна паліндромна послідовність, що повторюється, (КЕР), ентеробактеріальний міжгенний сі 2рб Кконсенсус, що повторюється, (ЕКІС) та ВОХ-елемент, віграють важливу роль в організації бактеріального геному. Вважається, що організація геному створюється відбором, та диференційна дисперсія (розкид) цих о елементів в геномі близькоспоріднених бактеріальних штамів, може бути використано для відрізнення цих штамів (наприклад, І ошцмув, Б.9У., Ешргідні О.МУ., е(Ферпепз, С.Т. апа ОЄ Вгиїп, Р.). 1994. Аррі. Епмігоп.

Місго. 60, 2286-2295). Кер-РСК використовує олігонуклеотидні праймери, комплементарні до цих (У послідовностей, що повторюються, для ампліфікації ДНК-фрагментів з розмірами, які відрізняються, що лежать між ними. Отримані продукти розділяють електрофорезом для встановлення "фінгерпринту" ДНК для кожного со штаму. чЕ

Для виділення геномної ДНК з наших штамів осади клітин повторно суспендували в буфері ТЕ (10ММ

Трис-НСІ, 1МмМ ЕДТК, рнНеВ,0) до кінцевого об'єму 1Омл та потім додавали 5М Масі. Цю суміш центрифугували 20 с з5 хвилин при 15000х9. Отриманий осад повторно суспендували в 5,7мл ТЕ та додавали ЗООмкл 1095 ДСН та с бОомкл 20мг/мл протеїнази К (Сірсо ВКІ Ргодисів, Сгапа ІзіІапа, МУ). Суміш інкубували при 372С протягом г, потім додавали приблизно 10 мг л ізозиму та суміш інкубували ще протягом 45 хвилин. Потім додавали один мілілітр 5М Масі та 800мкл розчину ЦТАБ/Масі (1095 м./об. ЦТАБ, 0,7М Масі) та суміш інкубували та перемішували ще протягом 20 хвилин для покращання виведення клітинного матеріалу. Додавали рівний об'єм « розчину хлороформ/ізоаміловий спирт (24:106б./06.), змішували обережно та потім центрифугували. Потім с проводили три екстракції рівним об'ємом суміші фенол/хлороформ/ізоаміловий спирт (50:49:11). Геномну ДНК а осаджували 0,6 об'єму ізопропанолу. Осаджену ДНК видаляли скляною паличкою, промивали двічі 7095 "» етанолом, сушили та розчиняли в 2мл СТЕ (10мМ Трис-НСЇІ, рН8,О, 1о0мММ Масі, 1МмМ ЕДТК). Потім ДНК кількісно визначали за оптичною густиною при 2бОнм. Для виконання Кер-РСК-аналізу геномної ДНК РПоюгпавраив використовували такі праймери, КЕРІК-І: 5-ІПІСОІССІСАТСІВОС-3 та КЕР2-1: 5-ІСВІСТТАТСІВОССТАС-3 ПЛР (се) виконували з використанням об'єму реакції 25мкл: 7,75мкл води, 2,5мкл 10Х буферу ГА (Рапмега Согр., Мадізоп,

М/І) 16мкл суміші аМТР (2,5мМ кожний), їмкл кожного праймера при 5О0пМ/мкл, їІмкл ДМСО, 1,5мкл геномної ДНК о (з концентрацією в діапазоні 0,075 - 0,48Омкг/мкл) та 0,25мкл ТаКаКа ЕХ Тад (РапМега Согр., Мадівоп, УМ). т» ПЛР-ампліфікацію проводили в ДНК-термоциклері Регкіп ЕІтег (МопоїкК, СТ) з використанням таких умов: 959077 со 50 хвилин, потім 35 циклів: 942С/1хвил., 652С/8хвил., потім 1бхвил. при 6520. Після проведення циклів реакційну суміш 25мкл додавали до 5мкл 6Х буферу для нанесення на гель (0,25956 бромфеноловий синій, 40905 м./об. «(пл сахароза в НО). Потім проводили електрофорез в 195 агарозному гелі 15х20см в буфері ТБЕ (0,09М Трис-НСЇ, 0,002М ЕДТК) з використанням 8мкл кожної ПСР-реакції. Електрофорез проводили протягом приблизно 16 годин при 458. Потім гелі забарвлювали в 20мкг/мл етидійброміда протягом 1 години та обезбарвлювали в буфері ТБЕ 59 протягом приблизно З годин. Потім гелі фотографували Поляроїдом при освітленні ультрафіолетовим світлом. о Наявність або відсутність смуг при специфічних для кожного штаму розмірах оцінювали з цих фотографій та вводили як матриці подібності в цифрову програму таксономії комп'ютера, МТЗУ5-рс (Ехефег Зоїмаге, Зегацкеї, ко МУ). Контролі, штам РИ101 Е. Соїї та Хепогппардивз огугае ру. огугаеє, що аналізувалися одночасно, давали "фінгерпринти" ПСР, які відповідали опублікованим даним ІМегзаЇоміс, 9У., Коецій, Т. апа І орекКі, У.К. 1991. 60 Мисівїс Асідз Бевз. 19, 6823-6831; Мега Сги7, СМ., Наїда-Аїйа, І. Іов, Р., ЗКіппег, О.7., Сеогде, М.Ї.,

Меївоп, К.ЮУ., ОЄЕ Вгиїп, Б.)., Кісе, С. апа Іеасп, У.Е. 1995. |п7ї Кісе Кев. Моїев5, 20, 23-24; Мега Сги?,

СМ., Агааіез, Е.У., ЗКіппег, О.7., Таіад, 9У., Меївоп, К.У., Гоцмув, Е.)., Гецпд, Н., Мем, Т.МУ. апа І еаси, У.Е. 1996. РНуїораїпоіоду (іп ргезв5, гезресіїмеІу)). Потім дані для штамів РІоіїогпардиз аналізували з серією програм в МТЗУЗ-рс; ЗІМОШАГ (Подібність для кількісних даних) для отримання матриці коефіцієнтів подібності бо (з використанням коефіцієнту Жаккарда) та утворення ЗАНМ-кластерів (Зедпепійа), Аддіотегаїйїме, Неїгагспіса!

апа Мезіед) |з застосуванням ОРОМА (пуеідпі Раїг-Стгоцр Меїйод мййп АгпАтеїйіс Амегадев)-способу)|, що групують споріднені штами та можуть бути виражені у вигляді фенограми (Фіг.5). Програми СОРН (ко-фенетичних величин) та МХСОМР (порівняння матриць) використовували для отримання матриці ко-фенетичних величин та порівняння кореляції між нею та вихідною матрицею, на якій засновано утворення кластерів. Було отримано результуючу нормалізовану статистику Мантеля (г), що є мірою погодження для кластерного аналізу (1-О,8-0,9 означає дуже добре погодження). В нашому випадку г-0,919. Таким чином, наша колекція складається з різноманітної групи штамів, які легко розрізнити та які є характерними для роду

Ріпоюгнараицв. 70 Приклад 13

Придатність як інсектицидів токсину (токсинів), що продукуються штамами Рпоїогпаврдив

Вихідні культури для посіву різних штамів Ріоїогпардиз одержували інокулюванням 175мл 295 Ргоїеозе

Рерюп Моз (РРЗ) (Оіїсо І абогайгіез, Юеїйгоїї, МІ) рідкого середовища первинним варіантним субклоном в колбі з трьома перегородками на 500мл з горлом Делонга, закритій Каршї. Інокулят для кожної культури для посіву 7/5 одержували з залитих маслом культур на скошеному агарі або з культур на чашках. Після інокулювання ці колби інкубували протягом 16 г при 28 9С на ротаційному шейкері при 150об./хвил. Ці культури для посіву використовували потім як однорідні джерела інокулятів для конкретної ферментації кожного штаму. Крім того, покриття культури для посіву пост-логарифмічної фази росту стерильним мінеральним маслом, додання стерильного магнітного стержня для подальшого повторного суспендування та зберігання культури в темряві при кімнатній температурі забезпечували тривале консервування інокулята в токсин-компетентному стані.

