WO1987003302A1 - Chaine d'adn contenant un gene resistant a la streptomycine et pouvant reguler la manifestation de ce gene - Google Patents
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- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
Definitions
- the present invention relates to a DNA chain containing an actinomycete streptmycin resistance gene and having a function of regulating the expression of this gene.
- the present invention relates to a streptmycin-inhibiting enzyme that coats a streptmycin-inactivating enzyme (streptmycin, a phosphotransferase).
- the present invention relates to a novel DNA strand containing a gene and a DNA region having a function of regulating the expression of this gene.
- Actinomycetes are important microorganisms widely used in the microbial industry to produce useful substances such as antibiotics.
- the vectors were always satisfactory and satisfying.
- the present inventors have studied to improve these points, and as a result, have found that known strain-mycin-producing bacteria,
- the stripe mitigation It has previously been found that the resistance gene has the following properties.
- This gene is known to be an amino-glycoside antibiotic, especially hoshotlan's spherase, an enzyme that phosphorylates the 6-OH group of streptmycin.
- the inventors are S Economics. Approximately 7.0 kb ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ B ⁇ II digested DNA fragment of about 7.0 kb obtained by digesting the chromosomal DNA of Tomyces * griseus with the restriction enzyme Bg ⁇ ⁇ It has also been found that the above-mentioned streptmycin-resistant gene is present in the DNA fragment obtained by further digesting the Gluent with the restriction enzyme SphI (see the above description). See the specification of Kaisho 61-146 186).
- SM streptmycin
- a known gene was inserted into the known restriction site Bg ⁇ ⁇ site of the DNA of IJ702.
- PST141 is this new plasmid-like plasmid?
- Fig. 2 shows that the size of 30 to 141 is about 12.6 1 ⁇ and the restriction map of hybrid plasmid pST144 is shown in Fig. 2 of the attached drawings.
- Japanese Patent Application No. 54-26553733 describes “S Economics. Tomyces ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ cut fragment of DNA of Glyceus. And pIJ702 plasmid, a II fragment of PDNA and a powerful hybrid plasmid, as shown in the restriction map in Figure 2 of the attached drawing.
- the plasmid P used for the above transformation was a plasmid P containing the entire D chain corresponding to the SM resistance gene, and was transformed by a powerful plasmid. Strains that have no or low expression of the SM-resistant gene are out of the SM-resistant strains. I realized that. Further research taking into account this
- the SphI truncated DNA fragment of size is SM
- a DNA region that functions to regulate the expression of resistance genes i.e., a stratum that is artificially added from outside.
- the DNA region having this gene expression regulation function has SM resistance.
- the present inventor has found that it is possible to produce the same.
- the SM resistance gene contains the SM resistance gene and has a function of regulating the expression of this gene.
- the host strain transformed with the recombinant plasmid is: — I
- a substance that induces the expression of the SM resistance gene from the outside for example, Streptomycin
- Genes can be expressed.
- the DNA strand (or region) having the above-mentioned gene expression regulating function, together with an appropriate gene is transformed into a plasmid using recombinant DNA technology.
- the recombinant plasmid thus obtained, it is possible to express the gene in an actinomycete host at will. It is estimated to be. Therefore, the DNA strand having the above function is industrially useful in various aspects.
- the present inventor has succeeded in obtaining such a novel DNA strand.
- the gist of the present invention is a strain mysterious grease.
- Chromosomal DNA containing the tomycin resistance gene was digested with restriction enzyme ⁇ to obtain a 7.0 kb Bg ⁇ ⁇ -cleaved fragment and pIJ702 plasmid DNA.
- ⁇ ⁇ It has a restriction enzyme cleavage site which is constructed by joining the cleavage fragment and is shown in the restriction map of FIG.
- the fragment is further digested with the restriction enzyme SphI.
- the DNA chain has a size of about 3.8 kb, and contains a strep and tomycin resistance gene.
- Fig. 1 is a stiff.
- the DNA base containing the resistance gene (nucleotide 1)
- the novel DNA strand according to the present invention includes: STRESS MISSION 'Grecess.Sillion.
- a ⁇ ⁇ cut of 7.0 kb in size obtained by cutting the chromosomal DNA of a tomycin-resistant strain with the restriction enzyme Bs ⁇ ⁇ and represented by the restriction map shown in Fig. 1.
- DNA strand is used to mean a DNA strand having a nucleotide sequence identical to that of the DNA strand, and different bases (nucleic acid) depending on the degeneracy of the DNA component. It also refers to DNA strands that have a creatio sequence but are identical in their function.
- a specific example of the novel DNA strand according to the present invention is a hybrid plasmid PpST11 (restriction enzyme thereof) already synthesized by the present inventors.
- the map is as shown in Fig. 2), and its size is about 12.6 kb). It was isolated from its host actinomycete, and this plasmid was replaced with the restriction enzyme Bg ⁇ . ⁇ ⁇ ⁇ -cut DNA fragment (approximately 7.0 kb and obtained from Streptomics * Glyceus DNA) This restriction map is shown in Fig. 1).
- Sph I (2) and Sph I (3) in Figure 1 at the site of cleavage.] 9 obtained as a DNA strand approximately 3.8 kb in size.
- the GCATGC part with Sph I (3) displayed at the top of the row is the Sph I (3) shown in the map in Fig. 1.
- the (a) AGGCCT part with Aa ti (shown above) corresponds to the Aat 1 (1) cutting site in Fig. 1, and (b) a line with the Bam HI (4) mark.
- the GGATCC part written above is Bam HI (corresponding to the cutting site in Fig. 1).
- the GGATCC part with Bam HI (3) displayed above corresponds to the Bam HI (3) cutting site in Fig. 1, and (e) Bam HI) displayed above.
- the GGATCC portion corresponds to the Bam HI (2) cleavage site in Fig. 1, and (f) the GAGCTC portion with Ss st I shown above is the S S st I cleavage site in Fig. 1.
- (G) Pvu ⁇ GAGCTG indicated at the top corresponds to the Pvu II cutting site in Fig. 1, and (h) Sph I (2) indicated at 380
- the portion of GCATGC leading to C in Fig. 1 corresponds to the Sph I (2) cleavage site in Fig. 1, and (i) the 38th G: ⁇ with Bam HI (1) displayed above.
- the portion of GGATCC from the 3rd to the 3830th C corresponds to the BamHI (1) cleavage site in Fig. 1.
- the DNA fragment from the 104th input to the 1966th A is the above-mentioned stripe mimic. It has been decided this time to use a resistant gene.
- the DNA strand according to the present invention has the Sph I (3) character displayed above the DNA base (nucleotide) sequence diagram shown in FIG. 3 of the accompanying drawings. From the DNA region corresponding to the SphI cleavage site to the DNA region corresponding to the SphI cleavage site indicated above, the letters Sph1_ ( 2 ) are shown in FIG. Is a DNA strand that has a nucleotide P sequence, or is due to the degeneracy of the DNA and this DNA strand.3 .
- the production of a novel DNA strand according to the present invention can also be carried out by artificial synthesis since the nucleotide P sequence of the DNA strand has been found as described above. However, it can also be prepared directly from the DNA sequence of griseus or its mutant strains using common genetic recombination techniques. You. However, by the present inventors, Strept Mystery deposited with the Institute of Microbial Industry and Technology (MIC) as FERMBP-118 (FERMBP-118) * The restriction enzyme was converted from the plasmid pST141 retained by Streptomyces lividans 4-1 (refer to Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-46886). It is easy to obtain by cutting.
- MIC Institute of Microbial Industry and Technology
- the plasmid P pST 14 1 was obtained from Strept Myces Reduction 4-1 according to the conventional method of gene recombination technology, and the restriction was obtained.
- the plasmid P is cut with the enzyme Bg ⁇ II, and further cut with the restriction enzyme SphI to obtain a mixture of DNA fragments of various lengths.
- a DNA fragment having a size of about 3.8 kb was isolated by gel gel electrophoresis, and the desired DNA ⁇ strand according to the present invention was separated from this fragment by the present invention. Wear. '
- a DNA strand that cooperates with a phosphotransferase that inactivates streptomycin that is, the DNA strand according to the present invention
- i) is a recombinant DNA molecule constructed by inserting it into an appropriate plasmid vector (i ⁇ -), which is incorporated into an appropriate host actinomycetes. In this case, when the presence of the streptomy machine is sensed, the host machine will deactivate the streptomycin.
- Novel recombinant DNA molecules can be created that demonstrate the ability to produce amylase.
- an appropriate plasma vector used for this purpose the above-described plasma mit pIJ702 is used.
- this hypervisor / prism is incorporated into Streptomyces / Revidence, it will be applied to Streptomyces. It can produce a phosphotransferase that senses its presence and inactivates it.
- the cells were collected by centrifugation for 0 minutes.
- Chromosomal DNA can be obtained by a known method (Chater et al., “Current To PICs in 'Microbiology and Immu no 1 ogy” 96, 69)
- the recovered DNA fragment was dried under reduced pressure and dissolved in 40 ml of pure water.
- a buffer solution comprising 0.66 M Tris-HC ⁇ (H7.6), 66 mM MgC ⁇ 2 , 0.1 M dithiothreitol, 1 OmM ATP; ⁇ ⁇ And were combined with 15 units of 4-DNA ligase (5) and a conjugation reaction was performed overnight at 4 TC.
