UA85489C2

UA85489C2 - Мукоровий гриб blakeslea trispora штам pht 1+, pht 1- - продуцент фітоїну

Info

Publication number: UA85489C2
Application number: UAA200714381A
Authority: UA
Inventors: Ярослав Михайлович Сорока; Галина Миколаївна Дмитренко; Алла Степанівна Стенько; Маргарита Степанівна Горна; Юрій Давидович Туріянський; Алєксєй Алєксандровіч Тюрєнков; Владімір Алєксандровіч Тюрєнков
Original assignee: Товариство З Обмеженою Відповідальністю "Науково Виробниче Підприємство "Вітан"
Priority date: 2007-12-20
Filing date: 2007-12-20
Publication date: 2009-01-26
Also published as: WO2009082365A1

Abstract

Селекціоновано штам Pht 1+; Pht 1- мукорового гриба Blakeslea trispora - продуцента фітоїну. Штам депонований в депозитарії Інституту мікробіології та вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за № F-100053. Концентрація фітоїну залежить від співвідношення двох статевих форм та тривалості ферментації. Оптимальним є співвідношення 1:5 при 7-добовій ферментації. Вихід фітоїну складав від 1,5 до 2,2 г/л культуральної рідини або концентрації 10-15 %.

Description

4. Мукоровий гриб за п. 1 з інтенсивним нестате- 5. Мукоровий гриб за п. 1 з наявністю білої зони вим спороутворенням. без зигоспороутворення при сумісному вирощу- ванні на чашці.

Винахід відноситься до біотехнології, а саме, Характеристика штаму РИ ТГіРТІ: одержання природного каротиноїду фітоїну шля- Гриб ВіакезіІєа ігізрога відноситься до мукоро- хом мікробіологічного синтезу, який може бути вих грибів класу Мисогасеае (Споапергога реіден- використаний у медицині, харчовій та косметичній тифікований у вид Віакезієа (гізрога на основі до- індустріях. сліджень Кігка у 1984р. та описаних у визначнику

Фітоїн - природний каротиноїд з вираженою "А топодгарі ої Фе Споаперпогасеае. Мусо!одісаї біотехнологічною активністю, має набір багатьох рарег, Кем/, Епдіапа, 1984, Ме152, р.1-61). Штам цінних якостей значний фармацевтичний потенці- депоновано у Колекції промислових мікроорганіз- ал (лікування та профілактика хвороб дихальних мів Інституту мікробіології та вірусології ім. Д. К. шляхів, шлунково-кишкового тракту, серцево- Заболотного НАН України під Мо Е-100053 судинної системи, зору; має антиоксидантні, фото- Морфологічні властивості захисні та антиканцерогенні властивості), а також РМ" статева форма - добре розвинений по- широке застосування в харчовій та косметичній вітряний міцелій від сірувато-білого до сірувато- індустріях. Зокрема, в косметичній індустрії йому жовтого кольору. Субстратний міцелій такого ж відводиться роль фактора попереджуючого глибо- кольору, добре розвинений, щільний. Спороутво- ке проникнення УФ променів в шкіру, опіків шкіри, рення слабке. сприяє омолодженню шкіри (1-41. РИЕТ1 статева форма - повітряний міцелій роз-

Фітоїн (7, 8, 11, 12,7, 811, 12'-октагідро- у - винений, білого кольору, спороутворення інтенси- у-каротин) - безбарвний каротиноїд має ацикліч- вне нестатеве, тільки спорангіальне, представле- ний ізопреноїдний ланцюг СаоНех. Він є попередни- не остилоспорангями і спорангіями. Спорангії й под ди. й еліптично-шаровидні 12х16 - 10х12мкм, триспоро- ком біосинтезу лікопіну і р-каротину: фітоїн - фі- ві, багаточисельні. Субстратний міцелій проростає тофлуїн - б -каротин - нейроспорін - лікопін - р- в середовище, липкий і погано відділяється від каротин. Фітоїн синтезується з двох молекул гера- агаризованого середовища. нілгеранілпірофосфату (СОРР) за участю фітоїн- При сумісному вирощуванні (ж) і (-) статевих синтетази; геранілгеранілпірофосфат утворюється форм зона зигоспроутворення відсутня, але утво- шляхом конверсії мевалонової кислоти або кон- рюється широка біла зона. денсацією пірувату та гліцеральдегід-З-фосфату. Фізіологічні властивості: оптимальним живиль-

Фітоїн на відміну від лікопіну і рД-каротину стій- ним середовищем для гриба є сусло-агар, добре кий до світла та окиснення, чим має певні перева- росте на кукурудзяному 6-5905 агарі, МПА, гірше - ги у використанні. на середовищі Чапека. Температурний оптимум