Продукційні бульйони інокулювали доданням 195 активно зростаючої посівної культури до свіжого 295

РРЗ-середовища (наприклад, 1,75мл на 175мл свіжого середовища). Приготування бульйонів відбувалось або в колбах з трьома перегородками на 500мл (див. вище), або в колбах з випуклим дном на 2800мл (об'єм 500мл), закритих пробками з кремнійорганічного пенопласту. Продукційні колби інкубували протягом 24 - 48 годин за с описаних вище умов. Після інкубації бульйони розподіляли в стерильні поліетиленові бутлі на Тл, відкручували при 2600х9 протягом 1 години при 102С та декантували з осаду клітин та залишків клітин. Потім рідкий бульйон і) фільтрували під вакуумом через фільтри М/пайтап СРГ/О (2,7мкМ утримання) та скляні фільтри СР/В (1,0мкМ утримання) для вилучення клітинних залишків. Подальше освітлення бульйону досягали за допомогою тангенціального проточного микрофільтраційного пристрою з відкритими каналами 0,5мкм. При необхідності МЮУ додаткового освітлення можна досягнути шляхом охолодження бульйону (до 42С) та центрифугування протягом декількох годин при 26б00х9. Після цих процедур бульйон пропускали крізь стерилізуючий фільтр, що со використовує нітроцелюлозну мембрану 0,2мкм. Потім стерильні бульйони використовували безпосередньо для чЕ біологічного аналізу, біохімічного аналізу або концентрували (максимально в 15 разів) з застосуванням відсікаючого мол. масу 10000 ультрафільтраційного приладу М12 (Атісоп, Вемепу МА) або центрифугальних с концентраторів (Міййроге, Веатога, МА та Раї! Рійгоп, Мопйпрогоцди, МА) з розміром пор 10000 (мол. маса). У «0 випадку центрифугальних концентраторів бульйон відкручували при 2000х9 протягом приблизно 2 годин.

Матеріал, що проходив, (пермеат) з мол. масою 10000 додавали до відповідного матеріалу, що його утримував фільтр, (ретентату) для досягнення бажаної концентрації компонентів з мол. масою більшою за 10000. «

Інактивацію нагріванням проб обробленого бульйону досягали шляхом нагрівання проб при 100 9 в заповненому піском блоці нагрівання протягом 10 хвилин. - с Бульйон (бульйони) та комплекс (комплекси) токсину з різних штамів Рпоїогпардиз є застосовними для "» зменшення популяцій комах та були використані в способі інгібування популяції комах, що передбачає " нанесення в осередок комахи ефективного для інактивації комах кількості описаного активного компонента.

Демонстрацію широти інсектицидної активності, що спостерігається при застосуванні бульйонів вибраної групи штамів Ріоїогпардив, що їх ферментовано, як описано вище, показано в Таблиці 19. Можливо, що можна було б о виявити додаткові інсектицидні активності з цими штамами шляхом збільшення концентрації бульйону або т шляхом застосування різних способів ферментації. Відповідно до активності, зв'язаної з білком, інсектицидна активність всіх випробуваних штамів була термолабільною (див. вище). Культуральний бульйон (бульйони) г» різноманітних штамів РІоїогпардиз виявляють диференційну інсектицидну активність (смертність та/або со 20 інгібування росту, зменшене вилуплення дорослих особин) у відношенні до личинок блішки довговусої та личинок довгоносика бавовняного, що є членами ряду комах Соіеоріега. Інші члени СоіІеоріега включають «сл дротяників, квітогриза рапсового та колорадського жука. Також спостерігали активність проти цикадок айстр, що є членами ряду Ноторіега. Інші члени Ноторіега включають цикад, листоблішку грушеву, медяницю звичайну, виноградних червеців та щитівок, білокрилок, зрішШе-жуків, а також численні специфічні у відношенні до 22 живителя види тлі. Бульйони та очищені комплекси токсину активні також проти совки та точильника зернового, що є членами ряду І ерідоріега. Іншими типовими членами цього ряду є совка мала, совка капустяна, совка о іпсилон, совка бавовняна, плодожерка яблунева, справжня міль, вогнівка амбарна південна, іо) метелики-листовійки, мішечниця поденкоподібна, коконопряд кільчастий американський, лучний метелик та совка трав'яна. Активність також спостерігали проти личинок плодової мушки звичайної та личинок комарів, що є 60 членами ряду Оірієга. Іншими членами ряду Оірієга є галіця горохова, муха морквяна, муха капустяна весняна, муха ріпи, муха цибульна, довгоніг та муха кімнатна й різні види комарів. Активність бульйонів та комплексів токсину спостерігали також проти кліща двоплямистого павутинного, що є членом ряду Асагіпа, який включає також кліщів суничних, кліщів, кліщика червоного цитрусового, кліщика павутинного волохатого, кліщика грушевого та кліщика-руйнівника. бо Активність проти личинок блішки довговусої визначали так. Культуральні бульйони РПИогпардиз (сконцентровані в 0 - 15 разів, які було пропущено через стерилізуючий фільтр), 296 Ргоїеозе Реріоп МоЗ,

очищені комплекси токсину |0,2Змг/мл| або буфер, що містить 10мММ фосфату натрію, рН7,0О, наносили безпосередньо на поверхню (приблизно 1,5см?7) штучного корму (Козе, В.І. апа МеСарбе, -.М. (1973). У. Есоп.

Епіотої. 66, (398-400)) у вигляді аліквот по 4О0мкл. Комплекс токсину розбавляли в 10МмМ фосфатному буфері, рРН7,О. Чашки з кормом сушили на повітрі в стерильному ламінарному боксі та лунки заражали окремими новонародженими Оіабгоїїса ипдесітрипсіаїа поуагаї (блішка довговуса південна, ЗСК), що вилупилися з стерилізованих на поверхні яєць. Чашки герметизували, приміщували в зволожену камеру для вирощування та підтримували при 272 протягом підхожого періоду часу (З - 5 днів). Потім оцінювали смертність та масу личинок. Як правило, в усіх дослідженнях використовували 16 комах на варіант. Смертність у контролі як 70 правило була меншою за 5905.

Активність проти довгоносика бавовняного (Апіпотопаз адгапаіз) тестували так. Концентровані (в 1 - 10 разів) бульйони Ріоїогпардив, контрольне середовище (295 Ргоїеозе Реріоп Мо3), очищені комплекси токсину

ІО,2Змг/млі| або 10мММ фосфатний буфер, рН7 0, наносили у вигляді аліквот по бомкл на поверхню 0,35г штучного корму (корму лускокрилих, білянки з жовтим забарвленням) та давали висохнути. Одну 12 - 24-годинну личинку 75 довгоносика бавовняного приміщували на корм та лунки герметизували та витримували при 259С та 50905 відносній вологості протягом 5 днів. Потім оцінювали смертність та масу личинок. Смертність у контролі була в діапазоні 0 - 1395.

Активність проти личинок комарів тестували так. Кожна лунка містила 20Омкл водного розчину (концентрованих в 10 разів) культуральних бульйонів Ріоїогпардив, контрольного середовища (295 Ргоіеозе

Реріюоп Мо3), 10ММ фосфатного буферу, комплексів токсину (0,2Змг/мл) або води та приблизно одноденні личинки (Аедез аедурії). Використовували б лунок на варіант. Результати реєстрували при З - 4 днях після зараження. Смертність у контролі була між 0 та 20965.

Активність проти плодової мушки звичайної тестували так. Придбане середовище для ОЮгозорпіЇа теїаподавзіег готували з застосуванням 5095 сухого середовища та 50905 рідини, такої як вода, контрольне Ге середовище (295 Ргоїозе Реріоп Мо3), концентрований в 10 разів культуральний бульйон РПоюгпарацв, о очищений комплекс токсину (0,2Змг/мл| або 10ММ фосфатний буфер, рН7,0. Це виконували приміщенням 4,Омл сухого середовища в кожний з З флаконів для вирощування на варіант та доданням 4,Омл відповідної рідини.

Потім 10 личинок Огозорпійа теїІаподазіег пізньої вікової стадії додавали до кожного флакону на 25мл. Флакони витримували на лабораторному столі при кімнатній температурі під світлом флуоресцентних ламп на стелі. М

Підрахунок ляльок або дорослих особин проводили після 15 днів експозиції. Вилуплення дорослих особин порівнювали з варіантами з водою та контрольним середовищем (0 - 1695 зменшення). со

Активність проти дорослих особин цикадок айстр (Масгозівіез земегіпі) та німф цикади кукурудзяної чі (Регедгіпиз таїдів) тестували за допомогою тесту з зараженням через рот, призначеним для проковтування активного інгредієнту без іншого зовнішнього контакту. Резервуар для розчину активного інгредієнта/"корма" с готували, зробивши 2 отвори в центрі нижньої частини чашки Петрі розміром З35х1О0мм. Квадрат з парафільму со (Рагайт У) (2 дюйми) приміщували на верхній частині чашки та закріплювали його "0"-кільцем. Потім пластикову чашку на 1 унцію заражали приблизно 7 цикадами, та резервуар приміщували на цю чашку парафільмом донизу.