- the Bg ⁇ fl cut-fragment of actinomyces plasmid ⁇ pIJ702 was added to the stripe myceles grease ISP 52 3 Hybrid plasmid pST141 (size approx.
- the regenerated clones consisted of ISP ⁇ 4 medium and SM20? ISP73 ⁇ 44 medium containing / '/ ⁇ and SM50? The culture was re-replicated to an ISP3 ⁇ 44 medium containing the medium. Then, the cells are cultured at 27'C for 3 days, and the SM-resistant clones grown simultaneously on the medium containing SM and the medium containing SM are selected.
- the Streptomyces 'Revidence 4-1' transformed with the plasmid pST144 contains SM5 ⁇ ,
- (Oxid) was inoculated into a medium consisting of (Oxid) and cultivated for 4 days at 27 jimes.
- the cells were collected by centrifugation of the culture solution at 900 rpm for 10 minutes, and the cells were washed with physiological saline. Later, 1 0 the cells 3 ⁇ 4 1 2 5 ⁇ Tr is -ma 1 a 1 e, was suspended in 12-5 mM MgS0 4 (pH 7.0) or al composed buffer 4 0, the ultrasonic in ice water To disrupt the cells. The homogenate was centrifuged at 160000 rpm for 30 minutes to obtain a cell-free enzyme extract.
- the reaction mixture was centrifuged at 1,600 rpm for 10 minutes, and then centrifuged.
- CM-Sephadex C-25 (equilibrated with 0.1 M NaC) Chromatographic graph in the 100 column After elution with water, elution was performed with 0.1 M to 1 M NaC. Flow the Sakaguchi reaction-positive zone into the activated carbon 5 tower, and add water, 40 to
- a 7'0 kb SM-resistant DNA strand is a phosphotransferase that phosphorylates and inactivates the OH group at position 6 of streptmycin. (APH (6)) was clarified.
- the culture was regenerated by culturing for 283 days in the ground. Played ⁇ Extracted a plastic ⁇ from the green. Cleavage of the extracted brass ⁇ with restriction enzymes. The turns were examined by the aga ⁇ -sgel electrophoresis method. As a result, the portion between Bo (1) and Sph I ( 2 ) was deleted from the 7.0 kb DNA fragment in FIG. 1 and Pst I to BH
- Streptococcus lividense obtained in Experimental Example 1 a strain having a plasmite pH T000 and a strain having a PHT002. And a strain having PHT083 ⁇ 4 and a strain having pHT010, respectively, in YEME culture.
- the cells were cultured in a 500-milliliter triangular flask containing 100 / l, until the late logarithmic stage at 28.
- the bacteria cultured in each flask were divided into two parts, and one was transferred to a 50-piece triangular flask containing YEME medium 5 containing streptomicin 5 / ⁇ . The other was transferred to a 500 ml triangular flask containing YEME medium 5 containing streptmycin.
- the amount of the plasmid was quantitatively determined depending on the presence or absence of streptmycin. No change was observed in the value of the sprouts.
- the difference in the expression level of the streptmycin resistance gene is not attributable to the difference in the amount of blast mitosis containing the gene, but is the difference in the streptmycin resistance gene. It was concluded that it was directly derived from the presence or absence of the addition.
- the DNA strand indicated by the portion between BamHI (?) And SphI ( 3 ) in the 7.0 k DNA fragment in FIG. 1 exists alone (p In the case of HT08), it is a sSurgical. Expression of the tomycin resistance gene is present, but the expression of the gene is regulated (on / off) depending on the presence or absence of the streptomycin. It is clear from the results in Table 1 that this is not possible.
- the expression of the streptomycin resistance gene depends on the DNA fragment between BamHI ( 3 ) and Sphl) in the DNA fragment shown in Fig. 1.
- Fig. 1 In addition to the DNA strand (pH T08 :) shown between Bam HI (3) and Sph I (3) of the DNA fragment of FIG. n in which the Gume down the door of cormorants Chino Sph I (2) or Ps t part this DNA region (p HT 0 0 2) is Ru Oh essential that shown in between the I or has come in the confirmation
- the measurement of streptmycin-inactivating enzyme was performed by the following method.
- Ru door 4 of the ratio ⁇ Tsu off Ryo one (] 0 mM Tr is - HC ⁇ (pH 7.6) ⁇ , 1 0 mM MC ⁇ 2, 5 Suspend in 0 mM H 4 C ⁇ , and 3 mM 2 (mercaptoethanol), and sonicate the cells in ice water. Centrifuge in a chilled centrifuge at 2,600 rpm for 30 minutes to remove the cells and obtain a cell extract.
- the total protein contained in the 'cell extract' is determined by the change in absorbance at 595 nm with Coomassie Pliant Blue using serum permeate as a standard. (Brad df 0 rd "Ana. Biochem” 72, 248 (19776)) 0 Cell extract 5 or 25 and sterile water 40 ⁇ or 20 Tsu full completion one [1 M Application Benefits scan one Ma Le _ (pH 7.0), 1 0 0 mM MgS0 4, 3 0 mM ATP, 1 0 mM be sampled replica preparative microstrip Thin] and 5 were mixed, their Keep the mixed solution at 37 ° C for 1 hour. Immediately after the reaction, transfer to 95 and hold for 5 minutes to inactivate the enzyme.
- reaction solution was subjected to a bioassay using PA, tils' subbutyls ATCC 6633 to quantitate unreacted streptmycin contained in the reaction solution.
- S gleich Specific activity of tomycin inactivating enzyme is 1 protein, 1 hour 1-Expressed as the amount of decrease in the stripe machine of this D.
- the DNA strand according to the present invention can be reliably incorporated as a Strept-Mycin-resistant selection marker by incorporating it into an appropriate plastic vector. It is useful for preparing a hybrid liposome that works well, and is suitable for use in the gene manipulation technology of actinomycetes.
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Description
明 細 書
ス ト レプ ト マ イ シ ン耐性遣伝子を含有 し且つ この遺伝子の発現 ¾調節する D N A鎖
技 術 分 野
本発明は、 放線菌のス ト レ プ ト マ イ シ ン耐性遺伝子 を含有 し且つこ の遣伝子の発現を調節する機能を有す る D N A鎖に関する も のである。 特に、 本発明はス ト レプ ト マ イ シ ン不活化酵素 （ ス ト レ プ ト マ イ シ ン . ホ ス ホ ト ラ ンスフ エ ラ 一 ） をコ ー ト するス ト レプ ト マイ シ ン耐性遺伝子及びこの遺伝子の発現を調節する機能 を有する D N A領域を含有する新規 ¾ D N A鎖に関す る も のであ る。
背 景 技 術
放線菌は、 抗生物質の如き.有用物質の生産菌と して 微生物工業に於て広 く 使用されている重要な微生物で る。
