WO1988002006A1 - Anticorps monoclonal specifique du ganglioside superficiel de cellules tumorales et hybridome le produisant - Google Patents

Anticorps monoclonal specifique du ganglioside superficiel de cellules tumorales et hybridome le produisant Download PDF

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Shuji Nakamura
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells

Definitions

  • Anti-vaginal cell surface ganglioside-specific monoclonal antibody Antibodies that produce it.
  • the present invention relates to a novel monoclonal antibody and a novel hybridoma that produces the same. More specifically, the present invention provides antibody production cells and mouse osteosarcoma of a mouse produced by the mouse limber system.
  • Ganglioside which is a common tumor S3 fast antigen. 33 cells of mouse and human, obtained by cloning from, especially GD 2 (Ga! NAc / 31 ⁇
  • Neuroectoderm which reacts with melanoma, neuroblastoma cells, and gliomas but does not react with normal cells.
  • Many of the hybridomas producing these monoclonal antibodies are human tumor cells. It is made by a heterogeneous immunization method that combines mouse antibody-producing cells and mouse bone, heel, and cyst cells envisioned in ⁇ . However, most of the hybrids obtained by this method are the main group of humans HLA, which is an anti-corruption antigen system (Major Histocorapati bi Ityty Complex), also produces monoclonal antibodies that produce antibodies that produce specific antibodies to the target cell surface ganglioside. Is always slight W
  • the present invention provides a monoclonal antibody that specifically reacts with gangliosides of stunning cells.
  • mouse antibody-producing cells produced by mouse lymphoid cells and mouse bone S [ ⁇ 3 ⁇ 4! 5 From the hybridoma obtained by the transformation, the common heel of the microscopic aspects of the mouse and human cells was obtained.
  • IS (A) is a mixture of pure ganglioside (GM3 + GM2 + GM1 + GD3 + GD2) and the ganglioside fraction of M14, which were subjected to TLC and stained with resorcinol from the left.
  • Fig. 2 ( ⁇ ) shows the GD3 of class 4 applied to TLC and stained with resorcinol.
  • lane number 4 is GD3 (NeuGc, NeuGc).
  • C are the results of the enzyme immunostaining of T-C with MoA2 and MoAl, respectively.
  • the lane number and the type of GD3 are the same as in Fig. 2 (A).
  • Fig. 3 shows the results of measuring the reactivity of Mo A1, Mo A2 and Mo A3 with ganglioside products by EL IZA.
  • ⁇ - ⁇ is GD2, O-O I
  • GD 3 (NeuGc, NeuAc) and GT 1a
  • room is GD 1b
  • low port is GT 1 b
  • S-S is GQI b
  • ⁇ 1 A is GD 3 (NeuAc, euGc) 3 ⁇ 4 GO 3 (NeuGc , NeuGc), GDIa, monosia sigganglioside, and neutral tongue.
  • Fig. 3 ( ⁇ -1) shows serial dilutions of antigen-specific gangliocyst “products”, coating the gels, reacting with ⁇ ⁇ 10 (10 ig / Bl), and reacting with 3 ⁇ 4S. Further reaction with mouse I antibody Fig.
  • FIG. 3 shows the addition of stepwise diluted MoAl to a certain amount of ganglioside (0,1 sa / well).
  • Operation similar to (A-1) 3 ⁇ 4 Figure 3 (B-1) and (B-2) are for M0A2, respectively.
  • Fig. 3 (C-11) and (C-12) are the same as Fig. 3 (A- :! and (A-2), respectively, for Mo A3.
  • the monoclonal antibody of the present invention discriminates gangliocysts, which are embryologically classified as 3 ⁇ 4S. Strong cells derived from human neural crest, from tumor cells, and distinguishes them from normal cells. More specifically, gangliosides react more commonly and more strongly to GD2.
  • the monoclonal antibody of the present invention is produced by culturing a hybridoma obtained by cloning from a mouse antibody-producing cell and a mouse bone malignant cell that has been misled by mouse lymphoid intestinal cells. I can do it.
  • the hybridoma of the present invention is prepared by first culturing mice with mouse lymphoid stromal cells. * As mouse lysine 3 ⁇ 43 ⁇ 45 cells, those which are allogeneic and lineable with the mouse that can be cultivated can be used. Can it be, but the details? It is desirable that the S-mechanical properties be examined relatively well.
  • a mouse myeloma with an appropriate selection marker is suitable.
  • a parental mouse myeloma and antibody-producing cells are prepared in an appropriate ratio and then mixed.
  • the usual method of using an agent is used. Polyethylene glycol or the like is used as a mixture and the ratio is 1: 3-1: 5.
  • the hybridoma obtained in this way can be used to select a single stable hybridopoma by repeating cloning by the well-known method of limiting dilution and then assimilating it.
  • the hybridoma producing the anti- ⁇ of the present invention can be obtained.
  • Purification of the monoclonal antibody specifically recognizing ganglioside on the tumor cell surface of the present invention is carried out by appropriately combining known methods such as Ryuan fractionation, gel passage, and affinity column.
  • Antibodies obtained in this manner are those in which cells derived from biological neural crests, such as human-dariomas, human neuroblasts, and human melanomas, have become tumors. Specifically, but not with normal cells. This specificity is common to a part of human neural crest-derived iris and mouse-derived lupus cells. * In addition, anti-tumor is used as antigen-statutory grave against human neural crest-derived vaginal cysts. Tumors derived from heat-treated neural crests.
  • T L C Loss of sex, and specific recognition of gangliosides on the surface of tumor cells derived from neural crests from the results of immunoadhesion inhibition reaction with the gandarioside fraction Chromatography to determine microstructures (Hereinafter referred to as T L C) on ⁇ rabbit ⁇ staining with
  • Monoclonal antibodies specifically reacting with human neural crest-derived tumor cells obtained in this manner were tested for tumors by serum tests, tissue examination, imaging, etc. It is expected to be used for such purposes.
  • a cell line is inoculated intraperitoneally with T cell tumor ⁇ EL4, 10 7 cellsZ mouse derived from C57BL mouse once per week and 4 weeks into the A mouse, and the spleen is removed 3 days after the final inoculation, and the cells are suspended. It was adjusted as a liquid.
  • BALBZc mice Yukari ⁇ of Mi Eroma NS. 1 was 10 7 cells cultured prepared. Fusion was performed as follows according to a known method (Nature, 256 495 (1975)).
  • the direct cytotoxicity test method was as follows: C57BL mouse-derived T cell vagina EL4 suspension 20 ⁇ S, rabbit heron serum 20 ⁇ 1, Five
  • the culture supernatant was mixed for 37 and 45 minutes, and the reaction was performed according to the presence or absence of cytotoxicity.
  • the clonal antibodies were (IgM, ⁇ ), (IgM, ⁇ ) and (IgG3, x), respectively.
  • the intermediate layer except for the upper pristen layer and the cell rose was recovered and stored. '
  • the antibody was MoA 3.