Потім додавали тест-розчин до резервуару через отвір. В тестах з використанням культурального бульйону « (бульйонів), який було сконцентровано в 10 разів, бульйон та контрольне середовище (295 Ргоїеозе Реріоп Мо3) діалізували проти 10ММ буферу, що містив фосфат натрію, рН7,0, та додавали сахарозу (до 595) до отриманого ще) с розчину для зниження смертності у контролі. Очищені комплекси токсину (0,2Змг/мл| або 10ММ фосфатний "з буфер, рН7,0, також випробовували. Смертність реєстрували на 3-й день. Аналіз проводили в термостаті при " 282, 7090 відносній вологості з фотоперіодом 16/8. Оцінку смертності реєстрували при 72 годинах. Смертність у контролі була меншою за 695.

Активність проти личинок лускокрилих комах тестували так. Сконцентрований (в 10 разів) культуральний со бульйон (бульйони) РПоїогпардив, контрольне середовище (2956 Ргоїеозве Реріоп Мо3), очищений комплекс т токсину (0,2Змг/мл| або 10ММ буфер, що містить фосфат натрію, рН7,0, наносили безпосередньо на поверхню (71,5см) стандартного штучного корму для лускокрилих (корм БіопеміШе МейЙом/) у вигляді аліквот по 4Омкл. ї» Планшетам з кормом давали висохнути на повітрі в стерильному ламінарі та кожну лунку заражали однією оо 20 новонародженою личинкою. Яйця точильника зернового (Овігіпіа пибйайв) та бражника (Мапацйса звзехіа) одержували з комерційних джерел та вилуплення проводили в лабораторії, тоді як личинок совки одержували «сл самі. Після зараження личинкою планшети з кормом герметизували, приміщували в зволожену камеру для вирощування та тримали в темряві при 272С протягом підхожого періоду. Смертність та масу оцінювали на 5-й день. Як правило, в усіх дослідженнях використовували 16 комахи на варіант. Смертність у контролі була між 4 22 та 12,596 для контрольного середовища та менше 1095 для фосфатного буферу.

ГФ! Активність проти кліща двоплямистого павутинного (Тейгапуспив цигпіісає) визначали так. Молоді рослини гарбузу обрізали до однієї сім'ядолі та обприскували до стікання сконцентрованим в 10 разів бульйоном, ле контрольним середовищем (295 Ргоїеозе реріоп Мо3), очищеним комплексом токсину (0,2Змг/мл| або 10мММ фосфатним буфером, рН7,0. Після висушування рослини заражали змішаною популяцією павутинних кліщів та 60 витримували при температурі та вологості лабораторії протягом 72 годин. Потім робили підрахунок живих кліщів для визначення рівня контролю. бо Штам Рпоїогпардиз Види комах, що є чутливими"

к"-1: совка; 2: точильник зерновий; З: бражник; 4: блішка довговуса; 5: довгоносик бавовняний; б: комар; 7: плодова мушка звичайна (дрозофіла); 8: цикада айстр; 9: цикада кукурудзяна; 10: кліщ двоплямистий павутинний то з 2 см щі о ю зо со - см 35 Приклад 14 со

Штами Ріоюгпаваив, що не є МУ-14:

Очищення, характеристика та спектр активності

Очищення «

Протокол, що його викладено далі, є подібним до розробленого для очищення МУ-14 та заснований на З7З очищенні фракцій, які мають найбільшу активність проти блішки довговусої південної (ЗСК), як визначено в с біотестах (див. Приклад 13). Як правило одержували 4 - 20л бульйону, який було профільтровано, як описано в :з» Прикладі 13, та концентрували його за допомогою спірального ультрафільтраційного картриджа типу БІМІОО (Атісоп), який було прикріплено до фільтраційного пристрою Атісоп М-12. Матеріал, що утримувався, містив нативні білки з мол. масами більше 100кДа, тоді як матеріал, що проходив, містив нативні білки розміром менше со 100кДа. Більша частина активності проти 5СК містилася в матеріалі 100кДа, що утримувався. Потім матеріал, що утримувався, безупинно діафільтрували з 10ММ фосфатним буфером (рн-7,0) до тих пір, поки фільтрат не іо) досягав Агово«0,100. Якщо немає інших вказівок, всі процедури до цього моменту виконували в буфері, такому як 10мММ буфер, що містить фосфат натрію (рН7,9). Потім матеріал, що утримувався, концентрували до кінцевого те 50 об'єму приблизно 0,20л та фільтрували за допомогою стерилізуючого фільтруючого елементу 0,45мм МаїЇдепе (ее) Еійепмаге. Матеріал, який було відфільтровано, наносили при швидкості 7,5мл/хвил. на колонку РНаптасіа сл НЕ16/10, що була упакована сильним аніонообмінним мматриксом РегЗеріїме Віовувіет Рогозе? НО, зрівноваженим в буфері, за допомогою системи ВЕРХ РегЗеріїме Віозувіет Зргіпі?. Після нанесення колонку промивали буфером до тих пір, доки не досягали А зво 0,100. Потім білюи елюювали з колонки при швидкості 2,5Ммл/хвил. за допомогою буферу з 0,4М Масі протягом 20 хвилин для загального об'єму 5Омл. Потім колонку промивали буфером з 1,0М Масі при тій самій швидкості потоку ще протягом 20 хвилин (кінцевий об'єм -5О0мл). (Ф; Білки, які було елюйовано 0,4М та 1,0М Масі, приміщували в окремі діалізні мішочки та давали діалізу з проходити впродовж ночі при 42С в 12л буферу. Більша частина активності проти ЗСК містилася в фракції 0,4М.

Фракцію 0,4М очищали далі нанесенням 20мл на колонку 25/100 Рпагтасіа, що була упакована Зерпагозе СІ 48 бо (Рпаптасіа), з застосуванням швидкості потоку 0,75мл/хвил. Фракції об'єднували на основі профілю піків Аодо та концентрували до кінцевого об'єму 0,75мл за допомогою мембрани Віотах-50К ММУМІ. центрифугального фільтруючого пристрою МіПіроге ОКгаїгтее?ф. Концентрації білка визначали, застосовуючи набір Віогай Ргоїеіп

Аззау з бичачим гама-глобуліном як стандартом.

Характеристика 65 Нативну молекулярну масу комплексу токсину проти БСК визначали за допомогою колонки РІагтасіа 16/50, що її було упаковано попередньо Зерпагозе СІАВ в буфері. Потім колонку калібрували за допомогою білків -А3-

відомого молекулярного розміру, що дозволяло розрахувати приблизний нативний молекулярний розмір. Як показано в таблиці 20, молекулярний розмір комплексу токсину знаходиться в межах від 777кКДа для штаму НЬ до 1900кДа для штаму МУХ-12. Вихід комплексу токсину також варіював, від О,8мг/л для штаму МУХ-12 до 7,Омг/л для штаму НЬ.

Білки, виявлені в комплексі токсину, випробовували на розмір індивідуальних поліпептидів за допомогою аналізу електрофорезом в ПААГ-ДСН. Як правило, 20мг білка комплексу токсину з кожного штаму наносили на 2 - 1595 поліакриламідний гель (Іпігедгагед Зераганоп Зузіетв) та піддавали електрофорезу при 20мА в буфері для електрофорезу Віогад. По закінченні електрофорезу гелі забарвлювали протягом ночі в Віогаа Соотавзві Біе 7/0 К-250 (0,295 в суміші метанол:оцтова кислота:вода; 40:10:40 об./об6./06.). Потім барвник видаляли з гелів в суміші метанол:оцтова кислота:вода; 40:10:40. Потім гелі промивали водою протягом 15 хвилин та сканували за допомогою персонального лазерного денситометру Моіесшаг ЮОупатісв. Доріжки оцінювали кількісно та розраховували молекулярні розміри в порівнянні з високомолекулярними стандартами Віогад, що були в діапазоні від 200 до 45кДа.

