JPH0530991A - 抗ガングリオシドモノクローナル抗体 - Google Patents
抗ガングリオシドモノクローナル抗体Info
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- JPH0530991A JPH0530991A JP3191589A JP19158991A JPH0530991A JP H0530991 A JPH0530991 A JP H0530991A JP 3191589 A JP3191589 A JP 3191589A JP 19158991 A JP19158991 A JP 19158991A JP H0530991 A JPH0530991 A JP H0530991A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 各種のガングリオシドに対して反応性を有す
る抗ガングリオシドモノクローナル抗体が提供される。 【構成】 ラクトン型ＧＤ３ガングリオシドによりマウ
スを免疫し、その脾細胞とマウスミエローマ細胞とを融
合することにより、各種のガングリオシドに対して反応
性を有する抗ガングリオシドモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマが得られる。このモノクローナル抗
体は黒色腫などの癌の治療薬として用いることができ、
また癌のイメージングにも利用できる。
る抗ガングリオシドモノクローナル抗体が提供される。 【構成】 ラクトン型ＧＤ３ガングリオシドによりマウ
スを免疫し、その脾細胞とマウスミエローマ細胞とを融
合することにより、各種のガングリオシドに対して反応
性を有する抗ガングリオシドモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマが得られる。このモノクローナル抗
体は黒色腫などの癌の治療薬として用いることができ、
また癌のイメージングにも利用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、黒色腫、神経芽細胞
腫、膵癌等に分布する各種のガングリオシドを幅広く認
識する抗ガングリオシドモノクローナル抗体に関する。
更に詳細には、本発明はガングリオシドＧＭ４、ＧＭ
３、ＧＭ２、ＧＭ１ａ、ＧＭ１ｂ、ＳＰＧ（α２−
３）、ＳＰＧ（α２−６）、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１
ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ３と広く反応する抗ガングリオシド
モノクローナル抗体であって、黒色腫、神経芽細胞腫、
膵癌等の治療薬として用いることのできる抗ガングリオ
シドモノクローナル抗体に関する。
腫、膵癌等に分布する各種のガングリオシドを幅広く認
識する抗ガングリオシドモノクローナル抗体に関する。
更に詳細には、本発明はガングリオシドＧＭ４、ＧＭ
３、ＧＭ２、ＧＭ１ａ、ＧＭ１ｂ、ＳＰＧ（α２−
３）、ＳＰＧ（α２−６）、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１
ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ３と広く反応する抗ガングリオシド
モノクローナル抗体であって、黒色腫、神経芽細胞腫、
膵癌等の治療薬として用いることのできる抗ガングリオ
シドモノクローナル抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】癌関連抗原としてのガングリオシドを認
識するモノクローナル抗体は、これまでに抗ＧＭ３であ
る抗体Ｍ２５９０（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７５，
４１８−４２６，１９８４）及びＤＨ２（Ｄｏｉ，
Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４８，
５６８０−５６８５，１９８８）、あるいは抗ＧＤ３抗
体Ｒ−２４（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．，ｅｔ ａ
ｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８２，１２４２−１２６４，１９８５）、抗ＧＤ２抗体
Ｌ７２（Ｉｒｉｅ Ｒ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．
Ｎａｌｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，８６９４
−８６９８，１９８６）などが報告されている。これら
のモノクローナル抗体は黒色腫の治療薬として開発が進
められている。
識するモノクローナル抗体は、これまでに抗ＧＭ３であ
る抗体Ｍ２５９０（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７５，
４１８−４２６，１９８４）及びＤＨ２（Ｄｏｉ，
Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４８，
５６８０−５６８５，１９８８）、あるいは抗ＧＤ３抗
体Ｒ−２４（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．，ｅｔ ａ
ｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８２，１２４２−１２６４，１９８５）、抗ＧＤ２抗体
Ｌ７２（Ｉｒｉｅ Ｒ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．
Ｎａｌｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，８６９４
−８６９８，１９８６）などが報告されている。これら
のモノクローナル抗体は黒色腫の治療薬として開発が進
められている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】黒色腫、神経芽細胞
腫、膵癌は、悪性で転移し易く、その治療は他の癌と比
べて困難であり、その治療法の開発は臨床医の切望する
ところである。従来報告されている、抗癌抗体としての
