WO1987007725A1 - Procede cyclique de dosage immunoenzymatique d'un ligand - Google Patents

Procede cyclique de dosage immunoenzymatique d'un ligand Download PDF

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WO1987007725A1
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Christian Bourdillon
Daniel Thomas
Catherine Gyss
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes

Definitions

  • Cyclic immunoenzymatic assay for a ligand Cyclic immunoenzymatic assay for a ligand.
  • the present invention relates to a cyclic immunoenzymatic assay for a ligand, in the heterogeneous phase.
  • Recent techniques use the enzymatic activity as a means of labeling and amplifying the molecules ensuring the molecular recognition processes which intervene in the immunological analysis methods. It has thus been envisaged to label antigens or anti ⁇ body with enzymes such as peroxidase or glucose oxidase, the activity of which can be easily determined by spectrophotometry.
  • the enzymatic activity is a function of the antibody-antigen reaction and it is not necessary to separate the "bound fraction", that is to say the immunoreactor (antigen-enzyme conjugate 5 or antibody-enzyme), which reacted in the immunological reaction, of the "free fraction", which represents the reactive immu ⁇ neactant;
  • the enzymatic activity is not modified by the antigen-0 antibody reaction and a separation of the bound fraction and- of the free fraction turns out to be necessary.
  • the conjugate enzy e-ligand (antigen or antibody) is mixed with a sample of the biological medium to be assayed (or with a sample of a standard medium) containing the ligand li ⁇ bre, in order to compete with it to combine to antiligands fixed in limited quantities on a solid support.
  • the ligand can be immobilized on a support and enter into competition with the ligand to be assayed, when they are simultaneously placed in the presence of a limited quantity of antiligand in solution.
  • the enzymatic activity is inversely proportional to the concentration in ligand to be assayed.
  • the so-called "sandwich” method is the best known and it applies to the assay of ligands having at least two antigenic sites.
  • the ligand to be assayed is brought into contact with a solid support on which antibodies are fixed.
  • the ligand combines with the antibodies and, after washing of the support, the latter is brought into contact with a determined excess of the same antibodies labeled with an enzyme.
  • These in turn bind to the ligands, which are thus sandwiched between the antibodies attached to the support and those labeled by the enzyme, hence the name of the method.
  • the enzymatic activity is directly proportional to the concentration of ligand to be assayed.
  • enzyme electrocatalysis is that the quantity of enzyme detectable in this situation is extremely low, which, in its application to an enzyme-linked assay, in heterogeneous phase, leads to a sensitivity greater than that of the previous detection means.
  • the subject of the invention is a cyclic immunoenzymatic assay method for a ligand, according to which, after having revealed reactive sites on the surface of an electrode by electro-chemical oxidation, ci in contact with an antiligand specific for the ligand to be assayed to form a conductive solid phase comprising said electrode and, fixed to the surface thereof, a substantially monomolecular layer of said antiligand without the interposition of an intermediate support, this solid phase then being exposed to the ligand to be assayed and to an antiligand-enzyme or ligand-enzyme conjugate, depending on whether the so-called "sandwich” or “competitive” assay methods are applied, the enzyme of said conjugate being capable of reacting with a substrate to provide an electroactive product with respect to said solid phase, this process being characterized in that, at the end of the assay, at least the ligands and the conjugates are separated from the electrode tiligand-enzyme or ligand-enzy
  • the separation of the solid phase from the ligands and the anti-ligand enzyme or ligand-enzyme conjugates may be carried out by simple rinsing of the solid phase with a liquid whose pH and / or polarity conditions are different from those of the medium. dosage.
  • the substantially monomoleic layer of anti-ligand can also be separated from the electrode on which it is fixed, with a view to the reuse of this electrode for a new assay cycle, for example in subjecting this electrode to electrochemical pickling by the action of a direct or alternating current.
  • An alternating current can also be used with a potential difference of + _ 3 volts between the metering electrode and the pickling electrode.
  • the dosing electrode could be, for example, carbon, platinum or gold ; and can take any form depending on the constraints of introduction of the sample to be assayed (flat, porous or percolating solution electrode).
  • the antibodies or antigens can be fixed to the electrode by any means known in the art, for example by covalent bond or by physical adsorption, by forming a single molecular layer.
  • the electrode will be subjected to a pretreatment comprising, in a manner known per se, a phase of creation of reactive sites on the surface of the electrode by electro-chemical oxidation of this and a phase of activation of these sites by a coupling agent appropriate to the nature of the electrode and to that of the antico ns or the antigen to be fixed, for example an activation by a carbodii ide in the case of a carbon electrode.
  • an electrochemical pretreatment of the surface of the electrode will also be carried out before bringing it into contact with said antibodies or antigens.
  • the quantity of antibody or antigen to be brought into contact with the electrode can be optimized in order to obtain a substantially mono ⁇ molecular layer on the surface of the electrode, so that 'she does not do not "screen” in front of the solid phase during the subsequent electrochemical detection of the product of enzymatic catalysis.
  • the ligands and / or the anti-ligand enzyme conjugates may only saturate a fraction of the sites of the associated anti-ligands or ligands, which will limit the duration of implementation of the process.
  • the detection of the product released by the substrate, during the dosing phase, can advantageously be carried out by measuring a current flowing between the electrode and a reference electrode with controlled potential.
  • the attached schematic drawings illustrate the implementation of the invention. In these drawings:
  • FIGS. 1 to 4 illustrate the preparation of an electroenzymatic electrode according to the invention which can be used in an assay process by a non-competitive method of the "sandwich" type;
  • Figures 5 and 6 illustrate the preparation of an electrode usable in a competitive method
  • Figures .7 and 8 are diagrams, respectively, of an electrochemical cell and a metering system usable in the electroenzymatic metering methods according to the invention
  • Figures 9 and 10 show swimming standard curves used respectively in the assays of Examples 1 and 2;
  • Figure 11 is a diagram of an assay cell used in Example 3.
  • Figure 12 is a calibration curve used in Example 3.
  • FIG. 1 has the electrode 1, after having undergone a treatment suitable to allow immobilisa ⁇ tion to its antibody 2 surface by covalent bonding or by physical adsorption, is contacted with a solution containing these antibodies.
  • These which are antibodies specific for the antigen to be assayed, bind to the surface of the electrode by forming a monolayer, which completely or partially covers the treated surface, depending on the treatment conditions and the desired result.
  • the resulting modified electrode is then brought into contact with a solution of the antigen 3 to be assayed (FIG. 2) which is fixed on the antibodies 2.
  • the conditions for bringing into contact are such that the antibodies are not saturated with antigens and that part of the antibody sites remains vacant.
  • the number of antigen-antibody bonds formed will depend on the concentration of antigens in the test solution.
  • the time for bringing the solid phase into contact with the antigen solution, or incubation phase is of the order of a few minutes, whereas, in most i ⁇ jiunoenzymatic assay methods, the durations of incubation bation are around 1 hour. In fact, this method is much more sensitive than the usual methods, for the reasons indicated above, and it is therefore not necessary to saturate all the antibody sites, which makes it possible to significantly reduce the contact time.
