UA99276C2 - ВИДІЛЕНЕ МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО, ЯКЕ ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ErbB3, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ - Google Patents

ВИДІЛЕНЕ МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО, ЯКЕ ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ErbB3, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ Download PDF

Info

Publication number
UA99276C2
UA99276C2 UAA200909492A UAA200909492A UA99276C2 UA 99276 C2 UA99276 C2 UA 99276C2 UA A200909492 A UAA200909492 A UA A200909492A UA A200909492 A UAA200909492 A UA A200909492A UA 99276 C2 UA99276 C2 UA 99276C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
antigen
cells
binding
antibodies
Prior art date
Application number
UAA200909492A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Биргит Шоэберл
Ульрик Нильсен
Майкл Фелдхаус
Муруганандам Арумугам
Баклер Девид
Original Assignee
Мерримак Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Мерримак Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Мерримак Фармасьютикалз, Инк.
Publication of UA99276C2 publication Critical patent/UA99276C2/uk

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід належить до виділеного моноклонального антитіла, яке зв’язує ErbB3, гібридоми, що його продукує, композиції, набору, способу пригнічення проведення сигналів ЕrbВ3 у суб'єкта, способу лікування раку.

Description

Підродина ЕпВ/НЕНК рецепторів поліпептидних факторів росту включає рецептор фактору епідермального росту (ЕСЕВ, ЕгВ1/НЕВІ), новий продукт онкогену (ЕТФВ2/НЕРВ2) та ідентифіковані пізніше рецепторні білки ЕФВЗ/НЕВЗ ї ЕГВА/НЕНА (дивись, наприклад, Нупез есеї. аї. (1994) Віоспіт.
Віорпуз. Асіа Нех. Сапсег 1198, 165-184). Кожний з цих рецепторів прогнозовано складається з позаклітинного домену, який зв'язує ліганд, домену, який натягує мембрану, домену цитозольної протеїнтирозинкінази (РТК) і домену С-термінальної фосфориляції (дивись, наприклад, Кіт еї аї., (1998) Віоспет. 9. 334, 189-195).
Експериментами іп міо було встановлено, що активність протеїнтирозинкінази білку ЕТВЗ є суттєво зниженою по відношенню до активності інших представників родини ЕТВ/НЕН, і цю знижену активність було приписано, частково, наявності неконсервативних амінокислотних заміщень в прогнозованому каталітичному домені ЕГтВ3З (дивись, наприклад, Су єї аї. (1994) Ргос. Маї). Асай. 5сі.
ИБА. 91, 8132-8136; бієтКке вї а!. (1997) Віоснет. у. 322, 757-763). Однак було показано, що білок ЕГОВЗ фосфорилюється в дуже різних клітинних контекстах. Наприклад, ЕптВвВЗ3 конститутивно фосфорилюється на тирозинових залишках в підгрупі клітинних ліній раку молочної залози людини, які з надлишком експресують цей білок (дивись, наприклад, Кгайз сеї а!. (1993) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА. 90, 2900-2904; і Кіт єї аі. Зирга; дивись також 5спавтег еї а!. (2006) Меоріавзіа 8(7):613-22 та 5спавєтег єї аІ. Сапсег Вез (2004) 64(10):3395-405).
Хоча роль ЕГБВЗ у виникненні раку вже встановлено (дивись, наприклад, Ногві єї аї!. (2005) 115, 519-527; Хие вї аї. (2006) Сапсег Рез. 66, 1418-1426), ЕТОВЗ залишається в основному неоціненим в якості мішені для клінічного втручання. Сучасні способи імунотерапії фокусуються головним чином на пригніченні дії ЕтЬВ2 і, зокрема, гетеродимеризації комплексів ЕТВ2/ЕТВЗ (дивись, наприклад,
ЗІЇМ/КОомьКі єї аї. (1994) 9. Віої. Снет. 269(20):14661-14665 (1994)). Відповідно, метою даного винаходу є вдосконалення імунотерапії в частині ефективного пригнічення сигнального шляху ЕгГОВЗ, і він може бути використаний для лікування і діагностики різних видів раку.
Даний винахід стосується нового класу моноклональних антитіл, які зв'язуються з рецептором
ЕбВЗ і пригнічують різні функції ЕГО8В3. Наприклад, описані тут антитіла здатні зв'язуватись з ЕгбВЗ і пригнічувати фосфориляцію рецептору, опосередковану лігандом, подібним до епідермального фактору росту (ЕСЕ). Як тут описується, ЕСЕ-подібні ліганди включають ЕСЕ, ТОаЕ-а, бетацелулін, епідермальний фактор росту, що зв'язує гепарин, бірегулін і амфірегулін, які зв'язуються з ЕСЕНВ і індукують димеризацію ЕСЕВ під дією ЕТВ3. Ця димеризація, в свою чергу, викликає фосфориляцію
ЕбВЗ ї активує проведення сигналів через цей рецептор. Отже, моноклональні антитіла за цим винаходом можуть бути використані для лікування і діагностики різних видів раку, що асоціюються з опосередкованим ЕГВЗ клітинним проведенням сигналів. Відповідно, в одному з варіантів здійснення, даний винахід стосується моноклональних антитіл (та їх частин, що зв'язують антиген), які зв'язуються з ЕГТЬВ3З і пригнічують опосередковану ЕсСЕ-подібним лігандом фосфориляцію ЕгЬВЗ.
В іншому варіанті здійснення ці антитіла додатково характеризуються однією чи більше з наступних властивостей: (і) здатністю пригнічувати опосередковане лігандом ЕбВЗ3 проведення сигналів, включаючи проведення сигналів, опосередковане зв'язуванням лігандів ЕтВ3, таких як херегулін, епірегулін, епігон ії ВІН, з ЕгбВ3З; (ії) здатністю пригнічувати проліферацію клітин, що експресують ЕгОВЗ; (ії) здатністю знижувати рівні ЕТОВЗ на поверхнях клітин (наприклад, викликаючи інтерналізацію ЕгВЗ); (ім) пригнічення секреції МЕСЕ клітин, що експресують ЕгеВЗ; (ху) здатністю пригнічувати міграцію клітин, що експресують ЕгбВЗ; (мі) здатністю пригнічувати сфероїдальний ріст клітин, що експресують ЕгЬВЗ; та/або (мії) здатністю зв'язуватись з епітопом, що розміщується на домені І (залишки 20-209) ЕВЗ, наприклад епітопом, який включає чи перекриває залишки 20-202 амінокислотної послідовності ЕТОВ3З.
Певні моноклональні антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом демонструють
Ко 50 нМ чи менше при визначенні за допомогою проби з використанням поверхневого плазмонного резонансу чи проби на зв'язування клітин.
В інших варіантах здійснення конкретні моноклональні антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом включають варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 905 (наприклад, 85 95, 90 95, 9595, 96 95, 97 Уо, 98 95 чи 99 Ор) тотожна амінокислотній послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга, наведеній в ЕС ІЮ Мо:/1,
ЗЕО ІО Ме:3, 5ЕО ІО Ме:5, 5ЕО ІО Ме:35 чи 5ЕО ІО Мо: 37. Інші конкретні моноклональні антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом включають варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 95 (наприклад, 85 95, 90 Фо, 95 95, 96 95, 97 9У6, 98 95 чи 99 95) тотожна амінокислотній послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга, наведеній в ЗЕО ІО Ме:2, 5ЕО ІО Ме:4, 5ЕБО ІО Ме:б, 5ЕБО ІО Ме:3б чи 5ЕО ІЮО Ме:38. Такі антитіла можуть включати також обидві вищезгадані варіабельні ділянки важкого ланцюга і легкого ланцюга.
Варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів таких антитіл чи їх частин, що зв'язують антиген, типово включають одну чи більше ділянку, що визначає комплементарність (СОР), яку ще називають гіперваріабельною ділянкою. Вони включають одну чи більше ділянку СОВІ, СОН2 і СОВЗ.
Відповідно, інші конкретні антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом включають одну чи більше послідовність СОВА, вибрану з варіабельної діллики СОВ1 важкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮ Ме:7; варіабельної ділянки СОН? важкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮ Мео:8; варіабельної ділянки СОНЗ важкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮО Мое:9; варіабельної ділянки
СОВІ1 легкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮО Мое:10; варіабельної ділянки СОВ2 легкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮО Ме:11; варіабельної ділянки СОВЗ легкого ланцюга, що являє собою 5ЕО І
Мо:12; та їх комбінації.
Ще інші конкретні антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом включають одну чи більше послідовність СОН, вибрану з варіабельної ділянки СОВІ1 важкого ланцюга, що являє собою
ЗЕБО ІО Ме:13; варіабельної діллнки СОНВН2 важкого ланцюга, що являє собою 5БО І Меое:14; варіабельної ділянки СОНЗ важкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮ Мое:15; варіабельної ділянки
СОВІ1 легкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮО Мо:16; варіабельної ділянки СОВ2 легкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮО Ме:17; варіабельної ділянки СОВЗ легкого ланцюга, що являє собою 5ЕО І
Мо:18; та їх комбінації.
Ще інші конкретні антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом включають одну чи більше послідовність СОН, вибрану з варіабельної ділянки СОВІ1 важкого ланцюга, що являє собою
ЗЕБЕО ІО Ме:19; варіабельної діллнки СОНВН2 важкого ланцюга, що являє собою 5БО І Мое:20; варіабельної ділянки СОНЗ важкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮ Мое:21; варіабельної ділянки
СОВІ1 легкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮО Мо:22; варіабельної ділянки СОВ2 легкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮО Ме:23; варіабельної ділянки СОВЗ легкого ланцюга, що являє собою 5ЕО І
Мо:24; та їх комбінації.
Ще інші конкретні антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом включають одну чи більше послідовність СОН, вибрану з варіабельної ділянки СОВІ1 важкого ланцюга, що являє собою
ЗЕБЕО ІО Ме:39; варіабельної діллнки СОВН2 важкого ланцюга, що являє собою 5БО І Мо:40; варіабельної ділянки СОНЗ важкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮ Мое:41; варіабельної ділянки
СОВІ1 легкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮО Мо:42; варіабельної ділянки СОВ2 легкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮО Ме:43; варіабельної ділянки СОВЗ легкого ланцюга, що являє собою 5ЕО І
Мо:44; та їх комбінації.
Ще інші конкретні антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом включають одну чи більше послідовність СОН, вибрану з варіабельної ділянки СОВІ1 важкого ланцюга, що являє собою
ЗЕБО ІЮО Ме:45; варіабельної діллнки СОНВН2 важкого ланцюга, що являє собою 5БО І Мо:46; варіабельної ділянки СОНЗ важкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮ Мое:47; варіабельної ділянки
СОВІ1 легкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮО Мо:48; варіабельної ділянки СОВ2 легкого ланцюга, що являє собою 5ЕО ІЮО Мое:49; варіабельної ділянки СОВЗ легкого ланцюга, що являє собою 5ЕО І
Мо:50; та їх комбінації.
Антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, можуть включати також одну чи більше ділянок СОН, які є щонайменше на 80 95 (наприклад, 85 95, 9095, 95 95, 96 95, 97 95, 9895 чи 99 95) тотожними вищезгаданим СОВ чи комбінаціям СОВ.
В одному варіанті здійснення даного винаходу антитіла і частини антитіл є повністю людськими (тобто, містять СОВ ії каркасні послідовності людини). Конкретні людські антитіла за цим винаходом включають ті, що мають варіабельну ділянку важкого ланцюга з гену зародкової лінії МНЗ3 людини та/або варіабельну ділянку легкого ланцюга з гену зародкової лінії МН2 людини.
Даний винахід охоплює також моноклональні антитіла і їх частини, що зв'язуються з тими самими чи епітопами чи епітопами, що перекриваються, зв'язаними будь-якими іншими антитілами чи їх частинами, описаними тут (наприклад, епітопом, розміщеним на домені | ЕТОВ3З, таким як епітоп, що включає чи перекриває залишки 20-202 амінокислотної послідовності ЕТОВ3). Антитіла, які мають таку саму активність, що й антитіла, описані тут, наприклад антитіла з такою самою послідовністю, що й АБ
Моб, також охоплюються даним винаходом.
Антитіла за даним винаходом включають всі відомі форми антитіл та інших білкових каркасів з властивостями, подібними до антитіл. Наприклад, таке антитіло може бути антитілом людини, гуманізованим антитілом, біспецифічним антитілом, химерним антитілом чи білковим каркасом з властивостями, подібними до антитіл, таким як фібронектин чи анкиринові повтори. Антитіло може бути також Раб, Рар2, 5сЕм, ЗМІР, афітілом, нанотілом чи домен-специфічним антитілом. Антитіло може мати також будь-який з наступних ізотопів: Їдс1, Іде, аз, да, ДМ, ІдА1, ІдАг, ІдАзес, ІдО і
І9Е.
В ще іншому варіанті здійснення даний винахід стосується також композицій, що містять комбінації антитіл чи їх частин, що зв'язують антиген, описаних тут, скомпоновані з прийнятним носієм та/або ад'ювантом. В одному конкретному варіанті здійснення така композиція містить два чи більше антитіла, які зв'язують різні епітопи на ЕГОВ3З, або антитіла, описані тут, комбінуються з протираковими антитілами, які не зв'язують ЕТОВЗ.
В ще іншому варіанті здійснення даний винахід стосується виділених нуклеїнових кислот, які кодують описані тут антитіла і їх частини, що зв'язують антиген. В конкретних варіантах здійснення така нуклеїнова кислота кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга, що являє собою нуклеотидну
З послідовність, яка щонайменше на 80 95 (наприклад, 85 95, 90 95, 95 95, 96 Фо, 97 95, 98 905 чи 99 90) є тотожною з 5ЕО ІЮО Мес25, 5ЕБЕО ІЮО Ме27, 5ЕБО ІО Ме:29, 5ЕБО ІО Ме:-35 чи 5ЕО ІО Ме:37 або яка гіобридизується з ними за дуже строгих умов; або варіабельну ділянку легкого ланцюга, що являє собою нуклеотидну послідовність, яка щонайменше на 80 95 (наприклад, 85 95, 90 95, 95 9», 96 9, 97 Об, 98 95 чи 99 95) є тотожною з 5ЕО ІЮО Мо:26, 5ЕО ІЮО Мо:28, 5ЕО ІО Мо:30, 5ЕО ІО Ме:36 чи 5ЕО І Ме:38 або яка гібридизується з ними за дуже строгих умов; або комбінації таких варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів.
Даний винахід стосується також трансгенних ссавців, що не є людиною, гібридом і трансгенних рослин, які експресують та/або продукують описані тут антитіла і їх частини, що зв'язують антиген.
Даний винахід стосується також набору, який включає одне чи більше виділене моноклональне антитіло чи його частини, що зв'язують антиген, описані тут, і, факультативно, інструкції щодо їх використання в лікуванні чи діагностуванні хвороби, пов'язаної із залежним від ЕТОВЗ проведенням сигналів, такої як рак.
Антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом можуть знайти використання для широкого кола терапевтичних і діагностичних застосувань, зокрема в онкології. Відповідно, в своєму іншому аспекті, даний винахід стосується способу пригнічення опосередкованої ЕСіт-подібним лігандом фосфориляції ЕВЗ у суб'єкта шляхом введення йому одного чи більше антитіла чи його частин, що зв'язують антиген, описаних тут, у кількості, достатній для пригнічення опосередкованої
ЕСЕ-подібним лігандом фосфориляції ЕгОВ3. Даний винахід стосується також способів лікування різних видів раку у суб'єкта, включаючи, але не обмежуючись ними, меланому, рак молочної залози, рак яєчника, карциному нирок, рак шлунково-кишкового тракту чи ободової кишки, рак легень, світлоклітинну саркома і рак передміхурової залози, шляхом введення йому одного чи більше антитіла чи його частин, що зв'язують антиген, описаних тут, у кількості, достатній для лікування раку. Антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, можуть вводитись окремо або в комбінації з іншими терапевтичними препаратами, такими як протиракові препарати, наприклад з іншими антитілами, хіміотерапевтичними препаратами та/або опроміненням.
В ще інших варіантах здійснення даний винахід стосується способів для діагностування і прогнозування виходу хвороб (наприклад, раку), пов'язаних з ЕТЬВ3. В одному варіанті це досягається шляхом контактування антитіл чи їх частин, що зв'язують антиген, за цим винаходом (наприклад, ех мімо чи іп мімо) з клітинами від суб'єкта і визначення рівня їх зв'язування з ЕГВЗ на цих клітинах.
Аномально високий рівень зв'язування з ЕТОВЗ буде свідчити про те, що у даного суб'єкта є рак, асоційований з ЕГОВЗ.
Інші характерні особливості і переваги даного винаходу стануть очевидними з наступного докладного опису, а також з формули винаходу.
Короткий опис пояснювальних малюнків
На Фіг. 1А ії 18 представлені діаграми в вигляді стовпчиків, які показують зв'язування різних кандидатів на анти-ЕТОВ3З антитіло (Рабрв, які тут позначені як АБ) з ЕїОВ3З, експресованим на клітинах меланоми МАЇ МЕ-ЗМ, з використанням вторинного антитіла козла проти людини Аїеха 647.
На Фіг. 2А-20 представлені графіки, які показують величини Ко різних кандидатів на анти-ЕТвЗ3 антитіло. На Фіг. 2А-28 представлені графіки, які показують величини Ко антитіла Моб (тут позначається як Ар Моб) і антитіла Мо3З (тут позначається як АБ Ме3), відповідно, визначені за допомогою методики поверхневого плазмонного резонансу. На Фіг. 2А-20 представлені графіки, які показують величини Ко АБ Моб і Ар Ме3, відповідно, визначені за допомогою проби на зв'язування з використанням клітин меланоми МАСМЕ-ЗМ.
На Фіг. З представлено графік специфічності зв'язування анти-ЕТВЗ3 антитіла (АБ Моб), яка оцінювалась за допомогою ЕГІЗА (імуноферментного твердофазного аналізу). ЕСЕВ, ВА і ТаБ-а слугували у якості контролю.
На Фіг. 4 графічно представлено здатність анти-ЕОВЗ3 антитіла (АБ Моб) знижувати загальний рівень ЕтВЗ в клітинах меланоми МАЇМЕ-ЗМ іп міо, яка оцінювалась за допомогою ЕГІ5БА (імуноферментного твердофазного аналізу).
На Фіг. 5А ї 58 графічно представлено здатність анти-ЕгбВ3 антитіла (АБ Моб) регулювати на пониження рецептори ЕтОВЗ на клітинах МАЇ МЕ-ЗМ, яка оцінювалась за допомогою ГАС5-аналізу (аналізу збудженої флуоресценції сортованих клітин). Фіг. 5А показує результати, отримані при використанні Ідс1 ізотипу цього антитіла. Фіг. 5В показує результати, отримані при використанні Ідсг ізотипу цього антитіла.
На Фіг. бА-60 представлені графіки, які показують залежність від часу опосередкованої антитілом регуляції ЕгОВЗ3 на пониження (АБ Моб), яка оцінювалась за допомогою ЕАсСз-аналізу (аналізу збудженої флуоресценції сортованих клітин).
На Фіг. 7 представлена діаграма у вигляді стовпчиків, яка показує здатність різних анти-ЕТЬВвЗ антитіл регулювати ЕГОВ3З на пониження в клітинах меланоми іп мімо.
На Фіг. 8 представлена діаграма у вигляді стовпчиків, яка показує здатність анти-ЕТЬВЗ антитіла (АБ Моб) регулювати ЕГОВЗ на пониження в ксенотрансплантатах АОН;к іп мімо.
На Фіг 9 графічно представлена здатність анти-ЄТВЗ антитіла (АБ Моб) пригнічувати проліферацію клітин МА МЕ-ЗМ в пробі на титроване світіння клітин.
На Фіг. 10 графічно представлена здатність анти-ЕВЗ антитіла (АБ Моб) пригнічувати проліферацію клітин в клітинній лінії яєчника, АОВГ.
На Фіг. 11 графічно представлена здатність анти-ЕВЗ антитіла (АБ Моб) пригнічувати проліферацію клітин АСНМ.
На Фіг. 12 представлена діаграма у вигляді стовпчиків, яка показує здатність анти-ЕТЬВ3З антитіла (АБ Меб) пригнічувати фосфориляцію ЕГОВ3З в ксенотрансплантатах АОНВ іп мімо.
На Фіг 13А-13С графічно представлена здатність анти-ЕТОВЗ3 антитіла (АБ Моб) пригнічувати опосередковану бетацелуліном і херегуліном фосфориляцію ЕГгЬВЗ в клітинах АОВГ.
На Фіг 14А-148 графічно представлена здатність анти-ЕТВЗ антитіла (902 ізотип АБ Моб) пригнічувати фосфориляцію ЕгЬВЗ в клітинних лініях пухлини яєчнику ОМСАВ 5 і ОМСАБК 8.
На Фіг 15А-15С графічно представлена здатність бетацелуліну (ВТС) зв'язувати ЕГТВІ, продемонстровану відсутністю зв'язування з негативними щодо ЕгпВ1 клітинами МАЇ МЕ-ЗМ (Фіг. 17А); зв'язуванням з позитивними щодо ЕВІ1 клітинами АОНг при концентраціях 10 нМ (Фіг. 178) і 200 нМ (Фіг. 17В), відповідно, і пригніченням такого зв'язування препаратом Егбих.
На Фіг 16А-1688 графічно представлена здатність анти-ЕТВЗ антитіла (902 ізотип АБ Моб) пригнічувати опосередковане херегуліном проведення сигналів у клітинах МАЇ МЕ-ЗМ. Фіг 16А показує здатність АБ Меб пригнічувати опосередковану херегуліном фосфориляцію ЕГбВЗ в клітинах МАЇ МЕ-
ЗМ, а Фіг. 168 - здатність АБ Моб пригнічувати фосфориляцію АКТ в клітинах МА МЕ-ЗМ.
На Фіг. 17А-17О0 графічно представлена здатність анти-ЕТОВ3 антитіла (АБ Моб) пригнічувати ріст пухлин (А) яєчнику (клітини АОН/г), (В) передміхурової залози (клітини Юи145), (С) яєчнику (клітини
ОмУСАНВ) ії (0) підшлункової залози (клітини Соі0о357), яка оцінювалась за допомогою дослідження ксенотрансплантатів.
На Фіг. 18А і 188 графічно представлена здатність анти-ЕтВ3З антитіла (АБ Меб) (Фіг. 184А) і баб як
Ар Мез (Фіг. 188) пригнічувати зв'язування херегуліну з ЕТОВЗ на клітинах МАЇ МЕ-ЗМ, яка оцінювалась за допомогою ГАС5-аналізу (аналізу збудженої флуоресценції сортованих клітин).
На Фіг. 19А ї 198 графічно представлена здатність АБ Моб пригнічувати зв'язування епірегуліну з
ЕбВЗ на клітинах АОМАг. Фіг. 19А показує зв'язування епірегуліну з клітинами АОНг, а Фіг. 198 - здатність Егбйих і АБ Моб пригнічувати зв'язування епірегуліну з клітинами АОВУу.
На Фіг. 20А ї 20В графічно представлена здатність епідермального фактору росту, що зв'язує гепарин (НВ-ЕСЕ), зв'язувати ЕГЬВ на клітинах АОВ»г (Фіг. 20А) і нездатність анти-ЕТВЗ антитіла (АБ
Моб) пригнічувати таке зв'язування (Фіг. 208).
Фіг. 21А-21С показують амінокислотні послідовності варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів антитіл: АБ Моб, АБ Мо3, АБ Мо14, АБ Ме17 і АБ Ме19.
Фіг. 22А-22В8 показують нуклеотидні послідовності варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів антитіл: АБ Моб, АБ Моз і АБ Мо14.
Фіг. 23 показує амінокислотні послідовності варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів антитіл: АБ Моб, АБ Мо17 ії АБ Мо19, які було повернуто до відповідної зародкової амінокислотної послідовності. Зміни амінокислотних залишків підкреслені.
На Фіг. 24А і 24С графічно представлена здатність АБ Моб пригнічувати секрецію МЕС клітин пухлини.
На Фіг. 25 графічно показано вплив АБ Меб на міграцію клітин.
На Фіг. 26А-26С графічно показано (А) пригнічення сфероїдального росту в клітинах аг, (В) пригнічення індукованого НАСї сфероїдального росту в клітинах Ааг і (С) пригнічення індукованого
НВа сфероїдального росту в клітинах Юи145.
На Фіг. 27А і 27В графічно показано вплив АБ Моб на зв'язування (А) НКО і (В) ВТС з клітинами дат.
На Фіг. 28 графічно показано вплив Ар Меб на індуковану НЕ фосфориляцію ЕгоВ3.
На Фіг. 29А і 298 показано вплив АБ Моб на фосфориляцію (А) рЕГЬВІ1 і рЕгГОВ3З ії (В) індуковане
НКО утворення комплексу ЕгрВ2/3.
На Фіг. 30 графічно показано, що Ар Меб зв'язує амінокислотні залишки 20-202 ЕГЬВ3З.
Докладний опис винаходу
Для того, щоб полегшити сприйняття даного винаходу, спочатку будуть визначені основні терміни.
І. Дефініції
Терміни "ЕбВ3", "НЕНЗ", "рецептор ЕбВ3" і "рецептор НЕНЗ", які використовуються тут взаємозамінно, стосуються білку ЕГОВЗ3 людини, як його описано в патенті США Мо5,480,968 і в статті
Ріожмтап еї аї., Ргос. Май. Асад. сі. ОБА, 87:4905-4909 (1990); дивись також Кагпі еї а!., Віоспетівігу 44:15842-857 (2005), Спо 8 І вану, бсіепсе 297:1330-1333 (2002)).
Термін "ЕСЕ-подібний ліганд", як він тут використовується, стосується лігандів рецептору епідермального фактору росту (ЕСЕВ), включаючи епідермальний фактор росту (ЕСЕ) і близько споріднені з ним білки, такі як трансформуючий фактор росту-є (ТОаЕ-а), бетацелулін (ВТС),
епідермальний фактор росту, що зв'язує гепарин (НВ-ЕСЕЕ), бірегулін (ВІР) і амфірегулін (АРК), які зв'язуються з ЕСЕВ на поверхні клітин і стимулюють активність власної протеїнтирозинкінази цього рецептору. Більш конкретно, ЕСЕ-подібні ліганди індукують утворення ЕСЕВ (який позначають також як ЕВ) і комплексу білків ЕГОВЗ (дивись також Кіт еї аї., (1998) Віоснет .., 334:189-195), що має своїм результатом фосфориляцію тирозинових залишків в цьому комплексі.
Антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом пригнічують опосередковану ЕСЕ- подібним лігандом фосфориляцію ЕгВЗ і, в певних варіантах здійснення, демонструють одну чи більше з наступних додаткових властивостей: (ії) здатність пригнічувати опосередковане одним чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену і бірегуліну (ВІВ) проведення сигналів через ЕгрВЗ; (ії) здатність пригнічувати проліферацію клітин, що експресують ЕгВЗ; (ії) здатність знижувати рівень
ЕВЗ на поверхні клітин; (ім) здатність пригнічувати секрецію МЕС клітин, що експресують ЕгВЗ; (м) здатність пригнічувати міграцію клітин, що експресують ЕпВЗ; (мі) здатність пригнічувати сфероїдальний ріст клітин, що експресують ЕгЬВЗ; та/або (мії) здатність зв'язуватись з епітопом, який міститься на домені | ЕбВЗ3, наприклад з епітопом, що включає чи перекриває залишки 20-202 амінокислотної послідовності ЕТОВ3З.
Термін "пригнічення", як він тут використовується, стосується будь-якого статистично достовірного зниження біологічної активності включаючи повне блокування такої активності. Наприклад, "пригнічення" може стосуватись зниження біологічної активності приблизно на 10 95, 20 Фв, ЗО 9, 40 9, то, 6о0 зо, 70 то, 80 то, 90 95 чи 100 95.
Відповідно, фраза "пригнічення опосередкованої ЕСЕ-подібним лігандом фосфориляції ЕгоВ3", як вона тут використовується, стосується здатності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, статистично достовірно зменшувати фосфориляцію ЕпВЗ3, індуковану ЕСЕ-подібним лігандом, по відношенню до фосфориляції в необробленій (контрольній) клітині. Клітиною, яка експресує ЕТВЗ, може бути клітина чи клітинна лінія, що зустрічається природно, або вона може бути рекомбінантно створеною шляхом введення нуклеїнової кислоти, кодуючої ЕпВЗ3, в клітину-хазяїна. В одному варіанті здійснення даного винаходу антитіло чи його частини, що зв'язує антиген, пригнічує опосередковану ЕсСЕ-подібним лігандом фосфориляцію ЕбВЗ3 щонайменше на 1095, або щонайменше на 20 95, або щонайменше на 30 95, або щонайменше на 40 95, або щонайменше на 5095, або щонайменше на 6095, або щонайменше на 7095, або щонайменше на 80 95, або щонайменше на 90 95, або 100 95, що визначається, наприклад, за допомогою вестерн блотингу з наступним використанням антифосфотирозинового антитіла, як описано в публікації Кіт еї а!., (1998)
Віоспет у., 334:189-195 і в подальших Прикладах.
Фраза "пригнічення опосередкованого херегуліном, епірегуліном, епігеном чи бірегуліном проведення сигналів через ЕгїбВ3", як вона тут використовується, стосується здатності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, статистично достовірно зменшувати проведення сигналів, опосередковане лігандом ЕТВЗ (наприклад, херегуліном, епірегуліном, епігеном і бірегуліном), через
ЕпЬВЗ по відношенню до проведення сигналів за відсутності такого антитіла (контроль). ЕГОВЗ-ліганди тут також позначаються як "херегулін-подібні ліганди". Це означає, що в присутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за цим винаходом сигнал, опосередкований в клітині, що експресує
ЕбВЗ3, одним чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену і бірегуліну, є статистично достовірно зниженим по відношенню до контролю (за відсутності антитіла). Опосередкований ЕгВЗ-лігандом сигнал може бути оцінений шляхом визначення рівня активності субстрату ЕТЬВЗ та/або білку, який присутній в клітинному каскаді за участі ЕтОВ3. В одному варіанті здійснення антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, знижує рівень активності субстрату ЕГЬВЗ та/або активність білку, який присутній в клітинному каскаді за участі ЕГТОВ3, щонайменше на 10 95, або щонайменше на 20 95, або щонайменше на 3095, або щонайменше на 4095, або щонайменше на 5095, або щонайменше на 60 95, або щонайменше на 70 95, або щонайменше на 80 95, або щонайменше на 90 95, або 100 95 по відношенню до рівня активності за відсутності такого антитіла чи його частини, що зв'язує антиген (контроль). Таке опосередковане ЕгоВЗ-лігандом проведення сигналів може оцінюватись за допомогою методів, відомих в цій галузі, які визначають рівень активності субстрату ЕТВ3З (наприклад, 5НС чи РІЗК) або білку, який присутній в клітинному каскаді за участі ЕГОВЗ (наприклад, АКТ), використовуючи аналіз кіназної активності щодо таких білків (дивись, наприклад, Ногві єї а. взирга, 5цадо еї а!. (2000) Меїнодз
Епгутої, 322:388-92; а також Могадап еї а!. (1990) Єиг. У. Віоспет., 191:761-767).
В одному конкретному варіанті здійснення антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, пригнічує опосередковане ЕгрВЗ-лігандом (наприклад, херегуліном, епірегуліном, епігеном чи бірегуліном) проведення сигналів через Е"Ї0ВЗ3 шляхом пригнічення зв'язування ЕгВЗ-ліганду (наприклад, одного чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну) з ЕТЬВ3. Деякі ліганди (наприклад, бірегулін чи ВІВ) функціонують і як ЕСЕ-подібні ліганди (тобто зв'язуються з ЕСЕВ/ЕТЬВІ), і як ЕТВЗ-подібні ліганди (тобто зв'язуються з ЕгОВ3).
Фраза "пригнічення зв'язування херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну з ЕГТЬВ3З", як вона тут використовується, стосується здатності антитіла чи його частини, що зв'язують антиген, статистично достовірно зменшувати зв'язування ліганду ЕтВЗ (наприклад, одного чи більше з херегуліну,
б епірегуліну, епігену чи бірегуліну) з ЕТОВ3З по відношенню до зв'язування за відсутності такого антитіла (контроль). Це означає, що в присутності антитіла чи його частини, що зв'язують антиген, кількість
ЕбВЗ-ліганду (наприклад, херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну), яка зв'язується з ЕТВЗ, є статистично достовірно зменшеною по відношенню до контролю (за відсутності антитіла). Кількість ліганду ЕТВЗ, яка зв'язує ЕГОВ3, може бути зменшеною в присутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за цим винаходом щонайменше на 10 95, або щонайменше на 20 95, або щонайменше на 3095, або щонайменше на 4095, або щонайменше на 5095, або щонайменше на 60 95, або щонайменше на 70 95, або щонайменше на 80 95, або щонайменше на 90 95, або 100 95 по відношенню до такої кількості за відсутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген (контроль). Зменшення зв'язування ЕгВЗ-ліганду може оцінюватись за допомогою відомих в цій галузі методів, які визначають рівень зв'язування міченого ЕВЗ-ліганду (наприклад, радіоактивно міченого херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну) до клітин, що експресують ЕГТЬВЗ, в присутності чи за відсутності (контроль) антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за цим винаходом.
Фраза "пригнічення проліферації клітин, що експресують ЕгОВ3", як вона тут використовується, стосується здатності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, статистично достовірно зменшувати проліферацію клітини, що експресує ЕГ0В3, по відношенню до проліферації за відсутності такого антитіла. В одному варіанті здійснення проліферація клітини, що експресує ЕГЬВЗ (наприклад, ракової клітини), може бути зменшеною щонайменше на 1095, або щонайменше на 20 95, або щонайменше на 30 95, або щонайменше на 40 95, або щонайменше на 50 95, або щонайменше на 60 95, або щонайменше на 70 95, або щонайменше на 80 95, або щонайменше на 90 95, або 100 95, коли клітини контактують з антитілом чи його частиною, що зв'язує антиген, за цим винаходом по відношенню до проліферації за відсутності такого антитіла чи його частини, що зв'язує антиген (контроль). Проліферація клітин може оцінюватись методами, відомими в цій галузі, які визначають швидкість поділу клітин, фракцію клітин в даній популяції, яка піддається поділу, та/або швидкість втрати клітин з даної їх популяції через термінальну диференціацію чи загибель клітин (наприклад, за допомогою аналізу титрованого світіння сортованих клітин чи включення тимидину).
Фраза "здатність знижувати рівень ЕВЗ3 на поверхні клітин", як вона тут використовується, стосується здатності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, статистично достовірно зменшувати кількість ЕГОВЗ на поверхні клітини, яку було піддано дії антитіла, по відношенню до необробленої (контрольної) клітини. Наприклад, зниження рівня ЕГЬВЗ на поверхні клітин може бути наслідком збільшеної інтерналізації ЕГОВЗ3 (чи збільшеного ендоцитозу ЕгВ3). В одному варіанті здійснення даного винаходу антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, зменшує експресію ЕтВвЗ на поверхні клітин щонайменше на 10 95, або щонайменше на 20 95, або щонайменше на 30 95, або щонайменше на 40 95, або щонайменше на 50 95, або щонайменше на 60 95, або щонайменше на 70 95, або щонайменше на 80 95, або щонайменше на 90 95, або 100 95 та/або збільшує інтерналізацію рецептору ЕТОВ3 щонайменше на 10 95, або щонайменше на 20 95, або щонайменше на 30 95, або щонайменше на 40 95, або щонайменше на 50 95, або щонайменше на 60 95, або щонайменше на 70 95, або щонайменше на 80 95, або щонайменше на 90 95, або 100 95 по відношенню до експресії на поверхні клітин чи інтерналізації за відсутності такого антитіла чи його частини, що зв'язує антиген (контроль). Рівні ЕТВ3З на поверхнях клітин та/або інтерналізація рецептору ЕГТЬВЗ в присутності і за відсутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, можуть легко оцінюватись за допомогою методів, відомих в цій галузі, таких як описані в публікації Ногзі єї аї!., зирга та в подальших прикладах.
Фраза "пригнічення секреції МЕСЕ клітин, що експресують ЕГбВ3", як вона тут використовується, стосується здатності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, статистично достовірно зменшувати секрецію МЕС клітин, що експресують ЕптВ3, по відношенню до секреції МЕСЕ за відсутності такого антитіла. В одному варіанті здійснення даного винаходу секреція МЕС клітини, що експресує ЕТВЗ (наприклад, ракової клітини), може бути зменшеною щонайменше на 10 95, або щонайменше на 20 95, або щонайменше на 30 95, або щонайменше на 40 95, або щонайменше на 5095, або щонайменше на 6095, або щонайменше на 7095, або щонайменше на 80 95, або щонайменше на 90 95, або 100 95, коли клітини контактують з антитілом чи його частиною, що зв'язує антиген, за цим винаходом по відношенню до секреції МЕСЕ за відсутності такого антитіла чи його частини, що зв'язує антиген (контроль). Секрецію МЕСЕ можна оцінити методами, відомими в цій галузі, такими як описані тут.
Фраза "пригнічення міграції клітин, що експресують ЕптВ3", як вона тут використовується, стосується здатності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, статистично достовірно зменшувати міграцію клітин, що експресують ЕГВЗ, по відношенню до міграції за відсутності такого антитіла. В одному варіанті здійснення даного винаходу міграція клітини, що експресує ЕВвЗ (наприклад, ракової клітини), може бути зменшеною щонайменше на 10 95, або щонайменше на 20 95, або щонайменше на 30 95, або щонайменше на 40 95, або щонайменше на 50 95, або щонайменше на 60 95, або щонайменше на 70 95, або щонайменше на 80 95, або щонайменше на 90 95, або 100 95, коли клітини контактують з антитілом чи його частиною, що зв'язує антиген, за цим винаходом по відношенню до міграції за відсутності такого антитіла чи його частини, що зв'язує антиген (контроль).
Секрецію МЕСЕ можна оцінити методами, відомими в цій галузі, такими як описані тут.
Фраза "пригнічення сфероїдального росту клітин, що експресують ЕВ3", як вона тут використовується, стосується здатності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, статистично достовірно зменшувати міграцію клітини, що експресує ЕГОВЗ, по відношенню до міграції за відсутності такого антитіла. В одному варіанті здійснення даного винаходу міграція клітини, що експресує ЕгтВЗ (наприклад, ракової клітини), може бути зменшеною щонайменше на 10 95, або щонайменше на 20 95, або щонайменше на 30 95, або щонайменше на 40 95, або щонайменше на 50 95, або щонайменше на 60 95, або щонайменше на 70 95, або щонайменше на 80 95, або щонайменше на 90 95, або 100 95, коли клітини контактують з антитілом чи його частиною, що зв'язує антиген, за цим винаходом по відношенню до міграції за відсутності такого антитіла чи його частини, що зв'язує антиген (контроль).