D N A組換え技術を放線菌の育種に、 或いはその遺 伝的性質の解明に利用する こ とは産業上極めて有益で ある。
こ の よ う な見地か ら、 放線菌で利用 し う るプ ラ ス ミ · ベ ク タ ーが多数構築され発表されて る。 しかし ながら、 これ らの既知のプラ ス ミ ベク タ一に放線 菌の遺伝子を挿入した場合に、 その挿入された遺伝子 は必 らず しも所望の通 ]? に発現が起らず、 この遺伝子 の発現は人為的な制御を受けるい こ とが判明 している
従って、 さ らに高度 遺伝子の発現の制御を必要と す
る遺伝子組換え操作には、 従来の放線菌プ ラ ス ミ
ベ ク タ ーは必 らず し も 満足で ¾かった。
本発明者等は これ らの点を改善すベ 研究 した結果、 ' 公知のス ト レ プ ト マ イ シ ン生産菌 ， ス ト レプ ト マ イ セ
ス * グ リ セ ウ ス I S Ρ 5 2 3 6 ( St re p tomyc es
、
gr i seus I S P 5 2 3 6 , A T C C 2 3 3 4 5 ) の保
有するス ト レ プ ト マ ィ シ ン 耐性遺伝子を含有 し且この
遺 伝子の発現の調節機能を有する D N A 領域を含む新
規 D N A フ ラ グメ ン ト を単離す る こ と に今回、 成功
した。 'しか も、 こ の よ う ス ト レブ ト マ イ シ ン耐性遺
伝子の'発現を調節する機能を有す る D N A領域を欠い
た状態で該ス ト レプ ト マ イ シ ン耐性遺伝子を プ ラ ス ミ
！？ . ぺ ク タ — に挿入 して も、 その プ ラ ス ミ ぺ ク タ 一の組換え D Ν Α 分子は所望の通 ]? には、 ス ト レ プ ト
マ イ シ ン耐性遣伝子の発現を しない こ と を知見 した。
すで に、 本発明者は、 ス ト レプ ト マ イ シ ン生産菌 と
して公知であ る前記ス ト レブ ト マ イ セ ス · グ リ セ ウ ス
I S P 5 2 3 6 力 らのス ト レ プ ト マ イ シ ン 耐性遣伝子
の 分離と、 この遺伝子の ク ロ ー ニ ングを試みてお ]9、
実験の結果、 ス ト レプ ト マ イ シ ン耐性遺伝子の所在及 · びその性状を若千解明 した （ 特願昭 5 4 - 2 6 5 3 7
3 号 ， 昭和 5 4 年 1 2 月 1 8 B 出願 ； 特開昭 6 1 - 1 4 6 1 8 6 号明細書参照 ） 。
すな わ ち、 本発明者 ら に よ る と、 ス ト レ プ ト マ イ シ
ン耐性遺伝子は、 下記の性質を有する も の で あ る こ と が先に見出されていた。
(ィ） こ の遣伝子は、 ス ト レブ ト マ イ セ ス . グ リ セ ゥ ス の ス ト レ プ ト マ イ シ ン耐性を支配する染色体の D N A を制限酵素 Π で切断して得 られる約
7.0 キ π ペ ース （kb)の大 き さ の Bg^ Π · Π切 断 D N A フ ラ グメ ン ト 中に含まれる。
(口） こ の遺伝子 ¾含む上記の約 7.0 kb の大き さ の D N A フ ラ グ メ ン ト の制限酵素地図は、 添付図面 の第 1 図に示す通 ]? であ る。
こ の遺伝子は、 了 ミ ノ配糖体抗生物質、 特にス ト レプ ト マ イ シ ン の 6 - O H基を リ ン酸化する酵 素である ホ ス ホ ト ラ ン'ス フ エ ラ ーゼを コ 一 ト する。 ま た： 発明者 らは、 ス ト レ フ。 ト マ イ セ ス * グ リ セ ウ ス の染色体 D N A を制限酵素 Bg^ ϋ で切断 して得 られた 前記の約 7.0 kb の大 き さの Β^^ Π · B^^ II 切断 DNA フ ラ グメ ン ト を、 更に制限酵素 Sph I で切断 して得ら れた D N A フ ラ グ メ ン ト 中 に前記ス ト レ プ ト マ イ シ ン 耐性遺伝子が存在する こ と も 知見した （ 前記特開昭 6 1 - 1 4 6 1 8 6 号明細書参照 ） 。
さ らに、 本発明者 らは、 前述のス ト レ プ ト マ イ シ ン ( 以下、 S M と略記する ） 耐性遺伝子を含有する約 7.0 kb の B II · Bg^ II切断 D N A フ ラ グメ ン ト ¾ 用 て、 これを、 既知の ブ ラ ス ミ I J 7 0 2 の D N A の制限酵素 Bg^ Π の切断サ イ ト に公知の遺伝子
組換え技術で組込む こ と に よ って、 新規る ハ イ ブ リ ツ · プ ラ ス ミ を創製する こ と に成功 した。 この新規 イ ブ リ ツ ト · プ ラ ス ミ 1?を p S T 1 4 1 と 命名 した, ま た こ の プ ラ ス ミ ト ？ 3 0? 1 4 1 が約 1 2.6 1^ の大 き さ であ る こ と 及びハ イ ブ リ ツ · プ ラ ス ミ p S T 1 4 1 の制限酵素地図が添付図面の第 2 図に示す通 ]) で あ る こ と も 知見 した （ 前記特開昭明細書参照 ） 。 こ の プ ラ ス ミ ト p S T 1 4 1 を保有する ス ト レプ ト マ イ セ ス · リ ダ ン ス形質転換株は、 微ェ研に昭和 5 9 年 1 2 月 6 日 以来、 微ェ研菌寄第 7 9 8 4 号 と して寄託 し、 ま た昭和 6 2 年 1 0 月 3 1 日 にブ タ ペ ス ト 条約に よ る 国際寄 Kの規定に よ る移管で微ェ研条寄第 1 1 9 8 号 （ F E R M B P - 1 1 9 8)と して寄託 して あ る。
そ して、 特願昭 5 4 - 2 6 5 3 7 3 号においては、 「 ス ト レ フ。 ト マ イ セ ス 《 グ 'リ セ ウ ス の D N A の Βσ^ Π 切断フ ラ グメ ン ト と p I J 7 0 2 プ ラ ス ミ P D N A の II切断 フ ラ グメ ン ト と 力 らる るハ イ プ リ ッ ' プ ラ ス ミ で あって、 添付図面の第 2 図の制限酵素地図 に示 した制限酵素切断サ イ ト を有 し且つ大き さ約 12.6 k を有する ハ イ ブ リ ッ ト · プ ラ ス ミ p S T 1 4 1 中に存在 して且つス ト レ プ ト マ イ セ ス · グ リ セ ウ ス
D N A 由来で あ る D N A フ ラ グメ ン ト と 等価であ る こ と を特徵 と する、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン耐性遺伝子を内 部 に保有する D N A 鎖」 に係る発明を し特許請求 し た。 '
更に、 今回、 本発明者は、 研究を進めた。 する わ ち、 前記のス ト レ プ ト マ イ セ ス · グ リ セ ウ ス の染色体 DNA を Bg^ Πで切断 して得 られて第 1 図の制限酵素地図を 有 し S M 耐性遺伝子を含有する約 7.0 kb の大 き さ の Bg^ Π · By fl 切断 D N A フ ラ グ メ ン ト を、 更 に制限 酵素 Sph I で切断 して得 られた S phi - Sphl 断片を作 .
1?、 さ らに この Sphl - Sphl 断片を、 制限酵素 pst I で切断 して得 られた Sphl - Pst I断片 ， あ る は Bam H I で切断して得 られた Sphl - Bam H I 断片を収得 し、 これ ら断片を用いてぺ ク ク タ 一 に組込み、 各種のプ ラ ス ミ を再構築 した。 得 られた各種の .?。 ラ ス ミ I ^を、 本来ほス ト レ プ ト マ イ シ ン を生産 し い性質のス ト レ . プ.ト マ イ セ ス * リ ビダン ス ¾株に夫々 に導入 した。 得 られた各種のス ト レプ ト マ イ セ ス · リ ピダ ン ス形質転 換菌株を夫 々 に培養 し、 その菌株の培養液中にス ト レ プ ト マ イ シ ン を添加 して更に培養 した。 こ の培養実験 の場合の形質転換株の発育状況か ら、 各種の形質転換 株のス ト レ プ ト マ イ シ ン不活化酵素の産生の有無を調 査 し、 その結果か ら導入 した夫 々 の ブ ラ ス ミ 中 に存 在する S M耐性遺伝子が発現さ れている か否かを調査 した。 その調査の結果、 上記の形質転換に用いたプラ ス ミ Pが S M耐性遺伝子に対応する D 鎖の全体を 含有する プ ラ ス ミ Pで あって、 力 る プ ラ ス ミ で形 質転換された菌株で あって も、 S M 耐性遣伝子の発現 がな い又は少 い菌株が S M耐性を示す菌株の外に生
じた こ と を知見 した。 こ'の こ と を勘案 して更に研究を
続けた。 その結果、 前記の第 1 図の制限酵素地図を有
し且つ S M耐性遺伝子を含有する約 7.0 kb の大き さ
の Π · Bg^ E切断フ ラ グメ ソ ト を Sph I で切断し
て得られ且つ S M耐性遺伝子を含有する約 3.8 kb の
大き さの前記の Sph I 切断 D N A フ ラ グメ ン ト は、 SM
耐性遺伝子の発現を調節する機能を有する D N A領域、 すなわち外部か ら人為的に加え られたス ト レブ ト マイ
シ ン の存在を感知 して且つ S M耐铨遺伝子の発現を支
配する、 即.ち調節'する D N A領域を含有する こ と、 ま
た こ の遺伝子発現調節機能を もつ D N A領域が S M耐
性遺伝子の附近にない と、 S M耐性遺伝子は所望の通
]3 には発現 しない こ と を今回、 知見 した。 これ らの知
見の一部は、 本発明者 らに よって、 「 The Journal of
Antibiotics 」 Vol. 3 9 , M. 1 0 , 1 5 0 5〜 1 5 0 7 頁 （ 1 9 8 6 年 ]. 0 月 2 5 日 発行 ） に発表された。
従って、 上記の S M耐性遺伝子発現の調節機能を有
する領域の D N A鎖又はこ の領域を含有する D N A鎖
が単離 ， 収得されれば、 これを S M'耐性遺伝子と共に
ブ ラ ス ミ ベ ク タ 一 に組込むこ と に よ 、 S M耐性
選択マー カ 一 と して確実に働 く 組換えプ ラ ス ミ を作
製する こ とが可能にな る こ と を本発明者は知見 した。
しかも 、 S M耐性遺伝子を含有する と共に、 こ の遺伝 ' 子の発現を調節する機能を も つ D Ν Α鎖 （ 又は領域）
を含む.組換えプ ラ ス ミ ト で形質転換された宿主菌株は、
— i一 こ れ に、 外部か ら S M耐性遺伝子の発現を誘導せ しめ る物質、 例えばス ト レ プ ト マ イ シ ン を添加する こ と に よ って、 人為的に任意に、 S M耐性遺伝子を発現さ せ る こ と が可能に ¾ る。 ま た、 さ らに S M耐性—遺伝子の 替 わ に、 適当 な遺伝子 と共に、 前記の遣伝子発現調 節機能を も つ D N A 鎖 （ 又は領域 ） を組換 D N A 技術 を用いて プ ラ ス ミ 中に挿入 し、 こ う して得 られた組 換えプ ラ ス ミ を用 いる こ と に よ って、 該遣伝子を任 意に放線菌宿主中 で発現せ しめる こ と が可能である と 推定される。 従って、 前記の機能を有す る D N A 鎖は 種々 の面で産業上有用であ る。 か る新規 ¾ D N A 鎖 を得る こ と に今回、 本発明者は成功 したのであ る。
発 明 の 開 '示
従って、 本発明 の要旨 と する と こ ろ は、 ス ト レ ブ ト マ イ セ ス . グ リ セ ウ ス の ス ト レ フ。トマ ィ シ ン耐性遺伝子 を含む染色体 D N A を制限酵素 Π で切断 して得 ら れた大き さ 7.0 kb の Bg^ ϋ 切断 フ ラ グ メ ン ト と pIJ 7 0 2 ブ ラ ス ミ の D N A の Β ^ Π 切断 フ ラ グ メ ン ト と を接合 して構築さ れて且つ添付図面の第 2 図の制限 酵素地図に示 した制限酵素切断サ イ ト を有 し且つ約
1 2.6 kb の大き さ を有する ハ イ ブ リ ッ ブ ラス ミ p S Τ 1 4 1 を、 制限酵素 Bg^ Π で切断 して得 られ て且つス ト レプ ト マ イ セ ス · グ リ セ ウ ス D N A 由来で あ る Π · Β9£^ Π 切断 フ ラ グメ ン ト で あって、 しか も ス ト レプ ト マ イ シ ン耐性遺伝子を含有 し且つ添付図
面の第 1 図の制限酵素地図に示 した制限酵素サ イ ト を
有する 7. 0 kb の大 き さ の前記 Bg^ Π · B9£> II切断フ
ラ グメ ン ト を、 更に制限酵素 Sph I で切断する こ と に
よ 得 られた Sph I · Sph I切断 D N A鎖であ ] 3 、 こ
の D N A 鎖は、 約 3。8 kb の大 き さ を も ち、 ス ト レ プ 、 ト マ イ シ ン耐性遺伝子を 内部に含有する と共に、 前記
ス ト レ プ ト マ ィ シ ン耐性遣伝子の発現を調節する機能
を有する D N A 領域を内部に含有する D N A鎖であ 、
あ るいは この D N A 鎖 と等価で あ る こ と を特徵と する、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン耐性遺伝子を含有 し且つ この遺伝
子の発現を調節す'る機能を有する D N A 鎖に ある。
図面の簡単な説明 .