  • the electrode is then exposed to the antibody-enzyme conjugate 4-, which selectively binds to the anti-genes 3 (FIG.
  • the conditions for contacting can be such that the conjugates 4- saturate all the antigenic sites , but this is not an obligation, if one proceeds by comparison with an internal standard produced under the same conditions. The incubation time can therefore be considerably reduced compared to prior techniques.
  • the antibody-enzyme conjugate 4- is in a situation of enzymatic electro-catalysis at the surface of the electrode 1. It suffices, in fact, to introduce in the medium to be assayed one or more substances (or "substrates") capable of reacting with the enzyme of the conjugate 4-, as seen in FIG. 4-, to detect and assay using the electrode 1 the product 6 of the enzymatic reaction.
  • acetylcholinesterase used with an artificial substrate of the acetylthiocholine type the catalyzed reaction is: acetylthiocholine> thiocholine + acetate
  • the thiocholine (R-SH) produced is electrochemically detected if the potential of the electrode is at least at 0.7 V with respect to a reference electrode of the Ag / Ag Cl type:
  • the enzyme-ligand conjugate 7 is put in competition with the free ligand 3 of the biological medium to be assayed to combine with the antibodies 2 immobilized by forming a monolayer on the electrode 1 (FIG. 5) “As before, if the 'one then introduces into the medium to be assayed one or more substances 5 (or substrates) capable of reacting with the enzyme E of the conjugate 7 ' it is possible, as can be seen in FIG. 6, to detect and assay with the using electrode 1 the product 6 of the enzymatic reaction.
  • the electrode in order to be able to reuse the electrode for a new dosing cycle, after the detection phase illustrated in FIGS. 4- to 6, the electrode is brought back to its starting state, before fixing the antibody 2.
  • an electrochemical pickling is carried out under conditions analogous to those of the pretreatment of the electrode mentioned above.
  • the reuse of the electrode in accordance with the invention, applies to all the usual immunoenzymatic assays in heterogeneous phase, whether competitive methods, sandwich or by inhibition, of any molecule allowing a immunological recognition (protein, enzyme, hormone, hapten, etc.), through the use of an appropriate medium and dosage conditions.
  • the enzyme used for the preparation of the conjugates is necessarily an enzyme having as substrate or product of catalysis an electroactive redox couple.
  • This redox couple which can be physiological or artificial, is chosen so that it has good electrochemical reactivity on the electrode used, in order to obtain optimal sensitivity.
  • the corresponding enzymes are generally oxidoreductases, but can also be enzymes of another class, meeting the previous condition, for example hydrolases.
  • the detection sensitivity is linked to the molecular catalytic activity of the enzyme used for the amplification (for example, approximately 10 000 s " for a conjugate obtained with acetylcholinesterase from Electricus Electrophorus).
  • the enzymatic electrocatalysis is capable of detecting the presence of a
  • the detection sensitivity of the conjugate is entirely independent of the surface of the solid phase.
  • the size and shape of the electrode used can therefore be adapted to the amount of antigen which it is desired to measure.
  • this contact time determines a "capture rate" T, which may be less than 1, if all the antigens have not been captured, the rate of capture being defined as the ratio between the number of antigenic molecules captured by the solid phase and their total number in the sample.
  • T rate is also sensitive to the ratio between the volume of the sample and the surface of the solid phase *.
  • the practical sensitivity of the assay method is a function, as with any immunological method, of the quality of the antibodies used as well as the non-specific parasitic adsorption on the solid phase. Rinses in appropriate buffers, known to the skilled person, limit the adsorption not spe ⁇ cific. However, it will be noted that the very short incubation time allowed by the proposed procedure considerably reduces these non-specific adsorptions.
  • the overall sensitivity obtained is ultimately a modular parameter depending on the analytical problem treated.
  • the examples presented below illustrate effective sensitivities of up to 2.10 - " 12 mole per liter or 2.10 - 21 mole in the test portion.
  • the anti rabbit 1 gG was ourni * by BYOSIS laboratories of Compiègne (Prance). It was obtained from sheep and purified according to known procedures.
  • the glucose oxidase-anti conjugate 1gG is prepared by the glutaraldehyde method of AVRAMEAS et al (Immunochemistry, Pergamon Press 6, 4-3-52 (1969). After purification, the conjugate is enzymatically active at $ 95 and im unologically active 2) Apparatus
  • the measurement could, for example, be carried out in an electrochemical cell 9 with circulation, of the type illustrated in FIG. 7 "
  • the liquid arrives via a canalization 10, circulates in a thin strip delimited by a film 11 of plastic material, for example of PTPE, and is discharged via a pipe 12.
  • the cell also comprises a working electrode 13, for example made of vitreous carbon, a counter electrode 14-, for example of the Ag / Ag Cl type, and a pickling electrode 15, for example in vitreous carbon.
  • the electrodes are sheathed over their entire lateral surface by an insulating material and are in contact with the liquid to be metered only by their end face.
  • a cell is only of exemplary value and one could use any other system designed by those skilled in the art.
  • the cell 9 is incorporated in a fully automated system of the type, that of FIG. 8, which allows an internal calibration ensuring the precision of the assay.
  • the electrochemical cell 9 is supplied by the line 10 from a fluid circuit 16, itself supplied with reagents by the line 17 " with possible taking of sample by the line 18.
  • the electrodes 13, 14 and 15 are connected to a power supply system 19, which simultaneously serves as an electronic control and acquisition interface, coupled to a micro computer 20. 3) Metering
  • the working electrode 13 is oxidized for 5 seconds in a nitrochromic mixture (10% by weight of HNO5 + 2% by weight of + water) by passing a current of 5 ⁇ iA.
  • the electrode 15 is used as the cathode. This stripping phase of the electrode regenerates the surface of the solid phase and facilitates the adsorption of the antibody 0
  • an antibody solution (300 g / l in the same buffer) is brought into contact for 5 minutes with the solid phase.
  • Rinse for 2 minutes with blocking buffer (0.01 M phosphate, ' pH 7,'' ' gelatin 0.25 + Tween 20.0.1 (polyoxyethylenesorbitan onolaurate sold under this name and used as surfactant) + 0.15 M NaCl) makes it possible to remove the excess antibody.
  • blocking buffer (0.01 M phosphate, ' pH 7,'' ' gelatin 0.25 + Tween 20.0.1 (polyoxyethylenesorbitan onolaurate sold under this name and used as surfactant) + 0.15 M NaCl
  • 0.2 c ⁇ r of the solution containing the anti ⁇ gene to be dosed is introduced with a flow rate of 0.1 c ⁇ r per minute. This phase is followed by 2 minutes of rinsing with a blocking buffer.
  • the conjugate (100 ⁇ g / cm- 5 in the blocking buffer) is introduced for 1 minute, then rinsed with a solution of benzoquinone (10 M in 0.1 M acetate buffer, pH 5.6 + 0.15 M NaCl) .
  • the current of the electrode brought to 350 mV relative to the electrode 14-, is then sampled for 1 minute by the data acquisition system 19 and 20.