Секрецію МЕСЕ можна оцінити методами, відомими в цій галузі, такими як описані тут. Терміни "антитіло" чи "імуноглобулін", які тут використовуються взаємозамінно, включають цілі антитіла і будь- який їх фрагмент (тобто, "частину, що зв'язує антиген") чи одиночні ланцюги, що зв'язують антиген. "Антитіло" включає щонайменше два важких (Н) ланцюги і два легких (І) ланцюги, що з'єднані між собою дисульфід ними зв'язками. Кожний важкий ланцюг має варіабельну ділянку важкого ланцюга (яка тут скорочено позначається як Мн) і постійну ділянку важкого ланцюга. Постійна ділянка важкого ланцюга складається з трьох доменів СНІ, СН2 ії СН3З. Кожний легкий ланцюг має варіабельну ділянку легкого ланцюга (яка тут скорочено позначається як Мі) і постійну ділянку легкого ланцюга. Постійна ділянка легкого ланцюга складається з одного домену, Сі. На ділянках Мн і Мі можуть бути далі виділені ділянки гіперваріабельності, які називаються ділянками, що визначають комплементарність (СОВ). Ділянки СОВ вставлені в проміжки між ділянками, що є більш законсервованими, які називають каркасними ділянками (ЕВ). Кожна ділянка Мн і Мі складається з трьох ділянок СОВ і чотирьох ділянок
ЕВ, які розміщуються від М-кінця білкового ланцюга до його карбоксильного кінця в наступному порядку: ЕВІ, СОВІ, ЕН2, СОВ2, ЕВЗ, СОВЗ, ЕН4. Варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів містять зв'язувальний домен, який взаємодіє з антигеном. Постійні ділянки антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами чи факторами хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) і перший компонент (Сід) класичної системи комплементу. Показові антитіла за цим винаходом включають антитіла Мої, МеЗ і Мо14 та їх частини, що зв'язують антиген.
Термін "частина антитіла, що зв'язує антиген" або просто "частина антитіла", як він тут використовується, стосується одного чи більше фрагментів антитіла, які зберігають здатність специфічно зв'язуватись з антигеном (наприклад, ЕВ3). Було показано, що функція зв'язування антигену може виконуватись фрагментами антитіла повної довжини. Приклади зв'язувальних фрагментів, які охоплюються терміном "частина антитіла, що зв'язує антиген", включають (ії) фрагмент
Еаб, моновалентний фрагмент, що складається з доменів Мі, Мн, Сі ї СНІ; (її) фрагмент Е(ар)», двохвалентний фрагмент, що містить два фрагменти Раб, зв'язані дисульфідним містком на шарнірній ділянці; (ії) фрагмент Ба, що складається з доменів Мн і СНІ; (м) фрагмент Ем, що складається з доменів Мі і Мн одного плеча антитіла; (м) аАБЮ, що включає домени МН і Мі; (мі) фрагмент ЗАБ (У/ага єї а!. (1989) Машге 341, 544-546), який містить домен Мн; (мії) АБ, який містить домен МН чи МІ; ії (мії) виділену ділянку, що визначає комплементарність (СОР) чи (їх) комбінацію двох чи більше виділених
СОВ, які факультативно можуть бути з'єднаними синтетичним лінкером. Більш того, хоча два домени фрагменту Ем, Мі і Мн, кодуються окремими генами, їх можна об'єднати за допомогою рекомбінантних методів синтетичним лінкером з утворенням єдиного білкового ланцюга, в якому ділянки Мі ї Мн паруються в моновалентні молекули, відомі як Ем з єдиним ланцюгом (зсЕм); дивись, наприклад, Віга еї аІ. (1988) бсіепсе 242, 423-426; і Нибюп єї аї. (1988) Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА 85, 5879-5883).
Мається на увазі, що такі антитіла з єдиним ланцюгом охоплюються терміном "частина антитіла, що зв'язує антиген". Ці фрагменти антитіл отримують за допомогою звичайних методів, відомих спеціалістам в цій галузі, і їх відбирають для використання так само, як інтактні антитіла. Частини антитіл, що зв'язують антиген, можуть бути отримані за методиками, які використовують рекомбінантну ДНК, або ферментативним чи хімічним розщепленням інтактних імуноглобулінів.
Термін "моноклональне антитіло", як він тут використовується, стосується антитіла, отриманого з популяції суттєво гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, що складають цю популяцію, є ідентичними, за виключенням можливих мутацій, які трапляються природно і які можуть бути присутніми в незначній кількості. Моноклональні антитіла є високо специфічними, будучи спрямованими проти єдиної ділянки детермінанти. Більш того, на відміну від препаратів, що містять звичайні (поліклональні) антитіла і типово включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло є спрямованим проти єдиної детермінанти на антигені. Моноклональні антитіла можуть бути отримані за допомогою методів, відомих в цій галузі і описаних тут, таких як, наприклад, метод гібридоми, як описано Копіег єї аї. (1975) Маїшиге, 256:495, метод використання трансгенної тварини, як описано, наприклад в публікації І опрегу, єї аї. (1994)
Маїште 368(6474): 856-859), методів рекомбінантної ДНК (дивись, наприклад, патент США Мо
4,816,567), або за допомогою бібліотек фагових антитіл з використанням методик, описаних, наприклад, в публікаціях Сіаскбоп єї аї., Маїшгтє, 352:624-628 (1991) та Маїкв еї аї., уУ. Мої. Віо!., 222:581-597 (1991). Моноклональні антитіла включають химерні антитіла, антитіла людини і гуманізовані антитіла і можуть зустрічатись природно або бути отриманими рекомбінантно.
Термін "рекомбінантне антитіло" стосується антитіл, які отримуються, експресуються, створюються чи виділяються рекомбінантними засобами, таких як (а) антитіла, виділені з тварини (наприклад, миші), що є трансгенною чи трансхромосомною щодо імуноглобулінових генів (наприклад, імуноглобулінових генів людини), чи гібридоми, отриманої з них; (б) антитіла, виділені з клітини- хазяїна, трансформованої таким чином, щоб експресувати це антитіло, наприклад з трансфектоми; (в) антитіла, виділені з бібліотеки рекомбінантних комбінаторних антитіл (наприклад такої, що містить послідовності антитіл людини) за допомогою фагового дисплею; і (г) антитіла, які отримуються, експресуються, створюються чи виділяються будь-якими іншими засобами, які включають сплайсинг послідовностей імуноглобулінових генів (наприклад, імуноглобулінових генів людини) до інших послідовностей ДНК. Такі рекомбінантні антитіла можуть мати варіабельні і постійні ділянки, що походять від зародкових імуноглобулінових послідовностей людини. Однак, в певних варіантах здійснення даного винаходу такі рекомбінантні антитіла людини можуть бути піддані мутагенезу іп мішо і, відповідно, амінокислотні послідовності ділянок Мн і Мі таких рекомбінантних антитіло є послідовностями, які, хоча походять від зародкових послідовностей Мн і Мі людини і споріднені з ними, можуть не існувати природно в зародковому репертуарі антитіл людини іп мімо.
Термін "химерний імуноглобулін" чи антитіло стосується імуноглобуліну чи антитіла, варіабельні ділянки яких походять від першого виду, а постійні ділянки - від другого виду. Химерні імуноглобуліни чи антитіла можуть бути створені, наприклад, методами генної інженерії з сегментів генів імуноглобуліну, що належать різним видам.
Термін "антитіло людини", як він тут використовується, включає антитіла з варіабельними ділянками, в яких каркасні і СОВ ділянки походять від зародкових імуноглобулінових послідовностей людини, як описали, наприклад, Кабаї єї аЇ. (Дивись Кабаї, єї аЇ. (1991) бЗедиепсев ої ргоївїнв5 ої
Ітітипоіодіса! Іпіегеві, ГИ Еайіоп, 0.5. Оерайтепі ої Неайй апа Нитап 5егуісевз, МІН Рибіїсайоп Мо. 91-3242). Більш того, якщо таке антитіло містить постійну ділянку, ця постійна ділянка також походить від зародкових імуноглобулінових послідовностей людини. Антитіла людини можуть включати амінокислотні залишки, які не кодовані зародковими імуноглобуліновими послідовностями людини (наприклад, мутації, введені випадковим чи сайт-специфічним мутагенезом іп міо чи соматичною мутацією іп мімо). Однак термін "антитіло людини", як він тут використовується, не включає антитіл, в яких послідовності СОВА, що походять від ембріональної лінії інших видів ссавців, таких як миша, було трансплантовано на каркасні послідовності людини.
Антитіло людини може мати щонайменше одну чи більше амінокислот, заміщених амінокислотним залишком, наприклад посилюючим активність амінокислотним залишком, що не є кодованим зародковою імуноглобуліновою послідовністю людини. Типово, антитіло людини може мати до двадцяти позицій, заміщених амінокислотними залишками, які не є частиною зародкової імуноглобулінової послідовності людини. В одному конкретному варіанті здійснення ці заміщення припадають на ділянки СОН, як докладно буде описано далі.
Термін "гуманізований імуноглобулін" чи "гуманізоване антитіло" стосується імуноглобуліну чи антитіла, які включають щонайменше один ланцюг гуманізованого імуноглобуліну чи антитіла (тобто, щонайменше один гуманізований важкий чи легкий ланцюг).
Термін "ланцюг гуманізованого імуноглобуліну" чи "ланцюг гуманізованого антитіла" (тобто, "легкий ланцюг гуманізованого імуноглобуліну" чи "важкий ланцюг гуманізованого імуноглобуліну") стосується ланцюга імуноглобуліну чи антитіла (тобто, легкого чи важкого ланцюга, відповідно), варіабельна ділянка якого включає варіабельну каркасну ділянку від імуноглобуліну чи антитіла людини і ділянки, що визначають комплементарність (СОР), (наприклад, щонайменше СОВ, краще два СОВ, а ще краще три СОР) суттєво від імуноглобуліну чи антитіла не людини, і додатково включає постійні ділянки (наприклад, щонайменше одну постійну ділянку чи її частину у випадку легкого ланцюга і переважно три постійні ділянки у випадку важкого ланцюга). Термін "гуманізована варіабельна ділянка" (наприклад, "гуманізована варіабельна ділянка легкого ланцюга" чи "гуманізована варіабельна ділянка важкого ланцюга") стосується варіабельної ділянки, яка включає варіабельну каркасну ділянку суттєво від імуноглобуліну чи антитіла людини і ділянки, що визначають комплементарність (СОР) суттєво від імуноглобуліну чи антитіла не людини. "Біспецифічне" чи "біфункціональне антитіло" - це штучне гібридне антитіло, що має дві різні пари важкого/легкого ланцюгів і два різних сайти зв'язування. Біспецифічні антитіла можуть бути отримані різними методами, включаючи зрощування гібридом чи зв'язування фрагментів Раф. Дивись, наприклад, бопадвіміїаї 5 Гасптапп, (1990) Сіїп. Ехр. Іттипої. 79, 315-321; Ковів!пу єї аї. (1992) 9.
Іттипої. 148, 1547-1553. В одному конкретному варіанті здійснення біспецифічне антитіло за даним винаходом включає сайти зв'язування і для ЕпВЗ3, і для ІЩ4Е1-ЩА (тобто, для рецептору інсулін- подібного фактору росту 1). В іншому варіанті здійснення біспецифічне антитіло за цим винаходом включає сайти зв'язування для ЕТЬВЗ і С-МЕТ. В інших варіантах здійснення біспецифічне антитіло включає сайт зв'язування для ЕгГОВЗ і сайт зв'язування для ЕтВ2, ЕНЬБВЗ, ЕтЬВ4, ЕСЕЕВ, І ємів У, МОС- 1, ЕРСАМ, СА125, специфічного до передміхурової залози мембранного антигену, РОСЕВ-а, РОСЕВ-
В, С-КІТ чи будь-якого з рецепторів ЕСЕ.
Термін "гетерологічне антитіло", як він тут використовується, визначається по відношенню до трансгенного організму, що не є людиною, чи рослини, які продукують таке антитіло.
Термін "виділене антитіло", як він тут використовується, стосується антитіла, що є суттєво вільним від інших антитіл, які мають різні антигенні специфічності (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з ЕГОВ3З, є суттєво вільним від антитіл, що специфічно зв'язують інші ніж Е"ОВЗ антигени). До того ж, виділене антитіло типово є суттєво вільним від іншого клітинного матеріалу та/або хімічних сполук. В одному варіанті здійснення даного винаходу комбінація "виділених" моноклональних антитіл з різною специфічністю щодо зв'язування ЕГОВЗ утворює добре визначену композицію.
Термін "ізотип", як він тут використовується, стосується класу антитіла (наприклад, І9М чи да), який кодується генами постійної ділянки важкого ланцюга. В одному варіанті здійснення антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, є ізотипом, вибраним з наступних ізотипів антитіла: Ідс1, Ідс2, Ід,
Ідс4, ІМ, ІДЗАТ, ІдАг, ІдАзес, ІДО чи ІДЕ. В певних варіантах здійснення моноклональне антитіло за цим винаходом належить до ізотипу Ід(с2.
Термін "переключення ізотипу", як він тут використовується, стосується того явища, коли клас чи ізотип антитіла змінюється з Ід одного класу на Ід інших класів.
Термін "не переключений ізотип", як він тут використовується, стосується ізотипного класу важкого ланцюга, який отримується тоді, коли ніякого переключення ізотипу не відбувається; ген СН, який кодує такий не переключений ізотип, типово є першим геном СН, що розміщується безпосередньо перед функціонально реаранжованим геном МО). Переключення ізотипу було класифіковано як класичне чи некласичне переключення ізотипу. Класичне переключення ізотипу відбувається при явищах рекомбінації, які передбачають щонайменше одну ділянку з послідовністю переключення в гені, що кодує антитіло. Некласичне переключення ізотипу може відбуватись, наприклад, при гомологічній рекомбінації між си людини і Уни людини (б-асоційована делеція). Альтернативні механізми некласичного переключення, такі як інтертрансген та/або міжхромосомна рекомбінація, серед інших, можуть траплятись і здійснювати переключення ізотипу.
Термін "послідовність переключення", як він тут використовується, стосується тих послідовностей
ДНК, які відповідають за рекомбінацію на етапі переключення. Послідовність "донора переключення", типово ділянка М переключення, буде 5' (тобто, вище) конструктивної ділянки і буде стерта під час рекомбінації на етапі переключення. Ділянка "акцептора переключення" буде знаходитись між конструктивною ділянкою, яку буде стерто, і постійною ділянкою заміщення (наприклад, у, є і т.д.).
Оскільки не існує якогось специфічного місця, де завжди відбувається рекомбінація, кінцеву послідовність гену типово не можна передбачити за конструктивною ділянкою. "Антиген" є сутністю (наприклад, білковоподібною сутністю чи пептидом), з якою зв'язується антитіло чи його частина, що зв'язує антиген. В різних варіантах здійснення даного винаходу антигеном є ЕТВЗ чи ЕтЬВЗ-подібна молекула. В одному конкретному варіанті здійснення даного винаходу антигеном є ЕїОВЗ людини.
Термін "епітоп" чи "антигенна детермінанта" стосується місця (сайту) на антигені, з яким специфічно зв'язується імуноглобулін чи антитіло. Епітопи можуть бути утвореними із замінних амінокислот чи незамінних амінокислот, які суміщуються з третинним фолдингом (укладкою, білку.
Епітопи, утворені із замінних амінокислот, типово витримують дію денатуруючих розчинників, тоді як епітопи, утворені третинною укладкою, типово втрачаються після обробки денатуруючими розчинниками. Епітоп типово включає щонайменше 3, 4,5,66, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 чи 15 амінокислот в унікальній просторовій конформації. Методи визначення просторової конформації епітопів включають методи, відомі в цій галузі, і ті, що описані тут, наприклад рентгенівська кристалографія і двомірний ядерний магнітний резонанс. Дивись, наприклад, Еріре Марріпа
Ргоїосоїв іп Меїнос3з іп МоїІесшіаг Віоіоду, Мої. 66, Сх. Е. Моїтів, Ед. (1996).
Даний винахід охоплює також антитіла, які зв'язують той самий чи частково покриваючий епітоп, що й антитіла за цим винаходом, тобто антитіла, які конкурують за зв'язування з ЕТЬВЗ, або зв'язують епітопи, які перекриваються з епітопами, зв'язаними описаними тут антитілами, тобто епітоп, розміщений на домені І ЕГЬВ3. Антитіла, які впізнають той самий епітоп, можуть бути ідентифіковані за допомогою рутинних методів, таких як імунологічний аналіз, наприклад з визначенням здатності одного антитіла блокувати зв'язування іншого антитіла з антигеном-мішенню, тобто методом конкурентного зв'язування. Конкурентне зв'язування оцінюється за методикою, в якій імуноглобулін, що тестується, пригнічує специфічне зв'язування контрольного антитіла з поширеним антигеном, таким як ЕбВ3. Відомі численні різновиди методу конкурентного зв'язування, наприклад: твердофазний прямий чи непрямий радіоїмунний аналіз (ВІА), твердофазний прямий чи непрямий ферментативний імунологічний аналіз (ЕІА), метод сандвіч-конкуренції (дивись 5їанії єї аї., (1983)
МешШшодв5 іп Еплутоіоду 9:242); твердофазний прямий біотин-авідиновий ферментативний імунологічний аналіз (ЕЇІА) (дивись КіткКіапа еї аї., (1986) 9. Іттипої. 137:3614); твердофазний прямий радіоїзотопний аналіз, твердофазний прямий радіоізотопний сандвіч-аналіз (дивись Напом 4. І апе, (1988) Апіїбодієє: А Іарогату Мапиа!, Соїй Зргіпд Напої Ргев55); твердофазний прямий радіоїзотопний ВІА з використанням мітки 1725 (дивись Могеєї! єї аї., (1988) Мої. Іттипої. 25(1):7); твердофазний прямий біотин-авідиновий ЕІА (Специпуд еї аїЇ., (1990) Мігіоду 176:546); і прямий радіоїзотопний НВІА (МоІдепнацег еї аїЇ., (1990) бсапа. У. ІттипоїЇ. 32:77). Типово, такий аналіз передбачає використання очищеного антигену (наприклад, ЕТтЬВ3З), зв'язаного з твердою поверхнею, чи клітин, що несуть те і інше, неміченого імуноглобуліну, що тестується, і міченого контрольного імуноглобуліну. Конкурентне пригнічення оцінюється шляхом визначення кількості мітки, зв'язаної з твердою поверхнею чи клітинами в присутності імуноглобуліну, що тестується. Звичайно, імуноглобулін, що тестується, має бути присутнім в надлишку. Звичайно, коли конкуруюче антитіло присутнє в надлишку, воно буде пригнічувати специфічне зв'язування контрольного антитіла з загальним антигеном щонайменше на 50-55 95, 55-60 95, 60-65 95, 65-70 95, 70-75 95 чи більше.
Терміни "специфічне зв'язування", "специфічно зв'язує", "селективне зв'язування" і "селективно зв'язує", як вони тут використовуються, означають, що антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, демонструє помітну афінність до якогось конкретного антигену чи епітопу і, загалом, не демонструє суттєвої перехресної реактивності з іншими антигенами чи епітопами. "Помітне" чи переважне зв'язування включає зв'язування з афінністю щонайменше 106, 107, 108, 109 М" чи 1019 М". Краще, щоб афінність перевищувала 107 М", а ще краще, щоб вона перевищувала 108 М". Величини, проміжні до тих, що наведені тут, також входять в об'єм даного винаходу, і краща афінність до зв'язування може вказуватись як діапазон значень, наприклад від 1052 до 1079 М", краще від 107 до 1019
М", ще краще від 108 до 109 М". Антитіло, "яке не демонструє суттєвої перехресної реактивності", це таке антитіло, яке не буде помітно зв'язуватись з небажаною сутністю (наприклад, небажаною білковоподібною сутністю). Наприклад, в одному варіанті здійснення антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, які специфічно зв'язуються з ЕтВ3З, будуть помітно зв'язувати цю молекулу ЕГВЗ, але не будуть суттєво реагувати з іншими молекулами ЕВ і не-ЕПОВ білками чи пептидами.
Специфічне чи селективне зв'язування може оцінюватись відомими в цій галузі засобами для визначення такого зв'язування, включаючи, наприклад, аналіз за 5бсаїснагі та/або аналізи на конкурентне зв'язування.
Термін "Ко", як він тут використовується, стосується константи рівноваги дисоціації конкретної взаємодії антитіло-антиген чи афінності антитіла до антигену. В одному варіанті здійснення антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, за цим винаходом зв'язують антиген (наприклад, ЕтВЗ) з афінністю (Ко) 50 нМ чи більше (або менше) (наприклад, 40 нМ, чи 30 нМ, чи 20 нМ, чи 10 нМ, чи менше), що оцінюється за допомогою поверхневого плазмонного резонансного аналізу чи методом зв'язування клітин. В одному конкретному варіанті здійснення антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, за цим винаходом зв'язують ЕгрВЗ з афінністю (Ко) 8 нМ чи більше (наприклад, 7 нМ, 6 нМ, 5
НМ, 4 НМ, 2 нМ, 1,5 нМ, 1,4 нМ, 1,3 нМ, 1 нМ чи менше) при визначенні за допомогою поверхневого плазмонного резонансного аналізу чи методом зв'язування клітин. В інших варіантах здійснення антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, зв'язують антиген (наприклад, ЕгтВЗ) з афінністю (Ко), меншою ніж приблизно 10-7 М, такою як 10-98 М, 10- М чи 10-19 М або навіть меншою при визначенні за методикою поверхневого плазмонного резонансу (5РА) на приладі ВІАСОВЕ 3000 з використанням рекомбінантного ЕтВЗ в якості того, що визначається при аналізі, і антитіла в якості ліганду.
Зв'язування з цим попередньо визначеним антигеном відбувається з афінністю, яка щонайменше вдвічі перевищує афінність до зв'язування з неспецифічним антигеном (наприклад, В5А, казеїном), іншим ніж цей попередньо визначений антиген чи якийсь близько споріднений антиген.
Термін "Кот, як він тут використовується, стосується константи швидкості дисоціації для дисоціації антитіла з комплексу антитіло/антиген.
Термін "ЕС5О", як він тут використовується, стосується концентрації антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, яка викликає реакцію при аналізі іп міо чи іп мімо, що становить 50905 від максимальної реакції, тобто знаходиться посередині між максимальною реакцією і вихідним рівнем.
Термін "характер глікозилювання", як він тут використовується, визначається як структура вуглеводневих одиниць, ковалентно приєднаних до білку, а конкретніше до імуноглобулінового білку.
Термін "такий, що трапляється природно", як він тут використовується, у застосуванні до об'єкту стосується тієї обставини, що цей об'єкт може бути знайдений у природі. Наприклад, поліпептидна чи полінуклеотидна послідовність, що присутня в організмі (у вірусах включно), яку можна виділити з якогось джерела у природі і яку не було умисно модифіковано людиною в лабораторії, є такою, що трапляється природно.
Термін "реаранжована", як він тут використовується, стосується конфігурації локусу імуноглобуліну важкого ланцюга чи легкого ланцюга, в якому М сегмент розміщується безпосередньо суміжно з 0-) чи у) сегментом в конформації, що кодує суттєво весь домен Мн чи Мі, відповідно. Реаранжований локус гену імуноглобуліну може бути ідентифікований шляхом порівняння із зародковою ДНК; реаранжований локус буде мати щонайменше один рекомбінований гептамер/нонамерний гомологічний елемент.
Термін "нереаранжована" або "зародкова конфігурація" як він тут використовується по відношенню до М сегменту, стосується такої конфігурації, в якій М сегмент не є рекомбінованим таким чином, щоб бути безпосередньо суміжним з О чи ) сегментом.
Термін "молекула нуклеїнової кислоти", як він тут використовується, включає молекули ДНК і молекули РНК. Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюговою чи дволанцюговою, але переважно є дволанцюговою ДНК.
Термін "виділена молекула нуклеїнової кислоти", як він тут використовується по відношенню до нуклеїнових кислот, що кодують антитіла чи частини антитіл (наприклад, Мн, Мі, СОВЗ), які зв'язуються з ЕїВЗ3, стосується молекули нуклеїнової кислоти, в якій нуклеотидні послідовності, що кодують антитіло чи частину антитіла, є вільними від інших нуклеотидних послідовностей, що кодують антитіла, які зв'язують антигени, інші ніж ЕТОВ3З, причому ці інші послідовності можуть природно бути розташованими з боків нуклеїнової кислоти в геномній ДНК людини.
Термін "модифікація", як він тут використовується, стосується зміни однієї чи більше амінокислот в антитілах чи їх частинах, що зв'язують антиген. Така зміна може здійснюватись шляхом додавання, заміщення чи видалення якоїсь амінокислоти в одній чи більше позицій. Для цього використовуються відомі в цій галузі методи, такі як ПЛР мутагенез. Наприклад, в певних варіантах здійснення даного винаходу антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, ідентифіковані за допомогою способів за цим винаходом, можуть бути модифіковані, щоб тим самим модифікувати афінність до зв'язування цього антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, з ЕГОВ3З.
Даний винахід охоплює також "консервативні амінокислотні заміщення" в послідовностях антитіл за цим винаходом, тобто такі модифікації нуклеотидних і амінокислотних послідовностей, які не скасовують зв'язування антитіла, кодованого цією нуклеотидною послідовністю, чи такого, що містить цю амінокислотну послідовність, з антигеном, тобто з ЕТВ3. Консервативні амінокислотні заміщення включають заміщення амінокислоти одного класу амінокислотою того самого класу, де клас визначається загальними фізико-хімічними властивостями бокового ланцюга амінокислоти. У природі з високою частотою зустрічаються заміщення в гомологічних білках, що визначається за допомогою, наприклад, стандартної матриці частоти обміну Дайхофа чи матриці ВГОБОМ. Виділяють шість загальних класів бокових ланцюгів амінокислот: Клас І (Сув); Клас ІІ (Зег, ТАг, Рго, Аа, Спу); Клас ПІ (Авп, Азр, Сп, Сі); Клас ІМ (Ні, Ага, Гуз); Клас М (Пе, І еи, Маї, Ме); та Клас МІ (РНе, Туг, Тгр).
Наприклад, заміщення Авр на інший залишок класу І, такий як Авп, Сіп чи Сі, є консервативним заміщенням. Отже, прогнозований залишок замінної амінокислоти в анти-ЕТВ3 антитілі краще заміщувати залишком іншої амінокислоти з того самого класу. Методи ідентифікації нуклеотидних і амінокислотних консервативних заміщень, які не усувають зв'язування антигену, є добре відомими спеціалістам в цій галузі (дивись, наприклад, Вгиттеї! єї аї., Віоспет. 32:1180-1187 (1993); Корауавні еї а). Ргоїєїп Епд. 12(10):879-884 (1999); а також Вик5 еї а). Ргос. Маї. Асай. 5сі. ОБА 94:.412-417 (1997)).
Термін "неконсервативне амінокислотне заміщення" стосується заміщення амінокислоти одного класу амінокислотою з іншого класу; наприклад, заміщення Аа, залишку класу ІІ, залишком з класу ПІ, таким як Авр, Авп, Си чи Сі.
Альтернативно, в іншому варіанті здійснення, мутації (консервативні чи неконсервативні) можуть вводитись по всій кодуючій послідовності чи по частині кодуючої послідовності анти-ЕтЬВЗ антитіла, як при мутагенезі з насиченням, і отримані модифіковані анти-ЕТЬВЗ антитіла можуть бути відібрані за активністю зв'язування. "Консенсусна послідовність" - це послідовність, утворена з найпоширеніших амінокислот (чи нуклеотидів) в родині споріднених послідовностей (дивись, наприклад, М/іппакег, гот Сепев
Сіопез (МепадздезеїІзснай, М/єіпнєїт, Септапу 1987). В родині білків кожну позицію в консенсусній послідовності займає амінокислота, яка найчастіше зустрічається в цій позиції в цій родині. Якщо дві амінокислоти зустрічаються з однаковою частотою, кожна з них може включатись в консенсусну послідовність. "Консенсусній каркас" імуноглобуліну стосується каркасної ділянки в консенсусній імуноглобуліновій послідовності.
Так само, консенсусна послідовність для ділянок СОВ може бути отримана шляхом оптимального суміщення амінокислотних послідовностей СОВ антитіл ЕТЬВЗ за цим винаходом.
Для нуклеїнових кислот термін "суттєва гомологія" вказує на те, що дві нуклеїнові кислоти чи їх визначені послідовності при оптимальному суміщенні і порівнянні є ідентичними, з відповідними вставками чи делеціями, по щонайменше 80 95 нуклеотидів, звичайно по щонайменше 90-95 95, а краще по щонайменше 98-99,5 905 нуклеотидів. Альтернативно, суттєва гомологія існує тоді, коли сегменти будуть гібридизуватись за селективних умов гібридизації до комплементу ланцюга.
Відсоток ідентичності між двома послідовностями є функцією кількості ідентичних позицій, спільних для обох послідовностей (тобто, 95 гомології - кількість ідентичних позицій / загальна кількість позицій х 100), з урахуванням кількості пропусків (і довжини кожного пропуску), які необхідно було ввести для оптимального суміщення двох послідовностей. Порівняння послідовностей і визначення відсотку тотожності між двома послідовностями можуть здійснюватись за допомогою математичного алгоритму, як буде описано далі в Прикладах, що не є обмежуючими.
Відсоток ідентичності між двома нуклеотидними послідовностями можна визначити за допомогою програми САР в програмному забезпеченні СО з використанням матриці МУ/Здарапа СМР, вагового коефіцієнту пропуску 40, 50, 60, 70 чи 80 і вагового коефіцієнту довжини пропуску 1, 2, 3, 4, 5 чи 6.
Відсоток ідентичності між двома нуклеотидними чи амінокислотними послідовностями можна визначити також за допомогою алгоритму Е. Меує!з та МУ. Міег (САВІО5, 4:11-17 (1989)), який було включено до програми АГІСМ (версія 2.0), з використанням таблиці ваги залишків РАМ120, штрафу за довжину пропуску 12 і штрафу за пропуск 4. До того ж, Відсоток ідентичності між двома амінокислотними послідовностями можна визначити також за допомогою алгоритму Меедіетап і
МуШпзей (9. Мої. Віо!. (48):444-453 (1970)), який було включено до програми САР в пакеті програмного забезпечення СО, з використанням матриці Віоз5ит 62 чи матриці РАМ250О, вагового коефіцієнту пропуску 16, 14, 12, 10, 8, 6 чи 4 і вагового коефіцієнту довжини пропуску 1, 2, 3, 4, 5 чи 6.
Послідовності нуклеїнових кислот і білків за цим винаходом можуть бути використані також в якості "пошукової послідовності" для здійснення пошуку в загальних базах даних з метою, наприклад, ідентифікації споріднених послідовностей. Такі пошуки можуть здійснюватись за допомогою програм
МВІ А5Т і ХВІ А5Т (версія 2.0), описаних АїЇвсени!ї єї аї. (1990) 9. Мої. Віої. 215:403-10.
Нуклеотидні пошуки ВІ А5Т можуть здійснюватись за допомогою програми МВІ А5Т, сума балів - 100, розрядність слова - 12, щоб отримати нуклеотидні послідовності, гомологічні молекулам нуклеїнових кислот за цим винаходом. Пошуки білків ВАТ можуть здійснюватись за допомогою програми ХВІ А5Т, сума балів - 50, розрядність слова - 3, щоб отримати амінокислотні послідовності, гомологічні білювим молекулам за цим винаходом. Щоб досягти суміщень з пропусками для цілей порівняння, можна скористатись програмою Сарредй ВІ А5Т, описаною АЇйвсениї еї аї., (1997) Мисівєїс
Асіах Ве. 25(17):3389-3402. При використанні програм ВІ АТ і Сарред ВІ А5Т можна застосувати стандартні значення параметрів (значення за умовчанням) для відповідних програм (наприклад,
ХВІ АТ і МВІ АТ).
Нуклеїнові кислоти можуть бути присутніми в цілих клітинах, клітинному лізаті чи в частково очищеному або суттєво чистому вигляді. Нуклеїнова кислота є "виділеною" чи "доведеною до суттєвої чистоти", коли її очищено від інших клітинних компонентів чи інших контамінантів, наприклад інших клітинних нуклеїнових кислот чи білків, стандартними методами, включаючи обробку лугом/505 (505 - додецилсульфат натрію), С5СІ бендинг, колонкову хроматографію, електрофорез в агарозному гелі та інші методи, добре відомі спеціалістам в цій галузі (дивись Р. А!йвибеї, єї аї., ед. Сцтепі Ргоїосої!5 іп
Моїесшіаг Віоіоду, Стеепе Рибіївпіпуд апа УМіеу Іпієегвсівепсе, Мем МоїКк (1987).
Композиції нуклеїнових кислот за цим винаходом, хоча й часто в нативній послідовності (крім модифікованих сайтів рестрикції і т.п.), з КДНК, геномної ДНК чи їх сумішей можуть бути піддані мутації за стандартними методиками для отримання генних послідовностей. В разі кодуючих послідовностей такі мутації можуть впливати на амінокислотну послідовність, як це є бажаним. Зокрема, розглядаються послідовності ДНК, суттєво гомологічні нативним постійним ділянкам У, 0, У чи похідні від них, переключення та інші такі послідовності, описані тут (термін "похідна" означає, що дана послідовність є ідентичною чи модифікованою з іншої послідовності).
Термін "функціонально пов'язана" стосується послідовності нуклеїнових кислот, що знаходиться у функціональному взаємозв'язку з іншою послідовністю нуклеїнових кислот. Наприклад, ДНК для передпослідовності чи секреторної лідерної послідовності є функціонально пов'язаною з ДНК для поліпептиду, якщо вона експресується як білок-попередник, який приймає участь в секреції даного поліпептиду. Промотор чи енхансер є функціонально пов'язаними з кодуючою послідовністю, якщо він має вплив на транскрипцію цієї послідовності. Сайт зв'язування рибосоми є функціонально пов'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він позиціонований таким чином, щоб забезпечувати трансляцію.
Загалом, "функціональний зв'язок" означає, що послідовності ДНК, будучи зшитими, є суміжними і, у випадку секреторної лідерної послідовності, суміжними також у фазі зчитування. Однак енхансери не мають бути суміжними. Зшивка здійснюється шляхом лігірування на звичайних сайтах рестрикції.
Якщо такі сайти не існують, то у відповідності до звичної практики використовуються синтетичні олігонуклеотидні адаптери чи лінкери. Нуклеїнова кислота є "функціонально зв'язаною", коли її поставлено у функціональну взаємозалежність з іншою послідовністю нуклеїнових кислот. Наприклад, промотор чи енхансер є функціонально зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію цієї послідовності. По відношенню до регуляторних послідовностей транскрипції функціональний зв'язок означає, що послідовності ДНК, будучи зшитими, є суміжними їі, коли необхідно приєднати дві білкові кодуючі ділянки, суміжними також в рамці зчитування. Для послідовностей переключення функціональний зв'язок означає, що ці послідовності здатні впливати на рекомбінацію на етапі переключення.
Термін "вектор", як він тут використовується, стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою її було зшито. Одним з видів вектору є "плазміда" - кругова двонитчаста петля ДНК, в якій можуть бути зшитими додаткові сегменти ДНК. Іншим типом вектору є вірусний вектор, в якому додаткові сегменти ДНК можуть бути вшиті у вірусний геном. Певні вектори є здатними до автономної реплікації в клітині-хазяїні, в яку вони вводяться (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальне походження реплікації, і епісомні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неєепісомні вектори ссавців) можуть бути інтегрованими в геном клітини-хазяїна після інтродукції в клітину-хазяїна і, тим самим, бути включеними в реплікацію разом з геномом хазяїна. Більш того, певні вектори є здатними спрямовувати експресію генів, з якими вони функціонально поєднані. Такі вектори називаються тут "рекомбінантними векторами експресії" (або просто "векторами експресії"). Загалом, вектори експресії, які знаходять застосування в технології рекомбінантних ДНК, часто мають вигляд плазмід. Терміни "плазміда" і "вектор" можуть використовуватись взаємозамінно. Однак даний винахід включає інші види векторів експресії, такі як вірусні вектори (наприклад, дефективні щодо реплікації ретровіруси, аденовіруси і адено-асоційовані віруси), які виконують еквівалентні функції.
Термін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн"), як він тут використовується, стосується клітини, в яку було введено рекомбінантний вектор експресії. Слід розуміти, що ці терміни стосуються не тільки конкретної клітини суб'єкту, а й також потомства такої клітини. Оскільки в наступних генераціях можуть трапитись певні модифікації через мутацію чи вплив оточуючого середовища, таке потомство може, в дійсності, не бути ідентичним материнській клітині, але воно все ще включається в об'єм терміну "клітина-хазяїн", як він тут використовується.
Терміни "лікувати" і "лікування", як вони тут використовуються, стосуються терапевтичних чи профілактичних заходів, описаних тут. Способи "лікування" застосовують введення суб'єкту антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за цим винаходом, наприклад суб'єкту з хворобою чи розладом, асоційованими із залежним від ЕГТОВЗ проведенням сигналів, чи схильному до розвитку такої хвороби чи розладу, для того щоб попередити, вилікувати, відстрочити, зменшити тяжкість, пом'якшити один чи більше симптомів такої хвороби чи розладу, або зменшити частоту рецидивування хвороби чи розладу, або подовжити виживання суб'єкта зверх очікуваного за відсутності такого лікування.
Термін "хвороба, що асоціюється із залежним від ЕГТОВЗ проведенням сигналів" чи "розлад, що асоціюється із залежним від ЕГТОВЗ3 проведенням сигналів", як він тут використовується, включає патологічні стани та/або симптоми, пов'язані з патологічним станом, коли виявляються підвищені рівні
ЕбВЗ та/або активація клітинних каскадів з участю ЕптВ3. Має бути зрозумілим, що ЕгтрвЗ3 гетеродимеризується з іншими ЕВ білками, такими як ЕСЕВ і ЕїЬВ2, коли виявляються підвищені рівні ЕТОВ3. Відповідно, термін "хвороба, що асоціюється із залежним від ЕГОВЗ проведенням сигналів" включає також патологічні стани та/або симптоми, пов'язані з патологічним станом, коли виявляються підвищені рівні гетеродимерів ЕСЕВ/ЕтВЗ та/або ЕтЬВ2/ЕтВЗ3. Загалом, термін "хвороба, що асоціюється із залежним від ЕЇОВЗ3 проведенням сигналів" стосується будь-якого розладу, початок, прогресування чи персистенція симптомів якого вимагає участі Еї0В3. Показові опосередковані ЕТОВЗ розлади включають, але не обмежуються ним, наприклад рак.