第 1 図はス ト レ フ。 ト マ イ セ ス · グ リ セ ウ ス の染色体
D N A を制限酵素 Πで切断 して得.られて ス ト レフ。
ト マ イ シ ン耐性遺伝子を含む大き さ 7.0 kb の D N A
フ ラ グメ ン ト の制限酵素開裂地図で あ る。 第 2 図は第
1 図の D N A フ ラ グ メ ン ト を プ ラ ス ミ Pぺ ク タ 一 pIJ
7 0 2 に組込んで合成さ れたハ イ ブ リ ッ · ブラ ス ミ
^ pS 1 4 1 の制限酵素地図であ る。 第 3 図は第 1 図
の制限酵素開裂地図で示される大き さ 7.0 kb の DNA
フ ラ グメ ン ト の う ちの Sph I (3)乃至 Bam H I (1.)の部分
( 大き さ 約 3.8 kb ) で あっ て、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン
耐性遺伝子を含有する部分の D N A塩基 （ ヌ ク レオチ '
^ ) 配列図 で あ る。
本発明 に よ る上記の新規な D N A鎖は、 具体的には、 .
ス ト レ ブ ト マ イ セ ス ' グ リ セ ウ ス.ス ト レ フ。 ト マ イ シ ン 耐性菌株の染色体 D N A を制限酵素 Bs^ Π で切断して 得られて且つ第 1 図に示した制限酵素切断地図で表わ された 7.0 kb の大き さの Β^^ Π切断フ ラ グメ ン ト を、 第 1 図で示される Sph I (2)の切断サ イ ト と Sph I (3)の 切断サ イ ト との処で切断して得 られた約 3.8 の大 き さ の D N A フ ラ グ メ ソ ト に存在する。
こ こ で、 本発明 において、 「 ス ト レブ ト マ ィ シ ン耐 性遺伝子を含有 し且つこ の遺伝子の発現を調節する機 能を有する D N A領域を内部に含有する D N A鎖と等 価である」 D N A鎖とは、 該 D N A鎖 と全 く 同一の塩 基 （ ヌ ク レ オ チ ） 配列の D N A鎖を意味するばか で ¾ く 、 D N A コ ン の縮重に よ 、 異なった塩基' ( ヌ ク レ オチ 配列を持つがその機能におい ては同 —であ る D N A鎖を も 意味している。
発明 を実施するための最良の形態 本発明に る新規 D N A鎖の一具体例は、 本発明者 に よってすでに合成されたハ イ ブ リ ツ ト · ブラ ス ミ P pST 1 1 ( これの制限酵素地図は第 2 図に示された 通 ]) であ 、 その大き さは約 1 2.6 kb である ） をそ の宿主放線菌か ら単離 し、 こ の プ ラ ス ミ ト を制限酵素 Bg^ IIで切断し、 得 られた大き さ約 7.0 kb を有 し且 つ ス ト レ プ ト マ イ セ ス * グ リ セ ウ ス D N A 由来であ る Π · Π切断 D N A フ ラ グ メ ン ト （ こ れ の制限 酵素地図は第 1 図に示された通 である ） を、 制限酵
素 Sph I で第 1 図の Sph I (2) と Sph I (3) と の切断サ イ ト と の処で切断する こ と に よ ]9、 大き さ 約 3.8 kb の D N A鎖 と して得 られる。
今回、 上記の大 き さ 約 3.8 kb の D N A鎖の上流側 の一方の Sph I 切断サ イ ト （ 第 1 図の Sph I (3)で示さ れた切断サ イ ト ） か ら、 当該 D N A鎖の上流 よ 下流 へ向 う 第 2 番 目 の Sph Ϊ 切断サ イ ト （ 第 1 図の Sph I (2)で示された切断サ イ ト ） を越え、 第 1 図の Bam HI(1) で示された切断サ イ ト に達する全長 3 8 3 0 ペー ス の D N A フ ラ グ メ ン ト 中の塩基 （ ヌ ク レオ チ ド ） 配列を 解析 した。 こ の塩基 （ ヌ ク レ オ チ ド ） 配列を添付図面 の第 3 図 に示す。 第 3 図の塩基配列に おい て、 第 3 図 の塩'基配 .列の初端で Sph I (3)を上に表示 した GCATGC の部分は第 1 図の地図で示 した Sph I (3)の切断サ イ ト に相当する。 ま た（a) Aa t i ( を上に表 した A G G C C T の部分は、 第 1 図の Aa t 1 (1)切断サイ ト に相応 し、 （b) Bam H I (4)の表.示 と 共に線を上に書いた G G A T C C の部分は第 1 図の Bam H I ( 切断サ イ ト に相応 し、 （c) Ps t_J を上に表示 した C T G C A G の部分は第 1 図の Ps t I 切断サ イ ト に相応 し、 （d) Bam H I (3)の表示を上 に示 した G G A T C C の部分は第 1 図の Bam H I (3)切 断サ イ ト に相応 し、 （e) Bam H I ）を上に表示さ れた G G A T C C の部分は第 1 図の Bam H I (2)切断サ イ ト に相応 し、 （f) Ss t I を上に表示された G A G C T C の 部分は第 1 図の Ss t I 切断サ イ ト に相応 し、 （g) Pvu Π
を 上に表示された G A G C T G は第 1 図の Pvu Π切断 サイ ト に相応 し、 （h) Sph I (2)を上に表示さ れた 380 4 番 目 の G 力 ら 3 8 0 9 番 目 の C に至る G C A T G C の 部分は第 1 図の Sph I (2)切断サ イ ト に相応 し、 （i) Bam H I (1)を上に表示さ れた 3 8 2 5 番 目 の G :^ ら 3830 番 目 の C に至る G G A T C C の部分は第 1 図の B am H I (1)切断サ イ ト に相応する。 第 3 図に示された塩基 配列の う ち、 1 0 4 3 番 目 の Α 力 ら 1 9 6 6 番 目 の A に至る D N A フ ラ グ メ ン ト が前記ス ト レ プ ト マ イ シ ン 耐性遣伝子を す と今回、 決定されて る。
従って、 本発明に よ る D N A 鎖は、 添付図面の第 3 図に示された D N A塩基 （ ヌ ク レ オ チ ト ） 配列図につ いて、 Sph I (3)の文字を上に表示さ れた Sph I切断サ ィ ト に対応する D N A領域力 ら、 Sph 1_(2)の文字を上 に表示された Sph I 切断サ イ ト に対応する D N A 領域 ま でに至る第 3 図に示された ヌ ク レ オチ P配列を有す る D N A 鎖であ る、 あ る は こ の D N A 鎖 と コ ト ン の 縮重に よ ]3 等価であ る D N A 鎖で あ る と言え得る も の め る 。
本発明に よ る新規 D N A鎖の生産は、 その D N A鎖 の ヌ ク レ オ チ P配列が上記の如 く 判明 したの で人工的 に合成 して も 行い得る。 しか し、 ま たス ト レ ブ ト マ ィ セ ス . グ リ セ ウ スま たはその変異株の D N A 力ゝ ら、 ― 般的 遺伝子組換え技術を用いて直接に調製する こ と も でき る。 しか しなが ら、 すでに本発明者等に よ って
工業技術院微生物工業技術研究所 （ 微ェ研 ） に微ェ研 条寄第 1 1 9 8 号 （ F E R M B P - 1 1 9 8 ) と し て寄託されてい る、 ス ト レ プ ト マ イ セ ス * リ ダ ン ス 4 - 1 ( Streptomyces li vidans 4 一 1 ) ( 特開昭 6 1 - 1 4 6 8 6 号明細書参照 ） の保持する プ ラ ス ミ pST 1 4 1 か ら、 制限酵素 に よ る切断で収得する の が簡便で ある。 す ¾わち、 ス ト レ プ ト マ イ セ ス · リ ダ ン ス 4 - 1 か ら、 遺伝子組換え技術の慣用的る手法 に従って、 プ ラ ス ミ P pST 1 4 1 を取得 し、 制限酵素 Bg^ II で該プ ラ ス ミ P ¾切斬 し、 さ ら に制限酵素 Sph I で切断 して各種の長さの D N A断片の混合物を得て. こ の混 物か ら、 了 ガ ロ ー スゲル ¾気泳動に よって約 3.8 kb の大き さ の D N A フ ラ グ メ ン ト を単離 し、 さ ら に この フ ラ グメ ン ト か ら本発明 に よ る所望の D N A ■ 鎖を分離で き る。 '