Розміри індивідуальних поліпептидів, що містять комплекс токсину проти СК з кожного штаму, наведено в таблиці 21. Розміри окремих поліпептидів знаходяться в межах від 230кДа у штаму МУХ-1 до 16кДа, як видно у випадку штаму МУХ-7. Кожен штам, за винятком штаму НЕ, мав поліпептиди в комплексі токсину, що були в діапазоні 160-230кДа, 100-160кДа та 50-8ОкДа. Ці дані вказують на те, що комплекс токсину може варіювати в пептидному складі та компонентах у різних штамах, однак, в усіх випадках токсин, очевидно, складається з 2ор Великого олігомерного білкового комплексу. токсинів з штамів Рпоїогнарадив, які не є М/-14 зв с о ю зо со а 1вю1111011086 їй сч зв со а Нативна молекулярна маса, яку визначено з застосуванням колонки 16/50 Рнагтасіа НЕ, яку набито Сефарозою СІ АВ « - с Спектр активності й Як показано в таблиці 21, комплекси токсину, очищені з штамів Нт та НО, випробовували на активність проти «» численних комах, з комплексом токсину з штаму МУ-14 для порівняння. Тести проводили, як описано в Прикладі 13. Комплекс токсину з всіх трьох штамів виявив активність проти совки, точильника зернового та цикадки айстр. Крім того, комплекс токсину з штамів Нт та МУ-14 виявляв активність проти кліща двоплямистого

Го! павутинного. Крім того, комплекс токсину з М/-14 виявив активність проти личинок комарів. Ці дані свідчать про те, що комплекс токсину, що мав схожість в активностях щодо деяких рядів комах, може також виявляти різні ко активності проти інших рядів комах. т со сл ов о лю люттю мо) вело по 05 лю 0 моло ю зв |лю в мо л6 9 9800 в 0яа00о 100130 вті вві яю) ло 1174 76064332 05 во вові яв вв 60560 зов) в во о вв ію. в 83) 85300060 во 0 в60 55 в овіт пф юю | ю ввів ю в 1019 353289 | то вію 5003101 560 вв вв я я 08118318 5100065 52 БА 45 зо 24 18 37 63 -дА-

лі | | з | 128 22111613 1111 тт І о В По ПО ПОН НО ПО НОТ в 11151111 1 111111

ПИШНЕ ПИ НН ВО Я В В поля по ВЕ ші ПИ ПО ПО ПОН ПОЛОН ПОН НО НОЯ НИ о спектр очищеного комплексу токсину з штамів Рпоїогпардивз, що його спостерігають і к"-1: совка; 2: точильник зерновий; З: блішка довговуса південна; 4: комар; 5: кліщ двоплямистий павутинний; 6: цикадка айстр; 7: плодова мушка звичайна; 8: довгоносик бавовняний 720 Приклад 15

Субфракдіонування комплексу білкового токсину Рпоїогпардиз

Комплекс білкового токсину Ріоїогпардиз виділяли, як описано в Прикладі 14. Потім приблизно 10мг токсину наносили на колонку Мопос) 5,5, зрівноважену 20мММ Трис-НСЇІ, рН7,0, при швидкості потоку Тмл/хвил. Колонку сч промивали 20мМ Трхсо-НСІ, рН7,0, до тих пір, поки оптична густина при 280нм не верталася до поглинання 25 пото, я ; базової лінії. Білки, що зв'язувались з колонкою, елюювали лінійним градієнтом 0 - 1,0М Масі в 20мМ Трис-НСЇІ, о рН7,О, при Тмл/хвил., протягом 30 хвилин. Збирали фракції по їмл та піддавали їх біоаналізу з блішкою довговусою південною (ЗСК) (див. Приклад 13). Піки активності визначали за допомогою серій розведень кожної фракції в біотестах з СК. Спостерігали два піки активності проти ЗСК, які було названо А (елюйований ю приблизно при 0,2 - 0,3М Масі) та В (елюйований приблизно при 0,3 - 04М Масі). Піки активності А та В зливали окремо та обидва піки очищали далі за допомогою 3-стадійної процедури, яку описано нижче. (ге)

Твердий (МН/)»5О) додавали до згаданої вище білкової фракції до кінцевої концентрації 1,7М. Потім білки наносили на колонку 5/5рпепуІ-Зирегозе, зрівноважену 1,7М (МНА)»ЗО; в 50ММ К-фосфатному буфері, рН7,0, - при швидкості потоку Тмл/хвил. Білки, що зв'язалися з колонкою, елюювали лінійним градієнтом 1,7М се (МНА)»ЗО,, 095 етиленгліколь, БХОММ фосфат калію, рН7,0, - 2595 етиленгліколь, 25ММ фосфат калію, рН7,О (без со сульфату амонію) при 0,5мл/хвил. Фракції діалізували протягом ночі проти 10ММ К-фосфатного буферу, рН7,0.

Активності в кожній фракції проти ЗСК визначали за допомогою біотесту.

Фракції з найвищою активністю об 'єднували та наносили на колонку 5/5 Мопос), яку зрівноважували 20ММ

Трис-НСІ, рН7,0, при Імл/хвил. Білки, що зв'язалися з колонкою, елюювали при І1мл/хвил лінійним градієнтом « 20 0О-Ін МасіЇ в 20мМ Трис-НСЇ, рнН7,0. З

Для кінцевої стадії очищення найбільш активні фракції (які визначено за допомогою біотесту з 5СК) с об'єднували та піддавали очищенню на другій колонці рпепуІ-Зирегозе 5/5. Твердий (МН.)»5О) додавали аж до :з» кінцевої концентрації 1,7М. Потім розчин наносили на колонку, зрівноважену 1,7М (МНА)»ЗзО; в 50мММ

К-фосфатному буфері, рН7,0О, при Тмл/хвил. Білки, зв'язані з колонкою, елюювали лінійним градієнтом 1,7М (МНА)»ЗО»Х, 5ММ фосфат калію, рН7 0, - 1мМ фосфат калію, рН7 0, при О,5мл/хвил. Фракції діалізували протягом й й но - со ночі проти 10ММ Ма-фосфатного буферу, рН7,0. Активності в кожній фракції проти ЗСК визначали за допомогою біотесту. кз Кінцевий білок, очищений за допомогою описаної вище З-стадійної процедури, з піка А було названо токсином А, а кінцевий білок з піка В було названо токсином В. Характеристика та секвенування амінокислот те вро токсину А та токсину В. (се) При електрофорезі в ПААГ-ДСН токсин А та токсин В містили два основних (29095 від всього забарвленого

Кумасі білка) пептиду: 192кДа (що їх назвали АТ та ВІ, відповідно) та 58кДа (що їх назвали А2 та В2, сл відповідно). Токсин А та токсин В виявили тільки одну основну смугу в нативному електрофорезі, що свідчить про те, що АТ та А? були субодиницями одного білкового комплексу, та В1 і В2 були суб одиницями одного білкового комплексу. Далі, було визначено, що нативна молекулярна маса обох токсинів (А та В) дорівнює 8бокДа відповідно до гель-фільтраційної хроматографії. Відносні молярні концентрації АТ до А2 було оцінено як

ГФ) екв. до Текв., як визначене денситометричним аналізом гелів ПААГ-ДСН. Подібно, пептиди В1 та В2 наявні при одній і тій самій молярній концентрації. о Токсин А та токсин В піддавали електрофорезу в 1096 ПААГ-ДСН та трансблотингу на мембрани РМОБЕ. во Блоти посилали на амінокислотний аналіз та М-кінцеве амінокислотне секвенування до Нагмага Місгтоспет та

Сатргідде Ргоспет, відповідно. Було визначено, що М-кінцева послідовність В1 є ідентичною ЗЕО ІЮО Мо1, району

ТерА; гена ІСБА (ЗЕО ІЮО Мо12, позиція 87-99). Унікальну М-кінцеву послідовність було отримано для пептиду В2 (ЗЕБЕО ІС Мо40). М-кінцева амінокислотна послідовність пептиду В2 була ідентична району ТеБА;, отриманої амінокислотної послідовності для гена ІСБА (ЗЕО І Мо12, позиція 1935-1945). Отже, токсин В містив здебільшого ве два пептиди, ТСОБА;; та ТоБА;;, що були вироблені з одного ген продукту, ТерА.

М-кінцева послідовність А2 (ЗЕ ІЮ Мо41) була унікальною порівняно з пептидом ТерА ;; та іншими пептидами. Пептид А2 було названо ТсаА;, (див. Приклад 17). Було визначено, що ЗЕО І Моб є сумішшю амінокислотних послідовностей 5ЕО ІЮ Мо40 та 41.

Пептиди А!1 та А2 піддавали далі секвенуванню внутрішньою амінокислотною послідовністю. 1Омкг токсину А піддавали електрофорезу в 1095 ПААГ-ДСН-електрофорезі та трансблотингу на мембрану РМОР. Після забарвлення блота амідо чорним пептиди А1 та А2, названі ТсаА;, та ТсаА;;, відповідно, вирізали з блота та посилали до Нагмагі Місгоспет та Сатрбгідде РгоСпет. Пептиди піддавали розщепленню трипсином з подальшою ВЕРХ для розділення індивідуальних пептидів. Аналіз М-кінцевої амінокислотної послідовності виконували на вибраних пептидних фрагментах, отриманих при розщепленні трипсином. Було виявлено, що дві 7/0 ВнУтрішні амінокислотні послідовності пептиду АТ (ТсаА;-РК71, БЕО І Моз8 та Тсад-РК44, БЕО ІЮ Ме39) мають значні гомології з розшифрованими амінокислотними послідовностями району ТсдА ;; гена ІСБА (ЗЕО ІЮ Мо12).