Терміни "рак" чи "канцерозний" стосуються або описують фізіологічний стан у ссавців, який типово характеризується неконтрольованим ростом клітин. Приклади раку включають, не обмежуючись ними, карциному, лімфому, бластому, саркому і лейкемію. Більш конкретні приклади раку включають плоскоклітинний рак, дрібноклітинну карциному легень, недрібноклітинну карциному легень, рак шлунку, рак підшлункової залози, гліальноклітинні пухлини, такі як гліобластома і нейрофіброматоз, рак шийки матки, рак яєчнику, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак ободової кишки, меланому, колоректальний рак, карциному ендометрію, карциному слинних залоз, рак нирок, рак передміхурової залози, рак піхви, рак щитовидної залози, карциному печінки і різні види раку голови і шиї. В одному конкретному варіанті здійснення даного винаходу рак, що лікується чи діагностується з використанням способів за цим винаходом, вибирається з меланоми, раку молочної залози, раку яєчнику, світлоклітинного раку, раку шлунково-кишкового тракту/товстої кишки, раку легень і раку передміхурової залози.
Термін "ефективна кількість", як він тут використовується, стосується такої кількості антитіла чи його частини, що зв'язує ЕпВЗ3, якої достатньо для здійснення лікування, прогнозування чи діагностування хвороби, що асоціюється із залежним від ЕГОВЗ проведенням сигналів, як тут описано, коли вона вводиться суб'єкту. Терапевтично ефективна кількість буде варіювати в залежності від суб'єкту і патологічного стану, який лікується, маси тіла і віку суб'єкту, тяжкості патологічного стану, способу введення і т.п. і легко визначається спеціалістами в цій галузі. Дози для введення можуть коливатись, наприклад, від приблизно 1 нг до приблизно 10000 мг, від приблизно 5 нг до приблизно 9500 мг, від приблизно 10 нг до приблизно 9000 мг, від приблизно 20 нг до приблизно 8500 мг, від приблизно 30 нг до приблизно 7500 мг, від приблизно 40 нг до приблизно 7000 мг, від приблизно 50 нг до приблизно 6500 мг, від приблизно 100 нг до приблизно 6000 мг, від приблизно 200 нг до приблизно 5500 мг, від приблизно 300 нг до приблизно 5000 мг, від приблизно 400 нг до приблизно 4500 мг, від приблизно 500 нг до приблизно 4000 мг, від приблизно 1 мкг до приблизно 3500 мг, від приблизно 5 мкг до приблизно 3000 мг, від приблизно 10 мкг до приблизно 2600 мг, від приблизно 20 мкг до приблизно 2575 мг, від приблизно 30 мкг до приблизно 2550 мг, від приблизно 40 мкг до приблизно 2500 мг, від приблизно 50 мкг до приблизно 2475 мг, від приблизно 100 мкг до приблизно 2450 мг, від приблизно 200 мкг до приблизно 2425 мг, від приблизно 300 мкг до приблизно 2000 мг, від приблизно 400 мкг до приблизно 1175 мг, від приблизно 500 мкг до приблизно 1150 мг, від приблизно 0,5 мг до приблизно 1125 мг, від приблизно 1 мг до приблизно 1100 мг, від приблизно 1,25 мг до приблизно 1075 мг, від приблизно 1,5 мг до приблизно 1050 мг, від приблизно 2,0 мг до приблизно 1025 мг, від приблизно 2,5 мг до приблизно 1000 мг, від приблизно 3,0 мг до приблизно 975 мг, від приблизно 4,0 мг до приблизно 925 мг, від приблизно 4,5 мг до приблизно 900 мг, від приблизно 5 мг до приблизно 875 мг, від приблизно 10 мг до приблизно 850 мг, від приблизно 20 мг до приблизно 825 мг, від приблизно 30 мг до приблизно 800 мг, від приблизно 40 мг до приблизно 775 мг, від приблизно 50 мг до приблизно 750 мг, від приблизно 100 мг до приблизно 725 мг, від приблизно 200 мг до приблизно 700 мг, від приблизно 300 мг до приблизно 675 мг, від приблизно 400 мг до приблизно 650 мг, приблизно 500 мг чи від приблизно 525 мг до приблизно 625 мг антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за цим винаходом. Схеми прийому лікарського засобу можуть регулюватись таким чином, щоб забезпечувати оптимальну терапевтичну реакцію. Ефективна кількість є також такою, при якій будь-які токсичні чи ушкоджуючі ефекти (тобто, побічні ефекти) антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, мінімізуються та/або переважуються корисними ефектами.
Термін "пацієнт" включає людину та інших суб'єктів-ссавців, які приймають профілактичне чи терапевтичне лікування.
Термін "суб'єкт", як він тут використовується, включає людину чи будь-яку тварину. Наприклад, способи і композиції за цим винаходом можуть бути використані для лікування суб'єкта, що має рак. В конкретному варіанті здійснення суб'єктом є людина. Тварини, що не відносяться до людини, включають всіх хребетних, наприклад ссавців і не ссавців, таких як примати, вівці, собаки, корови, кури, амфібії, рептилії і т.д.
Термін "зразок" стосується тканини, рідини організму чи клітини від пацієнта чи суб'єкта. Звичайно, тканину чи клітину можна взяти у пацієнта, але діагностика іп мімо також мається на увазі. У випадку солідної пухлини зразок тканини може бути взятий з хірургічно видаленої пухлини і підготовлений до дослідження звичайними методами. У випадку лімфом і лейкемій можуть бути отримані і відповідно підготовлені для дослідження лімфоцити, лейкозні клітини чи лімфатичні тканини. Інші зразки від пацієнта, включаючи сечу, слізну рідину, сироватку, цереброспінальну рідину, фекалії, мокротиння, екстракти клітин і т.п., також можуть бути корисними у випадку певних пухлин.
Терміни "протираковий препарат" і "антинеопластичний препарат" стосуються лікарських препаратів, які використовуються для лікування неоплазій, таких як ракові пухлини. Медикаментозна терапія може використовуватись самостійно або в комбінації з іншими видами лікування, такими як хірургія чи променева терапія. Кілька класів лікарських препаратів можуть знайти використання в лікуванні раку в залежності від природи ураженого органу. Наприклад, рак молочної залози звичайно викликається естрогенами і може лікуватись препаратами, які інактивують ці статеві гормони. Подібно до цього, рак передміхурової залози може лікуватись препаратами, які інактивують андрогени, чоловічий статевий гормон. Протиракові препарати за цим винаходом включають, серед інших, наступні препарати:
Протираковий Коментарі Приклади препарат
А12 (повністю гуманізоване тАб)
Антитіла Антитіла, які зв'язують ІСЕ-1А 19012 (повністю гуманізоване тАбБ) (а) антитілаіншініж (рецептор інсулін подібного СР 751-871 (повністю гуманізоване тАб) анти-ЕтВЗ антитіла; фактору росту типу 1), який Н7СТ10 (гуманізоване тАБ) і (б) анти-ЕТЬВЗ експресується на поверхні аірна!АЗ (миша) антитіла, які зв'язують клітини більшості раків 5СЕМ/ЕС (миша/людина химера) різні епітопи людини. ЕМ/164 (миша)
Антитіла, які зв'язують ЕСЕН Маїйигитаь (ЕМО72000) (рецептор епідермального ЕгрїихФф / Сеїихітабр (Іпсіопе) фактору росту); Месііріх? / Рапішпитарб (Атдеп)
Мутації, які впливають на тАбр 806 експресію чи активність ЕСЕНВ, Мітоїи2гитаь (Тнегасім) можуть призводити до раку.
Антитіла, які зв'язують СМЕТ АМЕО (АМ299) (АМЕО) (мезенхімальний фактор АМмат102 (Атдеп)
епітеліального переходу); 5О5 (ОА-505) (Сепепівєсн) представник родини МЕТ рецепторних тірозинкіназ.
Анти-ЕЬВЗ антитіла, які Ар яЯ14 (ММ 121-14) описаний тут, зв'язують різні епітопи. НегсерііпФ (Тгтахти2итар; сСепепіесі) 18403; 201012 (03 Рнагта АС)
Малі молекули, ІСЕ-1АВ (рецептор інсулін ММР-АЕМУ541-А націлені на ІСЕТВ подібного фактору росту типу ВМ5-536,924 (1Н-бензоіїмідазол-2-іл)-1Н- 1), який експресується на пирідин-2-он) поверхні клітини більшості ВМ5-554,417 раків людини. Сусіоїїдап
ТАЕ226
РО401
Малі молекули, ЕСЕВ (рецептор Ігеззаф / Сепіпіб (Азіга/епеса) націлені на ЕСЕВ епідермального фактору СІ-1033 (РО 183805) (Ріїгег) росту); І арайіпір (яМу-572016) (СПахозтПНКІЇїпе)
Мутації, які впливають на ТукКкегрф / І арайіпір Ойозуїасе (ЗтіййКіІїпе експресію чи активність ЕСЕВ, Вееспат) можуть призводити до раку. Тагсемаф/ Егпіоїіпів НС. (051-774) (051
Рпапта)
РКІ-166 (Момапйів)
РО-158780
ЕКВ-569
Тугріповіїп Да 1478(4-(3-хлораніліно)-6,7- диметоксихіназолін)
Малі молекули, СМЕТ (мезенхімальний фактор РНАбЄ65752 націлені на СМЕТ епітеліального переходу); АВО 197 представник родини МЕТ рецепторних тірозинкіназ.
Антиметаболіти Антиметаболіт - це хімічна Фторурацил (5-ЕИ) сполука зі структурою, Саресйабіпе / ХЕГОБАФ (НІ К Коспе) подібною до субстанції 5-Трифторметил-2'-деоксиуридин (метаболіта), необхідноїдля Натрієва сіль метотрексату (Тгехаї|) (Ватт) нормальних біохімічних Вайійгехеа / ТотидехФф (Авігалапеса) реакцій, і все-таки достатньо Ретеїгехеа / АйтіаФтФ (І Шу) відмінною, щоб впливати на /Тедаїишг нормальні функції клітин, Цитозин арабінозид (Суїагабіпе, Ага-С) / включаючи поділ клітин. Тпіодоапіпеб (СіахозтйНКІЇїпе) 5-азацитидин б-меркаптопурин (Мегсаріоригіпе, 6-МР)
Азатіоприн / А7азапфФ (ААІРНАКМА І І С) б-тіогуанін (6-ТС) / Ригіпеєпокю (ТЕМА)
Пентостатин / МірепкіФ (Нозріга Іпс.)
Флударабіну фосфат / РІшдагафє (Вауег
Неайй Сагеє)
СіІадгіріпе (2-СаА, 2-хлордеоксиаденозин) / Ї еизіайпФ (Огпіпо Віоїтесп)
Алкилюючі препарати Алкилюючий Інгібітор рибонуклеотидредуктази (АМА) антинеопластичний препарат Циклофосфамід / Суїохап (ВМ5) - це алкилюючий агент, який Меозаг (ТЕМА) приєднує алкильну групу до Іфосфамід /Міохапаф (АЗТА Меаіса)
ДНК. Оскільки ракові клітини Тіотепа (Весіога, Абгахів, Тема) загалом проліферують ВСМОИ-» 1,3-ріб(2-хлоретил)-1- необмежено більше, ніж нітрозосечовина здорові клітини, вони єбільш ССМИ-» 1,-(2-хлоретил)-3-циклогексил-1- чутливими до ушкодження нітрозосечовина (метил ССМИ)
ДНК, і алкилюючі препарати Гексаметилмеламін (Ашеїатіпе, НММ) / використовуються в клініці для НехаіепфФ (МОЇ Рпагта Іпс.) лікування широкого кола Бусульфан / Муіегап (СіахозтНКІЇїпе) пухлин. Прокарбазин НОЇ /
Маїшіапе (Зідта Тайм Ріагптасеціїсаї!в,
Іпс.)
Дакарбазин (ОТІС)
Хлорамбуцил / І еикагапФ (ЗтіййпКіїпе
Вееспат)
Мелфалан / АІКегапфФ (сСіахозтійНКіІЇїпе)
Цисплатин (Сізріаїйпит, СООР) / Ріаїіпої (Вгівіо! Муег5)
Карбоплатин / Рагаріайіп (ВМ5)
Оксаліплатин / Еіохйапе (Запоїїі-Амепіїв
Б)
Інгібітори Інгібітори топоїзомерази - це Юохогибісіп НОЇ. / Оохіке (АІга) топоїзомерази хіміотерапевтичні препарати, ОЮаипогибісіп сігасге / бСапохоте? призначені для порушення дії (Сіїєаа) топоіїзомеразних ферментів Міюхапіюпе НОСІЇ /Момапітопе (ЕМО (топоїзомерази І і ІІ), що є Зегопо) ферментами, які контролюють Асііпотусіп Ю зміни в структурі ДНК, Еорозіде / Мерезіде (ВМ5)У/ ЕюрорпозФ каталізуючи розрив і (Нозріга, Ведіога, Тема Рагеп'іегаї!, Ес.) возз'єднання Тороївєсап НОЇ / НусатіїпФе фосфодиефірного каркасу (СіахозтіїнКіїпе) ниток ДНК під час Тепірозіде (ММ-26) / МитопФ (ВМ5) нормального клітинного циклу. Ігіпоїєсап НОСІ (СРТ-11) /
Сатріозагю (Рпагтасіа 85 Оріопп)
Препарати, націлені Мікротрубки є одним з Вінкристин / ОпсоміпФфФ (І Шу) на мікротрубки компонентів цитоскелету. Вінбластин сульфат / МеІрапф (вже не
Вони мають діаметр біля 24 випускається) (І Пу) нм і довжину від кількох Вінорелбін тартрат / МамеіІріпеФ мікрометрів до, можливо, (РієїттеРабгє) міліметрів в аксонах нервових Віндезин сульфат / ЕІдібіпефФ (І Пу) клітин. Мікротрубки слугують Паклітаксель / Тахо!Ф (ВМ5) структурними компонентами в Доцетаксель / Тахоїетеф (Запоїї Амепіїв клітинах і задіяні в багатьох США) клітинних процесах, Паклітаксель в наночастках (АВІ-007) / включаючи мітоз, цитокінезі Абгахапеф (Абгахі5 Віозсієпсе, Іпс.) везикулярний транспорт. Іхареріюпе / ІХЕМРКА "м (ВМ5)
Інгібітори кіназ Тирозинкінази є ферментами Ітаїйпір тезуїаїє / СІеємес (Момапів) всередині клітини, функція зЗипіпір таїаїе / Зщіепіф (Ріїег) яких полягає в приєднанні зогагепіб їозуЇаге / Мехамаго (Вауег) фосфатних груп до МПоїіпір пуагоспіогіде топопуагаїе / амінокислоти тирозин. ТазідпаФ (Момагів)
Блокуючи здатність протеїнтирозинкіназ функціонувати, ці сполуки є інструментом для контролю канцерозного росту клітин.
Інгібітори синтезу Викликають апоптоз клітин І -аспарагіназа / Еізраге (Мегск 4 Со.) білку
Імунотерапевтичні Індукують у онкологічних Альфа інтерферон препарати пацієнтів імунну реактивність Інгібітор ангіогенезу / АмавіїпФ (Сепепієсн)
І/-2-- Інтерлейкін 2 (АІдевієеицкіп) /
РгоїеиКіп Ф (Спігоп)
І/-12-- Інтерлейкін 12
Гормони Гормональна терапія, Тореміфен цитрат / Рагезіопб (СТУ, Іпс.) асоційована з менопаузою і Ешмевзігапі / РазіодехФф (Азіга/епеса) старінням, намагається Ваїохітепе НОЇ / ЕмівіафФ (І Шу) збільшити кількість певних Апавзігагоїе / АгітідехфФ (Азігагепеса) гормонів в організмі, щоб Ї емо201е / Ретагаф (Момапйів) компенсувати вікове чи Еадгогоїє (СС5 16949А) пов'язане з хворобою Ехетевзіапе / АготазіпФ (Рпагтасіа 8. зниження їх рівнів. Оріопп)
Гормональна терапія як Лейпролід ацетат / ЕїдагаФ (ОТ. США) лікування раку знижує рівень ГиргопФ (ТАР РВагт.) певних гормонів чи змінює Госерелін ацетат / 2о0Їадех здатність раку (Авіга/епеса) використовувати ці гормони Тпіріогеїїп ратоаїе / Тгтеістагю (Умаїзоп для росту і поширення. Ї арх)
Визегеїїйп / Зиргетаскю (Запоїї Амепії5)
Маїагеїїп
Сеїгогеїїх / СеігоїідетФ (ЕМО Зегопо)
Вісаїшатіде / СазодехФф) (Азіга/епеса)
Мішатіде / МіапагопФ (Амепіїз Рпагт.)
Мегестрол ацетат / Медасеб (ВМ5)
Аналоги соматостатину (Октреотид ацетат / Запдовіаїйпое (Момапів5))
Глюкокортикоїди Протизапальні препарати, які Преднізолон використовуються для Дексаметазон / Оесадгопе (Умуесй) зменшення набряку, що спричинює раковий біль.
Інгібітори ароматози Включають імідазоли Кетоконазол
Інгібітори тТтОВ Сигнальний шлях тТОйА було бБігоїїтив (Наратусіп) / спершу відкрито під час Варатипеф (М/уеїй) досліджень імуносупресивного Тетвігоїїтив (СС1І-779) / Тогізекю (Уууеїй) препарату рапаміцин. Цей Оегтогоїїтив (АР23573) (Агіай РНагт.) дуже консервативний Емегоїїтив5 (НАООО1) /Сепісапфб (Момагіі5) сигнальний шлях регулює проліферацію і метаболізм клітин у відповідь на дію чинників оточуючого середовища, проводячи сигнали рецептору фактору росту клітини через фосфоінозитид-3-кіназу (РіІ-
ЗК) для клітинного росту, проліферації і ангіогенезу.
Хіміотерапевтичні Адріаміцин, 5-Фторурацил, Цитоксин, препарати Блеоміцин, Мітоміцин С, Дауноміцин,
Карміноміцин, Аміноптерин,
Дактиноміцин, Мітоміцини, Еспераміцини
Один чи більше протиракових препаратів можуть вводитись одночасно з введенням антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за цим винаходом, до такого введення чи після нього.
Різні аспекти даного винаходу описуються більш докладно в наступних підрозділах.
ІІ. Способи отримання антитіл за цим винаходом () Моноклональні антитіла
Моноклональні антитіла за цим винаходом можуть бути отримані за допомогою різних відомих методів, таких як стандартний метод гібридизації соматичних клітин, описаний Копіег і Міївієїп (1975)
Маїшге 256: 495, вірусна чи онкогенна трансформація В лімфоцитів чи метод фагового дисплею з використанням бібліотек генів антитіл людини. В певних варіантах здійснення даного винаходу такі антитіла є повністю моноклональними антитілами людини.
Відповідно, в одному варіанті здійснення, для отримання антитіла, яке зв'язує ЕгВЗ, використовується гібридомний метод. За цим методом мишу чи іншу відповідну тварину-хазяїна імунізують відповідним антигеном, щоб отримати лімфоцити, які продукують чи здатні продукувати антитіла, що специфічно зв'язуються з тим антигеном, який було використано для імунізації. Як варіант, лімфоцити можуть бути імунізовані іп міо. Потім лімфоцити можуть бути злиті з мієломними клітинами, для чого використовується відповідний фактор, що викликає злиття клітин, такий як поліетилен гліколь, з утворенням клітини гібридоми (Сюодіпа, Мопосіопа! Апіїродієв: Ргіпсірієїх апа
Ргасіїсе, рр.59-103 (Асадетіс Ргев5, 1986)). Культуральне середовище, в якому вирощуються клітини гіоридоми, досліджують на продукцію моноклональних антитіл, спрямованих проти даного антигену.
Після ідентифікації клітин гібридоми, що продукують антитіла бажаної специфічності, афінності та/або активності, відповідні клони можуть бути субклоновані методами серійного розведення і можуть вирощуватись стандартними методами (Содіпд, Мопосіопа! Апіібодіев:Ргіпсіріеєз апа Ргасіїсе, рр. 59- 103 (Асадетіс Ргезз, 1986)). Придатні для цієї мети культуральні середовища включають, наприклад, 0О-МЕМ чи середовище КРМІ-1640. Крім того, клітини гібридоми можуть вирощуватись іп мімо як асцитні пухлини у тварини. Моноклональні антитіла, секретовані такими субклонами, можуть біти відділені від культурального середовища, асцитної рідини чи сироватки звичайними методами очистки імуноглобуліну, такими як, наприклад, протеїн А-Сефарозна, гідроксилапатитна хроматографія, гель- електрофорез, діаліз чи афінна хроматографія.
В іншому варіанті здійснення антитіла і частини антитіл, що зв'язують ЕТЬВЗ, можуть бути виділені з фагових бібліотек антитіл, створених з використанням методів, описаних, наприклад, МеСанепу еї а!., Майте, 348:552-554 (1990). Сіасквоп еї аї., Майте, 352:624-628 (1991), Магкз еї аї., У. Мої. Віо)., 222:581-597 (1991) та Нові евї а! (2005) Маїшге ВіоїесппоЇІоду 23, 344-348; патенти США МоМо 5,223,409; 5,403,484; і 5,571,698, видані І адпег єї аІх; патенти США МоМо 5,427,908 і 5,580,717, видані Оомег вї аї.; патенти США МоМо 5,969,108 і 6,172,197, видані МеСанепу еї а); і патенти США МоМо 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 і 6,593,081, видані Сиійнйне5 єї аіЇ... Додатково, може бути використана також продукція антитіл людини з високою афінністю (нМ діапазон) за допомогою перестановки ланцюгів (Магкз еї аї!., Віо/ТесппоіІоаду, 10:779-783 (1992)), а також комбінаторної інфекції і рекомбінації іп мімо як стратегії для створення дуже великих фагових бібліотек (УУаіегпоизе еї аї.,
Мис. Асід5. Нев., 21:2265-2266 (1993)).
В одному конкретному варіанті здійснення моноклональне антитіло чи його частина, що зв'язує
ЕІбВЗ, отримується за допомогою методу фагового дисплею, описаного Новєї еї аї!., зхирга. Цей метод передбачає генерацію бібліотеки баб людини, що містить унікальну комбінацію імуноглобулінових послідовностей, виділених від донорів-людей, із забезпеченою синтезом різноманітністю ділянок СОВ важкого ланцюга. З цієї бібліотеки потім вибирають Раб», які зв'язуються з ЕТЬВ3.
В ще іншому варіанті здійснення моноклональні антитіла людини, спрямовані проти Е"0В3, можуть бути отримані з використанням трансгенних чи трансхромосомних мишей, які несуть швидше частини імунної системи людини, ніж систему миші (дивись, наприклад, І опрего, єї а!. (1994) Майте 368(6474): 856-859; І опрегу, М. еї аї. (1994), вирга; рецензовану в книзі Гопрега, М. (1994) НапароокК ої
Ехрептепіа! Рпаптасоїіоду 113:49-101; І опрега, М. апа Низлаг, 0. (1995) Іпіет. Нем. Іттипої. 13: 65- 93, а також Нагаїпо, Р. ії Гопрего, М. (1995) Апп. М.У. Асад. 5сі. 764:536-546. Дивись також патенти
США МоеоМео 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; і 5,770,429; всі видані Гопрегуд і Кау; патент США Мо 5,545,807, виданий Зигапі єї аї.; публікації РОСТ МоМо МО 92/03918, МО 93/12227, МО 94/25585, МО 97/13852, МО 98/24884 і МО 99/45962, всі від І опрего і Кау; і публікацію РОСТ Мо М/О 01/14424 від Коттап ев! аї.).
В іншому варіанті здійснення антитіла людини за цим винаходом можуть бути отримані з використанням миші, яка несе імуноглобулінові послідовності людини на трансгенах і трансхромосомах, такої як миша, яка несе трансген важкого ланцюга людини і трансхромосому легкого ланцюга людини (дивись, наприклад, публікацію РСТ МО 02/43478 від Івпіда еї аї.).
Відомі в цій галузі альтернативні системи на трансгенних тваринах, що експресують імуноглобулінові гени людини, також можуть бути використані для отримання анти-ЕгЬВЗ антитіл за цим винаходом. Наприклад, можна скористатись альтернативною трансгенною системою під назвою
Хепотоизе (Ардепіх, Іпс.); такі миші описані, наприклад, в патентах США МоМо 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 і 6,162,963, виданих КисПепараї! єї аї.
Більш того, відомі в цій галузі альтернативні трансхромосомні системи у тварин, що експресують імуноглобулінові гени людини, також можуть бути використані для отримання анти-ЕгЬВ3З антитіл за цим винаходом. Наприклад, можуть бути використані миші, що несуть і трансхромосому важкого ланцюга людини, і трансхромосому легкого ланцюга людини, як описано ТотігикКа еї а!. (2000) Ргос.
Май. Асай. сі. ОБА 97:722-727. Крім того, описані корови, що несуть трансхромосоми важкого і легкого ланцюга людини (Кигоїма сеї аї!. (2002) Маїшге Віоїеєсппоіоду 20:889-894), які теж можуть бути використані для отримання анти-ЕгЬВЗ антитіл за цим винаходом.
В ще іншому варіанті здійснення антитіла за цим винаходом можуть бути отримані за допомогою трансгенної рослини та/або культивованих клітин рослини (такої як, наприклад, тютюн, кукурудза і ряска), які продукують такі антитіла. Наприклад, листя трансгенного тютюну, що експресує антитіла чи його частини, що зв'язують антиген, може бути використане для отримання таких антитіл за допомогою, наприклад, індукованого промотору (дивись, наприклад, Статег єї аї., Ст. Тор. Місгобо!).
Іттипої. 240:95 118 (1999)). Трансгенна кукурудза також може бути використана для експресії таких антитіл і їх частин, що зв'язують антиген (дивись, наприклад, Ноооа еї аї., Адм. Ехр. Меа. Віої. 464:127 147 (1999)). Антитіла можуть отримуватись у великих кількостях також з насіння трансгенних рослин, включаючи частини антитіл, такі як одноланцюгові антитіла (5сЕму5), наприклад, при використанні насіння тютюну і бульб картоплі (дивись, наприклад, Сопгай еї аї., Ріапі Мої. Віої. 38:101 109 (1998)).
Методи отримання антитіл чи їх частин, що зв'язують антиген, з рослин описані також в інших джерелах, наприклад Різспег єї аї., Віоїесппої. Аррі. Віоспет. 30:99 108 (1999), Ма еї аї., Геепав
Віотесппої. 13:522 7 (1995); Ма еї аї., Ріапі Рпузіої. 109:341 6 (1995); М/піеіат еї аї!., Віоспет. бос.
Ткапв. 22:940 944 (1994) та патенти США МомМо 6,040,498 і 6,815,184.
Специфічність зв'язування моноклональних антитіл чи їх частин, що зв'язують ЕТВЗ, отриманих будь-яким способом, включаючи способи, описані тут, може бути визначена за допомогою методу імунної преципітації або аналізу зв'язування іп міїго, такого як радіоімунологічне дослідження (АВІА) чи твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІ5ЗА). Афінність моноклонального антитіла чи його частини до зв'язування можна оцінити за допомогою аналізу бсаїснага (Мипзоп еї аї., Апаї!. Віоспет., 107220 (1980)).
В певних варіантах здійснення даного винаходу антитіло ЕГОВЗ чи його частина, отримані будь- яким з описаних вище методів, можуть бути піддані подальшим змінам чи оптимізації для досягнення бажаної специфічності зв'язування та/або афінності, для чого можуть бути використані методи, відомі в цій галузі, такі як описані тут.
В одному варіанті здійснення для отримання структурно і функціонально споріднених антитіл можуть бути використані часткові послідовності антитіла, похідні від антитіла ЕтВ3. Наприклад, антитіла взаємодіють з цільовими антигенами головним чином через амінокислотні залишки, які знаходяться на шести ділянках, що визначають комплементарність (СОВ), важкого і легкого ланцюгів.
З цієї причини амінокислотні послідовності в межах СОВА більше відрізняються між окремими антитілами, ніж послідовності поза СОВ. Оскільки послідовності СОВ є відповідальними за більшість взаємодій антитіло-антиген, то існує можливість експресії рекомбінантних антитіл, які імітують властивості специфічних антитіл природного походження, якщо створити вектори експресії, які включають послідовності СОМ від специфічного антитіла природного походження, перенесені на каркасні послідовності від іншого антитіла з іншими властивостями (дивись, наприклад, Віесптапти, Ї. еї а!., 1998, Маїште 332:323-327; допез, Р. єї аї!., 1986, Маїште 321:522-525; та Оцееп, б. еї аї., 1989,
Ргос. Маї). Асад. беє. Ш.5.А. 86:10029-10033). Такі каркасні послідовності можна отримати із загальних баз даних щодо ДНК, які включають зародкові послідовності гену антитіла.
Отже, одна чи більше структурні особливості анти-ЕГтЬВЗ антитіла за цим винаходом, такі як СОВА, можуть бути використані для створення структурно споріднених анти-ЕтВЗ антитіл, які зберігають щонайменше одну функціональну властивість антитіл за цим винаходом, наприклад властивість пригнічувати опосередковану ЕСЕ-подібним лігандом фосфориляцію ЕгОВ3З; властивість пригнічувати опосередковане одним чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну проведення сигналів через ЕгЬВ3З; властивість пригнічувати проліферацію клітин, що експресують ЕгЬВЗ; та/або властивість знижувати рівні ЕГОВЗ на поверхні клітин.
В одному конкретному варіанті здійснення одна чи більше ділянок СОВ, вибраних з БЕО ІЮО Мо:7- 12, ЗЕО 10 Мое:13-18, 5ЕО 10 Мо119-24, 5ЕО ІО Мо:39-44, апа 5ЕО ІО Мое:45-50, рекомбінантно комбінуються з відомими каркасними ділянками і ділянками СОК людини для створення додаткових, рекомбінантно сконструйованих анти-ЕТВЗ антитіл за цим винаходом. Варіабельні каркасні ділянки важкого і легкого ланцюгів можуть отримуватись з тієї самої або з різних послідовностей антитіла.
Спеціалістам в цій галузі добре відомо, що домени СОВЗ важкого і легкого ланцюгів антитіла відіграють особливо важливу роль в специфічності зв'язування/афінності антитіла щодо антигену (дивись Наї! еї аї., у. Ітипої., 149:1605-1612 (1992); Роїутепів еї аї., У. Іттипої., 152:5318-5329 (1994);
Уанп еї аї., ІттипоБбіоі., 193:400-419 (1995); КіїткКа еї а!., Вії. У. Сапсег, 83:252-260 (2000); Веїроеєг єї а!., У. Мої. Віої, 296:833-849 (2000); Надег єї аї., Ргос. Маї!. Асад. Зсі. ОБА, 95:8910-8915 (1998); Ваграв ей а), У. Ат. Сет. 5Бос., 116:2161-2162 (1994); Оіїшеї еї аїЇ., У. Іттипої., 157:739-749 (1996).
Відповідно, в певних варіантах здійснення генеруються антитіла, які включають СОВЗ важкого та/або легкого ланцюга конкретних антитіл, описаних тут (наприклад, 5ЕО ІО Мо:9, 15, 21, 41, 47 та/або 5ЕО
ІО Мо:12, 18, 24, 44, 50). Такі антитіла можуть додатково включати СОВІ1 та/або СОВ2 важкого та/або легкого ланцюга антитіл за цим винаходом (наприклад, 5ЕО ІО Мое:7-8 та/"або 5ЕО ІО Ме:10-11; 5ЕО І
Мо:13-14 та/або 5ЕО ІЮО Мое:16-17; 5ЕО 10 Мо:20-21 та/або 5ЕО ІЮ Мо:22-23; 5ЕО ІО Мо:39-40 та/"або 5ЕО
ІО Ме:42-43; ог 5ЕО ІЮ Мо:45-46 та/або 5ЕО І Мо:48-49).
Ділянки СОВА, 2, та/або 3 описаних вище сконструйованих антитіл можуть включати точну амінокислотну послідовність (послідовності), як та, що описана тут (наприклад, ділянки СОМ АБ Моб,
Ар Ме3, АБ Мо14, АБ Мо17 чи АБ Ме19, показані в 5ЕО ІО Мое:7-12, 13-18, 19-24, 39-44 і 45-50,
відповідно). Однак спеціалістам в цій галузі має бути очевидно, що можливі певні відхилення від точних послідовностей СОВА при збереженні здатності такого антитіла ефективно зв'язувати ЕТВЗ (наприклад, консервативні амінокислотні заміщення). Відповідно, в іншому варіанті здійснення, сконструйоване антитіло може включати одну чи більше ділянок СОН, які є, наприклад, на 90 95, 95 Об, 98 95, 99 95 чи 99,5 95 ідентичними одній чи більше ділянок СОН АБ Моб, АБ МеЗ чи АБ Ме14.
В іншому варіанті здійснення один чи більше залишків СОВА можуть бути змінені з метою модифікувати зв'язування для досягнення більш сприятливої швидкості зв'язування. У такий спосіб можна створити антитіло, що має надвисоку афінність до зв'язування, наприклад 1092 М" чи більше.
Методи дозрівання афінності, добре відомі в цій галузі і ті, що описані тут, можуть бути використані для того, щоб змінити ділянку (ділянки) СОВ і відібрати серед отриманих молекул ті, які демонструють бажану зміну щодо зв'язування. Відповідно, коли ділянки СОВА змінюються, зміни в афінності зв'язування, а також в імуногенності можуть контролюватись і оцінюватись таким чином, щоб отримане антитіло було оптимізованим щодо найкращої комбінації зв'язування і низької імуногенності.
На додачу до модифікацій в ділянках СОВ, чи замість них, модифікації можуть вноситись також в одну чи більше каркасних ділянок ЕВ, ЕВ2, ЕВЗ і ЕН4 варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюга антитіла, якщо ці модифікації не знищують афінність цього антитіла до зв'язування.
В іншому варіанті здійснення антитіло модифікується далі у відношенні ефекторної функції з тим, щоб посилити ефективність цього антитіла, наприклад в лікуванні раку. Так, в ділянку Ес може бути введений цистеїнів залишок (залишки), що забезпечує утворення на цій ділянці дисульфідного зв'язку між ланцюгами. Гомодимерне антитіло, яке створюється при цьому, може мати поліпшену здатність до інтерналізації та/"або посилені опосередкований комплементом лізис клітин і залежну від антитіла клітинну цитотоксичність (АОСС). Дивись Сагоп вї аї!., у). Ехр Мед. 176:1191-1195 (1992) апа 5Норез, В.
У. Іттипої. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерні антитіла з посиленою протипухлинною активністю можуть бути отримані також з використанням гетеробіфункціональних крослінкерів, як описано в статті
МО! єї а. Сапсег Везеатгси 53:2560-2565 (1993). Як варіант, можна сконструювати антитіло, що має подвійні ділянки Ес і, відповідно, посилену здатність щодо опосередкованого комплементом лізису клітин і залежної від антитіла клітинної цитотоксичності (АОСС). Дивись біємепзоп еї аї. Апіі-Сапсег
Огид Оеєзідп 3:219-230 (1989).
Даний винахід охоплює також біспецифічні антитіла та імунокон'югати, як докладніше буде описано далі. (ії) Біспецифічні антитіла
Біспецифічні антитіла за цим винаходом включають щонайменше одну специфічність зв'язування для ЕїВЗ і щонайменше одну специфічність зв'язування для іншого антигену, такого як продукт онкогену. Біспецифічні антитіла можуть бути отримані як антитіла повної довжини або як фрагменти антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла Е(аб'г).
Методи отримання біспецифічних антитіл є добре відомими в цій галузі (дивись, наприклад, публікації УМО 05117973 і МО 06091209). Наприклад, отримання біспецифічних антитіл повної довжини може базуватись на коекспресії двох пар важкий ланцюг-легкий ланцюг імуноглобуліну, причому ці два ланцюги мають різні специфічності (дивись, наприклад, Міїївїєїп еї а!., Маїшге, 305:537- 539 (1983)). Більш докладний опис отримання біспецифічних антитіл можна знайти, наприклад, в таких джерелах, як Зигевзі еї а!., Меїподвз іп Епгутоіоду, 121:210 (1986) та Вгеппап еї аї., Зсієпсе, 229: 81 (1985), в яких описано процес хімічного зв'язку для отримання біспецифічних антитіл. Описані також різні методи для отримання і виділення фрагментів біспецифічних антитіл безпосередньо з культури рекомбінантних клітин. Наприклад, біспецифічні антитіла отримувались з використанням лейцинових "блискавок" (дивись, наприклад, Ковієїпу єї аї., У. Іттипої., 148(5):1547-1553 (1992)).
Повідомлялось також про іншу стратегію отримання фрагментів біспецифічних антитіл з використанням одноланцюгових димерів Ем (5Ем) (дивись, наприклад, Стирег єї аї., у. Іттипої., 152:5368 (1994)).
В одному конкретному варіанті здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло включає перше антитіло або його зв'язувальну частину, яка зв'язує ЕТЬВЗ, і друге антитіло або його зв'язувальну частину, яка зв'язується з ЕТОВ2, ЕВЬБВЗ, ЕтЬВ4, ЕСЕНВ, ІСЕ1-В, О-МЕТ, І емі5 М, МОС-1, ЕрСАМ,
СА125, специфічним мембранним антигеном передміхурової залози, РОСЕВН-а, РОСЕВ-В, С-КІТ або будь-яким з РСЕ рецепторів. (ії) Імунокон'югати
Імунокон'югати за цим винаходом можуть бути отримані шляхом кон'югації описаних тут антитіл чи їх частин, що зв'язують антиген, з іншим терапевтичним препаратом. Відповідні препарати включають, наприклад, цитотоксичний препарат (наприклад, хіміотерапевтичний препарат), токсин (наприклад, ферментативно активний токсин бактеріального, грибкового, рослинного чи тваринного походження або його фрагменти) та/або радіоактивний ізотоп (тобто, радіокон'югат). Хіміотерапевтичні препарати, придатні для використання в отриманні таких імунокон'югатів, були описані раніше. Придатні для використання ферментативно активні токсини і їх фрагменти включають А ланцюг дифтерії, незв'язувальні активні фрагменти дифтерійного токсину, А ланцюг екзотоксину (від Рзендотопав аегидіпоза), А ланцюг рицину, А ланцюг абрину, А ланцюг модецину, альфа-сарцин, білки АіІєшйев тогаї, білки діантину, білки Рнуіаса Атегісапа (РАРІ, РАРІЇ ї РАР-5), інгібітор тотогаїса сНагапіа, курцин, кротин, інгібітор зараопагіа ойісіпаїї5, гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин і трикотецени. Для отримання радіокон'югованих анти-ЕВЗ3 антитіл підходить широке коло радіонуклідів. Приклади включають 272ВІ, 1911, 191|п, 0 і 186 Де.