  • IA immunoadhesion reaction
  • reaction was carried out while adding the morphogen trap 25; tJ2 diluted in 1 to 32 and squeezing at 37 ° C for 35 to 40 minutes.
  • thermostable live antigen by IA adsorption test
  • the mixture was centrifuged at 2,000 rpra for 10 minutes, and the supernatant (i was subjected to an IA adsorption test according to the method of IA above.
  • the anti-sequence * also contained sialyl in the antigenic determinant.
  • the purified ganglioside fraction was added to the anti-solution to S nmol or 10 ⁇ , and then subjected to ⁇ with M14.
  • the ganglioside fraction was diluted with 1% acetic acid to 100,
  • TLC ⁇ 3 ⁇ 4 immunostaining on fee
  • Silica gel made by Merck a 3 ⁇ 4 ⁇ Lc plate coated ⁇ Chromatography using TLC glass sheet coated with silica gel made by Merck as well as on silica gel 60 (13: 200 / im)
  • the solvent used is chloroform Z-Meknorno 0-22, a solution of aC in water is used as the developing solvent in gram, and resorcinol and resorcinol staining are used for staining ganglioside on ⁇ TLC plate.
  • Orcinol (orcino I) staining was used to stain neutral sugars.
  • TLC plate is used as a solution to a dwarf acid buffer containing TLC plate and porcine vinyl yroi idone IX and poi vinyl yroi idone IX. After drying in the air, the plate was reacted with the monoclonal antibody solution at 2:25. * Next, the salt solution (hereinafter referred to as P8S) was changed five times. While washing the chromatogram in it, the goat anti-mouse I and I combined with horseradish peroxidase
  • the gM antibody was reacted with this chromatogram at CC for 2 hours. Again, the P8S was replaced five times, and the chromatogram was washed and cleaned.
  • a ganglioside fraction of M14 was prepared according to Tai, T. et a, Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 80, 5392-53.
  • Gangliosides GM1, GDla, GD] b and GT1b were prepared from maggot brain and purified according to Kanfer, J. N. Methods Enzyisol., 660-664 (1963).
  • G Q] b was purchased from Jatlon. Human
  • 3 ⁇ 4 GM3 was obtained from Dr. S vennerhola of Got University, Sweden. * GM2 and GD 2 are from GM2 and GD 1b, respectively. ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ? -Galactosidase ⁇ Dr. J, V. Jourdian of University of Michigan, USA GM4 of human myelin and GT1a of human brain prepared from S ⁇
  • GD 3 (fieuAc, NeuAc), GD 3 (HeuAc, NeuGc) ⁇ GO 3 (NeuGc, NeuAc) ⁇ and GD 3 euGc, NeuGc of bear erythrocytes obtained from Dr. Arisaki of the Institute of Bed Medicine ⁇ UcCer.
  • GgOs 3 Cer and GgOsaCer obtained from Dr. Kanemoto and Dr. Akashi Suzuki of Clinic Research Institute are treated with GM3, GM2 and GM1 with weak acid, respectively, It was prepared by purification.
  • GlcCer is Tai, T. et a, Proc, KatK Acad. Sci. USA
  • GbOsaCer and GbOs ⁇ Cer were purchased from Supelco's Bellafonte, Zamerica, Bensilvania
  • Table 4 shows the results of immunostaining on the C plate.
  • Mo A 1 reacts only with GD 2 and does not react with other gangliosides.
  • GD lb is only the addition of 1 ⁇ ⁇ galactose to the GD 2 chain
  • GM2 and GD 3 are 1 ⁇ N-acetylneuramine or 1 mm respectively from the GD 2 strain.
  • M 0 A ⁇ distinctly reacts only with GD2.
  • GD ⁇ b> and addition to the terminal sialylated residue (GT1b) show that the antigenic determinant NeuAc 2 ⁇ 8NeuAc ⁇ 22 ⁇ 3Gai is masked.
  • GQ 1b in which sialic acid is added to the terminal sialic acid residue of GT 1 b, recovers reactivity up to the GD 1 b repertoire.Reactivity of GT 1 a is similar to that of GQ 1 b.
  • the recognition position of GQ1b is supposed to be the sugar of the sugar pheasant.
  • MoA2 is a disialosyl residue rNeuAca2 combined with a galactose residue (wherever it may be internal or terminal). ⁇ 8NeuAca2 ⁇ 3j 3 ⁇ 4g ⁇ .
  • MoA3 has only GD 2, GT la, and GQ lb. * Next, four kinds of GD 3 (GD 3 (NeuAc, NeuAc) .GD 3 (NeuAc, NeuGc) ⁇ GD 3 (NeuGc, NeuAc), And GD 3 (NeuGc, NeuGc)) and the monoclonal antibody on TLC plate. The results of the immunostaining method are shown in Fig. 2. Only Mo A2 reacted with these Ichiro and MoA l and Mo A 3 are all (The result of Mo A3 was not shown in Fig. 2 but the result was similar to Mo A 1) 9 The reaction with Mo A2 was GD 3 (NeuAc, HeuAc) GD 3 (euGc, NeuAc).
  • Results ⁇ shown in FIG. 3 is generally the same as the result of Xue immunostaining on TLC plate.
  • GD 3 Net c, NeuAc
  • Mo A3 which did not give rise to GD 3 (MeuGc, NeuA c) in the enzyme immunostaining method on TLC plate, were reacted in ELI ZA.
  • the reaction S also differs by 1% between the two methods.These are considered to be because the ELIZA method has a higher degree of imagination.
  • the reactivity of 13 pure lipids and 6 pure sugars and fats (5 nM) against the monoclonal antibody of the present invention was determined by killing with IA-adsorbed S-block.