Таким чином, М-кінцева послідовність (ЗЕО ІЮО Мо41) та дві внутрішні послідовності пептидів А2 (ТсаА;;-РК57,

ЗЕО ІО Мо42 та ТсаА;-РК20, 5ЕО ІЮ Мо43) також виявили значну гомологію з розшифрованими амінокислотними послідовностями району ТебБА;; гена ІСБА 5ЕО ІЮ Мо12).

Резюмуючи наведені вище результати, можна сказати, що комплекс токсину має принаймні два активних проти ЗСК комплекси: токсин А та токсин В. Токсин А та токсин В є схожими за нативною молекулярною масою та молекулярною масою субодиниць, однак, їх пептидні склади відрізняються. Токсин А містить пептиди ТеаА ; та ТсаА;; як основні пептиди, а токсин В містить ТебБА;; та ТебА;;, як основні пептиди.

Приклад 16

Розщеплення та активація пептиду ТеБА

В комплексі токсину В пептиди ТебА; та ТерА;; походять від одного генного продукту ТСЬБА (Приклад 15).

Процесінг пептиду ТсБА до ТерА; та ТсрА;, як припускається, здійснюється протеазою (протеазами)

РІПпоїюогпардиз та, найбільш імовірно, металопротеазами, які описано в Прикладі 10. У деяких випадках відзначалось, що при обробці бульйону МУ-14 Ріпоїюгпардив пептид ТерА є наявним в комплексі токсину В як с основний компонент, на доповнення до пептидів ТсБА;; та ТерА;;. Ідентичні процедури, які описано для очищення комплексу токсину В (Приклад 15) використовували для збагачення пептиду ТеБА з фракції комплексу (8) токсину бульйону МУ-14. Кінцевий очищений матеріал аналізували в 4-2095 градієнтному електрофорезі в

ПААГ-ДСН та основні пептиди визначали кількісно денситометрією. Було визначено, що ТеБА, ТеБА; та ТеБА;; містили 5895, 3695 та 695, відповідно, загального білка. Ідентичності цих пептидів було підтверджено їх ю зо Відповідними молекулярними розмірами в електрофорезі в ПААГ-ДСН та Вестерн-блотингом з застосуванням моноспецифічних антитіл. Було визначено, що нативна молекулярна маса цієї фракції дорівнює 8бОкДа. со

Розщеплення ТерА оцінювали шляхом обробки очищеного, як описано вище, матеріалу металопротеазами «У

З8кДа та 58кДа МУ-14 РІіоїогпардиз (Приклад 10) та трипсином як контрольним ферментом (Зідта, МО).

Стандартна реакція містила 17,5мкг очищеної фракції, 1,5 одиниць протеази та 0,1М Трис-буфер, рН8О, в с зв Загальному об'ємі 10Омкл. До контрольної реакції протеазу не додавали. Реакційні суміші інкубували при 372С со протягом 90 хвилин. В кінці реакції брали 2О0мкл та кип'ятили з буфером для проб для електрофорезу в

ПААГ-ДСН безпосередньо перед електрофорезом в 4 - 2095 градієнтному гелі. Було визначено на основі електрофорезу в ПААГ з ДСН, що в обох варіантах (з протеазою З8кДа та протеазою 58кДа) кількість пептидів

ТеБА; та ТоБА;; збільшувалася приблизно в З рази, тоді як кількість пептиду ТерА зменшувалася пропорційно « «Таблиця 23). Відносне зменшення та збільшення вибраних пептидів було підтверджено Вестерн-блотингом. -о с Крім того, гель-фільтрування розщепленого матеріалу виявило, що нативний молекулярний розмір комплексу й залишився тим самим. При обробці трипсином пептиди ТеБА та ТерА; неспецифічно розщеплялись на невеликі «» пептиди. Це вказувало на те, що протеази З8кДа та 58кДа Рпоїюгпавациз можуть специфічно процесувати пептид

ТеБА в пептиди ТебБА;, та ТоерА;;. Оброблений протеазою та необроблений контроль решти - 8Омкл - реакційної суміші серійно розводили 10мММ буфером з фосфату натрію, рН7,0, та аналізували за допомогою біотесту з ЗСК.

Го! Шляхом порівняння активності в кількох розведеннях визначили, що обробка протеазою З8кДа збільшувала інсектицидну активність у відношенні до ЗСК приблизно в З - 4 рази. Інгібування росту комах, що залишалися, ко при обробці протеазою було більш значним, ніж у контролі (Таблиця 23).

ФТ» о Перетворення та активація пептиду ТоБА в пептиди й 11111111017111зхонтяоль | Обробка протавою звда.:/-/-:О о Весвзеяльноювтєу 111111101600111111108 з 20

Приклад 17

Скринінг бібліотеки на ген, що кодує пептид ТесаА;,

Було проведено клонування та характеристика гена, що кодує пептид ТсаАу, який описано в ЗЕО ІЮ Мо17 (М-кінцева послідовність внутрішнього пептиду ТсаА;-РТІИ), та 5БЕО 10 Мо18 (М-кінцева послідовність бо внутрішнього пептиду ТсаА;-Р1Т79). Було синтезовано два пула вироджених олігонуклеотидів, призначених для кодування амінокислотних послідовностей ЗЕО ІЮ Мо17 (таблиця 24) та 5ЕО ІЮ Мо18 (Таблиця 25) й зворотних комплементів цих послідовностей, як описано в Прикладі 8. Послідовність ДНК цих олігонуклеотидів наведено нижче:

Таблиця 29

Вироджений олігонуклеотид для 5ЕО ТО До 17

Б М Бе ДА (ТС Ат (ТІСТА) СА СТО) БА СТІСУ Б

Пі підівнн Піно пий НН кН пох МАННЯ ВИНИ з ртасея ТТ(Т/с) ІДАСТ/С) (АТ (Т/С/А) (САТ) СА(Т/СУ Б (8)

Таблиця 24 ою со

Вироджений олігонуклеотид для 5ЕО ТІ Де 18 «І ло реп, со бійні Бін ва Бій нні в вка і а ві й и реп єх

Р2.79.2 О'ТТХ|АТУ|СТК|ТАТІ АСУ ТСТ| ТК |ССХ |СТК|ДАТ|ІССКІААТІДАТ У - с со Р2.798.сВ п АТТІАТТІХОСІ|АТТІМАСТАССТСАСІВЕСТІССТ|АТА МАСТААТІААА 3 ко

ФТ» со 50

Ж Відповідно до ПШІРАС-ІИВ кодує нуклеотиди: У - Сабо Т, Н.А, С або (л т, и А,СаботТ,К: Сабо, КА абобтам А абос

Полімеразні Ланцюгові Реакції (ПЛР) виконували по суті, як описано в Прикладі 8, з використанням як

ГФ) прямих праймерів Р2.3.6.СВ або Р2.3.5 та як зворотних праймерів Р2.79.К.1 або Р2.79К.СВ в усіх о прямих/зворотних комбінаціях, з використанням геномної ДНК РПИоіогпардиз як матриці. В інший серії реакцій праймери Р2.79.2 або Р2.79.3 використовували як прямі праймери та Р2.3.5К, Р2.3.5К.1 та Р2.ЗК.СВ бр Використовували як зворотні праймери в усіх прямих /зворотних комбінаціях. Тільки в реакціях, що містили

Р2.79.К.І або Р2.79К.СВ як прямі праймери в комбінації з Р2.79.К.І або Р2.79К.СВ як зворотні праймери було виявлено не-артефактний продукт ампліфікації, з визначеним розміром (за рухливістю на агарозних гелях) 2500п.н. Порядок праймерів, які використовували для отримання цього продукту ампліфікації, вказує на те, що пептидний фрагмент ТсдА;-РТІЇ лежить амінопроксимально по відношенню до пептидного фрагменту в5 ТсдА;-РТ79.

Продукти ПЛР 2500п.н. лігували з плазмидним вектором роті! (Іпмйгодеп, Зап Оіедо, СА) відповідно до інструкцій виробника, та послідовності ДНК, що перетинають кінці інсерційних фрагментів двох ізолятів (НБЗ24 та Н5З27) визначали за допомогою рекомендованих постачальником праймерів та способів секвенування, які було описано вище. Послідовність обох ізолятів була однаковою. Нові праймери синтезували на основі визначеної послідовності та використовували для праймування додаткових реакцій секвенування для отримання в цілому 2557 основ інсерту І(ІЗЕО І Мо36б). Трансляція часткового пептиду, який кодує ЕС ІЮО Мо3б, дає послідовність з 845 амінокислот, описану в ЗЕ ІЮО Мо37. Аналіз білкової гомології цієї частини пептидного фрагменту ТсаА; виявив значну амінокислотну гомологію (6895 схожість; 5390 ідентичність) з залишками 542-1390 білка ТеБА ІЗЕО ІЮ Мо12). Таким чином, очевидно, що ген, який представлено в частині ЗЕО ІЮ Мозб, /о продукує білок схожої, але не ідентичної амінокислотної послідовності з білюом ТсБА, причому цей білок, як видно, має подібну, але не ідентичну біологічну активність порівняно з білком ТерА.

