WO1992000086A1 - Agent antitumoral - Google Patents

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Shinya Okubo
Mitsunobu Sato
Kunisuke Himeno
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/80—Scrophulariaceae (Figwort family)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to an anticancer agent comprising an extract having an ability to induce interleukin-12 and interleukin-17 "extracted from seeds of nambangui cells.
  • Interleukin or interferon inducers are substances that act on human and animal cells to induce interleukin (IL) and interferon (IFN). .
  • IL interleukin
  • IFN interferon
  • Various natural substances having such an action are known.
  • a substance having IFN-inducing activity is isolated from an extract obtained by treating a Chinese herbal medicine “Toki” with hot water (Japanese Patent Laid-Open No. Similarly, an IFN-inducing active substance has been isolated from a Chinese herb medicine “Mulberry bark” (Japanese Patent Application Laid-Open No. 53-93913).
  • Nambangisel (Aeglnetia Indica L; AIL), known as a tonic, is an annual leafless plant belonging to the genus Nambangisel, which belongs to the genus Hamaubocaceae. I put myriad of dusty fine seeds inside.
  • the present inventors have found that the substance extracted from the seeds of nambangisel has a remarkable IL-12 and a component having IFN-r-inducing activity and has no side effect.
  • An anticancer drug consisting of an extract from the seeds of nambangui cells Providing is an issue.
  • the anti-pain agent of the present invention is characterized by comprising an extract having the ability to induce interleukin-12 and interferon-1, which is extracted from the seeds of nambangisel.
  • the interleukin-12 and the interleukin-1 inducer are derived from the seeds of nambanguicel.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining the therapeutic effect of the anticancer agent of the present invention on ascites-type tumor in terms of survival rate
  • FIG. 2 is a diagram for elucidating the growth of intraperitoneal tumor cells in pain-bearing mice by increasing body weight
  • Fig. 3 shows that the tumor was transplanted intraperitoneally, the drug was discontinued in the long-term surviving mice receiving the anti-pain agent of the present invention, and then the tumor was transplanted again Diagram for explaining the effect of
  • FIG. 4 is a diagram showing a change in body weight in the experimental group shown in FIG. 3.
  • FIG. 5 is a diagram showing a comparison of the antitumor effects of Extract 2 and Extract 3, which are anticancer agents of the present invention,
  • FIG. 6 is a diagram showing the suppression of weight gain in the treated mice shown in FIG. 5,
  • FIG. 7 is a diagram for explaining the antitumor effect of Extract 2 on a subcutaneously transplanted tumor
  • FIG. 8, FIG. 9, and FIG. 10 are diagrams for explaining that the extract from the seeds of nambangui cells has IL-12 and IF ⁇ -inducing ability.
  • the precipitate-removed solution was concentrated using an ultrafiltration membrane having a molecular weight of 3500 and a core side of 3000 (Namicon, USA) at a pressure of 1.5 kg / cm 2 , and the extract of the present invention was concentrated. I got The yield was 45 rag per gram of seeds of nambangui cells as determined by ⁇ ⁇ -acid ⁇ .
  • 2% of acetic acid reamer was added in the same manner as described above, mixed with an equal volume of ethanol, and left still at 01: for 30 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 5000 ⁇ g for 20 minutes, and the precipitate mainly containing RNA was discarded. Further, a 6-fold volume of ethanol was added to the supernatant, and the resulting precipitate was allowed to stand for 1 hour. The resulting precipitate was collected by centrifugation at 5000 ⁇ g for 20 minutes, dissolved in a distillation column, and dialyzed against distilled ice.
  • RNA Since polysaccharides and trace amounts of RNA are mixed in this dialysis solution, 30-40 jug of bovine ribonuclease (Pancreatic RNase) is added per ra ⁇ in order to destroy RNA. Processed at 38 for 1 hour. After the treatment, 2% of potassium acetate and 6 volumes of ethanol were added, and the resulting precipitate was collected by centrifugation, dissolved in distilled water, and centrifuged at 200 xg. The obtained supernatant was dialyzed against distilled ice, and the dialysate was concentrated to obtain a sample according to Extraction Example 3. The yield was 38 mg per 1 g of nanbangisel seeds as determined by humic acid.
  • Pancreatic RNase bovine ribonuclease
  • the extractable substance in the present invention can be extracted from the seeds of nambangisel with distilled water, particularly phosphate-buffered saline, or prepared by a method such as Morrison & Leive. Fractions of Lipopolysaccharide. from Escherichia col ⁇ 01 11: B4 Prepared by Two Extraction Procedures. J. Biol. Chem. 250; 2911-2919, 1975), and a similar method (Westphal, 0,. and Luderitz, 0. Chemis he Brf orschung von Lipopolysacchnden grammnegat tier Bakterien. Angew. Chera. 66; 407-417, 1954).