Імунокон'юЮгати за цим винаходом можуть бути отримані з використанням широкого кола біфункціональних білкових зв'язувальних агентів, таких як М-сукцинімідил-3-(2-пирідилдитіол) пропіонат (5РОР), імінотіолан (ІТ), біфункціональних похідних імідоефірів (таких як диметиладипімідат
НОЇ), активних ефірів (таких як дисукцинімідил суберат, альдегідів (таких як глютаральдегід), сполук
Бів-азидо (таких як бБіз(р-азидобензоїл) гександиамін), похідних бБів-диазонію (таких як бів-(р- диазонійбензоїл)-етилендиамін), похідних диазонію (таких як диазонійбензоїл)-етилендиамін), диіїзоціанатів (таких як толуол 2,6-диізоціанат). Наприклад, рициновий імунотоксин можна отримати, як описано в Мйена еї аїЇ., Зсіеєпсе 238: 1098 (1987). Мічена вуглецем-14 1-ізотіоціанатобензил-3- метилдиетилен триамінпентаоцтова кислота (МХ-ОТРА) є показовим хелатоутворюючим агентом для кон'югації радіонуклеотиду до антитіла (дивись, наприклад, УУО94/11026).
ПІ. Методи відбору антитіл за цим винаходом
Після отримання антитіл чи їх частин, що зв'язують Е/бВЗ, такі антитіла чи їх частини мають пройти відбір за різними властивостями, такими як описані тут, з використанням численних аналізів, які є добре відомими в цій галузі.
В одному варіанті здійснення даного винаходу антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, проходять відбір на здатність пригнічувати опосередковану ЕсСЕ-подібним лігандом фосфориляцію
ЕбВ3. Це можна здійснити, обробивши клітини, що експресують ЕтВ3, ЕСЕЕ-подібним лігандом в присутності і за відсутності даного антитіла чи його частин, що зв'язують антиген. Потім ці клітини піддають лізису, і неочищені лізати центрифугують, щоб видалити нерозчинний матеріал.
Фосфориляцію ЕпВЗ3 можна оцінити за допомогою, наприклад, вестерн блотингу з наступним дослідженням анти-фосфотирозиновим антитілом, як описано в Кіт еї а!Ї., вирга і в подальших
Прикладах.
В інших варіантах здійснення антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, піддаються подальшому відбору за однією чи більше з наступних властивостей: (1) здатність пригнічувати опосередковане ЕгрВЗ-лігандом (наприклад, херегуліном, епірегуліном, епігеном чи бірегуліном) проведення сигналів через ЕгбВ3З; (2) здатність пригнічувати проліферацію клітин, що експресують
ЕбВЗ; (3) здатність знижувати рівні ЕТОВ3З на поверхнях клітин (наприклад, викликаючи інтерналізацію
ЕбВЗ); (4) здатність пригнічувати секрецію МЕСЕ клітинами, що експресують ЕгЬВЗ; (5) здатність пригнічувати міграцію клітин, що експресують ЕгбВ3; (б) здатність пригнічувати сфероїдальний ріст клітин, що експресують ЕгЬВ3; та/або (7) здатність зв'язуватись з епітопом, що розміщується на домені
І ЕТ6В3. Кожну з цих властивостей можна легко оцінити за допомогою методів, відомих в цій галузі, і тих, що описані тут.
Пригнічення опосередкованого одним чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну проведення сигналів через ЕбВЗ3 можна легко оцінити за допомогою рутинних аналізів, таких як описані в Ногзї єї аЇ. вирга. Наприклад, здатність антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, пригнічувати опосередковане херегуліном, епірегуліном, епігеном чи бірегуліном проведення сигналів через ЕТВЗ можна оцінити за допомогою аналізів активності кінази щодо відомих субстратів ЕГОВЗ, таких як, наприклад, 5НО і РІЗК, як описано, наприклад, в Ногві єї аї. зирга, 5цидо еї аї., (2000) Меїнодз
Епгутої, 322:388-92; апа Могдап еї аї. (1990) Єиг. У. Віоспет., 191:761-767, після стимуляції одним чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну. Відповідно, клітини, що експресують ЕГЬВЗ, можуть стимулюватись одним чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну та інкубуватись з антитілом-кандидатом чи його частиною, що зв'язує антиген.
Отримані з таких клітин лізати можуть бути піддані імунопреципітації антитілом до субстрату ЕГОВЗ (або білку на шляху клітинного метаболізму за участі ЕТВЗ), такого як, наприклад, анти-)МК-1 антитіло, і досліджені на активність кінази (наприклад, активність МК кінази чи активність РіІЗ-кінази) за допомогою методів, відомих в цій галузі. Зниження рівня чи повне зникнення активності (наприклад, активності кінази) субстрату ЕТОВЗ чи білку на шляху клітинного метаболізму за участі ЕТВЗ3 в присутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, по відношенню до рівня активності за відсутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, є свідченням того, що це антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, пригнічує опосередковане одним чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну проведення сигналів.
В певних варіантах здійснення даного винаходу антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, пригнічує опосередковане ЕпВЗ-лігандом (наприклад, херегуліном, епірегуліном, епігеном чи бірегуліном) проведення сигналів, зменшуючи зв'язування одного чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну з ЕВЬБВ3З.
Для того, щоб відібрати ті антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, які пригнічують зв'язування одного чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну з ЕВЬВЗ, клітини, що експресують
ЕТЬВЗ (наприклад, клітини МАЇ МЕ-ЗМ, як описано в Прикладах далі), можуть бути приведені в контакт з міченим ЕгбВЗ-лігандом (наприклад, радіоактивно міченим херегуліном, епірегуліном, епігеном чи бірегуліном) за відсутності (контроль) чи в присутності анти-ЕГтВЗ антитіла чи його частини, що зв'язує антиген. Якщо антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, пригнічує зв'язування херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну з ЕГОВ3З, то буде спостерігатись статистично достовірне зменшення кількості відновленої мітки (наприклад, радіоактивно міченого херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну) по відношенню до кількості за відсутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген.
Антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, можуть пригнічувати зв'язування щ ЕгбВЗ-ліганду (наприклад, херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну) будь-яким механізмом. Наприклад, антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, можуть пригнічувати зв'язування ЕгбВЗ-ліганду (наприклад, одного чи більше з херегуліну, епірегуліну, епігену чи бірегуліну) до ЕТВЗ за рахунок зв'язування до того самого сайту чи сайту, що накладається, на ЕТВЗ, що й ЕВ3З ліганд. Як варіант, антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, можуть пригнічувати зв'язування ЕгВЗ-ліганду, змінюючи чи спотворюючи конформацію ЕТЬВЗ, що робить його нездатним зв'язуватись з ЕТВЗ лігандом.
Антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, які знижують рівні ЕГОВ3З на поверхні клітин, можуть бути ідентифіковані за їх здатністю регулювати на пониження ЕГТЬВЗ на пухлинних клітинах. В певних варіантах здійснення антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, зменшують поверхневу експресію клітинами ЕгГеВ3З за рахунок індукції інтерналізації (чи збільшення ендоцитозу) ЕТВ3. Щоб довести це,
ЕбВЗ може бути біотинильованим, і кількість молекул ЕТВЗ на поверхні клітин може бути легко визначена, наприклад шляхом визначення кількості біотину на моношарі клітин в культурі в присутності чи за відсутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, наприклад як описано у
Муаїеттап еї аї!., 9. Віої. Снет. (1998), 273:13819-27, наступної імунопреципітації ЕТВ3З і дослідження стрептавідином. Зниження виявлення біотинильованого ЕГТЬВЗ з часом в присутності антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, є свідченням того, що дане антитіло знижує рівні ЕГОВЗ на поверхні клітин.
Антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом можуть бути досліджені на здатність пригнічувати проліферацію клітин, що експресують ЕГОВ3З, наприклад пухлинних клітин, за допомогою відомих в цій галузі методів, таких як аналіз збудженої флуоресценції сортованих клітин, описаний в Прикладах далі (дивись також, наприклад, Масаїїап єї аї., Ргос. Май. Асай. 5сі. (1998) 20:95(2):708-13; Реге? вї а!. (1995) Сапсег Везєагсі 55, 392-398).
В іншому варіанті здійснення антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, відбираються за здатністю пригнічувати секрецію МЕСЕ клітинами, що експресують ЕТВ3. Це можна здійснити за допомогою добре відомих аналізів, таких як аналіз з використанням набору МЕСЕ ЕГІБЗА від фірми
ВО бувієтв (США, кат. МеОУ293В). Подібно до цього, антитіла чи їх частини можуть відбиратись за здатністю пригнічувати міграцію клітин, що експресують ЕптВ3 (наприклад, клітин МОСЕ-7) з використанням транс-лункового аналізу (МіПіроге Согр., США, кат. Мо ЕСМ552), як його тут описано.
В іншому варіанті здійснення даного винаходу антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, відбираються за здатністю пригнічувати сфероїдальний ріст клітин, що експресують ЕГОВ3. Це можна здійснити за допомогою аналізу, який апроксимує умови розвитку пухлинного росту (дивись, наприклад, Нептагп евї а!. (2007) дошитаї ої Віотоіесціаг 5стеєпіпуд ЕІесітопіс рибіїсайіоп), як тут описано.
Антитіла чи їх частини, що зв'язують антиген, можуть зв'язуватись з тим самим епітопом чи з епітопами, що накладаються, оскільки одне чи більше антитіл за цим винаходом можуть бути ідентифіковані також за допомогою стандартних методів, відомих в цій галузі і описаних тут.
Наприклад, для того, щоб відібрати антитіла, які зв'язуються з тим самим епітопом чи з епітопом, що накладається, на ЕпВ3, зв'язаному досліджуваним антитілом, може бути використаний епітоп- перехресний конкурентний аналіз, такий як описаний в книзі Апііродіеєз, А І арогаїюгу Мапиаї, Соїа зЗрііїпду Нагбог І арогаїогу, Еа Напом 4 Оаміад І апе (1988).
ІМ. Фармацевтичні композиції
В іншому аспекті даний винахід стосується композиції, наприклад фармацевтичної композиції, яка містить одне моноклональне антитіло чи комбінацію моноклональних антитіл або їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом, разом з фармацевтично прийнятним носієм. В одному варіанті здійснення такі композиції включають комбінацію з кількох (наприклад, двох чи більше) окремих антитіл за цим винаходом, які зв'язують різні епітопи на ЕТОВ3З.
Термін "фармацевтично прийнятний носій", як він тут використовується, включає будь-який і всі розчинники, середовища для диспергування, покриття, антибактеріальні і антифунгальні препарати, ізотонічні агенти, агенти, що уповільнюють всмоктування, і т.п., що є фізіологічно сумісними.
Переважно, такий носій є придатним для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, парентерального, спинального чи епідермального введення (наприклад, у вигляді ін'єкції чи інфузії). В залежності від шляху введення, активна сполука, тобто антитіло, біспецифічна чи мультиспецифічна молекула, може бути покрита матеріалом, який захищає її від дії кислот та інших природних умов, здатних інактивувати цю сполуку.
"Фармацевтично прийнятна сіль" стосується солі, яка зберігає бажану біологічну активність материнської сполуки і не чинить будь-яких небажаних токсикологічних ефектів (дивись, наприклад,
Вегає, 5.М., єї аїІ. (1977) У. РНнапт. сі. 66:1-19). Приклади таких солей включають солі, отримані шляхом додавання кислоти, і солі, отримані шляхом додавання основи. Солі приєднання кислоти включають ті, що походять від нетоксичних неорганічних кислот, таких як соляна, азотна, фосфорна, сірчана, бромисто-воднева, йодисто-воднева, фосфориста і т.п., а також від нетоксичних органічних кислот, таких як аліфатичні моно- і дикарбонові кислоти, феніл-заміщені алканові кислоти, гідроксиалканові кислоти, ароматичні кислоти, аліфатичні і ароматичні сильфонові кислоти і т.п. Солі приєднання основи включають ті, що походять від лужноземельних металів, таких як натрій, калій, магній, кальцій і т.п., а також від нетоксичних органічних амінів, таких як М, М'-дибензилетилендиамін,
М-метилглюкамін, хлорпрокаїн, холін, диетаноламін, етилендіамін, прокаїн і т.п.
Фармацевтичні композиції за цим винаходом можуть вводитись окремо чи в складі комплексної терапії, тобто в комбінації з іншими препаратами. Наприклад, така комплексна терапія може включати композицію за цим винаходом і щонайменше один чи більше додатковий терапевтичний препарат, такий як протиракові препарати, які будуть описані далі. Фармацевтичні композиції за цим винаходом можуть також вводитись у поєднанні з променевою терапією та/або хірургією.
Композиція за цим винаходом може вводитись різними способами, відомими в цій галузі. Як має бути зрозуміло спеціалістам, шлях та/або спосіб введення будуть залежати від бажаних результатів.
Активні сполуки можуть бути доповнені носіями, які захищають їх від швидкого вивільнення, як це має місце в препаратах з контрольованим вивільненням, включаючи імплантати, трансдермальні накладки і мікроінкапсульовані системи доставки. Для цього можуть використовуватись біосумісні полімери, що біологічно розкладаються, такі як етилен вінілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, поліортоефіри і полімолочна кислота (полімер молочної кислоти). Спеціалістам в цій галузі відомо багато методів приготування таких препаратів, в тому числі і запатентованих. Дивись, наприклад,
Зивіаіпед апа Сопігоєд Реїеазе Огиа Овєїїмегу Зузіетв, У.В. Вобіпзоп, ед., Магсе! ОеккКег, Іпс., Мем мок, 1978.
Щоб ввести сполуку за цим винаходом певними шляхами введення може знадобитись покрити цю сполуку матеріалом, що запобігає її інактивації, або вводити її одночасно з таким матеріалом.
Наприклад, сполука може вводитись суб'єкту у відповідному носії, наприклад в ліпосомах чи в розріджувачі. Фармацевтично прийнятні розріджувачі включають сольові і водні буферні розчини.
Ліпосоми включають емульсії вода-в-маслі-в-воді фірми СС і звичайні ліпосоми (5ігє)|ап еї аї. (1984)
У. Меигоіїттипої. 7:27).
Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водні розчини чи дисперсії і стерильні порошки для приготування для негайного прийому стерильних ін'єкційних розчинів чи дисперсій.
Використання таких середовищ і агентів для фармацевтично активних субстанцій є добре відомим спеціалістам в цій галузі. Крім випадків, коли будь-яке звичайне середовище чи агент є несумісними з активною сполукою, використання їх в фармацевтичних композиціях за цим винаходом є можливим. В такі композиції можуть включатись також допоміжні активні сполуки.
Терапевтичні композиції типово мають бути стерильними і стабільними в умовах виготовлення і зберігання. Така композиція може мати вигляд розчину, мікроемульсії, ліпосоми чи іншої упорядкованої структури, придатної для того, щоб містити високу концентрацію препарату. Носій може бути розчинником чи середовищем для диспергування, яке містить, наприклад, воду, етиловий спирт, поліол (наприклад, гліцерин, пропилен гліколь і рідкий поліетилен гліколь і т.п.), а також їх придатні суміші. Необхідна текучість може підтримуватись, наприклад, за рахунок використання покриття, такого як лецитин, забезпечення необхідного розміру часток у випадку дисперсії і застосування сурфактантів. В багатьох випадках буває доцільно включати в композицію ізотонічні агенти, наприклад цукри, поліспирти, такі як манітол, сорбіт, чи натрію хлорид. Пролонговане всмоктування ін'єкційних композицій може забезпечуватись включенням до їх складу агента, який уповільнює всмоктування, наприклад моностеаратних солей чи желатину.
Стерильні ін'єкційні розчини можуть готуватись включенням активної сполуки в необхідній кількості у відповідний розчинник з одним інгредієнтом чи з комбінацією інгредієнтів, перелічених вище, як необхідно, з наступною стерилізацією мікрофільтрацією. Загалом, дисперсії готують включенням активної сполуки в стерильний носій, який містить основне середовище для диспергування і інші необхідні інгредієнти з тих, що перелічені вище. У випадку стерильних порошків для приготування стерильних ін'єкційних розчинів кращими методами приготування є вакуумна сушка і сушка заморожуванням (ліофілізація), які дають порошок активної сполуки плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт з його попередньо стерилізованого фільтруваннням розчину.
Схеми введення регулюються таким чином, щоб забезпечити оптимальну бажану реакцію (наприклад, терапевтичну реакцію). Наприклад, може вводитись єдиний болюс, можуть вводитись кілька розділених доз за певний час чи доза може пропорційно зменшуватись або збільшуватись, що визначається потребами конкретної терапевтичної ситуації. Наприклад, людські антитіла за цим винаходом можуть вводитись один раз чи двічі на тиждень шляхом підшкірної ін'єкції або раз чи два на місяць шляхом підшкірної ін'єкції.
Особливо доцільно мати парентеральні композиції у вигляді дозованої лікарської форми, що забезпечує легкість введення і однорідність дози. Дозована лікарська форма, як цей термін тут використовується, стосується фізично дискретних одиниць, призначених для введення за один раз суб'єктам, які лікуються; при цьому кожна одиниця містить наперед визначену кількість активної сполуки, розраховану так, щоб викликати бажаний терапевтичний ефект, у сполученні з необхідним фармацевтичним носієм. Технічні вимоги до дозованих лікарських форм за цим винаходом диктуються і безпосередньо залежать від (а) унікальних характеристик активної сполуки і того конкретного терапевтичного ефекту, який необхідно досягти, і (б) обмежень, які накладаються способом приготування такої активної сполуки з урахуванням чутливості індивідуумів.
Приклади фармацевтично прийнятних антиоксидантів включають: (1) водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, цистеїну гідрохлорид, натрію бісульфат, натрію метабісульфіт, натрію сульфіт і т.п.; (2) антиоксиданти, розчинні в олії, такі як аскорбілпальмітат, бутильований оксианізол (ВНА), бутильований окситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгалат, альфа-токоферол і т.п.; і (3) металохелатні агенти, такі як лимонна кислота, етилендіамін тетраоцтова кислота (ЕОТА), сорбіт, винна кислота, фосфорна кислота і т.п.
Препарати, що містять терапевтичні композиції за цим винаходом, можуть бути призначеними для орального, назального, місцевого (включаючи трансбукальне і сублінгвальне), ректального, вагінального та/або парентерального введення. Для зручності ці препарати можуть бути у вигляді дозованої лікарської форми, і їх можна приготувати будь-якими методами, відомими в галузі фармації.
Кількість активного інгредієнту, яка може комбінуватись з матеріалом-носієм для отримання дозованої лікарської форми, буде коливатись в залежності від суб'єкта, якого лікують, і конкретного способу введення. Кількість активного інгредієнту, яка може комбінуватись з матеріалом-носієм для отримання дозованої лікарської форми, загалом буде відповідати кількості композиції, яка викликає терапевтичний ефект. Загалом, від ста відсотків ця кількість буде в межах від приблизно 0,001 відсотка до приблизно 90 відсотків активного інгредієнта, краще від приблизно 0,005 відсотка до приблизно 70 відсотків, а найкраще від приблизно 0,01 відсотка до приблизно 30 відсотків.
Препарати за цим винаходом, призначені для вагінального введення, включають також песарії, тампони, креми, гелі, пасти, пінки чи аерозолі, які містять носії, визнані придатними для цієї галузі.
Лікарські форми для місцевого чи трансдермального введення композицій за цим винаходом включають порошки, аерозолі, мазі, пасти, креми, лосьйони, гелі, розчини, накладки і лікарську форму для інгаляції. Активна сполука може змішуватись в стерильних умовах з фармацевтично прийнятним носієм, а також з будь-яким консервантом, буфером чи пропелентом, як може знадобитись.
Вирази "парентеральне введення" чи "введений парентерально", як вони тут використовуються, означають спосіб введення, інший ніж ентеральне і місцеве введення, звичайно у вигляді ін'єкції чи інфузії і включає, без обмеження, внутрішньовенне, внутрішньом'язове, інтраартеріальне, інтратекальне, інтракапсулярне, інтраорбітальне, інтракардіальне, інтрадермальне, інтраперитонеальне, транстрахеальне, підшкірне, субкутикулярне, інтраартикулярне, субкапсулярне, субарахноїдальне, інтраспинальне, епідуральне і інтрастернальне введення.
Приклади придатних водних і неводних носіїв, які можуть бути використані в фармацевтичних композиціях за цим винаходом, включають воду, етиловий спирт, поліоли (такі як гліцерин, пропилен гліколь, поліетилен гліколь і т.п.) і їх суміші, рослинні олії, такі як оливкова олія, і придатні для ін'єкції органічні складні ефіри, такі як етил олеат. Необхідна текучість може досягатись, наприклад, шляхом використання покриття, такого як лецитин, забезпеченням необхідного розміру часток у випадку дисперсій і застосуванням сурфактантів.
Такі композиції можуть містити також ад'юванти, такі як консерванти, зволожувачі, емульгатори і диспергатори. Конкретні приклади ад'ювантів, які є добре відомими спеціалістам в цій галузі, включають, наприклад, неорганічні ад'юванти (такі як солі алюмінію, наприклад фосфат алюмінію і гідроокис алюмінію), органічні ад'юванти (наприклад, сквален), ад'юванти на олійній основі, віросоми (наприклад, віросоми, які містять зв'язаний з мембраною гемаглютинін і нейрамінідазу, похідну від вірусу грипу).
Відсутність мікроорганізмів може забезпечуватись як описаними вище методами стерилізації, так і включенням різних антибактеріальних і антифунгальних препаратів, наприклад парабену, хлорбутанолу, фенолсорбінової кислоти і т.п. Може бути бажаним включення в такі композиції також ізотонічних агентів, таких як цукри, натрію хлорид і т.п. Крім того, пролонговане всмоктування ін'єкційної фармацевтичної форми може досягатись включенням агентів, які уповільнюють всмоктування, таких як моностеарат алюмінію і желатин.
Коли сполуки за цим винаходом вводяться як фармацевтичні препарати людям чи тваринам, вони можуть даватись окремо або як фармацевтична композиція, що містить, наприклад, від 0,001 до 90 95 (краще від 0,05 до 70 95, так як від 0,01 до 30 95) активного інгредієнта в комбінації з фармацевтично прийнятним носієм.
Незалежно від обраного шляху введення, сполукам за цим винаходом, які можуть використовуватись і відповідній гідратованій формі, тал"або фармацевтичним композиціям за цим винаходом фармацевтично прийнятні лікарські форми можуть надаватись звичайними методами, відомими спеціалістам в цій галузі.
Дійсний рівень дози активного інгредієнту в фармацевтичній композиції може змінюватись з метою досягнення такої кількості активного інгредієнту, яка є ефективною для забезпечення бажаної терапевтичної реакції для даного пацієнта, складу препарату і способу введення і не буде токсичною для цього пацієнта. Обраний рівень дози буде залежати від широкого кола фармакокінетичних чинників, включаючи активність тих конкретних композицій за цим винаходом, які використовуються, форми активного інгредієнту (складний ефір, сіль чи амід), шляху введення, тривалості введення, швидкості екскреції даної сполуки, тривалості лікування, інших препаратів, сполук та/або матеріалів, які використовуються одночасно, віку, статі, маси тіла, хвороби, загального стану здоров'я, анамнезу пацієнта і подібних чинників добре відомих медикам. Лікар чи ветеринар, які мають звичайну підготовку, можуть легко визначити і призначити ефективну кількість необхідної фармацевтичної композиції. Наприклад, лікар чи ветеринар можуть почати вводити сполуки за цим винаходом у фармацевтичній композиції з рівня, нижчого ніж той, який необхідний для досягнення бажаного терапевтичного ефекту, і поступово підвищувати дозу доки не буде досягнутий бажаний ефект.
Загалом, доцільною добовою дозою композиції за цим винаходом буде така кількість сполуки, яка є найнижчою ефективною дозою, здатною забезпечити терапевтичний ефект. Така ефективна доза буде загалом залежати від описаних вище чинників. Краще, щоб введення було внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, інтраперитонеальним чи підшкірним, причому краще вводити близько до місця- мішені. Якщо це бажано, ефективна добова доза терапевтичної композиції може вводитись за два, три, чотири, п'ять, шість чи більше прийомів через відповідні інтервали впродовж одного дня, факультативно у вигляді дозованих лікарських форм. Хоча можливо, щоб сполука за цим винаходом вводилась окремо, доцільно вводити цю сполуку у вигляді фармацевтичного препарату (композиції).
Терапевтичні композиції можуть вводитись зо допомогою медичних пристроїв, відомих в цій галузі.
Наприклад, в кращому варіанті здійснення терапевтична композиція за цим винаходом може вводитись за допомогою безголкового підшкірного ін'єкційного пристрою, описаного в патентах США
МоМо 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824 чи 4,596,556. Приклади добре відомих імплантатів і модулів, які можуть бути використані за цим винаходом, включають ті, що описані в патенті США Мо 4,487,603 (мікро-інфузійний насос, що імплантується, для видачі медикаменту з контрольованою швидкістю), в патенті США Мо 4.,486,194 (терапевтичний пристрій для введення медикаментів через шкіру), в патенті США Мо 4,447,233 (інфузійний насос для видачі медикаменту, який забезпечує точну швидкість вливання), в патенті США Мо 4,447,224 (інфузійний апарат, що імплантується, для постійної доставки препарату з регульованою швидкістю), в патенті
США Мо 4,439,196 (багатокамерна осмотична система доставки препарату) і в патенті США Мо 4,475,196 (осмотична система доставки препарату). Спеціалістам в цій галузі відомо багато інших імплантатів, систем доставки і модулів.
В певних варіантах здійснення моноклональні антитіла за цим винаходом можуть входити в рецептуру, яка забезпечує належний їх розподіл іп мімо. Наприклад, бар'єр кров-головний мозок виключає застосування багатьох сполук з сильною гідрофільністю. Щоб сполуки за цим винаходом могли перетинати цей бар'єр (якщо це бажано), вони можуть вводитись у вигляді, наприклад, ліпосом.
Способи виготовлення ліпосом описані, наприклад, в патентах США МоМо 4,522,811; 5,374,548; і 5,399,331. Ліпосоми можуть включати одну чи більше складових, які вибірково транспортуються до специфічних клітин чи органів, тим самим посилюючи цільову доставку препаратів (дивись, наприклад, М.М. Вападе (1989) У. Сііп. Рнаптасої. 29:685). Показові спрямовуючі складові ліпосом включають фолат чи біотин (дивись, наприклад, патент США Мо 5,416,016, виданий І ом еї аї.); манозиди (Штегама еї аї., (1988) Віоспет. Віорпуз. Не5. Соттип. 153:1038); антитіла (Р.сх. Віоетап еї аІ. (1995) РЕВ5 І ей. 357:140; М. Оумаїз евї аї!. (1995) Апіітістор. Адепі5 СпетоїНег. 39:180); рецептор протеїну А сурфактанту (Віїзсоє єї аІ. (1995) Ат. 9. РНувіої. 1233:134). Вони можуть включати препарати за цим винаходом, а також компоненти винайдених молекул (5спНгвєїег еї аї!. (1994) у. Віо!.
Спет. 269:9090); дивись також К. Кеїпапеп; М.І. ІГашкКапеп (1994) РЕВ5 Гей. 346123; 9.9. КіпПіоп; 1.У.
Ніаїег (1994) Іттипотеїнод5 4:273.
У. Методи використання антитіл за даним винаходом
Даний винахід стосується також методів використання антитіл і їх частин, що зв'язують ЕГтВЗ, в різноманітних діагностичних і терапевтичних застосуваннях ех мімо і іп мімо. Наприклад, антитіла за цим винаходом можуть бути використані для лікування хвороби, що асоціюється із залежним від
ЕїбВ3 проведенням сигналів, включаючи різновиди раку.
В одному варіанті здійснення даний винахід стосується способу лікування хвороби, що асоціюється із залежним від ЕГОВЗ проведенням сигналів, шляхом введення суб'єкту антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за цим винаходом в кількості, яка є ефективною в лікуванні цієї хвороби.
Відповідні хвороби включають, наприклад, різновиди раку, включаючи, але не обмежуючись ними,
меланому, рак молочної залози, рак яєчнику, світлоклітинну карциному, рак шлунково-кишкового тракту, рак ободової кишки, рак легень і рак передміхурової залози.
Таке антитіло може вводитись окремо чи разом з іншим терапевтичним препаратом, який діє спільно чи в синергізмі з цим антитілом в лікуванні хвороби, що асоціюється з опосередкованим ЕТЬВЗ проведенням сигналів. Такі терапевтичні препарати включають, наприклад, протиракові препарати, описані далі (наприклад, цитотоксини, хіміотерапевтичні препарати, низькомолекулярні препарати і опромінення).
В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способу діагностики хвороби (наприклад, раку), що асоціюється з підвищеною регуляцією ЕГЬВЗ у суб'єкта, шляхом контактування антитіл чи їх частин, що зв'язують антиген, за цим винаходом (наприклад, ех мімо чи іп мімо) з клітинами від цього суб'єкта і визначення рівня зв'язування з ЕТЬВЗ на цих клітинах. Аномально високі рівні зв'язування з
ЕбВЗ засвідчують, що даний суб'єкт має хворобу, що асоціюється з підвищеною регуляцією ЕГТЬВЗ.
В об'єм даного винаходу входять також набори, які містять антитіла і їх частини, що зв'язують антиген, за цим винаходом і, факультативно, інструкцію щодо їх використання в лікуванні хвороби, що асоціюється з підвищеною регуляцією ЕГтВЗ та/або залежного від ЕГОВЗ проведення сигналів. Такі набори можуть включати етикетку, інформація на якій стосується призначення вмісту набору. Термін "етикетка" включає будь-який напис, маркетингові матеріали чи матеріал, записаний на плівку, який розміщується зверху чи всередині набору або супроводжує набір якимось іншим способом.
Інші варіанти здійснення даного винаходу описані в наступних Прикладах.
Даний винахід ілюструється також наступними Прикладами, які не мають вважатись такими, що обмежують його об'єм. Зміст Переліку послідовностей, малюнків і всіх посилань, патентів і опублікованих патентних заявок вважаються включеними в цей опис в повному об'ємі за посиланням.
Приклади
Матеріали і методі
В цих прикладах були використані наступні матеріали і методи, якщо не вказувалось на інше.
Загалом, практика здійснення даного винаходу передбачає використання, якщо не вказується на інше, звичайних методів хімії, молекулярної біології, біотехнології на основі рекомбінантної ДНК, імунології (зокрема, наприклад, технології отримання антитіл) і стандартних методик приготування поліпептидів. Дивись, наприклад, Затьгоок, Епівсй апа Мапіаїї5, МоїІесшіаг Сіопіпа: Соїд ріпа Натбог
І арогаїогу Ргезз (1989); Апіїроду Епдіпеегпа Ргоїосоіїв (Меїнодз іп Моієсшіаг Віоіоаду), 510, Раші, 5.,
Нитапа Рг (1996); Апіїбоду Епадіпеегпд: А Ртгасіїсаї Арргоасп (Ргасіїсаї Арргоасий 5бепев, 169),
МсСанепу, Еа., 1 Ре (1996); Апіїродієз: А І арогаюгу Мапиаї, Напому єї а!., С.5.Н.І. Ргезв, Риб. (1999); і
Ситепі Ргоїосоїв5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, еа5. А!йзибеї еї аї., дхопп УМіеу є 5опв (1992). Модельні системи іп міїго і іп мімо для аналізу біології НСМ (вірусу гепатиту С) описані, наприклад, в СеїЇ сийигте тоав!5 апа апіта! тодеїв5 ої міга! пераїйів. Рап ІІ: пераїйів С, І ар. Апіт. (ММУ).34(2):39-47 (2005), а також в ТНе спітрапгее тоавеї ої пераїййів С мігив іп'есіїоп5, ІГ АВ У.42(2):117-26 (2001).
Клітинні лінії
Всі клітинні лінії, які були використані в описаних далі експериментах, було отримано від
Національного інституту раку (США) чи надано дослідниками (дивись відповідні посилання).
Клітинні лінії:
МСЕ7-АТСС кат. Мо НТВ-22
Т470-АТСС кат. Мо НТВ-133
Соіо357 - Ці клітини було отримано від одного з дослідників, наукового співробітника університету; вони описані Коїб єї а. (2006) Іпі. У. Сапсег, 120:514-523. би145-АТОС кат. Мо НТВ-81
ОМСАНВВ - джерело вже описувалось в попередній заявці.
НІ1975 АТСС кат. Мо СВІ -5908
Подрібнення пухлинних клітин на порошок
Для подрібнення пухлин на порошок було використано кріопульверизатор (Сомагі5 Іпс). Пухлини зберігались в спеціальних мішечках (що попередньо зважувались), які до використання знаходились в рідкому азоті. В разі дрібних пухлин спочатку в мішечок з пухлиною вводили 200 мкл буферу для лізису, заморожували в рідкому азоті, а потім перетворювали на порошок, щоб покращити вихід пухлини з мішечка. Подрібнені на порошок пухлини переносили в 2-мл пробірки Епендорфа, які зберігались в рідкому азоті до готовності до наступної обробки.
Лізис пухлинних клітин
Лізис пухлин здійснювався в буфері для лізису, доповненому інгібіторами протеази і фосфатази.
Лізис для буферу додавався аліквотами до кінцевої концентрації приблизно 62,5 мг/мл. Зразки пухлини гомогенізували інтенсивним перемішуванням на вортексі впродовж 30 сек і інкубацією на льоду впродовж приблизно 30 хвилин. Лізати прокручували приблизно 10 хвилин в колонках Оіадеп
ОіазНтедадаег для подальшої гомогенізації зразків. Очищені лізати переносили аліквотами в свіжі пробірки для подальшої обробки.
Кількісний аналіз на вміст білків (аналіз ВСА)
Аналіз ВСА (Рієгсе) здійснювався у відповідності до протоколу виробника на всіх зразках пухлин.
Загальна концентрація білку (в мг/мл) в кожному зразку пухлини пізніше використовувалась для нормалізації результатів ЕГІЗА.
Аналіз ЕГІЗА (твердофазний імуноферментний аналіз)
Всі реактиви для загального і фосфо-ЕгЬВЗ аналізів ЕГІЗА були придбані у фірми НО бувієтв у вигляді наборів Юозеї. 9б-лункові планшети Мипс Махізого покрили 50 мкл антитіла і інкубували впродовж ночі при кімнатній температурі. Наступного ранку планшети тричі промили, використовуючи 1000 мкл/лунку засобу ВіоТеК для мийки планшет з РВЗТ (0,05 95 Твін-20). Потім планшети блокували біля 1 години при кімнатній температурі, використовуючи 2 95 альбумін бичачої сироватки (В5А) у фосфатно-сольовому буферному розчині (РВ5). Планшети тричі промили, використовуючи 1000 мкл/лунку засобу ВіотТек для мийки планшет з РВЗТ (0,05 95 Твін-20). 50 мкл клітинних лізатів і стандартів розвели в 50 95 буфері для лізису і використали 1 95 альбумін бичачої сироватки (В5А) в двох повтореннях для подальшої обробки. Зразки інкубували впродовж 2 годин при 49С на планшетному шейкері і тричі промили, використовуючи 1000 мкл/лунку засобу ВіоТек для мийки планшет з РВБТ (0,05 95 Твін-20). Приблизно 50 мкл детекторного антитіла розвели в 2 95 В5А, додали РВ5Т і інкубували приблизно 1 годину при кімнатній температурі Для фосфо-ЕТВЗ детекторне антитіло кон'югували безпосередньо до пероксидази хрону (НРАР) і інкубували впродовж 2 годин при кімнатній температурі. Планшети тричі промили, використовуючи 1000 мкл/лунку засобу
ВіоТек для мийки планшет з РВЗТ (0,05 95 Твін-20). Додали приблизно 50 мкл 5ігеріамідіп-НАР і інкубували 30 хвилин при кімнатній температурі (крім рЕгбВ3). Планшети тричі промили, використовуючи 1000 мкл/лунку засобу ВіоТек для мийки планшет з РВ5Т (0,05 95 Твін-20). Додали приблизно 50 мкл субстрату Зирегзідпа! Рісо ЕГІ5А і піддали планшету зчитуванню, використовуючи зчитувач планшет Еивіоп. Отримані дані аналізувались за допомогою ЕХСЕЇ. Зразки-дублікати усереднювали, і планки погрішностей використовували для репрезентації стандартного відхилення між двома повтореннями.
Приклад 1: Отримання антитіл за допомогою фагового дисплею
Для того, щоб отримати анти-ЕтЬВЗ антитіла людини, які тут називаються Ар Моб, АБ Ме3, АБ Мео14,
Ар Ме17, і АБ Мо19, Рар-фагову бібліотеку людини, яка включає унікальну комбінацію імуноглобулінових послідовностей від донорів-людей (Нові еї аЇ. зирга, включено в повному об'ємі в цей опис за посиланням), було спочатку піддано скринінгу щодо зв'язувальних компонентів ЕгоВ3.
При використанні очищеного ЕгбВЗ і клітинної лінії яєчнику китайського хом'яка, що експресує
ЕбВЗ на поверхні клітин, з цієї бібліотеки було ідентифіковано 73 унікальні Рар послідовності. Ці 73 клони було переформатовано як тільки Раб без фага. За допомогою методів з високим виходом ці Бар були виділені в невеликій кількості і випробувані на зв'язування з використанням аналізу ЕГІ5А і методу Ріехспір, що є високоефективною технологією поверхневого плазмонного резонансу (РЕ). Всі 73 Бар без фага були нанесені на поверхню чіпу для визначення кінетики зв'язування і блокування епітопу до злитого цільового білку ЕГТОВЗ-пі чи ЕТВЗ-Есргоївіп (В а О бЗузіет5). З отриманих даних було вирахувано константу рівноважного зв'язування і швидкості "включення-виключення".
Потім оцінювалось зв'язування різних Бар з клітинами МА МЕ-ЗМ, для чого використовували приблизно 500 нМ Раб і розведення 1:750 вторинного антитіла козла проти людини АїЇеха 647. Як показано на фіг. 1А їі 18, кілька Рар-кандидатів демонстрували помітне забарвлення на клітинах
МАЇ МЕ-ЗМ.
Приклад 2: Оптимізація анти-ЕТВЗ Бар
Після ідентифікації Раб, які блокували зв'язування ЕгВЗ ліганду херегуліну до ЕТВЗ, послідовності УН і МІ Рар були оптимізовані щодо кодону наступним чином.
Конкретно, ділянки МН і МІ були переформатовані з використанням конструкцій для експресії ізотипу 421 чи Ідс2. Ці конструкції експресії включали каркас 5еїехі5, який має касету, призначену для заміщення відповідних послідовностей важкого і легкого ланцюгів. Вектори 5єЇєхіз включали ЦМВ промотор і узгоджуючий полі-А сигнал.
Послідовності нуклеїнових кислот для кодон-оптимізованих МН і МІ антитіла АБ Моб наведені в
ЗЕО ІО Ме: 25 і 26, відповідно, а послідовності нуклеїнових кислот для антитіла АБ Ме3 -в 5ЕО І Мо: 21 і 28, відповідно, як показано на Фіг. 22.
Приклад 3: Афінність зв'язування для ЕгВЗ
Константи дисоціації анти-ЕГЬВ3З антитіл були визначені за допомогою двох незалежних методів, а саме аналізу поверхневого плазмонного резонансу і аналізу зв'язування клітин, з використанням клітин МА МЕ-ЗМ.