抗ガングリオシドモノクローナル抗体は、各々抗原認識
特異性が高く、特定の腫瘍の特定の集団に対しては著効
を示すが、同種の腫瘍全般に対して効果を持つとは言い
難い。ましてや、多種類の腫瘍に対して効果を持つこと
は殆ど無い。
腫、膵癌は、悪性で転移し易く、その治療は他の癌と比
べて困難であり、その治療法の開発は臨床医の切望する
ところである。従来報告されている、抗癌抗体としての
抗ガングリオシドモノクローナル抗体は、各々抗原認識
特異性が高く、特定の腫瘍の特定の集団に対しては著効
を示すが、同種の腫瘍全般に対して効果を持つとは言い
難い。ましてや、多種類の腫瘍に対して効果を持つこと
は殆ど無い。
【０００４】
【課題を解決するための手段】このような問題点を解決
するために、各種腫瘍細胞に、比較的多量に存在してい
るガングリオシドを広範囲に認識する抗体が必要とされ
る。かくして本発明により、ガングリオシド分子種を幅
広く認識する抗ガングリオシドモノクローナル抗体が提
供される。本発明の抗ガングリオシドモノクローナル抗
体の使用により、上記した従来の問題点は解決される。
即ち、本発明の抗体を毒素や抗癌剤と結合させた形態で
用いて、あるいは非修飾の形態で用いて各種癌の治療が
可能となる。更には、ラジオアイソトープ標識した本発
明のモノクローナル抗体、又はラジオアイソトープ標識
した本発明のモノクローナル抗体の（Ｆａｂ′）2 フラ
グメントを患者に投与することにより、各種癌のイメー
ジングが可能となる。
するために、各種腫瘍細胞に、比較的多量に存在してい
るガングリオシドを広範囲に認識する抗体が必要とされ
る。かくして本発明により、ガングリオシド分子種を幅
広く認識する抗ガングリオシドモノクローナル抗体が提
供される。本発明の抗ガングリオシドモノクローナル抗
体の使用により、上記した従来の問題点は解決される。
即ち、本発明の抗体を毒素や抗癌剤と結合させた形態で
用いて、あるいは非修飾の形態で用いて各種癌の治療が
可能となる。更には、ラジオアイソトープ標識した本発
明のモノクローナル抗体、又はラジオアイソトープ標識
した本発明のモノクローナル抗体の（Ｆａｂ′）2 フラ
グメントを患者に投与することにより、各種癌のイメー
ジングが可能となる。
【０００５】本発明の抗ガングリオシドモノクローナル
抗体は各種のガングリオシドと反応する。即ち、ガング
リオシドＧＭ４及びＧＭ３と強く反応し、更にＳＰＧ
（α２−３）、ＧＤ３、ＧＤ２及びＧＴ３と反応し、ま
たＧＭ２、ＧＭ１ａ、ＧＭ１ｂ、ＳＰＧ（α２−６）、
ＧＤ１ａ及びＧＤ１ｂとも反応する。ガングリオシドの
これらの名称は、Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍの命名法（Ｓ
ｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ｌ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．
５，１４５−１５５（１９６４））による。本発明の抗
ガングリオシドモノクローナル抗体は、免疫グロブリン
クラスＩｇＧ３に属する。
抗体は各種のガングリオシドと反応する。即ち、ガング
リオシドＧＭ４及びＧＭ３と強く反応し、更にＳＰＧ
（α２−３）、ＧＤ３、ＧＤ２及びＧＴ３と反応し、ま
たＧＭ２、ＧＭ１ａ、ＧＭ１ｂ、ＳＰＧ（α２−６）、
ＧＤ１ａ及びＧＤ１ｂとも反応する。ガングリオシドの
これらの名称は、Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍの命名法（Ｓ
ｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ｌ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．
５，１４５−１５５（１９６４））による。本発明の抗
ガングリオシドモノクローナル抗体は、免疫グロブリン
クラスＩｇＧ３に属する。
【０００６】本発明の抗ガングリオシドモノクローナル
抗体は以下のようにして調製することができる。ガングリオシド抗原による動物の免疫 ガングリオシド抗原を用いる例えばマウスの免疫法は既
に明らかにされている（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，２２，１２６５
−１２７１，１９８５）。即ち、例えばラクトン型ＧＤ
３ガングリオシド５μｇを試験管に乾固する。これに予
め１Ｎ塩酸で処理しておいたアジュバントであるサルモ
ネラ菌ミネソタ株の菌体（１ｇ）を含む、５ｍＭリン酸
緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２，５００μｌ）を加え、５
分間超音波処理を行うことによりガングリオシドを菌体
に吸着させ抗原液とする。この抗原液をＢａｌｂ／ｃマ
ウスの腹腔内に投与する。上記した方法以外にも、通常
使用されている他の方法を採用することもできる。例え
ばアジュバントとして結核死菌、乳化剤などを使用し、
マウスやラットに皮下あるいは静脈内投与する方法を採
用することもできる。
抗体は以下のようにして調製することができる。ガングリオシド抗原による動物の免疫 ガングリオシド抗原を用いる例えばマウスの免疫法は既
に明らかにされている（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，２２，１２６５
−１２７１，１９８５）。即ち、例えばラクトン型ＧＤ
３ガングリオシド５μｇを試験管に乾固する。これに予
め１Ｎ塩酸で処理しておいたアジュバントであるサルモ
ネラ菌ミネソタ株の菌体（１ｇ）を含む、５ｍＭリン酸
緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２，５００μｌ）を加え、５
分間超音波処理を行うことによりガングリオシドを菌体
に吸着させ抗原液とする。この抗原液をＢａｌｂ／ｃマ
ウスの腹腔内に投与する。上記した方法以外にも、通常
使用されている他の方法を採用することもできる。例え
ばアジュバントとして結核死菌、乳化剤などを使用し、
マウスやラットに皮下あるいは静脈内投与する方法を採
用することもできる。
【０００７】脾細胞とミエローマの融合細胞の作製
モノクローナル抗体を産生する細胞株の作製は、例え
ば、ガングリオシドで免疫されたマウスの脾細胞とマウ