  • the extract in the present invention is water-soluble and ⁇ -butanol-insoluble as described below, and contains RNA (by the Mezbauro method utilizing the orcinol reaction and ultraviolet absorption). No, the molecular weight seems to be in the range of 100,000 to 200,000. Next, it will be described that the substance extracted from the seeds of Nambangisel in this way has the ability to induce interleukin-12 and interfluoro-1r.
  • RNA was prepared by the method of Majorbaum using the orcinol reaction (Mezbaum, W. Color reactions of nucleic acid components; In The nucleic acids. (Chargaf f, B., and Davidson, J. , editors). Academic Press, New York. 1; 283-305, 19 39. ⁇ , and ultraviolet absorption as indices.
  • protein quantification was performed by the method of Folin, etc. (Follin, 0., and Clocalteau, V. 0 tyrosine and tryptophane determination in proteins. J. Biol. Chera. 73; 627-650, 1927.). The index and And quantified.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • RPM 1-1640 10% fetal bovine serum-containing culture medium
  • CTLL cells whose cell growth is dependent on IL-12 are suspended in a 96-well microplate with 5 ⁇ 10 3 CTLL cells in a growth medium containing 10% test sampleg.
  • the cells were inoculated into each hole and cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 t: for 24 hours.
  • 3 H- Ji Mi Jin (Amasha ⁇ , UK) in each hole 50Ju Ci was further continued for 16 hours culture was added, taken up Write-amount of 3 H- thymidine was measured by liquid Shinchireshiyo Lanka U centers .
  • the IL-2 titer was calculated using recombinant IL-2 (Shionogi) at final concentrations of 5.0, 2.5, 1.25, 0.63, and 0.31 units. Converted from uptake of 3 H- Ji Mi Jin when treated with CTLL cells by standard preparations prepared so as to.
  • Human amniotic membrane-derived FL cells (10 s ) were inoculated into a plastic Petri dish having a diameter of 60 and cultured in a 5% carbon dioxide incubator for 37 days and 2 days to prepare FL monolayer cells.
  • VSV Vesicular Stomatitis virus
  • the extract prepared in Extraction Example 2 was subjected to column chromatography (Sephadex G-200 Pharmacia, Sweden, column size; 00.9 cm x 30 cm) using 0.15 mol Na Ci -0.02 mol Tris-HC_g buffer. (PH 7.4), and fractions were collected as 20 fractions as 2 m ⁇ per fraction. For each fraction, see write planted P BMC 1 X 10 7 cells Z mi to each hole of a 24-well plates, further, 24 hours and added in each fraction 0.1 ⁇ ⁇ ⁇ , and cultured at 37. Thereafter, the culture supernatant was collected, and IFN activity and IL-12 activity were measured.
  • a culture supernatant prepared by culturing the crude extract prepared in Extraction Example 1 and PBMC for 24 hours and 48 hours was measured by the above-described method for measuring IL-12 titer.
  • Figure 8 is a quantitative curve prepared using a standard IL- 2 (recombinant IL- 2), ⁇ standard IL- 2 (units m ⁇ ), the uptake of the vertical axis 3 H- thymidine Represent.
  • Table 1 confirms that the crude extract of the seeds of nambangui cells according to the present invention has IL-12-inducing ability.
  • Table 2 confirms that the crude extract of the seeds of Nambunghicell has IFN-producing ability.
  • the 24-hour preparation has a higher IFN activity than the 48-hour preparation.
  • the number in the table indicates the number of blacks, and indicates the average of two plates.
  • Figures in parentheses indicate antibody treatment against the number of VSV blacks on untreated control FL monolayer culture cells, or VSV black on FL monolayer culture cells treated with untreated test IFN preparation. 5 Indicates the rate of decrease ().
  • the crude extract of the seeds of Nambunghicell was subjected to the above-mentioned chromatography to search for the IL-2 and IF0N inducibility in each of the fractions, and to determine the presence of peronic acid (0D 530 nra, ), And the protein (OD D 280 ⁇ ) was quantified, and the results are shown in FIG. In this measurement, the IF ⁇ titer indicates the V S V black reduction rate (%) for the 5-fold diluted product.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • IL-12 titers were measured.
  • PBMCs were prepared from six people, A, B, C, D, E, F. The measurement results of the IL-12 titer are shown in Table 4 below.
  • the unit is unit Z.
  • Table 5 below shows the measurement results of the IFN-r titers of the extracts prepared in Extraction Examples 2 and 3.
  • each polysaccharide fraction prepared in Extraction Example 2 and Extraction Example 3 was used.
  • the culture supernatant obtained by treating PBMC for 24 hours was diluted 5-fold, and the diluted sample was divided into anti-IFN-7 "-treated and untreated ones.
  • VSV black was formed by treating FL monolayer cultured cells and comparing the number of VSV blacks with anti-IFN-r treated or untreated FL monolayer cultured cells. Indicates the rate of decrease ().