Аналіз поверхневого плазмонного резонансу
Аналіз поверхневого плазмонного резонансу (який називають також аналізом РіІехспПір) здійснювався так, як описано в УУ/аззаї єї аї. (2006) Апаїуїїса! Віоспет., 351:241-253. Значення Ко вираховували, виходячи з формули Ко-Ка/Ка.
Значення Ко для антитіл АБ Моб і АБ Ме3, відповідно, визначені за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансу, наведені на Фіг. 2А і 28. Антитіло АБ Моб мало величину Ко біля 4 нМ, а антитіло Ар Ме3 мало величину Ко біля 8 НМ, як показано на Фіг. 2А і 2В, відповідно.
Аналіз зв'язування клітин
Аналіз зв'язування клітин для визначення значень Ко для антитіл АБ Моб ії АБ Ме3З здійснювався наступним чином.
Клітини МАЇ МЕ-ЗМ були відщеплені за допомогою 2 мл трипсину-ЕОТА (етилендіамін тетраоцтова кислота) ї 2 мл ВМРІ (живильне середовище, яке використовується в імунобіологічній діагностиці) ж 5
ММ ЕОТА при кімнатній температурі впродовж 5 хвилин. Повне середовище ВАРМІ (10 мл) додали відразу до оброблених трипсином клітин, обережно ресуспендували і розігнали в настільній центрифузі ВесКтап при 1100 об/хв. впродовж 5 хвилин. Клітини ресуспендували в буфері барвника
ВО (РВ5-2 95 фетальна бичача сироватка «з 0,1 95 натрію азид, Весіоп ОРісКіпзоп) при концентрації 2 х 105 клітин на мл, і 50-мкл (1 х 105 клітин) аліквоти переносили на 96-лункову титрувальну планшету.
В пробірці Епендорфа приготували 150 мкл розчину 200 нМ анти-ЕТтЬВЗ антитіла (АБ Моб і АБ Ме3) в буфері барвника ВО і серійно розвели 2-кратно в 75 мкл буферу барвника ВО. Концентрації такого розведеного антитіла були в межах від 200 нМ до 0,4 нМ. Потім 50-мкл аліквоти різних розведень білку додали безпосередньо до 50 мкл клітинної суспензії, отримавши кінцеві концентрації антитіла 100 нМ, ХО НМ, 25 НМ, 12нМ, 6 НМ, ЗНМ, 1,5нМ, 0,8 НМ, 04 нМій,2 нм.
Порції клітин в 96-лунковій планшеті інкубували з розведеннями білку впродовж 30 хвилин при кімнатній температурі на платформному шейкері і промили тричі, використовуючи 300 мкл буферу барвника ВО. Клітини потім інкубували з 100 мкл розведення 1:750 міченого ЇдДа козла проти людини
АІїеха 647 в буфері барвника ВО впродовж 45 хвилин на платформному шейкері в холодному приміщенні. Насамкінець, клітини двічі промили, осадили центрифугуванням і ресуспендували в 250 мкл буферу барвника ВО--0.5 мкг/мл пропідіуму йодиду. Аналіз 10000 клітин було здійснено на проточному цитометрі РГАСобсаїїригї з використанням каналу Р4. Величини МРЕЇ (середньократний приріст) ії відповідні концентрації анти-Е/ОВЗ3 антитіла наносились, відповідно, на у-вісь і х-вісь.
Значення Ко молекули визначали за допомогою СтарнРаай Ргізт з використанням моделі зв'язування на одному сайті для побудови кривої нелінійної регресії.
Значення Ко було вирахувано за формулою М-Втах" Х/ Ко-Х (Втах - флуоресценція при насиченні; Х - концентрація антитіла; У - ступінь зв'язування). Як показано на Фіг. 20 і 20, антитіла Ар
Моб і АБ Ме3 мали Ко приблизно 4 НМ і 1,3 нМ, відповідно, за даними аналізу зв'язування клітин з використанням клітин МАГ МЕ-ЗМ.
Приклад 4: Специфічність зв'язування / зв'язування з епітопом для ЕТОВЗ
Специфічність зв'язування ізотипу (Д022 антитіла АБ Моб з ЕТЬВЗ оцінювалась за допомогою аналізу ЕГІЗА наступним чином. Аналізувалась також ідентифікація епітопу, зв'язаного антитілом АБ
Моб.
Більш конкретно, 9б-лункові планшети Мипс Махізот покрили 50 мкл 5-мкг/мл білку (рекомбінантний ЕТВЗ людини, рекомбінантний ЕСЕВ людини чи неспоріднений білок (В5А)) і інкубували впродовж ночі при кімнатній температурі. Наступного ранку тричі промили планшети, використовуючи 1000 мкл/лунку РВОТ (0,05 95 Твін-20) в засобі ВіоТек для мийки планшет. Потім лунки блокували впродовж 1 години при кімнатній температурі з 295 В5А в РВ5. Планшети тричі промили, використовуючи 1000 мкл/лунку РВБОТ (0,05 95 Твін-20) в засобі ВіоТеК для мийки планшет.
Додали приблизно 50 мкл антитіла АБ Меб в кількох розведеннях (1 мкл і серійні 2-кратні розведення) в 2 95 ВБА, РВ5Т. Всі зразки проганяли двічі і інкубували впродовж 2 годин при 49С на шейкері для планшет. Планшети тричі промили, використовуючи 1000 мкл/лунку РВОТ (0,05 95 Твін-20) в засобі
ВіоТеК для мийки планшет. Додали 50 мкл детекторного антитіла Ід людини (кон'югованого до НАР (Веїйу! Іпс; розведення 1:75000 в 295 В5А, РВБ5Т)) і інкубували планшети впродовж 1 години при кімнатній температурі. Планшети тричі промили, використовуючи 1000 мкл/лунку РВ5Т (0,05 95 Твін- 20) в засобі ВіоТек для мийки планшет. Додали 50 мкл субстрату Зирегзідпа! Рісо ЕГІ5ЗА і піддали планшети зчитуванню на зчитувачі планшет Еивіоп. Отримані дані були проаналізовані з використанням програми ЕХСЕЇ. Дані для дублікатних зразків усереднили і представили стандартне відхилення у вигляді планок похибки між двома повтореннями.
Як показано на фіг. 3, антитіло АБ Моб зв'язувало рекомбінантний ЕГтЬВЗ в аналізі ЕГІ5А, Але не демонструвало скільки-небудь помітного зв'язування з ЕСЕВ, ВЗА чи Тав-а.
Фрагмент (мутант відсічення), який відповідає амінокислотним залишкам 20-202 ЕгВ3З, було клоновано в дисплейний вектор дріжджів рУ02 (модифікована версія ру (Іпмігодеп) зі стоп- кодоном, пристроєним попереду мітки Гіса) між рестрикцій ними сайтами Мне і Взім/І. Цю плазміду було трансформовано в штам дріжджів ЕВУ100 (Іпийгтодеп) і клони, що містили цю плазміду після селекції на Тгр-селективному середовищі. Такий клон вирощували у середовищі, що містить глюкозу, впродовж ночі при 309С, і експресію мутанту усічення ЕТВЗ індукували перенесенням у середовище, що містить галактозу, на 2 доби при 189С. Дріжджі, які демонстрували мутант усічення ЕгрВ3, фарбували, використовуючи 50 нМ антитіла АБ Меб, а потім антитілом козла проти людини, міченим барвником АїІеха-647. Окремий зразок фарбували тільки антитілом козла проти людини, щоб показати відсутність неспецифічного зв'язування цього вторинного антитіла до дріжджів. Аналіз здійснювався за допомогою проточної цитометрії на сортувальнику клітин ЕАС5 Саїїриг (ВО Віозсієпсев).
Як показано на фіг. 30, антитіло Ар Моб зв'язувалось з мутантом усічення, тобто з амінокислотними залишками 20-202 ЕІБВ3.
Приклад 5: Знижена регуляція загального ЕГЬВЗ на пухлинних клітинах
Здатність антитіла АБ Моб знижувати експресію ЕпОВЗ іп міо і іп мімо в пухлинних клітинах досліджувалась наступним чином.
Клітини МАЇМЕ-ЗМ засівали на 96б-лункові планшети для тканинної культури і вирощували в середовищі АРМІ-1640, доповненому антибіотиками, 2 мМ І-глутаміну і 10 95 фетальної бичачої сироватки (ЕВ5), впродовж 24 годин при 379С і 5 956 двоокису вуглецю. Середовище потім змінили на
АРМІ-1640 МЕВОІА з антибіотиками, 2 мМ І --глутаміну з антитілом чи без нього в концентраціях 1 мкМ, 250 нМ, 63 нМ, 16 нм, 4,0 нМ, 1,0 нМ, 240 пМ, 61 пМ і 15 пМ. Клітини вирощували впродовж 24 годин при 379С ї 595 двоокису вуглецю, після чого промили холодним РВБ, потім зібрали за допомогою буферу для лізису з білковим екстрактом ссавця (МРЕВ) (Рієгсе, 78505), який містив 150 мМ масі, 5
ММ натрію пірофосфату, 10 мкм рр (рпеп), 50 мкМ феналарсину, 1 мМ натрію ортованадату і коктейль інгібіторів протеази (5ідта, Р714). Клітинні лізати розвели 2-кратно 4 95 альбуміном бичачої сироватки у забуференому фосфатом сольовому розчині з 0,1 95 Твін-20, після чого піддали аналізу
ЕЙПІЗА з іммобілізованим антитілом ЕпВ3 миші проти людини і біотинильованим вторинним детекторним антитілом ЕбВЗ миші проти людини. Сигнал генерували стрептавідином, кон'югованим до пероксидази хрону, яка прореагувала з хемілюмінесцентним субстратом (Ріегсє, 37070).
Результати ЕГІЗА візуалізувались за допомогою люменометру.
Як показано на Фіг. 4, антитіло АБ Моб знизило загальні рівні ЕГРОВЗ на 46,9 95 в клітинах МАЇ МЕ-ЗМ іп міо, як було визначено за допомогою аналізу ЕГІЗА. Середовище, що не містило сироватки і антитіла, слугувало в якості контролю.
В подальшому експерименті знижена регуляція рецепторів ЕВ3 на клітинах МАЇМЕ-З3М досліджувалась за допомогою аналізу ЕАС5 з використанням ізотипів ІДС і Ід02 антитіла АБ Моб.
Клітини МА МЕ-ЗМ піддали трипсинізації з 15-см чашки і промили один раз середовищем АРМІ--10О 95 фетальної бичачої сироватки. Отримані після центрифугування клітини ресуспедували при щільності 1 х 106 клітин на мл. Дві аліквоти по 2 х 105 клітин додали до 12-лункової планшети для тканинної культури і ресуспендували в кінцевому об'ємі 800 мкл середовища АРМІ-10 95 фетальної бичачої сироватки. До однієї лунки додали ізотип Ідс1 чи Ід(32 антитіла АБ Моб до кінцевої концентрації 100
НМ (оброблений зразок), а в другу лунку - еквівалентний об'єм РВ5 (необроблений зразок).
Наступного дня оброблені і необроблені клітини були піддані трипсинізації, промиті, після чого їх інкубували з 100 нМ антитіла АБ Моб в буфері з барвником ВО впродовж 30 хвилин на льоду. Потім клітини двічі промили, використовуючи 1 мл буферу з барвником ВО, і інкубували зі 100 мкл розведення 1:500 міченого АІеха-647антитілом козла протри людини впродовж 45 хвилин на льоду.
Після цього клітини промили і ресуспендували в 300 мкл буферу з барвником ВОж0,5 мкг/мл пропідіуму йодиду. Аналіз 10000 клітин було здійснено в проточному цитометрі ЕГАСбсаїїриг з використанням каналу РІ 4.
Як показано на Фіг. 5А і 5В, обидва ізотипи Ідс1 і Їдус52 антитіла АБ Моб знижували активність ЕГОВЗ на клітинах МА МЕ-ЗМ приблизно на 62 95 і 66 95, відповідно.
Для того, щоб встановити чи обумовлене це зниження інтерналізацією рецептору ЕтбВЗ3 на поверхні клітин МАСМЕ-ЗМ, визначили експресію ЕгрВЗ в присутності антитіла впродовж певного часу.
Більш конкретно, клітини МАСМЕ-ЗМ трипсинізували з 15-см чашки і промили 1 раз середовищем
АРМІ--10 95 фетальної бичачої сироватки. Отримані після центрифугування клітини ресуспедували при щільності 1 х 105 клітин на мл. Дві аліквоти по 2 х 105 клітин додали до 12-лункової планшети для тканинної культури і ресуспендували в кінцевому об'ємі 800 мкл середовища КРМІ-10 95 фетальної бичачої сироватки. До однієї лунки додали анти-ЕгВЗ3 антитіло до кінцевої концентрації 100 нм (оброблений зразок), а до другої лунки - еквівалентний об'єм РВ5 (необроблений зразок). Наступного дня оброблені і необроблені клітини були піддані трипсинізації, промиті, після чого їх інкубували з 100
НМ антитіла АБ Моб в буфері з барвником ВО впродовж 30 хвилин на льоду. Потім клітини двічі промили, використовуючи 1 мл буферу з барвником ВО, і інкубували зі 100 мкл розведення 1:500 міченого АІеха-647антитілом козла проти людини впродовж 45 хвилин на льоду. Після цього клітини промили і ресуспендували в 300 мкл буферу з барвником ВЮО-О,5 мкг/мл пропідіуму йодиду. Аналіз 10000 клітин було здійснено в проточному цитометрі ЕАСсС5саїїриг з використанням каналу РІ 4.
Як показано на Фіг. 6, знижена регуляція ЕгрВЗ в присутності антитіла АБ Моб визначалась в 0 годин (Фіг. бА), через 0,5 години (Фіг. 6В), через 2 години (Фіг. 6С) і через 24 години (Фіг. 60). Як показано на бА-60, кількість рецепторів ЕгрВЗ3 на поверхні клітин була зниженою приблизно на 50 95 через 30 хвилин і приблизно на 93 95 через 24 години.
Здатність антитіла АБ Моб викликати зменшувати кількість рецепторів ЕГОВЗ3 була досліджена також іп мімо в клітинах меланоми.
зо
Коротенько, це здійснювалось наступним чином. Миші пи/пи з дефіцитом Т-клітин (самки мишей 3- 4-тижневого віку з Національного інституту здоров'я (США); аутбредні; альбіносного фенотипу) були придбані у фірми СПпагіеєх Кімег арх (США). Клітини МАЇМЕ-ЗМ для імплантації були вирощені в культурі (середовище ЕРМІ, 10 95 ЕВ5, І -глутамін і антибіотики, 37 "С, 5 95 СбО2) до приблизно 80 95 конфлюентності перед збиранням. Клітини тримали на льоду до імплантації. Мишей імплантували підшкірною ін'єкцією 100 мкл клітин МАЇ МЕ-ЗМ у правий бік і давали їм відновитись при забезпеченні контролю за початковим пухлинним ростом.
Пухлини вимірювались (довжина на ширину) за допомогою цифрового штангенциркулю; мишам вводили ІдСега (бідта, М7769-5МО) у вигляді внутрішньовенної ін'єкції. Потім їм щодня вводили інтраперитонеально 15 мкг чи 100 мкг антитіла Меб; пухлини вимірювали тричі на тиждень, заносячи результати в електронну таблицю Місгозой ЕХСЕЇ.
Після останнього виміру пухлин (І х М/) мишей піддавали евтаназії шляхом асфіксії СО» і пухлини висікали, швидко заморожували в рідкому азоті і зберігали при -809С (для біохімічного аналізу).
Останні виміри пухлин аналізували і будували графіки площі пухлини і об'єму пухлини, як описано, наприклад, в Випгит еї аї., (2003) Сапсег Вев., 63:8912-8921. Отримані дані аналізувались також "нормалізованими" і "ненормалізованими" засобами стосовно площі пухлини і об'єму пухлини. Для "нормалізації" даних в кожний інтервал вимірювання виміри кожної пухлини в кожній групі ділили на початковий розмір пухлини, визначений штангенциркулем.
Як показано на Фіг. 7, серед інших досліджених за допомогою цього аналізу антитіл, антитіло Ар
Моб (обидва ізотипи Іде і (д42) викликало зменшення загальної кількості ЕТОВЗ в пухлинах вже через 24 години після ін'єкції. РВ5 використовувався в якості контролю.
В наступному експерименті досліджувалась здатність антитіла АБ Моб регулювати на пониження
ЕїбВ3 в ксенотрансплантатах АОН; іп мімо.
Коротенько, зразки подрібнювались до порошкоподібного стану за допомогою кріопульверизатору (Сомагів Іпс). Пухлини зберігались в спеціальних мішечках (вони попередньо зважувались), які до використання знаходились в рідкому азоті. В разі дрібних пухлин в мішечок з пухлиною спочатку вводили 200 мкл буферу для лізису, заморожували в рідкому азоті, а потім перетворювали на порошок, щоб покращити вихід пухлини з мішечка. Подрібнені на порошок пухлини переносили в 2-мл пробірки Епендорфа, які зберігались в рідкому азоті до лізису. Лізис пухлин здійснювався в буфері для лізису, доповненому інгібіторами протеази і фосфатази. Лізис для буферу додавався аліквотами до кінцевої концентрації приблизно 62,5 мг/мл. Зразки пухлини гомогенізували інтенсивним перемішуванням на вортексі впродовж 30 сек і давали їм осісти на льоду впродовж приблизно 30 хвилин. Лізати прокручували приблизно 10 хвилин в колонках Оіадеп Оіазпгедаеєг для подальшої гомогенізації зразків. Очищені лізати переносили аліквотами в свіжі пробірки.
Кількісний аналіз на вміст білків (аналіз ВСА) здійснювався, як було описано в розділі "Матеріали і методи" раніше.
Загальні рівні ЕГТОВЗ визначались за допомогою аналізу ЕІ І5А. Реактиви для аналізу ЕГІ5А були придбані у фірми НО Бувієтв у вигляді наборів Юшозеї. 96-лункові планшети Мипс Махізого покрили мкл іммобілізованого антитіла і інкубували впродовж ночі при кімнатній температурі. Наступного ранку планшети тричі промили, використовуючи 1000 мкл/лунку засобу ВіоТек для мийки планшет з
РВОТ (0,0595 Твін-20). Потім планшети блокували біля 1 години при кімнатній температурі, використовуючи 2 95 альбумін бичачої сироватки (В5А) у забуференому фосфатном сольовому розчині (РВ5). Планшети тричі промили, використовуючи 1000 мкл/лунку засобу ВіоТек для мийки планшет з РВ5Т (0,05 95 Твін-20). 50 мкл клітинних лізатів і стандартів розвели в 50 95 буфері для лізису і для подальшої обробки використали 195 альбумін бичачої сироватки (В5А) в двох повтореннях. Зразки інкубували впродовж 2 годин при 49С на планшетному шейкері і тричі промили, використовуючи 1000 мкл/лунку засобу ВіоТек для мийки планшет з РВ5Т (0,05 95 Твін-20). Приблизно 50 мкл детекторного антитіла розвели в 2 95 В5А, додали РВ5Т і інкубували приблизно 1 годину при кімнатній температурі Для фосфо-ЕРВЗ детекторне антитіло кон'югували безпосередньо до пероксидази хрону (НАР) і інкубували впродовж 2 годин при кімнатній температурі. Планшети тричі промили, використовуючи 1000 мкл/лунку засобу ВіоТек для мийки планшет з РВЗТ (0,05 95 Твін-20).
Додали приблизно 50 мкл бгеріамідіп-НАР ії інкубували 30 хвилин при кімнатній температурі.
Планшети тричі промили, використовуючи 1000 мкл/лунку засобу ВіоТек для мийки планшет з РВ5Т (0,05 95 Твін-20). Додали приблизно 50 мкл субстрату Зирегзідпа! Рісо ЕПІЗА і піддали планшети зчитуванню, використовуючи зчитувач планшет ЕРивіоп. Отримані дані аналізувались за допомогою
ЕХСЕЇ. Зразки-дублікати усереднювали, і планки погрішностей використовували для репрезентації стандартного відхилення між двома повтореннями.
Результати цього експерименту представлені на Фіг. 8. Як показано на Фіг. 8, антитіло АБ Моб викликало регулювання на пониження Е/бВЗ в ксенотрансплантатах АОНВ; іп мімо.
Приклад 6: Пригнічення проліферації пухлинних клітин
Здатність антитіла АБ Моб пригнічувати проліферацію клітин, що експресують ЕТЬВЗ (наприклад, ракових клітин), досліджувалась наступним чином.
Клітини МА МЕЗМ, АСНМ і МСІ/АОВг висівались в 96-лункаві планшети для тканинних культур і росли в середовищі ВРМІ-1640, доповненому антибіотиками, 2 мМ І-глутаміну і 10 95 фетальної бичачої сироватки (ЕВ5), впродовж 24 годин при 379С і 5 95 двоокису вуглецю. Це середовище потім замінили на середовище АРМІ-1640 з антибіотиками, 2 мМ І-глутаміну і без антибіотику чи з антибіотиком в концентрації 1 мкМ, 250 нМ, 63 нМ, 16 нм, 4,0 нМ, 1,0 нМ, 240 пМ, 61 пМ і 15 пМм.
Клітини вирощували впродовж 9б годин при 379С і 595 двоокису вуглецю, після чого зібрали за методикою люмінесцентного аналізу життєздатності клітин СеїЇПіег-сСіоФ І тіпезсепі Сеї! Міарійу
Авзау (Рготеда, 17573) та проаналізували за допомогою люменометру. Середовище, яке не містило ні сироватки, ні антитіла, слугувало контролем.
Як показано на Фіг. 9, 10 ї 11, антитіло АБ Моб пригнічувало проліферацію клітин МАЇ МЕ-ЗМ (Фіг. 9), клітин раку яєчнику АОВ;г (Фіг. 10) і клітин АСНМ (Фіг. 11), які експресують ЕГбВ3. Більш конкретно, антитіло АБ Моб пригнічувало проліферацію клітин МАЇМЕ-ЗМ приблизно на 19,6 95, як було визначено за допомогою проби на титроване світіння клітин, а проліферацію клітин раку яєчнику АОВг приблизно на 30,5 95. Крім того, як показано на Фіг. 11, антитіло АБ Моб пригнічувало проліферацію клітин АСНМ приблизно на 25,4 95.
Приклад 7: Пригнічення фосфориляції ЕТОВЗ в пухлинних клітинах
Здатність антитіла АБ Моб пригнічувати фосфориляцію ЕгбВЗ іп мімо досліджувалась наступним чином.
Зразки подрібнювали до порошкоподібного стану за методикою, описаною в Прикладі 5 вище (Фіг. 8). Кількісний аналіз на вміст білків (аналіз ВСА) здійснювався, як було описано в розділі "Матеріали і методи" раніше, а аналіз ЕІ І5А було виконано так, як описано в Прикладі 5 вище (Фіг. 8).
Результати цього експерименту наведені на Фіг. 12. Як показано на Фіг. 12, антитіло АБ Моб достовірно пригнічувало фосфориляцію ксенотрансплантатів яєчнику АОН;к іп мімо, що було визначено за кількістю фосфорильованого ЕТВЗ (рЕГЬВЗ) в нг/мг загального білку.
Досліджувалась також здатність антитіла АБ Моб пригнічувати індуковану бетацелуліном (ВТС) чи херегуліном (НАС) фосфориляцію ЕгбВ3. Це було здійснено наступним чином.
Клітини яєчнику АОВг попередньо інкубували з антитілом АБ Моб впродовж 30 хвилин перед стимуляцією з використанням 50 мМ ВТС, 10 мМ НРа чи 333 нМ ТаБ-а. Після попередньої інкубації середовище видалили і стимулювали клітини впродовж 5 хвилин при 379С, 5 95 СО», використовуючи нМ ВТС чи 333 нМ (для РЕ498). Використовувався також НАС контроль (5 хвилин, 5 мМ), 10 95 сироватки і контроль з 0 95 сироватки. Клітини промили один раз холодним РВ5 і піддали лізису в 30 мкл холодного буферу для лізису (буфер М-РЕВ плюс натрію ванадат (МаМО»:, Зідта), 2- гліцерофосфат, феніларсин оксид, Вр і інгібітори протеази) з інкубацією на льоду впродовж 30 хвилин. Лізати зберігались впродовж ночі при -800С.
Як показано на Фіг. 13А-13С, антитіло АБ Моб достовірно пригнічувало опосередковану бетацелуліном і херегуліном фосфориляцію ЕГЬВ3.
В наступному експерименті досліджувалась здатність антитіла АБ Меб пригнічувати фосфориляцію
ЕбВЗ в клітинних лініях пухлини яєчнику ОМСАВ 5 і ОМСАВ 8. Це було здійснено наступним чином.
Клітинні лінії ОМСАВ 5 і ОМСАВ 8 були отримані від Національного інституту раку (США), відділення лікування і діагностики раку ("ОСТО"). Аналіз ЕГІЗА виконувався так, як описано в розділі "Матеріали і методи" вище.
Результати цього експерименту представлені на Фіг. 14А і 14В. Як показано на Фіг. 14А і 148, антитіло АБ Моб пригнічувало фосфориляцію ЕТЬВЗ в обох лініях клітин раку яєчнику - ОМСАН 5 і
ОМСАН 8.
Як вже говорилось, антитіло АБ Моб пригнічує опосередковану бетацелуліном фосфориляцію
ЕйбВ3. Для того, щоб дослідити чи буде опосередкована бетацелуліном фосфориляція ЕгрвЗ відбуватись через ЕтеВІ1 чи ЕГбВ3З, було виконано наступний експеримент.
Клітини АОВг чи клітини МА МЕ-ЗМ (1 х 105) попередньо інкубували з 25 мкМ Егйих (в якості контролю) в 50 мкл буферу з барвником ВО впродовж 30 хвилин на льоду. Після цього до клітин додали 50 мкл 400 нМ біотинильованого ВТС і інкубували їх ще 30 хвилин на льоду. Це дало кінцеву концентрацію 12,5 мкМ антитіл і 200 нМ ВТС. Потім клітини двічі промили, використовуючи 500 мкл буферу з барвником ВО і інкубували зі 100 мкл розведення 1:200 стрептавідину-РЕ (РЕ - фікоеритрин) (Іпийтодеп) в буфері з барвником ВО впродовж 45 хвилин. Насамкінець, клітини двічі промили, ресуспендували в 300 мкл буферу з барвником ВО і піддали аналізу на проточному цитометрі
ЕАСбзсаїїриг. В якості позитивного контролю інкубували 1 х 105 клітин АОВг чи МАЇ МЕ-ЗМ з 200 нм
ВТС впродовж 30 хвилин на льоду, двічі промивали і інкубували з розведенням 1:200 стрептавідину-
РЕ впродовж 45 хвилин. Щоб оцінити фонове забарвлення від кон'югату стрептавідину-РЕ, клітини інкубували тільки зі 100 мкл розведення 1:200 стрептавідину-РЕ впродовж 45 хвилин.
Результати цього експерименту представлені на Фіг. 15А-15С. Як показано на Фіг. 15А, бетацелунін не демонструє скільки-небудь помітного зв'язування з негативними щодо ЕТЬВІ1 клітинами
МАЇ МЕ-ЗМ. Однак, як показано на Фіг. 158 і 15С, ВТС дійсно демонструє зв'язування з позитивними щодо ЕТЬВІ1 клітинами АОВУу.
з2
Крім того, як показано на фіг. 15В і 15С, це зв'язування блокувалось Егройих'ом, що є анти-ЕСЕВ антитілом, яке специфічно зв'язує ЕСЕН, і був включений в якості контролю, щоб продемонструвати, що ЕаСіЕ-подібні ліганди зв'язуються з ЕСЕВ, як це описано, наприклад, у Адатзв еї аї. (2005), Маїшге
ВіоїесппоЇоду 23, 1147-1157.
Приклад 8: Пригнічення опосередкованого херегуліном проведення сигналів в пухлинних клітинах
Здатність антитіла АБ Моб пригнічувати опосередковане херегуліном проведення сигналів досліджувалась наступним чином.
Клітини МАГЇГМЕ-ЗМ висіяли в 96б-лункові планшети для тканинної культури і вирощували в середовищі АРМІ-1640, доповненому антибіотиками, 2 мМ І-глутаміну і 10 95 фетальної бичачої сироватки (ЕВ5) впродовж 24 годин при 379С і 5 95 двоокису вуглецю. В середовищі АРМІ-1640 без сироватки, але з антибіотиками і 2 мМ І -глутаміну клітини знаходились впродовж 24 годин при 379С і 95 двоокису вуглецю. Клітини попередньо обробили анти-ЕтВЗ антитілом (ізотип ЇД32 антитіла АБ
Моб) і без нього в концентрації 1 мкМ, 250 нМ, 63 нМ, 16 нМ, 4,0 нМ, 1,0 нМ, 240 пМ і 61 ПМ впродовж хвилин, після чого стимулювали ННАС1-реїа!-ЕСО впродовж 10 хвилин при 379С і 5 95 двоокису вуглецю. Потім клітини промили холодним РВ5 і зібрали буфером для лізису (Рієгсе, 78505) з білковим екстрактом ссавця (МРЕБ), який містив 150 мМ Масі, 5 мМ натрію пірофосфату, 10 мкм Бр (рпеп), 50 мкМ феналарсину, 1 мМ натрію ортованадату і коктейль інгібіторів протеази (Зідта, Р714).
Клітинні лізати розвели 2-кратно 4 95 альбуміном бичачої сироватки в забуференому фосфатом сольовому розчині з 0,1 95 Твін-20 і піддали аналізу ЕГІЗА на АКТ (нижче розміщений ефектор ЕГЬВЗ) і фосфориляцію ЕгоВ3.
Для того, щоб дослідити фосфориляцію АКТ, лізати проганяли на планшеті ЕЙ ІБА з іммобілізованим антитілом, специфічним щодо АКТ, і біотинильованим детекторним антитілом, специфічним до сайту фосфориляції на серині 473 АКТ. Сигнал генерували стрептавідином, кон'югованим до пероксидази хрону, що прореагувала з хемілюмінесцентним субстратом (Ріегсе, 37070). Щоб кількісно оцінити фосфориляцію ЕгрВ3, лізати проганяли на планшеті ЕЕГ ІЗА з іммобілізованим антитілом, специфічним до ЕгЬВЗ ї анти-фосфотирозиновим детекторним антитілом, кон'югованим до пероксидази хрону. Це потім реагувало з хемілюмінесцентним субстратом (Ріегсе, 37070). Результати ЕГ ІЗА візуалізувались за допомогою люменометру.
Як показано на Фіг. 16А і 168, антитіло АБ Меб є сильним інгібітором опосередкованого херегуліном проведення сигналів в клітинах МА! МЕ-ЗМ, про що свідчила знижена фосфориляція ЕГОВЗ (Фіг. 16А) і
АКТ (Фіг. 168). Варто відзначити, що антитіло АБ Моб пригнічувало фосфориляцію АКТ майже на 100 Об.
Приклад 9: Пригнічення росту пухлин яєчнику, передміхурової залози і підшлункової залози
Щоб оцінити ефективність антитіла АБ Моб іп омімо, було використано кілька моделей ксенотрансплантації раку людини на голих мишах, і пригнічення росту пухлин оцінювалось при багаторазовому введенні антитіла. Миші пи/пи з дефіцитом Т-клітин (самки мишей 3-4-тижневого віку з Національного інституту здоров'я (США); аутбредні; альбіносного фенотипу) були придбані у фірми
СНнапез Вімег І абз (США). Клітини МАЇ МЕ-ЗМ для імплантації були вирощені в культурі (середовище
ВРМІ, 10 95 ЕВ5, І -глутамін і антибіотики, 37 "С, 5 95 СО»2) до приблизно 85 95 конфлюентності перед збиранням. Клітини тримали на льоду до імплантації. Мишей імплантували підшкірною ін'єкцією 100 мкл клітин АЮВг у правий бік і давали їм відновитись при забезпеченні контролю за початковим пухлинним ростом.
Пухлини вимірювались (довжина на ширину) за допомогою цифрового штангенциркулю; мишам вводили Ідсга (бідта, М7769-5МО) у вигляді внутрішньовенної ін'єкції Потім їм вводили інтраперитонеально кожного третього дня 30 мкг чи 300 мкг антитіла Меб; пухлини вимірювали тричі на тиждень, заносячи результати в електронну таблицю Місгозой ЕХСЕЇ.
Після останнього виміру пухлин (І х М) мишей піддавали евтаназії шляхом асфіксії СО» і пухлини висікали, швидко заморожували в рідкому азоті і зберігали при -809С (для біохімічного аналізу).
Останні виміри пухлин аналізували і будували графіки площі пухлини і об'єму пухлини, як описано, наприклад, в Випгит єї аі. (2003) Сапсег Нез., 63:8912-8921. Отримані дані аналізувались також "нормалізованими" і "ненормалізованими" засобами стосовно площі пухлини і об'єму пухлини. Для "нормалізації" даних в кожний інтервал вимірювання виміри кожної пухлини в кожній групі ділили на початковий розмір пухлини, визначений штангенциркулем.
Дані, отримані на трьох різних моделях, в яких було використано клітинні лінії пухлин людини -
АОВГг (яєчнику), би145 (передміхурової залози) і ОУСАН8 (яєчнику), показані на Фіг. 17А-17С, а результати дослідження ксенотрансплантації Соі0357 показані на Фіг. 170. Як можна бачити, 300-мкг доза антитіла АБ Моб кожні три дні (034) забезпечила достовірне пригнічення росту пухлини (р-«е0,05 для кількох інтервалів під час дослідження). Більш того, ця інгібітор на дія антитіла АБ Моб посилювалась при підвищенні дози до 600 мкг, СІЗО, в моделі раку передміхурової залози Ои145, а також в моделях ксенотрансплантації світлоклітинної карциноми і карциноми підшлункової залози (АСНМ ії СО 0357). Однак подальше підвищення дози до 1500 мкг ОЗа не приводило до зростання ефективності (ОуСАНВ8 - Фіг. 17; СО 0357), що дозволяє припустити, що 600-мкг доза є дозою з3 насичення щодо пригнічення росту пухлини. Фармакокінетичні аналізи сироватки від тварин з цих досліджень демонструють дозозалежне збільшення затримки антитіла АБ Меб в сироватці. Подібно до цього, біохімічний аналіз рівнів антитіла АБ Меб в пухлинах показав дозозалежний діапазон від 0 до 6 пг ММ121/мкг загального пухлинного лізату (дані не приведено).
Приклад 10: Пригнічення зв'язування ЕГЬВЗ лігандів з ЕТОВЗ на пухлинних клітинах
В наступному експерименті специфічність антитіл за цим винаходом щодо пригнічення зв'язування
ЕТЬВЗ лігандів з ЕТЬВ3З і не-ЕсСЕ-подібних лігандів з ЕСЕЕ досліджувалась таким чином.
В одному експерименті досліджувалась специфічність антитіла АБ Меб і версії Раб антитіла АБ МеЗ (АБ/Бар Ме3) щодо пригнічення зв'язування ЕГВ3 лігандів (наприклад, херегуліну і епірегуліну) з
ЕТВЗ.
Щоб дослідити здатність антитіла АБ Меб і антитіла АБ/Рар МеЗ пригнічувати зв'язування херегуліну з ЕТБВ3, було проведено наступний експеримент.
Клітини АОНВГ (1 х 105) інкубували з 10 мкМ анти-ЕгтЬВ3 антитіла (наприклад, АБ Моб чи АБ/Рар Мез3) в 50 мкл буферу з барвником ВО впродовж 30 хвилин на льоду. Потім до цих клітин додали 50 мкл 40
НМ ЕСЕ біотинильованого херегуліну і інкубували ще 10 хвилин на льоду. Це дало кінцеву концентрацію 5 мкМ антитіла і 20 нМ ЕСЕ херегуліну. Після цього клітини двічі промили, використовуючи 500 мкл буферу з барвником ВО, і інкубували зі 100 мкл розведення 1:200 стрептавідину-«РЕ (РЕ - фікоеритрин) (Іпийгодеп) в буфері з барвником ВО впродовж 45 хвилин.
Насамкінець, клітини двічі промили, ресуспендували в 300 мкл буферу з барвником ВО і піддали аналізу на проточному цитометрі ЕАСзсаїрриг. В якості позитивного контролю інкубували 1 х 105 клітин
АОНВГ з 20 нМ ЕСЕ херегуліну впродовж 10 хвилин на льоду, двічі промили і інкубували з розведенням 1:200 стрептавідину""РЕ впродовж 45 хвилин. Щоб оцінити фонове забарвлення від кон'югату стрептавідину-РЕ, 1 х 105 клітин АОВг інкубували тільки зі 100 мкл розведення 1:200 стрептавідину-РЕ впродовж 45 хвилин.
Результати цього експерименту наведені на Фіг. 18А і 18В. Як показано на Фіг. 18А і 188, обидва антитіла Ар Меб і АБ/Раб Ме3 продемонстрували здатність пригнічувати здатність херегуліну з ЕТЬВ3.
Подібно до цього, здатність антитіла АБ Моб пригнічувати зв'язування іншого ЕгоВЗ-ліганду епірегуліну з ЕГОВЗ оцінювалась наступним чином.
Клітини АОКг (1 х 105) попередньо інкубували з 25 мкМ Егбйих (в якості контролю) в 50 мкл буферу з барвником ВО впродовж 30 хвилин на льоду. Після цього до клітин додали 50 мкл 2 мкм біотинильованого Ері і інкубували їх ще 30 хвилин на льоду. Це дало кінцеву концентрацію 12,5 мкМ антитіл і 1 мкМ Ері. Потім клітини двічі промили, використовуючи 500 мкл буферу з барвником ВО і інкубували зі 100 мкл розведення 1:200 стрептавідину-РЕ (РЕ - фікоеритрин) (Іпмігодеп) в буфері з барвником ВО впродовж 45 хвилин. Насамкінець, клітини двічі промили, ресуспендували в 300 мкл буферу з барвником ВО і піддали аналізу на проточному цитометрі ЕАСсСзсаїїриг. В якості позитивного контролю 1 х 105 клітин АОКг інкубували з 200 нм ВТС впродовж 30 хвилин на льоду, двічі промивали і інкубували з розведенням 1:200 стрептавідину""РЕ впродовж 45 хвилин. Щоб оцінити фонове забарвлення від кон'югату стрептавідину-РЕ, клітини інкубували тільки зі 100 мкл розведення 1:200 стрептавідину-РЕ впродовж 45 хвилин.
Результати цього експерименту наведені на Фіг. 19А ії 198. Як показано на Фіг. 19А, епірегулін зв'язується з клітинами АЮАг, позитивними щодо ЕпВ3. Більш того, як показано на Фіг. 198, це зв'язування пригнічується і Егйшх, і антитілом АБ Моб, що засвідчує здатність епірегуліну зв'язуватись із ЕСЕВ, і з ЕГЬВ3З.
Наступний експеримент було здійснено для дослідження того, чи здатне антитіло АБ Моб пригнічувати зв'язування ЕСг-подібного ліганду (наприклад, НВ-ЕСЕЕ) до пухлинних клітин.