本発明 に よ る D N A 鎖を用 いる と、 ス ト レプ ト マ イ シ ン を不活化する ホ ス ホ ト ラ ンス フ ェ ラ 一 ゼを コ 一 P する D N A 鎖、 す ¾ わち本発明 によ る 前記の約 3，8 kb の大き さ を も ち且つス ト レ プ ト マ イ シ ン耐性遺伝子と この遣伝子の発現を調節する機能を も つ D N A領域と を含有する D N A鎖（i)を、 適当 な ブ ラ ス ミ ベ ク タ 一 ( i ί- ) に挿入する こ と に よ って構築さ れた組換え D N A 分子で あって、 適当 ¾ 宿主の放線菌に組込んだ 場合に、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン の存在を感知 した際には ス ト レ プマ イ シ ン を不活化する ホ ス ホ ト ラ ン ス フ ェ ラ
一ゼを産生する こ と の でき る能力を示す新規な組換え D N A分子が創製でき る。 この 目的に用い られる適当 プ ラ ス ミ · ベク タ ー と しては、 前述のブ ラ ス ミ ト pIJ 7 0 2 が用い られる。 本発明に よ る約 3.8 k b の 大きさ の前記 D N A鎖の下流側の Sph I切断サ Λ ト
(第 1 図の Sph I (2)で示されたサ イ ト ) へ、 第 1 図に 示 した 7.0 kb の D N A フ ラ グ メ ン ト の う ち の下流側 にある Π (1) 一 Sph I (1)切断セ グ メ ン ト （ 大き さ
1.0 kb ) を接合 して組換え D N A鎖を作 、 この組 換え D N A鎖を、 プ ラ ス ミ 、 ぺク タ 一 pIJ 7 0 2 の
B 9& H - Sph I 切断サ イ ト に挿入する こ と に よつて ィ ブ リ ッ ,. · プ ラ ス ミ ト （ 組換え D N A 分子 ） を作る
'こ と ^でき る。 こ のハ イ プ リ ツ ト · プ ラ ス ミ はス ト レ プ ト ミ セ ス · リ ビダ ン ス に組込んだ場合には、 ス ト レ プトマ イ シ ン 添力 [Iされる と、 これの存在を感知 し、 そしてそれを不活化するホ ス ホ ト ラ ン ス フ エ ラ —ゼを 産生でき る。
次に、 本発明を参考例及び実験例について説明する 参考例 1
(1) S M耐性遺伝子 ¾含む S M耐性 D N A鎖のク
ユ ン グ
(ィ） ハ イ プ リ ッ · プ ラ ス の形成
ス ト レ プ ト マ イ セ ス * グ リ セ ウ ス I S P 523 6 ( A T C C 2 3 3 4 5 ) を、 5 0 0 三角 フ ラ ス コ に 分注された 1 グル コ ー ス、 0.3 ィ 一 ス ト エ キ ス
( Diico ) 、 0.5 ペ プ ト ン （ Diico ) 、 0 .3 マ ル ト エ キ ス （ Oxoid ) よ i? ¾ る組成の培地 1 0 中で、 2 で 2 日間培養 した。 培養液を 9 0 0 0 回転、
) 0 分間遠心分離して菌体を集めた。
次に、こ の菌体を 2 X T E S 緩衝液 （ 5 0 mM Tris · HC^ ( pH 7.4 ) 、 5 0 mM E D T A、 5 0 mM NaC^ ) で洗滌した後、 菌体を破砕した， 破砕液か ら染色体 D N A を公知の方法 ( Chater 等 「 Cur rent To pi cs in' Microbiology and Immu n o 1 o g y」 9 6 ， 6 9
( 1 9 8 1 ) の方法 ） で抽出 して、 供与体 （ ナ一 ） D Ν Α を得た。
この よ う に して得た供与体 D N A の 8 ？ と、 放線 菌のぺク タ 一 ' プ ラ ス ミ ト pIJ 7 0 2 の 4 ？ と を混 合 した。 その混合物に制限酵素 Bg^ II の 2 0 単位を加 えてゝ 1 0 mM Tris - RC£ ( pH 7.5 ) , 7 mM M C^9 1 0 0 mM NaC^ , 7 mM メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル よ ])成 る緩衝液 5 0 中で 3 7 °Cで 1.5 時間 D N Aの切断 反応を行った。 反応後 6 8 °Cで ]. 0 分間加熱処理して 制限酵素の不活化を行った。
D N A断片を含む反応液に対して、 O .l M Tris -
HC ( pH 8.0 ) ， 0.2 メ ル カ ブ ト エ タ ノ ー ル よ ] 5 成る緩衝液で飽和したフ エ ノ 一 ル溶液の等量を加えて 振盪した後、 混合物の全体を 1 5 0 0 0 回転で 1 分間 遠心分離した。 こ の水層部分をェ チ ル エ ー テ ル で 2 回 抽出 して フ エ ノ ー ルを除去 し、 冷エ タ ノ ー ルを 2 倍量
加えて - 2 O :で一夜放置 した。 その後、 1 5 0 0 0 回転で 1 0 分間の遠心分離に よ って D N A 断片を沈澱 と して回収 した。
回収 した D N A 断片を減 E下で乾燥 し、 純水 4 0 ュ '& に溶解 した。 得 られた D N A断片溶液に対 して、 0.66 M Tris - HC^ ( H 7.6 ) , 6 6 mM MgC^2 , 0.1 M ジチオ ス レィ ト ール、 1 O mM A T P ; ^ ら成 る緩衝 液 5 ^ と で 4-D N A リ ガーぜ 1 5 単位 （ 5 ） を 加 え、 4 TC で一夜、 接合反応を行 った。 この よ う に して、 放線菌プ ラ ス ミ ^ pIJ 7 0 2 の Bg^ fl 切断 - フ ラ グメ ン ト に、 ス ト レ プ ト マ イ セ ス · グ リ セ ウ ス ISP 5 2 3 6 の染色体 D N A の Bj^ fl · Bg^ fl 切断 D N A フ ラ グメ ン ト （ 大き さ 約 7 .0 kb ) を組込んだハ イ ブ リ ツ · プ ラ ス ミ pST 1 4 1 ( 大き さ 約 1 2.6 kb) ¾,含む各種多様 ¾ ハ イ プ リ ッ · プ ラ ス ミ の混合物 を得た。
I口) ク ロ 一ニ ンク- こ の よ う に して得た各種ハ イ ブ リ ツ · ブ ラ ス ミ P の混合物を用い、 宿主であ る ス ト レ プ ト マ イ セ ス ' リ ビダ ン ス 6 6 ( J. Virology , 9 ， 2 5 8 ( 1 9 7 2 ) の ブ α ト プ ラ ス ト を形質転換 した。 S M 耐性の組換え 菌株を選別 して、 それの菌体か らハ イ ブ リ ッ ト ' ブラ ス ミ P pST 1 4 1 を単離 した。 こ の よ う に して、 S M 耐性遺伝子を含む S M耐性 D N A鎖のク ロ ー ニ ングを 行 った。
こ の場合、 ス ト レ プ ト マ イ セ ス ' リ ビ、ダン ス 6 6 の プ ロ ト プ ラ ス ト の調製は、 下記の通 ]3 行った。 ス ト レ プ ト マ イ セ ス · リ ビダン ス 6 6 を 1 グ ル コ ー ス 、
0 .3 ¾ イ ー ス ト エ キ ス （ Di i co ) 、 0. 5 ¾ ペ プ ト ン ( Di ic o ) 、 0. 3 % マ ソレ ト エ キス （ Oxo id ) 、 3 4 ¾ シ ョ 糖、 0 .0 0 5 M MgC^2 , 0. 5 グ リ シ ン ；^ ら成 る 培地に接種 し、 2 日 間培養 した。 その後培養液'を 9 0 0 0 回転、 1 0 分間の遠心分離にかける こ と に よ .り 菌体を集め、 1 0. 3 シ ョ 糖溶液で洗滌する。 洗滌 した菌体は、 1 ' ^の卵白 リ ： チー ム を含む P 培地 ( 1 0.3 ¾ シ ョ 糠、 0.0 2 5 ¾ K2S04 , 0.2 ¾ MgC つ · 2H O , 0. 0 0 0 0 0 8 Z Q&n 0.0 0 0 0 4 ¾ Fe C^z · 6H O , 0.0 0 0 0 0 2 ¾ Cu C^2 ,0.0 0 0 0 0 2 °h MnC^, · 4H20 , 0 .0 0 0 0 0 2 % Na2B/I0o · 10H2O , 0 .0 0 0 0 0 2 ¾ ( NH4) ό Mo 702 4 · 4Hつ 0 ， 0.0 0 5 ¾ KH2P04 , 0.3 7 ° CaC^2* 2H20 , 2 5 mM T E S パ、 ッ フ 了一 ， ρΗ 7. 2 ) 1 6 /^ に懸濁 し、 3 2 。C で 6 0 〜 9 0 分間保温 して プ α ト プ ラ ス ト を形成させた。 プ 口 ト プ ラ ス ト 化 してい い菌体は、 綿 と ホ° ァサ イ ズ 3.0 の フ ィ ル タ 一 ¾通す こ と に よ って除き 、 2500 回転 1 0 分間の遠心分離に よ ] プ ロ ト プ ラ ス ト を集め た。 集めたプ ロ ト プ ラ ス ト は P 培地で 1 回洗滌後、