スミエローマ細胞との融合により行われ、その方法はす
でに諸処で明らかにされている。例えばマウス／マウス
の細胞融合は「実験医学」６（１０）９０９（１９８８
年）に述べられた方法で行うことができる。先ず、ガン
グリオシドで免疫されたマウスから脾臓を摘出して細切
し、適当な大きさのメッシュ、例えば２００メッシュを
通して、適当な培地、例えばＲＰＭＩ１６４０に懸濁す
る。一方、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培
地等で１０5 個／ｍｌに培養したミエローマ細胞、例え
ばＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を血清不含
のＲＰＭＩ１６４０培地等で５×１０5 個／ｍｌとなる
ように懸濁する。マウス脾細胞懸濁液とマウスミエロー
マ懸濁液２０ｍｌを混合し、１０００ｒｐｍ、５分間塩
沈してペレットを形成させ、上清をデカントにより完全
に除く。このペレットに３７℃に加温した５０％ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ １５００）含有ＲＰＭＩ１
６４０培地１ｍｌを攪拌しながら徐々に加え、約１分間
攪拌を続ける。次いで、ＲＰＭＩ１６４０培地９ｍｌを
攪拌しながら４、５分にわたり徐々に加えた後、１００
０ｒｐｍで約５分間遠沈する。上清を除いた後、細胞を
２０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地５０ｍｌ
に懸濁し、９６穴細胞培養用プレートの各穴に１００μ
ｌずつ分注する。５％ＣＯ 2 培養装置中で３７℃、２４
時間後からはＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテ
リン、チミジン、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６
４０培地；Ｌｉｔｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ１
４５ ７０９−７１０，１９６４）を加えて培養するこ
とにより、融合細胞のみを育成させる。上記した融合細
胞の調製法以外にも、他の通常の融合方法を採用するこ
ともできる。例えば融合剤としてポリエチレングリコー
ル６０００、ＨＶＪなどを用い、他のミエローマ細胞株
を用いて融合細胞を調製することもできる。かくして得
られる融合細胞の培養上清を用い、各種ガングリオシド
を広く認識する抗体のスクリーニングを行う。
ば、ガングリオシドで免疫されたマウスの脾細胞とマウ
スミエローマ細胞との融合により行われ、その方法はす
でに諸処で明らかにされている。例えばマウス／マウス
の細胞融合は「実験医学」６（１０）９０９（１９８８
年）に述べられた方法で行うことができる。先ず、ガン
グリオシドで免疫されたマウスから脾臓を摘出して細切
し、適当な大きさのメッシュ、例えば２００メッシュを
通して、適当な培地、例えばＲＰＭＩ１６４０に懸濁す
る。一方、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培
地等で１０5 個／ｍｌに培養したミエローマ細胞、例え
ばＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を血清不含
のＲＰＭＩ１６４０培地等で５×１０5 個／ｍｌとなる
ように懸濁する。マウス脾細胞懸濁液とマウスミエロー
マ懸濁液２０ｍｌを混合し、１０００ｒｐｍ、５分間塩
沈してペレットを形成させ、上清をデカントにより完全
に除く。このペレットに３７℃に加温した５０％ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ １５００）含有ＲＰＭＩ１
６４０培地１ｍｌを攪拌しながら徐々に加え、約１分間
攪拌を続ける。次いで、ＲＰＭＩ１６４０培地９ｍｌを
攪拌しながら４、５分にわたり徐々に加えた後、１００
０ｒｐｍで約５分間遠沈する。上清を除いた後、細胞を
２０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地５０ｍｌ
に懸濁し、９６穴細胞培養用プレートの各穴に１００μ
ｌずつ分注する。５％ＣＯ 2 培養装置中で３７℃、２４
時間後からはＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテ
リン、チミジン、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６
４０培地；Ｌｉｔｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ１
４５ ７０９−７１０，１９６４）を加えて培養するこ
とにより、融合細胞のみを育成させる。上記した融合細
胞の調製法以外にも、他の通常の融合方法を採用するこ
ともできる。例えば融合剤としてポリエチレングリコー
ル６０００、ＨＶＪなどを用い、他のミエローマ細胞株
を用いて融合細胞を調製することもできる。かくして得
られる融合細胞の培養上清を用い、各種ガングリオシド
を広く認識する抗体のスクリーニングを行う。
【０００８】抗体のスクリーニング
ガングリオシドを広く認識する抗体を取得するために、
多種類のガングリオシドを抗原として用いるＥＬＩＳＡ
法を行い、多種類のガングリオシドと反応する抗体をス
クリーニングする。ガングリオシドを抗原として用いる
ＥＬＩＳＡ法に既に明らかにされている（Ｈｉｇａｓｈ
ｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５，
７８５−７９４，１９８４）。例えば、ガングリオシド
を２００ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度になるようエタノールに
溶解し、そのうち５０μｌを９６穴ポリスチレンプレー
トの各穴に分注する。３７℃で約３時間放置し、エタノ
ールを蒸発させる事によりガングリオシドをポリスチレ
ンプレートの各穴に吸着させる。各穴に５％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を含む、５ｍＭリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）を１００μｌずつ分注し、