  • the IL-2 and IFN titers of the culture supernatant obtained by stimulating PBMC with the polysaccharide fraction prepared in Extraction Example 2 for 24 hours are shown in FIG. 10.
  • the IFN titer was measured by the VSV black reduction rate of a sample obtained by diluting the PBMC supernatant five-fold.
  • the black circles indicate changes in IL-12 activity, and the white triangles indicate changes in IFN titer.
  • both IL-12 and IFN titers increase with the amount of polysaccharide.
  • the polysaccharide prepared in Extraction Example 2 was injected into the abdominal cavity of 10 Balbushi mice (Balb-C mice) with 500 mg of 1 mg and 3 mg of lipoic acid. No abnormalities were observed in the test.
  • the present invention is based on the finding that the IL-12 and IFN inducers extracted in the respective extraction examples described above act as anticancer agents.
  • the present invention will be described below by specific examples.
  • ddY mice were used as animals, and Sarcoma-180 (under £ 1, referred to as S-180) capable of being transplanted into ddY mice was used as tumor cells.
  • S-180 Sarcoma-180
  • the extract obtained by Extraction Example 2 is referred to as Extract 2
  • the extract obtained by Extraction Example 5 is referred to as Extract 3.
  • mice died of tumors by the 17th day after receiving the S-180 transplantation in mice that did not receive the extract 2 (indicated by ⁇ ).
  • mice that received 0.6 mg / kg ( ⁇ ), 1.2 mgXkg (+), and 2.5 mg / kg (O) of Extract 2 intraperitoneally every two days from the same day of tumor implantation Also increased survival That is, by day 29 after tumor implantation, three of six mice were administered with 0.6 mg / kg of Extract 2, and five of six mice in the 1.2 mg / kg group, and an additional 2.5 mgZkg 4 out of 6 survived in group
  • the carrier mice that did not receive Extract 2 (-) showed a weight gain of 20 g Jil after transplantation of the tumor intraperitoneally, but 0.6 mg
  • FIG. 6 shows the results obtained by observing the degree of suppression of tumor growth in these treated mice in terms of the degree of suppression of body weight increase.

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Description

明細書
抗痛剤
技術分野
本発明は、 ナンバンギセルの種子より抽出されるイ ンタ 一 ロイキン一 2、 及びイ ンタ一フヱロン一 7"誘起能を有する抽 出物からなる抗癌剤に関する。