Ще в одному випадку, було виділено ген, що кодує пептиди ТсдА;-РК4А4 та М-кінцевий пептид 58кДа ТесаА;;, які описано як БЕО ІЮ Ме9 (ТсаА;-РКа44 послідовність внутрішнього пептиду), та 52ЕО ІЮ Мо41 (М-кінцева пептидна послідовність 58кДа ТсадА;). Було синтезовано два пули вироджених олігонуклеотидів, призначених для 7/5 Кодування амінокислотних послідовностей, описаних як ЗЕО ІЮ Мо39 (таблиця 27) та ЗЕО ІЮО Мо41 (Таблиця 26), та зворотних комшіементів цих послідовностей, як описано в Прикладі 8, та їх послідовності ДНК.

Таблиця 26

Вироджений олігонуклеотид для 5БКО ТО До 41 2 кодону 2 3 й 3 7 10|11, 12 713 14 с о ймінокис- | Ге | Ах А1Та |Авип Теч АвріТеч їеч сіп пота ів) ом НИ НО НО і Боні Боні іо Мой Колі Бай БА Бін Б Божій НИК с д2.3.В пто|ТОс| ЧА ААА | ХАВІКТС|КЕСсСТ|ХАВ | ВЕСТ|КТТ| ОС КсСтТ|Коо У со

ПооінЙ НИО НИ НО і і Біо рі Бон БИ Б Бі Бай Мій Бій « - с з со ко

ФТ» со «сл

Ф) ко 60 б5

Таблиця 26 9 Вироджений олігонуклеотид для ЗЕО Ір Ле 39 2 амі-| (8) (9) (10) (11) (12у (13) (15) (15) (16) нокис- поти а кодо- 1 2 3 а в) 7

НУ

Аміно- с1у Уаї січ І1е Авип Тег Аїа Ії1е і о ів) со

Полімеразні Ланцюгові Реакції (ПЛР) проводили по суті, як описано в Прикладі 8, з застосуванням прямих праймерів А1.44.1 або А1.44.2 та зворотних праймерів А2.3ВЕ. або А2.4Е в усіх прямих/зворотних комбінаціях, з ЖЕ використанням геномної ДНК РІоїогпарадив УУуУ-14 як матриці. В інший серії реакцій праймери А2.1 або А2.2 с використовували як прямі праймери та А1.44.1К та А1.44.2К використовували як зворотні праймери в усіх

Зо прямих/зворотних комбінаціях. Не-артефактний ампліфікований продукт з розміром 1400п.н. (визначеним за со рухливістю на агарозних гелях) було виявлено тільки в реакціях, що містили А 1.44.1 або А 1.44.2 як прямі праймери в поєднанні з А2.З3К якості зворотним праймером. Порядок праймерів, що використовувалися для отримання цього ампліфікованого продукту вказує на те, що пептидний фрагмент ТсаА /|-РК44 лежить « амінопроксимально по відношенню до пептидного фрагменту 58кДа ТеадА;.

Продукти ПЛР 1400п.н. лігували з плазмидним вектором рОктмі! відповідно до інструкцій постачальника. - с Послідовності ДНК, що перетинають кінці інсерційних фрагментів чотирьох ізолятів визначали з використанням "» праймерів, схожих за послідовністю з рекомендованими постачальником праймерами, та з використанням " способів секвенування, які було описано раніше. Послідовність нуклеїнової кислоти всіх ізолятів відрізнялася, як і очікувалося, в районах, що відповідають виродженим послідовностям праймерів, але амінокислотні послідовності, які було розшифровано з цих даних, були такими же, що й істинні амінокислотні послідовності со для цих пептидів, визначені раніше, (ЗЕО ІЮ Мо41 та 39). т Скринінг геномної космидної бібліотеки М/-14, як описано в Прикладі 8, радіоактивно міченим зондом, що складався з ДНК, отриманої вище (ЗЕО ІЮ Мо3б), ідентифікував п'ять космидних ізолятів, які гібридизувалися, а

Т- саме, 1709, 20810, 2102, 27810 та 26ба1. Ці космиди відрізнялися від космид, що ідентифікувалися раніше з оо 20 зондами, які відповідали генам, описаним як ЗЕСО ІЮО Мо1ї або ЗЕО ІО Мо25. Рестикційний аналіз та блот-гібридизації ДНК ідентифікували три фрагменти ЕсокК І з приблизним розміром 3,7, 3,7 та 1,1т.п.н., що сп охоплюють район, який включає ДНК ЗЕО ІЮО Мо3б. Скринінг геномної космидної бібліотеки МУ-14 з застосуванням як зонду радіоактивно міченого фрагменту ДНК 1,4т.п.н., отриманого в цьому прикладі, ідентифікував ти ж самі п'ять космид (1709, 20810, 2102, 27810 та 2601). Блот-гібридизація ДНК з 22 розщепленими Есов І космидними ДНК також показала гібридизацію з тією ж самою підсерією фрагментів Есові, о яку спостерігали з зондом гена ТсаА; 2,5т.п.н., що свідчить про те, що обидва фрагменти кодуються на геномній ДНК. ко Визначення послідовності ДНК клонованих фрагментів ЕсокК | виявило неперервну рамку зчитування з 7551п.н. (ЗЕО ІЮО Мо46), що кодує білок 282,9кДа з 2516 амінокислот (БЕО ІЮ Мо47). Аналіз амінокислотної 60 послідовності цього білка виявив всі очікувані внутрішні фрагменти пептидів ТсаА; (ЗЕО ІЮО Мо17, 18, 37, 38 та 39) та М-кінця пептиду ТсаА;; (ЗЕО ІЮ Мо41) й усі внутрішні пептиди ТсаА;; (ЗЕО ІЮ Мо42 та ЗЕО ІЮ Мо43). Кожен з пептидів, виділених та ідентифікованих як ТсаА;; та ТсаА;;, є продуктом відкритої рамки зчитування, яку позначено ТсаА, описано в БЕО ІЮ Мо46. Далі, 560 ІЮ Мо47 показує, починаючи з позиції 89, послідовність, яку описано у вигляді ЗЕО ІЮО Мо13, що є М-кінцевою послідовністю пептиду з розміром приблизно 201кДа, а це 62 вказує на те, що первинний білок, який продукується з ЗЕО ІЮ Мо46, процесується подібно до того, як описано раніше для ЗЕО ІЮ Мо12. Крім того, цей білок потім розщепляється з утворенням продукту з розміром 209,2кДа, який кодує ЗЕО ІО Мо48 та який описано як ЕС ІЮ Мо49 (пептид ТсаА ;), та продукту з розміром 63,бкДа, який кодує ЗЕО ІЮ Мо50О та який описано як 5ЕСО І Мо51 (пептид ТсаА ;;)). Таким чином, можна вважати, що інсектицидна активність, що ідентифікувалася як токсин А (Приклад 15), вироблений з продуктів ЗЕО ІЮ Мо46, таких як повнорозмірний білок 282,9кДа, який описано в БЕО ІЮ Мо47, процесується з утворенням пептидів, описаних у вигляді хЕО ІЮ Мо49 та 5ЕО ІЮ Мо51. Вважають, що інсектицидна активність, яку ідентифіковано як токсин В (Приклад 15), виробляється з продуктів 5ЗЕС ІЮО Мо11, таких як білок 280,бкДа, що його описано у вигляді ЗЕО ІЮ Мо12. Цей білок протеолітично процесується з утворенням пептиду 207,бкДа, який описано в ЗХЕО 70 ІО Мо53, що його кодує ЗЕО ІЮО Мо52, та пептиду 62,9кДа, що має М-кінцеву послідовність, описану у вигляді ЗЕС

ІО Мо40 та далі описану у вигляді 5260) ІЮ Мо55, що кодується ЗБЕО ІЮ Мо54.

Порівняння амінокислотних послідовностей між білками, описаними як ЗЕО ІЮ Мо12 та ЗЕО ІЮ Мо47, виявили, що вони мають 69905 схожість та 5495 ідентичність. Цей високий ступінь еволюційної спорідненості не є однорідним по всій амінокислотній послідовності цих пептидів, але він є високим у напрямку карбокси-кінця цих 7/5 білків, оскільки пептиди, описані як ЗЕ ІЮ Мо51 (вироблені з ЗЕО ІЮ Мо47) та як БЗЕО ІЮ Мо55 (вироблені з ЗЕС

ІО Мо12) мають 7695 схожість та 6495 ідентичність.