室温で３時間放置する。これを吸い出し、融合細胞の培
養上清を５０μｌずつ各穴に分注して室温で２時間放置
する。培養上清を吸い出し各穴を１００μｌのＰＢＳで
３回洗った後、各穴には０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳを５
０μｌずつ分注し室温で１５分放置する。これを吸い出
し、各穴に、０．１％西洋わさびペルオキシダーゼ標識
ヤギ抗マウスイムノグロブリン（カッペル社）と０．２
５％ＢＳＡを含むＰＢＳを５０μｌずつ分注し、室温で
２時間放置する。これを吸い出し、各穴を２００μｌの
ＰＢＳで５回洗った後、各穴に０．１％ｏ−フェニレン
ジアミン、０．０１％過酸化水素含有クエン酸リン酸緩
衝液（ｐＨ５．０）を５０μｌずつ加え、室温で１０分
間発色反応を行う。各穴に１Ｎ塩酸を加え反応を止め、
５１０ｎｍに於ける吸光度を測定する。このようなスク
リーニングを繰り返すことによって各種のガングリオシ
ドと反応するモノクローナル抗体を産生する融合細胞の
クローニングを行う。かくして得られる目的とする融合
細胞を培養しその培養上清より本発明の抗ガングリオシ
ドモノクローナル抗体を得ることができる。あるいは融
合細胞を例えばマウスに腹腔内投与し、その血清あるい
は腹水中から抗ガングリオシドモノクローナル抗体を得
ることもできる。
多種類のガングリオシドを抗原として用いるＥＬＩＳＡ
法を行い、多種類のガングリオシドと反応する抗体をス
クリーニングする。ガングリオシドを抗原として用いる
ＥＬＩＳＡ法に既に明らかにされている（Ｈｉｇａｓｈ
ｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５，
７８５−７９４，１９８４）。例えば、ガングリオシド
を２００ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度になるようエタノールに
溶解し、そのうち５０μｌを９６穴ポリスチレンプレー
トの各穴に分注する。３７℃で約３時間放置し、エタノ
ールを蒸発させる事によりガングリオシドをポリスチレ
ンプレートの各穴に吸着させる。各穴に５％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を含む、５ｍＭリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）を１００μｌずつ分注し、
室温で３時間放置する。これを吸い出し、融合細胞の培
養上清を５０μｌずつ各穴に分注して室温で２時間放置
する。培養上清を吸い出し各穴を１００μｌのＰＢＳで
３回洗った後、各穴には０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳを５
０μｌずつ分注し室温で１５分放置する。これを吸い出
し、各穴に、０．１％西洋わさびペルオキシダーゼ標識
ヤギ抗マウスイムノグロブリン（カッペル社）と０．２
５％ＢＳＡを含むＰＢＳを５０μｌずつ分注し、室温で
２時間放置する。これを吸い出し、各穴を２００μｌの
ＰＢＳで５回洗った後、各穴に０．１％ｏ−フェニレン
ジアミン、０．０１％過酸化水素含有クエン酸リン酸緩
衝液（ｐＨ５．０）を５０μｌずつ加え、室温で１０分
間発色反応を行う。各穴に１Ｎ塩酸を加え反応を止め、
５１０ｎｍに於ける吸光度を測定する。このようなスク
リーニングを繰り返すことによって各種のガングリオシ
ドと反応するモノクローナル抗体を産生する融合細胞の
クローニングを行う。かくして得られる目的とする融合
細胞を培養しその培養上清より本発明の抗ガングリオシ
ドモノクローナル抗体を得ることができる。あるいは融
合細胞を例えばマウスに腹腔内投与し、その血清あるい
は腹水中から抗ガングリオシドモノクローナル抗体を得
ることもできる。
【０００９】本発明の抗ガングリオシドモノクローナル
抗体は黒色腫、神経芽細胞腫、膵癌などの治療薬として
用いることができる。例えばヒトメラノーマ細胞ＫＨＭ
−１／ｗ株に対して顕著な増殖抑制作用を発揮し、特に
黒色腫の治療薬として有用である。抗ガングリオシドモ
ノクローナル抗体を有効成分とする抗腫瘍剤の製剤化は
公知の方法を適用すればよく、その投与方法としては点
滴注射による投与が好ましい。注射剤は、生理的食塩
水、滅菌水リンゲル液等の水溶性溶剤、安定化剤などの
公知の担体、添加剤等を用いて通常の方法により調製す
ることができる。あるいは抗ガングリオシドモノクロー
ナル抗体をそのまま連結乾燥して注射剤とすることもで
きる。この場合には使用時に生理的食塩水などに溶解し
て投与される。また、本発明の抗ガングリオシドモノク
ローナル抗体は毒素あるいは他の抗腫瘍剤に結合させて
癌のミサイル療法剤として利用することもできる。本発
明の抗ガングリオシドモノクローナル抗体の投与量は症
状、年令、性別等により変動し得るが通常５０〜５００
ｍｇ／日である。
抗体は黒色腫、神経芽細胞腫、膵癌などの治療薬として
用いることができる。例えばヒトメラノーマ細胞ＫＨＭ
−１／ｗ株に対して顕著な増殖抑制作用を発揮し、特に
黒色腫の治療薬として有用である。抗ガングリオシドモ
ノクローナル抗体を有効成分とする抗腫瘍剤の製剤化は
公知の方法を適用すればよく、その投与方法としては点
滴注射による投与が好ましい。注射剤は、生理的食塩
水、滅菌水リンゲル液等の水溶性溶剤、安定化剤などの
公知の担体、添加剤等を用いて通常の方法により調製す
ることができる。あるいは抗ガングリオシドモノクロー
ナル抗体をそのまま連結乾燥して注射剤とすることもで
きる。この場合には使用時に生理的食塩水などに溶解し
て投与される。また、本発明の抗ガングリオシドモノク
ローナル抗体は毒素あるいは他の抗腫瘍剤に結合させて
癌のミサイル療法剤として利用することもできる。本発
明の抗ガングリオシドモノクローナル抗体の投与量は症
状、年令、性別等により変動し得るが通常５０〜５００
ｍｇ／日である。
【００１０】本発明の抗ガングリオシドモノクローナル
抗体は各種の癌の体内診断（イメージング）に用いるこ
とができる。即ち、抗ガングリオシドモノクローナル抗
体あるいはその（Ｆａｂ′）2 フラグメントを 131Ｉ、
111Ｉなどの放射性同位元素で標識して生体内に投与
し、ガンマカメラでスキャンすることにより抗体が集積
した癌部位を映像化することができる。
抗体は各種の癌の体内診断（イメージング）に用いるこ