背景技術
ィ ンタ一ロイ キンまたィ ンタ一フ ヱ ロ ン誘起剤は、 ヒ ト、 動物の細胞に作用して、 イ ンターロイキン （ I L) 、 イ ンタ —フュ ロ ン （ I F N) を誘起する物質である。 このような作 用を有する天然物質は種々知られており、 例えば、 漢方薬 「 当帰」 を熱水で処理し、 その抽出液から I F N誘起活性を有 する物質が単離され （特開昭 5 3— 3 2 1 0 7号公報） 、 ま た漢方薬 「桑白皮」 から同様に I F N誘起活性物質が単離さ れて （特開昭 5 3 - 9 9 3 1 3号公報） いる。
ナンバンギセル （Aeglnetia Indica L;AIL) は、 強壮剤と して知られ、 ハマウッボ科ナンバンギセル属の 1年生無葉綠 植物で、 ススキ、 ミ ヨ ゥガ、 サ トゥキビ等の根に寄生し、 果 実のうちに無数のほこりのように細かい種子を入れている。
(広川書店、 総合薬用植物、 第 1 0 6〜 1 Q 7頁、 昭和 1 1 年発行）
本発明者等は、 このナンバンギセルの種子からの抽出物質 が、 著しい I L一 2、 及び I F N— r誘起活性を有する成分 を有し、 かつ副作用を有しないことを見出したが、 本発明は 、 このナンバンギセルの種子からの抽出物からなる抗癌剤の 提供を課題とする。
発明の開示
本発明の抗痛剤は、 ナンバンギセルの種子から抽出され るイ ンタ一ロイ キン一 2、 及びイ ンターフヱロ ン一 r誘起能 を有する抽出物からなることを特徴とする。
このイ ンターロイ キン一 2、 及びイ ンタ一フヱロ ン一 r誘 起剤は、 ナンバンギセルの種子より
①、 蒸溜氷、 特に蒸溜水がリ ン酸緩衝生理食塩水により抽 出されるか、 また、
②、 ナンバンギセルの種子より水飽和ブタノ ールにより抽 出され、 得られた水層をプ Dナーゼ処理し、 その沈澱除去液 を限外濾過して回収されるか、
③、 ナンバンギセルの種子より水飽和フエノ 一ルにより抽 出され、 得られた氷層を酌酸力 リ ウム、 及びエタノ ール処理 し、 その沈澱除去液を蒸溜永に対して透析し、 その透析内液 より R N Aを除去後、 得られた永層を更に酌酸カ リ ウム、 及 びエタノ ール処理し、 沈澱除去液を蒸溜水に対して透析し、 その透析内液を濃縮することにより得られるものである。
図面の簡単な説明
第 1図は、 腹氷型腫瘍に及ぼす本発明の抗癌剤の治療効果 を生存率で説明するための図、
第 2図は、 担痛マウスにおける腹腔内腫瘍細胞の増殖を体 重増加で說明するための図、
第 3図は、 腫瘍を腹腔内に移植後、 本発明の抗痛剤の投与 を受け長期生存したマウスに投薬を中止後、 再度腫瘍を移植 した場合の影響を説明するための図、
第 4図は、 第 3図に示す実験群における体重変化を示す図 第 5図は、 本発明の抗癌剤である抽出物 2 と抽出物 3の抗 腫瘍効果に闋する比較を示す図、
第 6図は、 第 5図に示す処理マウスにおける体重増加の抑 制度を示す図、
第 7図は、 皮下移植腫瘍への抽出物 2の抗腫瘍効果を説明 するための図、
第 8図、 第 9図、 第 1 0図はナンバンギセルの種子からの 抽出物が I L一 2及び I F Ν誘起能を有することを説明する ための図である。
発明を実施するための最良の形態 まず、 ナンバンギセルの種子よりイ ンタ一ロイ キン一 2、 及びイ ンターフェロ ン一 7 "誘起能を有する抽出物の抽出方法 について具体的に説明する。
〔抽出例 1〕
ナンバンギセルの種子の リ ン酸緩衝生理食塩水抽出物 （以 下、 粗抽出物という） の調製
ナンバンギセルの種子 40m gに、 カルシウムイ オン、 マグ ネシゥムイ オ ンを舍有しない 0. 1モルリ ン酸緩衝生理食塩水 ( H 7. 2 ) 1 πΐ ·βを加え、 乳鉢中において粉砕した。 この 粉砕物を 15000 xg 、 15分間、 4 て遠心処理し、 得られた上 清を、 0. 45 ί ΐη径のミ リ ポアフィ ルタ一を通して無菌化し、 本発明の抽出物を得た。
〔抽出例 2〕 上記ナンバンギセルの種子の粉枠物に、 等容量の永飽和 π - ブタノ ールを加え、 0 でで 15分間撹拌した。 この混和物を 35 OOOxg で 20分間遠心して、 分離した下層の永層を集めた。 な ぉブタノ 一ル層および沈澱物は更に 2回ブタノ ール抽出を行 ない、 得られる永層分画を更に遠心処理して不溶物を除去し 、 蛋白質分解酵素であるプロナ一ゼを最終濃度 g /ra £に なるように添加し、 37でで一夜処理した。 このプロナ一ゼ処 理によりプロナーゼを含む蛋白質からなる白色沈澱が生じ、 この沈澱を遠心処理により除去した。
次いで、 沈澱除去液を力 ッ トォフ分子量 3500、 コアサイ ド 3000の限外濾過膜（ ァミ コ ン社、 米国） を使用し、 圧力 1. 5 kg/ cm2 で濃縮し、 本発明の抽出物を得た。 収量はゥ π ン酸 定量によりナンバンギセルの種子 1 gにっき 45 ra gであった ο
〔抽出例 3〕