  • the antigen titer shown in ⁇ 5 represents the reciprocal of the dilution when rosette formation was inhibited 502;
  • GD3 (NeuAc, NeuAc) 0 32 0

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Description

明 細 書
発明の名称
抗膣瘙細胞表面ガングリオシ ド特異的モ ノ ク 口一ナル抗体 それを達生.する. Λィプリ f—マ 産業上の利用分好
本発明は新溴なモノクローナル抗体とそれを産 ― 生する新規なハイブリ ドーマに閭する， 更に詳し くはマウスリンバ系臛躇¾抱で惑作されたマウス - の抗体産生細跑とマウス骨璲腫细跑との 合細胞 ： からクローン化して得られる、 マウスおよびヒ ト の 33¾¾胞の細跑衷面の種 共通の腫膳 S3速抗原 . であるガングリオシド、 特に G D 2 (Ga!NAc/31→
4(NeuAco£ 2→-8NeuAca 2→3)Gal β l-*4Glc-*Cer)
を特異的に認¾し、 かつ該腫 ¾¾胞に対して翱跑
傷害活性を持つモノクローナル抗体を産生するこ
とを特¾とする新規なハイプリ ドーマと該モノク
ローナル抗体に閲する。
なお、 ： こ こにおいてガングリオシ ドの名
前 〈G D 2、 G D 3など） は Svennerholniの命名法
- - Svenner olui, し. 」· Lipid Res. 5， 145-153(1
964〉〉 による Λ また、 G D 3のシアル '装 ^導体は
括弧の中に記した。 すなわち、 G D 3 (NeuAc， He
uAc)、 G O '3 (NeuAc, NeuGc)s G O 3 ( euGc, Ne z uAc)、 および G D 3 (NeuGc, NeuGc)はそれぞれ、
I l 3(NeuAc)2-LacCers f I3 (NeuAc a 2-→8HeuGc)-La cCer, I !3<NeuGcof2→8NeuAc)- cCer> I i3(HeuG c〉2_LacCerを; ¾味する。 そのほかの物質の名称は
1UPAC-IUB会 (iUPAC-IU8 Coraniission on 8ioc
emiocaf Nomenclature, Li ids 12, 455-463(197
7)) による。
.従来技術
モノ ク ローナル抗侔を用いてヒ ト廬瘍抗原を^ 折する試みは、 ハィブリ ドーマ法が確立された直— 後に始ま リ、 1978年に H.Koprowski らによって早 く も ヒ トメラノーマモノクローナル抗体の作製 が報告 (H oprowski et al . Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 2i 3405 (1973))された. この抗悪性膣 瘙抗体の報告は、 膣瘙特異抗原を特異的に認識し ている可能性から癀の診新、 治療という臨床分野 で大いに注目 され、 その後同様な靳究が数多くの 研究者によ y精力.的に行なおれてきた (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 76 1433(1979)、 Proc. Mail. Acad. Sci. USA, 77 6891(1980) , Br. J. Cancer , 43 596 (1981)) ,
当初、 こ う した研究は、 腫瘙抗原の抗原法定基 と して腫瘙細胞蛋白 を対象と して研究され、 それ に対するモノ ク ローナル抗体が作製されていたが それらの多く は、 正常細胞とも反応し膛瘙細胞に 対する特異性において満足できるものではなかつ た。 しかし得られたモ ノク ローナル抗体のうち比 較的腫瘍細胞に特異性の高い抗侔を調べていく う ち これらの抗体の多く が腥瘙細胞表面の糖脂賓、 糖蛋白質といっ た複合糖質の糖鎖部分を抗原決定 基と して担っている こ とが生化学分祈の結果によ リ次第に明かになってきた。 なかでも最近、 末端 にシアル酸を有する'糖脂賓， 即ちガンダリ シ ド (シアル酸を含む糖脂質）を抗原とするモノ ク ロ一 ナル抗体の有用性が示されてきている （Cancer Res. , 45 2405-2414 (1985)) . こう したガングリオシ ドで代表される腫瘙細跑 糖鎖を認識するモ ノ ク ローナル抗体の一部は既に 瘙の血清診靳の分野で既に応用され始めている， 例えば Koprosskiらによって見いだされた N-19-9 抗体- Science, 2Π 53-54 (1981)) は、 薛 の診 断に有用との評価を得ている。 この抗体は、 当初 シアル酸を含む糖鎖を 目的とする抗体と して開癸 されたものではないが、 その後の生化学分祈の結 杲シアル酸を含む糖鎮を認識することがおかつて きている。 この他に瘥の血清診靳で有用性を確か め られている抗体は、 現在までのところシアル酸 を含む篛鎮を特異的に認識するものがほとんどで あ る （神奈木 日本医師会雜誌 11 Ρίο2 200-208 (1986) , 神奈木 代謝 23. 141-154(1986)) β この よう に生化学的分折が進むにつれ膣瘙抗原と して ガングリオシ ドで代表される膣瘙細跑の表面糖鎖 の重要性が髙まつてきている， しかしそれに対す るモ. クローナル抗体に Κしていえば、 腫瘙耝^ に長短さまざまな特徴的なガングリォシ ドが多数 存在しているのにもかかおらず、 その大部分のガ ングリオシドに対するモノク ローナル抗体が作製 されていないのが現祅である， ガングリオシト'に対するモノク ΠΓ—ナル抗 は
G D 3に対しては Pukei C.S. et aし， J. Exp. M ed. 1133-1147(1982)や Kudelman, £， et al
,, j, 8iol . Chea, 257, 12752-12756(1982). G
D 2に対しては Cahan, L.O. et al., Proc. Kail
. Acad. Sci. USA 79, 7629-7833(1982). Cheres
, D.A. et al Proc. Natl. Acad* Sci . USA 8 丄, 5767-5771(1984), Cheung, N. . et aし, Can cer Res. 45, 2642-2649 および Saito M. et a! り Bioc em. Biophys. Res. Coo画， 127, 1-7(1 985)、 GM2に対しては Tai, T. et al . , Proc. Natil. Acad. Sci. USA 80» 5392-5396(1983〉や N a o! i , E. J . et aし， Cancer Res. 46, 4116-412 oCi 586 , 5·ΐνί 3 対しては Himbayashi , 丫. trt aし， J. Biol. Cheffl. 260. 】 3323- 13333( !985)の ような研究があり、 これらの知見はいずれも抗ガ ングリオシドモノクローナル抗体が神経外狂葉 -(