とができる。即ち、抗ガングリオシドモノクローナル抗
体あるいはその（Ｆａｂ′）2 フラグメントを 131Ｉ、
111Ｉなどの放射性同位元素で標識して生体内に投与
し、ガンマカメラでスキャンすることにより抗体が集積
した癌部位を映像化することができる。
【００１１】
【発明の効果】以上に詳述した所から明らかなように、
本発明の抗ガングリオシドモノクローナル抗体は各種の
ガングリオシドに対して幅広く反応する性質を有し、黒
色腫、神経芽細胞腫、膵癌などの各種の癌の治療として
有用であり、また各種の癌の体内診断にも利用すること
ができる。
本発明の抗ガングリオシドモノクローナル抗体は各種の
ガングリオシドに対して幅広く反応する性質を有し、黒
色腫、神経芽細胞腫、膵癌などの各種の癌の治療として
有用であり、また各種の癌の体内診断にも利用すること
ができる。
【００１２】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
する 実施例１ モノクローナル抗体の製造 １−１ ラクトン型ＧＤ３ガングリオシドによるＢａｌ
ｂ／Ｃマウスの免疫 ウシ脳から抽出し、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマ
シア社）カラムで精製したＧＤ３ガングリオシド１０μ
ｇを氷酢酸存在下、２５℃、８時間インキュベートした
（Ｙｕ．Ｒ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，９８ １３６７−１３７３，１９８５）。反応液
を透析、凍結乾燥することにより、ラクトン型ＧＤ３ガ
ングリオシドを得た。この内５μｇを試験管に乾固し、
これに予め１Ｎ塩酸で処理しておいたサルモネラ菌ミネ
ソタ株の菌体（１ｇ）を含む５ｍＭリン酸緩衝生理食塩
水５００μｌを加えた。５分間超音波処理を行うことに
よりラクトン型ＧＤ３ガングリオシドを菌体に吸着さ
せ、抗原液とした。この抗原液５００μｌをＢａｌｂ／
ｃマウス（雌、５週令）の腹腔内に投与した。
する 実施例１ モノクローナル抗体の製造 １−１ ラクトン型ＧＤ３ガングリオシドによるＢａｌ
ｂ／Ｃマウスの免疫 ウシ脳から抽出し、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマ
シア社）カラムで精製したＧＤ３ガングリオシド１０μ
ｇを氷酢酸存在下、２５℃、８時間インキュベートした
（Ｙｕ．Ｒ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，９８ １３６７−１３７３，１９８５）。反応液
を透析、凍結乾燥することにより、ラクトン型ＧＤ３ガ
ングリオシドを得た。この内５μｇを試験管に乾固し、
これに予め１Ｎ塩酸で処理しておいたサルモネラ菌ミネ
ソタ株の菌体（１ｇ）を含む５ｍＭリン酸緩衝生理食塩
水５００μｌを加えた。５分間超音波処理を行うことに
よりラクトン型ＧＤ３ガングリオシドを菌体に吸着さ
せ、抗原液とした。この抗原液５００μｌをＢａｌｂ／
ｃマウス（雌、５週令）の腹腔内に投与した。
【００１３】１−２ マウス脾細胞の調製
１−１の方法でラクトン型ＧＤ３ガングリオシドを免疫
したＢａｌｂ／ｃマウスより摘出した脾臓を細切し、ス
テンレスメッシュ（アベ化学社製、２００メッシュ）を
通し１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。これ
を５０ｍｌの遠心管に採り１０００ｒｐｍ、５分間遠心
し上清を除いた。次に細胞を１０ｍｌの５０ｍＭ塩化ア
ンモニウム水溶液に再懸濁し、４℃において１０分間放
置後ピペッチングすることにより赤血球を溶血した。こ
れを１０００ｒｐｍ、５分間遠心し上清を除いた。ペレ
ットに１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を加えリンパ球
数を計測した後１０００ｒｐｍ、５分間遠心した。ペレ
ットにＲＰＭＩ１６４０培地を加え、１０7 個／ｍｌに
調製した。 １−３ マウスミエローマ細胞の調製 １０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１０5
細胞／ｍｌに培養したマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を血清不含のＲＰＭＩ１
６４０培地で洗い、細胞数５×１０5 個／ｍｌになるよ
うに血清不含ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。
したＢａｌｂ／ｃマウスより摘出した脾臓を細切し、ス
テンレスメッシュ（アベ化学社製、２００メッシュ）を
通し１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。これ
を５０ｍｌの遠心管に採り１０００ｒｐｍ、５分間遠心
し上清を除いた。次に細胞を１０ｍｌの５０ｍＭ塩化ア
ンモニウム水溶液に再懸濁し、４℃において１０分間放
置後ピペッチングすることにより赤血球を溶血した。こ
れを１０００ｒｐｍ、５分間遠心し上清を除いた。ペレ
ットに１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を加えリンパ球
数を計測した後１０００ｒｐｍ、５分間遠心した。ペレ
ットにＲＰＭＩ１６４０培地を加え、１０7 個／ｍｌに
調製した。 １−３ マウスミエローマ細胞の調製 １０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１０5
細胞／ｍｌに培養したマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を血清不含のＲＰＭＩ１
６４０培地で洗い、細胞数５×１０5 個／ｍｌになるよ
うに血清不含ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。
【００１４】１−４ マウスリンパ球とマウスミエロー
マ株の融合 マウス／マウス融合細胞の作成法は既に諸処で明らかに
されているが主として「実験医学」６（１０）９０９
（１９８８年）の方法に従った。１−２で調製した免疫
Ｂａｌｂ／Ｃマウスの脾臓細胞懸濁液１０ｍｌと、１−
３で調製したマウスミエローマ（Ｐ３Ｕ１）細胞懸濁液
１０ｍｌを混合し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し