10
0 個ノ と な る よ う に P 培地に再懸濁 し た
上記のプ ロ ト プ ラ ス ト 懸濁液に対 して、 前述 した放
ー丄 — 線菌プ ラ ス ミ P pIJ 7 0 2 の Β?^ Π切断 D N A フ ラ グ メ ン ト と ス ト レ プ ト マ イ セ ス * グ リ セ ウ ス I S P
5 2 3 6 < D N A <2 B?^ H · Bg^ fl 切断 D N A フ ラ グ メ ン ト と ^ ら成るハ イ ブ リ ッ ト プ ラ ス ミ ト pST 1 4 1 を含むハ イ ブ リット プ ラ ス ミ ト 混合物の溶液 5 0 & を 加えた。 その直後、 さ らに ボ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル # 1 0 0 0 溶液 （ ボ リ エ チ レ ング リ コ ー ル # 1 0 0 0 3 3 を含む P 培地 ） を加えて 6 0 秒間混合 した。
次に、 得 られた混合物を P 培地 5 /^で希釈 し、
2 5 0 0 回転 ] 0 分間の遠心分離でプ α ト プ ラ ス ト を 集めた。
こ の プ ロ ト プ ラ ス ト を l m£の Ρ 培地 に懸濁 し、 得 ら れ た フ。 口 ト プ ラ ス ト 懸濁液を、 直径 9 の プ ラ ス チ ッ ク 製ぺ ト リ 皿に分注 ， 固化させた培地 （ 1 0.3 シ ョ 糖、 0.0 2 5 °h K2S04 , 3 ¾ MgC^2 ·6Η20 , 1 % グル コ ー ス、 0.0 1 カ ザ ミ ノ 酸 （ 01£ 00 ) 、 0.00000 8 ZnC^2 、 0.0 0 Q 0 4 °h Fe C ^z · 6H20、 0.00000 2 ° CuC^2 、 0,0 0 0 0 0 2 % MnC^9 ·4Η20 、 0.000002 °h Na2B407 · 10ii2O 、 0.0 0 0 0 0 2 ¾ (NH4 ) όΜο 7024 4H20 、 0.0 0 5 °h KH2P04 、 0.3 <¾ CaC 2 · 2H20 、 0.3 L — プ ロ リ ン 、 2 5 mM T E S パ、 ッ フ ァ ー （ pH 7.2 ) 、 0.0 0 5 M NaOH、 0.5 % イ ー ス ト エ キ ス ( Dif co ) ) に 0.1 m£ずつ塗布 して、 2 7 。Cで一夜培 養 した。 その後、 培養 したブ 口 ト プ ラ ス ト の上に、 チ オ ペプ チ ン 1 0 0 1 9 ノ /^を含'む同軟寒天培地を 1/4
量重層 し、 さ ら 4 日 間培養を継続 して プ ロ ト プ ラ ス ト の再生を行 う。
再生 したク ロ ー ンは、 I S P τ¾ 4 培地 と、 S M20 ？ /' /^ を含む I S P 7¾ 4 培地 と、 S M 5 0 ？ ノ m£ を含む I S P ¾ 4 培地 と に レ ブ リ カ した。 そ して 2 7 'C で 3 日 間培養を行なって、 S M を含む培地 と、 含ま い培地 と に同時に生育 した S M耐性ク ロ ー ン を選択 する 。
得 られた S M耐性ク π — ンの菌体か ら、 公知の方法 ( Chater 等 「 Current Topics in Microbiology and
Immunology 」 9 6 , 6 9 ( 1 9 8 1 ) ) に従って プ ラ ス ミ Pを抽 出 し、 更に、 約 ]. 2.6 ¾ b の大 き さ の S M耐性ハ イ ブ リ ッ · プ ラ ス ミ pS 1 4 1 の純粋 物を単離 した。 ，， -- - 検 定
こ の よ う に して S M耐性ク 口 一 ンか ら得 られた S M 耐性ハ イ プ リ ッ ト · プ ラ ス ミ ト pST 1 4 1 を、 制限酵 素 Bg^ I [ で切断し、 0.7 ァガ ロ ース電気泳動で分析 した結果、 ベ ク タ 一 に用いた pIJ 7 0 2 と約 7.0 kb の大き さ の D N A 断片 と が検出 された。 お、 前記の よ う に ク ロ 一 ユ ン グ さ れた ハ イ ブ リ ッ · ブ ラ ス ミ pST 1 4 1 を用いて、 前述の方法に よ 再びス ト レ プ ト マ イ セス · リ ビダン ス 6 6 を形質転換させた と こ ろ、 再び S M耐性ク ロ ー ン 、 すな わ ちス ト レ プ ト マ イ セ ス ' リ ビダ ン ス 4 - 1 が得 られた。
一 一
(2) 遺伝学上の解析
プ ラ ス ミ pST 1 4 1 で形質転換された ス ト レ プ ト マ イ セ ス ' リ ビダ ン ス 4 - 1 を、 S M 5 ^を含む、
1 ¾ グ ソレ コ ー ス 、 0.3 ィ 一 ス ト エ キ ス ( Difco ) 、 0.5 ペ プ ト ン （ Dijf co ) ^ 0.3 % マル ト エ キ ス
( Ox 0 i d ) か ら成る培地に接種 し、 2 7 匸で 4 日 間培 養を行った。 培養液の 9 0 0 0 回転 1 0 分間の遠心分 離で菌体を集め、 生理的食塩水で菌体を洗滌した。 そ の 後、 1 0 の菌体¾ 1 2 5 ^ Tr i s -ma 1 a 1 e , 12-5 mM MgS04 ( pH 7.0 ) か ら成る緩衝液 4 0 に懸濁し、 氷水中で超音波にて菌体を破砕 した。 破砕液を 16000 0転、 3 0 分間の遠心分離にかけて、 無細胞の酵素抽 出液を得た。
無細胞の酵素抽出液に 6 0 0 の ？ ， 1 /^の ト ル ェ ン と 2 0 0 m?の ス ト レ プ ト マ イ シ ンを力 Bえ 3 7 °C に 1 6 時間保温した。
反応液は 1 6 0 0 0 回転、 1 0 分間、 遠心分離後、 C M — セ フ アデッ ク ス C - 2 5 ( 0.1 MNa C で平衡化 ） 1 0 0 の塔でク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に付し、 水洗後、 0.1 M〜 ： 1 Mの NaC で溶出 した。 坂口反応陽性区を 活性炭素 5 の塔に流し、 水、 4 0 了 セ ト ン、
8 0 ア セ ト ン で洗滌後、 0.0 4 N HC^を含む 8 0 ¾ ァ セ ト ンで溶出 した。 坂口反応陽性区を集'めて減圧下 に饞縮し凍結乾燥する と 1 0 3 の粉末が得 られた。 この う ち 5 0 Wを樹脂吸着剤、 ダイ 了 イ オ ン L H - 20
の 100 の塔に流し、 メ タ ノ ー ル - 水 （ 1 ： 1 ：) で展 開 した。 坂口反応陽性区を集めて減 E下に濃縮 し凍結 乾.燥する と、 2 0.9 の粉末が得 られた。
この粉末を S I M S と 13 C — N M R で分析する と、 分子イ オ ン ヒ。ーク 力； 6 6 2 に見出され、 6 位力 S リ ン酸 化されたス ト レプ ト マ イ シ ン で ある こ と が確認で き た, す わ ち、 ス ト レ プ ト マ イ セ ス ， グ リ セ ウ ス S M耐 性菌株か ら ク α —ニ ング して前記の よ う に得 られた約
7' 0 kb の大き さ の S M耐性 D N A 鎖は、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン の 6 位の O H基を リ ン酸化 し て不活化する ホ ス ホ ト ラ ン ス フ ェ ラ ーぜ （ A P H (6) ) を コ ー P してい る こ と が明 らか と なった.