Neuroectoderm) 由来のメラノーマ、 神経芽腫 ¾胞、 グリオ一マと反応し、 正 ¾細胞とは反応しないこ とを示している そしてこれらのモノクローナル 抗体を産生するハイブリ ドーマの多くはヒ ト腫臛 細跑で想作させたマウスの抗体産生細胞とマウス 骨 ¾踵 ¾胞を ¾合する異種免疫の方法で作られて いる， ところがこの方法により得られるハイアリ ド一マのほとんどがヒ トの主要組遨遇応抗原系 ( Major H istocorapati b i I ί ty Complex) である H L Aも |g¾するモノクローナル抗体を産生するもの であって、 目的とする臛 ¾¾胞表面ガングリオシ ドに特異的な抗体を産生するものは 常にわずか W
； であって、 ク π
Figure imgf000008_0001
二ングのための作業 ¾極めて煩 雜なものにしている，
従って、 ¾ ^抗原として 露¾½表面ガングリ オシドに対して Sい特異性 ¾もつ抗体の開発は重 要な砑究対象でありながら作業の煩雑さもあって 進んでおらず、 薛床における通 irの絵断および治 瑷のためにも今後の 荬な研究琛 ϋとなっている β 問題点を 解决するための手段 そこで本発明.者らは、 朦 ¾¾胞のガングリオシ ドに特異的に反応するモノクローナル抗体の作成 ¾目的として研究を行なつたところ、 マウスリン パ系臆 翱胞で瘀作されたマウスの抗体産生細胞 とマウス骨 ¾ [趲 ¾!5との S合鎺胞からク σ
Figure imgf000008_0002
ン化 して得られるハイブリ ド一マから、 マウスおよび 'ヒ トの趲 ^ 胞の細孢衷面の棰間共通の踵. 閲連 抗 であるガングリオシド、 特に G D 2を转異的 に g し、 かつ該趙 に対して 活性 ¾持つモノクローナル抗钵 ¾見いだし、 本発明 ¾ 完成するに至った β 本潁発明のハイアリ ドーマの 作成に当たっては、 マウスの憨作に¾いる抗原に 同 ¾異系のマウス 1/ンバ系笾盜 を^いたため に、 異種のヒ ト ¾腸¾胞を抗原として用いる従来 の方法よりも遙かに ¾ぃ確率で目的のモノクロ一 ナル抗体を産生するハイブリ ドーマを得ることが 出来ることも大きな特徴である》 図面の ¾明
第 I S (A) は左からガングリオシド純品の混 合物 (GM 3 + GM2 + GM 1 + G D 3 + GD 2) および M14のガングリオシド分画を T L Cにかけ、 レゾルシノールで染色したものである， 第 1図 （ B ) は Mi4の T L Cにかけた後、 M 0 A Mo A 2および Mo A 3で酵鬵免疫染色を行なった ίί 果である β
第 2図 （Α〉 は 4¾類の GD 3を TL Cにかけ、 レゾルシノールで染色したものである。 左からガ ングリオシド钝品の混合 (GM3 + GM 1 + G D 3〉 、 レーン番号 1 は G D 3 (NeuAc, NeuAc：)、 レーン番号 2は G D 3 (NeuAc, NeuGc；)、 レーン番 号 3は G D 3 euGc, NeuAc)、 レーン番号 4は G D 3 (NeuGc, NeuGc) である。 第 2図 （S) と （C) はそれぞれ MoA2と MoA lによる Tし Cの酵 免疫染色の钴果である レーン番号と G D 3の 種類は第 2図 （A) と同じである， 第 3図は Mo A 1、 Mo A 2および Mo A3と ガングリオシド½品との反応性を EL I Z Aで測 定した結果を示したものである 各グラフ中で β ー粵は GD 2、 O— Oは GD 3(NeuAc， e )、
G D 3 (NeuGc, NeuAc)およ GT 1 a、 厶ー厶は G D 1 b、 ロー口は G T 1 b、 S— Sは G Q I b ▲一 Aは G D 3 (NeuAc, euGc)¾ GO 3 (NeuGc, NeuGc), G D I a、モノシァ σシルガングリオシド、 および中性塘脂 ¾¾袠わす。 第 3図 （Α— 1〉 は 抗原の各ガングリオシト" ½品;を段璲希釈してゥェ ルにコート し、 Μό Α Ι (10 ig/Bl) と反応きせ、 ¾Sで揉羝された抗マウス I 抗体と更に反応させ たもの。 第 3図（A— 2) は一定 ¾のガングリオ シド （0，1 さ/ゥェル〉 に対レて段階希轵された M o A lを加えた後、 ( A- 1 ) と同様の操作 ¾行 なったもの。 第 3図 （ B— 1〉 と （ B— 2 ) は M 0 A 2についてそれぞれ笫 3図 （ A— 1〉、 (A 一 2) と同様な ¾作を行なったもの。 第 3図 （C 一 1 ) と （ C一 2) は Mo A3にっぃてそれぞれ 篥 3図 （A—：！） 、 （A— 2) と同様な操作 ¾行 なったものである。 発明の構成
本発明のモノクローナル抗体は、 発生学的にヒ トの神経堤 ( neura l crest) 由来の ¾S.強細胞に分 類される腫凝細抱衷面のガングリオシトを正^細 胞と区別し： 特異的に 32 する そして g識する ガングリオシドを更に烊しく述べると、 G D 2に 共通してかつ も強く反応する。
本発明のモノクローナル抗体は、 マウスリンパ 系腫腸細胞で惑作されたマウスの抗体産生細胞と マウス骨 ¾ [腥 ¾胞との ¾合細胞からクローン化し て得られるハイプリ ドーマを培 ¾して製造ざれる。 本発明のハイプリ ドーマは、 まずマウスリンパ 系臛魔細胞でマウス ¾慼作する * マウスリンパ系 ¾¾5¾胞としては、 慼作きれるマウスと異系でか つライン化されたものであれば用いることが出来 るが、 その細.？ S学的性 ίが比鉸的良く調べられて いることが望ましい。 マウスリンパ系腫 ¾ ¾孢を マウスに憨作するに ¾しては ¾ S内もしくは皮下 0 に 10δ〜ί 07細跑ノマウスで 1 〜 2 ¾ f8! に数回接 植することにより兔¾する β 最終免疫後、 1 ~ 5 Β後に脾趫を取り ffiし抗 体産生細胞と し親細胞と ¾合させハイプリ ドーマ を得る · .
親鈿跑と しては、 適切な遘択マーカーを持つマ ウスミエローマ- が適当である， ハイプリ ドーマ作製には、 親細胞であるマウス ミエローマ と抗体産生細胞を適切な割合で用意 し、 敲合剤を用いて行なう通常-の方法を使用する 齄合剤と してポリェチレングリ コール等が、 割合 と しては 1 ： 3 - 1 ： 5 が ¾当である。
こう して得られるハイブリ ドーマは、 公知の方 法である限界希^法でク ローニングを操り返し安 定した単一のハイプリ ドーマを選び asす， ついで 巨的とする膣瘙細胞に障害性をもつ抗^産生をチ エ ッ クすることで本発明の抗^を産生するハイブ リ ドーマを得る ことができる。