てペレットを形成させ、上清を完全に除いた。このペレ
ットに３７℃に加温した１ｍｌの５０％ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ１５００）含有ＲＰＭＩ１６４０培地
を攪拌しながら徐々に加え、１分間攪拌を続けた。次い
で９ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を４、５分間に渡り徐
々に加え、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を除
いた後、２０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地
５０ｍｌに細胞を懸濁し、１００μｌずつ分注した。
マ株の融合 マウス／マウス融合細胞の作成法は既に諸処で明らかに
されているが主として「実験医学」６（１０）９０９
（１９８８年）の方法に従った。１−２で調製した免疫
Ｂａｌｂ／Ｃマウスの脾臓細胞懸濁液１０ｍｌと、１−
３で調製したマウスミエローマ（Ｐ３Ｕ１）細胞懸濁液
１０ｍｌを混合し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し
てペレットを形成させ、上清を完全に除いた。このペレ
ットに３７℃に加温した１ｍｌの５０％ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ１５００）含有ＲＰＭＩ１６４０培地
を攪拌しながら徐々に加え、１分間攪拌を続けた。次い
で９ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を４、５分間に渡り徐
々に加え、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を除
いた後、２０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地
５０ｍｌに細胞を懸濁し、１００μｌずつ分注した。
【００１５】１−５ ＨＡＴセレクション
１−４で調製した細胞懸濁液を、９６穴の細胞培養用プ
レートの各穴に１００μｌずつ分注し、５％ＣＯ2 培養
装置中で３７℃で培養した。２４時間後、培養プレート
の各穴にＨＡＴ培地を１００μｌずつ分注した。更に、
培養開始日より、２、３、５、８、１１、１４、１７、
２１日目に、培養系の培地の半量を新しいＨＡＴ培地で
置換する操作を繰り返した。このＨＡＴセクションによ
り融合しなかったミエローマや脾細胞は死滅し、融合細
胞のみ育成してくる。育成してきたハイブリドーマを１
０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、
その培養液を酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ法）の分析試
料とした。
レートの各穴に１００μｌずつ分注し、５％ＣＯ2 培養
装置中で３７℃で培養した。２４時間後、培養プレート
の各穴にＨＡＴ培地を１００μｌずつ分注した。更に、
培養開始日より、２、３、５、８、１１、１４、１７、
２１日目に、培養系の培地の半量を新しいＨＡＴ培地で
置換する操作を繰り返した。このＨＡＴセクションによ
り融合しなかったミエローマや脾細胞は死滅し、融合細
胞のみ育成してくる。育成してきたハイブリドーマを１
０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、
その培養液を酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ法）の分析試
料とした。
【００１６】１−６ 酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ法）
適当な原料、例えば牛脳より精製した各種ガングリオシ
ドをエタノールに溶かし、各々１ｎｍｏｌ／ｍｌの溶液
とした。このエタノール溶液を９６穴ポリスチレンプレ
ート（フローラボラトリー社）の各穴に５０μｌずつ分
注、３７℃で約３時間放置し、エタノールを蒸発させる
事によりガングリオシドをポリスチレンプレートの各穴
に吸着させた。各穴に５％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１００μ
ｌずつ分注し、室温で３時間放置した。これを吸い出
し、融合細胞の培養上清を５０μｌずつ各穴に分注して
室温で２時間放置した。培養上清を吸い出し各穴を１０
０μｌのＰＢＳで３回洗った後、各穴に０．５％ＢＳＡ
含有ＰＢＳを５０μｌずつ分注し室温で１５分放置し
た。これを吸い出し、穴に０．１％西洋わさびペルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン（カッペル
社）と０．２５％ＢＳＡを含むＰＢＳを５０μｌずつ分
注し室温で２時間放置した。これを吸い出し、各穴を２
００μｌのＰＢＳで５回洗った後、各穴に０．１％ｏ−
フェニレンジアミン、０．０１％過酸化水素含有クエン
酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μｌずつ加え、室
温で１０分間発色反応を行った。各穴に５０μｌの１Ｎ
塩酸を加え反応を止め、５１０ｎｍに於ける吸光度を測
定した。これにより、多種類のガングリオシドと反応す
る抗体を選択した。かくして、抗ガングリオシドモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株ＬＤ３を
クローン化した。このマウスハイブリドーマＬＤ３は１
９９１年５月２２日に微工研に寄託され、受託番号とし
て微工研菌寄第１２２６７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２２６
７）が付与されている。
ドをエタノールに溶かし、各々１ｎｍｏｌ／ｍｌの溶液
とした。このエタノール溶液を９６穴ポリスチレンプレ
ート（フローラボラトリー社）の各穴に５０μｌずつ分
注、３７℃で約３時間放置し、エタノールを蒸発させる
事によりガングリオシドをポリスチレンプレートの各穴
に吸着させた。各穴に５％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１００μ
ｌずつ分注し、室温で３時間放置した。これを吸い出