Приклад 18

Захист від пошкодження листя рослин кукурудзи, який індукує точильник зерновий, шляхом нанесення розпиленням бульйону

Ріпоюгпавдиз (штаму МУ-14)

Здатність токсину (токсинів) Рпоїогпардиз зменшувати пошкодження листя, що викликається личинками комах, було показано шляхом вимірювання пошкодження листя, що викликається точильником зерновим (Озігіпіа пибіїіаії5), оселеним на рослини кукурудзи, оброблені бульйоном Рпоюгпардивз. Ферментаційний бульйон від штаму МуУ-14 РНИоїогпардиз одержували та концентрували приблизно в 10 разів за допомогою с ов ультрафільтрування (розмір пор 10000 (мол. маса)), як описано в Прикладі 13. Отриманий концентрований бульйон стерилізували, пропускаючи крізь нітроцелюлозні мембранні фільтри 0,2 мікрон. Приготовану у такий (8) спосіб пробу неінокульованого 295 протеозе-пептона Мо3З використовували для контролю. Рослини кукурудзи (інбредна лінія, маєток ОомЕІапсо) вирощували з насіння до вегетативної стадії 7 або 8 у горщиках, що містили суміш (без грунту), в оранжереї (272С удень, 222 вночі, приблизно 5095 відносна вологість, тривалість юю зо світлового періоду 14 годин, полив та добрива - по необхідності). Тест-рослини розміщували у вигляді рандомізованих груп, що повторюються (3 повторності/варіант (обробку), 6 рослин/варіант)) в оранжереї з со температурою приблизно 222 удень, 1892 вночі, без штучного світла та з частковим затіненням, з відносною «г вологістю близько 5095 та з поливами та внесенням добрив по необхідності. Обробляючі розчини (неінокульовані середовища та концентрований бульйон Ріоїогпардив) наносили обприскувачем з шприцом, по 2,0мл наносили с 3з5 З відстані приблизно б дюймів над мутовкою листя та додаткові 2,0мл наносили рухом по колу з відстані с приблизно одного фута над мутовкою. Крім того, одну групу рослин не було оброблено. Після підсихання нанесених розчинів (приблизно через ЗО хвилин) дванадцять новонароджених личинок точильника зернового (яйця одержували з комерційних джерел та вилуплення проводили в лабораторії) наносили безпосередньо на мутовку. Після одного тижня рослини оцінювали на пошкодження листя, застосовуючи модифіковану шкалу « 470 Гатрі ІКолієї М.0., Веїіапа, б.Ї., Вом/тап, С, Сагоглі, М.В., Степепаму, К., Стозвіапа, Г., Юам/зоп, .-)., Юезаї, 2 с М., НІіЇ, М., КаймеїІЇ, 5., Іашйпів, К., Іемів, К., Мадаох, О., МеРпеггоп, К., Меорпіі), М.7., Мегпіп, Е., й КПподевз, К., МУагтеп, .МУ., Мугідні, М. апа Емоїа, 5.М. 1993) Віо/Гесппоіоду, ІІ, 194-195) та оцінка порівнювали "» статистично |Т-критерій (найменша значуща (вірогідна) різниця, І ЗО) р«0,05 та Тикеуз 5ійдепіїгеа Капде (Н5О)

Теві р«0,111. Ці результати наведено в таблиці 28. Для посилання, оцінка 1 означає відсутність пошкодження, оцінка 2 означає дрібне пошкодження типу "віконного скла" на листі, що не згорнувся, без шпилькових со проникнень та оцінка 5 означає проникнення в лист з подовженими пошкодженнями та/або поїданням середньої жилки, що спостерігаються на більш ніж З листах (пошкодження «1 дюйму). Ці дані показують, що бульйон або де інші фракції, що містять білок, можуть створювати захист проти специфічних комах-шкідників при нанесенні у

Чї» вигляді розприскуваного препарату або при постачанні гена або його похідного, що кодує цей білок або його частину, через трансгенну рослину або мікроб. со

І бульйону Рпоїогпардиз на пошкодження листя точильником зерновим на кукурудзі зв о з во

Приклад 19

Генетичне конструювання генів для експресії в Е. Сої

Резюме конструювання в5 Ряд плазмид було сконструйовано для експресії гена ІсБА РІіоіїогпарацв М/-14 в Езспегіспіа соїї. Перелік цих плазмид наведено в Таблиці 29. Далі йде стислий опис кожної конструкції, а також резюме отриманих для -БО0-

експресії Е. соїї даних. ; о

Конструювання рРАВбЗА

В Прикладі 9 описано великий фрагмент Есог І, що гібридизується з зондом ТсрА . Цей фрагмент 75 субклонували в рВС (Зігаїадепе, Га доПа СА). Аналіз секвенуванням показує, що цей фрагмент має 8816п.н.

Фрагмент кодує ген ІсСБА з ініціюючим кодоном АТО у позиції 571 та термінуючим кодоном ТАА у позиції 8086.

Отже, цей фрагмент несе 570п.н. ДНК РІИоїогпардиз проти ходу транскрипції від АТО та 7ЗОп.н. по ходу транскрипції від ТАА.

Конструювання плазмиди раАсОоРб7ВЛсСЬА

Ген ЇсСЬА було ампліфіковано за допомогою ПЛР з використанням таких праймерів: 5'-праймер (ЗІАс51) 5 ТТ

ААА ССА ТО ОАА АСТ САТ ТАТ САА ОСА СТА ТС 3 та 3і--праймер (5ІАс31) 5 ТТ ААА СО ОСС ОСТ ТАА

Со АТО ОТА ТАА СОА АТА ТО 3. ПЛР проводили, застосовуючи набір ТаКакКа ГА РСК з Рапмега (Мадізоп,

МУізсопзіп) в такій реакції: 57,5мл води, їОмл 10Х І А-буферу, 1бмл аМТР (2,5мМ кожного вихідного розчину), 20мл кожного з праймерхв при 1Опмоль/мл, ЗООнг плазмиди ррАВб6З34, що містила ген (срА МУуУ-14 та один мл сч полімерази Тад ТаКаКа Га. Умови проведення циклів були такими: 98 2г/20сек., 682С/5хвил., 722С/10хвил. впродовж 30 циклів. Очікуваний продукт ПЛР близько 7526бп.н. виділяли в 0,895 агарозному гелі в ТБЕ-буфері о (100мММ Трис, 90мММ борна кислота, 1ММ ЕДТК) та очищали за допомогою набору Оіаех ІІ з Оіадеп (Спайвзмогій,

Саїйогпіа). Очищений ген їсБА розщепляли Мсо | та Мої | та лігували в бакуловірусний вектор-переносник рАсСОоРбУВ (Рпагміпдеп (Зап Оіедо, СаїЇйогпіз) та трансформували у клітини ЮОНба Е. соїї. Потім ген ІсБА ю зо вирізали з рАсОоРб7В та переносили в рЕТ27Ь для створення плазмиди ррАВ 635. Місенс-мутацію в гені ІСБА було репаровано в рОАВб635. (ге)

Репарований ген (сБА містить дві зміни порівняно з послідовністю, яку показано в ЗЕО ІЮО Мо11: А замість О « у позиції 212, що замінює аланін 71 на серин 71, та С замість А у позиції 229, що замінює аланін 77 на треонін 77. Обидві ці модифікації знаходяться проти ходу транскрипції від прогнозованого М-кінця ТерА; с

Конструювання рЕТ15-ІсЬА со

Кодуючий район ІсБА ррАВбЗ35 переносили у вектор рЕТ15Б. Це здійснювали за допомогою шотган-лігувань,

ДНК вирізали за допомогою рестриктаз Мсо І та Хо І. Отриманий рекомбінант було названо рЕТ15-їЇсЬА.