こう したハイブリ ドーマの抗^產生のスク リー ニングは、 ハイプリ ドーマを培養した培養 清に マウス T細胞 EL4と良質なゥサギ血清襦^を用い た公知の方法である直 ¾法細跑障害性試験または 培養上清に神経堤 （neural crest) '由来のヒ ト腫 瘍細胞と希釈したモルモ ッ 卜血清補体およびヒ ト 0型赤血球の補体受容体を用いた免疫轱着反応試 験いずれかによ り行なう . こう して得られる本発明のハイ ブリ ドーマでモ ノ ク ローナル抗钵を製造するために、 必要に応じ て培養容器中 (in vitro) または動物の腹腔 (in vivo) を利甩 し培養し、 高抗体価のモノ ク ローナ ル抗体を得ることが；^きる。 in vitroO場合、 '通 常の培地に FCSを添加したものでよ く、 in vivoの 場合、 ハイプリ ドーマをヌー ドマウスの腹腔内に 接種し？〜 14日後に腹水を採取し得る。
本発明の腫瘙細胞表面のガングリオシ ドを特異 的に認識するモノク ローナル抗体の精製は、 琉安 分画、 ゲル口過、 ァフィ 二ティ ーカラム等の公知 の方法を適宜耝み合おせて行なう a
本発明では、 このよ う に して同様の特異性をも つ 3つのモノ ク ローナル抗体およびハイブリー ド 一 έ、得-た a 2
こう しで得られる抗体は、 -ヒ ト—ダリオ一マ， ヒ ド神経芽颍胞邇、 ヒ トメ ラノーマ等で代表される 生学的にヒ ト神経堤由来の細胞が腫瘙化したも のと特異的に反応し正常細跑とは反応しない， こ の特異性は、 ヒ ト神経堤由来の邋瘙莉跑およびマ ウス由来の廬瘙細胞の一部に対して共通なもので あ る * また抗钵は、 ヒ ト神経堤由来の膣瘙细胞に 対する抗原法定墓と して、 熱処理した神経堤由来 の腫.瘙細胞との免疫 着阻止反応， シァリダーゼ 処理し 膣瘙細胞との反応性の消失、 ガンダリオ シ ド分画との免疫轱着阻止反応の結果よ リ ヒ トの 神経堤由来の腫瘍細胞表面のガングリオシドを特 異的に認識しているものである · 更にこれらのモノクローナル抗体が ¾|¾してい る微鏞铼造 ¾決定するために、 クロマトグラ フィー （以下 T L Cと称す） 上での篛棻兔 ©染色
法、 ¾素兔^ ¾蓄法 ぐ 下、 Eし I Z Aと称す） 、 糖 is¾%品 いた I AS止 ¾袅 ¾ ίϊなつたとこ ろ、 3つのモノクローナル抗体は するガング
リォシドに若干の差異が δるが、 共通 てかつ ¾ も強くガングリオシド GD 2 ¾誌識していること
が判明した このよう に して得られたヒ ト神経堤由来の腫瘙 細胞に特異的に反応するモノ ク ロ ーナル抗体は、 血清検査、 組識診靳、 イ メージング等による腫瘙 の診靳等に利甩しう るもの と期待される。
以下実施例によ り本発明を更に具体的に説明す る。
実施例 1 ハイブリ ドーマの作製
A系マウスに C57BLマウス由来の T細胞腫瘥 EL4、 107cellsZマウスを 1 、回 週、 4週間におた り腹 腔内接種し、 最終接種後 3 日 目 に脾臓を摘出 し、 細胞浮遊液と して調整した。
一方融合の親細胞と して BALBZc系マウス由夹 の ミ エローマ NS. 1 を 107 cells培養し用意した。 融合は公知の方法 （Nature, 256 495 (1975)) に 従い以下の通り行なっ た。
上記で諝整したマ ウス脾艤細胞と ミ エローマ^ 胞を 5 ： 1 の比率になるよ う に遠心チューブに g 年
合し、 遠心した後上清をすて， RPHI1640 (GIBC0¾: 製） で 40 % に調整したポリ ェチレングリ コール (平均分子量 4， 000 Merck社製） を 0.2 i2 加え 2分 間よ く混合した。 その後 5 D ^の培地を 1滴づっ 3 分間で加えて希^し、 遠心分 H (500rpm, 5分） し 上清をすてた。 次に細跑を H A T培地 (i¾PHI1640 培地に 102 F C Sに終濃度でヒポキサンチン 10- ¾. ァ ミ ノブテリ ン 4 X 10-7M、 チミ ジン 1·δ X 10~S を 加える） に浮遊させ, 六マイ クロブレー トに約 100 づっ分配して培養した。
培養 3 日 目 と 6 日 目 に HAT培 ¾で培 ¾交換を行 ない、 それ以後は 3 B毎に H T培 ¾ (HAT培地の组 成からアミ ノブリテンのみを除いた培地） で培地 交換を行 ¾つた，
このよう にしてコロニーの形 が十分観察でき るよう になる と（10〜： 14 S後）、 培養上清中の抗^ 活拴を良賓なゥサギ血清禧体を Sいた直接細胞漳 害試験法にてスク リーニングした， - - 直接翎胞障害試験法は、 C57BL マ ウ ス由来の T 細胞膣瘙 EL4浮遊液 20 μ S、 ゥサギ血清禧 20 β 1、 5
培養上清 を 37て、 45分混合し細胞障害性の 有無によ り行なっ た。
スク リーニングしたハイ ブリ ドーマ 48S偭のう ち EL4細胞に対して反応するものが 14假得られ， そのう ち 3個のハイブリ ドーマについて、 9S穴プ レー ト を用いて限界希轵を行ない安定なク ローン を得るためにク ローニングを籙リ返し、 安定で単 一なソヽイブリ ドーマ A 1 、 A 2、 A 3 を得た。
ォク タ ニー法を用いて各ハイブリ ドーマの産 生するモノ ク ローナル抗^の免疫グロブ—リ-ンク ラ ス を決定 し たと こ ろ ， A l 、 A 2、 A 3.の産生 するモ ノ ク ローナル抗体はそれぞれ （IgM、 κ )、 (IgM, κ )、 (IgG3, x ) であっ た。
実施例 2 · モノ ク ローナル抗体の精製
ΒΑし 3Zc系の ヌー ドマ ウス 3 匹の腹腔に 0.5nii2ブ リ ステンを各投与し 7 日後に A 1、 A 2 , A 3各 々約 5〜； L0 X 10S cellsを先に用意したヌー ドマウ スにそれぞれ接種し腹水化を行なっ た， 1 〜 2週 間後に腹水を採取し、 3， 000rpm， 15分の遠心分雞 G
で上層のプリステン層と細胞瑰とを除いた中間層 を回収して保存した。'
腹水よ りの抗体成分の精製は以下の方法によ り 行なった。
琉酸ァンモニゥムを終濃度 50% となるよう に腹 水溶液 IQmiに加えて塩拆し、 10,000r∑)m, 30分間 の遠心分雜沈嚴钫を P B S (O.OlfTリ ン酸鍰葑液、 0.15M NaClを含む、 pH7.2) 鋟銜液
Figure imgf000018_0001
溶薛し、 同液 l に对して透？ を 3回缲リ返し各免疫グロブ リ ン画分と した；
こう して得た A 1 と 2の免疫グロブリ ン画分 を F B S (( 01«リ ン酸緩銜液， 0.15¾ NaCl, PH 7.2) 緩衝液にて平衡化したセフ アデックス G-200 カ ラムに負荷し， 最初に溶 Sする面分 （ボイ ド画 分）を回収し精製 IgM抗体と し、 得られたモノク ^ ーナル抗体を ίίοΑ Ι , MoA 2 と した， 次いで A 3の免疫グロブリ ン画分を 0,04M リ ン 酸緩衝液 （0.03M NaClを含む、 ΡΗ3·0)に対して十 分に透祈した後、 同緩箭液で平衝化したイオン交 換撐脂 DS52カラム（ヮ トマン製）に負荷し、 DS52 に未 着靣分を回収し、 ； P B S緩衝液に透折した /JP87/00690