Фітоїн можна одержати із вищих рослин та во- 28"С. Гриб вирощується на косяках із сусло- доростей. Серед них найбільш доступним джере- агаром або чашках Петрі 7-10 діб. Для зберігання лом є Юипаїеїа зресіев5. культури гриба використовують грунт після спеці-

Культивування ЮипаїївЇїа зр. можна проводити альної обробки та стерилізації. Для глибинного у відкритих солених озерах при інтенсивній інсо- культивування (в колбах) використовують посівне ляції, а також в умовах вирощування в ферменте- та ферментаційне середовища наступного складу. рах. Вона синтезує від 1 до ЗОмг/л фітоїну. Вченим Посівне середовище, г/л: борошно кукурудзя-

Ізраїлю шляхом хімічного мутагенезу вдалось не - 47,0; борошно соєве -28,0; КНоРО; - 0,5; вода одержати білі варіанти водорості ОипаїїеНа взр.; що водопровідна - 1,0л; рН-б,3-6,4. синтезують більше фітоїну (5І|, але тільки в ком- Ферментаційне середовище, г/л: борошно ку- плексі з фітофлуїном. курудзяне - 14,0; борошно соєве - 33,0; олія - 26,5;

Здатність синтезувати каротиноїди мікроорга- вода водопровідна - 1,0л; рН-б,3-6 4. нізмами відома, але це лише синтез комплексного Середовища розливають в колби ємністю набору каротиноїдів. Відомо більше 600 різних 75Омл по 100бмл. Стерилізацію обох середовищ каротиноїдів і джерел їх походження та лише мала здійснюють в автоклаві при 120-1227"С. протягом частка цих джерел може бути використана як про- 40Охв. дуцент біологічно-активних речовин. Штам - прототроф.

На сьогодні невідомо продуцентів фітоїну се- Отримання цільового продукту - фітоїну - ілю- ред мікроорганізмів. струється наступними прикладами

Задача винаходу, що запропоновано - одер- Приклад Ме1 жання штаму-продуценту фітоїну міцеліальним Отримання фітоїну при вирощуванні гриба грибом Віакезіва гізрога, який на сьогодні є про- Віакевіва КГізрога РАК 17 ї РІЇ 1" в лабораторних дуцентом лікопінуі Д -каротину. умовах.

За допомогою селекції гриба Віакезієа ігізрога На чашках Петрі при сумісному вирощуванні з використанням дифеніламіну (5-1Омг/мл) нами агарових дисків з (-4ЯО статевими формами 7-й одержано РЕ" і РІК 1". добового віку наносяться полярно і культивуються

7 діб. На зоні дотику 2-х статевих форм утворю- рація фітоїну в 30 разів вища, ніж окремо взятих ється широка біла смуга без зигоспороутворення. форм.

З цієї зони брали наважки 5-7мг, екстрагували в Спектр поглинання фітоїну в наших дослі- гексані та визначали фітоїн за допомогою спект- дженнях порівнювали з даними, представленими рофотометру. Г. Бріттоном та ін.

Визначення концентрації фітоїну проводиться Спектри фітоїну отримані при скануванні екст- наступним чином: наважку 4-Змг фітоїнової біома- рактів з біомаси штаму РН 1 на спектрофотометрі си переноситься у пробірку з 0,5-0,бг Ма2504 без- Неїов у, АХтах: 276; 286; 297 (а) і спектр пред- водного, додається 5см гексану, ретельно розти- ставлений Г. Бріттоном та ін. 6) (Фіг.2). рається біомаса скляною паличкою, пробірка Приклад Ме? закривається корковою чи поліпропіленовою проб- Отримання фітоїну при вирощуванні РИ 1(5) і кою ї залишається для екстракції в темному місці РН (-) в колбах на качалках. Споровоміцеліаль- на 1 годину. Після цього повторно розтирається ною суспензією, яку змивали із косяків 7-добового суспензія бомаси з сульфатом натрію безводного росту, засівали маточні колби з посівним середо- і перемішується на вортексі. За допомогою спект- вищем, що наведені вище. Вирощування продов- рофотометру проводяться вимірювання оптичної жується на качалках при 180-200об/хв і 2-2870. густини при довжині хвилі Х -286бнм (якщо оптич- Визначали накопичення біомаси. Засівали в колби на густина перевищує показник 2, то розчин роз- із ферментаційним середовищем в різних співвід- бавляється гексаном і об'єм розбавлення врахову- ношеннях статевих форм (в) і (-) - 1:1,5; 1:3; 1:5; ється під час розрахунку концентрації). В якості 1:7 відповідно і культивували від З до 7 діб. контролю використовується чистий гексан. Концентрація фітоїну залежала від співвідно-