  • the introduction of 0.2 M glucose into the same solution causes a current jump, due to the detection of the enzymatically formed hydroquinone.
  • This current jump is directly proportional to the quantity of conjugate in the electrocatalysis - enzymatic position.
  • 11 is connected by a calibration curve (FIG. 9) the concentration of 1 gG in the sample.
  • the calculated capture rate is here of the order of 0.03 and the sensitivity of the order of 2.1 O "1 mole / 1, in antigen, ie 4-, 10 " ⁇ mole of antigen in the taking of trial.
  • the measurement cycle can then start again by pickling the solid phase.
  • the whole cycle here lasts 20 minutes including the adsorption of the antibody on the solid phase.
  • EXAMPLE 2 This example relates to the determination of a steroid, 176 oestradiol, by a so-called “competitive” method, on a solid phase of medium surface (flat carbon electrode 0.1 cm in surface) "
  • the rabbit anti-estradiol antibody was obtained from a specialized laboratory.
  • the estradiol-acetylcholinesterase conjugate was prepared according to the method of
  • Example 1 The same apparatus is used as in Example 1.
  • an antigen-enzyme conjugate solution of appropriate concentration is introduced with the solution to be assayed.
  • the flow rate of this sample / conjugate mixture is 0.1 c ⁇ / min. and this phase lasts 3 minutes.
  • the current jump measured by electrode 13, previously brought to + 700 mV relative to electrode 14-, corresponds to the oxidation of the thiocholine produced by the conjugate in the position of enzymatic electrocatalysis.
  • the measured current is inversely proportional to the concentration of antigen in the sample to be assayed.
  • FIG. 10 represents a calibration curve.
  • EXAMPLE 3 This example relates to the assay of an immunoglobin G by the "sandwich” method, using a solid phase of large surface (carbon felt electrode of real surface 50 cm).
  • the antibodies have the same origin as those of Example 1.
  • the conjugate is obtained here by coupling the acetylcholinesterase from Electricus electrophorus to the antibody by the carbodii ide method described by Goodfried TL et al., Science 1964-, 14-4-, 13 -4- - 4-6.
  • the apparatus used is shown diagrammatically in Figure 11.
  • the solid phase is a carbon felt cyclinder 22 (for example, that bearing the reference RYC 2000 sold by the company Le Carbone Lorraine) 7 mm long by 5 ⁇ im in diameter, corresponding to a
  • the reference electrode 26 and the stripping electrode 27 are identical to those of FIG. 7.
  • This electrochemical micro-reactor 21 is incorporated in place of the electrochemical cell in the automated system described in FIG. 8.
  • This micro reactor is particularly effective for very dilute solutions which require a high capture rate. It also makes it possible to further reduce the contact times between solutions and solid phase due to the large surface / volume ratio obtained.
  • the sample to be dosed (volume 10 cnr 5 ) is introduced with a flow rate of 5 c ⁇ r / minute; - the potential of electrode 22 during the measurement phase is + 700 m? relative to the electrode 26; the current jump is obtained by introduction of the enzyme substrate, here acetylthiocholine 51C " M in a 0.01 M phosphate buffer, pH 7.5 / NaCl 0.15 MB
  • the phase stripping procedure solid is different because of its large surface area.
  • the power supply 18 imposes an alternating current on the frequency of the sector of approximately ⁇ 3V * in amplitude between the working electrode 22 and the electrode 27 "This phase, carried out in the presence of the nitro- mixture " lasts 5 seconds. is known to have a phase of erosion with phosphate buffer 0.01, M, pH 7.4-).
  • the entire measurement cycle lasts 15 minutes and an example of a calibration curve is given in FIG. 12.
  • the sensitivity is of the order of 2.10 ⁇ 2 mol / 1 with a capture rate of between 0.5 and 0 , 9. It will be noted that, if less good sensitivity is desired, it is sufficient to reduce the volume of the sample.
  • This example concerns the detection and localization of a protein in vivo using a microelectrode (carbon fiber with a diameter of 10 ⁇ m).
  • the solid phase is used to detect the presence of free acetylcholinesterase located at the periphery of a nerve cell in the spinal cord of the rat.
  • the anti-acetylcholinesterase antibody is immobilized on the carbon fiber, which is introduced under microscopic control into the tissues ' , according to the usual methods in electrophysiology. 1) Reagents ' The anti-acetylcholinesterase monoclonal antibody suitable for this measure is not marketed and was supplied by a specialized university research laboratory.
  • microelectrode used (for example that bearing the reference MPC1 marketed by SOLEA-TACUSS ⁇ L) is sectioned so that the useful length of the fiber is approximately 50 ⁇ m. Taking into account the diameter (10 ⁇ m), this corresponds to an external surface of the fiber of the order of 1, 6.10 " ⁇ cm 2 ⁇
  • the electrode is mounted on a micromanipulation stand.
  • the electrode is placed as the working electrode in a conventional electrochemical assembly with three electrodes. The current is measured using a pico-amperometer, because of the low currents output.
  • the anti-acetylcholinesterase antibody is adsorbed by simple soaking of the fiber in a solution 10 pg / cm in the same buffer.
  • the electrode After rinsing with the blocking buffer of Example 1, the electrode is fixed on a micromanipulator and the tip of the carbon fiber is inserted into the preparation for 2 minutes. Localization is carried out under a ⁇ microscope
  • the detection of the acetylcholinesterase thus "taken up by the antibodies fixed on the electrode can then be carried out, in deferred fashion, in the electrochemical cell.
  • the currents measured are of the order of 10 to 100 pico A, depending on the quantity of enzymes to be detected and the contact times in vivo.
  • the sensitivity, expressed here in quantity of enzymes and not in concentration, is of the order of 2.10—21 mole of acetylcholinesterase.
  • the method is semi quantitative, provided that contact times with witnesses are standardized.
  • the method can be used in vitro according to the same principles, in the case of very small sample volumes (for example of volume less than 1 ⁇ l). This proves the very high sensitivity of the detection method.

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Abstract

Dans ce procédé, on utilise une électrode à la surface de laquelle est fixé directement un anti-ligand spécifique du ligand à doser. En fin de dosage, on soumet cette électrode à un décapage électrochimique pour la réutiliser dans un nouveau cycle de mesure.

Description

Procédé cyclique de dosage immunoenzymatiαue d'un ligand.
La présente invention concerne un procédé cyclique de dosage immunoenzymatiq e d'un ligand, en phase hétéro- 5 gène.
On sait que le dosage de substances présentes en faible concentration dans les liquides biologiques industriels soulève un grand intérêt dans les milieux scientifiques; en raison des très nombreuses applications 10. de ces dosages dans divers domaines techniques,,
Les techniques récentes utilisent l'activité enzy a- tique comme moyen de marquage et d'amplification des molé¬ cules assurant les processus de reconnaissance moléculaire qui interviennent dans les procédés d'analyse immunologique, 15 On a ainsi envisagé de marquer des antigènes ou des anti¬ corps avec des enzymes telles que la peroxydase ou la glucose oxydase, dont il est possible de doser facilement l'activité par spectrophotométrie.