7 ものを精製 IgG抗俸と し， 得られたモノク ローナ
ル抗体を MoA 3 と した。
実旃例 3 モノ ク ローナル抗体の特異性の検討
(a) 精製された Ho 1 , Ho A 2 , ΜοΑ 3 について
種々の腫瘙細胞株に対する反応性を検討した。 マ
ウス廬瘙铢との反応性試験は、 良賓のゥサギ血清
摇体を用いた直接法細胞障害性試験を ヒ ト膣瘙採
との反応性試験は希^したモルモッ 卜血清捕体お
よびヒ ト◦型赤血球の補体受容体を用いた免-疫粘
着反応試験によ り行なっ た。 結杲を表 1および表
2 に示す。 マウス腫瘍株では、 HoA l が EL4細胞お
よび RB L 5細胞と反応し、 MoA 2、 MoA 3 が RBし 5細跑
および細胞と反応した。 ヒ ト腫瘍株では、 60種の
細胞株との試験で， Mo A 1、 MoA 3 がグリオ一マ，
メ ラノーマ、 肺痉よ りの細胞株と反応し、 Mo A 2 がその他に神経芽細胞腫よ り の細胞採とも反応し
た。 この結杲— Mo A 1 , Mo A 2 , ΜοΑ 3 と も ヒ トの神
経堤由来の腫瘩細胞株およびマウスの腫瘙細胞採
の一部と反応する こ とが確認された 表 1 マウス膣瘥細跑株との反応性試袞
マウス 由 来 反 性 腫瘍細胞株 ?io A 1
Figure imgf000020_0001
ΜοΑ3
EL 4 Τ繊 + + +
RBし 5 Τ繊 + +
. BPC 4 Τ纖 一 + 卞
EMG 2 ミエローマ
ERLD τ纖
70Z/3 Β細胞
416 B 幹細跑 .
8057 巨核芽球白血病 一
3072 侵性骨髓白血病
RLM 1 Τ繊
BALBRV1 Τ雌
BALBRVA . Τ繊
LSTRA noloney fa J 一 一
CMS- 鎳維肉遁
CHS17 線錐肉腫
C14 肉膣
B6RV1 T繊
L1210 -
P815 マス卜サイ卜一マ 表 2 ヒト腫瘙钿跑-株との反応性試験 ヒト膣瘙細胞株 反応性 の由来^組織 MoAl Mo A 2 MoA3 グリ才一マ 9/14 13/14 5/14 メラノーマ 1/2 2/2 1/2 肺^
小細胞 2/9 1/7 1/8
. 葸平上皮瘙 0/4 2/4 0/4
0/5 2/5 1/6 その他肺 ;ΐ 0/2 0/2 0/2 神経芽細胞腫 0/3 2/3 0/3 胃瘙 0/6 0/2 0/6
0/2 0/2 0/2
0/1 0/1 0/1 肝窑 0/1 0/1 0/1 迄 0/2 0/2 0/2 膀 ¾i 0/2 0/1 0/2 肉腫 0/2 1/3 0/2
®頭^ 0/1 0/1 0/1
0/5 0/6 0/6
Ρ n. d . 0/4. n.d .
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
(b) 正常經胞にますする反応性の試襞も同接に行 なった a oAl, MoA2, oA3いずれもマウスの正常 翘膛とは反応しなかった。 表 3 に結杲を示す，
3
B d、 ¾
¾ 胞
MoAl HoA2 ΜσΑ3 胸腺細胞
脾饞細胞
リンパ節細跑
骨髄細胞 - 実施例 4 モノ ク ローナル抗体抗原決定基の検討 Μο 1、 o A 2および »oA 3 について認識する抗 原搆逡を決定する ため に ヒ 卜 メ ラ ノ ーマ細胞株
UCLAS0-M14 (以下 M14と称す）を標的と した免疫轱 着反応（以下 IAと称す）、 IA阻止試綮， IA吸着試験 を行なつ す:、 . ，
(1) IAの方法
あ らかじめ^下の組威のヒ 卜アルブミ ン含有べ 口ナール緩衝液 下 と称す） を調整してお いた。 . ヒ 卜血清アルブミ ン（ミ ド リ 十字） 4πιΰ 0.03Ν CaCl2 2.5nu2 0.1M MgCl2 2.5mH
Figure imgf000023_0001
0.1 g /πιΰ Glucose 5mJ2 ベロナール緩衝液（ X 5) 100mj2 (25m バルピタール、 pH7.5、 0.73 NaCl) 1 10s cells/m<2 <7) M14 25 ;i £と抗体溶液 を加え、 7てで 30分間振と う しながら反応させた HAVB 0.8mj2を反応液に加え、 l， 400rpm、 5分間 遠心分離を行ない上清をすて， 次いでこの揍作を 3 回鎳リ返し細胞の铣浄を行なっ た。
次に 1ノ 32に希^したモルモ ジ ト捕体 25 ;t J2を加 えて 37°C、 35〜40分間握と う させながら反応を行 なっ た。
続いてヒ 卜 0型赤血球 3 X 107cells/maを 25 i2 を加え、 更に 37てで 10分間振と う しながら反応さ せ、 最後の 20分間は静置して反応させた。
(2) IA吸着試験による熱安定生抗原の判定
14, 5 X I0scellsを Ο.ΐιηΰの ·培地に淳遊させた ものを 2つ用意し、 一方を 100 、 5分閒加熱処 理した a %z 各々 に Ηοΐΐ抗体溶液を 0. Ιιιβ加えて 4 で 1晚 吸着反応を実施した。
反応後、 2，000rpra、 10分間遠心分齄を行ない、 上清 ( i を先の IAの方法に従い IA吸着試験に洪 した， .
同様に fioA 2 および ϋοΑ 3 についても反応させた， " その結杲どの抗体も反応を示し， 結合部位が爇 安定抗原、 即ち篛賈抗原であることが云された。
(3) シァリダーセ'処理腫瘍細胞との反応
Μ14、 1 X 10s cells /mlを 1 mil取り， シァ リ ダ一 一
セ' （シグマ ¾製) を 1単位加えて 37 で 2時間反 応させた後、 細胞を培地で ¾浄し、 これをシァリ ダーゼ処理細胞と して爾い 。
シァリ ダーゼ処理細跑を標的と して floA 1、 oA 2および MoA 3 の反応性を、 先に示した IAの方法 によ り調べたと ころ、 いずれも反応が消失した
このことよ リぃ.ずれの抗 *も抗原決定基にシァ ル蝥を含むことが確認された。
(4) ガングリオシ ド分画を用いた IA阻止試漦
¾14よ り Svennerho-laiらの方法 diochen . Biophy s . Acta. 617 97-107(1930)) に準じて総脂質画分の Z3
抽出、 DEASク ロマ トグラ フィ ー、 アルカ リ 処理、 ィ ァ ト ロ ビーズ力，ラム ク ロマ 卜グラ フィ 一によ リ 精製 した。
精製ガングリ オシ ド画分を抗^溶液に S nmolま たは 10 ηιποΐと なる よ う に加えた後， M14と の Πを 行なっ た
その結果 JloA 1 、 οΑ 2 および？ ΙοΑ 3 とも ΙΑ反応 が阻止された。
またガングリ オシ ド画分を 1 %酢酸で 100 、
1 時間処理してシアル酸の搆造を破壊した後、 各 抗体溶液に加え 試験を行なっ たと ころ、 ΜοΑ 1、 ΜοΑ 2 および ΜοΑ 3 と も ΙΑ試験が阻止された，
こ の こ と よ リ いずれの抗体も その抗原決定基に シアル酸が関係 してお り 、 腫瘍細胞のガングリ オ シ ドであ る こ と が確認された。 モノクローナ