Клітини АОВ; (1 х 105) попередньо інкубували з 25 мкМ антитіла АБ Моб чи з 25 мкМ Егойих (в якості контролю) в 50 мкл буферу з барвником ВО впродовж 30 хвилин на льоду. Після цього до клітин додали 50 мкл 400 нМ біотинильованого НВ-ЕСЕЕ і інкубували їх ще 30 хвилин на льоду. Це дало кінцеву концентрацію 12,5 мкМ антитіл і 200 нМ НВ-ЕСЕЕ. Потім клітини двічі промили, використовуючи 500 мкл буферу з барвником ВО і інкубували зі 100 мкл розведення 1:200 стрептавідину-РЕ (РЕ - фікоеритрин) (Іпийтодеп) в буфері з барвником ВО впродовж 45 хвилин. Насамкінець, клітини двічі промили, ресуспендували в 300 мкл буферу з барвником ВО і піддали аналізу на проточному цитометрі ЕАСзсаїїриг. В якості позитивного контролю 1 х 105 клітин АОВг інкубували з 200 нм НВ-
ЕСЕ впродовж 30 хвилин на льоду, двічі промили і інкубували з розведенням 1:200 стрептавідину-РЕ впродовж 45 хвилин. Щоб оцінити фонове забарвлення від кон'югату стрептавідину-РЕ, клітини інкубували тільки зі 100 мкл розведення 1:200 стрептавідину-РЕ впродовж 45 хвилин.
Як показано на фіг. 20А і 208, НВ-ЕСЕЕ зв'язується з ЕГОВ на клітинах АОВІг і антитіло АБ Моб не пригнічує це зв'язування, а це засвідчує, що антитіло АБ Моб є специфічним щодо зв'язування ЕгВЗ лігандів (наприклад, херегуліну і епірегуліну) з ЕТОВ3З.
Приклад 11: Пригнічення секреції МЕСЕ в пухлинних клітинах
Здатність антитіла АБ Моб пригнічувати секрецію МЕСЕЕ клітин, що експресують ЕТЬВЗ (наприклад, ракових клітин) досліджувалась за допомогою аналізу секреції судинного ендотеліального фактору росту (набір МЕСЕ ЕГІЗА від НО бБузіет5, США, кат. Мо ОУ293В). Спочатку аналізували здатність антитіла АБ Меб пригнічувати секрецію МЕСЕЕ в необроблених і оброблених ННС-бета 1 клітинах МСЕ- 7, Т47О0 ії СО010-357. Це дослідження показало, що клітини СОЇ О-357 секретують в середовище найбільшу кількість МЕС. Оскільки ці клітини мають також дуже високі рівні НВО (дані не наведені), то додавання НАС до середовища було нездатним далі індукувати секрецію УЕСЕЕ (Фіг. 24А). В той самий час, НЕО був здатним індукувати секрецію МЕСЕЕ в клітинах МСЕ-7 і ТА70.
Антитіло АБ Моб демонструє сильну інгібіторну дію при високих рівнях у всіх трьох клітинних лініях, причому найсильнішим цей ефект був у клітинах СОЇ О-357 (Фіг. 24А). Антитіло АБ Моб демонструє подібний ефект також іп мімо, пригнічуючи секрецію МЕСЕ в трьох різних ксенотрансплантатах, причому найсильнішим цей ефект був у ксенотрансплантаті СОЇ О-357 (Фіг. 248). Пригнічення МЕСЕ корелює з пригніченням фосфориляції ЕГЬВЗ (Фіг. 24 С). Пригнічення секреції МЕСЕ корелює також з пригнічення ангіогенезу в пухлинних клітинах. Зокрема, було встановлено, що фактори, які декретуються клітинами мієломи, такі як МЕСЕ їі БЕСЕ, запускають ангіогенез (дивись, наприклад,
Ї еипа вї а. (1989) бсієпсе 246(4935):1306-9; Меп еї а!. (2000) Опсодепе 19(31):3460-9).
Приклад 12: Пригнічення міграції клітин
Здатність антитіла АБ Моб пригнічувати міграцію клітин, що експресують ЕТЬВЗ (наприклад, клітин
МСЕ-7), досліджувалась за допомогою транс-лункового аналізу (МіПіроге Согр., США, кат. Мо ЕСМ552).
Спочатку клітини МСЕ-7 витримали впродовж ночі без сироватки, а потім інкубували в присутності чи за відсутності антитіла АБ Моб (кінцева концентрація 8 мкМ) впродовж 15 хвилин при кімнатній температурі. Після цього клітини перенесли у верхню камеру, відділену від нижньої камери мембраною, покритою колагеном типу 1, через яку клітини можуть мігрувати. До середовища в нижній камері додавали 10 95 ЕВ5 в якості хемоатрактанту в присутності чи за відсутності антитіла АБ Моб.
Камери інкубували при 379 впродовж 16 годин, після чого клітини, що мігрували через мембрану, видаляли за допомогою буферу для відщеплення і інкубували з флуоресцентним барвником, що зв'язується з клітинами. Середня флуоресценція ж стандартна похибка середнього показані на Фіг. 25.
Як показано на Фіг. 25, 10 95 ЕВ5 стимулює міграцію клітин (смуга 3), порівняно з необробленим контролем (смуга 1), а 8 мкМ антитіла Ар Меб пригнічують індуковану ЕВ5 міграцію клітин (смуга 4).
Приклад 13: Пригнічення сфероїдального росту
Здатність антитіла АБ Моб пригнічувати сфероїдальний ріст клітин, що експресують ЕгВЗ, досліджувалась за допомогою аналізу, який апроксимує умови пухлинного росту (Неттап 6ї аї. (2007)
Уоштаї ої Віотоїесшіаг 5стеепіпу ЕІесітопіс рибіїсайоп). Сфероїди Аа і 0БИО145 були ініційовані з частотою 1 сфероїд на лунку з 96-лункової планшети з використанням методу висячої краплі (Негптап еї аї., 2008). Індивідуальні сфероїди потім обробляли антитілом АБ Меб (кінцева концентрація 8 мкМ), доменом ЕСЕ херегуліну-р1 (НО бЗузіет5, США, кат. Мо 396-НВ, кінцева концентрація 3,4 нМ) чи їх комбінацією, як вказується. Діаметри сфероїдів вимірювали за допомогою світлового мікроскопу (об'єктив Х10) в день 1 і день 13.
Антитіло АБ Моб пригнічує ріст сфероїдів в клітинах АагА (Фіг. 26А). Крім того, 3,4 нНМ НАС стимулюють ріст сфероїдів, а антитіло АБ Моб пригнічує цю дію НВа (Фіг. 268). Сфероїди з клітин
БИ145 не збільшились у розмірі протягом 13 днів експерименту; однак ріст значно стимулювався при додаванні НАС1-бета 1. В цих клітинах антитіло АБ Моб в концентрації 8 мкМ пригнічує індукований
НКО ріст сфероїдів (Фіг. 265).
Приклад 14: Пригнічення проведення сигналів
Досліджувалась здатність антитіла АБ Моб пригнічувати проведення сигналів, індукованих різними лігандами. Наприклад, вивчався вплив антитіла АБ Моб на зв'язування НВО і ВТС з клітинами Ааге, що експресують рецептор ЕГбВ3. Як показано на Фіг. 27А і 27В, за даними аналізу ЕАС5 антитіло Ар
Моб конкурує з НВО, але не з ВТС, за зв'язування з клітинами АсгВ. Відповідно, блокування антитілом
Ар Моб зв'язування НН з ЕТЬВЗ попереджає проведення сигналів, індукованих НН.
Додатково різні ліганди тестувались щодо стимуляції фосфориляції ЕГТЬВ3. Три ліганди - НС, ВТС і НОЕ - демонстрували здатність стимулювати індуковану ЕГОВЗ фосфориляцію в клітинах Аа, тоді як ЕСЕ такої здатності не демонстрував. Як показано на Фіг. 28, антитіло АБ Меб пригнічує індуковану
На фосфориляцію рЕеЕВЗ в клітинах АагЕ (Фіг. 28). При цьому відомо (дивись, наприклад, УМаїепійв еї а). (2000) Ат .) Раїної. 156 (3):821-9 10702398), що посилене проведення сигналів НОЕ виявляється в різних епітеліальних і не епітеліальних пухлинах.
Взаємодія ЕтВЗ/СМЕТ і роль антитіла АБ Меб в модуляції цієї взаємодії
Було показано, що недрібноклітинна карцинома легень, що несе активуючі мутації в рецепторі епідермального фактору росту (ЕСЕР), розвиває резистентність до інгібіторів тирозинкінази, мобілізуючи МЕТ і НЕВЗ ії, тим самим, активуючи шлях виживання клітин РІЗК-АКТ (ЕпдеЇІтапп еї аї. (2007) Зсіепсе 316: 1039-1043; бхтои (2007) РМАБ: 105(2): 692-697). Зв'язок між ЕСЕВ і с-МЕТ в клітинних лініях, які несуть активуючі мутації ЕСЕВ було добре встановлено за допомогою ко- імунопреципітації (ЕпдеІтапп єї аїЇ., 2007; бхои, 2007). бхшо єї а. недавно продемонстрували за допомогою ко-імунопреципітації, що с-МЕТ і ЕїВЗ існують у комплексі також у шлунковій клітинній лінії МКМ45, яка відома залежністю від посиленого с-МЕТ.
Така взаємодія с-МЕТ-ЕГЬВЗ спостерігається також в клітинах лак, що несуть ЕСЕВ дикого типу і не залежать від посиленого с-МЕТ. НО (фактор росту гепатоцитів) індукує фосфориляцію ЕТВЗ в клітинах АакА дозозалежним чином, як показано на Фіг. 28. До того ж, антитіло АБ Моб пригнічує індуковану НЕ фосфориляцію ЕТЬВЗ.
Досліджувався також вплив НАС і ВТО на фосфориляцію ЕГОВІ і ЕГТЬВЗ, і було встановлено, що
НВа ії ВТС індукують фосфориляцію ЕГТВІ і ЕгбВ3. Виявилось, що ННа є більш сильним індуктором фосфориляцію ЄЕїВ3, тоді як ВТС є сильним індуктором фосфориляції ЕВ1 (Фіг. 29). Ця фосфориляція вірогідно запускається комплексом між ЕГОВІ і ЕТЬВ3. Коротко кажучи, зв'язування НС з ЕїВЗ індукує утворення комплексу між ЕОВ1 ії ЕїВ3, що приводить до фосфориляції і. ЕгОВ/І, і
ЕТВЗ.
Пригнічення антитілом стимульованої лігандом (НАС, ВТС, ЕСЕ і НОР) фосфориляції ЕТЬВЗ
Здатність антитіла АЬ Моб пригнічувати індуковану лігандом (НАВС, ВТС, ЕСЕ ї НЕЕ) фосфориляцію
ЕВЗ досліджувалась за наступною методикою: 1. Клітини АдгК наносять на 9б-лункову планшету зі щільністю 30000 клітин/лунку/100 мкл в середовищі ЕРМІ, яке містить 10 95 ЕВ5, і дають рости впродовж ночі. 2. Наступного дня клітин позбавляють сироватки, для чого замінюють середовище на таке, що не містить ЕВ5, і дають рости впродовж ночі. 3. Клітини попередньо обробляють різними концентраціями антитіла АБ Моб (від 0,01 нМ до 100
НМ) чи буфером (контроль) впродовж 2 годин. 4. Потім клітини стимулюють, використовуючи 10 нМ НК їі НОЕ впродовж 10 хвилин або 10 нм
ВТС і ЕСЕ впродовж 5 хвилин. 5. Реакцію припиняють, видаляючи культуральне середовище і промиваючи клітини один раз льодової холодності РВ5. 6. Потім клітини піддають лізису в 25 мМ Ттгі5, рРН--7,5; 150 мМ Масі, 1 мМ ЕОТА, 1,0 95 Піп Х-100, 1,0 956 СНАРБ, 10 95 в/в гліцерину, доповненому 1Х інгібітору протеази і 1Х інгібітору фосфатази. 7. В клітинних лізатах вимірюють фосфориляцію ЕгЬВ3 з використанням набору Нитап Рпоз5рпо-
ЕтбВЗ ЕГІЗА (КО Зузіет5, США, кат. Мо ОУС1769) у відповідності до інструкцій виробника.
Пригнічення антитілом утворення білкового комплексу ЕГОВ2-ЕТЬВЗ
Клітини АагК попередньо інкубували з буфером (контроль) або з 250 нМ антитіла АБ Моб впродовж 60 хвилин при кімнатній температурі, після чого обробили 10 нМ НК чи 10 нМ ВТС чи контрольним буфером впродовж 10 хвилин. Потім клітини піддали лізису в 25 мМ Тті5, рН-7,5; 150 мМ Масі, 1 мМ
ЕОТА, 1,0 95 Тип Х-100, 1,0 96 СНАРБ, 10 95 в/в гліцерину, доповненому 0,2 ММ РМ5БЕ, 50 мТО/мл апротиніну і 100 мкМ лейпептину. Неочищений лізат нетривало центрифугували для видалення нерозчинного матеріалу. Супернатант (надосадовий шар) перенесли в нову пробірку Епендорфа і додали анти-ЕГОВЗ3 антитіло (Запіа Стгий 550-285) в розведенні 1:500. Супернатанти інкубували впродовж ночі при обережному струшуванні при 49С. 60 мкл бусинок іммобілізованого білку А/5 агарози (Ріегсе, США, кат. Мо 20421) спочатку промили 1Х РВ5. Суміш клітинний лізат-антитіло додали до промитих РВ5 бусинок і інкубували впродовж 2 годин при обережному струшуванні при 490. Потім імунопреципітати тричі промивали льодяної температури буфером для лізису, ресуспендували в 30 мкл 2Х 505 буферу для зразка (505 - додецилсульфат натрію), піддавали термічній денатурації при 95027 впродовж 7 хвилин і проганяли на 4-12 95 Віб-Тгі5 гелях, аналізували методом електрофорезу в поліактиламідному гелі з додецилсульфатом натрію (505-РАСЕ) і перенесли на РУХОЕ мембрану в три-гліциновому буфері з 10 96 Меон. Мембрану блокували впродовж 1 години в 10 мл блокуючого буферу (Гі-Сог Віозсіепсе5, США, кат. Мо 927-40000), після чого інкубували з анти-ЕгЬВ2 антитілом в розведенні 1:1000 (Сеї!І бБідпаїпуд ТесппоЇоду, США, кат. Мо 2908) в 10 мл блокуючого буферу (Гі-Сог
Віозсіепсе5, кат. Мо 927-40000). Сигнал виявляли за допомогою ІКОуевоО0 козла проти кролика в розведенні 1:5000 (2 мкл) в 10 мл блокуючого буферу (І і-Сог Віозсіепсе5, кат. Мо 927-40000).
Було показано також, що антитіло АБ Моб повністю пригнічує стимульоване НАС утворення комплексу ЕГОВ2/3З (Фіг. 298).
Еквіваленти
Спеціалісти в цій галузі мають визнати чи зможуть переконатись в тому, що шляхом не більше, ніж рутинного експериментування, можна знайти багато еквівалентів конкретних варіантів здійснення описаного тут винаходу. Такі еквіваленти вважаються такими, що охоплюються наступною формулою винаходу. Будь-яка комбінація варіантів здійснення, розкритих в залежних пунктах формули винаходу, входить до об'єму даного винаходу.
Включення за посиланням
Всі публікації, патенти і патентні заявки, що розглядаються, згадані тут, вважаються включеними в даний опис в повному об'ємі за посиланням.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ тр рег ху ака ер место АТ тати ші МЕРРІМАХ ФфАСМАСЬКТІКАПЯ, ІНК. мини да акт тут о три А : ж тА т. к: го
ФівО» АБТИТІЛА ПпосотТИи ЕБВВЗ ТА їх ВИКОРИСТАННЯ жи з
І пе ММ й й Ав «ах вСтТИпеЕТповВиплві1а «іч ВО и о синя ж ти пи «їБОох БОИ/ЗОЕ, ЗО «БІ ецО- 02-56 яри ща ил сто «тай» віз, ах кі па -01-05 «ї80з 53 «ій» Патент у версії 3, кт мох 1» її де. ак «Феї 118 «ти ЗТ
ТЕ пр КІ сли стажу хх кий» ШЩтУучва песліповність деп жих. сема . туту Й ори я пити ТИ ук т у ху кед пон чщ :ї «сФсивах и приміткає"Оодис штУчНОЇ послідовності: тихе тідтихй км тд трехд уві?
Сивтетичнкий попіпептиа. «апп її
У ек т пові: их паз, щи С ку ЕТ я жу. ша ео. Вишня сор хи ко спа ува сур бен Ге аїль бек бі 1 щу првЯ Мве Пів о бжаж ие са 1 к | 10 щ5 я Ся о М злу Фе дет, качання І по - ї ук їх сту с ХА о. ві ач В х бек цес Дюк Без сек Сув Ала Аза бек піу Ва тВу Реве о дек Бі Тук о Ж З яв ле - ху ік че и йди (Зх шо хх Тара КА х -
Уві мес віз Ткр Уві Ду СЕ о Ата Рко б1у бує о1у Мем бій Тур о Уві да я: лют ення На а ШІ Жовтих то ах блю 30 ота Сн
Щек век гі ек ЕТ бек с1у біУ Тр тТвх без» Тух Дія Авв бек Уві -О а ви н ек ля колаж СТ тт тора лю щш ла йдож зує у че тео Хо з був сіу бсу бпе Тис тїє Бест ово АвроАво Зек Був АвваоОтня Бе тує ик ет - не 5 то ТВ що ни сг ов пак отр ук ше сера ж- з В НІ ях за -
Мет са Месє Двпобек без оАху Азв обі дер ТВхУ Дів уаї Тук о Тух був ве: па рен пере пу БІЛ Ж лу Ж ко Манн оо ОЛлх Ух хи Кн Но НН а в
ТЕ дкш баіу вем бук Мах віч Тви ів бе жор гук Кв осіУ вів ет
ЖИ ик тт; щи ло тою Ж одля ЖфуЯ трон якщо тп ви Уві їх Уві Зек цех 115 «ей :
пр тях ків 11 ресур Би гм «ТИ ВТ ом СВ Після, ре рев у че» Штучна посліловнуєть еВ ве очнея 7 пити мери сту но ЕУч ди стриж рт ст ту З ї свй» , приміткак"Олпис втучної песпідоввостії
СимуєтичимМИ попіпептиде «апОм й
ТЯ жо дан ДТ Жоюкі ТИ жо кт та ЯН их же к жк 7. и я КИ ВЕК сзіп Бек дія бен Тпт біб Ехо Аза тех баї бах сі Зак рко БІ піп х її й що
А А 15 15 а в з тт се нн но Тк фах АТ я ку Федя же СЕМ жк СЕ трак» ес Те тв о Ттєе Зег був Тпх б1у ТО бЗес бек Ар ув сту бек Тек туї у «тро 2 а Бо) а ее виш е шО яри ІТ ла ни о НН - Ж - т
Аві Уві Уві шетї ТЕЖ Тух ОІп зів нів Ро бі був Аза бо був пав 75 я 35 450 а ьо якшо рух у хх Си 2 я Оу ми СИТА тк ин кожну 0 Дн ен
Тже Тіє Тук 5То Уді шек біб вАкЗ ко Чех сіУу Уві Бех Ази Ага Бе ле п їй що 8 5О
Фан Ку СХ о и вуж ТІ От тр Н те 7 дю вк ох зак сіу шетг ГУ ш-ожАх ЗУ айви ожнх Аа пек Бей Теж тів бак СІ У Бей аб та 75 НО ої з дл их, но сви КН ж. ен уж св скати - 4 гу
Біп тТвх Сів дДБробів Аїе Аве Тут Тук дув Су Бех о їСух Дів біу Бег вк | ЗО | ше
З ту сем Хр Тк Ох, Зх тяж т-щ ря РЕ. тов
Зах 1 рие Маї Хе вне щу бі пі1у ТВУ був Уаї Твх Уаї Пец пе віх че 19 ч А 5 ОКХ Ге ов нин ЗЕ кА
Кеш жа «ша КК «жів? ВІТ ро ов ли вч Не потр я пет «гід Штучна посліцевніств сту тт, й : «Ех ока дк чить пкоутя -Жо свт буки що рн
Хей й примуткае сопУсС штучної послІдДсВввОостіх
Синтхвтичний поліпептид" шаг»: А пт тро ит хі Теж ті Шия й бля, Бі ту СВ ал по деку тії ху віз маю біп обецй геУ біц 5ес су шіє біу рем Уві бів Ко бі біу з 5 то ІЗ ре пкт хх У Жов Фени ин ЕЛ я тв що - Раш о І и Ше вич Б не и шия ко чех цев одйтт Пед вв Сув дів Літа бек б5іу вне тпе ває бат Аза тут ж ХВ З. т - Мет Толнохо божу ее Яку ВЛ ня мом вк в М ОН як 4 хи зх Е вп оМес Ако. у КЕ ох зі Ак бів Ав оБко б1іу У У ошАу бер с-ще Тх5 Уаї
З З Я Е : на Х г ва о 45
Фе ка тд ви р Фе бли КЛ ля Й р нн яр ДЕ я зг-щ зех Уаї Т16 Тук Ркб хек зіїу 1у Алі ТВх Дхо ТУух Дів Аве Бех Уві ; пк у: тр тА 5 еш Біо дк Бе отв о тів ше Джип де два дек Бед дви ти бер тує му за ОК И ПЕ ОКУ ее жи ло шт ЗЕ мущшотмнІМ Між пем жук
Ко: І 78 БО
Ж х ожах Го Го ор о не КНУ Не тро що очно кож.
Без іп Мекс ово беї жо Ага Аза бів двр їх Аза Уді ТУЮ Тут Суд
Зо 5 -т чук Отож Тк я роуунк Мекжа у жк З що т з бля Мур йізв'ага БУ Ток ТтТУЄ ТуУук Тур 531 Мех Ав о Уві Тхв БіУу біп РУ ТЕ - и ерсеих Гах Й що М5 10 т ле невинним Ех р о дл пез УЗА Тих У«ї Бек бех 115 чі пі м «ах а «11 ТО ий ЗИ
Бекуче нн ях . Я є кі Я цх ка» Штучна послаідовнасть «ва0х «туту Й нику тік джен ву тет меумлясуєттї «2835 ; приміткаж"Опис штучнаї послідовності
Синтетичний поліпептид" рих и кавОх я т ооЖсуюо уд т ї оц а шо Ше ж Ск що г я мих Спи жу и
Зіп век Маю цей Тахо бій Бгто Рус о Яеах Аза бек Бзу ТЕЖ Бра біж біт «т - но 1 5 Ін; 15 і уни тид у лет б т т ч г : ди щ г ре кж уч В
Аха чаї Жих Ехе бек Су ек ІМ Бек Ар озек Ав ї18 515 Ах ДБп тих пи з о ре 30 о «о кщя- дижтюи Витяги сет Ж я СЖуахуч и шк ре од тя ву -. жо
Тухк ее Тух Тево тує сп обІій ВМе БЖЕО біу Та о Ата Рко був бею рей 75 жо а5 я ще з ви шо кое пит ож я У чих я що роурчнк си ШЕ
Іре тур Ак Дер» дв обі вка Ро бех сту баї Ро АкроАтоа ї112 дек з ! ян 50 їі Зат їв ке щу тьЕ ЕВУ ДІВ Фаеру. Бе А їії-е Дех пі тем ду шу ее ув о еотк су пж ошеЕ ваш шжех щей лЬев їі ге ек су сейовує
Коса зв У я то Та с - са ТК век, ета В 3 Фо і ше я Ж я - 1 Б хучщях, ш- -е ше; т. зак шию Авт біл Аз біц тує НІВ Сув БУ ТАС отже Ар о дво Зегоцеу резрої ит -
Ге о 8 шо ра -и дню ї- що Й бух як и, У о ач що ІА ет Зі Бра Уа: Ере сСіу 1у біу ТБЖ Буш без ТЕ Уві во 130 ян її «В» 5 Що шт тиву ту «віхи Її побуту ев. «їв» ЗТ «ій» Штучна песпінповність. «вай? ол й примітка пируєснох фе сидіти я чек, приміткаєт Опис штУучнОУ послід внетА
Синтетичний попіпвптищ'" ж й у ЕЕ «щОшШе 5 х
Кос жни тт лою Ту Жир Ку За із бік ту тої З. зе я дю Я бе Ві Іі Сем ев спі БВ піУу БіуУу бі бай Уа біт Рего пі зіу 1 х 15 15 пря то ся що т рн фу Ве І; дом Мої зши реодяе т : ; чи вет їев Ак цей бат Су Адбв дів шк сСіу Бе ТВкЕ Р» о сбет атіа тує уд - ех Й о В БІВ
21-х Хе Тло те уч Фооуєиж га под х пря шк х зт « Зоя пн її с1У Мег біУ ТЕО чаї Ака бів діа Бо пі бух біу во бій ТЕрочмаі
З СТВІ а
Бех Тук їіе Бех Рхо бек іу БА Вів ТЕ бує ТК Аза дер бек Уа) 50 85 І ї лів й ти сх вод ин тоне схожі - я с шех ст - - Кг ву
Був о шіуУу Акоа Ве ТБ тів дек Ака Ар оАврдойеж БУ дв тик Бер, Тух ва то 75 ва чи. ТПеин В сет пи ання Зодоеи у з пр А що хр є тут тя пев бу Меї Аби бек гемо оАра Аза с сі: Авротнх Аів уві ТУук Тух був за за г шо 1 говуя р тртт ств. п Ї 5 по хи - сх. -
Аза БУ ув рей оса ТЕ осі ев о Се Уві АвроАла ВНе дво її Туз 155 105 115 с-у Мп о сіУу Те Ме Уві ТВ Чаї Звк бек
ІЗ ко «Ро в й «кл ЩО «ер в ая каїши ВІ шу ик Пт кт ч дути и ку тя р і в «ій Штучна послаідевнаікштів жу «МИ? «ай и поимісказ" Опис шжучноеї песліІцевностя: тих. ГуИех рн АН ей
Сянтетичний полем «ас сих Мр дж ня ек СТ у о ше п зе Ко ВН ї Се і Фр сич кт ж зХи ТУ Мо бес Те сів Руб Руб Зех УВІ Єв Уві ТУ Бсо сіу сій 1 З хо 15 сія тив З бук о фак бу ку То 1 пух ; «у ; ще жкщол твх дав дак їЗіє ТБж Су бе ЗіУ Аво о біб Без стУ Бек цу Рне стві році 25 БЕН х г «о в реа з нн НИК - «о Туучю х то дожи пе бржх- зек Тхгр їУух Бів іп о Аго вжо бу біз бах РКО Уаї їй Уві МеботТех
ЗЕ 49 45
Пув йо Пуз КУ Аха Еко БЗет бій Хі Еко Ос бо БНе бек бу Бех х я во - ШО? - М ой 7
БО ЗЕ 5 тож деко бю ик спін у спр Ток пн ще що шу т ї" ше ван
Кшао Бех СТУ Авп отв дів Тну Гей ТвВЕ Ії Вак сі ТвЕ бій дтя ТІ 5 т ту зо кет й ТО мя сю уж дж БУ поджує Фред - Я б не
Авробіч Аза во Тук тук Сув Сів Аа Тер оАвю бек Бес Тру тую Уві 85 зо 5 ек З я І шлю ств т Кк г- кан шу т
Епесовіу тТрх БА Тих Куш Уві ТВх баї Бей ит чем 150 ТО «105 7 «жа соль пут и сті? ЗІ «ІЗ» Штучна послідовність «ІОВ пот, А - паж холкукш ТЕ Кутя у птіхк тт Хо ячут п «ешай у примеркасє"Опис штучної послідовно: нею ї ч сч й.
Сиктеумичний пептид" у част їі
Я бут сте Же з
Ніз Тук Уві Мек Дід з с ії 5 «йти В сет я «М «ши ЕЙ «ад Штучна тими ко ква» ли з. х . ї. ик і ж - о - до в рунх ня Я ж «ва У приміткаез"Опис штучнеї послідавноша: их гу зд рн сивтежичниМй пепекд «8005 В вд НИ А Сили кад и ан На аж вашу ик Ки: я сш а Тов
ЗеЕ їіє век бек Бек бі щЩіУу Тк» Тр Бех Ту Вів Авр о бех таї пу ї в. їп їй пані є щі
Сл ни - п «я «Ії 1 «ий» ВТ «Та» Штучна поспідовність сей чаша й примітказ"Оолис штучнаї песпідсввосвх:
Симлпетимний пПЕейтищ" ся В ча З :
Сьшни шк п й змен С в 1. вл т- ьх Мжох
Сім ї-о муз Мег Аха ТВх бі Бе Аве тує т к ЗА - як М пн неки в: УШВе ше
КАМ АХ
«Фет 1 «їв ВД «ма Штучна послідсвнусть «а хи ту: теідитк і спав ут Прима їх оутитлечи ох сайт й пемиміткасо Снтис штучної послідовності:
СинлестичниМм гер" ча» 15 пи. зоною біди удо сп шуму Лиш я тю пух то едся Вр ек
ТЕ ОЄбТУ Тк важ Бек Аяв о Маї бів бек Тер оДви о тві ча оБеЕк з - І то
У а ша «кйїОм 17 у сту, я кл ний си олуг ун «Тіз ВЕ «кій Штучна пошле внистлв
«ж усвржрту Дощ Х іду й, - серелоквко ож в, зх «жк» й приміткаеє"Опис штучної поснлідсвностії я. ї ля вих чт
Синтетичний пвитищ" «400 т ча КежАНИ Стих М ин ния дя зів Уаї Беж бій Аку Бтє пе я т ї З тю ку ху сих їй «І клі ЗТ «іх ЩШтУсна доспідовність «чив ума ан и сит рт У тер туру ти «Еко й приміжтказ"сопис штучної послідовності:
Синттєвичний пептищ" «400 15
Пиво ВВЕ Ту Ліва бТ1Уу Бек вк їі ББПеБоуві Т16 я е г
Ж г) 3 «й ІЗ «її 5 чаї» ЗЕ кеїі1З2 Штучна пеослпідсвніалвь утри «ший
Ак й пра кя хв ех ря пинхАтеХ прп туди «ша й примітка" Опис штучної послідовності: ра г МУКУ дріт шинепУвичви ПЕЧЕРИ щ «апп і
РІ Я ян ок дя тому вла ТУЮ АВ МеЖ АКИ
З «5 «Ей 4 шт -- я «вів ЗІ сиїа» щшеУчна послідовні сев «390» «вах й приміткак" Опис штучної послідовності сСивтетичний пептид" «ар 14 я З. ою хіх шум Ше да нн ж кВА І Мн Мо ож пшона Ко Ж тав Іс тую Ехо Беї біу сту із ТВт АКУ Теж Аїв двроБек уві БУВ
М к КН! й ї З ТО ЇЇ і «ох 15 сер З
«шо ВЖИ ет | ку КЕ. екон о п і ша «13» Штучна послідовність «и еле Йо, хе «ук Е ку х шШ зи. Я ж чикот приміткаєтиєс штучнеї послідовне: синтетичний пептих" «ОО 15 пе бе Тл ни о ху «их колу
Сію тую Ту ТУук тую ау Меїх Ар ов - х
Н « 10» 15 длуж ях тосту; й «юн ТВ : кп ття ут «Іа ВІЙ дату тя Ко кжнм и дат, ки я ї щ а.
ІЗ Шеучна поспідовихств «ких «ша» , приміткає"Омис штучної послудовноєтх:
Сянтетичний пейтий" «45 16
В З ця й як Он как рю дом рок зо Имя ую цавж бі бер Авробек Ав обі Я4у Акаш Аза о Тую Те туф й й дя ї В КО ! «2017 «иа «То» ЗЕ са» тучнае послідовність шерернуюх
Кк си акво і ни и сг віти ки пред сту рр я ше й прим Ежкат опис шхУчза посльдевнОоЄстих кути сут сю фурксоку т спинтетоаний пептид «ча Кі тк ск пед суєти г р; терен ШО нукх
Ага Ав Ав іп Аж Бжо Зеж 1 5 я КВ: кеї1ї? 11 «ай ВТ «ій Шштуциа послідовність халат ке кКАН «232 й приміткає"Опис штузної послідовності пткжилут их з едтиа щ сгетає м пимтетичсний пептид з Его ч- ках З селфи хі де Мао Фуко Тоня буд ММ: уч лев віУ ТНК Тв Авр о Азрвожх Сей бек БІіУ Вко Увх
Ї 5 їі «100 15 «тії 5 «шій КИ ря я. . м ке182 Штучна послідовність «ге» / приміткає"Опис вбучнеої послідсвності г пи у НН в -Млтетичний іти «ак та чи се
Віа Ту ШУ МЕЖ 51 ня ія
Ек я
Яр ню т «и 17
МЕТУ КД
«и ЗТ еа» Штучна послідавнаісєть «оо» уста : ТЯ и о - но с Ж м й їх «жах и приміткат"Опис штучної послідовності:
Дихкухииіі и ву и з рр р ра
СинтетуУчний попіпентий я т кп АК
КАН Вр й ла ж ня ШК пох: Сх Я о пу стою тих ке - вх шик. и же іУх їзе ех хо стек ку сі пів тТпЕ був ТУ Аїв Ар овЕХ Уйі Був
І ї ло 5 ах иа ШВУ че кі «шії2 13 «гій ЗІ з буря р нта ві етики уко Я ит «вії» Штучна послідовність «рго5 од тутутує х оду і нс да БЕ из мзпауау тран пінь ер тт ж сегат ; примьткан пис штучний посладекяхнлянь сх
Сяинтатичний пепйтвд" «або кА чаеі1 ем бл таж біб їео без Уа Ах ва впе дев 118 1 З Іо прав туту каз ий киїії» 11 «ві» ВЖИ деле соте вия іехткт тінуликІч ща «від» Штучна послідовність чий ее ; кож кт Ви м по нн ня : киеве и приміткае Опис втечної поблідевностії
Сивтетичний пептид" сао ие
Бек піу ев біг оЇїшв БрУу Бех Був пе Уа бек ї 5 зи м к. ях.