On distingue, dans ces techniques, les dosages en 20 phase homogène et les dosages en phase hétérogène :
- dans les dosages en phase homogène, l'activité enzymatique est fonction de la réaction anticorps-antigène et il n'est pas nécessaire de séparer la "fraction liée", c'est-à-dire l'immunoréactant (conjugué antigène-enzyme 5 ou anticorps-enzyme), qui a réagi dans la réaction immu¬ nologique, de la "fraction libre", qui représ.ente l'immu¬ noréactant qui n'a pas réagi ;
- dans les dosages en phase hétérogène, l'activité enzymatique n'est pas modifiée par la réaction antigène- 0 anticorps et une séparation de la fraction liée et- de la fraction libre s'avère nécessaire.
C'est à ces dosages en phase hétérogène .que s'inté¬ resse la présente invention et l'on commencera par rap¬ peler les principes de ces différents dosages, qu'il est usuel de classer en méthodes compétitives et non-compétiti¬ ves.
Dans les méthodes dites compétitives, le conjugué enzy e-ligand (antigène ou anticorps) est mélangé avec un échantillon du milieu biologique à doser (ou avec un échantillon d'un milieu standard) contenant le ligand li¬ bre, en vue d'entrer en compétition avec ce dernier pour se combiner à des antiligands fixés en quantité limitée sur un support solide. En variante (dosage par inhibition), le ligand peut être immobilisé sur un support et entrer en compétition avec le ligand à doser, lorsqu'ils sont mis simultanément en présence d'une quantité limitée d'antiligand en solution. Dans ces méthodes, l'activité enzymatique est inversement proportionnelle à la concentra¬ tion en ligand à doser.
Parmi les méthodes non compétitives, la méthode dite "sandwich" est la plus connue et elle s'applique au dosage de ligands ayant au moins deux sites antigéniques. Le ligand à doser est mis en contact avec un support solide sur lequel sont fixés des anticorps. Le ligand se combine avec les anticorps et, après lavage du support, on met celui-ci en,contact avec un excès déterminé des mêmes anticorps marqués par une enzyme. Ceux-ci- se fixent à leur tour sur les ligands, qui sont ainsi pris en sandwich entre les anticorps fixés sur le support et ceux marqués par l'enzyme, d'où le nom de la méthode. Dans ce cas, l'activi¬ té enzymatique est directement proportionnelle à la con- centration en ligand à doser.
L'utilisation d'une phase solide dans un dosage immu- noenzymatique est une technique relativement récente, qui présente l'avantage de permettre une séparation de la fraction libre sans avoir recours à des procédés physico- chimiques qui compliquent les dosages.
Toutes ces méthodes en phase hétérogène nécessitent la détection finale de l'activité enzymatique, qui est réalisée en général en phase homogène (par des méthodes spectrophotométriques, fluorimétriques ou par biolumines- cence) ou pseudo-homogène (par un capteur enzymatique). Une méthode optique très complexe, l' éllipsométrie, permetde détecter directement sur la phase solide la présence, par exemple, de l'anticorps utilisé pour le dosage. Mais, cette méthode n'est pas envisageable pour des mesures de routine.
Aussi a-t-on proposé d'utiliser la phase solide elle- même comme détecteur de la présence de l'enzyme, ce qui rend le processus totalement hétérogène et facilite sa mise en oeuvre.
Dans des procédés de ce type, après avoir fait ap¬ paraître des sites réactifs à la surface d'une électrode, on amène celle-ci en contact avec un antiligand spécifique du ligand à doserpour former une phase solide conductrice que l'on expose ensuite au ligand à doseret à un conjugué antiligand -enzyme ou ligand- enzyme, l'enzyme de ce conjugué étant apte à réagir avec un substrat pour fournir un produit électro-actif vis-à-vis de la phase solide conductrice (voir, par exemple, ϋP-A-0 1 -2 301 et EP-A-
0150999").
En effet, lorsqu'une enzyme qui produit une espèce électroactive se trouve immobilisée en 'situation de pro- ximité moléculaire sur une surface conductrice, la ciné¬ tique électrochimique et la cinétique enzymatique sont interdépendantes, ce qui permet de quantifier la présence de l'enzyme par le courant électrique de détection élec- trochimique de cette espèce électroactive. Cet état de proximité moléculaire peut être obtenu par l'une quelconque des méthodes immunologiques précé¬ demment décrites, l'anticorps étant immobilisé directement sur la surface conductrice.
Une conséquence importante de l'utilisation de ce procédé de dosage, que l'on désignera par l'expression
"électrocatalyse enzymatique", est que la quantité d'enzyme détectable dans cette situation est extrêmement faible, ce qui, dans son application à un dosage im unoenzymatique, en phase hétérogène, conduit à une sensibilité supérieure à celle des moyens de détection antérieurs.
Pour des dosages successifs à l'échelle industrielle de ligands identiques ou différents, il serait toutefois avantageux de pouvoir réutiliser immédiatement pour un nouveau cycle de mesure l'électrode qui a déjà servi dans une première mise en oeuvre du procédé. On gagnerait ainsi un temps considérable entre des cycles successifs de dosage par rapport aux méthodes connues dans la technique. C'est ce problème que se propose de résoudre la présente invention.
A cet effet, l'invention a pour objet un procédé cy¬ clique de dosage immunoenzymatique d'un ligand, selon lequel, après avoir fait apparaître par oxydation électro- chimique des sites réactifs à la surface d'une électrode, on amène celle-ci en contact avec un antiligand spécifique du ligand à doser pour former une phase solide conductrice comprenant ladite électrode et, fixée à la surface de celle-ci, une couche sensiblement monomoléculaire dudit antiligand sans interposition d'un support intermédiaire, cette phase solide étant ensuite exposée au ligand à doser et à un conjugué antiligand-enzyme ou ligand-enzyme, suivant que l'on applique les méthodes de dosage dites "sandwich" ou "compétitive", l'enzyme dudit conjugué étant apte à réagir avec un substrat pour fournir un produit électro-actif vis-à-vis de ladite phase solide, ce procédé étant caractérisé en ce que, en fin de dosage, on sépare de l'électrode au moins les ligands et les conjugués antiligand-enzyme ou ligand-enzyme fixés sur ladite phase solide, en vue de la réutilisation de cette dernière pour un nouveau cycle de dosage.
La séparation de la phase solide des ligands et des conjugués anti-ligand enzyme ou ligand-enzyme pourra s'effectuer par simple rinçage de la phase solide avec un liquide dont les conditions de pH et/ou de polarité sont différentes de celles du milieu de dosage.
En fin de dosage, la couche sensiblement monomolé¬ culaire d'anti-ligand peut également être séparée de 'l'électrode sur laquelle elle, est fixée, en vue de la réutilisation de cette électrode pour un nouveau cycle de dosage , par exemple en soumettant cette électrode à un décapage électrochimique par action d'un courant continu ou alternatif.