Figure imgf000025_0001
原决 の M 樓 挨^
更にこれらのモノクローナル抗^が a してい
る を'决定するために、 薄; ¾クロマ トグラ
フィー （以下 T L Cと称す） 上での餑¾免疫染色
法、 穽¾免疫吸着法 （以下、 E L I ZAと称す） 、 1 第 質 ¾品¾甩いた i 止弑鼓を行なった。
( 1 ) TL Cの方法
メルク a製のシリカゲル ¾塗布済みの τ L cブ レ一ト Γシリカゲル 60上 （13：ざ 200 /im) と同じ くメルク社製のシリカゲルを塗布済みの T L Cブ ラスチヅクシ一トを使用した， クロマトグラムの 展閗溶媒はクロ フオルム Zメ クノールノ 0-22 ， aC 水溶液を容稹比 としたものを甩ぃ た β T L Cブレート上に展閣されたガングリォシ ドの染色にはレゾル、ンノール (resorcinol) 染色 も、 中性糖 Μ の染色にはオルシノール （orcino I) 染色を ¾ぃた》
(2〉 TL Cブレート上での薛素免疫染色法 ガングリォシドの T L 了後、 TLCブレー ト ¾ゥシ血滑アルブミン とボリビニ一ルビロリ ドン (poi vinyl yroi idone) IXと 含有する矮酸 緩街迄溶液に Sした》 空気中で圪燥さ た後、 ブ レートをモノク σ ナル抗体溶液 と 2 時¾25てで反応ざ た * 次に浚 缓衝塩溶液 （以 下 P8Sと称す〉 を 5回交換しつつその中でク Gマト グラムも洗浄した。 そして西洋ヮサビペルォキシ ダーセ 合させたャギ抗マウス I および I
Figure imgf000027_0001
gM抗体をこのクロマ トグラムとお' Cで 2時閗反 応ざせた。 再び P8Sを 5回交換しつつその中でクロ マトグラムを洗淨した。 染色に当たっては
/nlの 0-フエ二レンジァミンと 0.122の通酸化水素 を含むクェン酸-燐酸 ¾Φ液 （pH5.0、 80m«) を用 い、 15分間反応ざせた， その後、 水に浸して反応 を停止ざ た
( 3) JvU4のガングリオシド分画と糖 質 ½品の 弱製
M14のガングリオシド分画の調製は Tai, T. et aし， Proc. Nat! . Acad. Sci . USA 80, 5392-53
96(1983)に従った ·
ガングリオシド GM 1、 G D l a、 G D 】 b、 G T 1 bはウジの脳から調製し、 Kanfer, J.N. M ethods Enzyisol . , 660-664(1963)に従って精 した。 G Q 】 bはャト ロン社から隳入した。 ヒ ト
¾の GM3はスウェーデンの Got 大学の S vennerhola博士から入手した * GM2と G D 2は それぞれ GM2と GD 1 bから、 ゥシ ¾丸 ? -ガラ ク トシダーゼ 〈アメリカのミシガン大学の J, V. Jourdian博士から入手） ¾ ^いて調製した ヒ ト ミエリンの GM4とヒ ト脳の G T 1 aは東京都 S
Figure imgf000028_0001
床医学総合研究所の有¾博士から入手した ， クマ 赤血球の G D 3(fieuAc, NeuAc), GD 3 (HeuAc, NeuGc)^ G O 3 (NeuGc, NeuAc)^ および G D 3 euGc， NeuGc)は東京都臨床医竽総合研究所の構本 博士と鈴木明身 士から入手した β UcCer. GgOs 3Cer、 および GgOsaCerはそれぞれ GM3、 GM 2, GM 1 から弱酸で処理レ、 ィァトロビーズカラム ク口マトグラフィ一で精製して調製した。 GlcCer は Tai, T. et a , Proc, KatK Acad. Sci . USA
80, 5392·5398(1983)に従って調 gレた; GbOsaC erと GbOs^Cerは Supelco社ズァメリカ、 ベンシルバ ニァ州、 ベラフォンテ〉 から購入した a
(4) MUのガングリオシドとモノクローナル抗 体と ¾反応きせた TL Cブレート上での薛素免疫 染色法の钴果
第 1図に示すように Mo A 1 と Mo A3は Mi4 の G D 2とのみ反応し、 M 0 A 2は G D 2と G D 3とに反応している a
(5) ガングリオシド¾品とモノクローナル沆体 とを反応ざせた TLCブレート上で ¾繁免疫染色 法の銥果
¾品のジ一、 ト リーおよびテトラーシァ口シル 一ガングリオシドとモノク σ—ナル抗体との T L Cブレート上で铮袞免疫染色法の掊果を表 4に示 す，
¾ - 反 性
ガングリオシド Mo A l M 0 A 2 M o A 3
G D 3 +
G O 2 + + + + G D 1 a
G D 1 + +
G T 1 a + + + + G T 1 b
G Q 1 b + + + + G T 3
G T 2
GM4
GM3
GM2
GM 1
GicCer
LacCer
G«0s3Car
GgOs^Cer
GbOsiCer
GbOSiCar
+ + +： 強い、 + +： 中程度、 +： 弱い、 若しく は痕^程度、 - ： 陰注
Figure imgf000030_0001
表 4から分かるように本願発明のモノクローナ ル抗体はいずれも乇ノーシァ πシルーガングリオ シド （ G M 4、 G 3、 G Μ 2および G Μ 1 )、 および中性糖脂篾 (G!cCers LacCer、 GgOs3Cer、 GsOSiCer G&GssCerおよび GiiOs Cer) とは反応し ない,
次に各モノクローナル抗体の反応性の特徵を述 ベる
Mo A 1は GD 2とのみ反応し、 他のガングリ オシドとは反応しない。 GD l bは G D 2の榱造 に 1锢のガラク トースが付け加わっているだけで あり、 また GM2と G D 3は G D 2の株造からモ れぞれ 1儸の N—ァセチルノィラミン致または 1 個の N—ァセチルガラク トサミンが欠損している だけであるにもかかわらず、 M 0 A ίはこれら 峻別して G D 2とだけ反応している。
Μ 0 Α.2は euAcな 2→3'e'jAc 2→3Ga 1という三 糖櫞逭を持つ G D 3、 GD 2、 G O l b. G T l a、 G T l bおよび G Q 1 &と反応し、 他のガン グリオシドとは反応しない。 聂も強く反^するの が G D 2であり逆に Sも反応が弱いのは G T ！ b である * G D 2にガラク トース ί儸が付加された G D 1 bは反応性が弱くなり、 GD l bに更にシ アル酸が末端ガラク トース残基に付加ざれた G T 1 bはもつと反応性が落ちる この知見からシァ ル酸が末端のガラク トース残基 （G D 〗 b〉 や末 端のシアル截残基 (G T 1 b) に付加することに よって、 抗原決定基である NeuAcな 2→8NeuAc<22→ 3Gaiはマスクされることが示 ¾される。 一方、 G T 1 bの末端シアル羧残基にシアル發が付加した G Q 1 bは G D 1 bのレペルまで反応性が回復す る G T 1 aの反応性は G Q 1 bと同程度である から、 G Q 1 bの認識郞位は末雉の三糖であるは ずである， 以上から、 Mo A2はガラク トース残 基 〈塌所は内部、 末端 ¾問わない） に ¾合したジ シァロシル残基 rNeuAca2→8NeuAca2→3j ¾g ¾していることが判明した。