上記ナンバンギセルの種子の粉砕物に、 等容量の水飽和フ ェノ ールを加えて 0でで 30分間撹拌した後、 200xg で 10分間 遠心処理し、 永層を分離した。 氷層中に混入しているフ ニノ ールをエーテルで抽出除去し、 永層に溶解したエーテルは窒 素ガスを通気することにより除去した。 このようにして得ら れるフ エノ 一ル抽出物に酢酸力 リ ゥムを 2 % (w/w) の割合で 添加し、 10倍容量の 95%エタノ ールを添加し、 4 で、 一夜静 置した後形成される沈澱物を蒸溜水に溶解させた。
この溶液に上記同様 2 %の割合に酢酸力 リ ゥムを添加した 後等容量のェタノ ールと混和させ、 01：で 30分間静置した。 その後 5000xg、 20分間遠心し、 主として R N Aを舍有する沈 澱を廃棄した。 更に上清に 6倍容量のエタノ ールを添加し、 1時間静置した後生じた沈澱を 5000xg、 20分間遠心処理して 集め、 蒸溜永に溶解させ、 蒸溜氷に対して透析した。
この透析内液には多糖類と微量の R N Aが混在しているの で、 R NAを破壊する目的で 1 ra^あたり 30〜40ju gの牛脖 由来 R N A分解酵素（Pancreatic RNase)を添加し、 38でで 1 時間処理した。 処理後、 酢酸カ リ ウム 2 %と 6倍容量のエタ ノ ールを添加し、 生じた沈澱を瑋心処理により集め、 蒸溜水 に溶解し、 200 xgで遠心処理した。 得られた上清を蒸溜氷に 対して透析し、 透析内液を濃縮し抽出例 3 による標品とした 。 収量はゥ口ン酸定量によりナンバンギセルの種子 1 gあた り 38 mgであった。
上述のように、 本発明における抽出物質は、 ナンバンギセ ルの種子から蒸溜水、 特に リ ン酸緩衝生理食塩水により抽出 されるか、 またはモ リ ソ ン等の方法 （Morrison& Leive. Fra ctions of Lipopolysaccharide from Escherichia col ι 01 11： B4 Prepared by Two Extraction Procedures. J. Biol. Che m.250 ; 2911-2919, 1975) 、 更に同様の方法であるウェス 2 ト フアール等の方法 （ Westphal, 0, . and Luderitz, 0. Chemise he Brf orschung von Lipopolysacchnden grammnegat ι er B akterien. Angew. Chera.66 ;407 - 417、 1954) により得られる 高分子多糖体である。
抽出物質における多糖類の構造、 組成は、 いまだ充分には 判明していないが、 ナンバンギセルの種子を抽出する際に、 ウェス ト ファール等の方法により水飽和フヱノ ールで抽出す ると、 蛋白質成分が殆ど結合していない多糖類が得られ、 一 方、 モリ ソン等の方法を使用し、 水飽和 η-ブタノ 一ルにより 抽出すると、 脂質である リ ピド Αが蛋白により結合した多糖 類が抽出されるものと思われる。
本発明における抽出物質は、 後述するように水可溶性、 π- ブタノ ール不溶性であり、 R NA (オルシノ ール反応を利用 したメ ジャバウム （Mezbauro)法、 および紫外部吸収による） は含有されてなく、 分子量は 10万〜 20万の範囲と思われる。 次に、 このようにしてナンバンギセルの種子から抽出され る物質が、 イ ンターロイキン一 2、 及びイ ンタ一フ ロ ン一 rの誘起能を有することを説 する。
まず、 上記各抽出例により抽出した多糖類分画についての 化学分析は、 次のように行った。
ゥロ ン酸の定量は、 力ルバゾ一ル反応を利用したビタ一等 の方法 ( Bitter, j. , and Ewins, . A modified carbazole r eaction for uronic acids. Biochem. J. 81 43， 1961. )によ り、 また R N Aはオルシノ 一ル反応を利用したメ ジャバウム の方法 { Mezbaum, W. Color reactions of nucleic acid com ponents ; I n The nucleic acids. (Chargaf f, B. , and Davidso n, J. , editors). Academic Press, New York. 1; 283-305, 19 39. } 、 及び紫外部吸収を指標として定量した。 また蛋白質 定量はフォ リ ン等の方法 （ Follin, 0.， and Clocalteau, V. 0 n tyrosine and tryptophane determination in proteins. J. Biol. Chera.73 ; 627-650, 1927.). 及び紫外部吸収を指標と して定量した。
( I L— 2、 及び I F N r活性検索）
検索用標品の調製
へパリ ン添加ヒ ト末梢血より密度旬配遠心法 （密度、 1.07 7 、 Boyum, A. Isolation of mono - nuclear cells and granu locytes from human blood. Scan. J. Clin. Invest. 21 ;77-8 9， 1967.)を用いて、 末梢血単核球 （以下、 P BMCという） を分離し、 10%胎児牛血清を舍有する白血球増殖培養液（RPM 1-1640) を使用して 10ソ の細胞浮遊液を調製した。