Обробка результату шення двох статевих форм та тривалості фермен-

Концентрацію (С) в 76 обчислюють за форму- тації. Оптимальними виявились співвідношення лою: 1:5 при 7-добовій ферментації. Вихід фітоїну скла- с- О.М де: дав від 1,5 до 2,2г/л культуральної рідини або кон-

АТ центрації 10-1596. Й

О - оптична густина розчину, що досліджуєть- терела інформації ся; - МІПадзеп І А тетшой ої депегайпд Підн

М - об'єм розведення, см, сагоїепоіїд-родисіпд тісгоогдапізтв, т - маса наважка зразку, г; тістюогдапізте обБіаїплей ру Ше тещод апа а - товщина кювети для вимірювання, см; ргосезз г рюодисіпд сагоїепоїйі сопіаіпіпуд сеїЇБ ог о ; Я і. сеїЇ рагів ог риптейд сагюіепоїд. УМО 92/22648, 1992.

АТ; - екстинкція одновідсоткового розчину, 2. Наїті А, 2еІКпа М., Рагап Е. Сагоїепоїдв5 ав яка для фітоїну, розчиненого в гексані, становить апіі-пурепепвісп адепв МО 02/058683 ДО 2002 915(Х -286бнм). о 3. 7еікпа М., Міг 7., Зедіом Т. Саговепойй

Паралельно визначається вологість біомаси: соптровійшт апа теййоа г ргоїєсйоп зКкіп. УМО наважку біомаси 0,15-0,20г зважується з точністю 03/041678 А1. 2002. до 5-го знаку і висушується в сушильній шафі 40- 4. 7еіка М. Зейіюм Т., Міг 1, Ап апі- 45хв. Після сушки зважується зразок! визначаєть: ашегозсіеговів сотрозійит сопіаіпіпу сагоіїепоїд5 ся волопеть. , що апа тео бог іппірійпу 191 охідайоп. УМО

Контролем слугували такі ж наважки кожної! ІЗ 02/058682 А?. 2002 статевих форм, вирощених окремо. Якщо у окремо 5. бЗопаапі Е., Зспіскіег Н. еї аї. А сагоїєпоїй вирощеній (ж) і (-) статевих форм концентрація ргерагайоп. УУО 0013654. 2000. фітоїну складала 0,35-0,3895, то при сумісному б. Вгійоп О., І іааеп-)депзеп 5., Ріапаег Н. вирощуванні концентрація складала від б до 11- Сагоїепоїдв. - Ваве!: Вігкпаєзег Ммепад 329р. - 1595. Тобто при спільному вирощуванні концент- 2004. " І