MoA3は G D 2、 G T l a、 G Q l bとのみ 反 ffiしている * 次に 4種類の GD 3 ( G D 3 (NeuAc, NeuAc). G D 3 (NeuAc, NeuGc)^ G D 3 (NeuGc, NeuAc)、 および G D 3 (NeuGc, NeuGc)) とモノクローナル 抗体の TL Cブレート上で鎵 ¾免疫染色法の钴果 は第 2図に示されている， Mo A2のみがこれら の一郎と反応しており、 MoA l と Mo A 3は全 く反応レなかった （なお Mo A3は第 2図に結果 ¾示していないが ¾果は Mo A 1と周様であった） 9 Mo A2と反^したのは G D 3 (NeuAc, HeuAc) と G D 3 ( euGc, NeuAc)である。 この钴果は M ο A 2のガングリオシドの^ ¾には三塘の内 SiJシァ ル餒が必須であり、 かつ該シァル鼓は NeuAcB^で なければならないことを示している。 内部シアル 漦が NeuAcでなく、 KetiGcの時は S¾ざれていない。 一方、 末端シアル酸残基は NeuGc、 NeuAcのいずれ ' でも Mo A 2に g|¾されている。 すると Mo A2 の抗原決定甚は Si a 2→8NeuAca 2-*3Ga 1残基とな るはずである
( 6 ) E L I Z Aの方法
98穴ボリスチレン · マイクロタイタ一♦プレー トを使用し、 エタノールで段 希釈した塘脂 ¾¾ 各穴に 50 i〖づっ入れた β モノクローナル抗体はヒ ト血 アルブミン 12¾含む1^5で希^した。 第 2抗 体としてはベルォキシダーゼ ¾铳合さ^た、 ャギ 抗マウス ί S Gおよび Γ 抗 ¾：¾招いた s
(7) 品による Sし I 2 の¾果
果¾第 3図に示す β 全般的に *つて T L Cブ レ一ト上で薛¾免疫染色法の結果と同搔である。 しかしながら T L Cブレート上で酵素免 ¾染色法 では G D 3 (Net c, NeuAc)と G D 3 (MeuGc, NeuA c〉を g¾しなかった Mo A3が E L I ZAでは反 応している。 また GQ 1 bの反応 Sにも両測定法 の 1¾で差がある · これらは E L I Z A法の方が想 度が ¾いためであると考えられる <·
(8) 1 A¾¾阻止轼¾
段港希釈した各種塘脂質抗原 50 Iと抗体 50/ 1 を ¾合し、 該«合液を 4てで一! ¾反応させた Λ その 後 3.0ΧΙ04 個の M14を含むパルビツール酸瑷 ¾ί 塩溶液 25 Η¾加え、 I A吸蓊試験を行なった。
(9) 1八吸¾阻止試験のお果
13種の羧性镩脂質と 6種の中性糖脂買の純品（5 nM)の、 本願発明のモノクローナル抗体に対する反 応性を I A吸着 S止轼 ¾の¾果で弑桀した拮果を 衮 5に示す， 衷中の抗原タイターはロゼッ ト形成 が 502；阻害されたときの希 话率の逆数を表わす。 3
表 5
抗原タイター
ガングリオシド MoAl MoA2 MoA3
GD3(NeuAc, NeuAc) 0 32 0
GD3(NeuAc， HeuGc) U 0
G03(KeuGc, NeuAc) 0 0 0
GOSCNeuGc, NeuGc) 0 0 0
G02 64 256 256
GDla 0 Q 0
GOlb - 0 16 0
GTla 0 8 2
GTlb 0 2 0
GQih 0 8 8
T L C上の ¾素免疫法による 果とおおむね同 様の珐果である。 Mo A 1と との钴合は G D 2によってのみ Sihされた Λ Mo Α2の場合ば三 糖椽造も有する 7種のガングリオシドにより、 様 々な程度で 害された。 中でも GD 2が最大の、 G T l が最小の SI1を示した。 M 0 A 3 ¾ G D 2 G T 1 aおよび G Q 1 bの 3種のガングリオ ドにより阻寄された β Μ 0 A 3でも002が¾ 大の阻 ¾活性を有している， 3 以上の钴果をまとめると、 表 6のようになる < 袠 6
モノクローナル抗体 反応するガングリオシ ド
Mo A 1 G O 2
M o A 2 G D 2 > G D 3 (NeuAc,Neu
- Ac), G D 3 (NeuGcNeuAc), GD l b ,G T l ,G Q l b > G T 1 b
M o A 3 GD 2 > G T l ,G Q l b

Claims

3f ' . 請求の範囲
C1) マウスリンパ系腫 紺胞で憨作されたマク スの抗体産生細胞とマウス 臚細胞との狨合細
鉋が産生する、 クスおよび トの譴麋細胞の細 胞袠面のガングリオシドも特異的に認 し、 かつ
該 廯¾艇 対レて 胞. 赉 .性を-持つ と^镜
滎-とす-る乇ノク ーナル抗体 a
： (2) マ ウス リ ンパ系膣瘙細胞が T莉胞 铮 E 4である とを特徵とする特^ 請求範囲第ェ項記載のモノ ク 口 ナル抗律。
(3) 感作ざれたマウ スが A系マウスであることを特徴とする转許讅求
の範囲第 1項に K戴のモノクローナル抗钵
(4) ヒ ト腫臛細跑が神玆堤 （neural c
rest) 由^の踵膣細跑であることを特徴とする待 許講求の Ιδϋ第 1項 3S載のモノクローナル坑法,
(5) ¾飽衷面のガン
グリオシドが GD 2であること ¾特徴とする持許 一
§f求の範通笫 1項 載のモノクローナル抗^,
- (6) マウスリンパ系踵 ¾¾跑で^^き
れたマウスの抗体産生^跑と.マウス骨 ¾贖¾泡と の ¾合¾胞からクローン化して得られる、 ウス および bの1^¾砲の ½表面のガングリオシ ドを特異的に S¾し、 か-つ ¾ ^ 対して箱
J SSeitを モノクローナル抗体を產生する ことを特徴とするハイプリ ドーマ，
(7) ' マウスリンパ系踵饞細胞が T細抱 病 抹 Eし 4であることも特微とする特扦 謬求の IS函第 6項紀載のハイプリ ドーマ， ) 想作されたマウ スが A系マウスであること 恃^とする特許請求 の範囲第 6項に ss载のハイ： rリ ド マ。
(9 ) ヒ トほ が神轻^ ( neura l c rest) 由来の腫藤轴胞であることを特徴とする特 扦 S求の範囲第 6項 S3載のハイプリ ドーマ。
1 0) 銦胞表面のガ ングリオシドが G D 2であること ¾转徵とする特 扦 I»求の 1§蹈第 S項纪¾のハィプリ ドーマ，
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