実験例
本例では、 種々 の欠失プ ラ ス ミ の作成を次の如 く 行った。
(ィ） 参考例 1 (1) (口） の方法でス ト レ プ ト マ イ セ ス · リ ビダン ス 4 — 1 よ ]3 得たプ ラ ス ミ ト ST 1 4 1 の 1 ？ を制限酵素 Sph I で完全に分解 した。 その後、 得 られ た ： 7° ラ ス ミ P断片の混合物に D N A 連結酵素 T 4 を加 え て 4 Ό でー晚連結反応を行った。 こ う して連結され て 再構築さ れた名種のブ ラ ス ミ D N A の混合物を用 い て、 ス ト レ プ ト マ イ セ ス * リ ビダン ス 6 6 の プ ロ ト ブ ラ ス ト 'を形質転換 した。 形質転換さ れたプ ロ ト プ ラ ス ト を、 チ オ ペプチ ン 2 0 meを含む R 2 Y E 培地 で 2 8 °C 3 日 間培養 して再生 した。 再生さ れたク ロ 一
ン は、 さ らにス ト レ プ ト マ イ シ ン 2 0 ^/m& を含む Y S 培地 （ イ ー ス ト · エ キ ス 0. 2 、 ス タ ー チ 1. 0 ^ 、 寒天 2 · 0 "¾ 、 ρΗ 7. 0 ) に レブ '】 力 した。 培養さ れた コ 口 -— ;^ ら、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン耐性ク ロ ー ン を選 択 した。 こ の操作で得 られたク ロ ー ン力 ら、 さ らに上 記の D N A 抽出方法に従って、 上記の再構築された各 種の： 7° ラ ス ミ Ρを抽 出 した。 第 1 図の制限酵素地図で 示された 7. 0 kb の D N A フ ラ グ メ ン ト か ら、 こ の う ち の Sph I (1)乃至 Sph I (2)の間の部分を欠失させ且つ Sph I (3)乃至 Bg^ I (2)の間の部分を欠失させて得 られ た D N A フ ラ グ メ ン ト 〔 す わち、 第 ]. 図の 7.0 kb の D N A フ ラ グメ ン ト の ちの Sph I (2)乃至 Sph I (3) . の部分 （ 約 3.8 kb の大き さ の本発明の D N A 鎖に相 当 ） に Bg^ II (1)乃至 Sph I (1)の部分を連結 して る D N A フ ラ グメ ン ト 〕 をベク タ ー p IJ 7 2 0 の B ^ D - Sph I 切新サ イ ト に挿入 して成る組換えプ ラ ス ミ を選び取 j5 、 これを プ ラ ス ミ p H T O ' O O と命名 し た。 こ の プ ラ ス ミ P P 'H T O O O は新規る組換え DNA 分子で ある 。
(口） さ ら に上言己のプ ラ ス ミ p H T O 0 0 の 1 ¾ 制限酵素 B E で完全に分解 （ 切断 ） した後、 引 き つ づいて少量の制限酵素 Bam H I で部分的に分解 （ 切断 ） した。 これ らの分解さ れた D N A 断片の混合物は低融 点ァガ ロ ー ス ゲ ル電気泳動に よ っ て各フ ラ グ メ ン ト を 分離 した後、 大き さ 7. 9 kb ( ベ ク タ 一部分を合計し
- - て ） に相当する D N A フ'ラ グ メ ン 小 を含むゲル部分を
切 取] フ ラ グ メ' ン ト を融解抽 出 した。 この フ
ラ グメ ン ト を用いて上記と 同様に T 4 D N A連結酵 、' 素で環状に して プ ラ ス ミ を再構築 した後、 ス ト レプ
ト マ イ セ ス ' リ ビダ ン ス 6 6 の プ ロ ト フ。 ラ ス ト を形質
転換 し、 さ ら にス ト レ プ ト マ イ シ ン耐性ク ロ ー ン を選
択 した。 得 られたク ロ ー ンか ら プ ラ ス ミ を抽出 した， プ ラ ス ミ pH T 0 0 0 か ら切出さ れたプ ラ ス ミ であ つて、 し；^ も 第 1 図の 7.0 kb の D N A フ ラ グ メ ン ト
か ら、 この う ちの Β? Π (1)乃至 Bam H I (3)の間の部分
を欠失させ且つ Sp h I (3)乃至 Π (2)の間.の部分を欠
失させて得 られた D Ν Α フ ラ グ メ ン ト 〔 すな わち第 1
図の D N' Α フ ラ グメ ン ト の う ちの Bam H 1 (3)乃至 Sph
I ）の部分に相当 する D N A フ ラ グメ ン ト 〕 を含むプ
ラ ス ミ ト を選び取 、 これを プ ラ ス ミ Ρ ρ ΗΤ Ο Ο δ
と命名 した。
) —方、 プ ラ ス ミ ト p I J 7 0 2 ( 前出 ） と プ ラ ス
ミ P pST 1 4 1 の各 1 ？ を夫々 に、 制限酵素 Sph I
で完全分解 した後、 引 きつづ き 制限酵素 Pst I で完全
分解 した。 得 られた夫 々 の分解物を混合 して、 更に T
4 - D N A連結酵素を加えて 4 で一晚、 連結反応を
行った。 得 られた連結 D N A の混合物を用 てス ト レ
ブ ト マ イ セ ス . リ ビ ダン ス 6 6 の プ ロ ト プ ラ ス ト を形
質転換 した。 ブ ロ ト ブ ラ ス ト 形質転換株を R 2 Y E 培
地で 2 8 3 日 間培養 して再生 した。 再生されたク π
ー ンか ら プ ラ ス ミ ^を抽 出 じた。 抽 出 されたブ ラ ス ミ ^を制限酵素の切断ハ。 タ ー ン を ァガ α — ス ゲ ル電気泳 動法で調べた。 この こ と に よ って、 第 1 図の 7.0 kb の D N A フ ラ グメ ン ト か ら、 この う ちの Bo (1)乃至 Sph I (2)の間の部分を欠失させ且つ Pst I 乃至 B H (2)の間の部分を欠失さ せて得 られた D N A フ ラ グメ ソ ト 〔 すな わち第 ]. 図の D N A フ ラ グ メ ン ト の う ちの Sph I (2)乃至 Bam H I (3)の部分に相当する D N A フ ラ グメ ン ト 〕 を含むプ ラ ス ミ ト を持つク ロ ー ン を選択し、 こ の ブ ラ ス ミ ト を ブ ラ ス ミ p HT 0 0 2 と命名 した。
次に上記の操作に よ って得たフ。 ラ ス ミ P p HT 0 0 0 か ら、 第 1 図の地図の 7 .0 kb の フ ラ グ メ ン ト の う ち の Bam H I ）乃至 Sph I ）の間の部分の断片を 切出 し、 低融点了ガロ ー ス ゲ ル電気泳動法に よ っ て抽 出 し、 更に該断片を プ ラ ス ミ ト p HT 0 0 2 の Bg^ E 切断サ イ ト か ら Sph I切断サ イ ト の間に挿入 し、 プ ラ ス ミ を作成 した。 こ の ブ ラ ス ミ I ^を フ。 ラ ス ミ pH T 0 1 0 と 命名 した。
実験例 2 _
本例では、 ス ト レ ブ ト マ イ シ ン耐性遺伝子の発現の 調節を下記の如 く して調べた。
実験例 1 に よ って得たス ト レプ ト マ イ セ ス · リ ビダ ン ス であって ブ ラ ス ミ ト pH T 0 0 0 を も つ菌株 と、 P HT 0 0 2 を も つ菌株 と、 P HT 0 0 8 ¾ も っ菌株 と、 p HT 0 1 0 を も つ菌株と を、 それぞれ Y E M E 培
地 1 0 0 /ι£を含む 5 0 0 m£の三角 フ ラ ス コ で 2 8 に て対数後期ま で培養 した。 各々 の フ ラ ス コ で培養され た菌 ¾ 2 分割 して、 一方をス ト レ ブ ト マ イ シ ン 5 /^を含む Y E M E 培地 5 を含む 5 0 の三角 フ ラ ス コ に移 し、 他方を ス ト レ プ ト マ イ シ ンを含ま るい Y E M E 培地 5 を含む 5 0 0 m£の三角 フ ラ ス コ に 移した。 夫 々 を さ らに 2 8 に て 一晚培養 した。 得 ら れた菌体か ら、 後記の方法で菌'体抽出液を得、 それに 含ま れ る ス ト レ ブ ト マ イ シ ン不活化酵素の比活性 （ モ ル /' W蛋白 Z時間 ） を後記の方法で測定 した と こ ろ 次の第 1 表に示される結果を得た。
： i
従って、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン耐性遺伝子の発現量の 差は、 該遺伝子を含むブ ラ ス ミ ト の量の差に由来する も のではる く 、 ス ト レブ ト マ イ シ ン の添加の有無に直 接由来する も の と結論された。 しか も、 第 1 図の 7. 0 k の D N A フ ラ グメ ン ト の う ちの Bam H I (？)乃至 S ph I (3)の間の部分で示される D N A鎖が単独で存在 する場合 （ p HT 0 0 8 の場合 ） では、 ス ト レ フ。 ト マ イ シ ン耐性遣伝子の発現は あ るが、 ス ト レ プ ト マ イ シ 'ン の添加の有無に よ って、 遺伝子の発現を調節 （ オ ン ' · オ フ ） す る こ と が不可能で あ る こ と が第 1 表の結果 か ら明 らかで あ る。 すな わち、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン耐 性遣伝子の発現には、 第 1 図の D N A フ ラ グメ ン ト の う ちの Bam H I (3)乃至 Sp h I ）の間の部分が必要で あ るが、 S M耐性遺伝子の発現を、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン の外部か らの添加に よって調節'（ オ ン · オ フ ） する た めには、 第 1 図の D N A フ ラ グ メ ン ト の う ちの Bam HI (3)乃至 Sph I (3)の間の部分で示さ れる D N A 鎖 （ pH T 0 0 8 ：) に加えて、 第 1 図の D N A フ ラ グメ ン ト の う ちの Sph I (2)乃至 Ps t I ま での間の部分で示さ れる D N A 領域 （ p H T 0 0 2 ) が必須で あ る こ と が確認 で き た n