Claims

(51) МПК (2009) Ко с12Мм 1/14 М С12Р 23/00 С12М 15/01 С12Р 1/645 (2008.01) МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ о, п И С ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ЛАСНОСТ ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД ППП (54) МУКОРОВИЙ ГРИБ ВІ АКЕБ5І ЕА ТВІ5РОВА ШТАМ РНТ 17, РНТ 1" - ПРОДУЦЕНТ ФІТОЇНУ 1 2 (21) а2007 14381 «апа-10827958Біоріуре-раг (22) 20.12.2007 ОА49710 А, 16.09.2002 (24) 26.01.2009 ОА2220 С1, 26.12.1904 (46) 26.01.2009, Бюл.Мо 2, 2009 р. Ки 2296161 С2, 27.03.2007 (72) СОРОКА ЯРОСЛАВ МИХАЙЛОВИЧ, ОА, Перетравність корму, обмін речовин, продуктив- ДМИТРЕНКО ГАЛИНА МИКОЛАЇВНА, ОА, ність та якість м'яса курчат-бройлерів при згодову- СТЕНЬКО АЛЛА СТЕПАНІВНА, ША 0 ГОРНА ванні біомаси гриба Віакезіва іізрога: Автореф. МАРГАРИТА СТЕПАНІВНА, ША, ТУРІЯНСЬКИЙ дис... канд. с-г. наук: 06.02.02/ В.П. Мартиновсь- ЮРІЙ ДАВИДОВИЧ, ОА, ТЮРЄНКОВ АЛЄКСЄЙ кий; Нац. аграр. ун-т. - К., 2003. - 19 с. І(но-лайн АЛЄКСАНДРОВІЧ, ТЮРЄНКОВ ВЛАДІМІР Інайдено 12.11.2008). Найдено із Інтернет: « КІ: М КСАНДРЕЛЯИСТВО З ОБМЕЖЕНОЮ пер: .примдом.ца/ всгпірівлумлий32 ехе/до5Віп- ВІДПОВІДАЛЬНІСТЮ "НАУКОВО ВИРОБНИЧЕ о вепрв/ер.іпоо5О» ПІДПРИЄМСТВО "ВІТАН", США Хімічний склад препаратів каротину вітатону і ві- (56) Тпотаз, О.М. Сооайміп, Т.ММ. екшщаїе5 оп тадепсу та їх вплив на ріст і деякі показники обміну сагоїеподепезів іп ВіаКкезіва гізрога-і. - Сепегаї речовин в організмі курей в постнатальному онто- орзегмайопе оп зупіпезів іп тай апа птагеай генезі: Автореф. дис. канд. біол. наук: 03.00.04 / зігаіпз., Рпуюспетівігу, 6 (3), р.355-360, Маг 1967 Л.О. Прімова; Тавр. нац. ун-т ім. В.І.Вернадського. Ге! (Іно-лайні, (найдено 12.11.2008). Найдено із Інтер- - Сімф., 2002. - 18 с.Іно-лайн| (найдено г) нет: « Ок: 12.11.2008). Найдено із Інтернет: «х ШКІ: й- пЕру/Аумли.зсіепседігесі сот/зсіепсе? ор-АпісіеОК пер: .примдом.ца/ всгпірівлумлий32 ехе/до5Віп- г. І« ца о вепрв/ер.іпоо5О» Ії-В6ТН7-42Н2МХ1- УКО 92/22648 АТ, 23.12.1992 ба ивзег-1085 гпіос-18 їті-б опд-зеагсй УМО 02/058683 А2, 01.08.2002 а зоп-авмем/-са мегзіоп-18 игіМезіоп-Ов ивегті МО 03/041678 АТ, 22.05.2003 б» а-1045та5 УКО 02/058682 А2, 01.08.2002 со -с7тата93ІвьвЬро5с469с361891а45адосе» УМО 00/13654 А2, 16.03.2000 « Т С Гее, О В Коаїдцег, І Кагазама, Т Нієе, КІ. Мосин О.В. Регуляция биосинтеза каротиноидов у С) Зітрзоп, апа С О СпПіспезіег. Спетіса! анегайоп ої бактерий, грибов, водорослей, растений и живот- с сагоїепе Біозупіпезів іп Рпусотусев БіаКезієвапив ньїх. Журнал "Самиздат" |но-лайні, 28.08.2007 - апа тшапв., Аррі Місговісї!, 1975 Оесетрбег; 30(6): Інайдено 12.11.2008). Найдено із Інтернет: « ОКІ: щ 988-993. РМСІО: РМС376580 (но-лайні, (найдено пер:/Лмеб.агспіме.огдалиер/20070828194358/пПЕр:

12.11.2008). Найдено із Інтернет: « /ШКІ: І мими пита! Лр.ги/о/оїед м т/сдоситепвапа пЕрулумли.рибтеасепіга!|.піп.дом зеціпдзоіедтоїдокитепіугедиЦасііаріозіпіегакаго « /рістепдегІсді?юс|І-ртсепіге2хатлна-3765808ріоріу поіїдомиракіетгідгіромлуодогоз Іе)газ'єппі|2гпіжмоїптуйгі -3 ре-ра?т ї.8 піті» р Оаїзике Отепо, АІехапаег У. Тобріаз, апа Егапсе5 (57) 1. Мукоровий гриб Віакезієа ігізрога штам РИ Ф

Н. Агпоїд. ОімегеПйупу Сагоїепоїй Віозупіпейс 177 РЕ" - продуцент фітоїну, депонований в депо- т- Рафтуауз Бу Оігесієй Емоїшіоп., Місгоріо! Мої! Віо! зитарії Інституту мікробіології та вірусології ім. Д. Кеу, 2005 Магей; 69(1): 51-78. дої: К. Заболотного НАН України за Мо Е-100053.

10.1128/ММВК.69.1.51-78.2005. РМСІЮ: 2. Мукоровий гриб за п. 1 з виходом фітоїну 10- РМС1082795 Іно-лайні, (найдено 12.11.2008). Най- 1596. дено із Інтернет: « ОК: З. Мукоровий гриб за п. 1 з відсутністю забарвлен- пЕрулумли.рибтеасепіга!|.піп.дом/рістепаегТсді?юої ня субстратного міцелію. хртсепігег