0 この P BMC浮遊液 1 に上記各抽出例で抽出した各分 画を各々 1 [D_g添加し、 5 %炭酸ガスを含む空気中で 37でで 24時間、 48時間培養した。 この培養上清を 500xg、 15分間遠 心した後、 ミ リ ポアフィルタ一を通して無菌化した標品を得 、 以下に記載する I L一 2、 及び I FN— r活性検索に供し 5
I L - 2活性測定法
細胞増殖が I L一 2依存性である C T L L細胞を、 96穴マ イ ク口プレー ト に、 1 0 %被検標品を含む増殖培養液 •gに 5X 103 個の CTL L細胞を浮遊させ各ホールに植え込 0 み、 5 %炭酸ガス培養器中で 37t:で 24時間培養した。 その後 各ホールに 3H- チ ミ ジン （アマシャ厶社、 英国） 50ju Ciを 添加して更に 16時間培養を継続し、 3 H- チミ ジンの取り込 み量を液体シンチレーシヨ ンカ ウ ンターで測定した。 この場 合、 I L— 2力価の算定は、 組み換え型 I L— 2 ( シオノギ 社製） を、 最終濃度 5.0 、 2.5 、 1.25、 0.63、 0.31単位 Z m になるように調製した標準標品により C T L L細胞を処理 した場合の 3H- チ ミ ジンの取り込み量より換算した。
I F N— τ活性測定法
ヒ ト羊膜由来 F L細胞 （10s)を 60随径のプラスチックぺ ト リ皿に植え込み、 5 %炭酸ガス培養器中で 37 、 2 日間培養 し、 F L単層細胞を調製した。
次に被検標品 0.2 m に最少必須培地 0.8 m を添加して 、 被検標品の 5 倍希釈したもの 0.5ra£により F丄単層培養細 胞を 12時間、 37t:で処理した。 その後この処理 F L単層培養 細胞における永疱性口内炎ウ ィ ルス （ Vesicular Stomatiti s virus 、 以下、 V S Vという） のブラ ック形成能を、 未処 理 F L単層培養細胞での V S Vブラック形成能との比較によ り算定した。 I F N力価は V S Vブラ ック形成能を 50%減じ るために必要な被検標品の最高希釈率でもつて表現される。
I F Nのタイ ビング方法
被検標品中に含有される I FNのタイ ビングは、 被検標品 0.2 ιη·ηこ抗 I F N—な / )9抗体 （米国国立衛生研究所（ΝΙΗ ) INC. 米国） を 0.2m£、 そして被検標品 0.2 m£に抗 I FN — 7"抗体 （イ ンタ一フヱロ ン サイ エンシーズ INC. 米国） 0.2 ra ^を添加して、 30分間、 37でで培養した後、 最少必須 培地 0.6 ιη·βを添加して総容量 1 π ^ とし、 この標品 0.5 m により F L単層培養細胞を 37t：、 12時間処理し、 上記同様 に V S Vブラ ック減少率を測定した。 尚、 抗 I FN— / 抗体或いは抗 I FN— r抗体は、 I FN—な、 または I F N 一 i3の 100 単位、 或いは I FN— rの 100 単位を中和する力 価を有するように調製し、 試験に供した。
抽出物のクロマ トグラフィ ー
抽出例 2で調製した抽出物を、 カラムクロマ トグラフィ ー ( Sephadex G-200 フ ァーマシア、 スヱ一デン、 カラムサイ ズ； 00.9cm X 30cm) を使用し、 0.15モル Na Ci -0.02 モル Tris- H C_g緩衝液（ P H7.4 ) により溶出させ、 1分画 2 m ^ として 2 0分画採取した。 それぞれの分画について、 P BMC 1 X 107 個 Z miを 24穴プレー トの各ホールに植え込 み、 更に、 各分画 0.1 ιη·βずつ添加して 24時間、 37 で培養 した。 その後培養上清を採取し、 I F N活性、 I L一 2活性 を測定した。
次に、 抽出例 1で抽出した粗抽出標品の I L一 2誘導能測 定方法を示す。
抽出例 1で抽出した粗抽出標品と P BMCとを、 2 4時間 、 4 8時間培養して調製した培養上清について、 上記 I L一 2力価の測定方法により測定した。
第 8図は標準 I L— 2 (組み換え I L— 2 ) を用いて作成 された定量曲線であり、 橫軸は標準 I L— 2 (単位 m^ ) 、 縦軸は 3H- チミ ジンの取り込み量を表す。 上記 2 4時間 、 4 8時間培養して調製した培養上清についての、 それぞれ の 3H- チミ ジンの取り込みを示す力ゥ ン ト数（ 単位は DPM) を計測し、 第 8図によりそのカ ウ ン ト数に相当する I L一 2 (単位 Z m ) を求めた結果を
第 1表に示す。 第 1表
Figure imgf000012_0001
第 1表により本発明におけるナンバンギセルの種子の粗抽 出標品は、 I L一 2誘導能を有していることが確認される。
次に、 抽出例 1 で調製したナンバンギセルの種子の粗抽出 標品の I F N産生能測定方法を示す。