Dans ce but, on pourra avantageusement faire passer un courant continu dans une solution oxydante, entre l'élec- trode de dosage et une électrode de référence, avec une différence de potentiel comprise entre + 1 ,7 volt et 2,2 volts.
On pourra aussi utiliser un courant alternatif avec une différence de potentiel de +_ 3 volts entre l'électrode de dosage et l'électrode de décapage.
L'électrode de dosage pourra être, par exemple, en carbone, en platine ou en or; et pourra prendre n'importe quelle forme en fonction des contraintes d'introduction de l'échantillon à doser (électrode plane, poreuse ou à solution percolante).
Les anticorps ou les antigènes peuvent être fixés sur l'électrode par tout moyen connu dans la technique, par exemple par liaison covalente ou par adsorption phy¬ sique, en formant une unique couche moléculaire. Dans le_ cas d'une fixation par liaison covalente, on fera subir à l'électrode un prétraitement comprenant, de „ façon connue en soi, une phase de création de sites réac¬ tifs à la surface de l'électrode par oxydation électro¬ chimique de celle-ci et une phase d'activation de ces sites par un agent de couplage approprié à la nature de l'électrode et à celle de l'antico ns ou de l'antigène à fixer, par exemple une activation par un carbodii ide dans le cas d'une électrode en carbone.
Dans le cas d'une immobilisation des anticorps ou des antigènes sur l'électrode par adsorption physique, on procédera également à un prétraitement électrochimique de la surface de l'électrode avant de la mettre en contact avec lesdits anticorps ou antigènes.
Dans chaque cas d'espèce, on peut optimiser la quan- tité d'anticorps ou d'antigène à mettre en contact avec l'électrode en vue d'obtenir une couche sensiblement mono¬ moléculaire à la surface de l'électrode, afin qu'elle ne fasse pas "écran" devant la phase solide lors de la dé¬ tection électrochimique ultérieure du produit de catalyse enzymatique.
Pendant la phase de dosage, les ligands et/ou les conjugués anti-ligand enzyme pourront ne saturer qu'une fraction des sites des anti-ligands ou ligands associés, ce qui limitera la durée de mise en oeuvre du procédé.
La détection du produit libéré par le -substrat., pen¬ dant la phase de dosage, pourra avantageusement être effectuée par mesure d'un courant s'écoulant entre l'élec¬ trode et une électrode de référence à potentiel contrôlée Les dessins schématiques annexés illustrent la mise en oeuvre de l'invention. Sur ces dessins:
Les figures 1 à 4- illustrent la préparation d'une électrode électroenzymatique selon l'invention utilisable dans un procédé de dosage par une méthode non compétitive du type "sandwich";
Les figures 5 et 6 illustrent la préparation d'une électrode utilisable dans une méthode compétitive; Les figures .7 et 8, sont des schémas, respectivement, d'une cellule électrochimique et d'un système de dosage utilisables dans les procédés de dosage électroenzymatique conforme à l'invention ;
Les figures 9 et 10 représentent des courbes d'étalon nage utilisées respectivement dans les dosages des Exemple 1 et 2 ;
La figure 11 est un schéma d'une cellule de dosage utilisée dans l'Exemple 3 î
La figure 12 est une courbe d'étalonnage utilisée dans l'Exemple 3.
Comme on le voit sur l'a figure 1 , l'électrode 1, aprè avoir subi un traitement propre à permettre l'immobilisa¬ tion à sa surface d'anticorps 2, par liaison covalente ou par adsorption physique, est mise en contact avec une solution contenant ces anticorps. Ceux-ci, qui sont des anticorps spécifiques de l' antigène à doser, se fixent à la surface de l' électrode en formant une monocouche, qui recouvre totalement ou partiellement la surface traitée, suivant les conditions du traitement et le résultat souhaité.
L'électrode modifiée résultante est ensuite mise en contact avec une solution de l'antigène 3 à doser (figure 2) qui vient se fixer sur les anticorps 2. Les conditions de la mise en contact sont telles que les anticorps ne soient pas saturés en antigènes et qu'une partie des sites anticorps demeure vacante. Le nombre des liaisons antigène- anticorps formées dépendra de la concentration en antigènes de la solution à doser.
Le temps de mise en contact de la phase solide avec la solution d'antigène, ou phase d'incubation, est de l'ordre de quelques minutes, alors que, dans la plupart des méthodes de dosages iπjiunoenzymatiques, les durées d'incu¬ bation sont de l'ordre de 1 heure. En effet, ce procédé est beaucoup plus sensible que les procédéa usuels, pour les raisons indiquées ci-dessus, et il n'est donc pas nécessaire de saturer tous les sites anticorps, ce qui permet de réduire de façon importante la durée de contact. L'électrode est alors exposée au conjugué anticorps- enzyme 4-, qui vient se fixer sélectivement sur les anti¬ gènes 3 (figure 3)« Les conditions de la mise en contact peuvent être telles que les conjugués 4- saturent tous les sites antigènes, mais ceci n'est pas une obligation, si l'on procède par comparaison avec un étalon interne réalisé dans les mêmes conditions. Le temps d'incubation peut donc être considérablement réduit par rapport aux techniques antérieures. A l'issue de la phase illustrée par la figure 3, le conjugué anticorps-enzyme 4- se trouve en situation d' élec¬ tro-catalyse enzymatique à la surface de l'électrode 1. Il suffit, en effet, d'introduire dans le milieu à doser une ou des substances 5 (ou "substrats") aptes à réagir avec l'enzyme du conjugué 4-, comme on le voit sur la figure 4-, pour détecter et doser à l'aide de l'électrode 1 le produit 6 de la réaction enzymatique. C'est ainsi qu'avec l'acétylcholinesterase utilisée avec un substrat artificiel du type acétylthiocholine la réaction catalysée est : acétylthiocholine > thiocholine + acétate La thiocholine (R-SH)produite est électrochi iquement détectée si le potentiel de l'électrode est au moins à 0,7 V par rapport à une électrode de référence du type Ag/Ag Cl:
2 R-SH •> R-S-S-R+2H++.2e" II est possible, à partir du courant d'oxydation obtenu, de calculer le nombre de molécules enzymatiques en situation d'électrocatalyse enzymatique et de mesurer ainsi, avec l'aide d'un étalonnage interne, la concentra¬ tion de l'antigène 3« Les figures 5 et 6 illustrent le même procédé de mise en condition d'électrocatalyse enzymatique pour un conjugué antigène-enzyme 7 utilisé dans une méthode par compétition.
Dans cette utilisation, le conjugué enzyme-ligand 7 est mis en compétition avec le ligand libre 3 du milieu biologique à doser pour se combiner avec les anticorps 2 immobilisés en formant monocouche sur l'électrode 1 (figure 5)« Comme précédemment, si l'on introduit alors dans le milieu à doser une ou des substances 5 (ou sub- strats) aptes à réagir avec l'enzyme E du conjugué 7» on peut, comme on le voit sur la figure 6, détecter et doser à l'aide de l'électrode 1 le produit 6 de la réaction enzymatique.