«а З кв1і1ї19» 8 збу лютуя «пуб «2125 ВІН цип лу Тіентю 5 тики ктать я рев: сеЕ8» Штучна послідовність «и «т 5 яко Й о срімрддя с пис и ній пійтУХТИ СУ везе фуд -шейи 6 ТщшИиМішжкВО-я Опис штучном пПпОоспІЬдовНносшекІ
Кк тетгритлїх та КІМ т
Синтетичний пайжиди пря те Я Во ке рони о Ху М раею туї Гуз двр їжа хз Аку жо спек розу шок 1 т . кет аа
КЕ В птзльх же чеїйи ЗІ «кій Штучна паслідовність «ех «Ей У поримізЕде"Опис штуйнаї подиьпевВношиі гад дитяти пекти -Оннжесжичний пептид кро я й Зощо я ж теж дю хз: шо хвалу рт іа: Аза бтю АБ обзем бе ПЕ Тук уві 1 5 личина ств ч«їа ий «11 ВО прос зт «й Др шик «ДІ Штечна посСліуповнаІсть да Тут. ж дк Кк Кт, - ну ту тут прик вд ж пр ту ТИ о р ния чав я «кий и 1риміткак пис штучне мпонотмеМвненикУо
Синаетичний пепівуюнестяв" «Я ее сит ее п о ие стран ее дю туту дж ж пе какая 2 ще п п ДЕ стем чи г сг свасччкцсацчс сосодовово соосодазуя сеоостссвас своссозучсве себя ее ран рт я ач чн п о и у чи о тя щ- сх лики ск т33 воссвосовосп совчссасУ сасссзсває сассвсосвза Сочискссасї сессдосадасос 15 ссадчсваще чосвосваку ччсшссснас «сацчоашо зЗезосодоео дасосевеве 180 тран не оп о оо жи пи уроч аа пу ау пр НУ стсцЧасацео сова сея ЗсЕсСВссСаЕс зуєсасоавова зозссавова сасссуптвс о -ткссадасоза асвоасстоава соасстуадсає вссоссогбох астсассвясат сазозасесоя 00 авцЗзсЧасоа бсавссевсув спаскасовс сайссосвєссс бопувнеяе баасяаєсе 357 «їй» яв. ки1її 553 киїши ДИКЕ «иа» Штучна послідовні ств сей» сєааа» 7 примітка "Олис штучної послідевность:
Синтетичний попівУКЛЕСТИЩИ «Оп ие свачиседоесс хоБсссвосо счссапсосо азососадес сазасовазу сасовссвло БО ауекусасся дсессазчсвое сосасасссос адстасвасо сспобугеста чбравсвосєсвау 159 сабссобоаса асттснсвя споєчЧевсякє бвослзусоє сесосвоводлє садова СНО засайсваці ссацозусза саазацечас аасозосасса сссісаксвс сасбосескя го свзчвсоссвсо ясспиобеоЧа свастасбоас соасвоскаса ссодевдеасяз сасовоюокоа З0о авт сзсос саосеасояа ого св | З ке «вії» 354 кшіш» ДНЕ «2185» Штучва послідовність ! «22 «та и приміткає"Опмо штучної послідовності:
Синтетичний полінуклестид" «ДО Я злачеасосаас Боссоавааве суссусчачеє ссчасосаос саддсдосва сесовалева
ЕествсвОося псвасоцеве расстєсадче дссвасааєв гововеодеає псоочсвелеє 120 есазбосвазу Зсстоозабв аабассоого зЕосавоссв осзоаєсеузває свсосвуаеяє Мо сесчасвося КЗазчоссви чсссвессвіс зчезосласа всацсвавуУча сассскахтас 840 стссяацчаєса зсвосесови залодавоувс ассопсереа всжасвосос свозлччстас оо тевсевсктася дсезбстласаї ссдочсассат дасассстод савосабавоа своє зве «хи» В «112 330 «с«кЕігз ДЕК «ІВ» Штучня посліповнасть «Ір» сєдо3 й приміткає"Опис лісучної послідовності:
Синтетичний попІнуклеотнии" кв» В садаплескшо засссачеос ссоваусчос адсудевссо садоссзаас сотовесСавих 60 ачсецсвасоа псасчесдяасда свгасабсзос воозласбасв їстассочта шсаздовосте 195 сседЗосвосу сососваасю Чогавесвас видЧазезасо вбазасссвоа сзцозсосес ЛО шесвзчасса деоопсвосве пзоасосовос васоссався содспаєтву сезссбвао Я зассазаася возссозаїта сстассослес вестІсучася чсзшссстаяЯ соддососвоаса 300 тесяасузаоя пцассвваст Зассокестя з3о «рій 28 «йіх За6 «512» ПЕК «кі» Штучна послідовність «ша; примітказ"Опис штучної посліновності:
Скятенишний лину клеОнищ «асо чвасиховає естасвов сдотедесав стотодсесацче сослецзеєєе остео свк о кстсссявсв стсссочасс свотукссох обдоссасуУста соска псуссавоусг 150 сстуцтавац ЗзсЕтосачтв Чобесоєтає етотексств сеЗдеоосса састзасттає 180
Чосевстсту ссавазвлуссо ссесвсєасс сссацачянся асбсбаноза Басбовогас 940 сосзсачаєсв всабоєсває зостовачас абсососсосас аксзсвоасоас давассвств 290
ЧалвстоФеє сакхзассюа сассжесеоає весбосоосс авоозасває ооссассоко 3650 їсазао 366 єгров ЗО : тт 218 сег» ДНК стій» Штучна послідовність «и «вк у примітка-"Опис штучнаї поСлідовнаєтіїл сСинтвтичний полінуклеотид" «ар З свчевозавЕ ЕЧастсвуєс ассостсвачсоа тосесотасео своЗасазаєс зЗссаасвЕе о асссдсвоба Часвоісавтху здазчвесава сосок сссь чаваєсадса дасосовчас 1950 сацісссска богбоцісах Зіасавачає авачозчсече счссововЧає сссідзпсов 185 тест ше ссвавибссоу здзасазсздос асбсісасса бсвосодпає ссвосостаса 240 заєзаучсте астаттаєта ссвоасосотЗ пасвосадев сттававев: содсасіосюву 300 ассаазаеса осабоста . ЗВ «твій» З «чкіїз 35 «2192 ДЕ «ВЕ Штучна послідсвидета «ве со», поиміткае"Опиш штучна послідевнасриї пПинеетичний полпінУуклестий" «а 3 чвастссаву Соєсасачіс Єдесоссаце сзстсксовує ссозсоЗзс встанов Во
Есссососко сесссооаБ: састтостсб саставсабва басеврадеє бслесавосї 190 себсосіваая Чсскодачтв аускевесю вестобесве стачечосоко свосшовевав 180 чЧствасьсст бтазачеасстя стєсастасєс сстачачаса асестеавчав сасестотас 950 стосасвйув аслеацттсвах частоавзчас всачсодеое асеассугас газзасассто З лазчасоачета свати кса созсстадачо саддасвсоо подосововат сссзацо 357 «810» 32 «2112 333 «2102 ДЕ «2132 Штучна послідовність «вах кеша» й, примітмхає"Огис штучнОї послідовності:
Синтетичний полівМЕЛООТИД" «90 ох сечадеатох базскосвотже сСусеососЯсоа сосозчсс сслувоваєс сапсвосаво БО
Ксестосасту уваствусаоє счабостовсе аФесабвеса КЕоарсєсссту дтассяасвяв 120 сасссзодсе авоассососва всссвосвік Євтовзоазсов спосадсодсо сссвососсїї ТВО сстїавксчев сосссаасес сазоасскадо авсашчасе сесгосечах сссосдедсво 240 свозстдзуч асовсоєтся ЖЕВЗЕКасБес Бостсвсявоа базова басуссовва З00 подо реити гоико чн Фоетмивиччиувя от ЗХ атавстозчесо сасозаєсвв себе восочво ста п ктулот тут : «і» 3 реа шо уся «из 354 жур: те «ій ПЕ «віз» ШеучнЕ ПОСЛІДОВНІСТЬ «9205
РКО й суки да т, гри керу ху я кит. тя ср сплуті ьт іх ї я «23 й поиміткає"Опис штучної песлідовнасхії
Сивтетичний полінуклестий" «ОО» 33 зпаацеєссває соссСачнауєс содсодосває ссвБоєссавс стукав сбсвсоуєио 50 феод вк ери ие чн у М п Ви ли п ен и о и оре с -щ едикт ен ТИ їтестзоЧее ссессзув сасБЕтстсх зостасвата сусоксочев ссоссвазше Мо стогчазсладоа спЕсксовоубо сессісьє всслаксє ссвеоссо басессстайх 150
Са шана ста шкід фл всведдит в дур тем очи ие ся пий чесчастссо бЕввачлцесоа стісавсьвес ссбвдацдяса еосокадчає асо еваєс йо є -к - г. п вк Е претет, що сти атктя с же ж ур дуже тут ж що вч прю рек отих ут стшсзозтоз зсадсставо чесесчаачат всадчесчсос астастогас баоачочеас пвсвасєтвсо статолпасеє стаазассяае пссзосстЗзЗ певсеЗіске васе з «им а «ві» 330
Щеня Е «ві ДИ «2135» Штучив послаюповніств : пере тую : «АК «223 и приміткає"Одис штучної послідовності:
Синтазтиччий попінуклеотицд" «Оп» 4 жу уки куму ки се дя т соки дор жду К і жд пут роукотроюнтня тю ню ДІ свавасассе сСозсксвцюс васостсовуса ссосудааосс сеоуссаовя чабсассаке во ссасоск сб даастзасвс садлсвзрсаца асзваттаєа гаївігоста ссавосавекс 190 севгсцвасоЗ ссесссвасчоу ссвсавЕсває зодазавсаавс восаєссстє васопобсюеї Во своссадест сбачесссве чЧІсСЕбОсВвсс сСаууєсотсс бадосвтсвт саадовессвЗ о
К АЖ пришестя ж кри фот г - р тери ля призів у - ВИХ восспвааавЕс чок цадка ссассвсода зсекЗучая шефи склаЯ спиш счсея ВЕБ сЕСсвууєссовзо Одуаставесс зчассоососов 30 «0 х 35 чиїх» 115 зу суду : «еІй ЗТ «вії» Штучна поспіпсовніств «ше шу тя. мен шок А чну лова срк уч вк имя - У як яти ки й примітка "ШИпис невБучни песпдадевасу
Синтетичний поОпапептид" «ап 35 бій Уві піп Тер Із бай бек Бі б1У Зі бо Зах бір ро Сію 1 1 , З їо ї5 бидощю ж ОН - поча З - і КТ зак Ка ше бно Тех, могу ючи чек бец АБ Пес Бех Сушж дія йіво век о зту Бле не Рпе беж Тур тує то шк 35 кі Ме сіу тк Уві да сь Аза ха бі Був бі дез біз Тов Уві 1о 45 ва хг ТЕО. на пи їм и дк ня ож З ик то ее ка он их Я ях Ен зак тук Хі вх РЕо бек сіу БІіу їі ТБ Уві Тук Вій дво Зах УвЕ
ВО хв 0 пух сіу Вуз Бе тн тів бек Вч джроАви Бек Ббуз двпотТнХ Бей тує
Каса: ТО Кох во тс у дао Да що Ж па Я кутя шу М МО Хо стер сту сит жк їжу біл мес Ар о Бех Гей Ак Аїв біб Авр отв Ата Уві ТУЮ ТУЮ Су ух, Пет Ек 85 Зо зе
ЩО ооо у Да ПП ж Ббдж ЖІ дя кує Тов гй си роя у Є дж дла Ата Сем Аж бек ТУЮ ТУуюк БІіУ Пез Аве Чаї ТЕвБ шпіу бів шіУ тТвЕ 155 125 115
Тк Уві ЖБх Узі Бех 58 ше а: «ІЗ 36 и Тов киев ВЕ кю пеки шу тер чт
З ш ШУ чн пООсСслрдевнНись «АП пулу й уми пути жпвхлхліди узи тк пе зе хежии й щприматкавсоОопис штучної послідовностих: дл. зх. тихі титу т «ат, і
Синтетичний поліпептид ту «асух 36 спітй Ав опіе сій оМес твЕБ ші ек гтОо 5вк Бах Гей; дей Аїв бех Уві :; Я я 1 ! З 10 15 ок В еч, пре ік и нн НЯ зажди й? ОА ля дум и х я І т сту дв» вхо ві ТВ їле Ах о Сув з блін ех бів Авр о б1іе с Аво 2о 5 Зо поро Ан я боуем т с тя по трюк тож то пол по Такі Та зек Пес дви ТЕО оТух вів опій Бу Бо 0тУу Був Акта Бта Аа ям: Тяка 88 45 45 її Тую Аяродів Бех Ав ей БМ Те оЗіУ Уаї РЕ втЗ дха вне бе
БІ 5 а біУ Бек Бі бах СЮУу Тпх дар о Бпе Тв Реве отТвеЕ Бре Ак! деж ех бір
ГА 7 75 що тах ЕЛ Теж вн г ЗК, - х ч т. уп Ж пас ст є М ух по вкО спі Аве Ті Дів Тв Ту во оСув пів біп бек АТа дя Аїа Кхо 85 зо з8 еве тає Епае осіб Рта сі ТЕ о Бу Ущі жор ТІ Буз я тих
Ух ре; кл сецши й я я Р «ее ЩІ «ЕР» ЗТ І : «ие Шуучна пебліпавністе срутжя «аж» «еВ й примівжасе Сицяє перичея гпослідсвносрі:
Синтетичний поліпептид"
зак. Гек ча тат «а й 7 пт зло хг пи. То т кожух зе бух ж т кх Тих ул то я порож КМ піч Уві бій Гез бет обіб бек сІіу біт бі ву УВІ бій вто б3у ту г. г ух а 3 З КН а шк т з Ж, Зх дом Жук Со тло Те рих и х т С КОС ун С- под ї зе зай оец Ас ес сви бух Афа два сек СТУ Ве ТБЕ Ббе да АК тТУух ст прп реа «А а ЗМ як Ач Н и а у ах Ки 4 Ще її ях рт т СХ ех ит Є т и біу Мех Ткр Ткр Уві вха біл вів Кто БіУу Буш бу Май біз Тер Ук пе АТ й
Б; 0 4 ту бух Рая ка. Же фено ЦЕ З Зк Бех р кю г яр дух Кв сяк
Бех Тут їїів сзіу беж пет бі біУ Хо ТВ тую Тухк Уаї Др обехк Уа
Гея Ге що
ЗО КЕ Ве пуд Крук Фйношк о пон СИ ОКУ ож тої З «х ж Ж рве А Ехя Па т ре пу сту ху ВЕ Тк Куе бек БО Аво АвпоБег бує Аа ТВкобев ТУЮ
Ніла трі й зов, о Х З я сх т- хх 4-0 дося Х ке Дали у Ех пох тт. А дощ Тихе ТИ жу ку їжи Біб Меє Авпобек Ппел АКч АїВ бій АЗротйк діа чат стью ТоЄ Су - т ср ки нау ни а пи КЛ КУ Межеум ав ен бахчею о Аж ші х
Аза Бі БА Ако Бі ЖТпх РКО тує Тує Бе Аве Бек Тр СБУ бів біу як тя яти
Ко 105 19
С ах су хочет Со беж жЖВк це) чаї ТБу Уві Бек век 115 15 рекет ша --су «10» ЗВ ки м три «Ії ТО дет ит сек с «Еш ВИ кеї4е Штучна посилдевнаств стул се зетулу ли Й вів яка і ети ще их я тік. стр турку «ве» й приміткакє" Опис штучної послідовності: синтехричзаив попіпееиде синів ше «ЦО» З й шт х тут Аа тя Фі йо шк Що б я би т ух я ден й у тя іп Тухк Бі: беюв Тпт о сіп ко Ага ошех Уві бЗвЕ біт Зекс бкоОо піч бі х КЕ ШЕ Гном в й 15 15 г Я тру не аск Оп на у не не ва я МИШІ о ока уже ТИ чних
Беж Те ТОК їі Бек Сук Тре осоТу Тахо бек ех АБО І11їЄ сі йхо Тр 20 шо 30 п з нн я о зар кл ті жах ті я Ж тод же Жорж тех
Ват вів ад йпех ТЕр о Тух біп о сій Ні Бк біу Бо АТа РК був Бе 43
Мас Гі ТУух Дав уві Бест би Лк ко бек Сіу ЧУ8Ї бву дав Ахо це
БО 55 БО зЗзехт сіу бБес Був Бей слу Ави Те Віа Бах о Грец Тк о їїе Бебосфу Пес 2 то Те що ложу кю й Моя ЖК. упря то тлутян Жах беж бу шов ба иле ту ож би бів вів БУ АБ смій дів др тую Ту Стув Бех бек отух ТНК Яву Бек п 5 гіду. МИХ те ча У я, ШЬ; ія ск ж тру ХК : зех ХЕ Же Таї Ббе сіу фу ЗУ М бує ви твх Хаї Тез
ВЕ 155 ії очної З «ий 1 «ЕЕ В «ех ЗТ
ЖЖ у мух и ріж ою р ункажкі чи шЕУчна псалом ши «ЕТО отут Га кв. Шон, -ї ятки зп жут іх коор шин и они «ситах; приМмЕткщх плани штУуйнои поСлІішвнисииіІ ід аміак Й сх т синмтежиний пептид"
Сун Ше І «ОО 55 тав тег сі меж іх о В; ї 1 5 «ші» в «и 17 «ща ТИ дожити сю тт нет ж ' «іа» цтучна посипідОовність «ие ик лю й - жк шш- а я Бо не я яки ну я я ру ні д «аз и примітка" Опис ШТУЧНОЇ послідОЗиності: (Сттктасисегпідтятітх зт " смитетвичний пептид - г о их «В о
Тух лів Бех РКО бек біУу Біо Тіє Тис лі Тук Аза Азов бах Уі Був 7 ке з Й "чук
М сх 10 15 аю и кат зі титр тм Е «ші
Ах ие. Пеїхьи «2193 ВТ «рід Цеучна послідовність вань «ЕМ
Пере нев - ожини МИ я и ин нку ня перш «Вей и примітка" Опис шетУчнОї послідовності пинтетваниькй пЕтнвидт І коду я ким
Бей оАяно ух Ту ТЕЖ сіУ Бей Або Уві ї 5 «й ай «иа «ЕЕ ВП тр Ні злет ІТ среди «жа т Штучна пПООСспііДдОбВНаІСЬ «ЕЕ жк ко приматкаєсоойлпис штучної поспаідавноеї сСивтетеануих йпептид" кап 40 аж ще Шк я вія с ї к Льаюру са Ко трун
Сів Ада бек б10 Ав оТів б3іу АБ о беЕ їв Ап ч щ Її ії 5. їй «ла «ак і «ии БІЙ «ві» Штучна гижлідовність ней ВІКАР: Тіною ИН їх «ви» од Я пера син й тет им ж, зкчичнх «се Я примиткав опис штучної послідовносяи: сСивтєтичний пептид кАпОз 43 ле Те Се си ИН йо 5 ті
Авр о атТа бе ДдялоЇнна полю ТВЕ ї 5 «Іо» ай сер ря : «ії» 8 «іш ВИ «ІЗ» Штуєий послідовність «ВВ. - ножу лук Й вт чкдак кі рр суди жк, у НН ин жк ум ка ях ї «ша 6 примітка "Опис штучної пюнлі левнастії
Синтатранихй пЕїреМД" «00 44 іп беж Аьшж да Аа Вже ВПе Так ї В «10» 45 «гії» 5 «Ваз ЩЕ тро м - тлу ї т-щї 2 киш Штучна послідовність кт ИиШа плужу туз ї ноут а нка аа о аа о дурно «ше» и примітка" Опве штучней пеосліденота: сСимтатичмий грЕп'иж «ан 45
Те. Плууме ПЛ ха Ману бод акт 1чЕ о Мешко: АЖ
Я І шо Кк 4 го «ати» 45 дит Їх; ев І сту |в Вр «и ат " «135 Штучна пеолідвнаєяиь иж ех кяння я Ко гтуч ї сел пре Туя и уки т я, я ся жит й хай» г приміска"Опис штучної послідсвиосту:ї
СОюктетичний пептиди «ай» з
ТУух Ііе сСіу шех Бех біУ Ту Рхо Тр ТУЮ ТЕ Укі дяк Берг Уві Був
З х ше у у 4 ! МОНЕ у ї В М ІВ учгтроюу шу «15 47 ста я «и» БО р: ж Уууукт «вій ВТО кут лтхїї Ух Ем ки, зп тт, «ами Штучна послідовність «ее «23» й приміткат"Опис зрушної пебвійдовнесе сей ОО примітка ла Цке я птІУучноК песпІдовноє их
Сичтетичний пептяд' «Ост ня код вк й пу ти о хау ша бі Акад Стіу ТП рхо ТУх Тук ББе Авро Бех
ЩІ ц ще 1 З 15 «Ох АВ и не АНЯ «ЕТ Уа «1» ЗТ як режатню, пищищо зум тем кі» Шучна псослІДсвність «ший пуху лук Глен ж Яхно сади. ФІН АТІМІУУ птиуч тк ле ід кю хи й пПримішкае" Опис штучної поснидеовностх тяг хіх ІТЕІ КК ор мьяях іч сшШинтетичний пеплид «ОС ай ч зе коех є ок - шо яю Ж псхте т ет ї- реч
ТЕ Оу ТвВк о сбех дек Аве ої1з б1у Аж Тхр Ав тіе Ма3 Чех
Й : я ї 5) 1 «их ЗУ
Кекси о «ФЕМ ту тули жут кшіи ЗТ хр у» кукі ск ж тиж рив «їй» Штучна посліІдДОВНІСТЬ ; «СЕ ДК» ут ух, Га сих. Яотт - коооиєрех г ; ще ач фут ж гемо «иа3з / приміткае" (ес штузної послудовноии:
Синтетичний пептид" «400 а пана Хек сяг т ї
Аж Мал Бек АВО ака ко Бе з В «Фа ж ВО «112 0 «как ВТ пп жк пасе мислі повиісте «жо шЖхучнва послідовна сте ши «ше й приміткач"Орис што послідевнкОості
Синтетичний септиде пої их й «ІІ» БО по є до Ж и су я м НН - тА зехк сек гук ХпЕ о бБет цех дес їТпЕ о тТЕЮ о Уді й їй к ї З то «их 5 «Ек ТІ викрутити «ші ЗИ пот ил, г У стжеч внести мі ; «-ї3е Штучна послідов Мсть туту «ЕМ стату ту га --к Здвх ті зл ТЯ між сек рю кт уче «шайв й примітка е"Опис дижучниї поспедсеанастя: т. суєті: тка жи зе гри чав, иктатичний подіти" «рим 51 гхт Со Бі ти пре пк а з Ед су так ще Пт сіпошек Віа Пе» тп бля во АТ Зек Уві йдех б5ЗруУу Бак Рко бБіу бій й Яй х і їй З 19 їЗ
А пора сплте СКЛощ Хв дк тлі х кр С дпске. Док Не Коди дж век дів жЖпйж Бі вес сСув Тпк обіу ТМІ беї Бек АвроУві (б беж тує що ве щу
ЕК) З 36 тюмх ЕК т т Со тку подо и Не ванн Жажсию БИ божу їх ще Ж ват : два Уаї чаї явеІ ТЕвоТут сзіп Біб Ні Рг СУ Був Ата РЕ пу їво г Я ру Те р Шк 15 дну наве пк ву д-нх нь тижні Ся Тк ти Ста фун тки зе
Меє тїіє Тук щіч Уві Бе пу Акау Бто бБвтосЗьуУу Одді Бек Авп ока Ропе цл ок; ої
ЗО я по
Ди ОТ св душ пк СКЛ Фршеж спее ос , т с От але Мч ШИ
Шев бі веж Буш век б1іу яки ТАХ Ліва ех їв ТАХ її бек обі Її я їх - р й дак по та 15 3; пк ост 5. В булла ол Те ми Нам АК реа нави КК як в х
Зіп вів сій АВВобІч Алла АБО Тук Тук Сув Сув Бек Тух Аїав біу Бек в Зо а5 що ву «КК, у Не Міс Соя бю ху ту тк як пре: ХЕ Ж
Зек Їеобпє Уді їіє Вце обі бі бі тах бує Уві Тк о Уаії їж доти вени я
Ж і ва)
Манн ння «іх ВЕ сшрдохчу сову «ЕВ сВОх тку» пяМтт «Тих БЕ я ух яритт ут ик па ях че ах Штучна ПпОспідовністе от ля т. яння ел і о ся сплив Мт пк жаи у пи и яри кажи и примітки ілпис штучною послі кОовиОеихї
Синтетичний поле лий" нені т «Ох я тн й тла ве Ма вою ту сю Фе Фебко тему Ше г суд кал сів Ар осла са Ме їбпЕ Бій беї Єко 5ек вве бев оЗек діз ех Уві 4 в їв я є ко - НУ 15
КУ я тож ж аа на и нн хв но Но ИН Фо Я лов яр ха сні су йвр для дів жо їїе таж Сух бів Аза бек спів дяв тів СТУ Дер 2 й Бо; таз хх а ях раку т и Ше. осяє жк бою т Те зек Бев Авт ТеюЮ Тут бі сій Був Руб сіу Був іа ко Атхе цес пек
ЗА 35 45 т сте пе кн Не НН сові в ЗИ лек що Хужя Яру як теку дах ж 11 Тух Бер діє бек веб ев піс ЛБтІ біб Уві Бгто го да БВ ЗБ
4 учет тт тт тт тт т тт тт тт тет з- 80 ння, пет естеттчіею ск рючютеннс ів еноднію інт ті іч ікнвнінне тіні жк вно і між яні кю т кто ад ж ж я обіти стю ніки ножни осно ж ж ж ню жк - сх
Ж вв нан ння дя тету ши шн ши нин нин сей --- . . що шк шк ш шини . ння ее НИ НИ Ж 000ттннннтняннттнтттітнтнтт тт чт КК осіння ж 0. . . . стяятнтя -
Е я ши ше -- с - понятих "ж . . .
В: щі Б. ший як. Бех ВИХ МУ ОВ шо - ж ця тз х а з я я Хе с М гу ще ще ше и не НО І НА НИ НИ НН Я ли ми м п п п В В В щи
Клон антитіла я я
Фіг. ТА сів тТУук біз Бест бів жо Аівз Беж Уві Бек сту цех бтєс Бу Ів
У З . 10 15 важ їіє ТБ сіє Бек Сув ТВ біу ТБх бек бек йвр Ті біу джу ТЕр
Рв! же зо
АвпоБі Уаї дек Ттр тую сів бів Нів рхОо бу пув Аїа РІВ Пув Ба ке 45 ї5
Меї їїе Тух йвр уаї Бех Авоп Аа Бко Бек о с1у Узі Бек Авподкє бе хо 8 БО пес сФіУу Беж Був швк б1іу Ав ТБЕ діа бек Пей Тв їте бе Стіу цех ке ле во сів Алла бій зр осі вія Аве тую Тух Сув Єех дек тТУк ТНЕ век ЗБЕ: пее тп уві уаї ВБе бу БІу сіу тних Буш бе Твк о Ууаї Бех. 199 ВОЗ ЕЕ до ннииттТтни
ЩЕ побтненттреіінннн й; Бо З олені о иивопо сво пом нав ост поро мні нн ніпель падінні нам ин пек Аа и
Ко ! й
Ф й
СК птн нн нут тн нини - ан й
ОХ Деруни ністатин нні -
Я вісти до г | З "Ше | ш Ї ем жшшшшшшяшниининннннннНншНШ : й | я г й | ях Ск й то й- і пенні с р й й шк в | й й й
Фо д-А-- шин и нн щі о ді й В: З й ней КИ - 2-Й й Я Й рон р тя ї них: ше нн с Но ня Но Но НН: НН
СК а ж ж ше и и В НН п В М В В В І
Клон антитіпа
Фіг. 1В
Зв'язування антитіл з ЕГОВ3З, оцінюване за допомогою поверхневого плазмонного резонансного аналізу (ЗРК) кенннЕеть в. Е пнів пд те одна дня си - щі: ав мов б най
З о ЗИ Її
Е ши: я й
ЩЕ Е Ох : ве 1-5 и !
КІ ЕЕ у й . Кк. ш і ни : ко : ; - БЯ 58 585 60 02 64 66 68 70 72 74 76
Час схвинпнна
Фіг. 2А доннність і. 25 - ом я і: Я а: Кн АННИ
ШЕ: гій Кошк пни тк с: т В. ЕКЗ ї г я ї - й окон нні око Кі 58 50 69 64 66 868 70 72 74 7 чесіхвнилини фіг. 28
Проби на зв'язування з використанням клітин меланоми МАІ.МЕ-ЗМ еВтахехукАХ
М
Ф ов НИ й вій є Щі ж ! і
З «й І. жо З30-Ї шо АБ Ме ї І щ 0
Ж Е х Ю4 їщ
ОО пи я ї. - 00 005 ОБ о Фне оцю 00555 і, Концентрація ДБ Моє ГИ МІ
Фіг. 26 1253 і о : Ї пові інно
Ф А Й. ре ді нниномньнвя ; ї - 1003 м "Бе 504 ж АВ МеЗ
ШЕ ка -Е ї - і ч 0: і - вен пн кни 5 000 005 0 015 020 0 по
Фф Е ; о Концентрація ДБ Ме І МІ фіг. 2)
Зв'язування іще антитіла АБ Моб з ЕГЬВЗ є специфічним що ТВОдЮд тн трете в р джажкжтттотннноф ї ЗБО0ОЮ КТ тт г: з2ощ і піетнн т ек Кк ПК КАК Кодески дені ка дю дк ен Кто Е Ге-Евкя!
Е ід ся пед ук Нкчні синів те НК ее тності етнічні нія Нд ннавіну чн інчт іні ВЗА Е а ВО0Об ТТ ТеЄетОова . п ния ! ; х Ї пінні допо ікі діт ні криз іст и ііі ето віт океетійлкі і піною п з що ОО що МО 1500 вита а Моб
Фіг. З
Антитіпо ДЬ Моб викликає зниження рівня загального ЕтЬВЗ в клітинах меланоми МАЇМЕ ЗМ ій унНтго за даними ЕП ІБА «ж жк Контремь: загальний ЕН В п снваБатки за вне Уутнаст
І інн Оову х ш ль
ОО» ШИ
Х жави я жави жживй а в є ш ще
С вра ш ке ОД х ИЙ
КО 10005 «12 Б БЕ 4 «В -ї «0 !
ЩЕ Соєві і фіг. 4
Зменшення кількості рецепторів ЕтЬОЗ на кпітинах меланоми МАСМЕ-ЗМ під дією 941 119052 антитіпа ДЬ Меб за даними аналізу збудженої флуоресценції сортованих кл
Зшекуони ПЕ Ди Бі Воетею Яюохх Ле В
ДО пн ; 100 тр оденннютівнттт нти»
НЕ "В
З й ЕЕ пі і. ГЕ м З Еш т щи й Ку 5 20 . / й в у І рі ; синя сб тьинь х бриття олені ПД мнвнтни
МО НиИ 0 кл Не ЩО
Бека НЕ В СН. коном КЗ Кави юна» зжжжих СКЕЛЯ У Ви ВЖК жзянтк ДО най ав МеВ ія чесюю я КОКОН У якою Круронивня ЯК --х ВО нія дев май ща ! дня фВнМАвнов вх
Фіг. 5А Фіг. 58
Динаміка опосередкованої антитілом АЮ Моб регупяції ЕТО на пониження виз новорхнеминин У швОлпецесвннеканннх Оле они пани нин 100 ур шо | я ША
Ка: | а ЕЙ ря В І и ГЕ : й В І. ій І і ба і? ке ги о. ши ШО х ОК ї Е ще зі ; -к Я З ТР Б бковахм і ш ме тк і ЩО адек щепи -к ЖЕ Я і і Ок Б ме с. їі Е У Я: р: ОБройки ! м ОВ
ЗШ ! 2 . ь
Уа ї і З
МУКУ и 5 шій жа же ги. Не т НЕ НЕТ | маш с М т Ен рі лвосВ тщі-ввсока
КУ Контраць ще І «ЖК Контропь чезянх НН Ді Неб Гі Аіеха ГОіНегашенаї ккзаккх з ТОН АБ Неба Ааха ДО негащшенаї зош ба Ах Неб Пр Аеха аю шкоже НМ Дік Неб Тер Агрежа 456 25лаку анти Ачеха 488 іраїеа Шк бли антена 485 бБашеної
Фіг. бА Фіг. В
Динаміка опосередкованої антитілом ДБ Меб регуляції ЕГЬНВОУ на пониження
ЕТЬНЗ поверхні клітин: Ен ЕТЬВЗ поверхні клітин: 55 и | ЕЕ
Я Ге ! ВО х Е і ! а У Бе ся і Кі син ШК в Ех м ШЕ я іх сви ШЕ - ШИ
Ух З є й то пф І Ї Є ЯК год п те В Я и Те Те
Кіізвисота КЗ» висота
БМ Контроль | ЖОУ конціоль тжеени ж НІНА» Неб НО Маки чпфінекгащена; єхенає з ТОМ А Це БРОЗ Агехиа ЗВ інегаднени сечею ОПН М АВ Неб НЕ Аіека НВ якозже ООН АВ НОВ Лео ехо ЯН мкгсанти-дівха НВ ощшеня) що 25 нкрантйдієха 480 (ашена)
Фіг. С Фіг. 60
Антитіло АБ Меб викликає регуляцію Ето на пониження я клітинах меланоми іп ко
Біень загального ОВО тло овннам ному дослідженні мАг м чевоз ба годинм після пеки
Ко їх 20. я п А А НН екв и х 5 : - я : Кто ПД ддлла ді лорет ккд,
Е | ; сн 55 - - смисли зок реа | в : ния я !
Би ния! «а Ще НИХ ОМ ад ШИ Я реф ДЕ чн я і ши я ши й й й і яви АБ АВМ АВвЗ двНиИЗ де дьЯБ РЕЄсопбої щи ще її и вс Ге чо ' Мис дет
Фіг. 7
Загальні рівні ЕТЬВЗ в ксенотрансплантатах АОК г
Я, : нн нн нн нн
ШЕ зай у и нини ин нн зе | | і їх з | й т 14. пня миши СКЕЕТЕ ТУ ІТ ВІННІ НН. в | Є ---30044-- їв4- Б Б/62--- | ши г й б М ; пенею ! и я А ... пня, й ее лезоєка дні ом З МО
Обробка антитілом (РВ5 х забуферений фосфатом сольовий розчин)
Фіг. 8
Антитіло АЬ Моб пригнічує проліферацію клітин меланоми МАСМЕ-ЗМ за: даними титрованого світіння клітин (Сей Тнег біож авзау)
Комтвопь:Оь скововБОтТК, ж иа кож. ад. пе . ншсутнє витЕто щі днтитіне дБ ков ий В. І ак ! з5к10 "о ин З щей вжи жа и жии юки ее й ою Я МШЧИ Й ще ш «Е
Е
Я Я - 00 - -й -й -й -В два соо и фіг. З
Антитіло Ар Моб пригнічує пропіферацію клітин в клітинній лінії р
АЮКг (яєчнику) « чо нон кю МОМІВОЛЬ ОБ Єнцоватим За ВіДОуТНОСТі їй Дектиснпо ДВ МЕ век
БКЦ? | м. ж ж Ши шк М и и о р а и п. и ке ек ЧЕ дакчо 23102 І захо - й и і Ош й но о зад» то стек. е ко Ви т7ав. "я
Тео я в и тв и їж я 4 - -12 ЕЕ: о -Й -В -ї не Б и ша фіг. 10
Антитіло АЬ Мев пригнічує проліферацію клітин в клітинній лінії АСНМ шо Кентевоть: що сна тен, Ба
Іжа жжаккжж КУ У я витнчла ще Б . днтвтіло Дь нев
Вк? 1
Вдев Ш в ява АМЖЖЕЖНЖЕЖаЖиже жає жежаияже ах ж жк чо ще я. зе ши т0х105- во Я її і й. й К їжж6« Вб ЩІ ке й : и НИ ш Й
Те з - ве -В -ї в -5 два нни п)
Фіг. 11
Антитіло АБ Моб пригнічує фосфорипяцію ЕгОВо в ксенотрансплантатах
АОВг ів міо
БізнізЕтвиЗ в кеенотранеплонтатах ДВ
Ж
Кк ее ї 0 і стін інінінінія говсашнни ок не с й ге пи п п п в пп в в : - г об Кф тт ост їх я нозова пні ілі іт інЕі т Я КНТ тт хек ечнтвотв юю с 00 - ос ло пи 1 ши 0000 шва КЗГр(б
БО шеонтеть сопрзОоБка А ов
Обробка антитілом (РВ8 « забуферений фосфатом сольовий розчин)
Днтитіло АБ Меб їдС2/ВТе
ІС50 | 8,37е-10 М : па СІ | 5,32е-10 - 1,32е-9
ІС5О антитіла АВ Моб в клітинах МСАОК- 05 сироватки ш" йно чено ПРЄ контТосоеЬ т - Ї снніфння КК» ВОСНЕТ ЕСЬННЬ
У Ї е 6 1 Т щі І ши пп нн х Й м свсатк й ще т кльще. й щ шо ЕЕ іш Т М 7 пес з й : й ве ще ще ше АТ В А, В дез конрвентовц і антитіпа о
Фіг. 13А
Антитіло АБ Меб Іст
ІС50 | 2,488е-009 9595 СІ | 1,051е-009 - 5,8898-009
Ізотип 402 антитіла АВ Моб в клітинах МСІ-АОКг - був сироватки ш аз кеВ одно зашфьь БІБ КОБТВОТЬ в зоні ТЗ КОВО і. і тттЕТТТтТТтІ ї 4 нини: анетивнинн! ще я Но ще Її З чик М ЖЖ ОК в сад іфофнф . -45 14 43 43 4 40 9878
Боб коннентуеціт семи і вк С
Фіг. 13В
Антитіло АБ Моб І4с2/ТоЕа
ІС5О |4,9012-009
Во СІ | 1,985е-009 - 1,222е-008
Їзотип цОб2 антитіла АВ Меб в клітинах МС-АВКг - д'» сироватки ш ав кевідОошннО зннфрннь БЕКНОЮ КУТ НТНЬ тен ДО КОНТВОЙЛЬ і 2 і. 3 - о ! ! зе -й зам новой па -й
М й -кі й сення н м зи пи пи поря зи плн зон зр 45-44 3 Я Я я у кісип овен тнищия анти о 5 ОБ
Фіг. 130
Пригнічення ізотипом ї402 автитіпа Ав Меб фосфориляції ЕТЬБЗ
Е в клітинах ОМСАК5 000 що- нано жом кю око жк ою - 0- в У
В чи іс воо- х - ав . щоох Х сежкикннння ВИМ НА
ЗО її . воює смак ниж СК МЕТ зу 3 в'я
Я Я В «Її -В -8 ав Бов ез
ІСБО 124-008
Фіг. 14А
Пригнічення ізотипом 462 антитіла АБ Моб фосфориляції Ето « клітинах ОМСАКВ 7500 сжжажчєнвюиважежжажения кю ї водо Ме ж дико
І: | 4 квжвіжжкижки а В ні ща . х можн ниж 0 М 2500 х "щ ре хе В -8 -ї В -5
ІШБО 10 1,бе08
Фіг. 148
7З мя щи 8 5 г ооо Ай
Но : АК Е : 40- | і щі ї Я 4 105 Щ їт їй це
Кент
БД конктрачль МАСМЕЗМЕВ ЕЕ --- МамеЕзМмеонм Те фіг. 15А
Об -гннн дня їв» : ск Е ія Я їх Е
КО 4 5 , ті ши Є Е М ій ГУ Ка ей ї ві і КУН юю щи
КЕ емоста «жявеза СЬКИМ Б нин фі. 158
Блокування зн'язування ВТС Етойцх ом, але не антитілом АБ Меб о я В.
З Со : ! в | я 5 ! ї у й ее Е- Ії сі й в х Її. ча 1 ж К п Мой й рин сні непьцясьно Й В слкноянн 1 ї це 10 її келнисота контвопь ВИХ пккехуєєьките ПОД нм ЩО пеня ВИМ В КЕНЕ фіг. 15С
Ізотип ЩО2 антитіла ДЬ Меб пригнічує опосередковане херегуліном проведення сигналів зі схожими ІС50 в клітинах МАСМЕ-ЗМ
РЕТВЯ РАКТ ооо зо0во ж ЩЕ |з є З о икокежие» і ї 0 | в | . мо 8000 - 5 00004 зефежі тар єьхиєювикєєики - МО Е ї | сла ві 3000. нику с іщдо- ; їх об х т ; «вав ї | | ж
Го мим зовн ом спппнннсня посох ин ння Дротенко вс ТЕ ї
СУ: Ме п ВИ п В Я кеша: нище пише ше: Не пи «вва ес п во | 00 бме-0о8 БО ОО 1.1е-008
Фіг. 16бА Фіг, 168
Пригнічення антитілом АВ Меб росту пухлин
ЕН воза холи каву х | ВЕНИ ФК» ВЕ ли ов з що нн нн нн нн «. джен щ таня ФРІ кОВУВКОЮ» шо пи и ! ж Гн Дж» ВЕ ЕК Ваш ше ж ШІ З Я "7 1 се щ шшиче ше ше з о ряжня Же Ве БО зе Е и СЕ ї ГУ ще її ій ї зд ІОННІ 5 що г! ша ! их я ОБО я є ЗЕ СВ Вова в З Я КОожа Е
Жов й ше ші ше
ОО ; Е ре Її окр і я о і є : 1, т кни ! ме ШК Качан Я. Я Ед і Е: КУ : ! то пржекх ЗЕчИ невинна и и ЩЕ и 2 : ча м в жажкжи З ї й Зоннуєтюмуа чех «кткухутех ник УДК хну ники КЕ ЖКЬ к уми ЗІКА Ммеіняж кни Моніки й г! і а же М як і ще я олова ле ме сіна овпи шення
ЕН кННСлеа греч ІН жо вн а ше я «рок 0,05
Фіг. 17А
Пригнічення антитілом АБ Меб росту пухлин
ЩО св» ЗНОу ан вк смак гав Я ВО 5 в і док
І ! жк тт ХИЖАКИ УК КУ ТК КОТ ХХ ЕК КК У КОМУ Хек уки що че Я с й ї
НИ: ше і- БЕЗ наве хякх - ї що кош КК вх ві: ЕВ важ : цккої ще . м Що ВКМ КЕ «Я КЕ | х і ем ооорю нн ве мов во ме і ША
ЕОШЩЯ000000ннннннннннннн
Ж Щ ШЕ з Ого М ше м в: и Ж Тож о во М а с що Ї 4 Я К й НК ШЕ Ще тих Ї ОХ
В що | щ Я | з й | ї ве о ке Ще. сон ж ВЕ ; . дояй г. й щЕ- | і о. а що. ШО М с мок кс ро НО ШО ЗИЧУ Кї НЕ с шк 4 ж ї о Ми шк ВВ НВ сін о МИ Піх ін м КИ ЧИНИ я с имени п НИ КЕ ЕЕ Вот ; вікову к ж с які ай як їх фе як й й вх Ж Ера аа вче ж в АН АК ОК ОС ЗНО вне 800 яенкуукве явка юю ! ддкохь виеувеейжнах Да же ! ;
Р « 0,05 ' Фіг. 17В
Пригнічення зититіпом АБ Меб росту пухлин сеовами це мч вні о Мов У сво
Дует нти не нення ння воспівження рр ча кам . і х Ж часах ФМ МОВ ЗНУ днк ; і: ї щі ! торт екон М со | !
У | зад вд» моб БО тер к. 7 | Кі | ї і. ж | ! ж Ї Ж ох ОВО, в. ї ; Одож р і Ї , ; х й пря Е !