抽出例 1で調製したナンバンギセルの種子の粗抽出標品と P B M Cとを、 24時間、 或いは 48時間培養した後採取し、 得 られた上清を 10倍に希釈したものにより、 F L単層培養細胞 を処理して V S Vブラ ック形成能を測定した。 またブラ ック 減少率は下式により算出される。 2回にわたって実験した結 果を第 2表に示す。
標品処理でのブラ ッ ク数
( 1 ) X 100
未処理射照でのブラ ッ ク数
第 2表
Figure imgf000013_0001
第 2表により、 ナンバンギセルの種子の粗抽出標品は、 I F N産生能を有していることが確認される。 特に 24時間標品 は、 48時間標品に比較して I F N活性が高値である。
続いて、 ナンバンギセルの種子の粗抽出標品より誘導され る I F Nのタイ ビング方法を示す。
ナンバンギセルの種子の粗抽出標品により P B M Cを 24時 処理して得た培養上清を 5倍に希釈した標品を本実験で使 用した。 2回実験し、 その測定結果を第 3表に示す。
第 3表
Figure imgf000014_0001
尚、 表の数值はブラ ック数を示し、 2プレー トの平均值を 示す。 （ ） 内の数値は、 未処理対照 F L単層培養細胞上で の V S Vブラ ック数に対する抗体処理、 或いは未処理被検 I F N標品で処理した F L単層培養細胞上での V S Vブラ ック 5 数の減少率 （ ） を示している。
本実験によりナンバンギセルの種子の粗抽出標品は、 I F N - τ誘導能を有していることが確認される。
また、 ナンバンギセルの種子の粗抽出標品を上記ク ロマ ト グラフィ ーにかけ、 その各分画における I L— 2、 及び I F 0 N誘導能の検索、 及びゥロ ン酸 （0D 530 nra 、 力ルバゾール 反応） 、 蛋白質 （OD D 280ηπι) の定量を行い、 その結果を第 9図に示す。 尚この測定において I F Ν力価は 5倍希釈品に ついての V S Vブラ ック減少率 （％) を示す。
第 9図からわかるように、 各分画における I L— 2、 及び 5 I F Ν誘導能、 ゥ口 ン酸量、 及び蛋白質量は同一の傾向を示 しており、 このことから本発明の粗抽出物は単一物質である ことが想定される。
次に、 ナンバンギセルの種子から抽出例 2、 および抽出例 3により調製した分画をそれぞれ gゥロ ン酸定量によ る） ずつ用いて、 P B M Cを 2 4時間刺激して、 その培養上 清について I L一 2力価を測定した。 P B M Cは A、 B、 C 、 D、 E、 Fの 6人の人から調製した。 I L一 2力価の測定 結果について下記第 4表に示す。
単位は、 単位 Z 。
0 第 4表
Figure imgf000015_0001
第 4表からわかるように、 抽出例 2、 抽出例 3により調製 0 した抽出物はいずれも I L一 2誘導能を有するが、 抽出例 2 による抽出物はより強い I L一 2誘導能を保有することが明 らかである。
また下記第 5表に抽出例 2、 抽出例 3により調製した抽出 物の I F N— r力価の測定結果を示す。 測定にあたっては、 まず抽出例 2、 抽出例 3により調製した各多糖類分画により 24時間、 P BMCを処理して得た培養上清を 5倍に希釈し、 この希釈した標品を抗 I F N— 7"処理したもの、 または未処 理のものにわけ、 次いでこの標品を F L単層培養細胞を処理 して V S Vブラ ックを形成させ、 抗 I F N— r処理、 または 未処理の F L単層培養細胞での V S Vブラ ック数を比較した ものである。 尚、 数値は減少率 （ ） を示す。
第 5表 - 1
4
Figure imgf000016_0001
この第 5表から分かるように抽出例 2、 抽出例 3により抽 出されたものは、 共に強い I F N— r誘導能を保有している ことがわかる。
次に、 抽出例 2で調製した多糖類分画で P BMCを 24時間 刺激して得た培養上清について、 I L— 2、 及び I F N力価 を測定した結果を第 1 0図に示す。 I F N力価は P BMC上 清を 5倍希釈した標品について V S Vのブラ ッ ク減少率によ り測定した。 尚、 黒丸により I L一 2活性の推移を示し、 白 三角により I F N力価の推移を示す。 第 1 0図からわかるように、 多糖類の量に応じて I L一 2 、 I F N力価共に増大することがわかる。
また、 バルブーシ一マウス （Balb- Cマウス） 10 匹の腹腔に 抽出例 2で調製した多糖類を、 ゥ口ン酸定量で 5 0 0 gを 1 mg、 3 mgを注射したが、 2 8 日後においても異常は認 められなかった。
本発明は、 上記各抽出例により抽出される I L一 2、 I F N誘起剤が、 抗癌剤として作用することを見出したものであ 0 21下、 具体例により本発明を説明する。
尚、 下記具体例においては、 動物と して d d Yマウスを、 腫瘍細胞として d d Yマウスに移植可能な Sarcoma- 180 (£1下 、 S-180 という） を用いた。 また、 下記具体例においては、 上記抽出例 2 により得られるものを抽出物 2、 抽出例 3によ 5 り得られるものを抽出物 3 と称する。
〔具体例 1〕