なお、 上言己の実験において、 ス ト レプ ト マ イ シ ン不 活化酵素の測定は下記の方法で行われた。
するわち、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン の存在下又は不存在 で各菌株を培養 し、 菌体を遠心 して集菌 した後、 同量 の生理的食塩水で 1 回洗滌した。 その後、 菌体 ： ッ フ ァ ー = 1 ： 4 の比率と る る よ う に ^ツ フ 了 一 （ ]. 0 mM Tr i s — HC^ ( pH 7.6 ) ·, 1 0 mM M C^2 , 5 0 mM H4C^，及び 3 mM 2 — メ ルカ プ ト エ タ ノ ー ル ） に懸 濁 し、 氷水中で菌体を超音波で破壊する。 冷却された 遠心機で 2 で 1 6,0 0 0 rpm 3 0 分間遠心して菌体 を除いて菌体抽出液を得る。
菌体抽出液' 含まれる総蛋白質は ゥ シ血清了 ル ブ ミ ン を標準と してク マ シ 一 · プ リ リ ア ン ト · ブル 一 に よ る 5 9 5 nm の吸光度の変化に よって定量した ·（ Bra- df 0 rd " Anal . Biochem " 7 2 , 2 4 8 ( 1 9 7 6 ) )0 菌体抽出液 5 あるいは 2 5 と、 滅菌水 4 0 ^ あ る は 2 0 と、 ツ フ 了 一 〔 1 M ト リ ス 一 マ レ _ ( pH 7.0 ) , 1 0 0 mM MgS04 , 3 0 mM A T P , 1 0 mM ス ト レプ ト マ イ シ ン 〕 5 と を混合し、 そ の混合溶液を 3 7 °Cに 1 時間保持する。 反応後ただち に 9 5 に移 し、 5 分間保持 して酵素を不活化する。 反応液をパ、チル ス ' サブチル ス A T C C 6 6 3 3 を 用いて生物検定する こ と に よって、 反応液中に含まれ る 未反応のス ト レ プ ト マ イ シ ンを定量した。 ス ト レ フ。 ト マ イ シ ン不活化酵素の比活性は 1 蛋白質、 1 時間
一 - 当 D の ス ト レ プ ト マ イ シ ン の減少量と して表わ した。
産業上の利用可能性
以上の よ う に、 本発明 に係る D N A鎖は、 適当 プ ラ ス ミ · Ρ · ぺク タ ーに組込む こ と に よ 、 ス ト レブ ト マ イ シ ン耐性選択マー カ 一 と して確実に働 く ハ イ ブ リ ッ ブラ ス ミ Ρを作製する の に有用であ .り 、 そ して 放線菌の遺伝子操作技術に用 るの に適 してい る。
国際様式 INTERNATIONAL FORM
BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT
特許手铳上の微生物の寄託の国際的承認 OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES に関するプダぺスト条約 OF PATENT PROCEDURE
RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL
下記国際寄託当局によつて規則 7. 1に従い
DEPOSIT
発行される
issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNA原寄託についての受託証 TIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page.
3号
I. 微生物の表示
(寄託者が付した識別のための表示） (¾託番号）
微ェ研条寄第 1198 号 S. 1 ividans 4-1
(FERM BP 1 198 )
Π . 科学的性質及び分類学上の位置
I欄の微生物には， 次の 項を記載した文 が添付されていた。
□ 科学的性質
Θ 分頸学上の位置
in . 受領及び受託 本国際寄託当局は， 昭和 59 年 12 月 6 日 （原寄託日） に受領した I檷の微生物を 受 する。.（昭和 59 年 12月 6 ョに寄託された徴ェ研菡寄第 7984号より移管）
N . 国際寄託当局
名 称：
あて名： 曰本国 城県筑波郡谷田部町東 1丁目 1番 3 (J(硬番号 305 )
1 -3, Higashi 1 chome Yatabe-machi Tsukuba-gun Ibaraki-ken
305, JAPAN
昭和 61 年 U 986 ) 10月 31 曰
Claims
1. ス ト レ プ ト マ イ セ ス * グ リ セ ウ ス の ス ト レ プ ト マ
ィ シ ン耐性遺伝子を含む染色体 D N A を制限酵素
Bj^ jtt で切断 して得 られた大き さ 7.0 kb の Bg^ fl 切断 フ ラ グ メ ン ト と 、 pIJ 7 0 2 ブ ラ ス ミ Pの DNA の Β^^ Π切断フ ラ グメ ン ト と を接合 して構築さ れ且 つ添付図面の第 2 図の制限酵素地図に示 した制限酵 素切断サ イ ト を有 し且つ約 1 2.6 kb の大き さ を有 する ハ イ ブ リ ッ ト プ ラ ス ミ pST 1 4 1 を、 制限酵 素 Β Α Π で切断 して得 られて且つス ト レ プ ト マ イ セ ス ' グ リ セ ウ ス D N A 由来であ る Β^^ Π ， Bg^ H切 断フ ラ グメ ン ト であって、 し力 も ス ト レプ ト マ イ シ ン 耐性遣伝子を含有 し且つ添付図面の第 1 図の制限 . 酵素地図 に示 した制限酵素サ イ ト を有する 7.0 kb
の大 き さ の前記 Β? Π · By^ Π切断 フ ラ グメ ン ト を、 更に制限酵素 Sph I で切断する こ と に よ ]3 得 られた
Sph I · Sph 切断 D N A 鎖であ .り 、 こ の D N A 鎖は、 約 3.8 kb の大 き さ を も ち、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン 耐 性遺伝子を内部に含有す る と 共に、 前記ス ト レ プ ト マ イ シ ン耐性遺伝子の発現を調節する機能を有する
D N A領域を 内部に含有する D N A 鎖であ j9 、 あ る いは こ の D N A鎖 と 等価であ る こ と を特徴と する、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン耐性遺伝子を含有 し且つ こ の遺 伝子の発現 ¾調節する機能を 有する D N A 鎖。
2. 添付図面の第 3 図に示さ れた D N A塩基 （ ヌ ク レ
-3θ_ 才 チ ！ ^ ) 配列図について、 Sph I (3)の文字を上に-表 示された Sph I 切断サ イ ト に対応する D N A領域か ら、 Sph _1 (2)の文字を上に-表示さ れた Sph I 切断サ ィ ト に対応する D N A領域ま でに至る第 3 図に示さ れた ヌ ク レオ チ ！^配列を有する D N A 鎖、 あ るいは この D N A 鎖 と コ ン の縮重に よ .り 等価であ る DNA 鎖であ る請求の範囲第 1 項記載の D N A 鎖。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25862285 | 1985-11-20 | ||
| JP60/258622 | 1985-11-20 |
Publications (1)
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|---|---|
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ID=17322834
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP1986/000596 Ceased WO1987003302A1 (fr) | 1985-11-20 | 1986-11-20 | Chaine d'adn contenant un gene resistant a la streptomycine et pouvant reguler la manifestation de ce gene |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0245523A4 (ja) |
| WO (1) | WO1987003302A1 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61146186A (ja) * | 1984-12-18 | 1986-07-03 | Microbial Chem Res Found | ストレプトマイシン耐性遺伝子を保有するｄｎａ鎖 |
-
1986
- 1986-11-20 WO PCT/JP1986/000596 patent/WO1987003302A1/ja not_active Ceased
- 1986-11-20 EP EP19860906942 patent/EP0245523A4/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61146186A (ja) * | 1984-12-18 | 1986-07-03 | Microbial Chem Res Found | ストレプトマイシン耐性遺伝子を保有するｄｎａ鎖 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| See also references of EP0245523A4 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0245523A4 (en) | 1989-05-11 |
| EP0245523A1 (en) | 1987-11-19 |
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