Conformément à l'invention, en vue de pouvoir réutili ser l'électrode pour un nouveau cycle de dosage, après la phase de détection illustréepar les figures 4- à 6, on ramène l'électrode à son état de départ, avant la fixation des anticorps 2.
A cet effet, on procède à un décapage électrochimique dans des conditions analogues à celles du prétraitement de l'électrode mentionné ci-dessus.
On notera que ce décapage de l'électrode n'est efficace que parce que la couche d'anticorps qui y adhère est une couche sensiblement monomoléculaire.
Pour procéder à ce décapage électrochimique, dans le cas d'une électrode en carbone vitreux, par exemple, il suffira de porter l'électrode à un potentiel d'environ 2 volts par rapport à une électrode de référence Ag/Ag Cl dans une solution oxydante, pendant quelques secondes. Il se peut aussi qu'après la phase de dosage, on veuille simplement réutiliser les anticorps fixés. Dans ce cas, les anticorps utilisés (par exemple monoclonaux) auront -été sélectionnés pour qu'un rinçage, dans des condi¬ tions physicochimiques différentes de la mesure, assure la rupture des liaisons antigène-anticorps, sans dénaturation de l'anticorps immobilisé sur la phase solide. La réutilisation de l'électrode, conformément à l'in¬ vention, s'applique à tous les procédés usuels de dosage immunoenzymatique en phase hétérogène, que ce soit les méthodes compétitives, sandwich ou par inhibition, de n'importe quelle molécule permettant une reconnaissance immunologique (protéine, enzyme, hormone, haptène, etc...), moyennant l'utilisation d'un milieu et de conditions de dosage appropriées.
On remarquera que, de façon connue si la molécule à doser est une enzyme catalysant une réaction électro- chimique détectable, le dosage est notablement simplifié et ne nécessite qu'un anticorps de cette enzyme. C'est ce qui ressortira notamment de l'Exemple 4- qui sera décrit ci-après.
Ainsi qu'il est connu, l'enzyme utilisée pour la préparation des conjugués est nécessairement une enzyme possédant comme substrat ou produit de la catalyse un couple redox électroactif. Ce couple redox, qui peut être physiologique ou artificiel, est choisi de telle sorte qu'il présente une bonne réactivité électrochimique sur l'électrode employée, afin d'obtenir une sensibilité optimale.
Les enzymes correspondantes sont en général des oxydoréductases, mais peuvent être aussi des enzymes d'une autre classe, répondant à la condition précédente, par exemple des hydrolases.
Le tableau ci-après rassemble quelques enzymes uti¬ lisables pour la préparation des conjugués détectables par électrocatalyse enzymatique.
TABLEAU
Figure imgf000012_0001
La sensibilité globale des procédés de dosage dépend de trois facteurs :
- la sensibilité intrinsèque de la détection en phase solide, - le temps de contact entre l'échantillon à doser et la phase solide,
- la qualité du matériel immunologique utilisé. Pour le premier facteur, la sensibilité de détection est liée à l'activité catalytique moléculaire de l'enzyme utilisée pour l'amplification (par exemple, environ 10 000 s" pour un conjugué obtenu avec l'acétylcholinestérase de Electricus Electrophorus). Dans ce cas, l'électrocatalyse enzymatique est capable de détecter la présence d'un
—1 fi minimum de 10"" mole de conjugué par cm de surface réelle de la phase solide.
Cette exceptionnelle sensibilité s'explique par la proximité moléculaire entre site enzymatique et site électrochimique, ce qui réduit à quelques nano ètres la distance que doit parcourir le produit pour être détecté.
Il est important de noter, à ce propos, que la sensibilité de détection du conjugué est entièrement indé¬ pendante de la surface de la phase solide. La taille et la forme de l'électrode utilisée peut donc être adaptée à la quantité ..d'antigène que l'on souhaite doser.
Ce point sera illustré dans les exemples proposés.
Pour ce qui est du temps de contact entre la phase solide et l'échantillon, ce temps de contact détermine un "taux de capture" T, qui peut être inférieure à 1 , si tous les antigènes n'ont pas été captés, le taux de capture étant défini comme le rapport entre le nombre de molécules antigèniques capturées par la phase solide et leur nombre total dans l'échantillon.
Le taux T est également sensible au rapport entre le volume de l'échantillon et la surface de *la phase solide. Une des caractéristiques de l'invention est que la détection est suffisamment sensible pour qu'il soit possible d'accepter des taux de capture faibles (par exemple T = 0,03 dans l'exemple 1). Enfin, la sensibilité pratique du procédé de dosage est fonction, comme pour toute méthode immunologique, de la qualité des anticorps utilisés ainsi que des adsorptions non spécifiques parasites sur la phase solide. Les rinçages dans des tampons appropriés, connus de l'homme de l'art, limitent ces adsorptions non spé¬ cifiques. Mais on notera que le temps d'incubation très court permis par la procédure proposée réduit considé¬ rablement ces adsorptions non spécifiques.
La sensibilité globale obtenue est finalement un paramètre modulable en fonction du problème analytique traité. Les exemples présentés ci-après illustrent des sensibilités effectives pouvant atteindre 2.10 —"12 mole par litre ou 2.10 -21 mole dans la prise d'essai.
Les exemples suivants illustrent diverses formes de mise en oeuvre de l'invention. EXEMPLE 1
Cet exemple illustre le dosage d'une immunoglobine
G par la méthode "sandwich." sur une phase solide de surface moyenne (électrode υlane de carbone vitreux ô de surface d'environ 0*1 cm ). 1 ) Préparation des réactifs
L'anticorps anti 1 gG de lapin a été ourni* par les laboratoires BYOSIS, de Compiègne (Prance). Il a été obtenu chez le mouton et purifié selon les pro¬ cédures connues. Le conjugué glucose oxydase-anti 1gG est préparé par la méthode au glutaraldehyde d'AVRAMEAS et al (Immunochemistry, Pergamon Press 6, 4-3-52 (1969). Après purification, le conjugué est enzymatiquement actif à 95$ et im unologiquement actif à 60 . 2) Appareillage La mesure pourra, par exemple, être effectuée dans une cellule électrochimique 9 à circulation, du type illustré par la figure 7»
Dans cette cellule, le liquide arrive par une canali¬ sation 10, circule en lame mince délimitée par une pelli- cule 11 de matière plastique, par exemple de P T P E, et est évacué par une canalisation 12. La cellule comprend, par ailleurs, une électrode de travail 13, par exemple en carbone vitreux, une contre-électrode 14-, par exemple du type Ag/Ag Cl, et une électrode de décapage 15, par exemple en carbone vitreux. Les électrodes sont gainées sur toute leur surface latérale par une matière isolante et ne sont en contact avec le liquide à doser que par leur face d'extrémité. Bien entendu, une telle cellule n'a qu'une valeur d'exemple et l'on pourrait utiliser ' tout autre système conçu par l'homme de l'art.