腹水型腫瘍に及ぼす抽出物 2の治療効果
d d Yマウスに、 2 X 1 0 6 個の S-180 腫瘍細胞を腹腔内 に移植し生存率を見た。
0 第 1図に示すように、 抽出物 2の投与を受けないマウス （ △印） は S-180 の移植を受けた 1 7 日目までにすべてのマウ ス （ 6匹） が腫瘍死した。
それに対して、 腫瘍移植の同日から 2 日ごとに抽出物 2を 0.6mg/kg (□印） 、 1.2 mgXkg ( +印） 、 2.5 mg/kg (O 印） を腹腔内に投与したマウスはいずれも生存率が上昇した 即ち、 腫瘍移植後 2 9 日目までに、 抽出物 2を 0.6 mg/kg 投与したマウスは 6匹中 3匹が、 また 1.2 mg/kg投与群では 6匹中 5匹が、 更に 2.5 mgZkg投与群では 6匹中 4匹が生存
J o
尚、 データには示さないが、 正常マウスに 0.6 ag/kg~2. 5 mgZkgを 2 日おきに投与しても認むべき副作用はなかった o
次に、 担痛マウスにおける腹腔内腫瘍細胞の増殖を体重増0 加で評価した結果を第 2図に示す。
抽出物 2の投与を受けなかった担瘙マウス （--印） は、 腫 瘍を腹腔内に移植後 20g Jil上の体重増加を示したが、 0.6 mg
/kg ( 印） 、 1.2 mg/kg (—— 印） 、 2.5 mg/kg ( ·
• · 印） の投与を受けて 2 9 日目まで生存したマウスの体重5 増加はいずれも 5 g内内であった。
〔具体例 2〕
(S - 180 腫瘍を腹腔内に移植後、 抽出物 2の投与を受け長期 生存したマウスに投薬を中止後、 再度 S-180 を移植した場合 の影響）
0 長期生存 （ 2 9 日以上） したマウスに、 投薬を中止し、 再 度、 S- 180 腫瘍細胞を腹腔内に再移植した結果を第 3図にお いて、 □印で示す。
また、 対照群として無処置の d d Yマウスに S-180 を移植 した場合を△印で示す。
5 第 3図から明らかなように、 長期生存マウスにおいては、 再移植後においても対照群に比して著明に生存率が高かった また、 これらの実験群における体重変化を第 4図に示す。 第 4図からわかるように、 長期生存マウスに S- 180 を再移植 した場合 （—— 印） には、 对照群 （ —— 印） に比して体 重増加の抑制が顕著であつた。
〔具体例 3〕
(抽出物 2 と抽出物 3の抗腫瘍効果に関する比較）
d d Yマウスに 2 x 1 Q 6 個の S- 180 腫瘍細胞を移植後、 25呢 1¾の抽出物 2、 或いは同量の抽出物 3を 2 日目ごとに 投与して生存率を見た。 その結果を第 5図に示す。
第 5図からわかるように、 生存率は抽出物 2投与群 （□印 ) が抽出物 3投与群 （+印） に比してわずかに高かった。 次に、 これらの処理マウスにおける腫瘍増殖の抑制度を体 重増加の抑制度で見た結果を第 6図に示す。
この場合にも、 抽出物 2投与群 （ —— 印） が抽出物 3投 与群に比して僅かに抑制度が強かった。 いずれの投与群も無 処理マウスに腫瘍を移植したとき （ · · · · 印） と比較した 場合には著明な抑制効果が見られた。 '
〔具体例 4〕
(皮下移植腫瘍への抽出物 2の抗腫瘍劲果）
d d Yマウス背部皮下に、 1 X 1 0 6 個の S- 180 の腫瘍細 胞を移植後 5 日目より腫瘍内に抽出物 2を連日投与した後の 腫瘍の大きさで比較した結果を第 7図に示す。
これからわかるように、 0. 5 mg Z kg投与群（ · · · · 印） 、 2.5 mgZkg投与群 （ ― -一 印） とも非投与群 （ —— 印） に比して著明な腫瘍増殖抑制が見られたが、 特に 2.5 mgZkg 投与群においてはほぼ完全に腫瘍の増殖は抑制された。 産業上の利用可能性
本発明におけるナンバンギセルの種子よりの抽出物は、 ィ ンターロイキ ン— 2、 及びイ ンタ ーフ ュ ロ ン一 r誘起能を有 し、 ヒ ト及び動物における各種ウ ィ ルス感染症の予防及び治 療に有効であり、 また優れた腫瘍増殖抑制作用を有すると共 に、 認むべき副作用はなく、 抗痛材として痛治療に有用であ る o

Claims

請求の範囲
( 1 ) ナ ンバンギセルの種子から蒸留水により抽出されるこ とを特徴とする、 イ ンタ ーロイ キ ン一 2及びイ ンタ ーフ ヱ 口 ン一 r誘起能を有する抗癌剤。
( 2 ) ナ ンバンギセルの種子を水飽和ブタノ 一ルを使用して 抽出し、 次いで得られた永層をプロナーゼ処理し、 その沈澱 除去液を限外濾過して回収されることを特徵とするィ ンタ 一 ロ イ キ ン _ 2及びィ ンタ 一フ ヱ ロ ン一 7"誘起能を有する抗癌 剤。
( 3 ) ナンバンギセルの種子を氷飽和フ エ ノ 一ルを使用して 抽出し、 次いで得られた永層を酢酸力 リ ウム及びエタ ノ ール 処理した後、 その沈澱除去液を蒸溜水に対して透析して得ら れる透析内液より R N Aを除去し、 その透析内液を濃縮して 回収されることを特徵とするィ ンターロイ キン一 2及ぴィ ン ターフ ェロ ン一 r誘起能を有する抗癌剤。
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