Експресія ТеБА в Е. соїї з плазмиди рЕТ15-ЇсБА

Експресію ІсБА в Е. соїї одержували шляхом модифікації способів, які було описано раніше 5іцаіег еї аї. « 20 Ізішаїег, Е.МУ., Козепрего, А., Юипп, У. апа ЮОиБрепадогпї, 9., (1990). Ове ої Т7/ КМА роїутегазе ю дігесі -о с ехргезвіоп ої сіопед депе5з. Меїйодз Еплутої!., 185: 60-89). Компетентні клітини Е. сої штаму ВІ21 (ОЕЗ) трансформували плазмидою рЕТ15-ІсСБА та висіювали на І В-агар, що містив 100мкг/мл ампіциліну та 40ММ з глюкози. Трансформовані клітини вирощували до густини кілька сотень ізольованих колоній на чашку. Після інкубування протягом ночі при 37 «С клітини вискрібали з чашок та суспендували в І В-бульйоні, що містив О0мкг/мл ампіциліну. Типові об'єми культур були 200-50О0мл. У час 0 густини культур (ОЮсоо) сягали 0,05 - со 0,15 залежно від експерименту. Культури струшували при одній з трьох температур (222С, 302С або 3722) до тих пір, доки не було отримано густину 0,15 - 0,5, після чого їх індукували 1мМмМ ко ізопропилтіо-бета-галактозидом (ІПТГ). Культури інкубували при обраній температурі протягом 4 - 5 годин та ї» потім переносили на 42С до обробки (12 - 72г).

Очищення та характеристика ТоеБА. експресованого в Е. соїї з плазмиди рРЕТ15-ІсБА со Культури Е. соїї, що експресують пептиди ТерА, обробляли так. Клітини збирали центрифугуванням при сл 17000Х9 та середовище декантували й зберігали в окремому контейнері.

Середовище концентрували приблизно в 8 разів за допомогою фільтраційної системи М12 (Атісоп, Вемепу

МА) та фільтру з відсіканням молекулярної маси 100кДа. Концентроване середовище наносили на аніонообмінну колонку та білки, що зв'язалися, елюювали 1,0М Масі. Було виявлено, що пік елюції 1,0М Масі спричинював смертність при застосуванні його проти личинок блішки довговусої, південної (ЗСК) (Таблиця 30). Фракцію 1,0М

Ф) масі діалізували проти 10ММ буферу з фосфату натрію, рН7,0, концентрували та піддавали гель-фільтруванню ко на Зерпагозе СІ-48 (РІагтасіа, Різсаїажау, Мем егвеу). Зону профілю елюції Сі-48, що відповідає розрахованій молекулярній масі (приблизно 900кДа) нативного комплексу токсину МУ-14, збирали, концентрували 60 та піддавали біотесту з личинками. Було виявлено, що зібрана фракція 900кДа мала інсектицидну активність (див. Таблицю 30 нижче), з симптоматологією, подібною до симптоматології, що спричинюється нативним комплексом токсину МУ-14. Цю фракцію піддавали дії Протеїнази К та термальній обробці. Активність в обох випадках зникала або зменшувалася, що доводить білкову природу носія активності. Крім того, ця активна фракція була імунологічно позитивною у відношенні до пептидів ТоБА та ТебБА;; в імуноблотингу при тестуванні 65 з моноклональними антитілами проти ТебА;; (Таблиця 30).

ТИ НИ ПЛИНИ Полон ПОН 1,0М іонообмін

СІ Ав ТеОБА; 70 яПротеїназа К ши сі Ав тнагрівання

Тов суперуклімнссяВ 1777-1111 нт 171111своодаГ///- : інгібування росту в порівнянні з контрольними пробами: 5 - 249р-"", 25 - 4З9р"", 5 - 1009",

Осад клітин повторно суспендували в 10ММ фосфатному буфері (з фосфатом натрію), рН7,0, та лізували, пропускаючи через клітинний розпилювач Віо-Мертм ((|Іав-Сої Іпс., Тетпа Націе, ІМ). Осад обробляли ДНКазою для видалення ДНК та центрифугували при 17000 х9 для відділення клітинного осаду від супернатанту. Фракцію супернатанту декантували та фільтрували через фільтр 0,2 мікрон, щоб вилучити великі частки, та піддавали аніонообмінної хроматографії. Білки, що зв'язались, елюювали 1,0М Масі, діалізували та концентрували за допомогою концентраторів Біотахтм (МійПіроге Согр, Веатога, МА) з відсіканням молекулярної маси 50000

Дальтон. Концентровану фракцію піддавали гель-фільтраційній хроматографії з застосуванням гранульованого матриксу СІ -48. Дані біоаналізу для приготованого у такий спосіб матеріалу наведено в таблиці 30 та названо с 29 "ТерА суперу клітин". Ге)

В ще одному способі для обробки великої кількості матеріалу осаду клітин повторно суспендували в 10ММ натрій-фосфатному буфері, рН7,0, та обережно гомогенізували за допомогою млину для тканини (Копіез СіІазв

Сотрапу (Міпеіапа, МО)) на 40мл. Залишки клітин осаджували центрифугуванням при 25000 хд та клітинний супернатант декантували, пропускали крізь фільтр 0,2 мікрон та піддавали аніонообмінної хроматографії з ю застосуванням колонки 10/10 Рпагтасіа, упакованої гранулами Рогов НО 50. Білки, що зв'язалися, елюювали с о) градієнтом Масі 0,0 - 1,0М. Фракції, що містили білок ТерА, об'єднували та концентрували за допомогою

Б5ОкДа-концентратору та піддавали гель-фільтраційній хроматографії з застосуванням гранульованого матриксу ча

РПпагтасіа СІ -4В. Фракції, що містили олігомер ТсБА з молекулярною масою приблизно 9О0ОкДа, збирали та Га піддавали аніонообмінній хроматографії з застосуванням колонки Рпагтасіа Мопо О 10/10, зрівноваженої 20ММ

Трис-буфером, рН7,3. Для елюції рекомбінантного білка ТсрБА використовували градієнт 0,0 - 1,0М Масі. со

Рекомбінантний ТерА елюювався з колонки при концентрації солі приблизно 0,3 - 0,4М, при тій самій молярності, при якій нативний олігомер ТсСБА елюювався з колонки Мопо С 10/10. Було виявлено, що ця фракція рекомбінантного ТерА викликала смертність ЗСК в експериментах з біоаналізом, подібних до експериментів, що « 20 їх наведено в таблиці 30. З с ч»

Claims (10)

Формула винаходу п

1. Полінуклеотид, функціонально зв'язаний з гетерологічним промотором, що кодує білок, який має 75 активність токсину проти комахи-шкідника, де нуклеотидна молекула, що кодує вказаний білок, зберігає со здатність до гібридизації з комплементарною послідовністю нуклеїнової кислоти після гібридизації і ко промивання, причому вказану гібридизацію здійснюють при 60 оС в розчині, що містить 10 905 (м/о) ПЕГ (поліетиленгліколю, М.м. приблизно 8000 Да), 0,6 х 55С, 7 95 (м/о) ЗО5, 10 мМ натрійфосфатний буфер, 5 мМ т- ЕДТА ії 100 мг/мл денатурованої ДНК із молочка лосося, де вказана послідовність нуклеїнової кислоти являє бо 79. собою ЕС ІЮ МО: 46.

2. Полінуклеотид за п. 1, який відрізняється тим, що промивання здійснюють в 0,25 х З5С і 0,2 96 505 при с воес.

З. Полінуклеотид, що кодує білок, який має активність токсину проти комахи-шкідника, де вказаний білок містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 47, де вказаний полінуклеотид функціонально зв'язаний з гетерологічним промотором. ГФ)

4. Полінуклеотид, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує білок, що має амінокислотну з послідовність ЗЕО ІЮ МО: 47, функціонально зв'язаний з гетерологічним промотором, причому вказаний білок має активність токсину проти комахи-шкідника. во

5. Трансгенна рослинна клітина, яка експресує полінуклеотид за п. 1.

6. Рекомбінантний білок, який має активність токсину проти комахи-шкідника, де нуклеотидна послідовність, що кодує вказаний білок, зберігає здатність до гібридизації з послідовністю нуклеїнової кислоти при гібридизації і промиванні, причому вказану гібридизацію здійснюють при 60 С в розчині, що містить 10 90 (м/о) ПЕГ (поліетиленгліколю, М.м. приблизно 8000 Да), 0,6 х З5С, 7 90 (м/о) 5О5, 10 мМ натрійфосфатний буфер, 5 65 ММ ЕДТА і 100 мг/мл денатурованої ДНК із молочка лосося, де вказана послідовність нуклеїнової кислоти являє собою ЗЕО ІЮ МО: 46.

7. Білок за п. 6, який відрізняється тим, що промивання здійснюють при 0,25 х З5С і 0,2 95 505 при 60 С.

8. Рекомбінантний білок, який має активність токсину проти комахи-шкідника, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 47.

9. Спосіб боротьби з комахою-шкідником, який передбачає пероральну доставку білка за п. б вказаному шкіднику.

10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що вказаний білок продукується і присутній у трансгенній рослині, яка є доступною для вказаного шкідника. с (8) Іо) со «І с Зо со -

с . и? о ко ФТ» о «сл Ф) ко 60 б5