し、融合細胞の培養上清を５０μｌずつ各穴に分注して
室温で２時間放置した。培養上清を吸い出し各穴を１０
０μｌのＰＢＳで３回洗った後、各穴に０．５％ＢＳＡ
含有ＰＢＳを５０μｌずつ分注し室温で１５分放置し
た。これを吸い出し、穴に０．１％西洋わさびペルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン（カッペル
社）と０．２５％ＢＳＡを含むＰＢＳを５０μｌずつ分
注し室温で２時間放置した。これを吸い出し、各穴を２
００μｌのＰＢＳで５回洗った後、各穴に０．１％ｏ−
フェニレンジアミン、０．０１％過酸化水素含有クエン
酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μｌずつ加え、室
温で１０分間発色反応を行った。各穴に５０μｌの１Ｎ
塩酸を加え反応を止め、５１０ｎｍに於ける吸光度を測
定した。これにより、多種類のガングリオシドと反応す
る抗体を選択した。かくして、抗ガングリオシドモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株ＬＤ３を
クローン化した。このマウスハイブリドーマＬＤ３は１
９９１年５月２２日に微工研に寄託され、受託番号とし
て微工研菌寄第１２２６７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２２６
７）が付与されている。
【００１７】１−７ モノクローナル抗体の特異性
１−６に記した酵素免疫抗体法により、抗ガングリオシ
ドモノクローナル抗体ＬＤ３の反応特異性を検討した。
ＬＤ３はＧＭ４やＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１ａ、ＧＭ１
ｂ、ＳＰＧ（α２−３）、ＳＰＧ（α２−６）、ＧＤ
３、ＧＤ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ３と反応した。
図１にＥＬＩＳＡの系に於けるＬＤ３とＧＭ４、ＧＭ３
との反応曲線を示した。また、表１にＬＤ３と各種ガン
グリオシドとの反応性を示した。５０ｐｍｏｌの各種ガ
ングリオシド抗原をそれぞれプレートにコートして抗ガ
ングリオシドモノクローナル抗体ＬＤ３と反応を行わせ
た時に、吸光度が０．２以上０．５未満の時＋、０．５
以上０．７５未満の時＋＋、０．７５以上の時＋＋＋と
した。
ドモノクローナル抗体ＬＤ３の反応特異性を検討した。
ＬＤ３はＧＭ４やＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１ａ、ＧＭ１
ｂ、ＳＰＧ（α２−３）、ＳＰＧ（α２−６）、ＧＤ
３、ＧＤ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ３と反応した。
図１にＥＬＩＳＡの系に於けるＬＤ３とＧＭ４、ＧＭ３
との反応曲線を示した。また、表１にＬＤ３と各種ガン
グリオシドとの反応性を示した。５０ｐｍｏｌの各種ガ
ングリオシド抗原をそれぞれプレートにコートして抗ガ
ングリオシドモノクローナル抗体ＬＤ３と反応を行わせ
た時に、吸光度が０．２以上０．５未満の時＋、０．５
以上０．７５未満の時＋＋、０．７５以上の時＋＋＋と
した。
【表１】
表１ ＬＤ３抗体と各種ガングリオシドとの反応性
────────────────────
ガングリオシド 反応性
────────────────────
ＧＭ４ ＋＋＋
ＧＭ３ ＋＋＋
ＧＭ２ ＋
ＧＭ１ａ ＋
ＧＭ１ｂ ＋
ＳＰＧ（α２−３） ＋＋
ＳＰＧ（α２−６） ＋
ＧＤ３ ＋＋
ＧＤ２ ＋＋
ＧＤ１ａ ＋
ＧＤ１ｂ ＋
ＧＴ３ ＋＋
────────────────────
【００１８】１−８ 抗体ＬＤ３の精製
ＬＤ３細胞を血清不含のＩＴＥＳ−ｅＲＤＦ（極東製
薬）培地で培養して培養上清を集め、蛋白画分（８０％
硫酸アンモニウム沈澱画分）を調製した。これをＳｅ
ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（ファルマシア社）カラム
クロマトグラフィーにより分画して精製ＬＤ３抗体を得
た。
薬）培地で培養して培養上清を集め、蛋白画分（８０％
硫酸アンモニウム沈澱画分）を調製した。これをＳｅ
ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（ファルマシア社）カラム
クロマトグラフィーにより分画して精製ＬＤ３抗体を得
た。
【００１９】実施例２ 精製抗体ＬＤ３のヒトメラノー
マ細胞ＫＨＭ−１／ｗ株に対する増殖抑制作用 ヒトメラノーマ細胞ＫＨＭ−１／ｗ株を、３０％ヒト血
清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で２×１０5 細胞／ｍｌの
密度で培養した。これに精製抗体ＬＤ３を２５、５０、
１００μｇ／ｍｌの濃度で添加して、２４時間後の生細
胞数を数えた（図２）。精製抗体ＬＤ３を２５、５０、
１００μｇ／ｍｌの濃度で添加した系における生細胞数
は、それぞれ３０％ヒト血清培地で培養した場合の３
１．８％、１２．８％、３．７％であり、精製抗体ＬＤ
３はメラノーマ細胞ＫＨＭ−１／Ｗ株に対して顕著な増
殖抑制作用を示した。
マ細胞ＫＨＭ−１／ｗ株に対する増殖抑制作用 ヒトメラノーマ細胞ＫＨＭ−１／ｗ株を、３０％ヒト血
清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で２×１０5 細胞／ｍｌの
密度で培養した。これに精製抗体ＬＤ３を２５、５０、
１００μｇ／ｍｌの濃度で添加して、２４時間後の生細
胞数を数えた（図２）。精製抗体ＬＤ３を２５、５０、
１００μｇ／ｍｌの濃度で添加した系における生細胞数
は、それぞれ３０％ヒト血清培地で培養した場合の３
１．８％、１２．８％、３．７％であり、精製抗体ＬＤ
３はメラノーマ細胞ＫＨＭ−１／Ｗ株に対して顕著な増
殖抑制作用を示した。
【００２０】実施例３ 注射剤の調製
ハイブリドーマＬＤ３を１０％仔牛血清入りＲＰＭＩ１
６４０培地又は無血清のｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬）で
培養する。又は、マウス腹腔内で増殖させ腹水を得る。
その培養上清又は腹水に、４℃において８０％飽和とな
るまで硫酸アンモニウムを加え、タンパク質画分を沈澱