ЕЕ і Би щі бий я я Ко К ШЕ є що, га р і | а а. й ї не не і що | гне і шк ле а а ЖЕ 5 ШЕ Ж ЕЕ ск Ж З НІ о п. / в о няння кан ее и он п нен х ин нн ня ДЕН ДАЙ
Ж Ева пе яв ей в да ха ку ге тв же авбноа:авош ве пат инвивнИхокО ве де мевЯвкоє КЕ 2 ЕЕ Е ЗЕ ще пес ве ЧЕНЬ ни НЕ В хр 005
Фіг. ТС
Пригнічення антитілом ДЮ Моб росту пухлин
ОНА НУ? по позу нової замов знаної ху сировини в КОН і Й зйке кісковідоввевНня рей їз йе ЕЕ Беха тих Н ЩО що Я а и ЕВ ЗЕ | : ря їй -Е їх (Ро і кбеейціх а ЗОМХ ве «і і | ЩО
ОА. їі | ре ! ї- ! РЕ же УНН З СК ержжиї шк я ! ! : ши ши фнкнкеннсня
З сек кеВ Ма ОД МНК ОС ! Ко їй Ши" ру МК і Е ко ТАК доку Еге зе Її ода з із ї я . ЖЕ ї ; ж кафе ВЕ МОУ ТО а 5 |і х МИ і і т и шш ! і ! : ак ї Зк ї ! 1 ук ї Н о КО 1 Я Ї ши и ША ЩЕ ; : - і у Ей ЕЕ сажі Со ї Н одн Ї І: ши сш й и ШИ 5 і і їх маси кож оду 1 ко Ка ОО ВАД: х і ї Щі Я Р А | ще фе де . КОЖ Що | ї ї р ижи р
І: РЕНІ те и дх ши Й 7 ноя щей ше Жієтиито ся готую ї я | Е і : х а тов ї г - у в ШИ за МИ ШЕ ШЕ щі ше і ста й 5 її | як ї рі Ї
СІ - : В ПОМ Ї І ! ще НЕ ШЕ ШЕ Не Б г ; і
Ї | Її їха | й х Я « я в Р ак сьо В Доля н-. в ун НЯ
К ; 45 з З і ; С ху УК
Й НІ 8 й вні її й й й Ки К «І г Й ВІВ жов; пове дона що В ЗОвект ОО дет Ота
КОН вас увн ввУчаау Поза знтихіна во Мей. ред005 ; .
Фіг. 170
Блокування антитілом Ар Меб Блокування зититілом Ар МеЗ зв'язування НКО з клітинами зв'язування НКО з клітинами
У Ва
МАСЄМЕЗ МАСМЕЗ
ІНК соди КІН КА ХАІ КАЖАН АЖ АЛЕ н ленні нічне ані КП терки ве ни Кк а
Мои ше ши З ши: ? ві З | її ї Я бе - Ж 5 ! ши | о
ОЖИНИ | й і | Як | КЕ і я т і ши ши ЯЩЕ ж як сао її. : | І Ж її г | | й, г ; де І КИ і т | 5 ; ки с м шк ни "у
Жено теле та
КЕКВ Жовуниль ОБКІ5З Контоовь покожикзсесяи КЕКВ секжкжижжкажі ВЕБ шок к вна х ме Тодету ЗЕВСЬ етее Х тн їсте булу ВЕККХ зеннентннняю МЕНО йе Мо пня ВУЖ АХ КЕКВ
Фіг. 18А Фіг. та
Зв'язування епірегуліну блокування зв'язування епірегуліну з АОКг з АОКгантитіпом АВ Моб ії Егойих ом 100. тонні інно ннні чн тенет ннітнні ні М: Дт кінетику щі Як хі щі
ЩОБ ! дн ди | инших ен т т ЕН. т ЕЕ Іі ; й Ка НВ невірні й БО Мом еле пл в нн с» ДЕ ДЕ НЕ сн
КЕж ча тКи- висоти
ОБ Комірень Коць кеєінзакхккозх МОВ ВІН НИ. зехжжелкетює» ВКЄНХ агро улну. жест ДОК ЯВИ ОБУ ЕНН мес ж жешсхолю: Ж ВАК НГ УННХ В ВО ВО менняеннттнюттнсях ТЕО ВІН ЧЕ МІННУ петееннннннння ДВК ОБІрегутну є ЖРОНОХ
Фіг. 19А Фіг. 198 в2 рт Моне пнкнесантнонінняан тек чкчнечниння і. що | ще «й Ю- ; и шими: ше «В киш ШИН зов. КИ
Еш І. | М | і 5
БОЯЧЕ о «др Кк ! в ан 20. ї 5 ли | 4 0 пою я кри ше й Ко жи вен: у еЕИя р т Ику х5 яй й Ї інве ша ТР ще г 1 її ЕН ЦЕ їж Це г
КІВ Елен
КО Конербнь Контроль втякзяжкеччка ВУС ВЕБ суежнеентекхає ЗИ ака БНВО шенні» ВИНО БОЇ пенні ШУ) ВК ВЕ КОК я ВНИХ слсіюннінкннньки В МВВ НЕеКНУЄ нон женю ен МАЯ НЕ- ЕЕ шо зок жк МОЙ НИЙ ВЕНЬ КУ
Фіг, 20А Фіг. 2085
Амінокиспотна послідовність МН вититіла АВ МОВ 5БО ЛО Ме:
ЕМОМЕБССОСУ ОБОВ КГ ЗСААЗОКТЕВНУ УМА УВС АРОКОСЕУУВВІВВЕ
ОСТ УАВВУКСКЕ ТК ОМКМТ СОМИ ВАВОТАУТУСТЕОЮКМАТІКО
УУОСТІУТУ5
Амінокислотна послідовність. Мі. антитіла Ар МеВ ЗЕО О Мо: 2)
ОБАГТОРАХУОВРСОБИПЯСТОТОВрУСЗУМУ У УОСНРОКАРКЕНУВУВОВ
РОІСУ МАРОК БОМ АВТ ОСОТЕОВАВУ СС УАОЗВЕМІВОСОТКУТМ.
Амінокиспотна послідовність УМ антитіла ДЬ МОЗ (5ЕСЄЮ Ме: 3)
ЕОМ ЕНН КОРОСВ КЕ ЕСААХСЕТЧАУММА Ж УВОСАРОКОСЕЖУВУТУВВ
ССАТЕХАВВУКОВЕТІЗВОМЕКМПЛТОММО ВАБОТАУ УСС УУОМОУ
УСОСтТУТУВЬ :
Амінокислотна поспідовність Мі аититіла АВ МОЗ БО ОО МЕ 4
О5УГТОРРЗАВОТРОСОКУТІЗСЗО5РЕМІСВМУ У МХУООБРОТАРКІЛЛУВММОВ Р
ЗСУРОВІЗОЗКВОТЗАВСАТС АЕОКАВХНОССТ АОС ОР УКОССТКИТ М,
Амінокислотна послідовність МН антитіла АВ Ме Я (5ЕС С Ме: 5)
ЕМНА ЕХО МОРОСВІКЬЯСААХСЕТЕЗА ХО МОУУВОАРОКОТЕ УВУ ВРУ
СОНІКУАЮЗУКОСВЕТІЗКОЧКЕМ ПИЛОМ КАБВТАУУСАКУСЕТСС МО
АВС МУТУКЕ
Амічокислотна послідовність Мі. антитіла АВ МЕТА (БОЮ Ме: 8)
ОУБІЛОРРУУЗУУРОСОТАВІТС5ОПОЇ ОКУ УМУООВРООБЕ У УМУКОКВЕР
БЕТРЕВЕБСЯМОСМТАТЛОСТОАЮВАВУУСОА ЖОВ ТУ ЕС ТКУ ТУЮ,
Амінокиспотна послідовність МН антитіла АБ Мео17 (ЗО О Ме; 35)
ЕУОМЕБСССТ ОРОС ВІ ЯСААЯОВІВНУУОМОЖУКОАРОКОТ ВЕЖ УВУ БР
СОПУХАВВУуКИКР ТАКИМ МТ У СОМ КАВУ ТУСАВІ МУ ВУ жОСОСТТУтТУВЕ '
Амінокислотна послідовність М. вититита АВ Ме17 (ЗЕ О Ме: 36)
ОДТОМТО5РЕБ ЗАВ УСОВТТТСОАВО ТОВ ОГУХООКРОКАРВЛЛУ РАМ
ТОУРЕВЕБОСВО5ОТОЕТЕТЕКМ ОРЕТАТУЕСООЗАМАРЕТЕОРОТКУТІК дмінокиспохна послідовність МН антитіла АБ МОТО (ЗКО МЕ ЗА
ЕКО ЕБООСССУОРОСК КС ЗСААУСЕТЕВЕ КОМА УЕОАРОКОТЕ МУ ВУ ОВ
ССРТУТУрБУКави томатом КАБОТАУУ КСАОСОКОТРУХКОВ
УЮ ТУ
Амінокислотна послідовність Мі. антитіла АЮ Мело ГБО 10 Мо: 38)
СТЕ ТОРАБУВОЗРООБПТОСТОТ ОВК ОСНеОКАРКОМ У ПУБМКРЗСУВННЕ
БОБКЕОМТАВІ ПОСТ ОХЕОБАВТУСВБУ 555 ИУКОСОТК ТЯ,
Фіг. 21А
АБ Мев УН СОБІ (ЕС О Ме: 7 нНтУМА до Меб УН.СОВО (ЕС ІЮ Мо: 8)
БІБ5ЯСОСМТОЖАВяУКС дЬ Меб УН СОБЗ БЕ Ю Ме: 8)
ССКМАТВВУ
Ав Меб МЕ СОБІ (5ЕО ЛЮ Ме: 10) тету У є
АдЬ Моб М. СОВ2БЕО Ю.М: 11)
ЕМЧОВРЕ
Аь МБ М. СОВЗВЕО О Мо: 12)
СУА
АБ МеЗ УН СОВІ (БОЮ Мо: 13)
АУММЕ дь Мез МН СОВо (5БО Ю Ме 14)
У УРЗОСАТЕТАрВУКО дьЬ МеЗ МНСОКЗ (ЗБОЮ Мег15) сТУтУуоМву
АВ Ме МІ. СОБІ (ЗБОЮ Ме; 18)
БОБОВМОВМУ ГУ
АБ Ме МІ. СОКУ (ЗЕ ЛО, Ме; 17)
КММОВР5
АБ Моз МІ. СОКЗ (БО І Ме; 18) ато ОВУ
Фіг. 218
АВ Ме 14 УНН СОВІ5ЕО ЛЮ Ме: 19) дДь Ме 19 МАЯ СОБІ (5ЕОЛЮ. Ме: 45)
АХОМО ВУБМИ
АЬ Ме 14 МН СОВ2 (ЗБОЮ Ме: 20) де Ме то УН СОБІ (ЗБОЮ Ме: 46)
ЧУІ5РЕОСНІКУАПЗУКО УЗОРУ ОЛІБУКО де Ме 14 МН СОВЗ (ЗЕО 1О Ме: 21) дь Ме 19 МН СОВБЗ (5ЕОЮ Ме: 47)
УСЕТОСГМВАРОЇ ОБОТРУУКОЄ
Ав Ме 14 МІ. СОБІ (ЗЕ ЛО. Мо: 22) дь Ме 19 М. СОБІ (ЗЕО ІЮ Ме: 48)
СПО О5КЕУ5 ТОеТВБ5ВІЗКАМУ
Аь Ме 14 М. СОБОЮ Ме: 23) дЬ Ме 19 М. СОВО (БЕ 1О Ме: 49)
КОКККе5 БУБМКРО
ДЬ Мо 14 МІ. СОБЗ (ЕС ІЮ Ме: 24) АЬ Ме 19 МІ. СОВЗ (ВЕС Ю Ме; 50)
ОА М БВУТОВОТАУ
АБ.М 47 МА СОБІ ЗБОЮ Ме: 38) том:
АВ Ме 17 УН'ЄВВ21І5ЕО 10 Мо: 40)
УБЕБОСПУТУАСЗУКО
Ав Ме 17 УН СОВЗ3І5ЕО 1 Ме: 41)
ЦКУ ОУ дь Ме 17. СО ЗЕ 1Ю. Мо: 42)
САБОПІСОВІМ
Ав Ме 17 М СОБКО Ме 43)
ПАБМЕТ дь Ме 17 М. СОБЗ(5ЕО О Ме: 44)
ООВАМАРЕТ
Фіг. 210
АБ Ме Б УН, оптимізована послідовність нуклеїнових кислот кодону (КО 1О Ме: 25) щаншсавстствеавааснвсрозв вес екесанссареснисанссвавиствіостюєносвссансивстсає спсввссастасвівис Есствевт все ресаресооуврисаввиноствва вені ніссавсвісарсавсавсв сви сіввасссицасиссвасавовісавневасвенисасовісвисвнниасвасяпсяанаасвосстетассттовсяваяс елправеиноскявенсассвссвіиасасесвосзвоосссттаава вессзсстспеваасврвросввяве асссншівасертрварсаре
ДЮ МеВ М. оптимізована послідовність нуклеїнових кислот кодену (ЗЕО 1 Ме: 28) саріссрюсєтрасссавосоросавостравсвисиресосавессвоарсаісвосиоарстсассерсяссавсавсва есВіввесавсгасвасти в остветаіозксарсяссссь свя еессоссзаистваця ставав вівісосвцавЕ ссеввснесвісносаесавонсзрсвесвисадооспосаасвоспосавсствассвсяосопосвсавассваво асвавдесвасіаєсаєтьсівсавстасьссвосавсадевіснею смс всовароввосааритааестіоса дь Ме З МН, оптимізована послідовність нуклаїнових кислот кодону (ЗБОЮ Ме: 27) вапшпсзвлтествозааксооссрвавеисівтосавосаписивсавссінявисівісстсоссрвссарсввоси сс сийсавсвестіясаасвівавасивівсвосврисоссввпсаавврсстюеав рен освівасіассосарсвисоВ авссаосаряигверосвасавснівазвирсзненсассяісвесарерасавсарсязвазсвосстасствсвоавза савоствавеоссеянрасаосвосютвіасаснсвссапнссеств статі свесимеелсд о вовоссаввнсяе ссіевівасстівавсаво до Ме З МЕ, оптимізована послідовність нуклеїнових кислот кодону (ЗО ІЗ Ме: 28) сарапсицетьасссавсосесалеснесввсенсвосссввнссвраневінасслісзсівсзвсвеисавсвасався асаісрисавогасіастістаствеівісавсарпооссросассвоссссавесівсівніасавозасаассзввоносо авсевевіессвисавкаюсавсввсввсзававсвесассавсвесавсствносвсавсевествакиавскаЕвяЄ
Бавессванізосаєтисивсяосівевасвасавсствиснесссавівносвесенавевассаввотасовтеста
Фіг. 22А доме 14 УН, послідовність нуклеїнових кислот (5ЕО В Ме: 29) наанисаяНой сан тер висно п омсавости він пса сдісн меси вснссвоановов спасе врвневи и свссвавсіссттвійваво тез ев сти сів ві внссатасіве
Віпствасссвназаноїсисисастаєтававасаасстваваамастсаснесана ваасавстяаовес
Інвевасаспьсою ан асіосозазнастосвавс ово несновмос на овооссадеенаса агЕвісассвістсвасе
АВ Ме 14 Мі. послідовність нуклеїнових кислот (ЗБОЮ Ме: 30) спвіасвзап расісавссасссісвоівіссріотасссвовасарасвосслосвісассівсі ств раряєсванои варавнешсстьсіаісзнсарасросаросов вісім ен овісаниаізаясвваласосвкесвісява.
ЕВІСССТрЯрСна По висіссвасітьесадсасвюссасістассвісае сви авоссве сао ві винос вапапантсазвесттненасвосарсас на тенересасівсвассавирісвесвіа
АБ. МеВ МИ поспідовність нуклеїнових кислот до оптимізав (ЗЕ О Ме; 31) ваависааненпававісівнвесврісивнозвоств ві сенотасвіст все ствспосввансаснст сепасви вес евоповссвави осв ріааво в еветевВ спе спон в вВстерастовтах есівасіссвиагарвсренсасістівиаввсавсіязсавінисітаснесаратевасарстааерестя асрасасавосрттанас настав встсвавцвистасаа ни асіасвоевесярвесвосствейсясов
Тсісзаве ! де Ме Мі. посліповність нукавічових кислот до оптимізації (ЗО 1 Ме: 32) сававсво й настоваествости ие вно есте вас сижсассме сс саствааассавсаняї впнерариа аа ис вві ссвасзасасссзресавансосссавасьстсв тата висавісяосяк сепсавесенініаане пе весіюєзакцивесаасасевосюстрасані ствер ссавастовенве вавиствананаєтистсюавносавв авансів нсвесвевинеяссааевтассвцта
Ав Ме З. МН. послідовністьснуютеїнових кислот до. оптимізації (ЗБОЮ. Мо: 35) ггевнесавницанявіствнтиневнісчЕнсзесстин винос стснвсессмесввя сао
ЕСпасівац сопе венспеоваросоєтр таза есе сін сс сі восоасісвй вівсівастссеназзввісвоисацанисівевнвсваснтавраца стоп всаваезасввстаавявої накеасаскоссці іачасіціссвзрарнвастсстюсовтекасвнтеевассаавасвссстввісвося їсбозвиє ї дв Ме З М. послідовність нуклеїнових кислот до оптимізації (ЗЕО 1 Ме: 34) сававси си расісзнссассстсввсвісівревососсвенсаБавинісассві стві вис вовавсвассса асвісвравнаваняіаінайавіассявсвайсесавезасввсссссаавсісстсаістатавнавіавсанснес сеісарверіосствассвавісттрестосватісівосасссвностюссівреслсановеосовіссвавои
БаяшстТарІВасіевевасатева сасаврсствавввіссемайсвосераровастзавстваосютєта
Фіг. 228
АБМеб УК:
ОЗАІТОРАБУВС5РОСОБІТІСТОТОВОМОВУМУУВМУУООНРОКАРК
ІМІМЕУЗКАРОСУЄМАЕОСЗКООМТАВІ ТІЗСІ ОДЕОБАОУУССВУА
" О55ІЕМЕЕООСТКУТМІ. (ЗБОЮ МОВІ)
АБ Мет7 УКАб:
ОБІОМТО5РУВІ ЗАБУСОВІТТТСОАВОРІСОБИМИООКРОКАРКЦ.
ІМОАЗМЕТОУРРВЕ5О5ОСТОЕТЕТЕВОЇ ОРЕБВІАТУРСООВАМАР
ЕТЕСРОТКУОІВ (ЗЕО Ю МО:52)
Ав Ме19 МБ:
ОУЕЇ ТОРАБУЗСЗРООБІТІЗСТОТЗВРІСНУУММУЗМУООНРОКАРК
ІМІУрУЄМАРОСУЗМАЕ5ОЗКООМТАВІ ТІОСІ ОДЕОБАРУУСВВУТВ
ЗЗТУМЕОООТКІ ТМ. (ЗЕО Ю МО53)
Фіг. 23
Клітинна лінія
МСЕ ТАТО Соіо-357
ВО о а На НН пакту тенет обо пивааннияєчни
ОПО | як плакі ЖАКА кін Кк ьаскн лк кінні . пиття птнвтнт вн ! вода пд ше Щ | Й «є ШО п ШО ох 1. ши я шш Би . скя се Кеш сег киш сен» сову СУ ж а и м а А А НН КА
ОБ НН ОК НН МО є че й я й я - г й я «Ф
СЯ « 5 я ке ; - .
Обробка
Фів. 24А
ОУСАКВ . бО0357 Н1975 105 Що. 200- я ш | : ШИ р. в ВИНИ й і | їх 5 зві ШИ щ ОА Ї щі щі 2. | 1 Е
З 48. і Е ще з Я г я з | ї ме А їж ! ї І І з (Фч пк пан ПЕК пон пня і б ро-- ЖИ. т
Контроль ав Контроль а ов Комнтвовь ве МеВ обробка фіг. 248
Корепяція між пригніченням фосфориляції ЕГЬВЗ та пригніченням секреції МЕСЕ клема я з. ЖСОГ0357 ра 757 | ж НІЗ75 ет | АОУСАВВ | Кк 804
Же .
АХ З - ї й 1 | - й ! Є : о З пивних ПІН нн ! й БО 0 7 зе принічення вив
Фіг. 74
Вплив антитіла АБ Моб на міграцію клітин ве. ї. КО я ЗО Аякс - ї ОО кі з. 00 п тях КО, т 1Бо0оч
В | о
ОО . "77 ва о плям Я лякої Е З а | шк і
Контеопь че ща М г! --кае
ТЕ ян к ОО Ея щу о кову доваво НОР АЕЕ Я. вав скнелетьнкчя М Моб
Шередевниве НЕТ Тр то
Ім са й шим ектів ав нов
Фіг. 25
Пригнічення росту сфероїдів антитілом Ав Меб в клітинах АПЕг дО і с» ЖБК
Зв о х У : па ЗО Мишка
Контвоме вища і сова
Фіг. 26А
Пригнічення індукованого НЕС росту сфероїдів в клітинах АОВг й ла 5160 У віч
Ей 1207) -
Ж 40-- Кк З | й се т зга шш ша шо о КЖовтволь це че ав вважа фіг. 268
Пригнічення індукованого НКО росту сфероїдів в клітинах Ви 145 те . т ща . дей до Комтроль вик АВМНОЄ Ментровь мим деЕМеє
Контроль щен есе жив че: Я
Фів. 260
Вплив антитіла АЬ Меб на зв'язування НЕКС з клітинами АОКг
ДО-я
Ж ня 0 ЩЕ т ше щи
З жа в зер НЯ ЗК НЯ ще х їі ОН г ком ть шен щи ще Б0-- АЙ Е окілююююттк МК як ї. кет ї т вив
БУ ї З х згткожот бе Ес ще як Пен КЕ
Яе 40 і о. а й зееоу мм х КІ не й мен пою, |; Ж КВ ЖК Й :. ух ях ї Же во е В ак к : віх Е ще З й Я З 3 ! ша с
НО а Бе: пн в. ИННННННННННЯ 1 о Ще ще че а У пд кі висот
Вилив антитіла Аб Меб на зв'язування ВТС з клітинами АК 00 -ч ь ї Ех
ІЗ як.
З 2
Б За | Кк. я і ко Б ЕЕ
МЕ . І г хз . і ЩО ; ГЕ со М шу КЕ Кемтоедь дя Кк Я Я й
БО шк й ете г я я З ся», ТЕ
Я оку по й. ї о яр ПКУ 5 сза в сво ши жо ее - чи кед. 5. й 5 -- шимавнов іони вте | й її Я о--н-н- п шЮМАВЕ Тон ТО 5 в й от шим ав мов їй нм ато
ЯКА М комі ЩЕ.
КК УКВ и и А йо. їе КН о, ТЯ ЖК дик онклааційннніл с АННИ м і і ї ! Й
ЩЕ яд о же з 1 1 це її її ен ик УШКЯ й фіг. 278
СЮ
Шк ШИ " НОЕ 2.4398-010 -ї во . -- я
З 50 шк
Як 40 4 х щі «4 З. ї 4 и НИ, ;
РІ; ШИ ше: НИ ЗИ Я
Ар ВВИсаМ)
Фіг. 28
АНТИТІЛА ПРОТИ ЕГЬВЗ ТА ІХ ЗАСТОСУВАННЯ
Ге : с е
Ж в ся К о ав
Ж є ВВ є ! ше о ! РЕФВЗ пон В сеові
Фіг, 29А
Е е
Щ т
Я КУ нРОшИ о М 2 і -
ЕЕ В В 5
ПЕ втьво І: етвЗ
ДТ нн ОС Л8Я ОО ІВефво
Фіг. 2983
ЕК,
Вк. ГУ Бу Ї : ; - 1 х 5 Я ї й і га г х х г р: з . ча 1 а! 30 і а
ВЕН ОАВЬКЯЙ ши
БП З мопс АСЖеОдьеваХ
ПТ єВ3 бопс однБатопу вав фіг, 30

Claims (36)

1. Виділене моноклональне антитіло, або його частина, яка зв'язує антиген, що зв'язується з ЕтЬВ3У, яке включає: а) варіабельну ділянку важкого ланцюга СЮОКІ, що включає 5ЕО ІЮ МО: 7; Б) варіабельну ділянку важкого ланцюга СОК2О, що включає БЕО ІЮ МО: 8; с) варіабельну ділянку важкого ланцюга СЮОКЗ, що включає 5ЕО ІЮ МО: 9; 4) варіабельну ділянку легкого ланцюга СОКІ, що включає БЕО ІЮ МО: 10; е) варіабельну ділянку легкого ланцюга СЮОК2О, що включає БЕО ІЮ МО: 11; та І) варіабельну ділянку легкого ланцюга СЮОКЗ, що включає БЕО ІЮ МО: 12.
2. Виділене моноклональне антитіло, або його частина, що зв'язує антиген, що зв'язується з ЕгЬВ3, яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає 5ЕО ІЮ МО: 1, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає БЕО ІЮ МО: 2.
3. Антитіло, або його частина, що зв'язує антиген, за будь-яким з пп. 1, 2, де антитіло, вибране з групи, що включає людське антитіло, гуманізоване антитіло, біспецифічне антитіло та химерне антитіло.
4. Антитіло, або його частина, що зв'язує антиген, за будь-яким з пп. 1-3, де антитіло або його частина, що зв'язує антиген, вибране з групи, що включає: Каб, Каб'2, 5сЕу, 5МІР, афітіло, авімер, нанотіло та домен-специфічне антитіло.
5. Антитіло, або його частина, що зв'язує антиген, за будь-яким з пп. 1-4, де Іі1З3ОТИП антитіла, вибраний з групи, що включає: Ів, ІгО2, 1603, ІвО4, ІеМ, ІвА1, ІгА2, ІгАвес, ІеО та ІвЕ антитіло.
6. Антитіло за п. 5, де антитіло є являє собою антитіло ізотипу ІгО2.
7. Композиція, що включає антитіло, або його частину, що зв'язує антиген, за будь-яким з попередніх пунктів, у фармацевтично-прийнятному носії.
8. Композиція за п. 7, яка представлена у формі стерильного водного розчину чи дисперсії, придатної для ін'єкції або інфузії, або представлена у формі стерильного порошку для екстемпорального приготування стерильного ін'єкційного розчину чи дисперсії, придатних для ін'єкції або інфузії.
9. Спосіб одержання стерильного водного розчину за п. 8, у якому виконують мікрофільтрацію зі стерилізацією водного розчину, що містить антитіло, або його частину, що зв'язує антиген, у фармацевтично-прийнятному носії.
10. Виділене моноклональне антитіло, яке зв'язується з ЕгОВ, що містить варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів, де варіабельна ділянка важкого ланцюга кодована нуклеїновою кислотою, що включає 5ЕО І МО: 25, та варіабельна ділянка легкого ланцюга кодована нуклеїновою кислотою, що включає 5ЕО ІЮ МО: 26.
11. Трансгенний ссавець, що не є людиною, який експресує моноклональне антитіло чи його частину, що зв'язує антиген, за п. 1 або за п. 2.
12. Трансгенна рослина, що експресує моноклональне антитіло чи його частину, що зв'язує антиген, за п. 1 або за п. 2.
13. Гібридома, яка продукує антитіло чи його частину, що зв'язує антиген, за будь-яким з пп. 1-6.
14. Гібридома, яка продукує антитіло людини чи його частину, що зв'язує антиген, за п. 1 або 2, де це антитіло кодується: нуклеотидною послідовністю варіабельної ділянки важкого ланцюга, наведеною в 5ЕО І МО: 25 та нуклеотидною послідовністю варіабельної ділянки легкого ланцюга, наведеною в 5ЕО ІЮ МО: 26.
15. Набір, який містить одне чи більше виділених моноклональних антитіл чи їх частин, що зв'язують антиген, за будь-яким з пп. 1-6, і включає інструкції щодо їх використання в лікуванні хвороби, яка асоціюється із залежним від ЕтбВ3 проведенням сигналів.
16. Набір, який містить одне чи більше виділених моноклональних антитіл чи їх частин, що зв'язують антиген, за будь-яким з пп. 1-6, і включає інструкції щодо їх використання в діагностиці хвороби, яка асоціюється із залежним від ЕгЬВ3 проведенням сигналів.
17. Набір за п. 15 або п. 16, де хворобою є рак.
18. Спосіб пригнічення проведення сигналів БтбВ3 у суб'єкта, який включає введення цьому суб'єкту виділеного моноклонального антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за будь-яким з пп. 1-6, у кількості, достатній для пригнічення проведення сигналів ЕгтоВ3.
19. Спосіб лікування раку у суб'єкта, який включає введення цьому суб'єкту терапевтично ефективної кількості виділеного моноклонального антитіла чи його частини, що зв'язує антиген, за будь-яким з пп. 1-6, у кількості, достатній для лікування раку.
20. Спосіб за п. 18 або п. 19, де антитіло, або його частина, яка зв'язує антиген, включає: варіабельну ділянку важкого ланцюга СОКІ, що включає 5ЕО І МО: 7; варіабельну ділянку важкого ланцюга СОК2О, що включає 5ЕО ІЮ МО: 8; варіабельну ділянку важкого ланцюга СЮОКЗ, що включає БЕО ІЮ МО: 9; варіабельну ділянку легкого ланцюга СОКІ, що включає 5ЕО ІЮ МО: 10; варіабельну ділянку легкого ланцюга СЮОК2, що включає БЕО І МО: 11; та варіабельну ділянку легкого ланцюга СЮОКЗ, що включає 5ЕО ІЮ МО: 12.
21. Спосіб за п. 18 або п.19, де антитіло, або його частина, яка зв'язує антиген включає: варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає БЕО ІЮ МО: 1 та варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає 5ЕО ІЮ МО: 2.
22. Спосіб за будь-яким з пп. 19-21, де рак вибирається з групи, що містить меланому, рак молочної залози, рак яєчника, світлоклітинну карциному, рак шлунково-кишкового тракту/ободової кишки, рак легень, світлоклітинну саркому 1 рак передміхурової залози.
23. Спосіб за будь-яким з пп. 18-22, де суб'єктом є людина.
24. Спосіб за будь-яким з пп. 18-23, де антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, вводяться суб'єкту внутрішньовенно, внутрішньом'язово чи підшкірно.
25. Спосіб за будь-яким з пп. 19-24, де антитіло чи його частина, що зв'язує антиген, вводяться в комбінації з другим терапевтичним препаратом.
26. Спосіб за п. 25, де другим препаратом є друге антитіло чи його частина, що зв'язує антиген.
27. Спосіб за п. 25, де другим препаратом є протираковий препарат.
28. Спосіб за п. 27, де протираковий препарат вибирають з групи, що містить антитіло, невелику молекулу, антиметаболіт, алкілуючий агент, інгібітор топоіїізомерази, препарат, націлений на мікротрубки, інгібітор кінази, інгібітор синтезу білка, імунотерапевтичний препарат, гормон чи його аналог, аналог соматостатину, глюкокортикоїд, інгібітор ароматази, невелику молекулу, спрямовану на ЕСРК, 1 інгібітор ТТОК.
29. Спосіб за п. 28, де антитіло є анти-ІСЕІК антитілом, анти-ЕСЕК антитілом чи анти- СМЕТЛ антитілом.
30. Спосіб за п. 28, де невелика молекула зв'язує ІСКІК, ЕСЕВ. або сМЕТ.
31. Спосіб за п. 28, де невелика молекула, спрямована на ЕСЕК, являє собою гефітиніб, лапатиніб або ерлотиніб.
32. Спосіб діагностики раку, асоційованого з ЕтбВ3, у суб'єкта який включає (а) контактування ех уї»о клітин від цього суб'єкта з виділеним моноклональним антитілом чи його частиною, що зв'язує антиген, за будь-яким з пп. 1-6, та (б) визначення рівня зв'язування з ЕтрВ3 на вказаних клітинах, де незвичайно великі рівні зв'язування з ЕгоВ3 вказують на те, що суб'єкт має рак, пов'язаний з ЕтоВ3.
33. Антитіло, яке є: виділеним повнорозмірним моноклональним ІС антитілом, зв'язується з ЕТЬВ3 з Ко приблизно 4 нМ, як визначено із застосуванням аналізу поверхневого плазмонного резонансу або аналізу зв'язування клітин, з використанням клітин МАІ.МЕ-3М, та включає варіабельну ділянку важкого ланцюга СЮОКІ, що включає БЕО ІЮ МО: 7; варіабельну ділянку важкого ланцюга СОК2О, що включає 5ЕО І МО: 8; варіабельну ділянку важкого ланцюга СЮОКЗ, що включає 5ЕО ІЮ МО: 9; варіабельну ділянку легкого ланцюга СОКІ, що включає 5ЕО ІЮ МО: 10; варіабельну ділянку легкого ланцюга СОК2, що включає БЕО ІЮ МО: 11; та варіабельну ділянку легкого ланцюга СЮОКЗ, що включає 5ЕО ІЮ МО: 12.
34. Антитіло, яке є:
виділеним повнорозмірним моноклональним ІС антитілом, зв'язується з ЕтоВ3, знижує регуляцію ЕтбВ3 рецептора в клітинах МАЇМЕ-3М так, що при концентрації антитіла 100 нМ, рівні ЕгЬВ3 на поверхні клітин знижуються принаймні на 90, 1 включає варіабельну ділянку важкого ланцюга СЮОКІ, що включає 5ЕО ІЮ МО: 7; варіабельну ділянку важкого ланцюга СОК2, що включає 5ЕО І МО: 8; варіабельну ділянку важкого ланцюга СЮОКЗ, що включає 5ЕО ІЮ МО: 9; варіабельну ділянку легкого ланцюга СОКІ, що включає 5ЕО ІЮ МО: 10; варіабельну ділянку легкого ланцюга СОКО, що включає БЕО ІЮ МО: 11; та варіабельну ділянку легкого ланцюга СЮОКЗ, що включає 5ЕО ІЮ МО: 12.
35. Антитіло, яке є: виділеним повнорозмірним моноклональним ІвС антитілом, зв'язується з ЕгоВ3, показує ІСзо для бетацелюлін-опосередкованого фосфорилування БЕтбВ3, що становить від 5,3270 М до 1,327 М у клітинах АЮВІ, стимульованих за допомогою бетацелюліну, та включає варіабельну ділянку важкого ланцюга СОКІ, що включає БЕО ІЮ МО: 7; варіабельну ділянку важкого ланцюга СЮОК2О, що включає 5БЕО І МО: 8; варіабельну ділянку важкого ланцюга СЮОКЗ, що включає БЕО ІЮ МО: 9; варіабельну ділянку легкого ланцюга СОКІ, що включає 5ЕО ІЮ МО: 10; варіабельну ділянку легкого ланцюга СОК2, що включає БЕО ІЮ МО: 11; та варіабельну ділянку легкого ланцюга СЮОКЗ, що включає 5ЕО ІЮ МО: 12.
36. Антитіло, яке є: виділеним повнорозмірним моноклональним ІС антитілом, зв'язується з ЕгоВ3, при концентрації 63 нМ, викликає зменшення у херегулін-опосередкованому фосфорилуванні АКТ на приблизно 100 90 в клітинах МАГ.МЕ-3М, та включає варіабельну ділянку важкого ланцюга СОКІ, що включає 5ЕО ІЮ МО: 7; варіабельну ділянку важкого ланцюга СЮК2О, що включає 5БЕО І МО: 8; варіабельну ділянку важкого ланцюга СЮОКЗ, що включає БЕО ІЮ МО: 9; варіабельну ділянку легкого ланцюга СОКІ, що включає 5ЕО ІЮ МО: 10; варіабельну ділянку легкого ланцюга СОКО, що включає БЕО ІЮ МО: 11; та варіабельну ділянку легкого ланцюга СЮОКЗ, що включає 5ЕО Ю МО: 12.
Те ргевепі іпуепцоп геїІагев о ап ізоЇагей топосіопа!Ї апибоду х/Вісі Ббіпаз ЕгЬВ3 тесеріог, а пубгідота ргодисіпе Ше апибоау, а сотровшоп, а Кі, а тетодй г іппібійпе уагіоих ЕгЬВ3З йипсцопв, а тефоой ої ітеайпе сапсег іп а зибіесі.
UAA200909492A 2007-02-16 2008-02-15 ВИДІЛЕНЕ МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО, ЯКЕ ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ErbB3, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ UA99276C2 (uk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90190407P 2007-02-16 2007-02-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA99276C2 true UA99276C2 (uk) 2012-08-10

Family

ID=50849081

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA200909492A UA99276C2 (uk) 2007-02-16 2008-02-15 ВИДІЛЕНЕ МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО, ЯКЕ ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ErbB3, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ

Country Status (1)

Country Link
UA (1) UA99276C2 (uk)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA128387C2 (uk) Антитіло до lag3
CN105073780B (zh) 用SIRPα-Fc融合蛋白处理CD47+疾病细胞
CN103189073B (zh) 抗表皮生长因子受体(egfr)的抗体及其用途
JP6249945B2 (ja) 上皮成長因子受容体（ｅｇｆｒ）に対する抗体及びその使用
CA2678181C (en) Antibodies against erbb3 and uses thereof
EA006972B1 (ru) Моноклональное антитело человека к ctla-4 и способы его применения
UA120753C2 (uk) Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20
EA023555B1 (ru) АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ c-fms ЧЕЛОВЕКА
UA114883C2 (uk) Антитіло до рецептора епідермального фактора росту-3 (her3)
UA125611C2 (uk) Біспецифічні молекули, що мають імунореактивність відносно pd-1 і ctla-4, і способи їх застосування
UA129471C2 (uk) Білки, які містять антигензв'язувальні домени пов'язаної з калікреїном пептидази 2, і їх застосування
UA126854C2 (uk) Антитіло до тім-3
EA017086B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против о8е и их применение
UA126896C2 (uk) Антитіло, що специфічно зв’язується з pd-1, і спосіб його застосування
UA115641C2 (uk) Виділене антитіло, яке зв'язує мезотелін, та імунокон'югат, що його містить
UA124615C2 (uk) АНТИТІЛО ПРОТИ ПОДІБНОГО ДО Fc-РЕЦЕПТОРА БІЛКА 5 (FcRH5)
UA119646C2 (uk) Гуманізоване антитіло, що зв`язується з сd3 людини
UA121464C2 (uk) Анти-jagged1 антитіло та способи його застосування
EA015584B1 (ru) Антитело к cd38 человека и его применение
EA013677B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение
EA026990B1 (ru) Антитела, связывающиеся с человеческой клеткой dec-205
EA027071B1 (ru) АНТИТЕЛО К ActRIIB И СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО КОМПОЗИЦИЯ
UA98762C2 (uk) Моноклональне антитіло, яке зв'язується з tat226, та імунокон'югат
EA014298B1 (ru) Анти-il-17-антитела
UA120357C2 (uk) Виділене біспецифічне антитіло, що специфічно зв'язується з klb і fgfr1 та спосіб його застосування