La cellule 9 s'incorpore dans un système entièrement automatisé du type, de celui de la figure 8, qui permet un étalonnage interne assurant la précision du dosage. La cellule électrochimique 9 est alimentée par la canalisation 10 à partir d'un circuit fluidique 16, lui- même alimenté en réactifs par le conduit 17» avec prise d'échantillon éventuelle par le conduit 18. Les électrodes 13, 14- et 15 sont connectée^ à un système d'alimentation électrique 19, qui sert en même temps d'interface élec- tronique de-contrôle et d'acquisition, couplée à un microordiήateur 20. 3) Dosage
On utilise, dans ce cas, le principe de la méthode "sandwich" décrite en référence aux figures 1 à 4-. L'in- troduction et la circulation des réactifs est assurée par le circuit fluidique 16 de la manière suivante:
L'électrode de travail 13 est oxydée 5 secondes dans un mélange nitrochromique (10% en poids de HNO5 + 2% en poids de + eau) par passage d'un courant de 5 πiA.
Figure imgf000015_0001
L'électrode 15 est utilisée comme cathode. Cette phase de décapage de l'électrode régénère la surface de la phase solide et facilite l'adsorption de l'anticorps0
Après rinçage au tampon (phosphate 0,01 M, pΞ 7, -» NaCl 0,15 M), une solution d'anticorps (300 g/ l dans le même tampon) est mise en contact 5 minutes avec la phase solide. Un rinçage pendant 2 minutes a -tampon bloquant (phosphate 0,01 M,' pH 7, "'"gélatine 0,25 + Tween 20,0,1 ( onolaurate de polyoxyéthylènesorbitane commercialisé sous cette appellation et utilisé comme tensio-actif) + NaCl 0,15 M) permet d'éliminer l'anticorps en excès. On introduit 0,2 cπr de la solution contenant l'anti¬ gène à doser avec un débit de 0,1 cπr par minute. Cette phase est suivie par 2 minutes de rinçage au tampon bloquant.
Le conjugué (100 pg/cm-5 dans le tampon bloquant) est introduit pendant 1 minute, puis rincé par une solution de benzoquinone (10 M dans du tampon acétate 0,1 M, pH 5,6 + NaCl 0,15 M).
Le courant de l'électrode, portée à 350 mV par rap¬ port à l'électrode 14-, est alors échantillonné pendant 1 minute par le système d'acquisition de données 19 et 20. L'introduction de glucose 0,2 M dans la même solution pro¬ voque un saut de courant, dû à la détection de l'hydro- quinone enzymatiquement formée. Ce saut de courant, pra¬ tiquement instantané, est directement proportionnel à la quantité .de' conjugué en position d'électrocatalyse - enzymatique..11 est relié par une courbe d'étalonnage (figure 9) la concentration en 1 gG dans l'échantillon.
Le taux de capture calculé est ici de l'ordre de 0,03 et la sensibilité de l'ordre de 2.1 O"1 mole/1, en antigène, soit 4-,10" ^ mole d'antigène dans la prise d'essai. Le cycle de mesure peut alors recommencer par le décapage de la phase solide. L'ensemble du cycle dure ici 20 minutes y compris 1*adsorption de l'anticorps sur la phase solide. Pour réutiliser immédiatement l'électrode 13 dans un nouveau- cycle- de mesure, il suffit de la soumettre à la même opération de décapage que celle qui a initié le cycle précédent.
EXEMPLE 2 Cet exemple concerne le dosage d'un stéroïde, le 176 oestradiol, par une méthode dite "compétitive", sur une phase solide de surface moyenne (électrode plane de carbone vitreux de 0,1 cm de surface)»
1 ) Réactifs
L'anticorps de lapin anti-oestradiol a été obtenu d'un laboratoire spécialisé. Le conjugué oestradiol- acétylcholinestérase a été préparé selon la méthode de
ERLANGER et al (Methods in immunology and immunochemistry, Académie Press, vol 1 144-, (1967).
2) Appareillage
On utilise le même appareillage que dans l'Exemple 1.
3) Dosage
On utilise le principe de la méthode par compétition de l'antigène vis-à-vis "de l'antigène marqué pour la phase solide, décrite en référence aux figures et 6. L'introduction et la circulation des réactifs est assurée automatiquement par le circuit fluidique 16 selon la chronologie suivante :
Les phases de décapage puis d'adsorption de l'anti¬ corps anti-oestradiol sontidentiquesaux deux premières phases de l|Exemple 1. " •
Pendant la phase de compétition, une solution de conjugué antigène-enzyme de concentration appropriée est introduite avec la solution à doser. Le débit de ce mélange échantillon/conjugué est de 0,1 cπ /min. et cette phase dure 3 minutes.
Après un rinçage d'une minute au tampon phosphate (0,01 M pH 7,5 + NaCl 0,15 M), la solution d'acétylthiα- choline (5.10" M dans le même tampon) est introduite.
Le saut de courant mesuré par l'électrode 13,préala- blement portée à + 700 mV par rapport à l'électrode 14-, correspond à l'oxydation de la thiocholine produite par le conjugué en position d'électrocatalyse enzymatique.
Dans ce cas, le courant mesuré est inversement proportionnel à la concentration en antigène dans l'échan- tillon à doser. La figure 10 représente une courbe d'éta¬ lonnage.
Pour une nouvelle mesure, il suffit de procéder à un nouveau décapage de l'électrode 13.
EXEMPLE 3 Cet exemple concerne le dosage d'une immunoglobine G par la méthode "sandwich", à l'aide d'une phase solide de grande surface (électrode en feutre de carbone de surface réelle 50 cm ).
1 ) Réactifs
Les anticorps ont la même provenance que ceux de l'Exemple 1. Le conjugué est ici obtenu par couplage de l'acétylcholinestérase de Electricus electrophorus sur l'anticorps par la méthode au carbodii ide décrite par Goodfried T.L. et al., Science 1964-, 14-4-, 13 -4- - 4-6.
2) Appareillage
L'appareillage utilisé est représenté sché atiquement sur la figure 11. La phase solide est un cyclindre 22 de feutre de carbone (par exemple, celui portant la référence RYC 2000 commercialisé par la Société Le Carbone Lorraine) de 7 mm de long sur 5 πim de diamètre, correspondant à une
2 surface réelle de fibre de carbone de l'ordre de 50 cm . Le contact électrique av c cette électrode de travail est assuré par l'électrode annulaire 23 en platine. La solu¬ tion, introduite par 24-, percole au travers de l'électrode 22 et est évacuée par la sortie 25»
L'électrode de référence 26 et l'électrode de déca- page 27 sont identiques à celles de la figure 7» Ce micro- réacteur électrochimique 21 s'incorpore à la place de la cellule électrochimique dans le système automatisé décrit dans la figure 8.
Ce micro réacteur est particulièrement efficace pour les solutions très diluées qui nécessitent un taux de capture élevé. Il permet également de réduire encore les temps de contact entre solutions et phase solide du fait de l'important rapport surface/volume obtenu.