させる。これをＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（フア
ルマシア社）によるゲル濾過法により分画し、ＩｇＧ画
分として精製ＬＤ３を得る。これをそのまま連結乾燥し
て注射剤とする。この注射剤は使用時に生理食塩水に溶
解して使用される。
６４０培地又は無血清のｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬）で
培養する。又は、マウス腹腔内で増殖させ腹水を得る。
その培養上清又は腹水に、４℃において８０％飽和とな
るまで硫酸アンモニウムを加え、タンパク質画分を沈澱
させる。これをＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（フア
ルマシア社）によるゲル濾過法により分画し、ＩｇＧ画
分として精製ＬＤ３を得る。これをそのまま連結乾燥し
て注射剤とする。この注射剤は使用時に生理食塩水に溶
解して使用される。
【図１】図１は、抗体ＬＤ３とガングリオシドＧＭ４及
びＧＭ３との反応性を実施例１−６酵素免疫抗体法によ
り調べた結果を示すグラフである。
びＧＭ３との反応性を実施例１−６酵素免疫抗体法によ
り調べた結果を示すグラフである。
【図２】図２は、抗体ＬＤ３のヒトメラノーマ細胞ＫＨ
Ｍ−１／Ｗ株に対する補体依存性細胞障害活性を実施例
２に記した方法で調べた結果を示すグラフである。
Ｍ−１／Ｗ株に対する補体依存性細胞障害活性を実施例
２に記した方法で調べた結果を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
// Ｃ１２Ｎ 5/20
15/06
(Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (7)
- 【請求項１】 ガングリオシド分子種を幅広く認識する
抗ガングリオシドモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ガングリオシドＧＭ４、ＧＭ３、ＳＰＧ
（α２−３）、ＧＤ３、ＧＤ２及びＧＴ３と反応する請
求項１の抗ガングリオシドモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 ガングリオシドＧＭ４、ＧＭ３、ＧＭ
２、ＧＭ１ａ、ＧＭ１ｂ、ＳＰＧ（α２−３）、ＳＰＧ
（α２−６）、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ及
びＧＴ３と反応する請求項１の抗ガングリオシドモノク
ローナル抗体。 - 【請求項４】 ラクトン型ＧＤ３ガングリオシドを免疫
したＢａｌｂ／ｃマウスの脾細胞とマウスミエローマ細
胞とのマウス／マウス融合細胞株が産生する請求項１の
抗ガングリオシドモノクローナル抗体。 - 【請求項５】 免疫グロブリンクラスがＩｇＧ３である
請求項１の抗ガングリオシドモノクローナル抗体。 - 【請求項６】 請求項１から５のいずれかの抗ガングリ
オシドモノクローナル抗体を有効成分として含有する抗
腫瘍剤。 - 【請求項７】 黒色腫治療のための請求項６の抗腫瘍
剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3191589A JPH0530991A (ja) | 1991-07-31 | 1991-07-31 | 抗ガングリオシドモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3191589A JPH0530991A (ja) | 1991-07-31 | 1991-07-31 | 抗ガングリオシドモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0530991A true JPH0530991A (ja) | 1993-02-09 |
Family
ID=16277158
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3191589A Pending JPH0530991A (ja) | 1991-07-31 | 1991-07-31 | 抗ガングリオシドモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0530991A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103675277A (zh) * | 2013-11-12 | 2014-03-26 | 浙江大学 | 流式细胞术鉴别诊断横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤骨髓转移及白血病的荧光探针及试剂盒 |
| WO2021172519A1 (ja) * | 2020-02-28 | 2021-09-02 | 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター | 膵臓がんの診断補助方法及び膵臓がん治療用医薬組成物 |
-
1991
- 1991-07-31 JP JP3191589A patent/JPH0530991A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103675277A (zh) * | 2013-11-12 | 2014-03-26 | 浙江大学 | 流式细胞术鉴别诊断横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤骨髓转移及白血病的荧光探针及试剂盒 |
| WO2021172519A1 (ja) * | 2020-02-28 | 2021-09-02 | 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター | 膵臓がんの診断補助方法及び膵臓がん治療用医薬組成物 |
| JP2021139895A (ja) * | 2020-02-28 | 2021-09-16 | 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター | 膵臓がんの診断補助方法及び膵臓がん治療用医薬組成物 |
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