3) Dosage Dans son principe, le processus de dosage est identi¬ que à celui de l'exemple 1, avec les différences suivan¬ tes : - le temps d'adsorption de l'anticorps est réduit à 2 minutes;
- l'échantillon à doser (volume 10 cnr5) est introduit avec un débit de 5 cπr/minute ; - le potentiel de l'électrode 22 pendant la phase de mesjure est à + 700 m? par rapport à l'électrode 26 ; le saut de courant est obtenu par introduction du substrat de l'enzyme, ici l'acétylthiocholine 51C" M dans un tam¬ pon phosphate 0,01 M,pH 7,5/NaCl 0,15 Mo La procédure de décapage de la phase solide est différente à cause de sa grande surface. Dans ce cas, l'alimentation 18 impose un courant alternatif à la fré¬ quence du secteur d'environ ^ 3V* d'amplitude entre l'élec¬ trode de travail 22 et l'électrode 27» Cette phase, réalisée en présence du mélange nitro- » dure 5 secondes. Elle
Figure imgf000019_0001
est su vie d une phase e r nçage au tampon phosphate 0,01, M,pH 7,4-).
L'ensemble du cycle de mesure dure 15 minutes et un exemple de courbe de calibration est donné sur la figure 12. La sensibilité est de l'ordre de 2.10 —î2 mole/1 avec un taux de capture compris entre 0,5 et 0,9. On remarquera que, si une moins bonne sensibilité est désirée, il suffit de réduire le volume de l'échantillon. EXEMPLE 4-
Cet exemple concerne la détection et la localisation d'une protéine in vivo à l'aide d'une microélectrode (fibre de carbone de diamètre 10 αm).
Dans cet exemple, la phase solide est utilisée pour détecter la présence d'acétylcholinestérase libre loca¬ lisée à la périphérie d'une cellule nerveuse dans la moè'lle épinière du rat. L'anticorps anti-acétylcholinesté- rase est immobilisé sur la fibre de carbone, qui est in¬ troduite sous contrôle microscopique dans les tissus', selon les méthodes habituelles à l' électrophysiologie. 1 ) Réactifs 'L'anticorps monoclonal anti-acétylcholinestérase adapté à cette mesure n'est pas commercialisé et a été fourni par un laboratoire de recherches universitaire spécialisé.
2) Appareillage On utilise ici une méthode manuelle.
La microélectrode utilisée (par exemple celle portant la référence MPC1 commercialisée par SOLEA-TACUSSΞL) est sectionnée de telle sorte que la longueur utile de la fibre soit d'environ 50 pm. Compte tenu du diamètre (10 um), ceci correspond à une surface externe de la fibre de l'ordre de 1 ,6.10"^ cm2 β
Pendant la phase de contact avec l'échantillon, l'électrode est montée sur un stand de micromanipulation. Pendant la phase de mesure de l'activité enzymatique, l'électrode est placée comme électrode de travail dans un montage électrochimique classique à trois électrodes. Le courant est mesuré à l'aide d'un pico-ampéromètre, à cause des faibles courants débités.
3) Dosage La micr-o-électrode est prétraitée par passage de
10 pA pendant 5 secondes dans le mélange nitrochromique de l'Exemple 1. Après rinçage au tampon phosphate (0,01 M, pH 7,4), l'anticorps anti-acétylcholinestérase est adsorbé par simple trempage de la fibre dans une solution à 10 pg/cm dans le même tampon.
Après rinçage au tampon bloquant de l'Exemple 1, l'électrode est fixée sur un micromanipulateur et la pointe de la fibre de carbone est enfoncée dans la préparation pendant 2 minutes. La localisation s'effectue sous microscopeβ
La détection de l'acétylcholinestérase ainsi "prélevée par les anticorps fixés sur l'électrode peut ensuite être effectuée, en différé, dans la cellule électrochimi¬ que. Les courants mesurés sont de l'ordre de 10 à 100 pico A, en fonction de la quantité d'enzymes à détecter et des temps de contact in vivo. La. sensibilité, exprimée ici en quantité d'enzymes et non en concentration, est de l'ordre de 2.10—21 mole d'acétylcholinestérase. La méthode est semi quantitative, à condition de standardiser les temps de contact avec des témoins.
On remarquera que la méthode peut être utilisée in vitro selon les mêmes principes, dans le cas de volumes d'échantillons très faibles (par exemple de volume infé¬ rieur à 1 pi). Ceci prouve la très grande sensibilité de la méthode de détection.

Claims

REVENDICATIONS
1.- Procédé cyclique de dosage immunoenzymatique d'un ligand, selon lequel, après avoir fait apparaître par oxydation électrochimique des sites réactifs à la surface d'une électrode, on amène celle-ci en contact avec un antiligand spécifique du ligand à doser pour former une phase solide conductrice comprenant ladite électrode et, fixée à la surface de celle-ci, une couche sensible¬ ment monomoléculaire dudit antiligand sans interposition d'un support intermédiaire, cette phase solide étant ensui exposée au ligand à doser et à un conjugué anti-ligand- enzy e ou ligand-enzyme suivant que l'on applique les méth des de dosage dites "sandwich" ou "compétitive", l'enzyme dudit conjugué étant apte à réagir avec un substrat pour fournir un produit électro-actif vis-à-vis de ladite phase solide, ce procédé étant caractérisé en ce que, en fin de dosage, on sépare de l'électrode au moins les ligands et les conjugués antiligand-enzy e ou ligand-enzyme fixés sur ladite phase solide, en vue de la réutilisation de c'ette dernière- pour un nouveau cycle de dosage.
2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séparation de la phase solide des ligands et des conjugués antiligand-enzyme ou ligand-enzyme s'effectue par rinçage de ladite phase solide avec un liquide dont les conditions de pΞ et/ou de polarité sont différentes de celles du milieu de dosage.
3.- Procédé selon la revendication 1 ? caractérisé en ce que, en fin de dosage, ladite couche dudit anti¬ ligand est également séparée de l'électrode sur laquelle elle est fixée, en vue de la réutilisation de ladite électrode pour un nouveau cycle de dosage.
4-o- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la séparation de ladite couche d'anti-ligand est réalisée en soumettant ladite électrode à un décapage électrochimique par action d'un courant continu ou al¬ ternatif.
5.- Procédé selon la revendication 4-, caractérisé en ce que, pour le décapage de l'électrode, on fait passer un courant continu dans une solution oxydante, entre l'électrode de dosage et une électrode de référence avec une différence de potentiel comprise entre + 1 ,7 volt et 2,2 volts.
6.- Procédé selon la revendication 4-, caractérisé en ce que, pour le décapage de l'électrode, on utilise un courant alternatif, avec une différence de potentiel de + 3 volts entre l'électrode de dosage et l'électrode de décapage.
7.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que, pendant la phase de dosage, les ligands et/ou les conjugués antiligand-enzyme ou ligand-enzyme ne saturent qu'une fraction des sites des εntiligands ou ligands associés.
8.- Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la détection du produit libéré par ledit substrat pendant la phase de dosage est effectuée par mesure d'un courant s'écoulant entre ladite électrode et une électrode de référence à- potentiel contrôlé.
PCT/FR1987/000203 1986-06-09 1987-06-09 Procede cyclique de dosage immunoenzymatique d'un ligand Ceased WO1987007725A1 (fr)

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